ES2951466T3 - Citómetro de flujo con ecualización óptica - Google Patents

Abstract

Los aspectos de la presente divulgación incluyen métodos para producir un rayo láser de salida que tiene dos o más rayos láser desviados angularmente (por ejemplo, para irradiar una muestra en una corriente de flujo) con un perfil de intensidad predeterminado. También se describen sistemas para practicar los métodos en cuestión que tienen un láser, un dispositivo acústico-óptico, un generador de radiofrecuencia y un controlador para ajustar la amplitud de las señales de excitación de radiofrecuencia para producir un rayo láser de salida de rayos láser desviados angularmente con un perfil de intensidad predeterminado. . (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Citómetro de flujo con ecualización óptica

Referencia cruzada a solicitud relacionada

De conformidad con el Título 35 del Código de los Estados Unidos, párrafo 119 (e), esta solicitud reivindica la prioridad de la fecha de presentación de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con el número de serie 62/393.976, presentada el 13 de septiembre de 2016.

Introducción

La caracterización de analitos en fluidos biológicos se ha convertido en una parte integral de los diagnósticos médicos y evaluaciones de la salud y el bienestar general de un paciente. En particular, la detección de analitos en fluidos fisiológicos, por ejemplo, sangre o productos derivados de la sangre, puede ser importante donde los resultados pueden desempeñar un papel destacado en el protocolo de tratamiento de un paciente en una variedad de enfermedades.

La citometría de flujo es una técnica bien conocida que se usa de forma rutinaria para el recuento de células, la clasificación de células, la detección de biomarcadores, entre otros. Un citómetro de flujo típicamente incluye un depósito de muestra para recibir una muestra de fluido, tal como una muestra de sangre, y un depósito de vaina que contiene un fluido de vaina. El citómetro de flujo transporta las partículas (incluidas las células) en la muestra de fluido como una corriente de células a una célula de flujo, al mismo tiempo que dirige el fluido de vaina a la célula de flujo. Dentro de la célula de flujo, se forma una vaina de líquido alrededor de la corriente de células para transmitir una velocidad sustancialmente uniforme a la corriente de células. La célula de flujo enfoca hidrodinámicamente las células dentro de la corriente para atravesar el centro de una fuente de luz en una célula de flujo. En un sistema de citometría de flujo, las partículas (típicamente células) que fluyen a través de una célula de flujo se iluminan con radiación láser y la radiación que proviene de las partículas (p. ej., fluorescencia y/o radiación dispersa) en respuesta a dicha iluminación se detecta y analiza. Los sistemas de citometría de flujo convencionales, sin embargo, están afectados por varios defectos. Por ejemplo, en los sistemas de citometría de flujo convencionales, el uso de corrientes de núcleo más anchas a caudales de muestra altos típicamente da como resultado una reducción de la resolución, por ejemplo, a causa de una respuesta óptica no uniforme de las partículas iluminadas. En dichos sistemas convencionales, con el fin de mejorar este problema, se usa un punto láser más ancho con un perfil gaussiano para asegurar una iluminación cuasi uniforme de las partículas. No obstante, típicamente se logra una resolución más baja en comparación con el uso de un caudal de muestra más lento (es decir, una corriente de núcleo más estrecha).

El estado de la técnica WO 2014/110290A1 divulga un aparato y procedimientos para la formación de imágenes usando excitación multiplexada por radiofrecuencia. Un aparato divide un láser de excitación en dos brazos de un interferómetro Mach-Zehnder en el que la frecuencia de la luz del primer haz se desplaza mediante un deflector acústico-óptico y la frecuencia del segundo haz se desplaza usando un desplazador de frecuencia acústico-óptico. La referencia WO 2016/075681A1 divulga un aparato óptico que incluye un medio acústico-óptico y una matriz de múltiples transductores piezoeléctricos unidos al medio acústico-óptico. La referencia US 2005/279808A 1 divulga un control digital de técnicas de modulación de frecuencia y/o amplitud de un AOM intracavitario y/o extracavitario para facilitar la extinción sustancialmente completa de un haz láser para impedir que la energía láser no deseada incida en una pieza de trabajo, facilitar la estabilidad de amplitud del pulso de láser a través del control de bucle cerrado de la energía láser pulso a pulso, facilitar el control de posicionamiento del haz, que incluye, entre otros, el control de bucle cerrado para aplicaciones tales como la corrección de errores de alineación, la rectificación del recorrido del haz o el posicionamiento terciario, y facilitar el empleo de más de un transductor en un AOM para realizar cualquiera de dichas aplicaciones. La referencia US 5255257 divulga un circuito electrónico que permite usar un deflector acústico-óptico en modo de frecuencias múltiples a un nivel de alta potencia con una cantidad mínima de intermodulación entre cada frecuencia.

Compendio

La presente invención se refiere a un procedimiento según la reivindicación 1 y a un sistema según la reivindicación 9.

Por ejemplo, el haz de excitación puede presentar una variación de intensidad a lo largo de su dimensión horizontal caracterizada por un aumento de intensidad desde el centro del haz hasta cada borde horizontal del mismo. En algunas de dichas realizaciones, la intensidad del haz en el centro del haz varía en un valor en un intervalo de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 99 % con respecto a la intensidad del haz en cualquiera de sus bordes horizontales. En algunas realizaciones, una variación de este tipo puede ser lineal mientras que en otros puede ser no lineal. En algunas realizaciones, el perfil de intensidad del haz a lo largo de una dimensión vertical puede ser gaussiano.

En algunas realizaciones, las amplitudes de las señales de radiofrecuencia están en un intervalo de aproximadamente 0,1 voltios a aproximadamente 40 voltios. En algunas realizaciones, las señales de radiofrecuencia abarcan un intervalo de frecuencias de aproximadamente 1 MHz a aproximadamente 250 MHz. Además, en algunas realizaciones, las señales de radiofrecuencia están separadas entre sí por una frecuencia en un intervalo de aproximadamente 0,1 MHz a aproximadamente 4 MHz.

En algunas realizaciones, las amplitudes de las señales de radiofrecuencia se ajustan de modo que los haces desviados presentan una intensidad creciente a medida que aumentan los ángulos de deflexión de los haces desde un haz central.

El sistema puede incluir además un sistema de detección para detectar la radiación que proviene de las partículas iluminadas en respuesta a la iluminación del haz de excitación. El perfil de intensidad se puede configurar de modo que las partículas equivalentes que interactúan con el haz en diferentes ubicaciones del mismo produzcan señales uniformes. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, la variación de intensidad del haz se caracteriza por un aumento de intensidad desde un centro del haz hasta cada borde horizontal del mismo. En algunas de dichas realizaciones, la intensidad del haz en el centro del haz varía en un valor en un intervalo de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 99 % (p. ej., en por lo menos aproximadamente el 50 %) con respecto a la intensidad del haz en cada uno de los bordes horizontales. En algunas realizaciones, el haz presenta un perfil de intensidad gaussiana en una dimensión vertical.

Las potencias de las señales de radiofrecuencia pueden ajustarse para obtener una variación de intensidad deseada (p. ej., a lo largo de la dimensión horizontal) del haz. En algunas realizaciones, el controlador puede ajustar las potencias de las señales de radiofrecuencia ajustando las amplitudes de esas señales en un intervalo de aproximadamente 0,1 voltios a aproximadamente 40 voltios.

Además, en algunas realizaciones, el controlador puede controlar el generador de radiofrecuencia para generar una pluralidad de señales de radiofrecuencia que están separadas entre sí por una frecuencia en un intervalo de aproximadamente 0,1 MHz a aproximadamente 4 MHz.

Se pueden usar una o más ópticas de excitación para entregar el haz de excitación a una célula de flujo a través de la cual fluye una muestra. A modo de ejemplo, dicha óptica de excitación puede incluir por lo menos una lente para enfocar el haz de excitación en la célula de flujo. Además, el sistema de detección puede incluir por lo menos un detector y una o más ópticas de detección colocadas en un ángulo de 90 grados con respecto a la dirección de propagación del haz de excitación para transmitir la radiación que proviene de las partículas iluminadas, por ejemplo, células, que atraviesan la célula de flujo hacia el detector.

En un aspecto relacionado, se divulga un procedimiento para ajustar un perfil de intensidad de un haz de excitación en un sistema de citometría de flujo, que incluye introducir un haz láser en un dispositivo acústico-óptico (p. ej., un deflector acústico-óptico), aplicar una pluralidad de señales de radiofrecuencia al dispositivo acústico-óptico para generar una pluralidad de haces de salida separados angularmente, y ajustar las potencias de las señales de radiofrecuencia para obtener las intensidades deseadas de dichos haces de salida separados angularmente. El haz de salida separado angularmente puede disponerse uno con respecto al otro para formar colectivamente un haz de excitación para iluminar una pluralidad de partículas que fluyen a través de una célula de flujo del sistema de citometría de flujo. En algunas realizaciones, las potencias de las señales de radiofrecuencia se ajustan de modo que el haz de excitación presenta una mayor intensidad en cada borde horizontal del mismo con respecto a su centro. A modo de ejemplo, la variación de la intensidad a lo largo de una dimensión horizontal del haz puede variar de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 99 %.

En algunas realizaciones, las amplitudes de las señales de radiofrecuencia varían en un intervalo de aproximadamente 0,1 voltios a aproximadamente 40 voltios para ajustar las potencias de las señales de radiofrecuencia. Además, en algunas realizaciones, las señales de radiofrecuencia están separadas en frecuencia entre sí por un valor en un intervalo de aproximadamente 0,1 MHz a aproximadamente 4 MHz.

En un aspecto relacionado, el generador de radiofrecuencia del sistema puede generar una pluralidad de minihaces desviados angularmente separados en frecuencia por las señales de radiofrecuencia y formar colectivamente un haz láser de radiofrecuencia desplazada. El sistema puede incluir además un divisor de haz para dividir el haz láser de radiofrecuencia desplazada en un par de haces láser divididos de radiofrecuencia desplazada de modo que cada uno de los haces divididos incluye una pluralidad de minihaces desviados angularmente separados en frecuencia por las señales de radiofrecuencia, y por lo menos una óptica para invertir horizontalmente uno del par de haces láser. El sistema también puede incluir un combinador óptico para combinar el haz invertido horizontalmente con el otro haz del par de modo que cada uno de los minihaces del haz invertido horizontalmente se superponga por lo menos parcialmente con por lo menos uno de los minihaces del otro haz del par para generar un haz de excitación para iluminar las partículas a medida que fluyen a través de la célula de flujo. El sistema también puede incluir por lo menos un detector para detectar la radiación de dispersión frontal que proviene de una o más de las partículas en respuesta a la excitación del haz de excitación y generar una señal de detección. Además, el sistema puede incluir un sistema de detección dispuesto a lo largo de una dirección de 90 grados con respecto a la dirección de propagación del haz de excitación para detectar la radiación que proviene de las partículas en una dirección ortogonal con respecto a la dirección de dispersión frontal.

El sistema anterior también puede incluir un analizador para recibir la señal de detección y proporcionar demultiplexación de frecuencia de la señal de detección para determinar una o más frecuencias de batido, en el que cada una de las frecuencias de batido corresponde a una diferencia de frecuencia entre un par de minihaces (p. ej., un par de minihaces parcialmente superpuestos) en dicho haz de excitación. El analizador puede correlacionar las frecuencias de batido con ubicaciones espaciales a lo largo del haz de excitación. Además, el analizador puede normalizar la intensidad de una señal detectada (p. ej., la señal de dispersión frontal) en base a la ubicación espacial a través del haz de excitación que está asociada con la frecuencia de batido presente en un contenido de frecuencia de la señal.

El sistema comprende un controlador que puede controlar el generador de radiofrecuencia también para ajustar las intensidades de los minihaces de modo que la intensidad del haz desplazado por radiofrecuencia varía a lo largo de una dimensión horizontal. En algunas realizaciones, las señales de radiofrecuencia se pueden desplazar en frecuencia entre sí por una frecuencia en un intervalo de aproximadamente 10 MHz a aproximadamente 250 MHz.

En otro aspecto, el procedimiento también puede implicar monitorizar una señal generada mediante la detección de radiación que proviene de la muestra en respuesta a la interacción con el haz de excitación para detectar una deriva espacial, si la hay, en la corriente de muestra, y ajustar las señales de radiofrecuencia para ajustar una posición espacial del haz de excitación en la célula de flujo para compensar la deriva detectada en la corriente de muestra. En algunas realizaciones, las frecuencias de las señales de radiofrecuencia se ajustan para provocar un desplazamiento en la posición espacial del haz de excitación.

En otro aspecto, se divulga un procedimiento para ajustar la anchura de un haz de excitación en un citómetro de flujo, que incluye introducir un haz láser en un deflector acústico-óptico, aplicar una pluralidad de señales de radiofrecuencia a dicho deflector acústico-óptico para generar una pluralidad de haces desviados angularmente (que pueden superponerse parcialmente) que forman colectivamente el haz de excitación de salida, y ajustar varias dichas señales de radiofrecuencia para ajustar la anchura de dicho haz de excitación.

Breve descripción de los dibujos

La invención se entenderá mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras:

La figura 1 representa esquemáticamente un sistema de citometría de flujo según una realización de la invención.

La figura 2 representa esquemáticamente una pluralidad de señales de activación de RF generadas por un generador de RF para su aplicación a un deflector acústico-óptico del sistema de la figura 1.

La figura 3 representa esquemáticamente una pluralidad de minihaces generados en respuesta a la aplicación de las señales de activación de R^f que se muestran en la figura 2 al deflector acústico-óptico.

La figura 4 representa esquemáticamente una variación de intensidad hipotética de un haz de excitación formado colectivamente por los minihaces representados en la figura 3.

La figura 5 representa esquemáticamente dos partículas ejemplares que atraviesan diferentes porciones del haz de excitación generado por los minihaces que se muestran en la figura 3, que de este modo están expuestas a diferentes intensidades de excitación.

La figura 6A es un gráfico esquemático que representa una intensidad hipotética de radiación detectada a partir de partículas que atraviesan un haz de excitación que tiene una distribución de intensidad gaussiana a lo largo de las direcciones horizontal y vertical.

La figura 6B representa esquemáticamente una sensibilidad óptica sustancialmente uniforme en función de las posiciones horizontales de las partículas a lo largo de un haz de excitación hipotético según la realización de la invención.

La figura 7 representa esquemáticamente un citómetro de flujo según otra realización de la invención.

La figura 8A muestra esquemáticamente un haz de excitación según una realización de la invención.

La figura 8B representa esquemáticamente señales de activación hipotéticas usadas para formar el haz de excitación representado en la figura 8A.

La figura 9A muestra esquemáticamente un haz de excitación que tiene una anchura mayor en relación con el haz de excitación representado en la figura 8A.

La figura 9B representa esquemáticamente señales de activación hipotéticas usadas para formar el haz de excitación representado en la figura 9A.

La figura 10A representa esquemáticamente un haz de excitación que tiene una anchura mayor en relación con el haz de excitación representado en la figura 9A.

La figura 10B representa esquemáticamente señales de activación hipotéticas usadas para formar el haz de excitación representado en la figura 10A.

La figura 11 representa esquemáticamente una implementación ejemplar de un analizador usado en diversas realizaciones de la invención.

La figura 12 representa esquemáticamente una implementación ejemplar de un controlador usado en diversas realizaciones de la invención.

La figura 13 representa esquemáticamente un citómetro de flujo según otra realización de la invención.

La figura 14A representa esquemáticamente una pluralidad de minihaces que forman colectivamente un haz en el sistema de citómetro de flujo de la figura 13.

La figura 14B muestra uno de los dos haces obtenidos al dividir el haz representado en la figura 14A.

La figura 14C muestra los otros dos haces obtenidos al dividir el haz representado en la figura 14B.

La figura 14D muestra una versión invertida horizontalmente del haz representado en la figura 14C.

La figura 15 muestra esquemáticamente un haz de excitación formado por superposición de dos conjuntos de minihaces.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a un procedimiento según la reivindicación 1 y a un sistema según la reivindicación 9.

Antes de que la presente invención se describa más en detalle, se ha de entender que esta invención no está limitada a las realizaciones particulares descritas, ya que pueden variar.

También se ha de entender que la terminología usada en la presente memoria solo tiene la finalidad de describir realizaciones particulares y no pretende ser limitativa, puesto que el alcance de la presente invención solo se verá limitado por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se ha de entender que todos los valores intermedios, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido quedan englobados dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños se pueden incluir independientemente en los intervalos más pequeños y también quedan englobados dentro de la invención, sometidos a cualquier límite de exclusión específico en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen ambos o uno de esos límites incluidos también están incluidos en la invención.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier procedimiento y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria se pueden usar en la práctica o ensayos de la presente invención, a continuación, se describen procedimientos y materiales ilustrativos preferidos.

