ES2949821T3 - Matrices moleculares - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una composición que comprende (a) un soporte sólido que comprende una superficie; (b) una primera pluralidad de cebadores oligonucleotídicos injertados en la superficie, en donde cada uno de los cebadores de la primera pluralidad comprende la secuencia 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'; y (c) una segunda pluralidad de cebadores oligonucleotídicos injertados en la superficie, en donde cada uno de los cebadores de la segunda pluralidad comprende la secuencia 5'-AATGATACGCGACCACCGA-3'. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Matrices moleculares

Campo de la invención

Esta invención se refiere a matrices de moléculas caracterizadas por una superficie de hidrogel útil en la formación y la manipulación de matrices de polinucleótidos ya la modificación química de las matrices.

Antecedentes

Los avances en el estudio de las moléculas se han liderado, en parte, por la mejora de las tecnologías usadas para caracterizar las moléculas o sus reacciones biológicas. En particular, el estudio de los ácidos nucleicos, tales como ADN y ARN, y otras moléculas biológicas grandes, tales como proteínas, se ha beneficiado del desarrollo de tecnologías usadas para el análisis de secuencias y el estudio de eventos de hibridación.

Un ejemplo de las tecnologías que han mejorado el estudio de los ácidos nucleicos es el desarrollo de matrices fabricadas de ácidos nucleicos inmovilizados. Estas matrices normalmente consisten en una matriz de alta densidad de polinucleótidos inmovilizados sobre un material de soporte sólido. Fodor et al., Trends in Biotechnology (1994) 12:19-26, describen formas de ensamblar las matrices de ácidos nucleicos usando una superficie de vidrio sensibilizada químicamente protegida por una máscara, pero expuesta en áreas definidas para permitir la unión de nucleótidos modificados adecuadamente. Normalmente, estas matrices pueden describirse como matrices de "muchas moléculas", a medida que se forman regiones distintas en el soporte sólido que comprende una alta densidad de un tipo específico de polinucleótido.

Un enfoque alternativo se describe por Schena et al., Science (1995) 270:467-470, donde las muestras de ADN se colocan en sitios predeterminados en un portaobjetos de microscopio de vidrio mediante técnicas robóticas de micropipeteo.

Un desarrollo adicional en la tecnología de matrices es la unión de los polinucleótidos a un material de soporte sólido para formar matrices de moléculas individuales (SMA). Las matrices de este tipo se describen en el documento WO00/06770. La ventaja de estas matrices es que las reacciones pueden monitorizarse a nivel de molécula individual y la información sobre un gran número de moléculas individuales puede recopilarse a partir de una reacción individual. Aunque estas matrices ofrecen ventajas particulares en los experimentos de secuenciación, la preparación de matrices a nivel de una molécula individual es más difícil que a nivel de múltiples moléculas, donde pueden tolerarse pérdidas de polinucleótido diana debido a la multiplicidad de la matriz. Por otra parte, donde la secuencia de un polinucleótido está determinada por incorporaciones secuenciales de nucleótidos marcados, un problema adicional que surge es la aparición de unión no específica de nucleótidos a la matriz, por ejemplo, a la superficie de la matriz. Existe, por lo tanto, una necesidad constante de mejoras en la preparación de matrices de moléculas, particularmente polinucleótidos, por ejemplo, matrices de polinucleótidos de una molécula individual, para los procedimientos de secuenciación.

Las matrices moleculares con soporte sólido se han generado previamente en una diversidad de formas. De hecho, la unión de biomoléculas (tales como proteínas y ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN) a una diversidad de soportes/sustratos (por ejemplo, sustratos basados en sílice tales como vidrio, plástico o metales) sustenta las modernas tecnologías de micromatrices y biosensores empleadas para el genotipado, el análisis de la expresión génica y la detección biológica.

En casi todos los ejemplos donde las biomoléculas se han inmovilizado sobre soportes sólidos, la química de unión se diseña alrededor del soporte. Por ejemplo, los silanos (por ejemplo, silanos funcionalizados tales como cloro- o alcoxi-silanos) se usan comúnmente para modificar el vidrio; los tioles se usan a menudo para modificar la superficie del oro. Un problema potencial aquí es que los agentes usados para modificar una superficie a menudo no son adecuados para modificar la superficie de otro soporte. Por ejemplo, los tioles no pueden usarse para modificar el vidrio, ni pueden usarse silanos para modificar el oro.

Los sustratos basados en sílice tales como la sílice o el vidrio se emplean a menudo como soportes sobre los que se construyen las matrices moleculares. Sería deseable poder usar la química útil para modificar dichos soportes con otros soportes.

Antes de la construcción de cualquier matriz de soporte sólido a base de sílice, la superficie de apoyo generalmente se limpia exhaustivamente. Con sustratos basados en sílice, la superficie limpia resultante posee grupos hidroxilo que son neutros y/o desprotonados y, por lo tanto, cargados negativamente. Como resultado, existe un grado de resistencia a la unión no específica de nucleótidos usados en los experimentos de secuenciación. Los grupos hidroxilo neutros no atraen a los nucleótidos cargados negativamente, o la carga negativa de los grupos desprotonados sirve para repeler los nucleótidos. Independientemente, el efecto de la superficie hacia la unión no específica e indeseada de nucleótidos no es alta y es deseable disminuir el grado de unión no específica en los experimentos de secuenciación. Esto sirve para reducir el "ruido" de fondo durante la detección de cada nucleótido individual en cada etapa de los experimentos de secuenciación.

Otra forma en la que los polinucleótidos (y otras moléculas) se han mostrado previamente en la superficie del soporte sólido es mediante el uso de hidrogeles. Las matrices moleculares, por ejemplo, las micromatrices, de moléculas, particularmente polinucleótidos, son útiles en técnicas que incluyen la amplificación de ácidos nucleicos y métodos de secuenciación. En la preparación de matrices moleculares con soporte sólido basado en hidrogel, se forma un hidrogel y se muestran moléculas a partir de él. Estas dos características, la formación del hidrogel y la construcción de la matriz, pueden efectuarse secuencial o simultáneamente.

Cuando el hidrogel se forma antes de la formación de la matriz, normalmente se produce permitiendo que polimerice una mezcla de comonómeros. Generalmente, la mezcla de comonómeros contiene acrilamida y uno o más comonómeros, el último de los cuales permite, en parte, la inmovilización posterior de moléculas de interés para formar la matriz molecular.

Los comonómeros usados para crear el hidrogel normalmente contienen una funcionalidad que sirve para participar en la reticulación del hidrogel y/o inmovilizar el hidrogel en el soporte sólido y facilitar la asociación con las moléculas diana de interés.

Generalmente, como se conoce en la técnica, los hidrogeles de poliacrilamida se producen como láminas delgadas tras la polimerización de soluciones acuosas de solución de acrilamida. Un agente de reticulación multiinsaturado (poliinsaturado) (tal como 6/sacrilamida) está generalmente presente; la proporción de acrilamida a 6/sacrilamida es generalmente de aproximadamente 19:1. Dichos métodos de colada son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) y no es necesario analizarlos en detalle aquí.

Como alternativa al uso de matrices moleculares soportadas por hidrogel, se ha informado el uso de multicapas de polielectrolito (PEM) (E.P. Kartov et al., Biotechniques (marzo de 2003), 34:505-510; e I. Braslavsky et al., Proct Nat. Acad. Sci (1 de abril de 2003), 100 (7), 3960-3964) para permitir que se lleven a cabo experimentos de secuenciación en los cuales se incorporan moléculas marcadas con fluorescencia en cadenas de ADN y después se identifican mediante microscopía de fluorescencia. Los autores informan que, mediante el uso de PEM, la densidad de carga en la superficie puede ajustarse para repeler selectivamente los nucleótidos marcados construyendo las PEM de tal manera que la capa final tenga una carga negativa.

En consecuencia, los autores describen PEM tal que, después de su construcción, se usó en la formación de una matriz molecular. Esta última se formó inicialmente biotinilando la superficie usando un kit disponible en el mercado (kit EZ-Link™ de Pierce Chemical (Rockford, IL, EE.UU.). La PEM biotinilada se recubrió con Streptavidin-Plus™ (Prozyme, San Leandro, CA, EE.UU.) al que se unió el ADN biotinilado. De esta manera, el ADN biotinilado se une a la biotina unida covalentemente a través de interacciones no covalentes específicas con moléculas de estreptavidina "intercaladas".

Los autores de E.P. Kartov et al. (a cont/nuac/ón) e I. Braslavsky et al. (los dos autores son comunes a ambas publicaciones) informan que la capa de ácido poliacrílico final cargada negativamente está destinada a evitar que los nucleótidos marcados cargados negativamente se unan a la superficie. Está claro, sin embargo, que esto no tuvo éxito en todos los casos ya que se informa en I. Braslavsky et al. (a cont/nuac/ón) que no se pudo determinar la identidad del tercer o cuarto nucleótido incorporado (era "ambiguo"). Según los autores, esto estuvo provocado por "el aumento de la unión no específica de nucleótidos no incorporados".

En consecuencia, existe la necesidad de un método para proporcionar matrices de moléculas, particularmente polinucleótidos, cuyas matrices tengan una menor tendencia a interactuar de forma no específica con otras moléculas (y en particular (opcionalmente nucleótidos marcados con fluorescencia usados en experimentos de secuenciación) que las disponibles en la técnica anterior. También existe la necesidad de un método general para modificar un soporte sólido para permitir la preparación de soportes útiles en la preparación de matrices.

Sumario de la invención

Hasta el momento, se ha practicado alguna forma de modificación covalente de la superficie del soporte sólido con el fin de conseguir una inmovilización satisfactoria de matrices moleculares basadas en hidrogel o hidrogeles en los cuales se desea disponer moléculas. Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que una modificación funcional tal del soporte no es necesaria para lograr una inmovilización satisfactoria de matrices de moléculas de interés, en particular polinucleótidos. Para hacer matrices soportadas útiles capaces de unir moléculas de interés, los presentes inventores han descubierto que una mezcla de comonómeros que comprende al menos un monómero hidrófilo y un comonómero funcionalizado (funcionalizado en la medida en que el monómero una vez incorporado en el polímero es capaz de unir la molécula de interés a la superficie del hidrogel) puede polimerizarse de tal manera que forme un hidrogel capaz de ser inmovilizado sobre un soporte sólido, preferentemente un sustrato basado en sílice.

Visto desde un aspecto, por lo tanto, la divulgación proporciona un método no reivindicado para preparar un hidrogel inmovilizado en un soporte sólido que comprende polimerizar sobre dicho soporte una mezcla de:

(i) un primer comonómero que es acrilamida, metacrilamida, metacrilato de hidroxietilo o N-vinil pirrolidinona; y (ii) un segundo comonómero que es una acrilamida o acrilato funcionalizado de fórmula (I):

H²C=C(H)-C(=O)-A-B-C (I);

o un metacrilato o metacrilamida de fórmula (II):

o

H²C=C(CH³)-C(=O)-A-B-C- (II)

(en donde:

A es NR u O, en donde R es hidrógeno o un grupo hidrocarbilo saturado opcionalmente sustituido que comprende de 1 a 5 átomos de carbono;

-B- es un birradical alquileno opcionalmente sustituido de fórmula -(CH²V en donde n es un número entero de 1 a 50; y

en donde n = 2 o más, uno o más birradicales etileno opcionalmente sustituidos -CH²CH²- de dicho birradical alquileno pueden estar independientemente reemplazados por restos etenileno y etinileno; y en donde n = 1 o más, uno o más birradicales metileno -CH²- pueden estar independientemente reemplazados por un birradical hidrocarbono mono o policíclico opcionalmente sustituido que comprende de 4 a 50 átomos de carbono, o un birradical heteromonocíclico o heteropolicíclico correspondiente en donde al menos 1 CH² o CH² está sustituido por un átomo de oxígeno, azufre o nitrógeno o un grupo NH; y

C es un grupo para la reacción con un compuesto para unir dicho compuesto covalentemente a dicho hidrogel) para formar un producto polimerizado,

caracterizado por que dicho método se lleva a cabo e inmoviliza el producto polimerizado a dicho soporte que no está modificado covalentemente en la superficie.

Vista desde un segundo aspecto, la invención proporciona un hidrogel en soporte sólido que puede obtenerse de acuerdo con el método del aspecto anterior.

Vista desde un tercer aspecto, la divulgación proporciona un método no reivindicado para preparar una matriz molecular basada en hidrogel en soporte sólido uniendo una o más moléculas de interés a los sitios reactivos presentes en el hidrogel en soporte sólido de acuerdo con la invención.

En una realización particular, la divulgación proporciona un método no reivindicado para preparar una matriz molecular basada en hidrogel en soporte sólido que es una matriz agrupada uniendo cebadores de oligonucleótidos a sitios reactivos presentes en el hidrogel en soporte sólido y realizando la amplificación de ácido nucleico de una plantilla usando los cebadores unidos.

Vista desde un cuarto aspecto, la invención proporciona una matriz molecular basada en hidrogel en soporte sólido que puede obtenerse de acuerdo con el tercer aspecto.

Vista desde un quinto aspecto, la divulgación proporciona el uso no reivindicado de una matriz molecular de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención en cualquier método de análisis que requiera la interrogación de las moléculas de interés o las moléculas unidas a la misma.

El uso de matrices de hidrogel en soporte sólido en aplicaciones de matriz de molécula individual no se ha llevado a cabo anteriormente. Por lo tanto, vista desde un sexto aspecto, la divulgación proporciona el uso no reivindicado de matrices de hidrogel en soporte sólido en aplicaciones de matriz de molécula individual, preferentemente en donde dichas matrices pueden obtenerse y generalmente se obtienen, mediante un método que comprende:

(1) preparar un hidrogel inmovilizado en un soporte sólido que comprende polimerizar sobre dicho soporte una mezcla de:

(i) un primer comonómero que es acrilamida, metacrilamida, metacrilato de hidroxietilo o N-vinil pirrolidinona; y (ii) un segundo comonómero que es una acrilamida o acrilato funcionalizado de fórmula (I):

H²C=C(H)-C(=O)-A-B-C (I);

o un metacrilato o metacrilamida de fórmula (II):

o

H₂C=C(CH3)-C(=O)-A-B-C- (II)

(en donde:

A es NR u O, en donde R es hidrógeno o un grupo hidrocarbilo saturado opcionalmente sustituido que comprende de 1 a 5 átomos de carbono;

-B- es un birradical alquileno opcionalmente sustituido de fórmula -(CH²)n- en donde n es un número entero de 1 a 50; y en donde n = 2 o más, uno o más birradicales etileno opcionalmente sustituidos -CH²CH²- de dicho birradical alquileno pueden estar independientemente reemplazados por restos etenileno y etinileno; y en donde n = 1 o más, uno o más birradicales metileno -CH²- pueden estar independientemente reemplazados por un birradical hidrocarbono mono o policíclico opcionalmente sustituido que comprende de 4 a 50 átomos de carbono, o un birradical heteromonocíclico o heteropolicíclico correspondiente en donde al menos 1 CH² o CH² está sustituido por un átomo de oxígeno, azufre o nitrógeno o un grupo NH; y C es un grupo para la reacción con un compuesto para unir dicho compuesto covalentemente a dicho hidrogel para formar un producto polimerizado y

(2) unir una o más moléculas de interés a sitios reactivos presentes en el hidrogel producido en la etapa (1). La divulgación también proporciona el uso no reivindicado de y los métodos de uso, matrices, preferentemente matrices de molécula individual de acuerdo con la invención, en el interrogatorio de las moléculas en dicha matriz. Una de las ventajas de las matrices moleculares basadas en hidrogel y los hidrogeles de la invención, se ha descubierto, es que la omisión de una etapa de modificación de superficie covalente (particularmente del soporte sólido) proporciona una superficie que tiene mayor pasividad que en la técnica anterior, particularmente cuando se compara con aquellos casos donde se emplea el uso de los agentes modificadores de silano descritos anteriormente con sustratos basados en sílice.

La provisión de una superficie que conduzca a la menor contaminación posible de una superficie específica es claramente ventajosa cuando los hidrogeles se usan para construir matrices, tales como micromatrices y preferentemente matrices agrupadas o SMA, para su uso en reacciones de secuenciación. A pesar de esto, sin embargo, los hidrogeles de esta invención tienen una funcionalidad usada para formar, o reaccionar con, las moléculas que están dispuestas. Como consecuencia, estos hidrogeles también sufren, aunque en un grado más limitado que los hidrogeles de la técnica anterior soportados sobre un soporte funcionalmente modificado, de un grado de unión a un nucleótido específico durante la secuenciación.

Sorprendentemente, los presentes inventores han demostrado que las matrices moleculares basadas en hidrogel en soporte sólido de la invención pueden mejorarse aún más efectuando determinadas modificaciones a estas matrices después de su formación pero antes del inicio de cualquier manipulación de, por ejemplo, interrogatorio de, las moléculas en la matriz. Estas matrices son aún más ventajosas en, por ejemplo, reacciones de secuenciación de polinucleótidos porque las superficies de las matrices pueden volverse más pasivas y, por lo tanto, menos reactivas, hacia moléculas tales como nucleótidos opcionalmente marcados.

En consecuencia el método de acuerdo con el tercer aspecto de la divulgación contiene preferentemente la etapa adicional de aplicar a la matriz polielectrolito o polímeros neutros producidos de esta manera. Esta mejora es de beneficio correspondiente a los otros aspectos de la invención dirigidos a las propias matrices y los usos y métodos de uso de tales matrices.

La mejora de las matrices moleculares basadas en hidrogel en soporte sólido y los usos de las matrices de la invención es de utilidad general en la preparación y el uso de matrices moleculares. Se apreciará a partir del análisis anterior que, en la preparación de matrices de moléculas hasta la fecha, particularmente en la preparación de matrices de polinucleótidos, estas se han ensamblado invariablemente por la preparación inicial del soporte, ya sea que esto se logre mediante la modificación de un sustrato basado en sílice, o la formación de un PEM sobre un sustrato de vidrio, o la formación de un hidrogel sobre vidrio u otros soportes sólidos. Solamente una vez finalizada la constitución del soporte sólido se forma la matriz por reacción entre el soporte y las moléculas de interés. Después se usa la matriz, sin modificación adicional, en métodos de análisis tales como experimentos de secuenciación en los que las moléculas, normalmente polinucleótidos, se interrogan.

