ES2948037T3 - Formulación estable congelada del virus del herpes simple - Google Patents
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Abstract
Una composición de virus vivo que mantiene la infectividad y proporciona una estabilidad mejorada del virus durante uno o más ciclos de congelación/descongelación y/o durante el almacenamiento a largo plazo en estado líquido a temperaturas que varían desde justo por encima del punto de congelación hasta la temperatura ambiente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Formulación estable congelada del virus del herpes simple
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 U.S.C. 119(e) de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América número 62/093.663, presentada el 18 de diciembre de 2014.
ANTECEDENTES
Los virus vivos, tal como el virus del herpes simple, suelen ser inestables durante largos períodos de tiempo a temperaturas de almacenamiento mayores que -80°C. La falta de termoestabilidad plantea un desafío para dichos virus, en particular para los virus terapéuticos en una formulación líquida. Tales composiciones de virus terapéuticos deben almacenarse y transportarse congeladas, y usarse poco después de la descongelación para mantener su infectividad terapéuticamente eficaz.
La falta de termoestabilidad plantea desafíos operativos que aumentan el coste de fabricación, almacenamiento y transporte. Durante las operaciones de fabricación, por ejemplo, los ciclos de congelación/descongelación podrían conducir a rendimientos del procedimiento por debajo del nivel óptimo y a la falta de la flexibilidad necesaria en la cadena de suministro. El almacenamiento y el transporte también son un desafío, lo que da como resultado una manipulación complicada y cadenas de suministro complejas.
La falta de termoestabilidad también plantea desafíos comerciales. Las composiciones de virus vivos que requieren almacenamiento a -80°C para asegurar una vida útil estable dan lugar a protocolos de manipulación y almacenamiento complejos para los proveedores de atención médica. Tales limitaciones aumentan el riesgo de devolución de productos si se almacenan incorrectamente o si no se usa todo el producto. Esto tiene el potencial de aumentar el coste para el cliente.
El documento WO 2013/177172 A2 describe composiciones líquidas y secas que comprenden un herpesvirus vivo, atenuado o genéticamente modificado, y métodos para preparar dichas composiciones. Las composiciones incluyen excipientes farmacéuticamente aceptables ventajosos en la preparación de vacunas de herpesvirus estables que retienen la infectividad viral en las condiciones de almacenamiento deseadas.
El documento WO 2014/036412 A2 describe métodos para tratar el melanoma usando el virus del herpes simple en combinación con un inhibidor del punto de control inmunitario.
El documento WO 99/12568 describe composiciones para mejorar la estabilidad de vacunas de virus vivos. Estos estabilizantes son disoluciones acuosas que contienen seroalbúmina humana recombinante (rHA) como componente a 1-100 g/l.
La invención proporciona una formulación de virus vivo que se puede usar para estabilizar y preservar la infectividad durante múltiples ciclos de congelación/descongelación y durante el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente y frías. La formulación reduce las limitaciones durante la fabricación, el transporte, el almacenamiento y el uso del virus, proporcionando flexibilidad sin pérdida de estabilidad y/o infectividad.
El creciente campo de la inmunoterapia oncolítica ha incrementado el uso terapéutico de las composiciones víricas oncolíticas. Cualquier mejora en las composiciones de virus vivos que mantengan la infectividad y proporcionen una mejor estabilidad del virus durante uno o más ciclos de congelación/descongelación y/o durante el almacenamiento a largo plazo en estado líquido a temperaturas que oscilan desde justo por encima del punto de congelación hasta la temperatura ambiente sería ventajosa desde el punto de vista operativo, así como también aumentaría en gran medida la comodidad y la flexibilidad para el proveedor de atención médica y el paciente. La invención satisface esta necesidad proporcionando tales composiciones.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención es como se define en las reivindicaciones. La invención proporciona una composición de virus vivo que comprende un virus del herpes simple, una proteína, al menos un azúcar, cloruro de sodio y fosfato de sodio a pH 7,4, en la que la composición está congelada, la proteína es gelatina parcialmente hidrolizada (PHG) a una concentración de 0,5% (p/v), y el al menos un azúcar es sorbitol a una concentración de 2% (p/v).
En una realización, la composición se puede descongelar y almacenar a 2°C hasta al menos 25°C. En una realización relacionada, después de la descongelación a 2°C hasta al menos 25°C, la composición de virus vivo se congela nuevamente y se almacena a una temperatura de al menos -30°C.
En otra realización, la composición se puede descongelar y almacenar a 2°C hasta 82C. En una realización relacionada, después de la descongelación a 2°C hasta 8°C, la composición de virus vivo se congela nuevamente y se almacena a una temperatura de al menos -30°C.
En otra realización, la concentración de cloruro de sodio es 145 mM.
En otra realización, la concentración de cloruro de sodio es alrededor de 145 mM.
En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 100 mM.
En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 100 mM.
En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 102 mM.
En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 102 mM.
En otra realización, la gelatina parcialmente hidrolizada es porcina.
En otra realización, el virus es un virus del herpes simple 1.
En otra realización, el virus del herpes simple es un aislado clínico.
En otra realización, el virus del herpes simple es un aislado clínico de un herpes labial recurrente.
En otra realización, la cepa 1 del virus del herpes simple se selecciona del grupo que consiste en la cepa JS1, la cepa 17+, la cepa F, y la cepa KOS.
En otra realización, el herpes simple carece de uno o más genes funcionales. En una realización relacionada, el virus del herpes simple carece de un gen codificante de ICP34.5 funcional. En una realización relacionada, el virus del herpes simple carece de un gen codificante de ICP47 funcional. En una realización relacionada, el virus del herpes simple carece además de un gen que codifica ICP6 funcional, un gen que codifica glicoproteína H funcional, o un gen que codifica timidina cinasa funcional. En una realización relacionada, el virus del herpes simple carece de un gen que codifica vhs funcional. En otra realización relacionada, el virus del herpes simple carece de un gen que codifica UL43 funcional. En una realización relacionada, el virus del herpes simple carece de un gen que codifica VMW funcional, un gen que codifica ICPO funcional, un gen que codifica ICP4 funcional, un gen que codifica ICP22 funcional, o un gen que codifica ICP27 funcional. En una realización relacionada, se ha realizado una modificación al virus del herpes simple de manera que el gen Us11 se expresa como un gen temprano. En una realización relacionada, el virus del herpes simple comprende uno o más genes heterólogos y/o genes virales. En una realización relacionada, el gen heterólogo y/o el gen viral se selecciona del grupo que consiste en un gen que codifica una citotoxina, una proteína inmunomoduladora, un antígeno tumoral, un activador de profármacos, un supresor de tumores, una enzima convertidora de profármacos, proteínas capaces de causar la fusión celular, un inhibidor de TAP, la proteína viral Us11, una molécula de ARN antisentido, o una ribozima. En otra realización relacionada, el gen heterólogo y/o el gen viral se selecciona del grupo que consiste en un gen que codifica IL-12, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), la citosina desaminasa, la glicoproteína fusogénica de la leucemia del simio gibón, el polipéptido UL49.5 del herpesvirus bovino (BHV) o la proteína viral Us11.
En otra realización, el virus del herpes simple se selecciona del grupo que consiste en talimogén laherparepvec, Seprehvir™ (HSV-1716), G207, OrienX010, NV1020, M032, ImmunoVEX, NSC-733972, HF-10, BV-2711, JX-594, Myb34.5, AE-618, Brainwel™, Heapwel™, y OncoVEXGALV/CD.
También se describe un método para exterminar células tumorales en un paciente, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composición de virus vivo descrita anteriormente en condiciones eficaces para exterminar células tumorales en el paciente. En una realización relacionada, la composición de virus vivo se administra en combinación con un inhibidor de puntos de control. En una realización relacionada, la composición de virus vivo se administra antes, simultáneamente o después del inhibidor de puntos de control. En una realización relacionada, las células tumorales se seleccionan del grupo que consiste en astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblastoma, ependimoma, schwannoma, neurofibrosarcoma, meduloblastoma, células de melanoma, células de cáncer de páncreas, células de carcinoma de próstata, células de cáncer de mama, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de colon, células de hepatoma, mesotelioma, células de cáncer de vejiga, y células de carcinoma epidermoide. En una realización relacionada, el paciente es un ser humano. En una realización relacionada, la administración se lleva a cabo mediante inyección.
En otra realización, la infectividad aumenta en comparación con la misma composición de virus vivo que carece de la proteína de la invención.
FIGURAS
Fig. 1. Efecto del contenido de amortiguador y sal sobre la estabilidad de congelación/descongelación. Rombo negro, línea continua: Naphos 10 mM, Círculo blanco, línea discontinua, Kphos 10 mM, Círculo negro, línea continua: 100 mM Kphos; Cuadrado negro, línea continua: NaCl 73 mM; Cuadrado blanco, línea discontinua: NaCl 0 mM, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 2A. Efecto de la concentración de azúcar sobre la estabilidad de congelación/descongelación. Cuadrado negro, línea continua: 9% de sorbitol, Cuadrado blanco, línea discontinua: 15% de sorbitol, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig 2B. Efecto de la concentración de azúcar sobre la estabilidad de congelación/descongelación. Cuadrado negro, línea continua, 9% de sorbitol, Triángulo negro, línea continua: 15% de sacarosa, Cuadrado blanco, línea discontinua: 9% de trehalosa y Triángulo blanco, línea discontinua: 15% de trehalosa.
