WO2018018123A2

WO2018018123A2 - Anticorpos monoclonais humanos antitetânicos neutralizantes para a infecção por c.tetani, método de obtenção dos ditos anticorpos monoclonais e seu uso na imunoterapia para acidentes susceptíveis à infecção pelo bacilo tetânico

Info

Publication number: WO2018018123A2
Application number: PCT/BR2017/050215
Authority: WO
Inventors: Ana Maria MORO; Jorge Elias Kalil Filho; Eduardo ALIPRANDINI
Original assignee: Fundacao Butantan
Current assignee: Fundacao Butantan
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2018-02-01
Anticipated expiration: 2019-01-29
Also published as: AR125231A2; WO2018018123A3; BR102016017782A2; AR125232A2; PH12019500431A1; AR109221A1

Abstract

A presente invenção se refere a anticorpos monoclonais humanos antitetânicos para a infecção por C. tetani, os quais são obtidos a partir de técnicas de engenharia genética tendo como base a informação de sequência gênica obtida a partir de linfócitos B do sangue periférico de pessoas imunizadas com o toxóide tetânico. A informação genética é inserida em vetores usados para transfecção de células de mamíferos com o objetivo de gerar linhagens celulares produtoras dos anticorpos monoclonais antitetânicos. Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a composições imunológicas contendo o dito anticorpo monoclonal, assim como seus usos no tratamento e/ou imunoterapia da infecção por tétano.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para: "ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS ANTITETANICOS NEUTRALIZANTES PARA A INFECÇÃO POR C.TETANI, MÉTODO DE OBTENÇÃO DOS DITOS ANTICORPOS MONOCLONAIS E SEU USO NA IMUNOTERAPIA PARA ACIDENTES SUSCEPTÍVEIS À INFECÇÃO PELO BACILO TETÂNICO" .

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere anticorpos monoclonais humanos antitetânicos neutralizantes para a infecção por C. tetani, método de obtenção dos ditos anticorpos monoclonais e seu uso na imunoterapia para acidentes susceptíveis à infecção pelo bacilo tetânico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O tétano é uma doença neurológica causada pela toxina da bactéria Clostridium tetani, um bacilo gram- positivo esporulado presente em grande quantidade no solo, instrumentos enferrujados e poeira ( Collingridge , 1982) . A toxina tetânica (TxT) ativa é uma proteína composta por uma cadeia leve (cerca de 50 kDa) e uma pesada (100 kDa) ligadas por pontes dissulfeto. Sua síntese no citoplasma da bactéria ocorre como uma cadeia polipeptídica única. Quando transportada para o exterior, ocorre quebra da cadeia por enzimas presentes na parede celular do C. tetani gerando as cadeias pesada e leve mencionadas acima (Bizzini et al . , 1970; Matsuda et al . , 1974).

[003] A principal ação da TxT envolve o bloqueio da liberação de neurotransmissores inibitórios (glicina e GABA- ácido-Y-aminobutírico ) em neurónios medulares (Humeau et al . , 2000) . Como resultado, causa hipertonia muscular mantida, hiperreflexia e espasmos. A cadeia leve (domínio A) contém motivo de ligação de zinco que é responsável pela ação proteolítica sobre um complexo presente nas vesículas sinápticas, chamado VAMP/sinaptobrevina . VAMP, quando intacta, tem a função de favorecer a aproximação e fusão da vesícula à membrana pré-sináptica, garantindo a liberação dos neurotransmissores inibitórios na sinapse (Schiavo et al., 1992a; Schiavo et al . , 1992b).

[004] A cadeia pesada da toxina tem papel anterior a esse evento. O domínio presente na porção C-terminal da cadeia pesada (conhecida como fragmento C) é responsável pela ligação ao neurônio através da interação com gangliosídios presentes na membrana. Gangliosídios são glicoesfingolipídeos complexados com ácido siálico (Chen et al . , 2009) . Outro domínio (domínio B) da cadeia pesada tem função na translocação, que ajuda a toxina a atravessar a membrana neuronal .

[005] Após internalizada, a TxT é transportada de forma retrógrada até neurónios da medula espinhal, onde causa seus efeitos tóxicos.

[006] A dose letal tóxica (LD) da toxina em camundongos é entre 0,1 e 1 ng/kg de peso corporal. A sensibilidade em humanos para essa toxina é similar à dos camundongos. É uma das substâncias mais tóxicas que se conhece (Schiavo et al . , 2000) . A proteção contra a toxina é garantida pela vacinação com o toxoide tetânico, que corresponde à anatoxina tetânica (AnT) adsorvida pelo hidróxido de alumínio (Brasil, 2010) . No Instituto Butantan a toxina é obtida a partir do cultivo da bactéria por filtração tangencial e precipitação com sulfato de amónio, depois destoxifiçada por tratamento com formaldeído e glicina durante 30 dias, gerando a AnT (Sonobe et al . , 2007) . Um estudo feito em São Paulo mostrou que 3% da população não apresenta proteção contra o tétano (nível de anticorpo < 0,01 UI/mL) e em 18%, a quantidade de anticorpos circulantes no sangue está entre 0,01 e 0,1 U/mL, o que representa nível basal de proteção (Divono-Goes et al . , 2007) .

[007] A letalidade do tétano chega a 30% e atinge principalmente os menores de cinco anos e os idosos (Ministério da Saúde, 2005) . Em indivíduos idosos, observa- se maior número de pessoas sem proteção vacinai. Um estudo publicado em 2006 avaliou a imunidade de 98 idosos de um asilo em São Paulo, SP, com média de idade de 84 anos através da dosagem de anticorpos antitetânicos (anti-TT) . O resultado mostrou que 94% dos indivíduos testados eram suscetíveis ao tétano e, após uma dose reforço da vacina do tétano, esse número diminuiu para 79%, ainda considerado preocupante (Weckx et al . , 2006) .

[008] A Tabela 1 mostra dados dos casos confirmados de tétano por região no Brasil.

Tabela 1: Incidência de tétano (exceto o neonatal)

confirmados por região.

Óbito

Região

Região Região Região Região Ign/ por

Ano Centro- Total Cura Óbito

Norte Nordeste Sudeste Sul Branco outra

Oeste

causa

2010 29 109 59 66 25 288 145 88 51 4

2011 44 133 72 54 32 335 188 101 39 7

2012 42 108 70 55 44 319 176 108 31 4

2013 37 60 64 59 62 282 152 92 32 6

2014 41 89 65 46 32 273 148 75 45 5

2015 10 24 26 16 7 83 31 22 28 2

TOTAL 203 523 356 296 202 1580

Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE (2015b)

1. Situação da base de dados de julho/2015

2. Excluídos casos não residentes no Brasil

3. Informações referentes a tétano acidental, apenas [009] A incidência de tétano neonatal está diminuindo no Brasil. Em 2001 foram registrados 27 casos em todo o pais, o que é considerado eliminação da doença, pois equivale a menos de um caso por 1000 nascidos vivos (FUNASA, 2001) . Em 2012 (último registro encontrado) foram registrados dois casos no Brasil, um no Pará e outro em Minas Gerais (Ministério da Saúde, 2015a) .

A tabela 2 mostra uma comparação entre o tétano neonatal e tétano total durante os anos de 2010 a 2014.

[0010] A perfuração da pele com objetos contaminados está entre as principais causas para a evolução para tétano. Dentre os procedimentos para a profilaxia nesses casos está a utilização do soro antitetânico equino (SAT), produzido pelo Instituto Butantan. Esse soro é obtido a partir da inoculação do toxoide tetânico em cavalos. Após a completa imunização dos animais, um volume de plasma é colhido por aférese, de onde é processado o soro que contém os anticorpos anti-TT. As imunoglobulinas produzidas pelo cavalo são administradas aos pacientes que sofreram acidente com perfuração e que correm o risco de se contaminar com C. tetani_f e têm a função de se ligar à toxina e neutralizá-la. [0011] A imunidade contra a toxina é provida pela vacinação e a doença não confere imunidade ao paciente, já que a TxT é um imunógeno fraco. O que garante a imunogenicidade do toxoide na vacina é a presença do adjuvante, que pode ser o gel de hidróxido de alumínio, como no caso da vacina produzida pelo Instituto Butantan (Lindley- Jones et al . , 2004) . Nos casos em que o SAT é administrado, a proteção dura uma semana em média. Além do soro existe a imunoglobulina humana hiperimune antitetânica (IGHAT) . É fabricada a partir do plasma de doadores que foram imunizados recentemente e que apresentam altos títulos do anticorpo. A IGHAT é indicada em casos de hipersensibilidade ao soro heterólogo ou história pregressa de alergia ou reação de hipersensibilidade ao uso de outros soros heterólogos (Funasa, 2001) . O uso de imunoglobulinas humanas, ainda que devidamente testadas quanto à presença de vírus contaminantes, não é completamente isento de riscos devido ao potencial de conter vírus emergentes ou ainda não detectáveis .

[0012] A persistência de casos de tétano, quando já existe uma vacina eficiente, demanda alternativas para o tratamento. Em casos suspeitos, utiliza-se o soro antitetânico obtido de animais, em geral cavalos, composto de anticorpos policlonais. Sabe-se, porém, que o uso de proteínas heterólogas pode induzir a formação de anticorpos contra essas imunoglobulinas, o que limita sua utilização em uma dose e inviabiliza o possível tratamento em outras situações, em que anticorpos heterólogos estão disponíveis. O uso da imunoglobulina humana hiperimune obtida de doadores humanos, apesar de ser uma boa alternativa, apresenta riscos em casos de transmissão de doenças e a produção dos lotes não é homogénea.

[0013] Infecções por micro-organismos que causam mortalidade são geralmente tratadas por imunoterapia passiva pela injeção de anticorpos neutralizantes . No caso de acidentes com probabilidade de infecção com o bacilo C. tetani_f que causa o tétano, é utilizada a soroterapia com soro hiperimune produzido em cavalos ou, em casos de hipersensibilidade, é utilizado a imunoglobulina humana hiperimune. A soroterapia tem papel terapêutico crucial no combate a acidentes com probabilidade de infecção pelo Clostridium tetani, que causa o tétano.

[0014] O Instituto Butantan, por exemplo, produz o soro policlonal equino antitetânico que é eficaz, porém de origem heteróloga.

[0015] O soro heterólogo antitetânico foi proposto há mais de cem anos. Hoje existem tecnologias que permitem a obtenção de produtos mais definidos, com consistência de produção e menor imunogenicidade .