Vista desde un aspecto aún más amplio, por lo tanto, la divulgación proporciona un método no reivindicado para modificar una matriz molecular, cuya matriz molecular comprende una pluralidad de moléculas de interés, preferentemente biomoléculas, inmovilizadas a la superficie de un soporte, comprendiendo dicho método la etapa de aplicar a la matriz polielectrolito o polímeros neutros.

Vista desde un aspecto aún más amplio, la invención proporciona una matriz molecular obtenible de acuerdo con el aspecto inmediatamente anterior de la divulgación.

Vista desde un aspecto aún más amplio, la divulgación proporciona el uso no reivindicado de una matriz molecular de acuerdo con el aspecto inmediatamente anterior de la invención en cualquier método de análisis que requiera la interrogación de biomoléculas inmovilizadas o de moléculas unidas a la misma.

La presente invención se describirá a continuación con más detalle. En los siguientes pasajes se definen con más detalle diferentes aspectos de la invención. Cada aspecto así definido puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada siendo preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características siendo como preferidas o ventajosas.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1: La Figura 1 muestra imágenes que muestran la detección de fluorescencia a partir de oligonucleótidos inmovilizados sobre sustratos tanto de acuerdo como no de acuerdo con la invención, de acuerdo con el Ejemplo 11. Puede verse la unión mejorada del ADN terminado en fosforotioato (PS-ADN) sobre el ADN terminado en hidroxilo;

Fig. 2: La Figura 2 muestra los niveles relativos de señal positiva debido a la unión de PS-ADN frente al ruido negativo de la unión de OH-ADN resultante del acoplamiento de PS-ADN 1 μM de y OH-ADN 1 μM con plástico y sílice fundida (vidrio SPECTRASIL®) detectado en las superficies cuya preparación se describe en el Ejemplo 10; Fig. 3: La Figura 3 muestra que la estabilidad aparente del PS-ADN adsorbido específicamente (en tampón fosfato 50 mM (pH7, 65 °C)) para varios materiales plásticos es aproximadamente la misma que para el vidrio SPECTRASIL™;

Fig. 4: La Figura 4 muestra imágenes de la detección de fluorescencia a partir de oligonucleótidos inmovilizados sobre sustratos tanto de acuerdo como no de acuerdo con la invención, de acuerdo con el Ejemplo 13. Puede verse la unión mejorada del ADN terminado en fosforotioato (PS-ADN) sobre el ADN terminado en hidroxilo. Fig. 5: La Figura 5 es una ilustración esquemática de un método de la técnica anterior de amplificación en fase sólida en cual que una mezcla de cebadores de oligonucleótidos y cadenas molde se injertan simultáneamente en un soporte sólido.

Fig. 6: La Figura 6 es una ilustración esquemática de un método de amplificación en fase sólida de acuerdo con la invención en el cual los cebadores de oligonucleótidos se injertan primero en un soporte sólido y después se hibridan con las cadenas plantilla.

Fig. 7: La Figura 7 ilustra el uso de nucleótidos espaciadores para mejorar la eficiencia de la hibridación entre un cebador polinucleotídico inmovilizado y una diana marcada, de acuerdo con el Ejemplo 14.

Fig. 8: La Figura 8 muestra los resultados de los experimentos de hibridación realizados en placas de microtitulación entre diversas concentraciones de cebadores inmovilizados, con y sin nucleótidos espaciadores, y oligonucleótidos diana marcados con rojo Texas (TXR). En la Figura 8(a) la identidad del cebador inmovilizado se indica en la parte superior de la placa. Se añadieron plantillas en grupos de cuatro pocillos, como se muestra en la clave. La hibridación se llevó a cabo en dos tampones diferentes: un tampón de PCR (PCR) y 5xSSC (SSC). Se probó la hibridación de cada cebador inmovilizado con un cebador complementario (es decir, P5' es complementario de P5) y con un cebador control no complementario. La Figura 8(b) ilustra resultados típicos en forma gráfica.

Fig. 9: La Figura 9 ilustra la configuración experimental para los experimentos de hibridación descritos en el Ejemplo 14.

Fig. 10: La Figura 10 ilustra la configuración experimental y los resultados de los experimentos de hibridación usando diversas cebadores de oligonucleótidos inmovilizados, con y sin nucleótidos espaciadores, y oligonucleótidos diana marcados complementarios.

Fig. 11: La Figura 11 representa gráficamente los resultados de experimentos de hibridación típicos de acuerdo con la Figura 13 y el Ejemplo 14.

Fig. 12: La Figura 12 ilustra los resultados de los experimentos de hibridación usando cebadores de oligonucleótidos inmovilizados que contienen números variables de nucleótidos espaciadores y oligonucleótidos diana marcados complementarios. La Figura 12 (a) muestra la configuración y los resultados experimentales. La Figura 12(b) proporciona una representación gráfica de los resultados de los experimentos típicos de hibridación.

Descripción detallada de la invención

La divulgación, como se describe en el presente documento, proporciona un método mejorado no reivindicado para mostrar moléculas de interés, y particularmente biomoléculas (moléculas biológicas) tales como polinucleótidos y proteínas (preferentemente polinucleótidos) que se muestran en la superficie de un soporte sólido, preferentemente un hidrogel en soporte sólido.

El sólido sobre el que se soporta el hidrogel no se limita a una matriz o sustrato particular. De hecho, esta es una de las ventajas de la invención: la misma química usada para modificar los sustratos basados en sílice puede aplicarse a otros soportes sólidos y permite que el soporte sólido se adapte a cualquier aplicación particular a la que se desee aplicar en lugar de estar limitado por la química de la superficie es posible realizarlo en cualquier soporte dado. Los sólidos que pueden ser útiles en la práctica de esta invención incluyen sustratos basados en sílice, tales como vidrio, sílice fundida y otros materiales que contienen sílice; también pueden ser hidruros de silicona o materiales plásticos tales como polietileno, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), polipropileno, náilones, poliésteres, policarbonatos y poli(metacrilato de metilo). Los materiales plásticos preferidos son poli(metacrilato de metilo), poliestireno y sustratos poliméricos de olefinas cíclicas. Como alternativa, pueden usarse otros soportes sólidos tales como oro, dióxido de titanio o soportes de silicio. Se pretende que los anteriores listados sean ilustrativos de, pero no limitados a, la invención. Preferentemente, el soporte es un material basado en sílice o un material plástico tal como se analiza en el presente documento.

Las ventajas de usar sustratos basados en plástico en la preparación y el uso de matrices moleculares incluyen el coste: la preparación de sustratos apropiados basados en plásticos mediante, por ejemplo, moldeo por inyección, es generalmente más barato que la preparación, por ejemplo mediante grabado y unión, de sustratos basados en sílice. Otra ventaja es la diversidad casi ilimitada de plásticos que permiten ajustar con precisión las propiedades ópticas del soporte para adecuarlo a la aplicación para la que está destinado o a la cual puede destinarse.

Cuando se usan metales como sustratos, esto puede deberse a la aplicación deseada: la conductividad de los metales puede permitir la modulación del campo eléctrico en sensores basados en ADN. De esta manera, puede mejorarse la discriminación de emparejamientos incorrectos de ADN, puede verse afectada la orientación de las moléculas de oligonucleótidos inmovilizados o puede acelerarse la cinética del ADN.

Preferentemente el soporte está basado en sílice pero la forma del soporte empleado puede variar de acuerdo con la aplicación para la que se practica la invención.

Generalmente, sin embargo, las platinas de material de soporte, tal como sílice, por ejemplo, sílice fundida, son de particular utilidad en la preparación y la posterior interrogación de moléculas. Son de uso particular en la práctica de la invención los portaobjetos de sílice fundida vendidos bajo el nombre comercial SPECTRASIL™. A pesar de esto, será evidente para el experto en la materia que la invención es igualmente aplicable a otras presentaciones de soporte sólido (incluyendo los soportes basados en sílice), tales como perlas, varillas y similares.

El génesis de la invención es el reconocimiento por parte de los inventores de que la superficie del soporte no necesita modificarse covalentemente para que un hidrogel se inmovilice sobre ella. Como se describe en el presente documento, la etapa de modificación covalente de la superficie puede omitirse cuando la mezcla de comonómeros descrita y estipulada en el presente documento se use para producir un hidrogel.

Si se desea visualizar moléculas de interés, por ejemplo, biomoléculas, estas pueden ser cualquier molécula biológica que se desee analizar. De particular interés son los polipéptidos o proteínas (incluidas las enzimas) y los polinucleótidos, siendo particularmente preferidos los polinucleótidos.

Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se refiere a ácidos nucleicos en general, incluyendo ADN (por ejemplo, ADN genómico o ADNc), ARN (por ejemplo, ARNm), oligonucleótidos sintéticos y análogos de ácidos nucleicos sintéticos. Los polinucleótidos pueden incluir bases naturales o no naturales o combinaciones de las mismas y enlaces de la estructura principal naturales o no naturales, por ejemplo, fosforotioatos, PNA o 2'-O-metil-ARN o combinaciones de los mismos.

Aunque se apreciará que los hidrogeles de soporte sólido usados en la invención son útiles para la presentación de muchos tipos diferentes de moléculas, los hidrogeles son de particular utilidad en la formación de matrices de polinucleótidos y su posterior análisis. Por este motivo, la mayor parte del análisis posterior se centrará en la utilidad de los hidrogeles soportados de la invención en la preparación de matrices de polinucleótidos (tanto matrices de molécula individual como micromatrices, tales como matrices agrupadas formadas por amplificación de ácido nucleico) aunque debe entenderse que tal aplicaciones de ninguna manera limitan la invención. Por otra parte, dado que los soportes basados en sílice se usan normalmente para soportar hidrogeles y matrices de hidrogel, el análisis posterior se centrará en el uso de soportes basados en sílice. De nuevo, esto no debe considerarse como una limitación de la invención; más bien esto es demostrativo de una ventaja particular de la invención. También para mejorar los procedimientos dirigidos a construir matrices de moléculas en hidrogeles soportados en sílice. La mejora ofrecida será evidente a partir de una revisión de la técnica anterior.

El documento WO00/31148 desvela hidrogeles de poliacrilamida y matrices basadas en hidrogel de poliacrilamida en las que se forma un llamado prepolímero de poliacrilamida, preferentemente de acrilamida y un ácido acrílico o un derivado de ácido acrílico que contiene un grupo vinilo. Después puede efectuarse la reticulación del prepolímero. Los hidrogeles producidos de esta manera están en un soporte sólido, preferentemente sobre vidrio. También puede efectuarse la funcionalización del hidrogel sobre soporte sólido.

El documento WO01/01143 describe una tecnología similar a la del documento WO00/31148 pero que difiere en que el hidrogel tiene una funcionalidad capaz de participar en una reacción de fotocicloadición [2+2] con una biomolécula para formar matrices inmovilizadas de tales biomoléculas. La dimetilmaleimida (DMI) es una funcionalidad particularmente preferida. El uso de reacciones de fotocicloadición [2+2], en el contexto de la tecnología de micromatriz basada en poliacrilamida también se describe en los documentos WO02/12566 y WO03/014392.

La Patente de EE.UU. N.° 6.465.178 desvela el uso de composiciones reactivas para proporcionar portaobjetos activados para su uso en la preparación de micromatrices de ácidos nucleicos; las composiciones de reactivos incluyen copolímeros de acrilamida. Se afirma que los portaobjetos activados son particularmente adecuados para reemplazar los portaobjetos de vidrio convencionales (por ejemplo, sililados) en la preparación de micromatrices.

El documento WO00/53812 desvela la preparación de matrices de ADN de hidrogel basadas en poliacrilamida y el uso de estas matrices en la amplificación de réplicas.

Ninguna de las técnicas anteriores descritas en el presente documento describe la preparación de un hidrogel en soporte sólido en donde el soporte sólido no está modificado covalentemente.

Una vez formados los hidrogeles, después se les pueden unir moléculas para producir matrices moleculares, si se desea. La unión se ha realizado de diferentes maneras en la técnica anterior. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 6.372.813 enseña la inmovilización de polinucleótidos que portan grupos dimetilmaleimida en los hidrogeles producidos que portan grupos dimetilmaleimida mediante la realización de una etapa de fotocicloadición [2+2] entre dos grupos dimetilmaleimida, uno unido al polinucleótido que se va a inmovilizar y otro pendiente del hidrogel.

Donde la matriz molecular se forma después de la generación del hidrogel, se han empleado dos estrategias para lograr este fin. En primer lugar, el hidrogel puede modificarse químicamente después de su producción. Los problemas con este enfoque incluyen una baja eficiencia general en la preparación de la matriz y la baja estabilidad relacionada con la química de unión, especialmente tras la exposición a altas temperaturas, soluciones iónicas y múltiples etapas de lavado.

Una alternativa más común es efectuar la polimerización con un comonómero que tenga una funcionalidad cebada o preactivada para reaccionar con las moléculas que se van a disponer.

En el estado de la técnica se han descrito alternativas a la formación inicial de hidrogeles seguida de la posterior disposición de moléculas en los mismos, donde la disposición se forma al mismo tiempo que se produce el hidrogel. Esto puede efectuarse mediante, por ejemplo, copolimerización directa de polinucleótidos derivados de acrilamida. Un ejemplo de este enfoque se describe en el documento WO01/62982 en el cual los polinucleótidos derivados de acrilamida se mezclan con soluciones de acrilamida y la polimerización se efectúa directamente.

Mosaic Technologies (Boston, Massachusetts, EE.UU.) producen ACRYDITE™ (una fosforamidita de acrilamida) que se puede hacer reaccionar con polinucleótidos antes de la copolimerización del monómero resultante con acrilamida. Efimov et al. (Nucleic Acids Research, 1999, 27 (22), 4416-4426) desvelan un ejemplo adicional de una formación simultánea de hidrogel/matriz en la cual se efectúa la copolimerización de acrilamida, los derivados reactivos del ácido acrílico y los polinucleótidos modificados que tienen grupos acrilamida en el extremo 5' o 3'.

Las técnicas descritas anteriormente, sin embargo, en las cuales el hidrogel se genera simultáneamente con la matriz mediante la introducción de comonómeros apropiados que portan las moléculas de interés, sufren problemas que incluyen daño a las moléculas de interés durante la polimerización.

En la técnica anterior se ha usado una diversidad de soportes sólidos para generar matrices moleculares en soporte sólido basadas en hidrogel. Estos incluyen los soportes analizados anteriormente. Generalmente el soporte sólido preferido comprende un sustrato basado en sílice. Los ejemplos de sustratos basados en sílice incluyen sílice fundida y vidrio.

De acuerdo con el conocimiento de los presentes inventores, en todos los casos de hidrogeles en soporte basado en sílice descritos en el estado de la técnica, la sílice se modifica químicamente de alguna manera para unir covalentemente un grupo químicamente reactivo capaz de reaccionar con el hidrogel o con un hidrogel parcialmente formado (por ejemplo, un prepolímero (PRP)). El agente activador de superficie es normalmente un compuesto de organosilicio (organosilano). Lo más comúnmente, es Y-metacriloxipropiltrimetoxisilano, conocido como "Bind Silane" o "Crosslink Silane" y disponible en el mercado de Pharmacia, aunque también se conocen otros agentes activadores de superficie basados en silicio, tales como monoetoxidimetilsililbutanal, 3-mercaptopropiltrimetoxisilano y 3-aminopropiltrimetoxisilano (todos disponibles de Aldrich). De esta manera, los grupos funcionales colgantes tales como grupos amina, grupos sulfhidrilo, grupos aldehído o grupos polimerizables (por ejemplo, olefinas) pueden unirse a la sílice.

Quedará claro a partir del análisis anterior que la invención es particularmente útil cuando el soporte sólido usado está basado en sílice, ya que el soporte basado en sílice no necesita modificarse covalentemente por su preactivación con un agente de sililación como se describe anteriormente para inmovilizar el hidrogel al mismo. Claramente, sin embargo, los polímeros descritos en el presente documento todavía pueden estar (en ciertos aspectos de la invención) unidos a soportes basados en sílice que se han activado en superficie, por ejemplo, con una molécula de organosilano como se ha descrito anteriormente; las ventajas completas de la invención, sin embargo, no podrán obtenerse de esta manera. También pueden, por supuesto, unirse a los otros soportes sólidos desvelados en el presente documento, en particular plásticos tales como poli(metacrilato de metilo) y poliolefinas. Tales plásticos están fácilmente disponibles en el mercado, por ejemplo, de Árnic, Corning, Zeon Chemical Ltd y otros.

La modificación de la superficie de soportes sólidos basados en sílice por medios distintos de la unión covalente de un resto de organosilicio no está excluida del alcance de esta invención. Preferentemente, sin embargo, no se efectúa ninguna activación de la sílice (por modificación covalente de una superficie de la misma o por cualquier otro medio) antes de efectuar la polimerización sobre la misma.

Se entenderá que las expresiones tales como "modificación covalente de la superficie", "modificar covalentemente la superficie" y "superficie modificada covalentemente" no abarcan la simple limpieza y/o secado de sustratos, particularmente sustratos de sílice, antes de su uso. Generalmente tales etapas se llevarán a cabo antes de cualquier polimerización pero no constituyen una etapa de modificación de la superficie ya que tales etapas esencialmente no efectúan ninguna modificación covalente de una superficie.

Cuando el sustrato está basado en sílice, la limpieza se logrará por contacto con uno o más disolventes orgánicos tales como acetona, isopropanol (IPA), etanol y similares o con agua o soluciones acuosas ácidas o alcalinas tales como ácido clorhídrico o sulfúrico diluido o hidróxido de sodio diluido. Los soportes basados en sílice también pueden limpiarse por contacto con una solución detergente (por ejemplo, Decon 90). Estas diversas etapas de limpieza pueden realizarse individualmente o en combinación, por ejemplo secuencialmente. El secado puede efectuarse, por ejemplo, por calentamiento de portaobjetos de sílice a temperaturas de 40 °C a 200 °C, preferentemente de 80 °C a 150 °C durante entre 5 minutos y 24 horas, preferentemente a temperaturas de aproximadamente 120 °C y, preferentemente, durante 1 a 2 horas.