Fig. 3 Efecto de las combinaciones de proteína/azúcar sobre la estabilidad durante la congelación/descongelación. Cuadrado negro, línea continua: 9% de sacarosa, 2% de mAb antiestreptavidina, Cuadrado blanco, línea discontinua: 9% de sacarosa, 2% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: 4% de rHSA, Círculo blanco, línea discontinua: 4% de phGelatin , y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 4A Efecto de los excipientes de azúcar y proteína sobre la estabilidad líquida a 2-8°C. Cuadrado negro, línea continua: 2% de rHSA, Cuadrado blanco, línea discontinua: 2% de phGelatin; Círculo negro, línea continua: 15% de trehalosa, Círculo blanco, línea discontinua: 15% de sacarosa, Triángulo negro, línea continua: 9% de sacarosa, 2% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 4B Efecto de los excipientes de azúcar y proteína sobre la estabilidad líquida a 25°C. Cuadrado negro, línea continua: 2% de rHSA, Cuadrado blanco, línea discontinua: 2% de phGelatin, Círculo blanco, línea discontinua: 15% de sacarosa, Triángulo negro, línea continua: 9% de sacarosa y 2% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 5 El efecto de la concentración de rHSA y phGelatin sobre la estabilidad durante los ciclos de congelación/descongelación. Cuadrado negro, línea continua: 1% de rHSA, Triángulo negro, línea continua: 2% de rHSA, Círculo negro, línea continua: 4% de rHSA, Cuadrado blanco, línea discontinua: 1% de phGelatin, Triángulo blanco, línea discontinua: 2% de phGelatin, Círculo blanco, línea discontinua: 4% de phGelatin , y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 6A El efecto de la concentración de rHSA y phGelatin sobre la estabilidad durante el almacenamiento del líquido a 25°C. Cuadrado negro, línea continua: 1% de rHSA, Triángulo negro, línea continua: 2% de rHSA, Círculo negro, línea continua: 4% de rHSA, Cuadrado blanco, línea discontinua: 1% de phGelatin, Triángulo blanco, línea discontinua: 2% de phGelatin, Círculo blanco, línea discontinua: 4% de phGelatin , y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 6B El efecto de la concentración de rHSA y phGelatin sobre la estabilidad durante el almacenamiento del líquido a 2-8°C. Cuadrado negro, línea continua: 1% de rHSA, Triángulo negro, línea continua: 2% de rHSA, Círculo negro, línea continua: 4% de rHSA, Cuadrado blanco, línea discontinua: 1% de phGelatin, Triángulo blanco, línea discontinua: 2% de phGelatin, y Círculo blanco, línea discontinua: 4% de phGelatin, Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 7A El efecto de diferentes grados y fuentes de rHSA sobre la estabilidad líquida a 25°C. Cuadrado negro, línea continua: 2% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: 2% de Sigma, Triángulo blanco, línea discontinua: 2% de Novozyme Alpha, Círculo blanco, línea discontinua: 2% de Novozyme Albix y Rombo blanco, línea discontinua: 2% Novozyme Prime.
Fig. 7B El efecto de diferentes grados y fuentes de rHSA sobre la estabilidad líquida a 25°C. Cuadrado negro, línea continua: 2% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: 2% de Sigma, Triángulo blanco, línea discontinua: 1% de Novozyme Alpha, Círculo blanco, línea discontinua: 2% de Novozyme Alpha, y Rombo blanco, línea discontinua: 4% Novozyme Alfa.
Fig. 7C El efecto de diferentes grados y fuentes de rHSA sobre la estabilidad líquida a 25°C. Cuadrado negro, línea continua: 2% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: 2% de Sigma, Triángulo blanco, línea discontinua: 1% de Novozyme Albix, Círculo blanco, línea discontinua: 2% de Novozyme Albix y Rombo blanco, línea discontinua: 4% de Novozyme Albix.
Fig. 7D El efecto de diferentes grados y fuentes de rHSA sobre la estabilidad líquida a 25°C. Cuadrado negro, línea continua: 2% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: 2% de Sigma, Triángulo blanco, línea discontinua: 1% de Novozyme Prime, Círculo blanco, línea discontinua: 2% de Novozyme Prime y Rombo blanco, línea discontinua: 4% de Novozyme Prime.
Fig. 8A El efecto de 0,25 - 1,0% de phGelatin sobre la estabilidad durante los ciclos de congelación/descongelación a 106 UFP/ml. Cuadrado negro, línea continua: 0,25% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: 0,5% de phGelatin, T riángulo negro, línea continua: 1,0% de phGelatin y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig 8B. El efecto de 0,25 - 1,0% de phGelatin sobre la estabilidad durante los ciclos de congelación/descongelación a 108 UFP/ml. Cuadrado negro, línea continua: 0,25% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: 0,5% de phGelatin, T riángulo negro, línea continua: 1,0% de phGelatin y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 8C El efecto de 0,25 - 1,0% de phGelatin sobre la estabilidad líquida a 2-8°C a 106 UFP/ml. Cuadrado negro, línea continua: 0,25% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: 0,5% de phGelatin, Triángulo negro, línea continua: 1,0% de phGelatin y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 8D El efecto de 0,25 - 1,0% de phGelatin sobre la estabilidad líquida a 2-8°C a 108 UFP/ml. Cuadrado negro, línea continua: 0,25% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: 0,5% de phGelatin, Triángulo negro, línea continua: 1,0% de phGelatin y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 8E El efecto de 0,25 -1,0% de phGelatin sobre la estabilidad líquida a 25°C a 106 UFP/ml. Cuadrado negro, línea continua: 0,25% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: 0,5% de phGelatin, Triángulo negro, línea continua: 1,0% de phGelatin y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 8F El efecto de 0,25 -1,0% de phGelatin sobre la estabilidad líquida a 25°C a 108 UFP/ml. Cuadrado negro, línea continua: 0,25% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: 0,5% de phGelatin, Triángulo negro, línea continua: 1,0% de phGelatin y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 8G. El efecto de 0,01%- 0,5% de phGelatin sobre la estabilidad líquida a 2-8°C a 106 UFP/ml. Cuadrado negro, línea continua: 0,01% de phGelatin, Triángulo negro, línea continua: 0,05% de phGelatin, Círculo blanco, línea continua: 0,1% de phGelatin, Estrella, línea discontinua: 0,25% de phGelatin. Círculo negro, línea continua: 0,5% de phGelatin y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 8H. El efecto de 0,01% - 0,5% de pHGelatin sobre la estabilidad líquida a 25°C a 106 UFP/ml. Cuadrado negro, línea continua: 0,01% de phGelatin, Triángulo negro, línea continua: 0,05% de phGelatin, Círculo blanco, línea continua: 0,1% de phGelatin, Estrella, línea discontinua: 0,25% de phGelatin. Círculo negro, línea continua: 0,5% de phGelatin y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 9A. El efecto de 0,25 - 2,0% sobre la estabilidad durante los ciclos de congelación/descongelación a 106 UFP/ml. Cuadrado negro, línea continua: 0,25% de rHSA, Triángulo negro, línea continua: 0,5% de rHSA, T riángulo blanco, línea continua: 1,0% de rHSA, Estrella, línea continua: 2,0% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 9B. El efecto de 0,25 - 2,0% sobre la estabilidad durante los ciclos de congelación/descongelación a 108 UFP/ml. Cuadrado negro, línea continua: 0,25% de rHSA, Triángulo negro, línea continua: 0,5% de rHSA, T riángulo blanco, línea continua: 1,0% de rHSA, Estrella, línea continua: 2,0% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 9C. El efecto de 0,25 - 2,0% de rHSA sobre la estabilidad líquida a 2-8°C a 106 UFP/ml a lo largo del tiempo, en semanas. Cuadrado negro, línea continua: 0,25% de rHSA, Triángulo negro, línea continua: 0,5% de rHSA, Triángulo blanco, línea continua: 1,0% de rHSA, Estrella, línea continua: 2,0% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 9D. El efecto de 0,25 - 2,0% de rHSA sobre la estabilidad líquida a 2-8°C a 108 UFP/ml a lo largo del tiempo, en semanas. Cuadrado negro, línea continua: 0,25% de rHSA, Triángulo negro, línea continua: 0,5% de rHSA, Triángulo blanco, línea continua: 1,0% de rHSA, Estrella, línea continua: 2,0% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 9E. El efecto de 0,25 - 2,0% de rHSA sobre la estabilidad líquida a 25°C a 106 UFP/ml a lo largo del tiempo, en días. Cuadrado negro, línea continua: 0,25% de rHSA, Triángulo negro, línea continua: 0,5% de rHSA, Triángulo blanco, línea continua: 1,0% de rHSA, Estrella, línea continua: 2,0% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 9F. El efecto de 0,25 - 2,0% de rHSA sobre la estabilidad líquida a 25°C a 108 UFP/ml a lo largo del tiempo, en semanas. Cuadrado negro, línea continua: 0,25% de rHSA, Triángulo negro, línea continua: 0,5% de rHSA, Triángulo blanco, línea continua: 1,0% de rHSA, Estrella, línea continua: 2,0% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 10A Estabilidad congelada a largo plazo a -302C a 106 UFP/ml, tiempo en semanas. Cuadrado negro: 0,5% de phGelatin, Círculo negro: 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 10B Estabilidad congelada a largo plazo a -30°C a 108 UFP/ml, tiempo en semanas. Cuadrado negro: 0,5% de phGelatin, Círculo negro: 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 10C Estabilidad congelada a largo plazo a -70°C a 106 UFP/ml, tiempo en semanas. Cuadrado negro: 0,5% de phGelatin, Círculo negro: 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 10D Estabilidad congelada a largo plazo a -70°C en B) 108 UFP/ml, tiempo en semanas. Cuadrado negro: 0,5% de phGelatin, Círculo negro: 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 10E. Estabilidad durante los ciclos de congelación/descongelación a 106 UFP/ml. Cuadrado negro: 0,5% de phGelatin, Círculo negro: 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 10F. Estabilidad durante los ciclos de congelación/descongelación a 108 UFP/ml. Cuadrado negro: 0,5% de phGelatin, Círculo negro: 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 10G Estabilidad líquida a largo plazo a 2-8°C a 106 UFP/ml, tiempo en semanas. Cuadrado negro: 0,5% de phGelatin, Círculo negro: 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 10H Estabilidad líquida a largo plazo a 2-8°C a 108 UFP/ml, tiempo en semanas. Cuadrado negro: 0,5% de phGelatin, Círculo negro: 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 101 Estabilidad líquida a largo plazo a 25°C a 106 UFP/ml, tiempo en semanas. Cuadrado negro: 0,5% de phGelatin, Círculo negro: 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 10J Estabilidad líquida a largo plazo a 25°C a 108 UFP/ml, tiempo en semanas. Cuadrado negro: 0,5% de phGelatin, Círculo negro: 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea discontinua: control.
