ES2991436T3 - Biomarcadores de cáncer - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan biomarcadores y métodos que utilizan los biomarcadores para la predicción del riesgo de recurrencia del cáncer en un paciente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Biomarcadores de cáncer
Campo de la invención
La invención se refiere de manera general a una clasificación molecular de enfermedad y de manera particular a marcadores moleculares para el cáncer y a métodos de uso de los mismos.
Antecedentes de la invención
El cáncer es uno de los principales problemas de salud pública, que representa aproximadamente el 25 % de todas las muertes en los Estados Unidos. Aunque se han concebido muchos tratamientos para diversos cánceres, estos tratamientos a menudo varían en cuanto a la gravedad de los efectos secundarios. Resulta útil que los médicos sepan cómo de agresivo es el cáncer de un paciente con el fin de determinar la agresividad con la que tratar el cáncer.
Por ejemplo, a la mayoría de los pacientes con cáncer de próstata asintomático de estadio temprano se les trata con prostatectomía radical o radioterapia y opcionalmente terapia complementaria (por ejemplo, terapia hormonal o quimioterapia), teniendo todas ellas graves efectos secundarios. Sin embargo, para muchos de estos pacientes, estos tratamientos y sus efectos secundarios y costes asociados son innecesarios porque el cáncer en estos pacientes no es agresivo (es decir, crece lentamente y es improbable que provoque mortalidad o morbilidad significativa durante la vida del paciente). En otros pacientes el cáncer es virulento (es decir, es más probable que reaparezca) y es necesario un tratamiento agresivo para salvar la vida del paciente.
Se han concebido algunas herramientas para ayudar a los médicos a decidir qué pacientes necesitan un tratamiento agresivo y cuáles no. De hecho, en la actualidad hay varios parámetros clínicos en uso para este propósito en diversos cánceres diferentes. En el cáncer de próstata, por ejemplo, tales parámetros clínicos incluyen antígeno prostático específico (PSA) en suero, grado de Gleason, estadio patológico, y márgenes quirúrgicos. En los últimos años, se ha hecho que los parámetros clínicos sean más útiles mediante su incorporación en nomogramas posoperatorios de múltiples variables continuas que calculan la probabilidad de que un paciente presente progresión/recidiva del cáncer. Véase, por ejemplo, Kattanet al.,J. CLIN. ONc Ol . (1999) 17:1499-1507; Stephensonet al.,J. CLIN. ONCOL. (2005) 23:7005-7012. Sin embargo, a pesar de estos avances, a muchos pacientes se les administran tratamientos contra el cáncer inadecuados y todavía existe la gran necesidad de herramientas nuevas y mejoradas para predecir la recidiva del cáncer.
Bibikovaet al(Genomics, vol. 89, n.° 6, 12 de mayo de 2007, páginas 666-672) divulgaron firmas de expresión génica que se correlacionan con la puntuación de Gleason en pacientes con cáncer de próstata. Se identificó un panel de 16 genes, cuyos niveles de expresión se usaron para derivar una puntuación de expresión que se correlaciona con la recaída de la enfermedad.
Sumario de la invención
La presente invención es tal como se expone en las reivindicaciones. Se basa en la determinación de que los genes cuya expresión sigue de cerca al ciclo celular (“genes del ciclo celular” o “CCG”) son genes particularmente poderosos para clasificar ciertos cánceres. De hecho, los inventores han descubierto que los CCG proporcionan la mayor parte de, si no todo, el poder predictivo en muchas firmas pronósticas. Por ejemplo, en el presente documento se muestra que los paneles de CCG son capaces de predecir la agresividad del cáncer de próstata, vejiga, cerebro, mama y pulmón.
Por tanto, un aspecto de la invención proporciona un método para clasificar el cáncer de próstata que comprende determinar el estado de un panel de genes que comprende al menos diez CCG de cualquiera de los paneles C-G, en el que un estado anómalo indica una clasificación de cáncer particular. En algunas realizaciones, el estado que va a determinarse son los niveles de expresión génica. En algunas realizaciones, el estado anómalo indica que el cánceres agresivo, que puede incluir tener un mal pronóstico, una probabilidad aumentada de recidiva o progresión, etc. En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para determinar el pronóstico del cáncer de próstata de un paciente que comprende determinar el nivel de expresión de un panel de genes que comprende al menos diez CCG de cualquiera de los paneles C-G, en el que una expresión elevada indica una probabilidad aumentada de recidiva o progresión del cáncer o la necesidad de un tratamiento agresivo.
El número de CCG sometidos a ensayo puede variar dependiendo de, por ejemplo, restricciones técnicas, consideraciones de costes, la clasificación que esté realizándose, el cáncer que esté sometiéndose a prueba, el nivel deseado de poder predictivo, etc. Sin embargo, se ha determinado que ciertos números mínimos de CCG proporcionan predicciones robustas y significativamente mejoradas. En algunas realizaciones, el panel comprende al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más CCG. En algunas realizaciones, el panel comprende al menos 10, 15, 20 o más CCG.
En algunas realizaciones, los CCG comprenden al menos una cierta proporción del panel de genes. Por tanto, en algunas realizaciones, el panel comprende al menos el 25 %, el 30 %, el 40 %, preferiblemente al menos el 50 %, el 60 %, el 70 %, más preferiblemente al menos el 75 %, el 80 %, el 85 %, y lo más preferiblemente el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de CCG.
En algunas realizaciones, los CCG se eligen del grupo que consiste en los genes en los paneles C a G. En algunas realizaciones, el panel comprende al menos 10 o más de los genes enumerados en cualquiera de los paneles C a G.
Se ha descubierto que los CCG son particularmente predictivos en ciertos cánceres. Por ejemplo, se ha determinado que un panel de CCG es preciso a la hora de predecir la recidiva en el cáncer de próstata. Además, los CCG pueden determinar el pronóstico en cáncer de vejiga, cerebro, mama y pulmón. Por tanto, la invención proporciona un método que comprende determinar el estado de un panel de genes que comprende al menos diez C<c>G, en el que un estado anómalo indica un mal pronóstico. En algunas realizaciones, el panel comprende al menos 10 genes elegidos del grupo de genes en al menos uno de los paneles C a G. En algunas realizaciones, el panel comprende al menos 15 genes elegidos del grupo de genes en al menos uno de los paneles A a G. En algunas realizaciones, el panel comprende la totalidad de los genes en al menos uno de los paneles A a G.
Se ha descubierto además que el estado de CCG se añade sinérgicamente a los parámetros clínicos (por ejemplo, nomogramas clínicos) a la hora de pronosticar el cáncer. En el caso de cáncer de próstata, se ha descubierto que un nivel alto de expresión génica de uno cualquiera de los genes en cualquiera de los paneles A a F está asociado con un riesgo aumentado de recidiva o progresión del cáncer en pacientes cuya puntuación de nomograma clínico indica un riesgo relativamente bajo de recidiva o progresión. Véanse, por ejemplo, los ejemplos 3 y 5. En el caso de cáncer de cerebro, se ha descubierto que un nivel alto de expresión génica de uno cualquiera de los genes en cualquiera de los paneles B, C o F está asociado con un riesgo aumentado de recidiva o progresión del cáncer independientemente del grado tumoral. En el caso de cáncer de pulmón, se ha descubierto que un nivel alto de expresión génica de uno cualquiera de los genes en cualquiera de los paneles B, C o F está asociado con un riesgo aumentado de recidiva o progresión del cáncer independientemente del estadio tumoral. En el caso de cáncer de mama, se ha descubierto que un nivel alto de expresión génica de uno cualquiera de los genes en cualquiera de los paneles B, C o F está asociado con un riesgo aumentado de recidiva o progresión del cáncer independientemente de la puntuación de nomograma del índice pronóstico de Nottingham (NPI). Por tanto, dado que la evaluación de los niveles de expresión de CCG puede detectar un riesgo aumentado no detectado usando los parámetros clínicos solos, la invención proporciona de manera general métodos que combinan la evaluación de al menos un parámetro clínico con la evaluación del estado de al menos un CCG.
Por tanto, un aspecto de la invención proporciona un método de diagnósticoin vitroque comprende determinar al menos un parámetro clínico para un paciente con cáncer de próstata y determinar el estado de al menos diez CCG en una muestra obtenida del paciente. En algunas realizaciones, se determina el estado de una pluralidad de CCG (por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o más). En algunas realizaciones, el estado anómalo indica una probabilidad aumentada de recidiva o progresión. A menudo, el parámetro clínico es al menos algo independientemente predictivo de recidiva o progresión y la adición del estado de CCG mejora el poder predictivo. Los CCG a modo de ejemplo incluyen aquellos en los paneles A a G. En algunas realizaciones, se evalúa más de un parámetro clínico junto con el nivel de expresión de al menos diez CCG. En algunas realizaciones, se evalúa más de un parámetro clínico, y la combinación de parámetros, junto con el nivel de expresión de al menos diez CCG, predice la probabilidad de recidiva o progresión del cáncer.
A menudo, los parámetros clínicos se combinan e incorporan en nomogramas para predecir el riesgo de recidiva o progresión del cáncer. Por tanto, otro aspecto de la invención proporciona un método de diagnósticoin vitroque comprende determinar una puntuación de nomograma clínico para un paciente con cáncer y determinar el estado de al menos diez CCG de cualquiera de los paneles C-G en una muestra obtenida del paciente. A menudo, los nomogramas clínicos están diseñados de manera que una puntuación alta se correlaciona con un riesgo aumentado de recidiva. De manera similar, un estado de<c>C<g>elevado (por ejemplo, expresión o actividad aumentada) se correlaciona con un riesgo aumentado. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona un método para determinar si un paciente con cáncer de próstata tiene una probabilidad aumentada de recidiva o progresión que comprende determinar una puntuación de nomograma clínico para el paciente y determinar el estado de al menos diez CCG de cualquiera de los paneles C-G en una muestra obtenida del paciente, en el que una puntuación alta de nomograma y/o un estado de CCG elevado indican que el paciente tiene una probabilidad aumentada de recidiva o progresión.
En un aspecto, la invención proporciona un método de diagnósticoin vitroque comprende determinar al menos un parámetro clínico (o una puntuación de nomograma) para un paciente y determinar el estado de un panel de CCG que comprende al menos diez CCG de cualquiera de los paneles C-G. El número de CCG sometidos a ensayo puede variar dependiendo de, por ejemplo, restricciones técnicas, consideraciones de costes, la clasificación que esté realizándose, el cáncer que esté sometiéndose a prueba, el nivel deseado de poder predictivo, etc. Como un ejemplo, la invención proporciona un método de diagnósticoin vitroque comprende determinar una puntuación de nomograma para un paciente y determinar el nivel de expresión de diez o más de los genes enumerados en los paneles C a G. Puede usarse cualquier combinación de CCG (incluyendo cualquiera de los enumerados en la tabla 1 o los paneles A a G) para poner en práctica la invención. En una realización, se someten a ensayo todos los CCG enumerados en la tabla 1 o los paneles A a G.
También se ha descubierto que el estado dePTENpredice el cáncer de próstata agresivo. El estado dePTENse añade tanto a los parámetros clínicos como a los CCG. El estado dePTENcombinado con el estado de CCG es un mejor factor predisponente que un nomograma clínico de próstata. Dado que la evaluación del estado dePTENpuede detectar un riesgo aumentado no detectado usando los parámetros clínicos (por ejemplo, nomograma clínico) o los niveles de expresión de CCG solos o en combinación, algunos métodos combinan un parámetro clínico o nivel de expresión de<c>C<g>con una evaluación del estado dePTEN.
En los ejemplos a continuación se ha demostrado que pueden combinarse los tres marcadores para proporcionar un poder predictivo incluso mayor.
El estado de un gen incluye cualquier característica física, química o genética de ese gen. Los ejemplos incluyen nivel de expresión, nivel de actividad, mutaciones, número de copias, etc. En el contexto de CCG para predecir el riesgo de recidiva o progresión, el nivel de expresión y el nivel de actividad a menudo son las características más útiles a evaluar a la hora de determinar el estado de un CCG. En algunas realizaciones, determinar el nivel de expresión de un gen comprende al menos uno de:
(a) determinar la cantidad de polipéptido codificado por el gen; o
(b) determinar la cantidad de ARN codificado por el gen.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una ilustración del poder predictivo a lo largo del nomograma para paneles de CCG de diferentes tamaños.
La figura 2 es una ilustración de CCG que predicen el tiempo hasta la recidiva.
La figura 3 es una ilustración de nomograma que predice el tiempo hasta la recidiva.
La figura 4 es una ilustración de la recidiva no solapante predicha por el nomograma y una firma de CCG.
La figura 5 es una ilustración del tiempo hasta la recidiva para varias poblaciones de pacientes definidas por nomograma y/o estado de CCG.
La figura 6 es una ilustración de un ejemplo de un sistema útil en ciertos aspectos de la invención.
La figura 7 es un diagrama de flujo que ilustra un ejemplo de un método implementado por ordenador.
La figura 8 es un diagrama de dispersión que compara los parámetros clínicos y la puntuación de CCG como factores predisponentes de recidiva del ejemplo 5.
La figura 9 ilustra, a partir del ejemplo 5, el umbral de CCG derivado del análisis de la cohorte de entrenamiento con respecto al conjunto de datos de validación, subdividiendo eficazmente la puntuación de firma de CCG a pacientes identificados como con riesgo bajo usando parámetros clínicos en pacientes con tasas de recidiva muy bajas y con un mayor riesgo de recidiva.
La figura 10 ilustra la tasa de recidiva predicha frente a la puntuación de CCG para pacientes en la cohorte de validación del ejemplo 5.
La figura 11 ilustra la tasa de recidiva predicha frente a la puntuación de CCG para pacientes en la cohorte de validación del ejemplo 5.
La figura 12 ilustra la distribución de puntuación de riesgo clínico en 443 pacientes estudiados en el ejemplo 5. La línea vertical oscura representa el umbral elegido mediante medias de KM para dividir a pacientes con riesgo bajo y alto y usado a lo largo de este estudio.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que los genes cuya expresión sigue de cerca al ciclo celular (“genes del ciclo celular” o “CCG”) son genes particularmente poderosos para clasificar ciertos cánceres. “Gen del ciclo celular” y “CCG” en el presente documento se refieren a un gen cuyo nivel de expresión sigue de cerca a la progresión de la célula a través del ciclo celular. Véase, por ejemplo, Whitfieldet al.,MOL. BIOL. CELL (2002) 13:1977-2000. Más específicamente, los CCG muestran aumentos y disminuciones periódicos en la expresión que coinciden con ciertas fases del ciclo celular, por ejemplo,STK15yPLKmuestran una expresión máxima en G2/M.Id.A menudo, los CCG tienen una función relacionada con el ciclo celular clara y reconocida, por ejemplo, en la síntesis o reparación del ADN, en la condensación de cromosomas, en la división celular, etc. Sin embargo, algunos CCG tienen niveles de expresión que siguen el ciclo celular sin tener ningún papel directo obvio en el ciclo celular, por ejemplo,UBE2Scodifica para una enzima que se conjuga con ubiquitina, aunque su expresión sigue de cerca al ciclo celular. Por tanto, no es necesario que un CCG según la presente invención tenga un papel reconocido en el ciclo celular. Se enumeran CCG a modo de ejemplo en las tablas 1, 2, 3 y 4.