Las etapas de limpieza y secado descritas anteriormente se entenderán por los expertos en la materia como que no constituyen ninguna forma de modificación de superficie covalente (y en particular ninguna forma de modificación de superficie covalente en la que se une un resto de organosilicio (organosilano)). Dichas etapas sirven para eliminar la contaminación de la superficie (por ejemplo, suciedad o polvo) y generalmente se llevarán a cabo antes del uso de materiales a base de sílice en la mayoría de las aplicaciones científicas. El calentamiento del vidrio a temperaturas muy altas (por ejemplo, 1000 °C o más o incluso 300 °C o más) o por contacto con materiales que se sabe que se disuelven o graban el vidrio (como el ácido fluorhídrico), aunque es poco probable que se lleve a cabo en la limpieza de sustratos basados en sílice antes de la práctica de esta invención, no debe considerarse una forma de modificación de la superficie.

Para sustratos que no son basados en sílice, pueden ser apropiadas otras técnicas de limpieza, como resultará evidente para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, los sustratos de plástico pueden limpiarse por contacto con (por ejemplo, inmersión en) cualquier detergente conveniente (Decon 90 es un ejemplo) seguido de un enjuague completo con agua, preferentemente agua purificada como MilliQ, antes del secado.

Los métodos mediante los cuales se polimeriza la mezcla de comonómeros para proporcionar el producto de la invención no son característicos de esta invención y serán conocidos por el experto en la materia (por ejemplo, recurriendo a Sambrook et al. (anteriormente citado). Generalmente, sin embargo, la polimerización se llevará a cabo en un medio acuoso y la polimerización se iniciará con cualquier iniciador adecuado. Normalmente se emplea persulfato potásico o amónico como un iniciador. La tetrametiletilendiamina (TMEDA o TEMED) puede usarse y generalmente se usa para acelerar la polimerización.

Es importante señalar que, en contraste con la enseñanza de la preparación de hidrogel en la técnica anterior relacionada con la preparación de matrices moleculares, no es necesario que un agente de reticulación poliinsaturado como 6/sacrilamida o tetraacrilato de pentaeritritol está presente en la mezcla que se polimeriza; tampoco es necesario formar intermedios tipo PRP y reticularlos. Es una de las características sorprendentes de la invención que se puede lograr una estabilidad satisfactoria de la matriz inmovilizada en ausencia de dichos agentes de reticulación o etapas de reticulación de PRP. La ausencia de un agente reticulante poliinsaturado (tal como 6/sacrilamida o tetraacrilato de pentaeritritol) es una característica preferida en todos los aspectos de la provisión de esta invención dirigida a hidrogeles, o usos o métodos para la preparación de los mismos. Por lo tanto, es una característica preferida de tales aspectos de la divulgación que la mezcla a polimerizar no comprenda dicho agente de reticulación poliinsaturado y que los monómeros a polimerizar consistan esencialmente en los definidos en la cláusula 1 (es decir, no se incluye ningún monómero de reticulación poliinsaturado en la mezcla).

Generalmente, en la producción de hidrogeles que caracterizan esta invención, sólo se usará un compuesto de fórmulas (I) o (II).

Los presentes inventores han descubierto que el uso de un compuesto de fórmulas (I) o (II) permite la formación de un hidrogel capaz de inmovilizarse en soportes sólidos, preferentemente soportes sólidos basados en sílice. Los compuestos de estas fórmulas comprenden las porciones A, B y C como se definen en el presente documento. El birradical A puede ser oxígeno o N(R) en donde R es hidrógeno o un grupo alquilo C^1-5. Preferentemente, R es hidrógeno o metilo, particularmente hidrógeno. Donde R es un grupo alquilo C^1-5, esto puede contener uno o más, por ejemplo uno a tres sustituyentes. Preferentemente, sin embargo, el grupo alquilo no está sustituido.

El birradical B es un resto de enlace predominantemente hidrófobo, que conecta A con C y puede ser un birradical alquileno de fórmula -(CH²)ⁿ-, en donde n es de 1 a 50. Preferentemente n es 2 o más, por ejemplo, 3 o más. Preferentemente n es de 2 a 25, particularmente de 2 a 15, más particularmente de 4 a 12, por ejemplo, de 5 a 10. Donde n en -(CH²)ⁿ- es 2 o más, uno o más birradicales -CH²CH²-(-etileno-) puede reemplazarse por etenileno o birradicales de etinileno. Preferentemente, sin embargo, el birradical B no contiene tal insaturación.

Adicional o alternativamente, donde n en -(CH²V es 1 o más, uno o más radicales metileno -CH²- en B puede reemplazarse por un birradical mono- o policíclico que comprende preferentemente de 5 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, 5 o 6 átomos de carbono. Tales birradicales cíclicos pueden ser, por ejemplo, birradicales 1,4-, 1,3- o 1,2­ ciclohexilo. También pueden emplearse radicales bicíclicos tales como naftilo o decahidronaftilo. También pueden emplearse birradicales cíclicos sustituidos con heteroátomos correspondientes a esos birradicales homocíclicos, por ejemplo, piridilo, piperidinilo, quinolinilo y decahidroquinolinilo.

Se apreciará que, por lo tanto, el alcance de -B- no está particularmente restringido. Lo más preferentemente, sin embargo, -Bis es un birradical alquileno sencillo, no sustituido, insaturado tal como un grupo alquileno C³-C¹⁰, óptimamente C⁵-C⁸, tal como n-pentileno: -(CH²)⁵-.

Cuando se indica que un grupo alquilo (o alquileno, alquenileno, etc.) está (opcionalmente) sustituido, los sustituyentes pueden seleccionarse del grupo que comprende hidroxilo, halo (es decir, bromo, cloro, fluoro o yodo), carboxilo, aldehído, amina y similares. El birradical -B- está preferentemente no sustituido o sustituido con menos de 10, preferentemente menos de 5, por ejemplo, con 1, 2 o 3 de tales sustituyentes.

El grupo C sirve para permitir la unión de moléculas de interés después de la formación del hidrogel. La naturaleza del Grupo C está, por lo tanto, esencialmente ilimitada siempre que contenga una funcionalidad que permita la reacción entre el hidrogel y las moléculas de interés. Preferentemente, dicha funcionalidad no requerirá modificación antes de la reacción con la molécula de interés y, por lo tanto, el grupo C está listo para la reacción directa tras la formación del hidrogel. Preferentemente una funcionalidad tal es un hidroxilo, tiol, amina, ácido (por ejemplo, ácido carboxílico), éster y haloacetamido, siendo particularmente preferido haloacetamido y en particular bromoacetamido. Otros grupos C apropiados serán evidentes para los expertos en la materia e incluyen grupos que comprenden un doble enlace carbono-carbono individual que es terminal (es decir, donde un grupo C tiene un extremo que termina en un doble enlace carbono-carbono) o donde el doble enlace carbono-carbono no está en un extremo terminal. Cuando un grupo C comprende un doble enlace carbono-carbono, este preferentemente está completamente sustituido con grupos alquilo C^1-5, preferentemente grupos metilo o etilo, de tal manera que ninguno de los átomos de carbono del resto C=C porte un átomo de hidrógeno.

El resto C puede comprender, por lo tanto, por ejemplo, un resto de dimetilmaleimida como se desvela en el documento US 6.372.813, el documento WO01/01143, el documento WO02/12566 y el documento WO03/014394.

La (met)acrilamida o el (met)acrilato de fórmula (I) o (II) que se copolimeriza con acrilamida, metacrilamida, metacrilato de hidroxietilo o N-vinil pirrolidinona es preferentemente una acrilamida o acrilato, es decir, de fórmula (I). Más preferentemente es una acrilamida y aún más preferentemente es una acrilamida en la cual A es NH.

La reacción entre un comonómero de fórmula (I) o (II) y acrilamida, metacrilamida, metacrilato de hidroxietilo o metacrilamida de N-vinil pirrolidinona, particularmente acrilamida, se ha descubierto que proporciona hidrogeles particularmente adecuados para su uso en la generación de matrices moleculares. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que pueden formarse copolímeros análogos mediante la reacción entre comonómeros de fórmula (I) o (II) y cualquier comonómero vinílico, el hidroxietilmetacrilato y la n-vinilpirrolidinona son dos ejemplos de tales comonómeros vinílicos.

El control de la proporción de monómero de fórmula (I) o (II) con respecto al primer comonómero (por ejemplo, acrilamida y/o metacrilamida, preferentemente acrilamida) permite el ajuste de las propiedades físicas del hidrogel obtenido en la polimerización. Se prefiere que el comonómero de fórmula (I) o (II) esté presente en una cantidad de >1 % en moles, preferentemente > 2 % en moles (en relación con la cantidad molar total de comonómeros) para que el hidrogel tenga una estabilidad térmica y química óptima en las condiciones típicas encontradas durante la preparación y la manipulación posterior, de las matrices moleculares producidas a partir de los hidrogeles. Preferentemente, la cantidad de comonómero de fórmula (I) o (II) es inferior o igual a aproximadamente 5 mol, más preferentemente menos de o igual a aproximadamente el 4 % en moles. Las cantidades típicas de comonómero de fórmula (I) o (II) usadas son 1,5-3,5 % en moles, ejemplificado en el presente documento en aproximadamente el 2 % y aproximadamente en el 3 %.

Las cantidades de acrilamida o metacrilamida a partir de las cuales se construyen principalmente los hidrogeles son las que normalmente se usan para formar hidrogeles, por ejemplo, de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 10 % p/v, preferentemente menos del 5 o el 6 % p/v, por ejemplo, de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 2 % p/v. De nuevo, por supuesto, la naturaleza precisa del hidrogel puede ajustarse mediante, en parte, el control de la cantidad de acrilamida o metacrilamida usada.

Al formar los hidrogeles, la acrilamida o la metacrilamida pueden disolverse en agua y mezclarse con una solución de un comonómero de fórmula (I) o (II). Este último puede disolverse convenientemente en un disolvente miscible en agua, tal como la dimetilformamida (DMF) o el agua misma. El disolvente más apropiado puede seleccionarse por el experto en la materia y dependerá de la estructura del comonómero de fórmula (I) o (II).

Los métodos mediante los cuales se sintetizan los monómeros de fórmula (I) o (II) serán evidentes para los expertos en la materia. A modo de ejemplo, la síntesis de un monómero particularmente preferido (de fórmula (I) en donde A = NH, -B- = -(CH²)⁵- y -C = -N(H)-C(=O)CH²Br se proporciona como un ejemplo en lo sucesivo en el presente documento. Como se ha indicado anteriormente, los métodos generales por los que se lleva a cabo la polimerización son conocidos por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, generalmente la acrilamida o la metacrilamida se disuelven en agua purificada (por ejemplo, Milli Q) y el persulfato potásico o amónico se disuelve por separado en agua purificada. El comonómero de fórmula (I) o (II) puede disolverse convenientemente en un disolvente orgánico miscible en agua, por ejemplo, glicerol, etanol, metanol, dimetilformamida (DMF), etc. TEMED puede añadirse según sea apropiado. Una vez formulada (una preparación típica se describe en los ejemplos), la mezcla se polimeriza con el menor retraso posible después de su formulación.

El proceso de polimerización puede realizarse por cualquier medio conveniente. Varios ejemplos se describen en la sección experimental a continuación.

Los hidrogeles que caracterizan esta invención son de particular utilidad en la preparación de matrices de moléculas, particularmente matrices de molécula individual (SMA) o matrices agrupadas y en particular SMA o matrices agrupadas de polinucleótidos.

Se ha señalado anteriormente que es una característica sorprendente de los aspectos relevantes de esta divulgación que es posible omitir la inclusión de un agente de reticulación poliinsaturado. Cuando se omite dicho agente de reticulación, como sea preferible, es posible producir hidrogeles más delgados que los que se han logrado hasta ahora. En particular, la omisión de tales agentes de reticulación permite la preparación de hidrogeles que tienen espesores de menos de aproximadamente 100 nm, por ejemplo, menos de 75 nm; los hidrogeles pueden tener menos de aproximadamente 50 nm de grosor.

Dichos hidrogeles son de particular utilidad cuando se usan para generar matrices, en particular matrices de moléculas individuales o matrices agrupadas, particularmente de nucleótidos, y en la interrogación de dichas matrices en donde los nucleótidos marcados con fluorescencia se incorporan en un polinucleótido naciente y después se detectan. Dichas técnicas se describen con mayor detalle a continuación.

Hay una serie de ventajas de los hidrogeles producidos de acuerdo con esta divulgación.

Con especial atención a los sustratos basados en sílice, la descripción permite evitar la modificación química covalente (especialmente con agentes que contienen silicio) del sustrato basado en sílice para que los hidrogeles producidos sobre el soporte se inmovilicen en el mismo. Por lo tanto, la invención se caracteriza por hidrogeles inmovilizados sobre una diversidad de soportes sólidos sobre los cuales tal inmovilización no se ha informado anteriormente. Por "inmovilización" de un hidrogel sobre un soporte se entiende que los hidrogeles soportados se asocian al soporte de tal manera que permanecen como una capa sobre el soporte en las condiciones encontradas durante la preparación y manipulación (por ejemplo, interrogación) de matrices moleculares. Tales preparaciones y manipulaciones se describen con mayor detalle a continuación y son conocidas por los expertos en la materia.

Otra ventaja de los hidrogeles soportados que caracterizan la invención es que se evita la necesidad de modificación química del hidrogel (es decir, polimerización posterior) para unir moléculas de interés. Con los grupos "C" descritos en el presente documento, las moléculas apropiadamente funcionalizadas pueden unirse directamente al hidrogel. Una ventaja adicional es la pasividad, es decir, la falta esencial de reactividad, de la superficie del hidrogel hacia la adherencia no específica de moléculas (por ejemplo, nucleótidos marcados con fluorescencia) a la superficie; de lo contrario, dichos adherentes crearían un "ruido" no deseado durante la manipulación posterior de las matrices moleculares formadas a partir de los hidrogeles, particularmente en la manipulación de SMA o matrices agrupadas. Como se ha indicado anteriormente, se ha descubierto que la omisión de una etapa de modificación de superficie covalente da como resultado una superficie que tiene mayor pasividad que en la técnica anterior, particularmente cuando se compara con aquellos casos donde se emplea el uso de los agentes modificadores de silano descritos anteriormente con sustratos basados en sílice.

La provisión de una superficie que conduzca a la menor contaminación posible de una superficie específica es claramente ventajosa cuando los hidrogeles se usan para construir matrices para usarse en aplicaciones SMA. Por supuesto, donde los hidrogeles se usan para construir micromatrices agrupadas, también es ventajoso minimizar la contaminación de la superficie en la mayor medida posible.

De acuerdo con los aspectos preferidos de la descripción, las matrices moleculares basadas en hidrogel en soporte sólido de la invención pueden tratarse con polielectrolitos o polímeros neutros para producir matrices, preferentemente SMA o matrices agrupadas, particularmente SMA o matrices agrupadas de polinucleótidos, cuyas superficies han aumentado la pasividad hacia, por ejemplo, una unión específica con nucleótidos (por ejemplo, nucleótidos marcados) usados en la secuenciación y otros métodos interrogativos de uso de las matrices. También, la divulgación proporciona un método mejorado, que no se reivindica, por el cual las moléculas de interés (preferentemente biomoléculas tales como aquellas identificadas anteriormente), preferentemente polinucleótidos y proteínas (en especial preferentemente polinucleótidos) pueden mostrarse modificando matrices de moléculas existentes, es decir, preparadas. Se apreciará que, dado que este aspecto de la invención radica en la modificación de matrices moleculares existentes, la naturaleza de la matriz molecular tratada de acuerdo con el método de la divulgación no tiene ninguna importancia particular. A pesar de esto, se prefiere que las matrices tratadas estén de acuerdo con el cuarto aspecto de esta divulgación. De forma similar, la naturaleza de las biomoléculas dispuestas, o los medios por los cuales están dispuestas, es de menor importancia que el requisito para la etapa de modificación en donde la matriz se trata con polielectrolito o polímeros neutros.

Debido a la particular utilidad de las matrices moleculares, preferentemente SMA o matrices agrupadas, más preferentemente SMA o matrices agrupadas de polinucleótidos, en métodos de determinación de secuencias, el análisis anterior se ha centrado, y la discusión posterior se centrará, en esta utilidad de la composición de la invención, aunque debe entenderse que la invención no debe considerarse tan limitada.

De modo similar, la composición del soporte sólido de la matriz que se va a modificar, o el tipo de matriz que se va a modificar, no tiene tanta importancia como la manera en que se trata (se modifica) de acuerdo con la divulgación. SMA y matrices agrupadas, sin embargo y preferentemente, SMA y las matrices agrupadas de polinucleótidos son particularmente ventajosos.

La expresión "matriz de molécula individual" o "SMA", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas de polinucleótidos, distribuidas (o dispuestas) sobre un soporte sólido, en donde la separación de cualquier polinucleótido individual de todos los demás de la población es tal que es posible efectuar una resolución individual, o interrogación, de los polinucleótidos. Las moléculas de ácido nucleico diana inmovilizadas sobre la superficie del soporte sólido deberían, por lo tanto, ser capaces de resolverse por medios ópticos. Esto significa que, dentro del área resoluble del dispositivo de formación de imágenes particular usado, debe haber una o más señales distintas, representando cada una un polinucleótido. Esto puede conseguirse, preferentemente en donde el espacio entre las moléculas de polinucleótidos adyacentes en la matriz es de al menos 100 nm, más preferentemente al menos 250 nm, aún más preferentemente al menos 300 nm, incluso más preferentemente al menos 350 nm. Por lo tanto, cada molécula puede resolverse individualmente y detectarse como un punto fluorescente de molécula individual y la fluorescencia de dicho punto fluorescente de molécula individual también exhibe un fotoblanqueo de una sola etapa. Los grupos de moléculas sustancialmente idénticas no muestran fotoblanqueo de un solo punto en condiciones operativas convencionales usadas para detectar/analizar moléculas en matrices. La intensidad de un punto de fluorescencia de molécula individual es constante durante un período de tiempo anticipado después del cual desaparece en una etapa individual. Por el contrario, la intensidad de un punto de fluorescencia compuesto por dos o más moléculas, por ejemplo, desaparece en dos o más etapas distintos y observables, según sea apropiado. La intensidad de un punto de fluorescencia que surge de un grupo que consiste en miles de moléculas similares, tal como aquellos presentes en las matrices que consisten en miles de moléculas similares en cualquier punto dado, por ejemplo, desaparecería en un patrón consistente con un decaimiento exponencial. El patrón de decaimiento exponencial refleja la pérdida progresiva de fluorescencia de las moléculas presentes en el grupo y revela que, con el tiempo, cada vez menos moléculas en la mancha conservan su fluorescencia.