Cabe señalar que tal como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un/o”, “una” y “el/la” incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "solamente", "únicamente" y similares en relación con la lectura de los elementos de las reivindicaciones, o el uso de una limitación "negativa".

Como se resume anteriormente, la presente divulgación proporciona procedimientos para producir un haz láser de salida que tiene dos o más haces láser desviados angularmente (p. ej., para irradiar una muestra en una corriente de flujo) con un perfil de intensidad predeterminado. Al describir adicionalmente realizaciones de la divulgación, se describen en primer lugar con mayor detalle procedimientos para producir un haz láser de salida que tiene dos o más haces láser desviados angularmente y ajustar la amplitud de cada haz láser desviado angularmente. A continuación, también se describen sistemas para poner en práctica los procedimientos de la materia que tienen un láser, un dispositivo acústico-óptico, un generador de radiofrecuencia y un controlador para ajustar la amplitud de las señales de activación de radiofrecuencia para producir un haz láser de salida de haces láser desviados angularmente con un perfil de intensidad predeterminado. También se proporcionan kits que tienen un dispositivo acústico-óptico y una célula de flujo configurada para propagar una muestra en la corriente de flujo.

Procedimientos para producir un haz láser de salida que tiene haces láser desviados angularmente con un perfil de intensidad predeterminado

Los aspectos de la divulgación incluyen procedimientos para producir un haz láser de salida que tiene dos o más haces láser desviados angularmente (p. ej., para irradiar una muestra en una corriente de flujo) con un perfil de intensidad predeterminado. En la práctica de procedimientos según realizaciones, un dispositivo acústico-óptico se irradia con un láser mientras se aplican señales de activación de radiofrecuencia al dispositivo acústico-óptico para generar haces láser desviados angularmente y se ajusta la amplitud de una o más de las señales de activación de radiofrecuencia para generar un haz láser de salida que comprende haces láser desviados angularmente con un perfil de intensidad predeterminado. Cada haz láser desviado angularmente en el haz láser de salida tiene una intensidad que se basa en la amplitud de cada señal de activación de radiofrecuencia aplicada. El término "haz láser desviado angularmente" se usa en la presente memoria en su sentido convencional para referirse a los haces láser que se producen mediante la interacción de ondas acústicas en el dispositivo acústico-óptico, producidos por las señales de activación de radiofrecuencia aplicadas, con el haz de luz del láser para producir uno o más minihaces que tienen un desplazamiento en la frecuencia óptica y una desviación en el ángulo de propagación.

En realizaciones, los procedimientos incluyen irradiar el dispositivo acústico-óptico con un láser. Los láseres de interés pueden incluir láseres de pulsos o láseres de onda continua. El tipo y la cantidad de láseres usados en los procedimientos de la materia pueden variar y pueden ser un láser de gas, tal como un láser de helio-neón, láser de argón, láser de criptón, láser de xenón, láser de nitrógeno, láser de CO² , láser de CO, láser de excímeros de argónflúor (ArF), láser de excímeros de fluoruro de kriptón (KrF), láser de excímeros de cloruro de xenón (XeCI) o láser de excímeros de fluoruro de xenón (XeF) o una combinación de los mismos. En otros casos, los procedimientos incluyen irradiar el dispositivo acústico-óptico con un láser de colorante, tal como un láser de estilbeno, cumarina o rodamina. En otros casos, los procedimientos incluyen irradiar el dispositivo acústico-óptico con un láser de vapor de metal, tal como un láser de helio-cadmio (HeCd), láser de helio-mercurio (HeHg), láser de helioselenio (HeSe), láser de helioplata (HeAg), láser de estroncio, láser de neón-cobre (NeCu), láser de cobre o láser de oro y combinaciones de los mismos. Todavía en otros casos, los procedimientos incluyen irradiar el dispositivo acústico-óptico con un láser de estado sólido, tal como un láser de rubí, un láser Nd:YAG, láser NdCrYAG, láser Er:YAG, láser Nd:YLF, láser Nd:YVO₄, láser Nd:YCa4O(BO₃)₃, láser Nd:YCOB, láser de zafiro de titanio, láser de tulio YAG, láser de iterbio YAG, láser de iterbio₂O3 o láseres dopados con cerio y combinaciones de los mismos. En otros casos más, los procedimientos incluyen irradiar el dispositivo acústico-óptico con un láser de diodo semiconductor, un láser semiconductor bombeado ópticamente (OPSL) o una implementación de frecuencia duplicada o triplicada de cualquiera de los láseres mencionados anteriormente.

Dependiendo de las longitudes de onda de luz deseadas producidas en el haz láser de salida (p. ej., para usar en la irradiación de una muestra en una corriente de flujo), el láser puede tener una longitud de onda específica que varía de 200 nm a 1.500 nm, tal como de 250 nm a 1.250 nm, tal como de 300 nm a 1.000 nm, tal como de 350 nm a 900 nm e incluso de 400 nm a 800 nm. El dispositivo acústico-óptico puede irradiarse con uno o más láseres, tal como 2 o más láseres, tal como 3 o más láseres, tal como 4 o más láseres, tal como 5 o más láseres e incluso 10 o más láseres. Los láseres pueden incluir cualquier combinación de tipos de láseres. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los procedimientos incluyen irradiar el dispositivo acústico-óptico con una matriz de láseres, tal como una matriz que tiene uno o más láseres de gas, uno o más láseres de colorante y uno o más láseres de estado sólido.

Cuando se emplea más de un láser, el dispositivo acústico-óptico puede irradiarse con los láseres simultánea o secuencialmente, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, el dispositivo acústico-óptico puede irradiarse simultáneamente con cada uno de los láseres. En otras realizaciones, el dispositivo acústico-óptico se irradia secuencialmente con cada uno de los láseres. Cuando se emplea más de un láser para irradiar el dispositivo acústicoóptico secuencialmente, el tiempo que cada láser irradia el dispositivo acústico-óptico puede ser independientemente de 0,001 microsegundos o más, tal como 0,01 microsegundos o más, tal como 0,1 microsegundos o más, tal como 1 microsegundo o más, tal como 5 microsegundos o más, tal como 10 microsegundos o más, tal como 30 microsegundos o más e incluso 60 microsegundos o más. Por ejemplo, los procedimientos pueden incluir irradiar el dispositivo acústico-óptico con el láser durante una duración que va de 0,001 microsegundos a 100 microsegundos, tal como de 0,01 microsegundos a 75 microsegundos, tal como de 0,1 microsegundos a 50 microsegundos, tal como de 1 microsegundo a 25 microsegundos e incluso de 5 microsegundos a 10 microsegundos. En realizaciones donde el dispositivo acústico-óptico es irradiado secuencialmente con dos o más láseres, la duración de la irradiación del dispositivo acústico-óptico por cada láser puede ser la misma o diferente.

El período de tiempo entre la irradiación de cada láser también puede variar, según se desee, estando separados independientemente por un retraso de 0,001 microsegundos o más, tal como 0,01 microsegundos o más, tal como 0,1 microsegundos o más, tal como 1 microsegundo o más, tal como 5 microsegundos o más, por ejemplo, por 10 microsegundos o más, por ejemplo, por 15 microsegundos o más, por ejemplo, por 30 microsegundos o más e incluso por 60 microsegundos o más. Por ejemplo, el período de tiempo entre la irradiación de cada fuente de luz puede variar de 0,001 microsegundos a 60 microsegundos, tal como de 0,01 microsegundos a 50 microsegundos, tal como de 0,1 microsegundos a 35 microsegundos, tal como de 1 microsegundo a 25 microsegundos e incluso de 5 microsegundos a 10 microsegundos. En determinadas realizaciones, el período de tiempo entre la irradiación por cada láser es de 10 microsegundos. En realizaciones en las que el dispositivo acústico-óptico es irradiado secuencialmente por más de dos (es decir, 3 o más) láseres, el retraso entre la irradiación de cada láser puede ser el mismo o diferente.

El dispositivo acústico-óptico puede irradiarse de forma continua o en intervalos discretos. En algunos casos, los procedimientos incluyen la irradiación continua del dispositivo acústico-óptico con el láser. En otros casos, el dispositivo acústico-óptico se irradia con el láser en intervalos discretos, tal como irradiar cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos e incluso cada 1.000 milisegundos, o algún otro intervalo.

Dependiendo del láser, el dispositivo acústico-óptico puede irradiarse desde una distancia que varía, tal como 0,01 mm o más, tal como 0,05 mm o más, tal como 0,1 mm o más, tal como 0,5 mm o más, tal como 1 mm o más, tal como 2,5 mm o más, tal como 5 mm o más, tal como 10 mm o más, tal como 15 mm o más, tal como 25 mm o más e incluso 50 mm o más. Además, el ángulo o la irradiación también pueden variar, de 10° a 90°, tal como de 15° a 85°, tal como de 20° a 80°, tal como de 25° a 75° e incluso de 30° a 60°, por ejemplo, en un ángulo de 90°.

En realizaciones, los procedimientos incluyen aplicar señales de activación de radiofrecuencia al dispositivo acústicoóptico para generar haces láser desviados angularmente y ajustar la amplitud de una o más de las señales de activación de radiofrecuencia para generar un haz láser de salida que comprende haces láser desviados angularmente con un perfil de intensidad predeterminado. Se pueden aplicar dos o más señales de activación de radiofrecuencia al dispositivo acústico-óptico para generar un haz láser de salida con el número deseado de haces láser desviados angularmente, tal como 3 o más señales de activación de radiofrecuencia, tal como 4 o más señales de activación de radiofrecuencia, tal como 5 o más señales de activación de radiofrecuencia, tal como 6 o más señales de activación de radiofrecuencia, tal como 7 o más señales de activación de radiofrecuencia, tal como 8 o más señales de activación de radiofrecuencia, tal como 9 o más señales de activación de radiofrecuencia, tal como 10 o más señales de activación de radiofrecuencia señales de activación, tal como 15 o más señales de activación de radiofrecuencia, tal como 25 o más señales de activación de radiofrecuencia, tal como 50 o más señales de activación de radiofrecuencia e incluso 100 o más señales de activación de radiofrecuencia.

Cada uno de los haces láser desviados angularmente producidos por las señales de activación de radiofrecuencia tiene una intensidad basada en la amplitud de la señal de activación de radiofrecuencia aplicada. En realizaciones, los procedimientos incluyen la aplicación de señales de activación de radiofrecuencia que tienen amplitudes suficientes para producir haces láser desviados angularmente con una intensidad deseada. En algunas realizaciones, cada señal de activación de radiofrecuencia aplicada tiene independientemente una amplitud de aproximadamente 0,001 V a aproximadamente 500 V, tal como de aproximadamente 0,005 V a aproximadamente 400 V, tal como de aproximadamente 0,01 V a aproximadamente 300 V, tal como de aproximadamente 0,05 V a aproximadamente 200 V, tal como de aproximadamente 0,1 V a aproximadamente 100 V, tal como de aproximadamente 0,5 V a aproximadamente 75 V, tal como de aproximadamente 1 V a 50 V, tal como de aproximadamente 2 V a 40 V, tal como de aproximadamente 3 V a aproximadamente 30 V e incluso de aproximadamente 5 V a aproximadamente 25 V. Cada señal de activación de radiofrecuencia aplicada tiene, en algunas realizaciones, una frecuencia de aproximadamente 0,001 MHz a aproximadamente 500 MHz, tal como de aproximadamente 0,005 MHz a aproximadamente 400 MHz, tal como de aproximadamente 0,01 MHz a aproximadamente 300 MHz, tal como de aproximadamente 0,05 MHz a aproximadamente 200 MHz, tal como de aproximadamente 0,1 MHz a aproximadamente 100 MHz, tal como de aproximadamente 0,5 MHz a aproximadamente 90 MHz, tal como de aproximadamente 1 MHz a aproximadamente 75 MHz, tal como de aproximadamente 2 MHz a aproximadamente 70 MHz, tal como de aproximadamente 3 MHz a aproximadamente 65 MHz, tal como de aproximadamente 4 MHz a aproximadamente 60 MHz e incluso de aproximadamente 5 MHz a aproximadamente 50 MHz.

Como se resume anteriormente, el haz láser de salida del dispositivo acústico-óptico incluye haces láser desviados angularmente, cada uno de los cuales tiene una intensidad basada en la amplitud de la señal de activación de radiofrecuencia aplicada. En algunas realizaciones, los procedimientos incluyen aplicar señales de activación de radiofrecuencia al dispositivo acústico-óptico de una manera suficiente para producir un haz láser de salida con haces láser desviados angularmente que tienen un perfil de intensidad deseado. Dependiendo de la cantidad de haces láser desviados angularmente en el láser de salida, dos o más de los haces láser desviados angularmente se pueden ajustar para que tengan la misma intensidad, tal como donde 3 o más haces láser desviados angularmente tienen la misma intensidad, tal como donde 4 o más haces láser desviados angularmente tienen la misma intensidad, tal como donde 5 o más haces láser desviados angularmente tienen la misma intensidad, tal como donde 6 o más haces láser desviados angularmente tienen la misma intensidad, tal como donde 7 o más haces láser desviados angularmente tienen la misma intensidad, tal como donde 8 o más haces láser desviados angularmente tienen la misma intensidad, tal como donde 9 o más haces láser desviados angularmente tienen la misma intensidad, tal como donde 10 o más haces láser desviados angularmente tienen la misma intensidad e incluso donde 25 o más haces láser desviados angularmente tienen la misma intensidad. En otras realizaciones, el número de haces láser desviados angularmente en el láser de salida que tienen diferentes intensidades puede variar, tal como donde 2 o más haces láser desviados angularmente tienen intensidades diferentes, tal como donde 3 o más haces láser desviados angularmente tienen intensidades diferentes, tal como donde 4 o más haces láser desviados angularmente tienen diferentes intensidades, tal como donde 5 o más haces láser desviados angularmente los haces láser desviados tienen diferentes intensidades, tal como donde 6 o más haces láser desviados angularmente tienen diferentes intensidades, tal como donde 7 o más haces láser desviados angularmente tienen diferentes intensidades, tal como donde 8 o más haces láser desviados angularmente tienen diferentes intensidades, tal como como donde 9 o más haces láser desviados angularmente tienen intensidades diferentes, tal como donde 10 o más haces láser desviados angularmente tienen intensidades diferentes e incluso donde 25 o más haces láser desviados angularmente tienen intensidades diferentes.

En algunos casos, el perfil de intensidad de los haces láser desviados angularmente en el haz láser de salida incluye una intensidad creciente desde los bordes hasta el centro del haz láser de salida a lo largo del eje horizontal. En estos casos, la intensidad del haz láser desviado angularmente en el centro del haz de salida puede oscilar entre el 0,1 % y aproximadamente el 99 % de la intensidad de los haces láser desviados angularmente en el borde del haz láser de salida a lo largo del eje horizontal, tal como del 0,5 % a aproximadamente el 95 %, tal como del 1 % a aproximadamente el 90 %, tal como del 2 % a aproximadamente el 85 %, tal como del 3 % al 80 %, tal como del 4 % al 75 %, tal como de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 70 %, tal como de aproximadamente el 6 % a aproximadamente el 65 %, tal como de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 60 %, tal como de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 55 % e incluso de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 50 % de la intensidad de los haces láser desviados angularmente en el borde del haz láser de salida a lo largo del eje horizontal. En otros casos, el perfil de intensidad de los haces láser desviados angularmente en el haz láser de salida incluye una intensidad creciente desde los bordes hasta el centro del haz láser de salida a lo largo del eje horizontal. En estos casos, la intensidad del haz láser desviado angularmente en los bordes del haz de salida puede oscilar entre el 0,1 % y aproximadamente el 99 % de la intensidad de los haces láser desviados angularmente en el centro del haz láser de salida a lo largo del eje horizontal, tal como del 0,5 % a aproximadamente el 95 %, tal como del 1 % a aproximadamente el 90 %, tal como del 2 % a aproximadamente el 85 %, tal como del 3 % al 80 %, tal como del 4 % al 75 %, tal como de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 70 %, tal como de aproximadamente el 6 % a aproximadamente el 65 %, tal como de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 60 %, tal como de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 55 % e incluso de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 50 % de la intensidad de los haces láser desviados angularmente en el centro del haz láser de salida a lo largo del eje horizontal. En otros casos más, el perfil de intensidad de los haces láser desviados angularmente en el haz láser de salida incluye una distribución gaussiana a lo largo del eje horizontal del haz láser de salida. En otros casos más, el perfil de intensidad de los haces láser desviados angularmente en el haz láser de salida incluye una intensidad con perfil de sombrero a lo largo del eje horizontal.

