ES2951408T3 - Métodos y composiciones para protección inmunitaria contra E. coli patógena extraintestinal - Google Patents
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Abstract
Se describen composiciones y métodos para inducir una respuesta inmune contra Escherichia coli patógena extraintestinal (ExPEC) para proporcionar así protección inmune contra enfermedades asociadas con ExPEC. En particular, se describen composiciones y métodos para usar conjugados de antígenos polisacáridos de E. coli O25B, O1A, O2 y O6A unidos covalentemente a una exotoxina A detoxificada de la proteína portadora de Pseudomonas aeruginosa (EPA) como vacunas para la prevención de la enfermedad invasiva ExPEC causada. por los serotipos ExPEC O1A, O2, O6A y O25B. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para protección inmunitaria contra E. coli patógena extraintestinal
Campo de la invención
Esta invención se refiere a composiciones y a las composiciones para usar en métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra Escherichia coli patógena extraintestinal (ExPEC) para proporcionar así protección inmunitaria contra enfermedades asociadas con ExPEC. En particular, las realizaciones de esta invención se refieren a vacunas multivalentes que contienen conjugados de polisacáridos antigénicos de E. coli O25B, O1A, O2 y O6A, cada uno unido covalentemente a una proteína portadora de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa destoxificada, y a los usos de las vacunas para proporcionar protección inmunitaria eficaz contra la infección de ExPEC.
Antecedentes de la invención
La E. coli patógena extraintestinal (ExPEC) es un habitante normalmente inocuo del intestino humano. Sin embargo, cepas de ExPEC pueden poseer factores de virulencia para la colonización e infección de sitios fuera del tracto gastrointestinal para causar diversas enfermedades invasivas serias que dan como resultado morbilidad, mortalidad y costes significativos anualmente (véase, por ejemplo, Johnson et al., J Lab Clin Med. 2002; 139 (3): 155-162; Kohler et al., Int J Med Microbiol. 2011; 301 (8): 642-647; Foxman, Am J Med. 2002; 113 Sup. 1A: 5S-13S; y Russo et al., Microbes Infect. 2003; 5 (5): 449-456). Las cepas de ExPEC son la causa más común de la infección de las vías urinarias (UTI). También contribuyen a las infecciones de sitio quirúrgico y meningitis neonatal (Johnson et al., 2002; y Russo et al., 2003), asociadas con infecciones abdominales y pélvicas y neumonía nosocomial y, ocasionalmente, están implicadas en otras infecciones extraintestinales tales como osteomielitis, celulitis e infecciones de herida. Todos estos sitios primarios de infección pueden producir bacteremia de ExPEC (Russo et al., 2003).
La resistencia bacteriana a los antibióticos es un problema mayor en la lucha contra la infección bacteriana y las cepas de E. coli multirresistentes a los fármacos (MDR) se están haciendo cada vez más prevalentes (véase, por ejemplo, Schito et al., 2009, Int. J. Antimicrob. Agents, 34 (5): 407-413; y Pitout et al., 2012 , Expert Rev. Anti. Infect. Ther., 10 (10): 1165-1176). La emergencia y la rápida diseminación global de la secuencia de ExPEC del tipo 131 se consideran el principal impulsor del aumento de la resistencia a los fármacos, incluso la multirresistencia a los fármacos (Johnson et al., Antimicrob Agents Chemother., 2010; 54 (1): 546-550; Rogers et al., J Antimicrob Chemother., 2011; 66 (1): 1 14). Este clon se encuentra en el 12,5% al 30% de todos los aislados clínicos de ExPEC, exhibe principalmente el serotipo O25B:H4 y muestra un alto grado de resistencia a las fluoroquinolonas que frecuentemente va acompañada de resistencia al trimetoprim/sulfametoxazol (Rogers et al, 2011, y Banerjee et al., Antimicrob Agents Chemother., 2014; 58 (9): 4997-5004).
El serotipo del antígeno O se basa en la estructura química del polisacárido de antígeno O, la porción de la membrana externa de lipopolisacárido (LPS) de una bacteria gram negativa. Se han reportado más de 180 antígenos O de E. coli (Stenutz et al., FEMS Microbial Rev., 2006; 30: 382-403). La infección de ExPEC puede ser causada por cualquier serotipo. Aunque existe una sobrerrepresentación de ciertos serotipos en la infección de ExPEC, no obstante los polisacáridos de superficie de los aislados de ExPEC exhiben diversidad antigénica considerable, lo que hace sumamente desafiante el desarrollo de una vacuna de ExPEC basada en polisacáridos de superficie (Russo et al., Vaccine, 2007; 25: 3859-3870). También, ciertos antígenos O pueden ser escasamente inmunogénicos. Además, basándose en estudios de vacunas de conjugados neumocócicos, cuando varios serotipos pueden causar una enfermedad, la composición de vacuna, tal como la elección de los serotipos para su inclusión en la vacuna y los niveles de dosificación de los serotipos incluidos, puede ser crítica, puesto que el uso de una vacuna contra ciertos serotipos puede aumentar potencialmente el acarreo de, y la enfermedad de, serotipos no incluidos en la vacuna, o incluso un serotipo que está incluido en la vacuna pero apenas es débilmente eficaz para inmunizar contra el serotipo (Lipsitch, Emerging Infectious Diseases; 1999, 5: 336-345). Idealmente, una vacuna debe maximizar sus efectos beneficiosos en la prevención de una enfermedad causada por los serotipos incluidos en la vacuna, pero debe minimizar el riesgo de enfermedad añadida derivada de un mayor acarreo de los serotipos que no son de la vacuna.
Por consiguiente, existe la necesidad en la técnica de vacunas contra ExPEC. En particular, existe la necesidad de una vacuna de ExPEC basada en polisacáridos de superficie que se pueda usar para proporcionar una protección inmunitaria eficaz contra el serotipo O25B de ExPEC y otros serotipos prevalentes entre las ExPEC.
También se hace referencia a los siguientes documentos adicionales:
• Cross et al. (1994) Journal o f Infectious Diseases 170(4): 834-840 que se refiere a la seguridad e inmunogenicidad de una vacuna polivalente de Escherichia coli en voluntarios humanos;
• Cryz et al. (1995) Vaccine 13(5): 449-453 que se refiere a la síntesis y caracterización de una vacuna polivalente de conjugado de polisacárido O de Escherichia coli-toxina A;
• Feldman et al (2005) PNAS USA 102(8): 3016-3021 que se refiere a la N-glicosilación de proteínas mediante ingeniería genética con diversas estructuras de lipopolisacárido de antígeno O en Escherichia coli; y
• El documento WO 2014/037585 que se refiere a bioconjugados que comprenden antígenos modificados y a usos
de los mismos.
Breve sumario de la invención
Se ha descubierto que, sorprendentemente, un antígeno O25B de E. coli parece ser un poco menos inmunogénico que otros antígenos O de E. coli (p. ej., O1A, O2 y O6A) cuando se ensayan como conjugados de los antígenos O, unidos cada uno covalentemente a una proteína portadora de exotoxina A de P. aeruginosa (EPA) destoxificada, y que la vacunación con una composición que contiene conjugados de EPA del antígeno O25B de E. coli y conjugados de EPA de uno o más antígenos O de E. coli adicionales, a una dosis y proporción adecuadas, proporcionan una respuesta inmunitaria mejorada contra el serotipo O25B de ExPEC y los uno o más serotipos O de ExPEC adicionales. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición que comprende una primera concentración de un polisacárido de antígeno O25B de E. coli y una segunda concentración de cada uno de un polisacárido de antígeno O1A de E. coli, un polisacárido de antígeno O2 de E. coli y un polisacárido de antígeno O6A de E. coli, en donde la proporción entre la primera concentración y la segunda concentración es 2 :1, cada uno de los polisacáridos antigénicos O25B , O1A, O2 y O6A de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa destoxificada (EPA) y la primera concentración es de 10 a 36 μg/ml.
La presente invención proporciona además una composición inmunitaria multivalente que comprende un polisacárido de antígeno O25B de E. coli a una primera dosis de 5 a 18 μg y un polisacárido de antígeno O1A de E. coli, un polisacárido de antígeno O2 de E. coli y un polisacárido de antígeno O6A de E. coli, cada uno a una dosis que es independientemente el 50 % de la primera dosis, en donde cada uno de los polisacáridos antigénicos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa destoxificada (EPA).
En una realización, la presente invención proporciona una composición inmunitaria multivalente que comprende un polisacárido de antígeno O25B de E. coli que tiene la estructura de la fórmula O25B':
un polisacárido de antígeno O1A de E. coli que tiene la estructura de fórmula O1A':
un polisacárido de antígeno O2 de E. coli que tiene la estructura de fórmula O2:
’ Y
un polisacárido de antígeno O6A de E. coli que tiene la estructura de fórmula O6A':
en donde n es independientemente un número entero de 5 a 25, y
cada uno de los polisacáridos antigénicos O25B, O1A, O2 y O6A está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y las concentraciones de los polisacáridos antigénicos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli en las composiciones son respectivamente 16:8:8:8 μg/ml o 32:16:16:16 μg/ml.
En una realización preferida, la presente invención proporciona una composición de la presente invención para su uso en un método de inducción de una respuesta inmunitaria a E. coli patógena extraintestinal (ExPEC) en un sujeto que lo necesite, que comprende administrarle al sujeto una composición de la presente invención.
La presente invención proporciona además un polisacárido de antígeno O25B de E. coli para su uso en un método de inducción de una respuesta inmunitaria a E. coli patógena extraintestinal (ExPEC) en un sujeto que lo necesite, que comprende administrarle al sujeto una primera cantidad eficaz de un polisacárido de antígeno o 25B de E. coli y una segunda cantidad eficaz de cada uno de un polisacárido de antígeno O1A de E. coli, un polisacárido de antígeno O2 de E. coli y un polisacárido de antígeno O6A de E. coli, en donde la relación entre la primera cantidad eficaz y la segunda cantidad eficaz es 2:1, cada uno de los polisacáridos antigénicos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa destoxificada (EPA) y la primera cantidad eficaz es de 5 a 18 μg por administración.
En una realización, la invención proporciona un polisacárido de antígeno O25B de E. coli para su uso en en un método de inducción de una respuesta inmunitaria a E. coli patógena extraintestinal (ExPEC) en un sujeto que lo necesite, que comprende administrarle al sujeto un polisacárido de antígeno O25B de E. coli que tiene la estructura de la fórmula O25B':
un polisacárido de antígeno O1A de E. coli que tiene la estructura de fórmula O1A':
un polisacárido de antígeno O2 de E. coli que tiene la estructura de fórmula O2:
’ y
un polisacárido de antígeno O6A de E. coli que tiene la estructura de fórmula O6A':
en donde n es independientemente un número entero de 5 a 25, y
cada uno de los polisacáridos antigénicos O25B, O1A, O2 y O6A está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y los polisacáridos antigénicos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli se administran a 8:4:4:4 μg o 16:8:8:8 μg por administración.
De acuerdo con una realización preferida, la respuesta inmunitaria inducida por una composición de la presente invención previene una enfermedad invasiva de ExPEC causada por los serotipos de ExPEC O1A, O2, O6A y O25B en un sujeto humano que lo necesite. Las enfermedades asociadas con ExPEC o las enfermedades de ExPEC incluyen, sin limitación, infección de las vías urinarias, infección de sitio quirúrgico, bacteremia, infección abdominal o pélvica, neumonía, neumonía nosocomial, osteomielitis, celulitis, pielonefritis, infección de herida, meningitis, meningitis neonatal, peritonitis, colangitis, infecciones de tejido blando, piomiositis, artritis séptica y sepsis. Preferiblemente, el sujeto humano es un sujeto humano en riesgo, que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad invasiva de ExPEC, tal como un humano de edad avanzada, un paciente hospitalizado, un niño humano, un humano inmunocomprometido, una mujer embarazada, personas con diabetes o lesiones por herida, personas que recientemente tuvieron o están programadas para tener una cirugía, etc.
De acuerdo con una realización de la invención, cada antígeno O está unido covalentemente a la proteína portadora EPA en el resto Asn de una secuencia de glicosilación que comprende Asp (Glu)-X-Asn-Z-Ser (Thr) (SEQ ID NO: 3), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro. En una realización preferida, la proteína portadora EPA comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En otra realización, el antígeno O está unido covalentemente a la proteína portadora EPA a una proporción en peso de polisacárido a proteína de 1:7 a 1:2, preferiblemente de 1:5 a 1:2. Por ejemplo, en un conjugado de antígeno O/EPA de acuerdo con una realización de la invención, el peso del antígeno O puede ser del 15% al 50%, o del 20% al 40% el peso de la EPA.
Otro aspecto de la invención se refiere a un proceso para preparar una composición de acuerdo con una realización de la invención, comprendiendo el proceso combinar el polisacárido de antígeno O25B de E. coli, el polisacárido de antígeno O1A de E. coli, el polisacárido de antígeno O2 de E. coli y el polisacárido de antígeno O6A de E. coli, para obtener de esta manera la composición. El proceso comprende combinar los antígenos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli, cada uno, independientemente, unido covalentemente a la proteína portadora EPA, en una composición.
También se divulga el uso de una composición como se divulga en el presente documento para la fabricación de una vacuna o medicamento para inducir una respuesta inmunitaria a ExPEC, o para prevenir o tratar una enfermedad asociada con ExPEC en un sujeto que lo necesite.
Breve descripción de los dibujos
El sumario anterior y también la descripción detallada de la invención que sigue se entenderán mejor al leerse en conjunto con los dibujos anexos. Se debe entender que la invención no está limitada a las realizaciones precisas mostradas en los dibujos.
En los dibujos:
la figura 1 es una representación ilustrativa de la plataforma de producción de la vacuna de glicoconjugado: el citoplasma (marcado en gris) de la célula hospedadora contiene todas las construcciones de ADN necesarias para la producción recombinante del conjugado de antígeno O/EPA en el periplasma (marcado en blanco) de la célula hospedadora;
la figura 2 es una representación esquemática detallada del proceso de glicosilación de proteína;
las figuras 3A a 3C representan los índices de opsonización (OI) obtenidos con el suero derivado de ratas previamente inmunizadas (círculos en blanco) en comparación con 42 días después de la inmunización (cuadrados en negro) con una dosis de cebado y dos dosis de refuerzo de las dosis indicadas de la vacuna monovalente; figura 3A: inmunización con O2-EPA; figura 3B: inmunización con O6A-EPA; y figura 3C: inmunización con O25B-EPA;
la figura 4 muestra los títulos de ELISA obtenidos con suero de sujetos humanos vacunados con un placebo o con una vacuna tetravalente que comprende los antígenos O1A, O2, O6A y O25B de E. coli a 4 μg de polisacárido por serotipo; se observó un aumento significativo en los títulos de ELISA entre después de la inyección (30 días después de la inyección) y antes de la inyección (día 1 ) únicamente en los grupos vacunados (un asterisco (*) representa significado estadístico y varios asteriscos representan un mayor grado de significado; ns significa diferencia no significativa); y
las figuras 5A a 5D representan los OI obtenidos con sueros derivados de sujetos humanos vacunados con una vacuna tetravalente que comprende los antígenos O1A, O2, O6A y O25B de E. coli a 4 μg de polisacárido por serotipo; respuesta inmunitaria indicada por OI contra placebo y componentes de la vacuna tetravalente; figura 5A: O1A-EPA; figura 5B: O2-EPA; figura 5C: O6A-EPA; y figura 5D: O25B-EPA; antes de la inyección (día 1) y después de la inyección (30 días después de la inyección), en donde se observó un aumento significativo en el OI entre antes y después de la inyección (indicado por un asterisco (*), varios asteriscos representan un mayor grado de significado) únicamente en los grupos vacunados; ns significa diferencia no significativa.
