ES2949060T3 - Mejora de la potencia y amplitud de anticuerpos neutralizantes del VIH-1 mediante el anclaje de receptores celulares utilizando anticuerpos biespecíficos con arquitectura nativa - Google Patents

Mejora de la potencia y amplitud de anticuerpos neutralizantes del VIH-1 mediante el anclaje de receptores celulares utilizando anticuerpos biespecíficos con arquitectura nativa Download PDF

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Abstract

En diversas realizaciones, la presente invención se refiere en general al uso de anticuerpos biespecíficos en la prevención y el tratamiento del VIH. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Mejora de la potencia y amplitud de anticuerpos neutralizantes del VIH-1 mediante el anclaje de receptores celulares utilizando anticuerpos biespecíficos con arquitectura nativa
Campo de la invención
En diversas realizaciones, la presente invención se refiere en general a anticuerpos biespecíficos para su uso en la prevención y el tratamiento del VIH.
Antecedentes
La inmunización pasiva con anticuerpos (Ab) es un método reconocido de profilaxis y tratamiento de enfermedades infecciosas. Este enfoque puede implicar la preparación de inmunoglobulinas humanas a partir de donantes que se hayan recuperado de una enfermedad infecciosa y la utilización de dichas preparaciones, que contienen Ab específicos para el organismo infeccioso, para proteger a un receptor frente a la misma enfermedad. Como alternativa, pueden prepararse anticuerpos terapéuticos inmunizando ratones con un antígeno y, a continuación, modificando/humanizando el Ab de ratón para convertirlo en una versión humana. Los anticuerpos monoclonales (mAb) son homogéneos en cuanto a características físicas y reactividad inmunoquímica, por lo que ofrecen la posibilidad de una actividad específica absoluta.
Esa especificidad puede ser, en última instancia, una limitación para algunas dianas, por lo que los profesionales han desarrollado mAb "biespecíficos" compuestos por fragmentos de dos mAb diferentes y que se unen a dos tipos distintos de antígeno. Esto facilita la unión a antígenos expresados débilmente, por ejemplo. Algunos mAb biespecíficos pueden estimular fuertes respuestas inmunitarias, lo que limita su aplicación clínica. Un enfoque reciente para paliar este efecto es la metodología "CrossMab", un formato de anticuerpo biespecífico que adopta una estructura más similar a la de un anticuerpo nativo.
Las perspectivas de generar un anticuerpo biespecífico o bivalente altamente potente contra un patógeno, tal como el VIH, para un uso clínico conllevan muchas incertidumbres. Por ejemplo, la baja densidad y estructura de las espículas en el VIH puede impedir la unión bivalente de los anticuerpos al VIH, y la geometría y relación espacial del anclaje en la superficie celular no están bien caracterizadas. Tampoco se sabe si existe suficiente accesibilidad al epítopo en la envoltura del VIH. Los anticuerpos biespecíficos CrossMab anclados a la membrana de una célula hospedadora ofrecen la posibilidad de mejorar la concentración local de anticuerpos, dirigir etapas de entrada secuenciales y/o interdependientes y compensar la unión monovalente.
Markowitz ("Setting the Stage: Long-acting agents for PrEP" 2013; www.adarc.org/ files/May_6_2013_Presentations/Markowitz.pdf) divulga un anticuerpo CrossMab para neutralizar el VIH que comprende porciones de los anticuerpos 10E8 e ibalizumab.
Sumario
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo biespecífico para neutralizar el VIH. El anticuerpo biespecífico incluye porciones de un primer y un segundo anticuerpo, en el que el primer anticuerpo se une a una proteína de la envoltura del VIH. El primer anticuerpo es 10E8. El anticuerpo biespecífico incluye porciones de un segundo anticuerpo, en el que el segundo anticuerpo se une a una proteína de la membrana celular. El segundo anticuerpo es ibalizumab. El anticuerpo biespecífico tiene un formato CrossMab.
En diversas realizaciones, también se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen los anticuerpos biespecíficos divulgados en el presente documento. La composición farmacéutica puede formularse para la administración oral, intranasal, pulmonar, intradérmica, transdérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa.
En otro aspecto, se proporcionan los anticuerpos biespecíficos divulgados en el presente documento para su uso en la neutralización del VIH. El uso incluye las etapas de poner en contacto un sitio de unión al antígeno con un anticuerpo biespecífico que se une a una proteína de la envoltura del VIH y poner en contacto otro sitio de unión al antígeno con un anticuerpo biespecífico que se une a una proteína de la membrana celular.
En otro aspecto, también se proporcionan los anticuerpos biespecíficos divulgados en el presente documento para su uso en el tratamiento de un paciente infectado por el VIH. El uso incluye administrar al paciente cualquiera de los anticuerpos biespecíficos o composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento. En una realización, el paciente es un ser humano.
Breve descripción de los dibujos
En los dibujos, los caracteres de referencia similares se refieren generalmente a las mismas partes en las diferentes vistas. Además, los dibujos no están necesariamente a escala, sino que se hace hincapié en ilustrar los principios de la invención. En la siguiente descripción, diversas realizaciones de la presente invención se describen con referencia a los siguientes dibujos, en los que:
La figura 1 es un diagrama que ilustra un anticuerpo CrossMab derivado de dos anticuerpos monoclonales IgG.
La figura 2A es un diagrama que ilustra un anticuerpo iMab (abreviatura del anticuerpo monoclonal ibalizumab) dirigido a CD4 y un anticuerpo Pro 140 dirigido a CCR5.
La figura 2B es un diagrama que ilustra los mAb dirigidos a gp120 de la envoltura del VIH.
La figura 3 es un gráfico en el que se compara el porcentaje máximo de inhibición (PMI) con la transmisión célula a célula del VIH utilizando una combinación de anticuerpos iMab y 10E8 con anticuerpos biespecíficos CrossMab 10E8/iMab. Salvo que se indique lo contrario, todos los anticuerpos biespecíficos basados en iMab se construyeron utilizando la variante MV1.
La figura 4 es una serie de gráficos que comparan la inhibición de diversas cepas de X4 y VIH de doble tropismo utilizando concentraciones variables de anticuerpos 10E8, Pro 140 o 10E8/P140. P140 es la abreviatura de Pro 140.
La figura 5 es una serie de gráficos que comparan la inhibición de diversas cepas del VIH utilizando concentraciones variables de 10E8, Pro 140, 10E8/P140 o una combinación de los anticuerpos monoclonales 10E8 y Pro 140 individuales.
La figura 6 es una serie de gráficos que comparan la inhibición de diversas cepas del VIH utilizando concentraciones variables de anticuerpos 10E8, X19, 10E8/X19 o 10E8/P140.
La figura 7 es una serie de gráficos que comparan la inhibición de diversas cepas del VIH utilizando concentraciones variables de anticuerpos 10E8, Pro 140, 10E8/P140 y 10E8/aHer2.
La figura 8A es un gráfico que compara la unión de los anticuerpos biespecíficos CrossMab 10E8/iMab y A10E8/iMab a la glucoproteína MPER del VIH-1.
La figura 8B es una serie de gráficos que comparan los porcentajes de inhibición de 10E8 (líneas grises claras) y A10E8 (líneas grises oscuras) frente a virus R5 resistentes a iMab (panel A) y virus X4 (panel B), así como los porcentajes de inhibición de 10E8/iMab (líneas grises claras) y A10E8/iMab (líneas grises oscuras) frente a virus R5 resistentes a iMab (panel C) y virus X4 (panel D).
La figura 9 es una serie de gráficos que comparan la inhibición de diversas cepas del VIH utilizando concentraciones variables de anticuerpos 10E8, A10E8, 4E10, 10E8/P140, A10E8/P140 y 4E10/P140.
La figura 10 es un gráfico que compara la cobertura antivírica de los anticuerpos CrossMab 10E8/Pro140 y 10E8/iMab, sus anticuerpos monoclonales progenitores 10E8, Pro140 e iMab, y diversos otros anticuerpos monoclonales dirigidos a la envoltura del VIH con un amplio panel de virus seudotipados de la envoltura del VIH.
La figura 11 es una serie de gráficos que comparan el porcentaje máximo de inhibición (PMI) de un amplio panel de virus seudotipados de la envoltura del VIH con el anticuerpo monoclonal iMab (barras grises en todos los paneles) y los anticuerpos CrossMab PGT145/ibalizumab (145/iMab; panel superior izquierdo), PGT128/ibalizumab (128/iMab; panel superior central), PGT151/ibalizumab (151/iMab; panel superior derecho), 3BNC117/ibalizumab (117/iMab; panel inferior izquierdo) y 10E8/ibalizumab (10E8/iMab; panel inferior derecho).
La figura 12 es una serie de gráficos que comparan el porcentaje máximo de inhibición (PMI) y las concentraciones de anticuerpos CI80 de los anticuerpos CrossMab PGT145/ibalizumab (145/iMab; panel superior izquierdo), PGT128/ibalizumab (128/iMab; panel superior central), PGT151/ibalizumab (151/iMab; panel superior derecho), 3BNC117/ibalizumab (117/iMab; panel inferior izquierdo) y 10E8/ibalizumab (10E8/iMab; panel inferior derecho) con un amplio panel de virus seudotipados de la envoltura del VIH.
