ES2950507T3 - Tratamiento y gestión del aumento del síndrome de piernas inquietas - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos para tratar el síndrome de piernas inquietas (SPI), incluida la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de un antagonista del receptor D1 de dopamina. También se proporcionan composiciones y kits útiles para tratar el SPI. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento y gestión del aumento del síndrome de piernas inquietas

La presente invención se refiere a métodos para reducir o revertir el aumento en el Síndrome de Piernas Inquietas.

Antecedentes de la invención

El Síndrome de Piernas Inquietas (SPI) es un trastorno sensoriomotor que afecta de manera intensa y, principalmente, interrumpe el sueño [1, 2]. Los síntomas incluyen palpitaciones, tirones, deslizamientos u otras sensaciones desagradables en las piernas y un impulso incontrolable de moverlas. Estos síntomas se producen de forma circadiana y principalmente durante la noche, y la gravedad del intervalo de sensaciones varía de incomodidad a irritación o dolor [3, 4]. Según estudios epidemiológicos, la prevalencia de SPI oscila entre un 2,5-10 % de la población general [5-8], lo que lo convierte, con más de 3 millones de casos sólo en EE. UU., en el trastorno de movimiento más frecuente y en uno de los trastornos de sueño más comunes.

Diversos estudios de asociación de genoma completo han identificado marcadores genéticos que están altamente expresados en pacientes con SPI [5, 9-13], no obstante, la función de estos genes en el sistema nervioso y su contribución a SPI sigue sin estar clara. El paradigma actual de tratamiento primario de SPI se centra generalmente en agonistas de receptor de levodopa y dopamina (DA) que se dirigen a los receptores DA inhibidores acoplados a Gi (en particular los subtipos D3R y D2R ) [3, 14-18].

Muchos pacientes con SPI responden sólidamente a los agonistas de receptor DA, y los agonistas de D3R pueden actuar ya desde el primer día de tratamiento [19]. Sin embargo, la terapia a largo plazo conduce a menudo a un aumento y un cambio de las acciones inicialmente beneficiosas para dar lugar a efectos adversos [20-24]. Descrita por primera vez en el tratamiento de SPI en 1996 [25], la intensificación se caracteriza por una aparición más temprana de los síntomas durante la tarde, una latencia más corta hasta la aparición de los síntomas en reposo, una expansión de los síntomas a las extremidades superiores y el tronco, un aumento general de la intensidad de los síntomas, incluyendo parestesia [26], y un efecto terapéutico más breve de la medicación [27]. De este modo, los agonistas de DA parecen tener un periodo de utilidad clínica limitado para muchos pacientes, y el aumento grave, aunque no es frecuente en el primer año de tratamiento, se puede desarrollar incluso después de años con la medicación [28, 29].

Las opciones terapéuticas alternativas, tales como los ligandos alfa-2-delta (gabapentina, pregabalina) han mostrado resultados prometedores en el tratamiento de los síntomas de SPI [29-31] y se recomiendan cuando fracasa el tratamiento con agonistas de los receptores DA [3, 29], pero los efectos secundarios de los ligandos alfa-2-delta con frecuencia incluyen mareos, somnolencia y dificultad de concentración, y se han descrito casos de depresión inducida por fármaco [32, 33]. Aunque los opiáceos también pueden resultar eficaces en el tratamiento de SPI, su uso sigue resultando problemático debido a la posibilidad inherente de abuso y tolerancia a los fármacos opiáceos [34].

Además, la duración e intensidad de los síntomas de SPI son similares a los observados en pacientes con dolor crónico (neuropático), y la eficacia de los analgésicos en el tratamiento de SPI apoya el concepto de solapamiento entre alteraciones sensoriales de SPI y mecanismos moduladores de dolor en el dolor crónico [35, 36]. Al igual que SPI, el dolor crónico no se resuelve por sí solo y generalmente requiere un tratamiento prolongado o de por vida, a menudo basado en morfina o sus derivados.

El documento WO 02/100350 divulga composiciones que comprenden el agonista SCH 23390 de receptor de D¹ y un portador, excipiente o diluyente para su uso en el tratamiento de SPI.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones. Proporciona vías para el desarrollo clínico de opciones de tratamiento alternativas para el Síndrome de Piernas Inquietas (SPI) que puedan reducir o revertir el aumento que se produce al tratar el Síndrome de Piernas Inquietas con un agonista de receptor D3. Además, estas opciones terapéuticas pueden evitar los efectos secundarios de otros enfoques terapéuticos más convencionales.

Se describen en el presente documento (no son parte de la invención):

un método para tratar SPI que incluye administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de receptor de dopamina D1.

un método de tratamiento del dolor crónico que no depende de opiáceos que incluye administrar a un sujeto de una cantidad eficaz de un antagonista de receptor de dopamina D1.

un método para tratar SPI que incluye administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de receptor de dopamina D1 en combinación con un agonista de receptor D3.

un método para tratar el dolor crónico que no depende de opiáceos que incluye administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de receptor de dopamina D1 en combinación con un agonista de receptor D3.

un método de prevención de la capacidad de sobreexcitación del sistema nervioso que incluye administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un antagonista del receptor de dopamina D1 en combinación con un agonista de receptor D3, en el que la capacidad de sobreexcitación está provocada por la exposición prolongada a un agonista de receptor D3.

un método para restaurar la capacidad de respuesta o disminuir la tolerancia a un agonista de receptor D3, que incluye la activación de un mecanismo de receptor D3 y la inhibición de la actividad de receptor D1 tras el aumento mediado por el receptor D3.

métodos para restaurar la capacidad de respuesta o disminuir la tolerancia a un agonista de opioide, incluyendo el método la activación de un mecanismo de receptor D3 y la inhibición del receptor D1.

Las realizaciones de la presente invención incluyen una composición que comprende

(a) ecopipam como antagonista de receptor D1; (b) al menos un agonista de receptor D3; (c) opcionalmente un agonista de opioide; y (d) un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Las realizaciones de la presente invención proporcionan sistemas de administración transdérmica conocidos en la técnica, tales como parches, vendas, apósitos, gasas y similares que incluyen dicha composición.

Las realizaciones de la presente invención proporcionan artículos de fabricación tales como calcetines o calcetería que incluyen dicha composición.

Las realizaciones de la presente invención también proporcionan un estuche que incluye uno o más recipientes que tienen unidades de dosificación farmacéutica que incluyen una cantidad eficaz de ecopipam como al menos un antagonista de receptor D1, al menos un agonista de receptor D3 y opcionalmente un agonista de opioide, en el que el recipiente incluye instrucciones opcionales para reducir o revertir el aumento derivado del tratamiento de síndrome de piernas inquietas con un agonista de receptor D³.

Lo anterior y otros objetos y aspectos de la presente invención se explican con mayor detalle en referencia a los dibujos y la descripción expuesta en la presente memoria.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Modelo propuesto de interacciones de receptor D1/D3 antes y después de la terapia a largo plazo con agonistas de receptor D3 en SPI. A: Al inicio del tratamiento, los agonistas de DR3 externo y DA (por ejemplo, pramipexol, rotigotina) se dirigen preferentemente al mecanismo de receptor D3 de alta afinidad dentro del heterodímero D1R/D3R, y el resultado general es el alivio sintomático. B: Con el tratamiento a largo plazo, el receptor D3 se sensibiliza y aumenta la expresión del receptor D1, lo que a su vez aumentará los niveles de AMPc, la actividad PKA y la excitabilidad general. Los inventores proponen que este aumento de excitabilidad que depende de D3R, pero mediada por D1R, puede subyacer al aumento. AC: adenilato ciclasa; AMPc: AMP cíclico; (-): inhibidor, (+) excitador. Adaptado de Brewer et al., Frontiers in Neural Circuits, 2014 [81].

Figura 2. Modulación aguda de las respuestas de retirada térmica por medio de agonista de D3R (pramipexol, ppx) y antagonista de D1R (SCH 39166). Ambos fármacos tienen un efecto similar sobre el resultado conductual y aumentan las latencias de retirada, lo que sugiere un efecto analgésico (barra blanca y gris claro). Un tratamiento combinado con ambos fármacos aumenta significativamente las latencias de retirada con respecto a las de cada fármaco por separado, lo que sugiere un efecto sinérgico.

Figura 3. Efectos moduladores opuestos de la activación de D3R aguda vs a largo plazo. Tras el efecto agudo (A), el tratamiento a largo plazo con un agonista de D3R (>4 semanas, B), se tradujo en una disminución de las latencias de retirada térmica, lo que sugiere un aumento de sensibilidad. Este efecto hiperalgésico imita el fenotipo de aumento de SPI.

Figura 4. La expresión de la proteína D1R en médula espinal aumenta tras el tratamiento in vivo prolongado con un agonista de D3R.

Figura 5. Diagrama de flujo de diseño experimental. Se someten a ensayo los reflejos de retirada de dolor térmico en animales de tipo salvaje (WT) y nuligénicos de receptor D1 (D1KO). Cada cepa consiste en 4 cohortes y 5 subgrupos (a-e) que experimentan diferentes paradigmas de inyección de fármaco (simulacro vs agonista de D3R [a 2 dosis] vs antagonista de D1R). Los reflejos de retirada de dolor se someten a ensayo diariamente y los animales de los subgrupos a-d se sacrifican tras los ensayos conductuales y se recoge su médula espinal. Los subconjuntos (e) de cada cohorte siguen recibiendo inyecciones diarias y los reflejos de dolor térmico se someten a ensayo después de las semanas 5 y 6. A partir de la semana 5, las cohortes 2 y 3 reciben el tratamiento combinado de agonista de D3R/antagonista de D1R y sus respuestas se comparan con los subgrupos correspondientes de las cohortes 1 (simulacro) y 3 (SCH 39166).

Figura 6. Modulación de las amplitudes reflejas espinales (SRAs) por agonistas de D3R y D1R. A. La aplicación en baño a corto plazo (menos de 30 min) del agonista de D3R pergolida disminuye significativamente los valores de SRA respecto al control. Por el contrario, la aplicación del agonista de D1R, SKF 38393, aumenta los valores de SRA. B. La exposición continua de larga duración al agonista de D3R, pramipexol (ppx), invoca, tras una disminución inicial, un fuerte aumento de la amplitud de SRA. Este aumento de SRA se puede disminuir a continuación mediante la aplicación adicional en baño de un antagonista de D1R (SCH 39166).

Figura 7. Cambios en las latencias de retirada térmica con el tiempo con inyecciones crónicas. Se muestran los ensayos con la segunda opción de tratamiento más utilizada para SPI, pramipexol (0,5 mg/kg/día) y se establece la evolución temporal del cambio de analgesia a hiperalgesia La Figura 7A muestra los resultados de mediciones diarias, y la Figura 7B muestra los promedios semanales.

Figura 8. Cambios en las latencias de retirada térmica antes y después de las inyecciones con pramipexol. Se evaluaron los animales antes y después de una única inyección de un agonista de D3R (0,5 mg/kg de pramipexol) tanto antes de la primera inyección en la semana 1 como inmediatamente antes de la última inyección, después de 4 semanas, para mostrar los efectos del fármaco a corto plazo. La Figura 8A muestra los beneficios inmediatos que una sola inyección de Agonista de D3R tuvo sobre las latencias de retirada. La Figura 8B muestra los resultados después de 4 semanas de inyecciones diarias con pramipexol.