En realizaciones, los haces láser desviados angularmente en el haz láser de salida están separados espacialmente. Según las señales de activación de radiofrecuencia aplicadas y el perfil de irradiación deseado del haz láser de salida, los haces láser desviados angularmente pueden estar separados por 0,001 gm o más, tal como por 0,005 gm o más, tal como por 0,01 gm o más, tal como por 0,05 gm o más, tal como por 0,1 gm o más, tal como por 0,5 gm o más, tal como por 1 gm o más, tal como por 5 gm o más, tal como por 10 gm o más, tal como por 100 gm o más, tal como por 500 gm o más, tal como por 1.000 gm o más e incluso 5000 gm o más. En algunas realizaciones, los haces láser desviados angularmente se superponen, por ejemplo, con un haz láser adyacente desviado angularmente a lo largo de un eje horizontal del haz láser de salida. La superposición entre haces láser desviados angularmente adyacentes (tal como superposición de puntos de haz) puede ser una superposición de 0,001 gm o más, tal como una superposición de 0,005 gm o más, tal como una superposición de 0,01 gm o más, tal como una superposición de 0,05 gm o más, tal como una superposición de 0,1 gm o más, tal como una superposición de 0,5 gm o más, tal como una superposición de 1 gm o más, tal como una superposición de 5 gm o más, tal como una superposición de 10 gm o más e incluso una superposición de 100 gm o más.

En determinadas realizaciones, los procedimientos incluyen ajustar la anchura espacial del haz láser de salida, tal como ajustar la anchura espacial del haz láser de salida a lo largo de un eje horizontal del haz láser de salida. Según el tamaño deseado del haz láser de salida, la anchura espacial del haz láser de salida se puede aumentar en 0,001 gm o más, tal como en 0,005 gm o más, tal como en 0,01 gm o más, tal como en 0,05 gm o más, tal como en 0,1 gm o más, tal como en 0,5 gm o más, tal como en 1 gm o más, tal como en 5 gm o más, tal como en 10 gm o más, tal como en 100 gm o más, tal como en 500 gm o más, tal como en 1.000 gm o más e incluso en 5.000 gm o más. En otras realizaciones, los procedimientos incluyen disminuir la anchura espacial del haz láser de salida en 0,001 gm o más, tal como en 0,005 gm o más, tal como en 0,01 gm o más, tal como en 0,05 gm o más, tal como en 0,1 gm o más, tal como en 0,5 gm o más, tal como en 1 gm o más, tal como en 5 gm o más, tal como en 10 gm o más, tal como en 100 gm o más, tal como en 500 gm o más, tal como en 1.000 gm o más e incluso en 5.000 gm o más.

Para ajustar la anchura espacial del haz láser de salida, los procedimientos incluyen en determinadas realizaciones aumentar o disminuir el número de señales de activación de radiofrecuencia aplicadas al dispositivo acústico-óptico durante la irradiación con el láser. En algunas realizaciones, la anchura espacial del haz láser de salida se disminuye reduciendo el número de haces láser desviados angularmente en el haz láser de salida, tal como reduciendo el número de haces láser desviados angularmente en 1 o más, tal como en 2 o más, tal como en 3 o más, tal como en 5 o más, tal como en 10 o más, tal como en 25 o más e incluso en 100 o más. En estas realizaciones, los procedimientos incluyen reducir el número de señales de activación de radiofrecuencia aplicadas en 1 o más, tal como en 2 o más, tal como en 3 o más, tal como en 5 o más, tal como en 10 o más, tal como en 25 o más e incluso en 100 o más. En otras realizaciones, la anchura espacial del haz láser de salida se aumenta aumentando el número de haces láser desviados angularmente en el haz láser de salida, tal como aumentando el número de haces láser desviados angularmente en 1 o más, tal como en 2 o más, tal como en 3 o más, tal como en 5 o más, tal como en 10 o más, tal como en 25 o más e incluso en 100 o más. En estas realizaciones, los procedimientos incluyen aumentar el número de señales de activación de radiofrecuencia aplicadas en 1 o más, tal como en 2 o más, tal como en 3 o más, tal como en 5 o más, tal como en 10 o más, tal como en 25 o más e incluso en 100 o más.

En determinadas realizaciones, los procedimientos incluyen dividir el haz láser de salida en un primer haz láser dividido que tiene un primer conjunto de haces láser desviados angularmente y un segundo haz láser dividido que tiene un segundo conjunto de haces láser desviados angularmente del haz láser de salida. En algunas realizaciones, el primer haz láser dividido y el segundo haz láser dividido son idénticos e incluyen el mismo número de haces láser desviados angularmente con el mismo perfil de intensidad. Se puede usar cualquier protocolo de ajuste óptico conveniente para dividir el haz láser de salida, tal como un espejo dicroico o un divisor de haz. En estas realizaciones, los procedimientos pueden incluir además invertir uno de los haces láser divididos (es decir, el primer haz láser dividido o el segundo haz láser dividido) y combinar ópticamente los haces láser para producir un haz láser de salida combinado donde los haces láser desviados angularmente del haz láser dividido invertido se superponen con los haces láser desviados angularmente del haz láser dividido no invertido. Puede usarse cualquier protocolo de ajuste óptico conveniente para invertir el haz láser dividido, incluidos, entre otros, lentes, espejos, prismas (p. ej., prisma de paloma), entre otros protocolos de inversión óptica. Como se describe con gran detalle a continuación, cuando el haz láser dividido invertido se combina con el haz láser dividido no invertido, cada haz láser desviado angularmente superpuesto produce una frecuencia de batido, que es la diferencia entre las frecuencias de los haces láser desviados angularmente superpuestos.

En algunas realizaciones, los procedimientos incluyen irradiar una muestra en una corriente de flujo (p. ej., en un citómetro de flujo) con el haz láser de salida (o el haz láser de salida combinado descrito anteriormente). En algunas realizaciones, la muestra es una muestra biológica. El término "muestra biológica" se usa en su sentido convencional para referirse a un organismo completo, una planta, un hongo o un subconjunto de tejidos animales, células o partes componentes que, en determinados casos, pueden encontrarse en sangre, mucosidad, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, lavado broncoalveolar, líquido amniótico, sangre de cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen. Como tal, una "muestra biológica" se refiere tanto al organismo nativo o un subconjunto de sus tejidos, así como a un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir del organismo o un subconjunto de sus tejidos, incluidos, entre otros, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, secciones de la piel, vías respiratorias, gastrointestinales, cardiovasculares y genitourinarias, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos. Las muestras biológicas pueden ser cualquier tipo de tejido orgánico, que incluye tanto tejido sano como enfermo (p. ej., canceroso, maligno, necrótico, etc.). En determinadas realizaciones, la muestra biológica es una muestra líquida, tal como sangre o un derivado de la misma, por ejemplo, plasma u otra muestra líquida biológica, por ejemplo, lágrimas, orina, semen, etc., donde en algunos casos la muestra es una muestra de sangre, incluida la sangre total, tal como la sangre obtenida por venopunción o punción digital (donde la sangre puede combinarse o no con cualquier reactivo antes del ensayo, tal como conservantes, anticoagulantes, etc.).

En determinadas realizaciones, la fuente de la muestra es un "mamífero" o "de mamíferos", donde estos términos se usan ampliamente para describir organismos que están dentro de la clase de mamíferos, incluidos los órdenes carnívoros (p. ej., perros y gatos), roedores (p. ej., ratones, cobayas y ratas) y primates (p. ej., humanos, chimpancés y monos). En algunos casos, los sujetos son humanos. Los procedimientos pueden aplicarse a muestras obtenidas de sujetos humanos de ambos sexos y en cualquier etapa de desarrollo (es decir, neonatos, bebés, jóvenes, adolescentes, adultos), donde en determinadas realizaciones el sujeto humano es un joven, adolescente o adulto. Si bien la presente invención puede aplicarse a muestras de un sujeto humano, se ha de entender que los procedimientos también pueden llevarse a cabo en muestras de otros sujetos animales (es decir, en "sujetos no humanos") tales como, pero sin limitarse a, pájaros, ratones, ratas, perros, gatos, ganado y caballos.

En determinadas realizaciones, la muestra biológica contiene células. Las células que pueden estar presentes en la muestra incluyen células eucariotas (p. ej., células de mamíferos) y/o células procariotas (p. ej., células bacterianas o células de arqueas). Las muestras pueden obtenerse de una fuente in vitro (p. ej., una suspensión de células de laboratorio cultivadas en cultivo) o de una fuente in vivo (p. ej., un sujeto mamífero, un sujeto humano, etc.). En algunas realizaciones, la muestra celular se obtiene de una fuente in vitro. Las fuentes in vitro incluyen, pero no se limitan a, cultivos de células procariotas (p. ej., bacterias, arqueas), muestras ambientales que contienen células procariotas y/o eucariotas (p. ej., células de mamíferos, hongos, etc.), cultivos de células eucariotas (p. ej., , cultivos de líneas celulares establecidas, cultivos de líneas celulares conocidas o compradas, cultivos de líneas celulares inmortalizadas, cultivos de células primarias, cultivos de levadura de laboratorio, etc.), cultivos de tejidos y similares.

Cuando la muestra biológica incluye células, los procedimientos de la presente divulgación pueden incluir la caracterización de componentes de las células, tales como fragmentos celulares, membranas celulares fragmentadas, orgánulos, células muertas o lisadas. En algunas realizaciones, los procedimientos incluyen caracterizar las vesículas extracelulares de las células. Caracterizar las vesículas extracelulares de las células puede incluir identificar el tipo de vesículas extracelulares en las células o determinar el tamaño de las vesículas extracelulares en las células.

La muestra en la corriente de flujo puede irradiarse de forma continua o en intervalos discretos. En algunos casos, los procedimientos incluyen la irradiación de la muestra en la corriente de flujo con la fuente de luz de forma continua. En otros casos, la muestra en la corriente de flujo se irradia con la fuente de luz en intervalos discretos, tal como irradiar cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos e incluso cada 1.000 milisegundos, o algún otro intervalo.

Dependiendo de la fuente de luz, la muestra en la corriente de flujo puede irradiarse desde una distancia que varía, tal como 0,01 mm o más, tal como 0,05 mm o más, tal como 0,1 mm o más, tal como 0,5 mm o más, tal como 1 mm o más, tal como 2,5 mm o más, tal como 5 mm o más, tal como 10 mm o más, tal como 15 mm o más, tal como 25 mm 0 más e incluso 50 mm o más. Además, el ángulo o la irradiación también pueden variar de 10° a 90°, tal como de 15° a 85°, tal como de 20° a 80°, tal como de 25° a 75° e incluso de 30° a 60°, por ejemplo, en un ángulo de 90°.

El caudal de la corriente de flujo puede variar, por ejemplo, dependiendo de la intensidad de la luz y puede ser de 1 ul/min o más, tal como 2 ul/min o más, tal como 3 ul/min o más, tal como 5 ul/min o más, tal como 10 ul/min o más, tal como 25 ul/min o más, tal como 50 ul/min o más, tal como 75 ul/min o más, tal como 100 ul/min o más, tal como 250 ul/min o más, tal como 500 ul/min o más, tal como 750 ul/min o más e incluso 1.000 ul/min o más. En determinadas realizaciones, el caudal de la corriente de flujo en los procedimientos de la materia varía de 1 ul/min a 500 ul/min, tal como de 1 ul/min a 250 ul/min, tal como de 1 ul/min a 100 ul/min, tal como de 2 ul/min a 90 ul/min, tal como de 3 ul/min a 80 ul/min, tal como de 4 ul/min a 70 ul/min, tal como de 5 ul/min a 60 ul/min e incluso de 10 ul/min a 50 ul/min. En determinadas realizaciones, el caudal de la corriente de flujo es de 5 ul/min a 6 ul/min.

Los procedimientos también incluyen la detección de luz de la muestra en la corriente de flujo. La luz detectada puede ser luz de dispersión lateral, luz de dispersión frontal, luz emitida o una combinación de las mismas. Los protocolos de detección de luz adecuados incluyen, pero no se limitan a, sensores ópticos o fotodetectores, tal como sensores de píxeles activos (APS), fotodiodo de avalancha, sensores de imagen, dispositivos de acoplamiento de carga (CCD), dispositivos de acoplamiento de carga intensificada (ICCD), diodos emisores de luz, contadores de fotones, bolómetros, detectores piroeléctricos, fotorresistores, células fotovoltaicas, fotodiodos, tubos fotomultiplicadores, fototransistores, fotoconductores o fotodiodos de puntos cuánticos y combinaciones de los mismos, entre otros fotodetectores. En determinadas realizaciones, la luz de la corriente de flujo irradiada en la región de interrogación de muestras del módulo de clasificación de partículas se mide con un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD), dispositivos semiconductores de acoplamiento de carga (CCD), sensores de píxeles activos (APS), sensores de imagen de semiconductores complementarios de óxido metálico (CMOS) o sensores de imagen de semiconductores de óxido metálico de tipo N (NMOS). En determinadas realizaciones, la luz se mide con un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD).

En algunas realizaciones, la luz (p. ej., luz de dispersión frontal, luz de dispersión lateral, luz emitida, etc.) se detecta directamente de la muestra en la corriente de flujo. En otras realizaciones, la luz de la muestra en la corriente de flujo se propaga a un detector con uno o más componentes de ajuste óptico. Por "ajuste óptico" se entiende que la luz de la muestra en la corriente de flujo se cambia según se desea. Por ejemplo, la trayectoria del haz, la dirección, el foco o la colimación de la luz de la muestra en la corriente de flujo se pueden cambiar con un componente de ajuste óptico. En algunos casos, las dimensiones de la luz recogida de la muestra en la corriente de flujo se ajustan, tal como se aumentan las dimensiones en un 5 % o más, tal como en un 10 % o más, tal como en un 25 % o más, tal como en un 50 % o más e incluso se aumentan las dimensiones en un 75 % o más o se enfoca la luz para reducir las dimensiones de la luz, tal como en un 5 % o más, tal como en un 10 % o más, tal como en un 25 % o más, tal como en un 50 % o más e incluso se reducen las dimensiones en un 75 % o más. En otros casos, el ajuste óptico incluye la colimación de la luz. El término "colimar" se usa en su sentido convencional para referirse al ajuste óptico de la colinealidad de la propagación de la luz o a la reducción de la divergencia de la luz desde un eje de propagación común. En algunos casos, la colimación incluye estrechamiento de la sección transversal espacial de un haz de luz. En determinadas realizaciones, el componente de ajuste óptico es un separador de longitud de onda. El término "separador de longitud de onda" se usa en la presente memoria en su sentido convencional para referirse a un protocolo óptico para separar luz policromática en sus longitudes de onda componentes. La separación de longitudes de onda, según determinadas realizaciones, puede incluir pasar o bloquear de forma selectiva longitudes de onda específicas o intervalos de longitud de onda de la luz policromática. Los protocolos de separación de longitud de onda de interés incluyen, pero no se limitan a, vidrio coloreado, filtros de paso de banda, filtros de interferencia, espejos dicroicos, rejillas de difracción, monocromadores y combinaciones de los mismos, entre otros protocolos de separación de longitud de onda. En algunas realizaciones, el separador de longitud de onda es un filtro óptico. Por ejemplo, el filtro óptico puede ser un filtro de paso de banda que tiene anchuras de banda mínimas que van de 2 nm a 100 nm, tal como de 3 nm a 95 nm, tal como de 5 nm a 95 nm, tal como de 10 nm a 90 nm, tal como de 12 nm a 85 nm, tal como de 15 nm a 80 nm e incluso filtros de paso de banda que tienen anchuras de banda mínimas que van de 20 nm a 50 nm.

En determinadas realizaciones, el detector se coloca separado en el espacio de la muestra en la corriente de flujo y la luz de la muestra en la corriente de flujo se propaga hacia el detector a través de un sistema de relé óptico, tal como con fibra óptica o un sistema de relé de luces por el espacio libre. Por ejemplo, el sistema de relés ópticos puede ser un paquete de relés de luces de fibra óptica y la luz se transmite a través del paquete de relés de luces de fibra óptica hacia el detector.

Puede emplearse cualquier sistema de relé de luces de fibra óptica para propagar la luz hacia el detector. En determinadas realizaciones, los sistemas de relés de luces de fibra óptica adecuados para propagar la luz hacia el detector incluyen, pero no se limitan a, sistemas de relés de luces de fibra óptica como los que se describen en la patente estadounidense n.° 6.809.804. En otras realizaciones, el sistema de relé óptico es un sistema de relé de luces por el espacio libre. La frase "relé de luces por el espacio libre" se usa en la presente memoria en su sentido convencional para referirse a la propagación de la luz que emplea una configuración de uno o más componentes ópticos para dirigir la luz hacia el detector a través del espacio libre. En determinadas realizaciones, el sistema de relé de luces por el espacio libre incluye un alojamiento que tiene un extremo proximal y un extremo distal, estando acoplado el extremo proximal hacia el detector. El sistema de retransmisión por el espacio libre puede incluir cualquier combinación de diferentes componentes de ajuste óptico, tal como uno o más de lentes, espejos, hendiduras, orificios, separadores de longitud de onda o una combinación de los mismos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los sistemas de relés de luces por el espacio libre de interés incluyen una o más lentes de enfoque. En otras realizaciones, los sistemas de relés de luces por el espacio libre de la materia incluyen uno o más espejos. Aún en otras realizaciones, el sistema de relé de luces por el espacio libre incluye una lente de colimación. En determinadas realizaciones, los sistemas de relés de luces por el espacio libre adecuados para propagar luz hacia el detector, pero no se limitan a, sistemas de relés de luces tales como los que se describen en las patentes estadounidenses n.os 7.643.142; 7.728.974 y 8.223.445.

