ES2946681T3 - Genes y firmas génicas para el diagnóstico y tratamiento del melanoma - Google Patents

Genes y firmas génicas para el diagnóstico y tratamiento del melanoma Download PDF

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Abstract

Se describen paneles de biomarcadores, métodos y sistemas para determinar la expresión génica y diagnosticar y tratar el melanoma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Genes y firmas génicas para el diagnóstico y tratamiento del melanoma
Campo de la invención
La invención se relaciona generalmente con una clasificación molecular de enfermedades y particularmente con genes y firmas genéticas para el diagnóstico de melanoma y métodos de uso de los mismos.
Antecedentes de la invención
En los Estados Unidos, se diagnosticarán más de 76,000 nuevos casos de melanoma en 2013. American Cancer Society, FACTS AND FIGURES 2013. El tratamiento del melanoma en una etapa más temprana se asocia con mayores tasas de supervivencia en los pacientes. El documento WO-2013/192616 se relaciona con métodos para caracterizar una muestra que contiene melanocitos como nevo benigno o melanoma maligno. Estos métodos incluyen la caracterización de una muestra que contiene melanocitos mediante la determinación de un nivel de expresión para (i) al menos dos de los biomarcadores seleccionados de MAGEA2, PRAME, PDIA4, NR4A1, PDLIM7, B4GALT1, SAT1, RUNX1, SOCS3 y los de la Tabla 13 y (ii) al menos uno biomarcador de normalización, en la muestra que contiene melanocitos obtenida de un sujeto (tal como una muestra de nevos), generando así valores de expresión sin procesar para cada uno de los al menos dos biomarcadores y al menos un biomarcador de normalización. Por lo tanto, existe una gran necesidad de avances en los métodos de diagnóstico y tratamiento tempranos del melanoma.
Breve resumen de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Se describen paneles de biomarcadores, métodos y sistemas para determinar la expresión génica y diagnosticar y tratar el melanoma.
En un primer aspecto, la divulgación se relaciona con métodos de diagnóstico de melanoma en un paciente. En general, dichos métodos comprenden medir en una muestra obtenida del paciente la expresión de uno o más genes, o un panel de genes. Los genes pueden ser genes del ciclo celular, genes inmunitarios o genes adicionales como se define en el presente documento. Los genes se pueden seleccionar de la Tabla 1, la Tabla 3 o uno de los muchos paneles definidos específicamente (Paneles A-I o paneles en las Tablas WW-ZZ). El método también puede comprender comparar los niveles de expresión medidos del uno o más genes con los niveles de expresión del mismo uno o más genes medidos en una muestra de referencia. La detección de una diferencia en los niveles de expresión del uno o más genes indica que el paciente tiene melanoma.
En un segundo aspecto, pero que no forma parte de la invención, hay métodos para detectar niveles anormales de expresión génica en una lesión cutánea. En general, los métodos comprenden medir en una lesión cutánea obtenida de un paciente la expresión de uno o más genes, o un panel de genes. Los genes pueden ser genes del ciclo celular, genes inmunitarios o genes adicionales como se define en el presente documento. Los genes se pueden seleccionar de la Tabla 1, la Tabla 3 o uno de los muchos paneles definidos específicamente (Paneles A-I o paneles en las Tablas WW-ZZ). El método también puede comprender comparar los niveles de expresión medidos del uno o más genes con los niveles de expresión del mismo uno o más genes medidos en una muestra de referencia. El método también puede comprender detectar un nivel anormal de expresión génica de al menos uno del uno o más genes.
En un tercer aspecto, la divulgación se relaciona con el tratamiento de un paciente con melanoma. En general, los métodos comprenden medir en una lesión cutánea obtenida de un paciente la expresión de uno o más genes, o un panel de genes. Los genes pueden ser genes del ciclo celular, genes inmunitarios o genes adicionales como se define en el presente documento. Los genes se pueden seleccionar de la Tabla 1, la Tabla 3 o uno de los muchos paneles definidos específicamente (Paneles A-I o paneles en las Tablas WW-ZZ). El método también puede comprender comparar los niveles de expresión medidos del uno o más genes con los niveles de expresión del mismo uno o más genes medidos en una muestra de referencia. El método también puede comprender detectar un nivel anormal de expresión génica de al menos uno del uno o más genes, y alterar el tratamiento del paciente basándose al menos en parte en la diferencia.
También se divulgan, pero no forman parte de la invención, sistemas, composiciones y kits para ayudar a detectar niveles anormales de expresión génica, diagnosticar melanoma o tratar melanoma.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que se refiere esta invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un sistema para realizar métodos asistidos por ordenador para diagnosticar, detectar, cribar y/o tratar el melanoma en un paciente.
La Figura 2 muestra la distribución de las puntuaciones de CCP de las 30 muestras con puntuación y separadas por diagnóstico clínico. Las muestras de melanoma tienen distribuciones estadísticamente diferentes en comparación con las muestras de nevos.
La Figura 3 muestra las distribuciones de los 88 ensayos de amplicón individuales probados en las Rondas 1, 2 y 3 del descubrimiento de biomarcadores. El análisis se realizó en 30 muestras del Grupo 1 (círculos negros) y 53 muestras del Grupo 2 (círculos grises).
La Figura 4 muestra las distribuciones de cada amplicón individual analizado en las Rondas 1 y 2 del descubrimiento de biomarcadores. Las muestras se diferencian con base en su subtipo patológico en el eje Y. La expresión relativa (Ct) de cada gen (en comparación con la expresión de los genes constitutivos) se representa gráficamente en el eje X. Cada amplicón se identifica por el nombre del gen y los últimos tres dígitos del ensayo.
La Figura 5 muestra la expresión normalizada de PRAME en cada muestra, diferenciada por sitio y subtipo histológico. Las muestras malignas son negras, mientras que las muestras benignas son de color gris.
La Figura 6 muestra la expresión de cada uno de los mejores 8 genes inmunitarios. Cada uno de los genes tenía una relación lineal con la expresión promedio de los 8 genes inmunitarios (lo que indica que todos miden el mismo proceso biológico). Además, todos los genes inmunitarios pueden diferenciar muestras de melanoma y nevos (de color negro y gris, respectivamente).
La Figura 7 muestra gráficos de la expresión de cada marcador (de PRAME, el promedio de los 8 genes inmunitarios y S100A9) representados frente a los otros marcadores. Datos de cada sitio graficados por separado. La falta de una alta correlación entre cada biomarcador indica que es probable que cada uno mida diferentes procesos biológicos y que cada uno tenga un valor independiente.
La Figura 8 muestra la puntuación generada por el modelo de diagnóstico, usando la expresión de PRAME, los genes inmunitarios y S100A9. Esta puntuación se utilizó para diferenciar el melanoma maligno y el nevo benigno.
La Figura 9 muestra una curva AUROC generada a partir del conjunto de datos, utilizando la puntuación generada por el modelo. El AUC de la curva ROC es ~0.96.
La Figura 10 muestra la distribución de puntuaciones (eje x) de todas las muestras analizadas. Los datos se diferencian por diagnóstico primario. El panel superior muestra puntuaciones para muestras malignas. El panel inferior muestra decenas de muestras benignas.
La Figura 11 muestra una curva AUROC generada a partir del conjunto de datos con base en la capacidad del modelo para diferenciar muestras de melanoma y nevo. El AUC de la ROC es ~ 0.95. Se muestran la sensibilidad y la especificidad.
La Figura 12 muestra la distribución de puntuaciones (eje x) de todas las muestras analizadas para la cohorte de validación. Los datos se diferencian por diagnóstico primario. El panel superior muestra puntuaciones para muestras malignas. El panel inferior muestra decenas de muestras benignas.
La Figura 13 muestra una curva AUROC generada con base en la cohorte de validación. El AUC de la ROC es ~ 0.96. Se muestran la sensibilidad y la especificidad.
La Figura 14 muestra la distribución de puntuaciones (eje x) de todas las muestras analizadas para la cohorte de validación al implementar la Zona Indeterminada. Los datos se diferencian por diagnóstico primario. El panel superior muestra puntuaciones para muestras malignas. El panel inferior muestra decenas de muestras benignas.
Descripción detallada de la invención
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
Genes y Paneles
En el presente documento se divulgan biomarcadores genéticos y paneles de biomarcadores, métodos y sistemas para determinar la expresión génica y métodos para diagnosticar y tratar el melanoma. Debe entenderse que todos los métodos y sistemas divulgados están destinados a utilizarse junto con biomarcadores como se describe en el presente documento. En particular, cualquier panel divulgado puede usarse con cualquier método o sistema de esta divulgación. Además, los subpaneles de cualquier panel divulgado también pueden usarse, como se describe a continuación.
Los biomarcadores genéticos y los paneles de biomarcadores son útiles, al menos en parte, por su poder predictivo para determinar si un individuo tiene melanoma. Se ha descubierto que el poder predictivo de un panel o grupo de genes a menudo deja de aumentar significativamente más allá de un número determinado. Más específicamente, el número óptimo de genes en un panel, o utilizado para generar un valor de la prueba se puede encontrar siempre que lo siguiente sea cierto
(Pn+1 -Pn) < CO,
en la que P es el poder predictivo (es decir, Pn es el poder predictivo de una firma con n genes y Pn+1 es el poder predictivo de una firma con n genes más uno) y CO es una constante de optimización. El poder predictivo se puede definir de muchas maneras conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, el valor P de la firma. La CO puede ser elegida por el artesano con base en sus limitaciones específicas. Por ejemplo, si el coste no es un factor crítico y se desean niveles extremadamente altos de sensibilidad y especificidad, la CO puede establecerse en un valor muy bajo, de modo que solo se ignoren los incrementos triviales en el poder predictivo. Por otro lado, si el coste es decisivo y los niveles moderados de sensibilidad y especificidad son aceptables, la CO puede establecerse más alto de modo que solo los aumentos significativos en el poder predictivo justifiquen aumentar el número de genes en la firma.
Además, un experto reconocería que los paneles individuales pueden combinarse para generar paneles adicionales de acuerdo con esta divulgación, y que la combinación de dos paneles con un poder predictivo aceptable dará como resultado un panel combinado con un poder predictivo aceptable. Además, un experto en la técnica reconocería que, si bien los genes individuales se describen en el presente documento como pertenecientes a ciertos grupos (es decir, genes del ciclo celular, genes inmunitarios, etc.), todos los paneles y genes descritos en el presente documento están unificados por su capacidad común para ayudar a determinar la expresión génica, y tratar y diagnosticar el melanoma.
Genes CCP
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que los niveles de expresión de los genes CCP en una muestra de un paciente del que se sospecha que tiene melanoma predicen si el paciente se diagnosticará con melanoma y, además, que otros genes añaden un poder de predicción significativo cuando se combinan con genes CCP ("CCG").
"Gen del ciclo celular" y "CCG" en el presente documento se refieren a un gen cuyo nivel de expresión sigue de cerca la progresión de la célula a lo largo del ciclo celular. Véase, por ejemplo, Whitfield et al., Mol. Biol. Cell (2002) 13:1977-2000. El término "progresión del ciclo celular" o "CCP" también se utilizará en esta solicitud y generalmente es intercambiable con CCG (es decir, un gen CCP es un CCG; una puntuación de CCP es una puntuación de CCG). Más específicamente, los CCG muestran aumentos y disminuciones periódicos en la expresión que coinciden con ciertas fases del ciclo celular, por ejemplo, STK15 y PLK muestran un pico de expresión en G2/M. Id. A menudo, los CCG tienen una función clara y reconocida relacionada con el ciclo celular -por ejemplo, en la síntesis o reparación del ADN, en la condensación cromosómica, en la división celular, etc. Sin embargo, algunos CCG tienen niveles de expresión que rastrean el ciclo celular sin tener un papel directo y obvio en el ciclo celular, por ejemplo, UBE2S codifica una enzima conjugadora de ubiquitina, pero su expresión sigue de cerca el ciclo celular. Por tanto, un CCG de acuerdo con la presente invención no necesita tener un papel reconocido en el ciclo celular. Los CCG ejemplares se enumeran en las Tablas 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 y 9. Se puede encontrar una discusión más completa de los c Cg , incluyendo una lista extensa (aunque no exhaustiva) de CCG, en la Solicitud internacional No. PCT /US2010/020397 (pub. No. WO/2010/080933) (véase, por ejemplo, la Tabla 1 en WO/2010/080933). Solicitud Internacional No. PCT/US2010/020397 (pub. No. w O/2010/080933 (véase también la correspondiente solicitud de EE. UU. No.
13/177,887)) y Solicitud internacional No. PCT/US2011/043228 (pub no. WO/2012/006447 (véase también la solicitud de EE. UU. relacionada No. 13/178,380))
Se puede determinar si un gen particular es un CCG mediante cualquier técnica conocida en la técnica, incluyendo las enseñadas en Whitfield et al., Mol. Biol. Cell (2002) 13:1977-2000; Whitfield et al., Mol. Cell. Biol. (2000) 20:4188-4198; documento WO/2010/080933 ([0039]). Todos los CCG en la Tabla 1 a continuación forman un panel de CCG ("Panel A"). Como se mostrará en detalle a lo largo de este documento, también se pueden usar CCG individuales (por ejemplo, CCG en la Tabla 1) y subconjuntos de estos genes.
Tabla 1
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* Subconjunto de 124 genes de CCG ("Panel B"). Subconjunto de genes #10 de CCG (Panel C). ID de ensayo ABI indica el número de ID de catálogo para el ensayo de expresión génica comercialmente disponible de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) para el gen en particular.
En consecuencia, en un primer aspecto de la presente divulgación, se divulgan paneles de genes que comprenden los CCG para usar en la determinación de la expresión génica y para diagnosticar y tratar el melanoma. En algunas realizaciones, el uso de paneles que comprenden CCG comprende determinar la expresión de los CCG en una muestra de un individuo o paciente.
La expresión génica se puede determinar a nivel de ARN (es decir, ARNm o ARN no codificante (ARNnc)) (por ejemplo, ARNml, ARNt, ARNr, ARNsno, ARNsi y ARNpi) o a nivel de proteína. La medición de la expresión génica a nivel de ARNm incluye la medición de los niveles de ADNc correspondientes al ARNm. Los niveles de proteínas en una muestra se pueden determinar mediante cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, HPLC, espectrometría de masas o usando anticuerpos específicos para proteínas seleccionadas (por ejemplo, IHC, ELISA, etc.).
En una realización, se mide en la muestra la cantidad de ARN transcrito del panel de genes que incluye genes de prueba. Además, también se mide la cantidad de ARN de uno o más genes constitutivos en la muestra y se usa para normalizar o calibrar la expresión de los genes de prueba. Los términos "genes de normalización" y "genes constitutivos" se definen a continuación en el presente documento.
En cualquier realización de la invención que involucre una "pluralidad de genes de prueba", la pluralidad de genes de prueba puede incluir al menos 2, 3 o 4 genes del ciclo celular, que constituyen al menos 50 %, 75 % u 80 % de la pluralidad de genes de prueba, y en algunas realizaciones 100 % de la pluralidad de genes de prueba. En algunas realizaciones, la pluralidad de genes de prueba incluye al menos 5, 6, 7 o al menos 8 genes del ciclo celular, que constituyen al menos 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 % o 90 % de la pluralidad de genes de prueba y, en algunas realizaciones, 100 % de la pluralidad de genes de prueba. Como quedará claro a partir del contexto de este documento, un panel de genes es una pluralidad de genes. Normalmente, estos genes se analizan juntos en una o más muestras de un paciente.
En algunas otras realizaciones, la pluralidad de genes de prueba incluye al menos 8, 10, 12, 15, 20, 25 o 30 genes del ciclo celular, que constituyen al menos 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 % o 90 % de la pluralidad de genes de prueba, y preferiblemente 100 % de la pluralidad de genes de prueba.
Como será evidente para un experto en la técnica informado sobre la presente invención y la divulgación en el presente documento, "muestra" indica cualquier muestra biológica que contiene una o más células sospechosas de melanoma, o uno o más ARN o proteína derivada de células sospechosas de melanoma, y obtenida de un paciente. Por ejemplo, una muestra de tejido obtenida de un lunar o nevos es una muestra útil en la presente invención. La muestra de tejido puede ser una muestra FFPE, o una muestra fresca congelada, y preferiblemente contiene en gran parte las células sospechosas. Una sola célula del presunto melanoma de un paciente también es una muestra útil. Dicha célula puede obtenerse directamente de la piel del paciente o purificarse del fluido corporal del paciente (por ejemplo, sangre, orina). Por lo tanto, un fluido corporal tal como sangre, orina, esputo y saliva que contenga una o más células sospechosas de ser cancerosas, o ARN o proteínas derivadas de lunares o nevo, también puede ser útil como muestra para practicar la presente invención.
Los expertos en la técnica están familiarizados con diversas técnicas para determinar el estado de un gen o una proteína en una muestra de tejido o célula, incluyendo, pero no limitado a, el análisis de microarreglos (por ejemplo, para analizar la expresión de ARNm o microARN, el número de copias, etc.), PCR™ cuantitativa en tiempo real ("qRT-PCR™", por ejemplo, TaqMan™), inmunoanálisis (por ejemplo, ELISA, inmunohistoquímica), etc. Se puede usar el nivel de actividad de un polipéptido codificado por un gen de la misma manera que el nivel de expresión del gen o polipéptido. A menudo, los niveles de actividad más altos indican niveles de expresión más altos y mientras que los niveles de actividad más bajos indican niveles de expresión más bajos. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la descripción proporciona cualquiera de los métodos discutidos anteriormente, en los que el nivel de actividad de un polipéptido codificado por el CCG se determina en lugar del nivel de expresión del CCG o además del mismo. Los expertos en la técnica están familiarizados con las técnicas para medir la actividad de diversas de estas proteínas, incluyendo las codificadas por los genes enumerados en la Tabla 1. Los métodos de la descripción pueden practicarse independientemente de la técnica particular utilizada.
