ES2951262T3 - Métodos para tratar o prevenir la aterosclerosis mediante la administración de un inhibidor de ANGPTL3 - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos y composiciones para tratar o prevenir la aterosclerosis en un sujeto. Los métodos de la presente invención comprenden administrar un inhibidor de la proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3) a un sujeto que tiene aterosclerosis o está en riesgo de desarrollar aterosclerosis. En determinadas realizaciones, el inhibidor de ANGPTL3 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a ANGPTL3. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para tratar o prevenir la aterosclerosis mediante la administración de un inhibidor de ANGPTL3

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de inhibidores de ANGPTL3 para reducir la progresión de la aterosclerosis.

Antecedentes

La aterosclerosis es un síndrome que afecta a los vasos sanguíneos arteriales. La aterosclerosis se produce por una respuesta inflamatoria crónica en las paredes arteriales y es una de las principales causas de muerte y morbilidad cardiovascular. La aterosclerosis implica el engrasamiento de las paredes arteriales y se caracteriza por el desarrollo de placas arteriales y la eventual restricción o bloqueo del flujo sanguíneo. Los tratamientos actuales para la aterosclerosis incluyen modificaciones en la dieta y el estilo de vida (p. ej., dejar de fumar), intervención farmacéutica (p. ej., estatinas, anticoagulantes, etc.) y cirugía (p. ej., angioplastia, prótesis endovasculares, cirugía de bypass, etc.). La evaluación directa de la eficacia de las intervenciones farmacéuticas sobre el desarrollo de aterosclerosis en sujetos humanos es problemática debido a la dificultad para detectar y medir con precisión las placas y las lesiones arteriales en sujetos vivos. Por lo tanto, los modelos animales de aterosclerosis son muy útiles para el desarrollo y ensayo de nuevos tratamientos terapéuticos para la aterosclerosis.

Nuevos métodos para el tratamiento, en la técnica se necesita la prevención o la mejora de la aterosclerosis.

El documento WO 2012/174178 divulga un anticuerpo completamente humano de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo humano que se une específicamente e inhibe o interfiere con al menos una actividad de la proteína 3 similar a la angiopoyetina humana (hANGPTL3). El documento WO 2011/085271 describe métodos, compuestos y composiciones para reducir la expresión de una proteína y ARNm de ANGPTL3 en un animal.

Breve sumario de la invención

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia. La presente invención proporciona un inhibidor de la proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3) para su uso en un método para reducir la progresión de la aterosclerosis en un sujeto, comprendiendo el método seleccionar un sujeto que tiene aterosclerosis y administrar una o más dosis del inhibidor de ANGPTL3 al sujeto, en donde el inhibidor de ANGPTL3 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a ANGPTL3 y que comprende secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada y ligera que tienen las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8 y 9. Los métodos terapéuticos pueden dar como resultado una reducción de la placa aterosclerótica y de la formación de lesiones ateroscleróticas en sujetos que lo necesiten. Los métodos también son útiles para reducir el colesterol total en suero, el colesterol LDL y los triglicéridos en un sujeto, y para tratar enfermedades y trastornos que pueden tratarse mediante una reducción en uno o más del colesterol total, el colesterol LDL y/o los triglicéridos.

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, al sujeto, antes o en el momento del inicio del tratamiento con una o más dosis del inhibidor de ANGPTL3, se le diagnostica hipercolesterolemia familiar heterocigota (HeFH) o hipercolesterolemia familiar homocigota (HoFH) y/o lipoproteína (a) elevada (Lp[a]). La presente invención también incluye un inhibidor de ANGPTL3 como se define en las reivindicaciones para su uso en métodos para reducir la progresión de la aterosclerosis en un sujeto que tiene hipercolesterolemia que no es de naturaleza familiar (es decir, hipercolesterolemia no familiar). Los sujetos que pueden tratarse mediante los métodos, en determinadas realizaciones, incluyen los sujetos que tienen o han recibido un diagnóstico de enfermedad cardiovascular (p. ej., enfermedad cardiovascular aterosclerótica). En determinadas realizaciones, el sujeto que puede tratarse es un sujeto que ha padecido un accidente cerebrovascular o un infarto de miocardio.

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el inhibidor de ANGPTL3 se administra al paciente como una terapia adicional a la terapia modificadora de lípidos existente del paciente (p. ej., además de la terapia de base con estatinas del paciente).

Otras realizaciones de la presente invención resultarán evidentes tras una revisión de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama de flujo de estudio que ilustra los procedimientos, administraciones y mediciones realizadas en los animales a lo largo del curso del estudio descrito en el Ejemplo 2 del presente documento. Las Figuras 2A y 2B muestran los niveles de colesterol de animales de los diferentes grupos de tratamiento (tratados con control, cuadrados negros [■]; o tratados con evinacumab, círculos negros [•]) en diferentes momentos a lo largo del curso del estudio descrito en el Ejemplo 2 del presente documento. La Figura 2A muestra los niveles medios de colesterol (mM) a lo largo del tiempo (en semanas). La Figura 2B muestra la exposición total al colesterol (mM x semanas) en la semana 13.

La Figura 3 muestra los niveles de triglicéridos (mM) de los animales de los diferentes grupos de tratamiento (tratados con control, cuadrados negros [■]; o tratados con evinacumab, círculos negros [•]) en diferentes momentos a lo largo del curso del estudio descrito en el Ejemplo 2 del presente documento.

Las figuras 4A, 4B y 4C muestran los perfiles de lipoproteínas de colesterol (mM, después de la separación de las lipoproteínas) de los animales de los diferentes grupos de tratamiento (tratados con control, cuadrados negros [■]; o tratados con evinacumab, círculos negros [•]) en diferentes momentos a lo largo del curso del estudio descrito en el Ejemplo 2 del presente documento. Las lipoproteínas se separaron en una columna Superose y los valores que se muestran son valores absolutos de las mediciones de colesterol en plasma combinadas por grupo en los diversos puntos de tiempo indicados. La Figura 4A muestra los niveles de colesterol de diferentes fracciones de plasma extraídas en el tiempo = 0 del estudio. La Figura 4B muestra los niveles de colesterol de diferentes fracciones de plasma extraídas en el tiempo = 6 semanas del estudio. La Figura 4C muestra los niveles de colesterol de diferentes fracciones de plasma extraídas en el tiempo = 13 semanas del estudio.

Las figuras 5A, 5B y 5C muestran los perfiles de lipoproteínas de triglicéridos (mM, después de la separación de las lipoproteínas) de los animales de los diferentes grupos de tratamiento (tratados con control, cuadrados negros [■]; o tratados con evinacumab, círculos negros [•]) en diferentes momentos a lo largo del curso del estudio descrito en el Ejemplo 2 del presente documento. Las lipoproteínas se separaron en una columna Superose y los valores que se muestran son valores absolutos de las mediciones de triglicéridos en plasma combinadas por grupo en los diversos puntos de tiempo indicados. La Figura 5A muestra los niveles de triglicéridos de diferentes fracciones de plasma extraídas en el tiempo = 0 del estudio. La Figura 5B muestra los niveles de triglicéridos de diferentes fracciones de plasma extraídas en el tiempo = 6 semanas del estudio. La Figura 5C muestra los niveles de triglicéridos de diferentes fracciones de plasma extraídas en el tiempo = 13 semanas del estudio.

Las Figuras 6A y 6B muestran el área de la lesión aterosclerótica de los animales de los diferentes grupos de tratamiento (tratados con control, barra o círculos blancos; o tratados con evinacumab, barra o círculos negros) en la semana 13 del estudio descrito en el Ejemplo 2 del presente documento. La Figura 6A muestra el área media de la lesión aterosclerótica por sección transversal (x1000 μm2) para los diferentes grupos de tratamiento. La Figura 6B es un gráfico de dispersión del área total de la lesión, que muestra el área de la lesión aterosclerótica por sección transversal (x1000 μm2) para animales individuales en los diferentes grupos de tratamiento.

Las Figuras 7A y 7B muestran el contenido necrótico medio de secciones transversales de lesiones ateroscleróticas, clasificadas como tipo IV o tipo V, observadas en animales de los diferentes grupos de tratamiento (tratados con control, barra blanca; o tratados con evinacumab, barra negra) en la semana 13 del estudio descrito en el Ejemplo 2 del presente documento. La Figura 7A muestra el valor absoluto (μm2x1000) de área necrótica por sección transversal. La Figura 7B muestra los valores relativos (porcentaje de área de lesión) del contenido necrótico de las lesiones.