La figura 13 es una serie de gráficos que comparan las concentraciones de anticuerpos CI80 para los anticuerpos biespecíficos CrossMab basados en iMab y Pro140 y sus anticuerpos progenitores para PGT145/iMab y PGT145/Pro140 (panel superior izquierdo), 3BNC117/iMab y 3BNC117/Pro140 (panel superior central), PGT128/iMab y PGT128/Pro140 (panel superior derecho), PGT151/iMab y PGT151/Pro140 (panel inferior izquierdo) y 10E8/iMab y 10E8/Pro140 (panel inferior derecho).
La figura 14 es una serie de gráficos que comparan las concentraciones de anticuerpos CI50 para los anticuerpos biespecíficos CrossMab basados en iMab y Pro140 y sus anticuerpos progenitores para PGT145/iMab y PGT145/Pro140 (panel superior izquierdo), 3BNC117/iMab y 3BNC117/Pro140 (panel superior central), PGT128/iMab y PGT128/Pro140 (panel superior derecho), PGT151/iMab y PGT151/Pro140 (panel inferior izquierdo) y 10E8/iMab y 10E8/Pro140 (panel inferior derecho).
La figura 15 es un gráfico que muestra las concentraciones de anticuerpos CI80 para anticuerpos biespecíficos CrossMab basados en iMab y sus anticuerpos progenitores frente a la transmisión célula a célula del VIH para 10E8/iMab (panel superior izquierdo), 3BNC117/iMab (panel superior central), PGT145/iMab (panel superior derecho), PGT128/iMab (panel inferior izquierdo) y PGT151/iMab (panel inferior derecho).
La figura 16 es un gráfico que muestra el porcentaje máximo de inhibición (PMI) de los anticuerpos biespecíficos CrossMab y los anticuerpos progenitores frente a la transmisión célula a célula del VIH.
La figura 17, panel izquierdo, es un gráfico que compara la inhibición de una cepa de VIH frente a concentraciones variables de 10E8, Pro 140, anticuerpo biespecífico CrossMab 10E8/P140 y una combinación de anticuerpos monoclonales 10E8 y Pro 140 individuales. La figura 17, panel derecho, es un gráfico que compara la inhibición de una cepa de VIH frente a concentraciones variables de iMab, 10E8, anticuerpo biespecífico CrossMab 10E8/iMab y una combinación de anticuerpos monoclonales 10E8 e iMab individuales.
La figura 18, panel superior, es una serie de gráficos que comparan la inhibición de diversas cepas del VIH R5 frente a concentraciones variables de anticuerpos 10E8, Pro140, 10E8/P 140 y 10E8/515H7. La figura 18, panel inferior, es una serie de gráficos que comparan la inhibición de diversas cepas del VIH X4 frente a diversas concentraciones de anticuerpos 10E8, 515H7 y 10E8/515H7.
La figura 19, panel superior, es una serie de gráficos que comparan la inhibición de diversas cepas del VIH frente a concentraciones variables de los anticuerpos 10E8/Pro140, 10E8/iMab, 10E8/515H7 y 10E8/X19. La figura 19, panel inferior, indica la densidad de receptores CD4, CCR5 y CXCR4 presentes en las células TZM-bl.
En la figura 20 se compara la unión de los anticuerpos biespecíficos CrossMab 10E8/Pro140, A10E8/Pro140 y 4E10/Pro140 a la glucoproteína MPER del VIH-1.
La figura 21 es una serie de gráficos que comparan la inhibición de diversas cepas del VIH frente a concentraciones variables de anticuerpos 4E10, Pro140 y 4E10/P140 y 10E8/P140.
La figura 22 es un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño de los anticuerpos CrossMab 10E8/iMab, 10E8/P140 y 3BNC117/iMab (panel superior) y de los anticuerpos monoclonales iMab, 10E8 y Pro140 (panel inferior).
La figura 23 es un análisis por cromatografía de exclusión por tamaño del anticuerpo monoclonal 10E8 y de un anticuerpo quimérico compuesto por la cadena pesada de 10E8 apareada con la cadena ligera de 4E10.
La figura 24 es una serie de gráficos de cromatografía de exclusión por tamaño de los anticuerpos monoclonales 10E8 y 4E10 y un anticuerpo quimérico compuesto por la cadena pesada de 10E8 apareada con la cadena ligera de 4E10 (panel superior), el anticuerpo monoclonal 10E8 y los mutantes de 10E8 con mutaciones potencialmente estabilizadoras modificadas genéticamente en la cadena ligera de 10E8 (panel central), y el anticuerpo monoclonal 10E8 y los mutantes de 10E8 injertados genéticamente con la cadena ligera kappa de anticuerpos no 10E8 (panel inferior).
La figura 25 es un gráfico de cromatografía de exclusión por tamaño del anticuerpo monoclonal 4E10 y los mutantes de 4E10 injertados genéticamente con las regiones ligeras de 10E8 que incluyen la región c DR1, la región CDR2, la región CDR3 o las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 combinadas.
La figura 26, panel superior, es un gráfico de cromatografía de exclusión por tamaño de anticuerpos quiméricos de 10E8. CDR123 es un anticuerpo quimérico de la cadena pesada de 10E8 apareada con una cadena ligera de 10E8 genéticamente injertada con las secuencias de la región CDR de la línea germinal del anticuerpo 10E8. FW123 es un anticuerpo quimérico de la cadena pesada de 10E8 apareada con una cadena ligera de 10E8 genéticamente injertada con las secuencias de la región marco de la línea germinal del anticuerpo 10E8. La figura 26, panel inferior, es una tabla que indica la expresión, la capacidad de unión al MPER del VIH, el perfil de cromatografía de exclusión por tamaño y el perfil de neutralización del VIH de los anticuerpos CDR123 y FW123.
La figura 27 es un gráfico de cromatografía de exclusión por tamaño del anticuerpo monoclonal 10E8, su variante somática H6L10 y un anticuerpo biespecífico CrossMab consistente en H6L10 apareado con Pro 140.
La figura 28 es un gráfico que representa los perfiles farmacocinéticos de 10E8, H6L10/Pro 140 y sus anticuerpos progenitores en un modelo de ratón.
La figura 29 es un gráfico que compara la potencia de los anticuerpos 10E8v1.0/iMab o CrossMab P140 con los anticuerpos 10E8/iMab o P140.
La figura 30 es un gráfico que representa la farmacocinética de los anticuerpos 10E8 y CrossMab derivados de varias variantes de 10E8 e iMab o P140 en un modelo de ratón.
La figura 31 es una serie de gráficos que representan la cobertura vírica del VIH de los anticuerpos 110E8v1.1/P140 y 10E8v2.0/iMab (panel superior) y gráficos de estabilidad de cromatografía de exclusión por tamaño de los anticuerpos 10E8v1.1/P140 and 10E8v2.0/iMab (panel inferior).
La figura 32 es una serie de gráficos que representan los gráficos de estabilidad por exclusión por tamaño de los anticuerpos 10E8v1.1/P140 and 10E8v2.0/iMab conservados en PBS a 4 °C.
La figura 33 muestra un análisis de espectroscopia de masas nativa del anticuerpo 110E8v2.0/iMab( N297A).
La figura 34 es una serie de gráficos que comparan la actividad de 10E8v1.1/P140 and 10E8v2.0/iMab en un panel de VIH clado C, y las actividades de CI50 e CI80 de los anticuerpos.
Las figuras 35 y 36 son gráficos que comparan la potencia de 110E8v1.1/P140, 10E8v2.0/iMab y diversos anticuerpos monoclonales contra el VIH.
Descripción detallada
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Las realizaciones de la presente invención proporcionan la inhibición del VIH. En diversas aplicaciones, se forman anticuerpos biespecíficos, cada uno de los cuales incluye componentes de cadena pesada y de cadena ligera de dos anticuerpos progenitores diferentes. Uno de los anticuerpos progenitores se une específicamente a la proteína Env de la envoltura del VIH. El otro anticuerpo progenitor se une específicamente a CD4. En un anticuerpo biespecífico, se combinan una cadena pesada y una cadena ligera de cada uno de los dos anticuerpos progenitores, proporcionando un anticuerpo en el que los sitios de unión al antígeno del fragmento de unión al antígeno 1 (Fab1) y Fab2 tienen diferentes especificidades de unión. El anticuerpo biespecífico es un anticuerpo en formato CrossMab, tal como se muestra en la figura 1. En un formato CrossMab, una cadena pesada incluye una estructura de "bulto" y la otra cadena pesada incluye una estructura de "agujero" correspondiente, y se intercambian las posiciones de los dominios constantes (es decir, CL y CH1) de un anticuerpo progenitor, lo que en conjunto garantiza el apareamiento correcto de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras durante el ensamblaje.