Si un gen particular es un CCG puede determinarse mediante cualquier técnica conocida en la técnica, incluyendo aquella enseñada en Whitfieldet al.,MOL. BIOL. CELL (2002) 13:1977-2000. Por ejemplo, una muestra de células, por ejemplo, células HeLa, pueden sincronizarse de manera que todas ellas avancen a través de las diferentes fases del ciclo celular al mismo tiempo. Generalmente, esto se realiza deteniendo a las células en cada fase, por ejemplo, las células pueden detenerse en la fase S usando un bloque de timidina doble o en la mitosis con un bloque de timidina-nocodazol. Véase, por ejemplo, Whitfieldet al.,MOL. CELL. BIOL. (2000) 20:4188-4198. Se extrae el ARN de las células después de la detención en cada fase y se cuantifica la expresión génica usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, micromatriz de expresión (de genoma completo o genes de interés específicos), PCR™ cuantitativa en tiempo real (RTQ-PCR). Finalmente, se aplica análisis estadístico (por ejemplo, transformada de Fourier) para determinar qué genes muestran una expresión máxima durante fases particulares del ciclo celular. Los genes pueden clasificarse según una puntuación de periodicidad que describe cómo de cerca sigue la expresión génica al ciclo celular, por ejemplo, una puntuación alta indica un gen que sigue muy de cerca al ciclo celular. Finalmente, esos genes cuya puntuación de periodicidad supera un nivel de umbral definido (véase Whitfieldet al.,MOL. BIOL. CELL (2002) 13:1977-2000) pueden designarse como CCG. En la tabla 1 se proporciona una lista larga, pero no exhaustiva, de ácidos nucleicos asociados con CCG (por ejemplo, genes, EST, clones de ADNc, etc.). Véase Whitfieldet al.,MOL. BIOL. CELL (2002) 13:1977-2000. Todos los CCG en la tabla 2 a continuación forman un panel de CCG (“panel A”)
Tabla 2
* Subconjunto de 124 genes de CCG útiles en la invención (“panel B”). ID de ensayo de ABI significa el número de ID de catálogo para el ensayo de expresión génica disponible comercialmente de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) para el gen particular.
Aunque no se desea estar limitado por ninguna teoría, se piensa que las muestras de tejido que contienen una concentración relativamente alta de células que proliferan rápidamente mostrarán, en total, una expresión relativamente mayor de los CCG. Se piensa que esto es debido a que algunos CCG están regulados por incremento durante la proliferación celular (es decir, durante ciertas fases del ciclo celular). A su vez, los tumores que comprenden una alta concentración de células que proliferan rápidamente tienden a ser más agresivos y los pacientes que padecen tales tumores tienden a tener un peor pronóstico. De hecho, los inventores han determinado que los CCG proporcionan la mayor parte de, si no todo, el poder predictivo en la mayoría de las firmas pronósticas de cáncer. Por ejemplo, los paneles que tienen CCG pueden predecir la agresividad del cáncer de próstata, cerebro, mama y pulmón.
Por tanto, un aspecto de la invención proporciona un método para clasificar el cáncer de próstata que comprende determinar el estado de un panel de genes que comprende al menos diez CCG de uno cualquiera de los paneles C-G, en una muestra de tejido o células, particularmente una muestra de tumor, de un paciente, en el que un estado anómalo indica una clasificación de cáncer negativa. Tal como se usa en el presente documento, “determinar el estado” de un gen se refiere a determinar la presencia, la ausencia o el grado/nivel de alguna característica física, química o genética del gen o su(s) producto(s) de expresión. La presente invención hace uso de la determinación de la expresión media de un panel de genes tal como se recita en las reivindicaciones.
En el contexto de los CCG que se usan para determinar el riesgo de recidiva o progresión del cáncer o la necesidad de un tratamiento agresivo, las características particularmente útiles incluyen los niveles de expresión (por ejemplo, niveles de ARNm o proteína) y los niveles de actividad. Las características pueden someterse a ensayo directamente (por ejemplo, sometiendo a ensayo el nivel de expresión de un CCG) o determinarse indirectamente (por ejemplo, sometiendo a ensayo el nivel de un gen o genes cuyo nivel de expresión se correlaciona con el nivel de expresión del CCG). Por tanto, algunas realizaciones de la invención proporcionan un método para clasificar el cáncer de próstata que comprende determinar el nivel de expresión, particularmente el nivel de ARNm, de un panel de genes que comprende al menos diez CCG de uno cualquiera de los paneles C-G, en una muestra de tumor, en el que una expresión elevada indica una clasificación de cáncer negativa, o un riesgo aumentado de recidiva o progresión del cáncer, o la necesidad de un tratamiento agresivo.
Los expertos en la técnica están familiarizados con diversas técnicas para determinar el estado de un gen o una proteína en una muestra de tejido o células, incluyendo, pero sin limitarse a, análisis de micromatrices (por ejemplo, para someter a ensayo la expresión de ARNm o microARN, el número de copias, etc.), PCR™ cuantitativa en tiempo real (“qRT-PCR™”, por ejemplo, TaqMan™), inmunoanálisis (por ejemplo, ELISA, inmunohistoquímica), etc.
Un “estado anómalo” significa que el estado de un marcador en una muestra particular difiere del estado generalmente hallado en muestras regulares (por ejemplo, muestras sanas o muestras enfermas regulares). Los ejemplos incluyen mutado, elevado, disminuido, presente, ausente, etc. Un “estado elevado” significa que una o más de las características anteriores (por ejemplo, nivel de expresión o ARNm) es mayor que los niveles normales. Generalmente esto significa un aumento en la característica (por ejemplo, nivel de expresión o ARNm) en comparación con un valor indicador. A la inversa un “estado bajo” significa que una o más de las características anteriores (por ejemplo, nivel de expresión génica o ARNm) es menor que los niveles normales. Generalmente esto significa una disminución en la característica (por ejemplo, expresión) en comparación con un valor indicador. En este contexto, un “estado negativo” generalmente significa que la característica está ausente o es indetectable. Por ejemplo, el estado dePTENes negativo si el ácido nucleico y/o la proteína dePTENestá ausente o es indetectable en una muestra. Sin embargo, el estado dePTENnegativo también incluye una mutación o reducción del número de copias enPTEN.
Los expertos en la técnica apreciarán cómo obtener y usar un valor indicador en los métodos de la invención. Por ejemplo, el valor indicador puede representar los niveles de expresión génica hallados en una muestra normal obtenida del paciente de interés, en cuyo caso un nivel de expresión en la muestra de tumor significativamente mayor a este valor indicador indicaría, por ejemplo, un mal pronóstico o una probabilidad aumentada de recidiva del cáncer o la necesidad de un tratamiento agresivo.
Alternativamente, el valor indicador puede representar el nivel de expresión promedio de un conjunto de individuos de una población de cáncer diversa o un subconjunto de la población. Por ejemplo, puede determinarse el nivel de expresión promedio de un gen o panel de genes en un muestreo aleatorio de pacientes con cáncer de próstata. Este nivel de expresión promedio puede denominarse “valor indicador de umbral”, esperándose que los pacientes que tienen una expresión de CCG mayor a este valor tengan un peor pronóstico que los que tienen una expresión menor a este valor.
Alternativamente, el valor indicador puede representar el nivel de expresión promedio de un marcador génico particular en una pluralidad de pacientes de entrenamiento (por ejemplo, pacientes con cáncer de próstata) con desenlaces similares cuyos datos clínicos y de seguimiento están disponibles y son suficientes para definir y categorizar a los pacientes por desenlace de enfermedad, por ejemplo, recidiva o pronóstico. Véanse, por ejemplo, los ejemplos a continuación. Por ejemplo, un “valor indicador de buen pronóstico” puede generarse a partir de una pluralidad de pacientes con cáncer de entrenamiento caracterizados como que tienen un “buen desenlace”, por ejemplo, aquellos que no han tenido recidiva del cáncer cinco años (o diez años o más) después del tratamiento inicial, o aquellos que no han tenido progresión en su cáncer cinco años (o diez años o más) después del diagnóstico inicial. Un “valor indicador de mal pronóstico” puede generarse a partir de una pluralidad de pacientes con cáncer de entrenamiento definidos como que tienen un “mal desenlace”, por ejemplo, aquellos que han tenido recidiva del cáncer en el plazo de cinco años (o diez años, etc.) después del tratamiento inicial, o aquellos que han tenido progresión en su cáncer en el plazo de cinco años (o diez años, etc.) después del diagnóstico inicial. Por tanto, un valor indicador de buen pronóstico de un gen particular puede representar el nivel de expresión promedio del gen particular en pacientes que tienen un “buen desenlace”, mientras que un valor indicador de mal pronóstico de un gen particular representa el nivel de expresión promedio del gen particular en pacientes que tienen un “mal desenlace”.
En algunas realizaciones de la invención, los métodos comprenden determinar la expresión de diez o más CCG, y si esta expresión está “aumentada”, el paciente tiene un mal pronóstico. En el contexto de la invención, expresión “aumentada” de un CCG significa que el nivel de expresión del paciente o bien está elevado por encima de un valor indicador normal o indicador de umbral (por ejemplo, en al menos cierta cantidad de umbral) o bien es más próximo al “valor indicador de mal pronóstico” que al “valor indicador de buen pronóstico”.
Por tanto, cuando el nivel determinado de expresión de un marcador génico relevante es más próximo al valor indicador de buen pronóstico del gen que al valor indicador de mal pronóstico del gen, entonces puede concluirse que es más probable que el paciente tenga un buen pronóstico, es decir, una probabilidad baja (o no aumentada) de recidiva del cáncer. Por otro lado, si el nivel determinado de expresión de un marcador génico relevante es más próximo al valor indicador de mal pronóstico del gen que al valor indicador de buen pronóstico del gen, entonces puede concluirse que es más probable que el paciente tenga un mal pronóstico, es decir, una probabilidad aumentada de recidiva del cáncer.
Alternativamente, los valores indicadores pueden determinarse de la siguiente manera: con el fin de asignar a los pacientes a grupos de riesgo, se establecerá un valor de umbral para la media de ciclo celular. El valor de umbral óptimo se selecciona basándose en la curva característica operativa del receptor (ROC), que representa gráficamente sensibilidad frente a (1-especificidad). Para cada incremento de la media de ciclo celular, se calculan la sensibilidad y la especificidad de la prueba usando ese valor como umbral. El umbral real será el valor que optimiza estos parámetros según requisitos de los expertos (por ejemplo, qué grado de sensibilidad o especificidad se desea, etc.). El ejemplo 5 demuestra la determinación de un valor de umbral determinado y validado experimentalmente. En algunas realizaciones, el nivel de expresión de un gen particular (particularmente CCG) se obtiene como número absoluto de copias de ARNm de una célula o muestra de tejido tumoral particular. En otras realizaciones, el nivel de expresión de un gen particular (particularmente CCG) se obtiene normalizando la cantidad de un producto de expresión de un gen particular de interés frente a la cantidad de expresión de un producto génico de normalización (por ejemplo, uno o más genes de mantenimiento). La normalización puede realizarse para generar un valor indicador o simplemente para ayudar a reducir el ruido de fondo cuando se determina el nivel de expresión del gen de interés. En una realización, por ejemplo, a la hora de determinar el nivel de expresión de un gen relevante según la presente invención, se mide la cantidad de un producto de expresión del gen (por ejemplo, ARNm, ADNc, proteína) dentro de una o más células, particularmente células tumorales, y se normaliza frente a la cantidad de producto(s) de expresión de un gen de normalización, o un conjunto de genes de normalización, dentro de la misma una o más células, para obtener el nivel de expresión del gen marcador relevante. Por ejemplo, cuando se usa un único gen como gen de normalización, puede usarse un gen de mantenimiento cuya expresión se determina que es independiente del desenlace/pronóstico del cáncer de próstata o no varía entre células normales y células de cáncer próstata. También puede usarse un conjunto de tales genes de mantenimiento en el análisis de la expresión génica para proporcionar un conjunto de genes de normalización combinados. Los genes de mantenimiento se conocen bien en la técnica, con ejemplos que incluyen, pero no se limitan a,GUSB(glucuronidasa, beta),HMBS(hidroximetilbilano sintasa),SDHA(complejo de succinato deshidrogenasa, subunidad A, flavoproteína),UBC(ubiquitina C) yYWHAZ(proteína de activación de tirosina 3-monooxigenasa/triptófano 5-monooxigenasa, polipéptido zeta). Cuando se usa un conjunto de genes de normalización combinados en la normalización, puede promediarse la cantidad de expresión génica de tales genes de normalización, combinándose conjuntamente mediante adiciones directas o mediante un algoritmo definido. Como genes de normalización también pueden usarse genes distintos de los genes de mantenimiento. Otros ejemplos de genes de mantenimiento particularmente útiles incluyen los enumerados en la tabla A a continuación.
Tabla A
_ NM_003406.3
* Subconjunto de genes de mantenimiento usados, por ejemplo, en el ejemplo 5.
Los paneles de CCG (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más CCG) pueden predecir con precisión el pronóstico, tal como se muestra en el ejemplo 3. Los expertos en la técnica están familiarizados con diversos modos de determinar la expresión de un panel de genes (es decir, una pluralidad de genes). Puede determinarse la expresión de un panel de genes determinando el nivel de expresión promedio (normalizado o absoluto) de la totalidad de genes de panel en una muestra obtenida de un paciente particular (o bien en toda la muestra o bien en un subconjunto de células de la muestra o bien en una única célula). Expresión aumentada en este contexto significará que la expresión promedio es mayor que el nivel de expresión promedio de estos genes en pacientes normales (o mayor que algún valor indicador que se ha determinado que representa el nivel de expresión promedio en una población de referencia tal como pacientes con el mismo cáncer). Alternativamente, puede determinarse la expresión de un panel de genes determinando el nivel de expresión promedio (normalizado o absoluto) de al menos un cierto número (por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30 o más) de los genes en el panel. Alternativamente, puede determinarse la expresión de un panel de genes determinando el número de copias absoluto de ARNm (o proteína) de todos los genes en el panel y sumando o promediando los mismos a lo largo de los genes.
Tal como se usa en el presente documento, “clasificar un cáncer” y “clasificación de cáncer” se refieren a determinar una o más características clínicamente relevantes de un cáncer y/o determinar un pronóstico particular de un paciente que tiene dicho cáncer. Por tanto “clasificar un cáncer” incluye, pero no se limita a: (i) evaluar el potencial metastásico, el potencial para metastatizarse a órganos específicos, el riesgo de recidiva y/o la evolución del tumor; (ii) evaluar el estadio tumoral; (iii) determinar el pronóstico del paciente en ausencia de tratamiento del cáncer; (iv) determinar el pronóstico de respuesta del paciente (por ejemplo, reducción del volumen tumoral o supervivencia libre de progresión) al tratamiento (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, cirugía para extirpar el tumor, etc.); (v) diagnóstico de la respuesta real del paciente al tratamiento actual y/o anterior; (vi) determinar un transcurso de tratamiento preferido para el paciente; (vii) pronóstico de la recaída del paciente después del tratamiento (o bien tratamiento en general o bien algún tratamiento particular); (viii) pronóstico de la esperanza de vida del paciente (por ejemplo, pronóstico de la supervivencia global), etc.
Por tanto, una “clasificación negativa” significa una característica clínica desfavorable del cáncer (por ejemplo, un mal pronóstico). Los ejemplos incluyen (i) un potencial metastásico, potencial para metastatizarse a órganos específicos y/o riesgo de recidiva aumentados; (ii) un estadio tumoral avanzado; (iii) un mal pronóstico del paciente en ausencia de tratamiento del cáncer; (iv) un mal pronóstico de la respuesta del paciente (por ejemplo, reducción del volumen tumoral o supervivencia libre de progresión) a un tratamiento particular (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, cirugía para extirpar el tumor, etc.); (v) un mal pronóstico de la recaída del paciente después del tratamiento (o bien tratamiento en general o bien algún tratamiento particular); (vi) un mal pronóstico de la esperanza de vida del paciente (por ejemplo, pronóstico de la supervivencia global), etc. En algunas realizaciones, un parámetro clínico asociado a recidiva (o una alta puntuación de nomograma) y una expresión aumentada de un CCG indican una clasificación negativa en el cáncer (por ejemplo, probabilidad aumentada de recidiva o progresión).