Figura 9. Cambios en las latencias de retirada térmica antes y después de las inyecciones con el Antagonista D1R SCH 39166. Se evaluaron los animales antes y después de una única inyección de un Antagonista de D1R, al inicio del estudio (en la semana 1, Figura 9A), y después del paradigma de fármaco de 4 semanas como se muestra en la Figura 9B.

Figura 10. Se sometió a ensayo el agonista de D3R, pramipexol (PPX) y se estableció la evolución temporal gradual de los cambios conductuales como se muestra en la Figura 10A. La Figura 10B muestra que la respuesta de los animales a un único tratamiento con el antagonista de D1R rescata la inhibición original inducida por D3 en los animales "aumentados".

Descripción detallada

La presente invención se comprenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. La terminología empleada en la descripción de la invención en la presente memoria tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares.

1. Definiciones

Como se utiliza en la presente memoria, "un" o "una" o "el" o “la” pueden hace referencia a uno o más de uno. Asimismo como se usa en la presente memoria, "y/o" se refiere y abarca cualesquiera y todas las combinaciones posibles de uno o más de los elementos enumerados asociados, así como también la ausencia de combinaciones cuando se interpreta de forma alternativa ("o").

Además, el término "aproximadamente", tal como se utiliza en la presente al referirse a un valor medible como una cantidad de compuesto o agente de la presente invención, dosis, tiempo, temperatura y similares, se entiende que abarca variaciones de un 20 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,5 % o incluso un 0,1 % de la cantidad especificada.

Los términos "comprender", "comprende" y la expresión "que comprende", tal como se utilizan en la presente memoria, especifican la presencia de las características, números enteros, etapas, operaciones, elementos y/o componentes indicados, pero no excluyen la presencia o adición de una o más de otras características, números enteros, etapas, operaciones, elementos, componentes y/o grupos de los mismos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión transitoria "que consiste esencialmente en" significa que el alcance de una reivindicación se debe interpretar de manera que abarque los materiales o etapas especificados en la reivindicación y aquellos que no afecten materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) de la invención reivindicada. Por tanto, la expresión "que consiste esencialmente en" cuando se utiliza en una reivindicación de la presente invención no se debe interpretar como equivalente a "que comprende".

Los términos "modular", "modula" o "modulación" se refieren a la potenciación (por ejemplo, aumento) o inhibición (por ejemplo, reducción) de la actividad especificada. El término "gestión" como se usa en la presente memoria se refiere a la capacidad de afectar a un método, proceso, estado de ser, trastorno o similar. El efecto puede ser de prevención, tratamiento o modulación.

Con el término "tratar" o la expresión "tratamiento de" se pretende que la gravedad del trastorno o los síntomas del mismo se reduzcan, o que el trastorno se elimine parcial o totalmente, en comparación con lo que ocurriría en ausencia de tratamiento. El tratamiento no requiere la curación completa del trastorno.

Con los términos "prevenir" o "prevención" se pretende que los métodos de la invención eliminen o reduzcan la incidencia o aparición del trastorno, en comparación con lo que ocurriría en ausencia de la medida adoptada. Alternativamente, los presentes métodos ralentizan, retardan, controlan o disminuyen la probabilidad de que se produzca el trastorno en el sujeto, en comparación con lo que ocurriría en ausencia de la medida adoptada.

Se pretende que una cantidad "terapéuticamente eficaz" o "eficaz" designe una dosis que causa alivio de los síntomas de una enfermedad o trastorno, como se ha observado mediante ensayos y evaluación clínica, observación de paciente y/o similares. "Cantidad eficaz" o "eficaz" puede designar además una dosis que causa un cambio detectable de la actividad biológica o química. Los cambios detectables se pueden detectar y/o cuantificar por un experto en la técnica para el mecanismo o proceso correspondiente. Además, "cantidad eficaz" o "eficaz" puede designar una cantidad que mantiene un estado fisiológico deseado, es decir, reduce o evita un deterioro significativo y/o favorece la mejora de la afección de interés. Como se entiende generalmente en la técnica, la dosis varía en función de las vías de administración, los síntomas y el peso corporal del paciente, pero también en función del compuesto que se administra.

"Aumento" se refiere a un empeoramiento de los síntomas de SPI que se produce después de iniciar la terapia de tratamiento de SPI. Los signos de aumento incluyen, entre otros, una aparición de los síntomas más temprana (por ejemplo, palpitaciones, tirones, deslizamientos u otras sensaciones desagradables en las piernas y un impulso incontrolable de moverlas) que se puede producir durante la tarde o noche, una latencia más corta hasta la aparición de síntomas en reposo, una expansión de los síntomas a las extremidades superiores y el tronco, un aumento general de la intensidad de los síntomas, incluyendo parestesias, y/o un efecto terapéutico de medicamento de menor duración, tal como tolerancia. El aumento puede ser leve, moderado o grave.

"Tolerancia" se refiere a una respuesta decreciente al tratamiento con el tiempo.

"En combinación con" significa suficientemente próximo en el tiempo para producir un efecto combinado (es decir, en combinación con puede ser simultáneamente, o pueden ser dos o más episodios que ocurren en un corto período de tiempo antes o después uno con respecto al otro). En algunas realizaciones, la administración de dos o más compuestos en combinación con significa que los dos compuestos se administran suficientemente próximos en el tiempo como para que la presencia de uno modifique los efectos biológicos del otro. Los dos compuestos se pueden administrar en la misma o en diferentes formulaciones o de forma secuencial. Dicha administración concurrente se puede llevar a cabo mezclando los compuestos antes de la administración, o administrando los compuestos en dos formulaciones diferentes, por ejemplo, en el mismo momento pero en sitios anatómicos diferentes o utilizando vías de administración diferentes.

2. Agentes activos

Las realizaciones de la presente invención incluyen el uso de ecopipam como antagonista de receptor D1. Los antagonistas de receptor D1 también incluyen SCH 23390, SKF 83566, o mezclas de los mismos.

Las realizaciones de la presente invención incluyen el uso de agonistas de receptor D3. Los agonistas de receptor D3 incluyen, entre otros, nafadotrida, PD 128907, pramipexol, pergolida, rotigotina o mezclas de los mismos.

Algunas realizaciones de la presente invención incluyen el uso de agonistas de receptor de opioide. Los agonistas de opioide incluyen, entre otros, alilprodina, alfaprodina, anileridina, bencilmorfina, bezitramida, buprenorfina, butorfanol, clonitaceno, codeína, desomorfina, dextromoramida, dezocina, diampromida, diamorfina, dihidrocodeína, dihidromorfina, dimenoxadol, dimefeptanol, dimetiltiambuteno, butirato de dioxafetilo, dipipanona, eptazocina, etoheptazina, etilmetiltiambuteno, etilmorfina, etonitaceno fentanilo, heroína, hidrocodona, hidromorfona, hidroxipetamina, isometadona, cetobemidona, levorfanol, levofenacilmorfano, lofentanilo, meperidina, meptazinol, metazocina, metadona, metopón, morfina, mirofina, nalbufina, narceína, nicomorfina, norlevorfanol, normetadona, nalorfina, normorfina, norpipanona, opio, oxicodona, oximorfona, papaveretum, pentazocina, fenadoxona, fenomorfano, fenazocina, fenoperidina, piminodina, piritramida, proheptazina, promedol, properidina, propiram, propoxifeno, sufentanilo, tilidina, tramadol, o sus mezclas.

3. Formulaciones y Administración

En términos de administración, la vía más adecuada en cada caso depende de la naturaleza y gravedad de la afección o de la formulación farmacéutica que se administre. Los agentes activos descritos en la presente memoria se pueden formular para su administración en un vehículo farmacéutico según técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Remington, The Science And Practice of Pharmacy (última edición).

Las composiciones de la presente invención pueden resultar adecuadas y se pueden formular para administración parenteral, oral, aerosol para inhalación, tópica (es decir, tanto en superficies cutáneas como mucosas, incluidas las superficies de las vías respiratorias), rectal, nasal, bucal (por ejemplo, sublingual), vaginal o en recipientes implantados, etc., donde la vía más adecuada en un caso dado depende de la naturaleza y gravedad de la afección que se trata en combinación con el perfil farmacológico del compuesto descrito en la presente memoria, tal como comprenderá la persona con conocimientos ordinarios en la técnica.

Para administración tópica, las formas adecuadas incluyen, entre otras, una pomada, crema, emulsión, microemulsión, gel, dispersión, suspensión, espuma, aerosol, líquido, gota y sistemas adecuados de administración transdérmica conocidos en la técnica, tales como parches y vendas, apósitos, gasas y similares que incluyan el medicamento descrito en la presente memoria. La administración tópica puede incluir además prendas de vestir, tales como calcetines o medias que incluyan el medicamento descrito en la presente memoria.

El término "parenteral" como se usa en la presente memoria incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intradérmica, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraarticular, intrasinovial, intrasternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal.

Las composiciones inyectables incluyen el principio activo junto con vehículos adecuados, tales como propilenglicolalcohol-agua, agua isotónica, agua estéril para inyección (USP), emulPhorTM-alcohol-agua, cremophor-ELTM, polivinilpirrolidona, lecitina, aceite de araquis o aceite de sésamo, pudiendo incluir también otros aditivos para favorecer la solubilidad o conservación, u otros vehículos adecuados conocidos por los expertos en la técnica. Por consiguiente, estos vehículos se pueden utilizar solos o en combinación con otros agentes solubilizantes convencionales, tales como etanol, propilenglicol u otros agentes conocidos por los expertos en la técnica.

Las composiciones para administración oral pueden ser, por ejemplo, preparaciones sólidas tales como comprimidos, comprimidos revestidos de azúcar, cápsulas duras, cápsulas blandas, gránulos, polvos, gelatinas y similares, con vehículos y aditivos adecuados tales como almidones, azúcares, aglutinantes, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, agentes de desintegración y similares. Debido a su facilidad de uso y al mayor cumplimiento por parte del paciente, los comprimidos y las cápsulas representan las formas de dosificación oral más ventajosas para muchas afecciones médicas.

Del mismo modo, las composiciones para preparaciones líquidas incluyen disoluciones, emulsiones, dispersiones, suspensiones, jarabes, elixires y similares con vehículos y aditivos adecuados tales como agua, alcoholes, aceites, glicoles, conservantes, aromatizantes, agentes colorantes, agentes de suspensión y similares.

Cuando los compuestos descritos en la presente memoria se deban aplicar en forma de disoluciones o inyecciones, se pueden utilizar disolviendo o suspendiendo en cualquier diluyente convencional. Los diluyentes pueden incluir, por ejemplo, disolución salina fisiológica, disolución de Ringer, una disolución acuosa de glucosa, una disolución acuosa de dextrosa, un alcohol, un éster de ácido graso, glicerol, un glicol, un aceite derivado de fuentes vegetales o animales, una parafina y similares. Estas preparaciones se pueden preparar según cualquier método convencional conocido por los expertos en la técnica.