Se ha demostrado que diversos mAb bloquean la infección por VIH al dirigirse y unirse a la proteína Env de la envoltura del VIH (figuras 2B y 10). Estos mAb incluyen, por ejemplo, PGT145, PG9, PGT128, PGT121, 10-1074, 3BNC117, VRC01, PGT151, 4E10 y 10E8. Además, se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales Pro 140 ("P140"), ibalizumab ("iMab") y 515H7 bloquean la infección por VIH al dirigirse y unirse a las proteínas de la membrana celular humana CCR5, CD4 y CXCR4, respectivamente (figura 2A). En concreto, la figura 2A muestra cómo iMab se dirige a CD4, el principal receptor de entrada del VIH-1 que se expresa en los linfocitos T humanos; y cómo Pro 140 se dirige a CCR5, un correceptor de entrada del VIH-1 por el VIH-1 trópico CCR5. La figura 2B (adaptada de http://www.scripps.edu/news/press/2014/20140424hiv.html) ilustra cómo el mAb PGT145 se dirige al epítopo V1N2 sobre gp120 de la envoltura vírica del VIH; cómo el mAb PGT128 se dirige al glucano de la región troncal V3 de gp120 de VIH; cómo el mAb 3BNC117 se dirige al sitio de unión a CD4 de gp120 de VIH; cómo el mAb 10E8 se dirige a la región externa proximal de la membrana ("membrane proximal external region", MPER) de gp41 de VIH ; y cómo el mAb PGT151 se dirige a un epítopo sobre gp120 de VIH y sobre gp41 de VIH. En diversas realizaciones, el anticuerpo biespecífico (por ejemplo, un anticuerpo CrossMab del VIH) de la presente invención tiene la arquitectura natural de una molécula de IgG, pero con biespecificidad.
Por consiguiente, en diversas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos biespecíficos que se dirigen y se unen a la proteína Env del VIH, así como a la proteína de membrana celular CD4. Los anticuerpos biespecíficos incluyen secuencias (secuencias de cadena pesada y ligera) derivadas del anticuerpo 10E8.
Las secuencias de aminoácidos que definen las cadenas pesada y ligera del anticuerpo PGT145 pueden encontrarse, por ejemplo, en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/3U1S_H y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/3U1S_L, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos que definen las cadenas pesada y ligera del anticuerpo PG9 pueden encontrarse, por ejemplo, en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/3U4E_H y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/3MUH_L, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos que definen las cadenas pesada y ligera del anticuerpo PGT128 pueden encontrarse, por ejemplo, en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/3TYG_H y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/3TYG_L, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos que definen las cadenas pesada y ligera del anticuerpo PGT121 pueden encontrarse, por ejemplo, en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4FQC_H y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4FQC_L, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos que definen las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 10-1074 pueden encontrarse, por ejemplo, en Mouquet H., et al. (2012), PNAS, 109(47):E3268-77 (incluida la información suplementaria).
Las secuencias de aminoácidos que definen las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 3BNC117 pueden encontrarse, por ejemplo, en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4LSV_H y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4LSV_L, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos que definen las cadenas pesada y ligera del anticuerpo VRC01 pueden encontrarse, por ejemplo, en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4LST_H y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4LST_L, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos que definen las cadenas pesada y ligera del anticuerpo PGT151 pueden encontrarse, por ejemplo, en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4NUG_H y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4NUG_L, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos que definen las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 4E10 pueden encontrarse, por ejemplo, en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4LLV_H y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4LLV_L, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos que definen las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 10E8 pueden encontrarse, por ejemplo, en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4G6F_B y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4G6F_D, respectivamente.
Los anticuerpos biespecíficos incluyen secuencias (secuencias de cadena pesada y ligera) derivadas del anticuerpo iMab (o la variante MV1). Las secuencias de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos Pro 140, ibalizumab (o su variante MV1) y 515H7 se describen con más detalle, por ejemplo, en Olson, W. C. et al. (1999) J. Virol., 73(5):4145-4155, Trkola, A. et al., (2001) J. Virol., 75(2):579-588, la patente de EE. UU. n.° 7122 185, Burkly L. C. et al. (1992), J. Immunol., 149(5): 1779-1787, Moore J. P. et al. (1992), J. Virol., 66(8):4784-4793, Reimann K. A., et al., (1997), AIDS Res. Hum. Retroviruses, 13(11):933-943, publicación de patente internacional n.° WO2014100139, y publicación de patente europea n.° EP2246364.
Tal como se utiliza en el presente documento, una "variante" de anticuerpo se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo progenitor del que deriva. En diversas realizaciones, la variante tiene una o más alteraciones de aminoácidos con respecto al anticuerpo progenitor.
En unos ejemplos de realizaciones, se construyeron una serie de anticuerpos CrossMab del VIH que incluyen, entre otros, por ejemplo, 145/MV1, 117/MV1, 128/MV1, 10E8/MV1, 145/P140, 128/P140, 117/P140, 10E8/P140, 10E8/alpha-Her2, 10E8/X19, y 4E10/P140. PGT145 ("145"), 3BNC117 ("117"), PGT128 ("128") y 10E8 son cuatro anticuerpos diferentes de la envoltura del VIH. Pro 140 ("P140") es un mAb que se une al receptor de superficie celular CCR5. MV1 es un anticuerpo CD4 que es una variante modificada del mAb ibalizumab (véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional n.° WO2014100139). X19 es una de las variantes del anticuerpo contra el receptor de superficie celular CXCR4 (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 8329 178) que no se une a las células que expresan CXCR4 (y, por lo tanto, se utiliza como control de no unión a la superficie). Alpha-Her2 es un mAb que se une al receptor Her2 expresado sobre las células. Muchos de estos anticuerpos CrossMab aumentan la amplitud de la neutralización del VIH en comparación con sus anticuerpos progenitores (es decir, los anticuerpos monoclonales MV1, 145, 117 o 10E8). Además, muchos de estos anticuerpos también aumentan significativamente la potencia de neutralización contra el VIH en comparación con sus anticuerpos progenitores.
A continuación, se muestran las secuencias de aminoácidos que definen las cadenas pesada y ligera de diversos anticuerpos CrossMab del VIH.
Anticuerpo 145/MV1 (no forma parte de la invención):
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de MV1 del anticuerpo 145/MV1 - MV1-VLCH1 (SEQ ID NO:1):
Figure imgf000007_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de MV1 del anticuerpo 145/MV1 - MV1-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO:2):
Figure imgf000007_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada del PGT145 del anticuerpo 145/MV1 -PGT145-LC (SEQ ID NO:3):
Figure imgf000007_0003
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada del PGT145 del anticuerpo 145/MV1 -PGT145-HC-Knob (SEQ ID NO:4):
Figure imgf000007_0005
Anticuerpo 117/MV1 (no forma parte de la invención):
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de MV1 del anticuerpo 117/MV1 - MV1-VLCH1 (SEQ ID NO:1):
Figure imgf000007_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de MV1 del anticuerpo 117/MV1 - MV1-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO:2):
Figure imgf000008_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 3BNC 117 del anticuerpo 117/MV1 -3BNC117-LC (SEQ ID NO:5):
Figure imgf000008_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 3BNC117 del anticuerpo 117/MV1 -3BNC117-HC-Knob (SEQ ID NO:6):
Figure imgf000008_0003
Anticuerpo 128/MV1 (no forma parte de la invención):
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de MV1 del anticuerpo 128/MV1 - MV1-VLCH1 (SEQ ID NO:1):
Figure imgf000008_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de MV1 del anticuerpo 128/MV1 - MV1-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO:2):
Figure imgf000008_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada del PGT128 del anticuerpo 128/MV1 -PGT128-LC (SEQ ID NO:7):
Figure imgf000008_0006
Figure imgf000009_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de PGT128 del anticuerpo 128/MV1 -PGT128-HC-Knob (SEQ ID NO:8):
Figure imgf000009_0002
Anticuerpo 10E8/MV1 (no forma parte de la invención):
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de MV1 del anticuerpo 10E8/MV1 - MV1-VLCH1 (SEQ ID NO:1):
Figure imgf000009_0003
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de MV1 del anticuerpo 10E8/MV1 - MV1-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO:2):
Figure imgf000009_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 10E8 del anticuerpo 10E8/MV1 - 10E8-LC (SEQ ID NO:9):
Figure imgf000009_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 10E8 del anticuerpo 10E8/MV1 - 10E8-HC-Knob (SEQ ID NO: 10):
Figure imgf000009_0006
Anticuerpo A10E8/MV1 (no forma parte de la invención)
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de MV1 del anticuerpo A10E8/MV1 - MV1-VLCH1 (SEQ ID NO:1):