Tal como se comentó anteriormente, se piensa que una expresión de CCG elevada acompaña a células cancerosas que proliferan rápidamente (y, por tanto, más agresivas). Un cáncer de este tipo en un paciente a menudo significará que el paciente tiene una probabilidad aumentada de recidiva después del tratamiento (por ejemplo, las células cancerosas no destruidas o eliminadas mediante el tratamiento crecerán rápidamente de nuevo). Un cáncer de este tipo también puede significar que el paciente tiene una probabilidad aumentada de progresión del cáncer para una progresión más rápida (por ejemplo, las células que proliferan rápidamente harán que cualquier tumor crezca rápidamente, aumente su virulencia y/o se metastatice). Un cáncer de este tipo también puede significar que el paciente puede requerir un tratamiento relativamente más agresivo. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona un método para clasificar el cáncer de próstata que comprende determinar el estado de un panel de genes que comprende al menos diez CCG de uno cualquiera de los paneles C-G, en el que un estado anómalo indica una probabilidad aumentada de recidiva o progresión. Tal como se comentó anteriormente, en algunas realizaciones, el estado que va a determinarse son los niveles de expresión génica. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona un método para determinar el pronóstico del cáncer de próstata de un paciente que comprende determinar el nivel de expresión de un panel de genes que comprende al menos diez CCG de uno cualquiera de los paneles C-G, en el que una expresión elevada indica una probabilidad aumentada de recidiva o progresión del cáncer.
“Recidiva” y “progresión” son términos bien conocidos en la técnica y se usan en el presente documento según sus significados conocidos. Como un ejemplo, el significado de “progresión” puede ser dependiente del tipo de cáncer, significando progresión en cáncer de pulmón algo diferente de progresión en cáncer de próstata. Sin embargo, dentro de cada tipo y subtipo de cáncer, los expertos en la técnica entienden claramente “progresión”. Tal como se usa en el presente documento, un paciente tiene una “probabilidad aumentada” de alguna característica o algún desenlace clínico (por ejemplo, recidiva o progresión) si la probabilidad de que el paciente tenga la característica o el desenlace supera alguna probabilidad o algún valor de referencia. La probabilidad de referencia puede ser la probabilidad de la característica o el desenlace a lo largo de la población general de pacientes relevantes. Por ejemplo, si la probabilidad de recidiva en la población general de cáncer de próstata es del X% y se ha determinado que un paciente particular tiene una probabilidad de recidiva del Y %, y si Y>X, entonces el paciente tiene una “probabilidad aumentada” de recidiva. Alternativamente, tal como se comentó anteriormente, puede determinarse un valor de umbral o referencia y puede compararse la probabilidad de recidiva de un paciente particular con ese umbral o esa referencia. Dado que predecir la recidiva y predecir la progresión son actividades pronósticas, “predecir el pronóstico” a menudo se usará en el presente documento para referirse a cualquiera o a ambos. En estos casos, un “mal pronóstico” generalmente se referirá a una probabilidad aumentada de recidiva, progresión, o ambas.
Tal como se muestra en el ejemplo 3, los CCG individuales pueden predecir el pronóstico bastante bien.
El ejemplo 3 también muestra que los paneles de CCG (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 ó 6 CCG) pueden predecir con precisión el pronóstico. Por tanto, en algunos aspectos, la invención proporciona un método para clasificar el cáncer de próstata que comprende determinar el estado de un panel (es decir, una pluralidad) de genes que comprende una pluralidad de CCG. Por ejemplo, expresión aumentada en un panel de genes puede referirse al hecho de que el nivel de expresión promedio de todos los genes de panel en un paciente particular es mayor que el nivel de expresión promedio de estos genes en pacientes normales (o mayor que algún valor indicador que se ha determinado que representa el nivel de expresión promedio normal). Alternativamente, expresión aumentada en un panel de genes puede referirse a expresión aumentada en al menos un cierto número (por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30 o más) de los genes en el panel en comparación con el nivel de expresión promedio normal.
En algunas realizaciones, los CCG se eligen del grupo que consiste en los genes en los paneles C a G. En algunas realizaciones, el panel comprende al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 o más de los genes en cualquiera de los paneles C a G. En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para predecir el pronóstico que comprende determinar el estado de los CCG en los paneles C a G, en el que un estado anómalo indica un mal pronóstico.
En algunas de estas realizaciones, expresión elevada indica una probabilidad aumentada de recidiva o progresión. Por tanto, en una realización preferida, la invención proporciona un método para predecir el riesgo de recidiva o progresión del cáncer de próstata en un paciente que comprende determinar el estado de un panel de genes, tal como se define en las reivindicaciones, y un estado elevado para los CCG indica una probabilidad aumentada de recidiva o progresión.
Se han evaluado varios paneles de CCG (tabla 2 anteriormente y tablas 3 y 4 a continuación) para determinar su capacidad para predecir el pronóstico en varios cánceres diferentes. Los resultados de estos estudios se describen en los ejemplos 1 a 6 a continuación.
Tabla 3: “Panel C” evaluado en los ejemplos 1 a 4
* Estos genes se usaron como panel de subconjunto de 26 genes (“panel D”) en la rama de validación del experimento descrito en el ejemplo 2.
Tabla 4: “Panel E”
* Estos genes se usaron como panel de subconjunto de 31 genes (“panel F”) en el experimento descrito en el ejemplo 5.
Se ha determinado que la elección de los CCG individuales para un panel a menudo puede ser relativamente arbitraria. Dicho de otro modo, se ha hallado que la mayoría de los CCG son muy buenos sustitutos entre sí. Un modo para evaluar si los CCG particulares servirán bien en los métodos y las composiciones de la invención es evaluando su correlación con la expresión media de los CCG (por ejemplo, todos los CCG conocidos, un conjunto específico de CCG, etc.). Se espera que esos CCG que se correlacionan particularmente bien con la media funcionen bien, por ejemplo, porque estos reducirán el ruido en el ensayo. En la tabla 23 se proporciona una clasificación de CCG seleccionados según su correlación con la expresión de CCG media.
En las firmas de CCG, los CCG particulares sometidos a ensayo a menudo no es tan importante como el número total de CCG. El número de CCG sometidos a ensayo puede variar dependiendo de muchos factores, por ejemplo, restricciones técnicas, consideraciones de costes, la clasificación que esté realizándose, el cáncer que esté sometiéndose a prueba, el nivel deseado de poder predictivo, etc. Aumentar el número de CCG sometidos a ensayo en un panel según la invención es, como cuestión general, ventajoso porque, por ejemplo, un mayor grupo de ARNm que van a someterse a ensayo significa menos “ruido” provocado por valores atípicos y menor oportunidad de que un error de ensayo altere el poder predictivo global de la prueba. Sin embargo, el coste y otras consideraciones limitarán generalmente este número y es deseable hallar el número óptimo de CCG para una firma.
Se ha descubierto que el poder predictivo de una firma de CCG a menudo deja de aumentar significativamente más allá de un cierto número de CCG (véase la figura 1; ejemplo 1). Más específicamente, el número óptimo de CCG en una firma(nO)puede hallarse siempre que sea cierto lo siguiente
(P„+l - Pn)<Co,
donde P es el poder predictivo (es decir, Pn es el poder predictivo de una firma conngenes y Pn+1 es el poder predictivo de una firma conngenes más uno) y Co es alguna constante de optimización. El poder predictivo puede definirse de muchos modos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, el valor de p de la firma. CO puede elegirla el experto basándose en sus restricciones específicas. Por ejemplo, si el coste no es un factor crítico y se desean niveles extremadamente altos de sensibilidad y especificidad, puede establecerse una CO muy baja de manera que sólo se menosprecian aumentos triviales en el poder predictivo. Por otro lado, si el coste es decisivo y son aceptables niveles moderados de sensibilidad y especificidad, puede establecerse una CO más alta de manera que sólo aumentos significativos en el poder predictivo justifican el aumento del número de genes en la firma.
Alternativamente, puede representarse gráficamente un gráfico de poder predictivo en función del número de genes (como en la figura 1) y tomarse la segunda derivada de esta representación gráfica. El punto en el que la segunda derivada disminuye hasta cierto valor predeterminado (CO’) puede ser el número óptimo de genes en la firma.
Los ejemplos 1 y 3 y la figura 1 ilustran la determinación empírica de los números óptimos de CCG en paneles de CCG. Se sometieron a prueba subconjuntos seleccionados aleatoriamente de los 31 CCG enumerados en la tabla 3 como firmas de CCG distintas y se determinó el poder predictivo (es decir, el valor de p) para cada uno. Tal como muestra la figura 1, los valores de p dejaron de mejorar significativamente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15 CCG, lo que indica que un número óptimo de CCG en un panel de pronóstico es de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 15.
Se ha descubierto que los CCG son particularmente predictivos en ciertos cánceres. Por ejemplo, se ha determinado que los paneles de CCG son precisos a la hora de predecir la recidiva en el cáncer de próstata (ejemplos 1 a 5). Además, los CCG pueden determinar el pronóstico en cánceres de vejiga, cerebro, mama y pulmón, tal como se resume en el ejemplo 6 y las tablas 21 y 22 a continuación.
Por tanto, la invención proporciona un método que comprende determinar el estado de un panel de genes que comprende al menos 10 genes elegidos del grupo de genes en uno cualquiera de los paneles C a G. En algunas realizaciones, el panel comprende al menos 15 genes elegidos del grupo de genes en uno cualquiera de los paneles C a G. En algunas realizaciones, el panel comprende la totalidad de los genes en uno cualquiera de los paneles C a G.
Se ha descubierto además que el estado de CCG se añade sinérgicamente a los parámetros clínicos a la hora de pronosticar el cáncer. En el caso de cáncer de próstata, por ejemplo, se ha descubierto que un nivel alto de expresión génica de uno cualquiera de los genes en los paneles C a F está asociado con un riesgo aumentado de recidiva o progresión del cáncer de próstata en pacientes cuya puntuación de nomograma clínico indica un riesgo relativamente bajo de recidiva o progresión. Por tanto, dado que la evaluación de los niveles de expresión de CCG puede detectar un riesgo aumentado no detectado usando los parámetros clínicos solos, la invención proporciona de manera general métodos que combinan evaluar al menos un parámetro clínico con evaluar el estado de al menos diez CCG de uno cualquiera de los paneles C-G.
Tal como muestra el ejemplo 3, incluso los CCG individuales se añaden a los parámetros clínicos a la hora de predecir la recidiva del cáncer. Por tanto, un aspecto de la invención proporciona un método de diagnósticoin vitroque comprende determinar al menos un parámetro clínico para un paciente con cáncer de próstata y determinar el estado de al menos diez CCG de uno cualquiera de los paneles C-G en una muestra obtenida del paciente. Sin embargo, evaluar el estado de múltiples CCG mejora incluso más el poder predictivo (tal como se muestra en el ejemplo 1). Por tanto, en algunas realizaciones, se determina el estado de una pluralidad de CCG (por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o más). En algunas realizaciones, el estado anómalo indica una probabilidad aumentada de recidiva o progresión. A menudo, el parámetro clínico es al menos algo independientemente predictivo de la recidiva o progresión, y la adición del estado de CCG mejora el poder predictivo. Tal como se usa en el presente documento, “parámetro clínico” y “medida clínica” se refieren a características de la enfermedad o del paciente que se aplican normalmente para evaluar el transcurso de la enfermedad y/o predecir el desenlace. Los ejemplos en cáncer generalmente incluyen estadio tumoral, grado tumoral, estado de los ganglios linfáticos, histología, estado de rendimiento, tipo de cirugía, márgenes quirúrgicos, tipo de tratamiento, y edad de aparición. En el cáncer de próstata, los médicos a menudo usan los niveles de PSA en sangre previos a la cirugía, el estadio (definido por el tamaño del tumor y evidencias de metástasis), y la puntuación de Gleason (similar al concepto de grado). Después de la intervención quirúrgica, los parámetros clínicos importantes en el cáncer de próstata incluyen el margen y el estado de los ganglios linfáticos. En el cáncer de mama, los médicos a menudo usan el tamaño de la lesión indicadora en cm, la invasión, el número de ganglios implicados, y el grado.
A menudo, determinados parámetros clínicos se correlacionan con un carácter de enfermedad particular. Por ejemplo, en el cáncer generalmente así como en cánceres específicos, determinados parámetros clínicos se correlacionan con, por ejemplo, la probabilidad de recidiva o metástasis, el pronóstico de la supervivencia durante un determinado periodo de tiempo, la probabilidad de respuesta al tratamiento generalmente o a un tratamiento específico, etc. En el cáncer de próstata, algunos parámetros clínicos son de tal manera que su estado (presencia, ausencia, nivel, etc.) está asociado con la probabilidad aumentada de recidiva. Los ejemplos de tales parámetros asociados a la recidiva (algunos de los cuales, pero no todos, son específicos del cáncer de próstata) incluyen altos niveles de PSA (por ejemplo, mayores de 4 ng/ml), alta puntuación de Gleason, tamaño tumoral grande, evidencia de metástasis, estadio tumoral avanzado, grado nuclear, afectación ganglionar, edad temprana de aparición. Otros tipos de cáncer pueden tener parámetros diferentes correlacionados con la probabilidad de recidiva o progresión, y el estado de CCG, como medida de actividad proliferativa, se añade a estos parámetros para predecir el pronóstico en estos cánceres. Tal como se usa en el presente documento, “parámetro clínico asociado a recidiva” tiene su significado convencional para cada cáncer específico, con lo que los expertos en la técnica están bastante familiarizados. De hecho, los expertos en la técnica están familiarizados con diversos parámetros clínicos asociados a la recidiva más allá de los enumerados en el presente documento.
A menudo, un médico evaluará más de un parámetro clínico en un paciente y realizará una evaluación más completa para los caracteres de enfermedad de interés. El ejemplo 5 muestra cómo puede añadirse el estado de CCG a una agrupación particular de parámetros clínicos usados para determinar el riesgo de recidiva en el cáncer de próstata. Los parámetros clínicos en el ejemplo 5 incluyen variables binarias para la enfermedad confinada en órgano y puntuación de Gleason menor de o igual a 6, y una variable continua para el PSA logarítmico (tabla 14). Este modelo incluye todos los parámetros clínicos incorporados en el nomograma posterior a PR (es decir, nomograma de Kattan-Stephenson) excepto para el año de PR y los dos componentes de la puntuación de Gleason. Por tanto, en algunas realizaciones, se evalúan al menos dos parámetros clínicos (por ejemplo, dos de los parámetros enumerados anteriormente) junto con el nivel de expresión de al menos diez CCG.
Un modo en el que los médicos utilizan parámetros clínicos individuales, pero más a menudo múltiples, es con la ayuda de nomogramas. En el ámbito clínico, los nomogramas son representaciones (a menudo visuales) de una correlación entre uno o más parámetros y uno o más caracteres de paciente o de enfermedad. Un ejemplo de un nomograma clínico prevalente usado para determinar la probabilidad de recidiva de un paciente con cáncer de próstata se describe en Kattanet al.,J. CLIN. ONCOL. (1999) 17:1499-1507, y se actualiza en Stephensonet al.,J. CLIN. ONCOL. (2005) 23:7005-7012 (“nomograma de Kattan-Stephenson”). Este nomograma evalúa un paciente asignando un valor de punto a cada uno de varios parámetros clínicos (año de PR, márgenes quirúrgicos, extensión extracapsular, invasión de vesículas seminales, afectación ganglionar, puntuación primaria de Gleason, puntuación secundaria de Gleason y nivel de PSA preoperatorio), sumando los puntos para un paciente en una puntuación de nomograma, y luego prediciendo la probabilidad del paciente de estar libre de recidiva a intervalos de tiempo variables (hasta 10 años) basándose en esta puntuación de nomograma. Un ejemplo de un nomograma clínico prevalente usado para determinar el pronóstico de la supervivencia de un paciente con cáncer de mama es el índice pronóstico de Nottingham (NPI). Véase, por ejemplo, Galeaet al.,BREAST CANCER RES. & TREAT. (1992) 22:207-19.