La expresión "matriz agrupada" se refiere a una matriz en donde distintas regiones o sitios en la matriz comprenden múltiples moléculas de polinucleótidos que no pueden resolverse individualmente por medios ópticos. Dependiendo de cómo se forme la matriz, cada región o sitio de la matriz puede comprender múltiples copias de una molécula de polinucleótido individual o incluso múltiples copias de un pequeño número de diferentes moléculas de polinucleótido (por ejemplo, múltiples copias de dos cadenas de ácido nucleico complementarias). En una realización preferida la expresión "matriz agrupada" se refiere a una matriz producida por amplificación en fase sólida de un polinucleótido diana o plantilla, en donde las copias amplificadas de la diana o plantilla se unen covalentemente al soporte sólido durante la amplificación.

Pueden producirse matrices agrupadas de moléculas de ácido nucleico usando técnicas generalmente conocidas en la técnica. A modo de ejemplo, los documentos WO 98/44151 y WO 00/18957 describen ambos métodos de amplificación de ácidos nucleicos que permiten inmovilizar productos de amplificación sobre un soporte sólido para formar matrices compuestas por grupos o "colonias" de moléculas de ácido nucleico inmovilizadas. Otro método para la preparación de matrices agrupadas en un hidrogel unido a un soporte sólido se describe con más detalle a continuación y en los ejemplos adjuntos. Se apreciará que las matrices de la invención, en todos los aspectos, pueden ser matrices de grupos de moléculas. Tales conjuntos son una realización preferida de todos los aspectos de la invención.

El soporte para la matriz molecular (basado en hidrogel o de otro tipo) que puede modificarse de acuerdo con la divulgación no se limita a una matriz o sustrato particular. Los soportes que pueden ser de utilidad en la práctica de esta invención son como se describe anteriormente.

Algunos soportes a los que las biomoléculas, tales como polinucleótidos, se unen son soportes basados en sílice en sí mismos. En determinadas realizaciones de la invención estos pueden modificarse covalentemente de alguna manera para permitir la unión covalente de cualquiera de los polinucleótidos o para inmovilizar un hidrogel de grupo químicamente reactivo o un hidrogel parcialmente formado (por ejemplo, un prepolímero). El agente activador de superficie es normalmente un compuesto de organosilicio (organosilano) tal como aquellos enumerados anteriormente. Las matrices en las cuales los polinucleótidos se han unido directamente a soportes basados en sílice son, por ejemplo, aquellas descritas en el documento WO 97/04131, en donde los polinucleótidos en horquilla se inmovilizan sobre un soporte de vidrio mediante la reacción entre un grupo epóxido colgante sobre el vidrio con un grupo amino interno contenido dentro del bucle.

Zhao et al. (Nucleic Acids Research, 2001, 29(4), 955-959) desvelan la formación de un polinucleótido en horquilla que contiene múltiples restos de fosforotioato en el bucle. Los restos se usan para anclar, en más de una posición, el ADN de la horquilla en portaobjetos de vidrio preactivados con bromoacetamidopropilsilano.

El trabajo de Zhao se desarrolló sobre el trabajo anterior de Pirrung. et al. (Langmuir, 2000, 16, 2185-2191) en el cual los autores informan que los oligonucleótidos que terminan en 5'-tiofosfato podrían unirse al vidrio, preactivado con silanos mono y dialcoxilados y bromoacetamida.

Además, los presentes inventores desvelan en su solicitud de patente internacional en trámite número PCT/GB2004/004707 matrices de polinucleótidos en horquilla unidos a un soporte sólido, por ejemplo, para su uso en la preparación de SMA, mediante la reacción de un nucleófilo basado en azufre con el soporte sólido. El nucleófilo basado en azufre puede unirse directamente a la horquilla, aunque preferentemente se une indirectamente a través de un enlazador. La unión es por medio de un nucleótido interno dentro de la horquilla, es decir, que el nucleófilo basado en azufre no está conectado directamente o a través de un enlazador a un nucleótido en ninguno de los extremos de la horquilla.

Un ejemplo aún adicional de matrices son aquellas en las cuales las biomoléculas, preferentemente polinucleótidos, se unen a hidrogeles soportados sobre soportes sólidos basados en sílice u otros. Los soportes basados en sílice se usan normalmente para soportar hidrogeles y matrices de hidrogel como se describe en el documento WO00/31148, el documento WO01/01143, el documento WO02/12566, el documento WO03/014392, la Patente de EE.UU. N.° 6.465.178 y el documento WO00/53812.

Los soportes sólidos para tales hidrogeles son preferentemente basados en sílice ya que el soporte basado en sílice no necesita modificarse covalentemente por preactivación con un agente de sililación como se describe anteriormente para inmovilizar el hidrogel en el mismo. Claramente, sin embargo, dichos hidrogeles aún pueden unirse a soportes basados en sílice que han sido activados en la superficie, por ejemplo, con una molécula de organosilano como se ha descrito anteriormente.

Otro tipo de matriz molecular que puede tratarse de acuerdo con esta divulgación son las matrices moleculares soportadas por PEM del tipo descrito por Braslavsky et al. (más adelante) y kartlov et al. (más adelante).

Por lo tanto, hay tres tipos principales de matrices moleculares que pueden tratarse de acuerdo con esta divulgación: (1) matrices soportadas directamente sobre soportes basados en sílice;

(2) matrices moleculares basadas en hidrogel; y

(3) matrices moleculares compatibles con PEM.

De estas las matrices moleculares basadas en hidrogel son las más preferidas y, en particular, las matrices basadas en hidrogel de acuerdo con el cuarto aspecto de la divulgación principalmente debido a la simplicidad con la que pueden construirse. Aunque, tales hidrogeles son ventajosos debido a la pasividad de la superficie, los presentes inventores han descubierto que el tratamiento superficial de esta divulgación conduce a una pasividad aún mayor y, por lo tanto, a la utilidad en la secuenciación de reacciones y similares, de las matrices moleculares resultantes. De acuerdo con esta invención, la superficie de una matriz existente de biomoléculas, preferentemente de polinucleótidos, se modifica por tratamiento con una mezcla que comprende polielectrolitos, una mezcla que comprende polímeros neutros o una mezcla que comprende tanto polielectrolitos como polímeros neutros.

Los polielectrolitos son moléculas grandes, generalmente poliméricas, que contienen una pluralidad de grupos ionizables. Los ejemplos incluyen polialilamina (PAL), disponible en el mercado como clorhidrato de polialilamina (PAL.HCl), ácido poliacrílico (pAa ), poli(sulfonato de estireno) (PSS) y polietilenimina (PEI). El grado en que se ionizan depende del pH del medio en el que están presentes.

En el contexto de secuenciación de ADN, los presentes inventores han descubierto que una combinación de más de un polielectrolito es particularmente ventajosa cuando se modifican matrices moleculares. Como un ejemplo, los presentes inventores han descubierto que la aplicación secuencial de PAL.HCl seguida de PAA es particularmente preferida.

Las condiciones bajo las cuales pueden tratarse las matrices incluyen exponerlas a soluciones o suspensiones de polielectrolito o polímero neutro. Preferentemente estas soluciones o suspensiones son acuosas. De manera particularmente preferida el pH de la solución o suspensión es superior a 6 e inferior a 8,5, más preferentemente de 6,5 a 8, aún más preferentemente de 6,5 a 7,5, más preferentemente es aproximadamente neutro o aproximadamente pH 7.

Como alternativa a los polielectrolitos, pueden usarse polímeros neutros, por ejemplo, polialquilenglicoles, tales como aquellos disponibles en el mercado, por ejemplo, PEG 8000 disponible de Sigma.

Por supuesto, pueden usarse tanto polielectrolitos como polímeros neutros.

Se apreciará que el tratamiento de matrices moleculares de acuerdo con esta invención generalmente, en particular en el caso de matrices planas, debería servir para depositar capas de polielectrolito y/o polímeros. Cuando los polinucleótidos se organizan en matrices moleculares de acuerdo con los diversos aspectos de esta divulgación, incluyendo las matrices moleculares basadas en hidrogel en soporte sólido de la invención, estos son preferentemente polinucleótidos en horquilla que comprenden un dúplex de polinucleótido que puede usarse para retener un cebador y un polinucleótido diana en una relación espacial. Preferentemente, el polinucleótido diana está presente en el extremo 5' y el cebador está presente en el extremo 3' aunque los polinucleótidos en horquilla en los que el cebador está presente en el extremo 5' y el polinucleótido diana está presente en el extremo 3' también están abarcados en esta invención.

Como se usa en el presente documento, el término "interrogar" puede referirse a cualquier interacción de una molécula en la matriz con cualquier otro químico o molécula y también puede referirse a cualquier análisis de una señal detectable de una molécula en la matriz o cualquier otra molécula que esté unida o asociada con ella. En una realización el "interrogatorio" abarca un polinucleótido diana en la matriz que funciona como molde sobre el que actúa la ADN polimerasa. En otras palabras, "interrogar" puede abarcar el contacto de los polinucleótidos diana con otra molécula, por ejemplo, una polimerasa, un nucleósido trifosfato, una secuencia de ácido nucleico complementaria, en donde la interacción física proporciona información sobre una característica del polinucleótido diana dispuesto. El contacto puede implicar interacciones covalentes o no covalentes con la otra molécula. Como se usa en el presente documento, "información sobre una característica" significa información sobre la identidad o secuencia de uno o más nucleótidos en el polinucleótido diana, la longitud del polinucleótido, la composición de bases del polinucleótido, la Tm del polinucleótido, la presencia de un sitio de unión específico para un polipéptido, un ácido nucleico complementario u otra molécula, la presencia de un aducto o nucleótido modificado o la estructura tridimensional del polinucleótido.

La relación espacial entre el cebador y el polinucleótido diana presente en los polinucleótidos en horquilla permite llevar a cabo procedimientos mejorados de análisis de secuencias. El mantenimiento de la relación espacial es posible no solo por los enlaces de hidrógeno formados en la hibridación, sino también por la unión de un cebador conocido al polinucleótido diana. La fijación del cebador, como parte de la estructura de horquilla, al soporte de hidrogel, garantiza que el cebador pueda realizar su función de cebado durante un procedimiento de secuenciación basado en polimerasa y no se elimine durante ninguna etapa de lavado del procedimiento.

Hay muchas formas diferentes de formar una estructura de horquilla para incorporar el polinucleótido diana. Un método preferido es formar una primera molécula (que puede contener un nucleófilo basado en azufre sin estructura principal unido a través de un enlazador) capaz de formar una estructura de horquilla y ligar el polinucleótido diana a esta. Es posible ligar cualquier polinucleótido diana deseado a la construcción de horquilla antes o después de disponer las horquillas en el soporte sólido. Como alternativa, un primer polinucleótido puede ligarse antes de la disposición y un segundo puede ligarse después de la disposición. Es, por supuesto, también posible introducir un nucleófilo (preferentemente un nucleófilo basado en azufre) después de tal ligación.

Cuando un polinucleótido diana es un ADN bicatenario, este puede unirse al tallo de la horquilla ligando una cadena al polinucleótido de horquilla y eliminando la otra cadena después de la ligación.

El polinucleótido diana puede ser ADN genómico purificado usando métodos convencionales. El ADN genómico puede amplificarse mediante PCR o usarse directamente para generar fragmentos de ADN usando endonucleasas de restricción, otras enzimas adecuadas, una forma mecánica de fragmentación o un método de fragmentación química no enzimática. En el caso de fragmentos generados por endonucleasas de restricción, pueden usarse estructuras en horquilla que lleven un sitio de restricción complementario al final de la primera horquilla y la ligación selectiva de una cadena de los fragmentos de muestra de ADN puede lograrse mediante uno de dos métodos.

El Método 1 usa una horquilla que contiene un extremo 5' fosforilado. Usando este método, puede ser necesario desfosforilar primero los fragmentos de ADN genómico u otros fragmentos de ADN cortados por restricción antes de la ligación, de modo que solo una cadena de muestra se ligue covalentemente a la horquilla.

Método 2: en el diseño de la horquilla, puede incorporarse un único (o más) hueco de base en el extremo 3' (la cadena retirada) de tal manera que tras la ligación de los fragmentos de ADN sólo una hebra se une covalentemente a la horquilla. El hueco de base se puede formar hibridando otro polinucleótido separado con el extremo 5' de la primera estructura de horquilla. En la ligación, el fragmento de ADN tiene una cadena unida al extremo 5' de la primera horquilla y la otra cadena unida al extremo 3' del polinucleótido adicional. El polinucleótido adicional (y el otro soporte del fragmento) puede después retirarse interrumpiendo la hibridación.

En cualquier caso, el resultado neto debería ser la ligación covalente de solo una cadena de un fragmento de ADN genómico u otro ADN a la horquilla. Tales reacciones de ligación pueden llevarse a cabo en solución a concentraciones optimizadas basadas en la química de ligación convencional, por ejemplo, llevada a cabo por ADN ligasas o ligación química no enzimática. Si el ADN fragmentado se genera por cizallamiento aleatorio de ADN genómico o polimerasa, entonces los extremos pueden rellenarse con fragmentos de Klenow para generar fragmentos de extremos romos que pueden ligarse con extremos romos en horquillas de extremos romos. Como alternativa, los fragmentos de ADN de extremos romos pueden ligarse a adaptadores de polinucleótidos que están diseñados para permitir una ligación compatible con las horquillas de extremos cohesivos, de la manera descrita anteriormente.

Los polinucleótidos, particularmente los polinucleótidos en horquilla, puede unirse directamente a los grupos "C" de hidrogeles, si están presentes, mediante, por ejemplo, su inmovilización a través de un enlace covalente entre cada polinucleótido (a través de un nucleófilo, preferentemente un nucleófilo basado en azufre) y el grupo "C". Al hacerlo es por lo tanto posible generar matrices, por ejemplo micromatrices o SMA, preferentemente SMA, de los polinucleótidos en horquilla.

La densidad precisa de las matrices no es crítica. Para la resolución de una molécula individual, de hecho, cuanto mayor sea la densidad de las moléculas de polinucleótidos en horquilla ordenadas, mejor, ya que se puede obtener más información de cualquier experimento. Por ejemplo, puede haber al menos 103 moléculas/cm2, preferentemente al menos 105 moléculas/cm2 y lo más preferentemente 106-109 moléculas/cm2. En particular preferentemente, la densidad de las moléculas de la muestra es de al menos 107/cm2, normalmente es de aproximadamente 108-109/cm2. Dichas matrices de "alta densidad" contrastan con las matrices tales como aquellas descritas en la técnica anterior que no son necesariamente tan altas o, por ejemplo, en las muchas matrices de moléculas de Fodor et al (supra), que comprenden grupos de polinucleótidos que comprenden una pluralidad de polinucleótidos estrechamente empaquetados que se pueden resolver al nivel del grupo, no al nivel de los polinucleótidos, son demasiado altas para permitir la resolución de molécula individual. Al disponer los polinucleótidos a una densidad tal que puedan considerarse moléculas individuales, es decir, cada uno puede resolverse individualmente, se crea una SMA.

Las expresiones "resuelto individualmente" y "resolución individual" se usan en el presente documento para especificar que, cuando se visualiza, es posible distinguir una molécula en la matriz de sus moléculas vecinas. Se determinará la separación entre moléculas individuales en la matriz, en parte, por la técnica particular usada para resolver las moléculas individuales. Habitualmente será la porción del polinucleótido diana la que se resuelva individualmente, ya que es este componente el que se pretende interrogar, por ejemplo, por la incorporación de bases detectables. La unión covalente, cuando está presente, entre los grupos "C" en el hidrogel y los polinucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos en horquilla o cebadores de oligonucleótidos usados para la formación de matrices agrupadas mediante amplificación en fase sólida), puede efectuarse por cualquier medio conveniente.

Preferentemente, donde el grupo "C" es un grupo haloacetamido, se usan polinucleótidos que portan grupos nucleofílicos que contienen azufre. Algunos ejemplos de polinucleótidos que contienen nucleófilos de azufre apropiados se desvelan en Zhao et al (Nucleic Acids Research, 2001,29(4), 955-959) y Pirrung et al (Langmuir, 2000, 16, 2185-2191).

Sin embargo, la clase preferida de nucleófilos basados en azufre que cuelgan de los polinucleótidos para reaccionar con los grupos reactivos en los hidrogeles no está particularmente restringida. El nucleófilo basado en azufre puede ser así un tiol simple (-SH en donde ~ indica el enlace o enlazador que conecta el tiol con el resto del polinucleótido). Otros ejemplos de nucleófilos basados en azufre incluyen un resto de fórmula (III):

(en donde ~ indica el enlace o enlazador que conecta el nucleófilo basado en azufre con el resto del polinucleótido; X representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo NR, en el cual R es hidrógeno o un alquilo C^1-10 opcionalmente sustituido; Y representa un átomo de oxígeno o de azufre; y Z representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo alquilo C^1-10 opcionalmente sustituido).

Los restos preferidos de fórmula (III) son aquellos en los cuales X es oxígeno o azufre, preferentemente oxígeno. Donde X es un grupo NR, R es preferentemente hidrógeno. Y es preferentemente oxígeno. Z es preferentemente un átomo de oxígeno o azufre o un grupo metilo, en particular preferentemente un átomo de oxígeno.

El nucleófilo basado en azufre preferido es tiofosfato aunque también son de utilidad otros nucleófilos basados en azufre descritos, por ejemplo, tiofosforamidatos.

En particular preferentemente, los nucleófilos que contienen azufre descritos en el presente documento están conectados al polinucleótido a través de un grupo enlazador. El enlazador puede ser una cadena que contiene carbono tales como aquellas de fórmula (CH²)n donde "n" es de 1 a aproximadamente 1500, por ejemplo menos de aproximadamente 1000, preferentemente menos de 100, por ejemplo, de 2-50, particularmente 5-25. Sin embargo, puede emplearse una diversidad de otros enlazadores con la única restricción impuesta a sus estructuras de que los enlazadores sean estables en las condiciones bajo las cuales los polinucleótidos están destinados a usarse posteriormente, por ejemplo condiciones usadas en la secuenciación del ADN.

También pueden usarse enlazadores que no consisten únicamente en átomos de carbono. Dichos enlazadores incluyen polietilenglicol (PEG) que tiene una fórmula general de (CH²-CH²-O)m, en donde m es de aproximadamente 1 a 600, preferentemente menos de aproximadamente 500.

