ES2945315T3 - Método para realizar modificaciones específicas de sitio en la planta completa a través de la expresión transitoria de genes - Google Patents

Método para realizar modificaciones específicas de sitio en la planta completa a través de la expresión transitoria de genes Download PDF

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Abstract

Se proporciona un método para realizar una modificación específica del sitio en un segmento de gen objetivo en una planta completa a través de la expresión transitoria de genes, el método comprende los siguientes pasos: tomar la planta completa como un objeto de expresión transitoria, expresar transitoriamente una nucleasa distinta del gen objetivo segmento en la planta; bajo la acción de la nucleasa, cortando el segmento objetivo y realizando la modificación específica del sitio del segmento objetivo a través de la reparación del ADN de la planta. También se proporciona un método para cultivar una planta de mutación no transgénica usando el método anterior, y así obtener una planta de mutación no transgénica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para realizar modificaciones específicas de sitio en la planta completa a través de la expresión transitoria de genes
Campo técnico
La presente invención pertenece al campo de la ingeniería genética de plantas y está relacionada con un método para la modificación dirigida al sitio de la planta completa a través de la expresión transitoria de genes.
Antecedentes técnicos de la invención
La transgénesis se refiere a un proceso de transferencia de genes exógenos a un organismo específico a través de medios de biología molecular, de modo que las características o funciones biológicas del organismo se modifican parcialmente. En 1983, la primera planta transgénica del mundo, el tabaco antiviral transgénico, se desarrolló en EE. UU. En 1986, el algodón antiviral transgénico se desarrolló en EE. UU. y se sometió a pruebas de campo. En 1987, el gen resistente a los insectos y el gen resistente a los herbicidas se transfirieron a los cultivos. En 1992, se cultivó tabaco transgénico en China. En 1995, Canadá comenzó a comercializar Brassica transgénica resistente a herbicidas. En 1996, se cultivaron a gran escala en EE. UU. algodón transgénico resistente a insectos y soja resistente a herbicidas. Actualmente existen más de 120 plantas transgénicas en el mundo, en las cuales se han comercializado 51 cultivos transgénicos entre los que se encuentran la soja, el algodón y el maíz.
En la actualidad, se plantean cada vez más preocupaciones sobre los productos transgénicos, especialmente por la seguridad de los alimentos transgénicos. La regulación de los organismos transgénicos es muy estricta en la mayoría de los países. Costará mucho dinero y tiempo controlar una técnica o producto transgénico. De acuerdo con la investigación de International Crop Life, se necesitarían unos 5,5 años y 35 millones de dólares para la comercialización de un evento transgénico. Además, los cultivos transgénicos ya comercializados no son bien aceptados por el mercado, por ejemplo, el primer tomate transgénico permitido para la venta finalmente sale del mercado debido a las bajas ventas. Por lo tanto, es muy importante desarrollar métodos libres de transgenes para la mejora de cultivos.
Actualmente, los métodos para la mejora genética de un cultivo o la modificación de genes tienen muchos defectos. Por ejemplo, el cruzamiento tradicional debe llevarse a cabo durante varias generaciones y, por lo tanto, consume mucho tiempo y requiere un trabajo excesivo. También puede estar limitado por el aislamiento reproductivo entre especies y afectado por un enlace genético indeseable. Los métodos de mutagénesis física o química, tal como la mutagénesis por radiación, la mutagénesis EMS, etc., pueden introducir aleatoriamente un gran número de sitios mutados en el genoma, pero la identificación de los sitios mutados sería muy difícil.
Las herramientas de modificación genómica dirigida al sitio, que son técnicas novedosas surgidas en los últimos años, incluyen principalmente tres categorías de nucleasas específicas de secuencia (SSN): Nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN) y repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas/sistemas asociados a CRISPR (CRISPR/Cas9). Su característica común es que pueden actuar como una endonucleasa para escindir secuencias de ADN específicas, que produce la ruptura de doble cadena de ADN (DSB). La DSB puede activar el mecanismo de reparación intrínseco de la célula, la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR), para reparar los daños del ADN. La modificación dirigida al sitio de una secuencia de ADN específica se puede lograr durante el proceso de reparación del ADN.
El uso de técnicas de transferencia de genes para suministrar las herramientas anteriores a los cultivos puede superar los defectos del mejoramiento tradicional, tal como la baja eficiencia, el consumo de tiempo y la poca especificidad. Sin embargo, este proceso implica transgenes y, por lo tanto, debe obtenerse un mutante modificado dirigido al sitio libre de transgenes a través de la segregación en la población de la progenie. Dado que los genes exógenos se han integrado en el genoma de la planta (aunque finalmente se han eliminado por segregación), todavía existen problemas de seguridad. Por lo tanto, todavía existe la necesidad de un método para la modificación de cultivos dirigida al sitio que evite los transgenes.
Los medios de transferencia de genes convencionales, tal como la transformación por bombardeo de partículas, la transformación mediada por Agrobacterium o la transformación basada en protoplastos, requieren el proceso de cultivo de tejidos. El cultivo de tejido vegetal significa que los tejidos, células o protoplastos deseados se aíslan de la planta y se cultivan en condiciones artificiales para regenerar una planta completa. El cultivo de tejidos tiende a producir mutaciones somáticas y está limitado por el genotipo de la planta y el receptor específico. Requiere mucho tiempo obtener la planta regenerada y cuesta muchos recursos. La transformación in situ significa la transformación de una planta viva (no ex vivo), sin necesidad de cultivo de tejidos o células. La transformación in situ generalmente usa una planta completa como sujeto para la transformación e incluye, por ejemplo, el enfoque del tubo polínico, la inmersión de la inflorescencia, la regeneración del ápice del brote, la inyección de ovario, el enfoque del disco de la hoja y similares. La transformación in situ evita el cultivo de tejidos y, por lo tanto, es fácil de realizar y no requiere equipos específicos. Este método es independiente del genotipo y del receptor y, por lo tanto, se puede aplicar a diferentes variedades de diferentes especies. Además, la descendencia transgénica se puede obtener directamente. Por lo tanto, la modificación dirigida al sitio del genoma de una planta se puede lograr mediante un sistema de expresión transitoria a través de la transformación in situ, lo que es beneficioso para la aplicación de técnicas de edición de genes en plantas.
Jian-Feng Li y otros, "Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9", Nature Biotechnology, vol. 31, núm. 8; 8 de agosto de 2013; páginas 688-691, describen un método para introducir una modificación genética en una planta.
Voytas, D.F. et al., "Precision Genome Engineering and Agriculture: Opportunities and Regulatory Challenges", PLOS Biology, vol. 12, núm. 6; 10 de junio de 2014; páginas 1-6, describen varios métodos para introducir una modificación genética en una planta.
Resumen de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
El objeto de la invención es proporcionar un método para la modificación dirigida al sitio de la planta completa a través de la expresión transitoria de genes.
La invención proporciona un método para realizar la modificación dirigida al sitio en un fragmento diana de un gen diana en una planta completa, que comprende la etapa de: expresar transitoriamente una nucleasa dirigida al sitio en dicha planta, en donde se usa una planta completa como sujeto para la expresión transitoria, y en donde dicha nucleasa dirigida al sitio se dirige a y escinde dicho fragmento diana, para lograr de esta manera la modificación dirigida al sitio a través de la autorreparación del ADN de dicha planta, en donde la etapa de expresar transitoriamente la nucleasa dirigida al sitio comprende las siguientes etapas: a) suministrar la nucleasa dirigida al sitio o un material genético para expresar la nucleasa dirigida al sitio en dicha planta a través de un tubo polínico, inflorescencia, ápice de brote u ovario después de la polinización, y b) cultivar la planta obtenida en la etapa a) en ausencia de presión de selección, lo que permite la degradación de la nucleasa dirigida al sitio o el material genético no integrado en el cromosoma de la planta, y en donde se omite el cultivo de tejidos; en donde dicho material genético es un vector recombinante o un fragmento lineal de ADN o un ARN transcrito in vitro.
