ES2945580T3

ES2945580T3 - Composiciones de arginasas humanas genomanipuladas y procedimientos para tratar el cáncer

Info

Publication number: ES2945580T3
Application number: ES20171935T
Authority: ES
Inventors: George Georgiou; Everett Stone
Original assignee: AERase Inc
Current assignee: AERase Inc
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-11-02
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2029-11-02
Also published as: DK3064579T3; PL3064579T3; EP3064579A1; US20190000939A1; USRE46423E1; EP3778885A1; ES2574139T3; HUE062354T2; US20210128703A1; WO2010051533A2; US20240009283A1; WO2010051533A3; ES2838848T3; SMT202300162T1; US20100111925A1; PT3778885T; DK3778885T5; EP3957727A1; DK3778885T3; JP5695570B2

Abstract

Se describen composiciones farmacéuticas y usos médicos de arginasas humanas diseñadas y, en particular, entre otros, una formulación farmacéutica que comprende una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la arginasa I humana y un cofactor de metal no nativo, en el que el cofactor de metal no nativo es cobalto. ; una formulación farmacéutica que comprende una proteína Arginasa I humana que tiene un sitio de unión al metal y que comprende al menos una sustitución de aminoácido en el sitio de unión al metal, donde la proteína muestra un aumento en la hidrólisis de la arginina que da como resultado una kcat/Km de al menos dos veces mayor que la de una Arginasa I humana nativa; una formulación farmacéutica que comprende una proteína de fusión que comprende cualquiera de dichas proteínas; así como usos médicos relacionados con los anteriores. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de arginasas humanas genomanipuladas y procedimientos para tratar el cáncer Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La invención se refiere en general a una proteína arginasa I humana variante que es adecuada para su uso en el tratamiento de un cáncer que no expresa, o es de otro modo insuficiente en, argininosuccinato sintetasa (ASS), ornitina transcarbamilasa (0TC), u otras enzimas requeridas para la biosíntesis de arginina.

2. Descripción de la técnica relacionada

Se ha reconocido durante más de 50 años que determinadas células tumorales tienen una alta demanda de aminoácidos, tales como L-arginina, y se destruyen en condiciones de disminución de L-arginina (Wheatley y Campbell, 2002). En células humanas, la L-arginina se sintetiza en dos etapas; en primer lugar la argininosuccinato sintetasa (ASS) convierte L-citrulina y aspartato en argininosuccinato, seguido de conversión de argininosuccinato en L-arginina y fumarato por la argininosuccinato liasa. La propia L-citrulina se sintetiza a partir de L-ornitina y fosfato de carbamαlo por la enzima ornitina transcarbamilasa (0TC). Un gran número de carcinomas hepatocelulares, melanomas y, como se descubrió recientemente, carcinomas de células renales (Ensor et al., 2002; Feun et al., 2007; Yoon et al., 2007) no expresan ASS y por tanto son sensibles a la disminución de L-arginina. La base molecular de la carencia de expresión de ASS parece ser diversa e incluye la regulación génica anómala y defectos de empalme. Mientras que las células benignas entran en inactividad (G0) cuando disminuyen en L-arginina y por tanto permanecen viables durante varias semanas, las células tumorales tienen defectos en el ciclo celular que dan lugar a la reiniciación de la síntesis de ADN aunque se inhibe la síntesis de proteínas, lo que da como resultado a su vez importantes desequilibrios y una rápida muerte celular (Shen et al., 2006; Scott et al., 2000). La toxicidad selectiva de la disminución de L-arginina para HCC, melanoma y otras células cancerosas insuficientes en ASS se ha demostrado ampliamente in vitro, en modelos animales de xenoinjerto y en ensayos clínicos (Ensor et al., 2002; Feun et al., 2007; Shen et al., 2006; Izzo et al., 2004). Recientemente, Cheng et al. (2007) demostraron que muchas células de HCC también son insuficientes en la expresión de ornitina transcarbamilasa y, por tanto, también son susceptibles a la disminución de L-arginina enzimática.

Existe interés en el uso de enzimas hidrolíticas de L-arginina para el tratamiento del cáncer, en especial el tratamiento de hepatocarcinomas, melanomas y carcinomas de células renales, que son formas comunes de cáncer asociadas con alta morbilidad. Se han usado dos enzimas degradantes de L-arginina para el tratamiento del cáncer: arginina desiminasa bacteriana y arginasas humanas. Desafortunadamente, ambas enzimas muestran deficiencias importantes que presentan importantes impedimentos para su uso clínico (inmunogenicidad y baja actividad catalítica y muy poca estabilidad en suero, respectivamente). Por tanto, el éxito terapéutico del tratamiento de disminución de L-arginina dependerá de abordar estas deficiencias.

Sumario de la invención

La invención se refiere a una proteína arginasa I humana aislada que:

i. comprende la secuencia de aminoácidos de la arginasa I natural, opcionalmente sin el residuo de metionina N terminal; y

ii. comprende un cofactor metálico no natural que es cobalto en la forma de Co2+ para su uso en medicina. Se ha descubierto que un número de mutaciones incrementan la actividad catalítica y reducen drásticamente la Km para L-arginina en condiciones fisiológicas. En algunos modos de realización, no de acuerdo con la invención reivindicada, las mutaciones son mutaciones de sustitución seleccionadas del grupo que consiste en Asp181Ser, Ser230Cys, Ser230Gly, Cys303Phe, Cys303Ile, Glu256Gln, Asp181Glu y Ser230Ala. En algunos aspectos, la presente invención proporciona modos de realización donde dos o más mutaciones se introducen en arginasa humana. En algunos modos de realización, la proteína arginasa humana comprende al menos dos sustituciones aminoacídicas. En un modo de realización particular, las sustituciones son Asp181Glu y Ser230Ala.

En algunos aspectos, no de acuerdo con la invención reivindicada, la presente divulgación proporciona arginasas que comprenden cambios adicionales relativos a la proteína natural. En algunos modos de realización, no de acuerdo con la invención reivindicada, los cambios incluyen sustitución, deleciones (por ejemplo, parte carente de la secuencia natural), truncamientos, o una combinación de los mismos. En algunos modos de realización, no de acuerdo con la invención reivindicada, la presente divulgación también contempla arginasas naturales, en las que los únicos cambios de secuencia de aminoácidos son deleciones. En un modo de realización particular, la presente divulgación contempla una proteína arginasa I humana, en la que la proteína carece de una metionina N terminal. También se contemplan otras deleciones y mayores para las diversas arginasas mutantes descritas en el presente documento, pero no están de acuerdo con la invención reivindicada. Por ejemplo, se ha informado de arginasa truncada que carece de los 14 aminoácidos C terminales, dejando Arg-308 como el último residuo en la secuencia (Mora et al., 2000). Todavía en otro modo de realización, no de acuerdo con la invención reivindicada, la arginasa carece de los primeros 21 aminoácidos de la secuencia natural.

En algunos aspectos, la presente invención también contempla proteínas de fusión que comprenden una arginasa enlazada a una secuencia de aminoácidos distinta de arginasa. En un modo de realización, la secuencia distinta de arginasa comprende al menos una porción de la región Fc de una inmunoglobulina, por ejemplo, para incrementar la semivida de la arginasa en suero cuando se administra a un paciente. La región Fc o porción de la misma puede ser cualquier región Fc adecuada. En un modo de realización, la región Fc o porción de la misma es una región Fc de IgG. En un modo de realización, se contempla una proteína de fusión Fc-arginasa dimérica.

En un modo de realización divulgado, no de acuerdo con la invención reivindicada, la arginasa carece de una porción de la secuencia natural. En un modo de realización de la invención, la arginasa es arginasa I que carece de una metionina N terminal. En algunos modos de realización, no de acuerdo con la invención reivindicada, la arginasa contiene una sustitución que es Asp181Ser, Ser230Cys, Ser230Gly, Cys303Phe o Cys303Ile. En un modo de realización, las sustituciones son Asp181Glu y Ser230Asp.

En algunos aspectos, no de acuerdo con la invención reivindicada, la presente divulgación contempla además ácido nucleico que codifica dichas arginasas. En algunos casos, el ácido nucleico se ha optimizado con codón para la expresión en bacterias. En modos de realización particulares, la bacteria es E. coli. En otros aspectos, la presente divulgación contempla además vectores que contienen dichos ácidos nucleicos. En casos particulares, el ácido nucleico que codifica la arginasa mutante se enlaza de forma funcional a un promotor, incluyendo pero sin limitarse a promotores heterólogos. Todavía en otros aspectos, no de acuerdo con la invención reivindicada, la presente divulgación contempla además células huésped que comprenden dichos vectores. En algunos casos, las células huésped se transfectan o transforman células huésped que expresan arginasas mutantes. Las proteínas se pueden expresar de cualquier manera adecuada. En un caso, las proteínas se expresan en una célula huésped de modo que la proteína se glucosila. En otro caso, las proteínas se expresan en una célula huésped de modo que la proteína se aglucosila.

La presente invención también contempla las proteínas arginasas de la presente invención en particular para su uso en el tratamiento de cáncer. En algunos modos de realización, el cáncer es uno que no expresa, o es de otro modo insuficiente en, argininosuccinato sintetasa (ASS) u ornitina transcarbamilasa (0TC). En modos de realización particulares, el cáncer humano es un cáncer auxótrofo a arginina. En un modo de realización, no de acuerdo con la invención reivindicada, la presente divulgación contempla una formulación que comprende una proteína de fusión como se describe anteriormente para su uso en el tratamiento de cáncer en un paciente humano.

El cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer o tipo de tumor. En algunos modos de realización, el cáncer es carcinoma hepatocelular, carcinoma de células renales, melanoma, cáncer de próstata o cáncer de páncreas. En algunos casos, la formulación se adapta para administración por vía tópica, intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intraocular, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, intramuscular, subcutánea, subconjuntiva, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, oral, por inhalación, por inyección, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada con baño de células diana directamente, por medio de un catéter, o por medio de un lavado. En un modo de realización, para incrementar la semivida en suero, las variantes de arginasa descritas en el presente documento se "pegilan".

Todas las arginasas, variantes y similares mencionadas anteriormente se contemplan en un modo de realización preferente como proteínas purificadas o aisladas, y preferentemente proteínas monoméricas.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para querer decir "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere a alternativas solo o las alternativas son mutuamente exclusivas, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere a alternativas solo y a "y/o".

En toda esta solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo o procedimiento que se emplea para determinar el valor.

Siguiendo la ley de patentes tradicional, las palabras "un" y "uno," cuando se usan conjuntamente con la palabra "que comprende" en las reivindicaciones o memoria descriptiva, indican uno o más, a menos que se indique específicamente.

El término "terapéuticamente eficaz" como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad de células y/o composición terapéutica (tal como un polinucleótido terapéutico y/o polipéptido terapéutico) que se emplea en procedimientos de la presente invención para lograr un efecto terapéutico, tal como en el que al menos un síntoma de una afección que se está tratando al menos se mejora, y/o al análisis de los procedimientos o materiales usados conjuntamente con estas células.

Otros objetivos, rasgos característicos y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar además determinados aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modos de realización específicos presentada en el presente documento.

La FIG. 1 muestra las secuencias de ácido nucleico de arginasa I (SEQ ID N0:1) y arginasa II (SEQ ID N0:2).

La FIG. 2 es una fotografía de una SDS-PAGE que muestra etapas de purificación para arginasa humana I. L = escalera de peso molecular; WC = fracción celular completa, SN = sobrenadante; FT = flujo continuo a través de la columna IMAC; W = lavado de columna; E = fracción de elución de arginasa.

La FIG. 3 es un gráfico representativo de la cinética en equilibrio de la hidrólisis de L-arginina por C_0-hArgI (•) y Mn-hArgI (°) en un tampón Hepes 100 mM, pH 7,4, 37 °C. C_0-hArgI tuvo una kcat de 240 ± 14 s-1, una Km de 190 ± 40 |^j M, y kcat/KM de 1.270 ± 330 mM'1 s-1. Mn-ArgI tuvo una kcat de 300 ± 12 s-1, una Km de 2.330 ± 260 j M, y kcat/KM de 129 ± 20 mM-1 s-1.

La FIG. 4 es una curva de kcat/KM frente a pH para C_0-hArgI (•) con una rama ascendente pKa de 7,5 y Mn-hArgI (■) con una rama ascendente pKa de 8,5.

