ES2951171T3

ES2951171T3 - Nueva composición que contiene aminoácidos de cadena ramificada

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Publication number: ES2951171T3
Application number: ES20737378T
Authority: ES
Inventors: Marcello Allegretti; Andrea Aramini; Gianluca Bianchini
Original assignee: Dompe Farmaceutici SpA
Current assignee: Dompe Farmaceutici SpA
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2023-10-18
Anticipated expiration: 2040-06-29
Also published as: CN114025780A; CA3141522A1; US20220296670A1; EP3989999B1; PT3989999T; IL288801B1; HUE062802T2; SI3989999T1; FI3989999T3; US12186359B2; DK3989999T3; WO2020260689A1; IL288801B2; HRP20230743T1; CN114025780B; SMT202300215T1; PL3989999T3; EP3989999A1; LT3989999T; BR112021023228A2

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) y el dipéptido L-Alanil-L-alanina y su uso para mejorar el rendimiento y la recuperación durante la actividad física y para la prevención y/o tratamiento del desgaste muscular asociado a condiciones patológicas o relacionadas con la edad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nueva composición que contiene aminoácidos de cadena ramificada

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una combinación de aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) y el dipéptido L-Alanil-L-alanina, composiciones farmacéuticas relacionadas y suplementos dietéticos que los comprenden y usos de los mismos para mejorar el rendimiento y la recuperación durante la actividad física y para su uso como medicamento para la prevención y/o tratamiento de la pérdida muscular asociada a condiciones patológicas o relacionadas con la edad.

Antecedentes de la invención

El músculo esquelético es un órgano plástico que se mantiene mediante múltiples vías que regulan el recambio de células y proteínas. Las proteínas del músculo esquelético se sintetizan y degradan constante y simultáneamente. La cantidad de proteína en el músculo y el mantenimiento de la masa muscular esquelética en el individuo maduro depende del balance neto de proteína muscular (NBAL), la diferencia entre la síntesis de proteína del músculo esquelético (MPS) y la degradación (MPB). Los factores de crecimiento, las hormonas, las citocinas, los nutrientes y la carga mecánica pueden activar las vías de señalización celular que favorecen la síntesis o la degradación de proteínas, lo que conduce a una ganancia o pérdida, respectivamente, de masa muscular esquelética.

Los músculos no solo son importantes para la locomoción y el mantenimiento de la postura, sino que también proporcionan la mayor reserva de proteínas en el cuerpo y sirven como fuente de aminoácidos que pueden ser usados para la producción de energía y la gluconeogénesis por diversos órganos (incluido el corazón, hígado y cerebro) durante el metabolismo catabólico. Una serie de condiciones están asociadas a un balance neto de proteínas musculares negativo. Durante algunas condiciones patológicas, puede estar presente una mayor activación de los sistemas proteolíticos, por lo que las proteínas contráctiles y los orgánulos se eliminan del músculo, lo que da como resultado la atrofia muscular. La pérdida muscular ocurre sistémicamente en las personas mayores (una condición conocida como sarcopenia relacionada con la edad), como una respuesta fisiológica al ayuno, la desnutrición o la inmovilidad (por ejemplo, postoperatorio) y en condiciones patológicas tal como trastornos neuromusculares degenerativos (por ejemplo, distrofia o atrofia muscular), trastorno pulmonar obstructivo crónico, caquexia asociada al cáncer, diabetes, insuficiencia renal, insuficiencia cardíaca, síndrome de Cushing, sepsis, lesiones por quemaduras, uremia, cirrosis y SIDA.

La pérdida excesiva de masa muscular está asociada con un mal pronóstico en varias enfermedades.

También se puede observar pérdida de masa muscular como consecuencia de un ejercicio sostenido de alta intensidad, tal como por ejemplo correr una maratón, que estimulan el catabolismo muscular para aportar aminoácidos como sustrato para la producción de energía.

Los atletas usan ampliamente los suplementos deportivos para asegurar una apropiada disponibilidad de carbohidratos y proteínas y evitar de este modo el catabolismo muscular.

Los aminoácidos esenciales son biomoléculas que el cuerpo humano no puede sintetizar y, por lo tanto, deben suministrarse en la dieta. Los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) Leucina, Valina e Isoleucina representan el 35 % de los aminoácidos esenciales en los músculos y son los aminoácidos esenciales más consumidos durante la actividad deportiva.

También se ha demostrado que la concentración sérica de aminoácidos esenciales puede afectar el desarrollo y la extensión de la fatiga alcanzada durante una competición de resistencia.

Adicionalmente, se teoriza que los aminoácidos potencien el rendimiento en una variedad de formas, tales como modificar el uso de combustible durante el ejercicio y prevenir la fatiga mental y Newsholme EA et al, J Nutr. 2006, 136; 274S-6S; C.P.M. Sharp et al, Journal of Strength and Conditioning Research 2010, 24(4)/1125-1130).

Una serie de estudios han demostrado que los BCAA sirven como sustrato para la síntesis de proteínas y la producción de energía y realizan varias funciones metabólicas y de señalización, particularmente a través de la activación de la vía de señalización de mTOR.

Estos efectos los realizan los propios BCAA, especialmente la leucina, y sus metabolitos. De hecho, la leucina estimula la síntesis de proteínas a través de la vía de señalización mTOR y la fosforilación de factores de iniciación de la traducción y proteínas ribosómicas, mientras que el efecto inhibidor de la proteólisis está mediado principalmente por HMG (p-hidroxi-p-metilbutirato) y cetoácidos de cadena ramificada.

Curiosamente, a diferencia de la mayoría de los aminoácidos, la etapa inicial del catabolismo de los BCAA tiene lugar en el músculo esquelético y no en el hígado, debido a la mayor actividad en este tejido de la aminoácido aminotransferasa de cadena ramificada (BCAT), la primera enzima responsable de la vía catabólica de los BCAA. Esto les da una ventaja única a las fórmulas nutricionales basadas en BCAA en comparación con otras en lo que respecta al efecto sobre la mejora de la función muscular y cerebral, ya que los BCAA circulantes aumentan rápidamente después de la ingesta de proteínas y se vuelven fácilmente disponibles para los tejidos extrahepáticos.