En ausencia de presión de selección, el sistema de defensa de la planta inhibirá la entrada de un gen exógeno y degradará el gen exógeno que ya se ha suministrado a la planta. Por lo tanto, al cultivar la planta completa que ha experimentado una expresión transitoria, el gen exógeno (incluido cualquier fragmento del material genético para expresar la nucleasa específica del fragmento diana) no se integrará en el genoma de la planta y la planta que finalmente se obtendrá es una planta libre de transgenes con modificación dirigida al sitio.
En una modalidad donde dicha parte de la planta es un tubo polínico, el suministro se realiza mediante la inyección de una solución que contiene un vector recombinante (tal como un plásmido de ADN) o un fragmento lineal de ADN o ARN transcrito in vitro o una solución que contiene dicha nucleasa dirigida al sitio en el estigma después de la polinización, de esta manera el material genético exógeno o la nucleasa dirigida al sitio se suministra al óvulo fertilizado a través del tubo polínico que se forma durante la floración y la fertilización (es decir, el enfoque del tubo polínico).
En una modalidad donde dicha parte de la planta es una inflorescencia, el suministro se realiza al sumergir la inflorescencia en una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta un vector recombinante (tal como un plásmido de ADN) o un fragmento lineal de ADN (específicamente, el enfoque de inmersión de inflorescencia o inmersión floral).
En una modalidad donde dicha parte de la planta es un ápice de brote, el suministro se realiza al sumergir el ápice de brote con una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta un vector recombinante (tal como un plásmido de ADN) o un fragmento lineal de ADN (específicamente, enfoque de regeneración del ápice del brote).
En una modalidad donde dicha parte de la planta es un ovario, el suministro se realiza mediante la inyección de una solución que contiene un vector recombinante (tal como un plásmido de ADN) o un fragmento lineal de ADN o ARN transcrito in vitro o una solución que contiene dicha nucleasa dirigida al sitio en el ovario después de la polinización (específicamente, enfoque de inyección de ovario).
En una descripción donde dicha parte de la planta es un ovario, el suministro se realiza mediante la inyección de una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta un vector recombinante (tal como un plásmido de ADN) o un fragmento lineal de ADN en el ovario después de la polinización (específicamente, el enfoque de inyección de Agrobacterium en el ovario).
En una modalidad donde dicha parte de la planta es una hoja, el suministro se realiza mediante la inyección de una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta un vector recombinante (tal como un plásmido de ADN) o un fragmento lineal de ADN en la hoja (específicamente, enfoque de disco de hoja).
En dicho método, la nucleasa dirigida al sitio que es específica del fragmento diana puede ser cualquier nucleasa que pueda lograr la edición del genoma, tal como la nucleasa de dedo de zinc (ZFN) y la nucleasa efectora similar a un activador de transcripción (TALEN) y CRISPR/Cas9. nucleasa, etc.
En una modalidad de la invención, la "nucleasa dirigida al sitio" se refiere específicamente a las nucleasas CRISPR/Cas9. En algunas modalidades, el material genético para expresar las nucleasas CRISPR/Cas9 específicas de un fragmento diana está compuesto específicamente por un vector recombinante o fragmento de ADN para transcribir un ARN guía (o dos vectores recombinantes o fragmentos de ADN para transcribir crARN y tracrARN respectivamente) y para expresar la proteína Cas9; o está compuesto específicamente por un vector recombinante o fragmento de ADN para transcribir un ARN guía (o dos vectores recombinantes o fragmentos de ADN para transcribir crARN y tracrARN respectivamente) y un vector recombinante o fragmento de ADN o ARN para expresar la proteína Cas9; o está compuesto específicamente por un ARN guía (o un crARN y un tracrARN) y un vector recombinante o fragmento de ADN o ARN para expresar la proteína Cas9. Dicho ARN guía es un ARN con estructura palindrómica que se forma por apareamiento parcial de bases entre crARN y tracrARN; dicho crARN contiene un fragmento de ARN capaz de unirse complementariamente al fragmento diana.
Además, en el vector recombinante o fragmento de ADN para transcribir el ARN guía, el promotor para iniciar la transcripción de la secuencia de nucleótidos codificante de dicho ARN guía es un promotor U6 o un promotor U3. Más específicamente, el vector recombinante para la transcripción del ARN guía y la expresión de la proteína Cas9 es un plásmido recombinante que se obtiene mediante la inserción de la secuencia codificante del "fragmento de ARN capaz de unirse complementariamente al fragmento diana" en dirección directa entre dos sitios de restricción BsaI del plásmido pHSN40 o pHSN401.
El vector recombinante para transcribir el ARN guía es un plásmido recombinante que se obtiene mediante la inserción de la secuencia codificante del "fragmento de ARN capaz de unirse complementariamente al fragmento diana" en dirección directa entre dos sitios de restricción BbsI del plásmido pZmU3-ARNg; el vector recombinante de expresión de la nucleasa Cas9 es concretamente el vector pJIT163-Ubi-Cas9
En otra modalidad de la invención, la nucleasa dirigida al sitio es nucleasa TALENs. El material genético para expresar la nucleasa dirigida específica del sitio diana puede ser un vector recombinante (plásmido de ADN) o un fragmento de ADN o ARN que exprese proteínas TALEN emparejadas, en donde la proteína TALEN está compuesta por un dominio de unión a ADN capaz de reconocer y unirse al fragmento diana, y un dominio Fok I.
En el caso de que la nucleasa dirigida al sitio sea nucleasa con dedos de zinc (ZFN), el material genético para expresar la nucleasa dirigida al sitio que es específica del sitio diana puede ser un vector recombinante (plásmido de a Dn ) o fragmento de ADN o ARN que exprese proteínas ZFN emparejadas, en donde la proteína ZFN está compuesta por un dominio de unión a ADN capaz de reconocer y unirse al fragmento diana, y un dominio Fok I. En dicho método, la modificación dirigida al sitio es específicamente inserción, deleción y/o reemplazo en el fragmento diana en el genoma de la planta. En algunas modalidades, el fragmento diana está dentro de la región codificante de un gen diana. En algunas modalidades, el fragmento diana está dentro de la región de regulación de la transcripción de un gen diana, tal como un promotor. En algunas modalidades, el gen diana podría ser un gen estructural o un gen no estructural. En algunas modalidades, dicha modificación da como resultado la pérdida de la función del gen diana. En algunas modalidades, dicha modificación da como resultado la ganancia (o cambio) de la función del gen diana.
En algunas modalidades, la planta puede ser de cualquier genotipo. La planta puede ser monocotiledónea o dicotiledónea, tal como maíz (Zea mays), trigo, soja, algodón, tabaco, arabidopsis, centeno, Rosa roxbunghii, Eriobotrya japónica, Carica papaya, Rosa canina, Dendrobium nobile Lindl., Brassica oleracea, Fagopyrum tataricum o Hevea brasiliensis.