Se ha descubierto que determinar el estado de un CCG en una muestra obtenida de un paciente con cáncer de próstata, junto con la puntuación de nomograma de Kattan-Stephenson del paciente, es un mejor factor predisponente de la supervivencia libre de recidiva a los 10 años que la puntuación de nomograma sola. Véanse, por ejemplo, los ejemplos 2 y 5 a continuación. Específicamente, añadir el estado de CCG al nomograma de Kattan-Stephenson detecta pacientes con riesgo significativamente aumentado de recidiva que el nomograma por sí solo no detecta. La tabla 3 anterior proporciona un panel a modo de ejemplo de 31 CCG (panel C) y un panel de subconjuntos de 26 CCG (panel D, mostrado con *) determinados en el ejemplo 2 para mostrar la sinergia predictiva con el nomograma de Kattan-Stephenson en el pronóstico de cáncer de próstata. También se ha descubierto que determinar el estado de un CCG en una muestra obtenida de un paciente con cáncer de mama, junto con la puntuación de NPI del paciente, es un mejor factor predisponente de pronóstico que la puntuación de NPI sola. Véase, por ejemplo, el ejemplo 6 a continuación. Específicamente, añadir el estado de CCG al nomograma de NPI detecta pacientes con riesgo significativamente aumentado de recidiva que el nomograma por sí solo no detecta. Se determinó en el ejemplo 2 que los paneles B, C y D muestran una sinergia predictiva con el nomograma de NPI en el pronóstico de cáncer de mama.
Por tanto, otro aspecto de la invención proporciona un métodoin vitroque comprende determinar una puntuación de nomograma clínico (por ejemplo, puntuación de nomograma de Kattan-Stephenson o de NPI) para un paciente con cáncer de próstata y determinar el estado de al menos diez CCG de uno cualquiera de los paneles C-G en una muestra obtenida del paciente. El ejemplo 3 ilustra la determinación empírica del poder predictivo de CCG individuales y de varios paneles de c Cg de tamaño variable a lo largo del nomograma de Kattan-Stephenson. Se sometieron a prueba subconjuntos seleccionados aleatoriamente de los 31 CCG enumerados en la tabla 3 como firmas de CCG distintas y se determinó el poder predictivo (es decir, el valor de p) para cada uno. Tal como muestra la figura 1, las firmas de CCG de 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25 y 26 genes añaden, cada una, poder predictivo al nomograma. Por tanto, la invención proporciona un método para determinar si un paciente con cáncer de próstata tiene una probabilidad aumentada de recidiva que comprende determinar el estado de un panel de genes que comprende al menos 10, 15, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 o más CCG, en el que un estado elevado (por ejemplo, expresión aumentada) para los CCG indica una probabilidad aumentada de recidiva. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar una puntuación de nomograma clínico del paciente.
A menudo, los nomogramas clínicos para el cáncer se diseñan de manera que un valor particular (por ejemplo, puntuación alta) se correlaciona con un riesgo aumentado de recidiva. Un estado de CCG elevado (por ejemplo, expresión o actividad aumentada) también se correlaciona con un riesgo aumentado. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona un método para determinar si un paciente con cáncer de próstata tiene una probabilidad aumentada de recidiva o progresión que comprende determinar una puntuación de nomograma clínico para el paciente y determinar el estado de al menos diez CCG de uno cualquiera de los paneles C-G en una muestra obtenida del paciente, en el que una puntuación de nomograma alta y/o un estado de CCG elevado indican que el paciente tiene una probabilidad aumentada de recidiva o progresión.
En algunas realizaciones, esta evaluación se realiza antes de la prostatectomía radical (por ejemplo, usando una muestra de biopsia de próstata), mientras que en algunas realizaciones se realiza después (por ejemplo, usando la muestra de próstata resecada). En algunas realizaciones, una muestra de una o más células se obtiene de un paciente con cáncer de próstata antes o después del tratamiento para su análisis según la presente invención. El tratamiento de cáncer de próstata aplicado actualmente en la técnica incluye, por ejemplo, prostatectomía, radioterapia, terapia hormonal (por ejemplo, usando antagonistas de GnRH, agonistas de GnRH, antiandrógenos), quimioterapia, y ultrasonidos enfocados de alta intensidad. En algunas realizaciones, una o más células tumorales de próstata de tejido de cáncer de próstata se obtienen de un paciente con cáncer de próstata durante la biopsia o prostatectomía y se usan para su análisis en el método de la presente invención.
A menudo, los resultados de cualquier análisis según la invención se comunicarán a los médicos, asesores genéticos y/o pacientes (u otras partes interesadas tales como investigadores) en una forma transmisible que puede comunicarse o transmitirse a cualquiera de las partes anteriores. Una forma de este tipo puede variar y puede ser tangible o intangible. Los resultados pueden representarse en declaraciones descriptivas, diagramas, fotografías, esquemas, imágenes o cualquier otra forma visual. Por ejemplo, para explicar los resultados pueden usarse gráficos que muestran el nivel de expresión o de actividad o la información de variación de secuencia para diversos genes.
Los diagramas que muestran tal información para gen(es) diana adicional(es) también son útiles para indicar algunos resultados de prueba. Las declaraciones y formas visuales pueden grabarse en un medio tangible tal como papeles, medios legibles por ordenador tales como discos flexibles, discos compactos, etc., o en un medio intangible, por ejemplo, un medio electrónico en forma de correo electrónico o sitio web en Internet o Intranet. Además, los resultados también pueden grabarse en forma de sonido y transmitirse a través de cualquier medio adecuado, por ejemplo, líneas de cable analógicas o digitales, cables de fibra óptica, etc., a través del teléfono, facsímil, teléfono móvil inalámbrico, teléfono por Internet, y similares.
Por tanto, la información y los datos sobre un resultado de prueba pueden producirse en cualquier parte del mundo y transmitirse a una ubicación diferente. Como un ejemplo ilustrativo, cuando se lleva a cabo un ensayo de nivel de expresión, nivel de actividad o secuenciación (o genotipado) fuera de los Estados Unidos, la información y los datos sobre un resultado de prueba pueden generarse, emitirse en una forma transmisible tal como se describió anteriormente, y luego importarse a los Estados Unidos. Por consiguiente, la presente divulgación también abarca un método para producir una forma transmisible de información sobre al menos uno de (a) nivel de expresión para al menos una muestra de paciente. El método comprende las etapas de (1) determinar (a) anterior según los métodos de la presente invención; y (2) incluir el resultado de la etapa de determinación en una forma transmisible. La forma transmisible es el producto de un método de este tipo.
A menudo se implementarán técnicas para analizar tales datos de expresión, actividad y/o secuencia (de hecho, cualquier dato obtenido según la invención) usando hardware, software o una combinación de los mismos en uno o más sistemas informáticos u otros sistemas de procesamiento capaces de efectuar tal análisis.
La función de análisis basada en ordenador puede implementarse en cualquier lenguaje y/o navegador adecuado. Por ejemplo, puede implementarse con lenguaje C y preferiblemente usando lenguajes de programación de alto nivel orientados a objetos tales como Visual Basic, Small Talk, C++, y similares. La aplicación puede escribirse para adecuarse a entornos tales como el entorno de Microsoft Windows™ incluyendo Windows™ 98, Windows™ 2000, Windows™ NT, y similares. Además, la aplicación también puede escribirse para el entorno de MacIntosh™, SUN™, UNIX o LINUX. Además, las etapas funcionales también pueden implementarse usando un lenguaje de programación universal o independiente de plataforma. Los ejemplos de tales lenguajes de programación de múltiples plataformas incluyen, pero no se limitan a, lenguaje de marcas de hipertexto (HTML), JAVA™, JavaScript™, lenguaje de programación Flash, interfaz de entrada común/lenguaje de consulta estructurado (CGI/SQL), lenguaje práctico de extracción e informe (PERL), AppleScript™ y otros lenguajes de guiones de sistema, lenguaje de programación/lenguaje de consulta estructurado (PL/<s>Q<l>), y similares. Pueden usarse navegadores habilitados para Java™ o JavaScript™ tales como HotJava™, Microsoft™ Explorer™ o Netscape™. Cuando se usan páginas web de contenido activo, pueden incluir miniprogramas(applets)de Java™ o controles de ActiveX™ u otras tecnologías de contenido activo.
La función de análisis también puede incluirse en productos de programa informático y usarse en los sistemas descritos anteriormente u otros sistemas basados en ordenador o en Internet. Por consiguiente, otro aspecto se refiere a un producto de programa informático que comprende un medio utilizable con ordenador que tiene códigos o instrucciones de programa legibles por ordenador incluidos en el mismo para permitir que un procesador lleve a cabo el análisis del estado de genes. Estas instrucciones de programa informático pueden cargarse en un ordenador u otro aparato programable para producir una máquina, de manera que las instrucciones que se ejecutan en el ordenador u otro aparato programable crean medios para implementar las funciones o etapas descritas anteriormente. Estas instrucciones de programa informático también pueden almacenarse en un medio o una memoria legible por ordenador que puede dirigir un ordenador u otro aparato programable a funcionar de una manera particular, de manera que las instrucciones almacenadas en el medio o la memoria legible por ordenador producen un artículo de fabricación que incluye un medio de instrucción que implementa el análisis. Las instrucciones de programa informático también pueden cargarse en un ordenador u otro aparato programable para hacer que se realicen una serie de etapas de operación en el ordenador u otro aparato programable para producir un procedimiento implementado por ordenador de manera que las instrucciones que se ejecutan en el ordenador u otro aparato programable proporcionan etapas para implementar las funciones o etapas descritas anteriormente.
Por tanto, un aspecto proporciona un sistema para determinar si un paciente tiene una probabilidad aumentada de recidiva. En términos generales, el sistema comprende (1) un medio informático para recibir, almacenar y/o recuperar datos del estado de genes de un paciente (por ejemplo, nivel de expresión, nivel de actividad, variantes) y opcionalmente datos de parámetros clínicos (por ejemplo, puntuación de Gleason, puntuación de nomograma); (2) un medio informático para consultar estos datos de paciente; (3) un medio informático para concluir si existe una probabilidad aumentada de recidiva basándose en estos datos de paciente; y (4) un medio informático para emitir/visualizar esta conclusión. En algunos aspectos, este medio para emitir la conclusión puede comprender un medio informático para informar a un profesional sanitario sobre la conclusión.
Un ejemplo de un sistema de este tipo es el sistema [600] informático ilustrado en la figura 6. El sistema [600] informático puede incluir al menos un módulo [630] de entrada para introducir datos de paciente en el sistema [600] informático. El sistema [600] informático puede incluir al menos un módulo [624] de salida para indicar si un paciente tiene una probabilidad aumentada o disminuida de respuesta y/o indicar tratamientos sugeridos determinados por el sistema [600] informático. El sistema [600] informático puede incluir al menos un módulo [606] de memoria en comunicación con el al menos un módulo [630] de entrada y el al menos un módulo [624] de salida.
El al menos un módulo [606] de memoria puede incluir, por ejemplo, un dispositivo [608] de almacenamiento extraíble que puede estar en diversas formas, incluyendo, pero sin limitarse a, un dispositivo de banda magnética, un dispositivo de disco flexible, un dispositivo de VCD, un dispositivo de DVD, un dispositivo de disco óptico, etc. El dispositivo [608] de almacenamiento extraíble puede ser compatible con una unidad [610] de almacenamiento extraíble de manera que puede leer a partir de y/o escribir en la unidad [610] de almacenamiento extraíble. La unidad [610] de almacenamiento extraíble puede incluir un medio de almacenamiento utilizable con ordenador que tiene almacenados en el mismo códigos o instrucciones de programa legibles por ordenador y/o datos legibles por ordenador. Por ejemplo, la unidad [610] de almacenamiento extraíble puede almacenar datos de paciente. En la técnica se conocen bien ejemplos de unidades [610] de almacenamiento extraíbles, incluyendo, pero sin limitarse a, discos flexibles, bandas magnéticas, discos ópticos, y similares. El al menos un módulo [606] de memoria también puede incluir un dispositivo [612] de disco duro que puede usarse para almacenar códigos o instrucciones de programa legibles por ordenador y/o datos legibles por ordenador.
Además, tal como se muestra en la figura 1, el al menos un módulo [606] de memoria puede incluir además una interfaz [614] y una unidad [616] de almacenamiento extraíble que es compatible con la interfaz [614] de manera que pueden transferirse software, códigos o instrucciones legibles por ordenador desde la unidad [616] de almacenamiento extraíble al sistema [600] informático. Los ejemplos de pares de interfaz [614] y unidad [616] de almacenamiento extraíble incluyen, por ejemplo, chips de memoria extraíbles (por ejemplo, EPROM o PROM) y zócalos asociados con los mismos, cartuchos de programa e interfaz de cartucho, y similares. El sistema [600] informático también puede incluir un módulo [618] de memoria secundario tal como memoria de acceso aleatorio (RAM).
El sistema [600] informático puede incluir al menos un módulo [602] de procesador. Debe entenderse que el al menos un módulo [602] de procesador puede consistir en cualquier número de dispositivos. El al menos un módulo [602] de procesador puede incluir un dispositivo de procesamiento de datos, tal como un microprocesador o microcontrolador o una unidad de procesamiento central. El al menos un módulo [602] de procesador puede incluir otro dispositivo lógico tal como un procesador de DMA (acceso directo a memoria), un dispositivo de procesador de comunicación integrada, un dispositivo de VLSI (integración a escala muy grande) personalizado o un dispositivo de ASIC (circuito integrado específico de aplicación). Además, el al menos un módulo [602] de procesador puede incluir cualquier otro tipo de circuitos analógicos o digitales que están diseñados para realizar las funciones de procesamiento descritas en el presente documento.
Tal como se muestra en la figura 6, en el sistema [600] informático, el al menos un módulo [606] de memoria, el al menos un módulo [602] de procesador y el módulo [618] de memoria secundario están todos ellos unidos operativamente entre sí a través de una infraestructura [620] de comunicación, que puede ser un bus de comunicaciones, un tablero de sistema, una barra cruzada, etc. A través de la infraestructura [620] de comunicación, pueden transferirse e intercambiarse códigos o instrucciones del programa informático o datos legibles por ordenador. La interfaz [626] de entrada puede conectar de manera operable el al menos un módulo [626] de entrada a la infraestructura [620] de comunicación. Del mismo modo, la interfaz [622] de salida puede conectar de manera operable el al menos un módulo [624] de salida a la infraestructura [620] de comunicación.
El al menos un módulo [630] de entrada puede incluir, por ejemplo, un teclado, un ratón, una pantalla táctil, un escáner, y otros dispositivos de entrada conocidos en la técnica. El al menos un módulo [624] de salida puede incluir, por ejemplo, una pantalla de visualización, tal como un monitor de ordenador, un monitor de TV, o la pantalla táctil del al menos un módulo [630] de entrada; una impresora; y altavoces. El sistema [600] informático también puede incluir módems, puertos de comunicación, tarjetas de red tales como tarjetas de Ethernet, y dispositivos recién desarrollados para acceder a Intranet o Internet.