Descripción detallada de la invención
La discusión de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que se han incluido en el presente documento memoria descriptiva tiene la finalidad de proveer el contexto para la invención. Tal discusión no es una admisión de que alguna o todas estas materias formen parte de la técnica anterior con respecto a cualquier invención divulgada o reivindicada.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado entendido comúnmente para el experto en la materia a la que pertenece esta invención. Por otra parte, ciertos términos citados en el presente documento tienen los significados expuestos en la memoria descriptiva. Se debe tener en cuenta que, como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares “un”, “una”, “el”, “la”, incluyen la referencia plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Como se usan en el presente documento, las expresiones “polisacárido O”, “antígeno O”, “polisacárido de antígeno O”, “antígeno de polisacárido O” y la abreviatura “OPS”, se refieren todas ellas al antígeno O de las bacterias gram negativas, que es un componente del lipopolisacárido (LPS) y es específico para cada serotipo o sero(sub)tipo de las bacterias gram negativas. El antígeno O normalmente contiene unidades de repetición (RU) de dos a siete restos de azúcar. Como se usa en el presente documento, la RU se considera igual que la unidad de repetición biológica (BRU). La BRU describe la RU de un antígeno O como se sintetiza in vivo.
Como se usan en el presente documento, los términos “conjugado” y “glicoconjugado” se refieren a un producto de conjugación que contiene un antígeno O de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora. El conjugado puede ser un bioconjugado, que es un producto de conjugación preparado en una célula hospedadora, en donde la maquinaria de la célula hospedadora produce el antígeno O y la proteína portadora y enlaza el antígeno O a la proteína portadora, por ejemplo, por medio de enlaces de N. El conjugado también se puede preparar por otros medios, por ejemplo, por enlaces químicos de la proteína y el antígeno de azúcar.
Como se usa en el presente documento, la expresión “cantidad eficaz” en el contexto de administrar un antígeno O a un sujeto se refiere a la cantidad del antígeno O que es suficiente para inducir un efecto inmunitario o respuesta inmunitaria deseada en el sujeto. En ciertas realizaciones, una “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad de un antígeno O que es suficiente para producir inmunidad en un sujeto para obtener uno o más de los siguientes efectos en el sujeto: (i) prevenir el desarrollo o inicio de una infección de ExPEC, preferiblemente una enfermedad invasiva de ExPEC, o síntoma asociado con la misma; (ii) prevenir la recurrencia de una infección de ExPEC, preferiblemente una enfermedad invasiva de ExPEC, o síntoma asociado con la misma; (iii) prevenir, reducir o atenuar la gravedad de una infección de ExPEC, preferiblemente una enfermedad invasiva de ExPEC o síntoma asociado con la misma; (iv) reducir la duración de una infección de ExPEC, preferiblemente una enfermedad de ExPEC invasiva, o síntoma asociado con la misma; (v) prevenir la progresión de una infección de ExPEC, preferiblemente una enfermedad invasiva de ExPEC, o síntoma asociado con la misma; (vi) causar la regresión de una infección de ExPEC o síntoma asociado con la misma; (vii) prevenir o reducir el fallo orgánico asociado con una infección de ExPEC; (viii) reducir la probabilidad o frecuencia de hospitalización de un sujeto que tiene una infección de ExPEC; (ix) reducir la duración de hospitalización de un sujeto que tiene una infección de ExPEC; (x) aumentar la supervivencia de un sujeto con una
infección de ExPEC, preferiblemente una enfermedad invasiva de ExPEC; (xi) eliminar una infección de ExPEC, preferiblemente una enfermedad invasiva de ExPEC; (xii) inhibir o reducir la replicación de ExPEC; o (xiii) incrementar o mejorar el efecto profiláctico o terapéutico de otra terapia.
Una “cantidad eficaz” puede variar dependiendo de una diversidad de factores, tales como el estado físico del sujeto, su edad, peso, salud, etc.; la vía de administración, tal como oral o parenteral; la composición administrada, tal como el antígeno O diana, los otros antígenos O coadministrados, el adyuvante, etc.; y la enfermedad particular para la cual se desea la inmunidad. Cuando el antígeno O se une covalentemente a un portador de proteína, la cantidad eficaz para el antígeno O se calcula basándose únicamente en la fracción de polisacárido del antígeno O en el conjugado.
Como se usa en el presente documento, la expresión “en combinación”, en el contexto de la administración de dos o más antígenos O o composiciones a un sujeto, no restringe el orden en el cual se le administran al sujeto los antígenos 0 o composiciones. Por ejemplo, una primera composición se puede administrar antes (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), simultáneamente con, o después de (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) la administración de una segunda composición a un sujeto.
Como se usa en el presente documento, “sujeto” significa cualquier animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, que será o que ha sido vacunado por un método o composición de acuerdo con una realización de la invención. El término “mamífero” usado en el presente documento abarca cualquier mamífero. Los ejemplos de mamíferos incluyen, sin limitación, vacas, caballos, ovejas, cerdos, gatos, perros, ratones, ratas, conejos, cobayas, monos, seres humanos, etc., más preferiblemente un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un bebé humano. En otra realización, el sujeto es un niño humano. En otra realización, el sujeto es un adulto humano. En una realización específica, el sujeto es un adulto humano en riesgo. En otra realización, el sujeto es un ser humano de edad avanzada. En otra realización, el sujeto es un bebé humano que incluye un bebé humano prematuro y un bebé humano nacido a término. En otra realización el sujeto es un niño pequeño. Los términos “sujeto” y “paciente” se pueden usar de forma indistinta en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, la expresión “bebé humano prematuro” se refiere a un bebé humano nacido en menos de 37 semanas de edad gestacional.
Como se usa en el presente documento, la expresión “bebé humano” se refiere a un ser humano recién nacido y hasta de 1 año de edad.
Como se usa en el presente documento, la expresión “niño pequeño” se refiere a un ser humano que tiene de 1 a 3 años de edad.
Como se usa en el presente documento, la expresión “niño humano” se refiere a un ser humano que tiene de 1 a 18 años de edad.
Como se usa en el presente documento, la expresión “adulto humano” se refiere a un ser humano que tiene 18 años de edad o más.
Como se usa en el presente documento, la expresión “adulto humano en riesgo” se refiere a un humano que tiene 18 años de edad o más, que es más susceptible de infección de ExPEC que el promedio de la población adulta humana. Los ejemplos de “adulto humano en riesgo” incluyen, sin limitación, seres humanos de edad avanzada, seres humanos inmunocomprometidos, mujeres embarazadas, personas con diabetes o lesiones de herida, personas que recientemente tuvieron o han sido programadas para tener una cirugía, etc.
Como se usa en el presente documento, la expresión “ser humano de edad avanzada” se refiere a un ser humano que tiene 55 años de edad, preferiblemente 60, más preferiblemente 65 o más.
Como se usa en el presente documento, una “enfermedad invasiva de ExPEC” se define como el aislamiento e identificación de ExPEC de sitios del cuerpo normalmente estériles en un sujeto que presenta una enfermedad aguda compatible con una infección bacteriana.
Como se usa en el presente documento, una “respuesta inmunológica” o “respuesta inmunitaria” a un antígeno o composición se refiere al desarrollo en un sujeto de una respuesta inmunitaria humoral y/o celular al antígeno o a un antígeno presente en la composición.
Se ha descubierto sorprendentemente en la invención que el antígeno O25B de E. coli conjugado con una proteína portadora EPA parece ser menos inmunogénico que los otros antígenos O de E. coli (p. ej., O1A, O2 y O6A) conjugados con la proteína portadora EPA. Este descubrimiento condujo a una investigación ulterior sobre la dosis del
antígeno O25B de E. coli y las proporciones de dosis de varios antígenos O de E. coli dentro de una vacuna multivalente, y así al desarrollo de vacunas multivalentes y métodos de inmunización basados en los antígenos O de E. coli para respuestas inmunitarias mejoradas contra el serotipo O25B y otros serotipos de ExPEC.
Epidemiología
Los estudios sobre la distribución de serotipos de E. coli que causan enfermedad de ExPEC indican que 10 serotipos de O predominantes podrían cubrir una estimación del 60-80% de las infecciones de ExPEC, asumiendo la cobertura de subporciones de las cepas no tipificables. Véanse, por ejemplo, las tablas 1A a 1C mostradas más adelante. En poblaciones diana tanto de UTI como de bacteremia, los serotipos O1, O2, O6 y O25 se identificaron como los cuatro serotipos de E. coli más prevalentes, entre los cuales el serotipo O25 fue el serotipo de E. coli más prevalente en la bacteremia. También se encontró que, para un serotipo del antígeno O que está compuesto de subtipos distintos pero estructural y antigénicamente relacionados, un subtipo puede ser más prevalente entre los aislados clínicos que los otros. Por ejemplo, se determinó que los antígenos O1A, O6A y O25B eran los subtipos más frecuentes entre las cepas clínicas o aislados analizados más recientemente de los serotipos O1, O6 y O25, respectivamente. Véase la divulgación relacionada sobre estudios de epidemiologia en la solicitud de patente internacional N.° PCT/EP2015/053739, publicada como documento WO 2015/124769).
Tabla 1A: Distribución de los serotipos de E. coli más comunes asociados con UTI de una colección de 1841 muestras de orina recolectadas en Suiza en 2012. Se muestra la distribución de serotipos de muestras de una subpoblación relevante de 671 sujetos y la distribución de todas las muestras (**).
Tabla 1B: Prevalencia de los serotipos más comunes asociados con UTI de literatura seleccionada de 1987-2011 y de datos de EE. UU. de 2000-2011 analizados retrospectivamente (ECRC).
continuación
Tabla 1C: Distribución de los serotipos O de E. coli más comunes asociados con bacteremia de una colección de 860 aislados de sangre en EE. UU. y la UE en el periodo 2011-2013. Se indica la distribución relativa del serotipo O de las muestras.
Recientemente ha surgido un nuevo clon aglutinante de O25 en E. coli aislada de instalaciones hospitalarias que se denomina O25B. Para el serotipo O, O25, usando análisis de subtipificación por PCR, se observó que la inmensa mayoría es realmente del subtipo O25B (en un estudio de 24 aislados clínicos probados con un fenotipo de aglutinación de O25 positivo, 20 fueron asignados al subtipo O25B mientras que los 4 restantes fueron asignados al subtipo O25A, y en la población de bacteremia que fue estudiada entonces, 56 de 57 aislados estudiados del serotipo O25 fueron tipificables como O25B). Se ha confirmado que el antisuero autólogo reconoce el antígeno autólogo mejor que el antígeno no autólogo y, por lo tanto, la inclusión del antígeno O25B en una vacuna puede proveer una mejor protección contra las cepas clínicas O25B predominantes del grupo O25 de lo que lo haría la inclusión del antígeno O25a (véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional N.° PCT/EP2015/053739, publicada como documento WO 2015/124769). Los resultados mostraron que una vacuna de O25B puede producir suero que reacciona de forma cruzada con un antígeno O25A, proporcionando también así una respuesta inmunitaria contra el serotipo O25A (Id.). Las composiciones de acuerdo con las realizaciones de la invención comprenden un antígeno O25B de E. coli conjugado con una proteína portadora EPA y otros antígenos O de E. coli conjugados con la proteína portadora EPA.
Composiciones que comprenden conjugados del antígeno O de E. co li
En un aspecto general, la invención se refiere a una vacuna multivalente que contiene serotipos del antígeno O encontrados predominantemente entre los aislados clínicos de E. coli, que se puede usar para proporcionar inmunización activa para la prevención de la enfermedad causada por ExPEC que tiene los serotipos del antígeno O contenidos en la vacuna. En particular, la presente invención proporciona una composición inmunitaria multivalente que comprende un polisacárido de antígeno O25B de E. coli a una primera concentración de 5 a 18 μg, y un polisacárido de antígeno O1A de E. coli, un polisacárido de antígeno O2 de E. coli y un polisacárido de antígeno O6A de E. coli, cada uno a una dosis que es independientemente el 50% de la primera dosis, en donde cada uno de los polisacáridos antigénicos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una
proteína portadora de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa destoxificada (EPA).
Preferiblemente, el al menos un antígeno O de E. coli adicional usado en las composiciones de la divulgación es prevalente entre los aislados clínicos de E. coli. Los ejemplos de estos antígenos O adicionales incluyen, sin limitación, los antígenos O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15, O16, O18, O21, O73, O75 y O153 de E. coli. Dependiendo de la necesidad, la composición puede incluir más de un antígeno O de E. coli adicional, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve antígenos O de E. coli adicionales, para proporcionar protección inmunitaria contra múltiples serotipos de E. coli, además del serotipo O25B de E. coli. En un caso preferido, el antígeno O de E. coli adicional se selecciona del grupo que consiste en los antígenos O1, O2 y O6 de E. coli. Más preferiblemente, el antígeno O de E. coli adicional se selecciona del grupo que consiste en los antígenos O1A, O2 y O6A de E. coli.
En una realización, una composición de la invención comprende una primera concentración de un polisacárido de antígeno O25B de E. coli y una segunda concentración de cada uno de un polisacárido de antígeno O1A de E. coli, un polisacárido de antígeno O2 de E. coli y un polisacárido de antígeno O6A de E. coli, en donde la proporción entre la primera concentración y la segunda concentración es 2:1, cada uno de los polisacáridos antigénicos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa destoxificada (EPA) y la primera concentración es de 10 a 36 μg/ml. En una realización preferida, cada uno de los antígenos O1A, O2 y O6A de E. coli está presente independientemente a una concentración de al menos 5 μg/ml, más preferiblemente, a una concentración de al menos 8 μg/ml.