La FIG. 5 es un gráfico que muestra la estabilidad de C_0-hArgI y Mn-hArgI (1 j M) incubadas en mezcla de sueros humanos a 37 °C con el tiempo en mezcla de sueros humanos. Se extrajeron alícuotas con el tiempo y se sometieron a ensayo frente a 1 mM de L-Arg en un tampón Hepes 100 mM, pH 7,4, a 37 °C. Mn-hArgI (°) presentó una pérdida de actividad exponencial con una semivida T12 de 4,8 ± 0,8 h. Por el contrario, C_0-hArgI (•) presentó una pérdida de actividad bifásica con una primera T1^ aparente de 6,1 ± 0,6 h seguido de una segunda T1^ mucho mayor de 37 ± 3 h.

La FIG. 6 es un gráfico que muestra trazas de HPLC de los 20 aminoácidos estándar incubados con C_0-hArgI (panel superior) o bien tampón de diálisis (panel inferior). C_0-hArgI incubada con los 20 aminoácidos estándar dio como resultado una pérdida de un único pico a TR = 12,3 min, coincidiendo con el de los controles de L-arginina, y la aparición de un único nuevo pico a TR = 18,8 min, coincidiendo con el de los controles de L-ornitina.

Las FIGS. 7A-B son gráficos que muestran la supervivencia de HCC en cultivo tisular cuando se trata con diversas variantes de arginasa (junto con controles). La FIG. 7A demuestra la supervivencia de tejido tisular con HCC (Hep3b) cuando se trata con arginasa 0-100 nM (día 5). Mn-hArgI (A), dio como resultado una CI50 aparente de 5 ± 0,3 nM (~ 0,18 jg/ml). Las incubaciones con C_0-hArgI (•) dan lugar a un incremento de 15 veces en la citotoxicidad con una CI50 aparente de 0,33 ± 0,02 nM (~ 0,012 jg/ml). La FIG. 7B es un gráfico que muestra el efecto de hArgI sobre el crecimiento de células de melanoma A375 (día 5). Mn-hArgI (A), dio como resultado una CI 50 aparente de 4,1 ± 0,1 nM (~ 0,15 jg/ml). La incubación con C_0-hArgI (•) da lugar a un incremento de 13 veces en la citotoxicidad con una CI50 aparente de 0,32 ± 0,06 nM (~ 0,012 jg/ml).

La FIG. 8 es una fotografía de un gel electroforético no desnaturalizante que muestra que la variante hArgI-E256Q es monomérica a diferencia de h-ArgI natural trimérica.

La FIG. 9 es un gráfico representativo de la cinética en equilibrio de la hidrólisis de L-arginina por C_0-hArg-II (•) y Mn-hArg-II (°). Hidrólisis por hArg-II sustituida con cobalto (•) de L-Arg a pH 7,4 y 37 °C, con una kcat de 182 ± 7 s-1, una Km de 126 ± 18 j M, y una kcat/KM de 1.440 ± 260 mM’V . Hidrólisis por hArg-II sustituida con manganeso (°) de L-Arg a pH 7,4 y 37 °C, con una kcat de 48 ± 2 s-1, una K^mde 2.900 ± 300 ^jM, y kcat/KM de 17 ± 2 mM-1 s-1.

La FIG. 10 es un gráfico que muestra la disminución de L-arginina en suero en el modelo de ratón. Las concentraciones de L-Arg séricas de ratones Balb/c tratados con una única dosis i.p. de C_0-hArgI se mantienen < a 3-4 j M durante 3 días.

La FIG. 11 es un gráfico que muestra reducción de xenoinjerto tumoral de HCC cuando se trata con C_0-hArgI en comparación con los controles. Se trataron ratones atímicos que portan xenoinjertos tumorales de Hep3b dos veces por inyección i.p. con PBS (°) o bien C_0-hArgI (•) el día 9 y el día 12. Se observó reducción tumoral en los ratones tratados con C_0-hArgI mientras que los tumores tratados con PBS crecieron sin control.

La FIG. 12 es una SDS-PAGE al 14-20 % que muestra hArgI conjugada a PEG MW 5000, con un MW aparente de ~150 kDa.

Descripción de los modos de realización ilustrativos

La invención en general se refiere a una proteína arginasa I humana aislada como se describe anteriormente. La invención también se refiere a una proteína arginasa I humana variante para su uso en el tratamiento de cáncer. En algunos modos de realización, el cáncer es uno que no expresa, o es de otro modo insuficiente en, argininosuccinato sintetasa (ASS), ornitina transcarbamilasa (0TC) u otras enzimas requeridas para la biosíntesis de arginina u otras enzimas requeridas para la biosíntesis de arginina. La proteína arginasa I se puede fusionar a otros polipéptidos o conjugarse a polímeros que incrementan la persistencia en suero, por ejemplo, polietilenglicol de alto peso molecular

I. Arginasa

La arginasa es una enzima que contiene manganeso. Es la enzima final del ciclo de la urea. La arginasa es la etapa quinta y final del ciclo de la urea, una serie de reacciones biofísicas en mamíferos durante las que el cuerpo deshecha el amoníaco nocivo. Específicamente, la arginasa convierte L-arginina en L-ornitina y urea. L-arginina es el sustrato donador de nitrógeno para la óxido nítrico sintasa (N0S), que produce L-citrulina y N0. Aunque se ha informado de que la Km de arginasa (2-5 mM) es mucho mayor que la de N0S para L-arginina (2 20 |^j M), la arginasa también puede desempeñar un papel en la regulación de la actividad de N0S. En determinadas condiciones la arginasa I está Cys-S-nitrosilada, lo que da como resultado una mayor afinidad por L-arginina y una reducción en la disponibilidad de sustrato para N0S.

La arginasa es una enzima homotrimérica con un pliegue a/p de una lámina p de ocho ramas paralela rodeada por varias hélices. La enzima contiene una agrupación metálica dinuclear que es esencial para generar un hidróxido para el ataque nucleófilo sobre el carbono de guanidinio de L-arginina. El metal natural para arginasa es Mn2+. Estos iones Mn2+ coordinan el agua, orienta y estabilizan la molécula y permiten que el agua actúe como nucleófilo y ataque a L-arginina, hidrolizándola en ornitina y urea.

Los mamíferos tienen dos isozimas de arginasa (EC 3.5.3.1) que catalizan la hidrólisis de L-arginina a urea y L-ornitina. El gen de la arginasa I se localiza en el cromosoma 6 (6q.23), se expresa altamente en el citosol de hepatocitos, y funciona en la retirada de nitrógeno como la etapa final del ciclo de la urea. El gen de la arginasa II se encuentra en el cromosoma 14 (14q.24.1). La arginasa II se localiza mitocondrialmente en tejidos tales como riñón, cerebro y músculo esquelético, donde se cree que proporciona un suministro de L-ornitina para la biosíntesis de prolina y poliamina (Lopez et al., 2005).

Las arginasas se han investigado durante casi 50 años como un procedimiento para degradar la L-arginina extracelular (Dillon et al., 2002). Se han logrado algunos resultados clínicos prometedores introduciendo arginasa por embolización arterial transhepática; después de esto, varios pacientes experimentaron remisión parcial de HCC (Cheng et al., 2005). Sin embargo, puesto que la arginasa tiene una Km alta (~2-5 mM) y presenta actividad muy baja a valores de pH fisiológico, se requiere una dosificación alta para propósitos quimioterápicos (Dillon et al., 2002). Aunque la arginasa natural se aclara de la circulación en minutos (Savoca et al., 1984), una única inyección de PEG-arginasa MW5000 en ratas fue suficiente para lograr una disminución de arginina casi completa durante ~3 días (Cheng et al., 2007).

Cheng et al. realizaron la sorprendente observación de que muchas líneas celulares de HCC humano no expresan 0TC (además de a Ss ) y por tanto son susceptibles para PEG-arginasa (Cheng et al., 2007). En ratones con implante de células de hepatocarcinoma Hep3b la administración semanal de PEG-arginasa dio como resultado un retardo en el crecimiento tumoral que se acentuó por la coadministración de 5-fluorouracilo (5-FU). Sin embargo, se usó PEG-arginasa a las dosis muy altas que no son prácticas para tratamiento humano, lo que refleja su menor actividad fisiológica.

Para abordar estos problemas se ha sometido a prueba in vitro una enzimática hidrolizante de arginina bacteriana, arginina desiminasa o ADI que presenta buena cinética y estabilidad. Una forma PEGilada de ADI se está sometiendo ahora a ensayos clínicos de fase II/III. Desafortunadamente, ADI es una enzima bacteriana y por lo tanto induce fuertes respuestas inmunitarias y efectos adversos en la mayoría de los pacientes. Sin embargo, para los pacientes que no desarrollan respuestas adversas significativas, un porcentaje impresionante presenta enfermedad estable o remisión. No obstante, debido a su perfil inmunológico desfavorable no es probable que la disminución de L-arginina por ADI se convierta en un tratamiento aceptado para el cáncer de hígado.

Para uso clínico, es esencial que la arginasa se genomanipule para permitir que persista durante largos períodos (por ejemplo, días) en circulación. En ausencia de cualquier modificación, la arginasa humana tiene una semivida de solo unos pocos minutos en circulación principalmente debido a que su tamaño no es suficiente grande para evitar su filtración a través de los riñones. La arginasa humana sin modificar es muy susceptible a desactivación en suero y se degrada con una semivida de solo cuatro horas. Por lo tanto, la presente invención desarrolló formas novedosas y mejoradas de arginasa para investigación clínica y uso terapéutico potencial con una persistencia en circulación mejorada.

II. Variantes de arginasa

L-arginina es el único sustrato para la óxido nítrico sintasa (N0S), que produce L-citrulina y N0. Aunque se ha informado de que la K^m de arginasa (2-5 mM) es mucho mayor que la de N0S para L-arginina (2-20 ^jM), la arginasa también puede desempeñar un papel en la regulación de la actividad de N0S (Durante et al., 2007). En determinadas condiciones la arginasa I está Cys-S-nitrosilada, lo que da como resultado una mayor afinidad por L-arginina y una reducción en la disponibilidad de sustrato para N0S (Santhanam et al., 2007). La arginasa es una enzima homotrimérica con un pliegue a/p de una lámina p de ocho ramas paralela rodeada por varias hélices. La enzima contiene una agrupación metálica dinuclear que es esencial para generar un hidróxido para el ataque nucleófilo sobre el carbono de guanidinio de L-arginina (Cama et al., 2003; Dowling et al., 2008). El metal natural para arginasa es Mn2+. La arginasa con el metal natural (es decir, Mn2+) presenta un pH óptimo de 9. A pH fisiológico, la enzima presenta una kcat/Km más de 10 veces menor en la hidrólisis de L-arginina (FIG. 4). La actividad catalítica baja por la arginasa humana auténtica con la enzima Mn2+ natural presenta un problema para el tratamiento humano puesto que significa que se han de usar dosis poco prácticas de la enzima para lograr una reducción terapéuticamente pertinente en los niveles plasmáticos de L-arginina.

La presente invención contempla arginasas mutantes en las que el cofactor de metal natural (Mn2+) se reemplaza con cobalto (Co2+). La incorporación de Co2+ en lugar de Mn2+ en arginasa humana I o arginasa humana II da como resultado una actividad drásticamente mayor a pH fisiológico. Se descubrió que una enzima que contiene Co2+ ("C_0-hArgI") presentó un incremento de 10 veces en kcat/KM in vitro a pH 7,4, lo que a su vez se traduce en un incremento de 15 veces en la citotoxicidad de HCC y un incremento de 13 veces en la citotoxicidad de melanoma en comparación con la arginasa humana I que contiene Mn2+. También se descubrió que una preparación farmacológica de C_0-hArgI podía aclarar la L-Arg sérica durante 3 días en ratones con una única inyección. Además, se descubrió que una preparación farmacológica de C_0-hArgI podía reducir xenoinjertos tumorales de HCC en ratones atímicos mientras que Mn-hArgI solo mostró crecimiento tumoral (Ensor, Holsberg et al., 2002).