El al menos un módulo [606] de memoria puede estar configurado para almacenar datos de paciente introducidos a través del al menos un módulo [630] de entrada y procesados a través del al menos un módulo [602] de procesador. Los datos de paciente pueden incluir el nivel de expresión, el nivel de actividad, el número de copias y/o la información de secuencia paraPTENy/o un CCG. Los datos de paciente también pueden incluir parámetros clínicos relevantes para la enfermedad del paciente. También pueden introducirse al sistema cualesquiera otros datos de paciente que un médico podría encontrar útiles al tomar decisiones/hacer recomendaciones de tratamiento, incluyendo, pero sin limitarse a, la edad, el sexo y la raza/etnia y datos del estilo de vida tales como información sobre la dieta. Otros posibles tipos de datos de paciente incluyen síntomas experimentados en la actualidad o anteriormente, antecedentes de enfermedades del paciente, medicamentos, y procedimientos médicos.
El al menos un módulo [606] de memoria puede incluir un método implementado por ordenador almacenado en el mismo. El al menos un módulo [602] de procesador puede usarse para ejecutar software o códigos de instrucción legibles por ordenador del método implementado por ordenador. El método implementado por ordenador puede estar configurado, basándose en los datos de paciente, para indicar si el paciente tiene una probabilidad aumentada de recidiva, progresión o respuesta a cualquier tratamiento particular, para generar una lista de posibles tratamientos, etc.
El método implementado por ordenador puede estar configurado para identificar si un paciente tiene o no una probabilidad aumentada de recidiva o progresión. Por ejemplo, el método implementado por ordenador puede estar configurado para informar a un médico que un paciente particular tiene una probabilidad aumentada de recidiva. De manera alternativa o adicional, el método implementado por ordenador puede estar configurado para sugerir realmente un transcurso de tratamiento particular basándose en respuestas a/resultados para diversas consultas.
La figura 7 ilustra un método [700] implementado por ordenador que puede implementarse con el sistema [600] informático. El método [700] comienza con una de tres consultas ([710], [711], [712]), o bien de manera secuencial o bien de manera sustancialmente simultánea. Si la respuesta a/resultado para cualquiera de estas consultas es “Sí” [720], el método concluye [730] que el paciente tiene una probabilidad aumentada de recidiva. Si la respuesta a/resultado para todas estas consultas es “No” [721], el método concluye [731] que el paciente no tiene una probabilidad aumentada de recidiva. El método [700] puede proceder entonces con más consultas, hacer una recomendación ([740], [741]) de tratamiento particular, o simplemente terminar.
Cuando las consultas se realizan de manera secuencial, pueden realizarse en el orden sugerido por la figura 7 o en cualquier otro orden. Si se realizan consultas posteriores también puede depender de los resultados/respuestas para consultas previas. En algunas realizaciones del método ilustrado en la figura 7, por ejemplo, el método pregunta en primer lugar sobre parámetros clínicos [712], y si el paciente tiene uno o más parámetros clínicos que identifican que el paciente tiene un riesgo aumentado de recidiva, entonces el método lo concluye [730] u opcionalmente lo confirma consultando el estado de CCG, mientras que si el paciente no tiene tales parámetros clínicos, entonces el método procede a preguntar sobre el estado de c Cg [711]. Opcionalmente, si el estado de CCG no está elevado, entonces el método puede continuar preguntando sobre el estado dePTEN[710]. Tal como se mencionó anteriormente, el orden previo de consultas puede modificarse. En algunas realizaciones, una respuesta de “Sí” a una consulta (por ejemplo, [712]) da lugar a una o más de las consultas restantes para confirmar que el paciente tiene un riesgo aumentado de recidiva.
En algunos aspectos, el método [700] implementado por ordenador es abierto. Dicho de otro modo, la primera etapa [710, 711 y/o 712] aparente en la figura 7 en realidad puede formar parte de un procedimiento más largo y, dentro de este procedimiento más largo, no es necesario que sea la primera etapa/consulta. También pueden añadirse etapas adicionales a los métodos principales comentados anteriormente. Estas etapas adicionales incluyen, pero no se limitan a, informar a un profesional sanitario (o al propio paciente) sobre la conclusión a la que se llega; combinar la conclusión a la que se llega mediante el método [700] ilustrado con otros hechos u otras conclusiones para llegar a cierta conclusión adicional o refinada sobre el diagnóstico, pronóstico, tratamiento, etc., del paciente; hacer una recomendación para el tratamiento (por ejemplo, “el paciente debe/no debe someterse a prostatectomía radical”); consultas adicionales sobre biomarcadores adicionales, parámetros clínicos, u otra información útil del paciente (por ejemplo, edad en el momento del diagnóstico, salud general del paciente, etc.).
Con respecto al método [700] implementado por ordenador anterior, las respuestas a las consultas pueden determinarse mediante el método que establece una búsqueda de la respuesta en los datos de paciente. Por ejemplo, para responder a las consultas [710, 711, 712] respectivas, puede realizarse una búsqueda en los datos de paciente para el estado dePTEN(por ejemplo, cribado de mutaciones o IHC dePTEN),el estado de CCG (por ejemplo, datos de nivel de expresión de CCG), o parámetros clínicos (por ejemplo, puntuación de Gleason, puntuación de nomograma, etc.). Si aún no se ha realizado una comparación de este tipo, el método puede comparar estos datos con cierta referencia con el fin de determinar si el paciente tiene un estado anómalo (por ejemplo, elevado, bajo, negativo). De manera adicional o alternativa, el método puede presentar una o más de las consultas [710, 711, 712] a un usuario (por ejemplo, un médico) del sistema [100] informático. Por ejemplo, las consultas [710, 711, 712] pueden presentarse a través de un módulo [624] de salida. El usuario puede responder entonces “Sí” o “No” a través de un módulo [630] de entrada. El método puede proceder entonces basándose en la respuesta recibida. Del mismo modo, las conclusiones [730, 731] pueden presentarse a un usuario del método implementado por ordenador a través de un módulo [624] de salida.
La práctica de la presente invención también puede emplear métodos de biología, software y sistemas convencionales. Los productos de software informático incluyen normalmente medios legibles por ordenador que tienen instrucciones ejecutables por ordenador para realizar las etapas lógicas del método de la invención. Los medios legibles por ordenador adecuados incluyen disco flexible, CD-ROM/DVD/DVD-ROM, dispositivo de disco duro, memoria flash, ROM/RAM, bandas magnéticas, etc. Se describen métodos de biología computacional básicos en, por ejemplo, Setubalet al.,INTRODUCTION TO COMPUTATIONAL BIOLOGY METHODS (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberget al.(Ed.), COMPUTATIONAL METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (Elsevier, Ámsterdam, 1998); Rashidi y Buehler, BIOINFORMATICS BASICS: APPLICATION IN BIOLOGICAL SCIENCE AND MEDICINE (CRC Press, Londres, 2000); y Ouelette y Bzevanis, BIOINFORMATICS: A PRACTICAL GUIDE FOR ANALYSIS Of GENE AND PROTEINS (Wiley & Sons, Inc., 2a ed., 2001); véase también la patente estadounidense n.° 6.420.108.
La presente invención también puede hacer uso de diversos productos de programa informático y software para una variedad de propósitos, tales como diseño de sondas, gestión de datos, análisis, y operación instrumental. Véanse las patentes estadounidenses n.os 5.593.839; 5.795.716; 5.733.729; 5.974.164; 6.066.454; 6.090.555; 6.185.561; 6.188.783; 6.223.127; 6.229.911 y 6.308.170. Además, se muestran métodos para proporcionar información genética sobre redes tales como Internet en las patentes estadounidenses con n.os de serie 10/197.621 (publicación estadounidense n.° 20030097222); 10/063.559 (publicación estadounidense n.° 20020183936), 10/065.856 (publicación estadounidense n.° 20030100995); 10/065.868 (publicación estadounidense n.° 20030120432); 10/423.403 (publicación estadounidense n.° 20040049354).
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar un transcurso de tratamiento para un paciente con cáncer de próstata tal como se define en la reivindicación 11.
Si un tratamiento es agresivo o no dependerá generalmente del tipo de cáncer, la edad del paciente, etc. Por ejemplo, en el cáncer de mama, la quimioterapia complementaria es un tratamiento agresivo habitual proporcionado para complementar los tratamientos habituales menos agresivos de cirugía y terapia hormonal. Los expertos en la técnica están familiarizados con otros diversos tratamientos agresivos y menos agresivos para cada tipo de cáncer. Los expertos en la técnica entienden bien “tratamiento activo” en el cáncer de próstata y, tal como se usa en el presente documento, tiene el significado convencional en la técnica. En términos generales, tratamiento activo en el cáncer de próstata es cualquier otra cosa distinta de “conducta expectante”. El tratamiento activo aplicado actualmente en la técnica del tratamiento de cáncer de próstata incluye, por ejemplo, prostatectomía, radioterapia, terapia hormonal (por ejemplo, antagonistas de GnRH, agonistas de GnRH, antiandrógenos), quimioterapia, ultrasonidos enfocados de alta intensidad (“HIFU”), etc. Cada opción de tratamiento conlleva ciertos riesgos así como efectos secundarios de gravedad variable, por ejemplo, impotencia, incontinencia urinaria, etc. Por tanto, es habitual que los médicos, dependiendo de la edad y la salud general del varón diagnosticado con cáncer de próstata, recomienden un régimen de “conducta expectante”.
“Conducta expectante”, también denominada “vigilancia activa”, también tiene su significado convencional en la técnica. De manera general, esto significa observación y monitorización regular sin tratamiento invasivo. Conducta expectante se usa algunas veces, por ejemplo, cuando se halla un cáncer de próstata de estadio temprano y de crecimiento lento en un varón más anciano. La conducta expectante también puede sugerirse cuando los riesgos de cirugía, radioterapia o terapia hormonal superan los posibles beneficios. Pueden iniciarse otros tratamientos si se desarrollan síntomas, o si existen signos de que el crecimiento del cáncer está acelerándose (por ejemplo, aumento rápido de PSA, aumento de la puntuación de Gleason en biopsia repetida, etc.).
Aunque los varones que eligen conducta expectante evitan los riesgos de cirugía y radiación, la conducta expectante conlleva sus propios riesgos, por ejemplo, riesgo aumentado de metástasis. Para varones más jóvenes, un ensayo de vigilancia activa puede no significar evitar el tratamiento completamente, sino que puede permitir de manera razonable un retraso de algunos años o más, tiempo durante el cual puede evitarse el impacto del tratamiento activo sobre la calidad de vida. Los datos publicados hasta la fecha sugieren que los varones cuidadosamente seleccionados no se perderán un margen para la cura con este enfoque. Los problemas de salud adicionales que se desarrollan con el paso de la edad durante el periodo de observación también pueden hacer que sea más difícil someterse a cirugía y radioterapia. Por tanto, es clínicamente importante determinar cuidadosamente qué pacientes con cáncer de próstata son buenos candidatos para conducta expectante y qué pacientes deben recibir tratamiento activo.
Por tanto, se divulga un método para tratar a un paciente con cáncer de próstata o proporcionar pautas para el tratamiento de un paciente. En este método, se determina el estado de al menos un CCG (por ejemplo, aquellos en la tabla 1 o en los paneles A a G), al menos un parámetro clínico asociado a recidiva, y/o el estado dePTEN,y (a) se recomienda, inicia o continúa el tratamiento activo si una muestra del paciente tiene un estado elevado para al menos un CCG, el paciente tiene al menos un parámetro clínico asociado a recidiva, y/o un estado dePTENbajo/negativo, o (b) se recomienda/inicia/continúa la conducta expectante si el paciente no tiene ninguno de estado elevado para al menos un CCG, parámetro clínico asociado a recidiva, y estado dePTENbajo/negativo. En ciertos aspectos, el estado de CCG, el/los parámetro(s) clínico(s) y el estado dePTENpueden indicar no sólo qué tratamiento activo se recomienda, sino qué tratamiento activo particular es preferible para el paciente (incluyendo tratamientos relativamente agresivos tales como, por ejemplo, PR y/o terapia complementaria).
En general, la terapia complementaria (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, HIFU, terapia hormonal, etc., después de la prostatectomía o radioterapia) no es el tratamiento habitual en el cáncer de próstata. Sin embargo, según la presente invención, los médicos pueden ser capaces de determinar qué pacientes con cáncer de próstata tienen una enfermedad particularmente agresiva y, por tanto, deben recibir terapia complementaria. Se divulga un método para tratar a un paciente (por ejemplo, un paciente con cáncer de próstata) que comprende determinar el estado de al menos un CCG (por ejemplo, aquellos en la tabla 1 o en los paneles A a G), el estado de al menos un parámetro clínico asociado a recidiva y/o el estado dePTENe iniciar la terapia complementaria después de la prostatectomía o radioterapia si una muestra del paciente tiene un estado elevado para al menos un CCG, el paciente tiene al menos un parámetro clínico asociado a recidiva y/o el paciente tiene un estado dePTENbajo/negativo.
Además, se divulgan composiciones para su uso en los métodos anteriores. Tales composiciones incluyen, pero no se limitan a, sondas de ácido nucleico que se hibridan conPTENo un CCG (o con cualquier ácido nucleico codificado por los mismos o complementario a los mismos); cebadores y pares de cebadores de ácido nucleico adecuados para amplificar la totalidad o una porción dePTENo un CCG o cualquier ácido nucleico codificado por los mismos; anticuerpos que se unen inmunológicamente a un polipéptido codificado porPTENo un CCG; conjuntos de sondas que comprenden una pluralidad de dichas sondas de ácido nucleico, cebadores de ácido nucleico, anticuerpos y/o polipéptidos; micromatrices que comprenden cualesquiera de éstos; kits que comprenden cualesquiera de éstos; etc.
La divulgación proporciona una sonda que comprende un oligonucleótido aislado capaz de hibridarse selectivamente conPTENo al menos uno de los genes en la tabla 1 o en los paneles A a G. Los términos “sonda” y “oligonucleótido” (también “oligo”), cuando se usan en el contexto de ácidos nucleicos, se refieren indistintamente a una secuencia o un fragmento de ácido nucleico relativamente corto. La divulgación también proporciona cebadores útiles en los métodos de la invención. En las condiciones adecuadas y con los reactivos acompañantes adecuados, los “cebadores” son sondas capaces de amplificar selectivamente un ácido nucleico diana (por ejemplo, un gen diana). En el contexto de ácidos nucleicos, “sonda” se usa en el presente documento para abarcar “cebador” puesto que los cebadores generalmente también pueden servir como sondas.
La sonda puede tener generalmente cualquier longitud/tamaño adecuado. En algunos aspectos, la sonda tiene una longitud de aproximadamente 8 a 200, de 15 a 150, de 15 a 100, de 15 a 75, de 15 a 60, o de 20 a 55 bases de longitud. Pueden marcarse con marcadores detectables con cualquier marcador de detección adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, isótopos radiactivos, fluoróforos, biotina, enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina), sustratos enzimáticos, ligandos y anticuerpos, etc. Véanse Jablonskiet al.,N<u>C<l>EIC ACIDS RES. (1986) 14:6115-6128; Nguyenet al.,BIOTECHNIQUES (1992) 13:116-123; Rigbyet al.,J. MOL. BIOL. (1977) 113:237-251. De hecho, las sondas pueden modificarse de cualquier manera convencional para diversas aplicaciones de biología molecular. Las técnicas para producir y usar tales sondas oligonucleotídicas son convencionales en la técnica.