Cuando la planta es maíz, trigo, soja, algodón, tabaco y similares, la nucleasa dirigida al sitio o el material genético puede suministrarse mediante el enfoque del tubo polínico. Cuando la planta es Arabidopsis, trigo, centeno y similares, la nucleasa dirigida al sitio o el material genético pueden suministrarse mediante el enfoque de inmersión de inflorescencia. Cuando la planta es maíz, Rosa roxbunghii, Eriobotrya japonica, Carica papaya, Rosa canina y similares, el material genético puede suministrarse mediante el enfoque de regeneración del ápice del brote. Cuando la planta es trigo, soja, algodón, Dendrobium nobile Lindl. y similares, la nucleasa dirigida al sitio o el material genético pueden suministrarse mediante el enfoque de inyección en el ovario. Cuando la planta es el tabaco, Brassica oleracea, Fagopyrum tataricum, Hevea brasiliensis y similares, el material genético puede suministrarse mediante el enfoque de disco de hoja como parte de la descripción.
En una modalidad (Ejemplo 1) de la invención, la planta es maíz (en particular, maíz híbrido HiII y línea endogámica B73, Zheng58, etc.); la nucleasa es CRISPR/Cas9; el gen diana es el gen endógeno del maíz ZmIPK; el fragmento diana es 5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; el vector recombinante para transcribir el ARN guía es un plásmido recombinante que se obtiene mediante la inserción del fragmento de ADN como se muestra en 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT -3' en dirección directa entre dos sitios de restricción BbsI del plásmido pZmU3-ARNg; el vector recombinante de expresión de la nucleasa Cas9 es concretamente el vector pJIT163-Ubi-Cas9; el vector recombinante para transcribir el ARN guía y expresar la proteína Cas9 es un plásmido recombinante que se obtiene mediante la inserción del fragmento de ADN como se muestra en 5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3' en dirección directa entre dos sitios de restricción BsaI del plásmido pBUE411.
En otra modalidad (Ejemplo 2) de la invención, la planta es Arabidopsis; la nucleasa es CRISPR/Cas9; el gen diana es el gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA; el fragmento diana es 5'-ACGATATCCGCCGATTTCAC-3'; el vector recombinante para transcribir el ARN guía y expresar la proteína Cas9 es un plásmido recombinante que se obtiene mediante la inserción del fragmento de a Dn como se muestra en 5'- ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT -3' en dirección directa entre dos sitios de restricción BsaI del plásmido pHSN401.
Una planta mutante sin transgén y/o una descendencia de la misma obtenida mediante el uso del método de la invención para realizar una modificación dirigida al sitio en un fragmento diana de un gen diana en una planta de interés para permitir que el gen diana pierda sus funciones, también se describe.
La presente invención también proporciona un método para hacer una planta mutante libre de transgén, que comprende las siguientes etapas: realizar una modificación dirigida al sitio en un fragmento diana de un gen diana en una planta de interés mediante el uso del método de la invención, para obtener una planta en la que se pierden las funciones del gen diana y el genoma está libre de gen exógeno integrado.
Como se usa en la presente descripción, una planta transgénica se refiere a una planta con un gen exógeno integrado en el genoma de la misma. Una planta libre de transgén se refiere a una planta sin un gen exógeno integrado en el genoma de la misma.
La presente invención combina la técnica de edición del genoma y el sistema de expresión transitoria en el que se usa una planta completa como sujeto de expresión. Es decir, en la presente invención, la nucleasa dirigida al sitio se introduce en las células o tejidos de una planta completa a través del enfoque del tubo polínico, inmersión de la inflorescencia, regeneración del ápice del brote, inyección en el ovario y similares; luego se logra la modificación del genoma de la planta mediante la expresión transitoria de la nucleasa dirigida al sitio. La descendencia mutante con alta seguridad se puede obtener directamente. Por ejemplo, en el enfoque del tubo polínico, una solución que contiene la nucleasa dirigida al sitio o el ADN/ARN para expresar la nucleasa dirigida al sitio se suministra en los óvulos fertilizados o en las células germinales (esperma u óvulo) a través del tubo polínico formado durante la floración o fertilización de la planta. Estas células son similares a los protoplastos (sin formación de pared celular) y llevan a cabo una replicación y recombinación activas del ADN y, por lo tanto, serán editadas de manera eficiente por la nucleasa dirigida al sitio. Los óvulos fertilizados modificados o las células germinales pueden convertirse en plantas mutantes intactas. La nucleasa dirigida al sitio introducida o el ARN que codifica la nucleasa dirigida al sitio será degradada por las células vegetales. El ADN que codifica la nucleasa dirigida al sitio también será degradado por las células vegetales ya que el método se realiza completamente en ausencia de presión de selección. Por lo tanto, ningún gen exógeno se integrará en el genoma y los mutantes obtenidos tendrán una mayor bioseguridad. Las ventajas de la presente invención incluyen: se omite el cultivo de tejidos; la mutación se obtiene a nivel de la planta completa; el método es independiente del genotipo y del receptor y, por lo tanto, se puede aplicar a varias variedades de varias especies; los mutantes T1 se pueden obtener directamente y la mutación se puede heredar de forma estable; lo que es más importante, la planta mutante tal como se obtiene está libre de genes exógenos y, por lo tanto, tiene una bioseguridad más alta.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno del maíz ZmIPK por expresión transitoria del sistema ARNg:Cas9 en protoplasto, a) es un electroferograma en gel. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 250, 500, 750, 1000 pb respectivamente; el carril 2 y el carril 3 son resultados de digestión de restricción con SacI para productos de PCR de ADN de protoplasto, en donde el protoplasto se transformó con el sistema ARNg:Cas9; el carril 4 es el resultado de la digestión con SacI para el producto de PCR de ADN de protoplasto de tipo salvaje; el carril 5 es el producto de PCR del protoplasto de tipo salvaje, b) son los resultados de la secuenciación de algunos mutantes.
La figura 2 muestra la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno del maíz ZmIPK mediante la expresión transitoria del sistema ARNg:Cas9 en la variedad de maíz HiII a través del enfoque del tubo polínico, así como también los resultados de la secuenciación. a) es un electroferograma en gel. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000 pb respectivamente; los carriles 2-12 son los resultados de la digestión por restricción con SacI para los productos de PCR de los mutantes; el carril 13 es el resultado de la digestión con SacI para el producto de PCR del control de tipo salvaje. b) son los resultados de la secuenciación de algunos mutantes.
La figura 3 muestra la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno del maíz ZmIPK mediante la expresión transitoria del sistema ARNg:Cas9 en la variedad de maíz B73 a través del enfoque del tubo polínico, así como también los resultados de la secuenciación. a) es un electroferograma en gel. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000 pb respectivamente; los carriles 2-6 son los resultados de la digestión por restricción con SacI para los productos de PCR de los mutantes; el carril 7 es el resultado de la digestión con SacI para el producto de PCR del control de tipo salvaje. b) son los resultados de la secuenciación de algunos mutantes.
La figura 4 muestra la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno del maíz ZmIPK mediante la expresión transitoria del sistema ARNg:Cas9 en la variedad de maíz Zheng58 a través del enfoque del tubo polínico, así como también los resultados de la secuenciación. a) es un electroferograma en gel. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000 pb respectivamente; los carriles 2-9 son los resultados de la digestión por restricción con SacI para los productos de PCR de los mutantes; el carril 10 es el resultado de la digestión con SacI para el producto de PCR del control de tipo salvaje. b) son los resultados de la secuenciación de algunos mutantes.
La figura 5 es un electroferograma en gel que muestra la amplificación de los mutantes de los genes ZmIPK de diferentes variedades de maíz a través del enfoque del tubo polínico, mediante el uso de 2 juegos de cebadores en los vectores pZmU3-ARNg-Cl y pJIT163-Ubi-Cas9, a) es el resultado de la amplificación mediante el uso del par de cebadores ZmU3-HC1R; b) es el resultado de la amplificación mediante el uso del par de cebadores Cas9-1HCas9-1R. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000 respectivamente; los carriles 2-10 son mutantes según se ensayaron; el carril 11 es el control positivo (plásmido pZmU3-ARNg-C1 o pJIT163-Ubi-Cas9).