La presente invención proporciona una proteína arginasa humana que comprende al menos una sustitución aminoacídica en el sitio de unión a metal. La estructura de arginasa muestra una hendidura de sitio activo que contiene dos iones Mn2+, con el ion más profundamente localizado designado MnA coordinado a H101, D124, D128, D232 y con puente de hidróxido. El otro metal se designa MnB y se coordina por H126, D124, D232, D234 y por puente de hidróxido (Christianson y Cox, 1999). Los residuos que comprenden el sitio de unión a metal para la primera capa de arginasa I son H101, D124, H126, D128, D232 y D234 y para la segunda capa son W122, D181 y S230. De forma similar, los residuos que comprenden el sitio de unión a metal para la primera capa de arginasa II son H120, D143, H145, D147, D251, D253 y para la segunda capa son W141, D200, S249. Se ha mostrado que la arginasa requiere ambos iones Mn2+ para una actividad total, sin embargo MnA se puede disociar reversiblemente dando como resultado una enzima con la mitad de su actividad catalítica (Scolnick et al., 1997). El metal (A) de hArgI se coordina al imidazol de H101, que a su vez se une por hidrógeno al hidroxilo de S230. El metal (B) de hArgI se coordina al imidazol de H126, que tiene un enlace de hidrógeno de 2.a capa con el carboxilo de D181. Las posiciones implicadas en la unión del metal se sometieron a mutagénesis de saturación se cribaron las colecciones resultantes usando un ensayo de placa de pocillos de microvaloración para determinar la actividad de arginasa (descrito con más detalle a continuación en los ejemplos) para aislar clones que expresan proteínas que presentan mayor actividad catalítica. Se identificaron clones novedosos por secuenciación, se retransformaron en E. coli (BL21) y se purificaron y caracterizaron cinéticamente como se describe a continuación en los ejemplos. Las variantes que presentan actividad aparente > a la natural se purificaron a mayor escala y se sometieron a ensayo para determinar sus parámetros cinéticos en equilibrio de kcat y Km. Se descubrió que las siguientes variantes tienen mayores constantes kcat/KM que C_0-hArgI: D181S, D181E/S230A (mutante doble que contiene dos sustituciones). De forma similar, se descubrió que las sustituciones aminoacídicas S230C y S230G tienen en particular un efecto importante sobre la actividad catalítica y también sobre la estabilidad en suero. Adicionalmente, los aminoácidos retirados del sitio de unión a metal también se sometieron a mutagénesis de saturación combinatoria. Por ejemplo, se descubrió que una sustitución C303P en C_0-hArg I confirió una kcat/KMi 10 veces mayor con relación a la Mn-hArg I natural a pH 7,4. Muchas de estas formas variantes o mutantes de la arginasa se contemplan para su uso en el tratamiento de cáncer, incluyendo cuando se preparan como proteínas de fusión, por ejemplo con una región Fc (o porción de la misma) de una inmunoglobulina (para incrementar la semivida).

Las variantes Cys303 también se sometieron a prueba para determinar su estabilidad en suero. Se descubrió que una variante C303P, es decir, una única sustitución aminoacídica en arginasa, presenta un incremento de un ~60 % en estabilidad en suero que a su vez se traduce en un incremento de 30 veces en citotoxicidad de HCC en comparación con la enzima sustituida con Mn a pH 7,4. En un modo de realización, la presente invención contempla el tratamiento con esta enzima novedosa o esta enzima novedosa con otras mutaciones. En un modo de realización particular, esta enzima novedosa se emplea para el tratamiento como una proteína de fusión arginasa-Fc que capitaliza el reciclado endosómico del dominio Fc de IgG para garantizar una persistencia en suero larga de la variante de arginasa. La persistencia en suero larga mejora el uso de arginasa como producto terapéutico.

111. Pegilación

En determinados aspectos de la invención, se divulgan procedimientos y composiciones relativas a arginasa pegilada. Específicamente, la pegilación de arginasa en un residuo cisteína genomanipulado (por ejemplo, sustituyendo el tercer residuo N terminal) se puede usar para producir una composición de arginasa pegilada homogénea. También se divulgan procedimientos para el aislamiento de arginasa pegilada en base a interrupción temporal de la polimerización.

La pegilación es el procedimiento de unión covalente de cadenas poliméricas de poli(etilenglicol) a otra molécula, normalmente un fármaco o proteína terapéutica. La pegilación se logra de forma rutinaria por incubación de un derivado reactivo de PEG con la macromolécula objetivo. La unión covalente de PEG a un fármaco o proteína terapéutica puede "ocultar" al agente del sistema inmunitario del huésped (reducción en inmunogenicidad y antigenicidad), incrementar el tamaño hidrodinámico (tamaño en solución) del agente lo que prolonga su tiempo circulatorio reduciendo el aclaramiento renal. La pegilación también puede proporcionar solubilidad en agua en proteínas y fármacos hidrófobos.

La primera etapa en la pegilación es la funcionalización adecuada del polímero PEG en uno o ambos extremos. Los PEG que se activan en cada extremo con el mismo resto reactivo son conocidos como "homobifuncionales", mientras que si los grupos funcionales presentes son diferentes, a continuación el derivado PEG se denomina "heterobifuncional" o "heterofuncional". Los derivados químicamente activos o activados del polímero PEG se preparan para unir el PEG a la molécula deseada.

La elección del grupo funcional adecuado para el derivado PEG se basa en el tipo de grupo reactivo disponible en la molécula que se acoplará al PEG. Para proteínas, los aminoácidos reactivos típicos incluyen lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina, tirosina. El grupo amino N terminal y el ácido carboxílico C terminal también se pueden usar.

Las técnicas usadas para formar los derivados PEG de primera generación son en general hacer reaccionar el polímero PEG con un grupo que es reactivo con grupos hidroxilo, típicamente anhídridos, cloruros de ácido, cloroformiatos y carbonatos. En la química de pegilación de segunda generación, grupos funcionales más eficaces tales como aldehído, ésteres, amidas, etc. están disponibles para conjugación.

Como las aplicaciones de pegilación se han vuelto cada vez más avanzadas y sofisticadas, ha habido un incremento en la necesidad de PEG heterobifuncionales para conjugación. Estos PEG heterobifuncionales son muy útiles enlazando dos entidades, donde se necesita un espaciador hidrófilo, flexible y biocompatible. Los grupos finales preferentes para PEG heterobifuncionales son maleimida, vinilsulfonas, piridildisulfuro, amina, ácidos carboxílicos y ésteres NHS.

Los agentes de modificación más comunes, o conectores, se basan en moléculas metoxi-PEG (mPEG). Su actividad depende de añadir un grupo modificador de proteína al extremo alcohol. En algunos casos se usa polietilenglicol (PEG-diol) como molécula precursora. El diol se modifica posteriormente en ambos extremos para hacer una molécula enlazada a PEG hetero u homodimérica (como se muestra en el ejemplo con PEG bisvinilsulfona).

Las proteínas en general se PEGilan en sitios nucleófilos tales como tioles no protonados (residuos cisteinilo) o grupos amino. Los ejemplos de reactivos de modificación específicos de cisteinilo incluyen PEG-maleimida, PEG-yodoacetato, PEG-tioles y PEG-vinilsulfona. Los cuatro son fuertemente específicos para cisteinilo en condiciones leves y a pH de neutro a ligeramente alcalino pero cada uno tiene algunas desventajas. La amida formada con las maleimidas puede ser de algún modo inestable en condiciones alcalinas por lo que puede haber alguna limitación en las opciones de formulación con este conector. El enlace de amida formado con yodo-PEG es más estable, pero el yodo libre puede modificar los residuos de tirosina en algunas condiciones. Los PEG-tioles forman enlaces disulfuro con tioles de proteína, pero este enlace también puede ser inestable en condiciones alcalinas. La reactividad de PEG-vinilsulfona es relativamente lenta en comparación con maleimida y

yodo-PEG; sin embargo, el enlace tioéter formado es bastante estable. Su velocidad de reacción más lenta

también puede hacer que la reacción de PEG-vinilsulfona sea más fácil de controlar.

La pegilación específica de sitio en residuos de cisteinilo naturales rara vez se lleva a cabo, puesto que estos

residuos están normalmente en forma de enlaces disulfuro o se requieren para la actividad biológica. Por otra

parte, la mutagénesis dirigida a sitio se puede usar para incorporar sitios de pegilación de cisteinilo para conectores específicos de tiol. La mutación de cisteína se debe diseñar de modo que sea accesible al reactivo de pegilación y todavía sea biológicamente activa después de la pegilación.

Los agentes de modificación específicos de amina incluyen PEG-éster NHS, PEG-tresilato, PEG-aldehído, PEG-isotiocianato, y varios otros. Todos reaccionan en condiciones leves y son específicos para grupos amino. El

PEG-éster NHS es probablemente uno de los agentes más reactivos; sin embargo, su alta reactividad puede

hacer que la reacción de pegilación sea difícil de controlar a gran escala. El PEG-aldehído forma una imina con

el grupo amino, que a continuación se reduce a una amina secundaria con cianoborohidruro de sodio. A diferencia de borohidruro de sodio, el cianoborohidruro de sodio no reducirá los enlaces disulfuro. Sin embargo;

este producto químico es altamente tóxico y se debe manejar con cuidado, en particular a menor pH donde se

vuelve volátil.

Debido a los múltiples residuos de lisina en la mayoría de las proteínas, la pegilación específica de sitio puede

ser un reto. Afortunadamente, debido a que estos reactivos reaccionan con grupos amino no protonados, es

posible dirigir la pegilación a grupos amino de menor pK realizando la reacción a un menor pH. En general, el pK

del grupo amino alfa es 1-2 unidades de pH menor que el grupo amino épsilon de los residuos lisina. Al PEGilar

la molécula a pH 7 o inferior, se puede lograr una selectividad alta para el extremo N con frecuencia. Sin embargo; esto solo es factible si la porción N terminal de la proteína no se requiere para la actividad biológica.

Todavía, los beneficios farmacocinéticos de la pegilación con frecuencia superarán una pérdida significativa de la bioactividad in vitro, dando como resultado un producto con una bioactividad in vivo mucho mayor independientemente de la química de pegilación.

Existen varios parámetros a considerar cuando se desarrolla un procedimiento de pegilación. Afortunadamente, normalmente no existen más de cuatro o cinco parámetros clave. El enfoque de "diseño de experimentos" para la optimización de las condiciones de pegilación puede ser muy útil. Para las reacciones de pegilación específicas

de tiol, los parámetros a considerar incluyen: concentración de proteína, proporción de PEG con respecto a

proteína (en una base molar), temperatura, pH, tiempo de reacción, y en algunos casos, la exclusión de oxígeno.

(El oxígeno puede contribuir a la formación de disulfuro intermolecular por la proteína, lo que reducirá el rendimiento del producto PEGilado.) Los mismos factores se deben considerar (con la excepción del oxígeno)

para la modificación específica de amina excepto en que el pH puede ser incluso más crítico, en particular

cuando selecciona el grupo amino N terminal.

Para las modificaciones específicas tanto de amina como de tiol, las condiciones de reacción pueden afectar a la estabilidad de la proteína. Esto puede limitar la temperatura, concentración de proteína y pH. Además, la reactividad del conector PEG se debe conocer antes de comenzar la reacción de pegilación. Por ejemplo, si el

agente de pegilación solo es un 70 por ciento activo, la cantidad de PEG usada debe garantizar que solo las moléculas de PEG activas se cuentan en la estequiometría de la reacción de proteína con respecto a PEG.

Cómo determinar la reactividad y calidad de PEG se describirá después.

IV. Proteínas y péptidos

En determinados modos de realización, la presente invención se refiere a composiciones novedosas que comprenden al menos una proteína o péptido, tales como multímeros de arginasa estabilizados. Estos péptidos

pueden estar comprendidos en una proteína de fusión o conjugados a un agente como se describe supra.

A. Proteínas y péptidos

Como se usa en el presente documento, una proteína o péptido en general se refiere, pero no se limita a, una

proteína mayor de aproximadamente 200 aminoácidos, hasta una secuencia de longitud completa traducida de

un gen; un polipéptido mayor de aproximadamente 100 aminoácidos; y/o un péptido de desde aproximadamente

3 a aproximadamente 100 aminoácidos. Por comodidad, los términos "proteína," "polipéptido" y "péptido" se usan

de manera intercambiable en el presente documento.

En determinados modos de realización, el tamaño de al menos una proteína o péptido puede comprender, pero

no se limita a, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,

30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 275, aproximadamente 300, aproximadamente 325, aproximadamente 350, aproximadamente 375, aproximadamente 400, aproximadamente 425, aproximadamente 450, aproximadamente 475, aproximadamente 500, aproximadamente 525, aproximadamente 550, aproximadamente 575, aproximadamente 600, aproximadamente 625, aproximadamente 650, aproximadamente 675, aproximadamente 700, aproximadamente 725, aproximadamente 750, aproximadamente 775, aproximadamente 800, aproximadamente 825, aproximadamente 850, aproximadamente 875, aproximadamente 900, aproximadamente 925, aproximadamente 950, aproximadamente 975, aproximadamente 1000, aproximadamente 1100, aproximadamente 1200, aproximadamente 1300, aproximadamente 1400, aproximadamente 1500, aproximadamente 1750, aproximadamente 2000, aproximadamente 2250, aproximadamente 2500 o más residuos aminoacídicos.