Descripción detallada

Antes de describir la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a métodos ni a condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (p. ej., 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

Aunque se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación.

Métodos para reducir la progresión de la aterosclerosis

La presente invención se refiere, en general, al uso de un inhibidor de la proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3) como se define en las reivindicaciones para reducir la progresión de la aterosclerosis en un sujeto. Un inhibidor de la proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3) como se define en las reivindicaciones se usa en una o más dosis. De acuerdo con determinadas realizaciones, el uso de un inhibidor de la proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3) como se define en las reivindicaciones da como resultado una reducción en la formación de placas ateroscleróticas en un sujeto. Por ejemplo, el uso de un inhibidor de la proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3) como se define en las reivindicaciones puede dar como resultado una o más de una reducción del área de la lesión aterosclerótica y/o una reducción del área necrótica de las lesiones ateroscleróticas en un sujeto.

Selección de pacientes

De acuerdo con la presente invención, los sujetos que pueden tratarse mediante los métodos son sujetos que tienen o han recibido un diagnóstico de aterosclerosis. Por consiguiente, los métodos incluyen seleccionar un sujeto que tenga aterosclerosis y administrar una o más dosis del inhibidor de la proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3) al sujeto.

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el sujeto que puede tratarse por los métodos es un sujeto que, antes o en el momento del inicio del tratamiento con una o más dosis del inhibidor de ANGPTL3, ha recibido un diagnóstico de hipercolesterolemia familiar heterocigota (HeFH), hipercolesterolemia familiar homocigota (HoFH), lipoproteína (a) elevada (Lp[a]), hipercolesterolemia autosómica dominante (ADH, p. ej., ADH asociada con una o más mutaciones de ganancia de función en el gen LDLR, el gen ApoB y/o el gen PCSK9), hipercolesterolemia autosómica recesiva (ARH, p. ej., ARH asociada a mutaciones en LDLRAP1), así como incidencias de hipercolesterolemia que son distintas de la hipercolesterolemia familiar (no FH). El diagnóstico de hipercolesterolemia familiar (p. ej., heFH o hoFH) se puede realizar mediante genotipificación y/o criterios clínicos. Para pacientes que no están genotipificados, el diagnóstico clínico puede basarse en el criterio de Simon Broome con un criterio para definir FH, o el criterio de OMS/"Dutch Lipid Network" con una puntuación de > 8 puntos.

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el sujeto que puede tratarse por los métodos es un sujeto al que se le ha diagnosticado enfermedad cardiovascular (CVD) antes o en el momento del inicio del tratamiento con una o más dosis del inhibidor de ANGPTL3. El sujeto también puede seleccionarse basándose en si tiene una historia de cardiopatía coronaria (CHD). Como se usa en el presente documento, una "historia de CHD" (o "historia documentada de CHD") incluye uno o más de: (i) infarto agudo de miocardio (MI); (ii) MI silencioso; (iii) angina inestable; (iv) procedimiento de revascularización coronaria (p. ej., intervención coronaria percutánea [PCI] o cirugía de bypass de la arteria coronaria con injerto [CABG]; y/o (v) CHD clínicamente significativa diagnosticada por prueba invasiva o no invasiva (tal como angiografía coronaria, prueba de esfuerzo usando una cinta de correr, ecocardiografía de esfuerzo o realización de imagen nuclear).

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el sujeto que puede tratarse por los métodos puede seleccionarse basándose en si tiene una enfermedad cardiovascular no coronaria ("CVD no CHD"). Como se usa en el presente documento, "CVD no CHD" incluye uno o más de: (i) accidente cerebrovascular isquémico previo documentado con un déficit neurológico isquémico focal que persiste más de 24 horas, considerado de origen aterotrombótico; (ii) enfermedad arterial periférica; (iii) aneurisma aórtico abdominal; (iv) estenosis aterosclerótica de la arteria renal; y/o (v) enfermedad de la arteria carótida (ataques isquémicos transitorios o > 50 % de obstrucción de una arteria carótida).

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el sujeto que puede tratarse por los métodos puede seleccionarse basándose en si tiene uno o más factores de riesgo adicionales tales como, p. ej., (i) enfermedad renal crónica (CKD) moderada documentada definida por 30 ≤eGFR <60 ml/min/1,73 m2 durante 3 meses o más; (ii) diabetes mellitus tipo 1 o tipo 2 con o sin daño del órgano diana (p. ej., retinopatía, nefropatía, microalbuminuria); y/o (iii) una puntuación de riesgo de CVD mortal de 10 años calculada >5 % (ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidemias, Conroy et al., 2003, Eur. Heart J. 24:987-1003).

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el sujeto que puede tratarse por los métodos puede seleccionarse basándose en si tiene uno o más factores de riesgo adicionales seleccionados del grupo que consiste en la edad (p. ej., más de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 años), raza, nacionalidad de origen, género (masculino o femenino), hábitos de ejercicio (p. ej., hace ejercicio de forma regular, no hace ejercicio), otras condiciones médicas preexistentes (p. ej., diabetes tipo II, hipertensión, etc.) y actual estado médico (p. ej., toma actualmente bloqueadores beta, niacina, ezetimiba, fibratos, ácidos grasos omega-3, resinas de ácidos biliares, etc.).

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el sujeto que puede tratarse por los métodos presenta un nivel elevado de uno o más marcadores inflamatorios. Puede utilizarse cualquier marcador de la inflamación sistémica para los fines de la presente invención. Los marcadores inflamatorios adecuados incluyen, sin limitación, proteína C-reactiva, citocinas (p. ej., II-6, IL-8 y/o IL-17), y moléculas de adhesión celular (p. ej., ICAM-1, ICAM-3, BL-CAM, LFA-2, VCAM-1, NCAM y PECAM).

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el sujeto que puede tratarse por los métodos puede seleccionarse sobre la base de una combinación de uno o más de los criterios de selección o características terapéuticas anteriores. Por ejemplo, de acuerdo con determinadas realizaciones, además, un sujeto adecuado para el tratamiento con los métodos se puede seleccionar sobre la base de tener heFH o no FH en combinación con: (i) una historia de CHD documentada, (iii) CVD no CHD y/o (iii) diabetes mellitus con daño del órgano diana; tales pacientes también pueden seleccionarse basándose en si tiene una concentración de LDL-C en suero mayor o igual que 70 mg/dl.

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el sujeto que puede tratarse por los métodos tiene hipercolesterolemia que no se controla adecuadamente con una pauta terapéutica diaria de estatinas en dosis moderadas, y puede seleccionarse además basándose en si tiene heFH o no FH sin CHD, o CVD no CHD, pero tener (i) una puntuación de riesgo de CVD mortal de 10 años calculada de >5 %; o (ii) diabetes mellitus sin daño del órgano diana; tales sujetos también pueden seleccionarse basándose en si tienen una concentración de LDL-C en suero mayor o igual que 100 mg/dl.

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el sujeto que puede tratarse por los métodos es un sujeto que tiene síndrome de quilomicronemia familiar (FCS; también conocido como deficiencia de lipoproteína lipasa).

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el sujeto que puede tratarse por los métodos es un sujeto que está sometiéndose, o se ha sometido recientemente, a aféresis de lipoproteínas (p. ej., en los últimos seis meses, en las últimas 12 semanas, en las últimas 8 semanas, en las últimas 6 semanas, en las últimas 4 semanas, en las últimas 2 semanas, etc.).

Administración de un inhibidor de ANGPTL3 como terapia adicional

La presente invención incluye un inhibidor de ANGPTL3 como se define en las reivindicaciones para su uso en métodos para reducir la progresión de la aterosclerosis en un sujeto, en donde al sujeto se le administra el inhibidor de ANGPTL3 de acuerdo con una cantidad de dosificación y una frecuencia particulares, y en donde el inhibidor de ANGPTL3 se administra como adición a la terapia modificadora de lípidos (LMT) preexistente del paciente, tal como una adición a la pauta terapéutica de estatinas diaria preexistente. (En otra parte del presente documento se describen pautas terapéuticas de estatinas diarias ilustrativas específicas a las que se puede añadir un inhibidor de ANGPTL3).