Los procedimientos según determinadas realizaciones también incluyen medir la luz de la muestra en la corriente de flujo en una o más longitudes de onda, tal como 2 o más longitudes de onda, tal como 5 o más longitudes de onda diferentes, tal como 10 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 25 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 50 o más longitudes de onda diferentes, a 100 o más longitudes de onda diferentes, a 200 o más longitudes de onda diferentes, a 300 o más longitudes de onda diferentes e incluso la medición de la luz emitida por una muestra en la corriente de flujo a 400 o más longitudes de onda diferentes. En algunas realizaciones, los procedimientos incluyen medir la luz recogida en un intervalo de longitudes de onda (p. ej., 200 nm - 1.000 nm). Por ejemplo, los procedimientos pueden incluir la recopilación de espectros de luz en uno o más intervalos de longitud de onda de 200 nm a 1.000 nm. Aún en otras realizaciones, los procedimientos incluyen medir la luz recogida en una o más longitudes de onda específicas. Por ejemplo, la luz recogida se puede medir en uno o más de 450 nm, 518 nm, 519 nm, 561 nm, 578 nm, 605 nm, 607 nm, 625 nm, 650 nm, 660 nm, 667 nm, 670 nm, 668 nm, 695 nm, 710 nm, 723 nm, 780 nm, 785 nm, 647 nm, 617 nm y cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, los procedimientos incluyen la medición de longitudes de onda de luz que corresponden a la longitud de onda de fluorescencia pico de determinados fluoróforos.

La luz recogida se puede medir de forma continua o en intervalos discretos. En algunos casos, los procedimientos incluyen tomar mediciones de la luz de forma continua. En otros casos, la luz se mide en intervalos discretos, tal como medir la luz cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos e incluso cada 1.000 milisegundos, o algún otro intervalo.

Las mediciones de la luz recogida se pueden tomar una o más veces durante los procedimientos de la materia, tal como 2 o más veces, tal como 3 o más veces, tal como 5 o más veces e incluso 10 o más veces. En determinadas realizaciones, la propagación de la luz se mide 2 o más veces, promediando los datos en determinados casos.

Los procedimientos en determinadas realizaciones también incluyen adquisición, análisis y registro de datos, tal como con un ordenador, donde múltiples canales de datos registran datos de la muestra a medida que atraviesa la región de detección del sistema. En estas realizaciones, el análisis puede incluir clasificar y contar células o componentes de células (vesículas extracelulares) de modo que cada componente esté presente como un conjunto de valores de parámetros digitalizados.

Los sistemas de la materia se pueden configurar para activar un parámetro seleccionado a fin de distinguir las partículas de interés del fondo y el ruido. "Activador" se refiere a un umbral preestablecido para la detección de un parámetro y puede usarse como un medio para detectar el paso de un componente de interés a través de la región de detección. La detección de un evento que sobrepasa el umbral del parámetro seleccionado activa la adquisición de datos para el componente de muestra. No se adquieren datos de los componentes del medio que se está analizando que provocan una respuesta por debajo del umbral.

Sistemas para producir un haz láser de salida que tiene haces láser desviados angularmente con un perfil de intensidad predeterminado

Como se resume anteriormente, los aspectos de la presente divulgación incluyen sistemas configurados para producir un haz láser de salida que tiene dos o más haces láser desviados angularmente (p. ej., para irradiar una muestra en una corriente de flujo) con un perfil de intensidad predeterminado. Los sistemas incluyen por lo menos las características de la reivindicación 9 independiente.

En realizaciones, los sistemas de la materia incluyen uno o más láseres. Los láseres de interés pueden incluir láseres de pulsos o láseres de onda continua. El tipo y la cantidad de láseres usados en los procedimientos de la materia pueden variar y pueden ser un láser de gas, tal como un láser de helio-neón, láser de argón, láser de criptón, láser de xenón, láser de nitrógeno, láser de CO² , láser de CO, láser de excímeros de argón-flúor (ArF), láser de excímeros de fluoruro de kriptón (KrF), láser de excímeros de cloruro de xenón (XeCI) o láser de excímeros de fluoruro de xenón (XeF) o una combinación de los mismos. En otros casos, los procedimientos incluyen irradiar el dispositivo acústicoóptico con un láser de colorante, tal como un láser de estilbeno, cumarina o rodamina. En otros casos, los procedimientos incluyen irradiar el dispositivo acústico-óptico con un láser de vapor de metal, tal como un láser de helio-cadmio (HeCd), láser de helio-mercurio (HeHg), láser de helioselenio (HeSe), láser de helio-plata (HeAg), láser de estroncio, láser de neón-cobre (NeCu), láser de cobre o láser de oro y combinaciones de los mismos. Todavía en otros casos, los procedimientos incluyen irradiar el dispositivo acústico-óptico con un láser de estado sólido, tal como un láser de rubí, un láser Nd:YAG, láser NdCrYAG, láser Er:YAG, láser Nd:YLF, láser Nd:YVÜ4, láser Nd:YCa4O(BO₃)₃, láser Nd:YCOB, láser de zafiro de titanio, láser de tulio YAG, láser de iterbio YAG, láser de iterbio₂O3 o láseres dopados con cerio y combinaciones de los mismos. En otros casos más, los procedimientos incluyen irradiar el dispositivo acústico-óptico con un láser de diodo semiconductor, un láser semiconductor bombeado ópticamente (OPSL) o una implementación de frecuencia duplicada o triplicada de cualquiera de los láseres mencionados anteriormente.

El dispositivo acústico-óptico puede ser cualquier protocolo acústico-óptico conveniente configurado para desplazar la frecuencia de la luz láser usando ondas acústicas aplicadas. En determinadas realizaciones, el dispositivo acústicoóptico es un deflector acústico-óptico. El dispositivo acústico-óptico en el sistema de la materia está configurado para generar haces láser desviados angularmente a partir de la luz del láser y las señales de activación de radiofrecuencia aplicadas. Las señales de activación de radiofrecuencia pueden aplicarse al dispositivo acústico-óptico con cualquier fuente de señal de activación de radiofrecuencia adecuada, tal como un sintetizador digital directo (DDS), un generador de forma de onda arbitraria (AWG) o un generador de impulsos eléctricos.

En realizaciones, el controlador está configurado para aplicar señales de activación de radiofrecuencia al dispositivo acústico-óptico para producir el número deseado de haces láser desviados angularmente en el haz láser de salida, tal como configurado para aplicar 3 señales de activación de radiofrecuencia o más, tal como 4 señales de activación de radiofrecuencia o más, tal como 5 señales de activación de radiofrecuencia o más, tal como 6 señales de activación de radiofrecuencia o más, tal como 7 señales de activación de radiofrecuencia o más, tal como 8 señales de activación de radiofrecuencia o más, tal como 9 señales de activación de radiofrecuencia o más, tal como 10 señales de activación de radiofrecuencia o más, tal como 15 señales de activación de radiofrecuencia o más, tal como 25 señales de activación de radiofrecuencia o más, tal como 50 señales de activación de radiofrecuencia o más e incluso configurado para aplicar 100 señales de activación de radiofrecuencia o más.

Para producir un perfil de intensidad de los haces láser desviados angularmente en el haz láser de salida, el controlador está configurado para aplicar señales de activación de radiofrecuencia que tienen una amplitud que varía de aproximadamente 0,001 V a aproximadamente 500 V, tal como de aproximadamente 0,005 V a aproximadamente 400 V, tal como de aproximadamente 0,01 V a aproximadamente 300 V, tal como de aproximadamente 0,05 V a aproximadamente 200 V, tal como de aproximadamente 0,1 V a aproximadamente 100 V, tal como de aproximadamente 0,5 V a aproximadamente 75 V, tal como de aproximadamente 1 V hasta 50 V, tal como de aproximadamente 2 V hasta 40 V, tal como de aproximadamente 3 V a aproximadamente 30 V e incluso de aproximadamente 5 V a aproximadamente 25 V. Cada la señal de activación de radiofrecuencia aplicada tiene, en algunas realizaciones, una frecuencia de aproximadamente 0,001 MHz a aproximadamente 500 MHz, tal como de aproximadamente 0,005 MHz a aproximadamente 400 MHz, tal como de aproximadamente 0,01 MHz a aproximadamente 300 MHz, tal como de aproximadamente 0,05 MHz a aproximadamente 200 MHz, tal como de aproximadamente 0,1 MHz a aproximadamente 100 MHz, tal como de aproximadamente 0,5 MHz a aproximadamente 90 MHz, tal como de aproximadamente 1 MHz a aproximadamente 75 MHz, tal como de aproximadamente 2 MHz a aproximadamente 70 MHz, tal como de aproximadamente 3 MHz a aproximadamente 65 MHz, tal como de aproximadamente 4 MHz a aproximadamente 60 MHz e incluso de aproximadamente 5 MHz a aproximadamente 50 MHz.

El controlador tiene un procesador que tiene una memoria acoplada de forma operativa al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en el misma, que cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador produzca un haz láser de salida que tiene, en determinadas realizaciones, haces láser desviados angularmente con un perfil de intensidad deseado. Por ejemplo, la memoria puede incluir instrucciones para producir dos o más haces láser desviados angularmente con las mismas intensidades, tal como 3 o más, tal como 4 o más, tal como 5 o más, tal como 10 o más, tal como 25 o más, tal como 50 o más, e incluso la memoria, puede incluir instrucciones para producir 100 o más haces láser desviados angularmente con las mismas intensidades. En otras realizaciones, pueden incluir instrucciones para producir dos o más haces láser desviados angularmente con diferentes intensidades, tal como 3 o más, tal como 4 o más, tal como 5 o más, tal como 10 o más, tal como 25 o más , tal como 50 o más, e incluso la memoria, puede incluir instrucciones para producir 100 o más haces láser desviados angularmente con diferentes intensidades.

La memoria puede incluir instrucciones almacenadas en la misma, que cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador produzca un haz láser de salida que tiene una intensidad creciente desde los bordes hasta el centro del haz láser de salida a lo largo del eje horizontal. En estos casos, la intensidad del haz láser desviado angularmente en el centro del haz de salida puede oscilar entre el 0,1 % y aproximadamente el 99 % de la intensidad de los haces láser desviados angularmente en el borde del haz láser de salida a lo largo del eje horizontal, tal como del 0,5 % a aproximadamente el 95 %, tal como del 1 % a aproximadamente el 90 %, tal como del 2 % a aproximadamente el 85 %, tal como del 3 % al 80 %, tal como del 4 % al 75 %, tal como de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 70 %, tal como de aproximadamente el 6 % a aproximadamente el 65 %, tal como de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 60 %, tal como de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 55 % e incluso de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 50 % de la intensidad de los haces láser desviados angularmente en el borde del haz láser de salida a lo largo del eje horizontal. En otras realizaciones, el controlador tiene un procesador que tiene una memoria acoplada de forma operativa al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en el misma, que cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador produzca un haz láser de salida que tiene una intensidad creciente desde los bordes hasta el centro del haz láser de salida a lo largo del eje horizontal. En estos casos, la intensidad del haz láser desviado angularmente en los bordes del haz de salida puede oscilar entre el 0,1 % y aproximadamente el 99 % de la intensidad de los haces láser desviados angularmente en el centro del haz láser de salida a lo largo del eje horizontal, tal como del 0,5 % a aproximadamente el 95 %, tal como del 1 % a aproximadamente el 90 %, tal como del 2 % a aproximadamente el 85 %, tal como del 3 % al 80 %, tal como del 4 % al 75 %, tal como de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 70 %, tal como de aproximadamente el 6 % a aproximadamente el 65 %, tal como de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 60 %, tal como de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 55 % e incluso de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 50 % de la intensidad de los haces láser desviados angularmente en el centro del haz láser de salida a lo largo del eje horizontal. Aún en otras realizaciones, el controlador tiene un procesador que tiene una memoria acoplada de forma operativa al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en la misma, que cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador produzca un haz láser de salida que tiene un perfil de intensidad con una distribución gaussiana a lo largo del eje horizontal. Aún en otras realizaciones, el controlador tiene un procesador que tiene una memoria acoplada de forma operativa al procesador de modo que la memoria incluye instrucciones almacenadas en la misma, que cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador produzca un haz láser de salida que tiene una intensidad con perfil de sombrero a lo largo del eje horizontal.

En realizaciones, los sistemas están configurados para producir haces láser desviados angularmente en el haz láser de salida que están separados espacialmente. Según las señales de activación de radiofrecuencia aplicadas y el perfil de irradiación deseado del haz láser de salida, los haces láser desviados angularmente pueden estar separados por 0,001 gm o más, tal como por 0,005 gm o más, tal como por 0,01 gm o más, tal como por 0,05 gm o más, tal como por 0,1 gm o más, tal como por 0,5 gm o más, tal como por 1 gm o más, tal como por 5 gm o más, tal como por 10 gm o más, tal como por 100 gm o más, tal como por 500 gm o más, tal como por 1.000 gm o más e incluso 5000 gm o más. En algunas realizaciones, los sistemas están configurados para producir haces láser desviados angularmente en el haz láser de salida que se superponen, tal como con un haz láser adyacente desviado angularmente a lo largo de un eje horizontal del haz láser de salida. La superposición entre haces láser adyacentes desviados angularmente adyacentes (tal como superposición de puntos de haz) puede ser una superposición de 0,001 gm o más, tal como una superposición de 0,005 gm o más, tal como una superposición de 0,01 gm o más, tal como una superposición de 0,05 gm o más, tal como una superposición de 0,1 gm o más, tal como una superposición de 0,5 gm o más, tal como una superposición de 1 gm o más, tal como una superposición de 5 gm o más, tal como una superposición de 10 gm o más e incluso una superposición de 100 gm o más.

El sistema incluye una célula de flujo configurada para propagar la muestra en la corriente de flujo. Se puede emplear cualquier célula de flujo conveniente que propague una muestra fluídica a una región de interrogación de muestras, donde en algunas realizaciones, la célula de flujo incluye una porción cilindrica proximal que define un eje longitudinal y una porción troncocónica distal que termina en una superficie plana que tiene el orificio que es transversal al eje longitudinal. La longitud de la porción cilindrica proximal (medida a lo largo del eje longitudinal) puede variar de 1 mm a 15 mm, tal como de 1,5 mm a 12,5 mm, de 2 mm a 10 mm, tal como de 3 mm a 9 mm e incluso de 4 mm a 8 mm. La longitud de la porción troncocónica distal (medida a lo largo del eje longitudinal) también puede variar de 1 mm a 10 mm, tal como de 2 mm a 9 mm, tal como de 3 mm a 8 mm e incluso de 4 mm a 7 mm. El diámetro de la cámara de la boquilla de la célula de flujo puede variar, en algunas realizaciones, de 1 mm a 10 mm, tal como de 2 mm a 9 mm, tal como de 3 mm a 8 mm e incluso de 4 mm a 7 mm.

En determinados casos, la célula de flujo no incluye una porción cilindrica y toda la cámara interior de la célula de flujo tiene forma troncocónica. En estas realizaciones, la longitud de la cámara interior troncocónica (medida a lo largo del eje longitudinal transversal al orificio de la boquilla), puede variar de 1 mm a 15 mm, tal como de 1,5 mm a 12,5 mm, tal como de 2 mm a 10 mm, tal como de 3 mm a 9 mm e incluso de 4 mm a 8 mm. El diámetro de la porción proximal de la cámara interna troncocónica puede variar de 1 mm a 10 mm, tal como de 2 mm a 9 mm, tal como de 3 mm a 8 mm e incluso de 4 mm a 7 mm.

