RS64476B1 - Postupci za lečenje ili sprečavanje ateroskleroze davanjem inhibitora angptl3 - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Prikazani pronalazak se odnosni na upotrebu inhibitora ANGPTL3 za smanjenje napredovanja ateroskleroze.

[0002] Ateroskleroza je sindrom koji pogađa arterijske krvne sudove. Ateroskleroza je rezultat hroničnog inflamatornog odgovora u zidovima arterija i glavni je uzrok smrti i kardiovaskularnog morbiditeta. Ateroskleroza obuhvata zadebljanje zidova arterija i karakteriše je razvoj arterijskog plaka i eventualno ograničenje ili blokada protoka krvi. Trenutni tretmani ateroskleroze uključuju modifikacije u ishrani i načinu života (npr. prestanak pušenja), farmaceutske intervencije (npr. statini, antikoagulansi, itd.) i hirurgiju (npr. angioplastika, stentovi, bajpas operacija, itd.). Direktna evaluacija efikasnosti farmaceutskih intervencija na razvoj ateroskleroze kod ljudi je problematična zbog poteškoća u preciznom otkrivanju i merenju plaka i arterijskih lezija kod živih subjekata. Životinjski modeli ateroskleroze su stoga veoma korisni za razvoj i testiranje novih terapijskih tretmana za aterosklerozu.

[0003] U ovoj oblasti tehnike su potrebni novi postupci za lečenje, prevenciju ili ublažavanje ateroskleroze.

[0004] WO 2012/174178 opisuje potpuno humano antitelo fragmeta koji se vezuje za antigen humanog antitela koji se specifično veže i inhibira ili ometa najmanje jednu aktivnost humanog proteina 3 sličnog angiopoietinu (hANGPTL3). WO 2011/085271 opisuje postupke jedinjenja i kompozicije za smanjenje ekspresije ANGPTL3 mRNK i proteina kod životinja.

KRATKA SUŠTINA PRONALASKA

[0005] Bilo koje pozivanje u ovom opisu na postupke lečenja odnosi se na jedinjenje, farmaceutske kompozicije i lekove prema prikazanom pronalasku za upotrebu u postupcima za lečenje humanog (ili životinjskog) tela terapijom. Prikazani pronalazak obezbeđuje inhibitor proteina 3 sličnog angiopoietinu (ANGPTL3) za upotrebu u postupku smanjenja napredovanja ateroskleroze kod subjekta, postupak obuhvata odabir subjekta koji ima aterosklerozu i davanje jedne ili više doza inhibitora ANGPTL3 subjektu, gde je inhibitror ANGPTL3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji specifično veže ANGPTL3, koji sadrži aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca CDR koje imaju SEQ ID NOs:4, 5, 6, 7, 8, i 9. Postupci lečenja mogu dovesti do smanjenja aterosklerotskog plaka i obrazovanja aterosklerotskih lezija kod subjekta kome je to potrebno. Postupci su takođe korisni za smanjenje ukupnog holesterola u serumu, LDL holesterola, i triglicerida kod subjekta, i za lečenje bolesti i poremećaja koji se leče smanjenjem jednog ili više od ukupnog holesterola, LDL holesterola i/ili triglicerida.

[0006] Prema izvesnim izvođenjima prema prikazanom pronalasku, kod subjekata, pre ili u vreme početka lečenja sa jednom ili više doza inhibitora ANGPTL3, sa dijagnozom heterozigotne porodične hiperholesterolemije (HeFH) ili homozigotne porodične hiperholesterolemije (HoFH), i/ili povećanog lipoproteina(a) (Lp[a]). Prikazani pronalazak takođe uključuje inhibitor ANGPTL3 kako je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u postupcima smanjenja napredovanja ateroskleoze kod subjekta koji ima hiperholesterolemiju koja nije porodične prirode (tj., neporodična hiperholesterolemija). Subjekti koji se leče postupcima, u izvesnim izvođenjima, uključuju one subjekte koji imaju ili kod kojih je dijagnozirana kardiovaskularna bolest (npr., aterosklerotska kardiovaskularna bolest). U izvesnim izvođenjima, subjekt koji se leči je subjekt koji je pretrpeo moždani i miokrdijalni infarkt.

[0007] Prema izvesnim izvođenjima prikazanog pronalaska, inhibitor ANGPTL3 je davan pacijentu kao dodatna terapija pacijentovoj postojećoj terapiji za modifikovanje lipida (npr., povrh pacijentove trenutne standardne terapije statinima).

[0008] Druga izvođenja prikazanog pronalaska će biti očigledna iz pregleda sledećeg detaljnog opisa.

KRATAK OPIS SLIKA

[0009]

Slika 1 je dijagram toka ispitivanja koji prikazuje procedure, davanje i merenja koja se vrše na životinjama tokom ispitivanja ovde opisanog u Primeru 2.

Slike 2A i 2B pokazuju nivoe holesterola kod životinja iz različito tretiranih grupa (tretirana kontrola, zatvoreni kvadrati [ ■]; ili tretirana evinakumabom, zatvoreni krugovi [ ●]) u različitim vremenskim tačkama tokom ovde opisanog ispitivanja u Primeru 2. Slika 2A pokazuje srednje nivoe holesterola (mM) u toku vremena (u nedeljama). Slika 2B prikazuje ukupnu izloženost holesterolu (mM x ned.) u 13.nedelji.

Slika 3 prikazuje nivoe triglicerida (mM) životinja iz različito tretiranih grupa (tretirana kontrola, zatvoreni kvadrati [ ■]; ili tretirana evinakumabom, zatvoreni krugovi [ ●]) u različitim vremenskim tačkama tokom ovde opisanog ispitivanja u Primeru 2.

Slike 4A, 4B, i 4C prikazuju lipoproteinske profile holesterola (mM, posle odvajanja lipoproteina) životinja iz različito tretiranih grupa (tretirane kontrole, zatvoreni kvadrati [ ■]; ili tretirana evinakumabom, zatvoreni krugovi [ ●]) u različitim vremenskim tačkama tokom ispitivanja ovde opisanog u Primeru 2. Lipoproteini su odvojeni na Superose koloni, i prikazane vrednosti su apsolutne vrednosti iz merenja holesterola iz sakupljene plazme po grupi u različitim naznačenim vremenskim tačkama. Slika 4A prikazuje nivoe holesterola iz različitih frakcija plazme izvučene u datom trenutku =0 nedelja ispitivanja. Slika 4B prikazuje nivoe holesterola iz različitih frakcija plazme uzetih u vreme = 6. nedelja ispitivanja. Slika 4C prikazuje nivoe holesterola iz različitih frakcija plazme uzetih u vreme = 13. nedelja ispitivanja .

Slike 5A, 5B, i 5C prikazuju profile lipoproteina triglicerida (mM, posle odvajanja lipoproteina) životinja iz različito tretiranih grupa (tretirane kontrole, zatvoreni kvadrati [ ■]; ili tretirana evinakumabom, zatvoreni krugovi [ ●]) u različitim vremenskim tačkama tokom ovde opisanog ispitivanja u Primeru 2. Lipoproteini su bili odvojeni na Superose koloni, i vrednosti prikazane su apsolutne vrednosti iz merenja triglicerida u sakupljenoj plazmi po grupi u različitim naznačenim vremenskom tačkama. Slika 5A prikazuje nivoe triglicerida iz različitih frakcija plazme uzetih u vreme =0 nedlja ispitivanja. Slika 5B prikazuje nivoe triglicerida iz različitih frakcija plazme uzetih u vreme =6. nedelja ispitivanja. Slika 5C prikazuje nivoe triglicerida iz različitih frakcija plazme uzetih u vreme =13. nedelja ispitivanja.

Slike 6A i 6B pokazuju površnu aterosklerotskih lezija životinja iz različito tretiranih grupa (tretirane kontrole, otvoren stubić ili krugovi; ili tretirana evinakumabom, zatvoren stubić ili krugovi) u 13. nedelji ispitivanja ovde opisanog u primeru 2. Slika 6A prikazuje srednju vrednost površine aterosklerotnih lezija po poprečnom preseku (x1000 μm<2>) za različito tretirane grupe. Slika 6B je rasuti dijagram ukupne površine lezija, koji prikazuje površinu aterosklerotskih lezija po poprečnom preseku (x1000 μm<2>) za pojedinačne životinje u različito tretiranim grupama .

Slike 7A i 7B pokazuju srednju vrednost nekrotičkog sadržaja poprečnog preseka iz aterosklerotskih lezija, kategorisanih kao tip IV ili tip V, primećenih kod životinja iz različito tretiranih grupa (tretirana kontorla, otvoren stubić; ili tretirana evinakumabom, zatvoren stubić) u 13. nedelji ispitivanja ovde opisanog u 2. Slika 7A pokazuje apsolutnu vrednost ( μm<2>x1000) nekrotične površine po poprečnom preseku.

Slika 7B pokazuje relativne vrednosti (procenat površine lezija) nekrotičnog sadržaja lezija.

DETALJNI OPIS

[0010] Pre nego što bude opisan predmetni pronalazak, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određene postupke i opisane eksperimentalne uslove, pošto takvi postupci i uslovi mogu da variraju. Takođe treba razumeti da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisivanja određenih izvođenja, i nije namera da bude ograničavajuća, pošto će obim ovog pronalaska biti ograničen samo priloženim zahtevima.

[0011] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi korišćeni ovde imaju isto značenje koje obično razume stručnjak iz oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Kako se ovde koristi, izraz "oko", kada se koristi u odnosu na određenu navedenu numeričku vrednost, znači da vrednost može da varira od navedene vrednosti za najviše 1%. Na primer, kako se ovde koristi, izraz "oko 100" uključuje 99 i 101 i sve vrednosti između (npr.99.1, 99.2, 99.3, 99.4, itd.).

[0012] Iako se bilo koji postupak i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ovog pronalaska, sada su opisani poželjni postupci i materijali.

Postupci za smanjenje napredovanja ateroskleroze

[0013] Ovaj pronalazak se uopšteno odnosi na upotrebu inhibitora proteina-3 (ANGPTL3) sličnog angiopoietinu kao što je definisano u patentnim zahtevima za smanjenje napredovanja ateroskleroze kod subjekta. Inhibitor proteina-3 (ANGPTL3) sličnog angiopoietinu kao što je definisano u patentim zahtevima koristi se u jednoj ili više doza. Prema određenim izvođenjima, upotreba inhibitora proteina-3 (ANGPTL3) sličnog angiopoietinu kao što je definisano u patentnim zahtevima dovodi do smanjenja obrzovanja aterosklerotskog plaka kod subjekta. Na primer, upotreba inhibitora proteina-3 (ANGPTL3) sličnog angiopoietinu kao što je definisano u zahtevima može dovesti do jednog ili više smanjenja površine aterosklerotskih lezija i/ili smanjenja nekrotične oblasti aterosklerotskih lezija kod subjekta.

Odabir pacijenata

[0014] U skladu sa ovim pronalaskom, subjekti koji se mogu lečiti ovim postupcima su subjekti koji imaju ili im je dijagnostikovana ateroskleroza. Shodno tome, postupci uključuju odabir subjekta koji ima aterosklerozu i davanje subjektu jedne ili više doza inhibitora proteina-3 (ANGPTL3) sličnog angiopoietinu.