En algunas realizaciones, también se obtiene la expresión de uno o más genes de normalización (a menudo denominados "constitutivos" o "de constitución") para su uso en la normalización de la expresión de genes de prueba. Como se usa en el presente documento, "genes de normalización" se refiere a los genes cuya expresión se usa para calibrar o normalizar la expresión medida del gen de interés (por ejemplo, genes de prueba). Es importante destacar que la expresión de los genes de normalización debe ser independiente del diagnóstico de cáncer, y la expresión de los genes de normalización es muy similar entre todas las muestras. La normalización asegura una comparación precisa de la expresión de un gen de prueba entre diferentes muestras. Para este propósito, se pueden usar genes constitutivos conocidos en la técnica. Los genes constitutivos son bien conocidos en la técnica, con ejemplos que incluyen, pero no se limitan a, GUSB (glucuronidasa, beta), HMBS (hidroximetilbilano sintasa), SDHA (complejo de succinato deshidrogenasa, subunidad A, flavoproteína), UBC (ubiquitina C), YWHAZ (proteína de activación de tirosina 3-monooxigenasa/triptófano 5-monooxigenasa, polipéptido zeta), MRFAP1, PSMA1, RPL13A, TXNL1, SLC25A3, RPS29, RPL8, PSMC1 y RPL4. Se pueden usar uno o más genes constitutivos. Preferiblemente, se utilizan al menos 2, 5, 10 o 15 genes constitutivos para proporcionar un conjunto de genes de normalización combinados. La cantidad de expresión génica de dichos genes de normalización puede promediarse, combinarse mediante sumas directas o mediante un algoritmo definido. Algunos ejemplos de genes constitutivos particularmente útiles para usar en los métodos y composiciones de la invención incluyen los enumerados en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2
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* Subconjunto de genes constitutivos utilizados, por ejemplo, en el Ejemplo 3.
En el caso de medir los niveles de ARN de los genes, un método conveniente y sensible es el ensayo PCR™ cuantitativo en tiempo real (PCRq), luego de una reacción de transcripción inversa. Normalmente, se determina un umbral de ciclo (Ct) para cada gen de prueba y cada gen de normalización, es decir, el número de ciclos en los que es detectable la fluorescencia de una reacción de PCRq por encima del antecedente.
La expresión global del uno o más genes de normalización puede representarse mediante un "valor de normalización" que puede generarse combinando la expresión de todos los genes de normalización, ya sea ponderada por igual (suma directa o promedio) o por diferentes coeficientes predefinidos. Por ejemplo, de la manera más sencilla, el valor de normalización Cm puede ser el umbral del ciclo (Ct) de un solo gen de normalización, o un promedio de los valores de Ct de 2 o más, preferiblemente 10 o más, o 15 o más genes de normalización, en cuyo caso, el coeficiente predefinido es 1/N, donde N es el número total de genes de normalización utilizados. Así, CtH= (CtHi CtH2 ■■■ CtHn)/N. Como será evidente para los expertos en la técnica, dependiendo de los genes de normalización utilizados y del peso que se desee dar a cada gen de normalización, cualquier coeficiente (de 0/N a N/N) se puede dar a los genes de normalización al ponderar la expresión de tales genes de normalización. Es decir, CtH = xCtHi+ yCtH2 + ■■■ z CtHn, en la que x y ■■■ z = 1.
Como se discutió anteriormente, los métodos de la descripción generalmente implican determinar el nivel de expresión de un panel de los CCG. Con técnicas modernas de alto rendimiento, a menudo es posible determinar el nivel de expresión de decenas, cientos o miles de genes. De hecho, es posible determinar el nivel de expresión del transcriptoma completo (es decir, cada secuencia transcrita en el genoma). Una vez que se ha realizado dicho ensayo global, se puede analizar informáticamente uno o más subconjuntos de transcritos (es decir, paneles o, como se usa a menudo en el presente documento, pluralidades de genes de prueba). Después de medir la expresión de cientos o miles de transcritos en una muestra, por ejemplo, se puede analizar (por ejemplo, informáticamente) la expresión de un panel o una pluralidad de genes de prueba que comprenden principalmente los CCG de acuerdo con la presente invención combinando los valores del nivel de expresión de los genes de prueba individuales para obtener un valor de la prueba.
Como será evidente para un experto en la técnica, el valor de la prueba proporcionado en la presente descripción representa el nivel de expresión global de la pluralidad de genes de prueba compuestos sustancialmente por genes del ciclo celular. En una realización, para proporcionar un valor de la prueba en los métodos de la invención, la expresión normalizada para un gen de prueba puede obtenerse normalizando el Ct medido para el gen de prueba frente a CtH, es decir, ACti = (Cti - CtH). Por lo tanto, el valor de la prueba que representa la expresión global de la pluralidad de genes de prueba puede proporcionarse combinando la expresión normalizada de todos los genes de prueba, ya sea mediante suma directa o promedio (es decir, ponderados por igual) o mediante un coeficiente predefinido diferente. Por ejemplo, el enfoque más simple es promediar la expresión normalizada de todos los genes de prueba: valor de la prueba = (ACti ACt2 ■■■ ACtn)/n. Como será evidente para los expertos en la técnica, dependiendo de los genes de prueba usados, también se puede dar un peso diferente a los diferentes genes de prueba en la presente invención. En cada caso en el que este documento divulga el uso de la expresión de una pluralidad de genes (por ejemplo, "determinar [en una muestra del paciente] la expresión de una pluralidad de genes de prueba" o "correlacionar el aumento de la expresión de dicha pluralidad de genes de prueba con un mayor probabilidad de tener melanoma"), esto incluye en algunas realizaciones el uso de un valor de la prueba que representa, corresponde o se deriva o calcula a partir de la expresión general de esta pluralidad de genes (por ejemplo, "determinar [en una muestra del paciente] un valor de la prueba que representa la expresión de una pluralidad de genes de prueba" o "correlacionar un valor de la prueba aumentado [o un valor de la prueba por encima de algún valor de referencia] (representando opcionalmente la expresión de dicha pluralidad de genes de prueba) con una probabilidad de respuesta aumentada").
Se ha determinado que, una vez que se aprecia el fenómeno de CCP informado en el presente documento, la elección de los CCG individuales para un panel de prueba a menudo puede ser un tanto arbitraria. En otras palabras, se ha descubierto que muchos CCG son muy buenos sustitutos entre sí. Por lo tanto, cualquier CCG (o panel de los CCG) puede usarse en las diversas realizaciones de la invención. En otras realizaciones de la invención, se utilizan los CCG optimizados. Una forma de evaluar si los CCG particulares servirán bien en los métodos y composiciones de la descripción es evaluando su correlación con la expresión media de los CCG (por ejemplo, todos los CCG conocidos, un conjunto específico de los CCG, etc.). Se espera que los CCG que se correlacionan particularmente bien con la media funcionen bien en los ensayos de la descripción, por ejemplo, porque reducirán el ruido en el ensayo.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los diversos aspectos de la descripción, la pluralidad de genes de prueba comprende los 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40 superiores o más CCG del Panel A. En algunas realizaciones de cada uno de los diversos aspectos de la descripción, la pluralidad de genes de prueba comprende los 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 CCG superiores del Panel B. En algunas realizaciones, la pluralidad de genes de prueba comprende al menos una cierta cantidad de los CCG (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más CCG) y esta pluralidad de los CCG comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los genes en el Panel B. En algunas realizaciones, la pluralidad de genes de prueba comprende al menos alguna cantidad de los CCG (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más CCG) y esta pluralidad de los CCG comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez de genes números 1 y 2, 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 1 a 6, 1 a 7, 1 a 8, 1 a 9 o 1 a 10 de cualquiera de los genes en el Panel B (con base en orden de aparición en la Tabla 1). En algunas realizaciones, la pluralidad de genes de prueba comprende al menos algún número de los CCG (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más CCG) y esta pluralidad de los CCG comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve o todos los genes números 2 y 3, 2 a 4, 2 a 5, 2 a 6, 2 a 7, 2 a 8, 2 a 9 o 2 a 10 de cualquiera de los genes en el Panel B (con base en el orden de aparición en la Tabla 1). En algunas realizaciones, la pluralidad de genes de prueba comprende al menos algún número de los CCG (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más CCG) y esta pluralidad de CCG comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho o todos los genes números 3 y 4, 3 a 5, 3 a 6, 3 a 7, 3 a 8, 3 a 9 o 3 a 10 de cualquiera de los genes en el Panel B (con base en el orden de aparición en la Tabla 1). En algunas realizaciones, la pluralidad de genes de prueba comprende al menos algún número de CCG (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más CCG) y esta pluralidad de los CCG comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete o todos los genes números 4 y 5, 4 a 6, 4 a 7, 4 a 8, 4 a 9 o 4 a 10 de cualquiera de los genes en el Panel B (basado en el orden de aparición en la Tabla 1).
En otra realización, la pluralidad de los CCG o panel de los CCG comprende cualquier conjunto de genes de la Tabla WW.
Genes inmunitarios y adicionales
Además, se ha descubierto sorprendentemente que los paneles de genes inmunitarios son diagnósticos para el melanoma. Por consiguiente, en otro aspecto de la presente divulgación, se divulgan paneles de genes que comprenden genes inmunitarios para su uso en la determinación de la expresión génica y para el diagnóstico y tratamiento del melanoma. En algunas realizaciones, el uso de paneles que comprenden genes inmunitarios comprende determinar la expresión de los genes inmunitarios en una muestra de un individuo o paciente.
"Gen inmunitario" en el presente documento se refiere a un gen asociado o expresado por uno o más leucocitos. En realizaciones particulares, los genes inmunitarios comprenden genes asociados o expresados por linfocitos. En algunas realizaciones, los genes inmunitarios comprenden genes expresados por linfocitos activados. En algunas realizaciones, los genes inmunitarios comprenden genes expresados por células T. En algunas realizaciones, los genes inmunitarios comprenden genes expresados por células T activadas. En algunas realizaciones, los genes inmunitarios comprenden los genes inmunitarios identificados en la Tabla 3, a continuación.
Tabla 3
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*Panel de 30 genes mixtos (Panel D); #panel de 28 genes inmunitarios (Panel E); Apanel de 8 genes inmunitarios (Panel F)
La expresión génica de genes inmunitarios se puede determinar como se describe anteriormente con respecto a los CCG. En una realización, se mide en la muestra la cantidad de ARN transcrito del panel de genes que incluye genes inmunitarios. Además, también se mide la cantidad de ARN de uno o más genes constitutivos en la muestra y se usa para normalizar o calibrar la expresión de los genes de prueba. Los términos "genes de normalización" y "genes constitutivos" se han definido anteriormente.
En cualquier realización que implique una "pluralidad de genes de prueba", la pluralidad de genes de prueba puede incluir al menos 2, 3 o 4 genes inmunitarios, que constituyen al menos 50 %, 75 % u 80 % de la pluralidad de genes inmunitarios, y en algunas realizaciones 100 % de la pluralidad de genes inmunitarios. En algunas realizaciones, la pluralidad de genes inmunitarios incluye al menos 5, 6, 7 o al menos 8 genes del ciclo celular, que constituyen al menos 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 % o 90 % de la pluralidad de genes inmunitarios y, en algunas realizaciones, 100 % de la pluralidad de genes inmunitarios. Como quedará claro a partir del contexto de este documento, un panel de genes es una pluralidad de genes. Normalmente, estos genes se analizan juntos en una o más muestras de un paciente.
En algunas otras realizaciones, la pluralidad de genes inmunitarios incluye al menos 8, 10, 12, 15, 20, 25 o 30 inmunitarios, que constituyen al menos 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 % o 90 % de la pluralidad de genes inmunitarios, y preferiblemente 100 % de la pluralidad de genes inmunitarios.
La muestra utilizada para determinar la expresión de los genes inmunitarios puede ser cualquier muestra descrita anteriormente para los CCG.
En el caso de medir los niveles de ARN para los genes inmunitarios, se puede utilizar el ensayo PCR™ cuantitativo en tiempo real (PCRq) con valores normalizados, como se describe anteriormente.
Como se discutió anteriormente, algunas realizaciones de los métodos divulgados generalmente implican determinar el nivel de expresión de un panel que comprende genes inmunitarios. En algunas realizaciones de los métodos divulgados, los genes pueden ensayarse en una o más ubicaciones a lo largo de la secuencia del gen. Con técnicas modernas de alto rendimiento, a menudo es posible determinar el nivel de expresión de decenas, cientos o miles de genes. De hecho, es posible determinar el nivel de expresión del transcriptoma completo (es decir, cada secuencia transcrita en el genoma). Una vez que se ha realizado dicho ensayo global, se puede analizar informáticamente uno o más subconjuntos de transcritos (es decir, paneles o, como se usa a menudo en el presente documento, pluralidades de genes de prueba). Después de medir la expresión de cientos o miles de transcritos en una muestra, por ejemplo, se puede analizar (por ejemplo, informáticamente) la expresión de un panel o una pluralidad de genes de prueba que comprenden principalmente genes inmunitarios de acuerdo con la presente descripción combinando los valores del nivel de expresión de los genes de prueba individuales para obtener un valor de la prueba.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los diversos aspectos de la descripción, la pluralidad de genes de prueba comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 o 28 genes inmunitarios del Panel E. En algunas realizaciones de cada uno de los diversos aspectos de la descripción, la pluralidad de genes de prueba comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 genes inmunitarios del Panel F. En algunas realizaciones, la pluralidad de genes de prueba comprende al menos cierto número de genes inmunitarios (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más genes inmunitarios) y esta pluralidad de genes inmunitarios comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o 28 de los genes en el Panel E, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 genes inmunitarios de Panel F
También se ha encontrado que genes adicionales pueden ser diagnósticos de melanoma. Sin estar ligado a la teoría, se cree que estos genes adicionales son genes no CCG y no inmunitarios, y comprenden ARPC2, BCL2A1, FABP7, FN1, GDF15, HEY1, KRT15, NCOA3, NR4A1, PHACTR1, PHIP, POU5F1, PRAME, PTN, RGS1, S100A9, SELL, SPP1, WIF1 y WNT2 (Panel G). Por consiguiente, en otro aspecto de la presente divulgación, se divulgan paneles de genes que comprenden estos genes adicionales para su uso en la determinación de la expresión génica y para el diagnóstico y tratamiento del melanoma.
En una realización, el panel que comprende estos genes adicionales: BCL2A1, FABP7, FN1, HEY1, KRT15, PHACTR1, PRAME, Pt N, RGS1, S100A9, SELL, y SPP1 (Panel H). En otra realización, el panel que comprende genes adicionales comprende PRAME y S100A9.
En realizaciones adicionales, esta divulgación proporciona paneles mixtos de genes que son útiles para determinar la expresión génica y para diagnosticar y tratar el melanoma. Estos paneles mixtos pueden comprender genes inmunitarios y los CCG, o genes inmunitarios y genes del Panel G o H, o los CCG y genes del panel G o H. En una realización, el panel mixto comprende uno o más CCG, uno o más genes inmunitarios, y uno o más genes adicionales del panel G. En una realización, el panel mixto comprende el Panel D. En otra realización, el panel mixto comprende PrAm E, S100A9 y los genes del panel F.
En otra realización, el panel mixto comprende uno o más CCG, uno o más genes inmunitarios y uno o más genes adicionales del panel H. En una realización de un panel mixto, el panel mixto (Panel I) comprende los genes del Panel C y los genes del Panel D.
En una realización de un panel mixto, el panel mixto comprende genes relacionados con S100A9 y/o S100A9. Los genes relacionados con S100A9 pueden incluir genes que tienen una expresión altamente correlacionada en comparación con S100A9. Estos genes relacionados con S100A9 pueden incluir genes que están estrechamente agrupados con S100A9 en el cromosoma 1. Estos genes relacionados con S100A9 también pueden incluir genes que tienen un control de transcripción similar al de S100A9. Las proteínas relacionadas con S100A9 también pueden ser parte de la misma vía biológica. Los genes relacionados con S100A9 también pueden codificar proteínas que interactúan con la proteína codificada por S100A9. Como ejemplo no limitativo, el panel mixto puede comprender S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, PI3, S100A10 y S100A14 (Panel J). Como ejemplo no limitativo, el panel mixto puede comprender S100A9, S100A7, S100A8, S100A12 y PI3 (Panel L).
En una realización alternativa, el panel mixto comprende PRAME. En otra realización, el panel mixto comprende S100A9. En otra realización más, el panel mixto comprende CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, Pt Pn 22 o PTPRC. En otras realizaciones, el panel mixto comprende S100A7, S100A8, S100A12, PI3, S100A10 y S100A14. En algunas realizaciones, el panel mixto comprende S100A9, S100A7, S100A8, S100A12 y PI3. Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los diversos aspectos de la invención, el panel de genes mixtos comprende 2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes relacionados con S100A9 del Panel J. En otras realizaciones de cada uno de los diversos aspectos de la invención, el panel de genes mixtos comprende 2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes relacionados con S100A9 del Panel L.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los diversos aspectos de la descripción, el panel de genes mixtos comprende PRAME, al menos uno de los genes del Panel J y al menos uno de los genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel mixto comprende PRAME, S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, S100A10, S100A14, PI3, CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22 y PTPRC.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los diversos aspectos de la descripción, el panel de genes mixtos comprende PRAME, al menos uno de los genes del Panel L y al menos uno de los genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel mixto comprende PRAME, S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, PI3, CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22 y PTPRC.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los diversos aspectos de la descripción, el panel de genes mixtos comprende PRAME, S100A9 y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mixtos comprende PRAME y al menos 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes del Panel J, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mixtos comprende PRAME, S100A9 y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del panel E. En algunas realizaciones, el panel de genes mixtos comprende PRAME, y en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes del Panel J, y al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del Panel E.
Por tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los diversos aspectos de la descripción, el panel de genes mixtos comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 genes del Panel D y S100A9, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 genes del panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mixtos comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 genes del Panel D y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes del Panel J, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 genes del Panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mixtos comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 genes del Panel D, S100A9, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del panel E. En algunas realizaciones, el panel de genes mixtos comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 genes del Panel D, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes del Panel J, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del Panel E.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los diversos aspectos de la descripción, el panel de genes mixtos comprende al menos al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del Panel G y S100A9, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 genes del Panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mixtos comprende al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del Panel G y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes del Panel J y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 genes del Panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mixtos comprende al menos 1 al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del Panel G, S100A9, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del Panel E. En algunas realizaciones, el panel de genes mixtos comprende al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del Panel G y al menos 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes del Panel J y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del Panel E.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de cada uno de los diversos aspectos de la descripción, el panel de genes mixtos comprende al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 genes del Panel H y S100A9, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 genes del Panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mixtos comprende al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 genes del Panel H, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes del Panel J y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 genes del Panel F. En algunas realizaciones, el panel de genes mixtos comprende al menos 1 al menos 1 al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 genes del Panel H, S100A9, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del panel E. En algunas realizaciones, el panel de genes mixtos comprende al menos 1 al menos 1 al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 genes del Panel H, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 genes del Panel J, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del Panel E.
En una realización, el panel comprende cualquier conjunto de dos genes de la Tabla XX. En otra realización, el panel comprende cualquier conjunto de tres genes de la Tabla YY. En otra realización, el panel comprende cualquier conjunto de cuatro genes de la Tabla ZZ.