En algunas realizaciones, la corriente de flujo de muestra proviene de un orificio en el extremo distal de la célula de flujo. Dependiendo de las características deseadas de la corriente de flujo, el orificio de la célula de flujo puede tener cualquier forma adecuada donde las formas de sección transversal de interés incluyen, pero no se limitan a: formas de sección transversal rectilínea, por ejemplo, cuadrados, rectángulos, trapecios, triángulos, hexágonos, etc., formas de sección transversal curvilínea, por ejemplo, círculos, óvalos, así como formas irregulares, por ejemplo, una porción inferior parabólica acoplada a una porción superior plana. En determinadas realizaciones, la célula de flujo de interés tiene un orificio circular. El tamaño del orificio de la boquilla puede variar, en algunas realizaciones, de 1 gm a 20.000 gm, tal como de 2 gm a 17.500 gm, tal como de 5 gm a 15.000 gm, tal como de 10 gm a 12.500 gm, tal como de 15 gm a 10.000 gm, tal como de 25 gm a 7.500 gm, tal como de 50 gm a 5.000 gm, tal como de 75 gm a 1.000 gm, tal como de 100 gm a 750 gm e incluso de 150 gm a 500 gm. En determinadas realizaciones, el orificio de la boquilla es de 100 gm.

En algunas realizaciones, la célula de flujo incluye un puerto de inyección de muestras configurado para proporcionar una muestra a la célula de flujo. En realizaciones, el sistema de inyección de muestra está configurado para proporcionar un flujo de muestra adecuado a la cámara interna de la célula de flujo. Dependiendo de las características deseadas de la corriente de flujo, la tasa de muestra transportada a la cámara de la célula de flujo por el puerto de inyección de muestras puede ser de 1 gl/min o más, tal como 2 gl/min o más, tal como 3 gl/min o más, tal como 5 gl/min o más, tal como 10 gl/min o más, tal como 15 gl/min o más, tal como 25 gl/min o más, tal como 50 gl/min o más e incluso 100 gl/min o más, donde en algunos casos la tasa de muestra transportada a la cámara de la célula de flujo por el puerto de inyección de muestras es de 1 gl/s o más, tal como 2 gl/s o más, tal como 3 gl/s o más, tal como 5 gl/s o más, tal como 10 gl/s o más, tal como 15 gl/s o más, tal como 25 gl/s o más, tal como 50 gl/s o más e incluso 100 gl/s o más.

El puerto de inyección de muestras puede ser un orificio situado en una pared de la cámara interior o puede ser un conducto situado en el extremo proximal de la cámara interior. Cuando el puerto de inyección de muestras es un orificio colocado en una pared de la cámara interior, el orificio del puerto de inyección de muestras puede tener cualquier forma adecuada donde las formas de sección transversal de interés incluyen, pero no se limitan a: formas de sección transversal rectilínea, por ejemplo, cuadrados, rectángulos, trapecios, triángulos, hexágonos, etc., formas de sección transversal curvilínea, por ejemplo, círculos, óvalos, etc., así como formas irregulares, por ejemplo, una porción inferior parabólica acoplada a una porción superior plana. En determinadas realizaciones, el puerto de inyección de muestras tiene un orificio circular. El tamaño del orificio del puerto de inyección de muestras puede variar según la forma, en determinados casos, con una abertura que va de 0,1 mm a 5,0 mm, por ejemplo, 0,2 a 3,0 mm, por ejemplo, 0,5 mm a 2,5 mm, tal como de 0,75 mm a 2,25 mm, tal como de 1 mm a 2 mm e incluso de 1,25 mm a 1,75 mm, por ejemplo, 1,5 mm.

En determinados casos, el puerto de inyección de muestras es un conducto situado en un extremo proximal de la cámara interior de la célula de flujo. Por ejemplo, el puerto de inyección de muestras puede ser un conducto colocado para tener el orificio del puerto de inyección de muestras en línea con el orificio de la célula de flujo. Cuando el puerto de inyección de muestras es un conducto colocado en línea con el orificio de la célula de flujo, la forma de la sección transversal del tubo de inyección de muestra puede tener cualquier forma adecuada donde las formas de sección transversal de interés incluyen, pero no se limitan a: formas de sección transversal rectilínea, por ejemplo, cuadrados, rectángulos, trapezoides, triángulos, hexágonos, etc., formas de sección transversal curvilínea, por ejemplo, círculos, óvalos, así como formas irregulares, por ejemplo, una porción inferior parabólica acoplada a una porción superior plana. El orificio del conducto puede variar dependiendo de la forma, en determinados casos, con una abertura que va de 0,1 mm a 5,0 mm, por ejemplo, 0,2 a 3,0 mm, por ejemplo, 0,5 mm a 2,5 mm, tal como de 0,75 mm a 2,25 mm, tal como de 1 mm a 2 mm e incluso de 1,25 mm a 1,75 mm, por ejemplo, 1,5 mm. La forma de la punta del puerto de inyección de muestras puede ser igual o diferente a la forma de la sección transversal del tubo de inyección de muestras.

Por ejemplo, el orificio del puerto de inyección de muestras puede incluir una punta biselada que tiene un ángulo de bisel que va de 1° a 10°, tal como de 2° a 9°, tal como de 3° a 8°, tal como de 4° a 7° e incluso un ángulo de bisel de 5°.

En algunas realizaciones, la célula de flujo también incluye un puerto de inyección de fluido de vaina configurado para proporcionar un fluido de vaina a la célula de flujo. En realizaciones, el sistema de inyección de fluido de vaina está configurado para proporcionar un flujo de fluido de vaina a la cámara interna de la célula de flujo, por ejemplo, junto con la muestra para producir una corriente de flujo laminar de fluido de vaina que rodea la corriente de flujo de muestra. Dependiendo de las características deseadas de la corriente de flujo, la tasa de fluido de vaina transportado a la cámara de la célula de flujo por el puede ser de 25 gl/s o más, tal como 50 gl/s o más, tal como 75 gl/s o más, tal como como 100 gl/s o más, tal como 250 gl/s o más, tal como 500 gl/s o más, tal como 750 gl/s o más, tal como 1.000 gl/s o más e incluso 2.500 gl/s o más.

En algunas realizaciones, el puerto de inyección de fluido de vaina es un orificio colocado en una pared de la cámara interior. El orificio del puerto de inyección de fluido de vaina puede tener cualquier forma adecuada donde las formas transversales de interés incluyen, pero no se limitan a: formas de sección transversal rectilínea, por ejemplo, cuadrados, rectángulos, trapecios, triángulos, hexágonos, etc., formas de sección transversal curvilínea, por ejemplo, círculos, óvalos, así como formas irregulares, por ejemplo, una porción inferior parabólica acoplada a una porción superior plana. El tamaño del orificio del puerto de inyección de muestras puede variar según la forma, en determinados casos, con una abertura que va de 0,1 mm a 5,0 mm, por ejemplo, 0,2 a 3,0 mm, por ejemplo, 0,5 mm a 2,5 mm, tal como de 0,75 mm a 2,25 mm, tal como de 1 mm a 2 mm e incluso de 1,25 mm a 1,75 mm, por ejemplo, 1,5 mm.

En algunas realizaciones, los sistemas incluyen además una bomba en comunicación fluida con la célula de flujo para propagar la corriente de flujo a través de la célula de flujo. Puede emplearse cualquier protocolo de bomba de fluido conveniente para controlar el flujo de la corriente de flujo a través de la célula de flujo. En determinados casos, los sistemas incluyen una bomba peristáltica, tal como una bomba peristáltica que tiene un amortiguador de pulsos. La bomba en los sistemas de la materia está configurada para transportar fluido a través de la célula de flujo a una tasa adecuada para detectar la luz de la muestra en la corriente de flujo. En algunos casos, la tasa de flujo de muestra en la célula de flujo es de 1 gl/min (microlitro por minuto) o más, tal como 2 gl/min o más, tal como 3 gl/min o más, tal como 5 gl/min o más, tal como 10 gl/min o más, tal como 25 gl/min o más, tal como 50 gl/min o más, tal como 75 gl/min o más, tal como 100 gl/min o más, tal como 250 gl/min o más, tal como 500 gl/min o más, tal como 750 gl/min o más e incluso 1.000 gl/min o más. Por ejemplo, el sistema puede incluir una bomba que está configurada para hacer fluir la muestra a través de la célula de flujo a una tasa que va de 1 gl/min a 500 gl/min, tal como de 1 gl/min a 250 gl/min, tal como de 1 gl/min a 100 gl/min, tal como de 2 gl/min a 90 gl/min, tal como de 3 gl/min a 80 gl/min, tal como de 4 gl/min a 70 gl/min, tal como de 5 gl/min a 60 gl/min e incluso de 10 gl/min a 50 gl/min. En determinadas realizaciones, el caudal de la corriente de flujo es de 5 gl/min a 6 gl/min.

El sistema también puede incluir uno o más detectores para detectar la luz de una muestra en una corriente de flujo (p. ej., en un citómetro de flujo). Los detectores pueden configurarse para detectar luz dispersa lateral, luz de dispersión frontal, luz emitida o una combinación de las mismas. Los protocolos de detección de luz adecuados incluyen, pero no se limitan a, sensores ópticos o fotodetectores, tal como sensores de píxeles activos (APS), fotodiodo de avalancha, sensores de imagen, dispositivos de acoplamiento de carga (CCD), dispositivos de acoplamiento de carga intensificada (ICCD), diodos emisores de luz, contadores de fotones, bolómetros, detectores piroeléctricos, fotorresistores, células fotovoltaicas, fotodiodos, tubos fotomultiplicadores, fototransistores, fotoconductores o fotodiodos de puntos cuánticos y combinaciones de los mismos, entre otros fotodetectores. En determinadas realizaciones, la luz de la corriente de flujo irradiada en la región de interrogación de muestras del módulo de clasificación de partículas se mide con un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD), dispositivos semiconductores de acoplamiento de carga (CCD), sensores de píxeles activos (APS), sensores de imagen de semiconductores complementarios de óxido metálico (CMOS) o sensores de imagen de semiconductores de óxido metálico de tipo N (NMOS). En determinadas realizaciones, la luz se mide con un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD).

Los sistemas también pueden incluir uno o más componentes de ajuste óptico. Por ejemplo, los sistemas pueden incluir lentes, espejos, colimadores, separadores de longitud de onda tales como vidrio coloreado, filtros de paso de banda, filtros de interferencia, espejos dicroicos, rejillas de difracción, monocromadores, etc. En determinadas realizaciones, los sistemas incluyen un divisor de haz y un componente inversor óptico, tal como para invertir un haz láser de salida a lo largo de un eje horizontal como se describe anteriormente. En determinadas realizaciones, el detector se coloca separado en el espacio de la muestra en la corriente de flujo y la luz de la muestra en la corriente de flujo se propaga hacia el detector a través de un sistema de relé óptico, tal como con fibra óptica o un sistema de relé de luces por el espacio libre. Por ejemplo, el sistema de relés ópticos puede ser un paquete de relés de luces de fibra óptica y la luz se transmite a través del paquete de relés de luces de fibra óptica hacia el detector. Puede emplearse cualquier sistema de relé de luces de fibra óptica para propagar la luz hacia el detector. En determinadas realizaciones, los sistemas de relés de luces de fibra óptica adecuados para propagar la luz hacia el detector incluyen, pero no se limitan a, sistemas de relés de luces de fibra óptica como los que se describen en la patente estadounidense n.° 6.809.804. En otras realizaciones, el sistema de relé óptico es un sistema de relé de luces por el espacio libre. La frase "relé de luces por el espacio libre" se usa en la presente memoria en su sentido convencional para referirse a la propagación de la luz que emplea una configuración de uno o más componentes ópticos para dirigir la luz hacia el detector a través del espacio libre. En determinadas realizaciones, el sistema de relé de luces por el espacio libre incluye un alojamiento que tiene un extremo proximal y un extremo distal, estando acoplado el extremo proximal hacia el detector. El sistema de retransmisión por el espacio libre puede incluir cualquier combinación de diferentes componentes de ajuste óptico, tal como uno o más de lentes, espejos, hendiduras, orificios, separadores de longitud de onda o una combinación de los mismos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los sistemas de relés de luces por el espacio libre de interés incluyen una o más lentes de enfoque. En otras realizaciones, los sistemas de relés de luces por el espacio libre de la materia incluyen uno o más espejos. Aún en otras realizaciones, el sistema de relé de luces por el espacio libre incluye una lente de colimación. En determinadas realizaciones, los sistemas de relés de luces por el espacio libre adecuados para propagar luz hacia el detector, pero no se limitan a, sistemas de relés de luces tales como los que se describen en las patentes estadounidenses n.os 7.643.142; 7.728.974 y 8.223.445.

En determinadas realizaciones, los sistemas de la materia son sistemas de citometría de flujo que emplean los sistemas descritos anteriormente para producir un haz láser de salida que tiene dos o más haces láser desviados más angularmente (p. ej., para irradiar una muestra en una corriente de flujo) con un perfil de intensidad predeterminado. Los sistemas y procedimientos de citometría de flujo adecuados para analizar muestras incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Ormerod (ed.), Flow Cytometry: A Practical Approach, Oxford Univ. Press (1997); Jaroszeski et al. (eds.), Flow Cytometry Protocols, Methods in Molecular Biology n.° 91, Humana Press (1997); Citometría de flujo práctica, 3.a ed., Wiley-Liss (1995); Virgo, et al. (2012) Ann Clin Biochem. Enero; 49(pt 1):17-28; Linden, et al. Semin Throm Hemost. 2004 octubre; 30(5): 502-11; Allison, et al. J. Pathol, diciembre de 2010; 222(4):335-344; y Herbig, et al. (2007) Grit Rev Ther Drug Carrier Syst. 24(3):203-255. En determinados casos, los sistemas de citometría de flujo de interés incluyen el citómetro de flujo BD Biosciences FACSCanto™, sistemas BD Biosciences FACSVantage™, BO Biosciences FACSort™, BD Biosciences FACSCount™, BD Biosciences FACScan™ y BO Biosciences FACSCalibur™, un clasificador de células BD Biosciences Influx™, un clasificador de células BD Biosciences Jazz™ y un clasificador de células BO Biosciences Aria™ o similares.

En determinadas realizaciones, los sistemas de la materia son sistemas de citómetros de flujo que incorporan uno o más componentes de los citómetros de flujo descritos en las patentes estadounidenses n.os 3.960.449; 4.347.935; 4.667.830; 4.704.891; 4.770.992; 5.030.002; 5.040.890; 5.047.321; 5.245.318; 5.317.162; 5.464.581; 5.483.469; 5.602.039; 5.620.842; 5.627.040; 5.643.796; 5.700.692; 6.372.506; 6.809.804; 6.813.017; 6.821.740; 7.129.505; 7.201.875; 7.544.326; 8.140.300; 8.233.146; 8.753.573; 8.975.595; 9.092.034; 9.095.494 y 9.097.640.

Como se resume anteriormente, la presente invención se refiere en general a procedimientos y sistemas para realizar citometría de flujo. Como se analiza con más detalle a continuación (en particular en referencia a las figuras 1 a 15), en algunas realizaciones, se usa un deflector acústico-óptico para generar una pluralidad de minihaces, en respuesta a la aplicación de una pluralidad de señales de radiofrecuencia al deflector, que colectivamente forman un haz de excitación. Las señales de radiofrecuencia aplicadas pueden ajustarse para variar determinadas características de los minihaces y, por lo tanto, las respectivas del haz de excitación resultante. Por ejemplo, tal como se analiza con más detalle a continuación, las potencias de las señales de radiofrecuencia se pueden ajustar para variar la intensidad del haz de excitación a lo largo de su dimensión horizontal. Dicha variación se puede usar, por ejemplo, para asegurar una respuesta óptica sustancialmente uniforme de partículas equivalentes que atraviesan diferentes porciones del haz. En algunas realizaciones, las frecuencias de las señales aplicadas se pueden ajustar para mover espacialmente el haz de excitación para rastrear una corriente de muestra que fluye a través de una célula de flujo de un citómetro de flujo.

La figura 1 representa esquemáticamente un sistema 10 de citometría de flujo según una realización de la presente invención, que incluye una fuente 12 de láser para generar un haz láser LB. A modo de ejemplo, el haz láser puede tener una frecuencia en un intervalo de aproximadamente 1.000 THz a aproximadamente 300 THz, aunque también se pueden emplear otras frecuencias. El diámetro del haz láser (p. ej., la cintura del haz cuando se emplea un haz láser gaussiano) puede estar, por ejemplo, en un intervalo de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 10 mm. Sin pérdida de generalidad, en esta realización, se supone que el láser opera en el modo TEM⁰⁰ para generar un haz gaussiano. En otras realizaciones, se pueden emplear otros perfiles de intensidad del haz.