Una composición de acuerdo con un caso t de la divulgación contiene antígeno O25B de E. coli a una concentración que es igual o mayor que la concentración de cualquiera de los antígenos O adicionales en la composición. Por ejemplo, la composición puede tener antígeno O25B de E. coli a una primera concentración de, p. ej., 10, 16, 24, 32 o 36 μg/ml, y uno o más antígenos O de E. coli adicionales, cada uno a una concentración que es, p. ej., el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de la primera concentración. Cuando la composición contiene más de un antígeno O adicional, todos los antígenos O adicionales pueden tener la misma concentración, que es del 10 al 100% de la concentración del antígeno O25B de E. coli en la composición. Como alternativa, los antígenos O adicionales también pueden tener diferentes concentraciones, cada una de las cuales es independientemente el 10-100% de la concentración del antígeno O25B de E. coli. Preferiblemente, la composición comprende 32 μg/ml del antígeno O25B de E. coli e, independientemente, de 16 a 32 μg/ml de cada uno de los uno o más antígenos O adicionales, en donde cada uno del antígeno O25B de E. coli y los antígenos O de E. coli adicionales está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora EPA. En otra realización preferida, la composición comprende 16 μg/ml del antígeno O25B de E. coli e, independientemente, de 8 μg/ml a 16 μg/ml de cada uno de los uno o más antígenos O adicionales, en donde cada uno del antígeno O25B de E. coli y los antígenos O de E. coli adicionales está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora EPA.
En una realización preferida, la invención se refiere a una composición que comprende un antígeno O25B de E. coli a una primera concentración de 10 a 36 μg/ml, y una segunda concentración de cada uno de un antígeno O1A de E. coli , un antígeno O2 de E. coli y un antígeno O6A de E. coli, en donde cada uno de los antígenos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora EPA, y la proporción entre la primera concentración y la segunda concentración es 2 :1.
Preferiblemente, la composición comprende los antígenos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli en una proporción en peso de 2:1:1:1, y la composición comprende 32 μg/ml del antígeno O25B de E. coli, en donde cada uno de los antígenos O está unido covalentemente a una proteína portadora EPA. En otra realización preferida, la composición comprende los antígenos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli en una proporción en peso de 2:1:1:1, y la composición comprende 16 μg/ml del antígeno O25B de E. coli, en donde cada uno de los antígenos O está unido covalentemente a una proteína portadora EPA. Más preferiblemente, cada uno de los antígenos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora EPA que tiene la secuencia del aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y cada conjugado de antígeno O y proteína portadora e Pa se hace en una célula, es decir, es un bioconjugado. Más preferiblemente, los antígenos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli comprenden, respectivamente, las estructuras de la fórmula O25B', la fórmula O1A', la fórmula O2' y la fórmula O6A', que se describen más adelante.
Las composiciones descritas en el presente documento son útiles en el tratamiento y prevención de una infección de ExPEC en sujetos (p. ej., sujetos humanos). En ciertas realizaciones, además de comprender antígenos O de E. coli unidos covalentemente a una proteína portadora EPA, las composiciones descritas en el presente documento comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia regulatoria de un gobierno federal o estatal, o listado en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea reconocida generalmente para usarse en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término “vehículo”, usado en el presente documento en el contexto de un vehículo farmacéuticamente aceptable, se refiere a un diluente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra la composición farmacéutica. También se pueden utilizar soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados en “Remington's Pharmaceutical Sciences”
de E.W. Martin.
En una realización específica, se proporciona en el presente documento una composición que comprende un antígeno O25B de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA y cada uno de los antígenos O de E. coli adicionales se unen covalentemente a la proteína portadora EPA.
También se divulga en el presente documento una composición que comprende: (i) un bioconjugado que comprende un antígeno O25B de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA, y (ii) un bioconjugado que comprende un antígeno O1A de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA.
También se divulga en el presente documento una composición que comprende: (i) un bioconjugado que comprende un antígeno O25B de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA, y (ii) un bioconjugado que comprende un antígeno O2 de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA.
También se divulga en el presente documento una composición que comprende: (i) un bioconjugado que comprende un antígeno O25B de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA, y (ii) un bioconjugado que comprende un antígeno O6A de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA.
También se divulga en el presente documento una composición que comprende un bioconjugado de O25B de E. coli que comprende un antígeno O25B de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA y dos o más bioconjugados seleccionados del grupo que consiste en: (i) un bioconjugado de O1A de E. coli que comprende un antígeno O1A de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA; (ii) un bioconjugado de O2 de E. coli que comprende un antígeno O2 de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA; y (iii) un bioconjugado de O6A de E. coli que comprende un antígeno O6A de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA.
También se divulga en el presente documento una composición que comprende: (i) un bioconjugado de O25B de E. coli que comprende un antígeno O25B de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA; (ii) un bioconjugado de O1A de E. coli que comprende un antígeno O1A de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA; (iii) un bioconjugado de O2 de E. coli que comprende un antígeno O2 de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA; y (iv) un bioconjugado de O6A de E. coli que comprende un antígeno O6A de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA, en donde (i), (ii), (iii) y (iv) se formulan en una sola formulación.
También se divulga en el presente documento una composición que comprende: (i) un bioconjugado de O25B de E. coli que comprende un antígeno O25B de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA; (ii) un bioconjugado de O1A de E. coli que comprende un antígeno O1A de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA; (iii) un bioconjugado de O2 de E. coli que comprende un antígeno O2 de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA; y (iv) un bioconjugado de O6A de E. coli que comprende un antígeno O6A de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA, en donde (i), (ii), (iii) y (iv) se formulan en composiciones individuales que se administran en combinación.
En ciertas realizaciones, las composiciones anteriores comprenden opcionalmente una proteína portadora EPA unida covalentemente a un antígeno O de E. coli diferente de O1A, O2 , O6A y O25B de E. coli. Otros antígenos O de E. coli incluyen, sin limitación, los antígenos O adicionales indicados en las tablas 1A a 1C anteriores.
Las composiciones proporcionadas en el presente documento se pueden usar para provocar una respuesta inmunitaria en un hospedador al que se le administra la composición; es decir, son inmunogénicas. De esta manera, las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar como vacunas contra la infección de ExPEC, y pueden comprender cualquier componente adicional adecuado para usarse en una vacuna. Las composiciones descritas en el presente documento son formulaciones multivalentes, por ejemplo, formulaciones al menos tetravalentes que comprenden bioconjugados de antígenos O de E. coli de los serotipos/subserotipos O25B, O1A, O6A y O2.
En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento comprenden adicionalmente un conservante, tal como el derivado de mercurio timerosal. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden del 0,001% al 0,01% de timerosal. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprenden un conservante.
En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento (p. ej., las composiciones inmunogénicas) comprenden, o se administran en combinación con, un adyuvante. El adyuvante para administración en combinación con una composición descrita en el presente documento se puede administrar antes, simultáneamente o después de la administración de dicha composición. En algunas realizaciones, el término “adyuvante” se refiere a un compuesto que, cuando se administra en conjunto con, o como parte de, una composición descrita en el presente documento, aumenta, incrementa o refuerza la respuesta inmunitaria a un bioconjugado, pero cuando el compuesto adyuvante se administra solo no genera una respuesta inmunitaria al bioconjugado. En algunas realizaciones, el adyuvante genera una respuesta inmunitaria al péptido polibioconjugado y no produce alergia ni otra reacción adversa. Los adyuvantes pueden incrementar la respuesta inmunitaria por varios mecanismos que incluyen, por ejemplo,
reclutamiento de linfocitos, estimulación de células B o T y estimulación de macrófagos. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones descritas en el presente documento no comprenden un adyuvante además de los bioconjugados, y/o no se administran en combinación con un adyuvante además de los bioconjugados (en el caso de que los bioconjugados comprendan algunas propiedades adyuvantes intrínsecas, estas serían ignoradas y no se añadiría adyuvante extrínseco en estas realizaciones).
Los ejemplos específicos de adyuvantes incluyen, sin limitación, sales de aluminio (alumbre) (tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), monofosforil lípido (MPL) A 3 des-O-acilado (véase la patente del Reino Unido GB2220211), m F59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (véase la solicitud internacional N.° PCT/US2007/064857, publicada como publicación internacional N.° WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (véase la solicitud internacional N.° PCT/US2007/064858, publicada como publicación internacional N.° WO2007/109813) y saponinas tales como QS21 (véase Kensil et al., en “Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach” (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); patente de EE. UU. N.° 5.057.540). En algunas realizaciones, el adyuvante es adyuvante de Freund (completo o incompleto). Otros adyuvantes son emulsiones aceite en agua (tales como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios, tales como monofosforil-lípido A (véase Stoute et al., 1997, N. Engl. J. Med. 336, 86-91). Otro adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 de noviembre de 1998).
En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento se formulan para ser adecuadas para la vía de administración deseada a un sujeto. Por ejemplo, las composiciones descritas en el presente documento se pueden formular para adecuarlas a su administración subcutánea, parenteral, oral, intradérmica, transdérmica, colorrectal, intraperitoneal y rectal. En una realización específica, la composición farmacéutica se puede formular para administración intravenosa, oral, intraperitoneal, intranasal, intratraqueal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, transdérmica o pulmonar. En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento se administran por inyección intramuscular.
En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento comprenden adicionalmente uno o más tampones, por ejemplo, solución salina tamponada con Tris, tampón de fosfato y tampón de sacarosa, fosfato y glutamato.
En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento comprenden adicionalmente una o más sales, por ejemplo, Tris-clorhidrato, cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de potasio, fosfato de sodio, glutamato monosódico y sales de aluminio (p. ej., hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, alumbre (sulfato de potasio y aluminio), o una mezcla de estas sales de aluminio). En una realización, una composición de la invención comprende los bioconjugados descritos en el presente documento en una solución salina tamponada con Tris (TBS), pH 7.4 (que contiene, por ejemplo, Tris, NaCl y KCl, por ejemplo, a 25 mM, 137 mM y 2,7 mM, respectivamente).
Las composiciones descritas en el presente documento se pueden incluir en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones de administración.
Las composiciones descritas en el presente documento se pueden almacenar antes de usar; por ejemplo, las composiciones se pueden almacenar congeladas (p. ej., a aproximadamente -20 °C o a aproximadamente -70 °C); se pueden almacenar en condiciones de refrigeración (p. ej., a aproximadamente 4 °C); o se pueden almacenar a temperatura ambiente.
Métodos/Usos
En otro aspecto general, la invención proporciona un polisacárido de antígeno O25B de E. coli para su uso en un método de inducción de una respuesta inmunitaria a a E. coli patógena extraintestinal (ExPEC) en un sujeto que lo necesite, que comprende administrarle al sujeto una primera cantidad eficaz de un polisacárido de antígeno O25B de E. coli y una segunda cantidad eficaz de cada uno de un polisacárido O1A de E. coli, un polisacárido de antígeno O2 de E. coli, un polisacárido O6A de E. coli, en donde la proporción entre la primera cantidad eficaz y la segunda cantidad eficaz es 2:1, cada uno de los polisacáridos antigénicos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli se unen covalentemente de forma independiente a una proteína portadora de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa destoxificada (EPA) y la primera cantidad eficaz es de 5 a 18 μg por administración. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria es eficaz para prevenir o tratar una enfermedad asociada con ExPEC en el sujeto que lo necesita.
Preferiblemente, el al menos un antígeno O de E. coli adicional usado en los métodos y usos divulgados en el presente documento es prevalente entre los aislados clínicos de E. coli. Los ejemplos de tales antígenos O adicionales incluyen, sin limitación, los antígenos O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15, O16, O18, O21, O73, O75 y O153 de E. coli. Dependiendo de la necesidad, se puede administrar más de un antígeno O de E. coli adicional, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve antígenos O de E. coli adicionales, para proporcionar una protección inmunitaria contra múltiples serotipos de E. coli además del serotipo O25B de E. coli.
Preferiblemente, una composición de la presente invención es para usar en un método que induce una respuesta
inmunitaria en un sujeto que lo necesita contra el serotipo O25 de ExPEC, y uno o más antígenos O de E. coli adicionales seleccionados del grupo que consiste en los antígenos O1A, O2 y O6A de E. coli. La composición de la presente invención puede ser para usar en un método que comprende administrarle a un sujeto que lo necesita un antígeno O25B de E. coli en una primera cantidad eficaz de 5 a 18 μg por administración, y antígenos O1A, O2 y O6A de E. coli, cada uno en una cantidad eficaz que es el 50% de la primera cantidad eficaz, en donde cada uno del antígeno O25B de E. coli y los antígenos O de E. coli adicionales están unidos covalentemente de forma independiente a una proteína portadora EPA. En una realización preferida, cada uno de los antígenos O1A, O2 y O6A de E. coli se administra de forma independiente en una cantidad eficaz de al menos 3 μg por administración, más preferiblemente en una cantidad eficaz de al menos 4 μg por administración.
En un método de acuerdo con la divulgación, la cantidad eficaz administrada del antígeno O25B de E. coli es igual o mayor que la cantidad eficaz administrada de cualquiera de los antígenos O adicionales. Por ejemplo, el antígeno O25b de E. coli se puede administrar en una primera cantidad eficaz de 4 a 24 μg por administración, y el al menos un antígeno O de E. coli adicional se puede administrar en una segunda cantidad eficaz que es, por ejemplo, el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de la primera cantidad eficaz. Cuando se administran en combinación más de un antígeno O adicional, todos los antígenos O adicionales se pueden administrar en la misma cantidad eficaz que es el 10-100% de la primera cantidad eficaz para el antígeno O25B de E. coli. Los antígenos O adicionales también se pueden administrar en diferentes cantidades eficaces, cada una de las cuales es independientemente el 10-100% de la primera cantidad eficaz del antígeno O25B de E. coli. Preferiblemente, el antígeno O25B de E. coli se administra en una primera cantidad eficaz de 5 μg a 18 μg, y el al menos un antígeno O adicional se administra en una segunda cantidad eficaz que es, independientemente, del 50% al 100% de la primera cantidad eficaz.
En una realización, se proporciona una composición de acuerdo con la invención para usar en un método de inducción de una respuesta inmunitaria a ExPEC en un sujeto que lo necesita, que comprende administrarle al sujeto un antígeno O25B de E. coli en una primera cantidad eficaz de, p. ej., 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 μg por administración, y los antígenos O1A, o 2 y O6A de E. coli, cada uno, en una cantidad eficaz que es, independientemente, por ejemplo, el 50% de la primera cantidad eficaz, en donde cada uno del antígeno O25B de E. coli y los antígenos O de E. coli adicionales está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora EPA.
En una realización preferida, se proporciona una composición de la invención para usar en un método de inducción de una respuesta inmunitaria a ExPEC en un sujeto que lo necesita, que comprende administrarle al sujeto un antígeno O25B de E. coli en una primera cantidad eficaz de 5 a 18 μg por administración, y una segunda cantidad eficaz de cada uno de un antígeno O1A de E. coli, un antígeno O2 de E. coli y un antígeno O6A de E. coli, en donde cada uno de los antígenos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora EPA, y la proporción entre la primera cantidad eficaz y la segunda cantidad eficaz es 2:1. Preferiblemente, los antígenos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli se le administran al sujeto a una proporción de dosis de 2:1:1:1, y el antígeno O25B de E. coli se administra a 5 μg, 8 μg o 16 μg por administración. También preferiblemente, los antígenos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli se le administran al sujeto en una composición.
En el presente documento se divulgan métodos y usos de composiciones para inducir una respuesta inmunitaria a ExPEC en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrarle al sujeto un antígeno O25B de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA, y al menos un antígeno O de E. coli adicional unido covalentemente a la proteína portadora EPA. En un caso específico, las composiciones descritas en el presente documento se usan para vacunar a un sujeto humano para inducir inmunidad protectora contra la infección de ExPEC del sujeto humano.