La figura 6 muestra la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA por expresión transitoria del sistema ARNg:Cas9 en protoplasto, a) es un electroforetograma en gel. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000 pb, 2000, 3000, 5000 pb, respectivamente; el carril 2 y el carril 3 son resultados de digestión de restricción con EcoRV para productos de PCR de ADN de protoplasto, en donde el protoplasto se transformó con el sistema ARNg:Cas9; el carril 4 es el resultado de la digestión con EcoRV para el producto de PCR de ADN de protoplasto de tipo salvaje; el carril 5 es el producto de PCR del protoplasto de tipo salvaje, b) son los resultados de la secuenciación de las bandas sin cortar.
La figura 7 muestra la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA por expresión transitoria del sistema ARNg:Cas9 a través del enfoque de inmersión de inflorescencia, a) es un electroferograma en gel. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000 pb, 2000, 3000, 5000 pb, respectivamente; los carriles 2-9 son resultados de digestión de restricción con EcoRV para productos de PCR de los mutantes; el carril 10 es el resultado de la digestión con EcoRV para el producto de PCR del control de tipo salvaje. b) son los resultados de la secuenciación de algunos mutantes.
La figura 8 es un electroferograma en gel que muestra la amplificación del gen del mutante AtPTPA mediante el uso de cebadores en el vector pHSN401-C2. a) es el resultado de la amplificación mediante el uso del par de cebadores pHSN401-1HC2R; b) es el resultado de la amplificación mediante el uso del par de cebadores CAS9-2HCAS9-2R. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 pb respectivamente; los carriles 2-9 son mutantes según se ensayaron; el carril 10 es el control positivo (plásmido pHSN401).
La figura 9 muestra la mutación en la progenie del gen mutante AtPTPA. El carril 1 es un marcador, de abajo hacia arriba: 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 pb respectivamente; los carriles 2, 3, 4, 5 son descendientes de mutantes homocigóticos; los carriles 6, 7 son progenie de tipo salvaje obtenida por segregación; los carriles 8, 9, 10 son descendientes de mutantes heterocigóticos.
Modalidades detalladas
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Los métodos experimentales usados en los siguientes ejemplos son todos métodos convencionales, a menos que se indique de otra forma.
Los materiales, reactivos usados en los siguientes ejemplos están todos disponibles comercialmente, a menos que se indique de otra forma.
El vector de expresión pZmU3-ARNg se describió en "Liang, Z. y otros. Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs andthe CRISPR/Cas System. Journal of Genetics and Genomics.41:63-68, (2014)".
Los vectores de expresión pJIT163-Ubi-Cas9 se describieron en "Wang, Y. y otros. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nature Biotechnology. 32, 947-951 (2014)".
Los vectores de expresión pHSN401 y pBUE411 se describieron en "Xing, H. y otros. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biology.l4:327, (2014)".
La variedad de maíz Hill se describió en "Armstrong, C.L., Green, C.E.& Phillips, R.L. Development and availability of germplasm with high type II culture formation response. Maize Genet. Coop. News Lett. 65,92-93 (1991)".
La variedad de maíz B73 se describió en "Russell, W.A. Registration of B70 and B73 parental lines of maize. Crop Sci. 12, 721 (1972)".
La variedad de maíz Zheng58 se describió en "Zhang Falin, Breeding and application of a Maize inbred line Zheng58. Crop Journal, 2001(4):31-31".
Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia se describió en "Koorneef, M. y otros. Linkage map of Arabidopsis thaliana. Jornal of Heredity. 74,265-272 (1983)".
Medio MS: 4,43 g/l de sales MS (Sigma, M5524), 30 g/l de sacarosa, 3 g/l de fitogel, pH 5,7, esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 min.
Medio LB: 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl, pH 7,0 (para medio LB sólido, se adicionaron 15 g de agar por litro de medio líquido), esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 min.
Las soluciones usadas en la preparación y transformación de protoplastos se muestran en las tablas 1-6.
Tabla 1: Solución de enzimólisis 50 ml para Arabidopsis
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Tabla 2: 50ml de solución de enzimólisis para Maíz
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Tabla 3: 500 ml de W5
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Tabla 4: 250 ml de solución WI
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Tabla 5: 10 ml de solución MMG
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Tabla 6: 4 ml de solución de PEG
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Transformación de Agrobacterium tumefaciens:
1) Las células competentes (almacenadas a -80°C) se descongelaron en hielo, luego se adicionaron 2 |jg de ADN plasmídico y se mezclaron; la mezcla se colocó en hielo durante 30 min;
2) el tubo EP se sumergió en nitrógeno líquido durante 1 min y se transfirió rápidamente a un baño de agua a 37 °C para descongelarlo (2 min);
3) luego se adicionó 1 ml de medio líquido LB y se incubó a 28 °C durante 4-5 h con agitación a baja velocidad (150 rpm);
4) las células bacterianas se colectaron mediante centrifugación a 10 000 rpm durante 30 s, se descartó el sobrenadante y se sembraron 100 j l de células bacterianas resuspendidas en las placas de selección que contenían los antibióticos correspondientes.
5) las placas se incubaron boca abajo a 28 °C hasta que emergieron colonias blancas (transformantes).
Ejemplo 1. Edición dirigida al sitio del gen endógeno del maíz ZmIPK a través del enfoque del tubo polínico y el enfoque de regeneración del ápice del brote
I. Diseño del fragmento diana: diana-C1
Diana-Cl: 5'-CCGAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; (posición 393-415 del gen ZmIPK como se muestra en Genbank Núm. AY172635).
II. Preparación del plásmido pZmU3-ARNg y el plásmido pBUE411 que contiene el sitio C1
C1 es la secuencia de ADN para el ARN que se puede unir de manera complementaria a la diana-C1.
Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos monocatenarios con extremos cohesivos (subrayados):
C1-1F: 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT 3';
C1-2F:5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT 3';
C1R: 5'-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'.
El ADN de doble cadena con extremos cohesivos se formó a través de la hibridación entre C1-1HC1R y se insertó entre los dos sitios de restricción Bbsl en el plásmido pZmU3-ARNg, lo que resultó en un plásmido pZmU3-ARNg que contenía el sitio Cl. El plásmido positivo se verificó mediante secuenciación. Un plásmido recombinante, que se obtuvo mediante la inserción del fragmento de ADN como se muestra en 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCgAg CT-3' en dirección directa en el sitio de restricción BbsI del plásmido pZmU3-ARNg, fue positivo y se designó como pZmU3-ARNg-C1.
El ADN de doble cadena con extremos cohesivos se formó a través de la hibridación entre C1-2HC1R y se insertó entre los dos sitios de restricción BsaI en el plásmido pBUE411, lo que resultó en un plásmido pBUE411 que contenía el sitio Cl. El plásmido positivo se verificó mediante secuenciación. Un plásmido recombinante, que se obtuvo mediante la inserción del fragmento de ADN como se muestra en 5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3' en dirección directa en el sitio de restricción BsaI del plásmido pBUE411, fue positivo y se denominó pBUE411-C1.