En una realización de un panel de genes constitutivos, el panel constitutivo (Panel K) comprende uno o más genes para usar en la normalización de la expresión de genes de prueba. El Panel K puede estar formado por cualquier gen cuya expresión se utilice para calibrar o normalizar la expresión medida del gen o genes de interés. El Panel K puede estar formado por cualquier gen constitutivo o de constitución conocido en la técnica. Los ejemplos de genes constitutivos que se pueden usar en el Panel K incluyen CLTC, GUSB, HMBS, MMADHC, MRFAP1, PPP2CA, PSMA1, PSMC1, RPL13A, RPL37, RPL38, RPL4, RPL8, RPS29, SDHA, SLC25A3, TXNL1, UBA52, UBC, y YWHAZ. En algunas realizaciones, los genes constitutivos utilizados para normalizar la expresión de genes de prueba pueden incluir al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 genes del Panel K.
Métodos para determinar la expresión génica
Por consiguiente, en un primer aspecto, pero que no forma parte de la invención, hay un método para determinar la expresión génica en una muestra de un paciente (por ejemplo, uno que se sospecha que contiene melanoma). Generalmente, el método incluye al menos los siguientes pasos: (1) obtener una muestra de un paciente (por ejemplo, uno que se sospecha que contiene melanoma); (2) determinar la expresión de un panel de genes en la muestra; y (3) proporcionar un valor de la prueba al (a) ponderar la expresión determinada de cada gen del panel de genes con un coeficiente predefinido, y (b) combinar la expresión ponderada de cada gen del panel de genes para proporcionar dicho valor de la prueba.
La ponderación de la expresión de cada gen del panel de genes puede realizarse individualmente para cada gen, o los genes pueden agruparse primero y su expresión normalizada promediarse o combinarse de otro modo antes de realizar la ponderación. En algunas realizaciones, los genes se agrupan con base en si proporcionan información independiente para separar los nevos del melanoma. En algunos ejemplos, los CCG se agrupan antes de la ponderación. En otras realizaciones, los genes inmunitarios se agrupan antes de la ponderación. El experto en la técnica comprenderá que, en algunas realizaciones, la agrupación puede conceptualizarse como una forma de ponderar individualmente cada gen en el grupo predefinido para llegar a un valor intermedio, cuyo valor intermedio se pondera junto con otros valores de expresión génica individuales para obtener un valor final. En algunas realizaciones, se pueden realizar múltiples rondas de agrupación, dando como resultado múltiples valores intermedios, que a su vez se pueden agrupar para obtener un valor final.
En algunas realizaciones, se determinan coeficientes de ponderación que optimizan la contribución de cada perfil de expresión al valor predictivo de cualquier valor de la prueba resultante. En algunas realizaciones, los genes cuya expresión está más altamente correlacionada o anticorrelacionada con el melanoma reciben un coeficiente de ponderación mayor para maximizar el poder predictivo general de cualquier valor de la prueba resultante. En algunas realizaciones, los genes cuya expresión está correlacionada o anticorrelacionada con el melanoma, pero menos correlacionada con la expresión de otros genes en el panel, reciben un coeficiente de ponderación mayor para maximizar el poder predictivo general de cualquier valor de la prueba resultante. En algunas realizaciones, pueden agruparse genes cuya expresión está significativa, moderada o altamente correlacionada.
En algunas realizaciones, se utilizan análisis de regresión para obtener coeficientes de ponderación apropiados para maximizar el poder predictivo de un valor de la prueba. En algunas realizaciones, se usa la regresión lineal para ajustar los niveles de expresión a un modelo para proporcionar valores de prueba que son diagnósticos de melanoma. En otras realizaciones, se usa la regresión logística para determinar los coeficientes de ponderación para los niveles de expresión de genes individuales o grupos de genes en un modelo para el diagnóstico de melanoma.
En algunas realizaciones, ponderar la expresión de cada gen comprende agrupar los genes inmunológicos y luego ponderar la expresión de los genes inmunológicos, PRAME y S100A9 para llegar a un valor de la prueba que es diagnóstico para el melanoma. En realizaciones relacionadas, hay 8 genes inmunológicos. En realizaciones relacionadas, los genes inmunológicos comprenden el Panel F. En algunas realizaciones, la ponderación para llegar a un valor de la prueba es la siguiente: valor de la prueba = (A x PRAME) (B x inmunitario agrupado) (C x S100A9). En una realización relacionada, A es 0.525, Bis 0.677 y C es 0.357.
En algunas realizaciones, ponderar la expresión de cada gen comprende agrupar genes inmunológicos, agrupar genes relacionados con S100A9 y luego ponderar la expresión de genes inmunológicos, PRAME y los genes relacionados con S100A9 para llegar a un valor de la prueba que es diagnóstico para melanoma. En realizaciones relacionadas, hay 8 genes inmunológicos. En realizaciones relacionadas, los genes inmunológicos comprenden el Panel F. En realizaciones relacionadas, hay 7 genes relacionados con S100A9. En realizaciones relacionadas, los genes relacionados con S100A9 comprenden el Panel J. En realizaciones relacionadas, los genes relacionados con S100A9 comprenden el Panel L. En algunas realizaciones, la ponderación para llegar a un valor de la prueba es la siguiente: valor de la prueba = (A x PRAME) (B x agrupados inmunitario) (C x agrupados relacionados con S100A9). En una realización relacionada, A es 1.149, Bis 0.698 y C es 0.922.
En algunas realizaciones, ponderar la expresión de cada gen comprende agrupar genes inmunológicos, agrupar genes relacionados con S100A9 y luego ponderar la expresión de genes inmunológicos, PRAME y los genes relacionados con S100A9 y luego ajustar mediante un factor de escala lineal para llegar a un valor de la prueba que es diagnóstico de melanoma. En algunas realizaciones, el factor de escala lineal ajusta el valor de corte para que el valor de corte esté centrado alrededor de cero. En realizaciones relacionadas, hay 8 genes inmunológicos. En realizaciones relacionadas, los genes inmunológicos comprenden el Panel F. En realizaciones relacionadas, hay 7 genes relacionados con S100A9. En realizaciones relacionadas, los genes relacionados con S100A9 comprenden el Panel J. En realizaciones relacionadas separadas, los genes relacionados con S100A9 comprenden el Panel L. En algunas realizaciones, la ponderación para llegar a un valor de la prueba es la siguiente: valor de la prueba = (Ax PRAME) (B x inmunitario agrupado) (C x relacionado con S100A9 agrupado) D. En una realización relacionada, A es 1.149, B es 0.698, C es 0.922 y D es -0.334.
En algunas realizaciones, ponderar la expresión de cada gen comprende agrupar genes inmunitarios, agrupar genes relacionados con S100A9 y luego ponderar la expresión de genes inmunitarios, PRAME y los genes relacionados con S100A9 y luego ajustar mediante un factor de escala lineal para llegar a un valor de la prueba que es diagnóstico de melanoma. En alguna realización, el factor de escala lineal ajusta el valor de corte para que el valor de corte esté centrado alrededor de cero. En realizaciones relacionadas, hay 8 genes inmunitarios. En realizaciones relacionadas, los genes inmunitarios comprenden el Panel F. En realizaciones relacionadas, hay 5 genes relacionados con S100A9. En realizaciones relacionadas, los genes relacionados con S100A9 comprenden el Panel J. En realizaciones relacionadas separadas, los genes relacionados con S100A9 comprenden el Panel L. En algunas realizaciones, se analizan dos áreas del gen PRAME. En algunas realizaciones, la ponderación para llegar a un valor de la prueba es la siguiente: valor de la prueba = (A x PRAME) (B x inmunitario agrupado)+(C x relacionado con S100A9 agrupado) D. En algunas realizaciones A = 1.223, B = 0.704, C = 1.023 y D = 0.267.
En algunas realizaciones, un valor de la prueba derivado de los niveles de expresión se puede combinar con parámetros que no son de expresión para llegar a un valor de la prueba modificado o una puntuación que es diagnóstica para el melanoma. En algunas realizaciones, los factores clínicos pueden combinarse con un valor de la prueba derivado de los niveles de expresión para proporcionar una puntuación que sea diagnóstica para el melanoma. En realizaciones relacionadas, los datos de estadificación clínica pueden ponderarse y combinarse con un valor de la prueba basado en la expresión para obtener una puntuación que sea diagnóstica para el melanoma.
En algunas realizaciones se puede establecer una puntuación de referencia. En algunas realizaciones, las muestras pueden clasificarse correlacionando su puntuación de prueba con las puntuaciones de referencia. En algunas realizaciones, las puntuaciones de las pruebas pueden clasificarse como superiores o inferiores a la puntuación de referencia. En algunas realizaciones se pueden establecer dos puntuaciones de referencia, una primera y una segunda referencia. En algunas realizaciones, las muestras pueden clasificarse correlacionando su puntuación de prueba con las puntuaciones de referencia. En algunas realizaciones, las puntuaciones de las pruebas pueden clasificarse como por encima de uno, por encima de ambos, por debajo de uno, por debajo de ambos o entre las puntuaciones de referencia.
Métodos de diagnóstico de melanoma
En el presente documento también se proporcionan métodos para diagnosticar el melanoma. Generalmente, se proporciona un método para diagnosticar melanoma, que comprende a) determinar en una muestra de un individuo la expresión de un panel de genes; b) comparar la expresión del panel de genes en la muestra con la expresión del panel de genes en una o más muestras de control; y c) diagnosticar al individuo con melanoma, o concluir que es probable que el individuo tenga melanoma, basándose al menos en parte en una diferencia entre la expresión de uno o más genes del panel de genes en la muestra frente a la una o más muestras de control.
El paso de comparar la expresión del panel de genes se puede realizar directamente (es decir, obtener un valor de expresión para cada gen en el panel de genes en la muestra y en la una o más muestras de control, y determinar en una base gen por gen si hay una diferencia significativa entre la expresión en la muestra versus el uno o más controles). Alternativamente, se puede realizar implícitamente la comparación de la expresión del panel de genes en la muestra con la expresión en una o más muestras de control. En algunas realizaciones, la comparación implícita se logra construyendo un modelo basado en la una o más muestras de control y determinando dónde encaja la expresión del panel de genes en la muestra individual dentro del modelo. En una realización, la comparación implícita de la expresión del panel de genes en la muestra con una o más muestras de control comprende utilizar un conjunto predeterminado de coeficientes de ponderación basados en el análisis de la una o más muestras de control para ponderar la expresión del panel de genes en la muestra y llegar a un valor de la prueba. En una realización relacionada, el valor de la prueba se compara con un valor de corte predeterminado basado en el análisis de la una o más muestras de control para lograr una comparación implícita.
En algunas realizaciones, los métodos de diagnóstico comprenden además comunicar que es probable que el individuo tenga melanoma.
Como se usa en el presente documento, "comunicar" una pieza particular de información significa dar a conocer dicha información a otra persona o transferir dicha información a una cosa (por ejemplo, un ordenador). En algunos métodos de la invención, se comunica el diagnóstico de un paciente o la probabilidad de que tenga melanoma. En algunas realizaciones, se comunica la información utilizada para llegar a tal diagnóstico o predicción de probabilidad. Esta comunicación puede ser auditiva (por ejemplo, verbal), visual (por ejemplo, escrita), electrónica (por ejemplo, datos transferidos desde un sistema informático a otro), etc. En algunas realizaciones, comunicar un diagnóstico o probabilidad de melanoma comprende generar un informe que comunica el diagnóstico o la probabilidad de melanoma. En algunas realizaciones, el informe es un informe en papel, un informe auditivo o un registro electrónico. En algunas realizaciones, el informe se muestra y/o almacena en un dispositivo informático (por ejemplo, dispositivo portátil, ordenador de escritorio, dispositivo inteligente, sitio web, etc.). En algunas realizaciones, el diagnóstico o la probabilidad de melanoma se comunica a un médico (por ejemplo, se proporciona al médico un informe que comunica la clasificación). En algunas realizaciones, el diagnóstico o la probabilidad de melanoma se comunican a un paciente (por ejemplo, se proporciona al paciente un informe que comunica la clasificación). La comunicación de un diagnóstico o probabilidad de melanoma también se puede lograr mediante la transferencia de información (por ejemplo, datos) que incorpora la clasificación a un ordenador servidor y permitiendo que un intermediario o usuario final acceda a dicha información (por ejemplo, al ver la información tal como se muestra en el servidor, mediante la descarga de la información en la forma de uno o más archivos transferidos desde el servidor al dispositivo del intermediario o del usuario final, etc.).
Siempre que una realización de la invención comprenda concluir algún hecho (por ejemplo, la probabilidad de que un paciente tenga melanoma), esto puede incluir un programa informático que concluya dicho hecho, típicamente después de realizar un algoritmo que aplica información sobre la expresión del panel de genes en la muestra, como se describió anteriormente.
En algunas realizaciones, el método de diagnóstico incluye (1) obtener una muestra de un paciente del que se sospecha que tiene melanoma; (2) determinar la expresión de un panel de genes en la muestra que incluye al menos 2, 4, 6, 8 o 10 genes del ciclo celular, o al menos 2, 4, 6 u 8 genes inmunitarios; y (3) proporcionar un valor de la prueba (a) ponderar la expresión determinada de cada uno de una pluralidad de genes de prueba seleccionados del panel de genes con un coeficiente predefinido, y (b) combinar la expresión ponderada para proporcionar dicho valor de la prueba, donde al menos 20 %, 50 %, al menos 75 % o al menos 90 % de dicha pluralidad de genes de prueba son genes del ciclo celular, y donde la alta expresión (o expresión aumentada o sobreexpresión) de la pluralidad de genes de prueba indica una mayor probabilidad de tener melanoma. En algunas realizaciones, el método comprende al menos uno de los siguientes pasos: (a) correlacionar la expresión alta (o expresión aumentada o sobreexpresión) de la pluralidad de genes de prueba con una probabilidad aumentada de tener melanoma; (b) concluir que el paciente tiene una probabilidad aumentada de tener melanoma basándose al menos en parte en la expresión alta (o expresión aumentada o sobreexpresión) de la pluralidad de genes de prueba; o (c) comunicar que el paciente tiene una mayor probabilidad de tener melanoma basándose al menos en parte en la alta expresión (o mayor expresión o sobreexpresión) de la pluralidad de genes de prueba. En algunas realizaciones, el método comprende al menos uno de los siguientes pasos: (a) correlacionar los niveles de expresión mixtos de la pluralidad de genes de prueba con una probabilidad indeterminada de tener un melanoma medido en una muestra son (b) concluir que el paciente puede o no tener una mayor probabilidad de tener un melanoma basándose, al menos en parte, en expresión mixta de la pluralidad de genes de prueba; o (c) comunicar que el paciente tiene una probabilidad indeterminada de tener melanoma basándose al menos en parte en la expresión mixta (o expresión aumentada o sobreexpresión) de la pluralidad de genes de prueba.
En algunas realizaciones, los niveles de expresión medidos en una muestra se usan para derivar o calcular un valor o puntuación, como se describe anteriormente. Este valor puede derivarse únicamente de los niveles de expresión u, opcionalmente, derivarse de una combinación de las puntuaciones del valor de expresión con otros componentes (por ejemplo, estadificación clínica, etc.) para dar un valor/puntuación potencialmente más completo. Por lo tanto, en todos los casos en los que una realización de la descripción descrita en el presente documento implique determinar el estado de un biomarcador (por ejemplo, CCGS, genes inmunitarios o genes adicionales, según se define), las realizaciones relacionadas implican derivar o calcular un valor o puntuación a partir del estado medido (por ejemplo, puntuación de expresión o puntuación combinada).
En algunas de tales realizaciones, las puntuaciones múltiples (por ejemplo, el valor de la prueba de expresión y los parámetros clínicos, tal como la estadificación clínica) se pueden combinar en una puntuación más completa. Las puntuaciones de las pruebas de un solo componente (por ejemplo, CCG) o combinadas para un paciente en particular se pueden comparar con las puntuaciones de un solo componente o combinadas para las poblaciones de referencia, con diferencias entre las puntuaciones de la prueba y de referencia que se correlacionan o son indicativas de alguna característica clínica. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la descripción proporciona un método para determinar un diagnóstico de melanoma que comprende (1) obtener los niveles de expresión medidos de un panel de genes en una muestra del paciente, (2) calcular un valor de la prueba a partir de estos niveles de expresión medidos, (3) comparar dicho valor de la prueba con un valor de referencia calculado a partir de los niveles de expresión medidos del panel de genes en una población de referencia de pacientes, y (4)(a) correlacionar un valor de la prueba mayor que el valor de referencia con un diagnóstico de melanoma o (4) (b) correlacionar un valor de la prueba igual o menor que el valor de referencia con un diagnóstico benigno.
En algunas de tales realizaciones, las puntuaciones múltiples (por ejemplo, el valor de la prueba de expresión y los parámetros clínicos, tal como la estadificación clínica) se pueden combinar en una puntuación más completa. Las puntuaciones de las pruebas de un solo componente (por ejemplo, CCG) o combinadas para un paciente en particular se pueden comparar con las puntuaciones de un solo componente o combinadas para las poblaciones de referencia, con diferencias entre las puntuaciones de la prueba y de referencia que se correlacionan o son indicativas de alguna característica clínica. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la descripción proporciona un método para determinar un diagnóstico de melanoma que comprende (1) obtener los niveles de expresión medidos de un panel de genes en una muestra del paciente, (2) calcular un valor de la prueba a partir de estos niveles de expresión medidos, (3) comparar dicho valor de la prueba con un valor de referencia calculado a partir de los niveles de expresión medidos del panel de genes en una población de referencia de pacientes, y (4) correlacionar un valor de la prueba con uno de dos valores de referencia donde (a) un valor de la prueba igual o mayor que el primer valor de referencia se correlaciona con un diagnóstico de melanoma, (b) un valor de la prueba igual o menor que el primer valor de referencia pero mayor que el segundo valor de referencia se correlaciona con un diagnóstico indeterminado, o (c) un valor de la prueba igual o menor que el segundo valor de referencia se correlaciona con un diagnóstico benigno.
En algunas de tales realizaciones, el valor de la prueba se calcula promediando la expresión medida de los genes del panel (como se analiza a continuación). En algunas realizaciones, el valor de la prueba se calcula ponderando cada panel de genes de una manera particular, como se describe anteriormente.
En algunas realizaciones, la puntuación combinada incluye la puntuación de CCP como se definió previamente. En algunas realizaciones, la puntuación combinada incluye una puntuación inmunitaria como se demuestra en los Ejemplos. En algunas realizaciones, la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en un panel de genes inmunitarios. En algunas realizaciones, la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes de la Tabla 30. La puntuación inmunitaria puede ser cualquier valor usado para representar la expresión de uno o más genes inmunitarios como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en un panel de genes inmunitarios. En algunas realizaciones, la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en el Panel D. En algunas realizaciones, la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en un panel de genes inmunitarios. En algunas realizaciones, la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en el Panel E. En algunas realizaciones, la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en un panel de genes inmunitarios. En algunas realizaciones, la puntuación inmunitaria es un promedio de la expresión de los genes en el Panel F. Una puntuación combinada también puede incluir genes individuales con valor predictivo independiente y otros factores clínicos no basados en la expresión. Las puntuaciones de CCP e inmunitarias pueden ser una variable numérica continua.