Fig. 11A. Almacenamiento estático a 2-8°C de 106 UFP/ml, tiempo en semanas. Cuadrado negro, línea discontinua: amortiguador 0,5% de phGelatin, Círculo negro, línea discontinua: amortiguador 0,5% de rHSA, Rombo negro, línea discontinua: Control de amortiguador. Cuadrado negro, línea continua: formulación 0,5% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: formulación 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea continua: control de formulación.
Fig. 11B. Congelación a -70°C, después almacenamiento a 2-8°C (1 ciclo de congelación-descongelación) de 106 UFP/ml, tiempo en semanas. Cuadrado negro, línea discontinua: amortiguador 0,5% de phGelatin, Círculo negro, línea discontinua: amortiguador 0,5% de rHSA, Rombo negro, línea discontinua: Control de amortiguador. Cuadrado negro, línea continua: formulación 0,5% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: formulación 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea continua: control de formulación.
Fig. 12A. Almacenamiento estático a 2-8°C de 108 UFP/ml, tiempo en semanas. Cuadrado negro, línea discontinua: amortiguador 0,5% de phGelatin, Círculo negro, línea discontinua: amortiguador 0,5% de rHSA, Rombo negro, línea discontinua: Control de amortiguador. Cuadrado negro, línea continua: formulación 0,5% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: formulación 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea continua: control de formulación.
Fig. 12B. Congelación a -70°C, después almacenamiento a 2-8°C (1 ciclo de congelación-descongelación) de 108 UFP/ml, tiempo en semanas. Cuadrado negro, línea discontinua: amortiguador 0,5% de phGelatin, Círculo negro, línea discontinua: amortiguador 0,5% de rHSA, Rombo negro, línea discontinua: Control de amortiguador. Cuadrado negro, línea continua: formulación 0,5% de phGelatin, Círculo negro, línea continua: formulación 0,5% de rHSA, y Rombo negro, línea continua: control de formulación.
Descripción detallada de la invención
La invención descrita aquí proporciona una composición de virus vivos que se puede usar para estabilizar y preservar la infectividad durante múltiples ciclos de congelación/descongelación y durante el almacenamiento a largo plazo a temperaturas cercanas a la congelación y ambiente. La composición reduce los retos durante la fabricación, el transporte, el almacenamiento y el uso, al proporcionar flexibilidad para la congelación y descongelación. La composición inventiva de virus vivos protege al virus vivo del daño que ocurre típicamente durante los ciclos de congelación/descongelación, y, en estado líquido, proporciona estabilidad a 2-8°C o a temperatura ambiente, al tiempo que mantiene una buena estabilidad durante el almacenamiento congelado, a temperaturas - 30°C y más frías.
La partícula del virus del herpes es una estructura compleja que consiste en un genoma de ADN bicatenario empaquetado dentro de una cápside de proteína icosaédrica que está envuelta en una bicapa de membrana derivada de células. Intercalada entre la cápside y la cubierta lipídica hay una capa de proteínas virales conocida como tegumento [1,2]. La presencia de una envoltura de membrana es una característica distintiva de muchos tipos diferentes de virus animales. Al formular composiciones para estabilizar virus vivos, la cubierta lipídica parece conferir una inestabilidad física significativa a la partícula viral, lo que dificulta la estabilización de esta clase de virus, especialmente cuando se compara con virus de mamíferos sin cubierta, tales como adenovirus, reovirus, y poliovirus. Por ejemplo, en almacenamiento a 2-82C, se ha demostrado que el adenovirus tipo 5 es estable durante 2 años, y los poliovirus y reovirus durante al menos 1 año [3-5]. El poxvirus parece ser el único virus animal envuelto que exhibe grados similares de estabilidad de almacenamiento a temperaturas similares. Sin embargo, el poxvirus es estructuralmente distinto de otros virus animales con cubierta, ya que contiene una doble cubierta y otras diferencias estructurales [6,7]. De hecho, los poxvirus son notablemente estables, como lo demuestra el almacenamiento a largo plazo observado en tejidos archivados, muestras medioambientales, y el almacenamiento en laboratorio de muestras secas a 2-8°C durante más de 60 años [8-12].
De los productos de virus vivos envueltos aprobados en los EE. UU. [13], todos excepto uno (una vacuna contra el poxvirus; ACAM2000) contienen PHG (Tabla 1) (aunque, como se discutió anteriormente, se sabe sin embargo que los poxvirus son particularmente estables en una variedad de ambientes). Como se ilustra en la Tabla 1, incluso las formulaciones de virus vivos que utilizan PHG requieren liofilización, lo que indica que el uso de PHG no es suficiente para impartir una estabilidad de almacenamiento adecuada de una composición líquida a, por ejemplo, 2-8°C. FluMist*, aunque no está liofilizado, se puede almacenar a 2-8°C como una composición líquida, aunque durante un período relativamente corto de aproximadamente 18 semanas. Por el contrario, la composición de la presente invención permite formulaciones líquidas de virus vivos que demuestran una estabilidad de almacenamiento de al menos 9 meses (39 semanas) a 2-8°C, un aumento significativo con respecto a las formulaciones líquidas de virus vivos anteriores.
Tabla 1. Estabilidad de los productos de virus vivos aprobados en EE. UU.
La composición de la presente invención también evita la inactivación del virus debido al daño por congelación y descongelación. La capacidad de congelar y descongelar un producto farmacéutico o un producto intermedio sin pérdida de potencia (o actividad) es de enorme valor debido a que permite flexibilidad en el diseño del procedimiento
de fabricación, etiquetado, operaciones de envasado, distribución de la cadena de suministro del producto final, y manipulación del cuidador sanitario. Por ejemplo, una formulación de virus vivos que protege contra el daño por congelación y descongelación se puede volver a congelar si se descongela accidentalmente o no se usa, reduciendo así la cantidad de pérdida de medicamento. Sin embargo, los productos biológicos suelen experimentar algún daño debido a una operación de congelación y descongelación, y por lo tanto generalmente se limitan a un solo ciclo de congelación y descongelación, para minimizar la pérdida de potencia [14,15]. Entre los productos de virus vivos enumerados en la Tabla 1, ninguno de los productos liofilizados se puede volver a congelar después de la reconstitución. Además, FluMist® no se pueden congelar para descongelarlo y usarlo más tarde. Como se muestra en las Figuras 10E y 10F, las composiciones de la presente invención mantuvieron su potencia durante 10 ciclos de congelación-descongelación, mientras que el control perdió >2 logs y >1 logs de título, respectivamente. Este beneficio se realiza en un intervalo relativamente amplio de concentraciones de PGH, como se muestra en las Figuras 9A y 9B.
Además, la adición de PHG a las composiciones descritas aquí evitó la formación de partículas visibles y subvisibles. El aspecto del producto es un atributo importante del producto; un producto que no cumpla con los criterios de aspecto especificados podría dar como resultado el rechazo o la retirada del lote de virus relevante. La formación de partículas, ya sea durante la fabricación o en momentos posteriores (por ejemplo, durante el almacenamiento), es una preocupación importante con todos los productos biológicos. La adición de PHG a las composiciones redujo significativamente la cantidad de partículas presentes en el producto final tras la fabricación (Figuras 11A y 12A) o después de una congelación y descongelación (Figuras 11B y 12B). Se observa que, en ausencia de PHG, las composiciones exhibieron altos niveles de partículas. Este parece ser el primer informe de PHG que previene la formación de partículas en un grado tan significativo
En consecuencia, la invención proporciona una composición de virus vivos que comprende un virus del herpes simple, una proteína, al menos un azúcar, cloruro de sodio y fosfato de sodio a pH 7,4, en la que la composición se congela, la proteína es gelatina parcialmente hidrolizada (PHG) a una concentración de 0,5% p/v), y el al menos un azúcar es sorbitol a una concentración de 2% (p/v). En una realización, la composición de virus vivos se descongela y se almacena a 2°C hasta al menos 25°C. En otra realización, la composición de virus vivos se descongela y se almacena a 2°C hasta 25°C. En otra realización, la composición de virus se descongela y se almacena a 2°C hasta 8°C. En otra realización, después de la descongelación, la composición de virus vivos se vuelve a congelar. En aún otra realización, después de la descongelación, la composición de virus vivos se vuelve a congelar y se almacena a una temperatura de -30°C o inferior.