III. Suministro del sistema ARNg:Cas9 en protoplasto de maíz
El vector pJIT163-Ubi-Cas9 y el plásmido pZmU3-ARNg-C1 obtenidos en la etapa II se introdujeron en el protoplasto de maíz. El proceso específico incluye:
1. Cultivo de las plántulas de maíz.
Las semillas de la variedad híbrida de maíz Hill y las líneas puras B73 y Zheng58 se empaparon en agua durante toda la noche y se transfirieron a una placa que contenía papel absorbente (se adicionó agua), se trataron con luz durante 3 días para la germinación. Las semillas de maíz germinadas se cultivaron en suelo a 24 °C durante 10-11 días, para dar como resultado las plántulas de maíz.
2. Aislamiento de protoplasto
1) Se tomaron hojas tiernas de maíz, y la parte media de las mismas se cortó en hilos de 0,5-1 mm con una cuchilla cortadora, se colocaron en 50 ml de solución de enzimólisis durante 5 h de digestión (0,5 h de enzimólisis al vacío, luego 4,5 h de agitación lenta a 10 rpm).
Nota: La temperatura durante la enzimólisis debe mantenerse entre 20-25 °C, la reacción debe realizarse en la oscuridad; y la solución debe agitarse suavemente después de la reacción para liberar los protoplastos.
2) el producto de la enzimólisis se diluyó al adicionar 30 ml de W5 y se filtró en un tubo de centrífuga de fondo redondo de 50 ml mediante el uso de una membrana de filtro de nailon de 75 pm.
Nota: La membrana del filtro de nailon debe sumergirse en etanol al 75 % (porcentaje en volumen), lavarse con agua y luego remojarse en W5 durante 2 minutos antes de su uso.
3) 23°C, centrifugar 150 g por 3min, y se descartó el sobrenadante.
4) el sedimento se suspendió con 10 ml de W5, se centrifugó a 150g por 3min y se descartó el sobrenadante. 5) los protoplastos se suspendieron al adicionar una cantidad adecuada de solución de MMG, se colocaron en hielo hasta la transformación.
Nota: La concentración de los protoplastos debe determinarse por microscopía (x 100). La cantidad de protoplastos fue de 2*105/ml a 1*106/ml.
3. Transformación del protoplasto de maíz
1) Se adicionaron 10 μg del vector pJIT163-2NLSCas9 y 10 μg del plásmido pZmU3-ARNg-C1 a un tubo de centrífuga de 2 ml. Se adicionaron 200 pl del protoplasto mediante el uso de una pipeta y luego se mezcló con suaves palmaditas, se mantuvo quieto durante 3-5 min. Luego se adicionaron 220 pl de solución de PEG4000 y se mezclaron con suaves palmaditas. La transformación se realizó en la oscuridad durante 15 min;
2) Se adicionaron 880 pl de W5 (temperatura ambiente) y se mezclaron por inversión, se centrifugó a 100 g durante 3 min y se descartó el sobrenadante;
3) Se adicionó 1 ml de solución WI y se mezcló por inversión, el contenido se transfirió suavemente a una placa de 6 pocillos (con 1 ml de solución W i adicionado previamente) y luego se cultivó a 23 °C durante toda la noche. IV. Uso de experimentos de PCR/RE para analizar la mutagénesis del gen endógeno del maíz ZmIPK mediante el uso del sistema ARNg:Cas9
48 horas después de la transformación del protoplasto de maíz, se extrajo el ADN del genoma, que se usó como plantilla para el análisis del experimento de Pc R/Re (reacción en cadena de la polimerasa/digestión por restricción). Al mismo tiempo, los protoplastos de la variedad de maíz de tipo salvaje Hi II se usaron como control. El método de análisis de PCR/RE se basa enShan, Q. y otros. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Molecular Plant (2013). Dado que el fragmento diana (posiciones 393-415 de Genbank Núm. AY172635) del gen endógeno del maíz ZmIPK (Genbank No. AY172635) contiene la secuencia de reconocimiento (5'-GAGCTC-3') de la endonucleasa de restricción SacI y, por lo tanto, la endonucleasa de restricción SacI se usó en el experimento para realizar la prueba de PCR/RE. Los cebadores usados en la amplificación por PCR fueron: ZmIPK-1F: 5'-TCCGACGCCCCTGGCAGAGCAA-3';
ZmIPK-1R: 5'- GAGACCTGGGAGAAGGAGACGGATCC-3'.
Los resultados de los experimentos de PCR/RE se pueden ver en la figura 1, y los resultados mostraron que: ocurrieron mutaciones en el sitio diana del gen ZmIPK, las bandas sin cortar se recuperaron y secuenciaron, y los resultados de la secuenciación mostraron que la inserción/deleción (indel) ocurrió en el sitio diana del gen ZmIPK. V. Edición dirigida al sitio del gen endógeno de maíz ZmIPK a través del enfoque del tubo polínico
Los péptidos de penetración celular (CPP) son una clase de péptidos cortos que pueden transportar macromoléculas (incluidas proteínas y ácidos nucleicos) a las células. Un estudio reciente muestra que los péptidos que penetran en las células, cuando se unen al ADN, pueden proteger el ADN contra la degradación enzimática. Por lo tanto, los péptidos que penetran en las células se usan comúnmente en el enfoque del tubo polínico para mejorar la eficiencia.
1) Preparación de la solución de ADN que contiene CPP: se formularon CPP en polvo sólido (secuencia de aminoácidos: RKKRRQRRRRICICRRQRRR, sintetizada por Shanghai Bio-engineering Co., Ltd.) en una solución madre de 30 mg/ml con agua estéril. Se agregaron los CPP a una mezcla de plásmido pZmU3-ARNg-Cl y plásmido pJIT163-Ubi-Cas9 (la relación en peso de pZmU3-ARNg-Cl y pJIT163-Ubi-Cas9 en la mezcla es 1:1) en una relación en peso de 1:1, de manera que las concentraciones finales de ADN y CPP sean 25-30 μg/ml (la concentración final de la suma de los dos plásmidos es 25-30 μg/ml, la concentración final de CPP es 25-30 μg/ml).
2) Se seleccionaron plantas de maíz fuertes (HUI, B73 y Zheng 58) en el campo como materiales receptores. Después de la floración, los estigmas de estas plantas se embolsaron para evitar la fecundación cruzada o la autofecundación. La polinización manual se realizó en el momento adecuado. 18-21 h después de la polinización, se retiraron las bolsas y se cortaron los filamentos y las brácteas, con una longitud de 2-3 cm desde la parte superior de la mazorca retenida. La sección de corte de los filamentos es ligeramente más baja que la de las brácteas, lo que forma una pequeña ranura entre los filamentos y las brácteas, en el que se gotearon rápidamente con una pipeta 300-400 ul de solución de ADN de la etapa 1). Los filamentos se sumergieron en solución de ADN y los estigmas se embolsaron de nuevo. Cada experimento se llevó a cabo en 40-50 mazorcas de maíz. Una vez que los granos maduraron, las mazorcas de maíz se cosecharon y secaron individualmente. 3) Se cultivaron las semillas secas, y los genes mutantes de ZmIPK se detectaron con el método de PCR/RE (las etapas específicas y los cebadores usados se pueden ver en IV) después de la germinación.
Los mutantes se obtuvieron mediante el método del tubo polínico para plantas de maíz de diferentes genotipos. Los resultados de detección de algunos mutantes se muestran en las figuras 2-4, lo que indica que ocurrieron mutaciones dentro del sitio objetivo del gen ZmIPK en varias variedades de maíz. Las bandas sin cortar se recuperaron y secuenciaron, y los resultados de la secuenciación mostraron que la inserción/deleción (indel) ocurrió en el sitio diana del gen ZmIPK. Puede verse que los mutantes pueden obtenerse a nivel de la planta completa a través del enfoque del tubo polínico como se proporciona en la presente invención, que es independiente del genotipo o del receptor.