Figure imgf000010_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de MV1 del anticuerpo A10E8/MV1 - MV1-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO:2):
Figure imgf000010_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de A 10E8 del anticuerpo A10E8/MV1 -A10E8-LC (SEQ ID NO:21):
Figure imgf000010_0003
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de A 10E8 del anticuerpo A10E8/MV1 -10E8-HC-Knob (SEQ ID NO:22):
Figure imgf000010_0004
Anticuerpo 151/MV1 (no forma parte de la invención)
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de MV1 del anticuerpo 151/MV1 - MV1-VLCH1 (SEQ ID NO:1):
Figure imgf000010_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de MV1 del anticuerpo 151/MV1 - MV1-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO:2):
Figure imgf000011_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de PGT151 del anticuerpo 151/MV1 -PGT151-LC (SEQ ID NO:23):
Figure imgf000011_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de PGT151 del anticuerpo 151/MV1 -PGT151-HC-Knob (SEQ ID NO:24):
Figure imgf000011_0003
Anticuerpo 145/P140 (no forma parte de la invención):
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de Pro 140 del anticuerpo 145/P140 -PRO140-VLCH1 (SEQ ID NO:11):
Figure imgf000011_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de Pro 140 del anticuerpo 145/P140 -PRO140-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO: 12):
Figure imgf000011_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada del PGT145 del anticuerpo 145/P140 -PGT145-LC (SEQ ID NO:3):
Figure imgf000011_0006
Figure imgf000012_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada del PGT145 del anticuerpo 145/P140 -PGT145-HC-Knob (SEQ ID NO:4):
Figure imgf000012_0002
Anticuerpo 117/P140 (no forma parte de la invención):
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de Pro 140 del anticuerpo 117/P140 -PRO140-VLCH1 (SEQ ID NO:11):
Figure imgf000012_0003
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de Pro 140 del anticuerpo 117/P140 - PRO 140-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO: 12):
Figure imgf000012_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada del 3BNC117 del anticuerpo 117/P140 -3BNC117-LC (SEQ ID NO:5):
Figure imgf000012_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 3BNC117 del anticuerpo 117/P140 -3BNC117-HC-Knob (SEQ ID NO:6):
Figure imgf000013_0001
Anticuerpo 128/P140 (no forma parte de la invención):
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de Pro 140 del anticuerpo 128/P140 -PRO140-VLCH1 (SEQ ID NO:11):
D S L
V
Figure imgf000013_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de Pro 140 del anticuerpo 128/P140 -PRO140-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO: 12):
Figure imgf000013_0003
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada del PGT128 del anticuerpo 128/P140 -PGT128-LC (SEQ ID NO:7):
Figure imgf000013_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de PGT128 del anticuerpo 128/P140 -PGT128-HC-Knob (SEQ ID NO:8):
Figure imgf000013_0005
Anticuerpo 10E8/P140 (no forma parte de la invención):
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de Pro 140 del anticuerpo 10E8/P140 -PRO140-VLCH1 (SEQ ID NO:11):
Figure imgf000014_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de Pro 140 del anticuerpo 10E8/P 140 -PRO140-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO:12):
Figure imgf000014_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 10E8 del anticuerpo 10E8/P140 - 10E8-LC (SEQ ID NO:9):
Figure imgf000014_0003
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 10E8 del anticuerpo 10E8/P140 - 10E8-HC-Knob (SEQ ID NO:10):
Figure imgf000014_0004
Anticuerpo A10E8/P140 (no forma parte de la invención)
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de PRO140 del anticuerpo A10E8/P140 -PRO140-VLCH1 (SEQ ID NO:11):
Figure imgf000014_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de PRO140 del anticuerpo A10E8/P140 -PRO140-Hole-Cross (SEQ ID NO:12):
Figure imgf000015_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de A10E8 del anticuerpo A10E8/P140 -A10E8-LC (SEQ ID NO:21):
Figure imgf000015_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de A10E8 del anticuerpo A10E8/P140 -10E8-HC-Knob (SEQ ID NO:22):
Figure imgf000015_0003
Anticuerpo 151/P140 (no forma parte de la invención)
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de PRO140 del anticuerpo 151/P140 -PRO140-VLCH1 (SEQ ID NO:11):
Figure imgf000015_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de PRO140 del anticuerpo 151/P140 -PRO140-Hole-Cross (SEQ ID NO: 12):
Figure imgf000015_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada del PGT151 del anticuerpo 151/P140 -PGT151-LC (SEQ ID NO:23):
Figure imgf000015_0006
Figure imgf000016_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de PGT151 del anticuerpo 151/P140 -PGT151-HC-Knob (SEQ ID NO:24):
Figure imgf000016_0002
Anticuerpo 10E8/Alpha-Her2 (no forma parte de la invención):
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de alfa-Her2 del anticuerpo 10E8/Alpha-Her2 - antiHer2-VLCH1 (SEQ ID NO: 13):
Figure imgf000016_0003
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de alfa-Her2 del anticuerpo 10E8/Alpha-Her2 - antiHer2-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO: 14):
Figure imgf000016_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 10E8 del anticuerpo 10E8/Alpha-Her2 -10E8-LC (SEQ ID NO:9):
Figure imgf000016_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 10E8 del anticuerpo 10E8/Alpha-Her2 - 10E8-HC-Knob (SEQ ID NO:10):
Figure imgf000017_0001
Anticuerpo 4E10/P140 (no forma parte de la invención):
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de Pro 140 del anticuerpo 4E10/P140 -PRO140-VLCH1 (SEQ ID NO:11):
Figure imgf000017_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de Pro 140 del anticuerpo 4E10/P140 -PRO140-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO: 12):
Figure imgf000017_0003
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada 4E10 del anticuerpo 4E10/P140 - 4E10-LC (SEQ ID NO: 17):
Figure imgf000017_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada 4E10 del anticuerpo 4E10/P140 - PGT145-HC-Knob (SEQ ID NO: 18):
Figure imgf000017_0005
Anticuerpo 10E8/X19 (no forma parte de la invención):
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de X19 del anticuerpo 10E8/X19 - X19-VLCH1 (SEQ ID NO: 19):
Figure imgf000018_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de X19 del anticuerpo 10E8/X19 - X19-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO:20):
Figure imgf000018_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 10E8 del anticuerpo 10E8/X19 - 10E8-LC (SEQ ID NO:9):
Figure imgf000018_0003
VAPTECS
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 10E8 del anticuerpo 10E8/X19 -PGT145-HC-Knob (SEQ ID NO:10):
Figure imgf000018_0004
Anticuerpo 10E8/515H7 (no forma parte de la invención)
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 515H7 del anticuerpo 10E8/515H7 -515H7-VLCH1 (SEQ ID NO:25):
Figure imgf000018_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 515H7 del anticuerpo 10E8/515H7 -515H7-Hole-Cross (SEQ ID NO:26):
Figure imgf000019_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 10E8 del anticuerpo 10E8/515H7 - 10E8-LC (SEQ ID NO:9):
Figure imgf000019_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 10E8 del anticuerpo 10E8/515H7 -10E8-HC-Knob (SEQ ID NO: 10):
Figure imgf000019_0003
Anticuerpo quimérico CDR123 (SEQ ID NO:27) (no forma parte de la invención)
Figure imgf000019_0004
FW123 quimérico (SEQ ID NO:28) (no forma parte de la invención)
Figure imgf000019_0005
Anticuerpo 10E8V1.0/iMab (no forma parte de la invención)
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de MV1 del anticuerpo 10E8v1.0/MV1 - MV1-VLCH1 (SEQ ID NO:1):
Figure imgf000019_0006
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de MV1 del anticuerpo 10E8v1.0/MV1 -MV1-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO:2):
Figure imgf000020_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 10E8v1.0 del anticuerpo 10E8v1.0/iMab - 10E8v1.0-LC (SEQ ID NO:29):
Figure imgf000020_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 10E8v1.0 del anticuerpo 10E8v1.0/iMab - 10E8v1.0-HC-Knob (SEQ ID NO:30):
Figure imgf000020_0003
Anticuerpo 10E8V1.1/iMab (no forma parte de la invención)
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de MV1 del anticuerpo 10E8v1.1/iMab- MV1-VLCH1 (SEQ ID NO:1):
Figure imgf000020_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de MV1 del anticuerpo 10E8v1.1/iMab -MV1-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO:2):
Figure imgf000020_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 10E8v1.1 del anticuerpo 10E8v1.1/iMab - 10E8v1.1-LC (SEQ ID NO:31):
Figure imgf000021_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 10E8v1.1 del anticuerpo 10E8v1.1/iMab - 10E8v1.1 HC-Knob (SEQ ID NO:32):
Figure imgf000021_0002
Anticuerpo 10E8V2.0/iMab
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de MV1 del anticuerpo 10E8v2.0/iMab - MV1-VLCH1 (SEQ ID NO:1):
Figure imgf000021_0003
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de MV1 del anticuerpo 10E8v2.0/iMab -MV1-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO:2):
Figure imgf000021_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 10E8v2.0 del anticuerpo 10E8v2.0/iMab - 10E8v2.0-LC (SEQ ID NO:33):
Figure imgf000021_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 10E8v2.0 del anticuerpo 10E8v2.0/iMab - 10E8v2.0-HC-Knob (SEQ ID NO:34):
Figure imgf000022_0001
Anticuerpo 10E8V3.0/iMab (no forma parte de la invención)