En vista de lo anterior, la suplementación con BCAA se usa ampliamente en la actualidad para los atletas, tanto para limitar el desarrollo de la fatiga central como para apoyar la salud muscular y el anabolismo. La L-Alanina es un aminoácido gluconeogénico y es uno de los productos del catabolismo de los BCAA.

Friliver® Sport Performance (Dompe Farmaceutici S.p.A.) es un complemento dietético comercializado que comprende tanto BCCA como L-Alanina y se usa para mejorar el rendimiento deportivo y reducir la fatiga.

Todavía existe la necesidad de desarrollar composiciones mejoradas y más eficaces para usar como suplementos en atletas. Adicionalmente, se siente fuertemente la necesidad de desarrollar composiciones que sean efectivas en la prevención y/o tratamiento de pérdida muscular, por ejemplo asociado a la edad, ayuno, desnutrición, inmovilidad o condiciones patológicas.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente en modelos animales que la administración oral de una combinación que contiene BCAA y el dipéptido L-Alanil-L-alanina (Ala-Ala) es particularmente eficaz para mejorar la función, la estructura y el metabolismo muscular tanto en el caso de entrenamiento intenso y en aquellas condiciones en las que se produce pérdida muscular.

De acuerdo con lo anterior, es un objeto de la presente invención una composición que comprende los aminoácidos de cadena ramificada (BCCA) y el péptido L-Alanil-L-alanina.

Es un objeto adicional de la presente invención la composición anterior para su uso como medicamento para la prevención y/o tratamiento de la pérdida muscular asociada a condiciones patológicas, condiciones relacionadas con la edad, desnutrición, inmovilidad o ayuno.

Otro objeto de la presente invención es el uso de la composición anterior como complemento dietético para el ejercicio físico para mejorar el rendimiento y/o la recuperación muscular, y/o para reducir la fatiga muscular. Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica o complemento dietético que comprende como principio activo la combinación anterior de aminoácidos de cadena ramificada (BCCA) y L-Alanil-L-alanina, con al menos un vehículo, excipiente y/o adyuvante farmacéutica o nutracéuticamente aceptable.

Definiciones

Como se usa en este documento, el término "aminoácidos de cadena ramificada (BCAA)" se refiere a los aminoácidos L-Isoleucina, L-leucina y L-valina.

Como se usa en este documento, el término "L-Alanil-L-alanina" o "Ala-Ala" se usan indistintamente para indicar un dipéptido que consta de dos unidades de L-alanina unidas por un enlace amídico. En cambio, el término "Ala" se refiere al aminoácido L-alanina solo.

Figuras

La figura 1 muestra la fuerza de las extremidades anteriores normalizada con el peso corporal para ratones sometidos a un protocolo de entrenamiento y tratados con vehículo, BCAA (BCAA), BCAA más L-alanina (BCAA+2Ala) o BCAA más L-Alanil-L-alanina (BCAA+Ala-Ala), como se describe en el ejemplo 1. (ANOVA en T3: *** BCAA+Ala-Ala frente a BCAA+2Ala (p<0.005), frente a Bc Aa (p<0.005) y frente a vehículo (p<0.005); ªª BCAA+2ALA frente a vehículo (p<0.01). AN^oV^aen T4: ** BCAA+Ala-Ala frente a BcAA+2Ala (p<0.01), frente a BCAA (p<0.01) y frente a vehículo (p<0.005); ªª BCAA+2ALA frente a BCAA (p<0.05) y frente a vehículo (p<0.01).

La figura 2 muestra el contenido de proteína medido por el ensayo de Bradford en homogeneizados de músculo Gastrocnemius de ratones tratados con vehículo, BCAA (BCAA), b Ca A más L-Alanina (BCAA+2Ala) o BCAA más L-Alanil-L-alanina (BCAA+Ala-Ala), como se describe en el ejemplo 1 (BCAA+Ala-Ala * frente a Vehículo p<0.005; ª frente a BCAA p<0.01; ° frente a BCAA+2Ala p<0.05).

La figura 3 muestra los niveles de IgA en saliva normalizados a proteína total (ng/μg) en ratones tratados con Vehículo, BCAA (BCAA), BCAA más L-alanina (BCAA+2Ala) o BCAA más L-Alanil-L-alanina (BCAA+Ala -Ala), como se describe en el ejemplo 1 (* BCAA+Ala-Ala frente a Vehículo p<0.005; ª frente a BCAA p<0.01; ° frente a BCAA+2Ala p<0.01).

La figura 4 muestra los niveles de lactato deshidrogenasa en plasma (U/L) en ratones tratados con vehículo, BCAA (BCAA), BCAA más L-alanina en una relación de peso 1:2 (BCAA+2Ala) o BCAA más L-Alanil-L-alanina (BCAA+Ala-Ala), como se describe en el ejemplo 1. (* BCAA+Ala-Ala frente a Vehículo p<0.005; ª frente a BCAA p<0.01; ° frente a BCAA+2Ala p<0.01).

La figura 5 muestra el área bajo la curva de 0 a 24 horas (AUC0-24h, |ig/ml*min) de Valina (panel A), Leucina (panel B) e Isoleucina (panel C), medida después de la administración a ratones de BCAA solo (BCAA), BCAA más L-Alanina (BCAA+2Ala) o BCAA más L-Alanil-L-alanina (BCAA+Ala-Ala), como se describe en el ejemplo 2.

La figura 6 muestra la media de ± SD del tiempo medio de residencia (MRT) de Valina (panel A), Leucina (panel B) Isoleucina (panel C), medidas después de la administración a ratones de BCAA solo (BCAA), BCAA más L-Alanina (BCAA+2Ala) o BCAA más L-Alanil-L-alanina (BCAA+Ala-Ala), como se describe en el ejemplo 2.

La figura 7 muestra la curva glucémica tras la administración de un bolo de glucosa en ratones pretratados con vehículo, BCAA más L-alanina (BCAA+2Ala) o BCAA más L-Alanil-L-alanina (BCAA+Ala-Ala), como se describe en el ejemplo 3 (BCAA+Ala-Ala frente a Vehículo *** p<0.005; BCAA+2Ala frente a Vehículo ªªª p<0.005).

La figura 8 muestra el área incremental bajo la curva (iAUC) de la glucemia medida en los 120 minutos posteriores a la administración de un bolo de glucosa en ratones pretratados con vehículo, BCAA más L-Alanina (BCAA+2Ala) o BCAA más L-Alanil-L-alanina (BCAA+Ala-Ala), como se describe en el ejemplo 3.