En algunas realizaciones, la composición de virus se descongela, se almacena, y se vuelve a congelar (es decir, se somete a un ciclo de congelación/descongelación) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 veces. En algunas realizaciones, la composición de virus se descongela, se almacena, y se vuelve a congelar (es decir, se somete a un ciclo de congelación/descongelación) al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 veces.
La proteína es gelatina parcialmente hidrolizada (PHG). En una realización, la gelatina parcialmente hidrolizada es porcina. La concentración de PHG es 0,5% (p/v). En aún otra realización, la concentración de PHG porcina es 0,5% (p/v).
El al menos un azúcar es sorbitol, y la concentración de sorbitol es 2% (p/v).
En una realización, la concentración de cloruro de sodio es 145 mM. En otra realización, la concentración de cloruro de sodio es alrededor de 145 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es 10 a 500 mM, 10 a 300 mM, 50 a 300 mM, 50 a 250 mM, 100 a 250 mM, 100 a 200 mM, 100 a 190 mM, 100 a 180 mM, 110 a 180 mM, 120 a 180 mM, 120 a 170 mM, 130 a 170 mM, 130 a 160 mM, 140 a 160 mM, o 140 a 150 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es alrededor de 10 a alrededor de 500 mM, alrededor de 10 a alrededor de 300 mM, alrededor de 50 a alrededor de 300 mM, alrededor de 50 a alrededor de 250 mM, alrededor de 100 a alrededor de 250 mM, alrededor de 100 a alrededor de 200 mM, alrededor de 100 a alrededor de 190 mM, alrededor de 100 a alrededor de 180 mM, alrededor de 110 a alrededor de 180 mM, alrededor de 120 a alrededor de 180 mM, alrededor de 120 a alrededor de 170 mM, alrededor de 130 a alrededor de 170 mM, alrededor de 130 a alrededor de 160 mM, alrededor de 140 a alrededor de 160 mM, o alrededor de 140 a alrededor de 150 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es 135 mM, 136 mM, 137 mM, 138 mM, 139 mM, 140 mM, 141 mM, 142 mM, 143 mM, 144 mM, 145 mM, 146 mM, 147 mM, 148 mM, 149 mM, 150 mM, 151 mM, 152 mM, 153 mM, 154 mM, o 155 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es alrededor de 135 mM, alrededor de 1,36 mM, alrededor de 137 mM, alrededor de 138 mM, alrededor de 139 mM, alrededor de 140 mM, alrededor de 141 mM, alrededor de 142 mM, alrededor de 143 mM, alrededor de 144 mM, alrededor de 145 mM, alrededor de 146 mM, alrededor de 147 mM, alrededor de 148 mM, alrededor de 149 mM, alrededor de 150 mM, alrededor de 151 mM, alrededor de 152 mM, alrededor de 153 mM, alrededor de 154 mM, o alrededor de 155 mM.
En una realización, la concentración de fosfato de sodio es 100 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 100 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 102 mM. En aún otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 102 mM. En algunas realizaciones, la concentración de fosfato de sodio es 10 a 500 mM, 10 a 300 mM, 50 a 300 mM, 50 a 250 mM, 50 a 150 mM, 60 a 140 mM, 70 a 130
mM, 80 a 120 mM, 90 a 110 mM, 91 a 109 mM, 92 a 108 mM, 93 a 107 mM, 94 a 106 mM, 95 a 105 mM, 96 a 104 mM, 97 a 103 mM, 98 a 102 mM, o 99 a 101 mM. En algunas realizaciones, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 10 a alrededor de 500 mM, alrededor de 10 a alrededor de 300 mM, alrededor de 50 a alrededor de 300 mM, alrededor de 50 a alrededor de 250 alrededor de 50 a alrededor de 150 mM, alrededor de 60 a alrededor de 140 mM, alrededor de 70 a alrededor de 130 mM, alrededor de 80 a alrededor de 120 mM, alrededor de 90 a alrededor de 110 mM, alrededor de 91 a alrededor de 109 mM, alrededor de 92 a alrededor de 108 mM, alrededor de 93 a alrededor de 107 mM, alrededor de 94 a alrededor de 106 mM, alrededor de 95 a alrededor de 105 mM, alrededor de 96 a alrededor de 104 mM, alrededor de 97 a alrededor de 103 mM, alrededor de 98 a alrededor de 102 mM, o alrededor de 99 a alrededor de 101 mM. En algunas realizaciones, la concentración de fosfato de sodio es 90 mM, 91 mM, 92 mM, 93 mM, 94 mM, 95 mM, 96 mM, 97 mM, 98 mM, 99 mM, 100 mM, 101 mM, 102 mM, 103 mM, 104 mM, 105 mM, 106 mM, 107 mM, 108 mM, 109 mM, o 110 mM. En algunas realizaciones, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 90 mM, alrededor de 91 mM, alrededor de 92 mM, alrededor de 93 mM, alrededor de 94 mM, alrededor de 95 mM, alrededor de 96 mM, alrededor de 97 mM, alrededor de 98 mM, alrededor de 99 mM, alrededor de 100 mM, alrededor de 101 mM, alrededor de 102 mM, alrededor de 103 mM, alrededor de 104 mM, alrededor de 105 mM, alrededor de 106 mM, alrededor de 107 mM, alrededor de 108 mM, alrededor de 109 mM, o alrededor de 110 mM.
La invención proporciona una composición que comprende un virus del herpes simple, gelatina parcialmente hidrolizada, a una concentración de 0,5% (p/v), sorbitol a una concentración de 2% (p/v), cloruro de sodio y fosfato de sodio, a pH 7,4, en la que la composición está congelada. En otra realización, la composición comprende un virus del herpes simple 1, gelatina porcina parcialmente hidrolizada, a una concentración de 0,5% (p/v), sorbitol a una concentración de 2% (p/v), cloruro de sodio y fosfato de sodio, a pH 7,4, en la que la composición está congelada. En otra realización, la composición comprende un virus del herpes simple 1, gelatina porcina parcialmente hidrolizada a una concentración de 0,5% (p/v), sorbitol a una concentración de 2% (p/v), cloruro de sodio a una concentración de 145 mM, y fosfato de sodio a una concentración de 102 mM, a pH 7,4. En las realizaciones anteriores, el virus del herpes simple 1 puede ser talimogén laherparepvec.
Como se usa aquí, la expresión "alrededor de" se refiere a una variación de 5% de los valores indicados, o en el caso de un intervalo de valores, significa una variación de 5% de los límites inferior y superior de tales intervalos.
En una realización, la infectividad de la composición de virus vivos aumenta en comparación con la misma composición de virus vivos que carece de la proteína de la invención. La infectividad del virus (título) se puede medir mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo ensayos en placas, tal como el que se describe aquí.
Los virus de la invención pueden derivar de una cepa del virus del herpes simple 1 (HSV1) o del herpes simple 2 (HSV2), o de un derivado de los mismos, preferiblemente HSV1. Los derivados incluyen recombinantes intertipo que contienen ADN de las cepas HSV1 y HSV2. Tales recombinantes intertipo se describen en la técnica, por ejemplo en Thompson et al., (1998) Virus Genes 1(3); 275286, y Meignier et al., (1998) J. Infect. Dis. 159; 602 614.
Las cepas del virus del herpes simple pueden derivar de aislados clínicos. Tales cepas se aíslan de individuos infectados, tales como aquellos con herpes labial recurrente. Los aislados clínicos se pueden examinar para determinar la capacidad o característica deseada, tal como una mayor replicación en el tumor y/u otras células in vitro y/o in vivo en comparación con las cepas estándar de laboratorio, como se describe en las patentes US núms.
7.063.835 y 7.223.593, cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad. En una realización, el virus del herpes simple es un aislado clínico de un herpes labial recurrente.
Las cepas del virus del herpes simple 1 incluyen, pero no se limitan a, la cepa JS1, la cepa 17+, la cepa F, y la cepa KOS, la cepa Patton.
Los virus del herpes simple pueden modificarse, por ejemplo, en comparación con su cepa precursora, de modo que el virus modificado carezca de uno o más genes virales funcionales. Como se usa aquí, "que carece de un gen viral funcional" significa que el gen o los genes se eliminan, reemplazan, reorganizan, o alteran de otro modo, parcial o completamente, en el genoma del herpes simple, de tal manera que ya no se puede expresar una proteína viral funcional a partir de ese gen por el virus del herpes simple.
Los ejemplos de genes que se pueden modificar incluyen genes de virulencia que codifican proteínas tal como ICP34.5 (Y34.5). ICP34.5 actúa como un factor de virulencia durante la infección por HSV, limita la replicación en células que no se dividen, y hace que el virus no sea patógeno. Otro gen viral que se puede modificar es el gen que codifica ICP47, que reduce la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I en la superficie de las células hospedantes infectadas, y la unión al transportador asociado con la presentación de antígenos (TAP) bloquea el transporte de péptidos antigénicos en el retículo endoplasmático y la carga de moléculas MHC de clase I. Otra es ICP6, la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa, involucrada en el metabolismo de nucleótidos y la síntesis de ADN viral en células que no se dividen, pero no en células que se dividen. La timidina cinasa, responsable de la fosforilación de aciclovir a aciclovir-monofosfato, la proteína vmw65 transactivadora de viriones, la glicoproteína H, vhs, ICP43, y los genes tempranos inmediatos que codifican ICP4, 1CP27, ICP22 y/o ICP0, también pueden modificarse.