Los enlazadores formados principalmente a partir de cadenas de átomos de carbono y a partir de PEG pueden modificarse para que contengan grupos funcionales que interrumpan las cadenas. Los ejemplos de tales grupos incluyen cetonas, ésteres, aminas, amidas, éteres, tioéteres, sulfóxidos, sulfonas. Por separado o en combinación con la presencia de dichos grupos funcionales pueden emplearse alqueno, alquino, fracciones aromáticas o heteroaromáticas o fracciones alifáticas cíclicas (por ejemplo, ciclohexilo). Los anillos de ciclohexilo o fenilo pueden, por ejemplo, estar conectados a un PEG o una cadena (CH²)n a través de sus posiciones 1 y 4.

Son ejemplos de enlazadores modificados aquellos de fórmula (CH²)n (en donde n es como se definió anteriormente) y en los cuales una o más unidades CH² se sustituyen por grupos funcionales). Por lo tanto, una o más unidades CH² pueden intercambiarse por un oxígeno para formar un éter, o por un SO² para formar una sulfona, etc. Una o más unidades CH² pueden intercambiarse por un resto amida o unidad alqueno o alquino. En dichos enlazadores pueden estar presentes uno o más grupos funcionales; estos grupos funcionales pueden o no ser iguales entre sí.

Los enlazadores de particular interés contienen la unidad propargilamino unida a la base (por ejemplo, uracilo) en un nucleótido modificado. Dichos nucleótidos contienen la siguiente unidad:

El grupo amino puede conectarse al resto del enlazador mediante la formación de un enlace amida.

Los nucleótidos modificados están disponibles en el mercado, por ejemplo, de la empresa de síntesis de ADN Oswel (ahora Eurogentec Group). Dichos nucleótidos incluyen nucleótidos con protección terminal en 3'OH que pueden ser básicos cuando un enlazador con protección terminal está unido al átomo de carbono 1' o contienen una base a la que se une un enlazador con protección terminal. Dos de estos nucleótidos modificados son los productos OSW428 y OSW421 de Oswel:

Los expertos en la materia conocerán los métodos para desproteger el grupo fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) que protege terminalmente el enlazador en los nucleótidos mostrados anteriormente y para efectuar la modificación terminal, por ejemplo, tiofosforilación, del enlazador.

Como alternativa a los enlazadores descritos anteriormente, que se basan principalmente en cadenas lineales de átomos de carbono saturados, opcionalmente interrumpidos con átomos de carbono insaturados o heteroátomos, pueden considerarse otros enlazadores que se basan en ácidos nucleicos o unidades de monosacáridos (por ejemplo, dextrosa).

Restos enlazadores más largos (por ejemplo, aquellos que contienen una cadena o más de 100 átomos, particularmente los que superan los 500 o incluso los 1000 átomos) sirven para posicionar el polinucleótido más lejos del soporte sólido. Esto coloca al polinucleótido (por ejemplo, ADN) en un entorno que se parece más a la solución libre. Esto puede ser beneficioso, por ejemplo, en reacciones mediadas por enzimas efectuadas sobre el polinucleótido. Esto se debe a que tales reacciones sufren menos el impedimento estérico que se manifiesta cuando el polinucleótido se une directamente al soporte o se une indirectamente a través de un enlazador muy corto (tal como un enlazador que comprende una cadena o solo varios, por ejemplo, de aproximadamente 1 a 3 átomos de carbono). Cuando las moléculas de interés inmovilizadas en la matriz sean polinucleótidos, el "enlazador" puede comprender uno o más nucleótidos que forman parte del polinucleótido pero que no participan en ninguna reacción llevada a cabo sobre o con el polinucleótido (por ejemplo, una reacción de hibridación o amplificación). Dichos nucleótidos pueden denominarse en el presente documento polinucleótidos "espaciadores". Normalmente pueden incluirse de 1 a 20, más preferentemente de 1 a 15 o de 1 a 10 y más particularmente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos espaciadores. Lo más preferentemente, el polinucleótido incluirá 10 nucleótidos espaciadores. Se prefiere usar espaciadores poliT, aunque pueden usarse también otros nucleótidos y combinaciones de los mismos. En la realización más preferida, el polinucleótido incluirá nucleótidos espaciadores 10T.

Los nucleótidos espaciadores se incluyen normalmente en los extremos 5' de los polinucleótidos que se unen a un soporte adecuado, por ejemplo, un hidrogel de soporte sólido, a través de un enlace con el extremo 5' del polinucleótido. La unión puede lograrse a través de un nucleófilo que contiene azufre, tal como fosforotioato, presente en el extremo 5' del polinucleótido. En el caso de matrices basadas en hidrogeles de soporte sólido, este nucleófilo está unido a un grupo "C" presente en el hidrogel. El uno o más nucleótidos espaciadores funcionan para espaciar las porciones del polinucleótido que serán "interrogadas" y/o sujetas a manipulaciones adicionales, tales como la hibridación a un segundo polinucleótido, lejos del sitio de unión al soporte sólido. Los presentes inventores han observado que la inclusión de nucleótidos espaciadores en el extremo 5' puede mejorar notablemente el rendimiento de la hibridación de polinucleótidos complementarios con las regiones diana de los polinucleótidos inmovilizados posteriores (3') de los nucleótidos espaciadores. Se observa que el rendimiento de la hibridación aumenta bruscamente con espaciadores poliT de 2 a 10T nucleótidos. Cuando la longitud del espaciador aumenta de 10T a 20T, el rendimiento de hibridación comienza a disminuir. En la realización más preferida, el polinucleótido incluirá nucleótidos espaciadores 10T y un grupo fosforotioato en 5'.

Si bien se prefiere el uso de polinucleótidos que contienen nucleófilos de azufre (particularmente que contienen tiofosfato) y grupos de haloacetamida C para efectuar la unión de polinucleótidos en todos los aspectos de la invención, el experto en la materia podrá contemplar muchas otras combinaciones de funcionalidad que facilitarán la inmovilización de polinucleótidos en los hidrogeles descritos en el presente documento. Por ejemplo, el grupo C puede comprender un éster activado y el polinucleótido puede tener un grupo amino o un nucleófilo basado en oxígeno. Otras combinaciones serán evidentes para aquellos expertos en la materia.

En una realización particular, la divulgación proporciona un método para formar una matriz agrupada en un hidrogel en soporte sólido, que no se reivindica, mediante una reacción de amplificación de ácidos nucleicos.

Por tanto, en un aspecto adicional, la descripción proporciona un método no reivindicado para preparar una matriz molecular basada en hidrogel en soporte sólido que es una matriz agrupada de moléculas de interés, comprendiendo el método:

(i) hacer reaccionar moléculas de polinucleótidos con sitios reactivos presentes en un hidrogel en soporte sólido, en donde dichas moléculas polinucleotídicas son primer y segundo cebadores oligonucleotídicos capaces de hibridar con una plantilla a amplificar;

(ii) poner en contacto los primeros cebadores de oligonucleótidos unidos al hidrogel en soporte sólido en la etapa (i) con una o más plantillas para amplificar en condiciones que permitan la hibridación de las plantillas con los cebadores de oligonucleótidos, comprendiendo cada plantilla en el extremo 3' una secuencia capaz de hibridarse con el primer cebador oligonucleotídico y en el extremo 5' una secuencia cuyo complemento es capaz de hibridarse con un segundo cebador oligonucleotídico; y

(iii) realizar una o más reacciones de amplificación de ácidos nucleicos usando el primer y el segundo cebadores oligonucleotídicos y la plantilla o plantillas, generando de esta manera una matriz agrupada de moléculas de interés.

En este método se proporciona un hidrogel de soporte sólido, preferentemente preparado usando el método de acuerdo con el primer aspecto de la divulgación.

A continuación, los cebadores de oligonucleótidos se unen o se "injertan" al hidrogel a través de la reacción con los sitios reactivos presentes en el hidrogel. Esta etapa puede llevarse a cabo como se describe anteriormente y se aplican todas las características preferidas descritas cambiando lo que haya que cambiar a este aspecto de la divulgación. Los cebadores de oligonucleótidos se unen preferentemente al hidrogel a través de un enlace covalente en sus extremos 5', dejando el extremo 3' de la molécula libre para participar en la hibridación con un polinucleótido molde y la posterior extensión del cebador mediante la adición de más nucleótidos al extremo 3' libre del cebador. La unión también podría efectuarse a través de un nucleótido interno en el cebador, siempre que esto no impida que el cebador hibride con un molde y la posterior extensión del cebador. El medio de unión más preferido es mediante fosforotioato en 5' a un hidrogel compuesto de acrilamida polimerizada y BRAPA.

La secuencia precisa de los oligonucleótidos cebadores dependerá de la naturaleza del molde que pretende amplificarse. El primer y el segundo cebadores pueden tener una secuencia diferente o idéntica. Los cebadores pueden incluir bases naturales y no naturales o cualquier combinación de las mismas, y también pueden incluir enlaces de cadena principal no naturales tales como fosforotioato. El cebador puede incluir ventajosamente nucleótidos espaciadores, como se ha descrito anteriormente, con el fin de optimizar la eficacia de la hibridación posterior con el polinucleótido molde. La imprimación puede contener de 1 a 20, más preferentemente de 1 a 15 o de 1 a 10 y más particularmente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos espaciadores. Lo más preferentemente, el cebador incluirá 10 nucleótidos espaciadores. Se prefiere usar espaciadores poliT, aunque pueden usarse también otros nucleótidos y combinaciones de los mismos. En la realización más preferida, el cebador incluirá nucleótidos espaciadores 10T. Los oligonucleótidos cebadores se injertan en la superficie del hidrogel en soporte sólido, formando eficazmente una superficie que está lista para usarse para la amplificación de ácidos nucleicos. Este enfoque contrasta con los métodos de la técnica anterior para la amplificación en soportes sólidos, tal como el descrito en el documento WO 98/44151 (ilustrado esquemáticamente en la Figura 5), en donde se injerta una mezcla de cebadores y plantillas en la superficie sólida simultáneamente en una única etapa de injerto. En este enfoque debe usarse una mezcla de injerto específica de cebadores y plantillas para cada plantilla específica que se va a amplificar. Además, el injerto de fragmentos de ácido nucleico plantilla largos (>300 pb) es técnicamente difícil. El enfoque de los inventores evita este problema eliminando la necesidad de injertar cebadores y moldes simultáneamente. En el método de la descripción, los cebadores se injertan en ausencia de plantilla para formar una superficie que está lista para la hibridación con la plantilla y la posterior amplificación.

Después de la unión de los cebadores, el soporte sólido se pone en contacto con la plantilla que se va a amplificar en condiciones que permitan la hibridación entre la plantilla y los cebadores unidos. La plantilla generalmente se añade en solución libre y las condiciones de hibridación adecuadas serán evidentes para el lector experto. Las condiciones de hibridación típicas son 5xSSC a 40 °C, después de una etapa inicial de desnaturalización.

El polinucleótido plantilla (o una cadena sencilla desnaturalizada del mismo si se refiere a un dúplex plantilla) incluirá en el extremo 3' una secuencia que permite la hibridación con un primer oligonucleótido cebador y en el extremo 5' de la misma cadena una secuencia, cuyo complemento permite la hibridación con un segundo cebador oligonucleotídico (es decir, la secuencia del segundo cebador puede ser sustancialmente idéntica a la secuencia en el extremo 5' de la plantilla). El resto de la plantilla puede ser cualquier molécula de polinucleótido que se desee amplificar para formar una matriz agrupada. Las plantillas pueden ser, por ejemplo, fragmentos de ADN genómico o ADNc que se desea secuenciar. Las secuencias que permiten la hibridación con los cebadores tendrán normalmente una longitud de alrededor de 20-25 nucleótidos. El término "hibridación" abarca la unión específica de secuencia entre el cebador y la plantilla. La unión del cebador a su secuencia afín en la plantilla puede ocurrir en las condiciones típicas que se usan para la hibridación cebador-plantilla en la PCR estándar.

Después de la hibridación de los moldes con cebadores unidos al soporte sólido puede llevarse a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos usando los cebadores unidos y la plantilla hibridada. La primera etapa de la reacción de amplificación será una etapa de extensión del cebador, en la cual se añaden nucleótidos a los extremos 3' libres de los cebadores unidos para sintetizar cadenas complementarias correspondientes a la longitud total de la plantilla (ilustrado esquemáticamente en la Figura 6). La desnaturalización posterior da como resultado una cadena plantilla complementaria de longitud completa unida covalentemente al soporte sólido. Esta cadena complementaria incluirá de esta manera en su extremo 3' una secuencia que es capaz de unirse al segundo cebador oligonucleotídico. Las rondas de amplificación adicionales (análogas a una reacción de PCR convencional) conducen a la formación de grupos o colonias de moléculas de plantilla unidas al soporte sólido.

La amplificación de ADN en soportes sólidos es un procedimiento bien documentado en la bibliografía. Una amplia gama de tipos de soporte (por ejemplo, micromatrices (Huber M. et al. (2001) Anal. Biochem. 299(1), 24-30; Rovera G. (2001) Patente de EE.UU. 6221635 B120010424), perlas de vidrio (Adessi C. et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28(20), e87; Andreadis J. D. et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28(2), e5), agarosa (Stamm S. et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19(6), 1350) o poliacrilamida (Shapero M. H. et al. (2001) Genome Res. 11,1926-1934; Mitra, R. D. et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27(24), e34)) y químicas de unión (por ejemplo, oligo 5'-tiol sobre portaobjetos de aminosilano a través de reticulador heterofunctional (Adessi C. et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28(20), e87; Andreadis J. D. et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28(2), e5), química EDC sobre la superficie NucleoLink™ (Sjoroos M. et al. (2001) Clin. Chem. 47(3), 498­ 504) o amino silano (Adessi C. et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28(20), e87), polimerización por radicales (Shapero M. H. et al. (2001) Genome Res. 11,1926-1934; Mitra, R. D.et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27(24), e34)) se han descrito. La PCR en portaobjetos de vidrio recubiertos de poliacrilamida (Shapero et al., ibid.) o perlas (Mitra et al., ibid) también se ha informado. En ambos casos, al menos uno de los cebadores contiene una modificación de 5'-acrilamida de modo que el cebador se une covalentemente al soporte sólido a través de la copolimerización. El método de Mitra et al. consiste en la premezcla de todos los reactivos necesarios para realizar la PCR, los cebadores y una concentración muy baja de la plantilla, polimerizando después una película delgada de poliacrilamida en portaobjetos de vidrio. En el método de Shapero et al., los cebadores se copolimerizan mientras recubren las perlas y la plantilla se introduce por hibridación más adelante.

Uno de los principales inconvenientes de ambos métodos es la falta de versatilidad de la superficie debido a la introducción de las imprimaciones con o sin plantilla durante la preparación de la superficie. Por otra parte, los cebadores o la plantilla pueden dañarse potencialmente por los radicales libres generados durante la polimerización de poliacrilamida.

El documento WO 98/44151 describe el uso de una técnica de hibridación de un molde a un cebador seguido de una extensión de cadena y después replicación por PCR para generar colonias o grupos de ácidos nucleicos inmovilizados sobre un soporte sólido. La tecnología de grupos como se describe en el documento WO 98/44151 implica una etapa de injerto que consiste en inmovilizar simultáneamente cebadores y plantillas en una superficie carboxilada usando química de acoplamiento estándar (EDC). Esta unión es covalente y debe realizarse usando una mezcla de reacción específica para cada plantilla usada. La estrategia usada se ilustra en la Figura 5.

El enfoque de los inventores implica una etapa inicial de preparación de la superficie del soporte sólido, seguido de unión covalente (injerto) de cebadores para generar una superficie lista para usar en PCR. La plantilla de PCR puede hibridarse con cebadores adjuntos inmediatamente antes de la reacción de PCR. Por lo tanto, la reacción de PCR comienza con una etapa inicial de extensión del cebador en lugar de una desnaturalización de la plantilla. Este enfoque se ilustra en la Figura 6.

Usos de matrices preparadas de la invención

Una vez formadas, las matrices preparadas de la invención pueden usarse esencialmente en cualquier método de análisis que requiera la interrogación de moléculas de interés en la matriz o de moléculas unidas a moléculas de interés en la matriz. En este contexto, las moléculas "unidas" a moléculas de interés en la matriz incluyen cadenas de polinucleótidos complementarias hibridadas con polinucleótidos unidos en la matriz. A modo de ejemplo, las matrices pueden usarse para determinar las propiedades o identidades de moléculas afines. Normalmente, las interacciones entre moléculas biológicas o químicas con moléculas de interés unidas a las matrices se llevan a cabo en solución. En realizaciones preferidas, las matrices pueden usarse en procedimientos para determinar la secuencia de polinucleótidos en la matriz y también en la identificación y/o puntuación de polimorfismos de un solo nucleótido, análisis de expresión génica, etc.

En particular, las matrices pueden usarse en ensayos que se basan en la detección de etiquetas fluorescentes para obtener información sobre las moléculas dispuestas, normalmente polinucleótidos dispuestos. Las matrices son especialmente adecuadas para su uso en ensayos de varias etapas. Las matrices pueden usarse en técnicas convencionales para obtener información de secuencias genéticas. Muchas de estas técnicas se basan en la identificación paso a paso de nucleótidos adecuadamente marcados, se hace referencia en la Patente de EE.UU. N.° 5.654.413 como métodos de secuenciación de "base única" o "secuenciación por síntesis".

En una realización de la divulgación, la secuencia de un polinucleótido diana se determina de manera similar a la descrita en la patente de EE.UU. N.° 5.654.413, mediante la detección de la incorporación de uno o más nucleótidos en una cadena naciente complementaria al polinucleótido diana que se va a secuenciar mediante la detección de marcador o marcadores fluorescentes unidas a los nucleótidos incorporados. La secuenciación del polinucleótido diana se inicia con un cebador adecuado (o se prepara como una construcción de horquilla que contendrá el cebador como parte de la horquilla) y la cadena naciente se extiende por etapas mediante la adición de nucleótidos al extremo 3' del cebador en una reacción catalizada por polimerasa.

En realizaciones preferidas, cada uno de los diferentes nucleótidos (A, T, G y C) está marcado con un fluoróforo único que actúa como un grupo de bloqueo en la posición 3' para evitar la polimerización incontrolada. La enzima polimerasa incorpora un nucleótido en la cadena naciente complementaria al polinucleótido diana y el grupo bloqueador evita la incorporación adicional de nucleótidos. La superficie de la matriz se limpia de nucleótidos no incorporados y cada nucleótido incorporado se "lee" ópticamente por medios adecuados, como un dispositivo de carga acoplada que usa excitación láser y filtros. El grupo de bloqueo 3' después se retira (se desprotege), para exponer la cadena naciente para una incorporación adicional de nucleótidos.