En algunas realizaciones, la puntuación combinada se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:
(1) Puntuación combinada = A*(puntuación PCC) + B*(puntuación inmunitaria) +
{C*expresión del gen Xadicional) + D*expresión adicional del gen Y...}
Donde X e Y representan cualquier gen adicional de diagnóstico como se describe en el presente documento, y los puntos suspensivos indican que se pueden agregar genes adicionales extra, cada uno con su propio coeficiente.
Además, en algunas realizaciones, la puntuación combinada se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:
(2) Puntuación combinada = B*(puntuación inmunitaria) + {C*expresión adicional del gen X)
+D*expresión adicional del gen Y ...}
Donde X e Y representan cualquier gen adicional de diagnóstico como se describe en el presente documento, y los puntos suspensivos indican que se pueden agregar genes adicionales extra, cada uno con su propio coeficiente. En una realización relacionada, el gen X adicional es PRAME y el gen Y adicional es S100A9.
Además, en otras realizaciones más, la puntuación combinada se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: (3) Puntuación combinada = B*(puntuación inmunitaria) + {C*(expresión adicional del gen X) D*expresión adicional del gen Y...} + factor de ajuste
Donde X e Y representan cualquier gen adicional de diagnóstico como se describe en el presente documento, y los puntos suspensivos indican que se pueden agregar genes adicionales extra, cada uno con su propio coeficiente. El factor de ajuste representa un factor escalar que se puede utilizar para ajustar la puntuación lineal. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el factor de ajuste puede ajustar la puntuación de un valor de corte particular de manera que el valor de corte se centre en cero. En una realización relacionada, el gen X adicional es PRAME y el gen Y adicional es S100A9.
Además, en otras realizaciones más, la puntuación combinada se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: (4)
Puntuación combinada = B*(puntuación inmunitaria) {C*(puntuación S100) D*expresión del gen Y adicional...} + factor de ajuste
Donde Y representa cualquier gen adicional de diagnóstico como se describe en el presente documento, y los puntos suspensivos indican que se pueden agregar genes adicionales extra, cada uno con su propio coeficiente. El factor de ajuste representa un factor escalar que se puede utilizar para ajustar la puntuación lineal. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el factor de ajuste puede ajustar la puntuación de un valor de corte particular de manera que el valor de corte se centre en cero. La puntuación S100 puede ser cualquier valor usado para representar la expresión de uno o más genes relacionados con S100A9 y/o S100A9 como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la puntuación S100 es un promedio de la expresión de los genes en un panel de genes relacionados con S100A9 y/o S100A9. En una realización relacionada, la puntuación S100 es un promedio de la expresión de los genes en el Panel J. En una realización relacionada, la puntuación S100 es un promedio de la expresión de los genes en el Panel L. En una realización relacionada, la puntuación S100 es un promedio de la expresión de S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, PI3, S100A10 y S100A14. En una realización relacionada, la puntuación S100 es un promedio de la expresión de S100A9, S100A7, S100A8, S100A12 y PI3. En una realización relacionada, el gen Y adicional es PRAME.
En algunas realizaciones, la fórmula (1) se usa en los métodos, sistemas, etc. de la descripción para diagnosticar a un paciente con melanoma. En algunas realizaciones, la fórmula (2) se usa en los métodos, sistemas, etc. de la descripción para diagnosticar un paciente con melanoma. En algunas realizaciones, la fórmula (3) se usa en los métodos, sistemas, etc. de la descripción para diagnosticar un paciente con melanoma. En algunas realizaciones, la fórmula (4) se usa en los métodos, sistemas, etc. de la descripción para diagnosticar un paciente con melanoma. En algunas realizaciones, la puntuación de CCP es la media no ponderada de los valores de CT para la expresión de los genes CCP que se analizan, opcionalmente normalizada por la media no ponderada de los genes HK, de modo que
los valores más altos indican una expresión más alta (en algunas realizaciones, una unidad es equivalente a un cambio
doble en la expresión). En algunas realizaciones, la puntuación de CCP oscila entre -8 y 8 o entre -1.6 y 3.7.
En algunas realizaciones A = 0.95, B = 0.61, C = 0.90 (cuando corresponda) y D = 1.00 (cuando corresponda); A=
0.57 y B= 0.39; o A= 0.58 y B = 0.41. En algunas realizaciones, A, B, C, D y/o el factor de ajuste están dentro del redondeo de estos valores (por ejemplo, A está entre 0.945 y 0.954, etc.). En algunos casos, es posible que una fórmula no tenga todos los coeficientes especificados (y, por lo tanto, no incorpore las variables correspondientes).
Por ejemplo, la realización mencionada inmediatamente antes puede aplicarse a la fórmula (2) de modo que B en la fórmula (2) sea 0.61, C = 0.90 (cuando corresponda) y D = 1.00 (cuando corresponda). A no sería aplicable ya que
este coeficiente y su correspondiente variable no se encuentran en la fórmula (2). En algunas realizaciones, A está
entre 0.9 y 1, 0.9 y 0.99, 0.9 y 0.95, 0.85 y 0.95, 0.86 y 0.94, 0.87 y 0.93, 0.88 y 0.92, 0.89 y 0.91, 0.85 y 0.9, 0.8 y
0.95, 0.8 y 0.9, 0.8 y 0.85, 0.75 y 0.99, 0.75 y 0.95, 0.75 y 0.9, 0.75 y 0.85, o entre 0.75 y 0.8. En algunas realizaciones,
B está entre 0.40 y 1, 0.45 y 0.99, 0.45 y 0.95, 0.55 y 0.8, 0.55 y 0.7, 0.55 y 0.65, 0.59 y 0.63, o entre 0.6 y 0.62. En algunas realizaciones C es, en su caso, entre 0.9 y 1.5, entre 0.9 y 1.4, entre 0.9 y 1.3, entre 0.9 y 1.25, entre 0.9 y
1.20, entre 0.9 y 1.15, entre 0.9 y 1.10, entre 0.9 y 1.05, entre 0.9 y 1, 0.9 y 0.99, 0.9 y 0.95, 0.85 y 0.95, 0.86 y 0.94,
0.87 y 0.93, 0.88 y 0.92, 0.89 y 0.91, 0.85 y 0.9, 0.8 y 0.95, 0.8 y 0.9, 0.8 y 0.85, 0.75 y 0.99, 0.75 y 0.95, 0.75 y 0.9,
0.75 y 0.85, o entre 0.75 y 0.8. En algunas realizaciones D es, en su caso, entre 0.9 y 1.5, entre .9 y 1.4, entre 0.9 y
I . 3, entre 0.9 y 1.25, entre 0.9 y 1.20, entre 0.9 y 1.15, entre 0.9 y 1.10, entre 0.9 y 1.05, 0.9 y 1, 0.9 y 0.99, 0.9 y 0.95,
0.85 y 0.95, 0.86 y 0.94, 0.87 y 0.93, 0.88 y 0.92, 0.89 y 0.91, 0.85 y 0.9, 0.8 y 0.95, 0.8 y 0.9, 0.8 y 0.85, 0.75 y 0.99,
0.75 y 0.95, 0.75 y 0.9, 0.75 y 0.85, o entre 0.75 y 0.8
En algunas realizaciones A está entre 0.1 y 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.2 y 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
I I , 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.3 y 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.4 y 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o
20; o entre 0.5 y 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.6 y
0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.7 y 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5,
3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.8 y 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.9 y 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1 y
1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1.5 y 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2 y 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2.5 y 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3 y 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o ent 3.5 y 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4 y 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o ent 4.5 y 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 5 y 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 6 y 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 7 y 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 8 y 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre
9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 10 y 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 11 y 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 12 y 13,
14, 15, o 20; o entre 13 y 14, 15, o 20; o entre 14 y 15, o 20; o entre 15 y 20; B está entre 0.1 y 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6,
0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.2 y 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7,
0. 8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.3 y 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9,
1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.4 y 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5,
3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.5 y 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.6 y 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, o 20; o entre 0.7 y 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.8 y
0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.9 y 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1 y 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1.5 y 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2 y 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2.5 y 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3 y 3.5, 4, 4.5, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3.5 y 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4 y 4.5, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4.5 y 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 5 y 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 6 y 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 7 y 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 8 y 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 10 y 11, 12, 13, 14, 15, o 20;
o entre 11 y 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 12 y 13, 14, 15, o 20; o entre 13 y 14, 15, o 20; o entre 14 y 15, o 20; o entre
15 y 20; está, si aplica, entre 0.1 y 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.2 y 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.3 y 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.4 y 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o
entre 0.5 y 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.6 y 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.7 y 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.8 y 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.9 y 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1 y 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1.5 y 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2 y 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2.5 y 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3 y 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3.5 y 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4 y 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4.5 y 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 5 y 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 6 y 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 7 y 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 8 y 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 10 y 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 11 y 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 12 y 13, 14, 15, o 20; o entre 13 y 14, 15, o 20; o entre 14 y 15, o 20; o entre 15 y 20; y D está, si aplica, entre 0.1 y 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.2 y 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.3 y 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.4 y 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.5 y 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.6 y 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.7 y 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.8 y 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 0.9 y 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1 y 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 1.5 y 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2 y 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 2.5 y 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3 y 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 3.5 y 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4 y 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 4.5 y 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 5 y 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 6 y 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 7 y 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 8 y 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 9 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 10 y 11, 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 11 y 12, 13, 14, 15, o 20; o entre 12 y 13, 14, 15, o 20; o entre 13 y 14, 15, o 20; o entre 14 y 15, o 20; o entre 15 y 20; y el factor de ajuste es, en su caso, positivo o negativo y puede ser infinitamente grande o infinitamente pequeño. En algunas realizaciones, A, B, C, y/o D, está dentro del redondeo de cualquiera de estos valores (por ejemplo, A está entre 0.45 y 0.54, etc.).
Como se usa en el presente documento, un paciente tiene una "probabilidad aumentada" de alguna característica o resultado clínico (por ejemplo, tener melanoma) si la probabilidad de que el paciente tenga la característica o resultado excede alguna probabilidad o valor de referencia. La probabilidad de referencia puede ser la probabilidad de la característica o el resultado en la población general de pacientes relevante. Por ejemplo, si la probabilidad de tener melanoma en la población general es X % y se ha determinado mediante los métodos de la presente invención que un paciente en particular tiene una probabilidad de Y % de tener melanoma, y si Y > X, entonces el paciente tiene un "mayor probabilidad" de tener melanoma. Alternativamente, como se ha comentado anteriormente, se puede determinar un valor umbral o de referencia y se puede comparar la probabilidad de que un paciente en particular tenga melanoma con ese umbral o referencia.
En algunas realizaciones, el método correlaciona la puntuación específica del paciente (por ejemplo, puntuación de CCP, puntuación combinada de CCP con variables clínicas) con una probabilidad específica (por ejemplo, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, 100 %) o probabilidad de tener melanoma.
En algunas realizaciones, el método incluye la clasificación de la muestra como benigna, maligna o indeterminada basándose, al menos en parte, en la comparación de la puntuación de la prueba con una o más puntuaciones de referencia. En algunas realizaciones, una puntuación de prueba por debajo de una puntuación de referencia primera y segunda indica que la muestra es benigna. En algunas realizaciones, una muestra se clasifica como indeterminada cuando la puntuación de la prueba está entre una referencia primera y segunda. En algunas realizaciones, una puntuación de la prueba por encima de una puntuación de referencia primera y segunda indica que la muestra es benigna. En algunas realizaciones, la puntuación de la prueba y las puntuaciones de referencia pueden transformarse de manera que una puntuación de la prueba por encima de una puntuación de referencia primera y segunda indica que la muestra es maligna, y una puntuación de la prueba por debajo de una puntuación de referencia primera y segunda indica que la muestra es benigna. En algunas realizaciones, el método de diagnóstico incluye (1) obtener una muestra de un paciente del que se sospecha que tiene melanoma; (2) determinar la expresión de un panel de genes en la muestra; (3) calcular los valores o puntuaciones de las pruebas; y (4) proporcionar un informe que comunique el valor o las puntuaciones de la prueba. En algunas realizaciones, el informe es un informe en papel, un informe auditivo o un registro electrónico. En algunas realizaciones, el informe es visualizado y/o almacenado en un dispositivo informático (por ejemplo, dispositivo portátil, ordenador de escritorio, dispositivo inteligente, sitio web, etc.). En algunas realizaciones, el informe se comunica a un médico (por ejemplo, se proporciona al médico un informe que comunica los valores o puntuaciones de la prueba). En algunas realizaciones, el informe se comunica a un paciente (por ejemplo, se proporciona al paciente un informe que comunica los valores o puntuaciones de la prueba). También se puede proporcionar un informe mediante la transferencia de información (por ejemplo, datos) que incorpora los valores o puntuaciones de la prueba a un ordenadora servidor y permitiendo que un intermediario o usuario final acceda a dicha información (por ejemplo., al ver la información tal como se muestra en el servidor, descargando la información en forma de uno o más archivos transferidos desde el servidor al dispositivo intermediario o del usuario final, etc.).
En otras realizaciones, el informe puede comunicar puntuaciones derivadas de diferentes fuentes y otra información relevante del paciente. Por ejemplo, el informe puede comunicar puntuaciones derivadas únicamente de los niveles de expresión. El informe también puede informar las puntuaciones calculadas por la fórmula (1), la fórmula (2), la fórmula (3) y/o la fórmula (4). Alternativamente, el informe puede comunicar puntuaciones derivadas de una combinación de puntuaciones de valores de expresión con otros componentes (por ejemplo, estadificación clínica, antecedentes personales/familiares, resultados de dermatopatología, etc.) para brindar una puntuación potencialmente más completa. En otros casos, el informe puede comunicar múltiples puntuaciones (por ejemplo, valor de la prueba de expresión y parámetros clínicos, tales como la estadificación clínica) y/o una puntuación más completa. El informe también puede comunicar puntuaciones para genes individuales. En algunos casos, el informe puede comunicar puntuaciones junto con valores de referencia o de control. Algunos informes pueden comunicar una probabilidad específica (por ejemplo, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, 100 %) o probabilidad de tener melanoma. Otros informes pueden comunicar la clasificación de la muestra como benigna o maligna, predicciones de riesgo de melanoma, comparaciones de riesgo de melanoma, elementos clínicamente procesables, recomendaciones para el manejo del riesgo de cáncer y/o recomendaciones para el tratamiento. Sin embargo, otros informes pueden incluir antecedentes médicos personales y familiares.
Métodos para tratar el melanoma
En un aspecto, la presente descripción proporciona métodos para tratar a un paciente que comprenden obtener información sobre el estado de la expresión génica para un panel de genes (por ejemplo, obtenida mediante el método descrito en el presente documento) y recomendar un tratamiento, recetar un tratamiento, administrar un tratamiento, crear un plan de tratamiento, o modificar un plan de tratamiento para el paciente con base en el estado de expresión génica. En algunas realizaciones, el método comprende obtener el estado de expresión de CCG. En algunas realizaciones, el método comprende obtener el estado de expresión del gen inmunitario. En algunas realizaciones, el método comprende obtener el estado de expresión de genes adicionales como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la descripción proporciona un método para tratar a un paciente que comprende:
(1) determinar el estado de al menos un CCG;
(2) determinar el estado de al menos un gen inmunitario;
(3) determinar el estado de al menos un gen adicional; y
(4) recomendar, prescribir o administrar ya sea
(a) un tratamiento activo (incluso agresivo) si el paciente tiene al menos uno de aumento de la expresión del CCG, aumento de la expresión del gen inmunitario o expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control, o
(b) un tratamiento pasivo (o menos agresivo) si el paciente no tiene expresión aumentada del CCG, expresión aumentada del gen inmunitario o expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control.
En una realización relacionada, la descripción proporciona un método para tratar a un paciente que comprende:
(1) determinar el estado de al menos un gen inmunitario;
(2) determinar el estado de al menos un gen adicional; y
(3) recomendar, prescribir o administrar ya sea
(a) un tratamiento activo (incluso agresivo) si el paciente tiene al menos una expresión aumentada de un gen inmunitario, o la expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control, o
(b) un tratamiento pasivo (o menos agresivo) si el paciente no tiene una mayor expresión del gen inmunitario, o la expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control. En una realización relacionada, la descripción proporciona un método para
tratar a un paciente que comprende:
(1) determinar el estado de al menos un gen inmunitario;
(2) determinar el estado de al menos un gen adicional; y
(3) crear un plan de tratamiento que comprende
(a) componentes de terapia más agresivos si el paciente tiene al menos una expresión aumentada de un gen inmunitario, o la expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control, o
(b) componentes de terapia menos agresivos si el paciente no tiene expresión aumentada del gen inmunitario, o expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control; y
(4) implementar el plan de tratamiento. En un aspecto, la presente descripción proporciona métodos para tratar a un paciente que comprende obtener información sobre el estado de la expresión génica para un panel de genes (por ejemplo, obtenida mediante el método descrito en el presente documento) y recomendar un tratamiento, prescribir un tratamiento, administrar un tratamiento, crear un plan de tratamiento o modificar un plan de tratamiento para el paciente basado en el estado de expresión génica. En algunas realizaciones, el método comprende obtener el estado de expresión de CCG. En algunas realizaciones, el método comprende obtener el estado de expresión del gen inmunitario. En algunas realizaciones, el método comprende obtener el estado de expresión de genes adicionales como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la descripción proporciona un método para tratar a un paciente que comprende:
(1) determinar el estado de al menos un CCG;
(2) determinar el estado de al menos un gen inmunitario;
(3) determinar el estado de al menos un gen adicional; y
(4) recomendar, prescribir o administrar cualquiera de
(a) un tratamiento activo (incluso agresivo) si el paciente tiene al menos una expresión aumentada del CCG, expresión aumentada del gen inmunitario o expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control,
(b) un tratamiento pasivo (o menos agresivo) si el paciente no tiene expresión aumentada del CCG, expresión aumentada del gen inmunitario o expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control,
(c) un plan de tratamiento intermedio si el paciente tiene una expresión mixta aumentada, disminuida o neutra de los genes CCG, inmunitarios o adicionales en comparación con la expresión en una muestra de control.