Un espejo 14 dirige la radiación láser a un deflector 16 acústico-óptico. Un generador 18 de radiofrecuencia (RF), por ejemplo, un sintetizador digital directo, que opera bajo el control de un controlador 20, puede aplicar una pluralidad de señales de activación de radiofrecuencia simultáneamente al deflector 16 acústico-óptico para generar una pluralidad de minihaces separados angularmente que pueden formar colectivamente un haz de excitación. Las señales de activación pueden ser desplazadas en frecuencia entre sí por una frecuencia en un intervalo de aproximadamente 10 MHz a aproximadamente 250 MHz, por ejemplo, en un intervalo de aproximadamente 50 MHz a aproximadamente 150 MHz. En algunas realizaciones, el desplazamiento de radiofrecuencia entre señales de activación adyacentes puede estar en un intervalo de aproximadamente 0,1 MHz a aproximadamente 4 MHz. En muchas realizaciones, las señales de activación de RF son equidistantes en frecuencia y, por lo tanto, se denominan en la presente memoria peine de frecuencia de RF.

A modo de ejemplo, como se muestra esquemáticamente en la figura 2, el generador de RF puede aplicar una pluralidad de señales de activación RF1,..., RF8, al deflector acústico-óptico. La interacción del haz láser con cada una de las señales de activación de RF puede provocar la difracción del haz láser en múltiples órdenes de difracción. Como se muestra en la figura 1, en esta realización, el deflector acústico-óptico está configurado de modo que, para cada señal de activación, el haz correspondiente al orden de difracción -1 se propaga hacia una lente 22 convergente (el minihaz respectivo de orden cero es capturado con un tope de haz).

Los minihaces asociados con las señales de activación están separados angularmente entre sí y, en algunos casos, se superponen parcialmente. Por ejemplo, la figura 3 representa esquemáticamente una pluralidad de dichos haces BL1, ..., BL9, cada uno de los cuales está asociado con una de las señales de activación RF1, ..., RF8 que se muestran la figura 2. En este ejemplo, los minihaces adyacentes se superponen espacialmente parcialmente y los minihaces forman colectivamente un haz 24 de excitación, como se muestra en la figura 1, que tiene una extensión alargada a lo largo de una dimensión, que se supone que es la dirección horizontal en esta realización. A modo de ejemplo, la relación de la extensión del haz a lo largo de la dirección horizontal con respecto a la dirección vertical (p. ej., en base a la anchura total a la mitad de intensidad máxima) puede ser mayor que aproximadamente 4.

Cada uno de los minihaces está desplazado en frecuencia con respecto a la frecuencia del haz láser (LB) por una frecuencia de desfase correspondiente a la frecuencia de RF de la señal de activación asociada con ese minihaz. Además, las intensidades de los minihaces pueden variar en base a las potencias eléctricas de las señales de activación. Por ejemplo, las señales de activación que se muestran en la figura 2 muestran una potencia máxima para las señales de activación RF1 y RF8 y una potencia mínima para la señal de activación RF5. Más específicamente, en este ejemplo, la potencia de las señales de activación disminuye linealmente desde RF1 hasta RF5 y aumenta linealmente desde RF5 hasta RF8. Esta variación en las potencias de las señales de activación provoca una variación respectiva de las intensidades de los minihaces generados por esas señales de activación a lo largo de la dirección horizontal. Dichas variaciones se superponen al perfil de intensidad inicial del haz láser a lo largo de la dirección horizontal para proporcionar un haz de excitación que presenta una variación de intensidad deseada a lo largo de la dimensión horizontal.

Por ejemplo, en referencia a la figura 4, en esta realización, las intensidades de los minihaces BL1, ..., BL9, que se muestran esquemáticamente en la figura 3 varían a lo largo de la dirección horizontal (representada esquemáticamente por la línea discontinua etiquetada HD) linealmente desde una intensidad máxima para el minihaz BL1 hasta una intensidad mínima para el minihaz BL5, y aumenta linealmente desde la intensidad del minihaz BL5 hasta la del minihaz BL9. Esta variación de la intensidad de los minihaces en este ejemplo da lugar a un haz de excitación de intensidad variable que tiene una intensidad mayor en sus bordes horizontales que en su centro. En este ejemplo, los minihaces pueden tener una distribución de intensidad gaussiana a lo largo de la dirección vertical (representada por la línea continua VD), aunque también se pueden usar otras distribuciones de intensidad.

El controlador 20 puede ajustar las potencias de las señales de activación aplicadas al deflector 16 acústico-óptico (ajustando sus amplitudes) para obtener una variedad de variaciones de intensidad diferentes a lo largo de la dimensión horizontal del haz de excitación resultante. En algunos casos, tal como el ejemplo anterior, el controlador 20 puede ajustar las amplitudes de las señales de activación (y, en consecuencia, la potencia asociada con cada señal de activación) de modo que el haz de excitación tiene una intensidad máxima en sus bordes horizontales y una intensidad mínima en su centro. En otras realizaciones, las amplitudes de las señales de activación se pueden ajustar para obtener otras distribuciones de intensidad a lo largo de la dimensión horizontal del haz de excitación. Por ejemplo, en algunos casos, la variación de intensidad a través del haz de excitación puede caracterizarse por una variación oscilatoria. En algunas realizaciones, las amplitudes de las señales de RF aplicadas al deflector acústico-óptico pueden variar en un intervalo de aproximadamente 0,1 voltios a aproximadamente 40 voltios. En algunas realizaciones, la variación de las amplitudes de las señales de activación (y en consecuencia la variación de las potencias de las señales de activación) puede dar lugar a una variación máxima de la intensidad óptica a lo largo de por lo menos una dimensión del haz de excitación (elegida como la dimensión horizontal en esta realización) en un intervalo de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 99 %, por ejemplo, en un intervalo de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 90 %, o en un intervalo de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 80 %, o en un intervalo de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 70 %. Así, un perfil de intensidad deseado particular del haz de excitación a lo largo de la dimensión horizontal puede "marcarse" digitalmente por medio de la variación de las potencias eléctricas asociadas con las diferentes señales de activación aplicadas al deflector acústico-óptico.

Como se analiza con más detalle a continuación, en algunas realizaciones, dicha variación de intensidad permite una mayor excitación de las partículas (p. ej., células) que fluyen a través de los bordes del haz de excitación para contrarrestar la menor eficacia de recogida de radiación (p. ej., emisión de fluorescencia) que proviene de esas partículas en respuesta a la excitación para detectar una respuesta óptica sustancialmente uniforme de las partículas equivalentes iluminadas en una mayor extensión espacial en la célula de flujo de lo que es posible usando un punto láser de excitación de perfil plano o gaussiano convencional.

En referencia de nuevo a la figura 1, en esta realización, el haz 24 de excitación es enfocado por la lente 22 convergente en una célula 26 de flujo para iluminar una pluralidad de partículas que fluyen a través de la célula. En esta realización ejemplar, se supone que las partículas fluyen fuera del plano de la figura a lo largo de una dirección vertical. Las partículas iluminadas pueden emitir radiación (p. ej., a través de fluorescencia y/o dispersión), que puede detectarse y analizarse, como se analiza con más detalle a continuación.

En esta realización, se enfoca la radiación de dispersión frontal con una lente 28 hacia un fotodetector 30 y se detecta. El haz de excitación que atraviesa la célula de flujo sin dispersión es capturado por un tope 34 de haz. Se coloca un filtro 32 de paso de banda frente al fotodetector 30 para permitir la transmisión de la longitud de onda del láser de excitación y rechazar otras longitudes de onda. Un analizador 36 puede recibir las señales generadas por el fotodetector 30 y puede procesar esas señales para generar, por ejemplo, una señal de dispersión frontal de la muestra.

En una dirección ortogonal a la dirección de dispersión frontal, la radiación que proviene de las partículas (p. ej., radiación fluorescente y/o dispersada) puede recogerse con una lente 38 objetivo y se enfoca por medio de una lente 40 hacia una fibra 42 óptica multimodo, que se extiende desde un extremo proximal (PE) hasta un extremo distal (DE). Más específicamente, el extremo proximal (PE) de la fibra 42 óptica se coloca en la proximidad del plano focal de la lente 40 para recibir eficazmente la radiación (p. ej., radiación dispersa y/o fluorescente). Una lente 44 de acoplamiento de salida, acoplada al extremo distal (DE) de la fibra 42 óptica, colima la radiación que sale de la fibra.

La radiación colimada luego se detecta por una pluralidad de tubos 46, 48, 50 y 52 fotomultiplicadores. Más específicamente, un espejo 54 dicroico refleja una porción de la radiación en el tubo 46 fotomultiplicador y permite el paso de otra porción de la radiación a un espejo 56 dicroico en una fase posterior, que a su vez refleja una porción de la radiación recibida en el fotomultiplicador 50 y permite el paso de otra porción de la radiación a otro espejo 58 dicroico, que a su vez refleja una porción de la radiación recibida sobre el fotomultiplicador 48 y permite el paso del resto de la radiación al tubo 53 fotomultiplicador. En esta realización, se colocan una pluralidad de filtros 46a, 48a, 50a y 52a de paso de banda respectivamente, delante de los fotomultiplicadores 46, 48, 50 y 52.

Los filtros de paso de banda se pueden seleccionar para una variedad de propósitos diferentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, por lo menos uno de los filtros de paso de banda puede permitir la transmisión de la longitud de onda de excitación del láser mientras rechaza otras longitudes de onda para facilitar la obtención de una señal de dispersión lateral de la muestra. Además, en algunas realizaciones, uno o más de los filtros de paso de banda se pueden seleccionar para permitir el paso de la radiación fluorescente por un fluoróforo mientras bloquea sustancialmente otra radiación. En algunos casos, se usan diferentes filtros de paso de banda, cada uno de los cuales permite la transmisión de radiación fluorescente correspondiente a un fluoróforo diferente, para permitir la detección simultánea de radiación fluorescente emitida por una pluralidad de fluoróforos asociados con una muestra que fluye a través de la célula de flujo. Los tubos 46, 48, 50 y 52 fotomultiplicadores generan señales en respuesta a la detección de la radiación incidente sobre los mismos. El analizador 36 recibe estas señales y las procesa para generar, por ejemplo, datos de dispersión lateral y/o fluorescencia de la muestra. Estos datos se pueden crear, por ejemplo, analizando la altura, la anchura y el área de los pulsos electrónicos emitidos por cada tubo fotomultiplicador.

A modo de ejemplo, el haz de excitación puede excitar uno o más fluoróforos asociados con una muestra que fluye a través de la célula de flujo. La muestra puede incluir, por ejemplo, un fluido que fluye en el que se arrastran una pluralidad de células. En algunos casos, las células se pueden marcar con uno o más marcadores fluorescentes (fluoróforos). Algunos ejemplos de marcadores fluorescentes incluyen, sin limitación, proteínas fluorescentes (p. ej., GFP, YFP, RFP), anticuerpos marcados con fluoróforos (p. ej., isotiocianato de fluoresceína) (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC)), tinciones de ácido nucleico (p. ej., 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), SYTO16, yoduro de propidio (Pl)), tinciones de membrana celular (p. ej., FMl-43) y colorantes de funciones celulares (p. ej., Fluo-4, lndo-1). En otros casos, pueden emplearse fluoróforos endógenos presentes en las células para provocar la radiación fluorescente de las células. Dichos fluoróforos exógenos o endógenos se someten a excitación electrónica en respuesta a la radiación de iluminación y emiten radiación fluorescente (típicamente a una frecuencia más baja que la frecuencia de excitación), que se recoge y analiza.

Como se indica anteriormente, en esta realización, el haz de excitación presenta una variación de intensidad a lo largo de su dimensión horizontal caracterizada por una mayor intensidad en los bordes y una menor intensidad en el centro del haz. En consecuencia, las partículas que atraviesan diferentes porciones del haz de excitación están expuestas a diferentes intensidades de excitación. Por ejemplo, como se muestra esquemáticamente en la figura 5, una partícula A (p. ej., una célula) que atraviesa un borde horizontal del haz está expuesta a una intensidad de radiación más alta que una partícula B que atraviesa el centro del haz. En algunas realizaciones, dicha variación de intensidad se puede diseñar para compensar sustancialmente una eficacia de recogida más baja, por ejemplo, en la dirección ortogonal (que también se describe en algunos casos como una "geometría de recogida de 90 grados"), asociada con la radiación que proviene de las partículas que atraviesan los bordes del haz de excitación, en lugar de su centro. Además, en algunos casos, dicha variación de intensidad puede mejorar la excitación desigual de las partículas a causa de, por ejemplo, una menor intensidad del haz en los bordes del haz. Por ejemplo, en un sistema convencional en el que el haz de excitación muestra una distribución de intensidad gaussiana en la dirección horizontal, las partículas que atraviesan los bordes horizontales del haz están expuestas a una intensidad de radiación más baja. Esto, a su vez, puede dar como resultado una menor intensidad de la radiación (p. ej., radiación dispersa y/o de fluorescencia) que proviene de dichas partículas en respuesta a la interacción con el haz de excitación. Además, la eficacia de la recogida de la radiación que proviene de las partículas es en general desigual y se caracteriza por una menor eficacia de recogida de la radiación que proviene de aquellas partículas que atraviesan los bordes del haz. Estos factores pueden dar como resultado una sensibilidad óptica desigual en función de la ubicación horizontal (en la presente memoria denominada posición z) en la que una partícula atraviesa el haz.

A modo de ejemplo, la figura 6A muestra esquemáticamente un gráfico que representa una intensidad hipotética de radiación detectada a partir de partículas que atraviesan un haz de excitación caracterizado por una distribución de intensidad gaussiana a lo largo de la dirección horizontal en función de las ubicaciones horizontales de las partículas a lo largo del haz. El gráfico muestra una sensibilidad óptica no uniforme caracterizada por una mayor sensibilidad para las partículas que atraviesan el centro del haz en relación con las que atraviesan los bordes horizontales del haz. Por el contrario, la figura 6B presenta una intensidad hipotética de radiación detectada a partir de partículas después de ajustar la intensidad del haz de excitación usando, por ejemplo, un peine de RF como se muestra en la figura 2. La figura 6B representa una sensibilidad óptica sustancialmente uniforme en función de las posiciones de excitación horizontal de las partículas. En particular, la mayor intensidad en los bordes horizontales del haz puede compensar la menor eficacia de detección para detectar la radiación que proviene de aquellas partículas que atraviesan los bordes horizontales del haz. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la sensibilidad de detección óptica puede variar en menos de aproximadamente un 0,1 % para partículas equivalentes que atraviesan diferentes porciones del haz de excitación.

En algunas realizaciones, en lugar de usar una fibra óptica multimodo en el brazo de detección ortogonal, se puede usar la propagación por el espacio libre de la radiación que proviene de una muestra para dirigir la radiación a los tubos fotomultiplicadores. A modo de ejemplo, la figura 7 representa esquemáticamente un sistema 10' de citometría de flujo según una realización que es similar al sistema 10 de citometría de flujo analizado anteriormente excepto que emplea detección óptica por el espacio libre de la radiación que proviene de la muestra en la dirección ortogonal. Más específicamente, en esta realización, la lente 38 objetivo recoge la radiación (p. ej., fluorescencia y/o radiación dispersa) que proviene de una muestra que atraviesa el haz de excitación y una lente 100 enfoca el haz por medio del reflejo de un espejo 102 hacia un orificio 104. Un haz que sale del orificio es colimado por una lente 106 y el haz colimado se dirige a los tubos 46, 48, 50 y 52 fotomultiplicadores de la forma que se analiza anteriormente. De manera similar a las realizaciones anteriores, la radiación de dispersión frontal se puede enfocar con la lente 28 en el fotodetector 30. El analizador 36 puede recibir las señales generadas por el fotodetector 30 y los tubos 46, 48, 50 y 52 fotomultiplicadores y analizar esas señales como se analiza anteriormente.

En otro aspecto, las señales de activación de RF aplicadas al deflector acústico-óptico se pueden ajustar para variar la extensión horizontal (anchura) del haz de excitación. A modo de ejemplo, el controlador 20 puede cambiar el número de señales de activación aplicadas al deflector acústico-óptico para ampliar o acortar la extensión horizontal del haz. Usando un peine de frecuencia de RF de anchura variable para excitar una corriente de núcleo de muestra a diferentes caudales, el haz de excitación (el punto láser) se puede concentrar en el núcleo de muestra sin desperdiciar potencia de láser extendiéndolo sobre un área más grande para admitir caudales de muestra altos y núcleos de muestra más grandes, tal como se hace en los sistemas convencionales.

A modo de ilustración, la figura 8A muestra un haz 200 de excitación (en la presente memoria también denominado punto láser) generado mediante la aplicación de tres señales de activación de RF (representadas esquemáticamente en la figura 8B) al deflector 16 acústico-óptico. La anchura del punto láser es relativamente pequeña y, por lo tanto, es adecuada para iluminar una corriente de muestra de núcleo relativamente estrecho, por ejemplo, una corriente de muestra de núcleo que fluye con un caudal de muestra relativamente lento, por ejemplo, una tasa de un intervalo de aproximadamente 1 microlitro por minuto a aproximadamente 10 microlitros por minuto con una extensión espacial de aproximadamente 2 micrómetros de diámetro a aproximadamente 10 micrómetros de diámetro.