De modo similar, la Patente de EE.UU. N.° 5.302.509 desvela un método para secuenciar polinucleótidos inmovilizados en un soporte sólido. El método se basa en la incorporación de nucleótidos A, G, C y T bloqueados en 3' marcados fluorescentemente en una cadena creciente complementaria al polinucleótido inmovilizado, en presencia de ADN polimerasa. La polimerasa incorpora una base complementaria al polinucleótido diana, pero el grupo de bloqueo 3' impide que la adición adicional. El marcador de la base incorporada puede determinarse después y el grupo de bloqueo retirarse por escisión química para permitir que se produzca la polimerización adicional.

En el caso de matrices de molécula individual, porque la matriz consiste en distintos polinucleótidos ópticamente resolubles, cada polinucleótido diana generará una serie de señales distintas a medida que se detectan los eventos fluorescentes. La secuencia del polinucleótido diana se deduce del orden de adición de nucleótidos en la cadena complementaria siguiendo las reglas convencionales de apareamiento de bases.

La expresión "resuelto individualmente por microscopía óptica" se usa en el presente documento para indicar que, cuando se visualiza, es posible distinguir al menos un polinucleótido en la matriz de sus polinucleótidos vecinos usando métodos de microscopía óptica disponibles en la técnica. La visualización puede efectuarse mediante el uso de marcadores indicadores, por ejemplo, fluoróforos, cuya señal se resuelve individualmente.

Otros procedimientos de secuenciación adecuados serán evidentes para el experto en la materia. En particular, el método de secuenciación puede basarse en la degradación de los polinucleótidos ordenados, caracterizándose los productos de degradación para determinar la secuencia.

Un ejemplo de una técnica de degradación adecuada se describe en el documento WO95/20053, mediante el cual las bases en un polinucleótido se eliminan secuencialmente, un número predeterminado a la vez, mediante el uso de adaptadores etiquetados específicos para las bases y una escisión exonucleasa definida.

Una consecuencia de la secuenciación usando métodos no destructivos es que es posible formar una matriz direccionable espacialmente para estudios de caracterización adicionales y, por lo tanto, puede preferirse la secuenciación no destructiva. En este contexto, la expresión "direccionable espacialmente" se usa en el presente documento para describir cómo pueden identificarse diferentes moléculas sobre la base de su posición en una matriz. En el caso de que los fragmentos de polinucleótidos diana se generen mediante digestión de restricción de ADN genómico, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción u otra nucleasa proporcionará 4, 6, 8 bases o más de secuencia conocida (dependiendo de la enzima). La secuenciación adicional de entre 10 y 20 bases en la matriz debería proporcionar suficiente información de secuencia general para colocar ese tramo de ADN en un contexto único con una secuencia del genoma humano total, permitiendo de esta manera que la información de la secuencia se use para el genotipado y, más específicamente, para la puntuación del polimorfismo de un solo nucleótido (SNP).

El método de secuenciación que se usa para caracterizar la diana unida puede ser cualquiera conocido en la técnica que mida la incorporación secuencial de bases en una cadena que se extiende. Una técnica adecuada se describe en la Patente de EE.UU. N.° 5.302.509 que requiere el control de la incorporación secuencial de bases marcadas con fluorescencia en un complemento usando la reacción de la polimerasa. Las alternativas serán evidentes para la persona experta. Los reactivos adecuados, incluyendo nucleótidos marcados con fluorescencia serán evidentes para la persona experta.

Por lo tanto los dispositivos en los que se pueden incorporar las matrices de esta invención incluyen, por ejemplo, una máquina de secuenciación o máquina de análisis genético.

En el caso de matrices de moléculas individuales, los polinucleótidos individuales inmovilizados sobre la superficie de un soporte sólido deberían poder resolverse por medios ópticos. Esto significa que, dentro del área resoluble del dispositivo de formación de imágenes particular usado, debe haber una o más señales distintas, representando cada una un polinucleótido. Normalmente, los polinucleótidos de la matriz se resuelven usando un microscopio de fluorescencia de molécula individual equipado con un detector sensible, por ejemplo, un dispositivo acoplado a cargas (CCD). Cada polinucleótido de la matriz puede visualizarse simultáneamente o, escaneando la matriz, puede realizarse un análisis secuencial rápido.

Se determinará el grado de separación entre los polinucleótidos individuales en la matriz, en parte, por la técnica particular usada para resolver el polinucleótido individual. Los aparatos usados para obtener imágenes de matrices moleculares son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, puede usarse un microscopio de barrido confocal para explorar la superficie de la matriz con un láser para obtener imágenes directamente de un fluoróforo incorporado en el polinucleótido individual mediante fluorescencia. Como alternativa, un detector 2-D sensible, tal como un dispositivo de carga acoplada, puede usarse para proporcionar una imagen 2-D que representa los polinucleótidos individuales en la matriz.

Puede realizarse "resolución" de polinucleótidos individuales en la matriz con un detector 2-D si, con un aumento de 100 x, los polinucleótidos adyacentes están separados por una distancia de aproximadamente al menos 250 nm, preferentemente al menos 300 nm y más preferentemente al menos 350 nm. Se apreciará que estas distancias dependen de la ampliación y que, en consecuencia, pueden determinarse otros valores, por un experto habitual en la materia.

Hay otras técnicas disponibles, como la microscopía óptica de campo cercano (SNOM), que son capaces de una mayor resolución óptica, permitiendo de esta manera que se usen conjuntos más densos. Por ejemplo, usando SNOM, los polinucleótidos adyacentes pueden estar separados por una distancia de menos de 100 nm, por ejemplo, 10 nm. Para obtener una descripción de la microscopía óptica de campo cercano de barrido, véase Moyer et al., Laser Focus World (1993) 29(10).

Una técnica adicional que puede usarse es la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total específica de la superficie (TIRFM); véase, por ejemplo, Vale et al., Nature (1996) 380:451-453). Usando esta técnica, es posible lograr imágenes de campo amplio (hasta 100 μm x 100 μm) con sensibilidad de molécula individual. Esto puede permitir matrices de más de 107 polinucleótidos resolubles por cm2 a usarse.

Adicionalmente, las técnicas de microscopía de túnel de barrido (Binnig et al., Helvetica Physica Acta (1982) 55:726-735) y microscopía de fuerza atómica (Hansma et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (1994) 23:115-139) son adecuados para formar imágenes de las matrices de la presente invención. También pueden usarse otros dispositivos que no dependan de la microscopía, siempre que sean capaces de generar imágenes dentro de áreas discretas en un soporte sólido.

Una vez realizada la secuenciación, las matrices dirigidas espacialmente pueden usarse en una diversidad de procedimientos que requieren la caracterización de moléculas individuales de poblaciones heterogéneas.

Los polinucleótidos unidos en matrices agrupadas también pueden usarse como moldes para reacciones de "secuenciación por síntesis" en las cuales uno o más nucleótidos se incorporan sucesivamente en cadenas en crecimiento complementarias a los polinucleótidos diana que van a secuenciarse y se añade la identidad de la base o bases en una o más de las etapas de incorporación de nucleótidos. De nuevo la secuenciación requiere un cebador adecuado complementario a la plantilla que pueda servir como punto de inicio para la adición de más nucleótidos en la reacción de secuenciación. La secuencia del polinucleótido unido se deduce de la identidad de los nucleótidos incorporados siguiendo las reglas convencionales de apareamiento de bases. Se describen métodos para la secuenciación de ácidos nucleicos en matrices agrupadas o "colonias" de ácidos nucleicos, por ejemplo, en el documento WO 98/44152, el documento WO 98/44151, el documento WO 00/18957 y el documento ^w O 03/074734. La invención puede entenderse con referencia a los siguientes ejemplos que deben entenderse como ilustrativos, y no limitantes, de la presente invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas.

Preparación 1: Síntesis de W-(5-bromoacetam¡dilpent¡l) acrilamida (BRAPA)

El ácido W-Boc-1,5-diaminopentano toluenosulfónico se obtuvo de Novabiochem. El cloruro de bromoacetilo y el cloruro de acrilαlo se obtuvieron de Fluka. Todos los demás reactivos eran productos de Aldrich.

A una suspensión agitada de ácido W-Boc-1,5-diaminopentano tolueno sulfónico (5,2 g, 13,88 mmol) y trietilamina (4,83 ml, 2,5 eq) en THF (120 ml) a 0 °C se añadió cloruro de acrilαlo (1,13 ml, 1 eq) a través de un embudo de goteo con presión igualada durante un período de una hora. A continuación, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente y el progreso de la reacción se comprobó mediante TLC (éter de petróleo: acetato de etilo =1:1). Después de dos horas, las sales formadas durante la reacción se filtraron y el filtrado se evaporó a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (éter de petróleo puro seguido de un gradiente de acetato de etilo hasta el 60 %) para producir 2,56 g (9,98 mmol, 71 %) del producto 2 como un sólido beige. RMN ¹H (400 MHz, d⁶-DMSO): 1,20-1,22 (m, 2H, CH²), 1,29-1,43 (m, 13H, tBu, 2xCH²), 2,86 (q, 2H, J = 6,8 Hz y 12,9 Hz, CH²), 3,07 (q, 2H, J = 6,8 Hz y 12,9 Hz, CH²), 5,53 (dd, 1H, J = 2,3 Hz y 10,1 Hz, CH), 6,05 (dd, 1H, J = 2,3 Hz y 17,2 Hz, CH), 6,20 (dd, 1H, J = 10,1 Hz y 17,2 Hz, CH), 6,77 (t, 1H, J = 5,3 Hz, NH), 8,04 (s a, 1H, NH). Masa (electroionización+) calculada para C¹³H²⁴N²O³ 256, encontrada 279 (256+Na+).

El producto 2 (2,56 g, 10 mmol) se disolvió en ácido trifluoroacético:diclorometano (1:9, 100 ml) y se agitó a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC (diclorometano: metanol 9:1). Tras completarse, la mezcla de reacción se evaporó a sequedad, el residuo se coevaporó tres veces con tolueno y después se purificó por cromatografía ultrarrápida (diclorometano puro seguido de un gradiente de metanol hasta el 20 %). El producto 3 se obtuvo como un polvo blanco (2,43 g, 9 mmol, 900). RMN ¹H (400 MHz, D²O): 1,29-1,40 (m, 2H, CH²), 1,52 (quint., 2H, J = 7,1 Hz, CH²), 1,61 (quint., 2H, J = 7,7 Hz, CH²), 2,92 (t, 2H, J = 7,6 Hz, CH²), 3,21 (t, 2H, J = 6,8 Hz, CH²), 5,68 (dd, 1H, J = 1,5 Hz y 10,1 Hz, CH), 6,10 (dd, 1H, J = 1,5 Hz y 17,2 Hz, CH), 6,20 (dd, 1H, J = 10,1 Hz y 17,2 Hz, CH). Masa (electroionización+) calculada para C⁸H¹⁶N²O 156, encontrada 179 (156+Na+).

A una suspensión de producto 3 (6,12 g, 22,64 mmol) y trietilamina (6,94 ml, 2,2 eq) en THF (120 ml) se añadió cloruro de bromoacetilo (2,07 ml, 1,1 eq), a través de un embudo de goteo de presión igualada, durante un período de una hora y a -60 °C (cardice y baño de isopropanol en un Dewar). La mezcla de reacción después se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se comprobó la finalización de la reacción mediante TLC (diclorometano: metanol 9:1) al día siguiente. Las sales formadas durante la reacción se filtraron y la mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad. El residuo se purificó por cromatografía (diclorometano puro seguido de un gradiente de metanol hasta el 5 %). 3,2 g (11,55 mmol, 51 %) del producto 1 (BRAPA) se obtuvieron como un polvo blanco. Una recristalización adicional realizada en éter de petróleo:acetato de etilo dio 3 g del producto 1. R ^m N ¹H (400 MHz, d⁶-DMSO): 1,21-1,30 (m, 2H, CH²), 1,34-1,48 (m, 4H, 2xCH²), 3,02-3,12 (m, 4H, 2xCH²), 3,81 (s, 2H, CH²), 5,56 (d, 1H, J = 9,85 Hz, CH), 6,07 (d, 1H, J = 16,9 Hz, CH), 6,20 (dd, 1H, J = 10,1 Hz y 16,9 Hz, CH), 8,07 (s a, 1H, NH), 8,27 (s a, 1H, NH). Masa (electroionización+) calculada para C¹⁰H-ⁱ⁷ BrN²O²276 o 278, encontrada 279 (278+H⁺), 299 (276+Na⁺).

Preparación 2: Preparación del soporte de vidrio

A: Limpieza de portaobjetos de vidrio - Los portaobjetos de vidrio usados para la preparación de las superficies de hidrogel se limpiaron siguiendo el siguiente protocolo interno: los portaobjetos se incubaron secuencialmente en Decon™, hidróxido de sodio acuoso 1 M y finalmente ácido clorhídrico 0,1 M (ac). Después de cada etapa, los portaobjetos se sometieron a ultrasonidos en H₂O MilliQ. Los portaobjetos limpios se almacenaron en etanol. B: Silanización con aglutinante de los portaobjetos de vidrio (opcional) - Los portaobjetos de vidrio limpios se hornearon a 120 °C durante dos horas antes de la silanización. Después de enfriar en un desecador lleno de argón, los portaobjetos se incubaron a temperatura ambiente en una solución al 2 % v/v de metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo o (3-acriloxipropil)trimetoxisilano en tolueno de grado HPLC. Los portaobjetos después se enjuagaron cuidadosamente con tolueno y se curaron durante dos horas a 120 °C. Los portaobjetos silanizados se almacenaron en un desecador lleno de argón.

Preparación 3: Preparación de la mezcla de polimerización

Se disolvió acrilamida (pureza 99 % +, 0,4 g) en H₂O MilliQ (10 ml) (Solución I). Se disolvió persulfato de potasio o amonio (0,25 g) en H₂O MilliQ (5 ml) (Solución II). Se disolvió N-(5-bromoacetamidilpentil)acrilamida (BRAPA) (33 mg) en DMF (330:l) (Solución III).

La solución I se desgasificó 10 minutos con argón. La solución III se añadió a la solución I. Después de mezclar, se añadió N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED) (23 jl) a la mezcla. Finalmente se añadió la solución II (200 jl). La mezcla de polimerización se hizo reaccionar rápidamente con los portaobjetos silanizados (opcionalmente) de acuerdo con uno de los siguientes protocolos. La proporción de BRAPA a acrilamida fue del 2 % en moles.

Ejemplo 1: Síntesis de superficie basada en poliacrilamida

Aplicación del hidrogel de poliacrilamida a los portaobjetos de vidrio

Método I - Se ensamblaron dos portaobjetos (opcionalmente silanizados) con una junta de silicona en el medio para formar una celda de polimerización. Los portaobjetos y la junta se sujetaron con clips de unión. La mezcla de polimerización (800 jl) se inyectó en cada célula de polimerización. La reacción de polimerización avanzó a temperatura ambiente durante 1,5 h. Las células de polimerización después se desmontaron y los portaobjetos se lavaron minuciosamente con H₂O MilliQ. Los portaobjetos se secaron y después se almacenaron en atmósfera de argón.

Método II - Los portaobjetos (opcionalmente silanizados) se colocaron en un recipiente Coplin limpio. La mezcla de polimerización se vertió en el recipiente para cubrir los portaobjetos. La reacción de polimerización avanzó a temperatura ambiente durante 1,5 h. Los portaobjetos después se retiraron de la cubeta coplin uno por uno y se enjuagaron con H₂O MilliQ en movimiento. Los portaobjetos se introdujeron después en viales de plástico limpios que contenían H₂O MilliQ y se agitó durante 20 segundos. Los portaobjetos se enjuagaron con H₂O MilliQ en movimiento, se secaron y se almacenaron en argón.

Ejemplo 2: Inmovilización de polinucleótidos en superficies de poliacrilamida

Los siguientes constituyen procedimientos representativos para la inmovilización de polinucleótidos modificados con 5'-fosforotioato en la nueva superficie. Los oligos con un marcador fluorescente de 3' se usan normalmente para evaluar las características fundamentales de la superficie.

A: Aplicación a granel (adecuada para micromatrices)

El polinucleótido (1 jM ) en el tampón de impresión (fosfato potásico 100 mM, pH 7) se aplicó a la superficie como gotas de 1 jl. El portaobjetos se colocó en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 hora. El portaobjetos impreso se enjuagó después con H₂O MilliQ y agitado en tampón de lavado caliente (Tris HCl 10 mM, EDTA 10 mM, pH 8 (a 80-90 °C)). El portaobjetos impreso finalmente se enjuagó con H₂O MilliQ, secado bajo un flujo de argón y almacenado en la oscuridad antes de la toma de imágenes.

Para inmovilizar polinucleótidos en un área grande, se colocó una junta en el portaobjetos, se inyectó la solución de polinucleótidos en la cámara formada y se colocó un cubreobjetos sobre la junta. El portaobjetos se incubó después durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara húmeda y se procesó como se describió anteriormente.

B: Aplicación de matriz de molécula única

El portaobjetos revestido se colocó en una célula de flujo hecha a medida. El polinucleótido (400 jl, 0,1 a 10 nM) en el tampón de impresión se inyectó en la célula. La concentración de polinucleótido se elige para lograr una densidad de molécula única precisa de polinucleótidos en la superficie. La célula se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora. La superficie impresa se lavó después inyectando secuencialmente tampón de impresión (20 ml), tampón de lavado caliente (20 ml, 80-90 °C) y finalmente H₂O MilliQ (20 ml).

Ejemplo 3: Estabilidad térmica de los polinucleótidos inmovilizados

A: Aplicación a granel (adecuada para micromatrices)- Se tomaron imágenes de un portaobjetos impreso con un escáner de fluorescencia en presencia de un portaobjetos de control de referencia de fluorescencia que contenía colorante Cy3 adjunto. A continuación, el portaobjetos impreso se incubó en un frasco que contenía tampón de impresión a una temperatura predeterminada en la oscuridad. Se tomaron imágenes del portaobjetos a intervalos regulares y se registró la intensidad de la fluorescencia. La intensidad de fluorescencia de una mancha es proporcional a la cantidad de polinucleótido inmovilizado en esa área. Un gráfico de la variación de la intensidad de la fluorescencia con el tiempo proporcionó un perfil de estabilidad para el polinucleótido unido a la superficie de poliacrilamida.