Como se usa en el presente documento, un "residuo aminoacídico" se refiere a cualquier aminoácido natural, cualquier derivado de aminoácido o cualquier imitador de aminoácido conocido en la técnica. En determinados modos de realización, los residuos de la proteína o péptido son secuenciales, sin ninguna interrupción no aminoacídica en la secuencia de residuos aminoacídicos. En otros modos de realización, la secuencia puede comprender uno o más restos no aminoacídicos. En modos de realización particulares, la secuencia de residuos de la proteína o péptido se puede interrumpir por uno o más restos no aminoacídicos.

En consecuencia, el término "proteína o péptido" engloba secuencias de aminoácidos que comprenden al menos uno de 20 aminoácidos comunes hallados en proteínas naturales, o al menos un aminoácido modificado o inusual, incluyendo pero sin limitarse a los mostrados en la tabla 1 a continuación.

Las proteínas o péptidos se pueden preparar por cualquier técnica conocida para los expertos en la técnica, incluyendo la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos a través de técnicas de biología molecular estándar, el aislamiento de proteínas o péptidos de fuentes naturales o la síntesis química de proteínas o péptidos. Se han divulgado previamente las secuencias de polipéptidos y péptidos, nucleótidos y proteínas, correspondientes a diversos genes, y se pueden encontrar en bases de datos informatizadas conocidas por los expertos en la técnica. Una de dichas bases de datos es National Center for Biotechnology Information's Genbank y las bases de datos GenPept (disponibles en Internet en ncbi.nlm.nih.gov/). Las regiones codificantes para genes conocidos se pueden amplificar y/o expresar usando las técnicas divulgadas en el presente documento o como será conocido para los expertos en la técnica.

De forma alternativa, diversas preparaciones comerciales de proteínas, polipéptidos y péptidos son conocidas para los expertos en la técnica.

B. Ácidos nucleicos y vectores

En determinados aspectos de la invención, no de acuerdo con la invención reivindicada, se pueden divulgar secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión como arginasa multimérica estabilizada. Dependiendo del sistema de expresión que se va a usar, las secuencias de ácido nucleico se pueden seleccionar en base a procedimientos convencionales. Por ejemplo, la arginasa humana I y II contienen múltiples codones que se utilizan raramente en E. coli que pueden interferir con la expresión, por lo tanto los respectivos genes o variantes de los mismos se pueden optimizar con codón para la expresión en E. coli. También se pueden usar diversos vectores para expresar la proteína de interés, tal como una arginasa multimérica de fusión o una arginasa sustituida con cisteína. Los vectores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vectores plasmídicos, vectores víricos, vectores basados en liposoma o transposón.

C. Células huésped

Las células huésped, preferentemente células eucariotas, útiles en la presente invención son cualquiera que se pueda transformar para permitir la expresión y secreción de arginasa y multímeros de fusión de la misma. Las células huésped pueden ser bacterias, células de mamífero, levadura u hongos filamentosos. Diversas bacterias incluyen Escherichia y Bacillus. Las levaduras que pertenecen a los géneros Saccharomyces, Kiuyveromyces, Hansenula o Pichia encontrarán uso como célula huésped apropiada. Se pueden usar diversas especies de hongos filamentosos como huéspedes de expresión incluyendo los siguientes géneros: Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus y Pyricularia. Los ejemplos de organismos huésped utilizables incluyen bacterias, por ejemplo, Escherichia coli MC1061, derivados de Bacillus subtilis BRB1 (Sibakov et al., 1984), Staphylococcus aureus SAI123 (Lordanescu, 1975) o Streptococcus lividans (Hopwood et al., 1985); levaduras, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae AH 22 (Mellor et al., 1983) y Schizosaccharomyces pombe; hongos filamentosos, por ejemplo, Aspergillus nidulans, Aspergillus awamori (Ward, 1989), Trichoderma reesei (Penttila et al., 1987; Harkki et al, 1989).

Los ejemplos de células huésped de mamífero incluyen células de ovario de hámster chino (CH0-K1; ATCC CCL61), células de pituitaria de rata (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2,2), células de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCCCRL 1548), células de riñón de mono transformadas por SV40 (C0S-1; ATCC CRL 1650) y células embrionarias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Los anteriores son ilustrativos pero no limitativos de muchos organismos huésped posibles conocidos en la técnica. En principio, se pueden usar todos los huéspedes capaces de secreción sean procariotas o eucariotas.

Las células huésped de mamífero que expresan la arginasa y/o sus multímeros de fusión se cultivan en condiciones típicamente empleadas para el cultivo de la línea celular original. En general, las células se cultivan en un medio estándar que contiene sales fisiológicas y nutrientes, tales como RPMI, MEM, IMEM o DMEM estándar, típicamente complementado con suero al 5-10%, tal como suero fetal bovino. Las condiciones de cultivo también son estándar, por ejemplo, los cultivos se incuban a 37 °C en cultivos estacionarios o continuos hasta que se logran los niveles deseados de las proteínas.

D. Purificación de proteínas

Las técnicas de purificación de proteínas son bien conocidas para los expertos en la técnica. Estas técnicas implican, en un nivel, la homogeneización y fraccionamiento bruto de las células, tejido u órgano en fracciones polipeptídicas y no polipeptídicas. La proteína o polipéptido de interés se puede purificar además usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr una purificación parcial o completa (o purificación hasta homogeneidad) a menos que se especifique de otro modo. Los procedimientos analíticos en particular adecuados para la preparación de un péptido puro son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión en gel, electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad y enfoque isoeléctrico. Un procedimiento eficaz en particular de purificación de péptidos es la cromatografía de líquidos de rápida resolución (FPLC) o incluso cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC).

Una proteína o péptido purificado pretende referirse a una composición, aislable de otros componentes, en la que la proteína o péptido se purifica a cualquier grado con relación a su estado obtenible de forma natural. Una proteína o péptido aislado o purificado, por lo tanto, también se refiere a una proteína o péptido libre del entorno en el que se puede producir de forma natural. En general, "purificado" se referirá a una composición de proteína o péptido que se ha sometido a fraccionamiento para retirar diversos otros componentes, y composición que sustancialmente mantiene su actividad biológica expresada. Cuando se usa el término "sustancialmente purificado", esta designación se referirá a una composición en la que la proteína o péptido forma en principal componente de la composición, tal como constituyendo aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, o más de las proteínas en la composición.

Diversas técnicas adecuadas para su uso en la purificación de proteínas son bien conocidas para los expertos en la técnica. Estas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y similares, o por desnaturalización térmica, seguido de: centrifugación; etapas de cromatografía tales como intercambio iónico, filtración en gel, fase inversa, hidroxilapatita y cromatografía de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de estas y otras técnicas. Como es conocido en general en la técnica, se cree que el orden de realización de las diversas etapas de purificación se puede cambiar, o que determinadas etapas se pueden omitir, y todavía dar como resultado un procedimiento adecuado para la preparación de una proteína o péptido sustancialmente purificado.

Diversos procedimientos para cuantificar el grado de purificación de la proteína o péptido son conocidos para los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa, o evaluar la cantidad de polipéptidos dentro de una fracción por análisis SDS/PAGE. Un procedimiento preferente para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, compararla con la actividad específica del extracto inicial, y por tanto calcular el grado de pureza en el mismo, evaluado por un "número de purificación en veces". Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad dependerán, por supuesto, de la técnica de ensayo particular elegida para seguir la purificación, y de si la proteína o péptido expresado presenta o no una actividad detectable.

No existe un requisito general de que la proteína o péptido se proporcione siempre en su estado más purificado. De hecho, se contempla que los productos sustancialmente menos purificados pueden tener utilidad en determinados modos de realización. La purificación parcial se puede lograr usando menos etapas de purificación en combinación, o utilizando formas diferentes del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato HPLC en general dará como resultado una purificación en "veces" mayor que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía a baja presión. Los procedimientos que presentan un menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto de proteína, o en mantener la actividad de una proteína expresada.

En determinados modos de realización, una proteína o péptido se puede aislar o purificar, por ejemplo, una proteína de fusión multimérica estabilizada con arginasa, o una arginasa previa o posterior a la pegilación. Por ejemplo, una marca His o un epítopo de afinidad puede estar comprendido en una variante de arginasa de este tipo para facilitar la purificación. La cromatografía de afinidad es un procedimiento cromatográfico que se basa en la afinidad específica entre una sustancia que se va a aislar y una molécula a la que se puede unir específicamente. Este es un tipo de interacción receptor-ligando. El material de columna se sintetiza acoplando covalentemente uno de los compañeros de unión a una matriz insoluble. El material de columna es una continuación que puede adsorber específicamente la sustancia de la solución. La elución se produce cambiando las condiciones a aquella en las que no se producirá unión (por ejemplo, alteración en pH, fuerza iónica, temperatura, etc.). La matriz debe ser una sustancia que por sí misma no absorbe moléculas en cualquier grado significativo y que tiene un amplio intervalo de estabilidad química, física y térmica. El ligando se debe acoplar de tal forma que no afecte a sus propiedades de unión. El ligando también debe proporcionar unión relativamente estrecha. Y debe ser posible eluir la sustancia sin destruir la muestra o el ligando.

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es un procedimiento cromatográfico en el que las moléculas en solución se separan en base a su tamaño, o en términos más técnicos, su volumen hidrodinámico. Normalmente se aplica a moléculas grandes o complejos macromoleculares tales como proteínas y polímeros industriales. Típicamente, cuando se usa una solución acuosa para transportar la muestra a través de la columna, la técnica es conocida como cromatografía de filtración en gel, frente a la llamada cromatografía de permeación en gel que se usa cuando se usa un disolvente orgánico como fase móvil.

El principio subyacente de SEC es que las partículas de diferentes tamaños se eluirán (filtrarán) a través de una fase estacionaria a diferentes velocidades. Esto da como resultado la separación de una solución de partículas en base al tamaño. Siempre que todas las partículas se carguen simultáneamente o casi simultáneamente, las partículas del mismo tamaño se deben eluir juntas. Cada columna de exclusión por tamaño tiene un intervalo de pesos moleculares que se puede separar. El límite de exclusión define el peso molecular en el extremo superior de este intervalo y es cuando las moléculas son demasiado grandes para quedar atrapadas en la fase estacionaria. El límite de permeación define el peso molecular en el extremo inferior del intervalo de separación y es cuando las moléculas de un tamaño suficientemente pequeño pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria por completo y todas las moléculas por debajo de esta masa molecular son tan pequeñas que se eluyen como una única banda.

Cromatografía de líquidos de alto rendimiento (o cromatografía de líquidos de alta presión, HPLC) es una forma de cromatografía en columna usada con frecuencia en bioquímica y química analítica para separar, identificar y cuantificar compuestos. HPLC utiliza una columna que soporta material de relleno cromatográfico (fase estacionaria), una bomba que mueve la(s) fase(s) móvil(es) a través de la columna, y un detector que muestra los tiempos de retención de las moléculas. El tiempo de retención varía dependiendo de las interacciones entre la fase estacionaria, las moléculas que se analizan y el/los disolvente(s) usado(s).

V. Composiciones farmacéuticas

Se contempla que las arginasas novedosas de la presente invención se pueden administrar por vía sistémica o local para inhibir el crecimiento de células tumorales y, lo más preferentemente, destruir células cancerosas en pacientes con cáncer con cánceres localmente avanzados o metastásicos. Se pueden administrar por vía intravenosa, intratecal y/o intraperitoneal. Se pueden administrar solas o en combinación con fármacos antiproliferativos. En un modo de realización, se administran para reducir la carga de cáncer en el paciente antes de cirugía u otros procedimientos. De forma alternativa, se administran después de cirugía para garantizar que no sobrevive ningún cáncer que quede (por ejemplo cáncer que la cirugía no pudo eliminar).