Las composiciones para administración nasal se pueden formular como aerosoles, gotas, polvos y geles. Las formulaciones en aerosol suelen comprender una disolución o suspensión final del principio activo en un disolvente acuoso o no acuoso fisiológicamente aceptable. Dichas formulaciones se presentan típicamente en cantidades de monodosis o multidosis de forma estéril en un recipiente sellado. El recipiente sellado puede ser un cartucho o un recambio para su uso con un dispositivo atomizador. Alternativamente, el recipiente sellado puede ser un dispositivo dispensador unitario, tal como un inhalador nasal de un solo uso, un atomizador de bomba o un dispensador de aerosol equipado con una válvula dosificadora ajustada para suministrar una cantidad terapéuticamente eficaz, que se destina a su eliminación una vez que el contenido se ha utilizado por completo. Cuando la forma de dosificación comprende un dispensador de aerosol, contiene un propelente, tal como un gas comprimido, aire por ejemplo, o un propelente orgánico, incluido un fluoroclorohidrocarburo o un fluorohidrocarburo. Las composiciones adecuadas para administración bucal o sublingual incluyen comprimidos, pastillas, gelatinas y pastillas, en las que el principio activo se formula con un vehículo tal como azúcar y acacia, tragacanto o gelatina y glicerina.

En realizaciones particulares, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica que incluye el compuesto descrito en la presente memoria en el que la formulación farmacéutica es una formulación parenteral. En algunas realizaciones, la formulación parenteral es una formulación intravenosa. En algunas realizaciones, la formulación parenteral es una formulación intraperitoneal. En otras realizaciones, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica que incluye el compuesto descrito en la presente memoria en el que la formulación farmacéutica es una formulación oral.

Los métodos que utilizan la presente invención incluyen la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición de la presente invención tal como se describe con anterioridad. La cantidad eficaz de la composición, cuyo uso se encuentra en el ámbito de la presente invención, variará algo de sujeto a sujeto, y depende de factores tales como la edad, condición del sujeto y la vía de administración. Dichas dosificaciones se pueden determinar según procedimientos farmacológicos rutinarios conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los agentes activos de la presente invención se pueden administrar al sujeto en una cantidad que varía entre un límite inferior de aproximadamente un 0,01, 0,05, 0,10, 0,50, 1,0, 5,0 o un 10 % y un límite superior de aproximadamente un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % en peso de la composición. En algunas realizaciones, los agentes activos incluyen de aproximadamente un 0,05 a aproximadamente un 95 % en peso de la composición. En otras realizaciones, los agentes activos de aproximadamente un 0,05 a aproximadamente un 60 % en peso de la composición. En otras realizaciones, los agentes activos incluyen de aproximadamente un 0,05 a aproximadamente un 10 % en peso de la composición.

Las realizaciones de la presente invención proporcionan además estuches que comprenden uno o más recipientes con unidades de dosificación farmacéutica que comprenden una cantidad eficaz de ecopipam como antagonista de receptor D1, al menos un agonista de receptor D3 y opcionalmente un agonista de opioide, en los que el recipiente se envasa con instrucciones opcionales para reducir o revertir el aumento derivado del tratamiento de Síndrome de Piernas Inquietas.

"Sujetos", como se usa en la presente memoria, son generalmente sujetos humanos e incluyen, sin limitación, "pacientes". Los sujetos pueden ser hombres o mujeres y pueden ser de cualquier raza o etnia, incluyendo, sin limitación, caucásicos, afroamericanos, africanos, asiáticos, hispanos, indios, etc. Los sujetos pueden ser de cualquier edad, incluyendo recién nacidos, neonatos, lactantes, niños, jóvenes, adolescentes, adultos y geriátricos. Los sujetos también pueden ser animales, en particular mamíferos tales como caninos, felinos, bovinos, caprinos, equinos, ovinos, porcinos, roedores (por ejemplo, ratas y ratones), lagomorfos, primates (incluidos primates no humanos), etc., con fines de prevención y tratamiento, así como también de medicina veterinaria y/o desarrollo de fármacos. Los sujetos pueden incluir aquellos con SPI o riesgo de padecerlo. Los sujetos también pueden incluir aquellos que han experimentado aumento previo (con una, dos, tres, cuatro o más terapias) o aquellos que no han experimentado aumento.

4. Métodos de uso (no forman parte de la invención)

Se describen ejemplos de métodos de tratamiento o prevención de SPI que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, administrar a un sujeto una cantidad eficaz de ecopipam como antagonista de receptor D1 de dopamina. Los antagonistas de receptor D1 incluyen ecopipam (SCH 39166), SCH 23390, SKF 83566, o mezclas de los mismos.

A título informativo, también se describen métodos para tratar o prevenir el dolor crónico no dependiente de opioide que comprenden, consisten o consisten esencialmente en administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de D1 de dopamina. El dolor crónico incluye, sin limitación, dolor inflamatorio crónico, dolor neuropático crónico o una combinación de los mismos.

También se describen métodos para tratar o prevenir SPI que comprenden, consisten o consisten esencialmente en administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de receptor D1 de dopamina en combinación con un agonista de receptor D3. Los agonistas de receptor D3 incluyen, sin limitación, nafadotrida, PD 128907, pramipexol, pergolida, rotigotina, o mezclas de los mismos.

Se describen además métodos de tratamiento o prevención de dolor crónico no dependiente de opioide que comprenden, consisten esencialmente o consisten en administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de receptor D1 de dopamina en combinación con un agonista de receptor D3.

También se describen métodos para tratar o prevenir la sobreexcitabilidad del sistema nervioso que comprenden, consisten esencialmente o consisten en administrar a un sujeto una cantidad eficaz de antagonista de receptor D1 de dopamina en combinación con un agonista de receptor D3, en los que la sobreexcitabilidad está motivada por la exposición prolongada a un agonista de receptor D3.

También se describen métodos para restaurar la capacidad de respuesta o disminuir la tolerancia a un agonista de receptor D3, de forma que el método comprende, consiste esencialmente en, o consiste en activar un mecanismo de receptor D3 e inhibir la actividad de receptor D1 después del aumento mediado por receptor D3.

También se hace referencia a métodos para restaurar la capacidad de respuesta o disminuir la tolerancia a un agonista de opioide, de forma que el método comprende, consiste esencialmente o consiste en activar un mecanismo de receptor D3 e inhibir el receptor D1.

En ejemplos particulares, el sujeto corre el riesgo de sufrir un aumento o lo padece.

Se describen métodos para prevenir el aumento, en particular, asociado a la terapia con levodopa o agonistas dopaminérgicos, que comprenden, consisten esencialmente o consisten en administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de receptor D1 de dopamina. En algunas realizaciones, los métodos de prevención del aumento asociado a terapia con levodopa o con agonistas dopaminérgicos comprenden, consisten esencialmente o consisten en administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de receptor D1 de dopamina en combinación con un agonista de receptor D3.

El método puede incluir además la administración de un agonista de receptor de opioide. En realizaciones particulares, el agonista de opioide incluye, sin limitación, alilprodina, alfaprodina, anileridina, bencilmorfina, bezitramida, buprenorfina, butorfanol, clonitaceno, codeína, desomorfina, dextromoramida, dezocina, diampromida, diamorfina, dihidrocodeína, dihidromorfina, dimenoxadol, dimefeptanol, dimetiltiambuteno, butirato de dioxafetilo, dipipanona, eptazocina, etoheptazina, etilmetiltiambuteno, etilmorfina, etonitaceno fentanilo, heroína, hidrocodona, hidromorfona, hidroxipetidina, isometadona, cetobemidona, levorfanol, levofenacilmorfano, lofentanilo, meperidina, meptazinol, metazocina, metadona, metopón, morfina, mirofina, nalbufina, narceína, nicomorfina, norlevorfanol, normetadona, nalorfina, normorfina, norpipanona, opio, oxicodona, oximorfona, papaveretum, pentazocina, fenadoxona, fenomorfano, fenazocina, fenoperidina, piminodina, piritramida, proheptazina, promedol, properidina, propiram, propoxifeno, sufentanilo, tilidina, tramadol, o sus mezclas.

La dosificación eficaz de cualquier agente activo específico varía bastante de una composición a otra, de un paciente a otro, y depende de la condición del paciente y la vía de administración. Como propuesta general, una dosificación de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg tiene eficacia terapéutica, pudiéndose emplear dosificaciones aún mayores para administración oral, en la que la administración en forma de aerosol suele ser inferior a la oral o intravenosa. Las preocupaciones relativas a la toxicidad en el nivel más elevado pueden restringir las dosificaciones intravenosas a un nivel más bajo tal como hasta aproximadamente 10 mg/kg, estando todos los pesos calculados basados en el peso de base activa, incluyendo los casos en los que se emplea una sal. Típicamente se emplea una dosificación de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg para administración intravenosa o intramuscular. Para administración oral se puede emplear una dosis de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg.

En ejemplos particulares, la administración a un sujeto tal como una persona, se puede emplear una dosificación de aproximadamente 0,01, 0,1, o 1 mg/kg hasta 50, 100, o 150 mg/kg o más para cada agente activo. Dependiendo de la solubilidad de la formulación particular de los agentes activos administrados, la dosis diaria se puede dividir entre una o varias administraciones de dosis unitarias.

La invención se define en las reivindicaciones y se ilustra con referencia a determinados ejemplos, que se incluyen en la presente memoria únicamente con fines ilustrativos y que no pretenden ser limitantes de la invención.

Ejemplos

Síndrome de Piernas Inquietas (SPI): SPI es una dolencia sensoriomotora frecuente que no se comprende del todo y, aunque se ha avanzado sustancialmente en la identificación de marcadores genéticos asociados a SPI [5, 37-42], sus orígenes fisiopatológicos siguen sin estar claros; esto dificulta el desarrollo de tratamientos farmacológicos que no sólo cubran los síntomas, sino que puedan llegar a "curar" este trastorno. En términos de circuitos neuronales subyacentes que intervienen en SPI, las teorías más populares se centran en una disfunción del sistema de hierro en los ganglios basales, que a su vez modifica el sistema dopaminérgico (DA) [43-46]. Sin embargo, los ganglios basales sólo desempeñan un papel menor, si lo hubiera, en la nocicepción y en los mecanismos de señalización del dolor, y sin embargo todos los síntomas principales descritos por los pacientes con SPI se centran en síntomas sensoriales alterados que van de incomodidad a dolor en las extremidades afectadas. Los siguientes síntomas sensoriales deben estar presentes en su totalidad para clasificar a un paciente como SPI: 1) necesidad imperiosa de mover las piernas, acompañada de sensaciones incómodas o desagradables en las piernas; 2) esta necesidad imperiosa de moverse comienza o empeora durante los periodos de reposo o inactividad; 3) esta necesidad imperiosa de moverse se alivia parcial o totalmente con el movimiento, al menos mientras dura la actividad; 4) la necesidad imperiosa de moverse sólo se produce o empeora por la tarde o por la noche. Finalmente, 5) ninguno de estos criterios puede ser principal con respecto a ninguna otra afección médica, tal como estasis venosa, edema de piernas, calambres o similares [47]. La atención prestada a los aspectos sensoriales de SPI apunta a un papel de la médula espinal, ya que es el eje primario de la vía de nocicepción y mecanismo de procesad del dolor [48, 49].