Por el contrario, la figura 9A muestra un punto 300 láser generado por la aplicación simultánea de seis señales de activación de RF, como se muestra esquemáticamente en la figura 9B, al deflector acústico-óptico, dando como resultado un punto láser más ancho (es decir, un haz de excitación que tiene una extensión horizontal más grande). Este haz láser es más adecuado para iluminar una corriente de muestra de núcleo más amplia, por ejemplo, una corriente de muestra de núcleo asociada con un caudal medio de una muestra a través de la célula de flujo, por ejemplo, un caudal en un intervalo de aproximadamente 10 microlitros por minuto a aproximadamente 50 microlitros por minuto. La figura 10A muestra una corriente de núcleo asociada con un caudal de muestra alto, por ejemplo, un caudal en un intervalo de aproximadamente 50 microlitros por minuto a aproximadamente 1.000 microlitros por minuto, y que tiene una anchura mayor. En estos casos, se genera un punto 400 láser para iluminar la corriente de núcleo mediante la aplicación de once señales de activación de RF (que se muestran esquemáticamente en la figura 10B) al deflector 16 acústico-óptico, por lo que tiene una mayor extensión horizontal que coincide más estrechamente con la anchura de la corriente de muestra.

De esta manera, el uso de las señales de activación para ajustar el tamaño del haz de excitación, y en particular su extensión horizontal, permite adaptar el haz de excitación a diferentes caudales de la muestra a través de la célula de flujo. En algunas realizaciones, la anchura del haz de excitación se puede variar en por lo menos aproximadamente el 1.000 % (es decir, un cambio de 10 veces desde la más pequeña a la más grande), por ejemplo, en un intervalo de aproximadamente el 200 % a aproximadamente el 500 %. Esta iluminación adaptativa permite el uso de láseres de menor potencia para lograr intensidades de iluminación más altas en corrientes de núcleo de muestra más pequeñas cuando se desee, con lo que se reduce el requisito para láseres de alta potencia en citómetros de flujo según realizaciones de las presentes enseñanzas.

Además, en cada uno de estos ejemplos, las potencias de las señales de activación de RF aplicadas se pueden ajustar de la forma que se analiza anteriormente para modular la intensidad del haz de excitación de modo que tenga una mayor intensidad en sus bordes horizontales con respecto a su centro.

En otro aspecto, las señales de activación de RF se pueden usar para ajustar la posición espacial del punto de excitación del láser para rastrear la corriente de núcleo de muestra. Por ejemplo, en referencia a cualquiera de la figura 1 o 7, si una corriente de núcleo de muestra tiene una deriva espacialmente con el tiempo a medida que fluye a través de la célula de flujo, el analizador 36 puede detectar dichas derivas a través, por ejemplo, de una pérdida de sensibilidad o resolución de fluorescencia. En dicho caso, el controlador 20 puede recibir una señal del analizador indicativa de la deriva de la corriente de núcleo. El controlador, a su vez, puede hacer que el generador de RF ajuste la frecuencia absoluta de las señales de activación, por ejemplo, ajustando digitalmente las frecuencias directamente o escaneando la frecuencia de reloj del generador de peine de RF, para mover espacialmente los minihaces y, por lo tanto, el punto láser de excitación para rastrear la corriente de núcleo de muestra.

En referencia a las figuras 1 y 7, el controlador 20 y el analizador 36 pueden implementarse en una variedad de formas diferentes usando componentes y técnicas conocidas. Por ejemplo, cualquiera de los controladores y analizadores puede implementarse en hardware, firmware y/o software usando técnicas conocidas en la técnica y según las presentes enseñanzas. A modo de ejemplo, la figura 11 representa esquemáticamente dicha implementación del analizador 36 en la que un convertidor 400 analógico-digital recibe la(s) señal(es) generada(s) por el fotodetector 30 y/o uno o más de los tubos 46, 48, 50 y 52 fotomultiplicadores. La(s) señal(es) se pueden almacenar, por ejemplo, en una memoria 402 permanente. Una unidad 404 central de procesamiento (CPU) puede controlar el funcionamiento del analizador. El analizador también incluye ROM 406 (memoria de solo lectura) y RAM 408 (memoria de acceso aleatorio). Un bus 410 de comunicaciones facilita la comunicación entre diversos componentes del analizador, incluidas las comunicaciones entre la CPU 404 y otros componentes. Los módulos de memoria se pueden usar para almacenar instrucciones para analizar las señales recibidas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las instrucciones para procesar los datos recibidos pueden almacenarse en la ROM 406. La CPU puede emplear esas instrucciones para operar sobre las señales digitalizadas recibidas para generar, por ejemplo, mediciones de altura, anchura y área para las señales detectadas de la muestra. La CPU puede proporcionar el almacenamiento de señal(es) procesada(s) en la memoria 402 permanente. Además, en algunas realizaciones, se puede emplear una matriz de puertas programable in-situ (FPGA), en lugar de una CPU, para realizar estos cálculos.

A modo de ilustración adicional, la figura 12 representa esquemáticamente una implementación ejemplar del controlador 20. En esta implementación, el controlador 20 incluye una interfaz 500 de comunicaciones para comunicarse con el generador 18 de RF para enviar comandos al generador y recibir datos del mismo. El controlador también puede comunicarse con el analizador a través de la interfaz de comunicaciones. A modo de ejemplo, como se analiza anteriormente, en algunos casos el controlador puede recibir instrucciones del analizador, en respuesta a variaciones en la intensidad de la radiación de fluorescencia detectada de una muestra, para hacer que el generador de RF varíe las señales de activación para mover espacialmente el punto láser, rastreando así la corriente de muestra.

El controlador 20 incluye además una unidad 502 central de procesamiento (CPU) controla el funcionamiento del controlador, la RAM 504, la ROM 506 y la memoria 508 permanente. Un bus 510 de comunicaciones facilita la comunicación entre diferentes componentes del controlador. En esta implementación, el controlador incluye además una interfaz 512 gráfica de usuario (GUI) que permite que un usuario interactúe con el controlador, por ejemplo, para configurar el controlador para dar instrucciones al generador de RF para que aplique un patrón deseado de señales de activación al deflector acústico-óptico. En algunas realizaciones, los datos de instrucciones para la realización de determinadas tareas por parte del controlador, por ejemplo, dar instrucciones al analizador para que varíe la señal de activación en respuesta a cambios en la intensidad de fluorescencia, pueden almacenarse en la ROM 506, a la que puede acceder la CPU.

En otro aspecto, se divulgan procedimientos y sistemas que emplean codificación de frecuencia de batido de las posiciones de las partículas a media que interactúan con un haz de excitación láser. Dicha codificación de frecuencia de las posiciones de las partículas se puede usar junto con peines de frecuencia de RF ecualizados para permitir, por ejemplo, la ecualización de señales de dispersión frontal.

A modo de ejemplo, la figura 13 representa esquemáticamente un sistema 600 de citometría de flujo según otra realización de las presentes enseñanzas, que incluye un láser 601 para generar un haz de radiación láser LB, que es recibido por un deflector 604 acústico-óptico por medio del reflejo de un espejo 602. Un generador 606 de peine de RF que funciona bajo el control de un controlador 608 puede aplicar señales de activación de RF al deflector acústicoóptico. Como en las realizaciones anteriores, el generador 606 de RF puede aplicar simultáneamente una pluralidad de señales de activación de RF al deflector acústico-óptico para generar una pluralidad de minihaces, por ejemplo, cada uno correspondiente al orden de difracción -1 de la interacción del haz láser con las oscilaciones de radiofrecuencia generadas por una de las señales de activación.

La figura 14A representa esquemáticamente dicha pluralidad de minihaces B1, ..., B9, que se superponen parcialmente en el espacio, y forman colectivamente un haz 610 de excitación láser (mostrado en la figura 13). De manera similar a las realizaciones anteriores, las potencias de las señales de activación de RF se pueden ajustar para transmitir una variación de intensidad a través de los minihaces que forman el haz de excitación. A modo de ejemplo, en esta realización, las señales de activación de RF pueden tener una variación en la potencia de RF que se muestra esquemáticamente en la figura 10B analizada anteriormente en relación con la realización anterior, que puede dar como resultado una variación de intensidad a través del haz de excitación láser a lo largo de la dimensión horizontal.

Cada minihaz B1, ..., B9 tiene una frecuencia óptica que se desplaza con respecto a la frecuencia óptica del haz de excitación LB por la frecuencia de la señal de activación asociada con ese minihaz. Así, los minihaces B1, ..., B9 pueden tener frecuencias ópticas f¹, ..., f9, respectivamente, cada uno de los cuales se desplaza por el espaciamiento del peine de RF en relación con la frecuencia (fü) del haz láser LB. Así, los minihaces B1, ..., B9 se desplazan en frecuencia entre sí por el espaciamiento de frecuencias del peine de RF, por ejemplo, un desplazamiento de frecuencia en un intervalo de aproximadamente 10 MHz a aproximadamente 250 MHz, por ejemplo, en un intervalo de aproximadamente 50 MHz a aproximadamente 150 MHz, o en un intervalo de aproximadamente 0,1 MHz a aproximadamente 4 MHz. En este caso, el desplazamiento de frecuencia óptica máximo entre los minihaces es f9 - f¹.

Un divisor de haz 612 recibe el haz 610 de excitación compuesto por la pluralidad de minihaces B1, ..., B9 y divide el haz en dos haces 611 y 612 de propagación, cada uno de los cuales es una copia del haz 612 a una intensidad menor. Como se muestra en las figuras 14B y 14C, cada uno de los minihaces 611 y 612 incluyen, respectivamente, una pluralidad de minihaces C1, ..., C9 y D1, ..., D9, cada uno de los cuales muestra una variación de intensidad a lo largo de la dimensión horizontal correspondiente a la de los minihaces B1, ..., B9. Además, los minihaces C1, ..., C9 y D1, ..., D9 tienen frecuencias ópticas f ¹, ..., f9, correspondientes a las frecuencias ópticas de los minihaces B1, ..., B9.

El haz 612 es reflejado por un espejo 614 y es recibido por un prisma 616 de paloma. El paso del haz 612 a través del prisma 616 de paloma da como resultado una inversión horizontal del haz. En otras palabras, el prisma 616 de paloma invierte horizontalmente el haz 612 para generar un haz 618 invertido horizontalmente en el que el orden de los minihaces D1, ..., D9 se invierte espacialmente, como se muestra en la figura 14D, de modo que el minihaz D9 forma el borde horizontal izquierdo del haz 618 invertido y el minihaz D1 forma el borde derecho del haz invertido. El haz 618 invertido se propaga a un combinador 620 de haz óptico, que combina el haz 618 invertido con el haz 611, como se analiza a continuación.

En particular, el haz 611 se propaga a un espejo 622, que refleja el haz 611 al combinador 620 de haz óptico. El haz 611 es reflejado por el combinador 620 de haz óptico para superponerse al haz 611 invertido que atraviesa el combinador 620 de haz para formar un haz 624 de excitación combinado. El combinador de haz está configurado de modo que los haces 611 y 618 se superponen entre sí, de modo que los minihaces que forman los dos haces están sustancialmente alineados por pares en el haz 624 de excitación combinado. Más específicamente, en el haz 624 de excitación combinado, los minihaces D9, D8, D7, D6, D5, D4, D3, D2 y D1 se superponen, respectivamente, a los minihaces C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 y C9.

Una lente 626 convergente enfocó el haz de excitación combinado en una célula 628 de flujo para excitar una pluralidad de partículas (p. ej., células) que fluyen a través de la célula. La radiación que proviene de las partículas en respuesta al haz de excitación (p. ej., radiación dispersa y/o de fluorescencia) puede recogerse y analizarse, como se analiza con más detalle a continuación.

Cuando una partícula atraviesa una porción del haz de excitación formado por la superposición de dos minihaces, queda expuesta a una superposición de sus campos eléctricos. Así, la radiación emitida por la partícula presenta una frecuencia de batido correspondiente a una diferencia entre las frecuencias ópticas de esos minihaces. A modo de ejemplo y en referencia a la figura 15, la radiación emitida por una partícula A que atraviesa el borde horizontal izquierdo del haz de excitación, que se forma por medio de una superposición de los minihaces D9 y C1, presentaría una frecuencia de batido correspondiente a la diferencia entre las frecuencias de los minihaces D9 y C1, es decir, una frecuencia de batido de f^g - f¹.

La radiación emitida por otra partícula B que atraviesa el centro del haz de excitación formado por una superposición de los minihaces D5 y C5 presentaría una frecuencia de batido de fuga, ya que las frecuencias de D5 y C5 son idénticas. De esta manera, las posiciones de las partículas que atraviesan el haz de excitación pueden codificarse por medio de las frecuencias de batido de RF asociadas con la radiación emitida por esas partículas. Como se analiza con más detalle a continuación, en algunas realizaciones, dicha codificación de las posiciones de las partículas se puede usar para normalizar la intensidad de la radiación detectada emitida por esas partículas en relación con la variación de la intensidad del haz, por ejemplo, en su dirección horizontal.

Similar a la realización anterior, en esta realización, la intensidad del haz de excitación varía a lo largo de su dimensión horizontal con una intensidad máxima en sus bordes horizontales y una intensidad mínima en su centro. Esta variación de la intensidad puede compensar, por ejemplo, la menor eficacia de detección de la radiación emitida por aquellas partículas que atraviesan los bordes horizontales del haz de excitación.

En referencia de nuevo a la figura 13, la radiación dispersada por las partículas en la dirección frontal, en respuesta a su interacción con el haz de excitación, es enfocada por una lente 630 hacia un fotodetector 632. Un filtro 634 de paso de banda dispuesto frente al fotodetector 632 permite la transmisión de la longitud de onda de excitación mientras bloquea las longitudes de onda no deseadas.

La radiación emitida por las partículas (p. ej., radiación dispersa y/o de fluorescencia) en una dirección ortogonal a la dirección frontal por una lente 636 objetivo y es enfocada por una lente convergente 638 hacia un extremo proximal (PE) de una fibra 640 óptica multimodo. Una lente 642 de acoplamiento de salida colima la radiación que sale de la fibra 640 óptica y una pluralidad de espejos 644, 646 y 648 dicroicos distribuyen la radiación colimada hacia una pluralidad de tubos 650, 652, 654 y 656 fotomultiplicadores de la forma que se analiza anteriormente en relación con la realización anterior. Además, de manera similar a la realización anterior, una pluralidad de filtros 650a, 652a, 654a y 656a de paso de banda están dispuestos delante de los tubos 650, 652, 654 y 656 fotomultiplicadores, respectivamente. Los filtros de paso de banda se pueden seleccionar para permitir el paso de longitudes de onda de radiación específicas a los fotomultiplicadores mientras se bloquean otras longitudes de onda.

Un analizador 660 recibe las señales generadas por el fotodetector 632 y los fotomultiplicadores 650, 652, 654 y 656. El analizador puede decodificar la codificación RF de estas señales determinando el contenido de frecuencia de las señales detectadas. Se puede usar una variedad de procedimientos para determinar el contenido de frecuencia de las señales detectadas. Algunos ejemplos de dichos procedimientos adecuados incluyen, sin limitación, transformada de Fourier, detección de bloqueo, filtrado, demodulación I/Q, detección homodina y detección heterodina.

A modo de ejemplo, se puede digitalizar una señal detectada (p. ej., una señal detectada por el fotodetector o uno de los fotomultiplicadores) y se puede seleccionar una porción apropiada de la señal digitalizada para su análisis. Se puede realizar una transformada rápida de Fourier (FFT) de los datos seleccionados para determinar los componentes de frecuencia de la señal detectada. En algunas de dichas realizaciones, los contenedores de la FFT pueden corresponder a las frecuencias elegidas para la adquisición de datos. Por ejemplo, para una frecuencia de muestreo de 256 MHz, 256 muestras pueden producir contenedores de frecuencia que están separados entre sí por 1 MHz, por ejemplo, de CC a 128 MHz. El análisis FFT proporciona frecuencias correspondientes a las frecuencias de batido presentes en la señal detectada. Se puede calcular una medida de la amplitud de cada componente de frecuencia presente en los datos de FFT, por ejemplo, obteniendo la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de los componentes reales e imaginarios de ese componente de frecuencia.