[0015] Prema određenim izvođenjima ovog pronalaska, subjekt koji se može lečiti ovim postupcima je subjekt kome je, pre ili u vreme početka lečenja sa jednom ili više doza inhibitora ANGPTL3, dijagnostikovana heterozigotna porodična hiperholesterolemija (HeFH), homozigotna porodična hiperholesterolemija (HoFH), povišeni lipoprotein(a) (Lp[a]), autozomno dominantna hiperholesterolemija (ADH, npr. ADH povezan sa jednom ili više mutacija sticanja funkcije u LDLR genu, ApoB genu i/ili genu PCSK9), autozomna recesivna hiperholesterolemija (ARH, npr. ARH povezana sa mutacijama u LDLRAP1), kao i slučajevi hiperholesterolemije koje se razlikuju od porodične hiperholesterolemije (neFH). Dijagnoza porodične hiperholesterolemije (npr. heFH ili hoFH) može se postaviti genotipizacijom i/ili kliničkim kriterijumima. Za pacijente koji nisu genotipizovani, klinička dijagnoza se može zasnivati ili na kriterijumima Simon Broome sa kriterijumima za definitivnu FH, ili na kriterijumima SZO/Holandske mreže lipida sa rezultatom > 8 poena.

[0016] Prema određenim izvođenjima ovog pronalaska, subjekt koji se može lečiti ovim postupkom je subjekt kome je dijagnostikovana kardiovaskularna bolest (CVD) pre ili u vreme početka lečenja jednom ili više doza inhibitora ANGPTL3. Subjekt se može takođe izabrati na osnovu toga da ima istoriju koronarne bolesti srca (CHD). Kako se ovde koristi, "istorija CHD" (ili "dokumentovana istorija CHD") uključuje jedno ili više od: (i) akutnog infarkta miokarda (MI); (ii) tihog MI; (iii) nestabilne angine; (iv) postupka koronarne revaskularizacije (npr., perkutane koronarne intervencije [PCI] ili operacije koronarne arterijske bajpas operacije [CABG]); i/ili (v) klinički značajne CHD dijagnostikovane invazivnim ili neinvazivnim testiranjem (kao što je koronarna angiografija, test opterećenja pomoću trake za trčanje, stres ehokardiografija ili nuklearno snimanje).

[0017] U skladu sa određenim izvođenjima ovog pronalaska, subjekt koji se može lečiti ovim postupcima može biti izabran na osnovu kardiovaskularne bolesti koja nije koronarna bolest srca ("ne-CHD CVD"). Kako se ovde koristi, "ne-CHD CVD" uključuje jedno ili više od: (i) dokumentovanog prethodnog ishemijskog moždanog udara sa fokalnim ishemijskim neurološkim deficitom koji je trajao više od 24 sata, za koje se smatra da su aterotrombotičkog porekla; (ii) bolesti perifernih arterija; (iii) aneurizme abdominalne aorte; (iv) aterosklerotične stenoze bubrežne arterije; i/ili (v) bolest karotidne arterije (prolazni ishemijski napadi ili opstrukcija >50% karotidne arterije).

[0018] U skladu sa određenim izvođenjima ovog pronalaska, subjekt koji se može lečiti ovim postupcima može biti izabran na osnovu toga što ima jedan ili više dodatnih faktora rizika kao što je, npr., (i) dokumentovana umerena hronična bolest bubrega (CKD) kako je definisano 30 ≤eGFR <60 mUmin/1,73 m2 tokom 3 meseca ili više; (ii) dijabetes melitus tipa 1 ili tipa 2 sa ili bez oštećenja ciljnog organa (npr. retinopatija, nefropatija, mikroalbuminurija); i/ili (iii) izračunatog 10-godišnjeg fatalnog rizika CVD REZULTAT ≥5% (ESC/EAS Smernice za lečenje dislipidemija, Conroy et al., 2003, Eur. Heart J.24:987-1003).

[0019] Prema određenim izvođenjima ovog pronalaska, subjekt koji se može lečiti ovim postupcima može biti izabran na osnovu toga što ima jedan ili više dodatnih faktora rizika izabranih iz grupe koju čine starost (npr. stariji od 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ili 80 godina), rasa, nacionalno poreklo, pol (muški ili ženski), navike vežbanja (npr. redovno vežbanje, ne vežbanje), druga postojeća medicinska stanja (npr. dijabetes tipa II , visok krvni pritisak, itd.), i trenutni status lekova (npr., trenutno uzimanje beta blokatora, niacina, ezetimiba, fibrata, omega-3 masnih kiselina, smola žučnih kiselina, itd.).

[0020] Prema određenim izvođenjima ovog pronalaska, subjekt koji se može lečiti ovim postupcima pokazuje povišen nivo jednog ili više inflamatornih markera. Bilo koji marker sistemske inflamacije može se koristiti za svrhe ovog pronalaska. Pogodni inflamatorni markeri uključuju, bez ograničenja, C-reaktivni protein, citokine (npr. II-6, IL-8 i/ili IL-17) i molekule ćelijske adhezije (npr. ICAM-1, ICAM-3, BL- CAM, LFA-2, VCAM-1, NCAM i PECAM).

[0021] U skladu sa određenim izvođenjima ovog pronalaska, subjekt koji se može lečiti postupcima može biti izabran na osnovu kombinacije jednog ili više prethodno navedenih kriterijuma selekcije ili terapeutskih karakteristika. Na primer, prema određenim izvođenjima, subjekat pogodan za lečenje ovim postupcima može se dalje odabrati na osnovu heFH ili ne-FH u kombinaciji sa: (i) istorijom dokumentovane CHD, (ii) ne-CHD CVD i/ili (iii) dijabetes melitusa sa oštećenjem ciljnog organa; takvi pacijenti takođe mogu biti odabrani na osnovu toga da li imaju koncentraciju LDLC u serumu veću ili jednaku 70 mg/dL.

[0022] U skladu sa određenim izvođenjima ovog pronalaska, subjekat koji se može lečiti ovim postupcima ima hiperholesterolemiju koja nije adekvatno kontrolisana terapeutskim režimom statina sa dnevnom umerenom dozom, i može se dalje birati na osnovu heFH ili ne-FH bez CHD, ili ne-CVD CVD, ali sa (i) izračunatim 10-godišnjim REZULTATOM od fatalnog rizika od CVD ≥5%; ili (ii) dijabetes melitus bez oštećenja ciljnog organa; takvi subjekti takođe mogu biti odabrani na osnovu toga da imaju koncentraciju LDL-C u serumu veću ili jednaku 100 mg/dL.

[0023] Prema određenim izvođenjima ovog pronalaska, subjekt koji se može lečiti ovim postupcima je subjekt koji ima sindrom porodične hilomikronemije (FCS; takođe poznat kao nedostatak lipoproteinske lipaze).

[0024] Prema određenim izvođenjima ovog pronalaska, subjekt koji se može lečiti ovim postupcima je subjekt koji je podvrgnut ili je nedavno bio podvrgnut lipoproteinskoj aferezi (npr. u poslednjih šest meseci, u poslednjih 12 nedelja, u poslednjih 8 nedelja, u poslednjih 6 nedelja, u poslednje 4 nedelje, u poslednje 2 nedelje, itd.).

Davanje inhibitora ANGPTL3 kao dopunska terapija

[0025] Ovaj pronalazak obuhvata inhibitor ANGPTL3 kao što je definisano u zahtevima za upotrebu u postupcima smanjenja progresije ateroskleroze kod subjekta, pri čemu se subjektu daje inhibitor ANGPTL3 prema određenoj količini i učestalosti doziranja, i gde se primenjuje inhibitor ANGPTL3 kao dodatak pacijentovoj već postojećoj terapiji za modifikaciju lipida (LMT), kao što je dodatak pacijentovom već postojećem dnevnom režimu terapije statinima. (Specifični, primeri dnevnih terapijskih režima statina kojima se može dodati inhibitor ANGPTL3 opisani su na drugom mestu).

[0026] Na primer, postupci obuhvataju dodatne terapeutske režime u kojima se inhibitor ANGPTL3 primenjuje kao dodatna terapija istom stabilnom dnevnom režimu terapije statina (tj. istu količinu doziranja statina) na kojoj je pacijent bio pre nego što je primio inhibitor ANGPTL3. U drugim izvođenjima, inhibitor ANGPTL3 se primenjuje kao dodatna terapija terapijskom režimu statina koji obuhvata statin u količini koja je veća ili manja od doze statina koju je pacijent uzimao pre nego što je primio inhibitor ANGPTL3. Na primer, nakon započinjanja terapijskog režima koji se sastoji od inhibitora ANGPTL3 koji se primenjuje u određenoj učestalosti i količini doziranja, dnevna doza statina koja se daje ili prepisuje pacijentu može (a) ostati ista, (b) povećati ili (c) smanjiti (npr. povećanje ili smanjenje titracije) u poređenju sa dnevnom dozom statina koju je pacijent uzimao pre početka terapijskog režima inhibitora ANGPTL3, u zavisnosti od terapijskih potreba pacijenta.

Terapeutska efikasnost

[0027] Postupci dovode do smanjenja obrazovanja aterosklerotskog plaka u arterijama subjekta, i/ili prevencije napredovanja ateroskleroze kod subjekta. Na primer, postupci su korisni za ograničavanje ili smanjenje oblasti aterosklerotskih lezija i/ili nekrotičnog jezgra u aterosklerotskim lezijama kod subjekta.

[0028] Postupci mogu dodatno da dovedu do smanjenja nivoa u serumu jedne ili više lipidnih komponenti odabranih iz grupe koju čine LDL-C, ApoB100, ne-HDL-C, ukupni holesterol, VLDL-C, trigliceridi, Lp(a) i ostatak holesterola. Na primer, u skladu sa određenim izvođenjima ovog pronalaska, davanje farmaceutske kompozicije koja sadrži inhibitor ANGPTL3 pogodnom subjektu će dovesti do srednje vrednosti procenta smanjenja u odnosu na početnu vrednost serumskog lipoprotein holesterola niske gustine (LDL-C) od najmanje oko 25 %, 30%, 40%, 50%, 60% ili više; srednji procenat smanjenja u odnosu na početnu vrednost ApoB100 od najmanje oko 25%, 30%, 40%, 50%, 60% ili više; srednje vrednosti procenta smanjenja u odnosu na početnu vrednost ne-HDL-C od najmanje oko 25%, 30%, 40%, 50%, 60% ili više; srednje vrednosti procenta smanjenja ukupnog holesterola od početne vrednosti za najmanje oko 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili više; srednje vrednosti procenta smanjenja VLDL-C u odnosu na početnu vrednost za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% ili više; srednje vrednosti procenta smanjenja triglicerida od početne vrednosti za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili više; i/ili srednje vrednosti procenta smanjenja Lp(a) u odnosu na početnu vrednost od najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25% ili više.