En una realización relacionada, la descripción proporciona un método para tratar a un paciente que comprende: (1) determinar el estado de al menos un gen inmunitario;
(2) determinar el estado de al menos un gen adicional; y
(3) recomendar, prescribir o administrar cualquiera de
(a) un tratamiento activo (incluso agresivo) si el paciente tiene al menos una expresión aumentada de un gen inmunitario, o la expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control, o
(b) un tratamiento pasivo (o menos agresivo) si el paciente no tiene expresión aumentada del gen inmunitario, o expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control, o
(c) un tratamiento intermedio si los pacientes tienen alguna expresión mixta aumentada, disminuida o neutra de los genes CCG, inmunitarios o adicionales en comparación con la expresión en una muestra de control.
En una realización relacionada, la descripción proporciona un método para tratar a un paciente que comprende: (1) determinar el estado de al menos un gen inmunitario;
(2) determinar el estado de al menos un gen adicional; y
(3) crear un plan de tratamiento que comprenda cualquiera de
(a) componentes de terapia más agresivos si el paciente tiene al menos una expresión aumentada de un gen inmunitario, o la expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control, o
(b) componentes de terapia menos agresivos si el paciente no tiene una mayor expresión del gen inmunitario, o la expresión de un gen adicional que difiere significativamente de la expresión en una muestra de control, o
(c) un tratamiento intermedio si los pacientes tienen una expresión mixta aumentada, disminuida o neutra de los genes CCG, inmunitarios o adicionales en comparación con la expresión en una muestra de control; y
(4) implementar el plan de tratamiento.
En algunas realizaciones, los pasos de recomendación, prescripción o administración comprenden recibir un informe que comunica el estado de expresión relevante (por ejemplo, estado CCG). En algunas realizaciones, el paso de crear un plan de tratamiento comprende recibir un informe que comunica el estado de la expresión relevante (por ejemplo, el estado CCG). En algunas realizaciones, este informe comunica dicho estado de manera cualitativa (por ejemplo, expresión "alta" o "aumentada"). En algunas realizaciones, este informe comunica dicho estado indirectamente mediante la comunicación de un valor de prueba o puntuación (por ejemplo, puntuación que refleja la probabilidad de tener melanoma, etc.) que incorpora dicho estado.
Si un tratamiento es agresivo o no, generalmente dependerá del diagnóstico o la probabilidad de tener melanoma. Para las personas diagnosticadas con melanoma o que tienen una alta probabilidad de tener melanoma, se prefiere un tratamiento agresivo. Los expertos en la técnica están familiarizados con otros tratamientos agresivos y menos agresivos para cada tipo de cáncer. Por otro lado, si un individuo tiene una probabilidad baja de tener melanoma, se podría prescribir una terapia menos agresiva. Por lo tanto, para una persona que tiene un riesgo bajo de tener melanoma, un proveedor médico podría recomendar un régimen de "espera vigilante". Si una persona tiene una probabilidad indeterminada de tener melanoma, se podrían prescribir más pruebas. Por lo tanto, para un individuo que tenga una puntuación indeterminada, un proveedor médico podría recomendar más pruebas de la lesión.
Los expertos en la técnica conocen una variedad de tratamientos y/o terapias para el melanoma. Esta gama de terapias para el melanoma puede variar en su agresividad. En general, a medida que aumenta la agresividad de la terapia del melanoma, aumenta la eficacia del tratamiento, pero también aumentan los efectos adversos para el paciente. Los expertos en la técnica pueden entender que la agresividad de la terapia del melanoma que se usa para tratar al paciente debe equilibrarse para tener en cuenta tanto la eficacia del tratamiento como los efectos adversos que probablemente experimentará el paciente. Por lo tanto, el experto en la técnica buscará maximizar la eficacia del tratamiento mientras minimiza los efectos adversos del tratamiento seleccionando un nivel apropiado de agresividad adaptado al paciente individual. El nivel apropiado de tratamiento se puede seleccionar basándose, al menos en parte, en el informe que comunica el estado de la expresión relevante.
En algunas realizaciones, un experto en la técnica puede incorporar el informe que comunica el estado de expresión relevante en la selección de la agresividad del tratamiento. Un informe que comunique una puntuación que indique una probabilidad alta de melanoma indicaría un tratamiento más agresivo, mientras que un informe que comunique una puntuación que indique una probabilidad más baja de melanoma indicaría un tratamiento menos agresivo. En algunas realizaciones, un tratamiento menos agresivo puede comprender la eliminación del melanoma sospechado durante una biopsia. En algunas realizaciones, un tratamiento más agresivo puede incluir la extirpación del melanoma sospechado, así como la extirpación de un borde pequeño de piel normal y una capa de tejido debajo del melanoma sospechoso y el borde pequeño de piel. En otras realizaciones, un tratamiento más agresivo puede comprender una nueva escisión del sitio de la biopsia para extirpar tejido adicional que bordea la muestra de biopsia extirpada. En aún otras realizaciones, un tratamiento más agresivo puede comprender una nueva escisión de tejido adicional que rodea el sitio de la biopsia.
En otras realizaciones, un tratamiento aún más agresivo puede incluir cirugía para extirpar cualquier ganglio linfático afectado o una disección de ganglio linfático (linfadenectomía). En otras realizaciones, un tratamiento incluso más agresivo puede incluir cirugía para extirpar cualquier ganglio linfático afectado o una disección de ganglio linfático (linfadenectomía) seguida de terapia adyuvante con interferón. En otras realizaciones, un tratamiento incluso más agresivo puede incluir cirugía para extirpar los ganglios linfáticos afectados, así como tratamientos adicionales tales como quimioterapia y/o radioterapia. En otras realizaciones, un tratamiento aún más agresivo puede incluir cirugía para extirpar cualquier tejido u órgano afectado. En realizaciones alternativas, incluso tratamientos más agresivos pueden incluir quimioterapia. Algunos métodos de administración de quimioterapia incluyen tratamientos orales e intravenosos. Algunos métodos de administración de quimioterapia incluyen la perfusión de fármacos quimioterapéuticos en extremidades aisladas. En otras realizaciones, incluso tratamientos más agresivos pueden incluir radioterapia. En aún otras realizaciones, tratamientos incluso más agresivos pueden incluir terapia biológica. Algunas terapias biológicas pueden incluir interferón y/o interleucina-2. Algunas terapias biológicas pueden incluir terapias basadas en anticuerpos como ipilimumab (Yervoy). En otras realizaciones, una terapia incluso más agresiva puede incluir inmunoterapia. Algunas inmunoterapias pueden incluir interferón-alfa, anti-CTLA-4, vacunas, vacuna Bacille Calmette-Guerin, interleucina 2 y/o terapia de células T. Algunas inmunoterapias también se pueden combinar con quimioterapia y/o radioterapia. En realizaciones alternativas, incluso terapias más agresivas pueden incluir terapia dirigida. Algunas terapias dirigidas pueden incluir medicamentos tales como vemurafenib (Zelboraf) que se usa para tratar el melanoma avanzado. Otras terapias dirigidas incluyen inhibidores de B RAF y/o inhibidores de KIT.
En algunas realizaciones, la selección del tratamiento específico puede basarse en parte en el estado de expresión relativo de los genes analizados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el perfil de expresión de los genes individuales dentro del panel sería indicativo de la selección del tipo y/o la clase de terapia. Un cierto perfil de expresión de los genes individuales dentro del panel puede ser indicativo de un melanoma que puede tratarse de manera efectiva solo con cirugía. Por otro lado, otro perfil de expresión puede ser indicativo de un melanoma que puede tratarse eficazmente con cirugía combinada con radioterapia. En otros casos, otro perfil de expresión puede ser indicativo de melanoma que puede tratarse eficazmente con cirugía combinada con quimioterapia. En otros casos, el perfil de expresión puede ser indicativo de un melanoma que puede tratarse de manera efectiva solo con un control cuidadoso y un seguimiento regular. En realizaciones alternativas, el perfil de expresión podría ser indicativo de melanoma que puede tratarse eficazmente con dosificaciones más altas de terapia administradas a intervalos más cortos, mientras que otros perfiles de expresión podrían ser indicativos de dosificaciones más bajas de terapia administradas a intervalos más largos. En algunas realizaciones, el perfil de expresión puede indicar ciertas combinaciones, dosificaciones y/o frecuencias de terapias.
En otras realizaciones, un experto en la técnica puede utilizar al menos en parte el informe que comunica el estado de expresión relevante para guiar la selección de fármacos apropiados para el melanoma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el perfil de expresión de los genes individuales dentro del panel puede ser indicativo de la selección de fármacos específicos para el melanoma. En algunas realizaciones, los fármacos para el melanoma pueden seleccionarse de Aldesleukin, Dabrafenib, Dacarbazine, DTIC-Dome (Dacarbazine), Intron A (Interferon Recombinante Alfa-2b), Ipilimumab, Mekinist (Trametinib), Peginterferon Alfa-2b, PEG-Intron (Peginterferon Alfa -2b), Proleukin (Aldesleukin), Interferón Alfa-2b recombinante, Sylatron (Peginterferón Alfa-2b), Tafinlar (Dabrafenib), Trametinib, Vemurafenib, Yervoy (Ipilimumab) y/o Zelboraf (Vemurafenib). En otras realizaciones, los fármacos para el melanoma pueden seleccionarse de la vacuna Bacille Calmette-Guerin (BCG), interleucina-2, imiquimod, citocinas, dacarbazina (DTIC), temozolomida (Temodar), inhibidor de la proteína quinasa quinasa activada por mitógeno (MEK) (trametinib) y/ o fármacos bloqueadores beta-adrenérgicos.
En algunas realizaciones, los pacientes con melanoma pueden tratarse seleccionando la agresividad relativa de la terapia de melanoma basándose al menos en parte en el informe que comunica el estado de expresión relevante (o valores de prueba o puntuaciones) y luego administrando esta terapia seleccionada. En otras realizaciones, los pacientes con melanoma pueden tratarse seleccionando la agresividad relativa de la terapia del melanoma basándose al menos en parte en el informe que comunica el estado de expresión relevante, administrando esta terapia seleccionada, midiendo nuevamente el estado de expresión relevante, comparando el último estado de expresión con el estado de expresión anterior, y continuar o modificar el tratamiento basado en la comparación del estado de expresión anterior y posterior. En realizaciones alternativas, la comparación del estado de expresión relevante puede usarse para controlar la eficacia del tratamiento. En algunos casos, un cambio en el estado de expresión relevante de una puntuación indicativa de una mayor probabilidad de melanoma a una puntuación indicativa de una menor probabilidad de melanoma puede indicar que el tratamiento es eficaz. En otros casos, un cambio en el estado de expresión relevante de una puntuación indicativa de una menor probabilidad de melanoma a una puntuación indicativa de una mayor probabilidad de melanoma puede indicar que el tratamiento es menos eficaz. Cuando un cambio en el estado de la expresión indique un tratamiento eficaz, el tratamiento puede continuarse o modificarse para incluir un tratamiento menos agresivo. Cuando un cambio en el estado de expresión indique un tratamiento menos efectivo, el tratamiento puede continuarse o modificarse para incluir un tratamiento más agresivo.
En aún otras realizaciones, el experto en la técnica puede crear o modificar un plan de tratamiento para el paciente individual con base al menos en parte en el informe que comunica el estado de expresión relevante. En algunas realizaciones, la selección de diferentes componentes de terapia que comprenden el plan de tratamiento puede basarse al menos en parte en el informe que comunica el estado de expresión relevante (o valores de prueba o puntuaciones). Por ejemplo, en algunos casos, el informe indicará una baja probabilidad de melanoma y el plan de tratamiento puede comprender componentes de terapia menos agresivos. Los componentes de terapia menos agresivos pueden incluir la extirpación del melanoma sospechado y el control de seguimiento del paciente. En otros casos, el informe puede indicar una alta probabilidad de melanoma y el plan de tratamiento puede comprender componentes de terapia más agresivos. Los componentes de un plan de tratamiento más agresivo pueden incluir la extirpación del melanoma sospechado y el tejido circundante, una nueva escisión del sitio de la biopsia para extirpar tejido circundante adicional, quimioterapia, radioterapia y/o terapia biológica. En realizaciones alternativas, el informe que comunica el estado de expresión relevante puede usarse en parte para seleccionar los diferentes elementos dentro de cada componente del plan de tratamiento. Como ejemplo no limitativo, el informe se puede utilizar para seleccionar fármacos individuales para el melanoma que comprenden el componente de quimioterapia del plan de tratamiento. En otros ejemplos no limitantes, el informe puede usarse para seleccionar los tipos de radiación, las cantidades de radiación y/o el régimen de dosificación del componente de radiación del plan de tratamiento. En algunas realizaciones, el plan de tratamiento puede comprender además la medición continua del estado de expresión relevante para determinar la eficacia del plan de tratamiento. En otras realizaciones, esta medición continua de la eficacia del tratamiento puede usarse para modificar el plan de tratamiento.
Sistemas para el Diagnóstico y Tratamiento del Melanoma
Los resultados de cualquier análisis de acuerdo con la invención a menudo se comunicarán a médicos, asesores genéticos y/o pacientes (u otras partes interesadas tales como investigadores) en una forma transmisible que se pueda comunicar o transmitir a cualquiera de las partes anteriores. Tal forma puede variar y puede ser tangible o intangible. Los resultados pueden incorporarse en declaraciones descriptivas, diagramas, fotografías, gráficos, imágenes o cualquier otra forma visual. Por ejemplo, se pueden usar gráficos que muestren el nivel de expresión o actividad o la información de variación de secuencia para diversos genes para explicar los resultados. Los diagramas que muestran dicha información para genes objetivo adicionales también son útiles para indicar algunos resultados de las pruebas. Las declaraciones y los formularios visuales pueden registrarse en un medio tangible, tales como papeles, medios legibles por ordenador, tañes como disquetes, discos compactos, etc., o en un medio intangible, por ejemplo, un medio electrónico en forma de correo electrónico o sitio web en Internet o intranet. Además, los resultados también pueden grabarse en forma de sonido y transmitirse a través de cualquier medio adecuado, por ejemplo, líneas de cable analógicas o digitales, cables de fibra óptica, etc., por teléfono, facsímil, teléfono móvil inalámbrico, teléfono de Internet y similares.
Por lo tanto, la información y los datos sobre el resultado de una prueba pueden generarse en cualquier parte del mundo y transmitirse a una ubicación diferente. Como ejemplo ilustrativo, cuando se realiza un ensayo de nivel de expresión, nivel de actividad o secuenciación (o genotipado) fuera de los Estados Unidos, la información y los datos sobre el resultado de una prueba pueden generarse, emitirse en una forma transmisible como se describe anteriormente y luego importarse a los Estados Unidos. En consecuencia, la presente invención también abarca un método para producir una forma de información transmisible sobre al menos uno de (a) nivel de expresión o (b) nivel de actividad para al menos una muestra de paciente. El método comprende los pasos de (1) determinar al menos uno de (a) o (b) anteriores de acuerdo con los métodos de la presente invención; y (2) incorporar el resultado del paso de determinación en una forma transmisible. La forma transmisible es el producto de tal método.
Las técnicas para analizar dichos datos de expresión, actividad y/o secuencia (de hecho, cualquier dato obtenido de acuerdo con la invención) a menudo se implementarán utilizando hardware, software o una combinación de los mismos en uno o más sistemas informáticos u otros sistemas de procesamiento capaces de efectuar dicho análisis.
Por lo tanto, se divulga, pero no forma parte de la invención, un sistema para determinar la expresión génica en una muestra de tumor, que comprende: (1) un analizador de muestras para determinar los niveles de expresión de un panel de genes en una muestra de un paciente, en el que el analizador de muestras contiene la muestra del paciente o moléculas de ADNc de ARNm expresadas del panel de genes derivados de la muestra; (2) un primer programa informático para (a) recibir datos de expresión génica del panel de genes, (b) ponderar la expresión determinada de cada uno de los genes de prueba y (c) combinar la expresión ponderada para proporcionar un valor de prueba; y opcionalmente (3) un segundo programa informático para comparar el valor de la prueba con uno o más valores de referencia, cada uno asociado con un grado predeterminado de riesgo de melanoma.
En otra realización, se mide en la muestra la cantidad de ARN transcrito del panel de genes que incluye genes de prueba. Además, también se mide la cantidad de ARN de uno o más genes constitutivos en la muestra y se usa para normalizar o calibrar la expresión de los genes de prueba, como se describe anteriormente.
El analizador de muestras puede ser cualquier instrumento útil para determinar la expresión génica, incluyendo, por ejemplo, una máquina de secuenciación, una máquina de PCR en tiempo real y un instrumento de microarreglo.
La función de análisis con base en ordenador se puede implementar en cualquier idioma y/o navegador adecuado. Por ejemplo, se puede implementar con lenguaje C y preferiblemente usando lenguajes de programación de alto nivel orientados a objetos tales como Visual Basic, SmallTalk, C++, y similares. La aplicación se puede escribir para adaptarse a entornos como el entorno de Microsoft Windows™, incluyendo Windows™ 98, Windows™ 2000, Windows™ NT y similares. Además, la aplicación también se puede escribir para el entorno Macintosh™, SUN™, UNIX o LINUX. Además, los pasos funcionales también se pueden implementar utilizando un lenguaje de programación universal o independiente de la plataforma. Los ejemplos de dichos lenguajes de programación multiplataforma incluyen, pero no se limitan a, lenguaje de marcado de hipertexto (HTML), JAVA™, JavaScript™, lenguaje de programación Flash, interfaz de puerta de enlace común/lenguaje de consulta estructurado (CGI/SQL), lenguaje de informes de extracción práctica (PERL), AppleScript™ y otros lenguajes de secuencias de comandos del sistema, lenguaje de programación/lenguaje de consulta estructurado (PL/SQL) y similares. Se pueden utilizar navegadores habilitados para Java™ o JavaScript™ tales como HotJava™, Microsoft™ Explorer™ o Netscape™. Cuando se utilizan páginas web de contenido activo, pueden incluir subprogramas Java™ o controles ActiveX™ u otras tecnologías de contenido activo.
La función de análisis también puede incorporarse en productos de programas informáticos y utilizado en los sistemas descritos anteriormente u otros sistemas con base en ordenador o Internet. En consecuencia, otro aspecto de la presente descripción se relaciona con un producto de programa informático que comprende un medio utilizable por ordenador que tiene incorporados códigos de programa legibles por ordenador o instrucciones para permitir que un procesador lleve a cabo análisis de estado genético. Estas instrucciones de programas informáticos pueden cargarse en un ordenador u otro aparato programable para producir una máquina, de manera que las instrucciones que se ejecutan en el ordenador u otro aparato programable crean medios para implementar las funciones o pasos descritos anteriormente. Estas instrucciones del programa informático también pueden almacenarse en una memoria o medio legible por ordenador que puede dirigir un ordenador u otro aparato programable para que funcione de una manera particular, de modo que las instrucciones almacenadas en la memoria o medio legible por ordenador produzcan un artículo de fabricación que incluye instrucciones que implementan el análisis. Las instrucciones del programa informático también pueden cargarse en un ordenador u otro aparato programare para hacer que se realice una serie de pasos operativos en el ordenador u otro aparato programable para producir un proceso implementado por ordenador de manera que las instrucciones que se ejecutan en el ordenador u otro aparato programable proporcionen pasos para implementar las funciones o pasos descritos anteriormente.