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de MV1 del anticuerpo 10E8v3.0/iMab - MV1-VLCH1 (SEQ ID NO:1):
Figure imgf000022_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de MV1 del anticuerpo 10E8v3.0/iMab -MV1-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO:2):
Figure imgf000022_0003
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 10E8v3.0 del anticuerpo 10E8v3.0/iMab - 10E8v3.0-LC (SEQ ID NO: 15):
Figure imgf000022_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 10E8v3.0 del anticuerpo 10E8v3.0/iMab - 10E8v3.0-HC-Knob (SEQ ID NO: 16):
Figure imgf000022_0005
Anticuerpo 10E8V1.0/P140 (H6L10/PRO140) (no forma parte de la invención)
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de PRO140 del anticuerpo 10E8V1.0/P140 - PRO140-VLCH1 (SEQ ID NO:11):
Figure imgf000023_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de PRO140 del anticuerpo 10E8V1.0/P140 - PRO140-Hole-Cross (SEQ ID NO: 12):
Figure imgf000023_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de L10 del anticuerpo 10E8V1.0/P140 - L10-LC (SEQ ID NO:29):
Figure imgf000023_0003
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de H6 del anticuerpo 10E8V1.0/P140 - H6-HC-Knob (SEQ ID NO:30):
Figure imgf000023_0004
Anticuerpo 10E8V1.1/P140 (no forma parte de la invención)
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de PRO140 del anticuerpo 10E8v1.1/P140 -PRO140-VLCH1 (SEQ ID NO:11):
Figure imgf000023_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de P140 del anticuerpo 10E8v1.1/P140 -PRO140-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO: 12):
Figure imgf000024_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 10E8v1.1 del anticuerpo 10E8v1.1/P140 - 10E8v1.1-LC (SEQ ID NO:31):
Figure imgf000024_0002
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 10E8v1.1 del anticuerpo 10E8v1.1/P140 - 10E8v1.1 HC-Knob (SEQ ID NO:32):
Figure imgf000024_0003
Anticuerpo 10E8V2.0/P140 (no forma parte de la invención)
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de PRO 140 del anticuerpo 10E8v2.0/P140 - PRO140-VLCH1 (SEQ ID NO:11):
Figure imgf000024_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de P140 del anticuerpo 10E8v2.0/P140 -PRO140-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO: 12):
Figure imgf000024_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 10E8v2.0 del anticuerpo 10E8v2.0/P140 - 10E8v2.0-LC (SEQ ID NO:33):
Figure imgf000025_0001
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 10E8v2.0 del anticuerpo 10E8v2.0/P140 - 10E8v2.0 HC-Knob (SEQ ID NO:34):
Figure imgf000025_0002
Anticuerpo 10E8V3.0/P140 (no forma parte de la invención)
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de PRO140 del anticuerpo 10E8v3.0/P140 -PRO140-VLCH1 (SEQ ID NO:11):
Figure imgf000025_0003
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de P140 del anticuerpo 10E8v3.0/P140 -PRO140-HC-Hole-Cross (SEQ ID NO: 12):
Figure imgf000025_0004
Secuencia de aminoácidos que define la cadena ligera derivada de 10E8v3.0 del anticuerpo 10E8v3.0/P140 - 10E8v3.0-LC (SEQ ID NO: 15):
Figure imgf000025_0005
Secuencia de aminoácidos que define la cadena pesada derivada de 10E8v3.0 del anticuerpo 10E8v3.0/P140 - 10E8v3.0 HC-Knob (SEQ ID NO: 16):
Figure imgf000026_0001
En diversas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo biespecífico (por ejemplo, el anticuerpo CrossMab del VIH) incluye además un análogo de aminoácido, un derivado de aminoácido u otros aminoácidos no clásicos.
La homología o identidad puede determinarse de diversas maneras que están dentro del conocimiento de la técnica, por ejemplo, utilizando un software informático de acceso público, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El análisis BLAST ("Basic Local Alignment Search Tool", herramienta de búsqueda de alineaciones básicas), que utiliza mediante el algoritmo empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Karlin et al. (1990), PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 87, 2264-2268; Altschul (1993), J. MOL. EvOL., 36, 290-300; Altschul et al. (1997), NUCLEIC ACIDS RES., 25, 3389-3402), se adapta a la búsqueda de similitudes de secuencia. El enfoque utilizado por el programa BLAST consiste en considerar, en primer lugar, los segmentos similares entre una secuencia de consulta y una secuencia de la base de datos, evaluar a continuación la significación estadística de todas las coincidencias identificadas y, por último, resumir únicamente las coincidencias que satisfacen un umbral de significación preseleccionado. Para un análisis de los aspectos básicos de la búsqueda de similitudes en las bases de datos de secuencias, véase Altschul et al. (1994), NATu Re GENETICS, 6, 119-129. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias comparadas. Los parámetros de búsqueda para el histograma, las descripciones, las alineaciones, la esperanza (es decir, el umbral de significación estadística para informar de las coincidencias con las secuencias de la base de datos), el valor de corte, la matriz y el filtro están en la configuración predeterminada. La matriz de puntuación por defecto utilizada por blastp, blastx, tblastn y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff et al. (1992), PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 89, 10915-10919). Se pueden ajustar cuatro parámetros de blastn de la siguiente manera: Q = 10 (penalización por creación de huecos); R = 10 (penalización por extensión de huecos); wink = 1 (genera aciertos de palabra en cada posición wink.sup.th a lo largo de la consulta); y gapw=16 (establece el ancho de ventana dentro del cual se generan las alineaciones con huecos). Los ajustes equivalentes de los parámetros Blastp pueden ser Q = 9; R = 2; wink = 1; y gapw = 32. Las búsquedas también pueden realizarse utilizando el parámetro de opción avanzada de BLAST de n Cb I (National Center for Biotechnology Information) (por ejemplo:-G, Coste de abrir hueco [número entero]: por defecto = 5 para nucleótidos/11 para proteínas; -E, Coste de extender hueco [número entero]: por defecto = 2 para nucleótidos/1 para proteínas; -q, Penalización por desapareamiento de nucleótidos [número entero]: por defecto = -3; -r, Recompensa por coincidencia de nucleótidos [número entero]: por defecto = 1; -e, Valor esperado [número real]: por defecto = 10; -W, Tamaño de palabras [número entero]: por defecto = 11 para nucleótidos/ 8 para megablast/3 para proteínas; -y, Parada (X) para extensiones blast en bits: por defecto = 20 para blastn/7 para otros; -X, Valor de parada X para la alineación con huecos (en bits): por defecto = 15 para todos los programas, no aplicable a blastn; y -Z, Valor de parada X final para la alineación con huecos (en bits): 50 para blastn, 25 para los demás). También puede utilizarse ClustalW para alineaciones de proteínas por pares (los parámetros por defecto pueden incluir, por ejemplo, matriz Blosum62 y Penalización de apertura de huecos = 10 y Penalización de extensión de huecos = 0,1). Una comparación Bestfit entre secuencias, disponible en el paquete GCG versión 10.0, utiliza los parámetros de ADN GAP = 50 (penalización por creación de huecos) y LEN = 3 (penalización por extensión de huecos) y los ajustes equivalentes en las comparaciones de proteínas son GAP = 8 y LEN = 2.
También se proporcionan en el presente documento derivados de anticuerpos quiméricos de los anticuerpos biespecíficos, es decir, moléculas de anticuerpos en las que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase concreta de anticuerpos, mientras que el resto de las cadenas son idénticas u homólogas a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico puede incluir una cadena pesada y/o ligera en la que una o más CDR o FW derivadas de un anticuerpo seleccionado de entre un anticuerpo PGT145, PG9, PGT128, PGT121,10-1074, 3BNC117, VRC01, PGT151, 4E10, 10E8, P140, iMab (o la variante MV1) o el anticuerpo 515H7 se sustituyen por una o más CDR o FW derivadas de un anticuerpo diferente seleccionado entre un anticuerpo PGT145, PG9, PGT128, PGT121, 10-1074, 3BNC117, VRC01, PGT151,4E10, 10E8, P140, iMab (o la variante MV1) o 515H7.
La modificación de la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión recombinante se consigue utilizando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, mutagénesis dirigida específica de sitio o mutagénesis basada en PCR. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y, 1989; y Ausubel etal., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y, 1989.
Los métodos para producir anticuerpos, tales como los divulgados en el presente documento, son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ADN que codifican regiones variables de cadena ligera y/o regiones variables de cadena pesada pueden sintetizarse por procedimientos químicos utilizando la información de secuencia proporcionada en el presente documento. Las moléculas de ADN sintético pueden ligarse a otras secuencias de nucleótidos apropiadas, incluidas, por ejemplo, secuencias de control de la expresión, para producir construcciones convencionales de expresión génica que codifiquen los anticuerpos deseados. La producción de construcciones génicas definidas es una práctica habitual en la técnica. Como alternativa, las secuencias proporcionadas en el presente documento pueden clonarse a partir de hibridomas mediante técnicas convencionales de hibridación o técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando sondas sintéticas de ácido nucleico cuyas secuencias se basen en la información de secuencias proporcionada en el presente documento, o en información sobre secuencias de la técnica anterior relativa a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera.
Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos deseados pueden incorporarse (ligarse) a vectores de expresión, que pueden introducirse en células hospedadoras mediante técnicas convencionales de transfección o transformación. Los ejemplos de células hospedadoras son células de E. coli, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y células de mieloma que no producen proteína IgG de otro modo. Las células hospedadoras transformadas pueden cultivarse en condiciones que permitan a las células hospedadoras expresar los genes que codifican las regiones variables de la cadena ligera y/o pesada de la inmunoglobulina. Las condiciones específicas de expresión y purificación variarán en función del sistema de expresión empleado.
En diversas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos CrossMab del VIH) son para su uso en terapia. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico (por ejemplo, el anticuerpo CrossMab del VIH) puede utilizarse para neutralizar el VIH en un mamífero (por ejemplo, un paciente humano). Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden unirse al VIH para inhibir parcial o completamente una o más actividades biológicas del virus. En una realización, el anticuerpo biespecífico (por ejemplo, el anticuerpo CrossMab del VIH) neutraliza un VIH R5-trópico. En otra realización, el anticuerpo biespecífico (por ejemplo, el anticuerpo CrossMab del VIH) neutraliza un VIH X4-trópico. En otra realización, el anticuerpo biespecífico (por ejemplo, el anticuerpo CrossMab del VIH) neutraliza un VIH de doble tropismo R5X4. El uso del anticuerpo para neutralizar el VIH en un mamífero puede comprender la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo.
En general, una cantidad terapéuticamente eficaz de componente activo está en el intervalo, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 1 m/kg a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del paciente. En diversas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de componente activo está en un intervalo de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del paciente, por ejemplo, aproximadamente 0,01 mg/kg, aproximadamente 0,02 mg/kg, aproximadamente 0,03 mg/kg, aproximadamente 0,04 mg/kg, aproximadamente 0,05 mg/kg, aproximadamente 0,06 mg/kg, aproximadamente 0,07 mg/kg, aproximadamente 0,08 mg/kg, aproximadamente 0,09 mg/kg, aproximadamente 0,1 mg/kg.02 mg/kg, aproximadamente 0,03 mg/kg, aproximadamente 0,04 mg/kg, aproximadamente 0,05 mg/kg, aproximadamente 0,06 mg/kg, aproximadamente 0,07 mg/kg, aproximadamente 0,08 mg/kg, aproximadamente 0,09 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 1,1 mg/kg, aproximadamente 1,2 mg/kg, aproximadamente 1,3 mg/kg, aproximadamente 1,4 mg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 1,6 mg/kg, aproximadamente 1,7 mg/kg, aproximadamente 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, incluidos todos los valores e intervalos entre ellos.
La cantidad administrada estará en función de variables tales como el tipo y la extensión de la enfermedad o indicación a tratar, la salud general del paciente, la potencia in vivo del anticuerpo, la formulación farmacéutica y la vía de administración. La dosis inicial puede aumentarse por encima del nivel superior para alcanzar rápidamente el nivel deseado en sangre o en los tejidos. Como alternativa, la dosis inicial puede ser menor que la óptima, y la dosis puede aumentarse progresivamente durante el desarrollo del tratamiento. La dosificación en seres humanos puede optimizarse, por ejemplo, en un estudio convencional de escalada de dosis de fase I diseñado para ejecutarse, por ejemplo, de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. La pauta posológica puede variar, en función de factores tales como la vía de administración, la cantidad de dosis y la enfermedad que se esté tratando. Los ejemplos de pautas posológicas son más de una vez al día, aproximadamente una vez al día, aproximadamente dos veces al día, aproximadamente tres veces al día, aproximadamente cuatro veces al día, aproximadamente cinco veces al día, aproximadamente cada dos días, aproximadamente cada tres días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente una vez cada dos semanas, aproximadamente una vez al mes, aproximadamente una vez cada dos meses, aproximadamente una vez cada tres meses, aproximadamente una vez cada seis meses o aproximadamente una vez al año. La formulación de fármacos basados en anticuerpos está dentro de los conocimientos habituales en la técnica.
Para un uso terapéutico, un anticuerpo puede combinarse con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en el presente documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa tampones, portadores y excipientes adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcional a una relación de beneficio/riesgo razonable. Los vehículos deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de las formulaciones y no perjudiciales para el receptor. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen tampones, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpos, tales como los divulgados en el presente documento, pueden presentarse en una forma farmacéutica unitaria y pueden prepararse mediante cualquier procedimiento adecuado. Una composición farmacéutica debe formularse de modo que sea compatible con la vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración son la administración intravenosa (IV), intradérmica, por inhalación, transdérmica, tópica, transmucosa y rectal. En una realización, la vía de administración de los anticuerpos de la invención es la infusión intravenosa.
Las formulaciones útiles pueden prepararse a través de procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (Mack Publishing Company, 1990). Los componentes de la formulación adecuados para la administración parenteral incluyen un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como EDTA; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato ("phosphate buffered saline", PBS). El vehículo debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe protegerse frente a los microorganismos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.
Las formulaciones farmacéuticas son preferentemente estériles. La esterilización puede realizarse, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización por filtración puede realizarse antes o después de la liofilización y la reconstitución.
Las figuras 13 y 14 demuestran que algunos CrossMab basados en iMab tienen mayor potencia y amplitud que los Ab progenitores. Salvo que se indique lo contrario, todos los anticuerpos biespecíficos basados en iMab se construyeron utilizando la variante MV1. La CI80, la concentración de anticuerpo que confiere un 80% de neutralización de la infectividad vírica, es un procedimiento para evaluar la potencia de los anticuerpos contra el VIH. Cuanto menor sea el número de CI80 (indicado en el eje de ordenadas de los gráficos en términos de concentración de anticuerpo (|jg/ml)), más potente será el anticuerpo para neutralizar una cepa o colonia aislada del VIH concretas. La CI50, la concentración de anticuerpo que confiere un 50 % de neutralización de la infectividad vírica, es otro método para evaluar la potencia de los anticuerpos contra el VIH. Cuanto menor sea el número de CI50 (indicado en el eje de ordenadas de los gráficos en términos de concentración de anticuerpo (jg/ml)), más potente será el anticuerpo para neutralizar una cepa o colonia aislada del VIH concretas.
Se ensayaron diversos conjuntos de anticuerpos frente a un gran panel de seudovirus del VIH-1 (118 colonias aisladas víricos del VIH diferentes) representativos de la diversidad de la envoltura del VIH por geografía, clado, tropismo y etapa de infección. Se utilizaron la CI80 y la CI50 se utilizaron para evaluar la fuerza de la potencia y la amplitud antivíricas. Los paneles inferiores derechos de las figuras 13 y 14 demuestran claramente que, en comparación con los anticuerpos progenitores iMab y 10E8, el CrossMab biespecífico de los dos juntos (10E8/iMab) neutraliza casi todos los virus VIH (cada virus se indica con un punto) con mayor potencia. Los otros conjuntos de anticuerpos (utilizados para preparar 145/iMab, 117/iMab, 128/iMab y 151/iMab) a veces aumentan la potencia del VIH en comparación con sus componentes progenitores y a veces no.
Tal como se muestra en la figura 15, el anticuerpo iMab también es relativamente potente en ensayos de neutralización célula-célula. PGT145, 3BNC117, 10E8, PGT128 y PGT151 son relativamente potentes en la neutralización de la infección vírica sin células, pero no actúan bien en la neutralización de virus en ensayos de transmisión célula-célula. La creación de anticuerpos biespecíficos tales como PGT145, 3BNC117, 10E8, PGT128 y PGT151 con iMab hace que estos anticuerpos quiméricos sean activos en la neutralización de virus en un ensayo de transmisión célula-célula. Se puede observar que 10E8/iMab es el anticuerpo más potente en estos estudios comparativos. También se ha comprobado que el 10E8/iMab es el más activo en la prevención de la transmisión célula-célula in vitro.
Tal como se ilustra en la figura 16, la potencia mejorada de 10E8/iMab es estadísticamente significativa. La figura 3 muestra que la mejora de la potencia requiere la unión covalente del anticuerpo, es decir, el formato CrossMab (ya que la administración conjunta de dos anticuerpos progenitores, iMab y 10E8, proporciona un IPM inferior al del anticuerpo biespecífico 10E8/iMab fusionado y unido físicamente). Las figuras 10 a 14 proporcionan pruebas adicionales de la potencia mejorada de los anticuerpos CrossMab derivados de iMab sobre sus anticuerpos progenitores.