Inhibitori ANGPTL3

[0029] Postupci ovog pronalaska obuhvataju davanje pacijentu terapeutske kompozicije koja sadrži inhibitor ANGPTL3. U kontekstu ovog pronalaska, inhibitori ANPTL3 su anti-ANGPTL3 antitela ili fragmenti antitela koji se vezuju za antigen koji specifično vezuju humani ANGPTL3 koji sadrže CDR aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca koji imaju SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8 i 9.

[0030] Termin "protein 3 sličan humanom angiopoietinu" ili "humani ANGPTL3" ili "hANGPTL3", kako se ovde koristi, odnosi se na ANGPTL3 koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:1 (videti takođe NCBI pristup NP_055310), ili njegov biološki aktivni fragment.

[0031] Termin "antitelo", kako se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi na molekule imunoglobulina koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, kao i njihove multimere (npr. IgM). Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno HCVR ili VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca obuhvata tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno LCVR ili VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca obuhvata jedan domen (CL1). VHi VLregioni se mogu dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regionima koji određuju komplementarnost (CDR), ispresecane regionima koji su više konzervirani, nazvanim regionima okvira (FR). Svaki VHi VLse sastoji od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od amino-kraja do karboksi-kraja u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U različitim izvođenjima pronalaska, FR antitela anti-ANGPTL3 (ili njegovog dela koji se vezuje za antigen) mogu biti identični humanim germinativnim sekvencama, ili mogu biti prirodno ili veštački modifikovane. Aminokiselinska konsenzusna sekvenca može biti definisana na osnovu paralelne analize dva ili više CDR-a.

[0032] Termin "antitelo", kako se ovde koristi, takođe uključuje fragmente potpunih molekula antitela koji se vezuju za antigen. Termini "deo koji se vezuje za antigen" antitela, "fragment koji se vezuje za antigen" i slično, kako se ovde koristi, obuhvataju bilo koji prirodni, enzimski dobijen, sintetički ili genetski modifikovan polipeptid ili glikoprotein koji specifično vezuje antigen da obrazuje kompleks. Fragmenti antitela koji se vezuju za antigen mogu biti izvedeni, npr., iz potpunih molekula antitela korišćenjem bilo koje odgovarajuće standardne tehnike kao što su proteolitička digestija ili tehnike rekombinantnog genetskog inženjeringa koje uključuju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira antitelo varijabilnih i opciono konstantnih domena. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, na primer, komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uključujući, na primer, biblioteke fag-antitela), ili se može sintetizovati. DNK se može sekvencionirati i manipulisati hemijski ili korišćenjem tehnika molekularne biologije, na primer, da se uredi jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena u odgovarajuću konfiguraciju, ili da se uvedu kodoni, stvore cisteinski ostaci, modifikuju, dodaju ili izbrišu aminokiseline , itd.

[0033] Neograničavajući primeri fragmenata koji se vezuju za antigen uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab’)2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice za prepoznavanje koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji oponašaju hipervarijabilni region antitela (npr. izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili ograničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi kontruisani molekuli, kao što su antitela specifična za domen, antitela sa jednim domenom, antitela sa brisanim domenom, himerna antitela, CDR-kalemljena antitela, dijatela, trijatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela, itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni ajkula, takođe su obuhvaćeni izrazom "fragment koji se vezuje za antigen", kako se ovde koristi.

[0034] Fragment antitela koji se vezuje za antigen će tipično sadržati najmanje jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili sastava aminokiselina i generalno će sadržati najmanje jedan CDR koji je susedan ili u okviru sa jednom ili više okvirnih sekvenci. U fragmentima koji se vezuju za antigen koji imaju VHdomen povezan sa VLdomenom, VHi VLdomeni mogu biti locirani jedan u odnosu na drugi u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimeran i sadržati VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, fragment antitela koji se vezuje za antigen može da sadrži monomerni VHili VLdomen.

[0035] U određenim aspektima opisa, fragment antitela koji se vezuje za antigen može da sadrži najmanje jedan varijabilni domen kovalentno vezan za najmanje jedan konstantni domen. Neograničavajući, primeri konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koji se mogu naći u fragmentu antitela koji se vezuje za antigen uključuju: (i) VH-CH1 ; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji promenljivih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od konfiguracija navedenih gore kao primer, varijabilni i konstantni domeni mogu biti ili direktno povezani jedan sa drugim ili mogu biti povezani potpunim ili delimičnim zglobom ili povezujućim regionom. Zglobni region se može sastojati od najmanje 2 (npr.5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina koje dovode do fleksibilne ili polufleksibilne veze između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom polipeptidnom molekulu. Štaviše, fragment antitela koji se vezuje za antigen može da sadrži homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) bilo koje od konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena navedenih gore u nekovalentnoj povezanosti jedan sa drugim i/ili sa jednim ili više monomernih VHili VLdomena (npr. disulfidnom vezom(ama)).

[0036] Kao i kod punih molekula antitela, fragmenti koji se vezuju za antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr. bispecifični). Multispecifični fragment antitela koji se vezuje za antigen će tipično sadržati najmanje dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično veže za poseban antigen ili za drugi epitop na istom antigenu. Bilo koji multispecifični format antitela, uključujući primere formata bispecifičnih antitela koji su ovde otkriveni, može se prilagoditi za upotrebu u kontekstu fragmenta antitela koji se vezuje za antitela korišćenjem rutinskih tehnika dostupnih u tehnici.

[0037] Konstantni region antitela je važan u sposobnosti antitela da fiksira komplement i posreduje u citotoksičnosti zavisnoj od ćelije. Stoga, izotip antitela može biti izabran na osnovu toga da li je poželjno da antitelo posreduje u citotoksičnosti.

[0038] Termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, treba da obuhvati antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci humanog imunoglobulina germinativne linije. Humana antitela mogu ipak uključiti aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humane germinativne linije (npr. mutacije uvedene slučajnom mutagenozom ili mutagenozom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-ovima i posebno CDR3. Međutim, termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije namenjen da uključi antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije druge vrste sisara, kao što je miš, kalemljene na sekvence humanog okvira.

[0039] Termin "rekombinantno humano antitelo", kako se ovde koristi, treba da obuhvati sva humana antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela eksprimirana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina (opisano dalje u nastavku), antitela izolovana iz rekombinantne, kombinovane biblioteke humanih antitela (opisano dalje u nastavku), antitela izolovana od životinje (npr. miša) koja su transgena za gene humanog imunoglobulina (videti npr., Tailor et al. (1992) Nucl Acids Res.20:6287-6295) ili antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje sekvenci gena humanog imunoglobulina na druge sekvence DNK. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci humanog imunoglobulina germinativne linije. U određenim izvođenjima, međutim, takva rekombinantna humana antitela su podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada se koriste životinjska transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatskoj mutagenezi) i na taj način aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako su izvedene i povezane sa VHi VLsekvencama humane germinativne linije, možda prirodno ne postoje unutar repertoara germinativne linije humanih antitela in vivo.

[0040] Humana antitela mogu postojati u dva oblika koja su povezana sa heterogenošću šarke. U jednom obliku, molekul imunoglobulina sadrži stabilnu četvorolančanu konstrukciju od približno 150-160 kDa u kojoj se dimeri drže zajedno disulfidnom vezom između teških lanca. U drugom obliku, dimeri nisu povezani preko međulančanih disulfidnih veza i oblikuje se molekul od oko 75-80 kDa sastavljen od kovalentno kuplovanog lakog i teškog lanca (poluantitelo). Ove forme je bilo izuzetno teško razdvojiti, čak i nakon afinitetnog prečišćavanja.

[0041] Učestalost javljanja drugog oblika kod različitih intaktnih IgG izotipova je usled, ali nije ograničena na, strukturne razlike povezane sa izotipom šarke antitela. Jedna supstitucija aminokiseline u zglobnom regionu humanogIgG4 šarke može značajno smanjiti pojavu drugog oblika (Angal et al. (1993) Molecular Immunologi 30:105) na nivoe koji se tipično primećuju korišćenjem šarke humanog IgG1. Ovaj pronalazak obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u zglobu, CH2 ili CH3 regionu koje mogu biti poželjne, na primer, u proizvodnji, da bi se poboljšao prinos željenog oblika antitela.

[0042] "Izolovano antitelo", kako se ovde koristi, označava antitelo koje je identifikovano i izdvojeno i/ili regenerisano iz najmanje jedne komponente svog prirodnog okruženja. Na primer, antitelo koje je izdvojeno ili uklonjeno iz najmanje jedne komponente organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kojima antitelo prirodno postoji ili se prirodno proizvodi, je "izolovano antitelo" za potrebe ovog pronalaska. Izolovano antitelo takođe uključuje antitelo in situ unutar rekombinantne ćelije. Izolovana antitela su antitela koja su bila podvrgnuta najmanje jednom koraku prečišćavanja ili izolacije. Prema određenim izvođenjima, izolovano antitelo može biti suštinski bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

[0043] Izraz "specifično se vezuje" ili slično znači da antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen formira kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan u fiziološkim uslovima. Postupci za određivanje da li se antitelo specifično vezuje za antigen su dobro poznate u tehnici i uključuju, na primer, ravnotežnu dijalizu, površinsku plazmonsku rezonancu i slično. Na primer, antitelo koje "specifično vezuje" ANGPTL3, kako se koristi u kontekstu ovog opisa, uključuje antitela koja vezuju ANGPTL3 ili njegov deo sa KDmanjim od oko 1000 nM, manjim od oko 500 nM, manjim od oko 300 nM, manjim od oko 200 nM, manjim od oko 100 nM, manjim od oko 90 nM, manjim od oko 80 nM, manjim od oko 70 nM, manjim od oko 60 nM, manjim od oko 50 nM, manjim od oko 40 nM, manjim od oko 30 nM, manjim od oko 20 nM, manjim od oko 10 nM, manjim od oko 5 nM, manjim od oko 4 nM, manjim od oko 3 nM, manjim od oko 2 nM, manjim od oko 1 nM ili manjim od oko 0,5 nM, izmereno u testu površinske plazmonske rezonance. Izolovano antitelo koje specifično vezuje humani ANGPTL3, međutim, ima unakrsnu reaktivnost na druge antigene, kao što su ANGPTL3 molekuli drugih (nehumanih) vrsta.