Por lo tanto, un aspecto de la divulgación, pero que no forma parte de la invención, es un sistema para determinar si un paciente tiene una mayor probabilidad de tener melanoma. En términos generales, el sistema comprende (1) un programa informático para recibir, almacenar y/o recuperar los datos del estado genético de un paciente (por ejemplo, nivel de expresión, nivel de actividad, variantes) y, opcionalmente, datos de parámetros clínicos (por ejemplo, estadificación clínica); (2) programa informático para consultar los datos de este paciente; (3) programa informático para concluir si existe una mayor probabilidad de tener melanoma con base en los datos de este paciente; y opcionalmente (4) programa informático para generar/mostrar esta conclusión. En algunas realizaciones, este programa informático para generar la conclusión puede comprender un programa informático para informar a un profesional sanitario de la conclusión.
La práctica de la presente invención también puede emplear métodos, software y sistemas de biología convencionales. Los productos de software informático de la invención normalmente incluyen medios legibles por ordenador que tienen instrucciones ejecutables por ordenador para realizar los pasos lógicos del método de la invención. Los medios legibles por ordenador adecuados incluyen disquete, CD ROM/DVD/DVD-ROM, unidad de disco duro, memoria flash, ROM/RAM, cintas magnéticas, etc. Los métodos básicos de biología computacional se describen, por ejemplo, en Setubal et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg et al. (Ed.), Computational Method s in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi & Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, Londres, 2000); y Ouelette & Bzevanis, Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed., 2001); véase también, Patente de EE.UU. No. 6,420,108.
También se divulga, pero no forma parte de la invención, el uso de diversos productos de programas informáticos y software para una variedad de propósitos, tales como diseño de sondas, gestión de datos, análisis y operación de instrumentos. Véase las Patentes de EE.UU. Nos. 5,593,839; 5,795,716; 5,733,729; 5,974,164; 6,066,454; 6,090,555; 6,185,561; 6,188,783; 6,223,127; 6,229,911 and 6,308,170. Además, la presente invención puede tener realizaciones que incluyen métodos para proporcionar información genética a través de redes tales como Internet, como se muestra en la publicación de EE.UU. No. 20030097222); 2. publicación de EE.UU. No. 20020183936, publicación de EE.UU. No. 20030100995); publicación de EE.UU. No. 20030120432); publicación de EE.UU. No. 20040049354).
Las técnicas para analizar dichos datos de expresión, actividad y/o secuencia (de hecho, cualquier dato obtenido de acuerdo con la invención) a menudo se implementarán utilizando hardware, software o una combinación de los mismos en uno o más sistemas informáticos u otros sistemas de procesamiento capaces de efectuar dicho análisis.
Por lo tanto, un aspecto de la presente descripción, pero que no forma parte de la invención, son los sistemas relacionados con los métodos anteriores de la invención. En una realización, la descripción proporciona un sistema para determinar la expresión génica en una muestra, que comprende:
(1) un analizador de muestras para determinar los niveles de expresión en una muestra de un panel de genes, en el que el analizador de muestras contiene la muestra, ARN de la muestra y expresado del panel de genes, o ADN sintetizado a partir de dicho ARN;
(2) un primer programa informático para
(a) recibir datos de expresión génica en uno o más genes de prueba seleccionados del panel de genes,
(b) ponderar la expresión determinada de cada uno del uno o más genes de prueba con un coeficiente predefinido, y (c) combinar la expresión ponderada para proporcionar un valor de prueba; y opcionalmente
(3) un segundo programa informático para comparar el valor de la prueba con uno o más valores de referencia, cada uno asociado con un grado predeterminado de riesgo de tener melanoma.
En otra realización, la descripción, pero no forma parte de la descripción, es un sistema para determinar la expresión génica en una muestra, que comprende: (1) un analizador de muestras para determinar los niveles de expresión de un panel de genes en una muestra, en el que el analizador de muestras contiene la muestra que es un nevo o un lunar sospechoso de tener melanoma, ARN de la muestra y expresado del panel de genes, o a Dn sintetizado a partir de dicho ARN; (2) un primer programa informático para (a) recibir datos de expresión génica en uno o más genes de prueba seleccionados del panel de genes, (b) ponderar la expresión determinada de cada uno de los genes de prueba con un coeficiente predefinido, y (c) combinar la expresión ponderada para proporcionar un valor de prueba, en el que los genes de prueba comprenden genes inmunitarios y genes adicionales; y opcionalmente (3) un segundo programa informático para comparar el valor de la prueba con uno o más valores de referencia, cada uno asociado con un grado predeterminado de riesgo de tener melanoma. En algunas realizaciones, el sistema comprende además un módulo de visualización que muestra la comparación entre el valor de prueba y el uno o más valores de referencia, o mostrar un resultado del paso de comparación, o mostrar el diagnóstico del paciente y/o el grado de riesgo de tener melanoma.
En una realización preferida, se mide en la muestra la cantidad de ARN transcrito del panel de genes que incluye genes de prueba (y/o ADN transcrito de forma inversa a partir de ellos). Además, también se mide la cantidad de ARN de uno o más genes constitutivos en la muestra (y/o el ADN transcrito a la inversa) y se usa para normalizar o calibrar la expresión de los genes de prueba, como se describe anteriormente.
El analizador de muestras puede ser cualquier instrumento útil para determinar la expresión génica, incluyendo, por ejemplo, una máquina de secuenciación (por ejemplo, Illumina HiSeq™, Ion Torrent PGM, secuenciador ABI SOLiD™, PacBio RS, Helicos Heliscope™, etc.), una máquina de PCR de tiempo (por ejemplo, ABI 7900, Fluidigm BioMark™, etc.), un instrumento de microarreglos, etc.
La Figura 1 ilustra un sistema 100 para realizar métodos asistidos por ordenador para diagnosticar, detectar, examinar y/o tratar el melanoma en un paciente.
El sistema 100 comprende un módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico que comprende un proveedor 11 médico y un paciente 12. El proveedor 11 médico comprende un médico y/u otro personal médico que atiende al paciente 12. El proveedor médico recopila un historial médico completo del paciente 12 que incluye, pero no se limitan a, síntomas, historial médico anterior y/o historial familiar. El proveedor 11 médico también realiza un examen físico del paciente 12 y obtiene una muestra del paciente 12.
El sistema 100 comprende además un dispositivo 20 de procesamiento de datos que comprende un módulo 21 analizador de muestras. La muestra del paciente se transporta desde el módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico hasta el dispositivo 20 analizador de muestras. El módulo 21 analizador de muestras determina los niveles de expresión génica de un panel de biomarcadores en la muestra del paciente. El panel de biomarcadores puede comprender biomarcadores útiles para determinar la presencia de melanoma en el paciente 12. El panel de biomarcadores puede comprender además genes constitutivos útiles para normalizar los niveles del panel de biomarcadores. El módulo 21 analizador de muestras puede comprender cualquier instrumento útil para determinar los niveles de expresión génica, incluyendo, por ejemplo, una máquina de secuenciación (por ejemplo, Illumina HiSeq™, Ion Torrent PGM, secuenciador ABI SOLiD™, PacBio RS, Helicos Heliscope™, etc.), una máquina de PCR en tiempo real (por ejemplo, ABI 7900, Fluidigm BioMark™, etc.), un instrumento de microarreglos etc.
El sistema 100 comprende además un dispositivo 30 de procesamiento de datos que comprende un módulo 31 de base de datos de historial médico. El módulo 31 de base de datos de historial médico puede comprender un historial médico completo del paciente 12 que incluye información de historial familiar que comprende el número de miembros de la familia de un paciente diagnosticado con cáncer, incluyendo melanoma. La información de antecedentes familiares también puede comprender el grado de parentesco con un paciente de cada miembro de la familia diagnosticado con cáncer, incluyendo el melanoma. El módulo 31 de base de datos de historial médico puede estar en comunicación con el módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico. El módulo 31 de base de datos de historial médico puede configurarse para recibir el historial médico del paciente desde el módulo 10 de interfaz de proveedor médico/paciente como un registro físico o como una transmisión electrónica.
El sistema 100 comprende además un dispositivo 40 de procesamiento de datos que comprende un módulo 41 de base de datos de información del paciente. El módulo 41 de base de datos de información del paciente comprende información del paciente que comprende los niveles de expresión génica de un panel de biomarcadores del paciente 12. El módulo 41 de base de datos de información del paciente puede estar en comunicación con el módulo 41 analizador de muestras. El módulo 41 de base de datos de información del paciente puede configurarse para recibir los niveles de expresión génica del paciente desde el módulo 21 analizador de muestras ya sea como un registro físico o como una transmisión electrónica.
El sistema 100 comprende además un dispositivo 50 de procesamiento de datos y un dispositivo 60 de procesamiento de datos. El dispositivo 50 de procesamiento de datos comprende un módulo 51 de puntuación. El dispositivo 60 de procesamiento de datos comprende un módulo 61 de base de datos de información de biomarcadores. El módulo 61 de base de datos de información de biomarcadores comprende información de biomarcadores que comprende información de nivel de umbral para cada biomarcador de un panel de biomarcadores, en el que el panel de biomarcadores comprende biomarcadores positivos, biomarcadores negativos, o ambos, en el que un nivel estadísticamente significativamente por encima de un nivel de umbral para cada biomarcador positivo particular es indicativo de melanoma en un paciente y un nivel estadísticamente significativo por debajo de un nivel de umbral para cada biomarcador negativo en particular es indicativo de la presencia de melanoma en un paciente.
El módulo 51 de puntuación puede estar en comunicación con el módulo 61 de base de datos de información de biomarcadores y el módulo 41 de base de datos de información del paciente. El módulo 51 de puntuación puede configurarse para comparar la información del biomarcador y la información del paciente para generar una puntuación que represente la comparación entre la información del biomarcador y la información del paciente. El módulo 51 de puntuación puede configurarse además para normalizar, promediar y aplicar la ponderación de subgrupos de biomarcadores durante la generación de la puntuación. El módulo 51 de puntuación puede configurarse además para sumar y/o restar algebraicamente subgrupos de biomarcadores durante la generación de la puntuación.
El dispositivo 50 de procesamiento de datos puede comprender además un módulo 52 de evaluación en comunicación con el módulo 51 de puntuación. El módulo 22 de evaluación puede además estar en comunicación con el módulo 61 de base de datos de información de biomarcadores. El módulo 52 de evaluación puede estar además en comunicación con el módulo 31 de base de datos de historial médico. El módulo 52 de evaluación puede configurarse para determinar una probabilidad de presencia de melanoma en el paciente con base en la puntuación del paciente en comparación con puntuaciones de grupos de pacientes diagnosticados con melanoma y puntuaciones de grupos de pacientes que no se diagnosticaron con melanoma. El módulo 52 de evaluación puede configurarse además para determinar una probabilidad de presencia de melanoma en el paciente con base en la puntuación del paciente y la información del paciente. El dispositivo 50 de procesamiento de datos puede comprender además un módulo 53 de diagnóstico en comunicación con el módulo 52 de evaluación. El módulo 53 de diagnóstico puede configurarse para determinar procedimientos de diagnóstico sugeridos adicionales con base en la probabilidad de melanoma de un paciente. El dispositivo 50 de procesamiento de datos puede comprender además un módulo 54 de generación de informes. El módulo 54 de generación de informes puede comprender cualquier dispositivo que agregue los datos y el proceso del dispositivo 50 de procesamiento de datos en un informe. El informe producido por el módulo 54 de generación de informes puede comprender la puntuación. El informe puede comprender además la probabilidad de la presencia de melanoma. El informe puede comprender además procedimientos de diagnóstico sugeridos adicionales. El informe puede incluir además tratamientos sugeridos.
El sistema 100 comprende además un dispositivo 70 de procesamiento de datos. El dispositivo 70 de procesamiento de datos comprende medios 71 de comunicación. El medio 71 de comunicación está en comunicación con el módulo 54 de generación de informes y el módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico. El medio 71 de comunicación está configurado para transmitir el informe generado por el módulo 54 de generación de informes al módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico. El informe puede transmitirse además por medios electrónicos al módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico. Los medios 71 de comunicación también pueden transmitir el informe imprimiéndolo en un medio tangible tal como papel y transmitiendo el informe al módulo 10 de interfaz de paciente/proveedor médico. Al recibir el informe transmitido, el proveedor 11 médico puede tratar al paciente 12 de acuerdo con la información del informe. El proveedor 11 médico puede además diagnosticar al paciente 12 con base en el informe. El proveedor 11 médico puede además crear o modificar un plan de tratamiento para el paciente 12 con base en el informe. El proveedor 11 médico puede seguir además la prueba de diagnóstico adicional sugerida del informe y/o seguir los tratamientos sugeridos en el informe.
En consecuencia, los diversos componentes, módulos, sistemas y/o características divulgadas en el presente documento pueden incorporarse como módulos dentro de un sistema. Dicho sistema puede implementarse en software, firmware, hardware y/o infraestructura física. Aunque no siempre se menciona explícitamente en el presente documento, un módulo puede identificarse (nombrarse) con base en la función que realiza. Por ejemplo, un módulo que está configurado para calcular algo puede comprender hardware, software o firmware específico y denominarse correctamente "módulo de cálculo".
Las realizaciones también se pueden proporcionar como un producto de programa informático que incluye un medio legible por máquina no transitorio que tiene almacenadas instrucciones que se pueden usar para programar o ejecutar en un ordenador (u otro dispositivo electrónico) para realizar los procesos descritos en el presente documento. El medio legible por máquina puede incluir, pero no se limita a, discos duros, disquetes flexibles, discos ópticos, CD-ROM, DVD-r Om , ROM, RAM, EPROM, EEPROM, tarjetas magnéticas u ópticas, dispositivos de memoria de estado sólido, u otros tipos de medios/medios legibles por máquina adecuados para almacenar instrucciones electrónicas. Además, un producto de programa informático puede realizar, ejecutarse, descargarse y/o usarse de otro modo local o remotamente a través de una red.
Debe entenderse que las referencias a "un dispositivo de procesamiento de datos" pueden referirse al mismo dispositivo o a uno o más dispositivos diferentes. Por ejemplo, ciertos pasos de los métodos asistidos por ordenador se pueden realizar en un dispositivo controlado por un proveedor de servicios de diagnóstico y otros pasos se pueden realizar en un dispositivo controlado por un médico. Asimismo, los dispositivos 10, 20, 30, 40, 50, 60 y 70 de procesamiento de datos pueden ser un solo dispositivo o, por ejemplo, el dispositivo 50 de procesamiento de datos puede ser múltiples dispositivos de procesamiento de datos.
En ciertas realizaciones, el método implementado por ordenador puede configurarse para identificar a un paciente que tiene o no cáncer de páncreas. Por ejemplo, el método implementado por ordenador puede configurarse para informar a un médico que un paciente particular tiene cáncer de páncreas. De manera alternativa o adicional, el método implementado por ordenador puede configurarse para sugerir realmente un curso de tratamiento particular con base en las respuestas/resultados de diversas consultas.
Sondas y kits
En algunas realizaciones, la descripción, pero no forma parte de la invención, es una sonda que comprende un oligonucleótido aislado capaz de hibridarse selectivamente con al menos uno de los genes de la Tabla 1, 3 o los Paneles A a I. Los términos "sonda" y "oligonucleótido" (también "oligo"), cuando se usan en el contexto de ácidos nucleicos, se refieren indistintamente a un fragmento o secuencia de ácido nucleico relativamente corto. La descripción también proporciona cebadores útiles en los métodos de la invención. Los cebadores son sondas capaces, en las condiciones adecuadas y con los reactivos complementarios adecuados, de amplificar selectivamente un ácido nucleico objetivo (por ejemplo, un gen objetivo). En el contexto de los ácidos nucleicos, "sonda" se usa en el presente documento para abarcar "cebador", ya que los cebadores generalmente también pueden servir como sondas.
La sonda puede ser generalmente de cualquier tamaño/longitud adecuada. En algunas realizaciones, la sonda tiene una longitud de aproximadamente 8 a 200, 15 a 150, 15 a 100, 15 a 75, 15 a 60 o 20 a 55 bases de longitud. Se pueden marcar con marcadores detectables con cualquier marcador de detección adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, isótopos radiactivos, fluoróforos, biotina, enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina), sustratos de enzimas, ligandos y anticuerpos, etc. Véase Jablonski et al., Nucleic Acids Res. (1986) 14:6115-6128; Nguyen et al., Biotechniques (1992) 13:116-123; Rigby et al., J. Mol. Biol. (1977) 113:237-251. De hecho, las sondas pueden modificarse de cualquier manera convencional para diversas aplicaciones de biología molecular. Las técnicas para producir y usar dichas sondas de oligonucleótidos son convencionales en la técnica.
Las sondas de acuerdo con la descripción se pueden utilizar en las técnicas de hibridación/amplificación/detección discutidas anteriormente. Por lo tanto, algunas realizaciones de la descripción comprenden conjuntos de sondas adecuados para su uso en un microarreglo. En algunas realizaciones, los conjuntos de sondas tienen una cierta proporción de sus sondas dirigidas a CCG, por ejemplo, un conjunto de sondas que consiste en 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % sondas específicas para CCG. En algunas realizaciones, el conjunto de sondas comprende sondas dirigidas a al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100,125, 150, o más, o todos, los genes en la Tabla 1, 3 o Paneles A a I, o cualquiera de los paneles descritos en las Tablas WW-ZZ. Dichos conjuntos de sondas se pueden incorporar en arreglos de alta densidad que comprenden 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, o 1,000,000 o más sondas diferentes.
En otro aspecto de la presente descripción, pero que no forma parte de la invención, se encuentra un kit para practicar el diagnóstico de la presente invención. El kit puede incluir un soporte para los diversos componentes del kit. El transportador puede ser un contenedor o soporte, en forma de, por ejemplo, bolsa, caja, tubo, estante, y está opcionalmente compartimentado. El transportador puede definir un confinamiento cerrado por motivos de seguridad durante el envío y el almacenamiento. El equipo incluye diversos componentes útiles para determinar el estado de uno o más paneles de genes como se describe en el presente documento, y uno o más marcadores de genes constitutivos, usando las técnicas de detección discutidas anteriormente. Por ejemplo, el kit puede incluir oligonucleótidos que hibridan específicamente bajo alta rigurosidad con ARNm o ADNc de los genes en la Tabla 1, 3 o Paneles A a I, o cualquiera de los paneles divulgados en las Tablas WW-ZZ. Dichos oligonucleótidos pueden usarse como cebadores de PCR en reacciones de RT-PCR o sondas de hibridación. En algunas realizaciones, el kit comprende reactivos (por ejemplo, sondas, cebadores o anticuerpos) para determinar el nivel de expresión de un panel de genes, donde dicho panel comprende al menos 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de CCG. En algunas realizaciones, el kit consiste en reactivos (por ejemplo, sondas, cebadores o anticuerpos) para determinar el nivel de expresión de no más de 2500 genes, en los que al menos 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 250 o más de estos genes son CCG.