[0016] A tendência moderna é a utilização de medicamentos biológicos modernos, em geral obtidos pela tecnologia do DNA recombinante .

[0017] A imunoterapia é comprovadamente eficiente quando se conhece o antigeno e se dispõe de anticorpos que o reconhecem e exercem alguma função, citotóxica, bloqueio de vias de sinalização, adjuvante ou neutralizante . Devido ao potencial terapêutico comprovado dos anticorpos, há um investimento continuo para torná-los mais eficazes e seguros. Um desafio consiste na produção de moléculas terapêuticas bem toleradas pelos pacientes. [0018] Há um grande desenvolvimento na área de anticorpos monoclonais, para torná-los mais humanos (humanizados), quando obtidos a partir de animais. Existem empresas que modificaram geneticamente camundongos, substituindo seus genes para síntese de imunoglobulinas por genes de imunoglobulinas humanas, pela necessidade de obter anticorpos com características mais próximas dos humanos.

[0019] Os anticorpos são moléculas secretadas por linfócitos B cuja região de reconhecimento do antígeno é igual à do receptor rearranjado presente na membrana. São formados por duas cadeias: pesada e leve, cada uma sendo codificada em cromossomos diferentes. A cadeia pesada (50 kDa) é formada por quatro regiões, CHI, C3 que correspondem à região constante e V, que corresponde à região variável. A região constante determina a classe e subclasse a qual o anticorpo pertence. As classes, conhecidas como isotipos podem ser IgM (cadeia constante μ) , IgG (γ) , IgA (a), IgE (ε) e IgD (d) , sendo que cada cadeia confere funções diferentes. A cadeia leve (25 kDa) é composta de uma região constante, CL, e uma variável, VLH. Existem dois tipos de cadeia leve: cadeia kappa (κ -gene localizado no cromossomo 2) e lambda (λ - gene localizado no cromossomo 22) que são diferenciadas pela região C. Em seres humanos, a relação entre cadeias kappa e lambda no repertório geral de anticorpos é de cerca de 60% kappa e 40% lambda (Abbas et al, 2012; Mcbride et al . , 1982).

[0020] Os anticorpos monoclonais (AcMos) são ferramentas importantes para o tratamento e diagnóstico por sua especificidade de ligação ao antígeno e produção homogénea em grandes quantidades. Os estudos com anticorpos ganharam incentivo na década de 70, quando foi desenvolvida a técnica de produção de hibridomas (Kohler; Milstein, 1976) . Através dessa técnica foi possível imortalizar uma célula produtora de um anticorpo de interesse pela sua fusão com uma célula de mieloma de origem murina. 0 produto hibridoma, passível de ser cultivado in vitro e produzir os AcMos selecionados . A tecnologia dos hibridoma trouxe avanços importantes nas pesquisas relacionadas ao diagnóstico de diversas patologias. A área de diagnóstico tem uma linha divisória antes e após a introdução dos AcMos, de forma isolada ou em kits. A abordagem terapêutica dirigida ao alvo, proporcionada pelos AcMos, necessitou de outra onda de inovação em pesquisa, criando os anticorpos quiméricos ou humanizados. Há mais de quarenta AcMos aprovados pelo FDA para o tratamento de rejeição de transplantes, câncer de mama, colorretal, linfoma, leucemia, esclerose múltipla, entre outros (Deffar e colaboradores, 2009; FDA, 2015; Reichert, 2012) .

[0021] A técnica de captura de linfócitos B de sangue periférico de indivíduos infectados pelo HIV (vírus da imunodeficiência humana) foi utilizada para obter sequências gênicas de anticorpos monoclonais, visando a imunoterapia passiva de pacientes com AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida) , sendo que os anticorpos monoclonais encontram- se em fase experimental de uso clínico (Tiller et al, 2008; Scheid et al, 2009a, b; Mouquet et al, 2010, 2011; Wardermann et al, 2013; Barbian et al, 2015; Zhou et al, 2015) .

[0022] A tendência moderna é de utilizar anticorpos monoclonais na forma humanizados ou humanos, sempre que o antígeno definido permitir essa abordagem. A possibilidade existe para a toxina tetânica, composta por 3 regiões com 150 kDa de massa molecular e conhecido modo de ação na interferência da transmissão de comunicação entre os neurônicos medulares inibitórios ao bloquear a liberação de neurotransmissores inibitórios. 0 pedido de patente Chinês CN 105153305, publicado em 16 de dezembro de 2015, em nome de ANTAGEN BEIJING BIOTECHNOLOGIES CO LTD., e intitulado: "FULLY HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST TETANUS TOXIN AND DERIVATIVE THEREOF, AND PREPARATION METHOD AND APPLICATION THEREOF" se refere a um anticorpo monoclonal totalmente humano contra a toxina do tétano. As sequências de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal são definidas na SEQ ID NO: 3 e na SEQ ID No. 4, respectivamente. De preferência, as sequências de aminoácidos de uma cadeia pesada e uma cadeia leve do anticorpo monoclonal são definidas nas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. O referido pedido de patente Chinês CN 105153305 ainda descreve um método de preparação e aplicação do anticorpo monoclonal totalmente humano contra a toxina do tétano e seu derivado. O anticorpo monoclonal totalmente humano contra a toxina do tétano fornecido pelo dito documento pode eliminar os riscos biológicos de reação anafilática e contaminação virai tendo uma meia-vida suficientemente longa e elevado titulo e atividade in vivo podendo ser aplicado à produção industrial em grande escala.

[0023] Contudo, através do programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), o qual foi desenvolvido para realizar buscas comparando sequências biológicas primárias contra um banco de dados que contém uma quantidade gigantesca de informação foi observado que as sequências reveladas no pedido de patente Chinês CN 105153305 possuem baixa porcentagem de identidade com as sequencias reveladas na presente invenção, mostrando que o referido pedido de patente Chinês CN 105153305 e a presente invenção possuem anticorpos monoclonais completamente diferentes.

[0024] O pedido de Patente Chinês CN 102453091, publicado em 16 de maio de 2012, em nome de SHANGHAI INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO., LTD, e intitulado: "TETANUS TOXOID MONOCLONAL ANTIBODY AND PREPARATION METHOD AND APPLICATION THEREOF" revela um anticorpo monoclonal de toxóide de tétano, um método de preparação e sua aplicação, em particular, a um anticorpo monoclonal contra a toxina tetânica. Uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal compreende a CDR1 mostrada como SEQ ID NO: 6, CDR2 mostrada como SEQ ID NO: 8 e / ou CDR3 mostrada como SEQ ID NO: 10; e uma CDR de uma região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal compreende a CDR1 mostrada como SEQ ID NO: 12, CDR2 mostrada como SEQ ID NO: 14 e CDR3 mostrada como SEQ ID NO: 16. A invenção descrita no dito pedido de patente Chinês CN 102453091 também fornece uma molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA) para codificar a sequência, um vetor de expressão e uma célula hospedeira.

[0025] Contudo, através do programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) foi observado que as sequências reveladas no pedido de patente Chinês CN 102453091 possuem baixa porcentagem de identidade com as sequencias reveladas na presente invenção, mostrando que o referido pedido de patente Chinês CN 102453091 e a presente invenção possuem anticorpos monoclonais completamente diferentes.

[0026] A patente Japonesa JPH0257195, publicada em 26 de fevereiro de 1990, em nome de MORINAGA & CO LTD, e intitulada: "HUMAN TYPE MONOCLONAL ANTIBODY OF ANTI-TETANUS TOXIN" se refere a um tipo de anticorpo monoclonal humano que tem a capacidade neutralizante elevada de toxina do tétano. A matéria descrita no dito documento é utilizada para a prevenção e tratamento do tétano e sendo produzido de forma estável em uma grande quantidade, em que na preparação primeiro linfócitos tendo alto valor de anticorpos neutralizante da toxina do tétano e formando um anticorpo do tipo IgG é coletado a partir de humano imunizado contra a toxina do tétano (TT) . Em seguida, o derivado de linfócitos humano é provocado com um antigeno e fundido com uma célula parental. Em seguida, uma cepa celular formando o anticorpo acima mencionado é selecionada a partir do hibridoma preparado e a cepa celular é produzida.

[0027] Como pode ser observado, os anticorpos monoclonais da referida patente Japonesa JPH0257195 são obtidos a partir da técnica do hibridoma. 0 referido documento não descreve nenhuma sequência (SEQ ID NO) na definição dos ditos anticorpos monoclonais. Sendo assim, a patente Japonesa JPH0257195 e a presente invenção possuem anticorpos monoclonais totalmente diferentes.

[0028] A patente Japonesa JPH1014570, publicada em 20 de janeiro de 1998, em nome de MATSUDA MORIHIRO e MORINAGA & CO LTD, e intitulada: "ANTIBODY DNA" se refere à obtenção de um cDNA que contém uma sequência de nucleotideos especifica e útil para a terapia antitóxica e prevenção de doenças infecciosas por Clostridium tetani e produção em massa de um anticorpo monoclonal humano em escala industrial, através de uma técnica de engenharia genética. Este cDNA, que codifica uma região variável de uma cadeia pesada do anticorpo, em particular, codifica um anticorpo monoclonal humano que contém uma sequência de nucleotideos da fórmula, é obtido por clonagem do cDNA produzido a partir de RNAm tomado a partir de um hibridoma [por exemplo, hibridoma TTG6 (FERM P-15719) ]

[0029] Como também pode ser observado, os anticorpos monoclonais da referida patente Japonesa JPH1014570 são obtidos a partir da técnica do hibridoma. O referido documento não descreve nenhuma sequência especifica (SEQ ID NO) na definição dos ditos anticorpos monoclonais. Sendo assim, a patente Japonesa JPH1014570 e a presente invenção possuem anticorpos monoclonais totalmente diferentes.

[0030] A patente Europeia EP 0562132, publicada em 29 de setembro de 1993, em nome de MATSUDA MORIHIRO e MORINAGA & CO LTD, intitulado: "MONOCLONAL ANTI-TETANUS TOXIN ANTIBODIES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING THEM" se refere a anticorpos monoclonais contra a toxina antitetânica que se ligam à cadeia leve da toxina do tétano e neutralizam a atividade biológica da toxina do tétano. Além disso, os anticorpos monoclonais antitétano que se ligam são divulgados adicionalmente para o fragmento C da cadeia pesada da toxina do tétano. Além disso, composições farmacêuticas são descritas contendo os referidos anticorpos monoclonais. Em uma concretização preferida, estas composições farmacêuticas são para a imunização passiva contra o tétano.