También se pueden realizar modificaciones para alterar el tiempo de expresión de los genes del virus del herpes simple. Por ejemplo, Us11 se puede expresar como un gen temprano colocando el gen Us11 bajo el promotor Us12, Mulvey et al. (1999) J Virology, 73:4, 3375-3385, patente US núm. US5824318, Mohr y Gluzman (1996) EMBO 15: 4759-4766.
Los ejemplos de virus del herpes simple modificados incluyen, pero no se limitan a, Seprehvir™ (HSV1716) cepa 17+ del virus del herpes simple tipo 1, que tiene una deleción de 759 pb ubicada dentro de cada copia del fragmento BamHI s (0 a 0-02 y 0-81 a 0,83 unidades de mapa) de la región de repetición larga del genoma del HSV, eliminando una copia completa del elemento DR~ de 18 pb de la secuencia 'a' y termina 1105 pb en dirección 5’ del extremo 5' del gen temprano inmediato (1E) 1, véase MacLean et al., (1991) Journal of General Virology 79:631-639).
G207, un HSV-1 oncolítico derivado de la cepa F del HSV-1 de tipo salvaje, que tiene deleciones en ambas copias del determinante principal de la neurovirulencia del HSV, el gen ICP 34.5, y una inserción inactivadora del gen lacZ de E. coli en UL39, que codifica la proteína 6 de células infectadas (ICP6), véase Mineta et al. (1995) Nat Med. 1:938- 943.
OrienX010, un virus del herpes simple con deleción de ambas copias de los genes y34.5 e ICP47, así como una interrupción del gen ICP6 e inserción del gen GM-CSF humano, véase Liu et al., (2013) World Journal of Gastroenterology 19(31 ):5138-5143.
NV1020, un virus del herpes simple, que elimina la región de unión de las regiones larga (L) y corta (S), que incluye una copia de ICP34.5, UL24 y UL56.34,35. La región eliminada se reemplazó por un fragmento de ADN de US de HSV-2 (US2, US3 (PK), gJ, y gG), véase Todo, et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:6396-6401.
M032, un virus del herpes simple con deleción de ambas copias de los genes ICP34.5 e inserción de interleucina 12, véase Cassady y Ness Parker, (2010) The Open Virology Journal 4: 103-108.
El talimogén laherparepvec, derivado de una cepa clínica, cepa JS1 de HSV-1, depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECAAC) con el número de acceso 01010209. En el talimogén laherparepvec, los genes virales de HSV-1 que codifican ICP34.5 e ICP47 han sido eliminado funcionalmente. La eliminación funcional de ICP47 conduce a una expresión más temprana de US11, un gen que promueve el crecimiento del virus en las células tumorales sin disminuir la selectividad tumoral. La secuencia de codificación para GM-CSF humano se ha insertado en el genoma viral, véase Liu et al., Gene Ther 10: 292-303,2003.
ImmunoVEX HSV2 es un virus del herpes simple (HSV-2) que tiene deleciones funcionales de los genes que codifican vhs, ICP47, ICP34.5, UL43 y US5.
OncoVEXGALV/CD, también deriva de la cepa JS1 del HSV-1, habiéndose eliminado funcionalmente los genes que codifican ICP34.5 e ICP47, e insertando en el genoma viral el gen que codifica la citosina desaminasa y la glicoproteína fusogénica de la leucemia del simio gibón en lugar de los genes ICP34.5.
Ejemplos adicionales de virus del herpes simple modificados incluyen NSC-733972, HF-10, BV-2711, JX-594, Myb34.5, AE-618, Brainwel™, y Heapwel™.
Las cepas del virus del herpes, y cómo obtener tales cepas, también se describen en las patentes US números US5824318; US6764675; US6,770,274; US7,063,835; US7,223,593; US7749745; US7744899; US8273568; US8420071; US8470577; Publicación de la WIPO números: WO199600007; WO199639841; WO199907394; WO200054795; WO2006002394; WO201306795; números de patentes chinas: CN128303, CN10230334 y CN 10230335; Varghese y Rabkin, (2002) Cancer Gene Therapy 9:967-97 y Cassady y Ness Parker, (2010) The Open Virology Journal 4:103-108.
Los virus del herpes simple de la invención también pueden comprender uno o más genes heterólogos. Gen heterólogo se refiere a un gen que se introduce en el genoma de un virus, en el que ese gen normalmente no se encuentra en el genoma del virus o es un homólogo de un gen expresado en el virus de una especie diferente que tiene una secuencia de ácido nucleico diferente y actúa a través de un mecanismo bioquímico diferente Los genes heterólogos pueden codificar una o más proteínas, por ejemplo una citotoxina, una proteína inmunomoduladora (es decir, una proteína que aumenta o suprime la respuesta inmunitaria del hospedante a un antígeno), un antígeno tumoral, un profármaco activador, un supresor de tumores, una enzima convertidora de profármacos, proteínas capaces de provocar la fusión entre células, inhibidor de TAP, una molécula de ARN antisentido, o una ribozima. Los ejemplos de proteínas inmunomoduladoras incluyen, por ejemplo, citocinas. Las citocinas incluyen interleucinas, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-20; interferones a, p o y, factor alfa de necrosis tumoral (TNFα), CD40L, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), y factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), quimiocinas (tales como la proteína activadora de neutrófilos (NAP), el factor activador y quimioatrayente de macrófagos (MCAF), RANTES, y los péptidos inflamatorios de macrófagos MIP-1a y MIP-1 b), componentes del complemento y sus receptores, moléculas accesorias del sistema inmunitario (por ejemplo, B7.1 y B7.2), moléculas de adhesión (por ejemplo, ICAM-1,2, y 3), y moléculas receptoras de adhesión. Los antígenos tumorales incluyen los
antígenos E6 y E7 del virus del papiloma humano, proteínas derivadas de EBV, mucinas, tal como MUC1, tirosinasa de melanoma, y MZ2-E. Los activadores de profármacos incluyen nitroeductasa y citocromo p450, los supresores de tumores incluyen p53. Las enzimas convertidoras de profármacos incluyen citosina desaminasa. Las proteínas capaces de provocar la fusión entre células incluyen la glicoproteína fusogénica de la leucemia del simio gibón. Los inhibidores de TAP incluyen el polipéptido UL49.5 del herpesvirus bovino (BHV). Moléculas de ARN antisentido que pueden usarse para bloquear la expresión de un ARNm celular o patógeno. Moléculas de ARN que pueden ser una ribozima (por ejemplo, una ribozima con forma de cabeza de martillo o a base de horquilla) diseñada para reparar un ARN celular defectuoso, o para destruir un ARN no deseado celular o codificado por un patógeno.
También se incluye la inserción de múltiples genes virales en el genoma del herpes simple, tal como la inserción de una o más copias del gen que codifica la proteína viral Us 11.
Las composiciones de virus vivos de la invención pueden usarse en un método de tratamiento de seres humanos o animales. En particular, las composiciones de virus vivos de la invención pueden usarse en métodos de terapia del cáncer.
Las composiciones de virus vivos de la invención se pueden usar para tratar varios tumores y cánceres. La descripción también proporciona un método para tratar un tumor en un paciente que lo necesite, administrando a dicho individuo una cantidad eficaz de una composición de virus vivos. Como se usa aquí, los términos "paciente" o "sujeto" se usan indistintamente, y significan un mamífero, que incluye, pero no se limita a, un mamífero humano o no humano, tal como un bovino, equino, canino, ovino, o felino. Preferiblemente, el paciente es un ser humano.
Las composiciones de virus vivos de la invención pueden usarse en el tratamiento terapéutico de cualquier tumor sólido en un paciente. Por ejemplo, las composiciones de virus vivos de la invención se pueden administrar a un paciente con carcinoma de próstata, mama, pulmón, hígado, células renales, endometrio, vejiga, colon o cuello uterino; adenocarcinoma; melanoma; linfoma; glioma; sarcomas, tales como sarcomas de tejidos blandos y óseos; o cáncer de cabeza y cuello, y, preferiblemente, cáncer de vejiga.
Las composiciones de virus vivos de la invención se pueden usar para tratar el cáncer en un paciente, incluidos todos los tipos de cáncer, neoplasias o tumores malignos, incluyendo leucemia, carcinomas y sarcomas. Los cánceres ejemplares incluyen cáncer de mama, cerebro, cuello uterino, colon, cabeza y cuello, hígado, riñón, pulmón, pulmón no microcítico, melanoma, mesotelioma, ovario, sarcoma, estómago, útero y meduloblastoma. Además, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de ovario, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores cerebrales primarios, insulanoma pancreático maligno, carcinoide maligno, cáncer de vejiga urinaria, lesiones cutáneas premalignas, cáncer testicular, linfomas, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de esófago, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer de endometrio, cáncer de la corteza suprarrenal, neoplasias del páncreas endocrino y exocrino, y cáncer de próstata.
Las composiciones de virus vivos descritas aquí son útiles para exterminar células tumorales seleccionadas del grupo que consiste en astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblastoma, ependimoma, schwannoma, neurofibrosarcoma, meduloblastoma, células de melanoma, células de cáncer de páncreas, células de carcinoma de próstata, células de cáncer de mama, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de colon, células de hepatoma, mesotelioma, y células de carcinoma epidermoide.
Las composiciones de virus vivos de la invención también se pueden usar en combinación con otras modalidades de tratamiento, que incluyen, sin limitación, radiación, quimioterapia, termoterapia, proteínas terapéuticas, y cirugía. La composición de virus vivos puede administrarse antes, simultáneamente o después de las otras modalidades de tratamiento.
Las proteínas terapéuticas incluyen inhibidores de puntos de control inmunitarios. Como se usa aquí, la expresión "inhibidor de puntos de control inmunitario" se refiere a moléculas que reducen, inhiben, interfieren con, o modulan, total o parcialmente, una o más proteínas del punto de control.