Las sondas pueden usarse en las técnicas de hibridación/amplificación/detección comentadas anteriormente. Por tanto, algunos aspectos comprenden conjuntos de sondas adecuados para su uso en una micromatriz para detectar, amplificar y/o cuantificarPTENy/o una pluralidad de CCG. En algunos aspectos, los conjuntos de sondas tienen una cierta proporción de sus sondas dirigidas a los CCG, por ejemplo, un conjunto de sondas que consiste en el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de sondas específicas de los CCG. En algunos aspectos, el conjunto de sondas comprende sondas dirigidas a al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700 u 800 o más, o la totalidad, de los genes en la tabla 1 o en los paneles A a G. Tales conjuntos de sondas pueden incorporarse en matrices de alta densidad que comprenden 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000 ó 1.000.000 o más de sondas diferentes. En otros aspectos, los conjuntos de sondas comprenden cebadores (por ejemplo, pares de cebadores) para amplificar ácidos nucleicos que comprenden al menos una porción dePTENo de uno o más de los CCG en la tabla 1 o en los paneles A a G.
En otro aspecto, se proporciona un kit para poner en práctica el pronóstico de la presente invención. El kit puede incluir un portador para los diversos componentes del kit. El portador puede ser un recipiente o soporte, en forma de, por ejemplo, bolsa, caja, tubo, rejilla, y opcionalmente está compartimentalizado. El portador puede definir un confinamiento cerrado con propósitos de seguridad durante el envío y el almacenamiento. El kit incluye diversos componentes útiles para determinar el estado de uno o más CCG y uno o más marcadores de genes de mantenimiento, usando las técnicas de detección comentadas anteriormente. Por ejemplo, el kit puede incluir oligonucleótidos que se hibridan específicamente bajo alta rigurosidad con ARNm o ADNc de los genes en la tabla 1 o en los paneles A a G. Tales oligonucleótidos pueden usarse como cebadores de PCR en reacciones de RT-PCR, o como sondas de hibridación. En algunos aspectos, el kit comprende reactivos (por ejemplo, sondas, cebadores y/o anticuerpos) para determinar el nivel de expresión de un panel de genes, en el que dicho panel comprende al menos el 25 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 75 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 99 % o el 100 % de los CCG (por ejemplo, los CCG en la tabla 1 o en cualquiera de los paneles A a G). En algunos aspectos, el kit consiste en reactivos (por ejemplo, sondas, cebadores y/o anticuerpos) para determinar el nivel de expresión de no más de 2500 genes, en el que al menos 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 250 o más de estos genes son CCG (por ejemplo, los CCG en la tabla 1 o en cualquiera de los paneles A a G).
Los oligonucleótidos en el kit de detección pueden marcarse con cualquier marcador de detección adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, isótopos radiactivos, fluoróforos, biotina, enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina), sustratos enzimáticos, ligandos y anticuerpos, etc. Véanse Jablonskiet al.,Nucleic Acids Res., 14:6115-6128 (1986); Nguyenet al.,Biotechniques, 13:116-123 (1992); Rigbyet al.,J. Mol. Biol., 113:237-251 (1977). Alternativamente, los oligonucleótidos incluidos en el kit no están marcados, y en su lugar, se proporcionan uno o más marcadores en el kit de modo que los usuarios pueden marcar los oligonucleótidos en el momento de uso.
En otro aspecto, el kit de detección contiene uno o más anticuerpos selectivamente inmunorreactivos con una o más proteínas codificadas porPTENo uno o más CCG u opcionalmente cualquier marcador adicional. Los ejemplos incluyen anticuerpos que se unen inmunológicamente aPTENo a una proteína codificada por un gen en la tabla 1 o en los paneles A a G. Los métodos para producir y usar tales anticuerpos se han descrito anteriormente con detalle. En el kit de detección también pueden incluirse otros diversos componentes útiles en las técnicas de detección. Los ejemplos de tales componentes incluyen, pero no se limitan a, polimerasa Taq, desoxirribonucleótidos, didesoxirribonucleótidos, otros cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia de ADN diana, ARNasa A, y similares. Además, el kit de detección incluye preferiblemente instrucciones para usar el kit para poner en práctica el método de pronóstico de la presente invención usando muestras humanas.
EJEMPLO 1
Se sometió a prueba la siguiente firma de genes del ciclo celular (CCG) para predecir el tiempo hasta la recidiva química después de la prostatectomía radical.
La expresión de ARNm media para los 31 CCG anteriores se sometió a prueba en 440 muestras FFPE de tumores de próstata usando un modelo de riesgos proporcionales de Cox en Splus 7.1 (Insightful, Inc., Seattle WA). El valor de p de la prueba de razón de probabilidades fue de 3,98x10-5
La media de la expresión de CCG es robusta al error de medición y a la variación individual entre genes. Con el fin de determinar el número óptimo de genes del ciclo celular para la firma, se sometió a prueba el poder predictivo de la media para conjuntos seleccionados aleatoriamente de desde 1 hasta 30 de los CCG enumerados anteriormente. Esta simulación demostró que existe un número umbral de CCG en un panel que proporciona un poder predictivo significativamente mejorado.
EJEMPLO 2
En un análisis univariante, se encontró que un conjunto de 31 CCG (tabla 3) era un factor predisponente significativo de la recidiva bioquímica (valor de p = 1,8x10-9) después de PR en pacientes con cáncer de próstata. Esta firma se evaluó adicionalmente para determinar si se añadía a un nomograma clínico establecido para la recidiva del cáncer de próstata (el nomograma de Kattan-Stephenson). En resumen, el nomograma fue un factor predisponente altamente significativo de recidiva (valor de p de 1,6x10-10) y, después de ajustar para el nomograma, la firma de CCG fue un factor predisponente significativo de recidiva bioquímica (valor de p de 4,8x10-5, tabla 6).
Pacientes y métodos
Se realizó un seguimiento de ochocientos cuatro pacientes sometidos a PR consecutivos durante una mediana de 9,5 años. Las características de los pacientes y los desenlaces del tratamiento de toda la cohorte se han notificado anteriormente (Swansonet al.,U<r>O<l>. ONCOL. (2007) 25:110-114). Se disponía de portaobjetos y/o bloques de tejido de la evaluación patológica final con suficiente tejido para el análisis de 430 pacientes. La cohorte se dividió aleatoriamente en 212 pacientes utilizados para un conjunto entrenamiento y 199 muestras de pacientes como conjunto de validación.
Expresión génica (métodos estadísticos): la asociación entre la recidiva bioquímica y la expresión de CCG se evaluó usando modelos de RP de Cox para el tiempo hasta la recidiva. Todos los valores de p notificados en este estudio se derivaron de una prueba de razón de probabilidades que comparaba el modelo nulo con el modelo que contenía la variable de prueba. Se seleccionó aleatoriamente un conjunto de 31 CCG (tabla 3, véase anteriormente). Los ensayos se usaron para generar datos de expresión de 212 pacientes en el conjunto de entrenamiento. Todos los datos de expresión se generaron por triplicado. Los datos de expresión se combinaron en una firma calculando el nivel de expresión medio para 26 CCG. La asociación entre la recidiva bioquímica y la expresión de CCG se evaluó usando modelos de RP de Cox para el tiempo hasta la recidiva.
Preparación de las muestras y diseño del estudio: se aisló ARN de cortes FFPE de tumores derivados de 411 pacientes con cáncer de próstata tratados con PR. Se usaron cortes tumorales representativos de 10 |im de grosor para aislar el ARN. Cuando fue necesario, se usó una macro o microdisección de la muestra guiada por un patólogo para enriquecer el tejido tumoral antes del aislamiento del ARN. Ninguna de las muestras de la cohorte de validación se sometió a microdisección. Antes de cualquier análisis, la cohorte se dividió en 212 pacientes para la caracterización inicial de la firma (“conjunto de entrenamiento”) y 199 pacientes para la validación. Las características clínicas de la cohorte de entrenamiento y validación se enumeran en la tabla 5.
Tabla 5
Resultados
La firma de expresión de CCG (tabla 3, véase anteriormente) fue predictiva de la recidiva de la enfermedad en un análisis univariante (valor de p = 1,8x10-9, tabla 6). La distribución de la puntuación de firma estaba sesgada hacia valores más altos (menor expresión). El valor de la mediana de la puntuación de firma se usó para dividir la cohorte de entrenamiento en dos grupos que contenían muestras con expresión de CCG alta o baja. En la figura 2 se muestra la supervivencia frente al tiempo para ambos grupos.
También se evaluó el poder predictivo de la firma de CCG después de tener en cuenta las variables clínicas que se incluyen normalmente en un nomograma posquirúrgico (el nomograma de Kattan-Stephenson). El nomograma fue un factor predisponente altamente significativo de la recidiva (valor de p de 1,6x10-10). Después de ajustar para el nomograma, la firma de CCG fue un factor predisponente significativo de la recidiva bioquímica (figura 3) en la cohorte de descubrimiento (valor de p de 0,03) y en la cohorte de validación clínica (valor de p de 4,8x10-5).
Tabla 6
* Media de la expresión de genes del ciclo celular con imputación de valores faltantes, prueba de razón de probabilidades para el modelo de riesgos proporcionales de Cox.
Para ayudar a entender la interacción entre el nomograma y la firma de expresión de CCG, se generó un diagrama de dispersión que comparaba estos factores predisponentes (figura 4) (las estrellas de color gris claro representan pacientes cuyo cáncer recidivó, mientras que las estrellas de color negro representan pacientes cuyo cáncer no recidivó). El análisis del diagrama de dispersión mediante medias de KM dividió las muestras en tres agrupaciones basándose únicamente en la puntuación de nomograma. Posteriormente, se descubrió que las agrupaciones se basaban en parámetros clínicos bien entendidos. Los pacientes en la agrupación de puntuación más baja (116/117) presentaban una enfermedad confinada en órgano. Los pacientes en la agrupación de puntuación media (48/60) tenían al menos un parámetro posquirúrgico que se sabe que está asociado con un mal desenlace (es decir, enfermedad a través de la cápsula, ganglios linfáticos positivos para la enfermedad y/o vesículas seminales positivas para la enfermedad) y un PSA prequirúrgico bajo (<10 ng/ml). Los pacientes en la agrupación de puntuación más alta tenían al menos un parámetro posquirúrgico desfavorable y un PSA prequirúrgico alto. A continuación, los pacientes en las agrupaciones de puntuaciones baja y media se dividieron por la media de la puntuación de CCG. Los desenlaces para los pacientes en la agrupación de puntuación más alta se predicen adecuadamente mediante el nomograma y, por tanto, no se dividieron adicionalmente. Como resultado, el diagrama de dispersión define cinco grupos de pacientes con tasas de recidiva de la enfermedad del 2 %, del 40 % (para dos grupos), del 65 % y del 80 % (tabla 7). En la figura 5 se muestra la tasa de recidiva de los cinco grupos frente al tiempo.
Tabla 7
El diagrama de dispersión mostrado en la figura 4 sugiere que existe una interacción no lineal entre la firma de CCG y el nomograma posquirúrgico. Es decir, la firma de CCG es un mejor factor predisponente en pacientes con puntuaciones de nomograma bajas. Por tanto, el estudio buscó evidencias estadísticas de una interacción entre estas variables en un modelo multivariante para predecir la recidiva de la enfermedad (tabla 8). Hubo evidencias significativas de una interacción favorable tanto en los estudios de entrenamiento como en los de validación. La inclusión del término de interacción en el modelo mejoró drásticamente la significación pronóstica de la firma de CCG después de ajustar para el nomograma (valores de p de 0,0015 en la cohorte de entrenamiento y de 1,2x10-8 en la cohorte de validación).
Tabla 8
EJEMPLO 3
El siguiente estudio tenía como objetivo determinar el número óptimo de CCG que debían incluirse en la firma. Tal como se mencionó anteriormente, los niveles de expresión de CCG están correlacionados entre sí, por lo que era posible que la medición de un pequeño número de genes fuera suficiente para predecir el desenlace de la enfermedad. De hecho, los CCG individuales del conjunto de 31 genes de la tabla 3 (panel C) se añaden significativamente al nomograma de Kattan-Stephenson, tal como se muestra en la tabla 9 a continuación (después de ajustar para el nomograma y un término de interacción entre el nomograma y la expresión de CCG):
Tabla 9
* Valor de p para la prueba de razón de probabilidades del modelo de RP de Cox completo (puntuación de nomograma posterior a PR expresión de ciclo celular nomograma:ciclo celular) frente a reducido (puntuación de nomograma posterior a PR sola) del tiempo hasta la recidiva.
Para evaluar el rendimiento de subconjuntos más pequeños del conjunto de CCG más grande (es decir, paneles de CCG más pequeños), el estudio también comparó lo bien que la firma predice el desenlace en función del número de CCG incluidos en la firma (figura 1). El tiempo hasta la recidiva química después de la cirugía de próstata se regresionó sobre la media de CCG ajustada por la puntuación de nomograma posterior a PR. Los datos consisten en ensayos de TLDA expresados como deltaCT para 199 muestras FFPE de tumores de próstata y 26 CCG y se analizaron mediante un modelo de RP de Cox multivariante. Los valores de p corresponden a la prueba de razón de probabilidades del modelo completo (nomograma media del ciclo celular, incluida la interacción) frente al modelo reducido (sólo nomograma). Tal como se muestra en la tabla 10 a continuación y en la figura 1, las firmas de CCG pequeñas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 CCG, etc.) se añaden significativamente al nomograma de Kattan-Stephenson:
Tabla 10
* Para 1000 subconjuntos extraídos aleatoriamente, de tamaño 1 a 6, de genes del ciclo celular.
EJEMPLO 4
El objetivo de este experimento fue evaluar la asociación entre las mutaciones dePTENy la recidiva bioquímica en pacientes con cáncer de próstata después de la prostatectomía radical. Se encontró que las mutaciones somáticas dePTENestaban significativamente asociadas con la recidiva y, lo que es más importante, añadían información pronóstica más allá del nomograma clínico establecido para la recidiva del cáncer de próstata (el nomograma de Kattan-Stephenson) y la puntuación de firma de CCG (descrita en los ejemplos 1 y 2, véanse anteriormente).
Pacientes y métodos
Se realizó un seguimiento de ochocientos cuatro pacientes sometidos a PR consecutivos durante una mediana de 9,5 años. Las características de los pacientes y los desenlaces del tratamiento de toda la cohorte se han notificado anteriormente (Swansonet al.,UrOl . ONCOL. (2007) 25:110-114). Se disponía de portaobjetos y/o bloques de tejido de la evaluación patológica final con suficiente tejido para el análisis de 430 pacientes. De ellos, se seleccionaron 191 para el cribado de mutaciones dePTENen función de la cantidad de tumor disponible.
Se aisló ADN genómico de las muestras FFPE de tumores para el cribado de mutaciones dePTENusando el kit de tejido FFPE para ADN QIAamp (Qiagen, Valencia, CA) según el protocolo del kit. Los portaobjetos FFPE se tiñeron en primer lugar con hematoxilina y eosina y se examinaron por un patólogo para identificar la región tumoral. Después de la desparafinización, se recortó el tejido tumoral de los portaobjetos con una cuchilla. En algunas muestras, la disección se facilitó mediante microscopía de captura láser (LCM), debido a la dispersión de las células tumorales.
Las mutaciones se detectaron diseñando cebadores de secuenciación para interrogar la secuencia genómica dePTEN.Los cebadores contenían colas M13 directas e inversas para facilitar la secuenciación. Después de la amplificación, la secuencia de ADN se determinó en un equipo Mega BASE 4500 (GE Healthcare) usando la química de colorante-cebador tal como se describe en Franket al.,J. CLIN. ONCOL. (2002) 20:1480-1490. Debido a las dificultades técnicas asociadas con la secuenciación del ADN derivado de material FFPE, cada mutación se detectó mediante al menos dos reacciones de amplificación y secuenciación independientes.