También se divulgan en el presente documento métodos de inducción de la producción de anticuerpos opsonofagocíticos contra ExPEC en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrarle al sujeto un antígeno O25B de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA, y al menos un antígeno O de E. coli adicional unido covalentemente a la proteína portadora EPA.
En una realización, dicho sujeto tiene una infección de ExPEC en el momento de la administración. En otra realización, dicho sujeto no tiene una infección de ExPEC en el momento de la administración. Los ejemplos de infecciones causadas por ExPEC incluyen, sin limitación, infección de las vías urinarias, infección de sitio quirúrgico, bacteremia, infección abdominal o pélvica, neumonía, neumonía nosocomial, osteomielitis, celulitis, pielonefritis, infección de heridas, meningitis, meningitis neonatal, peritonitis, colangitis, infecciones de tejido blando, piomiositis, artritis séptica y sepsis. Preferiblemente, la infección causada por ExPEC es una enfermedad invasiva de ExPEC causada por los serotipos de ExPEC cuyos antígenos se incluyen en las composiciones de acuerdo con realizaciones de la invención.
Las composiciones de la invención pueden ser para usar en métodos de inducción de una respuesta inmunitaria en un sujeto, descritos en el presente documento que tienen como resultado la vacunación del sujeto contra la infección por las cepas de ExPEC cuyos antígenos O están presentes en la composición o composiciones. Cuando se usa un subtipo de antígeno O, la invención también puede inducir una respuesta inmunitaria a otro subtipo de antígeno O que tiene antigenicidad similar.
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un método o composición descritos en el presente
documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada por E. coli del serotipo O25. En una realización específica, dicho serotipo O25 es o 25B. En otra realización específica, dicho serotipo O25 es O25A.
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un método o composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada por E. coli del serotipo O25, por ejemplo el serotipo O25B, y el serotipo O1, por ejemplo el serotipo O1A.
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un método o composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada por E. coli del serotipo O25, por ejemplo el serotipo O25B, y el serotipo O2.
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un método o composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada por E. coli del serotipo O25, por ejemplo el serotipo O25B, y el serotipo O6, por ejemplo el serotipo O6A.
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un método o composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada por E. coli del serotipo O25 (p. ej. O25B y/o O25A) y dos o más de los siguientes serotipos de E. coli: O1 (p. ej., O1A, O1B, y/o O1C), O2, y/o O6 (p. ej., O6A y/o O6GlcNAc).
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un método o composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada por cada uno de los siguientes serotipos de E. coli: O25 (p. ej., O25B y/o O25A), O1 (p. ej., O1A, O1B, y/o O1C), O2 y O6 (p. ej., O6A y/o O6GlcNAc).
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada por E. coli del serotipo O25B, y un serotipo de E. coli diferente de O1, O2, O6 u O25, que incluye, sin limitación, los serotipos O adicionales indicados en las tablas 1A a 1C.
Para inmunizar a un sujeto contra una infección de ExPEC, al sujeto se le puede administrar una sola composición descrita en el presente documento, en donde dicha composición comprende el antígeno O25B de E. coli y uno, dos, tres, cuatro o más antígenos O de E. coli adicionales descritos en el presente documento, cada uno unido covalentemente a una proteína portadora EPA. Como alternativa, para tratar a un sujeto que tiene una infección de ExPEC o inmunizar a un sujeto contra una infección de ExPEC, al sujeto se le pueden administrar varias composiciones descritas en el presente documento en combinación. Por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar una composición que comprende el antígeno O25B de E. coli conjugado con una proteína portadora EPA, en combinación con la administración de dos, tres, cuatro o más composiciones que comprenden conjugados de antígeno O adicionales de acuerdo con las realizaciones de la invención.
En ciertas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida en un sujeto después de la administración de una composición descrita en el presente documento es eficaz para prevenir o reducir un síntoma que resulta de una infección de ExPEC, preferiblemente en al menos el 30%, más preferiblemente en al menos el 40%, tal como en al menos el 50% de los sujetos a los que se administra la composición. Los síntomas de la infección de ExPEC pueden variar dependiendo de la naturaleza de la infección y pueden incluir, sin limitación: disuria, aumento de la frecuencia o urgencia urinaria, piuria, hematuria, dolor de espalda, dolor pélvico, dolor al orinar, fiebre, escalofríos y/o náuseas (p. ej., en sujetos que tienen una infección de vías urinarias causada por ExPEC); fiebre alta, cefalea, cuello rígido, náuseas, vómitos, convulsiones, somnolencia y/o sensibilidad a la luz (p. ej., en sujetos que tienen meningitis causada por ExPEC); fiebre, aumento de la frecuencia cardiaca, aumento de la frecuencia respiratoria, disminución de la producción de orina, disminución del recuento de plaquetas, dolor abdominal, dificultad respiratoria y/o función cardiaca anormal (p. ej., en sujetos que tienen sepsis causada por ExPEC).
En ciertas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida en un sujeto después de la administración de una composición descrita en el presente documento es eficaz para reducir la probabilidad de hospitalización de un sujeto que padece una infección de ExPEC. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida en un sujeto después de la administración de una composición descrita en el presente documento es eficaz para reducir la duración de la hospitalización de un sujeto que padece una infección de ExPEC.
Antígenos O de E. co li
Las realizaciones de la invención se refieren a composiciones y a las composiciones para usar en métodos relacionados con el antígeno O25B de E. coli y uno o más antígenos O de E. coli adicionales. Preferiblemente, el antígeno O adicional es prevalente entre los aislados clínicos de E. coli. Los ejemplos de antígenos de E. coli que se pueden usar en la invención incluyen, sin limitación, los antígenos O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli.
Como se usa en el presente documento, un “antígeno O25B de E. co li’ se refiere a un antígeno O específico para el serotipo O25B de E. coli. En una realización, un antígeno O25B de E. coli comprende la estructura de la fórmula O25B:
preferiblemente, el antígeno 025B de E. coli comprende la estructura de la fórmula 025B’:
en donde la n en la fórmula O25B o fórmula O25B' es un número entero de 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, o 15 a 20. En una realización de la invención, la n en la fórmula O25B o fórmula O25B' es un número entero de 10-20.
Preferiblemente, en las composiciones y métodos de acuerdo con las realizaciones de la invención se usa una población de antígenos O25B de E. coli que tienen la estructura de la fórmula O25B, más preferiblemente la fórmula O25B', en donde la n de al menos el 80% de los antígenos O25B de E. coli de la población es un número entero de 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, o 15 a 20. En una realización de la invención, la n de al menos el 80% de los antígenos O25B de E. coli de la población es un número entero de 10-20.
Como se usa en el presente documento, un “antígeno O1 de E. coli" se refiere a un antígeno O específico para el serotipo O1 de E. coli. En una realización, un antígeno O1 de E. coli es un antígeno O1A de E. coli.
Como se usa en el presente documento, un “antígeno O1A de E. co li’ se refiere a un antígeno O específico para el serotipo O1A de E. coli. En una realización, un antígeno O1A de E. coli comprende la estructura de la fórmula O1A:
preferiblemente, el antígeno O1A de E. coli comprende la estructura de la fórmula O1A':
en donde la n en la fórmula O1A o la fórmula O1A' es un número entero de 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, o 15 a 20. En una realización, la n en la fórmula O1A o fórmula O1A' es un número entero de 7-15.
Preferiblemente, en las composiciones y métodos de acuerdo con las realizaciones de la invención se usa una población de antígenos O1A de E. coli que tienen la estructura de la fórmula O1A, más preferiblemente la fórmula O1A', en donde la n de al menos el 80% de los antígenos O1A de E. coli de la población es de 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, o 15 a 20. En una realización, la n de al menos el 80% de los antígenos O1A de E. coli de la población es un número entero de 5-15. Como se usa en el presente documento, un “antígeno O2 de E. coli" se refiere a un antígeno O específico para el serotipo O2 de E. coli. En una realización, un antígeno O2 de E. coli comprende la estructura de la fórmula O2:
preferiblemente, el antígeno O2 de E. coli comprende la estructura de la fórmula 02 :
en donde la n en la fórmula O2 o fórmula 02 es un número entero de 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20 o 15 a 20. En una realización, la n en la fórmula O2 0 fórmula 02 es un número entero de 8-16.
Preferiblemente, en las composiciones y métodos de acuerdo con las realizaciones de la invención se usa una población de antígenos O2 de E. coli que tienen la estructura de la fórmula O2, más preferiblemente la fórmula 02 , en donde la n de al menos el 80% de los antígenos O2 de E. coli de la población es de 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, o 15 a 20. En una realización, la n de al menos el 80% de los antígenos O2 de E. coli de la población es un número entero de 5-20.
Como se usa en el presente documento, un “antígeno O6 de E. coli" se refiere a un antígeno O específico para el serotipo O6 de E. coli. En una realización, un antígeno O6 de E. coli es un antígeno O6A de E. coli.
Como se usa en el presente documento, un “antígeno O6A de E. co li’, también referido como “antígeno O6K2 de E. coli" o “antígeno O6Glc de E. coli", se refiere a un antígeno O específico para el serotipo O6A de E. coli. En una realización, un antígeno O6A de E. coli comprende la estructura de la fórmula O6A:
preferiblemente, el antígeno O6A de E. coli comprende la estructura de la fórmula 06A':
en donde el enlace p-1,2 también se denomina enlace p2, la n en la fórmula O6A o la fórmula O6A' es un número entero de 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, o 15 a 20. En una realización, la n en la fórmula O6A o fórmula O6A' es un número entero de 8-18.
Preferiblemente, en las composiciones y métodos de acuerdo con las realizaciones de la invención se usa una población de antígenos O6A de E. coli que tienen la estructura de la fórmula O6A, más preferiblemente la fórmula O6A', en donde la n de al menos el 80% de los antígenos O6A de E. coli de la población es de 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 10 a 30, 15 a 30, 20 a 30, 25 a 30, 5 a 25, 10 a 25, 15 a 25, 20 a 25, 10 a 20, o 15 a 20. En una realización, la n de al menos el 80% de los antígenos O6A de E. coli en la población es un número entero de 5-20.
En una realización preferida, una composición de la invención comprende antígenos O25B de E. coli que tienen la estructura de la fórmula O25B', en donde la n de al menos el 80% de los antígenos O25B de E. coli en la población es un número entero de 10-20; antígenos O1A de E. coli que tienen la estructura de la fórmula O1A', en donde la n de al menos el 80% de los antígenos O1A de E. coli en la población es un número entero de 5-15; antígenos O2 de E. coli que tienen la estructura de la fórmula O2', en donde la n de al menos el 80% de los antígenos O2 de E. coli en la población es un número entero de 5-20; y antígenos O6A de E. coli que tienen la estructura de la fórmula O6A', en donde la n de al menos el 80% de los antígenos O6A de E. coli en la población es un número entero de 5-20, en donde cada uno de los antígenos O está unido covalentemente a una proteína portadora EPA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Un antígeno O de E. coli útil en la invención puede producirse mediante métodos conocidos en la técnica en vista de la presente divulgación. Por ejemplo, se pueden producir a partir de una célula, preferiblemente una célula recombinante que está optimizada para la biosíntesis del antígeno O. Véase, por ejemplo, la divulgación relevante sobre ácidos nucleicos, proteínas, células hospedadoras, métodos de producción, etc., para la biosíntesis del antígeno O de E. coli en los documentos WO 2006/119987, WO 2009/104074, solicitud de patente internacional N.° PCT/EP2015/053739 (publicada como documento WO 2015/124769), Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61.
Proteína portadora EPA
De acuerdo con las realizaciones de la invención, cada antígeno O de E. coli se une covalentemente a una proteína portadora EPA (véase, p. ej., Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61). Se han descrito en la literatura diversas variantes de EPA destoxificadas y se pueden usar como proteínas portadoras EPA en los conjugados descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones, las proteínas portadoras EPA usadas en los conjugados descritos en el presente documento son EPA modificadas de tal manera que la proteína es menos tóxica y/o más susceptible de glicosilación. Por ejemplo, la destoxificación se puede lograr por mutación y supresión de los restos catalíticamente esenciales, tales como L552V y AE553, de acuerdo con Lukac et al., Infect Immun, 56: 3095-3098, 1988, y Ho et al., Hum Vaccin, 2: 89-98, 2006. En una realización específica, las proteínas portadoras usadas en la generación de los conjugados descritos en el presente documento son EPA modificadas de tal manera que el número de sitios de glicosilación en las proteínas portadoras se optimiza de una manera que permite administrar concentraciones más bajas de la proteína, por ejemplo, en una composición inmunogénica, en su forma de bioconjugado.
En ciertas realizaciones, las proteínas portadoras EPA son EPA modificadas para incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios de glicosilación de los que normalmente se asociarían con la proteína portadora (p. ej., con respecto al número de sitios de glicosilación asociados con la proteína portadora en su estado nativo/natural, por ejemplo, “tipo silvestre”). En realizaciones específicas, la introducción de sitios de glicosilación va acompañada por la inserción de secuencias de consenso de glicosilación (p. ej., Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO: 2); o preferiblemente Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural, excepto Pro (SEQ ID NO: 3) (véase el documento WO 2006/119987)) en cualquier parte en la estructura primaria de la proteína EPA. En una realización particular, la proteína portadora EPA comprende 4 secuencias de glicosilación de consenso Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr (SEQ ID NO: 3), y tiene la secuencia de aminoácidos proporcionada en la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, la proteína portadora EPA se puede producir junto con una secuencia señal (tal como un
péptido señal para DsbA de E. coli, porina A de membrana externa de E. coli (OmpA), proteína de unión de maltosa de E. coli (MalE), etc.) que dirige la proteína portadora al espacio periplásmico de la célula hospedadora que expresa la proteína portadora. La proteína portadora EPA también puede modificarse para hacer una “etiqueta”, es decir, una secuencia de aminoácidos que permite el aislamiento y/o identificación de la proteína portadora.
Una proteína portadora EPA útil en la invención puede producirse mediante los métodos conocidos en la técnica en vista de la presente divulgación. Véase, por ejemplo, la divulgación relevante, por ejemplo, en Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61, y en el documento WO 2006/119987, WO 2009/104074, y la solicitud de patente internacional N.° PCT/ EP2015/053739 (publicada como documento WO 2015/124769).
Conjugados
En ciertas realizaciones, una célula hospedadora puede producir un antígeno O de E. coli y una proteína portadora EPA, y unir covalentemente el antígeno O a la proteína portadora EPA para formar un bioconjugado útil en la invención. Véase, por ejemplo, la divulgación relevante, por ejemplo, en Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61, y en los documentos WO 2006/119987, WO 2009/104074, y en la solicitud de patente internacional N.° PCT/ EP2015/053739 (publicada como documento WO 2015/124769).