VI. Edición dirigida al sitio del gen endógeno del maíz ZmIPK a través del enfoque de regeneración del ápice del brote
1. Preparación de los materiales de maíz
1) Las semillas de maíz de la línea pura Hill se colocaron en un matraz triangular, se esterilizaron con alcohol al 70 % (v/v) durante 5 min y con hipoclorito sódico al 5 % (v/v) durante 30 min, luego se lavaron con agua estéril 5 veces. Se adicionaron 1,5 volúmenes de agua y el matraz se selló y se incubó a 28 °C durante 4-6 h.
2) Segunda esterilización. Las semillas se esterilizaron con hipoclorito sódico al 5 % (v/v) durante 30 min y luego se lavaron en agua estéril 5 veces.
3) Las semillas esterilizadas se colocaron en una placa esterilizada con papel filtro, se incubaron a 28 °C en oscuridad durante 3-4 días para la germinación. Las semillas germinadas con cultivo sincrónico se transfirieron a medio MS y se cultivaron a 28 °C en la oscuridad durante 3-4 días hasta que las plántulas alcanzaron los 4-5 cm.
2. Regeneración del ápice de brotes de maíz
1) Cortar los cogollos: el tallo se cortó transversalmente a 1,5-2 mm por encima de las juntas, lo que deja al descubierto el cogollo dentro del tallo. Luego, la yema se cortó por la mitad longitudinalmente hasta 0,2 mm por debajo de las juntas (o simplemente a través de las juntas). Se retuvo alrededor de 0,8 mm de raíz.
2) El plásmido pBUE411-C1 que contenía C1 se transformó en una célula AGL1 competente de Agrobacterium. Después de la verificación por PCR y digestión de restricción, se usó la cepa positiva para infectar las plantas. 3) La cepa positiva se sembró en medio sólido LB, se cultivó a 28 °C en la oscuridad durante 2 días. Se rasparon algunas bacterias en 20 ml de medio líquido MS, se cultivaron a 28 °C a aproximadamente la OD600=0,8. Luego se adicionó acetosiringona 200 pM.
4) Las plantas cortadas se colocaron en una placa, con las incisiones hacia abajo. La placa se colocó de forma inclinada (30-45 °C) en un dispositivo de vacío; se adicionó solución de Agrobacterium para sumergir las incisiones y permitir una infección de 20 min. Durante la infección se fijó la evacuación durante 10 min, con una presión de 0,05 MP.
5) Después de la infección, las plantas se extrajeron de la solución de Agrobacterium (el exceso de solución de Agrobacterium de las plantas se eliminó mediante el uso de papel de filtro) y se insertaron en medio MS, se cultivaron a 23 °C en la oscuridad durante 3 días.
6) Después del cocultivo, los materiales se sacaron y lavaron para eliminar el medio y luego se cultivaron en una maceta (4/5 de suelo común, 1/5 de vermiculita en la parte superior). Después del trasplante, las plántulas se cultivaron a 28 °C en la oscuridad durante 2 días y luego de 7-10 días en la luz, y luego se cultivaron en condiciones normales hasta la fructificación. Las semillas de maíz obtenidas se cultivaron y probaron para la mutación del gen ZmIPK a través del método de PCR/RE después de la germinación.
Los resultados indican que ocurrieron mutaciones en el sitio diana del gen ZmIPK. Las bandas sin cortar se recuperaron para la secuenciación. Los resultados de secuenciación indican que la inserción/deleción (indel) ocurrió en el gen ZmIPK.
VII. Determinación de si pZmU3-ARNg-C1 y pJIT163-Ubi-Cas9 están presentes en los mutantes de maíz obtenidos a través del enfoque del tubo polínico
Se diseñaron dos conjuntos de cebadores de acuerdo con las secuencias del plásmido pZmU3-ARNg-C1 y el plásmido pJIT163-Ubi-Cas9, para amplificar los dos plásmidos respectivamente.
ZmU3-HC1R ubicado entre ZmU3 y el fragmento diana:
ZmU3-F: 5'-CTGCCAAGATCAACAGCAACCA-3';
C1R: 5'- AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC -3'.
En teoría, el fragmento amplificado debería tener aproximadamente 322 pb y la secuencia debería estar en las posiciones 467-788 de SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1 es la secuencia de pZmU3-ARNg-C1.
Cas9-1H Cas9-1R ubicado en el vector pJIT163-Ubi-Cas9:
Cas9-1F: 5'-CTTCCCAAGCATTCCCTCCTGT-3';
Cas9-1R: 5'-CTTATGCCGTCCCATGACCTTC-3'.
En teoría, el fragmento amplificado debería tener aproximadamente 744 pb y la secuencia debería estar en las posiciones 1573-2316 de SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:2 es la secuencia de Cas9 en pJIT163-Ubi-Cas9.
No se amplificaron bandas diana para todas las plantas (Figura 5), lo que indica que la presente invención evita la inserción o el transporte de un transgén cuando se realiza una modificación dirigida al sitio en una planta, y el mutante obtenido tiene una bioseguridad relativamente alta.
VIII. Determinación de si pBUE411-C1 está presente en los mutantes de maíz obtenidos a través del enfoque de regeneración del ápice del brote
Se diseñaron dos conjuntos de cebadores de acuerdo con la secuencia del plásmido pBUE411-C1, para amplificar OsU3p y Cas9 respectivamente.
pBUE411-1HC1R se localiza entre OsU3p y el fragmento diana:
pBUE411-1F: 5'-GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC-3';
C1R: 5'-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'.
En teoría, el fragmento amplificado debería tener aproximadamente 289 pb y la secuencia debería estar en las posiciones 174-462 de SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:3 es la secuencia de ARNg de pBUE411-Cl.
CAS9-2H CAS9-2R se localiza en la región Cas9 en el vector pBUE411-Cl:
CAS9-2F: 5'-CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT-3';
CAS9-2R: 5'-TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC -3'.
En teoría, el fragmento amplificado debería tener aproximadamente 794 pb y la secuencia debería estar en las posiciones 1639-2432 de la SEQ ID NO:4. SEQ ID nO:4 es la secuencia Cas9 de pHSN411-Cl.
No se amplificaron las bandas diana para todas las plantas, lo que indica que la presente invención evita la inserción o el transporte de un transgén cuando se realiza una modificación dirigida al sitio en una planta, y el mutante obtenido tiene una bioseguridad relativamente alta.
Ejemplo 2. Edición dirigida al sitio del gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA a través del enfoque de inmersión de la inflorescencia
I. Diseño del fragmento diana: diana-C2
Diana-C2: 5'-CCGACGATATCCGCCGATTTCAC-3'; (posición 351-373 del gen AtPTPA como se muestra en Genbank Núm. AF360133).
II. Preparación del plásmido pHSN401 que contiene el fragmento C2
C2 es la secuencia de ADN para el ARN que se puede unir de manera complementaria a la diana-C2.
Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos monocatenarios con extremos cohesivos (subrayados):
C2F: 5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3';
C2R: 5'-AAACACGATATCCGCCGATTTCAC-3'.
El ADN de doble cadena con extremos cohesivos se formó a través de hibridación de oligonucleótidos y se insertó entre los dos sitios de restricción BsaI en el plásmido pHSN401, lo que resultó en un plásmido pHSN401 que contenía el sitio C2. El plásmido positivo se verificó mediante secuenciación. Un plásmido recombinante, que se obtuvo mediante la inserción del fragmento de ADN como se muestra en 5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3' en dirección directa en el sitio de restricción BsaI del plásmido pHSN401, fue positivo y se designó como pHSN401-C2.