[0044] Anti-ANGPTL3 antitela iz ovog opisa mogu sadržati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u okvirima i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim sekvencama germinativne linije iz kojih su antitela izvedena. Takve mutacije se mogu lako utvrditi upoređivanjem sekvenci aminokiselina koje su ovde otkrivene sa sekvencama germinativne linije koje su dostupne iz, na primer, javnih baza podataka sekvenci antitela. Ovaj opis uključuje upotrebu antitela i njihovih fragmenata koji se vezuju za antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od sekvenci aminokiselina koje su ovde opisane, pri čemu su jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više okvira i/ili CDR regiona mutirane u odgovarajuće ostatak(e) sekvence germinativne linije iz koje je izvedeno antitelo, ili odgovarajuće ostatak(e) druge sekvence humane germinativne linije, ili konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom odgovarajućeg(ih) ostatka(a) germinativne linije (takve promene sekvence se odnose na zajedno nazivaju „mutacije germinativne linije“). Prosečan stručnjak u ovoj oblasti tehnike, polazeći od ovde otkrivenih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, može lako proizvesti brojna antitela i fragmente koji se vezuju za antigen koji sadrže jednu ili više pojedinačnih mutacija germinativne linije ili njihovih kombinacija. U određenim aspektima opisa, svi ostaci okvira i/ili CDR unutar VHi/ili VLdomena su mutirani nazad na ostatke pronađene u originalnoj sekvenci germinativne linije iz koje je antitelo izvedeno. U drugim aspektima otkrivanja, samo određeni ostaci su mutirani nazad u originalnu sekvencu germinativne linije, na primer, samo mutirani ostaci pronađeni u prvih 8 aminokiselina FR1 ili u okviru poslednjih 8 amino kiselina u FR4, ili samo pronađeni mutirani ostaci unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim aspektima, jedan ili više ostataka okvira i/ili CDR ostataka su mutirani u odgovarajući ostatak(e) različite sekvence germinativne linije (tj. sekvencu germinativne linije koja se razlikuje od sekvence germinativne linije iz koje je antitelo bilo prvobitno izvedeno). Pored toga, antitela mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više mutacija germinativne linije unutar okvira i/ili CDR regiona, na primer, pri čemu su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene sekvence germinativne linije, dok se neki drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne linije sekvence održavaju ili su mutirani u odgovarajući ostatak druge sekvence germinativne linije. Jednom dobijena, antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen koji sadrže jednu ili više mutacija germinativne linije mogu se lako testirati na jedno ili više željenih osobina kao što su poboljšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, poboljšana ili unapređena antagonistička ili agonistička biološka svojstva (što može biti slučaj), smanjena imunogenost, itd. Upotreba antitela i fragmenata koji se vezuju za antigen dobijenih na ovaj opšti način obuhvaćeno je ovim opisom.

[0045] Ovaj opis takođe uključuje upotrebu anti-ANGPTL3 antitela koja sadrže varijante bilo koje od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde otkrivene sa jednom ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, ovaj opis uključuje upotrebu anti-ANGPTL3 antitela koja imaju HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, na primer, 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence koje su ovde opisane.

[0046] Izraz "površinska plazmonska rezonanca", kako se ovde koristi, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu interakcija u realnom vremenu otkrivanjem promena u koncentracijama proteina unutar matriksa biosenzora, na primer korišćenjem sistema BIAcore<™>(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ).

[0047] Izraz "KD", kako je ovde korišćen, treba da se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen.

[0048] Izraz "epitop" odnosi se na antigenu determinantu koja koja stupa u interakciju sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnom regionu molekula antitela poznatog kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Dakle, različita antitela se mogu vezati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop se dobija od prostorno suprotno postavljenih aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji proizvode susedni aminokiselinski ostaci u polipeptidnom lancu. U određenim okolnostima, epitop može da sadrži ostatke saharida, fosforil grupe ili sulfonil grupe na antigenu.

[0049] Prema određenim izvođenjima, anti-ANGPTL3 antitelo korišćeno u ovom pronalasku je antitelo sa pH zavisnim karakteristikama vezivanja. Kako se ovde koristi, izraz "vezivanje zavisno od pH" znači da antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen pokazuje "smanjeno vezivanje za ANGPTL3 pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH" (za potrebe ovog opisa, oba izraza se mogu koristiti naizmenično). Na primer, antitela "sa karakteristikama vezivanja zavisnim od pH" uključuju antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji vezuju ANGPTL3 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH. U određenim izvođenjima, antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen vezuju ANGPTL3 sa najmanje 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ili više puta veći afinitet pri neutralnom pH nego pri kiselom pH.

[0050] Prema ovom aspektu pronalaska, anti-ANGPTL3 antitela sa pH-zavisnim karakteristikama vezivanja mogu imati jednu ili više varijacija aminokiselina u odnosu na roditeljsko anti-ANGPTL3 antitelo. Na primer, anti-ANGPTL3 antitelo sa karakteristikama vezivanja zavisnim od pH može da sadrži jednu ili više supstitucija ili insercija histidina, npr., u jednom ili više CDR roditeljskog anti-ANGPTL3 antitela. Prema tome, u skladu sa određenim aspektima opisa, obezbeđuju se postupci koji obuhvataju primene anti-ANGPTL3 antitela koje sadrži CDR aminokiselinske sekvence (npr. CDR teških i lakih lanaca) koje su identične CDR aminokiselinskim sekvencama roditeljskog anti-ANGPTL3 antitela, osim supstitucije jedne ili više aminokiselina jednog ili više CDR roditeljskog antitela sa ostatkom histidina. Anti-ANGPTL3 antitela sa pH-zavisnim vezivanjem mogu imati, npr., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više supstitucija histidina, bilo unutar jednog CDR roditeljskog antitela ili raspoređenih po celom višestrukim (npr. 2, 3, 4, 5 ili 6) CDR roditeljskog anti-ANGPTL3 antitela. Na primer, ovaj opis uključuje upotrebu anti-ANGPTL3 antitela sa pH-zavisnim vezivanjem koja obuhvata jednu ili više supstitucija histidina u HCDR1, jednu ili više supstitucija histidina u HCDR2, jednu ili više supstitucija histidina u HCDR3, jednu ili više supstitucija histidina u LCDR1, jedna ili više supstitucija histidina u LCDR2, i/ili jedna ili više supstitucija histidina u LCDR3, roditeljskog anti-ANGPTL3 antitela.

[0051] Kako se ovde koristi, izraz "kiseli pH" označava pH od 6,0 ili manji (npr. manji od oko 6,0, manji od oko 5,5, manji od oko 5,0, itd.). Izraz "kiseli pH" uključuje pH vrednosti od oko 6.0, 5.95, 5.90, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0, ili manje. Kako se ovde koristi, izraz "neutralni pH" označava pH od oko 7,0 do oko 7,4. Izraz "neutralni pH" uključuje pH vrednosti od oko 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, i 7.4

[0052] Neograničavajući primeri anti-ANGPTL3 antitela koji se mogu koristiti u kontekstu ovog opisa uključuju, npr, evinakumab, kao i bilo koje iz primera anti-ANGPTL3 antitela kako je navedeno u US patentu br.9,018,356 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), ili bilo koje iz primera anti-ANGPTL3 antitela kako je navedeno u US patentu br.8,742,075 (Lekicon Pharmaceuticals, Inc.). U pronalasku, antitelo može biti evinakumab.

Dobijanje humanih antitela

[0053] Anti-ANGPTL3 antitela se mogu napraviti prema bilo kom postupku proizvodnje/izolacije antitela poznatom u tehnici. Na primer, antitela mogu biti napravljena hibridomskim tehnologijama, prikazom faga, prikazom kvasca, itd. Antitela za upotrebu u ovom pronalasku mogu biti, na primer, himerna antitela, humanizovana antitela ili potpuno humana antitela.

[0054] Postupci za dobijanje humanih antitela u transgenim miševa su poznati u tehnici. Bilo koji takav poznati postupak se može koristiti za pravljenje humanih antitela koja specifično vezuju ANGPTL3.

[0055] Na primer, korišćenjem VELOCIMMUNE™ tehnologije (videti, na primer, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals) ili bilo kog drugog poznatog postupka za dobijanje monoklonskih antitela, himerna antitela visokog afiniteta na ANGPTL3 se inicijalno izoluju sa humanim varijabilnim regionom i mišjim konstantnim regionom. Tehnologija VELOCIMMUNE® uključuje dobijanje transgenog miša koji ima genom koji se sastoji od humanog varijabilnih regiona teškog i lakog lanca koji su operativno povezani sa lokusima endogenog mišjeg konstantnog regiona tako da miš proizvodi antitelo koje se sastoji od humanog varijabilnog regiona i mišjeg konstantnog regiona kao odgovor na antigenu stimulaciju. DNK koja kodira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela je izolovana i operativno povezana sa DNK koja kodira konstantne regione humnog teškog i lakog lanca čoveka. DNK se zatim eksprimira u ćeliji sposobnoj da eksprimuje potpuno humano antitelo.

[0056] Generalno, VELOCIMMUNE® miš se izaziva sa antigenom od interesa, a limfne ćelije (kao što su B-ćelije) se regenerišu iz miševa koji eksprimiraju antitela. Limfne ćelije mogu biti spojene sa ćelijskom linijom mijeloma da bi se pripremile besmrtne ćelijske linije hibridoma, a takve ćelijske linije hibridoma se pregledaju i biraju da identifikuju hibridomske ćelijske linije koje proizvode antitela specifična za antigen od interesa. DNK koja kodira varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca može biti izolovana i povezana sa poželjnim izotipskim konstantnim regionima teškog lanca i lakog lanca. Takav protein antitela može se proizvesti u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira antigen-specifična himerna antitela ili varijabilne domene lakih i teških lanaca može se izolovati direktno iz limfocita specifičnih za antigen.

[0057] U početku se izoluju himerna antitela visokog afiniteta koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Antitela su okarakterisana i odabrana za poželjne karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd., korišćenjem standardnih postupaka poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Konstantni regioni miša su zamenjeni željenim humanim konstantnim regionom da bi se dobilo potpuno humano antitelo pronalaska, na primer divljeg tipa ili modifikovanog IgG1 ili IgG4. Dok odabrani konstantni region može da varira u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike vezivanja antigena visokog afiniteta i specifičnosti cilja nalaze se u varijabilnom regionu.

[0058] Generalno, antitela poseduju visoke afinitete, kao što je gore opisano, kada se mere vezivanjem za antigen ili imobilizovana na čvrstoj fazi ili u fazi rastvora. Konstantni regioni miša su zamenjeni željenim humanim konstantnim regionima da bi se dobila potpuno humana antitela. Dok odabrani konstantni region može da varira u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike vezivanja antigena visokog afiniteta i specifičnosti mete nalaze se u varijabilnom regionu.

[0059] U ovom pronalasku, anti-ANGPTL3 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog i lakog lanca (HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3) koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs:4, 5, 6, 7, 8 i 9.

[0060] U određenim izvođenjima ovog pronalaska, anti-ANGPTL3 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, koji se može koristiti u postupcima, sadrži HCVR koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 i LCVR koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:3.