Como alternativa, los glicoconjugados se pueden preparar mediante síntesis química, es decir, se pueden preparar fuera de las células hospedadoras (in vitro). Por ejemplo, los antígenos O de E. coli descritos en el presente documento, por ejemplo, el antígeno O25B, se puede conjugar con proteínas portadoras usando los métodos conocidos para los expertos en la materia, que incluyen por medios que utilizan grupos reactivos de activación en el polisacárido/oligosacárido así como la proteína portadora. Véase, por ejemplo, Pawlowski et al., 2000, Vaccine 18: 1873-1885; y Robbins et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106: 7974-7978. Estos enfoques comprenden la extracción de polisacáridos/oligosacáridos antigénicos de las células hospedadoras, purificación de los polisacáridos/oligosacáridos, activación química de los polisacáridos/oligosacáridos y conjugación de los polisacáridos/oligosacáridos con una proteína portadora.
Los bioconjugados tienen propiedades ventajosas sobre los glicoconjugados hechos in vitro, por ejemplo, los bioconjugados requieren menos sustancias químicas para su fabricación y son más uniformes y homogéneos en cuanto al producto final generado. De esta manera, los bioconjugados se prefieren sobre los glicoconjugados producidos químicamente.
En una realización específica, la proteína portadora EPA está N-enlazada a un antígeno O de E. coli útil en la invención. Por ejemplo, el antígeno O de E. coli se enlaza al resto Asn en una secuencia de glicosilación de una proteína portadora, tal como Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro (SEQ ID NO: 2), preferiblemente Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (SEQ ID NO: 3).
Los conjugados descritos en el presente documento se pueden purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una proteína, por ejemplo, por cromatografía (p. ej., cromatografía en columna de intercambio iónico, intercambio aniónico, afinidad y exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Véase, por ejemplo, Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID # 312709 (p. 1-18); véanse también los métodos descritos en el documento WO 2009/104074. Las condiciones reales usadas para purificar un conjugado particular dependerán, en parte, de la estrategia de síntesis (p. ej., producción sintética contra producción recombinante) y de factores tales como la carga neta, hidrofobicidad y/o hidrofilicidad del bioconjugado, y serán evidentes para los expertos en la materia.
Terapias de combinación
En ciertas realizaciones, una composición descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con una o más de otras terapias (p. ej., terapias antibacterianas o inmunomoduladoras). Las una o más de otras terapias pueden ser beneficiosas en el tratamiento o prevención de una infección de ExPEC o pueden atenuar un síntoma o condición asociada con una infección de ExPEC. En algunas realizaciones, las una o más de otras terapias son calmantes del dolor o medicamentos antipiréticos. En ciertas realizaciones, las terapias se administran con menos de 5 minutos a menos de 1 semana de separación. Cualquier agente antibacteriano conocido para el experto en la materia (p. ej., antibióticos) se puede usar en combinación con una composición descrita en el presente documento.
Poblaciones de pacientes
En ciertas realizaciones, una composición descrita en el presente documento es para usarse en un método donde se administra (o aplica) a un sujeto sin tratamiento previo, es decir, un sujeto que no tiene una infección de ExPEC o que previamente no ha tenido una infección de ExPEC. En una realización, una composición descrita en el presente documento es para usarse en un método donde se administra (o aplica) a un sujeto sin tratamiento previo que está en riesgo de adquirir una infección de ExPEC.
En ciertas realizaciones, una composición descrita en el presente documento es para usarse en un método donde se administra (o aplica) a un sujeto al que se le ha diagnosticado una infección de ExPEC. En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento es para usarse en un método donde se administra (o aplica) a un sujeto infectado con ExPEC antes de que los síntomas se manifiesten o se vuelvan graves (p. ej., antes de que el paciente requiera hospitalización).
En ciertas realizaciones, una composición descrita en el presente documento es para usarse en un método donde se administra (o aplica) a un sujeto al que se le ha diagnosticado una infección de E. coli uropatógena (UPEC). En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento es para usarse en un método donde se administra (o aplica) a un sujeto que padece infecciones recurrentes de las vías urinarias. En algunas realizaciones, una composición (o método) descrita en el presente documento se administra (o aplica) a un sujeto que padece infecciones recurrentes de las vías urinarias, pero está sano en el momento del tratamiento. En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento es para usarse en un método donde se administra (o aplica) a un sujeto que tiene o está en riesgo de adquirir bacteremia o sepsis.
En algunas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento es un animal. En ciertas realizaciones, el animal es un animal canino. En ciertas realizaciones, el animal es un animal felino. En ciertas realizaciones, el animal es un caballo. En ciertas realizaciones, el animal es una vaca. En ciertas realizaciones, el animal es un mamífero, por ejemplo, un caballo, cerdo, conejo, ratón o primate. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano.
En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento es un sujeto humano, preferiblemente un sujeto humano en riesgo de tener una enfermedad invasiva de ExPEC. En ciertas realizaciones, el sujeto al cual se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento es un adulto humano de más de 50 años de edad. En ciertas realizaciones, el sujeto al cual se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento es un adulto humano mayor de 55, mayor de 60 o mayor de 65 años de edad.
En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento es un niño humano. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento es un niño humano. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento es un bebé humano, que incluye un bebé humano prematuro. En algunas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento es un niño pequeño. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento no es un bebé menor de 6 meses de edad.
En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento es un individuo en estado de embarazo. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento es una mujer que ha dado a luz 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas antes.
En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento es un individuo con un riesgo mayor de ExPEC, por ejemplo, un individuo inmunocomprometido o inmunodeficiente, un individuo programado para cirugía o que recientemente ha sido sometido a cirugía, un individuo que tiene una lesión de herida, un paciente de la unidad de cuidados intensivos (ICU) o la unidad de atención crítica (CCU), etc. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición (o método) descrita en el presente documento es un individuo en estrecho contacto con un individuo que tiene o está en riesgo mayor de infección de ExPEC.
En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento es un trabajador de atención sanitaria. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento está inmunocomprometido (p. ej., padece infección de VIH) o inmunosuprimido.
En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento tiene diabetes. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento tiene esclerosis múltiple.
En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento tiene una afección que requiere el uso de un catéter, tal como un catéter urinario. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente documento tiene una lesión de la médula espinal.
En ciertas realizaciones, el sujeto es un hombre que será sometido, o recientemente ha sido sometido, a una biopsia de la próstata.
En una realización preferida, el sujeto al que se le administra (o aplica) una composición descrita en el presente
documento es un adulto humano en riesgo, que necesita inmunización para prevenir la enfermedad invasiva de ExPEC causada por los serotipos O1A, O2, O6A y O25B de ExPEC. Los ejemplos del humano en riesgo incluyen, sin limitación, los que se han descrito anteriormente en el presente documento. Otros ejemplos de humanos en riesgo incluyen, por ejemplo, individuos que tienen ultrasonografía transrectal con biopsia de aguja de próstata (TRUS-PNB) o urosepsis recurrente, residentes de una instalación de atención de larga estancia (LTCF), pacientes que viven con asistencia de atención a largo plazo (LTAC), pacientes de precirugía (que incluyen, sin limitación, pacientes programados para cirugía genitourinaria/abdominal); pacientes de prediálisis, prediálisis, etc.
Dosis y frecuencia de administración
La administración de los conjugados de antígenos O y una proteína portadora EPA y/o composición de la misma se puede realizar mediante varias vías conocidas para el médico, por ejemplo subcutánea, parenteral, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, intradérmica, transdérmica, intranasal, etc. En una realización, la administración es mediante inyección intramuscular.
De acuerdo con las realizaciones de la invención, la dosis del antígeno O25B de E. coli covalentemente no debe ser menor, sino preferiblemente mayor que las dosis de los otros antígenos O de E. coli usados en una composición o método en el que se va a usar la composición de la invención, en donde cada uno de los antígenos O de E. coli está unido covalentemente a una proteína portadora EPA. La dosis precisa a utilizar en la formulación y método dependerá de la vía de administración y la gravedad de la infección, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada sujeto.
En ciertas realizaciones de la invención, se usan dosis ilustrativas del antígeno O25B de E. coli que varían de 5 a 18 μg de antígeno O25B por administración, y las dosis ilustrativas para cada uno de los antígenos O de E. coli adicionales para usarse en combinación con el antígeno O25B de E. coli, varían del 10% al 100% de la dosis del antígeno O25B de E. coli, en donde cada uno de los antígenos O de E. coli está unido covalentemente a una proteína portadora EPA. En ciertas realizaciones, una dosis ilustrativa para un glicoconjugado de O25B de E. coli es, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 μg de antígeno O25B por administración, y una dosis ilustrativa para otro glicoconjugado de O de E. coli para usarse en combinación con el glicoconjugado de O25B de E. coli es, por ejemplo, el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de la dosis del glicoconjugado de O25B de E. coli, en donde la dosis se calcula por la cantidad del antígeno O en los glicoconjugados de O por administración.
En ciertas realizaciones de la invención, una composición de la presente invención es para usarse en un método donde a un sujeto que lo necesita se le administran 0,5 ml de una composición de acuerdo con la invención.
En ciertas realizaciones, una dosis ilustrativa por administración a un sujeto humano corresponde a 0,5 ml de una composición que contiene una primera concentración de aproximadamente 8-48 μg/ml, por ejemplo, aproximadamente 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 o 48 μg/ml, del antígeno O25B de E. coli, unido covalentemente a una proteína portadora EPA, y una concentración del 10% al 100% de la primera concentración de uno o más antígenos O de E. coli adicionales unidos covalentemente a la proteína portadora EPA.
En ciertas realizaciones, una dosis ilustrativa por administración a un sujeto humano corresponde a 0,5 ml de una composición que contiene una concentración de aproximadamente 16 μg/ml del antígeno O25B de c Eo.li unido covalentemente a una proteína portadora EPA, aproximadamente 8 μg/ml de antígeno O1A de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA, aproximadamente 8 μg/ml de antígeno O2 de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA, y aproximadamente 8 μg/ml de antígeno O6A de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA.
En ciertas realizaciones, una dosis ilustrativa por administración a un sujeto humano corresponde a 0,5 ml de una composición que contiene una concentración de aproximadamente 32 μg/ml del antígeno O25B de c Eo.li unido covalentemente a una proteína portadora EPA, aproximadamente 16 μg/ml de antígeno O1A de c Eo.li unido covalentemente a una proteína portadora EPA, aproximadamente 16 μg/ml de antígeno O2 de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA, y aproximadamente 16 μg/ml de antígeno O6A de E. coli unido covalentemente a una proteína portadora EPA.
En ciertas realizaciones, los conjugados de antígeno O de E. coli, preferiblemente bioconjugados descritos en el presente documento o una composición descrita en el presente documento es para usarse en un método donde se le administra a un sujeto una vez como una sola dosis. En ciertas realizaciones, los conjugados de antígeno O de E. coli, preferiblemente bioconjugados, descritos en el presente documento o una composición descrita en el presente documento es para usarse en un método donde se le administra a un sujeto como una sola dosis seguida por una segunda dosis de 3 a 6 semanas después. De acuerdo con estas realizaciones, se pueden administrar inoculaciones de refuerzo al sujeto a intervalos de 6 a 24 meses después de la segunda inoculación. En ciertas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden utilizar un antígeno O de E. coli, o bioconjugado o composición diferente. En algunas realizaciones se puede repetir la administración del mismo antígeno O de E. coli, conjugado o composición, y las administraciones se pueden separar al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 7 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses, o al menos 6 meses. En ciertas realizaciones, un conjugado de antígeno O de E. coli
descrito en el presente documento o una composición descrita en el presente documento es para usarse en un método donde se le administra a un sujeto como una sola dosis una vez al año. En ciertas realizaciones, un conjugado de antígeno O de E. coli descrito en el presente documento o una composición descrita en el presente documento es para usarse en un método donde se le administra a un sujeto como una sola dosis una vez cada n años, siendo n por ejemplo aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 años.
En ciertas realizaciones, un conjugado de antígeno O de E. coli descrito en el presente documento o una composición descrita en el presente documento es para usarse en un método donde se le administra a un sujeto como 2, 3, 4, 5 o más dosis con 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o 6 semanas de separación. En algunas realizaciones, se le administran a un sujeto 2, 3, 4, 5 o más dosis de un conjugado de antígeno O de E. coli descrito en el presente documento o una composición descrita en el presente documento, con 2, 3, 4, 5 o 6 semanas de separación. En ciertas realizaciones, el conjugado o composición de antígeno O de E. coli administrada es la misma cada vez. En ciertas realizaciones, el conjugado o composición de antígeno O de E. coli administrado es diferente cada vez.
Ensayos
La capacidad de los conjugados/composiciones descritas en el presente documento para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto se puede evaluar usando cualquier enfoque conocido para los expertos en la materia en vista de la presente divulgación.
Ensayo para evaluar la capacidad de los bioconjugados para inducir una respuesta inmunitaria
En algunas realizaciones, la capacidad de un bioconjugado para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto se puede evaluar inmunizando a un sujeto (p. ej., un ratón) o un grupo de sujetos con el bioconjugado e inmunizando un sujeto adicional (p. ej. un ratón) o un grupo de sujetos con un control (p. ej., un placebo). Los sujetos o el grupo de sujetos pueden exponerse subsiguientemente a ExPEC y se puede determinar la capacidad de ExPEC para causar enfermedad (p. ej., UTI) en los sujetos o grupo de sujetos. Los expertos en la materia reconocerán que si el sujeto o grupo de sujetos inmunizados con el control padecen la enfermedad después de la exposición a ExPEC, pero el sujeto o grupo de sujetos inmunizados con uno o más bioconjugados o una composición de los mismos descrita en el presente documento padecen menos o no padecen la enfermedad, entonces el bioconjugado es capaz de generar una respuesta inmunitaria en el sujeto. La capacidad de uno o más bioconjugados o composiciones de los mismos descritas en el presente documento para inducir antisuero que presenta reacción cruzada con un antígeno O de ExPEC puede ensayarse, por ejemplo, por medio de un inmunoensayo tal como ELISA.
Ensayos bactericidas in vitro
La capacidad de los conjugados/composiciones descritas en el presente documento para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto se puede evaluar usando un ensayo bactericida de suero (SBA) o un ensayo de destrucción opsonofagocítica (OPK), que representa un método establecido y aceptado que se ha utilizado para obtener la aprobación de vacunas basadas en glicoconjugado. Estos ensayos son muy conocidos en la técnica y, en resumen, comprenden las etapas de generar y aislar anticuerpos contra una diana de interés (p. ej., un antígeno O, por ejemplo, O25B de E. coli) administrándole a un sujeto (p. ej., un ratón) un compuesto que provoca tales anticuerpos. Subsecuentemente puede evaluarse la capacidad bactericida de los anticuerpos, por ejemplo, cultivando las bacterias en cuestión (p. ej., E. coli del serotipo relevante) en presencia de dichos anticuerpos y complemento y, dependiendo del ensayo, células neutrófilas, y determinando la capacidad de los anticuerpos para destruir o neutralizar a las bacterias, por ejemplo, usando enfoques microbiológicos convencionales.