La figura 9 muestra las curvas de fuerza-frecuencia (N*mm/kg) producidas por la torsión de los músculos flexores plantares de ratones de control y de ratones sometidos a descarga de las extremidades posteriores y tratados con Vehículo, BCAA o BCAA más L-Alanil-L-alanina (BCAA+Ala-Ala), como se describe en el ejemplo 4.

Descripción detallada de la invención

Como se demostrará en la sección experimental, los presentes inventores han descubierto inesperadamente que una formulación que comprende BCAA en combinación con el dipéptido L-Alanil-L-alanina es particularmente eficaz para mejorar la función, la estructura y el metabolismo muscular. Sorprendentemente, este efecto se observa tanto en caso de entrenamiento intenso como en condiciones patológicas de pérdida muscular. Los datos obtenidos también demuestran que el dipéptido L-Alanil-L-alanina aumenta significativamente la absorción de los BCAA cuando estos se administran por vía oral e inducen su distribución preferencial en el músculo.

Por lo tanto, es un primer objeto de la presente invención una composición que comprende los aminoácidos de cadena ramificada (BCCA) L-Leucina, L-Valina y L-Isoleucina en combinación con el péptido L-Alanil-L-alanina. Preferiblemente, en la composición anterior, la relación de peso L-Leucina: L-Valina: L-Isoleucina está entre 2:1:1 y 8:1:1.

Según una realización preferida de la invención, la L-Leucina, la L-Valina y la L-Isoleucina están presentes en la composición en una relación de peso de 2:1:1, respectivamente.

Según otra realización preferida de la invención, la L-Leucina, la L-Valina y la L-Isoleucina están presentes en la composición en una relación de peso de 4:1:1.

Según otra realización preferida de la invención, la L-Leucina, la L-Valina y la L-Isoleucina están presentes en la composición en una relación de peso de 8:1:1.

Preferiblemente, en la composición de la invención la relación de peso entre los BCAA y el péptido L-Alanil-L-alanina está entre 5:1 y 1:1, preferiblemente entre 3:1 y 1.5:1, más preferiblemente es 2:1 o 1.6:1. Según una realización particularmente preferida, en la composición de la invención, la relación de peso L-Leucina: L-Valina: L-Isoleucina: L-Alanil-L-alanina está entre 2:1:1:1 y 2:1:1:3.6, más preferiblemente es 2:1:1:2.5 o 2:1:1 :2.

Preferiblemente, la composición de la invención no contiene otros aminoácidos o péptidos además de los BCAA y L-Alanil-L-alanina.

Preferiblemente, la composición de la invención es apropiada para administración oral.

Según una realización, la composición según el primer objeto de la invención es una composición farmacéutica. Preferiblemente, dicha composición farmacéutica comprende dichos BCAA y el dipéptido L-Alanil-L-alanina mezclados con al menos un vehículo, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender cualquiera de los vehículos, excipientes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica. Por ejemplo, la composición farmacéutica según la invención puede contener ingredientes habituales tales como rellenos, aglutinantes, lubricantes, agentes aromatizantes, estabilizantes, ajustadores de pH, agentes disgregantes, conservantes. Preferiblemente, la composición farmacéutica de la invención es apropiada para administración oral.

La composición farmacéutica para administración oral de la invención puede ser una formulación sólida o líquida. Las formulaciones preferidas de la invención contemplan formas farmacéuticas seleccionadas del grupo que consiste en granulado, comprimido, cápsula, comprimido efervescente, suspensión oral, emulsión, polvo, solución o jarabe. La forma farmacéutica más preferida según la invención es un granulado para suspensión oral o disolución en un líquido, preferiblemente agua.

Según una realización alternativa, dicha composición es un complemento dietético.

Preferiblemente, dicho complemento dietético comprende dichos BCAA y el dipéptido L-Alanil-L-alanina mezclados con al menos un vehículo o excipiente aceptable para su uso humano.

Preferiblemente, dicho complemento dietético se presenta en forma de comprimido, cápsula o líquido, más preferiblemente es líquido. Según una realización, dicho complemento dietético puede presentarse en forma de bebida o de composición alimenticia. Preferiblemente, la composición de la invención, preferiblemente como composición farmacéutica o complemento dietético, se formula de modo que contenga la siguiente cantidad de BCAA y dipéptido por unidad de dosis:

entre 0.6 y 1 g, preferiblemente 0.8 g de L-Leucina, entre 0.3 y 0.5 g, preferiblemente 0.4 g de L-Isoleucina, entre 0.3 y 0.5 g, preferiblemente 0.4 g de L-Valina y desde 0.5 g a 1.5 g, preferiblemente desde 0.8 g a 1.5 g, más preferiblemente 0.8 g de L-Alanil-L-alanina.

Un segundo objeto de la invención es la composición divulgada anteriormente para su uso como medicamento. Como se demostró en la sección experimental, la composición según la invención mejora significativamente la función neuromuscular del músculo flexor plantar cuando se administra en un modelo animal de pérdida muscular.

De acuerdo con lo anterior, en una realización preferida, la composición anterior es para su uso en la prevención, mejora y/o tratamiento de la pérdida muscular asociada a:

i. condiciones patológicas, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en trastornos neuromusculares degenerativos, tales como distrofia muscular o atrofia muscular; trastorno pulmonar obstructivo crónico; caquexia asociada al cáncer; diabetes; insuficiencia renal; falla cardiaca; síndrome de Cushing; septicemia; lesiones por quemaduras; uremia; cirrosis; y SIDA;

ii. condición relacionada con la edad, preferiblemente sarcopenia; o

iii. desnutrición, inmovilidad o ayuno.

En todas las aplicaciones anteriores, la composición según la invención se administra preferiblemente dos veces al día.

Como se demuestra en la sección experimental, la composición de la invención es particularmente útil para ser administrada antes, durante o después del ejercicio físico para mejorar el rendimiento muscular y/o la recuperación, y/o para reducir la fatiga muscular.

De acuerdo con lo anterior, un tercer objeto de la invención es el uso de la composición anterior, preferiblemente como complemento dietético, antes, durante y después del ejercicio físico.