Sistema de receptor D3: SPI es una enfermedad crónica y se trata con medicamentos sintomáticos que probablemente sean necesarios durante toda la vida del paciente [28]. El tratamiento principal se dirige a los sistemas dopaminérgicos de SNC y tiene como objetivo la activación de los receptores de tipo D2 (en particular el subtipo de receptor D3, D3R). Esta terapia suele ser muy eficaz y puede actuar con rapidez a partir de la primera noche de tratamiento [19]. Sin embargo, múltiples líneas de evidencia han demostrado que los agonistas de receptor DA con el tiempo no sólo pierden su eficacia, sino que de hecho empeoran los síntomas existentes de SPI, provocando así un aumento [22, 25, 26, 50]. D3R es actualmente la diana principal en el tratamiento de SPI, y los agonistas preferentes de D3R pramipexol y rotigotina tienen una eficacia sobresaliente en la terapia inicial [14, 19, 51-56]. Sin embargo, con el tiempo estas terapias suelen disminuir su eficacia y se traducen en efectos adversos y aumento [21,22, 25, 26, 50].

Diversidad de acciones de receptor DA: Las acciones de DA se producen a través de receptores tipo D1 (D1R y D5R) y D2 (D2R, D3R y D4R). Los receptores tipo D1 se acoplan a mecanismos de GPCR de excitación, mientras que los receptores tipo D2 se unen a GPCR de inhibición. Es importante destacar que D3R puede desarrollar un fenotipo de tolerancia dependiente de agonista que viene acompañado de cambios en la conformación del receptor [57-60]. Resulta tentador especular que el desarrollo del aumento observado en pacientes con SPI puede ser resultado de la tolerancia a D3R y de los cambios que la acompañan en el sistema de mecanismo de segundo mensajero.

D3R y D1R pueden mostrar interacciones funcionales basadas en configuraciones de hetero-dímero [61-65] o heterotetrámero [66]. En médula espinal murina, D1R se expresa prominentemente en el asta ventral [67, 68], y están bien estudiado en el contexto de sistemas motores. Por ejemplo, la activación de D1R tiende a aumentar la excitabilidad o el rendimiento de las redes neuronales que subyacen o controlan la locomoción ficticia [69-72]. Por el contrario, los antagonistas de D1R disminuyen la hiper-locomoción en esquizofrenia [73], y actualmente se están sometiendo a ensayo clínico, para el tratamiento de tics en Síndrome de Tourette [74, 75]. Estos últimos estudios subrayan el papel potencial de los antagonistas de D1R en la reducción de la excitabilidad general de los sistemas motores, pero su posible papel en la mediación de función sensorial permanece en gran medida inexplorado.

Ratón nuligénico de receptor D1 (D1K0): los inventores utilizan un modelo de ratón transgénico disponible en el mercado para someter a ensayo y verificar sus hipótesis. Desarrollado originalmente para estudiar el papel de D1R en el cuerpo estriado [76], los animales están sanos y no presentan anomalías macroscópicas [77]. De manera intrigante, los informes indican que los ratones D1K0 muestran valores reducidos de actividad motora general [78, 79].

Con anterioridad los inventores informaron sobre el aspecto de que una disfunción del sistema D3R está asociada a una disminución significativa de las latencias de retirada de dolor térmico en el animal intacto, lo cual se manifestaba en la médula espinal en una disminución de la adaptación a la frecuencia mediada por fibra C [80]. Estos datos sugerían que D3R desempeña un importante papel en el control de modulación del dolor, y los inventores propusieron el ratón nuligénico de D3R (D3KO) como posible modelo de sensibilidad nociceptiva aumentada. En un estudio posterior, los inventores presentaron evidencias de que los ratones D3KO tenían mayores niveles de expresión de proteína D1R en la médula espinal, el punto principal de integración y procesado del mecanismo de nocicepción, y propusieron un modelo en el que la disfunción del sistema D3R se traduce en una regulación al alza del mecanismo D1R [81], cuya modificación sentó las bases para el presente estudio (Figura 1).

SPI se trata sintomáticamente con agonistas de D3R que pierden su eficacia con el tiempo, lo que se traduce en aumento. Por tanto, en primer lugar los inventores sometieron a ensayo los efectos de los agonistas de D3R utilizados en la clínica de reflejos de retirada de dolor en un contexto agudo, en animales de tipo salvaje (WT) y posteriormente sometieron a ensayo los efectos de un bloqueo agudo de la función D1R en los mismos animales (Figura 2).

Ejemplo 1

Someter a ensayo la hipótesis de que el tratamiento a largo plazo con agonistas de D3R en el animal intacto se traduce en aumento que se puede restaurar mediante bloqueo de la función D1R.

El objetivo de estos estudios es establecer el papel que desempeña el sistema de receptor D1 de dopamina en la aparición del aumento inducido por agonista-receptor D3. La hipótesis de trabajo es que la aplicación continua a largo plazo de un agonista de receptor D3 induce un cambio de inhibición a excitación. En concreto, los inventores tratan a los animales con agonistas de receptor D3 utilizados actualmente para el tratamiento de SPI (por ejemplo, pramipexol y rotigotina) y evalúan los efectos de estos compuestos sobre las latencias de retirada en las patas cuando los animales son sometidos a un estímulo térmico doloroso. Los inventores predicen que el efecto inicialmente analgésico (prolongación de las latencias de retirada) de D3R es sustituido con el tiempo por un efecto hiperalgésico (disminución de las latencias de retirada).

Los inventores observaron que tanto el agonista de D3R como el antagonista de D1R aumentaban las latencias de retirada térmica (pramipexol [ppx]; 0,5 mg/kg: a 152,9+/-2,8 % del control; SCH 39166; 0,1 mg/kg: a 131 /-6,5 % del control). El tratamiento combinado de ppx y SCH 39166 aumentó aún más las latencias a 185+/-7,9 % del control (p=0,001, RM ANOVA). Estos datos apoyan la hipótesis de que la nocicepción está mediada por los mecanismos tanto de DR3 como de D1R. A continuación, los inventores sometieron a ensayo los efectos de exposición prolongada a agonista de D3R en WT, y la consecuencia de un bloqueo de la función D1R tras esta exposición a largo plazo (Figura 3). Se sometieron a ensayo las latencias de retirada en el día 1 (barra gris claro de la Figura 3A) y al final de un experimento de 4 semanas de duración, en el que los animales se sometieron a inyecciones i.p. diarias (7 días/semana, barra blanca de la Figura 3B). Descubrieron que esta exposición continua al agonista de D3R no sólo redujo significativamente las latencias de retirada en comparación con la exposición única a agonista de D3R en el día 1, sino que fue suficiente para inducir un cambio del efecto analgésico agudo a una respuesta hiperalgésica en comparación con la simulación (barra negra de la Figura 3A), lo que sugiere un aumento de la sensibilidad térmica mediada por fibra C.

Además, el bloqueo posterior de la función D1R aumentó significativamente las latencias de retirada y las devolvió a los valores de control obtenidos antes del inicio del experimento (Figura 3B). Este rescate del estado "hiperalgésico" sugiere que la función o los niveles de D1R pueden estar regulados al alza en los animales tratados con D3R. Para someter a ensayo esta hipótesis, los inventores midieron los niveles de expresión de proteína D1R en médula espinal lumbar. Encontraron que las inyecciones i.p. repetidas de agonista de D3R dieron lugar a un aumento de la expresión de proteína D1R en los animales tratados (Figura 4).

En conjunto, estos datos sugieren que la aplicación sistémica de agonista de D3R puede conducir a dos resultados diferentes, dependiendo del marco temporal de tratamiento: la aplicación aguda puede tener efectos analgésicos de acción rápida, ya que aumenta significativamente las latencias de reflejo de retirada térmica y, por tanto, disminuye la sensibilidad térmica al dolor. En cambio, los tratamientos de mayor duración con agonista de D3R pueden producir el efecto contrario, es decir, una disminución de las latencias de retirada y, por tanto, un aumento de la sensibilidad térmica al dolor. Estos datos sugieren que el modelo de ratón con exposición prolongada a agonista de D3R de los inventores podría ser una representación adecuada de fenotipo aumentado en SPI.

Hay que abordar el papel de exposición a corto y largo plazo a agonistas de D3R y antagonistas de D1R y sus interacciones en los reflejos térmicos (asociados a fibras de dolor) in vivo y evaluar post mortem los cambios correspondientes en la expresión de proteína de receptor de DA en el perfil inmunohistológico de médula espinal in vitro,

Animales: Para este estudio de ensayo de concepto los inventores utilizaron ratones machos nuligénicos C57BL/6 de tipo salvaje (WT) y de receptor de ^d 1 (D1K0; B6.129S4-Drd1atm1Jcd/J, Jackson Laboratories) de 3-4 meses de edad. Basándose en su experiencia pasada anterior y en un análisis de potencia, los inventores esperan utilizar para este objetivo en el mejor de los casos 120 animales y en el peor de los casos 160 animales de cada cepa WT y D1K0 (240­ 320 animales en total). En cada cepa, los animales se agrupan de manera fortuita y se distribuyen de manera uniforme en 4 cohortes con 5 subgrupos (a-e), y 6-8 animales/subgrupo (s. diagrama de flujo de la Figura 5).

Evaluación de las latencias basales de los reflejos de retirada de dolor ("dolor térmico"): SPI es ante todo un trastorno sensorial que va acompañado de un componente motor. Las sensaciones clínicas ("necesidad de moverse") proceden de los tejidos musculares profundos y muchos pacientes, si no la mayoría, las consideran "dolorosas", a menos que actúen de forma inmediata (movimiento las extremidades). El dolor procedente de los músculos profundos es transmitido tanto por fibras C no mielinadas (peptidérgicas y no peptidérgicas) como por fibras a-8. El dolor debido a energía de estímulo térmico es transmitido específicamente por subconjuntos de estos nociceptores que expresan la proteína de potencial receptor transitorio V1 (TRPV1). Estos nociceptores que expresan TRPV1 también tienen una amplia distribución cutánea y se activan fácilmente por medio de una fuente térmica aplicada a la superficie cutánea. Por tanto, el estímulo de dolor térmico sometido a ensayo en el aparato Hargreaves (CITI, Inc., Life Science, Modelo 39D) proporciona un sustituto adecuado para controlar los cambios de actividad nociceptora del músculo profundo que puedan estar presentes en SPI, y las latencias para retirar la pata trasera procedentes de un estímulo térmico nocivo aplicado a la superficie plantar de la pata trasera proporcionan una medida de la sensibilidad al dolor. Los animales se sacan de sus jaulas y se colocan individualmente en pequeños recipientes Plexilas del sistema Hargreave (4" (10,2 cm) de anchura x 4" (10,2 cm) de longitud x 5” (12,7 cm) de altura). La sala de conducta tiene ajustes opcionales de luz baja para minimizar las perturbaciones visuales. Cada día, los animales se aclimatan en la plataforma Hargreaves durante 1-2 horas. Posteriormente, se determinan las latencias de retirada de referencia de cada animal, se llevan a cabo cinco ensayos independientes por cada pata trasera y sesión y se calcula la latencia media de cada día. Los ensayos se administran a lo largo de 4 días.