Por ejemplo, los métodos incluyen pautas terapéuticas adicionales en donde el inhibidor de ANGPTL3 se administra como terapia adicional a la misma pauta terapéutica de estatinas diaria estable (es decir, misma cantidad de dosificación de estatinas) que el paciente estaba tomando antes de recibir el inhibidor de ANGPTL3. En otras realizaciones, el inhibidor de ANGPTL3 se administra como terapia adicional a una pauta terapéutica de estatinas que comprende una estatina en una cantidad que es mayor o menor que la dosis de estatina que el paciente estaba tomando antes de recibir el inhibidor de ANGPTL3. Por ejemplo, después de comenzar una pauta terapéutica que comprende un inhibidor de ANGPTL3 administrado en una frecuencia y cantidad de dosificación particulares, la dosis diaria de estatina administrada o prescrita al paciente puede (a) permanecer igual, (b) incrementarse o (c) disminuirse (p. ej., ajustarse hacia arriba o ajustarse hacia abajo) en comparación con la dosis diaria de estatina que el paciente estaba tomando antes de comenzar la pauta terapéutica con inhibidores de ANGPTL3, dependiendo de las necesidades terapéuticas del paciente.

Eficacia terapéutica

Los métodos dan como resultado una reducción en la formación de placas ateroscleróticas en las arterias de un sujeto, y/o la prevención de la progresión de la aterosclerosis en un sujeto. Por ejemplo, los métodos son útiles para limitar o reducir el área de lesión aterosclerótica y/o el área central necrótica en lesiones ateroscleróticas en un sujeto.

Los métodos pueden dar como resultado adicionalmente la reducción de los niveles en suero de uno o más componentes lipídicos seleccionados del grupo que consiste en LDL-C, ApoB100, no HDL-C, colesterol total, VLDL-C, triglicéridos, Lp(a) y colesterol restante. Por ejemplo, de acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, la administración de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de ANGPTL3 a un sujeto adecuado dará como resultado una reducción en porcentaje media desde el valor de referencia del colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C) en suero de al menos aproximadamente un 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o más; una reducción en porcentaje media desde el valor de referencia de ApoB100 de al menos aproximadamente un 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o más; una reducción en porcentaje media desde el valor de referencia de no HDL-C, de al menos aproximadamente un 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o más; una reducción en porcentaje media desde el valor de referencia de colesterol total de al menos aproximadamente un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 % o más; una reducción en porcentaje media desde el valor de referencia de VLDL-C de al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % o más; una reducción en porcentaje media desde el valor de referencia de triglicéridos de al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 % o más; y/o una reducción en porcentaje media desde el valor de referencia de Lp(a) de al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o más.

Inhibidores de ANGPTL3

Los métodos de la presente invención comprenden administrar a un paciente una composición terapéutica que comprende un inhibidor de ANGPTL3. En el contexto de la presente invención, los inhibidores de ANPTL3 son anticuerpos anti-ANGPTL3 o fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen específicamente a ANGPTL3 humano que comprenden secuencias de aminoácidos de CDR de cadena ligera y pesada que tienen las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8 y 9.

La expresión "proteína similar a angiopoyetina 3 humana" o "ANGPTL3 humana" o "hANGPTL3", como se usa en el presente documento, se refiere a ANGPTL3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (véase también el número de acceso NCBI NP 055310), o un fragmento biológicamente activo de la misma.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (p. ej., IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o V_H) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, C_H1, C_H2 y C_H3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o V_L) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (C_L1). Las regiones V_H y V_L pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada V_H y V_L está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En distintas realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-ANGPTL3 (o parte de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana o pueden estar modificadas de forma natural o artificial. Una secuencia de aminoácidos consenso puede definirse basándose en un análisis en paralelo de dos o más CDR.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintética o modificada por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, p. ej., a partir de moléculas de anticuerpo completas, mediante cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas recombinantes de ingeniería genética que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica los dominios variables y, opcionalmente, los constantes, de un anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente en, p. ej., fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, p. ej., fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.

Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')₂; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (p. ej., una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento, también se incluyen otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo típicamente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio V_H asociado con un dominio V_L, los dominios V_H y V_L pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros V_H-V_H, V_H-V_L o V_L-V_L. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio V_H o V_L monomérico.

En determinados aspectos de la divulgación, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente al menos a un dominio constante. Las configuraciones ilustrativas, no limitantes, de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen: (i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv) V_H-C_H1-C_H2; (v) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii) V_L-C_H1; (ix) V_L-C_H2; (x) V_L-C_H3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; y (xiv) V_L-C_L. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (p. ej., 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Por otra parte, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios V_H o V_L monoméricos (p. ej., mediante uno o más enlaces disulfuro).

Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (p. ej., biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo típicamente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo distinto en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ilustrativos que se desvelan en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.

La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo de fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. Por lo tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si se desea que el anticuerpo medie la citotoxicidad.

La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. No obstante, los anticuerpos humanos pueden incluir restos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y, en particular, CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula hospedadora (que se describe en más detalle a continuación), anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinantes, combinatoria (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, p. ej., Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones V_H y V_L de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de, y están relacionadas con, secuencias de V_H y V_L de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que se asocian a la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150 a 160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro intercatenario de la cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están unidos a través de enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de la purificación por afinidad.

La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intactos se debe, aunque no de forma limitativa, a diferencias estructurales asociadas al isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una sustitución de un único aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta los niveles normalmente observados usando una bisagra de lgG1 humana. La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la bisagra, la región C_H2 o C_H3, que puede ser deseable, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en donde el anticuerpo existe de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido al menos a una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.

La expresión "se une de manera específica", o similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. Se conocen bien en la materia métodos para determinar si un anticuerpo se une de manera específica a un antígeno e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmón superficial y similares. Por ejemplo, un anticuerpo que "se une de manera específica a" ANGPTL3, como se usa en el contexto de la presente divulgación, incluye anticuerpos que se unen a ANGPTL3 o parte del mismo con una K^d inferior a aproximadamente 1000 nM, inferior aproximadamente 500 nM, inferior a aproximadamente 300 nM, inferior a aproximadamente 200 nM, inferior aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 90 nM, inferior aproximadamente 80 nM, inferior aproximadamente 70 nM, inferior a aproximadamente 60 nM, inferior aproximadamente 50 nM, inferior aproximadamente 40 nM, inferior a aproximadamente 30 nM, inferior aproximadamente 20 nM, inferior aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 5 nM, inferior aproximadamente 4 nM, inferior aproximadamente 3 nM, inferior a aproximadamente 2 nM, inferior a aproximadamente 1 nM o inferior aproximadamente 0,5 nM, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial. Un anticuerpo aislado que se une de manera específica a ANGPTL3 humano, sin embargo, tiene reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de ANGPTL3 de otras especies (no humanas).

Los anticuerpos anti-ANGPTL3 de la presente divulgación pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que proceden los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. La presente divulgación incluye el uso de anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que procede el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera desveladas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En determinados aspectos de la divulgación, todos los restos de región marco y/o CDR dentro de los dominios V_H y/o V_L retromutan a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal original de la que procede el anticuerpo. En otros aspectos de la divulgación, únicamente determinados restos se retromutan en la secuencia de la línea germinal original, p. ej., únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros aspectos, uno o más del resto o restos marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de línea germinal que es diferente de la secuencia de línea germinal de la que se obtuvo originalmente el anticuerpo). Además, los anticuerpos pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, p. ej., en donde determinados restos individuales se mutan en el resto correspondiente de una secuencia de línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de línea germinal original se mantienen o se mutan en el resto correspondiente de una secuencia de línea germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden ensayarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc. El uso de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están abarcados en la presente divulgación.

La presente divulgación también incluye el uso de anticuerpos anti-ANGPTL3 totalmente humanos que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye el uso de anticuerpos anti-ANGPTL3 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR con, p. ej., 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones de aminoácidos conservativas respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR desveladas en el presente documento.

La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones en tiempo real por detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biodetectora, por ejemplo, usando el sistema BIAcore™ (Biacore Life Sciences división de GE Healthcare, Piscataway, Nueva Jersey).