Es un objeto adicional de la invención el uso de la composición anterior para mejorar el rendimiento y/o la recuperación muscular, y/o para reducir la fatiga muscular antes, durante o después del ejercicio físico.

En el uso anterior, la composición se administra en una dosis única de entre 0.6 and 1 g, preferiblemente 0.8 g de L-Leucina, entre 0.3 y 0.5 g, preferiblemente 0.4 g de L-Isoleucina, entre 0.3 and 0.5 g, preferiblemente 0.4 g de L-Valina y desde 0.5 g a 1.5 g, preferiblemente desde 0.8 g a 1.5 g, más preferiblemente 0.8 g de L-Alanil-L-alanina, según sea necesario.

Sección experimental

Todos los experimentos se realizaron de conformidad con las Directrices italianas para el cuidado y uso de animales de laboratorio (D.L.116/92) y con la Directiva europea (2010/63/UE). El estudio pertenece a los estudios aprobados por el comité de ética nacional para el bienestar de los animales de investigación del Ministerio de Salud italiano en lo que respecta a cuestiones éticas y cumplimiento de la ley. La mayoría de los procedimientos experimentales usados en el presente estudio están aprobados por redes científicas internacionales que trabajan en modelos animales de enfermedades neuromusculares (http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/SOPs/).

Estadísticas

Todos los datos experimentales se expresaron como media ± error estándar de la media (S.E.M.). Las comparaciones estadísticas múltiples entre grupos se realizaron mediante ANOVA de una vía, con corrección post hoc de la prueba t de Bonferroni cuando se rechazó la hipótesis nula (p < 0.05), para permitir una mejor evaluación de la variabilidad intra e intergrupo y evitar falsos positivos. Si es necesario, comparaciones simples entre dos medias (formulaciones modificadas frente a vehículo o frente a formulación estándar).

Ejemplo 1- Eficacia de la formulación durante el entrenamiento

a) Grupos experimentales y protocolo

En el estudio se usaron ratones macho C57BL/6J de tipo salvaje (WT) de 10 semanas de edad adquiridos de Charles River (Calco, Italia). Todos los ratones se aclimataron durante una semana en las instalaciones para animales, antes del inicio del protocolo experimental; luego, se asignaron d a cada grupo de tratamiento en función de su peso corporal y de los valores absolutos y normalizados de fuerza de prensión de las extremidades anteriores, con el fin de crear cohortes homogéneas al comienzo del estudio.

Los experimentadores llevaron a cabo los experimentos, la recogida de datos y el análisis a ciegas.

Los ratones se dividieron en los siguientes grupos:

1. Grupo de control (n=5):

Ratones no sometidos a un protocolo de ejercicio físico y suministro de vehículo;

2. Grupo de vehículos (n=5):

Ratones sometidos a un protocolo de ejercicio físico descrito a continuación y suministro de vehículo (agua corriente filtrada).

3. Grupo BCAA (n=8):

Ratones sometidos a un protocolo de ejercicio físico descrito a continuación y suministrados con una solución acuosa que contenía una mezcla de L-Leucina, L-Valina y L-Isoleucina en una relación de peso 2:1:1. Cada ratón recibió una cantidad total de 328 mg/Kg de L-Leucina, 164 mg/Kg de L-Valina y 164 mg/Kg de L-Isoleucina.

4. Grupo BCAA y L-Ala (n=8):

Ratones sometidos a un protocolo de ejercicio físico descrito a continuación y suministrados con una solución acuosa de una mezcla de L-Leucina, L-Valina, L-Isoleucina y L-Alanina en una relación de peso 2:1:1:2. Cada ratón recibió una cantidad total de 328 mg/Kg de L-Leucina, 164 mg/Kg de L-Valina, 164 mg/Kg de L-Isoleucina y 328 mg/Kg de L-Alanina.

5. BCAA y L-ala-L-ala (n=8):

Ratones sometidos a un protocolo de ejercicio físico descrito a continuación y suministrados con una solución acuosa que contenía una mezcla de L-Leucina, L-Valina, L-Isoleucina y un dipéptido de L-Alanil-L-alanina en una relación de peso 2:1: 1:2. Cada ratón recibió una cantidad total de 328 mg/Kg de L-Leucina, 164 mg/Kg de L-Valina, 164 mg/Kg de L-Isoleucina y 328 mg/Kg de L-Alanil-L-alanina.

Las soluciones acuosas usadas para los grupos 3 a 5 se prepararon disolviendo los aminoácidos y el dipéptido en agua corriente filtrada, para obtener la concentración final deseada. Este se obtuvo por preparación directa, considerando la cantidad de agua semanal consumida por cada ratón y su peso corporal.

Los ratones de los grupos 2 a 5 se sometieron al siguiente protocolo de ejercicio físico.

En detalle, todos los ratones se hicieron correr en una cinta rodante horizontal con motor (Columbus Instruments, EE. UU.), según el siguiente programa de dos fases:

Fase 1: consistió en 3 semanas de sesiones de ejercicio pretratamiento (45 min, 5 días/semana), con el fin de que los ratones se adaptaran al procedimiento, alcanzando progresivamente la carga de trabajo diana. Todos los ratones se hicieron correr comenzando con un calentamiento de 5 min a 5 m/min, y luego aumentando la velocidad de 1 m/min cada minuto, hasta alcanzar la velocidad máxima que se mantuvo hasta el final de la serie de ejercicio. La velocidad máxima se incrementó semanalmente, hasta alcanzar la velocidad diana de 25 m/min.

Fase 2: esta fase consistió en 4 semanas de sesiones de ejercicio (45 min, 5 días/semana) a máxima carga de trabajo, comenzando con un calentamiento de 15 min a 10 m/min, y luego aumentando la velocidad de 1 m/min cada minuto, alcanzando una velocidad máxima de 25 m/min, que se mantuvo hasta el final de la serie de ejercicio.

El tratamiento con agua (grupo 2) o con las diferentes soluciones (grupos 3-5) se realizó en paralelo a la fase 2. Durante toda la duración del estudio, todos los ratones se mantuvieron con una dieta controlada con una cantidad diaria de pienso de 4-5 g/ratón.

b) Análisis de parámetros de ratones.

i. Métodos

Se recogieron parámetros in vivo y ex vivo de los animales.