Protocolo de inyección de fármaco: Tras establecer los parámetros de referencia, cada animal recibe diariamente en las semanas 1-4 una inyección i.p. de un único fármaco del compuesto respectivo: NaCl al 0,9 % (simulacro), el agonista de D3R (pramipexol) a 0,1 o 0,5 mg/kg, o el antagonista de D1R ecopipam (SCH 31966) a 0,1 mg/kg, y se somete a ensayo la tolerancia a la retirada de dolor térmico (detalles en el diagrama de flujo, Figura 5). A estas concentraciones, los inventores observan en sus estudios preliminares cambios tanto en el comportamiento como en la expresión de proteína receptora que se exploran con más detalle a continuación. Cada cohorte se trata de forma independiente de la otra, pero todos los animales reciben sus respectivas inyecciones i.p. diariamente (7 días / semana) entre las 9-11 am de la mañana, para evitar posibles conflictos con el ciclo circadiano [82]. Los reflejos de retirada de dolor térmico se someten a ensayo como se ha mostrado anteriormente en los 4 días posteriores por semana por la tarde, partiendo del segundo día de las inyecciones de fármaco. Los subgrupos a) de cada cohorte se sacrifican después de 1 semana, y los subgrupos b) - d) continúan en intervalos de 1 semana (Figura 5).

Después de la semana 4, los subgrupos (e) de las cohortes 1 y 4 siguen recibiendo sus respectivas inyecciones de un único fármaco (simulacro frente a SCH 39166) y se someten a los mismos ensayos que anteriormente en las semanas 5 y 6 antes de ser sacrificados después de la semana 6. En cambio, los animales de la cohorte 2 reciben un paradigma de dos fármacos en una única inyección, incluyendo pramipexol (0,1 mg/kg) SCH 39166 (0,1 mg/kg), mientras que los animales de la cohorte 3 reciben pramipexol (0,5 mg/kg) SCH 39166 (0,1 mg/kg). Los ensayos conductuales se llevan a cabo como con los animales de las cohortes 1 y 4. Al final de las 6 semanas, se anestesia a los animales de manera profunda y se sacrifican.

Análisis y Recogida Tisular: Dos horas después de la conclusión del último ensayo de comportamiento de cada semana y subgrupo, se anestesia a los animales de manera profunda con isoflurano inhalado (4-5 %), se decapitan y diseccionan sus médulas espinales, se cortan horizontalmente para separar las partes dorsal y ventral, se congelan en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 °C. Las proteínas se homogeneizan en tampón RIPA que contiene inhibidores de proteasa y fosfatasa (Sigma-Aldrich, St. Lois, MO), se centrifugan las fracciones de lisis y se recoge el sobrenadante. La proteína total se cuantifica utilizando un estuche de cuantificación EZQ (R33200; Invitrogen, Grand Island, NY). Se separan concentraciones iguales de proteína mediante SDS-PAGE (Criterion TGX Any kD, Bio-Rad, Canton, MA) y se transfieren a una membrana de PVDF (Immobolin-P, Millipore, Alemania). Para verificar que la transferencia de proteína es homogénea en todas las rutas, se mide la tinción de proteína total de la membrana con azul de Coomassie en las correspondientes rutas.

Según los resultados preliminares, el tratamiento prolongado con agonistas de D3R modifica las respuestas de reflejo térmico en las extremidades posteriores, que están mediadas en la médula espinal lumbar. Por tanto, los inventores analizan la expresión de proteína D1R y D3R en esta parte específica de SNC. Para las evaluaciones de proteína D1R, las membranas se bloquean durante la noche utilizando un 5 % de BSA a 4° C y se someten a tratamiento con sonda con anticuerpos primarios para D1R (ab81296, Abcam, Cambridge, MA) a 1:1000 durante la noche. Los inventores han verificado este anticuerpo en los experimentos de control con tejidos cerebrales de ratones nuligénicos D1R (D1K0; donado por la Dra. Rosario Moratalla, Instituto Cajal, Madrid, España [83]). Las membranas se lavan 4 veces a 5 minutos en TBS-T y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente utilizando BSA al 5 % en anticuerpos secundarios IR800 anti-conejo (35571, Thermo Scientific, Rockford, IL) e IR680 anti-ratón (926-68070, Li­ Cor, Lincoln, NE) a 1:30000. A continuación, las membranas se lavan otras 3 veces durante 5 min en TBS-T, seguido de 2 lavados a 5 min en PBS. Las proteínas diana se visualizan utilizando el sistema de detección Li-Cor (Odyssey Clx, Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE) y se analizan con el software asociado (Image Studio, Li-Cor) o con ImageJ (NIH). A continuación, los valores de expresión de proteína D1R se normalizan con respecto a la expresión de proteína total (Coomassie). Para la evaluación de la expresión de proteína D3R, los inventores siguen el mismo protocolo, pero en su lugar los inventores utilizan un anticuerpo primario para D3R (ab42114, Abcam).

Resultados esperados (in vivo): los datos preliminares in vivo de los inventores, que proceden únicamente de dos puntos temporales (tratamiento agudo y tras exposición a D3R a largo plazo, Figuras 2 y 3) indican no sólo la viabilidad del enfoque de los inventores, sino también sugieren un posible resultado favorable. Los inventores esperan:

1) establecer en ratones WT que el tratamiento continuo con un agonista de D3R dé lugar a dos resultados conductuales diferentes cuando se somete a ensayo la sensibilidad al dolor térmico: la aplicación a corto plazo (menos de 1-2 semanas) tiene como resultado un aumento de las latencias de retirada, lo que indica una disminución de sensibilidad y, de este modo, un efecto analgésico del fármaco. Por el contrario, la aplicación a largo plazo (3-4 semanas) invierte gradualmente este efecto y se traduce en una disminución progresiva de las latencias de retirada y un aumento de sensibilidad, lo que indica una sensibilidad anormalmente elevada frente al estímulo térmico aplicado. Los inventores esperan que este cambio en el resultado conductual imite los resultados de aumento observados en la clínica. Los inventores predicen además que este cambio depende de la dosis, y que el tratamiento con pramipexol a dosis bajas (0,1 mg/kg) aplicado a la cohorte 2 requiere un tiempo más prolongado para desarrollar el cambio, posiblemente hasta las semanas 3 y 4.

2) establecer en WT que el tratamiento adyuvante con antagonista de D1 R SCH 39166 (ecopipam) a las cohortes 2 y 3 revierte su estado "aumentado" en la sensibilidad al dolor térmico y devuelve las latencias de retirada a las observadas en los controles y/o a las observadas durante el tratamiento inicial con los agonistas de D3R.

3) establecer que los animales D1K0 responden al agonista de D3R (cohortes 2' y 3') a lo largo de las 4 semanas de tratamiento con un aumento persistente de las latencias de retirada de dolor, sin pasar a un estado "aumentado" y que este depende de la dosis de concentraciones bajas o altas de pramipexol.

4) establecer que el cambio al estado "aumentado" depende del receptor D1, ya que D1K0 no cambia sus respuestas al agonista de D3R con el tiempo.

Resultados previstos (in vitro): Los inventores detectan fácilmente cambios en la expresión de receptor DA en médula espinal [81]. Predicen que las respuestas conductuales observadas se reflejan en cambios en la expresión de proteína D1R y D3R en médula espinal.

De manera específica, los inventores esperan que el tratamiento a corto plazo (1 -2 semanas) conduzca en las cohortes 2 y 3 a un aumento dependiente de la dosis en la expresión de D3R, y a una disminución paralela en la expresión de proteína D1R. Prevén que este cambio en los niveles de expresión proteica se invierte en las semanas 3 y 4, con un aumento de los niveles de D1R y una disminución de los niveles de D3R.

Análisis Estadístico: Para los experimentos conductuales, las latencias de retirada en condiciones de fármaco se promedian y normalizan con respecto a la media de los valores previos de fármaco, y la significación estadística se determina con ANOVA RM y comparaciones posteriores post-hoc, según proceda, y con un conjunto a < 0,05 (SigmaPlot, Systat, San Jose, CA). Para el análisis de datos de inmunotransferencia, se utiliza el ensayo ANOVA de una vía para evaluar la significación, y se identifican las diferencias de grupo con las comparaciones apropiadas posthoc (por ejemplo, Holm-Sidak).

Ejemplo 2

Someter a ensayo la hipótesis de que la médula espinal aislada contiene todos los componentes necesarios para inducir, y recuperarse de, el aumento mediado por agonistas de D3R.

El objetivo del presente estudio consiste en establecer que la médula espinal aislada alberga la maquinaria celular y los circuitos neuronales necesarios para implementar los cambios de modulación inducidos por agonista de D3R que conducen a cambios conductuales observados in vivo. Los inventores someten a ensayo la hipótesis de que la aplicación prolongada en baño de un agonista de D3R induce una respuesta moduladora bifásica (de inhibición a excitación) en la médula espinal aislada. Específicamente, se evalúan los cambios de amplitudes del reflejo espinal (SRAs), utilizando el reflejo de estiramiento monosináptico en la médula espinal lumbar como modelo de la función de circuito neural. Los inventores predicen que la aplicación de D3R reduce inicialmente los valores de SRA en animales WT y D1KO por igual, y que este efecto modulador cambia gradualmente con el tiempo sólo en WT para posteriormente aumentar los valores de SRA. El fundamento de este objetivo consiste en demostrar que el circuito neural de SNC y, en particular, de médula espinal es suficiente para explicar los cambios conductuales observados en el animal intacto.

Una preocupación primordial de la terapia con cualquier fármaco es el desarrollo de efectos secundarios no deseados o perjudiciales. La aplicación sistémica de cualquier compuesto médico ingerido por vía oral, inyectable o por vía cutánea mediante un parche de liberación lenta puede tener efectos en múltiples tejidos orgánicos.

SPI es un trastorno neurológico en el que la médula espinal sirve como primer lugar de integración de los síntomas sensoriales y proporciona un circuito neural único, el reflejo de estiramiento monosináptico, que se puede aislar, identificar y mantener funcionalmente vivo en médula espinal aislada in vitro para someter a ensayo las acciones de neurotransmisores y moduladores selectos sobre este circuito [92-95]. Los experimentos aprovechan esta accesibilidad y funcionalidad y determinan las acciones y la evolución temporal de las acciones de los agonistas de D3R sobre SRAs con estimulación extracelular y técnicas de registro. Esto establece si las acciones moduladoras opuestas de agonista de D3R observadas en la clínica y en el enfoque in vivo de los inventores pueden surgir únicamente del interior de SNC.

Los inventores han demostrado en su trabajo publicado que DA tiene un efecto dependiente de la dosis en un generador de patrón central espinal, con dosis bajas y acciones de inhibición mediadas por receptores de tipo D2 (incluyendo D3R), mientras que las dosis altas y las acciones de excitación fueron mediadas por D1Rs [69]. Los inventores presentan datos que apoyan estas acciones moduladoras diferentes, y pueden mostrar que la activación con el agonista de D3R, pergolida, disminuyen significativamente los valores de SRAs mientras que la activación de D1R con SKF 38393 los aumentan de forma significativa (Figura 6A). Más importante aún, los inventores encuentran que la activación prolongada de D3R en médula espinal aislada (> 3 horas) se traducen en un incremento posterior de SRA, que fue posible revertir con la adición al baño de un antagonista de D1R (Figura 6B).