[0031] A referida patente Europeia EP 0562132 não descreve uma listagem de sequência referente ao dito anticorpo. Portanto, um técnico versado no assunto com base nos ensinamentos divulgados na patente Europeia EP 0562132 não poderia ser motivado a alcançar o anticorpo monoclonal definido através da listagem de sequências da presente invenção.

[0032] A obtenção de anticorpos antitetânicos monoclonais humanos representa uma tendência atual de oferta de biológicos com consistência de lotes de produção e imunogenicidade nula ou baixa. A presente invenção representa inovação no uso de imunoterapia contra doenças infecciosas, que foi iniciada há mais de um século com o uso de soros hiperimunes de animais imunizados, e hoje pode contar com métodos de biotecnologia para a obtenção de imunobiológicos mais consistentes e seguros.

[0033] Como pode ser observado, nenhum dos documentos do estado da técnica ensina ou muito menos sugere anticorpos monoclonais humanos antitetânicos neutralizantes para a infecção por C. tetani conforme definido pelas sequências específicas revelada pela presente invenção. Assim como, nenhum dos documentos do estado da técnica ensina ou muito menos sugere o método de obtenção dos anticorpos monoclonais revelados pela presente invenção e seu uso na imunoterapia para acidentes susceptíveis à infecção pelo bacilo tetânico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0034] Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação à obtenção de anticorpos monoclonais humanos com propriedades neutralizantes, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/benefício mais favorável.

[0035] A presente invenção propõe a obtenção de anticorpos monoclonais humanos com propriedades neutralizantes para o tratamento de pessoas com probabilidade de desenvolver tétano. Trata-se de produtos que podem ser obtidos de forma homogénea, com consistência de lotes e sem causar imunogenicidade.

[0036] Os anticorpos monoclonais da presente invenção são obtidos a partir de técnicas de engenharia genética tendo como base a informação de sequência gênica obtida a partir de linfócitos B do sangue periférico de pessoas imunizadas com o toxóide tetânico. A informação genética é inserida em vetores usados para transfecção de células de mamíferos com o objetivo de gerar linhagens celulares produtoras dos anticorpos monoclonais antitetânicos .

[0037] A presente invenção propõe um novo produto, que possa ser obtido de forma homogénea e consistente, de origem humana, para evitar reações de hipersensibilidade e imunogenicidade .

[0038] Os anticorpos monoclonais da presente invenção têm sequências únicas de nucleotídeos e aminoácidos .

[0039] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso dos referidos anticorpos monoclonais humanos para imunoterapia da infecção acidental por tétano. A vacinação, embora eficiente, mostra proteção diminuída nos idosos, não recuperada pela revacinação. Também são suscetíveis à infecção por tétano as pessoas acidentadas que não receberam reforço da vacina.

[0040] Em um outro aspecto da presente invenção se refere ao tétano neonatal, veiculado pelo corte do cordão umbilical, onde os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção poderiam ser utilizados em recém-nascidos acometidos pela infecção, já que outros anticorpos monoclonais de combate a agentes infecciosos são usados em bebés .

[0041] As sequências gênicas dos anticorpos neutralizantes da presente invenção serão utilizadas para geração de linhagens celulares estáveis produtoras dos anticorpos, em produtividade para escalonamento e produção em biorreatores . 0 produto resultante é um anticorpo com consistência de lote, de potência e de efetividade para uso em casos de acidentes com potencial de infecção pelo tétano. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0042] A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e a seguinte descrição:

[0043] A Figura 1 é um fluxograma mostrando a estratégia experimental para obtenção dos anticorpos monoclonais da presente invenção;

[0044] A Figura 2 mostra o resultado de ELISA qualitativo de ligação dos anticorpos à toxina tetânica, onde os anticorpos da presente invenção foram testados nas concentrações de 0,4 a 50 ng/mL. Soro do doador com alto titulo de neutralização foi usado para validação do teste como controle positivo na diluição inicial de 1:50 e diluições seriadas 1:5. Placa sensibilizada com 100 pL de toxina tetânica a 5 pg/mL;

[0045] A figura 3 mostra o resultado ELISA qualitativo de ligação dos anticorpos à anatoxina tetânica. Os anticorpos da presente invenção foram testados nas concentrações de 0,4 a 50 ng/mL. Soro do doador com alto titulo de neutralização foi usado para validação do teste como controle positivo na diluição inicial de 1:50 e diluições seriadas 1:5. Placa sensibilizada com 100 pL de anatoxina tetânica a 5 pg/mL; e

[0046] A figura 4 mostra o resultado de ensaio de neutralização da toxina tetânica in vivo da mistura dos anticorpos monoclonais 243 + 143 + 120. A mistura dos AcMos garantiu a sobrevivência de 100% dos animais quando utilizados 28 e 14 pg dos ditos anticorpos; e

[0047] A figura 5 mostra o resultado ELISA dos anticorpos monoclonais 120, 143 e 243 da presente invenção para teste de ligação com anatoxina diftérica. Anticorpos testados nas concentrações de 0,4 a 50 ng/mL em quatro diluições seriadas 1:5. Soro policlonal humano foi usado como controle positivo na diluição inicial de 1:50 e diluições seriadas 1:5. Placa sensibilizada com 100 pL de anatoxina diftérica a 2 pg/mL.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0048] Embora a presente invenção possa ser suscetivel a diferentes modalidades, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com o entendimento de que a presente modalidade deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.

[0049] Em um primeiro aspecto a presente invenção propõe a obtenção de anticorpos monoclonais humanos com propriedades neutralizantes para o tratamento de pessoas com probabilidade de desenvolver tétano. Trata-se de produtos que podem ser obtidos de forma homogénea, com consistência de lotes e sem causar imunogenicidade .

[0050] Os anticorpos monoclonais da presente invenção são obtidos a partir de técnicas de engenharia genética tendo como base a informação de sequência gênica obtida a partir de linfócitos B do sangue periférico de pessoas imunizadas com o toxóide tetânico. A informação genética é inserida em vetores usados para transfecção de células de mamíferos com o objetivo de gerar linhagens celulares produtoras dos anticorpos monoclonais antitetânicos .

[0051] Em um segundo aspecto a presente invenção propõe um novo produto, que possa ser obtido de forma homogénea e consistente, de origem humana, para evitar reações de hipersensibilidade e imunogenicidade .

[0052] Os anticorpos monoclonais da presente invenção têm sequências únicas de nucleotideos e aminoácidos .

[0053] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso dos referidos anticorpos monoclonais humanos para imunoterapia da infecção acidental por tétano. A vacinação, embora eficiente, mostra proteção diminuída nos idosos, não recuperada pela revacinação. Também são suscetíveis à infecção por tétano as pessoas acidentadas que não receberam reforço da vacina.

[0054] Em um outro aspecto da presente invenção se refere ao tétano neonatal, veiculado pelo corte do cordão umbilical, onde os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção poderiam ser utilizados em recém-nascidos acometidos pela infecção, já que outros anticorpos monoclonais de combate a agentes infecciosos são usados em bebés .

[0055] As sequências gênicas dos anticorpos neutralizantes da presente invenção serão utilizadas para geração de linhagens celulares estáveis produtoras dos anticorpos, em produtividade para escalonamento e produção em biorreatores . O produto resultante é um anticorpo com consistência de lote, de potência e de efetividade para uso em casos de acidentes com potencial de infecção pelo tétano. [0056] A implantação da tecnologia para anticorpos monoclonais humanos demonstrada na presente invenção abrirá um caminho para o tratamento do tétano, e também de outras doenças infecciosas, tais como difteria, raiva, zika, etc.

[0057] A vacina contra o tétano é sempre administrada junto com a diftérica (DT) . Diante deste fato, os anticorpos da presente invenção foram testados contra toxina diftérica e são exclusivos contra toxina tetânica.

CONCRETIZAÇÃO PREFERENCIAL DA PRESENTE INVENÇÃO

[0058] A presente invenção baseia-se na clonagem e expressão dos genes produtores de imunoglobulinas obtidos diretamente de linfocitos B humanos. Por essa técnica, amplificam-se os genes dos domínios variáveis das imunoglobulinas de um único linfócito B humano produtor de um anticorpo específico, que são clonados em um vetor de expressão à montante da região constante humana respectiva (pesada ou leve) .

[0059] Dessa forma, após transfecção, as células eucariotas produzirão uma molécula de anticorpo inteiro, com estrutura idêntica à humana. Para a produção de anticorpos por essa metodologia são necessários: a coleta de sangue de doadores que tenham células B circulantes contra um determinado antígeno e o antígeno purificado para a identificação dessas células por imunofenotipagem .

[0060] A presente invenção teve o objetivo de obter anticorpos monoclonais humanos antitetânicos através da captura de linfocitos B produtores de anticorpos específicos utilizando o antígeno ou pela separação de plasmablastos após reforço da vacinação. A separação das células coletada de doadores foi feita por equipamento de cell sorter, que depositou uma célula B específica em cada poço em placa de 96 poços. As regiões variáveis dos anticorpos foram amplificadas e clonadas em vetores de expressão que foram usados para transfectar transitoriamente células HEK293-F. Para a captura dos linfócitos B específicos raros foram usadas estratégias diferentes de marcação e cell sorting.

[0061] A utilização da toxina tetânica conjugada, independentemente, com dois marcadores diferentes, biotina e Alexa Fluor^® 647 possibilitou a separação específica de linfócitos B produtores de anticorpos tetânicos, que foram avaliados por ELISA, western blotting e pela inibição da ligação da toxina ao gangliosídio GTlb. 0 ensaio in vivo mostrou proteção total dos animais quando três anticorpos monoclonais foram usados em conjunto, neutralizando a toxina tetânica da ligação e protegendo os animais desafiados com o antígeno, em experimento no qual o soro policlonal produzido em cavalos foi utilizado como controle.