No se pretende que la presente invención esté limitada por la naturaleza particular de la preparación terapéutica. Por ejemplo, dichas composiciones se pueden proporcionar en formulaciones conjuntamente con vehículos, diluyentes y excipientes líquidos, en gel o sólidos fisiológicamente tolerables. Estas preparaciones terapéuticas se pueden administrar a mamíferos para su uso veterinario, tal como con animales domésticos, y uso clínico en seres humanos de manera similar a otros agentes terapéuticos. En general, la dosificación requerida para la eficacia terapéutica variará de acuerdo con el tipo de uso y el modo de administración, así como los requisitos particulares de los sujetos concretos.

Dichas composiciones se preparan típicamente como soluciones o suspensiones líquidas, como inyectables. Los diluyentes y excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea las composiciones pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes estabilizantes o de tamponación del pH.

Cuando se contemplan aplicaciones clínicas, puede ser necesario preparar composiciones farmacéuticas (vectores de expresión, reservas de virus, proteínas, anticuerpos y fármacos) en una forma apropiada para la aplicación destinada. En general, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de una o más variantes de arginasa o agente adicional disuelto o dispersado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción indeseable cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos una variante de arginasa, tal como una arginasa multimérica estabilizada o una arginasa pegilada aislada por el procedimiento divulgado en el presente documento, o ingrediente activo adicional será conocida para los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed., 1990. Además, para administración animal (por ejemplo, humana), se entenderá que las preparaciones deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según se requiere por la 0ficina de Normas biológicas de la FDA.

Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizantes de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, tintes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como se conocerá por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed., 1990). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas.

La presente invención puede comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se va a administrar en forma sólida, líquida o aerosol, y si necesita ser estéril para dichas vías de administración como inyección. La presente invención se puede administrar por vía intravenosa, intradérmica, transdérmica, intratecal, intraarterial, intraperitoneal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, tópica, intramuscular, subcutánea, mucosa, oral, tópica, local, inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada con baño de células diana directamente, por medio de un catéter, por medio de un lavado, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o por otro procedimiento o cualquier combinación de las anteriores como será conocido para el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed., 1990).

Las variantes de arginasa se pueden formular en una composición en una forma de base libre, neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de manera compatible con la formulación de dosificación y en dicha cantidad como sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas farmacéuticas tales como formuladas para administraciones parenterales tales como soluciones inyectables, o aerosoles para administración a los pulmones, o formuladas para administraciones alimentarias tales como cápsulas de liberación de fármaco y similares.

Además, de acuerdo con la presente invención, la composición de la presente invención adecuada para administración se proporciona en un vehículo farmacéuticamente aceptable con o sin un diluyente inerte. El vehículo deber ser asimilable e incluye vehículos líquidos, semisólidos, es decir, pastas, o sólidos. Excepto en la medida en que cualquier medio, agente, diluyente o vehículo convencional sea perjudicial para el receptor o para la eficacia terapéutica de la composición contenida en el mismo, es apropiado su uso en una composición administrable para su uso en la práctica de los procedimientos de la presente invención. Los ejemplos de vehículos o diluyentes incluyen grasas, aceites, agua, soluciones salinas, lípidos, liposomas, resinas, aglutinantes, rellenos y similares, o combinaciones de los mismos. La composición también puede comprender diversos antioxidantes para retardar la oxidación de uno o más componentes. Adicionalmente, la prevención de la acción de microorganismos se puede conseguir aproximadamente por conservantes tales como diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, incluyendo pero sin limitarse a parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal o combinaciones de los mismos.

De acuerdo con la presente invención, la composición se combina con el vehículo en cualquier manera conveniente y práctica, es decir, por solución, suspensión, emulsificación, mezcla, encapsulación, absorción y similares. Dichos procedimientos son rutinarios para los expertos en la técnica.

En un modo de realización específico de la presente invención, la composición se combina o se mezcla exhaustivamente con un vehículo semisólido o sólido. El mezclado se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente tal como por molienda. También se pueden añadió agentes estabilizantes en el procedimiento de mezclado para proteger la composición de la pérdida de actividad terapéutica, es decir, desnaturalización en el estómago. Los ejemplos de estabilizantes para su uso en la composición incluyen tampones, aminoácidos tales como glicina y lisina, carbohidratos tales como dextrosa, manosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, maltosa, sorbitol, manitol, etc.

En otros modos de realización, la presente invención se puede referir al uso de composiciones con vehículo lipídico farmacéutico que incluyen variantes de arginasa, uno o más lípidos, y un disolvente acuoso. Como se usa en el presente documento, el término "lípido" se definirá para incluir cualquiera de una amplio intervalo de sustancias que sea característicamente insoluble en agua y extraíble en un disolvente orgánico. Esta amplia clase de compuestos son bien conocidos para los expertos en la técnica, y como se usa el término "lípido" en el presente documento, no está limitado por cualquier estructura particular. Los ejemplos incluyen compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados. Un lípido puede ser natural o sintético (es decir, diseñado o producido por el hombre). Sin embargo, un lípido normalmente es una sustancia biológica. Los lípidos biológicos son bien conocidos en la técnica, e incluyen por ejemplo, grasas neutras, fosfolípidos, fosfoglicéridos, esteroides, terpenos, lisolípidos, glucoesfingolípidos, glucolípidos, sulfátidos, lípidos con ácidos grasos enlazados a éter y éster y lípidos polimerizables, y combinaciones de los mismos. Por supuesto, los compuestos distintos a los específicamente descritos en el presente documento que se entienden por un experto en la técnica como lípidos también se engloban por las composiciones y procedimientos de la presente invención.

El experto en la técnica estará familiarizado con la gama de técnicas que se pueden emplear para dispersar una composición en un vehículo lipídico. Por ejemplo, la arginasa multimérica estabilizada o arginasa pegilada se puede dispersar en una solución que contiene un lípido, disolverse con un lípido, emulsionarse con un lípido, mezclarse con un lípido, combinarse con un lípido, unirse covalentemente a un lípido, contenerse como una suspensión en un lípido, contenerse o complejarse con una micela o liposoma, o asociarse de otro modo con un lípido o estructura lipídica por cualquier medio conocido para los expertos en la técnica. La dispersión puede dar como resultado o no la formación de liposomas.

La cantidad de dosificación real de una composición de la presente invención administrada a un paciente animal se puede determinar por factores físicos y fisiológicos tales como peso corporal, gravedad de la afección, el tipo de enfermedad que se está tratando, intervenciones terapéuticas previas o simultáneas, idiopatía del paciente y la vía de administración. Dependiendo de la dosificación y la vía de administración, el número de administraciones de una dosificación preferente y/o una cantidad eficaz puede variar de acuerdo con la respuesta del sujeto. El profesional responsable para su administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los ingrediente(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual.

En determinados modos de realización, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente un 0,1 % de un compuesto activo. En otros modos de realización, un compuesto activo puede comprender entre aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 75 % del peso de la unidad, o entre aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 60 %, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable en el mismo. De forma natural, la cantidad de compuesto(s) activo(s) en cada composición terapéuticamente útil se puede preparar de tal forma que una dosificación adecuada se obtendrá en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Los factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, vía de administración, vida útil del producto, así como otras consideraciones farmacológicas se contemplarán por un experto en la técnica de preparación de dichas formulaciones farmacéuticas, y como tal, puede ser deseable una variedad de dosificaciones y regímenes de tratamiento.

En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 1 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg/peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable en los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable intervalo de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg/peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg/peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, etc., en base a los números descritos anteriormente.

VII. Definiciones

El término "aa" se refiere a aminoácido(s). Las sustituciones aminoacídicas se indican por la posición aminoacídica, por ejemplo 303, en la molécula usando un código de letras (la letra delante del número indica el aminoácido que se reemplaza, mientras que la letra después del número indica el aminoácido que se introduce). Como se usa en el presente documento, el término "porción" en referencia a una proteína (como en "una porción de una proteína dada") se refiere a fragmentos de esa proteína. Los fragmentos pueden variar en tamaño de cuatro residuos aminoacídicos a toda la secuencia de aminoácidos menos un aminoácido.

Como se usa en el presente documento, los términos "proteína" y "polipéptido" se refieren a compuestos que comprenden aminoácidos unidos por medio de enlaces peptídicos y se usan de manera intercambiable.

Como se usa en el presente documento, el término "proteína de fusión" se refiere a una proteína quimérica que contiene la proteína de interés (es decir, una arginasa humana o variante de la misma) unida (o enlazada de forma funcional) a un fragmento de proteína exógena (el compañero de fusión que consiste en una proteína distinta de arginasa). El compañero de fusión puede potenciar la semivida en suero, solubilidad, o ambos. También puede proporcionar una marca de afinidad (por ejemplo, marca his) para permitir la purificación de la proteína de fusión recombinante de la célula huésped o cultivo sobrenadante, o ambos.

Los términos "en combinación funcional", "en orden funcional" y "enlazado de forma funcional" se refieren al enlace de secuencias de ácido nucleico de manera tal que se produce una molécula de ácido nucleico que puede dirigir la transcripción de un gen dado y/o la síntesis de una molécula de proteína deseada. El término también se refiere al enlace de secuencias de aminoácidos de manera tal que se produce una proteína funcional. El término "Km" como se usa en el presente documento se refiere a la constante de Michaelis-Menten para una enzima y se define como la concentración del sustrato específico a la que la enzima dada proporciona la mitad de su velocidad máxima en una reacción catalizada por enzima.

El término kcat como se usa en el presente documento se refiere al número de recambio o al número de molécula de sustrato que cada sitio enzimático convierte en producto por unidad de tiempo, y en el que la enzima funciona a eficacia máxima.

El término Kcat/Km como se usa en el presente documento es la constante de especificidad que es una medida de cómo una enzima convierte eficazmente un sustrato en producto.

El término "Mn-hArgI" se refiere a arginasa humana I con un cofactor Mn(II). El término "C_0-hArgI" se refiere a arginasa humana I (mutante o natural) con un cofactor Co(II).

El término "CI50" la concentración inhibidora (CI) semimáxima (50 %) y por tanto una medida de la eficacia. El término "pegilado" se refiere a la conjugación con polietilenglicol (PEG), que se ha usado ampliamente como vehículo de fármaco, dado su alto grado de biocompatibilidad y facilidad de modificación. (Harris et al., 2001). Se ha mostrado que la unión a diversos fármacos, proteínas, y liposomas mejora el tiempo de residencia y disminuye la toxicidad. (Greenwald et al., 2000; Zalipsky et al., 1997). El PEG se puede acoplar (por ejemplo, enlazar covalentemente) a agentes activos a través de los grupos hidroxilo en los extremos de la cadena y por medio de otros procedimientos químicos; sin embargo, el propio PEG se limita a como máximo dos agentes activos por molécula. En un enfoque diferente, los copolímeros de PEG y aminoácidos se han explorado como biomateriales novedosos que mantendrían las propiedades de biocompatibilidad de PEG, pero que tendrían la ventaja añadida de numerosos puntos de unión por molécula (proporcionando una carga de fármaco mayor), y que se puede diseñar sintéticamente para adaptarse a una variedad de aplicaciones (Nathan et al., 1992; Nathan et al., 1993).

El término "gen" se refiere a una secuencia de ADN que comprende secuencias de control y codificantes necesarias para la producción de un polipéptido o precursor del mismo. El polipéptido se puede codificar por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante siempre que se mantenga la actividad enzimática deseada.

El término "sujeto" se refiere a animales, incluyendo seres humanos.

El término "natural" se refiere a un gen o producto génico que tiene las características de ese gen o producto génico cuando se aísla de una fuente natural. Un gen natural es el que se observa con más frecuencia en una población y por tanto se designa arbitrariamente como la forma "normal" o "natural" del gen. Por el contrario, el término "modificado" o "variante" o "mutante" se refiere a un gen o producto génico que presenta modificaciones en la secuencia y o propiedades funcionales (es decir, características alteradas) cuando se compara con el gen o producto génico natural. Cabe señalar que los mutantes naturales se pueden aislar; estos se identifican por el hecho de que tienen características alteradas cuando se comparan con el gen o producto génico natural.

VIII. Kits

La presente invención proporciona kits, tales como kits terapéuticos. Por ejemplo, un kit puede comprender una o más composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento y opcionalmente instrucciones para su uso. Los kits también pueden comprender uno o más dispositivos para llevar a cabo la administración de dichas composiciones. Por ejemplo, un kit de sujeto puede comprender una composición farmacéutica y catéter para llevar a cabo la inyección intravenosa directa de la composición en un tumor canceroso. En otros modos de realización, un kit de sujeto puede comprender ampollas prellenadas de una arginasa multimérica estabilizada o arginasa pegilada aislada, opcionalmente formulada como producto farmacéutico, o liofilizada, para su uso con un dispositivo de administración.