El término "K^d", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interacciona con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a distintas zonas en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos espacialmente de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En una determinada circunstancia, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

De acuerdo con determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-ANGPTL3 usado en la presente invención es un anticuerpo con características de unión dependientes del pH. Como se usa en el presente documento, la expresión "unión dependiente del pH" significa que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo presenta "unión a ANGPTL3 reducida a pH ácido en comparación con el pH neutro" (a efectos de la presente divulgación, ambas expresiones pueden usarse indistintamente). Por ejemplo, los anticuerpos "con características de unión dependiente del pH" incluyen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno del mismo que se unen a ANGPTL3 con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En determinadas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno se unen a ANGPTL3 con una afinidad al menos 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más veces mayor a pH neutro que a pH ácido.

De acuerdo con este aspecto de la invención, los anticuerpos anti-ANGPTL3 con características de unión dependientes del pH pueden poseer una o más variaciones de aminoácidos con respecto al anticuerpo anti-ANGPTL3 original. Por ejemplo, un anticuerpo anti-ANGPTL3 con características de unión dependientes del pH puede contener una o más sustituciones o inserciones de histidina, p. ej., en una o más CDR de un anticuerpo anti-ANGPTL3 original. Por lo tanto, de acuerdo con determinados aspectos de la divulgación, se proporcionan métodos que comprenden administrar un anticuerpo anti-ANGPTL3 que comprende secuencias de aminoácidos de CDR (p. ej., CDR de cadena pesada y ligera) que son idénticas a las secuencias de aminoácidos de CDR de un anticuerpo anti-ANGPTL3 original, excepto por la sustitución de uno o más aminoácidos de una o más CDR del anticuerpo original con un resto de histidina. Los anticuerpos anti-ANGPTL3 con unión dependiente del pH pueden poseer, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más sustituciones de histidina, dentro de una CDR única de un anticuerpo original o distribuidas por a lo largo de múltiples CDR (p. ej., 2, 3, 4, 5 o 6) de un anticuerpo anti-ANGPTL3 original. Por ejemplo, la presente divulgación incluye el uso de anticuerpos anti-ANGPTL3 con unión dependiente del pH que comprenden una o más sustituciones de histidina en HCDR1, una o más sustituciones de histidina en HCDR2, una o más sustituciones de histidina en HCDR3, una o más sustituciones de histidina en LCDR1, una o más sustituciones de histidina en LCDR2 y/o una o más sustituciones de histidina en LCDR3, de un anticuerpo anti-ANGPTL3 original.

Como se usa en el presente documento, la expresión "pH ácido" significa un pH de 6,0 o menos (p. ej., menos de aproximadamente 6,0, menos de aproximadamente 5,5, menos de aproximadamente 5,0, etc.). La expresión "pH ácido" incluye valores de pH de aproximadamente 6,0, 5,95, 5,90, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 o menos. Como se usa en el presente documento, la expresión "pH neutro" significa un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4. La expresión "pH neutro" incluye valores de pH de aproximadamente 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 y 7,4.

Los ejemplos no limitantes de anticuerpos anti-ANGPTL3 que pueden usarse en el contexto de la presente divulgación incluyen, p. ej., evinacumab, así como cualquiera de anticuerpos anti-ANGPTL3 ilustrativos expuestos en la Patente de Estados Unidos N.° 9.018.356 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), o cualquiera de anticuerpos anti-ANGPTL3 ilustrativos expuestos en la Patente de Estados Unidos N.° 8.742.075 (Lexicon Pharmaceuticals, Inc.). En la invención, el anticuerpo puede ser evinacumab.

Preparación de anticuerpos humanos

Los anticuerpos anti-ANGPTL3 pueden producirse de acuerdo con cualquier método de producción/aislamiento de anticuerpos conocido en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir mediante tecnologías de hibridoma, mediante presentación en fagos, mediante presentación en levaduras, etc. Los anticuerpos para usar en la presente invención pueden ser, p. ej., anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados o anticuerpos completamente humanos.

En la técnica se conocen métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos. Cualquiera de estos métodos conocidos puede usarse para producir anticuerpos humanos que se unan específicamente a ANGPTL3.

Por ejemplo, usando la tecnología VELOCIMMUNE™ (véase, por ejemplo, el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals) o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra ANGPTL3 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. La tecnología VELOCIMMUNE® implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a loci endógenos de región constante de ratón de manera que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se une operativamente al ^a Dⁿ que codifica las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas. A continuación, el ADN se expresa en una célula capaz de expresar el anticuerpo totalmente humano.

Generalmente, un ratón VELOCIMMUNE® se expone al antígeno de interés y se recuperan las células linfáticas (tales como linfocitos B) de los ratones que expresan los anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fusionar con una línea celular de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales y dichas líneas celulares de hibridoma se detectan de manera sistemática y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera puede aislarse y unirse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicho un anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas puede aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno.

Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Los anticuerpos se caracterizan y seleccionan por características deseables, incluyendo la afinidad, selectividad, epítopo, etc., usando procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo totalmente humano de la invención, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.

En general, estos anticuerpos poseen altas afinidades, tal como se ha descrito anteriormente, cuando se miden mediante unión a un antígeno inmovilizado en fase sólida o en fase de solución. Las regiones constantes de ratón se remplazan después con regiones constantes humanas deseadas para generar anticuerpos totalmente humanos. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.

En la presente invención, el anticuerpo anti-ANGPTL3, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada y ligera (HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3) que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8 y 9.

En determinadas realizaciones de la presente invención, el anticuerpo anti-ANGPTL3, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede usarse en los métodos comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Composiciones farmacéuticas y métodos de administración

La presente invención incluye la administración de un inhibidor de ANGPTL3 como se define en las reivindicaciones a un paciente, en donde el inhibidor de ANGPTL3 está contenido dentro de una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas se formulan con vehículos adecuados, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una adecuada transferencia, suministro, tolerancia y similares. Puede encontrarse una multitud de formulaciones adecuadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm. Sci. Technol. 52:238-311.

Se conocen diversos sistemas de suministro y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica, p. ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, p. ej., Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de administración incluyen, pero sin limitación, la vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (p. ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos.

Una composición farmacéutica puede suministrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto al suministro subcutáneo, un dispositivo inyector de pluma tiene fácilmente aplicaciones en el suministro de una composición farmacéutica. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y sustituirse por un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. En su lugar, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha todo el dispositivo.

Numerosos dispositivos inyectores de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRONiC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos inyectores de pluma desechables que tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), la FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), la pluma Pe Nl ET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), la pluma EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.

En determinadas situaciones, la composición farmacéutica se puede suministrar en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede utilizarse una bomba (véase Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. En otra realización más, puede colocarse en las proximidades de la diana de la composición un sistema de liberación controlada, siendo necesaria, por tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, p. ej., Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, págs. 115-138). Se analizan otros sistemas de liberación controlada en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, p. ej., mediante disolución, suspensión o emulsión del anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso usado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que puede usarse junto con un agente solubilizante apropiado, tal como un alcohol (p. ej., etanol), un polialcohol (p. ej., propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [p. ej., polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, p. ej., aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se carga preferentemente en una ampolla apropiada.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc.

Dosificación

La cantidad de anticuerpo anti-ANGPTL3 administrado a un sujeto de acuerdo con la presente invención es, generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se usa en el presente documento, la frase "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una dosis de inhibidor de ANGPTL3 que da como resultado una reducción detectable (al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % o más del valor de referencia) en uno o más parámetros seleccionados del grupo que consiste en LDL-C, ApoB100, no HDL-C, colesterol total, VLDL-C, triglicéridos, Lp(a) y colesterol restante, o una cantidad que previene o atenúa la aterosclerosis en un sujeto (como se describe en cualquier otro sitio en el presente documento).