• Recopilación de parámetros in vivo

Los siguientes datos fueron monitoreados durante el protocolo de ejercicio:

1. Variaciones de peso corporal e ingesta de agua.

2. Fuerza de agarre de las extremidades anteriores

En el día 0 (T0), 7 (T1), 14 (T2), 21 (T3) y 28 (T4) de la fase 2 del protocolo de ejercicio, se midió la fuerza de la extremidad anterior para cada ratón por medio de un medidor de fuerza de agarre (Columbus Instruments, EE. UU.). Para el análisis estadístico se usó la fuerza máxima (absoluta y normalizada al peso corporal) desarrollada contra un tirón suave del agarre durante 5 determinaciones/animal.

3. Determinación in vivo de los niveles de IgA en saliva mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Se recogieron muestras de saliva de la cavidad oral de cada ratón usando una micropipeta, ~5 minutos después de la inyección intraperitoneal de pilocarpina para estimular la secreción de saliva (1 mg/kg, Sigma-Aldrich, EE. ^uU.). Luego, la saliva se colocó inmediatamente en tubos de microcentrífuga que contenían PMSF (Sigma-Aldrich, EE. UU.) para inhibir las proteasas y se mantuvieron en hielo. Las muestras se clarificaron por centrifugación a 16,000 x g durante 10 min a 4 °C; el sobrenadante se almacenó a -80 °C hasta que se realizaron los análisis. Los niveles de IgA en saliva se cuantificaron usando un Kit ELISA Mouse IgA Ready-SET-Go! (eBioscience, Viena, Austria), según protocolo del fabricante.

4. Determinación de los niveles plasmáticos de lactato deshidrogenasa (LDH) por espectrofotometría.

Se obtuvo sangre por punción cardíaca del ventrículo izquierdo con una jeringa de insulina heparinizada y se recogió en tubos heparinizados. Las muestras se procesaron dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. El plasma pobre en plaquetas se obtuvo después de dos etapas de centrifugación consecutivas (20 min, 4000 rpm, 4 °C; 10 min, 12000 rpm, 4 °C). La actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) se determinó por medio de kits disponibles comercialmente (CK NAC LR y LDH LR, SGM Italia). El instrumento se ajustó a una longitud de onda de 340 nm, a 37 °C.

• Recopilación de parámetros ex vivo

Al final de la semana 4 de la fase 2, los animales se anestesiaron por vía intraperitoneal con una combinación de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (16 mg/kg) y se sacrificaron. Los músculos gastrocnemio y tibial se diseccionaron de cada ratón y se congelaron hasta el análisis.

Estas muestras se almacenaron a -80 °C con el fin de usarlas para evaluaciones de punto final planificadas. Se llevaron a cabo los siguientes análisis:

1. Determinación del contenido proteico por ensayo de Bradford en músculo Gastrocnemius.

La solución reguladora usada en el ensayo estuvo constituida por los siguientes ingredientes disueltos en 100 mL de agua: 1 mL de Triton X-100, 2 mL de Tris HCL pH 8, 2.74 mL de NaCl (5M), 10 mL de Glicerol, 1 mL de EDTA 0.5 M pH 8. Se agrega PMSF (inhibidor de proteasa) 100 mM en EtOH antes del uso. Los músculos gastrocnemios se homogeneizaron en solución reguladora con una dilución de 1/5 p/v (g/mL) usando el tubo CK14 (Precellys Lysing kit) con homogeneizador Bertin. Luego, las muestras se centrifugaron después de la homogeneización y los lisados se analizaron para la cuantificación de proteínas totales. La determinación del contenido de proteína se llevó a cabo con la prueba de Bradford según el siguiente protocolo: 1) se agregaron a una placa 250 |iL de Azul Brillante; 2) las muestras se analizaron diluidas 1:10 y estaban fuera del intervalo de calibración, por lo tanto se diluyeron 1:20 en solución salina y se volvieron a analizar 3) cinco |iL de solución salina (blanco), se agregaron a la placa 5 |iL de muestras. La calibración se realizó por triplicado al igual que las muestras; 4) las muestras se agitaron durante 30 segundos; 5) la placa se incubó durante 10 min a T.A.; 6) la placa se leyó a 595 nm.

ii. Resultados

1. Bienestar y peso corporal

Todos los ratones se sometieron al protocolo de ejercicio/tratamiento sin mostrar ningún signo de estrés (falta de apetito, pérdida anormal de peso corporal, pérdida de cabello, comportamiento estereotípico o agresivo, etc.) o alteraciones macroscópicas de funciones vitales. No se observaron variaciones significativas en el peso corporal de los animales, tratados o no, a lo largo de la ventana experimental.

2. Fuerza de agarre de las extremidades anteriores

Los valores de la fuerza máxima de las extremidades anteriores normalizados al peso corporal medido en cada punto de tiempo semanal se muestran en la figura 1.

En T0, los valores de los diferentes grupos experimentales se solapaban sustancialmente.

Desde T1 a T4, todos los ratones tratados con BCAA, BCAA y L-alanina y BCAA y L-Alanil-L-alanina mostraron valores de fuerza más altos con respecto a los ratones tratados con vehículo.

La adición de L-alanina o L-Alanil-L-alanina a los BCAA da como resultado una extremidad anterior más fuerte. En T3 y T4, los ratones tratados con BCAA y L-Alanil-L-alanina fueron significativamente más fuertes con respecto a los ratones tratados con BCAA y L-alanina (Figura 1).

Estos datos muestran que la suplementación con L-Alanil-L-alanina mejora la función y la fuerza muscular después del tratamiento: esto demuestra que la formulación es eficaz para proteger contra la debilidad muscular tanto en condiciones fisiológicas como patológicas.

3. Determinación del contenido proteico de los músculos

Los homogeneizados de músculo gastrocnemio analizados con el ensayo de Bradford indicaron un aumento significativo del contenido de proteína total en todos los grupos tratados en comparación con el vehículo (125 ± 13 mg/g de tejido). En particular, el grupo BCAA y L-Alanil-L-alanina (192 ± 8 mg/g de tejido) mostró los contenidos de proteínas más altos en comparación con BCAA y L-alanina (162 ± 18 mg/g de tejido) y el grupo BCAA (142 ± 10 mg/g). g tejido).

Los datos se presentan en la figura 2 como media ± S.E.M.