Animales: Se utilizan crías neonatales WT y D1K0 de ambos sexos, de entre 5 y 14 días de edad.

Diseño experimental:

Los animales se anestesian con cetamina/xilacina y se decapitan, y la médula espinal se disecciona con precaución de la cavidad corporal y se coloca en una placa Petri revestida de Sylgard (Dow Corning, Midland MI) en líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) enfriado (< 4° C) que contiene (en mM); 125 NaCl, 2,5 KCI, 2 CaCl² , 1 MgCl² , 25 glucosa, 1,25 NaH₂PÜ4, y 26 NaHCÜ3 a un pH de 7,4, se oxigena con un 95 % de O² - 5 % de CO². T ras abrir y retirar la duramadre, para facilitar el acceso de ACSF a la médula, se identifican las raíces dorsales y ventrales y se pinzan con pequeños alfileres para insectos. Las preparaciones se dejan intactas (en animales de menos de 7 días) o se someten a hemisección sagital media (animales de más de 1 semana) [80, 92]. La hemisección en los animales de más edad contribuye a oxigenar mejor el tejido y prolonga la esperanza de vida de la preparación aislada. En estas condiciones, los inventores pueden mantener la médula espinal funcionalmente viva durante más de 24 horas, y son capaces de someter a ensayo los valores de SRA en preparaciones individuales durante 48 horas. Tras una recuperación de 30-60 minutos a temperatura ambiente, se colocan electrodos de succión de vidrio en las partes distales de las raíces dorsales y ventrales de los segmentos lumbares L2-L5. Tras establecer la estabilidad de las conexiones de electrodo con las raíces, se estimulan las raíces dorsales con pulsos de corriente de 250-500 pA de amplitud y 100-500 ps de duración, para activar las fibras-C, A8 asociadas a dolor y de alto umbral y se registran las respuestas reflejas asociadas (reflejo de estiramiento monosináptico, MSR; y de latencia más larga, LLR) en las raíces ventrales con un Digidata 1440 utilizando el software pClamp 10 (Axon Instr., Union City, CA, EE. UU.) [13, 80]. Los registros de SRA duran 30 min por intervalo, y los intervalos se repiten según sea necesario, para incluir y comparar las acciones moduladoras posteriores con las anteriores. Para los análisis, las respuestas reflejas se rectifican y las integrales calculadas de estas respuestas se miden y comparan entre intervalos de idéntica duración antes y después de la aplicación de fármaco. Para evaluaciones a corto plazo de los efectos de fármaco, se promedian los diez últimos SRA consecutivos medidos antes de la aplicación de fármaco con los diez últimos SRA consecutivos después de 30 min de aplicación de fármaco por intervalo. Tras establecer los registros de referencia, los inventores aplican mediante baño los compuestos D1R y D3R seleccionados (D1R: SKF 38393 [agonista] y SCH 39166 [antagonista]; D3R: pramipexol, rotigotina [agonistas] y SB27701A [antagonista]) a concentraciones de 0,1-10 μM. Primero se someten a ensayo sus acciones moduladoras individuales sobre los valores de SRA durante periodos de tiempo cortos (menos de 30 minutos) y largos (hasta 24 horas). Tras la evaluación de los efectos moduladores de los fármacos individuales, se emparejan las aplicaciones de agonistas/antagonistas de D1R y D3R. Se aplican combinaciones de fármaco de agonistas de D3R y antagonistas de D1R o antagonistas de D3R y agonistas de D1R para evaluar las interacciones funcionales entre estos dos receptores in vitro.

Los inventores esperan que en la médula espinal aislada WT, la aplicación a corto plazo de agonistas de D3 se traduzca en una disminución de los valores de SRA de manera dependiente de la dosis. Esperan que este efecto modulador sea similar en médula espinal D1KO, lo que sugiere que la función D3R sigue operando en D1KO. Anticipan que la activación prolongada de D3R se traduce en WT en una reversión de la respuesta inicial, mientras que no se ve modificada en cuanto a SRA en D1 KO. Esperan además que el antagonista de D3R altamente selectivo, SB 27701 -A [96], aumente los valores de SRA durante la ventana de aplicación inicial tanto en WR como en D1 KO y que este efecto modulador no se vea modificado con el tiempo en WT o D1 KO. Prevén que la aplicación en baño de antagonista de D1R disminuya los valores de SRA en WT pero no en D1 KO, y que la activación de D1R en médula espinal WT invierta el aumento de SRA inducido por agonista de D3R a largo plazo. En conjunto, estos datos demuestran que tanto D3R como D1R son necesarios para inducir el cambio al estado aumentado, y que el reflejo espinal en la médula espinal podría ser la diana que, in vivo, pudiera mediar acciones similares. Los datos de los inventores también indican que el bloqueo de la función de D1R a nivel de circuito neural resulta suficiente para invertir el cambio de inhibición a excitación durante la exposición prolongada de la médula a D3R. Junto con otros, estos estudios apoyan la hipótesis de los inventores de que el aumento inducido por agonistas de D3R en pacientes con SPI puede ser rescatado por el tratamiento adyuvante con un antagonista de D1R.

Análisis Estadístico: Para los experimentos en médula espinal aislada, se miden los valores de SRA en condiciones de control y de fármaco, y los datos se promedian y normalizan con respecto a la media de los valores previos al fármaco. La significación estadística se determina con ANOVA de una vía y posteriores comparaciones post-hoc o de ensayo-t, según proceda, y con un valor a < 0,05 (SigmaPlot, Systat, San Jose, CA).

Ejemplo 3

Cambios en las latencias de retirada térmica con el tiempo con inyecciones crónicas.

Anteriormente los inventores habían sometido a ensayo únicamente los efectos del agonista de D3R, rotigotina (Neupro). En este caso se añaden ensayos de la segunda opción de tratamiento más usada para SPI, pramipexol (0,5 mg/kg/día), y también establece la evolución temporal del cambio de analgesia a hiperalgesia (Figura 7). La Figura 7A representa los resultados de las mediciones diarias, y la Figura 1B los promedios semanales. Los inventores encuentran que las latencias de retirada frente a un estímulo térmico aumentan significativamente en la semana 1 hasta un 204,81 % ± 6,3 % del control (Figura 7B). Este efecto analgésico disminuyó en las semanas 2 (158 /- 12 % del control) y 3 (135 /- 6,5 % del control) pero se perdió por completo en la semana 4 (85+/11 % del control).

Ejemplo 4

Cambios en las latencias de retirada térmica antes y después de inyecciones con pramipexol.

Los animales se sometieron a ensayo antes y después de una única inyección de agonista de D3R (0,5 mg/kg de pramipexol), tanto antes de la primera inyección en la semana 1 como inmediatamente antes de la última inyección, al cabo de 4 semanas. Esto se hizo para mostrar los efectos del fármaco a corto plazo. La Figura 8A muestra los beneficios inmediatos que una única inyección de agonista de D3R tuvo sobre las latencias de retirada. Las latencias de retirada previas a la inyección de la semana 1 actuaron como referencia y se registraron en valores de un 99,97 % ± 22,8 %. Las latencias de retirada posteriores a la inyección de la semana 1 aumentaron de forma significativa, una hora después de la primera inyección, hasta un 194,65 % ± 27 % (p=0,014, ensayo-t). En contraste, como se muestra en la Figura 8B, después de 4 semanas de inyecciones diarias con pramipexol, el compuesto ha perdido completamente su eficacia inicial, e incluso muestra una tendencia a la disminución (preinyección: un 99,98 /- 19 %; 1 hora después de la inyección: un 75,2 /- 32 %), que no fue significativamente diferente del valor antes de la inyección (p=0.25).

Ejemplo 5

Cambios en las latencias de retirada térmica antes y después de las inyecciones con antagonista de D1R SCH 39166.

Los animales se sometieron a ensayo antes y después de una única inyección de antagonista de D1R, al comienzo del estudio (en la semana 1, Figura 9A), y después del paradigma farmacológico de 4 semanas (Figura 9B). Esto se hizo para demostrar la capacidad de que un antagonista de D1R mantiene su potencial para lograr un beneficio modulador (analgésico), incluso en ausencia de un efecto de agonista de receptor D3. Los inventores encuentran que las latencias de retirada de inyección de grupo no tratado (Figura 9A) aumentan las latencias de retirada de un 100,01 % ± 8,7 % (control) a un 151 /- 13 % una hora después de la inyección (p=0,019, ensayo-t). Este efecto intenso y significativo se mantuvo en animales tratados durante 4 semanas con el agonista de receptor de D3, pramipexol (Figura 9B, antes de la inyección: un 99,9 /- 3 %, 1 hora después de la inyección: un 150 /- 15 %, p= 0,02.

Ejemplo 6

Ensayos a largo plazo de fármacos y combinaciones de fármaco sobre las latencias de retirada.

Ensayos a largo plazo (diariamente durante 4 semanas) de los efectos de los siguientes fármacos y combinaciones de fármaco sobre las latencias de retirada: a) rotigotina (agonista de receptor D3), para repetir los experimentos de evolución temporal con otro agonista de D3; b) antagonista de receptor D1 (SCH 39166), para someter a ensayo si el bloqueo continuado de D1R tiene algún efecto secundario adverso; y c) un tratamiento combinado de antagonista de D1R agonista D3R, para someter a ensayo si se puede evitar el aumento. Los conjuntos de datos actuales de los inventores indican que el agonista de D3R y el tratamiento combinado (D1/D3) tienen un efecto analgésico similar, mientras que el antagonista de DI por sí solo no tiene un efecto significativo.

Ejemplo 7

Estudios de evolución temporal

Se sometió a ensayo el segundo agonista de D3R más utilizado, pramipexol (PPX) y se estableció la evolución temporal gradual de los cambios conductuales durante este tratamiento (Figura 10A), y el presente estudio muestra que la capacidad de respuesta de los animales a un único tratamiento con antagonista de D1R rescata la inhibición original inducida por D3 en animales "aumentados" (Figura 10B).

Bibliografía:

1. Erman, M.K., Selected sleep disorders: restless legs syndrome and períodio limb movement disorder, sleep apnea syndrome, andnarcolepsy. Psychiatr Clin North Am, 2006. 29(4): p. 947-67; abstract viii-ix.

2. Chahine, L.M. and Z.N. Chemali, Restless legs syndrome: a review. CNS Spectr, 2006. 11(7): p. 511-20. 3. Earley, C.J., Latest guidelines and advances for treatment of restless legs syndrome. J Clin Psychiatry, 2014.

75(4): p. e08.

4. Odin, P., M. Mrowka, and M. Shing, Restless legs syndrome. Eur J Neurol, 2002. 9 Suppl 3: p. 59-67.

5. Dauvilliers, Y. and J. Winkelmann, Restless legs syndrome: update on pathogenesis. Curr Opin Pulm Med, 2013. 19(6): p. 594-600.

6. Phillips, B., et al., Prevalence and correlates of restless legs syndrome: results from the 2005 National Sleep Foundation Poli. Chest, 2006. 129(1): p. 76-80.

7. Garcia-Borreguero, D., et al., Algorithms for the diagnosis and treatment of restless legs syndrome in primary care. BMC Neurol, 2011. 11: p. 28.