Las proteínas del punto de control regulan la activación o función de las células T. Se conocen numerosas proteínas del punto de control, tales como CTLA-4 y sus ligandos CD80 y CD86; y PD1 con sus ligandos PDL1 y PDL2. Estas proteínas son responsables de las interacciones inhibidoras o coestimuladoras de las respuestas de las células T. Las proteínas del punto de control inmunitario regulan y mantienen la autotolerancia y la duración y amplitud de las respuestas inmunitarias fisiológicas. Los inhibidores de puntos de control inmunitario incluyen anticuerpos, o derivan de anticuerpos.
Los inhibidores de puntos de control incluyen inhibidores del antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). Los inhibidores de CTLA-4 incluyen tremelimumab, ipilimumab (también conocido como 10D1, MDX-D010) y comercializado con el nombre Yervoy™, y anticuerpos anti-CTLA-4 descritos en las patentes US núms.: 5,811,097; 5,811,097; 5,855,887; 6,051,227; 6,207,157; 6,682,736; 6,984,720; y 7,605,238.
Otras proteínas del punto de control inmunitario incluyen la muerte celular programada 1 (PD-1) y los ligandos de muerte celular programada 1 y 2 (PDL1) (PDL2). Los ejemplos de moléculas que inhiben PD1 y PDL1 y PDL2 incluyen nivolumab (MDX 1106, BMS 936558, ONO 4538), un anticuerpo IgG4 completamente humano que se une y bloquea la activación de PD-1 por sus ligandos PD-L1 y PD-L2; pembrolizumab (lambrolizumab, MK-3475 o SCH 900475), comercializado como KeytrudaTM; MPDL3280A, un anticuerpo anti-PDL1 diseñado mediante ingeniería (atezolizumab); CT-011; AMP-224; BMS-936559 (m Dx -1105-01 , y los descritos en las patentes US núms.7,488,802; 7,943,743; 8,008,449; 8,168,757; 8,217,149, y las Solicitudes de Patente Publicadas PCT núms.: WO03042402, WO2008156712, WO2010089411, WO2010036959, WO2011066342, WO2011159877, WO2011082400, y WO2011161699.
Otros inhibidores de los puntos de control inmunitario incluyen inhibidores del gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), tal como IMP321, una proteína de fusión de Ig soluble; inhibidores de B7, tal como el anticuerpo anti-B7-H3 MGA271. También se incluyen inhibidores de TIM3 (dominio de inmunoglobulina de células T y dominio de mucina 3).
Los médicos pueden administrar composiciones de virus vivos hasta alcanzar una dosis que logre el efecto deseado. Por lo tanto, la composición se puede administrar como una dosis única, o como dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) a lo largo del tiempo, mediante inyección directa u otro método de administración adecuado. Las composiciones de vacunas vivas de la invención se pueden administrar, por ejemplo, una o más de una vez, por ejemplo, a intervalos regulares durante un período de tiempo. En general, las composiciones de virus vivos de la invención pueden administrarse hasta que el paciente manifieste un grado de mejora médicamente relevante con respecto al valor inicial para el indicador o indicadores escogidos.
En una realización, la composición de vacuna viva comprende el talimogén laherparepvec. La composición se administra por inyección intratumoral en tumores cutáneos, subcutáneos y ganglionares inyectables, a una dosis de hasta 4,0 ml de 106 unidades formadoras de placas/ml (PFU/ml) en el día 1 de la semana 1, seguido de una dosis de hasta 4,0 ml de 1,08 UFP/ml en el día 1 de la semana 4, y cada 2 semanas (± 3 días) a partir de entonces. El volumen recomendado del talimogén laherparepvec para inyectar en el o los tumores depende del tamaño del tumor o tumores. Todas las lesiones razonablemente inyectables (enfermedades cutáneas, subcutáneas y ganglionares que pueden inyectarse con o sin guía por ultrasonidos) deben inyectarse con el volumen de dosificación máximo disponible en una ocasión de dosificación individual. En cada día de tratamiento, se recomienda priorizar las inyecciones de la siguiente manera: cualquier nuevo tumor inyectable que haya aparecido desde la última inyección; por el tamaño del tumor, comenzando con el tumor más grande; cualquier tumor o tumores previamente no inyectables que ahora sean inyectables.
A menos que se defina de otro modo aquí, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos normales en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas aquí son bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente invención se llevan a cabo generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Se desarrolló una formulación que contiene gelatina porcina parcialmente hidrolizada (phGelatin) para uso con virus oncolíticos. Esta formulación protege a los virus oncolíticos contra la pérdida de infectividad durante el almacenamiento a largo plazo en condiciones de congelación, múltiples ciclos de congelación/descongelación, y almacenamiento líquido a 2-8°C y 25°C. Además, la formulación redujo la formación de partículas tanto visibles como subvisibles en comparación con una formulación sin phGelatin. Esta formulación ofrece ventajas sobre una formulación sin phGelatin durante la fabricación, el envasado y el etiquetado, y aumenta en gran medida la comodidad y la flexibilidad para el proveedor de atención médica.
Preparación de las muestras
En este ejemplo, el virus oncolítico del herpes simple (HSV-1) talimogén laherparepvec (Lui et al., (2003) Gene Therapy, 10:292-303) se usó en concentraciones de 106 UFP/ml y 108 UFP/ml. Para la concentración de virus a 108 UFP/ml, las muestras se prepararon mediante adición de disoluciones madre concentradas de excipientes (es decir, 10-20% p/v de phGelatin o HSA recombinante) en un volumen que logró las concentraciones finales de excipientes deseadas. Para concentraciones oncolíticas de HSV-1 a 106 UFP/ml, las muestras se prepararon por simple dilución del material de 108 PFU/ml en el amortiguador deseado. Para concentraciones oncolíticas de HSV-1 a 108 UFP/ml, las muestras se prepararon mediante adición de disoluciones madre concentradas de excipientes y amortiguador a una disolución concentrada de HSV-1 oncolítico. Las muestras se almacenaron en viales de resina Crystal Zenith de 2 cc listos para
uso (West Pharmaceuticals Inc. Exton. PA) con tapón de elastómero de clorobutilo revestido FluoroTec® (West) cierres Flip-off® TruEdge® (West).
Ensayo en placas
La cantidad de HSV-1 oncolítico infeccioso se cuantificó valorando las muestras de ensayo en células indicadoras susceptibles, observando el efecto citopático (CPE) y contando las unidades formadoras de placas (PFU) subsiguientes (límite de detección >2,08 Log10 PFU/ml).
Brevemente, células BHK (riñón de cría de hámster; ATCC, Manassas, VA) se propagaron en DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado con L-glutamina (Life Technologies, Carlsbad, CA), suero bovino fetal al 10% (Thermo-Fisher, Waltham, MA) y los antibióticos estreptomicina y penicilina (Life Technologies, Carlsbad, CA). Las células BHK se sembraron en placas de 12 pocillos un día antes del ensayo. Las muestras de ensayo se diluyeron en serie, y se usaron para la infección de la monocapa. Después de un período de incubación inicial para permitir la adsorción del virus, las células se cubrieron con un medio de recubrimiento que contenía carboximetilcelulosa (CMC) y medio de crecimiento, y se incubaron durante 72 horas a 37°C y 5% de CO2. Posteriormente, las células se fijaron usando una disolución de glutaraldehído al 0,01% (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) después de aspirar el inóculo y lavar con PBS. A continuación, las células se tiñeron usando una disolución de cristal violeta al 2% (Sigma-Aldrich) para visualizar las placas. Para determinar el título viral, se contaron las placas formadas para cada dilución de la muestra de ensayo, y el título final se determinó (Log10 UFP/ml) a partir del promedio de los duplicados ensayados.
Análisis de partículas subvisibles
Las partículas subvisibles se monitorizaron mediante dos técnicas: oscurecimiento de la luz (HIAC) e imágenes de microflujo (MFI).
HIAC
Las partículas subvisibles se monitorizaron mediante oscurecimiento de la luz usando un contador de partículas Ryco HIAC (Beckman Coulter, Brea, CA). Se analizó un control de recuento de partículas estándar de 15 micrómetros (Duke Scientific, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) antes de analizar las muestras. Se llevaron a cabo recuentos de partículas subvisibles uando cuatro inyecciones de 0,2 ml. Las últimas tres lecturas se promediaron y se dieron a conocer como recuentos acumulativos por ml.
MFI
El análisis de partículas subvisibles se llevó a cabo en un instrumento de formación de imágenes de microflujo (MFI) (4200 Protein Simple, Santa Clara, CA) equipado con una celda de flujo recubierta de silano de 100 μm. Antes de cada medida, se hizo pasar agua a través del sistema, para optimizar la iluminación y proporcionar una línea de base limpia. Para cada muestra, se bombeó un total de 1 ml a través de la celda a un caudal de 0,2 ml/min. Los primeros 0,35 ml se usaron para purgar la celda de flujo, y se analizaron los 0,65 ml restantes. Se informó el número total de partículas > 2 μm.
Estabilidad de congelación y descongelación
Se seleccionaron múltiples factores mediante ensayo de la infectividad del virus después de 1 y 5 ciclos de congelación/descongelación.
Amortiguadores y sales
Se sabe que el fosfato de sodio cristaliza en estado congelado, lo que provoca caídas significativas en el pH en estado congelado. El fosfato de potasio, por otro lado, no cristaliza.