B: Aplicación de matriz de molécula única - Se imprimió un portaobjetos en una célula de flujo como se describe anteriormente. El tampón de impresión se inyecta a través de la célula a una velocidad de 1 ml/min, a una temperatura preestablecida y la imagen del portaobjetos a intervalos regulares usando un instrumento de fluorímetro de reflexión interna total hecho a medida. El perfil de estabilidad de la matriz de moléculas individuales se obtiene trazando la variación del número de moléculas individuales contadas en un área específica con el tiempo.

Ejemplo 4: Evaluación de la pasivación superficial hacia la adherencia de nucleótidos a nivel de SMA Un portaobjetos revestido se colocó en una célula de flujo hecha a medida. La célula se enjuagó con H₂O MilliQ (10 ml), luego tampón de impresión de fosfato (0,1 M, pH 7,0) y después se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Este procedimiento constituyó una pareja de ADN simulada con la superficie. La célula se enjuagó con H₂O MilliQ (10 ml), tampón TE caliente (10 ml, Tris.HCl 10 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0) después H₂O MilliQ (10 ml). A continuación, se tomaron imágenes del portaobjetos usando un instrumento de fluorímetro de reflexión interna total hecho a medida para dar una lectura de fondo fluorescente. La célula se enjuagó después con tampón enzimológico (10 ml, Tris.HCl 50 mM, MgSO₄ 4 mM, MnCh 0,2 mM, Tween 20 al 0,05%, pH 8,0). Una solución de nucleótido marcado con fluorescencia (400:l, 0,2 a 2:M en tampón enzimológico) se inyectó luego en la célula y la célula se incubó a una temperatura preestablecida durante 30 minutos. La célula se enjuagó con tampón de lavado (10 ml, 50 mM Tris.HCl, 4 mM MgSO₄, Tween 20 al 0,05 %, pH 8,0), tampón alto en sal (10 ml, Tris.HCl 50 mM, NaCl 1 M, MgCh 4 mM, Tween 20 al 0,05 %, pH 8,0), Tampón TE (10 ml, composición como la anterior) y H₂O MilliQ (10 ml). Se tomaron imágenes del portaobjetos usando un instrumento de fluorímetro de reflexión interna total hecho a medida para determinar el nivel de nucleótido adherido a la superficie.

Ejemplo 5: Evaluación de la enzimología en ADN de horquilla inmovilizado en superficie

A: Aplicación de matriz de molécula única - Se colocó un portaobjetos recubierto en una célula de flujo hecha a medida. Una solución de horquilla de ADN autocebante (200 μl, 1 nM, 0,1 M KPi, pH 7,0) se inyectó después en la célula de flujo y la célula se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La célula después se enjuagó con tampón TE hirviendo (20 ml, Tris.HCl 10 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0) y H₂O milliQ (20 ml). A continuación, se tomaron imágenes del portaobjetos usando un instrumento de fluorímetro de reflexión interna total hecho a medida para dar una lectura de fondo fluorescente. La célula de flujo se enjuagó después con tampón de lavado (20 ml, 50 mM Tris.HCl, MgSO₄4 mM, Tween 20 al 0,05 %, pH 8,0) y después mezcla enzimológica (2 x 100 μl, nucleótido marcado con fluorescencia 0,2 μM, ADN polimerasa 5 μg/ml, Tris.HCl 50 mM, MgSO44 mM, MnCh0,4 mM, Tween 20 al 0,05 %, pH 8,0) se inyectó en la célula de flujo. La célula de flujo se incubó a 45 °C durante 30 minutos. La célula de flujo se enjuagó después a un caudal de 0,5 ml/s con tampón de lavado (20 ml, 50 mM Tris.HCl, MgSO₄ 4 mM, Tween 20 al 0,05 %, pH 8,0), tampón de lavado alto en sal (20 ml, Tris.HCl 50 mM, NaCl 1 M, MgSO₄4 mM, Tween 20 al 0,05 %, pH 8,0), Tampón TE (20 ml, Tris.HCl 10 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0) y H₂O milliQ (20 ml). A continuación, se tomaron imágenes del portaobjetos usando un instrumento fluorímetro de reflexión interna total hecho a medida para determinar el nivel de incorporación enzimática del nucleótido marcado con fluorescencia en la horquilla.

Ejemplo 6: Preparación de un hidrogel soportado en sílice fundida tratado con polielectrolito y demostración de que es más pasivo frente a los nucleótidos marcados funcionalizados en comparación con un control no tratado

A: Se prepara un hidrogel sobre soporte de vidrio basado en poliacrilamida como se describe en el Ejemplo 1.

B: Pretratamiento con clorhidrato de polialilamina seguido de ácido poliacrílico

El tratamiento de un hidrogel de poliacrilamida que comprende 1 % en moles de BRAPA, como se describe en la Parte A, se efectúa poniendo en contacto el hidrogel con una solución de clorhidrato de polialilamina (2 mg/ml) H₂O MilliQ a pH 8. Se pone en contacto durante 30 min a temperatura ambiente, después de lo cual la solución se trata con ácido poliacrílico (2 mg/ml H₂O MilliQ a pH 8,2). La solución se incuba durante 30 min a temperatura ambiente seguido de tratamiento con H₂O MilliQ. La superficie tratada con las dos capas de polielectrolitos demuestra una reducción en la adherencia de los nucleótidos funcionalizados con fluorescencia en comparación con una superficie de hidrogel de control no tratada con los polielectrolitos.

Ejemplo 7: Demostración de que un hidrogel soportado en sílice fusionado tratado con poli(etilenglicol) es más pasivo frente a los nucleótidos marcados funcionalizados en comparación con un control no tratado El Ejemplo 6 se repitió excepto que en lugar del tratamiento con clorhidrato de polialilamina seguido de ácido poliacrílico, el hidrogel preparado como en el ejemplo 1 se trata con poli(etilenglicol) 8000 (Sigma). La superficie tratada con poli(etilenglicol) 8000 demuestra una reducción en la adherencia de los nucleótidos funcionalizados con fluorescencia en comparación con una superficie de hidrogel de control no tratada con poli(etilenglicol) 8000.

Ejemplo 8: Demostración de que el tratamiento de una matriz molecular basada en un hidrogel soportado en sílice fusionado tratado con polielectrolito o poli(etilenglicol) es más pasivo frente a los nucleótidos marcados funcionalizados en comparación con un control no tratado

Se repiten los ejemplos 6 y 7 excepto que en lugar de aplicar los polielectrolitos o poli(etilenglicol) a un hidrogel soportado en sílice fusionado como tal, en su lugar, se trata una matriz de polinucleótidos y las matrices modificadas de esta manera se usan en reacciones de secuenciación con nucleótidos marcados con fluorescencia. Las superficies tratadas con las dos capas de polielectrolito o con poli(etilenglicol) 8000, demuestran una reducción en la adherencia de nucleótidos funcionalizados con fluorescencia en comparación con superficies de hidrogel de control no tratadas.

Ejemplo 9: Preparación de hidrogel soportado en plástico

Los sustratos de plástico se obtuvieron de Amic y se limpiaron con Decon 90 durante la noche. Estos eran poli(metacrilato de metilo) (Amic PMMA) y plásticos de olefina cíclica 1060 y 1420 (Amic (COP) 1060 y Amic (COP) 1420). El día siguiente, se enjuagaron abundantemente con agua MilliQ y se secaron. Se preparó una solución de acrilamida al 2 % p/v disolviendo 1,3 g de acrilamida en 65 ml de agua MilliQ. Esta solución se purgó después con argón durante 15 minutos para eliminar el oxígeno, que puede inhibir la reacción de polimerización. Después se disolvió BRAPA (107 mg) con 1,07 ml de dimetilformamida (DMF) y se añadió a la solución de acrilamida desgasificada. Después de mezclar, se añadieron 75 μl de catalizador TEMED a la solución de acrilamida/BRAPA. Después se inició la polimerización añadiendo 0,65 ml de una solución de 0,05 g/ml de iniciador de persulfato de potasio a la solución de acrilamida/BRAPA/TEMED. La solución de acrilamida/BRAPA/TEMED/persulfato se mezcló rápidamente y se añadió a una jarra Coplin que contenía los sustratos de plástico (y vidrio) limpios y secos. Después de 90 minutos, los portaobjetos se retiraron de la mezcla de polimerización y se lavaron abundantemente con MilliQ bajo flujo. Después se sometieron a agitación en vórtex durante 20 segundos en MilliQ y se enjuagaron una segunda vez bajo flujo antes de secarlos con argón. Los portaobjetos tratados de esta manera se denominan en adelante portaobjetos tratados con acrilamida libre de silano (SFA) o "soporte con SFA".

Ejemplos 10: Funcionalización de hidrogel soportado en plástico

Después de la preparación del portaobjetos como se describe en el Ejemplo 9, se colocaron juntas de cubreobjetos CultureWell de GraceBio labs en los portaobjetos durante 1 hora. Después se colocaron fosforotioato-Cy3-DNA 1 μM (positivo) e hidroxil-Cy3-DNA 1 μM (ADN de control negativo) en tampón de fosfato 10 μM pH 7 en los pocillos de los portaobjetos de plástico (y vidrio) y se realizó el acoplamiento durante 1 hora en cámara de humedad a temperatura ambiente (20 °C). Después del acoplamiento cada portaobjetos se enjuagó copiosamente con tampón de fosfato 0,10 M de mayor fuerza iónica. A continuación, se retiró con cuidado la junta y el portaobjetos se sometió a agitación en vórtex durante 20 segundos en tampón Tris 10 mM/EDTA 10 mM, pH 8. Finalmente el portaobjetos se enjuagó con agua MilliQ bajo flujo, después se secó con argón.

Ejemplo 11: Detección de la funcionalización de oligonucleótidos de hidrogel soportado por plástico El escaneo de fluorescencia se realizó en un generador de imágenes Typhoon 8600 a 550 V, resolución de 100 um en el canal Cy3 (excitación láser 532).

Las imágenes que se muestran en la Figura 1 muestran el intento de acoplamiento de ADN positivo (PS, fosforotioato) y negativo (OH, control de hidroxilo) a Amic PMMA y plásticos 1060 y 1420 con y sin ^s F^a . Como puede verse al comparar la 1a y 2a columna de imágenes, solo se obtiene una señal fluorescente cuando el plástico se ha recubierto primero con SFA. Se observa cierta unión no específica de ADN hidroxilo 1 μM, pero menor que en el caso del sustrato de vidrio. Esto sugiere que los efectos del sustrato todavía están presentes a pesar de la presencia del recubrimiento SFA.

Los niveles relativos de señal positiva debido a la unión de fosforotioato se muestran en la Figura 2 junto con los valores medidos de señal/ruido (ADN de fosforotioato:ADN hidroxilo).

El gráfico que se muestra en la Figura 3 muestra que la estabilidad aparente del ADN de fosforotioato adsorbido específicamente en tampón de fosfato 50 mM pH 7 a 65 °C es esencialmente la misma que para el vidrio. Aproximadamente el 40 % de la señal de inicio queda después de 7 días de incubación en fosfato 50 mM pH 7 a 65 °C. Este valor es ligeramente más bajo de lo esperado para sustratos de vidrio y plástico y se atribuye al hecho de que las muestras siempre se escanearon en seco después de un breve enjuague con agua MilliQ. Cuando se seca, el tinte fluorescente se ve muy afectado por las condiciones ambientales, particularmente los niveles de ozono. Ejemplo 12: Preparación adicional de hidrogeles soportados en plásticos

También se probaron otros plásticos (por ejemplo, poliestireno) y plásticos del mismo tipo pero de diferentes proveedores y se intentaron estudios de hibridación de la siguiente manera:

Poliestireno de Corning, Zeonex E48R (un polímero de olefina cíclica) de Zeon Chemicals Ltd. y poli(metacrilato de metilo) de la Universidad Técnica de Dinamarca, así como sustratos de vidrio Spectrosil, se limpiaron como se describe en el Ejemplo 9. Algunas muestras limpias se mantuvieron aparte mientras que otras se recubrieron con SFA como se describe en el Ejemplo 9.

Fosforotioato-Cy3-ADN 1 μM (positivo), hidroxil-Cy3-ADN 1 μM (negativo, ADN control), cebador P5 sin marcar 1 μM con un espaciador 10T y cebador P7 sin marcar 1 μM con un espaciador 10T se acoplaron a sustratos como se preparó en el Ejemplo 12 y se limpiaron pero no se trataron con SFA. Después se realizó el escaneo como se describe en el Ejemplo 12. La siguiente hibridación de barrido se llevó a cabo usando una diana complementaria marcada con rojo Texas para el cebador P5 (P5') uniendo una junta de silicona cuadrada al sustrato y luego colocando otro portaobjetos limpio (vidrio sin recubrimiento) encima para formar una célula. Una inyección de diana complementaria de 0,5 μM en citrato de sodio 5X (SSC), tampón Tween 20 al 0,1 %, pH 7 se hizo en el espacio creado por la junta y la célula se calentó en un horno a 95 °C durante 30 minutos. A continuación, la temperatura del horno se cambió a 50 °C y la célula se dejó enfriar durante 2 horas. Posteriormente se retiró la célula y se dejó enfriar a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad. La solución diana complementaria se retiró después con una jeringa y Tampón Tween 205XSSC fresco al 0,1 % a temperatura ambiente inyectada, después se retiró. Este procedimiento de lavado se repitió 5 veces más. Después se desmanteló la célula y se agitó el subestado en un vaso de precipitados con 5XSSC fresco, Tween 20 al 0,1 % durante 2 minutos. El sustrato se transfirió después a un vaso de precipitados que contenía mayor rigurosidad (0,1XSSC, Tween 20 al 0,1 %) y se agitó durante 2 minutos. Esto se repitió una vez más y después se secó el sustrato con argón. Las muestras se escanearon de nuevo después esta vez a 700 V en el canal Rox usando una excitación de 633 nm (resolución de 100 μM).

Las imágenes que se muestran en la Figura 4 muestran a continuación el acoplamiento del fosforotioato marcado con Cy3 (GW2) y el ADN hidroxilo (GW4) a sustratos de vidrio y plástico con y sin recubrimientos SFA. De nuevo, se obtuvieron los mismos resultados (es decir, acoplamiento de ADN de fosforotioato solo cuando está presente SFA) aunque las intensidades de señal y las relaciones señal/ruido varían ligeramente respecto a antes (véase el gráfico).

Ejemplo 13: formación de matrices agrupadas por hibridación de plantilla y PCR

Visión general:

El enfoque de los inventores implica una etapa inicial de preparación de la superficie del soporte sólido, seguido de unión covalente (injerto) de cebadores para generar una superficie lista para usar en PCR. La plantilla de PCR puede hibridarse con cebadores adjuntos inmediatamente antes de la reacción de PCR. Por lo tanto, la reacción de PCR comienza con una etapa inicial de extensión del cebador en lugar de una desnaturalización de la plantilla. Este enfoque se ilustra en la Figura 6.

Parte experimental:

Los soportes sólidos usados en este experimento fueron chips de vidrio de 8 canales tales como los proporcionados por Micronit (Twente, Holanda) o IMT (Neuchatel, Suiza). Sin embargo, las condiciones y los procedimientos experimentales son fácilmente aplicables a otros soportes sólidos.

Los chips se lavaron como sigue: Decon puro durante 30 min, H₂O miliQ durante 30 min, NaOH 1 N durante 15 minutos, H₂O miliQ durante 30 min, HCl 0,1 N durante 15 minutos, H₂O miliQ durante 30 min.

Los chips se recubrieron después con hidrogel de poliacrilamida como se describe en el Ejemplo 1.

Los oligonucleótidos de 5'-fosforotioato se injertaron en la superficie del hidrogel en tampón fosfato 10 mM, pH 7, durante 1 hora a TA. Se usaron los siguientes cebadores ilustrativos:

Cebador P7 con espaciador poliT:

5'fosforotioato-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' [SEQ ID NO. 1]

Cebador P5 con espaciador poliT:

5'fosforotioato-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 2]

Los cebadores se usaron a una concentración de 0,5 μM en la solución de injerto.

La plantilla usada fue un fragmento de pBluescript T246 que contenía secuencias complementarias a los cebadores PHP5 mostrados anteriormente. El procedimiento de hibridación comenzó con una etapa de calentamiento en un tampón riguroso (95 °C durante 5 minutos en TE) para garantizar la desnaturalización completa antes de la hibridación de la plantilla. Después se llevó a cabo la hibridación en 5x SSC, usando plantilla diluida a una concentración final de 5 nM. Después de la hibridación, el chip se lavó durante 5 minutos con agua milliQ para retirar las sales.

La amplificación de superficie se llevó a cabo mediante PCR termociclada en un termociclador MJ Research.

Un programa típico de PCR es como sigue:

1- 97,5 °C durante 0:45

2- X°C durante 1:30

3- 73 °C durante 1:30

4- Ir a 1 [40] veces

5- 73 °C durante 5:00

6- 20 °C durante 3:00

7- Final

Dado que la primera etapa en la reacción de amplificación es la extensión de los cebadores unidos a la plantilla en la etapa de hibridación inicial, se omitieron las primeras etapas de desnaturalización e hibridación de este programa (es decir, el chip se colocó en el bloque de calentamiento solo cuando la mezcla de PCR se bombeó a través los canales y la temperatura era de 73 °C).

La temperatura de hibridación (X°C, etapa 2) depende del par de cebadores que se use. Los experimentos han determinado una temperatura de hibridación óptima de 57 °C para los cebadores P5/P7. Para otros pares de cebadores, la temperatura de hibridación óptima puede determinarse experimentalmente. El número de ciclos de PCR se puede variar si es necesario.

La PCR se llevó a cabo en una solución de reacción que comprendía tampón de reacción de PCR 1x (suministrado con la enzima), betaína 1 M, DMSO al 1,3 %, dNTP 200 μM y polimerasa Taq 0,025 U/ul.

Para visualizar las colonias los fragmentos de vidrio se tiñeron con SYBR Green-I en tampón TE (1/10000) y luego se observaron usando un microscopio de epifluorescencia. Se observó que se habían formado colonias amplificadas en los canales tratados como se describe anteriormente, pero no en los canales de control en los que se añadió la plantilla en la etapa de injerto del cebador (datos no mostrados).