Los kits pueden comprender un recipiente con una ficha técnica. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales y tubos de ensayo. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente puede contener una composición que incluye un anticuerpo que es eficaz para aplicaciones terapéuticas y no terapéuticas, tal como se describe anteriormente. La ficha técnica del recipiente puede indicar que la composición se usa para un tratamiento específico o aplicación no terapéutica, y también puede indicar directrices para su uso in vivo o bien in vitro, tal como las descritas anteriormente. El kit de la invención típicamente comprenderá el recipiente descrito anteriormente y uno o más de otros recipientes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos de envase con instrucciones para su uso.

IX. Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar determinados modos de realización preferentes y aspectos de la presente invención y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la misma. En la divulgación experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (Molar); μM (micromolar); mM (milimolar); N (Normal); mol (moles); mmol (milimoles); μmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); μg (microgramos); l (litros); ml (mililitros); μl (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); μm (micrómetros); nm (nanómetros); °C (grados centígrados); MW (peso molecular); PBS (solución salina tamponada con fosfato); min (minutos).

Ejemplo 1

Síntesis génica y expresión de arginasa humana i y ii

Los genes de arginasa humana I y II contienen ambos múltiples codones que se utilizan raramente en E. coli que pueden interferir con la expresión. Por tanto, para optimizar la expresión de proteínas en E. coli, se ensamblaron los respectivos genes con oligonucleótidos optimizados por codón diseñados con el programa informático DNA-Works (Hoover et al., 2002). Cada construcción contiene un sitio de restricción Ncol N terminal, una marca His6 N terminal sin cambio de pauta de lectura seguido de un sitio de proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) y un sitio BamHI C terminal para simplificar la clonación. La escisión por la proteasa TEV retira el péptido His6 y la Met N terminal de la arginasa. Se diseñó un gen de arginasa II con un sitio de escisión de proteasa TEV y sin los primeros 21 aa naturales. Los primeros 21 aa son una secuencia de selección mitocondrial putativa y su retirada da como resultado un mayor rendimiento y estabilidad de proteína (Colleluori et al., 2001). Después de la clonación en un vector pET28a (Novagen), se cultivaron E.coli (BL21) que contenían un vector de expresión de arginasa apropiado a 37 °C usando medio Terrific Broth (TB) que contenía 50 |jg/ml de kanamicina en matraces de agitación a 250 rpm hasta alcanzar una D0600 de 0,5-0,6. En ese punto, se transfirieron los cultivos a 25 °C, inducidos con IPTG 0,5 mM y se dejó que expresaran la proteína durante 12 h adicionales. A continuación se recogieron los sedimentos celulares por centrifugación y se resuspendieron en un tampón IMAC (NaP04 10 mM/imidazol 10mM/NaCl 300 mM, pH 8). Después de la lisis por un célula de presión de French, se centrifugaron los lisados a 20.000 x g durante 20 min a 4 °C, y se aplicó el sobrenadante resultante a una columna IMAC con cobalto o níquel, se lavó con 10-20 volúmenes de columna de tampón IMAC, y a continuación se eluyó con un tampón de elución IMAC (NaP04 50 mM/imidazol 250 mM/NaCl 300 mM, pH 8). El catión metálico divalente deseado se incorpora por incubación con metal 10 mM (CoCh o MnS04) durante 15 min a 50°-55 °C, seguido de filtración a través de un filtro de jeringuilla de 0,45 jm. Usando un dispositivo de filtro centrífugo de MWC010.000 (Amicon), a continuación se intercambiaron con tampón las proteínas varias veces en una solución de Hepes 100 mM, glicerol al 10%, pH 7,4. A continuación, se ultracongelaron alícuotas de enzima arginasa en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. La arginasa purificada de esta manera es > 95 % homogénea como se evalúa por SDS-PAGE y tinción de Coomassie (FIG. 2). El rendimiento se calcula que es ~ 200 mg/l de cultivo en base al coeficiente de extinción calculado, £280 = 24.180 M'1cirr1 en una concentración de tampón final de clorhidrato de guanidinio 6 M, tampón fosfato 20 mM, pH 6,5 (Gill y von Hippel, 1989).

Ejemplo 2

Incorporación y determinación de contenido metálico en arginasa i

Como se menciona en el ejemplo 1, la incorporación de Mn2+ y Co2+ se puede lograr purificando arginasa, seguido de una etapa de incubación con metal 10 mM a 50 °C durante 10 min. Para determinar el contenido metálico final y la identidad de las preparaciones de arginasa, las muestras de proteína de Mn-hArgI (145 jM), C_0-hArgI (182 jM ) y tampones de diálisis asociados (Hepes 100 mM, pH 7,4) se diluyeron en ácido nítrico al 2 % y se analizaron por espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-EM, Departamento de Ciencias Geológicas, Universidad de Texas en Austin) para cuantificar el contenido en cobalto, hierro, manganeso y cinc de la proteína restando la concentración de metales hallados en el tampón de diálisis de la concentración metálica de las muestras de proteína fina y dividiendo entre la concentración de proteína. Para determinar las concentraciones de proteína, se calculó un coeficiente de extinción para hArgI en base a la secuencia de aminoácidos (Gill y von Hippel, 1989). Todas las concentraciones de proteína para arginasa I se calcularon en base al £280 calculado = 24.180 M'1cirr1 en una concentración de tampón final de clorhidrato de guanidinio 6 M, tampón fosfato 20 mM, pH 6,5. Para su comparación, también se calculó la concentración de arginasa por el ensayo BCA usando diluciones de BSA como estándar. Usando este procedimiento se descubrió que las muestras de arginasa incubadas con Co2+ contienen 2,1 ± 0,5 equivalentes de Co y 0,4 ± 0,1 equivalentes de Fe, con cantidades no detectables de Zn o Mn. Las muestras incubadas con Mn2+ contienen 1,5 ± 0,2 equivalentes de Mn y 0,4 ± 0,1 equivalentes de Fe, y cantidades no detectables de Zn o Co. Por tanto, la incubación térmica es un procedimiento eficaz para la incorporación de cobalto.

Ejemplo de referencia 3

Incorporación y determinación de contenido metálico en arginasa ii

La incorporación de metal eficaz en arginasa II se logró cultivando E.coli que alberga el gen ArgII en medio mínimo hasta que se alcanzó una D0600 de 1, con lo que la proteína se expresó con IPTG 1 mM y CoCh 100 jM durante 12 h adicionales. Para determinar el contenido metálico final y la identidad de las preparaciones de arginasa, las muestras de proteína de C_0-hArgI (290 jM ) y tampones de diálisis asociados (Hepes 100 mM, pH 7,4) se diluyeron en ácido nítrico al 1% y se analizaron por espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-EM, Departamento de Ciencias Geológicas, Universidad de Texas en Austin) para cuantificar el contenido en cobalto, hierro, manganeso y cinc de la proteína restando la concentración de metales hallados en el tampón de diálisis de la concentración metálica de las muestras de proteína fina y dividiendo entre la concentración de proteína. Para determinar las concentraciones de proteína, se calculó un coeficiente de extinción para hArgI en base a la secuencia de aminoácidos (Gill y von Hippel, 1989). Todas las concentraciones de proteína para arginasa II se calcularon en base al £280 calculado = 22.900 M'1cirr1 en una concentración de tampón final de clorhidrato de guanidinio 6 M, tampón fosfato 20 mM, pH 6,5. Para su comparación, también se calculó la concentración de arginasa por el ensayo BCA usando diluciones de BSA como estándar. Usando este procedimiento se descubrió que las muestras de arginasa expresadas con Co2+ contienen 1,35 ± 0,1 equivalentes de Co y 0,63 ± 0,1 equivalentes de Fe, con cantidades no detectables de Zn o Mn.

Ejemplo 4

Cinética en equilibrio de arginasa i con cobalto a ph fisiológico

La derivatización de diacetilmonoxima (DAM0) de productos de urea en presencia de ácidos fuertes, tiosemicarbacida y Fe3+ con calentamiento para producir un cromóforo con una A-máx de ~ 530 nm, se usó para el seguimiento de la producción de urea después de la hidrólisis de L-arginina por arginasa. La estructura de tinte no se conoce concluyentemente, pero se plantea la hipótesis de que la reacción es una condensación de DAM0 y urea/ureido que se estabiliza posiblemente por iones Fe3+ (Beale y Croft, 1961). Se construyó una curva estándar de urea frente a A530 que se descubrió que era lineal entre 0 - 300 μM de urea con un límite de detección inferior de 1-2 μM. La cinética en equilibrio de C_0-hArgI, y Mn-hArgI se examinó durante un intervalo de concentraciones de L-arginina (0-40 mM) en un tampón Hepes 100 mM pH 7,4, 37 °C. Típicamente, se realizaron reacciones equilibrando 200 μl en 1,5 ml de tubos Eppendorf a 37 °C en un bloque térmico, comenzando la reacción añadiendo 5 μl de enzima durante 30 s y desactivando con 15 μl de HCl 12 N. Las reacciones y los blancos se mezclaron a continuación con 800 μl de reactivo de desarrollo de color (C0LDER) (Knipp y Vasak, 2000) y se hirvió durante 15 min. Después de enfriar durante 10min, las muestras se transfirieron a cubetas y se leyó a 530 nm en un espectrofotómetro. L-arginina tiene una absorbancia de fondo que hace necesaria una corrección, de modo que se incluyeron los blancos de L-arginina para todas las concentraciones usadas. Los datos resultantes a continuación se corrigen por el fondo y las concentraciones de producto formados se calculan a partir de la curva estándar. El producto a continuación se divide entre el tiempo y la concentración de enzima usada y Vo/[E] se representa frente a la concentración de sustrato y se ajusta directamente a la ecuación de Michaelis-Menten (FIG. 3), donde Vo/[E] = kcat*[S]/([S] Km). Con este procedimiento, C_0-hArgI tuvo una kcat de 240 ± 14 s-1, una K^mde 190 ± 40 μM, y kcat/KM de 1.270 ± 330 mM-1-s'1," en comparación con Mn-hArgI, que tuvo una kcat de 300 ± 12 s-1, una K^mde 2.330 ± 260 μM, y kcat/KM de 129 ± 20 mM-1-s-1. El uso de cobalto como cofactor a pH fisiológico da lugar un incremento de 10 veces en la constante de especificidad.

Ejemplo de referencia 5

Cinética en equilibrio de arginasa ii con cobalto a ph fisiológico

Se descubrió que la arginasa II purificada como se describe en el ejemplo 3 y caracterizada como se describe en el ejemplo 4 una kcat de 182 ± 7 s-1, una K^mde 126 ± 18 μM, y una kcat/KM de 1.440 ± 260 mM-1s-1 en comparación con Mn-hArgII donde se descubrió una kcat de 48 ± 2 s-1, una K^mde 2.900 ± 300 μM, y kcat/KM de 17 ± 2 mM-1 s-1. El uso de cobalto como cofactor a pH fisiológico da lugar a un incremento de 80 veces en la constante de especificidad para arginasa II.

Ejemplo 6

Cribado de placas de 96 pocillos para determinar la actividad de arginasa y clasificar clones

La hidrólisis con arginasa de L-arginina produce L-ornitina y urea. El ensayo de hidrólisis de L-arginina del ejemplo 3 se adaptó a un formato de placa de 96 pocillos para la detección de urea y se usó para el cribado de colecciones de mutantes de proteína y para ordenar por clasificación clones con la mayor actividad arginasa. Se seleccionaron los clones que presentan un incremento mayor de 2 veces en la actividad para su caracterización adicional. Se demostró que el ensayo tenía un intervalo dinámico de ~ 5 -200 μM para la detección del producto de ureido. Se pueden cribar fácilmente más de 500 clones por día por medio de cribado manual. La salida de señal, es decir, la intensidad de color, refleja tres parámetros principales, a saber la constante de especificidad (kcat/KM), la concentración enzimática [Enz] y el tiempo (t). Si es necesario, se pueden detectar niveles enzimático en clones individuales por ELISA; sin embargo, en general la expresión enzimática de arginasa varía menos de dos veces y por lo tanto las diferencias de expresión no constituyen un problema significativo.