Farmaceutske kompozicije i postupci davanja

[0061] Ovaj pronalazak uključuje davanje pacijentu inhibitora ANGPTL3 kao što je definisano u patentnim zahtevima, pri čemu je ANGPTL3 inhibitor sadržan u farmaceutskoj kompoziciji. Farmaceutske kompozicije su formulisane sa odgovarajućim nosačima, ekscipijensima i drugim agensima koji obezbeđuju odgovarajući transfer, isporuku, toleranciju i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može se naći u formularu poznatom svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Compani, Easton, PA. Ove formulacije uključuju, na primer, prahove, paste, masti, žele, voskove, ulja, lipide, lipide (katjonske ili anjonske) koje sadrže vezikule (kao što je LIPOFECTIN™), DNK konjugate, anhidrovane paste za apsorpciju, emulzije ulje u vodi i voda u ulju, emulzije carbowax-a (polietilen glikoli različite molekulske mase), polučvrste gelove i polučvrste smeše koje sadrže carbowax. Videti takođe Povell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0062] Poznati su različiti sistemi za davanje i mogu se koristiti za davanje farmaceutske kompozicije, npr., inkapsulacija u lipozome, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da eksprimiraju mutantne viruse, endocitoza posredovana receptorom (videti, npr., Vu et al., J, 1987 Biol. Chem.262:4429-4432). Postupci primene obuhvataju, ali nisu ograničeni na, intradermalni, intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, subkutani, intranazalni, epiduralni i oralni put. Kompozicija se može primeniti na bilo koji pogodan način, na primer infuzijom ili bolus injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutane obloge (npr. oralnu sluzokožu, rektalne i crevne sluzokože, itd.) i može se primeniti zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima.

[0063] Farmaceutska kompozicija se može uneti subkutano ili intravenski standardnom iglom i špricem. Pored toga, u pogledu subkutanog davanja , uređaj za davanje u obliku olovke lako se primenjuje u davanju farmaceutske kompozicije. Takav uređaj za davanje u obliku olovke može biti za višekratnu ili jednokratnu upotrebu. Uređaj za davanje u obliku olovke za višekratnu upotrebu generalno koristi zamenljivi kertridž koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Kada se cela farmaceutska kompozicija unutar kertridža da i kertridž je prazan, prazan kertridž se može lako odbaciti i zameniti novim kertridžom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Uređaj za davanje u obliku olovke se tada može ponovo koristiti. U uređaju za isporuku u obliku olovke za jednokratnu upotrebu ne postoji zamenljivi kertridž. Umesto toga, uređaj za isporuku u obliku olovke za jednokratnu upotrebu dolazi prethodno napunjen farmaceutskom kompozicijom koja se nalazi u rezervoaru unutar uređaja. Kada se rezervoar isprazni od farmaceutskog sastava, ceo uređaj se odbacuje.

[0064] Brojne olovke koje se mogu ponovo koristiti i autoinjekcioni uređaji za davanje imaju primenu u subkutanoznom davanju farmaceutske kompozicije . Primeri uključuju, ali bez ograničenja AUTOPEN<™>(Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC<™>pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25<™>pen, HUMALOG<™>pen, HUMALIN 70/30<™>pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN<™>I, II i III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR<™>(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD<™>pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN<™>, OPTIPEN PRO<™>, OPTIPEN STARLET<™>, i OPTICLIK<™>(Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany), da navededemo samo nekoliko. Primeri jednokratne olovke za davanje imaju primenu u subkutanoznom davanju farmaceutske kompozicije prikazanog pronalaska obuhvataju, ali bez ograničenja samo na njih SOLOSTAR<™>olovku (Sanofi-Aventis), FLEXPEN<™>(Novo Nordisk), i KWIKPEN<™>(Eli Lilly), SURECLICK<™>Autoinjektor (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET<™>(Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), i HUMIRA<™>Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), da navedemo samo neke.

[0065] U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija se može isporučiti u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. U jednom aspektu, pumpa se može koristiti (videti Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). U drugom izvođenju, mogu se koristiti polimerni materijali; videti, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Vise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. U još jednom izvođenju, sistem sa kontrolisanim oslobađanjem može biti postavljen u blizini cilja kompozicije, tako da zahteva samo delić sistemske doze (videti, npr., Goodson, 1984, u Medicinskim aplikacijama kontrolisanog oslobađanja, supra, tom 2, str. 115-138). Drugi sistemi kontrolisanog oslobađanja su razmatrani u pregledu Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[0066] Preparati za injektovanje mogu uključivati dozne oblike za intravenske, subkutane, intrakutane i intramuskularne injekcije, infuzije kap po kap, itd. Ovi preparati za injekcije se mogu pripremiti poznatim postupcima. Na primer, preparati za injekcije mogu se pripremiti, npr., rastvaranjem, suspendovanjem ili emulgovanjem antitela ili njegove soli opisane gore u sterilnom vodenom medijumu ili uljanom medijumu koji se uobičajeno koristi za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, postoje, na primer, fiziološki rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druge pomoćne agense, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim sredstvom za rastvaranje kao što je alkohol (npr. etanol), polialkohol (npr. propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr. polisorbat 80, HCO50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljani medijum koriste se npr. , susamovo ulje, sojino ulje, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa sredstvom za rastvaranje kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Tako pripremljena injekcija se poželjno puni u odgovarajuću ampulu.

[0067] Prednost je da se gore opisane farmaceutske kompozicije za oralnu ili parenteralnu upotrebu pripremaju u doznim oblicima u jediničnoj dozi koja odgovara dozi aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jediničnoj dozi uključuju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije itd.

Doze

[0068] Količina anti-ANGPTL3 antitela koja se daje subjektu u skladu sa ovim pronalaskom je, generalno, terapeutski efikasna količina. Kako se ovde koristi, fraza "terapeutski efikasna količina" označava dozu inhibitora ANGPTL3 koja dovodi do smanjenja koje se može detektovati (najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% , 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili više od početne vrednosti) u jednom ili više parametara izabranih iz grupe koju čine LDL-C, ApoB100, ne-HDL-C, ukupni holesterol, VLDL-C, trigliceridi, Lp(a) i ostatak holesterola, ili količina koja sprečava ili ublažava aterosklerozu kod subjekta (kao što je opisano na drugom mestu).

[0069] U slučaju anti-ANGPTL3 antitela, teraputski efikasna količina može biti od oko 0.05 mg do oko 600 mg, e.g., oko 0.05 mg, oko 0.1 mg, oko 1.0 mg, oko 1.5 mg, oko 2.0 mg, oko 10 mg, oko 20 mg, oko 30 mg, oko 40 mg, oko 50 mg, oko 60 mg, oko 70 mg, oko 80 mg, oko 90 mg, oko 100 mg, oko 110 mg, oko 120 mg, oko 130 mg, oko 140 mg, oko 160 mg, oko 170 mg, oko 180 mg, oko 190 mg, oko 200 mg, oko 210 mg, oko 220 mg, oko 230 mg, oko 240 mg, oko 250 mg, oko 260 mg, oko 270 mg, oko 280 mg, oko 290 mg, oko 300 mg, oko 310 mg, oko 320 mg, oko 330 mg, oko 340 mg, oko 350 mg, oko 360 mg, oko 370 mg, oko 380 mg, oko 390 mg, oko 400 mg, oko 410 mg, oko 420 mg, oko 430 mg, oko 440 mg, oko 450 mg, oko 460 mg, oko 470 mg, oko 480 mg, oko 490 mg, oko 500 mg, oko 510 mg, oko 520 mg, oko 530 mg, oko 540 mg, oko 550 mg, oko 560 mg, oko 570 mg, oko 580 mg, oko 590 mg, ili oko 600 mg, anti-ANGPTL3 antitela. Druge dozne količine inhibitora ANGPTL3 će biti očigledne stručnjaku iz odgovarajuće oblasti tehnike .

[0070] Količina anti-ANGPTL3 antitela koja se nalazi u okviru pojedinačnih doza može biti izražena u odnosu na miligrame antitela po kilogramu telesne težine pacijenta (tj., mg/kg). Na primer, anti-ANGPTL3 antitelo može biti davano pacijentu u dozi od oko 0.0001 do oko 10 mg/kg telesne težine pacijenta.

Kombinovane terapije

[0071] Kao što je opisano ovde na drugom mestu, prikazani pronalazak može sadržati davanje inhibitora ANGPTL3 pacijentu u kombinaciji sa ("povrh") pacijentove ranije prepisane terapije za snižavanje lipida . Na primer, u kontekstu sprečavanja ili ublažavanja ateroskleroze, inhibitor ANGPTL3 može biti davan pacijentu u kombinaciji sa pogodnim dnevnim terapeutskim režimom statina. Primeri dnevnih režima terapija statinima sa kojima inhibitor ANGPTL3 može biti davan u kombinaciji sa kontekstom prikazanog pronalska uključuju, npr., atorvastatin (10, 20, 40 ili 80 mg dnevno), (atorvastatin/ezetimib 10/10 ili 40/10 mg dnevno), rosuvastatin (5, 10 ili 20 mg dnevno), cerivastatin (0.4 ili 0.8 mg dnevno), pitavastatin (1, 2 ili 4 mg dnevno), fluvastatin (20, 40 ili 80 mg dnevno), simvastatin (5, 10, 20, 40 ili 80 mg dnevno), simvastatin/ezetimib (10/10, 20/10, 40/10 ili 80/10 mg dnevno), lovastatin (10, 20, 40 ili 80 mg dnevno), pravastatin (10, 20, 40 ili 80 mg dnevno), i njihove kombinacije. Druge terapije snižavanja lipida sa kojima inhibitor ANGPTL3 može biti davan u kombinaciji u kontekstu prikazanog pronalaska uključuju , npr., (1) sredstvo koje inhibira preuzimanje holesterila ili resorpciju žučnih kiselina (npr., ezetimib); (2) sredstvo koje povećava katabolizma lipoproteina (kao što je niacin); i/ili (3) aktivatori faktora transkripcije LXR koji igra ulogu u eliminaciji holesterola kao što je 22-hidroksiholesterol.

[0072] Prema izvesnim izvođenjima, prikazani pronalazak obuhvata davanje inhibitora ANGPTL3 subjektu u kombinaciji sa inhibitorom ANGPTL4 (npr., anti-ANGPTL4 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen), inhibitor ANGPTL8 (npr., anti-ANGPTL8 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ili njegov fragment koji vezuje antigen), i/ili inhibitor PCSK9 (npr., anti-PCSK9 antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen). Neograničavajući primeri anti-PCSK9 antitela koje može biti korišćeno u kontekstu prikazanog pronalaska uključuje, npr., alirokumab, evolokumab, bococizumab, lodelcizumab, ralpancizumab, ili delove koji se vezuju za antigen bilo kojeg antitela .

Režimi davanja

[0073] U skladu sa određenim izvođenjima ovog pronalaska, višestruke doze inhibitora ANGPTL3 (tj. farmaceutske kompozicije koja sadrži inhibitor ANGPTL3) mogu se davati subjektu tokom definisanog vremenskog toka (npr., povrh dnevnog terapeutskog režima statina ili druge trenutne standardne terapije za snižavanje lipida). Postupci prema ovom aspektu pronalaska obuhvataju sekvencijalno davanje subjektu višestrukih doza inhibitora ANGPTL3. Kako se ovde koristi, "sekvencionalno davanje" znači da se svaka doza inhibitora ANGPTL3 daje subjektu u različitom trenutku, npr., različitim danima razdvojenim unapred određenim intervalom (npr. satima, danima, nedeljama ili mesecima). Ovaj pronalazak uključuje sekvencijalno davanje pacijentu jedne početne doze ANGPTL3 inhibitora, nakon čega sledi jedna ili više sekundarnih doza ANGPTL3 inhibitora, i opciono praćena jednom ili više tercijarnih doza ANGPTL3 inhibitora.