[0062] O processo de obtenção dos anticorpos monoclonais da presente invenção é apresentado na Figura 1, e compreende as seguintes etapas:

1. Coleta de sangue de doadores com altos títulos de anticorpos neutralizantes para a toxina tetânica; 2. Separação de linfócitos B produtores de anticorpos antitetânicos de sangue de voluntários humanos vacinados contra o tétano;

3. Amplificação das regiões variáveis dos anticorpos das células separadas por cell sorting;

4. Clonagem das sequências em vetores de expressão de células de mamíferos;

5. Expressão dos anticorpos recombinantes , purificação e utilização no teste de atividade. Células mononucleares de sangue periférico (CMSP) de seis doadores adultos foram isoladas. Os experimentos referentes a presente invenção foram aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos do ICB da USP e pela Fundação Pró-Sangue, onde foram coletadas as bolsas de sangue. De alguns, o sangue foi coletado tempos diferentes pós vacinação, de outros o sangue foi coletado dias após vacinação de reforço.

[0063] O teste de neutralização in vivo foi feito de acordo com o método utilizado pelo Controle de Qualidade do Instituto Butantan e a Farmacopeia Brasileira (Brasil 2010), em projeto aprovado pelo Comité de Ética no Uso de Animais do Instituto Butantan.

[0064] Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss de ambos os sexos, entre 17 e 22 gramas. Ao todo, 250 animais procedentes do Biotério do Instituto Butantan foram divididos em cinco grupos experimentais com 50 animais: um controle com soro antitetânico de referência e quatro grupos teste. Cada anticorpo foi testado em cinco diluições, sendo 10 animais para cada diluição.

Etapa 1 - Separação de linfócitos B produtores de anticorpos antitetânicos de sangue de voluntários humanos vacinados contra o tétano

[0065] Foram realizados vários sortings com as células mononucleares (CMSP) dos doadores, visando separação de linfócitos B em modo single cell pelo uso de imunofenotipagem .

[0066] As células isoladas foram utilizadas para a realização da PCR e sequenciamento dos genes das regiões variáveis, leve e pesada, dos anticorpos. As estratégias para a captura de linfócitos B variaram para a obtenção de anticorpos específicos. [0067] As estratégias foram refinadas para a captura de células raras.

- Sorting 1 - utilizou-se o toxoide tetânico conjudado à biotina.

- Sorting 2 - as células foram separadas pelo fenótipo CD19+/Streptavidina+ .

- Sorting 3 - Os linfócitos B foram enriquecidos a partir de cerca de lOOxlO⁶ CMSP.

- Sorting 4 - as células foram coletadas após o doador ter recebido o reforço da vacina dT .

- Sorting 5 - este sorting foi realizado com células coletadas após o doador ter recebido o reforço da vacina dT .

- Sorting 6 - células coletadas após vacinação reforço pelo fenótipo CD19⁺IgG⁺TxT^DuP^l0+ .

- Sorting 7 - mesma condição do sorting 6.

- Sorting 8 - células coletadas após vacinação de reforço. A marcação foi feita diretamente com cerca de 100 x IO⁶ CMSPs sem enriquecimento prévio.

- Sorting 9 - As células com o fenótipo CD19⁺CD27⁺⁺ foram separadas nos poços. Não foi utilizado o antigeno tetânico na marcação.

- Sorting 10 - A separação no cell sorter das células foi feita após o reforço da vacina dT .

A Tabela 2 mostra o número de pares de genes obtidos para as estratégias utilizadas.

Tabela 2: Pares de anticorpos obtidos nos sortings das células separadas com toxina tetânica e dos plasmablastos .

Pares H+L

Células

Sorting amplificados

separadas

Kappa Lambda

#6 Linf. B memória 20 17 3

26

#7 Linf. B memória

18 8

59

#8 Linf. B memória

55 4

28

#9 Plasmablastos

15 13

84

#10 Plasmablastos

65 19

Etapa 2- Amplificação das regiões variáveis dos anticorpos das células separadas por cell sorting

[0068] A transcrição reversa foi realizada na mesma placa onde as células foram separadas por cell sorting. Os controles realizados nos poços onde não havia célula foram: dois controles negativos com adição de 1 pL de água, um controle da transcrição reversa com RNA de célula HeLa purificado e um controle da PCR das regiões variáveis com o conteúdo correspondente a 1000 linfócitos B que haviam sido separados previamente.

[0069] Em cada poço foram adicionados 3,5 pL de solução contendo 0,5 pL de oligonucleotideos hexaméricos randômicos a 300 ng/pL (150 ng) , 0,5 pL de Igepal CA-630 ( Sigma-Aldrich) a 10% em água, 6 U de RNAsin^® (Promega) (0,15 pL a 40 U/pL) e 2,35 pL de água tipo 1 esterilizada. O volume de 3,5 pL foi distribuído em cada poço usando micropipetador multicanal com homogeneização e troca de ponteiras a cada coluna. A placa foi selada, centrifugada rapidamente, incubada a 68 °C por 60 segundos no termociclador Mastercycler Nexus Gradient (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) e imediatamente colocada e mantida no gelo. Adicionaram-se em cada poço 7 pL de solução contendo 3 pL do tampão da enzima transcritase reversa SuperScript^® III (Invitrogen) 5 vezes concentrado com 15 mM MgCl2, 12,5 nmols de cada dNTP (0,5 pL da solução a 25 mM de cada dNTP) , 100 nmols DTT (1 pL DTT 100 mM) , 8 U RNAsin® (Promega) (0,2 pL a 40 U/pL), 50 U da enzima transcritase reversa SuperScript^® III (Invitrogen) (0,25 pL a 200 U/pL) e 2,05 pL de água tipo 1 esterilizada. O volume de 7 pL foi distribuído em cada poço usando micropipetador multicanal com homogeneização e troca de ponteiras a cada coluna. A placa foi selada e centrifugada rapidamente. A reação ocorreu a 42 °C por 5 min, 25 °C por 10 min, 50 °C por 60 min e 94 °C por 5 min e finalmente mantida a 4^o C. O cDNA obtido foi aliquotado em quatro placas de 96 poços novas (3 pL por poço), respeitando o endereço inicial de cada poço na placa. Cada placa foi utilizada para amplificação independente das regiões variáveis das cadeias pesada, leve kappa, leve lambda, além do controle β-actina.

[0070] As reações foram feitas com um protocolo de nested PCR, sendo que a primeira reação com o cDNA aliquotado em cada placa. Os componentes ( Oligonucleot ídeo 5' / Mistura oligonucleot ídeos 5' 50 pM, Oligonucleot ídeo 3' 50 pM, MgCl2, dNTP, HotStarTaq® Plus DNA polimerase e Água tipo 1 esterilizada qsp) foram adicionados em cada poço (em volume final de 40 pL) , a placa foi selada e a reação feita com ativação da enzima por 5 min a 95 °C, seguido de 50 ciclos de 94 °C por 30 s, 58 °C (IgD/Igic/p-actina) ou 60 °C (IgÀ) por 30 s, 72 °C por 55 s, e extensão final a 72 °C por 10 min. A segunda reação (nested) foi feita em outra placa com 3,5 pL do produto da primeira PCR transferido com micropipetador multicanal respeitando a posição inicial de cada poço e com os componentes descritos acima, em volume final de 40 pL . A condição foi: 5 min a 95 °C, seguido de 50 ciclos de 94 °C por 30 s, 58 °C (IgH/IgK) ou 60 °C (IgÀ) por 30 s, 72 °C por 45 s, e extensão final a 72 °C por 10 min. As reações foram feitas nos termocicladores GeneAmp^® PCR 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e Mastercycler Nexus Gradient (Eppendorf , Hamburg, Alemanha) . Os oligonucleotideos usados estão descritos na Tabela seguinte. Oligonucleotideos utilizados na amplificação das regiões variáveis das cadeias de imunoglobulinas

Nome do

Etapa Sequência do oligonucleotideo 5'- oligonucleot d

PCR 3'

eo

5 ' L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG

5' L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG

5' L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG

I^a

5' L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG

Reaçã

5' IGHV1,7-X1 ATGGACTGGACCTGGAG

o - 5' IGHV1-X1- Cadei TCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGC

041

a

5' IGHV2-X1- pesad TCCACGCTCCTGCTRCTGAC

036

a

5' VH3 Leader- gama TAAAAGGTGTCCAGTGT

A

5' RM-IGHV4-X1 ATGAAACACCTGTGGTTCTTCC

3 ' Cy CHI GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC

2^a 5' RMX2-A AGGTGCAGCTGCTGGAGTCKGG

Reaçã

o -

3 ' IgG

Cadei GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGAC

Internai

a

pesad

lambd CTGCTACCGGTTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTGAC

5 ' Agel νλ 4/5

a TCA

CTGCTACCGGTTCTTGGGCCAATTTTATGCTGAC

5 ' Agel νλ 6

TCAG

CTGCTACCGGTTCCAATTCYCAGRCTGTGGTGAC

5 ' Agel νλ 7/8

YCAG

3 ' Xhol CÀ CTCCTCACTCGAGGGYGGGAACAGAGTG

Fonte: BOSCARDIN (2013); WARDEMANN; KOFER (2013)

[0071] O controle com β-actina foi feito em uma reaçao única com oligonucleotideos

5' ηβ-actina 5 ' GAACCCCAAGGCCAACCGCGA e 3' ηβ-actina 5 ' CACGCACGATTTCCCGCTC .

[0072] Todas as amostras foram analisadas em gel de agarose 2% com SyBr Safe (Invitrogen) e visualizadas utilizando o transiluminador Safe Imager™ (Invitrogen) e sistema de fotodocumentação Gel Logic 112 (Carestream) . O tamanho esperado dos fragmentos era de: 450 pb para I gD , 510 pb para I gx , 405 pb para IgÀ e 302 pb para β-actina.

[0073] A quantificação dos produtos de PCR foi feita em gel de agarose 2% contendo SYBR^® Safe DNA Gel Stain (Invitrogen) com corrida em paralelo com marcador de massas quantitativo Low DNA Mass (Invitrogen) . A análise foi feita no software Carestream Molecular Imaging de acordo com manual do fabricante, com identificação das bandas do marcador de massas quantitativo, geração da curva-padrão e determinação da massa de DNA das bandas de cada amostra aplicada. [0074] O sequenciamento foi realizado em todos os fragmentos amplificados da cadeia pesada e os das cadeias leves em cujo poço houve amplificação do par cadeia pesada/leve. As amostras foram purificadas com ExoSAP-IT^® (Affymetrix) misturando-se 5 pL dos produtos de PCR e 2 pL de ExoSAP-IT e incubando-se por 15 min a 37 °C, seguido de 15 min a 80°C.