Los oligonucleótidos del kit de detección se pueden marcar con cualquier marcador de detección adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, isótopos radiactivos, fluoróforos, biotina, enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina), sustratos de enzimas, ligandos y anticuerpos, etc. Véase Jablonski et al., Nucleic Acids Res., 14:6115-6128 (1986); Nguyen y col., Biotechniques, 13:116-123 (1992); Rigby y col., J. Mol. Biol., 113:237-251 (1977). Como alternativa, los oligonucleótidos incluidos en el kit no están etiquetados y, en su lugar, se proporcionan uno o más marcadores en el kit para que los usuarios puedan etiquetar los oligonucleótidos en el momento del uso.
En otra realización de la descripción, el kit de detección contiene uno o más anticuerpos selectivamente inmunorreactivos con una o más proteínas codificadas por cualquiera de los genes en la Tabla 1, 3 o Paneles A a I, o cualquiera de los paneles descritos en las Tablas WW-ZZ.
Diversos otros componentes útiles en las técnicas de detección también pueden incluirse en el kit de detección de esta descripción. Los ejemplos de tales componentes incluyen, pero no se limitan a, Taq polimerasa, desoxirribonucleótidos, didesoxirribonucleótidos, otros cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia de ADN objetivo, RNasa A y similares. Además, el kit de detección incluye preferiblemente instrucciones sobre el uso del kit para practicar el método de diagnóstico de la presente invención utilizando muestras humanas.
Ejemplos
Ejemplo 1
En este ejemplo, se determina si los genes de progresión del ciclo celular pueden diferenciar entre el melanoma maligno y los nevos no malignos. Específicamente, este ejemplo evalúa si el melanoma se puede diferenciar de los nevos benignos, así como de los nevos displásicos.
Materiales y métodos
Muestras: Se obtuvieron de una institución académica 31 muestras de piel FFPE, con portaobjetos de 3 x 10 mm para cada muestra y un portaobjetos de 4 mm para la revisión de H&E entre las edades de 10 y 11 años. Las muestras consistieron en 11 nevos benignos, 10 nevos displásicos y 10 muestras de melanoma. La Tabla 4 enumera las muestras y los detalles clínicos correspondientes.
Tabla 4. Muestras de piel con diagnóstico, datos clínicos y puntuación de CCP.
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SSM = melanoma de extensión superficial
Procesamiento de muestras, generación de puntuación de CCP y análisis: Los portaobjetos de 4 mm se tiñeron para hacer portaobjetos de H&E y los revisó un patólogo que rodeó la lesión (ya sea el nevo o el melanoma). Utilizando el portaobjetos de H&E, las lesiones se diseccionaron y extrajeron de cada uno de los tres portaobjetos de 10 μM. Se agruparon las tres lesiones diseccionadas de un solo paciente.
Se extrajo ARN de las muestras y los niveles de expresión de ARN se determinaron utilizando técnicas estándar de PCRq. De las 31 muestras, 30 se procesaron con éxito y generaron una puntuación de CCP (véase la Tabla 4 para ver los datos).
Las puntuaciones de CCP de las muestras de melanoma se compararon con las de los otros dos grupos, nevos benignos y nevos displásicos, así como con los nevos displásicos solos, utilizando la prueba t de Student, para determinar si las puntuaciones de CCP de los grupos eran diferentes en un grado estadísticamente significativo.
Resultados
Se observo que las muestras de melanoma tenían puntuaciones de CCP diferentes a las de ambos subgrupos de nevos combinados, de una manera estadísticamente significativa (valor P, 1.4 x 10-6, véase la Figura 2). Al usar estos datos en un modelo de diagnóstico, las muestras de melanoma podrían identificarse con un AUC de 0.97. En promedio, las puntuaciones de CCP del melanoma fueron 1.08 más altas que las puntuaciones de CCP de los nevos. Véase la Tabla 4 para obtener una lista de todos los datos. La Figura 2 muestra la distribución de las puntuaciones de CCP de las 30 muestras con puntuación, separadas por el diagnóstico clínico.
También se observó que las muestras de melanoma tenían diferentes puntuaciones de CCP en comparación con los nevos displásicos, de una manera estadísticamente significativa (valor P, 3.9 x 10-5, véase la Figura 2). Al usar estos datos en un modelo de diagnóstico, las muestras de melanoma podrían identificarse, en comparación con solo los nevos displásicos, con un AUC de 0.97. En promedio, las puntuaciones de CCP del melanoma fueron 0.94 más altas que las puntuaciones de CCP de los nevos.
Finalmente, se observó que los nevos benignos no eran estadísticamente diferentes de los nevos displásicos (valor P, 0.17), lo que indica que cuando los nevos se vuelven displásicos, no se replican a un ritmo más rápido, y solo después de la transición a un melanoma, las células comienzan a replicarse más rápido. Los datos indican que las muestras de melanoma se replican a una tasa dos veces mayor que los nevos.
Discusión
Estos datos muestran que la medición de las puntuaciones de CCP puede diferenciar entre melanoma maligno y nevo no maligno. Más específicamente, estos datos muestran que una puntuación de CCP puede diferenciar entre melanoma y nevos displásicos. Si bien la diferencia promedio entre los dos grupos es moderada (~1 unidad CCP), la precisión de las mediciones permite una buena separación de los dos conjuntos de datos.
Ejemplo 2
En este ejemplo, se determinó si ciertos genes CCP diferenciaban nevos y melanomas de manera más efectiva (Tabla 6). De hecho, se observó que había ciertos genes de CCP que tenían valores de AUC mucho mejores que otros, aunque todos menos un gen tenía un AUC> 0.8, que aún era bastante impresionante. Se decidió seguir adelante y se seleccionar diez genes de CCP cuyas puntuaciones de AUC eran > 0.95 (véase la Tabla 6). Diez genes de CCP fueron suficientes para producir una puntuación de CCP robusta y fiable.
Tabla 6
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AUC indica diferenciación entre melanoma y todos los nevos.
Ejemplo 3
Este ejemplo evalúa una variedad de biomarcadores potenciales para determinar si su expresión alterada puede diferenciar entre melanoma maligno y nevos no malignos.
Materiales y métodos
Muestras: El descubrimiento de biomarcadores se realizó utilizando dos conjuntos de datos independientes. El primer conjunto de datos constaba de 31 muestras (Grupo 1). Consulte la Tabla 7 para obtener una lista de estas muestras y sus detalles clínicos. El segundo conjunto de datos constaba de 53 muestras (Grupo 2). Consulte la Tabla 8 para obtener una lista de estas muestras y sus detalles clínicos.
T l 7. M r l r 1.
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Tabla 8. Muestras del rupo 2
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Extracción de ARN: Las 31 muestras del grupo 1 se anonimizaron con una PCRqlD y un patólogo revisó un portaobjetos de H&E de 4 mm que rodeó con un círculo la lesión de interés (ya sea el nevo o el melanoma). A continuación, las lesiones se macrodiseccionaron y se extrajeron de tres portaobjetos de 10 μM. Las tres lesiones diseccionadas de un solo paciente se agruparon en un solo tubo. Se extrajo ARN de las muestras, se determinaron los niveles de expresión de ARN mediante técnicas estándar de PCRq y se generó una puntuación de CCP estándar.
Luego se utilizó ARN de 30 de las muestras en las dos primeras rondas de descubrimiento de biomarcadores. El ARN fue DNsado y cuantificado. Los ARN con concentraciones >40 ng/uL se normalizaron a 40 ng/uL.
Las 53 muestras del grupo 2 se anonimizaron con una PCRqlD, y un patólogo revisó un portaobjetos de H&E y rodeó con un círculo la lesión de interés. A continuación, las lesiones se macrodiseccionaron de cinco portaobjetos de 4 mm. Las cinco lesiones diseccionadas de un solo paciente se agruparon en un solo tubo. El ARN de cada tubo se extrajo utilizando técnicas estándar de extracción de ARN. El ARN fue ADNsado y cuantificado. Todas las muestras de ARN con concentraciones >40 ng/uL se normalizaron a 40 ng/uL.
Medición de la expresión génica: La expresión de ARN se midió usando técnicas estándar de PCRq. Se determinaron los valores de Ct, y la expresión de cada gen se normalizó a la expresión de los genes constitutivos.
Los biomarcadores se evaluaron en tres rondas de pruebas. Solo las muestras del grupo 1 se analizaron en las rondas 1 y 2 de la prueba. Las muestras de los grupos 1 y 2 se analizaron en la ronda 3 de prueba. Los datos de cada ronda de pruebas se analizaron por separado y se agregaron. Los genes constitutivos probados para la normalización en las tres rondas incluyeron MRFAP1, PSMA1, RPL13A y TXNL1. Además, los genes constitutivos SLC25A3, RPS29, RPL8, PSMC1 y RPL4 se incluyeron en la primera ronda de pruebas.
Resultados
La Tabla 9 enumera todos los amplicones utilizados en el descubrimiento de biomarcadores y enumera los valores de p para rondas separadas de análisis y análisis agregado como se indica en la columna de la ronda probada. Los valores de P son valores de P de Wilcoxon Rank Sum, y los valores de P y AUC indican la diferenciación de todos los subtipos de melanomas de todos los subtipos de nevos.
Tabla 9. Todos los amplicones utilizados durante el descubrimiento de biomarcadores
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La Figura 3 muestra la distribución de todos los amplicones probados en las tres rondas de descubrimiento de biomarcadores. Las muestras se diferencian de acuerdo con el diagnóstico en el eje Y. La expresión relativa (Ct) de cada gen (en comparación con la expresión de los genes constitutivos) se representa gráficamente en el eje X
La Figura 4 muestra las distribuciones de cada amplicón individual analizado en las rondas uno y dos del descubrimiento de biomarcadores. Las muestras se diferencian con base en su subtipo patológico en el eje Y. La expresión relativa (Ct) de cada gen (en comparación con la expresión de los genes constitutivos) se representa gráficamente en el eje X. Cada amplicón se identifica por el gen y los tres últimos dígitos de la ID del ensayo.
Discusión
Estos datos indican claramente que la expresión de genes biomarcadores específicos puede usarse para diferenciar el melanoma maligno de los nevos no malignos. No obstante, se necesita un conjunto de datos más grande para determinar con mayor confianza qué tan efectivo es cada biomarcador individual para diferenciar el melanoma, así como para determinar qué tan pesado sería necesario ponderar cada biomarcador en un modelo de diagnóstico.
La Tabla 10 enumera el ensayo/amplicón de mejor rendimiento de cada biomarcador determinado por su AUC, valor P y falta de datos faltantes. Los valores P son valores P de Wilcoxon Rank Sum. Los valores P y AUC indican la diferenciación de todos los subtipos de melanomas de todos los subtipos de nevos.
T a b la 10.
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Ejemplo 4
Se calcularon los valores P para distinguir el melanoma de los nevos para todas las combinaciones de dos, tres y cuatro genes del Panel I con datos de las mismas muestras utilizadas anteriormente. Se utilizó la regresión logística de Firth para asignar los mejores pesos a cada uno de los genes en cada combinación. Los valores de p se calcularon utilizando una prueba de razón de verosimilitud comparando un modelo que contenía todos los genes en cada combinación con un modelo reducido que no contenía variables predictoras. El número de muestras con datos para todos los genes. en cada combinación y si la combinación contiene genes CCP, otros genes o una mezcla de c Cp y otros genes se incluyen en los resultados.
Además, se calcularon los valores de p para la expresión promedio de CCP de todas las combinaciones de uno a diez de los genes de CCP en el panel C como continuación de la siguiente etapa para su uso en un conjunto de entrenamiento potencial. Se calculó el promedio de cada combinación de genes c Cp y se realizó una prueba t para probar una diferencia en la expresión promedio entre melanomas y nevos.
La Tabla WW contiene los resultados de las combinaciones de entre uno y 4 promedios de genes CCP. La Tabla XX contiene los resultados para todas las combinaciones de dos genes. La tabla YY contiene los resultados de las 500 mejores combinaciones de tres genes. La tabla ZZ contiene los resultados de las 500 mejores combinaciones de cuatro genes.
Tabla WW
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Tabla XX
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Tabla YY
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Tabla ZZ
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Ejemplo 5
En este ejemplo, se determinó un modelo para diferenciar las muestras de melanoma de las muestras de nevo con base en una puntuación calculada.
Métodos
Se adquirieron aproximadamente 600 lesiones cutáneas de dos sitios separados (codificados como "Munich" y "Provitro"), con números relativamente iguales de ambos sitios. Cada sitio proporcionó muestras malignas y benignas, con todos los principales subtipos histológicos representados. El diagnóstico de cada caso se confirmó utilizando un segundo dermatopatólogo que desconocía el diagnóstico del primer dermatopatólogo. Si había discordancia, un tercer dermatopatólogo adjudicaba el diagnóstico.
Luego, un patólogo revisó un portaobjetos teñido con H&E de cada caso y se identificó la lesión de interés para cada caso. El tejido correspondiente se macrodisectó de 5 portaobjetos no teñidos (4 mm de espesor) y se reunió en un solo tubo. A continuación, se extrajo el ARN del tejido, el ARN de ADNso utilizando ADNasa I y se sintetizó el ADNc. Luego, se preamplificaron todos los genes de interés, incluyendo 7 genes de normalización constitutivos) en una reacción multiplex. Finalmente, se utilizó PCR cuantitativa para medir la expresión de cada gen. Los valores de expresión se calcularon determinando el CT (Umbral de Cruce) de cada gen. Cada muestra se analizó por triplicado dividiendo cada muestra en 3 alícuotas después de la síntesis de ADNc.
Las tres mediciones de cada gen luego se promediaron y normalizaron mediante la expresión promediada de los siete genes constitutivos. Cada gen se estudió para determinar si su expresión podía diferenciar entre muestras de melanoma maligno y nevos benignos; si los genes eran efectivos en esto, se analizaban más a fondo para ver qué genes tenían datos correlacionados (una indicación de que estos genes miden la misma vía biológica). Los genes con datos correlacionados se agruparon en conjuntos, y se usó la expresión promedio del conjunto para diferenciar el melanoma y los nevos.
Resultados
Se adquirieron ~600 muestras de dos sitios alemanes (etiquetados como Munich y Provitro [Berlín]). Cada sitio contribuyó con números aproximadamente iguales de muestras malignas y benignas, con todos los principales subtipos histológicos representados en las muestras de cada sitio. Primero se identificó la lesión de interés en cada muestra y luego se extrajo el ARN de cada muestra y se midió el nivel de expresión de ARN de los genes característicos potenciales y 7 genes de normalización constitutivos (Tabla 11).
Tabla 11- Lista de posibles genes característicos probados y genes constitutivos utilizados para la normalización.
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A continuación, se analizó la capacidad de cada gen para determinar si su expresión era eficaz para diferenciar las muestras de melanoma maligno y nevos benignos. Se determinó que PRAME era un biomarcador muy efectivo (Figura 5). Además, también se encontró que una gran cantidad de genes inmunitarios también pudieron diferenciar fuertemente el melanoma y los nevos. Se investigó más a fondo 8 de estos genes inmunitarios y se descubrió que sus datos estaban altamente correlacionados, ya que la expresión de cada gen inmunitario individual tenía una relación lineal con el promedio de los 8 genes inmunitarios (Figura 6). Esto puede indicar que están midiendo el mismo proceso biológico y, por lo tanto, se agruparon en un conjunto "inmunitario". Se calculó la expresión promediada de los 8 genes inmunitarios y luego se usó al analizar el conjunto de datos. Finalmente, también se notó que el gen del ciclo celular S100A9 también pudo diferenciar muchas muestras de melanoma y nevos.
A continuación, se creó un modelo de diagnóstico combinado, utilizando estos tres conjuntos de biomarcadores (PRAME, los genes inmunitarios y S100A9). Cuando se graficó la expresión de cada biomarcador frente al otro, no se vio una correlación alta, lo que indica que es probable que cada biomarcador mida un proceso biológico diferente y tenga un valor independiente (véase la Figura 7). Se ejecutaron los datos a través de un modelo de regresión logística, para determinar mejor cómo se podría ponderar cada biomarcador en el modelo, para maximizar la capacidad del modelo para diferenciar el melanoma y los nevos. El modelo más eficaz se encontró con las siguientes ponderaciones para la expresión de cada conjunto de biomarcadores: (0.525 x PRAME) (0.677 x Inmunitario) (0.357 x S100A9). Luego, el modelo toma los datos de cada paciente y genera una puntuación, que se puede usar para diferenciar el melanoma y los nevos (véase la Figura 8). Este conjunto de datos actual se usó luego para generar una curva ROC (véase la Figura 9), que tenía un AUC de ~0.96.
Ejemplo 6
En este ejemplo, se determinó un modelo de diagnóstico para diferenciar entre melanoma maligno y nevos no malignos y luego se refinó aún más el modelo de diagnóstico.
Métodos
Las muestras de los pacientes se adquirieron y prepararon como se describe anteriormente en el Ejemplo 5. Asimismo, la extracción, preparación y cuantificación de la expresión génica de ARN también se llevaron a cabo de la misma manera que se describe anteriormente en el Ejemplo 5. Se ensayaron la misma lista de genes característicos potenciales y los mismos genes constitutivos que en el Ejemplo 5 (Tabla 11). Como en el Ejemplo 5, la expresión medida de cada gen se promedió y normalizó mediante la expresión promediada de los siete genes constitutivos. Cada gen se analizó para determinar si su expresión podía diferenciar entre muestras de melanoma maligno y muestras de nevos benignos. Los genes que fueron efectivos para diferenciar entre muestras de melanoma maligno y muestras de nevos benignos se analizaron más a fondo para determinar qué genes tenían datos correlacionados. La correlación de datos indicó que los genes midieron la misma ruta biológica. Los genes con datos correlacionados se agruparon en conjuntos, y se usó la expresión promedio del conjunto para diferenciar el melanoma y los nevos.