[0074] Izrazi "početna doza", "sekundarna doza" i "tercijarna doza" odnose se na vremensku sekvencu primene pojedinačnih doza farmaceutske kompozicije koja sadrži inhibitor ANGPTL3. Dakle, "početna doza" je doza koja se primenjuje na početku režima lečenja (takođe se naziva "osnovna doza"); "sekundarne doze" su doze koje se daju nakon početne doze; a "tercijarne doze" su doze koje se daju posle sekundarnih doza. Inicijalne, sekundarne i tercijarne doze mogu da sadrže istu količinu ANGPTL3 inhibitora, ali generalno mogu da se razlikuju jedna od druge u smislu učestalosti primene. U određenim izvođenjima, međutim, količina inhibitora ANGPTL3 sadržana u inicijalnoj, sekundarnoj i/ili tercijarnoj dozi varira jedna od druge (npr., prilagođena naviše ili naniže prema potrebi) tokom lečenja. U određenim izvođenjima, dve ili više (npr., 2, 3, 4 ili 5) doza se daju na početku režima lečenja kao "doze punjenja (oterećenja)", nakon čega slede sledeće doze koje se daju ređe (npr. doze održavanja").

[0075] Prema primerima izvođenja prikazanog pronalaska, svaka sekundarna i/ili tercijarna doza je davana 1 do 26 (npr., 1, 1 1⁄2, 2, 21⁄2, 3, 31⁄2, 4, 41⁄2, 5, 51⁄2, 6, 61⁄2, 7, 71⁄2, 8, 81⁄2, 9, 91⁄2, 10, 101⁄2, 11, 111⁄2, 12, 121⁄2, 13, 131⁄2, 14, 141⁄2, 15, 151⁄2, 16, 161⁄2, 17, 171⁄2, 18, 181⁄2, 19, 191⁄2, 20, 201⁄2, 21, 211⁄2, 22, 221⁄2, 23, 231⁄2, 24, 241⁄2, 25, 251⁄2, 26, 261⁄2, ili više) nedelja neposredno posle prethodne doze. Fraza "neposredno posle prethodne doze," kako je ovde korišćeno označava sekvencu višestrukih davanja, doza molekula koji vezuje antigen je davana pacijentu pre sledeće doze u skevenci bez interventnih doza.

[0076] Postupci prema ovom aspektu pronalaska mogu da obuhvataju davanje pacijentu bilo kog broja sekundarnih i/ili tercijalnih doza inhibitora ANGPTL3. Na primer, u određenim izvođenjima, pacijentu se daje samo jedna sekundarna doza. U drugim izvođenjima, dve ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) sekundarnih doza se daju pacijentu. Slično, u određenim izvođenjima, pacijentu se daje samo jedna tercijarna doza. U drugim izvođenjima, dve ili više (npr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) tercijarnih doza se daju pacijentu.

[0077] U izvođenjima koja uključuju višestruke sekundarne doze, svaka sekundarna doza može biti davana u istom učestalošću kao druge sekundarne doze . Na primer, svaka sekundarna doza može biti davana pacijentu 1 do 2, 4, 6, 8 ili više nedelja neposredno posle prethodne doze. Slično, u izvođenjima koja uključuju višestruke tercijarne doze, svaka tercijarna doza može biti davana sa istom učestalošću kao druge tercijarne doze. Na primer, svaka tercijarna doza može biti davana pacijentu 1 do 2, 4, 6, 8 ili više nedelja neposredno posle prethodne doze. Alternativno, učestalost kojom se sekundarne i/ili tercijarne doze daju pacijentu može varirati u toku režima lečenja. Učestalost davanja može takođe biti podešena u toku lečenja od strane lekara u zavisnosti od potreba pojedinačnog pacijenta posle kliničkog ispitivanja.

PRIMERI

[0078] Sledeći primeri su izneti da bi prosečnom stručnjaku iz ove oblasti obezbedili potpun prikaz i opis kako da koriste antitelo koje inhibira protein-3 sličan angiopoietinu (ANGPTL3) kao što je definisano u patentnim zahtevima za smanjenje napredovanja ateroskleroze. Uloženi su napori da se obezbedi tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr. količine, temperaturu, itd.), ali neke eksperimentalne greške i odstupanja treba uzeti u obzir. Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su delovi u odnosu na masu, molekulska masa je prosečna molekulska masa, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.

Primeri 1. Dobijanje humanih antitela na humani ANGPTL3

[0079] Humana anti-ANGPTL3 antitela su dobijena kao što je opisano u US patentu br.

9,018,356. Primer inhibitora ANGPTL3 koji se koristi u sledećem Primeru je humano anti-ANGPTL3 antitelo označeno kao "H4H1276S", takođe poznato kao "evinakumab". Evinakumab ima sledeće karakteristike sekvence aminokiselina: teški lanac koji sadrži SEQ ID NO:10 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO:11; varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži SEQ ID NO:2 i varijabilni domen lakog lanca (LCVR) koji sadrži SEQ ID NO:3; region 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR1) koji sadrži SEQ ID NO:4, HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO:5, HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO:6, region 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (LCDR1) koji sadrži SEQ ID NO: 7, LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO:8 i LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO:9.

Primer 2. Anti-ANGPTL3 antitelo sprečava razvijanje ateroskleroze na modelu miša

UVOD

[0080] Cilj ovih ispitivanja je da se proceni efekat inhibicije ANGPTL3 na razvoj ateroskleroze kod APOE*3Leiden.CETP miševa, dobro ustanovljenom modelu za hiperlipidemiju sa svim karakterisitikama mešovite ili porodične disbetalipoproteinemije, i ateroskleroze. (Videti, npr., Kühnast et al., 2014, J Lipid Res 55: 2103-2112, za generalni opis APOE*3Leiden.CETP mišjeg modela (alternatvno na koji se ovde poziva kao na "E3L.CETP miševe") i njegovu upotrebu u proceni efikasnosti farmakološkog sredstva na razvoj ateroskleroze).

[0081] Inhibicija ANGPTL3 je postignuta korišćenjem anti-ANGPTL3 antitela. Određeno anti-ANGPTL3 antitelo korišćeno u ovim ispitivanjama je bilo antitelo koje se nazva evinakumab kako je gore opisano. Kontrolno antitelo korišćeno u ovim ispitivanja je antitelo sa uklopljenim izotipom za odgovarajuću metu.

PLAN ISPITIVANJA

[0082] Ilustracija plana ispitivanja je prikazana na slici 1. Evinakumab je potpuno humano IgG4 antitelo. Stoga, kada se procenjuju u različitim sojevima miševa, neki miševi razvijaju antitela protiv lekova koja eliminišu efikasnost terapeutskog sredstva. Procenat miševa koji razvijaju ovaj odgovor protiv lekova može biti različit za svaki mišji model/genetsku pozadinu. Iz tog razloga više miševa po grupi je uključeno u ovo prvo ispitivanje na APOE*3Leiden.CETP miševima da bi se utvrdilo koliko miševa razvija anti-humani imuni odgovor u ovom određenom modelu. Nakon isključenja miševa koji razvijaju anti-humani imuni odgovor, preostali miševi se mogu koristiti za procenu efekta evinakumaba na aterosklerozu.

[0083] Šezdeset i tri ženke miševa APOE*3Leiden.CETP stavljene su na dijetu T (polusintetička modifikovana dijeta kako je opisana od Nishina et al. 1990, J Lipid Res 31:859, sa 0,15% dodatog holesterola i 15% kakao putera. U periodu od 4 nedelje 13 miševa sa niskim reagovanjem je uklonjeno iz ispitivanja, a preostalih 50 miševa je podeljeno u jednu kontrolnu grupu od dvadeset miševa i u jednu grupu tretiranu evinakumabom od trideset miševa, usklađene po telesnoj težini, holesterolu u plazmi i trigliceridima posle 4 sata gladovanja (t=0).

[0084] Lečenje evinakumabom ili kontrolnim antitelom davanim nedeljno putem subkutanih injekcija u dozi od 25 mg/kg/nedeljno. Zapremina injekcije tokom perioda lečenja bila je 10 mUkg koristeći 0,9% NaCl kao nosač i podešena je na poslednju izmerenu vrednost telesne težine. Telesna težina i unos hrane (po kavezu) mereni su u nedelji 0, 3, 6, 8, 11 i 13.

[0085] Posle 0, 2, 4, 6, 8, 11 i 13 nedelja lečenja, uzorci krvi su uzeti nakon četiri sata gladovanja. Holesterol i trigliceridi u plazmi su mereni pojedinačno i dodatna EDTA plazma je sakupljena za procenu hFc i mišjih anti-humanih antitela. Posle 6 nedelja lečenja, procenjen je prvi odgovor na lek i 3 miša iz kontrolne grupe i 5 miševa iz grupe za lečenje sa visokim nivoima antitela protiv leka su uklonjeni iz ispitivanja.

[0086] Profili lipoproteina su mereni u nedelji 0, 6 i 13 u uzorcima plazme, objedinjeni po grupi. Izmet je sakupljen po kavezu tokom 12. nedelje (dva puta tokom 48 sati). Pri t=13 miševi su žrtvovani bez gladovanja. EDTA-plazma je dobijena punkcijom srca i sakupljeno je nekoliko tkiva. Razvoj ateroskleroze u korenu aorte je meren kod 15 miševa po grupi (nakon isključenja miševa koji su razvili odgovor protiv lekova) merenjem broja lezija, površine lezija i težine lezija. Pored toga, određen je sastav lezija.

(1) Raspored merenih parametara je sledeći:

(2) Telesna težina (nedelja 0, 3, 6, 8, 11 i 13);

(3) Unos hrane (po kavezu, nedelja 0, 3, 6, 8, 11 i 13);

(4) Ukupan holesterol i trigliceridi u plazmi (posle 4h gladovanja u nedeljama 0, 2, 4, 6, 8, 11 i 13);

(5) Sakupljanje 20 μl EDTA plazme za pocenu hFc i mišjeg anti-humanog antitela (posle 4h gladovanja u nedljama 0, 2, 4, 6,8, 11 i 13);

(6) Profili lipoproteina (holesterol i trigliceridi, sakupljeni po grupi; nedelja 0, 6 i 13); (7) Razvoj ateroskleroze u korenu aorte (15 miševa po grupi): (a) broj lezija, (b) ukupna površina lezija, (c) ozbiljnost lezija, (d) sastav lezija (npr. makrofag, ćelija glatkih mišića u kapi, nekroza i sadržaj kolagena), i (e) prianjanje monocita. (Pri žrtvovanju [nedelja 13], aorte su sakupljene od svih miševa, međutim analiza ateroskleroze je izvedena sa 15 miševa po grupi; odabrani su miševi koji ne razvijaju antitela protiv leka).

POSTUPCI

[0087] Merenja telesne težine i unos hrane su izvedeni prema standardnim postupcima.

[0088] Uzorci kvne plazme su dobijeni prema standardnim postupcima. Ukupsi holesterol i trigliceridi u plazmi su određeni pomoću komercijalno dostupnih kitova.