En el caso de un anticuerpo anti-ANGPTL3, una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 600 mg, p. ej., de aproximadamente 0,05 mg, de aproximadamente 0,1 mg, de aproximadamente 1,0 mg, de aproximadamente 1,5 mg, de aproximadamente 2,0 mg, de aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 70 mg, de aproximadamente 80 mg, de aproximadamente 90 mg, de aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 110 mg, de aproximadamente 120 mg, de aproximadamente 130 mg, de aproximadamente 140 mg, de aproximadamente 160 mg, de aproximadamente 170 mg, de aproximadamente 180 mg, de aproximadamente 190 mg, de aproximadamente 200 mg, de aproximadamente 210 mg, de aproximadamente 220 mg, de aproximadamente 230 mg, de aproximadamente 240 mg, de aproximadamente 250 mg, de aproximadamente 260 mg, de aproximadamente 270 mg, de aproximadamente 280 mg, de aproximadamente 290 mg, de aproximadamente 300 mg, de aproximadamente 310 mg, de aproximadamente 320 mg, de aproximadamente 330 mg, de aproximadamente 340 mg, de aproximadamente 350 mg, de aproximadamente 360 mg, de aproximadamente 370 mg, de aproximadamente 380 mg, de aproximadamente 390 mg, de aproximadamente 400 mg, de aproximadamente 410 mg, de aproximadamente 420 mg, de aproximadamente 430 mg, de aproximadamente 440 mg, de aproximadamente 450 mg, de aproximadamente 460 mg, de aproximadamente 470 mg, de aproximadamente 480 mg, de aproximadamente 490 mg, de aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 510 mg, de aproximadamente 520 mg, de aproximadamente 530 mg, de aproximadamente 540 mg, de aproximadamente 550 mg, de aproximadamente 560 mg, de aproximadamente 570 mg, de aproximadamente 580 mg, de aproximadamente 590 mg o de aproximadamente 600 mg, del anticuerpo anti-ANGPTL3. Otras cantidades de dosificación de inhibidores de ANGPTL3 resultarán obvias para un experto en la materia.

La cantidad de anticuerpo anti-ANGPTL3 contenida en las dosis individuales puede expresarse en términos de miligramos de anticuerpo por kilogramo del peso corporal del paciente (es decir, mg/kg). Por ejemplo, el anticuerpo anti-ANGPTL3 puede administrarse a un paciente a una dosis de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del paciente.

Terapias de combinación

Como se describe en otra parte en el presente documento, la presente invención puede comprender administrar un inhibidor de ANGPTL3 a un paciente junto con ("además de") la terapia de reducción de lípidos previamente prescrita al paciente. Por ejemplo, en el contexto de la prevención o atenuación de la aterosclerosis, se puede administrar un inhibidor de ANGP^t _L 3 a un paciente en combinación con una pauta terapéutica diaria estable de estatina. Las pautas terapéuticas de estatina diarias ilustrativas en las que puede administrarse en combinación un inhibidor de ANGPTL3 en el contexto de la presente invención incluyen, p. ej., atorvastatina (10, 20, 40 u 80 mg diarios), (atorvastatina/ezetimiba 10/10 o 40/10 mg diarios), rosuvastatina (5, 10 o 20 mg diarios), cerivastatina (0,4 o 0,8 mg diarios), pitavastatina (1, 2 o 4 mg diarios), fluvastatina (20, 40 u 80 mg diarios), simvastatina (5, 10, 20, 40 u 80 mg diarios), simvastatina/ezetimiba (10/10, 20/10, 40/10 u 80/10 mg diarios), lovastatina (10, 20, 40 u 80 mg diarios), pravastatina (10, 20, 40 u 80 mg diarios) y combinaciones de los mismos. Otras terapias reductoras de lípidos en las que puede administrarse en combinación un inhibidor de ANGPTL3 en el contexto de la presente invención incluyen, p. ej., (1) un agente que inhibe la captación de colesterol y/o la reabsorción de ácidos biliares (p. ej., ezetimiba); (2) un agente que incrementa el catabolismo de lipoproteínas (tal como niacina); y/o (3) activadores del factor de transcripción LXR que interviene en la eliminación del colesterol, tal como 22-hidroxicolesterol.

De acuerdo con determinadas realizaciones, la presente invención comprende administrar un inhibidor de ANGPTL3 a un sujeto en combinación con un inhibidor de ANGPTL4 (p. ej., un anticuerpo anti-ANGPTL4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo), un inhibidor de ANGPTL8 (p. ej., un anticuerpo anti-ANGPTL8 o un fragmento de unión a antígeno del mismo) y/o un inhibidor de PCSK9 (p. ej., un anticuerpo anti-PCSK9 o un fragmento de unión a antígeno del mismo). Los ejemplos no limitantes de anticuerpos anti-PCSK9 que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, p. ej., alirocumab, evolocumab, bococizumab, lodelcizumab, ralpancizumab, o porciones de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos anteriores.

Pautas de administración

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, múltiples dosis de un inhibidor de ANGPTL3 {es decir, una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de ANGPTL3) se puede administrar a un sujeto durante un curso de tiempo definido (p. ej., además de un régimen terapéutico diario con estatinas u otra terapia reductora de lípidos de base). Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un inhibidor de ANGPTL3. Como se usa en el presente documento, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis de un inhibidor de ANGPTL3 se administra al sujeto en un momento diferente, p. ej., en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (p. ej., horas, días, semanas o meses). La presente invención incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una dosis inicial única de un inhibidor de ANGPTL3, seguido de una o más dosis secundarias del inhibidor de ANGPTL3 y, opcionalmente, seguido de una o más dosis terciarias del inhibidor de ANGPTL3.

Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración de las dosis individuales de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de ANGPTL3. Por lo tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio de la pauta de tratamiento (también denominada "dosis de referencia"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundaria y terciaria pueden contener la misma cantidad del inhibidor de ANGPTL3, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En determinadas realizaciones, sin embargo, la cantidad de inhibidor de ANGPTL3 contenida en las dosis inicial, secundaria y/o terciaria varían entre sí (p. ej., se ajustan hacia arriba o hacia abajo según corresponda) durante el transcurso del tratamiento. En determinadas realizaciones, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis al comienzo de la pauta de tratamiento como "dosis de carga" seguidas de dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").

De acuerdo con realizaciones ilustrativas de la presente invención, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (p. ej., 1, 1 / , 2, 2 / , 3, 3 / , 4, 41/ 2, 5, 51/ 2, 6, 61/ 2, 7, 71/ 2, 8, 81/ 2, 9, 91/ 2, 10, 101/ 2, 11, 11 /, 12, 121/ 2, 13, 131/ 2, 14, 14 /, 15, 15 /, 16, 16 /, 17, 17 /, 18, 18 /, 19, 19 /, 20, 20 /, 21, 21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 2 6 / o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se usa en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de la molécula de unión a antígeno que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin dosis intermedias.

Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención pueden comprender administrar a un paciente cualquier cantidad de dosis secundarias y/o terciarias de un inhibidor de ANGPTL3. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, solo se administra una dosis secundaria única al paciente. En otras realizaciones, se administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias al paciente. De manera análoga, en determinadas realizaciones, solo se administra al paciente una dosis terciaria única. En otras realizaciones, se administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias al paciente.

En realizaciones que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 2, 4, 6, 8 o más semanas después de la dosis inmediatamente anterior. De forma similar, en realizaciones que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 1 a 2, 4, 6, 8 o más semanas después de la dosis inmediatamente anterior. Como alternativa, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar en el transcurso de la pauta de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarla un médico durante el transcurso del tratamiento, dependiendo de las necesidades del paciente individual después del examen clínico.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas de cómo usar un anticuerpo inhibidor de la proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3) como se define en las reivindicaciones para reducir la progresión de la aterosclerosis. Se ha intentado garantizar la precisión con respecto a los números usados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra ANGPTL3 humana

Se generaron anticuerpos anti-ANGPTL3 humanos como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 9.018.356. El inhibidor de ANGPTL3 ilustrativo usado en el siguiente Ejemplo es el anticuerpo anti-ANGPTL3 humano denominado "H4H1276S", también conocido como "evinacumab". Evinacumab tiene las siguientes características de secuencia de aminoácidos: una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 11; una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la SEQ ID NO: 2 y un dominio variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la SEQ ID NO: 3; una región determinante de complementariedad 1 de cadena pesada (Hc Dr 1) que comprende la SEQ ID NO: 4, una HCDR2 que comprende la Se Q ID NO: 5, una HCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 6, una región determinante de complementariedad 1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende la SEQ ID NO: 7, una LCDR2 que comprende la SEQ ID No : 8 y una LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 9.

Ejemplo 2. Un anticuerpo anti-ANGPTL3 previene el desarrollo de aterosclerosis en un modelo de ratón

INTRODUCCIÓN

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la inhibición de ANGPTL3 sobre el desarrollo de aterosclerosis en ratones APOE*3Leiden.CETP, un modelo bien establecido para la hiperlipidemia con todas las características de la disbetalipoproteinemia mixta o familiar y la aterosclerosis. (Véase, p. ej., en Kühnast et al., 2014, J Lipid Res 55: 2103­ 2112, una descripción general del modelo de ratón APOE*3Leiden.CETP (denominado como alterna en el presente documento "ratones E3L.CETP") y su uso para evaluar los efectos de un agente farmacológico en el desarrollo de la aterosclerosis).