Métodos estadísticos: a menos que se especifique lo contrario, la asociación entre la recidiva bioquímica y las mutaciones dePTENse evaluó usando modelos de RP de Cox para el tiempo hasta la recidiva. Los valores de p resultantes se derivaron de una prueba de razón de probabilidades que comparaba el modelo nulo con el modelo que contenía la variable de prueba. En este ejemplo (ejemplo 4), la firma de CCG se derivó de 26 CCG (panel D de la tabla 2, véase anteriormente). Todos los datos de expresión se generaron por triplicado. Los datos de expresión se combinaron en una firma calculando el nivel de expresión medio para 26 CCG. Los datos clínicos fueron las variables incluidas en el nomograma de Kattan-Stephenson.
Resultados
Se encontraron mutaciones dePTENen 13 individuos (13/191). En este subconjunto de 191 pacientes,PTENfue un factor predisponente significativo de recidiva bioquímica (valor de p = 0,031). La tasa de recidiva en portadores de mutaciones fue del 69 % (9/13) en comparación con el 36 % (64/178) en pacientes sin mutaciones. La diferencia en la tasa de recidiva también es significativa usando una prueba exacta de Fisher (valor de p = 0,034). En el subconjunto de pacientes con datos de parámetros clínicos, puntuación de firma de CCG y mutaciones dePTEN,el estado dePTENfue un factor predisponente significativo de recidiva bioquímica después de ajustar tanto para los parámetros clínicos como para la firma de CCG (valor de p de 0,024). Finalmente, la combinación de la mutación dePTENcon la firma de CCG fue un mejor factor predisponente del desenlace después de ajustar para los parámetros clínicos que el uso de la firma de CCG después de ajustar para los parámetros clínicos (valor de p = 0,0002 para la combinación en comparación con 0,0028 para CCG solamente). Estos resultados muestran que las mutaciones dePTENproporcionan información sobre la probabilidad de recidiva que no está correlacionada con los parámetros clínicos ni con la firma de CCG, y que el uso de los tres parámetros para evaluar el riesgo de recidiva proporciona una estimación más precisa de la probabilidad de recidiva de lo que era posible anteriormente.
EJEMPLO 5
Este ejemplo describe estudios adicionales para validar y refinar las firmas de CCG.
Pacientes y métodos
Se realizó un seguimiento de ochocientos cuatro pacientes sometidos a prostatectomía radical consecutivos durante una mediana de 9,5 años. La mediana de edad fue de 67 años. El estadio clínico fue T1 34 %, T266 % y T3 <1 %. La mediana de PSA preoperatorio fue de 6,6 ng/ml, con un 72 % < 10 ng/ml y un 28 % > 10 ng/ml. Se entintaron las muestras y se registraron los parámetros clínicos en cuanto a margen del cuello vesical o de la uretra positivo, invasión de la cápsula, extensión a través de la cápsula, márgenes positivos y afectación de las vesículas seminales. La recidiva bioquímica se definió como un PSA >0,3 ng/ml. Para este estudio se tenía acceso a datos clínicos de 690 pacientes. Se disponía de portaobjetos y/o bloques de tejido de la evaluación patológica final con suficiente tejido para el análisis de 442 pacientes. La cohorte se dividió en 195 pacientes para una cohorte de entrenamiento y 247 pacientes para la validación.
Selección de genes
Se realizaron ensayos de 126 CCG y 47 genes HK (de mantenimiento) contra 96 muestras FFPE de tumores de próstata anónimas obtenidas comercialmente, sin desenlaces ni otros datos clínicos. La hipótesis de trabajo era que los ensayos medirían con distintos grados de precisión el mismo fenómeno subyacente (proliferación del ciclo celular dentro del tumor para los CCG y concentración de la muestra para los genes h K). Los ensayos se clasificaron según el coeficiente de correlación de Pearson entre el gen individual y la media de todos los genes candidatos, que es la mejor estimación disponible de la actividad biológica. Los resultados de la correlación de cada uno de los 126 CCG con la media se presentan en la tabla 23. Sin incluir los CCG con una expresión promedio baja, o los ensayos que produjeron fallos en las muestras, aproximadamente la mitad de los CCG tuvieron correlaciones inferiores a 0,58, y una cuarta parte de los genes HK tuvieron correlaciones inferiores a 0,95. Se interpretó que estos ensayos no reflejaban el fenómeno subyacente y se eliminaron, dejando un subconjunto de 56 c Cg (panel G) y 36 genes HK candidatos (tablas 11 y 12). Se volvieron a calcular los coeficientes de correlación en este subconjunto, y se realizó la selección final a partir de la lista clasificada.
Tabla 11: Lista completa de CCG evaluados (“Panel G”)
Tabla 12: Lista de 15 genes de mantenimiento (HK)
Expresión génica
Se extrajo ARN total de cortes FFPE de tumores representativos de 5 |im de grosor. Las muestras se desparafinizaron usando un baño de xileno y posteriormente se hidrataron en series graduales de baños de etanol. Después de eso, la región tumoral se diseccionó del portaobjetos con una cuchilla siguiendo las instrucciones del patólogo. Alternativamente, la región tumoral se diseccionó directamente en un tubo Eppendorf y se eliminó la parafina usando xileno y se lavó con etanol. Después, las muestras se trataron durante la noche con digestión con proteinasa K a 55 °C. El ARN total se extrajo usando RNeasy FFPE o miRNeasy (Qiagen) tal como describe el fabricante (con la única excepción de la digestión prolongada con proteinasa K descrita anteriormente). El ARN total aislado se trató con ADNasa I (Sigma) antes de la síntesis de ADNc. Posteriormente, se empleó el kit de archivo de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems) para convertir el ARN total en ADNc monocatenario, tal como describe el fabricante. Se necesitó un mínimo de 200 ng de ARN para la reacción de RT.
Antes de medir los niveles de expresión, el ADNc se amplificó previamente con una reacción conjunta que contenía ensayos TaqMan. Las condiciones de la reacción de amplificación previa fueron: 14 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 4 minutos. El primer ciclo se modificó para incluir una incubación de 10 minutos a 95 °C. La reacción de amplificación se diluyó 1:20 usando el tampón TE 1X antes de su carga en las matrices de baja densidad TaqMan™ (TLDA, Applied Biosystems) para medir la expresión génica.
Puntuación de CCG
La puntuación de CCG se calcula a partir de la expresión de ARN de 31 CCG (panel F) normalizada por 15 genes de mantenimiento (HK). Los números relativos de CCG (31) y genes HK (15) se optimizaron con el fin de minimizar la varianza de la puntuación de CCG. La puntuación de c Cg es la media no ponderada de los valores CT para la expresión de CCG, normalizada por la media no ponderada de los genes h K, de modo que los valores más altos indican una mayor expresión. Una unidad equivale a un cambio de dos veces en la expresión. Los valores faltantes se imputaron usando la expresión media para cada gen determinada en el conjunto de entrenamiento usando únicamente muestras de buena calidad. Las puntuaciones de CCG se centraron en el valor medio, también determinado en el conjunto de entrenamiento.
Se realizó un experimento de dilución con cuatro de las muestras de próstata comerciales para estimar el error de medición de la puntuación de CCG (e.e. = 0,10) y el efecto de los valores faltantes. Se halló que la puntuación de CCG permanecía estable a medida que disminuía la concentración hasta el punto de 5 fallos del total de 31 CCG. Basándose en este resultado, a las muestras con más de 4 valores faltantes no se les asignó una puntuación de CCG.
El umbral de puntuación de CCG para determinar un riesgo bajo se basó en la puntuación de CCG más baja de recidivas en el conjunto de entrenamiento. Luego, el umbral se ajustó a la baja en 1 desviación estándar con el fin de optimizar el valor predictivo negativo de la prueba.
Modelo de riesgo clínico
Se usó un modelo de riesgos proporcionales de Cox para resumir los datos de parámetros clínicos disponibles y estimar el riesgo clínico previo de recidiva bioquímica para cada paciente. El conjunto de datos consistió en 195 casos del conjunto de entrenamiento y otros 248 casos con información de parámetros clínicos pero muestra insuficiente para medir la expresión de ARN. Se realizaron pruebas univariantes de los parámetros clínicos que se sabe que están asociados con el desenlace (véase la tabla 13 a continuación). Los parámetros no significativos se excluyeron del modelo. Se creó una variable compuesta para la enfermedad confinada en órgano, con invasión definida como márgenes quirúrgicos, extensión extracapsular o afectación de cualquiera de vesículas seminales, márgenes del cuello vesical/uretra o ganglios linfáticos. La variable compuesta para la enfermedad confinada en órgano resultó más significativa en el modelo que cualquiera de sus cinco componentes, algunos de los cuales estaban correlacionados unos con otros o no eran prevalentes. El ajuste del modelo se realizó utilizando los criterios AIC para las covariables posoperatorias.
Tabla 13: Análisis univariante de los parámetros clínicos y asociación con la recidiva bioquímica
El modelo final (es decir, el nomograma) tiene variables binarias para la enfermedad confinada en órgano y la puntuación de Gleason menor que o igual a 6, y una variable continua para el PSA logarítmico (tabla 14). Este modelo incluye todos los parámetros clínicos incorporados en el nomograma posterior a PR (es decir, el nomograma de Kattan-Stephenson), excepto el año de PR y los dos componentes de la puntuación de Gleason. La distribución del riesgo clínico previo muestra tres ganglios distintos (figura 8). Se usó la agrupación de ^-medias con 3 centros para establecer el umbral de la agrupación de bajo riesgo, que comprende aproximadamente el 50 % de la muestra.
Tabla 14: Modelo clínico
Análisis estadístico
Los parámetros clínicos se compararon entre los conjuntos de entrenamiento y de validación usando la prueba de la t de Student para los parámetros continuos y la prueba exacta de Fisher para los parámetros categóricos. El riesgo clínico previo de recidiva bioquímica de los pacientes después de la cirugía se estimó mediante una puntuación de nomograma posterior a PR que resumía 7 covariables. Se usó la agrupación de ^-medias de la puntuación de nomograma para clasificar a los pacientes como de bajo o alto riesgo clínico previo. Los datos de expresión se expresaron como CT (el ciclo de PCR en el que la intensidad de fluorescencia supera un umbral predeterminado) de cada CCG normalizado por la media de los 15 genes de mantenimiento (tabla 12 anterior).
Las muestras de mala calidad se excluyeron del análisis para eliminar las muestras de mala calidad o las lecturas dudosas sin comprometer la integridad de la firma al excluir inadvertidamente muestras con baja expresión de CCG. Por consiguiente, los umbrales de limpieza o filtrado de los datos se establecieron de manera conservadora. Los niveles medios de expresión de los genes HK de cada muestra, que eran superiores a los de los CCG, se usaron para identificar las muestras de mala calidad. Las métricas técnicas de la eficiencia de amplificación y las desviaciones estándar excesivamente altas de las réplicas se usaron para identificar mediciones de CT poco fiables. No se permitieron fallos de genes HK, ni más de 1 fallo de 3 réplicas para los CCG.
La asociación entre la recidiva bioquímica y la expresión de CCG después de ajustar para el riesgo clínico predicho por los parámetros clínicos se evaluó usando un modelo de riesgos proporcionales de Cox para el tiempo hasta la recidiva. La suposición de ausencia de dependencia temporal de los riesgos proporcionales se sometió a prueba para el modelo completo de la firma de<c>C<g>más la puntuación binaria de parámetros clínicos con un término de interacción, y para la firma de CCG sólo en los subconjuntos de riesgo clínico. No fue significativo ni en el entrenamiento ni en la validación, lo que indica que no hay evidencias de dependencia temporal. Todos los valores de p notificados proceden de una prueba de razón de probabilidades que compara el modelo reducido o nulo con el modelo que contiene la variable de prueba. Los diagramas de Kaplan-Meier se usan para mostrar las probabilidades de supervivencia estimadas para subconjuntos de pacientes; sin embargo, los valores de p proceden de la prueba de razón de probabilidades de Cox para los valores continuos de la variable. Todos los análisis estadísticos se realizaron en S+ versión 8.1.1 para Linux (TIBCO Spotfire) o R 2.9.0 (http://www.r-project.org).
Resultados
Se aisló ARN de cortes FFPE de tumores derivados de 442 pacientes con cáncer de próstata tratados con PR. La cohorte se dividió en 195 pacientes para la caracterización inicial de la firma (“conjunto de entrenamiento”) y 247 pacientes para la validación. Los parámetros clínicos de la cohorte de entrenamiento y de validación se enumeran en la tabla 15. No hubo diferencias significativas después de ajustar para comparaciones múltiples.
Tabla 15: Parámetros clínicos de las cohortes de pacientes de entrenamiento y de validación
Para analizar la firma de CCG para este estudio, se sometieron a prueba 126 CCG en ARN derivado de 96 tumores de próstata (tabla 11). Las muestras tumorales eran anónimas y no estaban asociadas con datos clínicos. De este conjunto de genes, se seleccionaron 31 genes (panel F) para su inclusión en la presente firma (tabla 16). Los genes se seleccionaron en función de su rendimiento técnico y de lo bien que se correlacionaba cada gen con el nivel de expresión medio de todo el conjunto de CCG en las 96 muestras anónimas.
Tabla 16: Firma de CCG del conjunto de entrenamiento (panel F)
Para evaluar la utilidad pronóstica de la firma de CCG, se generaron datos de expresión en 195 pacientes en el conjunto de entrenamiento. Puesto que los niveles de expresión génica individuales estaban correlacionados, se combinaron en una puntuación de firma calculando la expresión media para el conjunto completo de 31 genes (panel F), normalizada por 15 genes de mantenimiento (tabla 12). La distribución de la puntuación de CCG se centró en cero, y cada unidad de puntuación corresponde a un cambio de 2 veces en el nivel de expresión. Las muestras de mala calidad se identificaron observando una baja expresión de los genes de mantenimiento o un número inaceptable de fallos de CCG, y se excluyeron del análisis. Después de aplicar las reglas de exclusión, quedaban 140 muestras disponibles para el análisis. La asociación entre la recidiva bioquímica y la expresión de CCG se evaluó usando modelos de RP de Cox para el tiempo hasta la recidiva. Un valor alto de expresión de CCG fue predictivo de recidiva de la enfermedad en un análisis univariante (valor de p = 0,01, tabla 17).
A continuación, se evaluó la utilidad pronóstica de la firma de CCG después de tener en cuenta los parámetros clínicos que se sabe que están asociados con la recidiva después de la PR. Para tener en cuenta las medidas clínicas en el presente análisis, se creó un modelo/nomograma que incluía el PSA preoperatorio, la puntuación de Gleason y evidencias de enfermedad fuera de la próstata (es decir, cualquiera de extensión extracapsular o patología posquirúrgica positiva en ganglios linfáticos, márgenes, cuello vesical, margen de la uretra o vesículas seminales). El modelo se optimizó en 443 pacientes (tablas 13 y 14), incluyendo todos los pacientes de los que se tenían datos clínicos pero que no estaban en el conjunto de validación, y fue un factor predisponente altamente significativo de recidiva en la cohorte de entrenamiento (valor de p = 2,5x10-11). La distribución de las puntuaciones del modelo clínico contenía varios modos (figura 8), que separaban los grupos de pacientes de alto y bajo riesgo. Por tanto, la puntuación se usó posteriormente como variable binaria (alto o bajo riesgo). La agrupación de bajo riesgo se correlacionó con un conjunto coherente de parámetros clínicos. Específicamente, la gran mayoría (215/218) tenía enfermedad confinada en órgano y puntuación de Gleason < 7. Además, el 80% tenía un PSA prequirúrgico bajo (< 10 ng/ml). Los pacientes de la agrupación de alto riesgo (N=225) eran más heterogéneos, pero tendían a presentar características clínicas que se sabe que están asociadas con un mal desenlace (por ejemplo, Gleason > 6 y/o enfermedad a través de la cápsula).