III. Suministro del sistema ARNg:Cas9 en el protoplasto de Arabidopsis
El plásmido pHSN401-C2 obtenido en la etapa II se introdujo en los protoplastos de Arabidopsis ecotipo Columbia. El proceso específico incluye:
1. Cultivo de plántulas de Arabidopsis
1) Tratamiento de semillas: Semillas de Arabidopsis ecotipo Columbia se colocaron en un tubo de 1,5 ml y se remojaron en alcohol al 75 % (v/v) durante 1 min e hipoclorito sódico al 10 % (v/v) durante 15 min, luego se lavaron en agua estéril durante 5-6 veces.
2) Las semillas esterilizadas se sembraron individualmente en medio MS con una micropipeta. Las placas se sellaron y se colocaron a 4 °C, 3-4 días para la vernalización.
3) Después de la vernalización, las placas se transfirieron a una incubadora, se cultivaron en las siguientes condiciones: 25±2 °C, iluminancia 5500±300 Lx, 12h luz/día. Después de 3 semanas de cultivo, se trasplantaron las plántulas.
4) Las plántulas se trasplantaron al suelo (suelo de turba: vermiculita: perlita = 1:1:1) cuidadosamente, se cubrieron con una película durante 3-4 días y luego se cultivaron a 21 °C, 6300±300 Lx.
2. Aislamiento de protoplasto
1) Se tomaron hojas tiernas de Arabidopsis ecotipo Columbia (cultivadas durante aproximadamente 1 mes) y se cortaron en hilos de 0,5 mm mediante el uso de una cuchilla de corte, se colocaron en 50 ml de solución enzimólisis durante 5 h de digestión (0,5 h enzimólisis al vacío, luego 4,5 h de agitación lenta a 10 rpm).
Nota: La temperatura durante la enzimólisis debe mantenerse entre 20-25 °C, la reacción debe realizarse en la oscuridad; y la solución debe agitarse suavemente después de la reacción para liberar los protoplastos.
2) el producto de la enzimólisis se diluyó al adicionar 30 ml de W5 y se filtró en un tubo de centrífuga de fondo redondo de 50 ml mediante el uso de una membrana de filtro de nailon de 75 pm.
Nota: La membrana del filtro de nailon debe sumergirse en etanol al 75 % (porcentaje en volumen), lavarse con agua y luego remojarse en W5 durante 2 minutos antes de su uso.
3) 23 °C, centrifugación de 60 g por 5 min, y se descartó el sobrenadante.
4) el sedimento se resuspendió con 10 ml de W5 mediante agitación suave; se centrifugó a 60 g durante 5 min y se descartó el sobrenadante.
5) los protoplastos se suspendieron al adicionar una cantidad adecuada de solución de MMG, se colocaron en hielo hasta la transformación.
Nota: La concentración de los protoplastos debe determinarse por microscopía (x100). La cantidad de protoplastos fue de 2*105/ml a 1*106/ml.
3. Transformación del protoplasto de Arabidopsis
1) Se adicionaron 20 μg de plásmido pHSN401-C2 a un tubo de centrífuga de 2 ml. Se adicionaron 200 pl del protoplasto obtenido en la etapa 2 anterior mediante el uso de una pipeta y luego se mezcló con suaves golpecitos. Luego se adicionaron 250 |jl de PEG4000 y se mezclaron con suaves golpecitos. La transformación se realizó en la oscuridad durante 15-30 min;
2) Se adicionaron 880 j l de W5 (temperatura ambiente) y se mezclaron por inversión, se centrifugó a 60 g durante 5 min y se descartó el sobrenadante;
3) Se adicionaron 1 ml de W5 y se mezcló por inversión, el contenido se transfirió suavemente a una placa de 6 pocillos (con 1 ml de W5 adicionado previamente) y luego se cultivó a 23 °C durante toda la noche.
IV. Uso de experimentos de PCR/RE para analizar la mutagénesis dirigida al sitio del gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA mediante el uso del sistema ARNg:Cas9
48 horas después de la transformación del protoplasto de Arabidopsis, se extrajo el ADN genómico, que se usó como plantilla para el análisis del experimento de PCR/RE (reacción en cadena de la polimerasa/digestión por restricción). El método de análisis de PCR/RE se basó en Shan, Q. y otros. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Molecular Plant (2013). Dado que el fragmento diana (posiciones 351-373 de Genbank Núm. AF360133) del gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA (Genbank Núm. AF360133) contiene la secuencia de reconocimiento (5'-GATATC-3') de la endonucleasa de restricción EcoRV y, por lo tanto, se usó la endonucleasa de restricción EcoRV en el experimento para realizar la prueba de PCR/RE. Los cebadores usados en la amplificación por PCR fueron:
PTPA-F: 5'-GATGCTCCAGCCACCATATC-3';
PTPA-R: 5'- CAGTTCGGTACACCACTTATATCA-3'.
Los resultados de los experimentos de PCR/RE se pueden ver en la figura 6, y los resultados mostraron que: ocurrieron mutaciones en el sitio diana del gen AtPTPA, las bandas sin cortar en la figura 6 se recuperaron y secuenciaron, y los resultados de secuenciación mostraron que la inserción/deleción (indel) ocurrió en el sitio diana del gen AtPTPA.
V. Edición dirigida al sitio del gen endógeno de Arabidopsis AtPTPA a través del enfoque de inmersión de la inflorescencia
1) Preparación de los materiales de Arabidopsis
Los cogollos de Arabidopsis se eliminaron en la primera floración para facilitar la ramificación. Las silicuas se cortaron antes de la transformación por inmersión de la inflorescencia.
2) El plásmido pHSN401-C2 que contenía C2 se transformó en la célula GV3101 competente de Agrobacterium. Después de la verificación por PCR y digestión de restricción, se usó la cepa positiva para infectar las plantas. 3) La cepa de Agrobacterium positiva se cultivó en un tubo de 2 ml durante 8-10 h y luego se transfirió a 200 ml de medio LB (inoculado en una relación de 1:100), se cultivó durante toda la noche hasta una OD600 de aproximadamente 0,8 ~ 1,0. Las células de Agrobacterium se recogieron mediante centrifugación durante 15 min y se resuspendieron en tampón de infección (2,16 g/L de MgCl2-6H2O, 5 % de sacarosa, 0,02 % de silwet L-77) para infectar las plantas.
4) Las inflorescencias de Arabidopsis se sumergieron en 100 ml de tampón de infección contenido en una placa grande durante 2 min, con rotación continua de las plantas. Después de la infección, se eliminó el exceso de solución de Agrobacterium en las plantas mediante el uso de papel de filtro. Las plantas se cubrieron con una bolsa de plástico negra o una película para un cultivo de 24 horas en la oscuridad. Como el período de floración de Arabidopsis es relativamente largo, generalmente requiere 2-3 infecciones.
5) Las plantas se cultivaron en condiciones normales. Las semillas T1 se colectaron y cultivaron. Después de la germinación, el gen AtPTPA se evaluó mediante el uso de PCR/RE (las etapas específicas y los cebadores usados se pueden ver en IV). De las 500 plantas obtenidas, 20 son mutantes del gen AtPTPA. El ecotipo Columbia de Arabidopsis de tipo salvaje se estableció como control.
Los resultados se muestran en la figura 7, y los resultados indicaron que ocurrieron mutaciones en el sitio diana del gen AtPTPA, las bandas sin cortar en la figura 7 se recuperaron y secuenciaron, y los resultados de secuenciación mostraron que la inserción/deleción (indel) ocurrió en el sitio diana del gen AtPTPA.