[0075] O sequenciamento foi feito usando o kit BigDye (Applied Biosystems) em sequenciador 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com cerca de 20 ng de DNA, juntamente com 1,6 pmol do oligonucleotideo 3' da reação nested da respectiva cadeia. Para a cadeia lambda foi sintetizado um oligonucleotideo especifico para sequenciamento, 3'ÀSeq -5' ACTCGAGGGYGGGAACAGAGTG . A condição da reação foi: 40 ciclos a 96° C por 10 s, 52 °C por 20 s e 60 °C por 4 min.

[0076] A análise das sequências foi feita usando o banco de dados IgBlast ( http : / /www . ncbi . nlm . nih . gov/ igblast / ) , com o sistema Kabat de delineamento do domínio V. Essa análise fornece a classificação dos segmentos V(D)J de acordo com a maior identidade com as sequências germinativas, além do número e localização das mutações somáticas. A sequência da CDR3 foi determinada pela contagem dos resíduos de aminoácidos posteriores à região do framework 3 até o motivo triptofano-glicina (WG) conservado nas sequências de cadeia pesada ou o motivo fenilalanina-glicina (FG) nas sequências das cadeias leves (WARDEMANN; KOFER, 2013) .

[0077] As cadeias pesadas e leves foram pareadas conforme originalmente formaram o par correspondente.

Etapa 3- Clonagem das sequências em vetores de expressão de células de mamíferos . [0078] Uma alíquota de bactérias Escherichia coli DH5 quimiocompetentes (Invitrogen) foi plaqueada em meio LB/ágar (triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 10 g/L, ágar 1,5%) e incubada a 37 °C por 16-18 horas. Uma colónia foi inoculada em 10 mL de meio LB liquido durante 16-18 horas a 37 °C sob agitação de 200 RPM. Volume de 0,4 mL da suspensão foi inoculado em 200 mL de meio LB liquido contendo 40 mM de glucose e 10 mM de MgCl2 e incubou-se a 37 °C sob agitação de 200 RPM até D0₆o o atingir 0,8-0,9.

[0079] A cultura foi subdividida em tubos que foram mantidos em gelo por 20 min e em seguida centrifugados a 2500 xg por 20 min a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e a células ressuspendidas em 50 mL de MgCl2 0,1 M estéril e gelado. Incubou-se em gelo por 20 min e centrifugou-se como indicado acima. O sedimento foi ressuspendido em 25 mL de CaCl2 0,1 M estéril e gelado, incubado em gelo por 20 min e centrifugado como descrito. Finalmente, as bactérias foram ressuspendidas em 2,4 mL de CaCl2 0,1 M estéril e gelado e adição de 0,6 mL de glicerol. Após homogeneizada, a suspensão foi aliquotada em microtubos em banho de gelo/etanol e armazenados no freezer -80 °C. A eficiência de transformação foi determinada usando um plasmideo controle.

[0080] Os vetores utilizados para clonagem e expressão dos anticorpos foram gentilmente cedidos pela Dra. Hedda Wardemann do Instituto Max Plank. Cada vetor contém a sequência que codifica para a região constante de uma das cadeias de imunoglobulina humana: pesada γΐ, κ ou λ. À montante da região constante está o sitio de clonagem para inserção da cadeia variável amplificada na PCR especifica (Tiller et al, 2008) . [0081] Os vetores foram transformados em bactérias E. coli DH5 quimiocompetentes misturando-se 2 ng de cada vetor (em volume de 1 pL) independentemente em 10 pL da suspensão de bactérias. As suspensões foram incubadas em gelo por 30 min, seguido de choque térmico a 42 °C por 45 s e novamente incubação em gelo por 5 min. Adicionaram-se 100 pL de meio SOC (triptona 20 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 500 mg/L, KC1 2,5 mM, MgCl₂ 10 mM e glucose 20 mM) à suspensão de bactérias e incubou-se por uma hora a 37 °C sob agitação de 180 RPM. Inoculou-se toda a suspensão em uma placa de LB/ágar/ampicilina (triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 10 g/L, ágar 1,5%, ampicilina 100 pg/mL) e incubou-se a 37 °C por 16-18 horas. Uma colónia de cada vetor foi inoculada individualmente em 4 mL de meio TB/ampicilina (Terrific Broth - triptona 12 g/L, extrato de levedura 24 g/L, glicerol 4 mL/L, KH₂P0₄ 17 mM, K₂HP0₄ 72 mM, ampicilina 75 pg/mL) e incubada a 37 °C por 16-18 horas sob agitação de 200 RPM. Cada suspensão foi dividida em duas aliquotas de 2 mL e foram usadas para isolamento dos vetores utilizando o kit Wizard^® Plus SV Miniprep DNA Purification (Promega) . A determinação da concentração e pureza dos vetores foi feita por espectrofotometria a 260/280 nm.

[0082] Os vetores foram digeridos com as respectivas enzimas para serem linearizados:

[0083] plgD - enzimas SalI-RF e Agel-HF (NEB - New England Biolabs)

[0084] plgK - enzimas Agel-HF e BsiWI (NEB)

[0085] plgÀ - enzimas Xhol-EF e Agel (NEB)

[0086] As digestões foram sequenciais, na ordem descrita acima com cada enzima na proporção de 2 U/pg de DNA para as enzimas Agel e BsiWI e 10 U/pg para as enzimas Sall e Xhol . A digestão procedeu por quatro horas a 37 °C para Agel, Sall e Xhol e 55 °C para BsiWI . Os vetores digeridos foram purificados por eletroforese em gel de agarose e kit Wizard^® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) .

[0087] As amostras da RT-PCR provenientes dos poços selecionados após análise das sequências das cadeias variáveis foram submetidas à PCR com oligonucleotideos específicos. Essa etapa serviu para amplificar o fragmento com um oligonucleotídeo em cada extremidade, evitando a inserção de mutações, além de adicionar sítios de restrição para clonagem nos vetores de expressão. 0 produto da primeira PCR foi usado como molde, com oligonucleotideos 5' e 3' específicos para os genes V e J, respectivamente, contendo sítio de restrição específicos

Oligonucleotideos utilizados na PCR especifica

Cadeia

Nome de Sequência do oligonucleotideo amplificad

oligonucleotideo 5'-3'

a

5' Agel VH 1/4/6 CTGCAACCGGTGTACATTCC [FRW1 ] 5' Agel VH 3/7 CTGCAACCGGTGTACATTCT [FRW1] 3' Sall JH TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGAC

Cadeia

1/2/4/5 CAG

pesada

TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGAC

gama 3 ' Sall JH 3

CATTG

TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGAC

3' Sall JH 6

CGTG

5' Agel VK

CTGCAACCGGTGTACAT [FRW1]

Cadeia específico

leve kappa GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGT

3' BsiWI Jk 1/4

C GCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGT

3 ' BsiWI Jk 2

C

GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGT

3 ' BsiWI Jk 3

C

GCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGT

3 ' BsiWI Jk 5

C

CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGTG

5 ' Agel VÀ 1

CTGACKCAG

CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGCC

5 ' Agel VÀ 2

CTGACTCAG

CTGCTACCGGTTCTGTGACCTCCTATGAG

5 ' Agel VÀ 3

Cadeia CTGACWCAG

leve CTGCTACCGGTTCTCTCTCSCAGCYTGTG

5 ' Agel VÀ 4/5

lambda CTGACTCA

CTGCTACCGGTTCTTGGGCCAATTTTATG

5 ' Agel VÀ 6

CTGACTCAG

CTGCTACCGGTTCCAATTCYCAGRCTGTG

5 ' Agel VÀ 7/8

GTGACYCAG

3 ' Xhol CÀ CTCCTCACTCGAGGGYGGGAACAGAGTG

Regiões sublinhadas correspondem aos sítios de restrição. Fonte: WARDEMANN & KOFFER (2013) .

[0088] Após a PCR específica, a amplificação das amostras foi confirmada por eletroforese em gel de agarose 2%. Os fragmentos obtidos foram purificados com kit QIAquick^® 96 PCR Purification (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante, eluídos com 60 pL de água tipo 1 esterilizada, digeridos com as enzimas de restrição cujos sítios foram inseridos durante a PCR específica, e clonados nos vetores de expressão que contêm as regiões constantes de cada cadeia do anticorpo.

[0089] Caso o fragmento amplificado contivesse sequência do sitio de restrição das enzimas utilizadas (verificado anteriormente à digestão através do site http : / /www . restrict ionmapper . org/ index . html ) , a digestão com a referida enzima era feita parcialmente, com diluições seriadas da enzima e incubação por 2 min na temperatura especifica da enzima (CAMPEAU, 2009) .

[0090] Após digestão, os produtos de PCR foram novamente purificados com QIAquick^® 96 PCR Purification (Qiagen) e eluidos com 60 pL de água tipo 1 esterilizada.

[0091] A ligação do fragmento ao vetor foi feita em volume total de 10 pL com 8 pL do produto da PCR especifica digerido e purificado, 0,5 pL do respectivo vetor linearizado a

50 ng/pL, 1 pL do tampão da enzima T4 DNA ligase (NEB) e 0,5 pL da enzima T4 DNA ligase 400 U/pL (NEB) . A incubação foi de duas horas a 23 °C. Procedeu-se à transformação como descrito em 3.11.2, utilizando 10 pL da suspensão de bactérias quimiocompetentes e 4,5 pL do produto de ligação. As colónias obtidas foram tríadas por PCR.

[0092] Três colónias de cada placa foram testadas para verificar a presença do inserto. A triagem foi feita por PCR utilizando oligonucleot ideos que se anelam na região líder à montante do sítio de clonagem e na região constante da respectiva cadeia.

[0093] A mistura da PCR utilizado continha para cada reação: 125 pM de cada dNTP, 400 nM do oligonucleot ídeo 5', 400 nM do oligonucleot ídeo 3', 1,5 mM de MgCl2 e 1 U de Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen) em 25 pL de reação. Oligonucleotideos utilizados para verificação da presença do inserto no vetor de expressão Sequência do

Nome do oligonucleotideo

oligonucleotideo 5 ' -3 '

5 'Ab sense GGTTCGTTAGAACGCGGCTAC

3' IgG (internai) - para cadeia

GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGAC

□

3' CK 494 - para cadeia κ GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT

CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTT

3 ' CK - para cadeia λ

G

Fonte: WARDEMANN & KOFFER (2013) .