Estos datos muestran que la suplementación con L-Alanil-L-alanina aumenta el contenido de proteína muscular: esto puede conducir a la preservación del peso muscular, lo que puede resultar ventajoso para el músculo esquelético afectado para la recuperación funcional.

4. Niveles de IgA en saliva

Las IgA son marcadores que indican el nivel de inflamación del tracto respiratorio superior. Los niveles de IgA en muestras de saliva, recolectadas justo antes del sacrificio de cada ratón, se muestran normalizados a valores de proteína total (ng/μg) en la figura 3. Niveles de IgA en saliva de ratones tratados con BCAA, BCAA y L-alanina y BCAA y L -Alanil-L-alanina se redujeron significativamente con respecto a los tratados con vehículo. Los niveles de IgA de los ratones tratados con BCAA y L-Alanil-L-alanina fueron significativamente más bajos en comparación con cualquiera de los otros grupos.

Estos datos muestran que la suplementación con BCAA y L-Alanil-L-alanina tiene una eficacia mejorada en comparación con BCAA y L-alanina para proteger el músculo del desgaste en condiciones patológicas y para prevenir la aparición de sobreentrenamiento.

5. Nivel plasmático de lactato deshidrogenasa (LDH)

La concentración plasmática de enzimas LDH evaluada en muestras de plasma de ratones se muestra en la figura 4. Los tres tratamientos mostraron una tendencia clara y significativa hacia la reducción de los niveles plasmáticos de LDH con respecto al vehículo. Los niveles de LDH de los ratones tratados con BCAA y L-Alanil-L-alanina fueron significativamente más bajos en comparación con cualquiera de los otros grupos.

Estos datos muestran que la suplementación con BCAA y L-Alanil-L-alanina tiene una eficacia mejorada en comparación con BCAA y L-alanina para proteger la integridad estructural y el metabolismo del músculo esquelético durante el ejercicio de larga duración.

Ejemplo 2- Estudio farmacocinético

El objetivo del estudio fue comparar la exposición de L-Leucina-13C₆, 15N, L-Isoleucina-13C₆, 15N, L-Valina-13C5, 15N en plasma después de su administración sola o en asociación con L-Alanina o L-Alanil-L-alanina en el ratón. Las muestras de plasma se analizaron mediante limpieza y derivación con el kit de análisis de aminoácidos EZfaast™ (Phenomenex) y se analizaron mediante UPLC-MSMS.

i. Métodos

Animales y mantenimiento

En este estudio se usaron ratones CD1 con pesos corporales de 25-30 gr en el momento del tratamiento, la edad aproximada fue de aproximadamente 4 semanas según la curva de crecimiento. Los animales fueron suministrados originalmente por Harlan, Italia. Una vez recibidos del proveedor, los animales fueron sometidos a exámenes de salud y aceptación. Los animales se alojaron, en grupos de cinco, en jaulas apropiadas para la especie. Los animales se aclimataron a las condiciones de alojamiento locales durante aproximadamente 5 días. Los animales se mantuvieron de forma rutinaria en el siguiente entorno, excepto durante breves períodos de tiempo en los que los procedimientos experimentales dictaban lo contrario. Los animales se alojaron en una habitación única y exclusiva, con aire acondicionado para proporcionar un mínimo de 15 cambios de aire por hora. Los controles ambientales se establecieron para mantener la temperatura dentro del intervalo de 22 °C y la humedad relativa dentro del intervalo de 50 a 60 % con un ciclo aproximado de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad que se controla automáticamente. Los alimentos (dieta Mucedola Standard GLP) y el agua estuvieron disponibles ad libitum durante todo el estudio. Todos los animales se pesaron el día de cada tratamiento y se asignaron al azar en grupos identificados de forma única con un pulverizador de color en la espalda antes del experimento. Los signos clínicos se controlaron a intervalos regulares durante todo el estudio para evaluar cualquier reacción al tratamiento. El experimento se llevó a cabo de acuerdo con la Ley italiana (D. L.vo 26/2014). Las muestras de sangre (50-60 μmL) se recolectaron en eppendorf heparinizados (Heparin Vister 5000U.l/mL), se mezclaron suavemente y se colocaron inmediatamente en hielo; luego se centrifugaron los eppendorf (3500xg, a 4 °C durante 15 min) y el plasma resultante se recogió y se transfirió a eppendorf marcados de forma única y se congeló a -80 °C hasta el análisis. Al final del estudio, los animales fueron sacrificados por desangrado bajo anestesia profunda con isoflurano.

Grupos y dosis

Los animales en ayunas se dividieron en 4 grupos de 6 ratones cada uno y los diferentes grupos se sometieron a los siguientes tratamientos. El volumen administrado fue de 15 mL/kg, mientras que el vehículo usado para el estudio fue una solución acuosa de ácido cítrico al 1.5 % p/p.

1) Grupo BCAA:

L-Leucina-13C₆,15N 328 mg/kg; L-Isoleucina-13C₆,15N 164 mg/kg; L-Valina-13C5,15N 164 mg/kg.

2) Grupo BCAA+Ala:

L-Leucina-13C₆,15N 328 mg/kg; L-Isoleucina-13C₆,15N 164 mg/kg; L-Valina-13C5,15N 164 mg/kg y L-Alanina 328 mg/kg.

3) Grupo BCAA+Ala-Ala

L-Leucina-13C₆,15N 328 mg/kg; L-Isoleucina-13C₆,15N 164 mg/kg; L-Valina-13C5,15N 164 mg/kg más L-Alanina 328 mg/kg.

Programa de sangrado y régimen de alimentación.

Los animales se mantuvieron en ayunas desde la noche anterior a la administración y se reintrodujo el alimento en las jaulas 3 horas después de la administración. Se llevó a cabo un muestreo en serie a los 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 8 h, 24 h, recogiendo aproximadamente 50-60 |iL de sangre en cada punto de tiempo.

ii. Resultados

Se calcularon las AUC ± SD para cada uno de los aminoácidos marcados para los intervalos de tiempo de 0-24 horas y se muestran en las figuras 5A, B y C. La media ± SD del tiempo de residencia medio (MRT) para cada aminoácido marcado son reportadas en la figura 6A, B y C.