Kits
Se divulga en el presente documento un paquete o kit que comprende uno o más recipientes llenos de uno o más de los ingredientes de las composiciones descritas en el presente documento, tales como uno o más antígenos O de E. coli y/o conjugados de los antígenos O de E. coli, unidos covalentemente a una proteína portadora EPA. Opcionalmente asociado con tal o tales recipientes puede estar un aviso o instrucciones en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, reflejando dicho aviso la aprobación de la fabricación, uso o venta para administración humana por parte de la agencia. Los kits se pueden usar en los métodos de tratamiento e inmunización de los sujetos anteriormente mencionados.
Los siguientes ejemplos de la invención son para ilustrar adicionalmente la naturaleza de la invención. Se debe entender que los siguientes ejemplos no limitan la invención y que el alcance de la invención ha de ser determinado por las reivindicaciones anexas.
Ejemplos
Bioconjugados de antígeno O
Los bioconjugados O1A-EPA, O2-EPA, O6A-EPA y O25B-EPA que contienen, respectivamente, O1A, O2, O6A y
O25B de E. coli unidos covalentemente a los sitios de glicosilación de una proteína portadora EPA, se pueden producir, purificar y caracterizar como se describe por ejemplo en Ihssen et al., 2010, Microbial Cell Factories 9, 61, y en los documentos WO 2006/119987, WO 2009/104074, y en la solicitud de patente internacional N.° PCT/EP2015/053739 (publicada como documento WO 2015/124769). Los bioconjugados se sintetizan usando células E. coli recombinantes que expresan las enzimas sintetizadoras de polisacárido de los diferentes serotipos O en presencia de oligosacariltransferasa PglB, y una proteína portadora (EPA). En este enfoque, la vacuna glicoconjugada puede ser expresada en el periplasma de E. coli, extraída y purificada por medio de un proceso bioquímico ilustrado en las figuras 1 y 2. La tabla 2 indica las cepas hospedadoras usadas para la producción de los conjugados de acuerdo con una realización de la invención.
Tabla 2: Cepas hospedadoras para la producción de lotes preclínicos, de estudio toxicológico y clínicos
Por ejemplo, para la producción de O25B-EPA, se construyó una cepa con un racimo de O25B integrado genómicamente: W3110 AwaaL AgtrABS AfbO16::rfb(upec138), que fue transformada con los plásmidos pGVXN1076 (que expresa la EPA que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1) y pGVXN970 (que expresa la oligosacaril transferasa PelB) (documento WO/2009/104074). Esta cepa se construyó a partir de la cepa W3110 mediante los métodos de Datsenko y Wanner (2000, Proc Natl Acad Sci USA 97: 6640-6645) y una técnica de recombinación homóloga para integración dirigida al sitio de insertos grandes en cromosomas bacterianos (véase el documento WO 2014/057109). El racimo rfb relacionado con el antígeno O25B se clonó a partir de la cepa de E. coli upec138, que es positiva para O25B. Las células hospedadoras recombinantes produjeron bioconjugados de O25B/EPA en el periplasma. Los bioconjugados de O25B resultantes se caracterizaron usando ensayos convencionales de liberación y caracterización. Los bioconjugados se purificaron usando dos etapas consecutivas de cromatografía de intercambio aniónico y exclusión de tamaño, produciendo preparaciones de bioconjugado de O25B con una pureza del 98,1 %.
Similarmente, se construyeron cepas hospedadoras para la producción recombinante de O1A-EPA, O2-EPA y O6A-EPA (tabla 2). Estas cepas incluyen los racimos rfb relacionados con O1A, O2 y O6A clonados a partir de la cepa de E. coli upec032, upec116 y CCUG11309, respectivamente. Los bioconjugados de O1A-EPA, O2-EPA y O6A-e Pa se produjeron a partir de estas células hospedadoras recombinantes y se purificaron usando los métodos conocidos en la técnica en vista de la presente divulgación.
Se usó cuantificación de SDS PAGE para el análisis de pureza. Se calcularon las proporciones entre azúcar y proteína basándose en la cuantificación de azúcar por medio del ensayo de antrona (véase Laurentin y Edwards, 2003, Anal Biochem 315, 143-145) y el ensayo de BCA para la concentración de proteína. La cromatografía de exclusión de tamaño analítica mostró un estado monomérico de las partículas en concordancia con el radio hidrodinámico esperado de EPA con cadenas de glicano unidas.
Los bioconjugados y un estándar de referencia de EPA no glicosilado se analizaron por cromatografía de exclusión de tamaño con dispersión de luz de ángulo múltiple (SEC-MALS), para cuantificar el grado de mono- y di-glicosilación de los bioconjugados individuales, y para determinar la masa molecular (MW) de la proteína portadora y del O-PS unido a la misma. Las muestras se separaron en una columna TSKgel-G3000 SWxl en tampón de fosfato (pH 7,0; NaCl 50 mM, fosfato de sodio 150 mM) y se supervisaron por UV (214 y 280 nm), índice de refracción (RI) y dispersión de luz de ángulo múltiple (MALS).
Composiciones de vacuna
Este ejemplo ilustra las composiciones de vacuna útiles para la invención.
Tabla 3-1: Composiciones de vacuna
(continuación)
Cada una de las composiciones de vacuna líquidas anteriormente ilustradas se envasa en un vial listo para inyección. Los productos de vacuna se deben almacenar de 2 °C a 8 °C.
Las sustancias activas de la composición de vacuna son proteínas glicosiladas (bioconjugados compuestos de la proteína portadora EPA unida covalentemente a un polisacárido de antígeno O de E. coli), y la dosis se calcula basándose únicamente en el contenido de la fracción de polisacárido (antígeno O).
La dosis de la proteína portadora EPA depende de la proporción de polisacárido a proteína. La proporción estimada de polisacárido a proteína estuvo comprendida entre el 15% y el 50%, dependiendo del serotipo de antígeno O, es decir, el peso del polisacárido en un conjugado es de aproximadamente el 15% al 50% del peso de la proteína portadora EPA en el conjugado. Para cada serotipo de ExPEC4V se cuantificó la proporción de polisacárido a proteína, por ejemplo, la cantidad de polisacárido (antígeno O) se midió por medio del ensayo de antrona (véase Laurentin y Edwards, 2003, Anal Biochem 315, 143-145) y se usó el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) para medir la concentración de proteína. Para cada serotipo de los productos 1-3, el valor de EPA proporcionado en las tablas 3-1 y 3-2 es el valor esperado basado en los resultados analíticos de ExPEC4V.
La estabilidad de las composiciones de vacuna tetravalente (bioconjugados de O25B, O1A, O2 y O6) se ensayó durante un periodo de 3 meses. Los estudios incluyeron condiciones de almacenamiento acelerado y de estrés para identificar las rutas de degradación. Estos estudios demuestran que las sustancias activas y las composiciones de vacuna tetravalente son estables durante al menos tres meses y, por lo tanto, son composiciones de vacuna adecuadas con respecto a la estabilidad.
Estudio de toxicidad de dosis repetida en ratas
Se realizó un estudio de toxicidad con buenas prácticas de laboratorio (GLP) con un periodo de recuperación de 14 días en ratas Sprague-Dawley para evaluar la toxicidad y tolerancia local de una composición de vacuna después de 2 inyecciones intramusculares (i.m.) (en el músculo cuádriceps femoral) los días 1 y 14. Se evaluó la reversibilidad, persistencia y retraso de aparición de cualquier cambio después de un periodo de recuperación de 14 días (es decir, el día 28). El diseño del estudio de toxicidad de dosis repetida de fase I en la rata se esboza en la tabla 4.
Tabla 4 : Diseño del estudio de toxicidad de dosis repetida en la rata
EPA = Exoproteína Nexotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, forma destoxificada usada como proteína portadora;
F = hembras,
M = machos
Nota: Día 1 = inicio del tratamiento
a Al grupo de vehículo se le administró el tampón de la formulación (control de vehículo)
b Los animales recibieron 2 inyecciones de 0,25 ml por administración (pata trasera izquierda y derecha). Los animales recibieron las dosis en 2 ocasiones: el día 1 y el día 14
c Los animales principales se sacrificaron el día 17
d Los animales recuperados se sacrificaron el día 28, es decir, 14 días después del segundo tratamiento
En este estudio se ensayó una dosis de 4 |jg por polisacárido (PS) de antígeno O de ExPEC4V (dosis total de PS de 16 jg). Esta dosis es equivalente a la dosis máxima que fue evaluada en el estudio clínico de fase I descrito más adelante. Por lo tanto, la dosis humana completa usada en la fase I se administró en el estudio de toxicología GLP de rata. El estudio se realizó con un lote no clínico que era representativo del lote usado en el estudio clínico de Fase I.
No se observó mortalidad durante el estudio ni tampoco signos clínicos (que incluyen temperatura corporal) ni observaciones oftalmológicas relacionadas con el tratamiento. Además, no hubo efectos adversos toxicológicamente relevantes en el peso corporal, ganancia de peso corporal, consumo de alimentos, o hematología, química clínica, coagulación y parámetros de uroanálisis. No hubo hallazgos macroscópicos relacionados con el artículo de ensayo ni diferencias en los pesos de órgano al final del tratamiento (día 14) y el periodo de recuperación (día 28).
No se observaron hallazgos microscópicos adversos relacionados con el artículo de ensayo. No se observaron hallazgos microscópicos adversos mínimos a leves (inflamación intersticial, degeneración/necrosis de miofibra e infiltrados de células inflamatorias mixtas) en los sitios de inyección en el músculo cuádriceps femoral al final del periodo de tratamiento tanto en el grupo de vehículo como en el grupo tratado. Por lo tanto, estos hallazgos fueron considerados no relacionados con la administración del artículo de ensayo, sino un resultado del procedimiento de dosificación (es decir, la inyección i.m.). Al final del periodo de recuperación, los músculos del sitio de inyección del día 1 se habían recuperado, mientras que en el sitio de inyección del día 14 se observó inflamación celular mixta/infiltrados mínimos residuales en el músculo, sugiriendo una recuperación en curso de los animales de vehículo y tratados. En general, la vacuna fue bien tolerada y no se observaron efectos adversos relacionados con el tratamiento.
La inmunogenicidad de la vacuna se ha confirmado al inducir títulos más altos de inmunoglobulina G (IgG) en el suero hacia los 4 antígenos O en el grupo vacunado, en comparación con el grupo de vehículo que recibió únicamente el tampón de la formulación.
Estudios de toxicidad de dosis repetida en conejos
Se realizó un estudio de toxicidad de dosis repetida GLP con un periodo de recuperación de 3 semanas en conejos NZW (TOX11163, proyecto de informe) para evaluar la toxicidad y tolerancia local de ExPEC4V después de 3 inyecciones i.m. (días 0, 14, y 28) administradas con 2 semanas de separación. La reversibilidad, persistencia y aparición retrasada de cualquier cambio se evaluaron el día 49, después de un periodo libre de tratamiento de 3 semanas después de la 3a inyección el día 28. El diseño del estudio de toxicidad de dosis repetida de fase 2 en el conejo se puede encontrar en la tabla 5.
Tabla 5 : Diseño de estudio de toxicidad de dosis repetida en el conejo
ADM: sitio de administración; F = hembras; M = machos
Nota: Día 0 = inicio del tratamiento; el grupo 1 recibió solución salina (grupo de control)
a Total de polisacárido de antígeno O (proporción 1:1:1:1 para los serotipos O1A, O2, O6A y O25B, respectivamente) b 8 |jg de polisacárido por serotipo 109 |jg en total de proteína portadora EPA
c 16 jg de polisacárido por serotipo 218 jg en total de proteína portadora EPA
d ADM 1: parte inferior izquierda del músculo bíceps femoral; ADM 2: parte inferior derecha del músculo bíceps femoral; ADM 3: parte superior izquierda del músculo bíceps femoral; ADM 4: parte superior derecha del músculo bíceps femoral; ADM 5: músculo cuádriceps femoral izquierdo; ADM 6: músculo cuádriceps femoral derecho
e Los animales terminales se sacrificaron el día 30 y los animales recuperados el día 49
En este estudio se ensayó una dosis máxima de 16 |jg por PS de antígeno O de ExPEC4V (dosis total de PS de 64 |jg, junto con 218 jg de proteína portadora EPA). Esta dosis es 4 veces más alta que la dosis máxima que se ensayó previamente en el estudio de toxicidad GLP de fase 1 en la rata, y es equivalente a la dosis máxima de PS (y EPA) que se evalúa en el estudio clínico de fase 2 que se describe más adelante. Por lo tanto, en este estudio de toxicología GLP de conejo se administró la dosis humana completa (máxima) usada en la fase 2.
El estudio se realizó con ExPEC4V (que contiene 32 jg/m l de PS en total) que se usó en el estudio clínico de fase 1 descrito más adelante. Este lote se considera representativo para la composición de vacuna que se usa en el estudio clínico de fase 2 descrito más adelante (que contiene 128 jg/m l de PS en total), ya que se usan las mismas sustancias de fármaco para ambas composiciones de vacuna.
No se observó mortalidad durante el estudio. No hubo efectos sobre la temperatura corporal, peso corporal, ganancia de peso corporal, consumo de alimentos, oftalmología, evaluación de la piel (puntuación de Draize), química clínica y proteína C reactiva.
Las hembras que recibieron 64 jg de ExPEC4V presentaron niveles de hemoglobina mínimamente disminuidos, no adversos, al final del periodo de tratamiento y recuperación, con disminuciones mínimas en el recuento total de RBC y hematocrito al final del periodo de recuperación. El fibrinógeno aumentó mínimamente 1 semana después de la 1a inyección y al final del periodo de tratamiento en las hembras, pero ya no se observaron cambios al final de la fase libre de tratamiento (recuperación).
Poco después de la dosificación, se observó una decoloración oscura de la hipodermis en algunos animales de los grupos que recibieron ExPEC4V, lo que se correlaciona con los focos/áreas de decoloración que se observaron en los sitios inyectados el día 28 en todos los grupos (incluido el grupo de control) en la necropsia (día 30). No se observaron anomalías al final del periodo de recuperación. Se observaron histopatológicamente múltiples focos de infiltrados celulares inflamatorios mixtos (de mínimos a ligeros) principalmente en los sitios de inyección del día 28 en los animales que recibieron ExPEC4V. Al final del periodo de recuperación (día 49) sólo 1 hembra del grupo de dosis alta presentó infiltrados celulares inflamatorios mixtos en los sitios de inyección del día 28, indicando recuperación (en curso).
Dentro de los ganglios linfáticos ilíacos mediales drenantes, se observó la producción (en centros germinales) y secuestro de células linfoblásticas dentro de la paracorteza y/o cordones medulares de los conejos que recibieron ExPEC4V al final del periodo de tratamiento, dando como resultado mayor celularidad general. Además, los ganglios linfáticos eran más grandes en ambos sexos, lo que se correlaciona con un aumento de peso en las hembras. Estos hallazgos no se observaron al final del periodo de recuperación. Al final del periodo de tratamiento y recuperación se observó un aumento en el número de centros germinales en el bazo de machos y hembras tratadas, y fue acompañado por un aumento en el peso del bazo en ambos sexos al final del periodo de tratamiento.