El análisis multivariante del conjunto de entrenamiento que incorporaba el presente modelo clínico binario mostró evidencias de una interacción no lineal entre la firma de expresión y los parámetros clínicos (tabla 17). Para ayudar a entender la naturaleza de esta interacción, se generó un diagrama de dispersión comparando estos factores predisponentes (figura 8). Tal como resulta evidente a partir de la figura, la puntuación de CCG resultó útil para evaluar el riesgo de recidiva en pacientes definidos como de bajo riesgo por los parámetros clínicos. De hecho, incluso después de ajustar para el modelo clínico dentro de los pacientes de bajo riesgo, la firma de CCG fue un fuerte factor predisponente de recidiva bioquímica (valor de p = 0,0071).
Tabla 17: Resumen estadístico
Se usaron los presentes datos de entrenamiento en el diagrama de dispersión para establecer una puntuación de umbral optimizada de -0,16 para la firma de CCG (la puntuación de CCG media es cero). La figura 12 muestra este umbral aplicado a los 443 pacientes estudiados en este ejemplo. El cuarenta por ciento de los pacientes de bajo riesgo se sitúan por debajo de este umbral, y se seleccionó de forma que no hubiera recidivas a los 10 años después de la PR (es decir, un valor predictivo negativo [VPN] del 100 %). Como resultado del establecimiento de valores de umbral tanto para el modelo clínico como para la puntuación de CCG, el diagrama de dispersión se dividió en cuatro secciones con tasas de recidiva del 0 % (CCG bajo) y del 26 % (CCG alto) para los pacientes de bajo riesgo; y del 60 % (CCG bajo) y del 50 % para los pacientes de alto riesgo.
A continuación, se generaron datos de expresión de CCG en 247 pacientes en la presente cohorte de validación. Se eliminaron treinta y dos muestras de los análisis adicionales según las reglas de exclusión desarrolladas en la cohorte de entrenamiento. El panel F fue un factor predisponente significativo de recidiva bioquímica en un análisis univariante (valor de p = 5,8x10-8, tabla 17). Después de ajustar para el modelo clínico binario, la firma de CCG fue altamente predictiva de recidiva en la cohorte de validación (valor de p de 8,3 x10-7), y como en el conjunto de entrenamiento, hubo evidencias significativas de una interacción no lineal entre variables. La firma de CCG fue informativa en todo el espectro de riesgo definido clínicamente (tabla 17). En cuanto a la validación de los resultados de entrenamiento, el valor de p para la asociación entre recidiva y firma de CCG en pacientes de bajo riesgo fue de 1,9x10-4.
Se aplicó el umbral de CCG derivado del presente análisis de la cohorte de entrenamiento al presente conjunto de datos de validación (figura 9). Los pacientes de bajo riesgo con puntuaciones de CCG por debajo del umbral tenían una tasa de recidiva predicha a los 10 años del 5% (equivalente a un VPN validado de 0,95). En general, la combinación de la puntuación de CCG y los parámetros clínicos dividió la cohorte en cuatro grupos con tasas de recidiva predichas a los 10 años del 5 %, del 22 %, del 36 % y del 70 % (tabla 18). En las figuras 10 y 11 se muestra la tasa de recidiva predicha frente a la puntuación de CCG para los pacientes de la cohorte de validación.
Tabla 18: Resumen de tasas de recidiva en la cohorte de validación definida por riesgo clínico y puntuación de CCG
Se sometió a prueba el presente umbral validado frente a diversas definiciones de pacientes de bajo riesgo (tabla 19). La puntuación de firma fue un indicador pronóstico significativo en una variedad de definiciones clínicas de bajo riesgo y, dependiendo de la definición, generó una tasa de recidiva predicha a los 10 años de 0,05 a 0,10.
Tabla 19: VPN de la firma de CCG en otras definiciones de pacientes de riesgo bajo
Comentario
Los presentes inventores han desarrollado y validado una firma molecular pronóstica para el cáncer de próstata. La firma se basa en la medición de los niveles de expresión de ARNm de los genes del ciclo celular (CCG). Por definición, la expresión de los CCG se regula en función de la fase del ciclo celular. Es decir, se activan en fases específicas del ciclo celular, de modo que las células en crecimiento activo tienen mayores niveles de expresión de CCG que las células quiescentes. Supuestamente, este hecho subyace a la capacidad de la firma para predecir la progresión del cáncer. Sin querer limitarse a la teoría, se cree que al medir los niveles de expresión de CCG están midiéndose indirectamente la tasa de crecimiento y la agresividad inherente del tumor, lo que en última instancia repercute en la probabilidad de recidiva del cáncer de próstata después de la prostatectomía.
Existe una distinción importante entre este estudio y muchos otros que han intentado generar firmas moleculares pronósticas. A menudo, los estudios similares comienzan con un gran número de biomarcadores candidatos (que a veces superan los 1.000 genes) que luego se evalúan en busca de su asociación con un fenotipo clínico de interés. En ocasiones, este enfoque puede adolecer de pruebas múltiples inherentes, lo que puede hacer que la significación de la firma derivada sea incierta. En este caso se ha sometido a prueba una única hipótesis: el CCG sería pronóstico en el cáncer de próstata (de hecho, se seleccionaron los genes en función de su correlación con la expresión de CCG, no en función de su asociación con la recidiva). Y puesto que la expresión de CCG está correlacionada, se combinaron los datos de expresión en una firma predictiva determinando el valor medio de expresión de todos los genes de la firma. La simplicidad de este enfoque, desde el punto de vista biológico y computacional, respalda la opinión de que es probable que la afirmación principal de este estudio sea muy sólida y se reproduzca en estudios posteriores.
La firma de CCG (panel F) es independientemente predictiva y se añade significativamente al poder predictivo de los parámetros clínicos normalmente empleados para predecir la recidiva de la enfermedad después de la cirugía. Esto es cierto tanto en la cohorte de entrenamiento como en la de validación.
La firma es inmediatamente útil para definir el riesgo de los pacientes que presentan parámetros clínicos de bajo riesgo. En este caso, se definió esencialmente el bajo riesgo como Gleason <7, PSA<10 y enfermedad confinada en órgano. La puntuación de firma de CCG subdivide eficazmente el grupo de bajo riesgo en pacientes con tasas de recidiva muy bajas (5 %) y un mayor riesgo de recidiva (22 %) (figura 9 y tabla 18). Este es el efecto más drástico de la firma molecular, redefinir con precisión el riesgo de los pacientes previamente definidos como de bajo riesgo basándose en parámetros clínicos. Cabe destacar que, dentro de esta subpoblación de pacientes (es decir, pacientes definidos como de bajo riesgo basándose en parámetros clínicos), los parámetros clínicos no son particularmente pronósticos (véase la tabla 17). Por tanto, como prueba diagnóstica, la firma podría ser útil para un gran número de pacientes. En este estudio, casi el 60 % de la cohorte se caracterizó como de bajo riesgo y se esperaba que el 40 % de ellos tuvieran puntuaciones de CCG bajas. Por tanto, la firma de CCG puede predecir una enfermedad indolente en una cuarta parte de los pacientes que han sido identificados previamente como de alto riesgo (y, por tanto, identificados como candidatos a prostatectomía radical). Finalmente, los datos de validación en particular sugieren que la firma de CCG puede ser útil para definir el riesgo en todos los pacientes. Específicamente, ayudó a dividir a los pacientes definidos como de alto riesgo según los parámetros clínicos en aquellos con tasas de recidiva del 30 % y del 70 % (tabla 18).
La combinación de los parámetros clínicos y la firma de CCG permite a los médicos predecir con mayor precisión el riesgo de fallo quirúrgico y, por tanto, identificar el transcurso apropiado de intervención terapéutica. Tal como se demostró, la firma mejora drásticamente la predicción de recidiva en pacientes que presentan parámetros clínicos generales de enfermedad no agresiva (tabla 19). Dentro de este subgrupo clínico, los pacientes con puntuaciones de CCG bajas se beneficiarían de la seguridad absoluta de que no está indicado ningún tratamiento adicional. Por el contrario, el grupo con CCG alto puede requerir una intervención inmediata. Los pacientes con parámetros clínicos posquirúrgicos desfavorables se benefician de la radioterapia complementaria. Por tanto, la firma de CCG debería predecir la eficacia de la radiación complementaria para pacientes con características clínicas de bajo riesgo y puntuaciones de CCG altas. En la cohorte de validación, los pacientes con puntuaciones de c Cg altas y enfermedad más allá de la próstata tienen una tasa de recidiva del 70 %, lo que debería identificar claramente a los pacientes que son buenos candidatos para la radiación complementaria. Por tanto, la combinación de los parámetros clínicos y la firma de CCG conduce claramente a una definición más precisa del riesgo del paciente, lo que debería permitir una evaluación más inteligente de la necesidad de tratamiento adicional.
EJEMPLO 6
Algunos de los paneles de CCG descritos en el presente documento se evaluaron adicionalmente para determinar su capacidad de pronóstico en otros cánceres. Se encontró que los paneles C, D y F fueron pronósticos en diversos grados en el cáncer de vejiga, cerebro, mama y pulmón.
Métodos
Los datos de expresión génica y de pacientes se obtuvieron de los siguientes conjuntos de datos disponibles públicamente: GSE7390 (Desmedtet al.,CLIN. CANCER RES. (2007) 13:3207-14; PMID 17545524); GSE11121 (Schmidtet al.,CANCER RES. (2008) 68:5405-13; PMID 18593943); GSE8894 (Sonet al.;sin publicar); Shedden (Sheddenet al.,NATURE MED. (2008) 14:822; PMID 18641660); GSE4412 (Freijeet al.,CANCER RES. (2004) 64:6503-10; PMID 15374961); GSE4271 (Phillipset al.,CANCER CELL (2006) 9:157-73; PMID 16530701); GSE5287 (Alset al.,CLIN. CANCER RES. (2007) 13:4407-14; PMID 17671123). Cada uno de estos conjuntos de datos tiene asociada una descripción detallada de los procedimientos experimentales usados en la recopilación de datos de expresión y de pacientes. Las micromatrices de expresión usadas para generar cada conjunto de datos se resumen a continuación en la tabla 20.
Tabla 20
Los datos de expresión de cada uno de los genes en los paneles C, D y F se recopilaron a partir de estos conjuntos de datos y se determinó el nivel de expresión medio de cada panel para cada paciente, cuyo desenlace clínico se conocía (por ejemplo, recidiva, progresión, supervivencia libre de progresión, supervivencia global, etc.). La puntuación de CCG es una expresión promedio de los genes de un panel. Si un gen está representado por más de un conjunto de sondas en la matriz, la expresión génica es una expresión promedio de todos los conjuntos de sondas que representan al gen. La asociación entre la puntuación de CCG y la supervivencia o la recidiva de la enfermedad se sometió a prueba usando un modelo de riesgos proporcionales de Cox univariante y multivariante. El análisis multivariante se realizó cuando se disponía de parámetros clínicos relevantes (grado en el cáncer de cerebro, estadio en el cáncer de pulmón, NPI en el cáncer de mama).
Resultados
Tal como se muestra en la tabla 21 a continuación, cada panel, en el análisis univariante, fue un factor pronóstico en cada uno de los cánceres analizados.
Tabla 21
Tal como se muestra en la tabla 22 a continuación, cada panel también fue pronóstico en el análisis multivariante cuando se combinó con al menos un parámetro (o nomograma) clínico.
Tabla 22
La tabla 23 a continuación proporciona una clasificación de CCG seleccionados según su correlación con la expresión de CCG media.
Tabla 23
La tabla 1 a continuación proporciona una lista larga, pero no exhaustiva, de CCG.
Tabla 1

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    i .Métodoin vitropara clasificar el cáncer de próstata en un paciente, comprendiendo el método:
    (a) determinar, en una muestra del paciente, la expresión media de un panel de genes que comprende al menos diez genes del ciclo celular seleccionados de uno cualquiera de los paneles C-G; y
    (b) comparar la expresión media con el nivel de expresión medio de los mismos genes en una población de referencia de pacientes con el mismo cáncer,
    en el que una elevación de la expresión media con respecto a la población de referencia indica un mal pronóstico.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, que comprende además determinar al menos un parámetro clínico asociado a riesgo para el paciente.
  3. 3. Método según la reivindicación 2, en el que la presencia de al menos un parámetro clínico asociado a riesgo y una expresión media elevada para dichos genes del ciclo celular indica que dicho paciente tiene una probabilidad aumentada de recidiva.
  4. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, que comprende determinar al menos dos o más parámetros clínicos que forman o son parte de un nomograma.
  5. 5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho nomograma comprende los parámetros clínicos del nomograma de Kattan-Stephenson.
  6. 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicho parámetro clínico se elige del grupo que consiste en estadio tumoral, grado tumoral, tamaño tumoral, estado de los ganglios linfáticos, histología, estado de rendimiento, tipo de cirugía, márgenes quirúrgicos, tipo de tratamiento, edad de aparición, niveles de PSA, y puntuación de Gleason.
  7. 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el paciente presenta parámetros clínicos de enfermedad no agresiva o de riesgo bajo, o en el que el paciente se ha tratado previamente para el cáncer.
  8. 8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho panel de genes comprende al menos diez genes del ciclo celular en el panel F.
  9. 9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que determinar el estado del panel de genes comprende al menos uno de:
    (a) determinar el nivel de un ácido nucleico codificado por dichos genes del ciclo celular; o
    (b) determinar el nivel de un polipéptido codificado por dichos genes del ciclo celular.
  10. 10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha expresión media elevada de los genes del ciclo celular comprende al menos uno de:
    (a) un nivel de expresión aumentado de un ácido nucleico codificado por dichos genes del ciclo celular; o (b) un nivel de expresión aumentado de un polipéptido codificado por dichos genes del ciclo celular.
  11. 11. Método para determinar un transcurso de tratamiento para un paciente con cáncer de próstata, que comprende:
    (a) determinar al menos un parámetro clínico asociado a riesgo para dicho paciente;
    (b) determinar, en una muestra del paciente, la expresión media de un panel de genes que comprende al menos diez genes del ciclo celular seleccionados de uno cualquiera de los paneles C-G; y
    (c) comparar la expresión media con el nivel de expresión medio de los mismos genes en una población de referencia de pacientes con el mismo cáncer,
    en el que una elevación de la expresión media con respecto a la población de referencia indica un mal pronóstico, y:
    (a) recomendar tratamiento activo si dicho paciente tiene al menos un parámetro clínico asociado a riesgo y una expresión media elevada para dichos genes del ciclo celular, o
    (b) recomendar conducta expectante si dicho paciente no tiene ni un parámetro clínico asociado a riesgo ni una expresión media elevada para dichos genes del ciclo celular.
    Método para determinar si un paciente con cáncer de próstata tiene una probabilidad aumentada de recidiva, que comprende:
    (a) determinar, en una muestra del paciente, la expresión media de un panel de genes que comprende al menos diez genes del ciclo celular seleccionados de uno cualquiera de los paneles C-G;
    (b) acceder a la información obtenida en (a) en un medio legible por ordenador;
    (c) consultar esta información para determinar si la muestra muestra una expresión media aumentada de los genes del ciclo celular en comparación con el nivel de expresión medio de los mismos genes en una población de referencia de pacientes con el mismo cáncer; y
    (d) emitir una indicación de que el paciente tiene una probabilidad aumentada de recidiva si la muestra muestra una expresión media aumentada de los genes del ciclo celular.
    Uso de una pluralidad de oligonucleótidos para determinar, en una muestra de un paciente, el nivel de expresión de un panel de genes que comprende al menos diez genes del ciclo celular seleccionados de uno cualquiera de los paneles C-G, para determinar el pronóstico o la probabilidad de recidiva del cáncer de próstata en el paciente.
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