La formulación: sorbitol al 2% (p/v), mioinositol al 4% (p/v), NaCl 145 mM y fosfato sódico 100 mM, pH 7,4, sirvió como control. La formulación de control se modificó de manera que la concentración de fosfato de sodio se redujo de 100 mM a 10 mM, o se sustituyó por fosfato de potasio 10 o 100 mM. También se ensayaron formulaciones en las que la concentración de NaCl se redujo a 73 mM o se eliminó por completo; véase la Tabla 1.
Tabla 1.
Las muestras se prepararon a 106 UFP/ml. La infectividad (Título) se determinó mediante ensayo en placas como se describe anteriormente. Las muestras se congelaron a -70°C durante al menos 1 día, y después se descongelaron a temperatura ambiente durante no más de 2 horas. Las muestras descongeladas se congelaron nuevamente a -70°C durante al menos 1 día, y después se descongelaron a temperatura ambiente durante no más de 2 horas, para cada ciclo de congelación/descongelación posterior (1 o 5 ciclos en total).
Con la reducción de fosfato de sodio o la sustitución de fosfato de potasio, todavía se observaron pérdidas en la infectividad después de los ciclos de congelación/descongelación, ninguno de los cuales se consideró que proporcionara ninguna ventaja sobre el control. De manera similar, la reducción de la concentración de NaCl no tuvo efecto sobre la estabilidad del virus durante los ciclos de congelación/descongelación en comparación con el control. (Fig. 1).
Azúcares
Los azúcares se usan comúnmente como excipientes crioprotectores, por lo que se evaluaron diferentes azúcares en un intervalo de concentraciones para determinar su efecto sobre la estabilidad del HSV-1 oncolítico durante los ciclos de congelación/descongelación.
La formulación de control se modificó de manera que se eliminó el mioinositol y se aumentó el sorbitol al 9% o al 15% (p/v). En un segundo grupo de muestras, la formulación de control se modificó de manera que tanto el mioinositol como el sorbitol se eliminaron y se reemplazaron por trehalosa al 9% o al 15% (p/v) o sacarosa al 9 o 15% (p/v); véase la Tabla 2.
Tabla 2
Las muestras se prepararon a 106 UFP/ml. Las muestras se sometieron a 1 o 5 ciclos de congelación y descongelación como se describe anteriormente. La infectividad (Título) se determinó mediante ensayo en placas.
Las formulaciones con sorbitol al 9% y al 15% produjeron un aumento significativo sobre la estabilidad del HSV-1 oncolítico, sin cambios en la infectividad después de 5 ciclos de congelación/descongelación. De manera similar, las formulaciones con sacarosa al 1,5% y trehalosa al 9% y al 15% proporcionaron protección contra el estrés por congelación/descongelación. La formulación con sacarosa al 9% no proporcionó protección contra el estrés por congelación/descongelación. (Fig. 2A y Fig. 2B).
Azúcares y proteínas
A continuación, se ensayaron combinaciones de alto contenido de azúcar y proteínas estabilizadoras para determinar su efecto sobre la estabilidad del HSV-1 oncolítico durante la congelación/descongelación. La formulación de control se modificó de manera que se eliminaron el mioinositol y el sorbitol y se reemplazaron por sacarosa al 9% (p/v) y mAb antiestreptavidina al 2% (p/v) (producido internamente) o gelatina parcialmente hidrolizada porcina al 2% (phGelatin) (p/v) (Gelita, Sargento Bluff, IA). En un segundo conjunto de experimentos, la formulación de control se mantuvo con la adición de phGelatin al 4% (p/v) o seroalbúmina humana recombinante al 4% (rHSA) (Novozymes, Franklinton, NC) (p/v); véase la Tabla 3.
Las muestras se prepararon a 106 UFP/ml. Las muestras se sometieron a 1 o 5 ciclos de congelación y descongelación. La infectividad (Título) se determinó mediante ensayo en placas.
Tabla 3
La adición de las proteínas estabilizadoras rHSA, phGelatin, o mAb anti-estreptavidina protegió contra el estrés por congelación/descongelación, sin pérdida de infectividad después de 5 ciclos de congelación/descongelación. phGelatin fue igualmente eficaz en la protección contra el estrés por congelación/descongelación en presencia de sacarosa al 9% (p/v) o la combinación de control de sorbitol al 2% (p/v) y mioinositol al 4% (p/v). Véase la Fig. 3.
La estabilidad a la congelación/descongelación se mejoró aumentando el contenido de azúcar o mediante la adición de una proteína estabilizadora. El HSV-1 oncolítico soportó 5 ciclos de congelación/descongelación sin pérdida de infectividad en todas las formulaciones ensayadas, lo que demuestra que tres proteínas muy diferentes pueden proporcionar protección contra el estrés por congelación/descongelación. De las tres proteínas, rHSA y phGelatin proporcionaron la mejor estabilidad, y dado que se aprobaron para uso en formulaciones terapéuticas, se escogieron para estudios adicionales.
Almacenamiento líquido
Los azúcares y las proteínas que protegían contra el estrés por congelación/descongelación se evaluaron para determinar su efecto sobre la estabilidad líquida del HSV-1 oncolítico a 2-82C y 25°C. En un conjunto de experimentos, la formulación de control se modificó de modo que el sorbitol y el mioinositol se reemplazaron por trehalosa al 15%, sacarosa al 15% o sorbitol al 9% y HSAr al 2%. En otro conjunto de experimentos, la formulación de control se mantuvo con la adición de rHSA al 2% o phGelatin al 2%; véase la Tabla 4.
Tabla 4
Las muestras se prepararon por dilución hasta 106 UFP/ml en las formulaciones de ensayo, se congelaron a -70°C durante al menos 1 día, y después se almacenaron a 2-8°C o a 25°C. Como el HSV-1 oncolítico muestra una estabilidad reducida a temperaturas más altas, las muestras se mantuvieron a 2-8°C durante 14 días, y a 25°C durante 3 días, para detectar una diferencia entre las formulaciones. La infectividad (Título) se determinó mediante ensayo en placas.
Reemplazar el sorbitol y el mioinositol por trehalosa al 15% no estabilizó el HSV-1 oncolítico durante el almacenamiento líquido a 2-8°C o 25°C. La sustitución por sacarosa al 15% produjo resultados inconsistentes, observándose cierta estabilización a 25°C, pero no a 2-8°C. Por el contrario, la adición de rHSA al 2% o phGelatin al 2% proporcionó una buena estabilidad durante el almacenamiento líquido a ambas temperaturas, en presencia de sorbitol al 2% mioinositol al 4% o sacarosa al 9%, véanse las Figs. 4A y 4B.
En conclusión, la adición de una proteína estabilizadora (phGelatin o rHSA) mejoró la estabilidad durante la congelación/descongelación y el almacenamiento líquido. La modificación del contenido de azúcar proporcionó estabilidad adicional durante la congelación/descongelación, pero tuvo un efecto relativamente pequeño durante el almacenamiento líquido. Por lo tanto, los esfuerzos adicionales se centraron en el efecto de diferentes niveles y tipos de proteínas estabilizadoras.
Ejemplo 2
Concentración de proteína
La combinación de congelación/descongelación mejorada y estabilidad líquida proporcionaría una ventaja sustancial para la fabricación, el envasado y el etiquetado. La capacidad de almacenar a 2-82C proporcionaría una gran flexibilidad y comodidad a los proveedores de atención médica.
La formulación de control se mantuvo con la adición de phGelatin al 1%, 2% o 4%, o rHSA al 1%, 2% o 4%. Las muestras se prepararon a 106 UFP/ml. La infectividad (Título) se determinó mediante ensayo en placas como se describe anteriormente. Las muestras se sometieron a 5 ciclos de congelación/descongelación como se describe anteriormente.
Se varió la concentración de rHSA y phGelatin para determinar el efecto de la concentración de proteína sobre la estabilidad del HSV-1 oncolítico. Tanto la phGelatin como la rHSA proporcionaron protección durante los ciclos de congelación/descongelación en todo el intervalo ensayado; véase la Fig. 5.
A continuación, se ensayó el efecto de concentraciones variables de proteína sobre la estabilidad líquida del HSV-1 oncolítico a 2-8°C y 25°C. La formulación de control se mantuvo con la adición de phGelatin al 1%, 2% o 4%, o rhHSA al 1%, 2% o 4%. Las muestras se prepararon a 106 UFP/ml, y se congelaron a -70°C durante al menos 1 día (precongelación), y después se almacenaron a 2-8°C y 25°C. La infectividad (título) se determinó mediante ensayo en placas.
Las formulaciones de phGelatin funcionaron mucho mejor durante el almacenamiento líquido, sin pérdida de actividad después de 3 días a 25°C. Por el contrario, todas las formulaciones que contenían rHSA mostraron pérdidas en la infectividad durante el mismo período. Además, las formulaciones que contenían rHSA en realidad se comportaron peor a 25°C a medida que aumentaba la concentración de rHSA. Se observó un pequeño cambio en la infectividad a 2-8°C durante este período de tiempo; véanse la Fig. 6A y la Fig. 6B.
Grado de rHSA
Para determinar por qué las formulaciones con cantidades crecientes de rHSA produjeron peor estabilidad que cantidades similares de phGelatin, se examinó la propia rHSA. Se planteó la hipótesis de que el resultado podría deberse a los componentes de la rHSA, tal como un contaminante o un compuesto añadido para estabilizar la rHSA. Alternativamente, el resultado podría deberse a un efecto de la propia rHSA.