Estos hallazgos se consideran no adversos y relacionados con la respuesta inmunitaria a la administración de la vacuna.
La inmunogenicidad de la vacuna se confirmó ya que los niveles de IgG en el suero contra los 4 serotipos de antígeno
O y también EPA fueron elevados en machos y hembras.
En general, la vacunación de los conejos (3 inyecciones i.m. con 2 semanas de separación) con dosis de ExPEC4V que contienen hasta 64 |jg de PS en total fueron seguras y bien toleradas. Se considera que todos los efectos observados relacionados con el tratamiento reflejan una respuesta normal no adversa inducida por la administración de la vacuna.
Funcionalidad de las respuestas de anticuerpo inducidas por las vacunas en ratas
Para evaluar la actividad funcional de las respuestas de anticuerpo inducidas por vacuna de los bioconjugados de O25B, O1A, O2 y O6A, el suero de ratas vacunadas con vacunas monovalentes o tetravalentes que contienen los bioconjugados de EPA de O25B, O1A, O2 y O6A, cada uno solo o en combinación, se analizó usando ensayos de destrucción opsonofagocítica (OPK), que miden la fagocitosis dependiente del complemento y de anticuerpos in vitro y la destrucción de las bacterias, por ejemplo, E. coli. El ensayo OPK mide la capacidad del suero para facilitar la opsonofagocitosis y la destrucción de diferentes serotipos de E. coli. En placas de 96 pocillos se incubaron diluciones definidas del suero de muestra en cada pocillo, con bacterias de uno de los cuatro serotipos de E. coli específicos de vacuna, una cantidad definida de células HL60 y complemento de cría de conejo. Después de la incubación, una proporción de la mezcla se aplicó sobre agar de soja tríptico (TSA) y se contó el número de colonias bacterianas. La capacidad de los anticuerpos para unirse a las células bacterianas y activar la deposición del complemento y mediar la captación y destrucción de las bacterias por células HL60, se expresó como el título opsónico. El título opsónico o índice de opsonización (OI) corresponde a la dilución del suero que destruye al 50% de las células bacterianas. Se proporcionan los índices opsónicos para el suero antes de la inmunización y después de la inmunización. Se considera significativo un aumento de al menos 4 veces del OI de antes de la inmunización a después de la inmunización.
La E. coli se opsonizó previamente con diluciones de suero de ratas vacunadas, incubadas con complemento y fagocitos (células HL60 diferenciadas), y se determinaron las unidades formadoras de colonias (CFU). Subsecuentemente, se calculó el % máximo de destrucción y los índices de opsonización (OI: dilución de suero que destruye al 50% de E. coli). Las bacterias E. coli seleccionadas para el análisis de OPK fueron OC 24453 (serotipo O2), OC 24781 (serotipo O6A) y OC 24176 (serotipo O25B).
Como muestran los resultados representados en las figuras 3A a 3C, las vacunas monovalentes que contienen O2-EPA, O6A-EPA y O25B-EPA indujeron respuestas de anticuerpo robustas en las ratas y estas respuestas de anticuerpo son funcionales para destruir E. coli de estos serotipos.
La tabla 6 muestra los títulos de OI total para los antígenos O: O2, O6A y O25B de las ratas inmunizadas con la vacuna tetravalente con 0,4 o 4 μg por antígeno O. Los títulos se determinaron en dos experimentos separados. La dosis de 0,4 μg indujo OI significativos en todos los animales para los serotipos O2 y O6A. Para O25B, 3/8 animales mostraron un aumento significativo en OI después de la inmunización con la dosis de 0,4 μg. En comparación con la dosis de 0,4 μg, la dosis de 4 μg indujo aumentos de OI más bajos para O2 en todos los animales. Cuando el suero del grupo de dosis de 4 μg se probó en E. coli O25B, 3/8 animales mostraron aumentos de OI.
Los datos confirman que una vacuna tetravalente es capaz de provocar anticuerpos opsónicos específicos del antígeno O contra O2, O6A y O25B en los animales, demostrando que las composiciones de vacuna descritas en el presente documento inducen respuestas de anticuerpo contra serotipos de E. coli cuyos antígenos O están incluidos en la vacuna, y que tales respuestas de anticuerpo son funcionales para destruir E. coli de estos serotipos.
Efectos en humano - Estudio de fase I
La ExPEC4V se ha ensayado en un primer estudio en humanos de fase 1 que reclutó un total de 194 sujetos. Este estudio de fase 1 es un estudio multicéntrico aleatorizado, controlado por placebo. El estudio se realizó con enmascaramiento simple ya que el investigador y el personal del estudio conocían el grupo de aleatorización de los sujetos, mientras que a los sujetos no se les dio a conocer su grupo de aleatorización en ningún momento.
El objetivo de este primer estudio en humanos fue evaluar la seguridad, inmunogenicidad y eficacia de la vacuna candidata en mujeres sanas de edad >18 años a ≤70 años con una historia de infección de las vías urinarias recurrente (rUTI). El objetivo primario del estudio fue la comparación de eventos adversos (AE) solicitados y no solicitados y eventos adversos graves (SAE) entre los sujetos que recibieron ExPEC4V y los que recibieron placebo. Los objetivos secundarios principales incluyeron parámetros de inmunogenicidad, el número de episodios de UTI sintomáticos causados por los serotipos de la vacuna de E. coli y la tasa de aparición de síntomas clínicos de UTI por E. coli específica del serotipo de la vacuna.
Se requirió que los sujetos elegibles hubieran tenido al menos 3 episodios de UTI independientes en los últimos 12 meses o al menos 2 episodios de UTI independientes en los 6 meses anteriores; al menos 1 de los episodios de UTI independientes se habría debido a una infección de E. coli confirmada por cultivo. Se reclutaron un total de 194 sujetos y se asignaron aleatoriamente a una sola dosis i.m. de 0.5 ml de ExPEC4V o placebo (véase la tabla 7). El reclutamiento se hizo con un enfoque escalonado para evaluar los datos de seguridad el día 14 antes de proceder con la siguiente fase:
1. Los primeros 8 sujetos se asignaron aleatoriamente (3:1) a una dosis de 1 μg de cada PS o placebo;
2. Los siguientes 8 sujetos se asignaron aleatoriamente (3:1) a una dosis de 4 μg de cada PS o placebo;
3. Los 178 sujetos restantes se asignaron aleatoriamente (1:1) a una dosis de 4 μg de cada PS o placebo.
Tabla 7 : Características demográficas y basales de los sujetos reclutados en el estudio de fase 1
Las dosis de ExPEC contienen polisacáridos de antígeno O de los 4 serotipos de ExPEC O1A, O2, O6A y O25B
En la primera visita se seleccionaron los sujetos elegibles que dieron su consentimiento informado y se confirmó el cumplimiento de los criterios de inclusión/exclusión. Se extrajo sangre y se recolectó la orina. En la visita 2 (día 1), cada sujeto recibió una inyección intramuscular de 0,5 ml de solución (ExPEC4V o placebo) en el músculo deltoides. La dosis reducida de la vacuna candidata contenía 1 μg de cada polisacárido (4 μg en total de polisacárido). La dosis diana de la vacuna candidata contenía 4 μg de cada polisacárido (16 μg en total de polisacárido).
La seguridad se evaluó basándose en los AE locales (dolor, eritema e hinchazón en el sitio de la inyección) y sistémicos (fiebre, es decir, temperatura corporal > 38° C) solicitados recopilados en un diario a partir del día 1 postvacunación hasta el día 7 y en los AE y SAE recopilados hasta el día 270 (finalización de la visita de estudio). La inmunogenicidad se evaluó calificando ensayos de inmunoabsorción ligados a enzima (ELISA) y ensayos de destrucción opsonofagocítica (OPK) usando suero de muestras de sangre tomadas antes de la vacunación el día 1 y después de la vacunación los días 30 y 270.
Se proporciona estadística descriptiva (n, media, desviación estándar, mediana e intervalos para variables continuas, frecuencias y porcentajes para variables categóricas) por grupo de tratamiento y/o visita, donde sea aplicable. Todos los datos se presentan por sujeto, grupo de tratamiento y, donde sea aplicable, visita. Todos los sujetos del grupo B que recibieron placebo se combinaron para formar el grupo de tratamiento de placebo.
Seguridad
Hasta la fecha, no se ha identificado ninguno de los siguientes casos en el estudio de fase 1 (que todavía está en curso): reacciones farmacológicas adversas, anomalías significativas de laboratorio clínico, efectos adversos cardiovasculares, pulmonares, del sistema nervioso central, renales u otros efectos adversos significativos, sobredosificación. La aparición de eventos adversos y eventos adversos graves fue comparable entre los grupos de placebo y vacunados.
Inmunogenicidad - Título de anticuerpo total
Para evaluar la inmunogenicidad de los componentes de vacuna, se obtuvo el suero de las mujeres que participaban en el estudio clínico y se analizó por ELISA para cuantificar IgG contra los cuatro antígenos O diferentes incluidos en la vacuna tetravalente (E. coli O1, E. coli O2, E. coli O6 y E. coli O25B). Los títulos de anticuerpo IgG total en el suero el día 1 (prevacunación) y el día 30 se evaluaron por medio de un ELISA cualificado optimizado para cada aislado de serotipo, usando antígeno O específico de serotipo purificado como el antígeno de ensayo primario. Los títulos totales de anticuerpo IgG por serotipo se calcularon usando un ajuste de una curva logística de 4 parámetros para determinar por muestra los valores de concentración media eficaz máxima (EC50).
1 μg de polisacárido por serotipo en ExPEC4V (N = 6)
Seis sujetos recibieron una dosis de ExPEC4V de 1 μg de PS por serotipo (4 μg de PS en total). El análisis de las respuestas inmunitarias específicas de serotipo de estos sujetos el día 30 mostraron que la proporción de sujetos con un aumento >2 veces de anticuerpo total por serotipo fue de 50% (serotipo O1A), 83% (serotipo O2), 50% (serotipo O6A) y 67% (serotipo O25B). La proporción de sujetos con un aumento >4 veces del título de anticuerpo fue más bajo, es decir, 17% (serotipo O6A), 33% (serotipo 1A), 33% (serotipo 2) y 50% (serotipo O25B).
El análisis de las respuestas del grupo de dosis de 1 μg de PS por serotipo produjo aumentos de magnitud similar entre los 4 serotipos. Para los serotipos O1A, O2, O6A y O25B, comparando el día 30 con el día 1, la mediana de veces de aumento del título de anticuerpo fue 2,5, 3,7, 2,2 y 4,1, respectivamente. Las veces de aumento individuales de sujeto variaron de 1 a 6 para los serotipos O1A y O2, de 1 a 7 para el serotipo O6A, y de 1 a 11 para el serotipo O25B. Los valores de media geométrica del título (GMT) el día 30 fueron 4.053, 13.768, 1.236 y 227 para los 4 serotipos respectivos (tabla 8), representando un aumento de aproximadamente 2,2 - 3,5 veces respecto a los valores de GMT del día 1.
Tabla 8 : GMT e intervalos de confianza del 95% de los títulos de anticuerpo total determinados por ELISA del día 1
(prevacunación) al día 30 - Estudio de fase 1
E PEC4V
4 μg de polisacárido por serotipo ExPEC4V (N = 93)
En comparación con la dosis que contiene 1 μg de PS por serotipo (4 μg de PS en total), la administración de una dosis de ExPEC4V de 4 μg de PS por serotipo (16 μg de PS en total) produjo una respuesta inmunitaria más robusta. El análisis de estos sujetos el día 30 mostró que la proporción de sujetos con un aumento >2 veces en el total de anticuerpos por serotipo fue del 81% (serotipo O1A), 92% (serotipo O2), 80% (serotipo O6A) y 82% (serotipo O25B). La proporción de sujetos con un aumento >4 veces en el título de anticuerpo varió del 57% (serotipos O1A y O6A) al 80% (serotipo O2), que es más baja que la proporción con un aumento de 2 veces, pero considerablemente más alta que la observada con la dosis que contiene 1 μg de PS por serotipo. Véase también la figura 4, se observó una respuesta inmunitaria robusta a cada uno de O1A, O2, o 6a y O25B, y se observó un aumento significativo en los títulos de ELISA entre después de la inyección (30 días después de la inyección) y antes de la inyección (día 1) solo en los grupos vacunados (V_Día 30 contra V_Día 1), pero no en los grupos de placebo (P_Día 30 contra P_Día 1).
El análisis de las respuestas del grupo de 4 μg de PS por serotipo produjo medianas de veces de aumento que fueron más grandes que las del grupo de dosis de 1 μg de PS por serotipo. Para los serotipos O1A, O2, O6A y O25B, comparando el día 30 con el día 1, las medianas de veces de aumento de EC50 fueron 4,6, 9,4, 4,9 y 5,9, respectivamente. La magnitud y variabilidad en las veces de aumento fueron mayores con este grupo de dosis, variando de 1 a 96 para el serotipo O1A, de 1 a 165 para el serotipo O2, de 0 a 61 para el serotipo O6A, y de 1 a 579 para el serotipo o 25B. Los valores de GMT el día 30 fueron 9.460, 27.973, 4.475 y 2.164 para los 4 serotipos respectivamente (tabla 8), representando aproximadamente un aumento de 4,9 a 9,8 veces sobre los valores de GMT del día 1.
Conclusión
Estos resultados intermedios muestran una respuesta inmunitaria específica de vacuna en sujetos sanos a los que se administró la dosis de 1 μg de PS por serotipo de ExPEC4V, y un aumento comparativamente mayor en la respuesta inmunitaria con la dosis más alta de 4 μg de PS por serotipo de ExPEC4V, durante un periodo de observación de 30 días. La falta de cambio relevante en los títulos de anticuerpo de los 95 sujetos del grupo de placebo durante este periodo sugiere que la respuesta de anticuerpo en los receptores de ExPEC4V está mediada por la vacuna y no se debe a exposición ambiental a las bacterias ExPEC.
Estos datos indican un aumento general de los títulos de anticuerpo asociado con la dosis más alta de 4 μg de PS por serotipo, en comparación con la dosis de 1 μg de PS por serotipo. Aunque estos resultados sugieren mayor variabilidad asociada con los títulos del grupo de dosis más alta en comparación con el grupo de dosis más baja, el pequeño número de sujetos del grupo de dosis de 1 μg por sujeto limita la interpretación de cualquier diferencia observada. También se observaron diferencias dentro de cada grupo de dosis en los títulos relativos de IgG por serotipo, siendo el título de anticuerpos para el antígeno O25B el más bajo (tabla 8).