Las concentraciones en plasma de los aminoácidos marcados aumentaron significativamente con la administración de Alanina y L-Alanil-L-alanina, mostrando esta última las concentraciones más altas (Figura 5A, B, C). Los valores medios del tiempo de residencia aumentaron significativamente en comparación con los grupos de BCAA, y los ratones tratados con BCAA más L-Alanil-L-alanina mostraron los valores más altos. No hubo diferencias en los otros parámetros farmacocinéticos calculados (Cmax, Tmax y T1/2) entre los tres grupos.

Ejemplo 3- Prueba de tolerancia oral a la glucosa en ratones

La prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) se evaluó en ratones pretratados con una administración oral de 15 mL/kg de vehículo (solución acuosa de ácido cítrico al 1.5 % p/p), o de la composición BCAA más L-alanina o BCAA más L-Alanil-L-alanina a las dosis descritas en el ejemplo 1 y disueltas en solución acuosa de ácido cítrico al 1.5 % p/p. El volumen de administración de cada solución fue de 15 mL/kg. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche, se pesaron y cada uno de los tratamientos anteriores se administró por vía oral como se describe anteriormente.

Cuarenta y cinco minutos después de la administración oral del pretratamiento, se administró por vía oral a los ratones un bolo de glucosa al 20 % (2 mg/g de peso corporal) y se midió la glucemia en sangre en el tiempo -45', 0', 15', 30', 60', 90' y 120' por sangrado de la vena de la cola con un glucómetro portátil (Johnson & Johnson).

La figura 7 muestra las curvas glucémicas obtenidas en ratones con cada uno de los pretratamientos. Después de la administración de un bolo de glucosa, los ratones tratados con BCAA más L-Alanil-L-alanina mostraron niveles glucémicos significativamente más bajos a los 15, 30 y 60 minutos, mientras que los ratones tratados con BCAA más L-alanina solo mostraron una disminución significativa de los niveles glucémicos a los 15 minutos.

Los datos obtenidos demostraron la mayor capacidad (es decir, su eficacia en más puntos de tiempo) de L-Alanil-L-alanina con respecto a L-alanina para mejorar la tolerancia a la glucosa en ratones.

El área incremental bajo la curva para la excursión de glucosa en sangre se calculó luego desde t = 0 hasta t = 120 minutos (iAUC0-120) y se mostró en la figura 8.

Como puede verse en la figura, la administración de BCAA más L-Alanil-L-alanina efectuó de manera significativa la tolerancia a la glucosa en comparación con ratones tratados con vehículo y BCAA más L-alanina.

Estos datos muestran que la administración oral de BCAA más L-Alanil-L-alanina indujo la mejora de la tolerancia a la glucosa en ratones C57BL/6 sanos. Esto está de acuerdo con los datos obtenidos en el estudio farmacocinético, que muestran que la L-Alanil-L-alanina aumenta la exposición de BCAA en comparación con la L-Alanina. Por lo tanto, este aumento de BCAA en plasma condujo a un aumento en la secreción de insulina después del bolo de glucosa, con la consiguiente disminución del contenido de glucosa en plasma. En conclusión, demostramos la mayor acción hipoglucemiante del dipéptido L-Alanil-L-alanina en comparación con L-Alanina.

Ejemplo 4- Evaluación preclínica de la eficacia en la mejora de la función muscular en un modelo de ratón con atrofia muscular (ratón HU).

i. Métodos

Los experimentos se realizaron de acuerdo con las Directrices italianas para el uso de animales de laboratorio (Decreto legislativo italiano 2014 n.26), que cumple con la Directiva de la Unión Europea para la protección de animales de experimentación (2011/63/e U), y recibió la aprobación del Ministerio de Salud italiano (D.M. n.133/2000-B).

Se adquirieron ratones macho adultos C57BL/6J (12-14 semanas de edad) de Charles River (Calco, Italia). Los ratones se subdividieron en 4 grupos de 8 animales, un grupo de control y 3 grupos de descarga de extremidades posteriores (HU). En detalle:

Grupo de control:

los ratones se alojaron individualmente en condiciones de control durante 4 semanas.

Grupos de descarga de extremidades posteriores (HU):

Se usó un protocolo de descarga muscular, similar al usado previamente para ratas HU (Pierno S, et al. J Physiol 2007;584:983-95). En detalle, los animales fueron suspendidos individualmente en jaulas especiales durante 2 semanas. Una cuerda delgada estaba unida en un extremo a la cola con yeso y en el otro extremo a la parte superior de la jaula. La longitud de la cuerda se ajustó para permitir que los animales se movieran libremente sobre las extremidades anteriores, mientras que el cuerpo estaba inclinado entre 30 y 40° con respecto al plano horizontal. Todos los ratones tenían agua ad libitum y recibieron 8 g al día de comida estándar para roedores. Se pesó la comida que quedaba al día siguiente para calcular el consumo diario de comida.

Los diferentes grupos de HU se trataron como sigue:

Vehículo: los ratones se alojaron individualmente durante 4 semanas y se descargaron las extremidades posteriores durante las últimas 2 semanas.

Durante este período, recibieron el vehículo (agua).

BCAA: los ratones se alojaron individualmente durante 4 semanas, recibieron BCAA (L-Leucina 328 mg/kg; L-Isoleucina 164 mg/kg; L-valina 164 mg/kg) una vez al día durante 4 semanas y se descargaron las extremidades posteriores durante las últimas 2 semanas. BCAA+Ala-Ala: los ratones se alojaron individualmente durante 4 semanas, recibieron una mezcla de BCAA más L-Alanil-L-alanina (L-Leucina 328 mg/kg; L-Isoleucina 164 mg/kg; L-Valina 164 mg/kg más L -Alanil-L-alanina 328 mg/kg) una vez al día durante 4 semanas, y se descargaron las extremidades posteriores durante las últimas 2 semanas.

Cada formulación se preparó disolviendo el polvo en agua corriente filtrada, para obtener la concentración final. Este se obtuvo por preparación directa, considerando la cantidad de agua semanal consumida por cada ratón y su peso corporal. La duración del tratamiento fue de 4 semanas.