6) Se realizaron aplicaciones de PCR contra los 20 mutantes obtenidos en 5) para determinar si pHSN401-C2 está presente en los mutantes. Se diseñaron 2 conjuntos de cebadores para la amplificación (diana para U6-26p y Cas9, respectivamente). pHSN401-lHC2R se localizó entre U6-26p y el fragmento diana:
pHSN401-1F: 5'-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3';
C2R: 5'-AAACACGATATCCGCCGATTTCAC-3'.
En teoría, el fragmento amplificado debería tener aproximadamente 286 pb y la secuencia debería estar en las posiciones 170-455 de s Eq ID NO:5. SEQ ID NO:5 es la secuencia parcial de ADNg en pHSN401-C2. CAS9-2H CAS9-2R se localiza en la región Cas9 del vector pHSN401-C2:
CAS9-2F: 5'-CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT-3';
CAS9-2R: 5'- TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC -3'.
En teoría, el fragmento amplificado debería tener aproximadamente 794 pb y la secuencia debería estar en las posiciones 1639-2432 de la SEQ ID NO:4. SEQ ID nO:4 es la secuencia Cas9 en pHSN401-C2.
El electroferograma en gel de la amplificación del gen mutante AtPTPA de Arabidopsis que usa los cebadores pHSN401-1HC2R en pHSN401-C2 se muestra en la figura 8a. El electroferograma en gel de la amplificación del gen mutante AtPTPA de Arabidopsis que usa los cebadores CAS9-2HCAS9-2R en pHSN401-C2 se muestra en la figura 8b. Se puede ver que no se amplificaron bandas diana en los genes mutantes AtPTPA de Arabidopsis obtenidos en 5), lo que indica que no hay ningún fragmento del sistema ADNg:Cas9 presente en los mutantes.
7) Se seleccionaron al azar 9 plantas de la progenie de los 20 mutantes obtenidos en 5) para análisis de PCR/RE y los resultados se muestran en la figura 9. Puede verse que la mutación del gen AtPTPA de Arabidopsis tal como se obtiene se puede transmitir de forma estable a la progenie. Por lo tanto, la presente invención evita la inserción o el transporte de un transgén cuando se realiza una modificación dirigida al sitio en una planta, lo que evita las preocupaciones del público sobre la seguridad del producto transgénico y también evita el proceso de cultivo de tejidos.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un método para realizar la modificación dirigida al sitio en un fragmento diana de un gen diana en una planta completa, que comprende la etapa de: expresar transitoriamente una nucleasa dirigida al sitio en dicha planta, en donde se usa una planta completa como sujeto para la expresión transitoria, y en donde dicha nucleasa dirigida al sitio se dirige a y escinde dicho fragmento diana, para lograr de esta manera la modificación dirigida al sitio a través de la autorreparación del ADN de dicha planta,
en donde la etapa de expresar transitoriamente la nucleasa dirigida al sitio comprende las siguientes etapas:
a) suministrar la nucleasa dirigida al sitio o un material genético para expresar la nucleasa dirigida al sitio en dicha planta a través de un tubo polínico, inflorescencia, ápice de brote u ovario después de la polinización, y
b) cultivar la planta obtenida en la etapa a) en ausencia de presión de selección, lo que permite la degradación de la nucleasa dirigida al sitio o el material genético no integrado en el cromosoma de la planta, y en donde se omite el cultivo de tejidos;
en donde dicho material genético es un vector recombinante o un fragmento lineal de ADN o un ARN transcrito in vitro.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el suministro de la nucleasa dirigida al sitio es a través de
a) el tubo polínico, el suministro se realiza mediante la inyección de una solución que contiene dicho vector recombinante o fragmento lineal de ADN o ARN transcrito in vitro o una solución que contiene dicha nucleasa dirigida al sitio en el estigma después de la polinización;
b) la inflorescencia, el suministro se realiza al sumergir la inflorescencia en una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta dicho vector recombinante o fragmento lineal de ADN;
c) el ápice del brote, el suministro se realiza al sumergir el ápice del brote con una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta dicho vector recombinante o fragmento lineal de ADN, y/o
d) el ovario, el suministro se realiza mediante la inyección de una solución que contiene dicho vector recombinante o fragmento lineal de ADN o ARN transcrito in vitro o una solución que contiene dicha nucleasa dirigida al sitio en el ovario después de la polinización, o mediante la inyección de una solución de Agrobacterium tumefaciens que porta dicho vector recombinante o fragmento lineal de ADN en el ovario después de la polinización.
3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque dicha nucleasa dirigida al sitio es una nucleasa CRISPR/Cas9, una nucleasa TALENs, una nucleasa con dedos de zinc o cualquier nucleasa que pueda lograr la edición del genoma, en donde
a) la nucleasa dirigida al sitio es una nucleasa CRISPR/Cas9, y el material genético está compuesto por un vector recombinante o fragmento de ADN capaz de transcribir el ARN guía y expresar la proteína Cas9; o está compuesto por un vector recombinante o fragmento de ADN capaz de transcribir el ARN guía y un vector recombinante o fragmento de ADN o ARN capaz de expresar la proteína Cas9; o está compuesto por un ARN guía y un vector recombinante o fragmento de ADN o ARN capaz de expresar la proteína Cas9; en donde el ARN guía es un ARN con estructura palindrómica que se forma por apareamiento parcial de bases entre crARN y tracrARN; el crARN contiene un fragmento de ARN que puede unirse complementariamente al fragmento diana;
b) la nucleasa dirigida al sitio es una nucleasa TALENs, y el material genético es un vector recombinante o fragmento de ADN o ARN capaz de expresar proteínas TALEN emparejadas, en donde la proteína TALEN está compuesta por un dominio de unión a ADN capaz de reconocer y unirse al sitio diana y un dominio Fok I; o
c) la nucleasa dirigida al sitio es una nucleasa con dedos de zinc, y el material genético es un vector recombinante fragmento de ADN o ARN capaz de expresar proteínas ZFN emparejadas, en donde la proteína ZFN está compuesta por un dominio de unión a ADN capaz de reconocer y unirse al sitio diana, y un dominio Fok I.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la modificación dirigida al sitio es una mutación de inserción, deleción y/o reemplazo en el fragmento diana.
5. Un método para fabricar una planta mutante libre de transgén, que comprende las siguientes etapas:
realizar una modificación dirigida al sitio en un fragmento diana de un gen diana en una planta de interés mediante el uso del método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para obtener una planta en la que se pierden las funciones del gen diana y su genoma está libre de gen exógeno integrado.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha planta es una planta de cualquier genotipo, preferentemente en donde la planta se selecciona de un grupo que consiste en maíz, trigo, soja, algodón, tabaco, Arabidopsis, centeno, Rosa roxbunghii, Eriobotrya japónica, Carica papaya, Rosa canina, Dendrobium nobile Lindi., Brassica oleracea, Fagopyrum tataricum y Hevea brasiliensis.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la planta es maíz, la nucleasa dirigida al sitio es una nucleasa CRISPR/Cas9 y el gen diana es ZmIPK.
8. El método de la reivindicación 7, en donde el fragmento diana es 5-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; el vector recombinante para la transcripción del ARN guía se obtiene mediante la inserción de un fragmento de ADN de 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3' entre los dos sitios de restricción Bbsl del plásmido pZmU3-ARNg; y el vector recombinante para expresar la nucleasa CR1SPR/Cas9 es pJIT163-Ubi-Cas9.
9. El método de la reivindicación 7, en donde el fragmento diana es 5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3', y el vector recombinante para transcribir el ARN guía y expresar la nucleasa CRISPR/Cas9 se obtiene mediante la inserción de un fragmento de ADN de 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3' entre los dos sitios de restricción Bsal del plásmido pBUE411.
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