8. Garcia-Borreguero, D., et al., Epidemiology of restless legs syndrome: the current status. Sleep Med Rev, 2006.

10(3): p. 153-67.

9. Winkelmann, J., et al., Genome-wide association study identifies novel restless legs syndrome susceptibility loci on 2p14 and 16q12.1. PLoS Genet, 2011.7(7): p. e1002171.

10. Schormair, B., et al., PTPRD (protein tyrosine phosphatase receptor type delta) is associated with restless legs syndrome. Nat Genet, 2008. 40(8): p. 946-8.

11. Xiong, L., et al., Moleculargenetic studies of DMT1 on 12q in French-Canadian restless legs syndrome patients and families. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet, 2007. 144B(7): p. 911-7.

12. Winkelmann, J., et al., Genome-wide association study of restless legs syndrome identifies common variants in three genomic regions. Nat Genet, 2007. 39(8): p. 1000-6.

13. Stefansson, H., et al., A genetic risk factor for periodic limb movements in sleep. N Engl J Med, 2007. 357(7):

p. 639-47.

14. Stiasny-Kolster, K., et al., Effectiveness and tolerability of rotigotine transdermal patch for the treatment of restless legs syndrome in a routine clinicalpractice setting in Germany. Sleep Med, 2013. 14(6): p. 475-81. 15. Scholz, H., et al., Levodopa for restless legs syndrome. Cochrane Database Syst Rev, 2011(2): p. CD005504.

16. Scholz, H., et al., Dopamine agonists for restless legs syndrome. Cochrane Database Syst Rev, 2011(3): p.

CD006009.

17. Manconi, M., et al., Preferential D2 orpreferential D3 dopamine agonists in restless legs syndrome. Neurology, 2011.77(2): p. 110-7.

18. Eng land, S.J., et al., L-Dopa improves Restless Legs Syndrome and periodic limb movements in sleep but not Attention-Deficit-Hyperactivity Disorder in a double-blind trial in children. Sleep Med, 2011. 12(5): p. 471 -7. 19. Manconi, M., et al., First night efficacy of pramipexole in restless legs syndrome and periodic leg movements.

Sleep Med, 2007. 8(5): p. 491-7.

20. Garcia-Borreguero, D., et al., Systematic evaluation of augmentation during treatment with ropinirole in restless legs syndrome (Willis-Ekbom disease): results from a prospective, multicenter study over 66 weeks. Mov Disord, 2012. 27(2): p. 277-83.

21. Hogl, B., et al., Progressive development of augmentation during long-term treatment with levodopa in restless legs syndrome: results of a prospective multi-center study. J Neurol, 2010. 257(2): p. 230-7.

22. Garcia-Borreguero, D. and A.M. Williams, Dopaminergic augmentation of restless legs syndrome. Sleep Med Rev, 2010. 14(5): p. 339-46.

23. Garcia-Borreguero, D., et al., Diagnostic standards for dopaminergic augmentation of restless legs syndrome:

report from a World Association of Sleep Medicine-lnternational Restless Legs Syndrome Study Group consensus conference at the Max Planck Institute. Sleep Med, 2007. 8(5): p. 520-30.

24. Paulus, W. and E.D. Schomburg, Dopamine and the spinal cord in restless legs syndrome; does spinal cord physiology reveal a basis for augmentation? Sleep Med Rev, 2006. 10(3): p. 185-96.

25. Allen, R.P. and C.J. Earley, Augmentation of the restless legs syndrome with carbidopa/levodopa. Sleep, 1996.

19(3): p. 205-13.

26. Garcia-Borreguero, D., et al., Augmentation as a treatment complication of restless legs syndrome: concept and management. Mov Disord, 2007. 22 Suppl 18: p. S476-84.

27. Garcia-Borreguero, D., et al., Validation of the Augmentation Severity Rating Scale (ASRS): a multicentric, prospective study with levodopa on restless legs syndrome. Sleep Med, 2007. 8(5): p. 455-63.

28. Silver, N., et al., A 10-year, longitudinal assessment of dopamine agonists and methadone in the treatment of restless legs syndrome. Sleep Med, 2011. 12(5): p. 440-4.

29. Garcia-Borreguero, D., et al., The long-term treatment of restless legs syndrome/Willis-Ekbom disease:

evidence-based guidelines and clinical consensus best practice guidance: a report from the International Restless Legs Syndrome Study Group. Sleep Med, 2013. 14(7): p. 675-84.

30. Garcia-Borreguero, D., et al., Treatment of restless legs syndrome with pregabalin: a double-blind, placebocontrolledstudy. Neurology, 2010. 74(23): p. 1897-904.

31. Allen, R., et al., A randomized, double-blind, 6-week, dose-ranging study of pregabalin in patients with restless legs syndrome. Sleep Med, 2010. 11(6): p. 512-9.

32. Kustermann, A., et al., Depression and attemptedsuicide underpregabalin therapy. Ann Gen Psychiatry, 2014.

13(1): p. 37.

33. Hall, T.D., et al., Changes in mood, depression and suicidal ideation after commencing pregabalin for neuropathic pain. Aust Fam Physician, 2014. 43(10): p. 705-8.

34. Bekhit, M.H., Opioid-induced hyperalgesia and tolerante. Am J Ther, 2010. 17(5): p. 498-510.

35. Winkelman, J.W., A. Gagnon, and A.G. Clair, Sensory symptoms in restless legs syndrome: the enigma of pain.

Sleep Med, 2013. 14(10): p. 934-42.

36. Trenkwalder, C. and W. Paulus, Restless legs syndrome: pathophysiology, clinical presentation and management. Nat Rev Neurol, 2010. 6(6): p. 337-46.

37. Trotti, L.M. and D.B. Rye, Restless legs syndrome. Handb Clin Neurol, 2011. 100: p. 661-73.

38. Salas, R.E., R. Rasquinha, and C.E. Gamaldo, All the wrong moves: a clinical review of restless legs syndrome, periodic limb movements of sleep and wake, and periodic limb movement disorder. Clin Chest Med, 2010. 31(2): p. 383-95.

39. Winkelmann, J., Genetics of restless legs syndrome. Curr Neurol Neurosci Rep, 2008. 8(3): p. 211-6.

40. Picchietti, D., et al., Restless legs syndrome: prevalence and impact in children and adolescents--the Peds REST study. Pediatrics, 2007. 120(2): p. 253-66.

41. Trenkwalder, C., W. Paulus, and A.S. Walters, The restless legs syndrome. Lancet Neurol, 2005. 4(8): p. 465­ 75.

42. Barriere, G., et al., The restless legs syndrome. Prog Neurobiol, 2005. 77(3): p. 139-65.

43. Earley, C.J., et al., AlteredBrain iron homeostasis anddopaminergic function in Restless Legs Syndrome (Willis-Ekbom Disease). Sleep Med, 2014. 15(11): p. 1288-301.

44. Earley, C.J., et al., Increased synaptic dopamine in the putamen in restless legs syndrome. Sleep, 2013. 36(1):

p. 51-7.

45. Bayard, S., M.C. Langenier, and Y. Dauvilliers, Decision-making, reward-seeking behaviors and dopamine agonist therapy in restless legs syndrome. Sleep, 2013. 36(10): p. 1501-7.

46. Connor, J.R., et al., Postmortem and imaging based analyses reveal CNS decreased myelination in restless legs syndrome. Sleep Med, 2011. 12(6): p. 614-9.

47. Allen, R.P., et al., Restless legs syndrome/Willis-Ekbom disease diagnostic criteria: updated International Restless Legs Syndrome Study Group (IRLSSG) consensus criteria--history, rationale, description, and significance. Sleep Med, 2014. 15(8): p. 860-73.

48. Clemens, S., D. Rye, and S. Hochman, Restless legs syndrome; revisiting the dopamine hypothesis from the spinalcordperspective. Neurology, 2006. 67(1): p. 125-30.

49. Thorpe, A., et al., Possible sites of therapeutic action in Restless Legs Syndrome: Focus on dopamine and lalphap[delta]ligands. Eur Neurol, 2011.66(1): p. 18-29.

50. Mackie, S. and J.W. Winkelman, Long-Term Treatment of Restless Legs Syndrome (RLS): An Approach to Management of Worsening Symptoms, Loss of Efficacy, and Augmentation. CNS Drugs, 2015. 29(5): p. 351-7.

51. Luo, F., et al., The long-term effects of the dopamine agonistpramipexole in a proposed restless legs syndrome animal model. Sleep Med, 2010.

52. Montplaisir, J., et al., Restless legs syndrome improved by pramipexole: a double-blind randomized trial.

Neurology, 1999. 52(5): p. 938-43.

53. Stiasny-Kolster, K. and W.H. Oertel, Low-dose pramipexole in the management of restless legs syndrome. An open label triaL Neuropsychobiology, 2004. 50(1): p. 65-70.

54. Oertel, W., et al., Long-term safety and efficacy of rotigotine transdermalpatch for moderate-to-severe idiopathic restless legs syndrome: a 5-year open-label extension study. Lancet Neurol, 2011. 10(8): p. 710-20.

55. Oertel, W.H., et al., Rotigotine transdermal patch in modérate to severe idiopathic restless legs syndrome: a randomized, placebo-controlledpolysomnographic study. Sleep Med, 2010. 11(9): p. 848-56.

56. Davies, S., Rotigotine for restless legs syndrome. Drugs Today (Barc), 2009. 45(9): p. 663-8.

57. Cote, S.R. and E.V. Kuzhikandathil, In vitro and in vivo characterization of the agonist-dependent D3 dopamine receptor toleranceproperty. Neuropharmacology, 2014. 79: p. 359-67.

58. Kuzhikandathil, E.V., et al., Identification and characterization of novel properties of the human D3 dopamine receptor. Mol Cell Neurosci, 2004. 26(1): p. 144-55.

59. Gil-Mast, S., et al., An amino acid residue in the second extracellular loop determines the agonist-dependent tolerance property of the human D3 dopamine receptor. ACS Chem Neurosci, 2013. 4(6): p. 940-51.

60. Westrich, L., et al., Development of tolerance in D3 dopamine receptor signaling is accompanied by distinct changes in receptorconformation. Biochem Pharmacol, 2010. 79(6): p. 897-907.

61. Fiorentini, C., et al., Reciprocal regulation of dopamine D I and D3 receptor function and trafficking by heterodimerization. Mol Pharmacol, 2008. 74(1): p. 59-69.

62. Surmeier, D.J., W.J. Song, and Z. Yan, Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal médium spiny neurons. J Neurosci, 1996. 16(20): p. 6579-91.

63. Missale, C., et al., The neurobiology of dopamine receptors: evolution from the dual concept to heterodimer complexes. J Recept Signal Transduct Res, 2010. 30(5): p. 347-54.

64. Maggio, R., et al., Heterodimerization of dopamine receptors: new insights into functional and therapeutic significance. Parkinsonism Relat Disord, 2009. 15 Suppl 4: p. S2-7.

65. Cruz-Trujillo, R., et al., D3 dopamine receptors interact with dopamine D I butnot D4 receptors in the GABAergic termináis of the SNr of the rat. Neuropharmacology, 2013. 67: p. 370-8.