En resumen, se observa que, para los CrossMab basados en iMab (fusionados con PGT145, 3BNC117, PGT151, PGT128 y 10E8), 117/iMab mejora la amplitud, pero no la potencia; 145/iMab, 151/iMab y 128/iMab mejoran la amplitud y la potencia; y 10E8/iMab mejora notablemente la amplitud y la potencia. En cuanto a la localización/accesibilidad del epítopo y los modelos potenciales de neutralización, 10E8/iMab parece mostrar neutralización previa y posterior a la adhesión; 145/iMab, 151/iMab y 117/iMab parecen mostrar neutralización previa a la adhesión; y l17/iMab puede mostrar signos de restricción estérica y potencia potencialmente reducida para algunos virus. 10E8/iMab también muestra una potente actividad contra la transmisión del VIH de célula a célula.
Como también se muestra en los paneles superior e inferior izquierdo de las figuras 13 y 14, las actividades de CrossMab basadas en Pro 140 son a veces más débiles que sus anticuerpos progenitores y los CrossMab basados en iMab correspondientes, tal como se muestra por las altas concentraciones requeridas para alcanzar la CI80 y la CI50. El anclaje de estos cuatro mAb al receptor de la célula hospedadora CCR5 a través de otro anticuerpo de unión al receptor de la célula hospedadora denominado Pro 140 no mejora la potencia antivírica ni la amplitud (medida por CI80 frente a un amplio panel de colonias aisladas del VIH) en comparación con sus respectivos anticuerpos progenitores. Estos paneles indican que los CrossMab basados en Pro140 para estos cuatro anticuerpos son más débiles que sus correspondientes CrossMab basados en iMab (comparaciones de CI50 y CI80 de los CrossMab basados en Pro140 frente a los basados en iMab).
Como se muestra en los paneles inferiores derechos de las figuras 13 y 14, 10E8/P140, un quinto CrossMab basado en Pro 140 es más potente que sus anticuerpos progenitores y el CrossMab 10E8/iMab. Estos paneles ilustran una comparación de la potencia (CI80 o CI50) del mAb progenitor Pro140 (columna más a la derecha de los puntos de datos en estos paneles), el CrossMab 10E8/P140 biespecífico (segunda columna desde la derecha de los puntos de datos en estos paneles) y el mAb progenitor 10E8 (columna central de los puntos de datos en estos paneles) frente a un amplio panel de colonias aisladas del VIH. Estos paneles también ilustran una comparación de la potencia (CI80 o CI50) del mAb iMab progenitor (columna más a la izquierda de los puntos de datos en estos paneles), el CrossMab 10E8/iMab biespecífico (segunda columna desde la izquierda de los puntos de datos en estos paneles) y el mAb 10E8 progenitor (columna central de los puntos de datos en estos paneles) frente a un amplio panel de cepas del VIH. La segunda columna desde la izquierda y la segunda desde la derecha de los puntos de datos en estos paneles ilustran una comparación de la potencia (CI80 o CI50) de los CrossMab biespecíficos 10E8/iMab y 10E8/P140 frente a un amplio panel de colonias aisladas del VIH.
Se sabe que Pro 140 no tiene actividad contra los virus VIH X4, ya que los virus X4 utilizan CXCR4 como correceptor para la entrada del VIH-1, y Pro 140 se une a CCR5. El 10E8 por sí solo tiene una actividad muy débil contra los virus X4. Sin embargo, el CrossMab 10E8/Pro 140 biespecífico puede neutralizar todos los virus X4 ensayados hasta la fecha mejor que cualquiera de los anticuerpos progenitores. Los paneles de la figura 4 ilustran la eficacia del anticuerpo CrossMab biespecífico 10E8, Pro 140 y 10E8/P140 en la inhibición de diversas cepas del VIH.
Tal como se muestra en la figura 5, el CrossMab 10E8/Pro140 es un inhibidor más potente de diversas cepas del VIH que la administración conjunta de los dos anticuerpos progenitores, lo que demuestra una mejora sinérgica, no meramente aditiva, de la potencia con este anticuerpo biespecífico concreta.
Tal como se muestra en la figura 6, un CrossMab de 10E8 fusionado a un anticuerpo no unido a membrana (X19) no mejora la potencia, como puede verse cuando se compara con 10E8/P140 unido a la membrana. Así, la potencia del CrossMab 10E8/P140 parece requerir el anclaje de 10E8 a la membrana celular. Sin embargo, la unión a la membrana por sí sola no proporciona la potencia mejorada de estos CrossMab. La figura 7 demuestra que el anclaje de 10E8 en HER2 no proporciona una mejora sustancial de la potencia en comparación con el anclaje de 10E8 a CCR5. El anclaje de 10E8 a un receptor vírico específico (en este caso, CCR5 a través de Pro 140 o CD4 a través de iMab) proporciona una mayor actividad antivírica.
A10E8 es una versión mutante del mAb 10E8 que tiene una deleción de un aminoácido en la cadena ligera FR3. En comparación con 10E8, A10E8 tiene una actividad de unión al epítopo mucho más débil, tal como se ilustra en la figura 8A y en los paneles A y B de la figura 8B. Sin embargo, una vez que el A10E8 se ancló a un receptor celular (mediante la combinación de A10E8 e iMab en un anticuerpo CrossMab; el iMab se une específicamente al receptor celular CD4), en la figura 8B, paneles C y D, se demuestra que su actividad inhibidora mejora. Estos datos sugieren la contribución del anclaje a receptores celulares específicos, es decir, el anclaje a un receptor vírico o a un correceptor vírico, a la potenciación de la actividad de este anticuerpo del VIH. Sin embargo, aunque CrossMab A10E8/P140 tiene mejor actividad antivírica que A10E8, todavía no es tan potente como CrossMab 10E8/P140. CrossMab A10E8/P140 es comparativamente más eficaz para neutralizar los virus R5 que para neutralizar los virus X4.
4E10 es un mAb MPER anti-gp41 conocido por ser menos potente que el mAb MPER anti-gp41 10E8. De forma similar a los resultados para A10E8, las figuras 20 y 21 muestran que el anclaje de 4E10 al correceptor CCR5 (a través de Pro 140 en un anticuerpo CrossMab) mejoró significativamente la actividad antiviral de 4E10. En conjunto, esto sugiere que el anclaje de una serie de anticuerpos MPER anti-gp41 a CCR5 o CD4 (mediante la combinación de los anticuerpos MPER con P140 o iMab en un anticuerpo CrossMab biespecífico) puede mejorar en gran medida la potencia y la amplitud de los respectivos anticuerpos MPER anti-gp41.
Múltiples parámetros contribuyen a mejorar la actividad de determinados CrossMab biespecíficos contra el VIH, incluidos la potencia del Ab progenitor, la afinidad y las capacidades de neutralización antes y después de la unión. En concreto, el CrossMab 10E8/Pro140 representa una combinación eficaz en términos de superación de las limitaciones energéticas, espaciales y temporales, de dirigirse a etapas secuenciales/interdependientes en el proceso de entrada, de localización/accesibilidad del epítopo, de afinidad de unión, de neutralización previa y posterior a la unión, y de geometría de la unión. Tal como se muestra en la figura 20, 4E10/Pro140 tiene una mayor afinidad de unión por MPER que A10E8/Pro140 y 10E8/Pro140. La figura 9 muestra la potencia de inhibición de 10E8/Pro 140, A10E8/Pro140 y 4E10/Pro140 y sus anticuerpos progenitores 10E8, A10E8 y 4E10 frente a diversas cepas del VIH. Las figuras 10 y 13 a 17 proporcionan pruebas adicionales de la mayor potencia de los anticuerpos CrossMab en comparación con sus anticuerpos progenitores individualmente y los anticuerpos progenitores en combinación.
La cobertura antivírica mejorada de los CrossMab 10E8/iMab y 10E8/Pro140 se ilustra en la figura 10, que representa la potencia y la amplitud de varios anticuerpos contra el VIH. El eje de abscisas indica la concentración de un anticuerpo concreto, el eje de ordenadas indica el porcentaje de un gran panel de colonias aisladas víricas del VIH neutralizados por un anticuerpo concreto a una concentración específica, y cada línea indica un anticuerpo diferente evaluado. Las líneas situadas más a la izquierda en el eje de abscisas y las que pueden acercarse o alcanzar el 100 % en el eje de ordenadas indican un anticuerpo muy potente y amplio contra el VIH. El CrossMab 10E8/P140 y el CrossMab 10E8/iMab se encuentran entre los anticuerpos más eficaces con respecto tanto a la cobertura vírica como a la potencia, y son significativamente más eficaces que sus anticuerpos progenitores.
Las figuras 18 y 19 muestran la potencia del anticuerpo CrossMab 10E8/515H7 en comparación con sus anticuerpos progenitores y anticuerpos previamente analizados. La potencia de un anticuerpo CrossMab no parece correlacionarse directamente con la densidad de las proteínas diana de la membrana celular, ya que la densidad de CCR5 (diana de Pro140) es menor que la de CD4 (diana de ibalizumab) y, sin embargo, la potencia del anticuerpo CrossMab derivado de 10E8/Pro140 es mayor que la del anticuerpo CrossMab derivado de 10E8/iMab.