La inhibición de ANGPTL3 se consiguió utilizando un anticuerpo anti-ANGPTL3. El anticuerpo anti-ANGPTL3 particular utilizado en estos estudios fue el anticuerpo denominado evinacumab como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo de control utilizado en estos estudios es un anticuerpo de isotipo coincidente contra una diana irrelevante.

DISEÑO DEL ESTUDIO

En la Figura 1 se muestra una ilustración del diseño del estudio. Evinacumab es un anticuerpo IgG4 completamente humano. Por lo tanto, cuando se evaluó en diferentes cepas de ratones, algunos ratones desarrollan anticuerpos antifármaco que eliminan la eficacia de la terapia. El porcentaje de ratones que desarrollan esta respuesta antifármaco puede ser diferente para cada modelo de ratón/origen genético. Por esta razón, se incluyeron más ratones por grupo en este primer estudio en ratones APOE*3Leiden.CETP para determinar cuántos ratones desarrollan una respuesta inmunitaria antihumana en este modelo en particular. Después de la exclusión de los ratones que desarrollaron una respuesta inmunitaria antihumana, los ratones restantes podrían usarse para evaluar el efecto de evinacumab sobre la aterosclerosis.

Sesenta y tres ratones hembra APOE*3Leiden.CETP recibieron la dieta T (una dieta modificada semisintética según describen Nishina et al. 1990, J Lipid Res 31:859, con un 0,15 % de colesterol añadido y un 15 % de manteca de cacao. Después de un período de preinclusión de 4 semanas, se retiraron del estudio 13 ratones de baja respuesta y los 50 ratones restantes se subdividieron en un grupo de control de veinte ratones y un grupo de tratamiento con evinacumab de treinta ratones, similares en peso corporal, colesterol y triglicéridos en plasma después de 4 h de ayuno (t = 0).

El tratamiento con evinacumab o anticuerpo de control se administró semanalmente mediante inyecciones subcutáneas a una dosis de 25 mg/kg/semana. El volumen de inyección durante el período de tratamiento fue de 10 ml/kg utilizando NaCl al 0,9 % como vehículo y se ajustó al último valor de peso corporal medido. El peso corporal y la ingesta de alimentos (por jaula) se midieron en las semanas 0, 3, 6, 8, 11 y 13.

Después de 0, 2, 4, 6, 8, 11 y 13 semanas de tratamiento, se tomaron muestras de sangre después de cuatro horas de ayuno. El colesterol y los triglicéridos en plasma se midieron individualmente y se recogió plasma adicional con EDTA para la evaluación de hFc y de anticuerpos antihumanos de ratón. Después de 6 semanas de tratamiento, se evaluó la primera respuesta antifármaco y se eliminaron del estudio 3 ratones del grupo de control y 5 ratones del grupo de tratamiento con altos niveles de anticuerpos antifármaco.

Los perfiles de lipoproteínas se midieron en las semanas 0, 6 y 13 en muestras de plasma, combinadas por grupo. Se recogieron heces por jaula durante la semana 12 (dos veces durante 48 horas). En t = 13, se sacrificaron ratones en situación posprandial. Se obtuvo plasma con EDTA mediante punción cardíaca y se recogieron varios tejidos. Se midió el desarrollo de aterosclerosis en la raíz aórtica en 15 ratones por grupo (después de la exclusión de los ratones que desarrollaron una respuesta antifármaco) midiendo el número de lesiones, el área de las lesiones y la gravedad de las lesiones. Además, se determinó la composición de las lesiones.

(1) El programa de mediciones de parámetros es el siguiente:

(2) Peso corporal (semanas 0, 3, 6, 8, 11 y 13);

(3) Ingesta de alimentos (por jaula, semanas 0, 3, 6, 8, 11 y 13);

(4) Colesterol total y triglicéridos en plasma (después de 4 h de ayuno en las semanas 0, 2, 4, 6, 8, 11 y 13); (5) Recolección de 20 μl de plasma con EDTA para hFc y evaluación de anticuerpos antihumanos de ratón (después de 4 h de ayuno en las semanas 0, 2, 4, 6, 8, 11 y 13);

(6) Perfiles de lipoproteínas (colesterol y triglicéridos, combinados por grupo; en las semanas 0, 6 y 13);

(7) Desarrollo de aterosclerosis en la raíz aórtica (15 ratones por grupo): (a) Número de lesiones, (b) Área total de lesiones, (c) Gravedad de las lesiones, (d) Composición de las lesiones (por ejemplo, macrófagos, células de músculo liso en la capa, necrosis y contenido de colágeno), y (e) Adherencia de monocitos. (Después del sacrificio [semana 13], se recogieron aortas de todos los ratones, sin embargo, el análisis de aterosclerosis se realizó con 15 ratones por grupo; se seleccionaron ratones que no desarrollaron anticuerpos antifármaco).

MÉTODOS

Las mediciones del peso corporal y la ingesta de alimentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos estándar.

Las muestras de sangre con plasma se obtuvieron de acuerdo con procedimientos estándar. El colesterol y los triglicéridos plasmáticos totales se determinaron utilizando kits disponibles en el mercado.

La medición de los perfiles de lipoproteínas por análisis FPLC se realizó utilizando un aparato AKTA de Amersham Biosciences. Los análisis se realizaron en muestras combinadas por grupo. El colesterol y los triglicéridos se midieron en las fracciones usando kits disponibles en el mercado.

El área y la gravedad de la lesión aterosclerótica se evaluaron en el área de la raíz aórtica como se ha indicado anteriormente (véase, p. ej., Kühnast et al., 2012, J Hypertens 30:107-116). La raíz aórtica se identificó por las valvas de la válvula aórtica, se montaron secciones transversales en serie de toda el área de la raíz aórtica (5 μm de espesor con intervalos de 50 μm) en portaobjetos recubiertos con 3-aminopropil trietoxisilano y se tiñeron con hematoxilinafloxina-azafrán (HPS). Para cada ratón, el área de la lesión se midió en 4 secciones posteriores. Cada sección consiste en 3 segmentos (separados por las válvulas). Para la determinación del tamaño y la gravedad de la lesión aterosclerótica, las lesiones se clasificaron en cinco categorías según la American Heart Association (AHA) (véase Stary et al., 1995, Arterioscler Thromb Vasc Biol 15:1512-1531): Tipo 1: estrías grasas tempranas (hasta 10 células espumosas en la íntima sin otros cambios); Tipo 2: estrías grasas regulares (diez o más células espumosas en la íntima sin otros cambios); Tipo 3: placa leve (células espumosas con una capa fibrótica); Tipo 4: placa moderada (lesiones más avanzadas con la capa media afectada, pero sin pérdida de arquitectura de la capa media); Tipo 5: placa grave (la capa media está gravemente afectada; con frecuencia se observan fibras elásticas rotas, hendiduras de colesterol, calcificación y necrosis).

Las imágenes se tomaron con un microscopio Olympus BX51 y las áreas se midieron con el software Image Processing. El área total de las lesiones y el número de lesiones se calcularon por sección transversal. Los segmentos no afectados se calcularon como porcentaje del total de segmentos. También se determinó la gravedad de las lesiones como porcentaje del total de lesiones. Las lesiones de tipo I-III se clasificaron como lesiones leves y las lesiones de tipo IV-V se clasificaron como lesiones graves.

Se contó el número de monocitos adheridos al endotelio activado en cada segmento utilizado para la cuantificación de la lesión, después de la inmunotinción con antisuero AIA 31240 (1:1000; Accurate Chemical and Scientific, Nueva York, Nueva York, Estados Unidos) y se calculó por sección transversal.