[0089] Merenje profila lipoproteina FPLC analizom pomoću AKTA uređaja od Amersham Biosciences. Analize su izvedena u uzorcima sakupljenim po grupi. Holesterol i trigliceridi su mereni u frakcijama pomoću komercijalno dostupnih kitova.

[0090] Površina i težina aterosklerotske lezije procenjeni su u predelu korena aorte kao što je prethodno zabeleženo (videti, npr., Kuhnast et al., 2012, J Hipertens 30:107-116). Koren aorte je identifikovan pojavom listića aortnog zalistka i serijski preseci čitavog područja korena aorte (debljine 5 mm sa intervalima od 50 mm) postavljeni su na staklene poločice obložene 3-aminopropil trietoksisilanom i obojeni hematoksilin-floksin-šafranom (HPS). Za svakog miša, površina lezije je merena u 4 uzastopna dela. Svaka sekcija se sastoji od 3 segmenta (odvojena ventilima). Za određivanje veličine i ozbiljnosti aterosklerotskih lezija, lezije su klasifikovane u pet kategorija prema Američkom udruženju za srce (AHA) (videti Stari et al., 1995, Arterioscler Thromb Vasc Biol 15:1512-1531): Tip 1: Rane masne pruge (do 10 penastih ćelija u intimi bez drugih promena); Tip 2: Redovne masne pruge (deset ili više penastih ćelija u intimi bez drugih promena); Tip 3: Blagi plak (penaste ćelije sa fibroznom kapom); Tip 4: Umeren plak (uznapredovale lezije sa zahvaćenim medijumom, ali bez gubitka arhitekture medijuma); Tip 5: Teški plak (medijum je jako pogođen; često se primećuju slomljena elastična vlakna, holesterolske pukotine, kalcifikacija i nekroza).

[0091] Slike su snimljene mikroskopom Olympus BKS51, a površine su merene softverom za obradu slike. Ukupna površina lezije i broj lezija izračunati su po poprečnom preseku. Neoboleli segmenti su izračunati kao procenat ukupnih segmenata. Takođe je određena ozbiljnost lezije kao procenat ukupnih lezija. Lezije tipa I-III su klasifikovane kao blage lezije, a lezije tipa IV-V su klasifikovane kao teške lezije.

[0092] Broj monocita koji koji prianjaju na aktivirani endotel je prebrojan u svakom segmentu koji je korišćen za kvantifikaciju lezije, nakon imunološkog bojenja sa AIA 31240 antiserumom (1:1000; Accurate Chemical and Scientific, Njujork, Njujork, SAD) i izračunat po poprečnom preseku.

[0093] Površina lezija makrofaga je merena nakon imunološkog bojenja sa antimišjim Mac-3 (1:50; BD Pharmingen, Holandija). Bojenje Sirius Red je izvedeno za bojenje kolagena. Površina glatkih mišićnih ćelija fibrotične kape merena je nakon imunološkog bojenja anti-alfa aktinom glatkih mišića (1:400; PROGEN Biotechnik GmbH, Hajdelberg, Nemačka) koji unakrsno reaguje sa mišjim alfa aktinom. Fotografije/slike lezija su snimljene mikroskopom Olympus BKS51. Makrofagi, kolagen, nekrotično jezgro i površina lezija glatkih mišića su kvantifikovane korišćenjem softvera za snimanje. Makrofagi, ćelije glatkih mišića (SMC), nekrotična jezgra i sadržaj kolagena u lezijama su izračunati kao procenat površine lezije. Indeks ranjivosti/stabilnosti plaka izračunat je tako što se zbir faktora stabilizacije SMC i kolagena podeli zbirom faktora destabilizacije, makrofaga i nekrotičnog jezgra.

[0094] U 13. nedelji miševi su žrtvovani bez gladovanja pomoću CO2. Nijedna poslednja injekcija antitela nije data tokom 13. nedelje pre žrtvovanja. Nakon žrtvovanja, sakupljeno je što je više moguće EDTA-plazme (putem punkcije srca) i čuvano na -70°C do dalje upotrebe. Srca uključujući koren aorte fiksirana su u 10% formalina. Torakalna aorta je sakupljena i fiksirana u 10% formalinu.

STATISTIKA

[0095] U zavisnosti od normalnosti, značajnost razlika između grupa izračunata je neparametarski, korišćenjem računarskog programa SPSS i Mann-Whitney U-testa za nezavisne uzorke. P-vrednost<0,05 se smatra statistički značajnom. Statističke razlike tretirane grupe u odnosu na kontrolnu grupu označene su zvezdicom u tačkama merenja na slikama.

REZULTATI

TELESNA TEŽINA

[0096] Rezultati telesne težine su ukratno dati u tabeli 1. Vrednosti su apsolutne vrednosti (grami) i one su srednja vrednost ± S.D. od 14-15 miševa po grupi.

TABELA 1

[0097] Nije bilo razlike u telesnoj težini između grupe tretirane evinakumabom u poređenju sa kontrolnom grupom.

UNOS HRANE

[0098] Rezultati uzimanja hrane su ukratko dati u tabeli 2. Vrednosti su apsolutne vrednosti (grama/mišu/danu) i srednja vrednost ± S.D.17 kaveza (svi miševi; pre uklapanja) ili 4-6 kaveza (posle uklapanja i početka lečenja).

TABELA 2

[0099] Nije bilo razlike u unosu hrane za grupu koja je lečena evinakumabom-treated u poređenj sa kontrolnom grupom.

HOLESTEROL U PLAZMI

[0100] Rezultati holesterola u plazmi su ukratko dati u tabelama 3 i 4, i na slikama 2A i 2B. Vrednosti su apsolutne vrednost (mM) i srednje su vrednosti ± S.D. od 14-15 miševa po grupi.

TABELA 3

TABELA 4

[0101] Lečenje evinakumabom je doveo do značajnog smanjenja holesterola u plazmi u poređenju sa kontrolnom grupom u svim vremenskim tačkama (srednja vrednost smanjenja od 52%). Na kraju eksperimenta, izloženost holesterolu tokom eksperimenta (0-13 nedelja period uvođenja) je značajno smanjen nakon lečenja evinakumabom (za 41%, p<0,001) u poređenju sa kontrolnom grupom.

TRIGLICERIDI U PLAZMI

[0102] Rezultati triglicerida u plazmi su ukratno dati u tabeli 5, i na slici 3. Vrednosti su apsolutne vrednosti (mM) i srednje su vrednosti ± S.D. iz grupe od 14-15 miševa.

TABELA 5

(nastavak)

[0103] Lečenje sa evinakumabom, vodilo je do značajnog pada triglicerida u plazmi u poređenju sa kontrolnom grupom u svim vremenskim tačkama (srednja vrednost pada 84%).

PROFILI LIPOPROTEINA

[0104] Lipoproteinu su odvojeni na Superose koloni. Frakcije holesterola i triglicerida pri t=0, t=6 nedelje, i t=13 nedelja, su prikazane na Slikama 4A, 4B, i 4C [holesterol] i 5A, 5B, i 5C [trigliceridi]. Vrednosti su apsolutne vrednosti iz merenja holesterola i triglicerida u sakupljenoj plazmi po grupi u t=0, 6 i 13 nedelja. Za svrhe ove analize, frakcije 3-7 su smatrane kao VLDL; 8-16 kao IDL/LDL i 17-24 kao HDL.

[0105] U t=0, pre početka lečenja, nisu primećene razlike u profilima lipoproteina, dok posle 6 i 13 nedelja lečenja sa evinakumab nivoi holesterola u plazmi, meren u uzorcima sakupljenim u grupi, su smanjeni u maksimalnoj vrednosti VLDL-LDL u poređenju sa kontrolnom grupom, i javili su se kao povećani HDL signali (videti Slike 4B i 4C). Profili triglicerida pokazali su sličan uzorak (videti slike 5A, 5B, i 5C).

[0106] Ovi podaci su u skladu sa primećenim padom ukupnog holesterola i triglicerida kod pojedinačne životinje u toku ispitivanja.

POVRŠINA ATEROSLKEROTSKIH LEZIJA

[0107] Površina aterosklerotskih lezija je ukratno data u tabeli 6, i na slikama 6A i 6B. Vrednosti su apsolutne površine lezija u korenu aorte po poprečnom preseku i izražane kao srednja vrednost ± S.D. za 14-15 miševa po grupi.

TABELA 6

[0108] Ukupna površina lezija u korenu aorte kontrolne grupe je bila 216082 μm<2>po poprečnom preseku pri žrtvovanju u t=13. Lečenje sa evinakumabom značajno je smanjilo ukupnu površinu lezija za 39% (p<0.001) u poređenju sa kontrolnom grupom pri žrtvovanju.

ATEROSKLEROZA: BROJ LEZIJA

[0109] Broj aterosklerotskih lezija po poprečnom preseku je ukratno dat u tabeli 7. Vrednosti su apsolutne vrednosti (broj lezija) i izražen kao srednja vrednost ± S.D. za 14-15 miševa po grupi.

TABELA 7

[0110] Nije bilo razlike u broju lezija između grupe lečene evinakumabom i kontrolne grupe.

ATEROSKLEROZA: OZBILJNOST LEZIJA

[0111] Rezultati ozbiljnosti aterosklerotskih lezija su ukratko dati u tabeli 8. Vrednosti su procenti ukupnih lezija i izraženi kao srednja vrednost ± S.D. za 14-15 miševa po grupi.

TABELA 8

[0112] Nije bilo razlika u ozbiljnosti lezija između grupe lečene evinakumabom u poređenju sa kontrolnom grupom.

ATEROSKLEROZA: SEGMENTI BEZ BOLESTI

[0113] Broj segmenata bez ateroskleroze je ukratko dat u tabeli 9. Vrednosti predstavljaju procent neaterosklerostih ("bez bolesti" ili zdravih) segmenata. Vrednosti su srednja vrednost ± S.D. za 14-15 miševa po grupi.

TABELA 9

[0114] Nije bilo razlika u količini segmenata bez bolesti između grupe lečene evinakumabom u poređenju sa kontrolnom grupom.

ATEROSKLEROZA: SADRŽAJ MAKROFAGA

[0115] Sadržaj makrofaga lezija je ukratko prikazan u tabeli 10 i na Slici 7A. Vrednosti su apsolutne vrednosti ( μm<2>*1000) ili relativne vrednosti (%lezija) i izražane kao srednja vrednost ± S.D. za 14-15 miševa po grupi.

TABELA 10

[0116] Lečenje sa evinakumabom težilo je smanji sadržaj makrrofaga po poprečnom preseku u aterosklerotskim lezijama tipa IV-V u poređenju sa kontrolnom grupom. Ova razlika nije primećena, međutim, posle korekcija za ukupnu površinu lezija i izražena je kao procent makrofaga u lezijama tipa IV-V (Slika 7A).

ATEROSKLEROZA: NEKROTIČKI SADRŽAJ

[0117] Nekrotički sadržaj lezija je ukratno dat u tabeli 11 i na slici 7A. Vrednosti su apsolutne vrednosti ( μm<2>*1000) ili relativne vrednosti (% lezija) i izražene kao srednja vrednost ± S.D. za 14-15 miševa po grupi.