Tal como se muestra en la figura 22, la falta de picos únicos y nítidos en la cromatografía de exclusión por tamaño indica un tipo de inestabilidad indicativa de múltiples especies moleculares para los anticuerpos 10E8 y CrossMab derivados de 10E8. La tabla 1 muestra diversas modificaciones del proceso y de la formulación utilizadas para resolver la inestabilidad del 10E8. Sin embargo, tal como indica la "X" en la columna SEC o cromatografía de exclusión por tamaño ("Size Exclusion Chromatography"), las modificaciones no consiguieron proporcionar un pico único y nítido.
Tabla 1: Selección del proceso y la formulación para resolver la inestabilidad de 10E8
Figure imgf000030_0001
El apareamiento de la cadena pesada de 10E8 con la cadena ligera de 4E10 resuelve el problema de inestabilidad, tal como se muestra en la figura 23, produciendo un anticuerpo funcional, aunque menos potente. Este resultado indica que la inestabilidad de 10E8 se debe a la cadena ligera. Diversas modificaciones de la cadena ligera de 10E8, mostradas en los paneles central e inferior de la figura 24, tales como la eliminación de una serina C-terminal, la modificación de una quimera de la región variable de lambda y la región constante de kappa, la modificación de un enlace disulfuro adicional entre las cadenas pesada y ligera de 10E8, o el injerto genético de regiones de cadena ligera kappa de anticuerpos no 10E8 en la cadena ligera de 10E8 no resuelven completamente la inestabilidad de 10E8. Tal como se muestra en las figuras 25 y 26, la inestabilidad se debe probablemente a una combinación de las regiones determinantes de la complementariedad ("Complementarity Determining Regions", CDR) y las regiones marco ("framework", FW) de 10E8. Utilizando 10E8-HC/4E10-LC, cada CDR de la cadena ligera de 10E8 se injertó en 4E10LC individualmente o en conjunto, tal como se muestra en la figura 25. La adición de las CDR2 y CDR3 de LC de 10E8 se toleró bien, pero la adición de la CDR1 de LC de 10E8 altera el pico único. Cuando todas las CDR de 10E8 se injertan en 4E10, el pico es amplio. El injerto de CDR o marcos de 10E8 en su cadena ligera A de línea germinal da como resultado un pico único, tal como se muestra en la figura 26, pero la eficacia en la unión a MPER y la neutralización del VIH disminuye. En la tabla 2 se resumen las variantes de la cadena ligera de 10E8 ensayadas y su eficacia.
Tabla 2: Variantes de LC de 10E8 generados
Figure imgf000031_0001
La variante H6L10 del anticuerpo 10E8 resultó ser activa, no autorreactiva y estable por cromatografía de exclusión por tamaño, tal como se muestra en la figura 27. Se observó que H6L10/Pro 140 y sus anticuerpos progenitores presentaban perfiles farmacocinéticos comparables en ratones, tal como se muestra en la figura 28. Sin embargo, tal como se muestra en la figura 29, la variante H6L10 de 10E8 (denominada 10E8v 1.0) combinada con P140 en un anticuerpo biespecífico es sustancialmente menos potente que 10E8/P140 cuando se ensaya contra un amplio panel de cepas del VlH. La variante H6L10 de 10E8 (denominada 10E8v1.ü) combinada con iMab en un anticuerpo biespecífico conserva la misma cantidad relativa de potencia en comparación con 10E8/iMab cuando se ensaya frente a un amplio panel de cepas del VIH, pero 10E8v 1.0/iMab posee la misma inestabilidad que 10E8/iMab según se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño y se indica con una X en la tabla 3. En una realización, la variante H6L10 puede incluir además una mutación S74W.
La tabla 3 enumera ejemplos de variantes, sus actividades, los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño y los resultados farmacocinéticos ("pharmacokinetics", PK).
Tabla 3: Ejemplos de variantes que son estables, al mismo tiempo que conservan la actividad anti-VIH
Figure imgf000032_0001
Tal como se ha indicado anteriormente, 10E8vi.o es una variante somática de 10E8 conocida como H6L10. Como mAb, H6L10 tiene un solo pico de SEC, pero presenta una actividad reducida en comparación con 10E8. El CrossMab H6L10/Pro140 tiene un solo pico de SEC y una buena PK en ratones, pero una actividad anti-VIH reducida. El CrossMab H6L10/iMab tiene picos de SEC dobles y una PK deficiente en ratones, pero su actividad contra el VIH es aproximadamente la misma que 10E8/iMab. 10E8vi.i incluye una única mutación puntual en H6L10. Cuando se aparea con Pro140 en un CrossMab biespecífico, esta construcción tiene un solo pico de SEC y una buena PK en ratones. Su actividad contra el VIH mejora en comparación con 10E8V1.0/Pro140, pero sigue siendo ligeramente inferior a la de 10E8/Pro140. Cuando se aparea con iMab en un CrossMab biespecífico, esta construcción tiene picos de SEC dobles y una PK deficiente en ratones, y su actividad contra el VIH sigue siendo aproximadamente la misma que 10E8/iMab y 10E8V1.0/iMab. 10E8v 2.oes una variante de anticuerpo quimérico de 1OE8 en la que el FW1, CDR1 y parte del fW2 son de 10E8V1.0 y la parte restante de FW2, CDR2, FW3, CDR3 y FW4 son de 10E8. Cuando se aparea con Pro140 en un CrossMab biespecífico, esta construcción tiene picos de SEC dobles y tiene una actividad reducida contra el VIH en comparación con 10E8/Pro140. Cuando se aparea con iMab en un CrossMab biespecífico, esta construcción tiene un único pico de SEC, una buena PK y una actividad contra el VIH mejorada respecto a 10E8/iMab.
10E8v3.o es una variante somática de 10E8 conocida como H11L1. El CrossMab H11L1/Pro140 tiene un único pico de SEC y mejor actividad anti-VIH que cualquier otra construcción de 10E8/Pro140 (incluyendo la original identificada), pero tiene una PK deficiente en ratones debido a la autorreactividad. El CrossMab H1lLl/iMab tiene un único pico de SEC y una actividad anti-VIH mejor que el 10E8/iMab original identificado y una actividad aproximadamente equivalente a la observada para el 10E8V2.0/iMab, pero tiene una PK deficiente en ratones debido a la autorreactividad.
La variante de 10E8 que produjo un solo pico de SEC en el contexto de un CrossMab biespecífico concreto fue diferente cuando se apareó con Pro140 o iMab. Parece que la estabilidad del brazo de 10E8 de estos anticuerpos CrossMab biespecíficos depende del contexto y variará en función del anticuerpo con el que se aparee. Así, se identificó una variante (10e 8v i.i ) que era estable según SEC y con buena PK en ratones y buena actividad anti-VIH cuando se apareaba con Pro140. También se identificó otra variante (10E8v2.o) que era estable según SEC con buena PK en ratones y con mejor actividad anti-VIH que el 10E8/iMab identificado originalmente.
La tabla 4 a continuación describe la autorreactividad de las variantes ensayadas, en la que "ANA" se refiere a la actividad antinuclear y "ACA" se refiere a la actividad anticardiolipina.
Tabla 4: Evaluación de la autorreactividad in vitro
Figure imgf000033_0001
|jLa figura 30 representa la farmacocinética de los anticuerpos 10E8 y CrossMab derivados de varias variantes de 10E8 e iMab o P140 en un modelo de ratón. Tal como se muestra en las figuras 31 y 32, 0E8v m /P140 y 10E8v2.0/iMab mejoran la actividad y la estabilidad contra el VIH, y presentan una buena estabilidad cuando se conservan en PBS a 4 °C. La figura 33 muestra un análisis de espectroscopia de masas nativa de 10E8v2.0/iMab (N297A). La figura 34 compara la actividad de 10E8v n /P140 and 10E8v2.0/iMab en un panel de VIH clado C, y compara su eficacia de CI50 e CI80. Las figuras 35 y 36 comparan la potencia de 10E8v n /P140, 10E8v2.0/iMab y diversos anticuerpos monoclonales contra el VIH.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo biespecífico capaz de neutralizar el VIH, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera y una cadena pesada de un primer anticuerpo 10E8, que se une a la proteína gp41 de la envoltura del VIH, y una cadena ligera y una cadena pesada de un segundo anticuerpo ibalizumab, que se une a la proteína del receptor de la membrana celular CD4, en el que:
la cadena ligera del primer anticuerpo 10E8 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, y la cadena pesada del primer anticuerpo 10E8 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; y
la cadena ligera del segundo anticuerpo ibalizumab comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y la cadena pesada del segundo anticuerpo ibalizumab comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
2. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en la que la composición está formulada para la administración oral, intranasal, pulmonar, intradérmica, transdérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa.
4. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de la reivindicación 2 o 3 para su uso en la neutralización del VIH, en el que el anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica se administra a un sujeto que lo necesita.
5. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de la reivindicación 2 o 3 para su uso en el tratamiento del VIH, en el que el anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica se administrará a un sujeto infectado por el VIH.
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