Se tomaron colonias individuales en placas de cultivo de 96 pocillos que contenían 75 μl de medio TB/pocillo que contenía 50 μg/ml de kanamicina. A continuación se cultivaron estos cultivos a 37 °C en un agitador de placa hasta alcanzar una D0600 de 0,8-1, se enfrió hasta 25 °C, con lo que se añadieron 75 μl adicionales de medio que contenía 50 μg/ml de kanamicina, e IPTG 0,5 mM. Se realizó la expresión a 25 °C con agitación durante ~2 h, después de esto se transfirieron 100 μl de cultivo/pocillo a una placa de ensayo de 96 pocillos. A continuación se centrifugaron las placas de ensayo para sedimentar las células, se retiró el medio, y se lisaron las células por adición de 50 μl/pocillo de reactivo de extracción de proteína B-PER (Pierce). Posteriormente se añadieron 50 μl/pocillo adicionales L-arginina 200 μM, CoCh 1 mM, en un tampón HEPES 100 mM, pH 7,4 y se dejó reaccionar a 37 °C. Después de reaccionar ~ 1-2 min, se añadieron 100 μl/pocillo de reactivo de desarrollo de color y se procesó la placa (Knipp y Vasak, 2000). Las colonias que tienen la capacidad de producir urea dieron como resultado la formación de un tinte rojo brillante con una Amáx de 530 nm.

Ejemplo 7

Dependencia de tasa de ph de arginasa con cobalto y arginasa con manganeso

Para examinar la dependencia de pH de kcat/KM de arginasa sustituida con cobalto y manganeso, se determinaron las constantes cinéticas en equilibrio a lo largo de un amplio intervalo de valores de pH. Se usaron los siguientes tampones: acetato de sodio (pH 5-5,5), MES (pH 6-6,5), HEPES (pH 7-7,8), Tris (pH 8-9), Capso (pH 9-10,5), todos a una concentración 100 mM. Se determinaron todas las cinéticas al menos por triplicado a 37 °C. Después de ajustar los datos cinéticos a la ecuación de Michaelis-Menten, se calcularon los valores de kcat/KM y se ajustaron a una ecuación de Henderson-Hasselbach para determinar los valores de pKa. Debido a que los ajustes para dos valores de pK próximos a 3,5 unidades tienden a infravalorar ymáx, se usó el procedimiento de Segel para calcular los valores de pK corregidos para cada rama de los perfiles de kcat/KMi (Segel, 1975). Los ajustes ajustados de ko/JKu frente a pH dieron como resultado una curva acampanada teniendo C_0-hArgI una rama ascendente pK de 7,5 ± 0,1 y una rama descendente pK de 9,8 ± 0,1. Mn-hArgI también tuvo una curva acampanada con una rama ascendente pK de 8,5 ± 0,1 y una rama descendente que presentaba un valor de pK aparente de 10,1 ± 0,1 (figura 4). Las enzimas Mn-hArgI y C_0-ArgI presentaron una ApKa de 1 unidades de pH. Esta desviación en pKatras la sustitución con Co probablemente imparte mucha de la mejora observada en la constante de especificidad. A pH fisiológico, aproximadamente un 44 % de C_0-hArgI tendrá hidróxido unido a diferencia de un 7 % con Mn-hArgI.

Ejemplo 8

El efecto de mutaciones en la posición 303

Se construyó una colección de saturación de codones NNS en la posición 303 y se cribó usando los siguientes cebadores mutagénicos: Directo '5-cgatcacgttagcaNNSttcggtttagcccg (SEQ ID N0:3), e inverso '5-CGGGCTAAACCGAAsnnTGCTAACGTGATCG (SEQ ID N0:4), usando el gen hArgI como ADN molde y cebadores de extremo específicos; directo "5-GATATACCATGGGTTCTTCTCACCATCATCACCACCACAGCTCTGGCG (SEQ ID N0:5) e; inverso '5-CGAATTCGGATCCTCACTTCGGTGGATTCAGATAATCAATT (SEQ ID N0:6). El producto de PCR se digirió con NcoI y BamHI y se ligó en el vector pET28a con ADN ligasa T4. La fijación resultante se transformó directamente en E.coli (BL21), se plaqueó en placas con LB-kanamicina para su posterior cribado como se describe en el ejemplo 4. Se aislaron los clones que presentan la mayor actividad y se secuenció el ADN. Se purificaron las respectivas variantes enzimáticas como se describe en el ejemplo 1 y se incubó con calor con cobalto como se describe en el ejemplo 2. Todas las proteínas se purificaron a > 95 % de homogeneidad como se evalúa por SDS-PAGE. Se determinaron las cinéticas de hidrólisis de arginina con un intervalo de concentraciones de L-arginina (0-2 mM) a 37 °C en un tampón Hepes 100 mM pH 7,4, y se ajustaron los datos resultantes a la ecuación de Michaelis-Menten en Kaleidagraph. Cys303 sustituido con Phe o Ile dio lugar a un incremento de 2 veces y 1,6 veces en koat/KM respectivamente en comparación con C_0-hArgI natural. Las sustituciones con Leu, Pro, His y Arg tuvieron aproximadamente un 90 % de actividad natural.

Las variantes Cys303 también se sometieron a prueba para determinar su estabilidad en suero a 37 °C como sigue: Se añadieron enzimas purificadas a mezcla de sueros humanos (Innovative) a una concentración de 1 μM y se incubó a 37 °C. Cada ~24 horas, se extrajeron alícuotas y se sometieron a prueba por triplicado para determinar su capacidad para hidrolizar L-arginina 1 mM en un tampón Hepes 100 mM pH 7,4. Después de ~ 4 días se ajustaron los datos resultantes a un modelo de disminución exponencial o bien logístico para calcular los valores de T1/2. Se usó la estabilidad de la enzima natural y se calculó que era una T1/2 de 33 ± 3 h. Las enzimas sustituidas con Phe, Ile, Leu e His fueron solo aproximadamente la mitad de estables que la natural. Mn-hArgI (°) presentó una pérdida de actividad exponencial con una semivida TA de 4,8 ± 0,8 h. Por el contrario C_0-hArgI (•) presentó una pérdida de actividad bifásica con una primera TA aparente de 6,1 ± 0,6 h seguido de una segunda TA mucho mayor de 37 ± 3 h.

Ejemplo 9

Especificidad de sustrato

Se evaluó la selectividad de la arginasa humana genomanipulada por la hidrólisis de arginina. Se incubó C_0-hArgI (1 μM) o tampón de diálisis con todos los 20 aa (5 mM cada uno) durante 12 h a 37 °C en un tampón fosfato 220 mM pH 7,4. Se derivatizaron los estándares, controles y experimentos con 0PA y FM0C (Agilent) y se separaron en una columna HPLC de fase inversa C18 (Agilent) (5 μm, 4,6 x 150 mm) esencialmente como se describe por Agilent Technologies (número de publicación: 5980-3088) excepto por la modificación del protocolo de separación reduciendo ligeramente el caudal en A y doblando el tiempo de adquisición para obtener una mejor separación de picos. Los 20 aminoácidos estándar incubados con tampón de diálisis mostraron 20 picos con buena resolución, y los 20 aminoácidos estándar incubados con C_0-hArgI mostraron 20 picos (FIG. 6) con desaparición del pico de L-Arginina (TR = 12,3 min) y aparición de un nuevo pico con un tiempo de retención que coincide con el de L-ornitina (TR = 18,8 min). Se observó que ninguno de los otros aminoácidos estaba afectado por C_0-hArg I.

Ejemplo 10

Purificación de alto rendimiento y cribado cinético de variantes

Se desarrolló un esquema de purificación a pequeña escala para purificar rápidamente decenas de proteínas a la vez y llevar a cabo un análisis cinético enzimático de alto rendimiento. Se expresaron cultivos de 50 ml de hArg I en matraces de agitación de 125 ml como se describe en el ejemplo 1. Se recogieron 5 ml del cultivo resultante por centrifugación. A continuación se lisaron los sedimentos celulares con 400 j l de reactivo de extracción de proteína B-PER (Pierce). Se mezcló la fracción soluble con 500 j l de tampón de lisis IMAC y 100 j l de perlas IMAC en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, se incubó durante dos minutos y se centrifugó a 3000 rpm durante 20 s en una centrífuga de sobremesa. Se desechó el sobrenadante y se lavaron las perlas con 2 x 1 ml de tampón de lisis IMAC por mezclado/centrifugación y se desechó el sobrenadante. A continuación se eluyó hArg I de las perlas por adición de 300 j l de tampón de elución IMAC y otra etapa centrífuga. El sobrenadante que contiene hArg I resultante se sometió a intercambio de tampón dos veces con un tampón Hepes 100 mM, pH 7,4 usando un dispositivo de concentración centrífugo de MWC0 10.000 (YM-10 Amicon). A continuación se cuantificó la proteína por A280, se calentó en presencia de cobalto como anteriormente, y se evaluó la C_0-hArg I resultante por SDS-PAGe como se describe en el ejemplo 1. Este procedimiento permite la purificación de 12 -16 proteínas en ~ 2 h con un rendimiento de 200 - 300 jg de proteína a un 90 - 95 % de pureza como se evalúa por SDS-PAGE.

A continuación se sometieron a prueba las variantes enzimáticas para determinar su capacidad para hidrolizar L-arginina incubando 24 nM de enzima con 200 jM de L-arginina en pocillos de una placa de microvaloración. Se recogieron alícuotas en diferentes puntos temporales y se desactivaron directamente en el reactivo de desarrollo de color (C0LDER). Después de desarrollar el tinte y leer la absorción, se ajustaron los datos de la curva de progreso a una ecuación exponencial para estimar un valor de kcat/KWi aparente.

Ejemplo 11

Genomanipulación de ligandos metálicos de 2.a capa de arginasa para actividad óptima

El poder catalítico de una metalohidrolasa proviene en parte de su capacidad notable para disminuir el valor de pKa normal de agua (~16) a un valor mucho menor y coordinar el ion hidróxido altamente reactivo para el ataque en el sustrato. Tanto el tipo de metal como su entorno local que comprende ligandos de 1.a y 2.a capa influyen en el pKa de la molécula de hidróxido/agua nucleófila (Christianson y Cox, 1999). El metal (A) de hArgI se coordina al imidazol de H101, que a su vez se une por hidrógeno al hidroxilo de S230. El metal (B) de hArgI se coordina al imidazol de H126, que tiene un enlace de hidrógeno de 2.a capa con el carboxilo de D181. Se construyó una colección de saturación de codones NNS en la posición 181 y 230 usando los siguientes cebadores mutagénicos: (D181) directo "5-cattggcttacgtNNSgtcgacccagg (SEQ ID N0:7), inverso '5-CCTGGGTCGACSNNACGTAAGCCAATG (SEQ ID N0:8); (S230) directo '5-cgtccaatccatctgNNSttcgatgttgacg (SEQ ID N0:9), inverso '5-CGTCAACATCGAASNNCAGATGGATTGGACG (SEQ ID N0:10), junto con el gen hArgI y cebadores de extremo específicos por medio de PCR de extensión por solapamiento. Después de clonar, se transformó la colección en E. coli (BL21) y se cribó como se describe en el ejemplo 4. Se identificaron clones novedosos por secuenciación, se retransformaron en E. coli (BL21) y se purificaron y caracterizaron cinéticamente como se describe a continuación en el ejemplo 8. Las variantes que presentan actividad aparente > a la natural se purificaron a mayor escala y se sometieron a ensayo para determinar sus parámetros cinéticos en equilibrio de kcat y K^m. Se descubrió que las siguientes variantes tienen mayores constantes kcat/KM que C_0-hArgI: hArg I D181S: 1420 ± 200 s'1 mM'1, hArg I D181E/S230A: 1.450 ± 200 s'1 mM'1, hArg I S230C: 2.290 ± 200 s-1 mM-1, y hArg I S230G: 2.340 ± 70 s’1 mM-1.