Se midió el área de macrófagos de las lesiones después de la inmunotinción con Mac-3 anti-ratón (1:50; BD Pharmingen, Países Bajos). Se realizó tinción con Sirius Red para teñir el colágeno. El área de células de músculo liso de la capa fibrótica se midió después de la inmunotinción con anti-actina alfa de músculo liso (1:400; PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg, Alemania) que reacciona de forma cruzada con la actina alfa de ratón. Se tomaron fotos/imágenes de las lesiones con el microscopio Olympus BX51. Los macrófagos, el colágeno, el núcleo necrótico y el área de células de músculo liso de las lesiones se cuantificaron utilizando un software de imágenes. Los macrófagos, las células de músculo liso (SMC), el núcleo necrótico y el contenido de colágeno de las lesiones se calcularon como porcentaje del área de lesión. El índice de vulnerabilidad/estabilidad de la placa se calculó dividiendo la suma de los factores estabilizadores SMC y colágeno por la suma de los factores desestabilizadores, macrófagos y núcleo necrótico.

En la semana 13, los ratones se sacrificaron en situación posprandial mediante CO₂. No se administró la última inyección de anticuerpos durante la semana 13 antes del sacrificio. Después del sacrificio, se recogió la mayor cantidad posible de plasma con EDTA (a través de una punción cardíaca) y se conservó a -70 °C hasta su uso posterior. Los corazones, incluida la raíz aórtica, se fijaron en formalina al 10 %. Se recogió la aorta torácica y se fijó en formalina al 10 %.

VALOR ESTADÍSTICO

Dependiendo de la normalidad, el significado de las diferencias entre los grupos se calculó de forma no paramétrica, utilizando el programa informático SPSS y una prueba U de Mann-Whitney para muestras independientes. Se consideró estadísticamente significativo un valor P < 0,05. Las diferencias estadísticas del grupo de tratamiento en comparación con el grupo de control se indican con un asterisco en los puntos de medición en las figuras.

RESULTADOS

PESO CORPORAL

Los resultados del peso corporal se resumen en la Tabla 1. Los valores son valores absolutos (gramos) y son medias ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 1

No hubo diferencias en el peso corporal entre el grupo tratado con evinacumab en comparación con el grupo de control.

INGESTA DE ALIMENTOS

Los resultados de la ingesta de alimentos se resumen en la Tabla 2. Los valores son valores absolutos (gramos/ratón/día) y son medias ± D.T. de 17 jaulas (todos los ratones; antes de agruparlos) o 4-6 jaulas (después de agruparlos y comenzar el tratamiento).

TABLA 2

continuación

No hubo diferencias en la ingesta de alimentos entre el grupo tratado con evinacumab en comparación con el grupo de control.

COLESTEROL EN PLASMA

Los resultados del colesterol en plasma se resumen en las Tablas 3 y 4 y en las Figuras 2A y 2B. Los valores son valores absolutos (mM) y son medias ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 3

TABLA 4

El tratamiento con evinacumab, condujo a una disminución significativa del colesterol en plasma en comparación con el grupo de control en todos los puntos de tiempo (disminución promedio del 52 %). Al final del experimento, la exposición al colesterol durante el experimento (0-13 semanas período de preinclusión) disminuyó significativamente con el tratamiento con evinacumab (con un 41 %, p<0,001) en comparación con el grupo de control.

TRIGLICERIDOS EN PLASMA

Los resultados de triglicéridos en plasma se resumen en la Tabla 5 y la Figura 3. Los valores son valores absolutos (mM) y son medias ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 5

El tratamiento con evinacumab, condujo a una disminución significativa de los triglicéridos en plasma en comparación con el grupo de control en todos los puntos de tiempo (disminución promedio del 84 %).

PERFILES DE LIPOPROTEÍNAS

Las lipoproteínas se separaron en una columna Superose. En las Figuras 4A, 4B y 4C [colesterol] y 5A, 5B y 5C [triglicéridos] se muestran las fracciones de colesterol y triglicéridos en t = 0, t = 6 semanas y t = 13 semanas. Los valores son valores absolutos de las mediciones de colesterol y triglicéridos en plasma combinado por grupo en t = 0, 6 y 13 semanas. Para los fines de este análisis, las fracciones 3-7 se consideraron VLDL; las fracciones 8-16 IDL/LDL y las fracciones 17-24 HDL.

A t = 0, antes de iniciar los tratamientos, no se observaron diferencias en los perfiles de lipoproteínas, mientras que después de 6 y 13 semanas de tratamiento con evinacumab, los niveles de colesterol en plasma, medido en las muestras combinadas por grupo, disminuyeron en el pico de VLDL-LDL en comparación con el grupo de control, y parecieron aumentar en el pico de HDL (véanse las Figuras 4B y 4C). Los perfiles de triglicéridos mostraron un patrón similar (véanse las Figuras 5A, 5B y 5C).

Estos datos están de acuerdo con las disminuciones observadas en los niveles de triglicéridos y colesterol total de animales individuales durante el estudio.

ÁREA DE LESIÓN DE ATEROSCLEROSIS

El área de la lesión aterosclerótica se resume en la Tabla 6 y en las Figuras 6A y 6B. Los valores son áreas absolutas de lesión en la raíz aórtica por sección transversal y se expresan como medias ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 6

El área total de lesión en la raíz aórtica del grupo de control fue de 216082 |jm2 por sección transversal después del sacrificio en t = 13 semanas. El tratamiento con evinacumab disminuyó significativamente el área total de la lesión en un 39 % (p<0,001) en comparación con el grupo de control después del sacrificio.

ATEROSCLEROSIS: NÚMERO DE LESIONES

El número de lesiones ateroscleróticas por sección transversal se resume en la Tabla 7. Los valores son valores absolutos (número de lesiones) y se expresan como medias ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 7

No hubo diferencias en el número de lesiones entre el grupo tratado con evinacumab en comparación con el grupo de control.

ATEROSCLEROSIS: GRAVEDAD DE LA LESIÓN

Los resultados de la gravedad de la lesión aterosclerótica se resumen en la Tabla 8. Los valores son porcentajes de lesiones totales y se expresan como medias ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 8

No hubo diferencias en la gravedad de la lesión entre el grupo tratado con evinacumab en comparación con el grupo de control.

ATEROSCLEROSIS: SEGMENTOS NO AFECTADOS

El número de segmentos ateroscleróticos no afectados se resume en la Tabla 9. Los valores representan el porcentaje de segmentos no afectados ("no afectados" o sanos). Los valores son medias ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 9

No hubo diferencias en la cantidad de segmentos no afectados entre el grupo tratado con evinacumab en comparación con el grupo de control.

ATEROSCLEROSIS: CONTENIDO DE MACRÓFAGOS

El contenido de macrófagos de las lesiones se resume en la Tabla 10 y en la Figura 7A. Los valores son valores absolutos (|jm2 *1000) o valores relativos (% de lesión) y se expresan como media ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 10

El tratamiento con evinacumab tendía a disminuir el contenido de macrófagos por sección transversal en las lesiones ateroscleróticas de tipo IV-V en comparación con el grupo de control. Sin embargo, esta diferencia no se observó después de la corrección para el área total de la lesión y se expresó como porcentaje de macrófagos en las lesiones de tipo IV-V (Figura 7A).

ATEROSCLEROSIS: CONTENIDO NECRÓTICO

El contenido necrótico de las lesiones se resume en la Tabla 11 y en la Figura 7A. Los valores son valores absolutos ( jm 2*1000) o valores relativos (% de lesión) y se expresan como media ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 11

El tratamiento con evinacumab disminuyó significativamente el contenido necrótico por sección transversal en las lesiones ateroscleróticas de tipo IV-V en comparación con el grupo de control (con un 69 %, p<0,001). Después de la corrección para el área total de la lesión, el porcentaje de área necrótica en las lesiones de tipo IV-V también disminuyó significativamente en comparación con el grupo de control (con 45 %, p = 0,001) (Figura 7A).

ATEROSCLEROSIS: CÉLULAS DE MÚSCULO LISO EN CAPA FIBRÓTICA

La cuantificación de células de músculo liso (SMC) en la capa fibrótica de las lesiones se resume en la Tabla 12 y en la Figura 7B. Los valores son valores absolutos ( jm 2*1000) o valores relativos (% de lesión) y se expresan como media ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 12

El tratamiento con evinacumab disminuyó significativamente el área de células de músculo liso (SMC) por sección transversal en las lesiones ateroscleróticas de tipo IV-V en comparación con el grupo de control (con un 39 %, p = 0,009). Sin embargo, después de la corrección para la lesión total, el porcentaje de SMC en la capa fibrótica en las lesiones de tipo IV-V no disminuyó significativamente en comparación con el grupo de control (Figura 7B).