66. Guitart, X., et al., Functional Selectivity of Allosteric Interactions within G Protein-Coupled Receptor Oligomers:

The Dopamine Dl-D3 Receptor Heterotetramer. Mol Pharmacol, 2014. 86(4): p. 417-29.

67. Zhu, H., et al., Unaltered D I, D2, D4, and D5 dopamine receptor mRNA expression and distribution in the spinal cord of the D3 receptor knockout mouse. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol, 2008.

194(11): p. 957-62.

68. Zhu, H., et al., Expression and distribution of all dopamine receptor subtypes (DI - D5) in the mouse lumbar spinal cord: A real-time polymerase chain reaction and non-a utoradiographic in situ hybridization study. Neuroscience, 2007. 149: p. 885-897.

69. Clemens, S., et al., Opposing modulatory effects of D I- and D2-like receptor activation on a spinal central pattern generator. J Neurophysiol, 2012. 107: p. 2250-2259.

70. Dziewczapolski, G., et al., Opposite roles of D I and D5 dopamine receptors in locomotion revealed by selective antisense oligonucleotides. Neuroreport, 1998. 9(1): p. 1-5.

71. Han, P. and P.J. Whelan, Modulation of AMPA currents by ü(1}-like but not ü(2}-like receptors in spinal motoneurons, Neuroscience, 2009. 158(4): p. 1699-707.

72. Han, P., et al., üopaminergic modulation of spinal neuronal excitability, J Neurosci, 2007. 27(48): p. 13192-204.

73. Bubenikova-Valesova, V., et al., The effect of a full agonist/antagonist of the Ü1 receptor on locomotor activity, sensorimotorgating andcognitive function in dizocilpine-treatedrats, Int J Neuropsychopharmacol, 2009. 12(7): p. 87383.

74. Gilbert, D.L., et al., A Ü1 receptor antagonist, ecopipam, for treatment of tics in Tourette syndrome, Clin Neuropharmacol, 2014. 37(1): p. 26-30.

75. Chipkin, R.E., Ecopipam Treatment of Tourette's Syndrome in Subjects 7-17 Years, 2014, ClinicalTrials.gov.

76. Drago, J., et al., Altered striatal function in a mutant mouse lacking Ü1A dopamine receptors, Proc Natl Acad Sci USA, 1994. 91(26): p. 12564-8.

77. Xu, M., et al., üopamine Ü1 receptor mutant mice are deficient in striatal expression of dynorphin and in dopamine-mediatedbehavioralresponses, Cell, 1994. 79(4): p. 729-42.

78. Darmopil, S., et al., Genetic inactivation of dopamine Ü1 but not Ü2 receptors inhibits L-ÜOPA-induced dyskinesia and histone activation, Biol Psychiatry, 2009. 66(6): p. 603-13.

79. Xu, M., et al., Elimination of cocaine-induced hyperactivity and dopamine-mediated neurophysiological effects in dopamine Ü1 receptor mutant mice. Cell, 1994. 79(6): p. 945-55.

80. Keeler, B.E., et al., Increased excitability of spinal pain reflexes and altered frequency-dependent modulation in the dopamine Ü3-receptor knockout mouse, Exp Neurol, 2012. 238(2): p. 273-283.

81. Brewer, K.L., et al., üopamine Ü3 receptor dysfunction prevents anti-nociceptive effects of morphine in the spinalcord, Frontiers in Neural Circuits, 2014. 8: p. 62-01 62-10.

82. Baier, P.C. and C. Trenkwalder, Circadian variation in restless legs syndrome. Sleep Med, 2007. 8(6): p. 645­ 50.

83. Granado, N., S. Ares-Santos, and R. Moratalla, Ü1 but not Ü4 dopamine receptors are critical for MÜMA-induced neurotoxicity in mice. Neurotox Res, 2014. 25(1): p. 100-9.

84. Breese, N.M., et al., Peripheral inflammation selectively increases TRPV1 function in IB4-positive sensory neurons from adult mouse. Pain, 2005. 115(1-2): p. 37-49.

85. Djouhri, L., et al., Spontaneous pain, both neuropathic andinflammatory, is related to frequency of spontaneous firing in intact C-fiber nociceptors, J Neurosci, 2006. 26(4): p. 1281-92.

86. Wei, L., Immunological aspect of cardiac remodeling: T lymphocyte subsets in inflammation-mediated cardiac fibrosis, Exp Mol Pathol, 2011.90(1): p. 74-8.

87. Huang, X.R., et al., Smad3 mediates cardiac inflammation and fibrosis in angiotensin Il-induced hypertensive cardiac remodeling, Hypertension, 2010. 55(5): p. 1165-71.

88. Johnson, T.L., et al., The dopamine Ü3 receptor knockout mouse mimics aging-related changes in autonomic function and cardiac fibrosis, PLoS One, 2013. 8(8): p. e74116.

89. Hubble, J.P., Pre-clinical studies of pramipexole: clinical relevance. Eur J Neurol, 2000. 7 Suppl 1: p. 15-20.

90. Rascol, O., üopamine agonists: what is the place of the newer compounds in the treatment of Parkinson’s disease? J Neural Transm Suppl, 1999. 55: p. 33-45.

91. Kuzhikandathil, E.V. and G.S. Oxford, Activation of human Ü3 dopamine receptor inhibits P/Q-type calcium channels and secretory activity in AtT-20 cells, J Neurosci, 1999. 19(5): p. 1698-707.

92. Clemens, S. and S. Hochman, Conversion of the modulatory actions of dopamine on spinal reflexes from depression to facilitation in Ü3 receptor knock-out mice, J Neurosci, 2004. 24(50): p. 11337-45.

93. Dougherty, K.J., M.A. Sawchuk, and S. Hochman, Properties of mouse spinal lamina I GABAergic interneurons, J Neurophysiol, 2005. 94(5): p. 3221-7.

94. Machacek, D.W., et al., Serotonin 5-HT(2} receptor activation induces a long-lasting amplification of spinal reflex actions in the rat, J Physiol, 2001.537(Pt 1): p. 201-7.

95. Shreckengost, J., et al., Biououlline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord. J Neurosci, 2010. 30(15): p. 5283-8.

96. Malik, P., M.B. Andersen, and L. Peacock, The effects of dopamine D3 agonists andantagonists in a nonhuman primate model of tardive dyskinesia. Pharmacol Biochem Behav, 2004. 78(4): p. 805-10.

97. Pham, A.N. and T.D. Waite, Cu(ii)-catalyzed oxidation of dopamine in aqueous solutions: mechanism and kinetics. J lnorg Biochem, 2014. 137: p. 74-84.

98. Massad, W.A., et al., Vitamin B-sensitized photo-oxidation of dopamine. Photochem Photobiol, 2008. 84(5): p.

1201-8.

99. luga, C., J.R. Alvarez-Idaboy, and A. Vivier-Bunge, ROS initiated oxidation of dopamine under oxidative stress conditions in aqueous and lipidic environments. J Phys Chem B, 2011. 115(42): p. 12234-46.

100. DeAndrade, M.P., et al., Motor restlessness, sleep disturbances, thermal sensory alterations and elevated serum iron levels in Btbd9 mutant mice. Hum Mol Genet, 2012. 21 (18): p. 3984-92.

101. Schormair, B., et al., MEiSI and BTBD9: genetic association with restless leg syndrome in end stage renal disease. J Med Genet, 2011.48(7): p. 462-6.

102. Spieler, D., et al., Restless legs syndrome-associated intronic common variant in Meisl alters enhancer function in the developing telencephalon. Genome Res, 2014. 24(4): p. 592-603.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una combinación para su uso en la reducción o reversión del aumento derivado de tratamiento de Síndrome de Piernas Inquietas por un agonista de receptor D3, comprendiendo la combinación:

(a) ecopipam (SCH 39166) como antagonista de receptor D1;

(b) al menos un agonista de receptor D3; y

(c) opcionalmente un agonista de receptor de opioide.

2. Una combinación para su uso según la reivindicación 1, en la que el agonista de receptor D3 es nafadotrida, PD 128907, pramipexol, pergolida, rotigotina o mezclas de los mismos.

3. Una combinación para uso según cualquier reivindicación anterior y que incluye un agonista de receptor de opioide, en la que el agonista de receptor de opioide es alilprodina, alfaprodina, anileridina, bencilmorfina, bezitramida, buprenorfina, butorfanol, clonitaceno, codeína, desomorfina, dextromoramida, dezocina, diampromida, diamorfina, dihidrocodeína, dihidromorfina, dimenoxadol, dimefeptanol, dimetiltiambuteno, butirato de dioxafetilo, dipipanona, eptazocina, etoheptazina, etilmetiltiambuteno, etilmorfina, etonitacen fentanilo, heroína, hidrocodona, hidromorfona, hidroxipetidina, isometadona, cetobemidona, levorfanol, levofenacilmorfano, lofentanilo, meperidina, meptazinol, metazocina, metadona, metopon, morfina, mirofina, nalbufina, narceína, nicomorfina, norlevorfanol, normetadona, nalorfina, normorfina, norpipanona, oxicodona, oximorfona, papaveretum, pentazocina, fenadoxona, fenomorfano, fenazocina, fenoperidina, piminodina, piritramida, proheptazina, promedol, properidina, propiram, propoxifeno, sufentanilo, tilidina, tramadol, o sus mezclas.

4. Una combinación para uso según cualquier reivindicación anterior, para administración parenteral, oral, en aerosol para inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o en recipiente implantado.

5. Una combinación para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que la composición se suministra en cantidades de monodosis o multidosis en forma estéril en un recipiente sellado.

6. Una combinación para uso según cualquier reivindicación anterior, en la que los agentes activos (a), (b) y (c) (si están presentes) están presentes en una cantidad que varía entre un límite inferior de un 0,01, 0,05, 0,10, 0,50, 1,0, 5,0 o un 10 % y un límite superior de un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % en peso de la composición.

7. Una combinación para uso según la reivindicación 6, en la que los agentes activos (a), (b) y (c) (si están presentes) están incluidos en la combinación en una cantidad de un 0,05 a un 95 % en peso de la combinación, preferentemente de un 0,05 a un 60 % en peso de la combinación, opcionalmente de un 0,05 a un 10 % en peso de la combinación.

8. Una combinación para uso según cualquier reivindicación anterior, en forma de comprimido o cápsula, aerosol, gotas, polvo, pomada, crema, emulsión o microemulsión, gel, dispersión, suspensión, espuma o líquido.

9. Ecopipam (SCH 39166) para su uso en la reducción o reversión del aumento derivado de tratamiento de Síndrome de Piernas Inquietas con un agonista de receptor D3.

10. Un artículo de administración transdérmica que incluye una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, opcionalmente un parche o vendaje, apósito o gasa.

11. Artículo de administración transdérmica que incluye una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y que es un artículo de fabricación que es un calcetín o un artículo de calcetería.

12. Un estuche que comprende uno o más recipientes con unidades de dosificación farmacéutica que comprenden una cantidad eficaz de ecopipam (SCH 39166) como antagonista de receptor D1, al menos un agonista de receptor D3 y opcionalmente un agonista de receptor de opioide, en el que el recipiente se presenta con instrucciones opcionales para reducir o revertir el aumento derivado de tratamiento de Síndrome de Piernas Inquietas con un agonista de receptor D3.