Ejemplo 14: Efecto de la longitud del espaciador en la hibridación de polinucleótidos

Antecedentes:

Las micromatrices de ADN pueden usarse para llevar a cabo miles de hibridaciones heterogéneas (interfaz sólidolíquido) simultáneamente para determinar los patrones de expresión génica o para identificar el genotipo. La hibridación en estas matrices depende de varios factores incluyendo la densidad de la sonda (Peterson, A.W. et al. (2001) Nucl. Acids Res. 29, 5163-5168) mientras que las velocidades cinéticas y las constantes de unión en equilibrio pueden diferir notablemente de la fase de solución.

Debido al impedimento estérico y a un grado de libertad reducido, la proximidad a la superficie de soporte es un criterio clave que afecta el rendimiento de la hibridación (Weiler, J et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, N.° 14, 2792-2799). Shchepinov et al., determinaron que 60 átomos era la longitud óptima del espaciador para un espaciador de sintón hidrófilo de PEG-fosforoamidita (Shchepinov, MS et al. (1997) Núcleo. Acids Res. 25, 1155-1161). Esto dio como resultado un aumento de 50 veces en el rendimiento de hibridación. Por encima de 60 átomos (aproximadamente 10 unidades de glicol) el rendimiento de hibridación disminuyó hasta que a las 30 unidades el rendimiento de hibridación fue el mismo que sin ningún espaciador. Por otra parte, el rendimiento de la hibridación se vio afectado por la densidad de carga a lo largo del espaciador, siendo independiente del tipo de carga.

Los estudios de hibridación indicados a continuación muestran que era posible mejorar el rendimiento de la hibridación incorporando un espaciador poliT en el cebador. Se ha demostrado anteriormente que espaciadores oligoT similares producen una mejora de la hibridación de 20 veces (Guo, Z. et al (1994) Nucl. Acids Res. 22, 5456-5465).

Parte experimental:

(1) Hibridación en una microplaca-efecto del espaciador

Modificación de vidrio con acrilamida libre de silano (SFA):

Una microplaca de poliestireno de fondo de vidrio de 96 pocilios se colocó en Decon 90 durante la noche. El día siguiente la microplaca se enjuagó abundantemente con agua MilliQ, después se secó con argón. Después la superficie de vidrio de cada pocillo de la microplaca se recubrió con acrilamida libre de silano (SFA). Brevemente, se disolvió acrilamida en agua para dar una solución al 2 % p/v y luego se burbujeó argón a través de esta solución durante 15 minutos. Se disolvieron 82,5 mg de BRAPA (el monómero activo) en 0,825 ml de dimetilformamida (DMF). Esta solución se añadió después a 50 ml de solución de acrilamida para dar una solución de BRAPA al 2 % en moles con respecto a la acrilamida. Después de mezclar se añadieron 57,5 μl de TEMED a la solución de acrilamida/BRAPA. Después se preparó una solución de persulfato potásico disolviendo 0,1 g en 2 ml de agua MilliQ. Después se añadieron 0,5 ml de la solución iniciadora a la solución desgasificada de acrilamida/BRAPA/TEMED y, después de mezclar, se pipetearon 0,4 ml de la mezcla de polimerización en cada pocillo de la microplaca. Se dejó proceder la polimerización durante 1,5 horas, después se lavó la microplaca en un lavador automático de microplacas con el programa AHPEM160. Después del lavado la placa se secó en argón y se almacenó durante la noche al vacío. Acoplamiento de cebadores oligo a la superficie SFA:

Los siguientes 4 cebadores se acoplaron a la superficie a concentraciones de 2,0 μM, 1,0 μM, 0,5 μM y 0,1 μM de tampón fosfato 10 mM pH 7:

1) Cebador P7 sin espaciador poliT:

5'fosforotioato-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' [SEQ ID NO. 3]

2) Cebador P7 con espaciador poliT:

5'fosforotioato-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' [SEQ ID NO. 1]

3) Cebador P5 sin espaciador poliT:

5'fosforotioato-AATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 4]

4) Cebador P5 con espaciador poliT:

5'fosforotioato-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 2]

El acoplamiento se realizó usando 0,1 ml de solución de oligonucleótidos durante 1 hora en ambiente húmedo a temperatura ambiente. En lo sucesivo la microplaca se lavó con tampón de fosfato 0,10 M, pH 7, en un lavador automático de microplacas.

Hibridación:

La hibridación con los cebadores (Figura 7) se llevó a cabo usando las siguientes dianas complementarias marcadas con rojo Texas:

P5 'diana complementaria a la secuencia P5:

5'Rojo Texas-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3' [SEQ ID NO. 5]

P7 'diana complementaria a la secuencia P7:

5'Rojo Texas-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3' [SEQ ID NO. 6]

El volumen diana fue de 0,1 ml y la concentración fue de 0,5 μM. La diana se compuso en dos tampones de hibridación diferentes y se probó. La composición del tampón TAQ pCr fue betaína 1 M, DMSO al 1,3 %, Tris 10 mM, MgCh 1,5 mM y KCl 50 mM (pH 9). El otro tampón contenía 5XSSC (diluido de un stock 20X) y Tween 20 al 0,1 % (v/v) (pH 7). Se usó una película PCR especial para sellar los pocillos de la microplaca y evitar la evaporación al calentarla. A continuación, la placa se colocó en un bloque de PCR con tapa y se sometió a las siguientes condiciones:

1) 0,5 °/s a 97,5 °C

2) 97,5 °C durante 2 min 30 s

3) 97,5 °C durante 2 s - 0,1 °C por ciclo

4) Ir a 3, 574 veces

5) 40,0 °C durante 15 min

6) Final

Después de calentar y enfriar la placa se lavó 15 veces usando el lavador de microplacas (programa modificado 'AHPEM170') con 5XSSC, Tween 20 al 0,1 % v/v pH 7, después 6 veces usando el mismo programa pero con 0,1XSSC, Tween 20 al 0,1 % v/v pH 7. Después del lavado, la placa se escaneó en húmedo con un generador de imágenes Typhoon 9600 a 700 V con el filtro ROX, excitación a 633 nm, tamaño de píxel de 200 μM.

Resultados:

Los resultados presentados en la Figura 8 muestran una clara mejora en la señal de hibridación para el cebador P5 y P7 tras añadir un espaciador con 10 bases T. No solo la señal es mucho más alta, sino que la relación señal-ruido (específica de la hibridación no específica) también mejora enormemente.

(2) Hibridación en portaobjetos Typhoon - efecto del espaciador

Acoplamiento de cebadores oligo a la superficie SFA:

Los siguientes 4 cebadores se acoplaron a la superficie a concentraciones de 1,0 μM de tampón de fosfato 10 mM pH 7:

1) Cebador P7 sin espaciador poliT:

5'fosforotioato-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' [SEQ ID NO. 3]

2) Cebador P7 con espaciador poliT:

5'fosforotioato-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' [SEQ ID NO. 1]

3) Cebador P5 sin espaciador poliT:

5'fosforotioato-AATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 4]

4) Cebador P5 con espaciador poliT:

5'fosforotioato-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 2]

El acoplamiento se llevó a cabo durante 1 hora colocando 7 μl de cada oligo en uno o más pocillos creados pegando una junta de cubreobjetos de Grace Biolab CultureWell (junta 1, Figura 9) en un portaobjetos Typhoon previamente modificado con acrilamida al 2 %, acrilamida al 2 % en moles sin silano BRAPA. Durante el acoplamiento, los portaobjetos se mantuvieron en la oscuridad en una cámara de humedad. Después del acoplamiento, los portaobjetos se enjuagaron con 250 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7 de una botella de lavado. Después cada portaobjetos se agitó durante 20 segundos en tampón Tris/EDTA 10 mM/10 mM, pH 8, después se enjuagó con agua MilliQ y se secó. Hibridación:

La hibridación con los cebadores (Figura 7) se llevó a cabo usando las siguientes dianas complementarias marcadas con rojo Texas:

P5' diana complementaria a la secuencia P5:

5'Rojo Texas-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3' [SEQ ID NO. 5]

P7' diana complementaria a la secuencia P7:

5'Rojo Texas-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3' [SEQ ID NO. 6]

Se adjuntó una junta de silicona (junta 2, Figura 9) al portaobjetos modificado con cebador y se colocó encima un portaobjetos de vidrio limpio para crear una cámara sellada. Se usaron clips para asegurar el sellado. El espacio creado por la junta se llenó después con una de las dianas complementarias (P5 'o P7'), después el lado modificado con imprimación se colocó en contacto con un bloque de calentamiento de aluminio. Se colocó una caja en la parte superior para evitar el acceso de la luz. La temperatura del bloque de aluminio se aumentó desde temperatura ambiente hasta 95 °C (15 minutos requeridos). A continuación, se bajó la temperatura del calentador a 40 °C y se dejó que los portaobjetos se enfriaran a 50 °C (se requieren 2 horas). Una vez a 50 °C se dejó enfriar el portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después se extrajo la solución diana complementaria con una jeringa y se lavó el interior mediante inyección 6X con 5XSSC, Tween 20 al 0,1 %. La junta, los clips y los portaobjetos se desmantelaron después y el portaobjetos modificado con cebador se enjuagó con agitación en un tubo que contenía 5XSSC, Tween 20 al 0,1 % durante 2 minutos. Esto se repitió y luego el portaobjetos modificado con cebador se enjuagó con 0.1XSSC, Tween 20 al 0,1 %, dos veces durante 2 minutos con agitación. El portaobjetos se secó después con argón y se secó por barrido a 700 V como anteriormente.

Resultados:

Los resultados presentados en las Figuras 10 y 11 muestran una clara mejora en la señal de hibridación para el cebador P5 y P7 tras añadir un espaciador con 10 bases T. No solo la señal es mucho más alta, sino que la relación señal-ruido (específica de la hibridación no específica) también mejora enormemente.

(3) Hibridación en portaobjetos Typhoon - efecto de la longitud del espaciador

Acoplamiento de cebadores oligo a la superficie SFA:

Los siguientes 8 cebadores se acoplaron a la superficie a concentraciones de 1,0 μM de tampón de fosfato 10 mM pH 7:

1) Cebador P7 sin espaciador poliT:

5'fosforotioato-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' [SEQ ID NO. 3]

2) Cebador P7 con espaciador poliT:

5'fosforotioato-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' [SEQ ID NO. 1]

3) Cebador P5 sin espaciador poliT:

5'fosforotioato-AATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 4]

4) Cebador P5 con espaciador poliT:

5'fosforotioato-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 2]

5) Cebador P5 con espaciador poliT:

5'fosforotioato-TTAATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 7]

6) Cebador P5 con espaciador poliT:

5'fosforotioato-TTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 8]

7) Cebador P5 con espaciador poliT:

5'fosforotioato-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 9]

8) Cebador P5 con espaciador C18:

5'fosforotioato-C¹⁸-AATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 4]

El acoplamiento se llevó a cabo durante 1 hora colocando 7 μl de cada oligonucleótido en uno o más pocillos creados pegando una junta de cubreobjetos de Grace Biolab CultureWell (junta 1, esquema 2) en un portaobjetos Typhoon previamente modificado con acrilamida al 2 %, acrilamida al 2 % en moles sin silano BRAPA. Durante el acoplamiento, los portaobjetos se mantuvieron en la oscuridad en una cámara de humedad. Después del acoplamiento, los portaobjetos se enjuagaron con 250 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7 de una botella de lavado. Después cada portaobjetos se agitó durante 20 segundos en tampón Tris/EDTA 10 mM/10 mM, pH 8, después se enjuagó con agua MilliQ y se secó.

Hibridación:

La hibridación con los cebadores (Figura 7) se llevó a cabo usando las siguientes dianas complementarias marcadas con rojo Texas:

P5' diana complementaria a la secuencia P5:

5'Rojo Texas-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3' [SEQ ID NO. 5]

P7' diana complementaria a la secuencia P7:

5'Rojo Texas-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3' [SEQ ID NO. 6]

La hibridación se llevó a cabo como anteriormente. Se adjuntó una junta de silicona (junta 2, Figura 9) al portaobjetos modificado con cebador y se colocó encima un portaobjetos de vidrio limpio para crear una cámara sellada. Se usaron clips para asegurar el sellado. El espacio creado por la junta se llenó después con una de las dianas complementarias (P5 'o P7'), después el lado modificado con imprimación se colocó en contacto con un bloque de calentamiento de aluminio. Se colocó una caja en la parte superior para evitar el acceso de la luz. La temperatura del bloque de aluminio se aumentó desde temperatura ambiente hasta 95 °C (15 minutos requeridos). A continuación, se bajó la temperatura del calentador a 40 °C y se dejó que los portaobjetos se enfriaran a 50 °C (se requieren 2 horas). Una vez a 50 °C se dejó enfriar el portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después se extrajo la solución diana complementaria con una jeringa y se lavó el interior mediante inyección 6X con 5XSSC, Tween 20 al 0,1 %. La junta, los clips y los portaobjetos se desmantelaron después y el portaobjetos modificado con cebador se enjuagó con agitación en un tubo que contenía 5XSSC, Tween 20 al 0,1 % durante 2 minutos. Esto se repitió y luego el portaobjetos modificado con cebador se enjuagó con 0.1XSSC, Tween 20 al 0,1 %, dos veces durante 2 minutos con agitación. El portaobjetos se secó después con argón y se secó por barrido a 700 V como anteriormente.

Resultados:

Los resultados presentados en la Figura 12 muestran que el rendimiento de la hibridación aumenta bruscamente con la longitud del espaciador poliT hasta 10T, pero entre las bases 10T y 20T comienza a disminuir. También se ha informado en otro lugar un rendimiento de hibridación reducido por encima de una longitud de espaciador óptima (Shchepinov, M.S. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 1155-1161; Guo,Z. et al (1994) Nucl. Acids Res. 22, 5456-5465). Una posible explicación podría ser que los cebadores más grandes tienen una menor densidad de cebadores en la superficie y, por lo tanto, dan como resultado una señal de hibridación más pequeña. Un espaciador C18 da como resultado solo una pequeña mejora en el rendimiento de hibridación, lo que sugiere que la hidrofilia del espaciador también es un factor importante.

Si bien esta invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a realizaciones preferidas, los expertos en la materia entenderán que pueden realizarse diversos cambios en la forma y los detalles sin apartarse del alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones adjuntas, que definen el alcance de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición, que comprende

(a) un soporte sólido que comprende una superficie;

(b) una primera pluralidad de cebadores de oligonucleótidos injertados en la superficie, en donde los cebadores de la primera pluralidad consisten cada uno en un espaciador que consiste en uno o más nucleótidos, y la secuencia 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' [SEQ ID NO. 3], donde el espaciador no participa en ninguna reacción llevada a cabo sobre o con el polinucleótido de SEQ ID NO. 3 o en donde los cebadores de la primera pluralidad consisten cada uno en la secuencia 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' [SEQ ID NO. 3]; y

(c) una segunda pluralidad de cebadores de oligonucleótidos injertados en la superficie, en donde los cebadores de la segunda pluralidad consisten cada uno en un espaciador que consiste en uno o más nucleótidos y la secuencia 5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 4] donde el espaciador no participa en ninguna reacción llevada a cabo sobre o con el polinucleótido de SEQ ID NO. 4 o en donde los cebadores de la primera pluralidad consisten cada uno en la secuencia 5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3' [SEQ ID NO. 4];

en donde los ácidos nucleicos están unidos covalentemente a un hidrogel que está inmovilizado en la superficie.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde el espesor del hidrogel es inferior a 100 nM.

3. La composición de la reivindicación 1, en donde los extremos 5' de los cebadores de oligonucleótidos están unidos covalentemente al hidrogel.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el hidrogel es el producto de la polimerización de

(i) un primer comonómero que es acrilamida, metacrilamida, metacrilato de hidroxietilo o N-vinil pirrolidinona; y (ii) un segundo comonómero que es una acrilamida o acrilato funcionalizado de fórmula (I):

H²C=C(H)-C(=O)-A-B-C (I);

o un metacrilato o metacrilamida de fórmula (II):

o

H²C=C(CH^a)-C(=O)-A-B-C- (II)

en donde:

A es NR u O, en donde R es hidrógeno o un grupo hidrocarbilo saturado opcionalmente sustituido que comprende de 1 a 5 átomos de carbono;

B es un birradical alquileno opcionalmente sustituido de fórmula -(CH²)ⁿ- en donde n es un número entero de 1 a 50; y en donde n = 2 o más, uno o más birradicales etileno opcionalmente sustituidos -CH²CH²- de dicho birradical alquileno pueden estar independientemente reemplazados por restos etenileno y etinileno; y en donde n = 1 o más, uno o más birradicales metileno -CH²- pueden estar independientemente reemplazados por un birradical hidrocarbono mono o policíclico opcionalmente sustituido que comprende de 4 a 50 átomos de carbono, o un birradical heteromonocíclico o heteropolicíclico correspondiente en donde al menos 1 CH² o CH² está sustituido por un átomo de oxígeno, azufre o nitrógeno o un grupo NH; y

C es un grupo para la reacción con un compuesto para unir dicho compuesto covalentemente a dicho hidrogel para formar un producto polimerizado.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el hidrogel es el producto de la polimerización de acrilamida con N-(5-bromoacetamidilpentil)acrilamida.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los cebadores de oligonucleótidos en la primera pluralidad comprenden cada uno la secuencia 5'-poliT-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3', en donde el poliT comprende de 2 a 10 nucleótidos de timina.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde los cebadores de oligonucleótidos en la segunda pluralidad comprenden cada uno la secuencia 5'-poliT-AATGATACGGCGACCACCGA-3', en donde el poliT comprende de 2 a 10 nucleótidos de timina.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el soporte sólido comprende un sustrato basado en sílice, plástico, oro, dióxido de titanio o silicio.

9. La composición de la reivindicación 8 en donde el soporte sólido comprende vidrio.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde los ácidos nucleicos de la primera pluralidad están hibridados con ácidos nucleicos diana que comprenden la secuencia 5'-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3' [SEQ ID NO. 5].

11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde los ácidos nucleicos de la segunda pluralidad están hibridados con ácidos nucleicos diana que comprenden la secuencia 5'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3' [SEQ ID NO. 6].

12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde el soporte sólido sobre el que se inmoviliza el hidrogel no está modificado covalentemente en la superficie.

13. Un método para preparar una matriz molecular con soporte sólido realizando la amplificación de ácido nucleico de una plantilla usando la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

14. Una matriz molecular basada en hidrogel en soporte sólido que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 obtenida mediante el método de la reivindicación 13.