[0094] A mistura foi distribuída em poços de uma placa de 96 poços para PCR. Usando uma ponteira de micropipeta estéril, retirou-se com a ponta uma colónia isolada que foi transferida para uma placa de petri com LB/ágar/ampicilina sobressalente. Em seguida, a ponteira foi mergulhada na mistura da PCR aliquotada na placa de 96 poços. A placa de petri foi incubada a 37° C por 16-18 horas e armazenada na geladeira. A reação da PCR foi na seguinte condição: 5 min 94° C; 27 ciclos de 94° C por 30 s, 58° C por 30 s, 72° C por 60 s ; e extensão final a 72° C por 10 min. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em agarose 2%, cujos tamanhos esperados eram: 650 pb para IgDl, 700 pb para IgK e 590 pb para IgÀ. Os fragmentos considerados positivos foram purificados com ExoSAP-IT (Affymetrix) e sequenciados de acordo como descrito anteriormente. O oligonucleotideo utilizado para sequenciamento foi o 5 ' Absense .

[0095] As sequências obtidas da PCR de colónias foram comparadas com as obtidas na RT-PCR utilizando a ferramenta de alinhamento de duas ou mais sequências do BLAST (bl2seq - Align Sequence Nucleotide BLAST) . Verificou-se a identidade das sequências, desconsiderando as regiões de anelamento dos oligonucleotídeos e determinou-se a colónia que continha o vetor com a sequência variável idêntica àquela obtida na RT-PCR.

[0096] Uma parte da colónia selecionada foi coletada da placa sobressalente e inoculada em 4 mL de meio TB. 0 vetor foi isolado de uma das aliquotas de 2 mL da suspensão das bactérias e a outra foi congelada após centrifugação a 10.000 xg por 5 min e remoção do sobrenadante . O isolamento foi feito com kit Wizard^® Plus SV Miniprep DNA Purification (Promega) e determinação da concentração e pureza por espectrofotometria a 260/280 nm.

Etapa 3- Expressão dos anticorpos recombinantes de forma transitória

[0097] A expressão dos anticorpos foi feita com cotransfecção transitória do vetor da cadeia pesada e da leve correspondente ao par obtido do mesmo poço na RT-PCR.

[0098] Células FreeStyle™ 293-F HEK 293f (Invitrogen) foram cultivadas em suspensão em FreeStyle™ 293 Expression Médium (Invitrogen) em estufa a 37° C com 8% CO2 e agitação de 120 RPM. No dia anterior à transfecção, a suspensão foi preparada no volume de 30 mL de suspensão para cada anticorpo a ser transfectado na concentração de aproximadamente 0,5xl0⁶ células/mL. No dia da transfecção, a suspensão foi aliquotada em volume de 30 mL em erlenmeyers de 125 mL na concentração entre 0,9 e Ι,ΙχΙΟ⁶ células/mL para cada anticorpo a ser transfectado.

[0099] A solução de DNA para transfecção foi preparada em volume final de 1,5 mL de PBS. Inicialmente, 30 pg dos vetores [15 pg de cada um (cadeia pesada e leve)] foram adicionados a volume de PBS e incubados por 5 minutos a temperatura ambiente. Adicionaram-se 103 pL de solução de Polietilenimina - PEI ( Sigma-Aldrich) a 0,45 mg/mL e agitou- se em vortex por 15 segundos, sendo incubada novamente por mais 10 min a temperatura ambiente protegida da luz antes de ser gotejada sobre a suspensão das células que foi mantida em cultivo por 72 horas. 0 sobrenadante foi coletado após centrifugação a 800 xg por 10 min em centrífuga de tubos (Sorvai Legend RT, Newtown, CT, EUA) .

[00100] Os anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade com proteína A utilizando o sistema ÀKTA Purifier (GE Healthcare, Suécia) . O sobrenadante filtrado foi aplicado na coluna de proteína A- sefarose (GE Healthcare, Suécia) equilibrada com tampão fosfato 20 mM pH 7. A coluna foi lavada com o mesmo tampão. A primeira eluição foi feita com tampão citrato de sódio 100 mM pH 6 e a segunda com tampão citrato de sódio 100 mM pH 3,2, para recuperação dos AcMos. A amostra coletada foi neutralizada com quantidade suficiente de solução de Tris 1 M. O anticorpo purificado e neutralizado foi dialisado contra PBS e esterilizado por filtração.

[00101] A concentração de cada anticorpo foi determinada por absorbância em 280 nm usando o coeficiente A₀,i% = 1,4.

[00102] Com as modificações nos protocolos foi possível obter sequências clonalmente relacionadas. A análise do repertório dos fragmentos VH dos anticorpos obtidos e as mutações somáticas. Os segmentos mais representados nos três doadores são da família VH3, seguido da V_H1 e V_H4.

[00103] Os anticorpos foram testados quanto à ligação às formas disponíveis do antígeno: toxina e anatoxina tetânicas, fragmento C recombinante da toxina tetânica. [00104] As Figuras 2 e 3 mostram as curvas de ligação dos anticorpos contra a TxT e AnT .

[00105] A Figura 2 mostra o resultado de ELISA qualitativo de ligação dos anticorpos à toxina tetânica, onde os anticorpos da presente invenção foram testados nas concentrações de 0,4 a 50 ng/mL. Foi usado Soro do doador para validação do teste como controle positivo na diluição inicial de 1:50 e diluições seriadas 1:5. A Placa foi sensibilizada com 100 pL de toxina tetânica a 5 pg/mL;

[00106] A figura 3 mostra o resultado ELISA qualitativo de ligação dos anticorpos à anatoxina tetânica. Os anticorpos da presente invenção foram testados nas concentrações de 0,4 a 50 ng/mL. Foi utilizado Soro do doador para validação do teste como controle positivo na diluição inicial de 1:50 e diluições seriadas 1:5. A Placa foi sensibilizada com 100 pL de anatoxina tetânica a 5 pg/mL.

[00107] A interação dos anticorpos com a toxina tetânica foi testada por western blotting após SDS-PAGE na forma reduzida e não reduzida. Também foram testados em relação à inibição da ligação da toxina ao gangliosideo GTlb. A ligação in vivo entre TxT e GTlb é necessária para a internalização da TxT no neurônio e geração dos efeitos tóxicos .

[00108] Os resultados do western blotting foram analisados juntamente com os resultados do ELISA e do ensaio de inibição da ligação ao GTlb para a escolha de alguns anticorpos para os ensaios in vivo em animais, visando conhecer a capacidade de neutralização da toxina tetânica pelos anticorpos humanos recombinantes .

[00109] O ensaio foi realizado no Infectório do Instituto Butantan, com autorização do Comité de Ética no Uso de Animais do Instituto Butantan, segundo o protocolo descrito na Farmacopeia Brasileira (Brasil 2010) . Foram testados quatro grupos de anticorpos:

[00110] - Mistura dos anticorpos BUT-TT-120, BUT-TT- 143 e BUT-TT-243. Os três anticorpos interagiram com a toxina tetânica no ELISA, e no ensaio de western blotting tiveram respostas diferentes: ligação na cadeia pesada, toxina inteira e cadeia leve, respectivamente.

[00111] Foi preparada mistura com mesma quantidade de cada anticorpo, testados em 50 animais em cinco grupos de 10 camundongos para teste de cinco diluições.

[00112] Foram preparadas misturas compostas da toxina tetânica na mesma concentração e quantidades diferentes dos anticorpos testados. Após incubação a 37° C por uma hora, aplicaram-se 200 pL de cada mistura subcutaneamente em 10 animais, que foram mantidos em observação por 96 horas, período em que foi verificado o número de camundongos saudáveis, mortos ou com sintomas de tétano.

[00113] A figura 4 mostra o resultado de ensaio de neutralização da toxina tetânica in vivo: Em D, mistura dos anticorpos BUT-TT-120, BUT-TT-143 e BUT-TT-243. A mistura dos AcMos garantiu a sobrevivência de 100% dos animais quando utilizados 28 e 14 pg dos anticorpos, sendo capaz de neutralizar a ação tóxica da toxina tetânica, garantindo a sobrevivência de todos os animais nos grupos com 28 e 14 pg de anticorpo.

[00114] A obtenção de anticorpos monoclonais humanos tem grande importância biotecnológica, sendo biofármacos com potencial terapêutico valioso pela baixa probabilidade de resposta imunogênica.

[00115] Com a presente invenção foi possível a obtenção de anticorpos humanos neutralizantes para a toxina tetânica pela modificação dos protocolos de marcação e captura dos linfócitos B produtores de anticorpos antitetânicos e pela estratégia de estabelecimento dos gates nos sortings, devido à baixa probabilidade da existência de células B de memória antitetânicos no sangue periférico.

[00116] A proposta da estratégia de separação com toxina tetânica e conjugação com dois marcadores, Biotina, para captura com Estreptavidina-PerCP-Cy™5.5 e Alexa Fluor® 647, teve dois objetivos:

- selecionar os linfócitos produtores de anticorpos relevantes contra epitopos da toxina (por usar o antigeno adequado) e

- aumentar a especificidade da identificação de células produtoras de anticorpos antitetânicos (por diminuir o background da identificação da população rara de linfócitos específicos ) .

[00117] A estratégia garantiu a obtenção de sequências clonalmente relacionadas, sugestivo da seleção pelo antigeno.

[00118] Além disso, um indicativo da especificidade da marcação foi a menor quantidade de poços com uma célula obtida quando da marcação com as toxinas conjugadas, comparado com os sortings feitos com as estratégias iniciais.

[00119] De um modo geral, os anticorpos obtidos a partir da marcação com a toxina tetânica ou a partir de plasmablastos reconheceram o antigeno nos ensaios realizados .

[00120] O repertório de segmentos VH detectado nas sequências obtidas parece concordar com o observado em outros doadores imunizados contra tétano (De Kruif et al . , 2009) , além de outras doenças, como AIDS (Scheid et al . , 2009a) e febre do Nilo Ocidental (Throsby et al . , 2006), em que a classificação da sequência VH da maior parte dos anticorpos eram das famílias 1, 3 e 4, que correspondem às famílias com maior número de representantes no lócus do cromossomo 14 [17 segmentos da família VH I, 4 da VH2, 51 da VH3, 13 da VH4, 3 da VH5, 1 da VH6 e 6 da VH7, de um total de 95 segmentos (Cook et al; , 1995) ] .

[00121] A quantidade de mutações somáticas detectadas nas regiões variáveis também foi semelhante à observada em AcMos humanos anti-HIV (Scheid et al . , 2009a) .