TABELA 11

(nastavak)

[0118] Lečenje sa evinakumabom je značajno smanjilo nekrotički sadržaj po poprečnom preseku u aterosklerotskim lezijama tipa IV-V u poređenju sa kontrolnom grupom (za 69%, p<0.001). Posle korekcije za ukupnu površinu lezija procent nekrotičke površine u lezijama tipa IV-V je takođe bio zanačano smanjen u poređenju sa kontrolnom grupom (za 45%, p=0.001) (Slika 7A).

ATEROSKLEROZA: ĆELIJE GLATKIH MIŠIĆA U FIBROTIČKOJ KAPI

[0119] Kvantifikacija ćelija glatkih mišića (SMCs) u fibrotičkoj kapi lezija je ukratko prikazana u tabeli 12 i na slici 7B. Vrednosti su apsolutne vrednosti ( μm<2>*1000) ili relativne vrednosti (% lezija) i izražene kao srednja vrednost ± S.D. za 14-15 miševa po grupi.

TABELA 12

[0120] Lečenje evinakumabom je značajno smanjio površinu glatkih mišićnih ćelija (SMC) po poprečnom preseku u aterosklerotskim lezijama tipa IV-V u poređenju sa kontrolnom grupom (sa 39%, p=0,009). Međutim, nakon korekcije za ukupnu leziju, procenat SMC u fibroznoj kapi u lezijama tipa IV-V nije značajno smanjen u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika 7B).

ATEROSKLEROZA: SADRŽAJ KOLAGENA

[0121] Sadržaj kolagena lezija je ukratko dat u tabeli 13 i na Slici 7B. Vrednosti su apsolutne vrednosti ( μm<2>*1000) ili relativne vrednosti (% lezija) i izražene kao srednja vrednost ± S.D. za 14-15 miševa po grupi.

TABELA 13

[0122] Lečenje sa evinakumabom značajno smanjuje sadržaj kolagena po poprečnom preseku u aterosklerotskim lezijama tipa IV-V u poređenju sa kontrolnom grupom (sa 40%, p=0.009). Međutim, posle korekcije za ukupnu površinu lezija, procent kolagena u lezijama tipa IV-V nije bio značajno smanjen u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika 7B).

ATEROSKLEROZA: MONOCITNA ADHEZIJA

[0123] Procenat monocita po poprečnom preseku je ukratko prikazan u tabeli 14. Vrednosti su apsolutne vrednosti (broj monocita koje prianjaju po poprečnom preseku) i izražene kao srednja vrednost ± S.D. za 14-15 miševa po grupi.

TABELA 14

[0124] Lečenje evinakumabom nije uticalo na prianjanje monocita za aktivirani endotelijum na zidu krvnog suda korena aorte u poređenju sa kontrolnom grupom.

ATEROSKLEROZA: INDEKS STABILNOSTI

[0125] Stabilnost plaka lezija (izražena pomoću indeksa stabilnosti) je ukratko prikazana u tabeli 15. Indeks stabilnosti je definisan kao zbir markera stabilizacije SMC i sadržaja kolagena koji je podeljen sa zbirom markera destabilizacije makrofaga i nekrotičkim sadržajem. Ova vrednost obezbeđuje meru za stabilnost paka. Vrednosti su srednje vrednosti ± S.D. za 14-15 miševa po grupi.

TABELE 15

[0126] Lečenje sa evinakumabom nije imalo efekata na indeks stabilnosti u poređenju sa kontrolnom grupom.

SUŠTINA

SIGURNOSNI ASPEKTI

[0127] U lečenju sa evinakumabom nije primećen uticaj na telesnu težinu (porast) i unos hrane u poređenju sa kontrolom.

SMANJENJE U NIVOIMA VLDL I LDL

[0128] APOE*3Leiden.CETP miševi su dobro ustanovljen model porodične disbetalipoproteinemije (FD) kod ljudi koje karakteriše akumulacija zaostalih lipoproteina i povećani odnos VLDL-C prema LDL-C. Profil lipoproteina u APOE*3Leiden.CETP miševima odražava onaj FD pacijenta sa sličnim odgovorom na terapije koje modifikuju lipide. Ovo je prikazano sa uporedivim smanjenjem holesterola kod svih podfrakcija lipoproteina koji sadrže apoB- sa lečenjem statinima 25 i fenofibratom i niacinom.

[0129] U prikazanom ispitivanju, lečenje sa evinakumabom značajno smanjuje srednju vrednost ukupnog holesterola (TC) (-52%, p<0.001) i triglicerida (TG) (-84%, p<0.001) u poređenju sa kontrolom, koja je bila ograničena na frakcije koje nisu HDL.

SMANJENJE VELIČINE LEZIJA I NEKROTIČNIH POVRŠINA

[0130] U sadašnjem ispitivanju, evinakumab značano smanjuje veličinu lezije (-39%, p<0.001) u poređenju sa kontrolnom grupom. Nisu nađene značajne razlike u broju lezija, segmentima bez bolesti ili osbiljnosti lezija.

[0131] Lečenje sa evinakumabom značajno smanjuje nekrotički sadržaj kao procent ukupne veličine lezija u ozbiljnim lezijama tipa IV-V (sa 45%, p=0.001), ali ne utiče na sadržaj makrofaga, sadržaj kolagena ili SMC površinu, dovodeći do sličnog indeksa stabilnosti lezija u kontrolnoj grupi. Evinakumab nije uticao na regrutaciju monocita u aktiviriranom endotelijumu.

[0132] Nekrotički sadržaj je bio jedini pokazatelj sastava plaka koji se promenio u smislu i apsolutne površine i takođe procenta ukupne površine lezija. Potencijalna objašnjenja mogu biti pomak u sastavu populacije makrofaga od proinflamatornijih M1 makrofaga "ubica" u isceljiteljske M2 makrofage "za oporavak" , koji mogu ukloniti holesterol iz plaka.

ZAKLJUČAK

[0133] Zajedno, rezultati izloženi u ovom primeru pokazuju da anti-ANGPTL3 monoklonsko antitelo, evinakumab, smanjuje lipide u plazmi i sprečava napredovanje ateroskleroze kod APOE*3Leiden.CETP miševa. Evinakumab nije imao uticaja na broj lezija, ozbiljnost lezije ili stabilnost plaka, ali je značajno smanjio površinu lezija i površinu nekrotičnog jezgra.

Claims (12)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Inhibitor proteina 3 sličnog angiopoietinu (ANGPTL3) za upotrebu u postupku smanjenja napredovanja ateroskleroze kod subjekta, postupak obuhvata odabir subjekta koji ima aterosklerozu i davanje jedne ili više doza inhibitora proteina 3 sličnog angiopoietinu subjektu, gde je inhibitor ANGPTL3 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji specifično veže ANGPTL3 koji se sastoji od CDR aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca koje imaju SEQ ID NO:4, 5, 6, 7, 8, i 9.

2. Inhibitor ANGPTL3 za upotrebu u postupku prema zahtevu 1, gde je kod subjekta, pre ili u vreme početka lečenja sa jednom ili više doza inhibitora ANGPTL3, dijagnozirana heterozigotna porodična hiperholesterolemija (HeFH) ili homozigotna porodična hiperholesterolemija (HoFH), i/ili povišeni lipoprotein (a) (Lp[a]).

3. Inhibitor ANGPTL3 za upotrebu u postupku prema zahtevu 1, gde je kod subjekta, pre ili u vreme početka lečenja sa jednom ili više doza inhibitora ANGPTL3, dijagnozirana kardiovaskularna bolest (CVD), ili je pretrpeo moždani udar ili infarkt miokarda.

4. Inhibitor ANGPTL3 za upotrebu u postupku prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde je subjekt na stabilnoj standardnoj terapiji modifikacije lipida (LMT) pre ili u vreme početka lečenja sa jednom ili više doza inhibitora ANGPTL3, ili istovremeno sa davanjem jedne ili više doza inhibitora ANGPTL3, opciono gde je stabilna standarna LMT terapija niskom-, umerenom-, ili visokom dozom statina.

5. Inhibitor ANGPTL3 za upotrebu u postupku prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde davanje jedne ili više doza inhibitora ANGPTL3 subjektu dovodi do jedne ili više terapeutskih posledica izabranih iz grupe koju čine:

(a) smanjenje nivoa ukupnog holesterola (TC) u serumu,

(b) smanjenje nivoa triglicerida (TG) u serumu,

(c) smanjenje nivoa lipoproteina niske gustine (LDL) u serumu, i

(d) smanjenje nivoa lipoproteina veoma niske gustine (VLDL) u serumu;

gde je smanjenje (a), (b), (c) i/ili (d) određeno relativno prema subjektovom nivou TC u serumu, nivou TG u serumu, nivou LDL u serumu, i/ili nivou VLDL u serumu pre ili u vreme početka lečenja sa jednom ili više doza inhibitora ANGPTL3.

6. Inhibitor ANGPTL3 za upotrebu u postupku prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde davanje jedne ili više doza inhibitora ANGPTL3 subjektu dovodi do smanjenja obrazovanja aterosklerotskog plaka.

7. Inhibitor ANGPTL3 za upotrebu u postupku prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji specifično veže ANGPTL3 sadrži HCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 i LCVR koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3.

8. Inhibitor ANGPTL3 za upotrebu u postupku prema zahtevu 1, gde antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji specifiično vezuje ANGPTL3 je evinakumab.

9. Inhibitor ANGPTL3 za upotrebu u postupku prema bilo kom od zahteva 1 do 8, koji dalje obuhvata davanje jedne ili više doza inhibitora proprotein subtilisin keksin-9 konvertaze (PCSK9) subjektu, gde je inhibitor PCSK9 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje PCSK9.

10. Inhibitor ANGPTL3 za upotrebu u postupku prema zahtevu 9, gde je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje PCSK9 izabran iz grupe koju čine alirokumab, evolokumab, bococizumab, lodelcizumab, i ralpancizumab.

11. Inhibitor ANGPTL3 za upotrebu u postupku prema bilo kom od zahteva 1 do 10, što dalje obuhvata davanje jedne ili više doza inhibitora ANGPTL4 i/ili inhibitora ANGPTL8 subjektu, gde je inhibitor ANGPTL4 antitelo ili njegov fragment koje vezuje antigen koji specifično vezuje ANGPTL4, gde je inhibitor ANGPTL8 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji specifično vezuje ANGPTL8.

12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u postupku za smanjenjenje napredovanja ateroskleroze kod subjekta, gde kompozicija sadrži inhibitor proteina 3 sličnog angiopoietinu (ANGPTL3), i gde jedna ili više doza inhibitora proteina 3 sličnog angiopoietinu (ANGPTL3) su davane subjektu, gde inhibitor ANGPTL3 je antitelo ili njegov fragment koje vezuje antigen koji specifično vezuje ANGPTL3 koji se sastoji od CDR aminokiselinskih sekvenci lakog i teškog lanca koje imaju SEQ ID NOs:4, 5, 6, 7, 8, i 9.