Ejemplo 12

Citotoxicidad de co-arg y sus variantes hacia células de carcinoma hepatocelular y melanomas metastásicos

Para someter a prueba la citotoxicidad in vitro de arginasa genomanipulada, se incubaron concentraciones variables (0 - 100 nM) de Mn-ArgI, C_0-ArgI, o variantes de C_0-hArgI con células HCC (Hep 3b) o células de melanoma (A375) (American Type Culture Collection) en placas de 96 pocillos a una densidad de siembra de 500 células/pocillo, en medio d Me M complementado con suero fetal bovino. Después de 24 horas de incubación a 37 °C, las células se trataron con medio que contenía arginasa por triplicado a diversas concentraciones. La solución de control fue una solución salina equilibrada en medio. Las células tratadas se mantuvieron a 37 °C y un 5 % de C02. Se sometieron a prueba células por ensayo MTT estándar (Sigma-Aldrich) los días 1, 3, 5 y 7 por adición de 100 jl/pocillo de MTT (5 mg/ml), y se incubaron durante 4 horas con agitación suave de una a dos veces por hora. Después de esto, se aspiró la solución y a continuación se añadieron 200 j l de DMS0 a cada pocillo. Se interpretó la absorbancia a 570 nm para cada pocillo usando un lector de placas automatizado para determinar el número relativo de células supervivientes en comparación con los controles. Los datos resultantes se ajustaron a una ecuación exponencial para determinar un valor de CI50 aparente para la citotoxicidad de arginasa. La FIG. 7A muestra el efecto de la adición de Mn-ArgI o C_0-ArgI sobre el % absorbancia MTT de células HCC. Se calcularon los valores de CI50 del día 5, proporcionando un valor de CI50 para Mn-hArgI de 5 ± 0,3 nM (~ 0,18 jg/ml) y un valor de 0,33 ± 0,02 nM para C_0-hArgI (~ 0,012 jg/ml). Por tanto, parece que la enzima C_0-ArgI es 15 veces más citotóxica que la enzima sustituida con Mn frente a HCC. Frente a la línea celular de melanoma metastásico (A375) Mn-hArgI (FIG. 7B) dio como resultado una CI50 aparente de 4,1 ± 0,1 nM (~ 0,15 jg/ml). La incubación con C_0-hArgI da lugar a un incremento de 13 veces en la citotoxicidad con una CI50 aparente de 0,32 ± 0,06 nM (~ 0,012 jg/ml).

Ejemplo 13

Genomanipulación de una proteína de fusión fc-arginasa para potenciar la semivida in vivo

La fusión al dominio Fc de IgG se ha empleado exhaustivamente para prolongar las semividas in vivo de polipéptidos terapéuticos tales como el inhibidor de TNF-a etanercept (Enbril®). El dominio Fc se une al receptor FcyRn, que se expresa en el endotelio vascular y muchos otros tejidos (Roopenian y Akilesh, 2007). La afinidad de FcyRn por el dominio Fc de IgG es fuertemente dependiente del pH. La unión se produce al pH ácido de los compartimentos endosómicos permitiendo que la proteína se recicle en la superficie celular y por tanto escape de la degradación proteolítica. En la superficie celular, el dominio Fc se libera de FcyRn debido a que la afinidad de unión es muy baja a pH fisiológico. Se estima que el reciclaje endosómico por medio de FcyRn incrementa la semivida en suero de las inmunoglobulinas al menos 4-7 veces, a aproximadamente 7-14 días en seres humanos. Las fusiones Fc aprovechan esta propiedad para dotar a las moléculas con vida corta de una semivida larga. Sin embargo, la arginasa humana es un homotrímero y por lo tanto se fusiona al Fc de IgG, que por sí mismo es un dímero, el polipéptido Fc-arginasa resultante probablemente formará agregados de alto peso molecular.

Este problema se evitó empleando formas mutantes de arginasa que interrumpen la trimerización y son estables en forma monomérica. La trimerización y la interfase subunitaria de la arginasa I se han estudiado con algún detalle (Lavulo et al., 2001). Se ha mostrado que una única sustitución aa en Glu256Gln interrumpe la trimerización dando como resultado la formación de la enzima arginasa I monomérica (Sabio et al., 2001). Esta mutación se introdujo en hArgI por el uso de dos cebadores mutagénicos: directo '5-ggtttaacgtatcgcCAGggcctgtatatcacgg (SEQ ID N0:11) e inverso '5-CCGTGATATACAGGCCCTGGCGATACGTTAAACC (SEQ ID N0: 12), y dos cebadores de extremo específicos (ejemplo 1) a través de la PCR de extensión por solapamiento y la clonación en un vector pET28a. Después de la expresión y purificación de esta variante, el análisis cinético en equilibrio reveló actividad casi idéntica en comparación a C_0-hArgI con kcJKu de 1.320 s_1 mM-1. La FIG. 8 muestra un gel PAGE no desnaturalizante que muestra que C_0-hArgI-E256Q es un monómero, como se esperaba.

A continuación se clonó esta construcción en vectores de expresión de Fc disponibles. El vector de expresión de Fc es una construcción basada en un plásmido pTRC99a (Amersham) que contiene una secuencia líder DsbA seguida de la región codificante de Fc de IgG, un sitio de restricción EcoRI y un codón de detención. El gen de arginasa monomérico se situó sin cambio de pauta de lectura detrás de la región codificante de Fc digiriendo tanto el vector como el gen con EcoRI, y posteriormente se ligó y se transformó en E. coli (BL21) para secuenciación y expresión. Puesto que el Fc de IgG normalmente es una proteína glucosilada, la expresión de IgG recombinantes o de fusiones de Fc se ha llevado a cabo hasta el momento en células de mamífero recombinantes que, a diferencia de las bacterias, pueden realizar glucosilación enlazada a N. Sin embargo, aunque la glucosilación en Asn297 es crítica para la unión a los receptores F^cyactivadores e inhibidores (FcyRI-III en seres humanos) no tiene un efecto notable sobre la afinidad o unión dependiente del pH a FcyRn (Tao y Morrison, 1989; Simmons et al., 2002). Por tanto, los anticuerpos IgG aglucosilados expresados en bacterias presentan persistencia en suero en primates casi indistinguible de la de los anticuerpos totalmente glucosilados expresados en células de mamífero (Simmons et al., 2002). Al contrario que las nociones anteriores predominantes, los anticuerpos IgG y proteínas Fc se pueden expresar eficazmente en E.coli hasta niveles de g/l en fermentadores. La expresión en E.coli es técnicamente mucho más simple y rápida. Además, puesto que la proteína resultante está aglucosilada, no presenta heterogeneidad de glucanos, un problema importante en la expresión de glucoproteínas terapéuticas (Jefferis, 2007). La proteína de fusión se purifica por cromatografía de proteína A y el rendimiento de la fusión Fc-arginasa dimérica correctamente plegada con relación a polipéptidos que no se dimerizan se cuantifica por cromatografía de filtración en gel FPLC. Esta formulación ha dado lugar a una forma altamente activa y muy estable de arginasa humana, adecuada para ensayos in vivo.

Ejemplo 14

Pegilación de arginasa

Se purificó la arginasa como se describe en el ejemplo 10 con una excepción: después de la unión a la columna IMAC, se lavó la proteína exhaustivamente (80-90 volúmenes de columna) con un tampón IMAC que contiene 0,1 % de Triton 114 (esta etapa retira la mayoría de la endotoxina), 10-20 volúmenes de columna de tampón IMAC, y a continuación se eluyó con un tampón de elución IMAC (NaP0450 mM/imidazol 250 mM/NaCl 300 mM, pH 8). Se intercambió el tampón de arginasa por un tampón de NaP04100 mM a pH 8,3 usando un dispositivo de filtración MWC0 10.000 (Amicon). Usando un frasco de reacción pequeño, se añadió éster succinimidilcarboximetílico de metoxi-PEG 5000 MW (JenKem Technology) a arginasa a una proporción molar 40:1 y se dejó reaccionar durante 1 h a 25 °C en agitación constante. A continuación se preparó la mezcla resultante a 10 mM con CoCl2 y se calentó a 50 °C durante 10 minutos. Después de centrifugar para retirar cualquier precipitado, se intercambió exhaustivamente el tampón de PEG-5000 arginasa (PBS con 10 % de glicerol) usando un dispositivo de filtración 100.000 MWC0 (Amicon), y se esterilizó con un filtro de jeringuilla de 0,2 micrómetros (VWR). Toda enzima pegilada se analizó para determinar el contenido en lipopolisacárido (LPS) usando un kit Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (Cape Cod Incorporated).

Se descubrió que C_0-hArgI pegilada tenía estabilidad en suero casi idéntica a la enzima wt y presentó un valor de kcat/K^mde 1690 ± 290 s-1mM'1. La figura 12 muestra un gel desnaturalizante del producto final con un MW aparente de ~ 150 kDa.

Ejemplo 15

Disminución sérica de l-arg en el modelo de ratón

Se trataron ratones Balb/c por inyección i.p. única con 500 |jg de C_0-hArgI pegilada farmacológicamente preparada o un volumen igual de PBS. Se sacrificaron los ratones por venopunción cardíaca para la extracción de sangre en los puntos temporales de 0, 48, 72, y 96 h. Las muestras de sangre se mezclaron de inmediato 50:50 (v/v) con un tampón citrato de sodio 400 mM pH 4 se dejó coagular durante 30 min y se centrifugó para la separación sérica. El suero resultante se filtró a continuación en el dispositivo 10.000 MWC0 (Amicon) para la retirada de proteínas grandes y precipitados y el flujo continuo se recogió para el análisis. Se derivatizaron los estándares de L-arginina, , suero de ratón de control y experimentos con 0PA (Agilent) y se separaron en una columna HPLC de fase inversa C18 (Agilent) (5 jm, 4,6 x 150 mm) esencialmente como se describe por Agilent Technologies (número de publicación: 5980-3088) excepto por la modificación del protocolo de separación reduciendo ligeramente el caudal en A y doblando el tiempo de adquisición para obtener una mejor separación de picos. Se construyó una curva estándar de L-arginina representando el área de pico de L-Arg frente a la concentración para cuantificar los niveles de L-Arg en suero. Una única dosis de C_0-hArgI farmacológicamente preparado fue suficiente para mantener la L-Arg a o por debajo de los límites de detección durante 3 días (FIG.

10).

Ejemplo 16

Tratamiento de xenoinjerto tumoral de hcc con co-hargi

A ratones atímicos se les inyectaron por vía subcutánea en el flanco ~106 células de HCC recogidas de un cultivo tisular confluente al 75 %. Después de que los tumores de HCC xenoinjertados crecieran hasta ~0,5 cm3 de diámetro (día 9), se clasificaron los ratones en dos grupos. El grupo experimental recibió una inyección i.p. de 500 jg de C_0-hArgI farmacológicamente optimizada el día 9 y el día 12. El grupo de control recibió inyecciones i.p. de PBS los días 9 y 12. Como se puede ver en la FIG. 11, los tumores tratados con PBS habían incrementado 3 veces su tamaño el día 15. En marcado contraste, los tumores tratados con C_0-hArgI habían disminuido su tamaño el día 15. Los tumores tratados con Mn-hArgI solo habían mostrado retardados en la tasa de crecimiento (Cheng et al., 2007). Parece que C_0-hArgI es un agente quimioterápico altamente eficaz frente a HCC tanto in vitro como in vivo.

Todas las composiciones y procedimientos divulgados y reivindicados en el presente documento se pueden realizar y ejecutar sin experimentación excesiva en vista de la presente divulgación. Aunque las composiciones y procedimientos de la presente invención se han descrito en términos de modos de realización preferentes, será evidente para los expertos en la técnica que determinados agentes que están tanto química como fisiológicamente relacionados se pueden sustituir por los agentes descritos en el presente documento mientras que se logren los mismos resultados o similares.

Referencias

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Claims

REIVINDICACI0NES

1. Una proteína arginasa I humana aislada que:

1. comprende la secuencia de aminoácidos de la arginasa I natural, opcionalmente sin el residuo de metionina N terminal; y

ii. comprende un cofactor metálico no natural que es cobalto en la forma de Co2 para su uso en medicina.

2. La proteína arginasa I humana aislada para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proteína arginasa I humana comprende una secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID N0:1, opcionalmente sin el residuo de metionina N terminal.

3. La proteína arginasa I humana aislada para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la proteína arginasa I humana carece de una metionina N terminal.

4. La proteína arginasa I humana aislada para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína arginasa I humana se enlaza covalentemente a polietilenglicol.

5. La proteína arginasa I humana aislada para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína arginasa I humana presenta una kcat/Km mayor de 400 mM-1s-1 a 37 °C y pH 7,4.

6. La proteína arginasa I humana aislada para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la arginasa I humana aislada es obtenible por expresión en una célula huésped que comprende un vector que contiene un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la arginasa I natural, opcionalmente sin el residuo de metionina N terminal.

7. Una composición farmacéutica para su uso en medicina, en la que la composición farmacéutica comprende una proteína arginasa I humana aislada como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 conjuntamente con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es una solución salina.