[00122] Houve concordância quanto à interação dos anticorpos nos ELISAs, sendo que aqueles que interagiram com a TxT também o fizeram com AnT .

[00123] Os três AcMos obtidos na presente invenção (243, 143 e 120) e que misturados protegeram os camundongos da linhagem Swiss contra a ação da TxT interagem em locais diferentes na toxina, de acordo com o resultado de western blotting: cadeia pesada, cadeia leve a toxina inteira, não reduz ida .

[00124] Parece ser um consenso no estado na técnica mostrar que a mistura de mais de um anticorpo monoclonal tem efeito neutralizante, mesmo se individualmente não o tenham, ou que seria necessária uma quantidade maior do AcMo para obter o mesmo efeito.

[00125] Volk e colaboradores (1984) mostraram que a combinação de anticorpos monoclonais era cerca de duas ordens de magnitude mais eficiente na capacidade de neutralização da toxina do que os AcMos testados individualmente em concentração equivalente (concentração total de anticorpos) . Propõe-se que, para manter a toxina neutralizada, o anticorpo monoclonal deva estar em quantidade para evitar a dissociação entre o AcMo e a TxT .

[00126] De acordo com a lei de açao de massas, quando em equilíbrio, ocorre associação e dissociação entre antígeno e anticorpo, sendo que, no caso de uma molécula de toxina ficar livre, ela estará disponível para exercer sua função tóxica.

[00127] Assim, quando misturados, dois ou mais anticorpos monoclonais podem ter efeito sinérgico e prevenir a liberação da toxina livre para exercer sua função tóxica.

[00128] De qualquer maneira, é necessário considerar que grande parte dos estudos do estado da técnica obtiveram os anticorpos monoclonais ant itetânicos a partir de hibridomas murinos, após imunização e coleta de células de baço .

[00129] Os anticorpos monoclonais da presente invenção foram obtidos de células do sangue periférico humano após imunização. Já foi demonstrado que, em seres humanos, a frequência de células de memória produtoras de anticorpos ant itetânicos é maior em órgãos linfoides secundários, como as tonsilas, e não no sangue periférico (Cao et al . , 2010) . OBTENÇÃO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS DA PRESENTE INVENÇÃO

Anticorpo monoclonal 1-BUT-TT-120-VL

[00130] SEQ ID NO 1: sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve do anticorpo BUT-TT-120

[00131] SEQ ID NO 2: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo BUT-TT-120 Primers utilizados:

Amplificação da sequência:

PCR 1

5' L-Vkl/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG 5' L-Vk3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG

5' L-Vk4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG

3' Ck543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA

PCR 2

5 ' Pan-Vk ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG

3' Ck494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT

• Clonagem

Anticorpo Monoclonal 1-BUT-TT-120-VH

[00132] SEQ ID NO 3: sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada do anticorpo BUT-TT-120

[00133] SEQ ID NO 4: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo BUT-TT-120 Primers utilizados:

Amplificação da sequência

5 'L-VH1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG

5 ' IGHV1, 7-X1 ATGGACTGGACCTGGAG

5 ' IGHV1-X1-041 TCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGC

5 ' IGHV2-X1-036 TCCACGCTCCTGCTRCTGAC

5'5'L-VH3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG

5'VH3 Leader-A TAAAAGGTGTCCAGTGT

5 'L-VH4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG

5 'RM-IGHV4-X1 ATGAAACACCTGTGGTTCTTCC

5 ' L-VH5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG

3' Cg CHI (gamma) GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC

PCR 2

5 'RMX2-A AGGTGCAGCTGCTGGAGTCKGG 3 ' IgG-internal GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGAC

• Clonagem

5' Agel VH4-39 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAG

3' Sall JH 1/2/4/5 TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG

Anticorpo Monoclonal 2-BUT-TT-143-VL

[00134] SEQ ID NO 5: sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve do anticorpo BUT-TT-143

[00135] SEQ ID NO 6: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo BUT-TT-143

Primers utilizados:

Amplificação da sequência:

PCR 1

• Clonagem:

Anticorpo Monoclonal 2-BUT-TT-143-VH

[00136] SEQ ID NO 7: sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada do anticorpo BUT-TT-143

[00137] SEQ ID NO 8: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo BUT-TT-143 Primers utilizados:

• Amplificação da sequência:

PCR 1 : 5 'L-VH1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG

5 ' IGHV1, 7-X1 ATGGACTGGACCTGGAG

5 ' IGHV1-X1-041 TCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGC

5 ' IGHV2-X1-036 TCCACGCTCCTGCTRCTGAC

5'5'L-VH3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG

5'VH3 Leader-A TAAAAGGTGTCCAGTGT

5 'L-VH4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG

5 'RM-IGHV4-X1 ATGAAACACCTGTGGTTCTTCC

5 ' L-VH5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG

3' Cg CH1 (gamma) GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC

PCR 2

5 'RMX2-A AGGTGCAGCTGCTGGAGTCKGG

3 ' IgG-internal GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGAC

• Clonagem:

5' Agel VH3-33 CTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAG

3 ' Sall JH 3 TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTG

Anticorpo Monoclonal 3-BUT-TT-243-VL

[00138] SEQ ID NO 9: sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve do anticorpo BUT-TT-243

[00139] SEQ ID NO 10: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo BUT-TT-243 Sequência dos primers:

• Amplificação da sequência:

PCR 1

PCR 2 5 ' Pan-Vk ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG

3' Ck494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT

• Clonagem:

Anticorpo Monoclonal 3-BUT-TT-243-VH

[00140] SEQ ID NO 11: sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada do anticorpo BUT-TT-243

[00141] SEQ ID NO 12: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo BUT-TT-243 Primers utilizados:

• Amplificação da sequência:

PCR 1 :

• Clonagem: CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTGCA

5' Agel VH1 G

3' Sall JH 1/2/4/5 TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG

ANTICORPOS MONOCLONAIS DA PRESENTE INVENÇÃO

[00142] Os anticorpos monoclonais da presente invenção foram obtidos de células do sangue periférico humano de invididuos imunizados. Já foi demonstrado que, em seres humanos, a frequência de células de memória produtoras de anticorpos antitetânicos é maior em órgãos linfoides secundários, como as tonsilas, e não no sangue periférico (Cao et al . , 2010) .

1) Anticorpo monoclonal l-BUT-TT-120

[00143] O Anticorpo monoclonal humano antitoxina tetânica l-BUT-TT-120 é um anticorpo monoclonal compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) , em que a cadeia pesada VH compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4 e a cadeia leve VL compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 2 - Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de anticorpo monoclonal humano #1- BUT-TT-120-VL antitoxina tetânica

Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

lie Tyr Ala Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

SEQ ID NO: 4 Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de anticorpo monoclonal humano #1-

BUT- TT-120 anti-toxina tetânica

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Thr His Phe Ser Gly Ser Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

Thr Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Phe Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Val Gly Ile Arg Arg Phe Ala Val Leu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

2) Anticorpo monoclonal 2-BUT-TT-143

[00144] O Anticorpo monoclonal 2-BUT-TT-143 humano antitoxina tetânica é um anticorpo monoclonal compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) , em que a cadeia pesada VH compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8 e a cadeia leve VL compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 6 - Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de anticorpo monoclonal humano #2- BUT-TT-143 anti-toxina tetânica

Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Phe Gly Ser Thr

20 25 30

Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Gln Gly Pro Arg Leu Leu

35 40 45

lie Tyr Asp Ala Ser Arg Arg Ala Pro Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys

100 105

SEQ ID NO: 8 Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de anticorpo monoclonal humano #2-

BUT- TT-143 anti-toxina tetânica

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe lie Arg Tyr Asp Ala Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg lie Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn lie Met Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Val Val Arg Ala Tyr Arg Tyr Ala Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

3) Anticorpo monoclonal 3-BUT-TT-243

[00145] O Anticorpo monoclonal humano antitoxina tetânica l-BUT-TT-243 é um anticorpo monoclonal compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) , em que a cadeia pesada VH compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12 e a cadeia leve VL compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10.

SEQ ID NO: 10 - Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de anticorpo monoclonal humano #3- BUT-TT-243 anti-toxina tetânica

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Leu Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Val Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Arg Ser Gly Ser Pro Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

SEQ ID NO : 12 - Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de anticorpo monoclonal humano #1- BUT-TT-243 anti-toxina tetânica

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Val Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Met Phe Pro Ile Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ala Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ala Ala Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Gly Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Ala Leu Val Arg Trp Leu Asp Pro Trp Gly Arg Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

ANTICORPOS MONOCLONAIS DA PRESENTE INVENÇÃO FORAM TESTADOS CONTRA TOXINA DIFTÉRICA E SÃO EXCLUSIVOS CONTRA TOXINA TETÂNICA

[00146] Os anticorpos monoclonais BUT-TT-120, BUT-TT- 143 e BUT-TT-243 também foram testados na ligação com a anatoxina diftérica (AnD) , pois o sangue de alguns doadores foi coletado alguns dias após o reforço da vacina dT, que é composta pelos toxoides tetânico e diftérico. Além disso, esse antigeno serviu como teste de ligação a uma proteína não relacionada à toxina tetânica. [00147] A figura 5 mostra o resultado ELISA dos anticorpos monoclonais 120, 143 e 243 da presente invenção para teste de ligação com anatoxina diftérica. Anticorpos testados nas concentrações de 0,4 a 50 ng/mL em quatro diluições seriadas 1:5. Soro policlonal humano foi usado como controle positivo na diluição inicial de 1:50 e diluições seriadas 1:5. Placa sensibilizada com 100 pL de anatoxina diftérica a 2 pg/mL.

[00148] Os resultados comprovam que anticorpos monoclonais 120, 143 e 243 da presente invenção foram testados contra toxina diftérica e são exclusivos contra toxina tetânica.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU IMUNOLÓGICAS

[00149] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas/imunológicas adequadas para administração a um sujeito .

[00150] Tipicamente, a composição farmacêutica/ imunológica da presente invenção compreende um anticorpo monoclonal ou porção de anticorpo monoclonal da presente invenção e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

[00151] Tal como aqui utilizado, "veiculo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes de retardamento da absorção e isotônicos, os quais sejam fisiologicamente compatíveis. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitando a, um ou mais de água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, e semelhantes, bem como combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir aminoácidos ou outros sais. [00152] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem compreender ainda quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, os quais aumentam a meia-vida ou a eficácia do anticorpo monoclonal ou porção de anticorpo monoclonal da presente invenção.