Los animales HU se examinaron diariamente durante todo el período HU en cuanto a comportamiento, limpieza, aspecto del pelo y los ojos, consumo de alimentos y agua. La ingesta diaria de alimentos se midió como el valor medio de la cantidad de alimentos comerciales (en gramos) ingeridos cada día durante 14 días por los ratones pertenecientes a los grupos CTRL y HU. A los ratones se les dio una cantidad estándar de comida (10 g) cada mañana, y la comida restante se pesó en la mañana del día siguiente. Se obtuvieron la ingesta diaria por resta, y se calculó una ingesta diaria media durante 14 días para cada animal. El resultado final informa la media de ± SEM de n animales en cada grupo experimental. Al final del período de tratamiento, los ratones se pesaron y anestesiaron profundamente con una inyección intraperitoneal de uretano (1.2 g/kg de peso corporal) para permitir la extracción de los músculos esqueléticos de las extremidades posteriores, que son el sóleo (Sol), el extensor largo de los dedos (EDL), y gastrocnemio (Gas). Estos músculos se usaron inmediatamente para estudios electrofisiológicos y funcionales o se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para análisis bioquímicos y de expresión génica adicionales. Después de la cirugía, los animales fueron sacrificados mediante una sobredosis de uretano. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.

Protocolo de torsión in vivo

Se evaluó la torsión isométrica máxima in vivo del grupo de músculos flexores plantares (músculos GC y sóleo) en los diversos puntos de tiempo de ejercicio crónico o actividad en jaula. Los ratones se anestesiaron por inhalación (-4 % de isoflurano y 1.5 % de O²l/min) y se colocaron en una mesa controlada termostáticamente; la anestesia se mantuvo mediante un cono nasal (-2 % de isoflurano y 1.5 % de O²l/min). Se afeitó y preparó asépticamente la extremidad posterior derecha y se colocó el pie sobre el pedal conectado a un servomotor (modelo 300C-LR; Aurora Scientific, Aurora, ON, Canadá). Las contracciones se provocaron mediante estimulación eléctrica percutánea del nervio tibial a través de electrodos de aguja (Chalgren Enterprises) conectados a un estimulador (modelo 701B; Aurora Scientific) para inducir la contracción del grupo de músculos flexores plantares. La corriente se ajustó desde 30 a 50 mA hasta que se alcanzó la torsión isométrica máxima. Luego se realiza una serie de estimulaciones a frecuencias crecientes: 1, 10, 30, 50, 80 y 100 Hz con un tren de pulsos de 200 ms. Los datos se analizaron usando el software Dynamic Muscle Analysis (DMAv5.201; Aurora Scientific) para obtener la torsión, que se normalizó a la masa corporal del ratón. Se usaron valores normalizados para construir curvas de frecuencia de torsión.

ii. Resultados

Bienestar y peso corporal

Todos los ratones se sometieron al protocolo de ejercicio/tratamiento sin mostrar ningún signo de estrés (falta de apetito, pérdida anormal de peso corporal, pérdida de cabello, comportamiento estereotípico o agresivo, etc.) o alteraciones macroscópicas de funciones vitales. No se observaron variaciones significativas en el peso corporal de los animales, ya sea tratados o no, a lo largo de la ventana experimental.

Torsión in vivo

La función neuromuscular in vivo se evaluó midiendo la torsión producida por los músculos flexores plantares de las extremidades posteriores en ratones anestesiados, independientemente de la voluntad del animal. Como se muestra en la figura 9, los ratones tratados con BCAA más L-Alanil-L-alanina resultaron tener la curva de frecuencia de torsión significativamente más alta entre los grupos tratados. En particular, se encontró que el valor de torsión máximo, producido a 100 Hz, casi se superpone al del grupo de ratones sedentarios (398 ± 7 frente a 379 ± 8 N*mm/kg; n = 8).

Las mediciones de torsión en animales anestesiados confirmaron la condición de desuso muscular (es decir, debilidad) en ratones con descarga de extremidades posteriores en comparación con el grupo de control.

Adicionalmente, los datos muestran claramente que el tratamiento con BCAA más L-Alanil-L-alanina mejora la función neuromuscular del músculo flexor plantar (principalmente músculos GC y sóleo) con respecto al vehículo y BCAA, y con valores de fuerza de torsión cercana a la observada para el grupo de control.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende los aminoácidos de cadena ramificada (BCCA) L-Leucina, L-Valina y L-Isoleucina en combinación con el péptido L-Alanil-L-alanina.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que la relación de peso L-Leucina: L-Valina: L-Isoleucina está entre 2:1:1 y 8:1:1.

3. Composición según la reivindicación 1 o 2, en la que la relación de peso L-Leucina: L-Valina: L-Isoleucina es 2:1:1 o 4:1:1 o 8:1:1.

4. Composición según las reivindicaciones 1 a 3, en la que la relación de peso L-Leucina: L-Valina: L-Isoleucina: L-Alanil-L-alanina está entre 2:1:1:1 a 2:1:1:3.6, preferiblemente es 2:1:1:2 5 o 2:1:1:2.

5. Composición según las reivindicaciones 1 a 4, que es un complemento dietético.

6. Composición según las reivindicaciones 1 a 4, que es una composición farmacéutica.

7. Composición según las reivindicaciones 1

a 6, para administración oral.

8. Composición según las reivindicaciones 1 a 6, que contiene las siguientes cantidades de BCAA y dipéptido por unidad de dosis: entre 0.6 y 1 g, preferiblemente 0.8 g de L-Leucina, entre 0.3 y 0.5 g, preferiblemente 0.4 g de L-Isoleucina, entre 0.3 y 0.5 g, preferiblemente 0.4 g de L-valina y desde 0.5 g a 1.5 g, preferiblemente 0.8 g de L-Alanil-L-alanina.

9. Composición según las reivindicaciones 1 a 8, para su uso como medicamento.

10. Composición según las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en la prevención, mejora y/o tratamiento de la pérdida muscular asociada a:

i. condiciones patológicas, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en trastornos neuromusculares degenerativos, tales como distrofia muscular o atrofia muscular; trastorno pulmonar obstructivo crónico; caquexia asociada al cáncer; diabetes; insuficiencia renal; falla cardiaca; síndrome de Cushing; septicemia; lesiones por quemaduras; uremia; cirrosis; y SIDA

11. condición relacionada con la edad, preferiblemente sarcopenia;

o

iii. desnutrición, inmovilidad o ayuno;

11. Uso de una composición según las reivindicaciones 1 a 8, para mejorar el rendimiento y/o la recuperación muscular, y/o para reducir la fatiga muscular antes, después o durante el ejercicio físico.