Resultados
Construcción del modelo de diagnóstico
Como se describe en el Ejemplo 5, se analizó cada gen para determinar si su expresión era eficaz para diferenciar las muestras de melanoma maligno de las muestras de nevos benignos. En este análisis, se utilizó la selección directa para elegir predictores para su inclusión en un modelo de diagnóstico que diferenciaría las muestras de melanoma y nevos. Como en el Ejemplo 5, se seleccionaron PRAME, S100A9 y una puntuación de componente inmunitario como predictores para diferenciar las muestras de melanoma maligno de las muestras de nevos benignos. La puntuación del componente inmunitario se compuso de ocho genes inmunitarios (CXCL9, CCL5, CXCL10, IRF1, PTPN22, PTPRC, LCP2 Y CD38) que tenían datos altamente correlacionados (Figura 6). Estos ocho genes inmunitarios se agruparon y se promediaron sus valores para crear una puntuación del componente inmunitario. Como en el Ejemplo 5, también se determinó que estos tres predictores (PRAMe , S100A9 o el componente inmunitario) tenían los patrones de expresión solamente correlacionados moderadamente entre sí (Figura 7), lo que indica que cada predictor proporciona en gran medida información independiente al distinguir muestras de melanoma y nevos.
A continuación, se creó un modelo de diagnóstico combinado utilizando PRAME, S100A9 y la puntuación del componente inmunitario. El modelo de diagnóstico combinado que se creó fue un modelo lineal basado en los datos de expresión génica de los tres predictores (PRAME, S100A9 y el componente inmunitario). Al generar el modelo lineal, se utilizó regresión logística generalizada para calcular las mejores ponderaciones para cada uno de los tres predictores que diferenciarían de manera más efectiva las muestras de melanoma y nevos en este conjunto de datos. Las mejores ponderaciones calculadas fueron las siguientes: 1.149 para PRAME, 0.922 para S100A9 y 0.698 para la puntuación del componente inmunitario. Usando estas mejores ponderaciones, los datos de expresión génica para los tres predictores se usaron luego para generar una puntuación que podría usarse para ayudar a diferenciar entre muestras de nevos benignos y muestras de melanoma. Los datos de expresión génica para cada predictor se multiplicaron por la mejor ponderación respectiva y luego se combinaron los tres valores ponderados. Este valor combinado, como se muestra aquí, representó una puntuación que podría usarse para ayudar a diferenciar entre muestras de nevos benignos y muestras de melanoma:
Puntuación = (1.149 x PRAME) (0.922 x S100A9) (0.698 x componente inmunitario)
Luego se generaron y trazaron puntuaciones para las 544 muestras (Figura 10). En las puntuaciones graficadas se observó una distribución bimodal. Casi todas las muestras con una puntuación superior a cero eran melanomas (barras de color gris oscuro), mientras que casi todas las muestras de nevos (barras de color gris claro) tenían una puntuación inferior a cero. Utilizando estos datos, se generó una curva ROC que tenía un AUC de ~ 0.95 y un valor p asociado de 2.0 x 10-63 (Figura 11). A partir de esta curva ROC, se seleccionó un punto de corte para diferenciar entre muestras de melanoma y muestras de nevos. Al seleccionar el punto de corte se buscó maximizar la sensibilidad del modelo, manteniendo la mayor especificidad posible. Seleccionó un punto de corte con una sensibilidad de 0.89 y una especificidad de 0.93. Luego se ajustó el cálculo de la puntuación para que el punto de corte seleccionado tuviera un valor de cero. Así, el cálculo de la puntuación ajustada fue:
Puntuación ajustada = (1.149 x PRAME) (0.922 x S100A9) (0.698 x componente inmunitario) - 0.334
Refinando el modelo de diagnóstico
Para mejorar la solidez y la precisión del ensayo, se quería determinar medidas adicionales para los predictores PRAME y S100A9. Se probaron amplicones adicionales correspondientes a PRAME y S100A9. Se intentó determinar si otros amplicones producían una señal confiable y correlacionada para estos genes. Se probaron cuatro amplicones PRAME adicionales.
También se probaron amplicones que correspondían a otros seis genes que se determinó que tendrían una expresión altamente correlacionada con S100A9: S100A7, S100A8, S100A10, S100A12, S100A14 y PI3.
Se determinó que un amplicón PRAME tenía bajas tasas de falla y tenía valores altamente correlacionados con el amplicón PRAMe utilizado previamente en el modelo. Se promedió su medida con la otra medida PRAME para proporcionar un componente PRAME.
Se eligieron otros cuatro genes potenciales que produjeron datos con bajas tasas de falla y estaban altamente correlacionados con el amplicón S100A9 seleccionado en el conjunto de entrenamiento. Estos cuatro genes, S100A7, S100A8, S100A12 y PI3 se promediaron con S100A9 para producir un solo componente relacionado con S100, o puntuación S100.
Por lo tanto, se pudo crear una firma refinada para los tres predictores, PRAME, el componente relacionado con S100 y el componente inmunitario. La firma refinada incluía mediciones adicionales para los predictores relacionados con PRAME y S100 determinados anteriormente. La firma refinada incluyó un total de 15 amplicones que midieron 14 genes característicos que comprenden dos mediciones del gen PRAME, una medición de cada uno de los genes relacionados con S100 S100A9, S100A7, S100A8, S100A12 y PI3, y mediciones de ocho genes inmunitarios altamente correlacionados (CXCL9, CCL5, CXCL10, IRF1, PTPN22, PTPRC, LCP2 Y CD38) (Tabla 12). Junto con estos 15 amplicones de firma, también se incluyeron amplicones correspondientes a nueve genes constitutivos diferentes para la normalización, para un total de 24 amplicones en la firma refinada (Tabla 12).
Tabla 12- Genes de firma y constitutivos que componen la firma refinada.
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Por último, se realizó un estudio económico para verificar que los cambios en la reacción de PCR multiplex no alterarían los datos generados a partir de los 10 amplicones de firma retenidos de la firma inicial. El ensayo de PCRq se basa en el hecho de que todos los genes medidos se preamplifican en una única reacción de PCR multiplex. Dado que la firma refinada diterta de la firma inicial, era importante asegurarse de que el conjunto de amplicón diferente de la firma refinada no alteraba la reacción de PCR multiplex y, en consecuencia, alteraba los datos generados a partir de los 10 amplicones retenidos del conjunto de firma inicial. Por lo tanto, se volvió a probar la expresión de ARN en 74 muestras de ARN del conjunto de entrenamiento inicial utilizando la firma refinada. Las puntuaciones de las muestras ARN reexaminadas demostraron una correlación extremadamente alta (eficacia de correlación de 0.99) cuando se compararon con las puntuaciones generadas a partir del conjunto de entrenamiento. Por lo tanto, la firma refinada no alteró los datos generados a partir de ninguno de los amplicones de la firma refinada. En consecuencia, la firma refinada produjo un cálculo de puntuaciones ajustado y refinado de:
Puntuación ajustada refinada = (1.223 x componente PRAME) (1.023 x componente S100) (0.704 x componente Inmunitario) 0.267
Ejemplo 7
En este ejemplo, se validó clínicamente un modelo de diagnóstico para diferenciar entre melanoma maligno y nevos no malignos.
Métodos
Se generó una cohorte de validación mediante la adquisición de más de 400 lesiones cutáneas de cuatro sitios separados: Cleveland Clinic, Moffit Cancer Center, Northwestern University y University of Utah (Tabla 13).
Tabla 13 - Fuentes de muestras para la cohorte de validación clínica.
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Solo se incluyeron las muestras que produjeron resultados analizables.
Cada sitio proporcionó muestras malignas y benignas, con todos los principales subtipos histológicos representados. El diagnóstico de cada caso se confirmó utilizando un segundo dermatopatólogo que desconocía el diagnóstico del primer dermatopatólogo. Si había discordancia en los diagnósticos, un tercer dermatopatólogo adjudicaba el diagnóstico. Los subtipos de melanoma incluyeron melanoma de extensión superficial, melanoma nodular, melanoma lentigo maligno, melanoma desmoplásico y subtipos clasificados como no especificados (Tabla 14).
Tabla 14 - Información clínica de las muestras de melanoma utilizadas en la validación clínica.
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SSM = Melanoma de extensión superficial, Nod = Melanoma nodular, LMM = Melanoma Lentigo maligno, Desm = Desmoplásico, NOS = Subtipo no especificado
Solo se incluyeron las muestras que produjeron resultados analizables.
Los subtipos de nevos incluyeron nevos azules, nevos compuestos, nevos de unión, nevos dérmicos, nevos de penetración profunda, nevos displásicos y subtipos clasificados como no especificados (Tabla 15).
Tabla 15 - Información clínica de las muestras de nevos utilizadas en la validación clínica.
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Comp = Compuesto, Junc = Unión, Derm = Dérmico, Deep Pen = Penetración profunda, NOS = Subtipo no especificado, Dysμl = Displásico.
*Los nevos displásicos se puntuaron como un atributo de un subtipo, no como un subtipo específico.
Las muestras de los pacientes se prepararon como se describe anteriormente en el Ejemplo 5. La extracción de ARN, la preparación de ARN y la cuantificación de la expresión génica también se llevaron a cabo como se describe anteriormente en el Ejemplo 5. Se ensayaron la misma lista de genes característicos potenciales y los mismos genes constitutivos que en el Ejemplo 5 (Tabla 11). Asimismo, como en el Ejemplo 5, la expresión medida de cada gen fue promediada y normalizada por la expresión promediada de los siete genes constitutivos. Luego, se generó una puntuación ajustada y refinada para cada muestra de paciente usando el cálculo de la puntuación ajustada y refinada de:
Puntuación ajustada refinada = (1.223 x componente PRAME) (1.023 x componente S100) (0.704 x componente Inmunitario) 0.267
Resultados
Las puntuaciones ajustadas y refinadas se trazaron para cada muestra de pacientes (Figura 12). Las puntuaciones ajustadas y refinadas trazadas dieron como resultado una distribución bimodal similar a la que se ve en la Figura 10 del Ejemplo 6. Casi todas las muestras de melanoma tenían puntuaciones mayores que cero (Figura 12, panel superior) y casi todas las muestras de nevos tuvieron puntuaciones inferiores a cero (Figura 12, panel inferior). Luego, estos datos se usaron para generar una curva ROC de validación que tenía un AUC de ~ 0.96 con una sensibilidad de 0.9 y una especificidad de 0.91 (Figura 13). El valor de p asociado a la curva ROC de validación fue de 3.7 x 10'63. A continuación, se comparó la curva ROC de validación con la curva ROC generada en el Ejemplo 6 (Figura 11) para determinar si se había validado el modelo de diagnóstico. La curva ROC de validación tenía un AUC de ~ 0.96, una sensibilidad de 0.9 y una especificidad de 0.91 en comparación con la curva ROC del ejemplo 6 que tenía un AUC de ~ 0.95, una sensibilidad de 0.89 y una especificidad de 0.93. La estrecha concordancia de la curva ROC de validación y la curva ROC del Ejemplo 6 indicó que la cohorte de validación validó el modelo de diagnóstico del Ejemplo 6.
A continuación, se analizó el rendimiento del modelo de diagnóstico dentro de subtipos histológicos individuales para aquellos subtipos con 30 o más muestras (Tabla 16).
Tabla 16 - Rendimiento del ensayo dentro de los subtipos individuales en la validación clínica.
Figure imgf000095_0001
Se reportaron solo grupos de subtipos con > 30 muestras.
Había dos subtipos benignos, compuestos y dérmicos, con más de 30 muestras. La puntuación de los subtipos compuestos y dérmicos dio como resultado especificidades del 94 % y 98 %, respectivamente, con una especificidad general del 91 % para todos los nevos. Había tres subtipos malignos, melanoma de extensión superficial, melanoma nodular y melanoma lentigo maligno con más de 30 muestras. La puntuación del melanoma de extensión superficial, el melanoma nodular y el melanoma lentigo maligno dio como resultado sensibilidades del 86 %, 97 % y 90 %, respectivamente, con una sensibilidad general del 90 % para todos los melanomas.
Ejemplo 8
En este ejemplo, se desarrolló un enfoque diferente para interpretar el diagnóstico mayor al designar una zona indeterminada. Las muestras con puntuaciones entre -2.0 y -0.1 se clasificaron como indeterminadas y no son compatibles con nevo benigno ni con melanoma maligno. Las muestras con puntuaciones entre -16.7 y -2.1 se clasificaron como compatibles con nevo benigno. Las muestras con puntuaciones entre 0 y 11.1 se clasificaron como compatibles con melanoma maligno.
Las puntuaciones ajustadas y refinadas se trazaron para cada muestra de pacientes (Figura 14). La puntuación de las muestras como consistentes con nevo benigno, indeterminadas o consistentes con melanoma maligno dio como resultado una sensibilidad del 94 % y una especificidad del 90 % después de que las muestras indeterminadas se eliminaron del análisis. El 9 % de las muestras se clasificaron como indeterminadas (5 % del total de melanomas y 13 % del total de muestras de nevos analizadas) (Figura 14).
Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con el fin de facilitar la comprensión, será evidente que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones en el marco de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para diagnosticar melanoma en un paciente que comprende:
a) medir en una muestra obtenida de un paciente sospechoso de padecer melanoma, la expresión normalizada de los genes PRAME, S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, S100A10, S100A14, PI3, CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22, y PTPRC; y
b) calcular una puntuación basada en la suma de:
(i) 0.9-1.5 multiplicado por la expresión normalizada de PRAME;
(ii) 0.40-1 multiplicado por el promedio de la expresión normalizada de CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22, y PTPRC;
(iii) 0.9-1.5 multiplicado por el promedio de la expresión normalizada de S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, S100A10, S100A14 y PI3; y
(iv) un factor de ajuste predefinido dispuesto para ajustar la puntuación de un valor de corte particular de manera que el valor de corte se centre en cero;
una puntuación superior a cero es indicativa de melanoma.
2. Aldesleukin, Dabrafenib, Dacarbazine, DTIC-Dome (Dacarbazine), Intron A (Interferón Alfa-2b recombinante), Ipilimumab, Mekinist (Trametinib), Peginterferon Alfa-2b, PEG-Intron (Peginterferon Alfa-2b), Proleukin (Aldesleukin), Interferón Alfa-2b recombinante, Sylatron (Peginterferón Alfa-2b), Tafinlar (Dabrafenib), Trametinib, Vemurafenib, Yervoy (Ipilimumab), Zelboraf (Vemurafenib), vacuna Bacille Calmette-Guerin (BCG), interleucina-2, imiquimod, citoquinas, dacarbazina (DTIC), temozolomida (Temodar), inhibidor de la proteína quinasa quinasa activada por mitógeno (MEK) (trametinib) y/o fármacos bloqueantes beta-adrenérgicos para usar en el tratamiento del melanoma en un paciente, en el que una muestra de dicho paciente produce una puntuación mayor a cero, en donde dicha puntuación está determinado por:
a) medir en dicha muestra, la expresión normalizada de los genes PRAME, S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, S100A10, S100A14, PI3, CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22 y PTPRC; y
b) calcular dicha puntuación con base en la suma de:
(i) 0.9-1.5 multiplicado por la expresión normalizada de PRAME;
(ii) 0.40-1 multiplicado por el promedio de la expresión normalizada de CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22, y PTPRC;
(iii) 0.9-1.5 multiplicado por el promedio de la expresión normalizada de S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, S100A10, S100A14 y PI3; y
(iv) un factor de ajuste predefinido dispuesto para ajustar la puntuación de un valor de corte particular de manera que el valor de corte se centre en cero.
3. Un método de detección de melanoma en pacientes que comprende:
a) medir en una muestra obtenida de un paciente sospechoso de padecer melanoma, la expresión normalizada de los genes PRAME, S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, S100A10, S100A14, PI3, CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22 y PTPRC;
b) calcular una puntuación basada en la suma de:
(i) 0.9-1.5 multiplicado por la expresión normalizada de PRAME;
(ii) 0.40-1 multiplicado por el promedio de la expresión normalizada de CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22, y PTPRC;
(iii) 0.9-1.5 multiplicado por el promedio de la expresión normalizada de S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, S100A10, S100A14 y PI3; y
(iv) un factor de ajuste predefinido dispuesto para ajustar la puntuación de un valor de corte particular de manera que el valor de corte se centre en cero; y
c) clasificar al paciente como portador de un melanoma maligno cuando dicha puntuación es superior a cero, y clasificar al paciente como portador de un nevo benigno o de un nevo displásico cuando la puntuación es inferior a cero.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el nivel de expresión del uno o más genes se mide mediante
(i) detectar ARN en dichas muestras;
(ii) PCRq; y/o
(iii) hibridación.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el nivel de expresión normalizado del uno o más genes se determina normalizando la expresión de uno o más genes constitutivos.
6. El método de la reivindicación 5, en el que dichos genes constitutivos comprenden al menos uno de MRFAP1, PSMA1, RPL13A, TXNL1, SLC25A3, RPS29, RPL8, PSMC1 y RPL4.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la muestra es
(i) una lesión en la piel;
(ii) un melanoma maligno;
(iii) un nevo benigno; y/o
(iv) un nevo displásico.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la puntuación se registra en un informe.
9. El método de la reivindicación 8, en el que el informe se comunica al proveedor médico del paciente.
10. Un método implementado por ordenador que comprende:
a) animar la ejecución de un módulo de código configurado para mostrar una puntuación que representa una comparación entre los niveles de expresión génica normalizados de un panel de biomarcadores en un paciente y los niveles de expresión génica normalizados en grupos de control con melanoma y en grupos de control sin melanoma; b) iniciar la ejecución del módulo de código; y
c) presentar una representación gráfica visual de la puntuación, en la que dicho panel de biomarcadores comprende los genes PRAME, S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, S100A10, S100A14, PI3, CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22 y PTPRC, y en el que la puntuación se calcula con base en la suma de:
(i) 0.9-1.5 multiplicado por la expresión normalizada de PRAME;
(ii) 0.40-1 multiplicado por el promedio de la expresión normalizada de CCL5, CD38, CXCL10, CXCL9, IRF1, LCP2, PTPN22, y PTPRC;
(iii) 0.9-1.5 multiplicado por el promedio de la expresión normalizada de S100A9, S100A7, S100A8, S100A12, S100A10, S100A14, y PI3; y
(iv) un factor de ajuste predefinido dispuesto para ajustar la puntuación de un valor de corte particular de manera que el valor de corte se centre en cero.
11. El método de la reivindicación 10, en el que el nivel de expresión normalizado del uno o más genes se obtiene normalizando el nivel de expresión al nivel de expresión de uno o más genes constitutivos.
12. El método de la reivindicación 11, en el que dichos genes constitutivos comprenden al menos uno de MRFAP1, PSMA1, RPL13A, TXNL1, SLC25A3, RPS29, RPL8, PSMC1 y RPL4.
13. El método de la reivindicación 10, en el que la puntuación representa la probabilidad de que el paciente tenga melanoma.
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