Respuesta de anticuerpo funcional
Se usaron ensayos de OPK para evaluar la respuesta de anticuerpo funcional de mujeres que participan en el estudio clínico. Se recolectó suero de los participantes del estudio. Previamente se opsonizó E. coli con diluciones de suero de las mujeres vacunadas, se incubó con complemento y fagocitos (células HL60 diferenciadas) y se determinaron las unidades formadoras de colonias (CFU) remanentes. Subsiguientemente se calculó el porcentaje máximo de destrucción y los índices de opsonización (OI: dilución de suero que destruye al 50% de E. coli). La E. coli seleccionada para los ensayos de OPK fueron OC 24452 (serotipo O1A), OC 24453 (serotipo O2), OC 24454 (serotipo O6A) y OC
24176 (serotipo O25B).
Se evaluaron los sueros del día 1 y del día 30 para determinar los anticuerpos funcionales (medidos como el índice de opsonización [OI], o la concentración en suero que produce una disminución del 50% de las unidades formadoras de colonias de E. coli), por medio de un ensayo de OPK optimizado usando cepas de ExPEC seleccionadas del serotipo O1A, O2, O6A u O25B, con complemento humano y células fagocíticas HL60. Los títulos de anticuerpo funcional para el serotipo O25B se incluyen en el análisis intermedio basándose en evaluaciones preliminares de exactitud del título y reproducibilidad. Los títulos de anticuerpo funcional se determinan, para todos los serotipos, a partir de las mediciones de destrucción de E. coli mediada por opsonofagocitosis usando el programa NICE desarrollado por el National Institute of Standards and Technology de Estados Unidos y el programa Opsititer3, desarrollado y autorizado por la University of Alabama. Para el análisis intermedio se determinaron los títulos de OPK de los 194 sujetos, que incluyen 95 sujetos que recibieron placebo, 6 sujetos que recibieron la vacuna de ExPEC4V de 1 μg de PS (por serotipo) y 93 sujetos que recibieron la vacuna de ExPEC4V de 4 μg de PS (por serotipo).
Receptores del placebo (N = 95)
Según se observa con los ensayos ELISA, los receptores de placebo (95 sujetos) mostraron respuestas de OPK similares en los sueros del día 1 y del día 30 contra los serotipos de ExPEC4V, observándose poco o nada de cambio en la mayoría de los valores respectivos del título de OPK por sujeto. Estos resultados indican un título de anticuerpo funcional estable en la mayoría o todos los sujetos de placebo durante este periodo.
1 μg de polisacárido p o r serotipo de ExPEC4V (N = 6)
Seis sujetos recibieron una dosis de ExPEC4V de 1 μg de PS por serotipo (4 μg de PS en total). El análisis de las respuestas inmunitarias específicas de serotipo en estos sujetos el día 30 mostró que la proporción de sujetos con un aumento >2 veces en el total de anticuerpos por serotipo fue del 33% (serotipo O1A), 67% (serotipo O2) y 0% (serotipos O6A y O25B). Para los serotipos O1A y O2, la proporción de sujetos con un aumento >4 veces en los títulos de anticuerpo disminuyó al 17% y 50%, respectivamente.
Para los serotipos O1A, O2, O6A y O25B, comparando el día 30 con el día 1, las medianas de veces de aumento de los títulos de anticuerpo fueron 1,0, 4,8, 0,9 y 1,0, respectivamente. Las veces de aumento por sujeto individuales variaron de 0,6 a 8,1 para el serotipo O1, de 0,3 a 9,5 para O2, de 0,8 a 1,3 para el serotipo O6A y de 0,5 a 1,5 para el serotipo O25B. Los valores de la media geométrica del título (GMT) del día 30 fueron 429, 1834, 1.136 y 51 para los 4 serotipos respectivos, representando aproximadamente un aumento de 1,0- 2,8 veces sobre los valores de GMT del día 1.
4 μg de polisacárido p o r serotipo de ExPEC4V (N = 93)
La administración de una dosis de ExPEC4V de 4 μg de PS por serotipo (16 μg de PS en total) produjo una respuesta inmunitaria funcional para todos los serotipos de ExPEC4V. El análisis de estos sujetos el día 30 mostró que la proporción de sujetos con un aumento >2 veces en los valores de OI por serotipo fue del 63% (serotipo O1A), 90% (serotipo O2), 33% (serotipo O6A) y 55% (serotipo O25B). La proporción de sujetos con un aumento >4 veces en los valores de OI varió del 20% (serotipo O6A) al 82% (serotipo O2); como era de esperar, estas proporciones fueron consistentemente más bajas que las observadas para el aumento de >2 veces.
Para los serotipos O1A, O2, O6A y O25B, comparando el día 30 con el día 1, los aumentos del título de OPK de la mediana de veces de OI fueron de 3,5, 14,7, 1,4 y 2,5, respectivamente. La magnitud de las veces de aumento por sujeto en este grupo de dosis varió de 0,5 a >292 para los serotipos O1A y O2, de 0,3 a 26,4 para el serotipo O6A y de 0,1 a 272,8 para el serotipo O25B. Como se representa en las figuras 5A a 5D, se observó una respuesta inmunitaria funcional robusta a cada uno de O1A, O2, O6A y O25B, y se observó un aumento significativo del OI entre después de la inyección y antes de la inyección solo en los grupos vacunados, no en los grupos de placebo.
Los valores de GMT el día 30 fueron 950,5, 4.132, 1.542 y 414,7 para los 4 serotipos respectivos (tabla 9), representando aproximadamente un aumento de 2 a 14 veces respecto a los valores de GMT del día 1. Estos datos indican un aumento general en los títulos de anticuerpo funcional el día 30, asociado con la dosis de 4 μg de PS por serotipo, entre todos los serotipos de ExPEC 4V.
Tabla 9 : GMT e intervalos de confianza del 95% de los títulos de anticuerpo funcional determinados por OPK del día _____________________________ 1 (prevacunación) al día 30 - Estudio de fase 1_____________________________
Í
Conclusión
Estos resultados intermedios muestran una respuesta inmunitaria funcional específica de vacuna en sujetos sanos a los que se administró la dosis de 4 μg de PS por serotipo de ExPEC4V durante un periodo de observación de 30 días. La falta de cambio significativo en los títulos de anticuerpo de los 95 sujetos en el grupo de placebo durante este periodo (figuras 5A a 5D y tabla 9) es coherente con los resultados de ELISA y apoya la conclusión de que ha sido demostrada una respuesta de anticuerpo a la vacunación entre los 4 serotipos de ExpEC.
Los resultados de inmunogenicidad intermedios del estudio de fase 1 muestran, tanto por los títulos de anticuerpo totales (ELISA) como funcionales (OPK), una respuesta inmunitaria específica de vacuna en los sujetos sanos a los que se administró la dosis de 1 μg de PS por serotipo de ExPEC4V, y un aumento comparativamente mayor en la respuesta inmunitaria con la dosis más alta de 4 μg de PS por serotipo de ExPEC4V durante un periodo de observación de 30 días. En comparación con las veces de aumento específico de serotipo observado con los ensayos ELISA, el ensayo de OPK mostró niveles de respuesta similares para los serotipos O1A y O2 en los dos ensayos, pero niveles un poco más bajos del % de respuesta de sujetos con los serotipos O6A y O25B por OPK. La disminución selectiva en la respuesta de OPK en algunos sujetos para los serotipos o 6a y O25B está en investigación.
Notablemente, el valor de GMT del título de anticuerpo funcional determinado por OPK para el antígeno O25B es menor que para los otros antígenos (O1A, O2 y O6A). El ensayo OPK ha sido aceptado como un mejor ensayo sustituto para la protección inmunitaria inducida por la vacuna de conjugado de PS contra Streptococcus pneumoniae (Prevenar®), puesto que el ELISA puede no diferenciar anticuerpos no protectores de avidez baja de los anticuerpos protectores de avidez alta (Kim et al., Clin Diagn Lab Immunol., 2003, 10(4):616-21).
Efectos en humanos - Estudio de fase II
Basándose en los resultados intermedios del estudio de fase I, se realizará un estudio de fase II. Este estudio multicéntrico aleatorizado, de doble enmascaramiento, controlado por placebo, está planeado para evaluar la seguridad, tolerabilidad e inmunogenicidad de 5 dosis diferentes en hombres y mujeres de salud estable, estratificados por edad: >18 a <50 años (N=275) y >50 años (N=560).
En el estudio de fase II se usarán dos composiciones de vacuna, es decir, los productos 1 y 2 proporcionados en la tabla 3-2, que tienen dos concentraciones de polisacárido diferentes, usando las mismas sustancias activas que las usadas para ExPEC4V. Más específicamente, la formulación de la composición 1 contiene 32, 32, 32, 32 μg/ml por polisacárido (PS) de antígeno O de E. coli serotipos O1A, O2, O6A y O25B, respectivamente, sin adyuvante. La formulación de la composición 2 contiene 16, 16, 16, 32 p/ml por PS de antígeno O de E. coli serotipos O1A, O2, O6A y O25B, respectivamente, sin adyuvante.
Se ensayarán diferentes dosis y proporciones de las sustancias activas en el estudio de fase II. Más específicamente, los sujetos reclutados se distribuirán aleatoriamente y se dividirán en seis brazos: (i - v) cinco dosis diferentes de vacuna candidata y (vi) placebo. Cada sujeto recibirá una sola dosis i.m. de la composición 1, la composición 2 o placebo. La dosis diana para los antígenos O de E. coli O1A: O2: O6A: O25B por inyección de la composición 1 o 2 es: 4:4:4:4 μg (es decir, la misma dosis más alta usada en el estudio de fase I indicado anteriormente), 4:4:4:8, 8:8:8:8, 8:8:8:16 y 16:16:16:16 μg. El objetivo del estudio es evaluar la seguridad, inmunogenicidad y eficacia de las 5 dosis
diferentes de la vacuna tetravalente de bioconjugado de E. coli.
Secuencias
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Claims (15)
1. Una composición que comprende una primera concentración de un polisacárido de antígeno O25B de E. coli y una segunda concentración de cada uno de un polisacárido de antígeno O1A de E. coli, un polisacárido de antígeno O2 de E. coli y un polisacárido de antígeno O6A de E. coli, en donde la proporción entre la primera concentración y la segunda concentración es 2:1, cada polisacárido de antígeno O25B, O1A, O2 y o 6a de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (EPA) destoxificada, y la primera concentración es de 10 a 36 μg/ml.
2. La composición de la reivindicación 1, que comprende los polisacáridos de antígeno O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli a una proporción en peso de 2:1:1:1, en donde la primera concentración es 10, 16, 24, 32 o 36 μg/ml.
3. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende 16 μg/ml del polisacárido de antígeno O25B.
4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende 32 μg/ml del polisacárido de antígeno O25B.
5. Una composición inmunogénica multivalente que comprende un polisacárido de antígeno O25B de E. coli a una primera dosis de 5 a 18 μg, y un polisacárido de antígeno O1A de E. coli, un polisacárido de antígeno O2 de E. coli y un polisacárido de antígeno O6A de E. coli, cada uno a una dosis que es, independientemente, del 50% al 100% de la primera dosis, en donde cada uno de los polisacáridos de antígeno O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (EPA) destoxificada.
6. Una composición inmunogénica multivalente que comprende un polisacárido de antígeno O25B de E. coli que tiene la estructura de la fórmula O25B':
un polisacárido de antígeno O1A de E. coli que tiene la estructura de la fórmula O1A':
un polisacárido de antígeno O2 de E. coli que tiene la estructura de la fórmula O2:
un polisacárido de antígeno 06A de E. coli que tiene la estructura de la fórmula 06A ’:
en donde n es, independientemente, un número entero de 5 a 25; y
cada uno de los polisacáridos de antígeno O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y las concentraciones de los polisacáridos de antígeno O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli en las composiciones son, respectivamente, de 16:8:8:8 μg/ml o 32:16:16:16 μg/ml.
7. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para usar en un método de inducción de una respuesta inmunitaria a E. coli patógena extraintestinal (ExPEC) en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrarle al sujeto dicha composición.
8. Un polisacárido de antígeno O25B de E. coli para usar en un método de inducción de una respuesta inmunitaria a E. coli patógena extraintestinal (ExPEC) en un sujeto que lo necesita, que comprende administrarle al sujeto una primera cantidad eficaz de un polisacárido de antígeno O25B de E. coli y una segunda cantidad eficaz de cada uno de un polisacárido de antígeno O1A de E. coli, un polisacárido de antígeno O2 de E. coli y un polisacárido de antígeno O6A de E. coli, en donde la proporción entre la primera cantidad eficaz y la segunda cantidad eficaz es 2:1; cada uno de los polisacáridos de antígeno O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (EPA) destoxificada, y la primera cantidad eficaz es de 5 a 18 μg por administración.
9. Un polisacárido de antígeno O25B de E. coli para usar en el método de la reivindicación 8, en donde los polisacáridos de antígeno O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli se administran a una proporción de dosis de 2:1:1:1, en donde la primera cantidad eficaz es 6, 8, 10, 12, 14, 16 o 18 μg por administración.
10. Un polisacárido de antígeno O25B de E. coli para usar en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde se administran 8 μg del polisacárido de antígeno O25B de E. coli por administración.
11. Un polisacárido de antígeno O25B de E. coli para usar en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde se administran 16 μg del polisacárido de antígeno O25B de E. coli por administración.
12. Un polisacárido de antígeno O25B de E. coli para usar en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde los polisacáridos de antígeno O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli se administran juntos en una composición.
13. Un polisacárido de antígeno O25B de E. coli para usar en un método de inducción de una respuesta inmunitaria a E. coli patógena extraintestinal (ExPEC) en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto un polisacárido de antígeno O25B de E. coli que tiene la estructura de la fórmula O25B':
un polisacárido de antígeno O1A de E. coli que tiene la estructura de la fórmula O1A':
un polisacárido de antígeno O2 de E. coli que tiene la estructura de la fórmula O2:
un polisacárido de antígeno O6A de E. coli que tiene la estructura de la fórmula O6A':
en donde n es, independientemente, un número entero de 5 a 25,
cada uno de los polisacáridos de antígeno O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli está unido covalentemente de forma independiente a una proteína portadora que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y los polisacáridos de antígeno O25B, O1A, O2 y O6A de E. coli se administran a 8:4:4:4 μg o 16:8:8:8 μg por administración.
14. Un polisacárido de antígeno O25B de E. coli para usar en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en donde la respuesta inmunitaria limita la gravedad de o previene una enfermedad invasiva de ExPEC causada por los serotipos O1A, O2, O6A y O25B de ExPEC en un sujeto humano en riesgo de tener una enfermedad invasiva de ExPEC seleccionada del grupo que consiste en infección de las vías urinarias, una infección de sitio quirúrgico, una infección abdominal o pélvica, neumonía, neumonía nosocomial, osteomielitis, celulitis, sepsis, bacteremia, una infección de herida, pielonefritis, meningitis, meningitis neonatal, peritonitis, colangitis, infecciones de tejido blando, piomiositis y artritis séptica.
15. Un proceso para fabricar una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende combinar el polisacárido de antígeno O25B de E. coli, el polisacárido de antígeno O1A de E. coli, el polisacárido de antígeno O2 de E. coli y el polisacárido de antígeno O6A de E. coli, para obtener así la composición.
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