Se ensayaron cuatro grados diferentes de rHSA para determinar su capacidad para estabilizar el HSV-1 oncolítico durante el almacenamiento líquido a 25°C. La formulación de control se mantuvo con la adición de rHSA Sigma al 2%, Novozyme Alpha al 1%, 2% o 4%, Novozyme Albix al 1%, 2% o 4%, o Novozyme Prime al 1%, 2% o 4%. Además, la formulación de control también se preparó con la adición de phGelatin al 2%; véase la Tabla 5. Se ensayó la estabilidad líquida de las formulaciones a 25°C durante 2 semanas como se describe anteriormente.
Tabla 5
Cada grado de rHSA tenía diferentes niveles de pureza y otros componentes destinados a estabilizar la rHSA. El material de Sigma era de grado de investigación, y tenía el efecto estabilizador más bajo. Los tres grados de Novozymes (Alpha, Abix y Prime) tenían una pureza significativamente mayor, pero cada uno tenía diferentes niveles de otros componentes. Los grados de rHSA de Novozyme proporcionaron mayor estabilidad que el grado de Sigma, pero no hubo diferencia entre los rHSA de Novozyme. Además, las tres rHSA de Novozyme mostraron una peor
estabilidad cuando se añadieron a concentraciones crecientes. Finalmente, ningún grado de rHSA funcionó tan bien como phGelatin; véase la Fig. 7A-7D.
Límite inferior de proteína
Se llevaron a cabo exámenes adicionales para determinar la cantidad mínima de rHSA y phGelatin necesaria para estabilizar las concentraciones de 106 y 108 UFP/ml de VHS-1 oncolítico.
La formulación de control se mantuvo con la adición de phGelatin al 0,25%, 0,5% y 1% p/v, y rHSA al 0,25%, 0,5% y 1% p/v (Novozyme Prime). Las muestras se prepararon con concentraciones de HSV-1 oncolítico de 106 y 108 UFP/ml. Un conjunto de muestras se sometió a 5 ciclos de congelación/descongelación como se describe anteriormente. Se analizó la estabilidad líquida de dos conjuntos de muestras, uno a 2-82C durante cuatro semanas y otro a 25°C durante 2 semanas, como se describe anteriormente. La infectividad (Título) se determinó mediante ensayo en placas. phGelatin brindó protección en todo el intervalo ensayado, 0,25%-1% p/v, durante los ciclos de congelación/descongelación y almacenamiento líquido a 2-8°C y 25°C (Fig. 8A-8F) a las concentraciones de virus tanto a 106 como a 108 UFP/ml. Todas las formulaciones que contenían rHSA mostraron pérdidas en la infectividad durante el almacenamiento líquido a 2-8°C y 25°C en todo el intervalo de concentraciones de proteína ensayadas a las concentraciones de virus tanto a 106 como a 108 UFP/ml, pero no se observó pérdida de infectividad durante los ciclos de congelación y descongelación (Fig. 9A-9F).
Se realizó un examen adicional en el que se ensayó phGelatin a niveles más bajos. La formulación de control se mantuvo con la adición de 0,01% - 0,5% (p/v) de phGelatin. Las muestras se prepararon con concentraciones de HSV-1 oncolítico de 106 y 108PFU/ml, y se ensayaron para determinar la estabilidad líquida a 2-8°C y 25°C, como se describe anteriormente. La infectividad (Título) se determinó mediante ensayo en placas. phGelatin proporcionó protección durante el almacenamiento líquido en todo el intervalo de concentraciones de proteína ensayadas (0,01% - 0,5%); véanse las Fig. 8G y 8H.
Estabilidad a largo plazo
Se realizó un estudio a largo plazo para determinar la estabilidad de las formulaciones que contienen proteínas en comparación con la formulación de control. El HSV-1 oncolítico se formuló a 106 UFP/ml y 108 UFP/ml en la formulación de control, o con la formulación de control que contiene 0,5% (p/v) de rHSA o phGelatin. Las muestras se evaluaron durante el almacenamiento líquido a 2-8°C y 25°C como se describe anteriormente; almacenamiento congelado a -30°C y -70°C y durante 10 ciclos de congelación y descongelación, como se describe anteriormente. La infectividad (Título) se determinó mediante ensayo en placas como se describe anteriormente.
Las formulaciones que contenían phGelatin nuevamente proporcionaron una estabilidad superior para todas las condiciones de almacenamiento evaluadas. Las formulaciones que contenían rHSA proporcionaron una estabilidad similar (dentro del error del ensayo) sólo para aquellas formulaciones almacenadas en estado congelado a -30°C (Figs.
10A y 10B) y -70°C (Figs. 10C y 10D) y cuando se sometieron a 10 ciclos de congelación y descongelación (Figs. 10E y 10F). Sin embargo, para el almacenamiento en estado líquido, las formulaciones de phGelatin mostraron el mayor efecto estabilizador, que fue más evidente cuando la concentración de HSV-1 oncolítico a 106 UFP/ml se almacenó a 2-8°C (Figs. 10G y 10H) y 25°C (Figs. 101 y 10J). Después de 39 semanas de almacenamiento a 2-8°C, la formulación que contenía phGelatin mostró una pérdida de 1,7 logs, mientras que la formulación que contenía rHSA mostró una pérdida de 2,9 logs. La formulación de control perdió toda actividad después de 12 semanas de almacenamiento a 2-8°C. Durante 4 semanas de almacenamiento a 25°C, la formulación que contenía phGelatin mostró una pérdida de 2,3 logs, mientras que la formulación que contenía rHSA mostró una pérdida de 3,6 logs. La formulación de control perdió toda actividad después de 2 semanas de almacenamiento a 25°C.
Estudio de partículas de las formulaciones
El HSV-1 oncolítico se formuló mediante la adición de rHSA o phGelatin al 20% (p/v) (o un volumen equivalente de amortiguador de formulación de control) hasta una concentración final de 108 UFP/ml de virus y 0,5% de proteína estabilizadora. Después, las disoluciones se hicieron pasar a través de un filtro de 0,22 gm (SterivexTM EMD Millipore, Billerica, MA) usando una jeringa desechable sin aceite de silicona (NORM-JECT® Luer Slip Centric Ti, Bellefonte, PA), para generar un material de partida libre de partículas.
Un conjunto de muestras se almacenó a 2-8°C, como se describe anteriormente (estático), y un segundo conjunto de muestras se congeló a -70°C y después se almacenó a 2-8°C (1 ciclo de congelación y descongelación).
Las partículas se midieron mediante análisis subvisible u observación visual.
Las formulaciones que contienen 0,5% (p/v) de rHSA o phGelatin mostraron una formación de partículas reducida en comparación con la formulación de control, según lo medido por técnicas de análisis subvisible (Fig. 11A-11B y 12A12B). Además, el HSV-1 oncolítico a una concentración de 108 UFP/ml formó partículas visibles en la formulación de control, pero no en las formulaciones que contenían 0,5% de phGelatin o rHSA.
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Claims (12)
1.Una composición de virus vivos que comprende un virus del herpes simple, una proteína, al menos un azúcar, cloruro de sodio y fosfato de sodio, en la que la composición tiene un pH de 7,4,
en la que la composición está congelada,
la proteína es gelatina parcialmente hidrolizada a una concentración de 0,5% (p/v), y
el al menos un azúcar es sorbitol a una concentración de 2% (p/v).
2. La composición de virus vivos según la reivindicación 1, en la que la composición se puede descongelar y almacenar a 2°C hasta al menos 25°C.
3. La composición de virus vivos según la reivindicación 2, en la que después de la descongelación, la composición de virus vivos se vuelve a congelar y se almacena a una temperatura de al menos -30°C.
4. La composición de virus vivos según la reivindicación 1, en la que la composición se puede descongelar y almacenar a 2°C hasta 8°C.
5. El virus vivo según la reivindicación 4, en el que después de la descongelación, la composición de virus vivos se vuelve a congelar y se almacena a una temperatura de al menos -30°C.
6. La composición de virus vivos según la reivindicación 1, en la que el virus del herpes simple es el virus del herpes simple 1, la concentración de cloruro de sodio es 145, la concentración de fosfato de sodio es 102, y la gelatina parcialmente hidrolizada es porcina.
7. La composición de virus vivos según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la infectividad aumenta en comparación con la misma composición de virus vivos que carece de la proteína.
8. La composición de virus vivos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en la que el virus del herpes simple se selecciona del grupo que consiste en HSV1716, G207, OrienX010, NV1020, M032, ImmunoVEX y OncoVEXGALV/CD.
9. La composición de virus vivos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en la que el virus del herpes simple es el talimogén laherparepvec.
10. Una composición de virus vivos según las reivindicaciones 8 o 9, para uso en el tratamiento del cáncer.
11. La composición de virus vivos para uso según la reivindicación 10, en la que la composición de virus vivos se administra en combinación con una proteína terapéutica, en la que la proteína terapéutica es un inhibidor de puntos de control.
12. La composición de virus vivos para uso según las reivindicaciones 10 u 11, en la que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cerebro, cuello uterino, colon, cabeza y cuello, hígado, riñón, pulmón, pulmón no microcítico, melanoma, mesotelioma, ovario, sarcoma, estómago, útero y meduloblastoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de ovario, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores cerebrales primarios, insulanoma pancreático maligno, carcinoide maligno, cáncer de vejiga urinaria, lesiones cutáneas premalignas, cáncer testicular, linfomas, cáncer de tiroides, cáncer de esófago, cáncer del tracto genitourinario, cáncer de endometrio con hipercalcemia maligna, cáncer de la corteza suprarrenal, neoplasias del páncreas endocrino y exocrino, y cáncer de próstata.
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