[00153] As composições imunolígicas da presente invenção podem estar numa variedade de formas.

[00154] A forma preferida depende do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. As composições preferenciais típicas estão sob a forma de soluções injetáveis ou para infusão, tais como composições semelhantes às utilizadas para a imunização passiva de humanos com outros anticorpos. O modo preferido de administração é a parentérica (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal , intramuscular) .

[00155] Em uma concretização preferida, o anticorpo monoclonal da presente invenção é administrado por infusão ou injeção intravenosa. Em uma outra concretização preferida, o anticorpo monoclonal da presente invenção é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.

[00156] As composições imunológicas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento.

[00157] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo (isto é, o anticorpo monoclonal ou parte de anticorpo monoclonal) na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido, por exemplo, de esterilização por filtração.

[00158] Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários de entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem por vácuo e liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.

[00159] A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de surfactantes . Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecido no estado da técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via / modo de administração preferido seja a injeção ou infusão.

[00160] Tal como será apreciado por um técnico versado no assunto, a via e / ou modo de administração irão variar dependendo dos resultados desejados.

[00161] Em algumas concretizações, agentes terapêuticos adicionais, é um agente ou agentes para o tratamento de uma doença ou condição que envolva a toxina tetânica .

[00162] Tal como aqui utilizado, os termos "tratar" e "tratamento" referem-se a tratamento terapêutico, incluindo medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou retardar (diminuir) uma alteração fisiológica indesejável associada com uma doença ou distúrbio. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio de sintomas, diminuição da extensão de uma doença ou desordem, estabilização de uma doença ou distúrbio (isto é, em que a doença ou distúrbio não piora), atraso ou abrandamento da progressão de uma doença ou distúrbio, melhoria ou paliação da doença ou desordem, e remissão (quer parcial ou total) da doença ou desordem, quer detectável ou indetectável .

[00163] 0 termo "tratamento" também pode significar prolongar a sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada se não recebesse o tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já estão com a doença ou desordem bem como aqueles propensos a ter a doença ou desordem ou aqueles em que a doença ou desordem se pretende prevenir.

[00164] As composições farmacêuticas da presente invenção podem incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um anticorpo monoclonal humano antitoxina tetânica da presente invenção .

[00165] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desej ado .

[00166] Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal da presente invenção pode variar de acordo com fatores, tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpo para induzir uma resposta desejada no indivíduo .

[00167] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção de anticorpo, são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

[00168] Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é utilizada em sujeitos antes ou numa fase precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será inferior à quantidade terapeuticamente eficaz.

[00169] Uma faixa não limitativa para uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente exemplificativa eficaz do anticorpo monoclonal da presente invenção é de 0,4 a 50 ng / ml. Portanto, no ensaio com camundongos suíços essa faixa se mostrou suficiente.

[00170] É para ser notado que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada. É para ser compreendido adicionalmente que para qualquer sujeito particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de dosagem aqui estabelecidas são apenas exemplificativas e não se destinam a limitar o escopo ou a prática da composição reivindicada.

UTILIZAÇÕES TERAPÊUTICAS DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS DA PRESENTE INVENÇÃO

[00171] Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para tratar qualquer doença ou distúrbio mediado por, associado com, ou causado pela ação da toxina tetânica.

[00172] Por exemplo, os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma doença ou distúrbio que resulta em tétano. [00173] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma doença ou desordem causada pelo tétano localizado, em que o inicio dos sintomas ocorre com mialgia por contraçoes involuntárias dos grupos musculares próximos ao ferimento, podendo ficar restrito a um determinado membro.

[00174] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma doença ou desordem causada pelo tétano cefálico, em que ocorre devido a ferimentos em couro cabeludo, face, cavidade oral e orelha, levando a paralisia facial ipsilateral à lesão, trismo, disfagia e comprometimento dos pares cranianos iii, iv, ix, x, xii .

[00175] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma doença ou desordem causada pelo tétano generalizado, em que este é caracterizado pelo trismo, devido à contração dos masseteres e músculos da mímica facial, ocasionando o riso sardónico. Outros grupos musculares são acometidos, como os retos abdominais e a musculatura paravertebral , podendo ocasionar opistótono (característico das crianças) . Com a evolução da doença, os demais músculos do organismo são acometidos progressivamente. As contraturas musculares vêm logo a seguir e, dependendo de sua intensidade e frequência, o tétano poderá ser com menor ou maior gravidade, piorando aos estímulos auditivos, visuais e táteis. Dependendo de sua intensidade, esses espasmos podem evoluir até para fraturas de vértebras ou parada respiratória. O paciente tetânico, a despeito de sua gravidade, permanece sempre lúcido. A febre, quando presente, indica mal prognóstico ou infecção secundária. Entre as manifestações de hiperatividade simpática, temos: taquicardia, hipertensão arterial lábil, sudorese profusa, vasoconstrição periférica, arritmias cardíacas e até hipotensão arterial.

[00176] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma doença ou desordem causada pelo tétano neonatal, em que é causado pela aplicação de substâncias contaminadas na ferida ou corte do cordão umbilical. 0 período de incubação é de aproximadamente sete dias e tem como característica principal o opistótono. No início, a criança pode apresentar apenas dificuldade para se alimentar. Geralmente ocorre em filhos de mães não- vacinadas ou inadequadamente vacinadas no pré-natal.

[00177] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados na imunoterapia para acidentes susceptíveis à infecção pelo bacilo tetânico.

[00178] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados para o tratamento de pessoas com probabilidade de desenvolver tétano. Trata-se de produtos que podem ser obtidos de forma homogénea, com consistência de lotes e sem causar imunogenicidade .

[00179] Assim, a presente invenção inclui métodos para tratar uma doença ou distúrbio mediado por, associada com, ou causado pela ação da toxina tetânica. Os métodos compreendem a administração a um paciente em necessidade da mesma de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente do anticorpo monoclonal tal como aqui divulgado.

[00180] A expressão "anticorpo monoclonal" tal como aqui divulgado pretende significar qualquer anticorpo monoclonal compreendendo qualquer uma das regiões VH e / ou regiões VL aqui definidos pelas suas sequências identificadoras (SEQ ID) , bem como qualquer anticorpo monoclonal compreendendo uma variante de qualquer uma das regiões VH estabelecidas pelas sequências identificadoras (SEQ ID) e / ou uma variante de qualquer uma das regiões VL aqui estabelecida.

[00181] Assim, embora tenham sido mostradas apenas algumas concretizações da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações nos anticorpos monoclonais humanos antitetânicos para a infecção por c.tetani podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espirito e escopo da presente invenção .

[00182] Ao menos que definido de outra forma, todos os termos científicos e técnicos são entendidos por terem os mesmos significados comumente utilizados na técnica a que pertencem. Para o propósito da presente divulgação, os termos a seguir são definidos.

[00183] É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma concretização descrita para outra são também totalmente pretendidos e contemplados.

[00184] Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceituai. A intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas. REFERÊNCIAS

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Claims

REINVIDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal humano antitoxina tetânica, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal compreendendo uma combinação da região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) selecionado de entre as seguintes possibilidades: (i) a (iii) :

(i) anticorpo monoclonal l-BUT-TT-120 compreendendo região variável de cadeia pesada VH compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4 e região variável de cadeia leve VL compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

(ii) anticorpo monoclonal 2-BUT-TT-143 compreendendo região variável de cadeia pesada VH compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NQ : 8 e região variável de cadeia leve VL compreende uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 6.

(iii) anticorpo monoclonal 3-BUT-TT-243 compreendendo região variável de cadeia pesada VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 e região variável de cadeia leve VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10.

2. Conjugado caracterizado pelo fato de compreender uma combinação do anticorpo monoclonal l-BUT-TT-120, anticorpo monoclonal l-BUT-TT-143 e anticorpo monoclonal l-BUT-TT-243 conforme definido pela reivindicação 1 acoplado a uma toxina, um radioisótopo, um fármaco ou um agente citotóxico.

3. Composição imunológica caracterizada pelo fato de compreender uma combinação do anticorpo monoclonal l-BUT-TT- 120, anticorpo monoclonal l-BUT-TT-143 e anticorpo monoclonal l-BUT-TT-243 conforme definido pela reivindicação 1 um veículo farmaceuticamente aceitável.

4. Composição imunológica caracterizada pelo fato de compreender um conjugado conforme definido pela reivindicação 2 o veículo farmaceuticamente aceitável.

4. Uso do anticorpo monoclonal conforme definido pela reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição imunológica para tratar e/ou prevenir tétano.

5. Uso do anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo monoclonal é para o tratamento de pessoas com probabilidade de desenvolver tétano.

6. Uso do anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é para imunoterapia da infecção acidental por tétano.

7. Uso do anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é para tratar o tétano neonatal em recém-nascidos acometidos pela infecção, veiculado pelo corte do cordão umbilical.

8. Uso do anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é tratar o tétano localizado, tétano cefálico ou tétano generalizado.

9. Processo de produção de um anticorpo monoclonal caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas :

(a) coletar o sangue de doadores que tenham células B de memória circulantes contra um determinado antígeno e o antígeno purificado para a identificação dessas células por imunofenotipagem; (b) separar os linfócitos B produtores de anticorpos antitetânicos de sangue de seres-humanos vacinados contra o tétano ;

(c) amplificar as regiões variáveis dos anticorpos das células separadas por cell sorting;

(d) clonar as sequências em vetores de expressão de células de mamíferos;

(e) expressar os anticorpos recombinantes de forma transitória .

10. Processo de produção de um anticorpo monoclonal, de acordo coma reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que na etapa (b) a separação específica de linfócitos B produtores de anticorpos tetânicos utiliza-se toxina tetânica conjugada, independentemente, com dois marcadores diferentes, biotina e Alexa Fluor^® 647.

11. Processo de produção de um anticorpo monoclonal, de acordo coma reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que na etapa (b) é selecionado os linfócitos produtores de anticorpos relevantes contra epítopos da toxina.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo monoclonal é obtido a partir da informação de sequência gênica obtida a partir de linfócitos B do sangue periférico de pessoas imunizadas com o toxóide tetânico.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a informação genética é inserida em vetores usados para transfecção de células de mamíferos para gerar linhagens celulares produtoras dos anticorpos monoclonais antitetânicos .