ATEROSCLEROSIS: CONTENIDO DE COLÁGENO

El contenido de colágeno de las lesiones se resume en la Tabla 13 y en la Figura 7B. Los valores son valores absolutos (|jm2*1000) o valores relativos (% de lesión) y se expresan como media ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 13

Análisis no paramétrico: prueba U de Mann-Whitney

El tratamiento con evinacumab disminuyó significativamente el contenido de colágeno por sección transversal en las lesiones ateroscleróticas de tipo IV-V en comparación con el grupo de control (con un 40 %, p = 0,009). Sin embargo, después de la corrección para el área total de lesión, el porcentaje de colágeno en las lesiones de tipo IV-V no disminuyó significativamente en comparación con el grupo de control (Figura 7B).

ATEROSCLEROSIS: ADHESIÓN DE MONOCITOS

El porcentaje de monocitos por sección transversal se resume en la Tabla 14. Los valores son valores absolutos (número de monocitos adherentes por sección transversal) y se expresan como medias ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 14

continuación

La adhesión de monocitos al endotelio activado en la pared vascular de la raíz aórtica no se vio afectada por el tratamiento con evinacumab en comparación con el grupo de control.

ATEROSCLEROSIS: ÍNDICE DE ESTABILIDAD

La estabilidad de la placa de las lesiones (expresada en términos de índice de estabilidad) se resume en la Tabla 15. El índice de estabilidad se define como la suma de los marcadores de estabilización SMC y contenido de colágeno dividida por la suma de los marcadores de desestabilización macrófagos y contenido necrótico. Este valor proporciona una medida de la estabilidad de la placa. Los valores son medias ± D.T. de 14-15 ratones por grupo.

TABLA 15

El tratamiento con evinacumab no tuvo efecto sobre el índice de estabilidad en comparación con el grupo de control.

SUMARIO ASPECTOS DE SEGURIDAD

No se observaron efectos sobre el peso corporal (ganancia) y la ingesta de alimentos con el tratamiento con evinacumab en comparación con el control.

REDUCCIÓN DE LOS NIVELES DE VLDL Y LDL

Los ratones APOE*3Leiden.CETP son un modelo bien establecido para la disbetalipoproteinemia familiar (FD) en seres humanos que se caracteriza por la acumulación de lipoproteínas remanentes y un aumento de la relación entre VLDL-C y LDL-C. El perfil de lipoproteínas en ratones APOE*3Leiden.CETP refleja el de los pacientes con FD con una respuesta similar a las terapias de modificación de lípidos. Esto se ilustra mediante una reducción comparable del colesterol en todas las sustracciones de lipoproteínas que contienen apoB con tratamiento con estatinas 25 y fenofibrato y niacina.

En el presente estudio, el tratamiento con evinacumab redujo significativamente el colesterol total promedio (CT) (­ 52 %, p<0,001) y los triglicéridos (TG) (-84 %, p<0,001) en comparación con el control, que se limitó a las fracciones no HDL.

REDUCCIÓN DEL TAMAÑO DE LA LESIÓN Y DEL ÁREA NECRÓTICA

En el presente estudio, evinacumab redujo significativamente el tamaño de la lesión (-39 %, p < 0,001) en comparación con el grupo de control. No se encontraron diferencias significativas en el número de lesiones, segmentos no afectados o gravedad de la lesión.

El tratamiento con evinacumab disminuyó significativamente el contenido necrótico como porcentaje del tamaño total de la lesión en lesiones graves de tipo IV-V (con un 45 %, p = 0,001), pero no afectó al contenido de macrófagos, el contenido de colágeno o al área de SMC, dando como resultado un índice de estabilidad de la lesión similar al del grupo de control. Evinacumab no afectó el reclutamiento de monocitos en el endotelio activado.

El contenido necrótico fue el único marcador de la composición de la placa que cambió en términos de área absoluta y también como porcentaje del área total de la lesión. Una posible explicación puede ser un cambio en la composición de la población de macrófagos en la placa desde los macrófagos "asesinos" M1 más proinflamatorios a los macrófagos M2 "reparadores" más curativos, que pueden eliminar el colesterol de la placa.

CONCLUSIÓN

De manera colectiva, los resultados expuestos en este Ejemplo muestran que el anticuerpo monoclonal anti-ANGPTL3, evinacumab, disminuye los lípidos plasmáticos y previene la progresión de la aterosclerosis en ratones APOE*3Leiden.CETP. Evinacumab no tuvo efecto sobre el número de lesiones, la gravedad de las lesiones o la estabilidad de la placa, pero redujo significativamente el área de lesión y el área del núcleo necrótico.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de la proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3) para su uso en un método para reducir la progresión de la aterosclerosis en un sujeto, comprendiendo el método seleccionar un sujeto que tiene aterosclerosis y administrar al sujeto una o más dosis del inhibidor de la proteína 3 similar a la angiopoyetina, en donde el inhibidor de ANGPTL3 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a ANGPTL3 y que comprende secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada y ligera que tienen las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8 y 9.

2. El inhibidor de ANGPTL3 para su uso en el método de la reivindicación 1, en donde el sujeto, antes o en el momento del inicio del tratamiento con una o más dosis del inhibidor de ANGPTL3, ha recibido un diagnóstico de hipercolesterolemia familiar heterocigota (HeFH) o hipercolesterolemia familiar homocigota (HoFH) y/o lipoproteína(a) elevada (Lp[a]).

3. El inhibidor de ANGPTL3 para su uso en el método de la reivindicación 1, en donde el sujeto, antes o en el momento del inicio del tratamiento con una o más dosis del inhibidor de ANGPTL3, ha recibido un diagnóstico de enfermedad cardiovascular (CVD) o ha sufrido un accidente cerebrovascular o infarto de miocardio.

4. El inhibidor de ANGPTL3 para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el sujeto se está sometiendo a una terapia modificadora de lípidos (LMT) de base estable antes o en el momento del inicio del tratamiento con una o más dosis del inhibidor de ANGPTL3, o simultáneamente con la administración de dichas una o más dosis del inhibidor de ANGPTL3, opcionalmente en donde la LMT de base estable es una terapia con estatinas de dosis baja, moderada o alta.

5. El inhibidor de ANGPTL3 para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la administración de dichas una o más dosis del inhibidor de ANGPTL3 al sujeto da como resultado una o más consecuencias terapéuticas seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) una reducción del nivel de colesterol total (CT) en suero,

(b) una reducción del nivel de triglicéridos (TG) en suero,

(c) una reducción del nivel de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en suero, y

(d) una reducción del nivel de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) en suero;

en donde la reducción de (a), (b), (c) y/o (d) se determina en relación con el nivel de CT en suero, el nivel de TG en suero, el nivel de LDL en suero y/o el nivel de VLDL en suero del sujeto antes o en el momento del inicio del tratamiento con dichas una o más dosis del inhibidor de ANGPTL3.

6. El inhibidor de ANGPTL3 para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la administración de dichas una o más dosis del inhibidor de ANGPTL3 al sujeto da como resultado una reducción en la formación de placas ateroscleróticas.

7. El inhibidor de ANGPTL3 para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a ANGPTL3 comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

8. El inhibidor de ANGPTL3 para su uso en el método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a ANGPTL3 es evinacumab.

9. El inhibidor de ANGPTL3 para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además administrar una o más dosis de un inhibidor de proproteína convertasa subtilisina kexina-9 (PCSK9) al sujeto, en donde el inhibidor de PCSK9 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PCSK9.

10. El inhibidor de ANGPTL3 para su uso en el método de la reivindicación 9, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PCSK9 se selecciona del grupo que consiste en alirocumab, evolocumab, bococizumab, lodelcizumab y ralpancizumab.

11. El inhibidor de ANGPTL3 para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además administrar una o más dosis de un inhibidor de ANGPTL4 y/o inhibidor de ANGPTL8 al sujeto, en donde el inhibidor de ANGPTL4 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a ANGPTL4, en donde el inhibidor de ANGPTL8 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a ANGPTL8.

12. Una composición farmacéutica para su uso en un método para reducir la progresión de la aterosclerosis en un sujeto, en donde la composición comprende un inhibidor de la proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3), y en donde se administran al sujeto una o más dosis del inhibidor de la proteína 3 similar a la angiopoyetina (ANGPTL3), en donde el inhibidor de ANGPTL3 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a ANGPTL3 y que comprende secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada y ligera que tienen las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8 y 9.