Cada frecuencia de batido extraída de la señal detectada puede asociarse con radiación emitida por partículas que atraviesan una porción del haz formado por la superposición de dos minihaces que tienen una diferencia de frecuencia igual a esa frecuencia de batido. Como tal, cada componente de frecuencia de la señal detectada se puede correlacionar con una posición particular a lo largo del haz de excitación. Cuando las partículas que atraviesan la célula de flujo son idénticas, las variaciones en las amplitudes de las frecuencias de batido pueden ser indicativas de variaciones en la intensidad a lo largo del haz de excitación y/o diferencias en la eficacia del sistema de detección de radiación con respecto a la radiación emitida por las partículas que fluyen a través de diferentes porciones del haz. Como tal, las amplitudes de las frecuencias de batido se pueden usar para compensar computacionalmente dichas variaciones para calcular una señal de detección normalizada. Usando el conocimiento de la posición de la partícula codificada por la frecuencia de batido detectada en combinación con el conocimiento de la intensidad óptica del haz de excitación en esa posición, la intensidad de la señal detectada se puede normalizar al dividir la señal detectada por un factor de escala, por ejemplo, en una tabla de consulta de datos de normalización. Esta tabla de consulta se puede calibrar midiendo las intensidades de la señal de partículas de referencia homogéneas que fluyen a medida que fluyen por el haz en múltiples ubicaciones horizontales. De forma alternativa, una corriente de núcleo estrecho (p. ej., de menos de 5 micras de ancho) se puede escanear mecánicamente a través del haz moviendo la célula de flujo en relación con el haz de excitación, de modo que se conoce la posición lateral de las partículas que cruzan el haz de excitación, y las intensidades de la señal se pueden medir con fines de calibración.

El controlador y el analizador en esta realización pueden implementarse, por ejemplo, de la forma que se analiza anteriormente en relación con el controlador y el analizador en la realización anterior.

Sistemas controlados por ordenador

Los aspectos no reivindicados relacionados con la invención incluyen sistemas controlados por ordenador para poner en práctica los procedimientos de la materia, donde los sistemas incluyen además uno o más ordenadores para la automatización completa o parcial de un sistema para poner en práctica procedimientos descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, los sistemas incluyen un ordenador que tiene un medio de almacenamiento legible por ordenador con un programa de ordenador almacenado en el mismo, donde el programa de ordenador, cuando se carga en el ordenador, incluye instrucciones para irradiar con un láser mientras se aplican señales de activación de radiofrecuencia al dispositivo acústico-óptico para generar haces láser desviados angularmente y ajustar la amplitud de una o más de las señales de activación de radiofrecuencia para generar un haz láser de salida que comprende haces láser desviados angularmente con un perfil de intensidad predeterminado. Cada haz láser desviado angularmente en el haz láser de salida tiene una intensidad que se basa en la amplitud de cada señal de activación de radiofrecuencia aplicada.

El sistema puede incluir un módulo de entrada, un módulo de procesamiento y un módulo de salida. En algunas realizaciones, los sistemas de la materia pueden incluir un módulo de entrada de modo que los parámetros o información sobre el dispositivo acústico-óptico (p. ej., deflector acústico-óptico), el láser, la fuente de señales de activación de radiofrecuencia (p. ej., un sintetizador digital directo), la muestra, la intensidad y las longitudes de onda (discretas o en intervalos) de la fuente de luz aplicada, el diámetro de la célula de flujo, el número de canales de luz, el número de regiones de detección, la duración de la irradiación por la fuente de luz, el número de fuentes de luz diferentes, la distancia de la fuente de luz al canal de flujo, la distancia focal de cualquier componente de ajuste óptico, el índice de refracción del medio del canal de flujo (p. ej., el fluido de vaina), la presencia de cualquier separador de longitud de onda, las propiedades de los separadores de longitud de onda, incluido la anchura de paso de banda, la opacidad, el espaciado de rejilla, así como las propiedades y la sensibilidad de los fotodetectores

Después de que el módulo de procesamiento haya realizado una o más de las etapas de los procedimientos de la materia, un módulo de salida comunica los resultados al usuario, tal como visualizándolos en un monitor o imprimiendo un informe.

Los sistemas de la materia pueden incluir tanto componentes de hardware como de software, donde los componentes de hardware pueden adoptar la forma de una o más plataformas, por ejemplo, en forma de servidores, de modo que los elementos funcionales, es decir, aquellos elementos del sistema que llevan a cabo tareas específicas (tal como la gestión de entrada y salida de información, el procesamiento de información, etc.) del sistema pueden llevarse a cabo mediante la ejecución de aplicaciones de software en y a través de una o más plataformas informáticas representadas del sistema.

Los sistemas pueden incluir un visualizador y un dispositivo de entrada del operador. Los dispositivos de entrada del operador pueden ser, por ejemplo, un teclado, un ratón o similares. El módulo de procesamiento incluye un procesador que tiene acceso a una memoria que tiene instrucciones almacenadas en la misma para realizar las etapas de los procedimientos de la materia, tal como irradiar con un láser mientras se aplican señales de activación de radiofrecuencia al dispositivo acústico-óptico para generar haces láser desviados angularmente y ajustar la amplitud de una o más de las señales de activación de radiofrecuencia para generar un haz láser de salida que comprende haces láser desviados angularmente con un perfil de intensidad predeterminado.

El módulo de procesamiento puede incluir un sistema operativo, un controlador de interfaz gráfica de usuario (GUI), una memoria del sistema, dispositivos de almacenamiento de memoria y controladores de entrada y salida, memoria caché, una unidad de datos de seguridad y muchos otros dispositivos. El procesador puede ser un procesador disponible comercialmente o puede ser uno de los otros procesadores que están o estarán disponibles. El procesador ejecuta el sistema operativo y las interfaces del sistema operativo con el firmware y el hardware de una manera bien conocida, y facilita al procesador la coordinación y ejecución de las funciones de diversos programas de ordenador que pueden estar escritos en una variedad de lenguajes de programación, tal como Java. , Perl, C++, otros lenguajes de alto nivel o bajo nivel, así como combinaciones de los mismos, tal como se conoce en la técnica. El sistema operativo, típicamente en cooperación con el procesador, coordina y ejecuta funciones de los otros componentes del ordenador. El sistema operativo también proporciona programación, control de entrada-salida, gestión de archivos y datos, gestión de memoria y control de comunicaciones y servicios relacionados, todo ello según técnicas conocidas.

La memoria del sistema puede ser cualquiera de una variedad de dispositivos de almacenamiento de memoria conocidos o futuros. Los ejemplos incluyen cualquier memoria de acceso aleatorio (RAM) comúnmente disponible, medio magnético tal como un disco duro residente o una cinta, un medio óptico como un disco compacto de lectura y escritura, dispositivos de memoria flash u otro dispositivo de almacenamiento de memoria. El dispositivo de almacenamiento de memoria puede ser cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos o futuros, que incluyen una unidad de disco compacto, una unidad de cinta, una unidad de disco duro extraíble o una unidad de disco flexible. Dichos tipos de dispositivos de almacenamiento de memoria típicamente leen y/o escriben en un medio de almacenamiento de programas (no se muestra) tal como, respectivamente, un disco compacto, una cinta magnética, un disco duro extraíble o un disco flexible. Cualquiera de estos medios de almacenamiento de programas, u otros actualmente en uso o que puedan desarrollarse más adelante, pueden considerarse un producto de programa de ordenador. Como se apreciará, estos medios de almacenamiento de programas típicamente almacenan un programa y/o datos de software de ordenador. Los programas de software de ordenador, también denominados lógica de control informático, típicamente se almacenan en la memoria del sistema y/o en el dispositivo de almacenamiento de programas usado junto con el dispositivo de almacenamiento de memoria.

Se describe un producto de programa de ordenador que comprende un medio usable por ordenador que tiene una lógica de control (programa de software de ordenador, que incluye el código de programa) almacenado en el mismo. La lógica de control, cuando es ejecutada por el procesador el ordenador, hace que el procesador realice las funciones descritas en la presente memoria. En otras realizaciones, algunas funciones se implementan principalmente en hardware usando, por ejemplo, una máquina de estados de hardware. La implementación de la máquina de estados de hardware para realizar las funciones descritas en la presente memoria será evidente para los expertos en las materias pertinentes.

La memoria puede ser cualquier dispositivo adecuado en el que el procesador pueda almacenar y recuperar datos, tal como dispositivos de almacenamiento magnéticos, ópticos o de estado sólido (incluidos discos magnéticos u ópticos, cinta o RAM, o cualquier otro dispositivo adecuado, ya sea fijo o portátil). El procesador puede incluir un microprocesador digital de propósito general adecuadamente programado a partir de un medio legible por ordenador que lleve el código de programa necesario. La programación se puede proporcionar de forma remota al procesador a través de un canal de comunicación, o se puede guardar previamente en un producto de programa de ordenador, tal como una memoria o algún otro medio de almacenamiento portátil o fijo legible por ordenador usando cualquiera de esos dispositivos en conexión con la memoria. Por ejemplo, un disco magnético u óptico puede llevar la programación y puede ser leído por un escritor/lector de disco. Los sistemas de la invención también incluyen algoritmos de programación, por ejemplo, en forma de productos de programas de ordenador, para su uso en la práctica de los procedimientos como se describen anteriormente. La programación según la presente invención puede grabarse en medios legibles por ordenador, por ejemplo, cualquier medio que un ordenador pueda leer y acceder directamente. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a: medios de almacenamiento magnético, tal como discos flexibles, medios de almacenamiento en disco duro y cinta magnética; medios de almacenamiento óptico tal como CD-ROM; medios de almacenamiento eléctrico tal como RAM y ROM; unidad de memoria flash portátil; e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos.

El procesador también puede tener acceso a un canal de comunicación para comunicarse con un usuario en una ubicación remota. Por ubicación remota se entiende que el usuario no está directamente en contacto con el sistema y retransmite información de entrada a un gestor de entrada desde un dispositivo externo, tal como un ordenador conectado a una red de área amplia ("WAN"), red telefónica, red satelital, o cualquier otro canal de comunicación adecuado, incluido un teléfono móvil (es decir, un teléfono inteligente).

Los sistemas pueden configurarse para incluir una interfaz de comunicación. La interfaz de comunicación incluye un receptor y/o transmisor para comunicarse con una red y/u otro dispositivo. La interfaz de comunicación se puede configurar para comunicación por cable o inalámbrica, que incluyen, pero no se limitan a, comunicación por radiofrecuencia (RF) (p. ej., identificación por radiofrecuencia (RFID), protocolos de comunicación Zigbee, WiFi, infrarrojos, bus serie universal inalámbrico (USB), banda ultraancha (UWB), protocolos de comunicación Bluetooth® y comunicación celular, tal como el acceso múltiple por división de código (CDMA) o Sistema Mundial para Comunicaciones Móviles (GSM).

De forma alternativa, la interfaz de comunicación está configurada para incluir uno o más puertos de comunicación, por ejemplo, puertos físicos o interfaces tales como un puerto USB, un puerto RS-232 o cualquier otro puerto de conexión eléctrica adecuado para permitir la comunicación de datos entre los sistemas de la materia y otros dispositivos externos tal como una terminal de ordenador (por ejemplo, en el consultorio de un médico o en un entorno hospitalario) que está configurada para una comunicación de datos complementaria similar.

De forma alternativa, la interfaz de comunicación está configurada para comunicación por infrarrojos, comunicación Bluetooth® o cualquier otro protocolo de comunicación inalámbrico adecuado para permitir que los sistemas de la materia se comuniquen con otros dispositivos tales como terminales y/o redes informáticas, teléfonos móviles habilitados para comunicación, asistentes personales digitales, o cualquier otro dispositivo de comunicación que el usuario pueda usar conjuntamente con el mismo, en la gestión del tratamiento de una condición de salud, tal como el VIH, el SIDA o la anemia.

De forma alternativa, la interfaz de comunicación está configurada para proporcionar una conexión para la transferencia de datos usando el protocolo de Internet (IP) a través de una red de telefonía celular, servicio de mensajes cortos (SMS), conexión inalámbrica a un ordenador personal (PC) en una red de área local (LAN) que está conectada a Internet, o una conexión WiFi a Internet en un punto de acceso WiFi.

Los sistemas de la materia pueden configurarse para comunicarse de forma inalámbrica con un dispositivo servidor a través de la interfaz de comunicación, por ejemplo, usando un estándar común tal como 802.11 o el protocolo de RF Bluetooth®, o un protocolo de infrarrojos lrDA. El dispositivo servidor puede ser otro dispositivo portátil, tal como un teléfono inteligente, un asistente personal digital (PDA) o un ordenador portátil; o un dispositivo más grande, tal como un ordenador de sobremesa, un electrodoméstico, etc. En algunas realizaciones, el dispositivo servidor tiene un visualizador, tal como un visualizador de cristal líquido (LCD), así como un dispositivo de entrada, tal como botones, un teclado, un ratón o una pantalla táctil.

De forma alternativa, la interfaz de comunicación está configurada para comunicar de forma automática o semiautomática los datos almacenados en los sistemas de la materia, por ejemplo, en una unidad de almacenamiento de datos opcional, con una red o un dispositivo servidor usando uno o más de los protocolos y/o mecanismos de comunicación descritos anteriormente.

Los controladores de salida pueden incluir controladores para cualquiera de una variedad de dispositivos de visualización conocidos para presentar información a un usuario, ya sea un ser humano o una máquina, ya sea local o remoto. Si uno de los dispositivos de visualización proporciona información visual, esta información típicamente puede organizarse lógica y/o físicamente como una matriz de elementos de imagen. Un controlador de interfaz gráfica de usuario (GUI) puede incluir cualquiera de una variedad de programas de software conocidos o futuros para proporcionar interfaces gráficas de entrada y salida entre el sistema y un usuario, y para procesar entradas de usuario. Los elementos funcionales del ordenador pueden comunicarse entre sí por medio de bus del sistema. Algunas de estas comunicaciones pueden lograrse en realizaciones alternativas usando la red u otros tipos de comunicaciones remotas. El gestor de salida también puede proporcionar información generada por el módulo de procesamiento a un usuario en una ubicación remota, por ejemplo, a través de Internet, teléfono o red satelital, según técnicas conocidas. La presentación de datos por parte del gestor de salida puede implementarse según una variedad de técnicas conocidas. Como algunos ejemplos, los datos pueden incluir documentos SQL, HTML o XML, correo electrónico u otros archivos, o datos en otras formas. Los datos pueden incluir direcciones URL de Internet para que un usuario pueda recuperar SQL, HTML, XML u otros documentos o datos adicionales de fuentes remotas. La una o más plataformas presentes en los sistemas de la materia pueden ser cualquier tipo de plataforma informática conocida o un tipo que se desarrollará en el futuro, aunque típicamente serán de una clase de ordenador denominado comúnmente como servidores. Sin embargo, también pueden ser un ordenador central, una estación de trabajo u otro tipo de ordenador. Pueden conectarse por medio de cualquier tipo de cableado conocido o futuro u otro sistema de comunicación, incluidos los sistemas inalámbricos, ya sea en red o de otro modo. Pueden estar ubicados en el mismo lugar o pueden estar separados físicamente. Pueden emplearse diversos sistemas operativos en cualquiera de las plataformas informáticas, dependiendo posiblemente del tipo y/o marca de la plataforma informática elegida. Los sistemas operativos apropiados incluyen Windows NT®, Windows XP, Windows 7, Windows 8, il)S, Sun Solaris, Linux, OS/400, Compaq Tru64 Unix, SGI IRIX, Siemens Reliant Unix y otros.

Kits

Los aspectos no reivindicados relacionados con la invención incluyen además kits, donde los kits incluyen una o más células de flujo configuradas para propagar una muestra en una corriente de flujo, un dispositivo acústico-óptico y un componente de ajuste óptico (p. ej., divisor de haz, inversor de haz como un prisma de paloma) como se describe en la presente memoria. Los kits pueden incluir además un láser. En determinados casos, los kits pueden incluir uno o más componentes de ensayo (p. ej., reactivos marcados, tampones, etc., tal como se describe anteriormente). En algunos casos, los kits pueden incluir además un dispositivo de recogida de muestras, por ejemplo, una lanza o aguja configurada para pinchar la piel para obtener una muestra de sangre completa, una pipeta, etc., según se desee. Los kits en cuestión también pueden incluir un contenedor de recogida de residuos.

Los kits pueden incluir una composición fluídica, tal como una composición de enzimas digestivas o una solución tampón. Los tampones de ejemplo pueden incluir, pero no se limitan a, tampón PBS (fosfato), tampón acetato, tampón de N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (bicina), tampón de ácido 3-{[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfónico (TAPS), tampón de 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), tampón de citrato, tampón de tris(hidroximetil)metilamina (Tris), tampón de N-tris(hidroximetil)metilglicina (tricina), tampón de ácido 3-[N-tris(hidroximetil)metilamino]-2-hidroxipropanosulfónico (TAPSO), tampón de ácido 4-2-hidroxietil-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), tampón de ácido 2-{[tris(hidroximetil)metil]amino}etanosulfónico (TES), tampón de piperazina-N, tampón de N'-bis(2-ácido etanosulfónico) (PIPES), tampón de ácido dimetilarsínico (cacodilato), tampón de citrato de sodio salino (SSC), tampón de ácido 2(R)-2-(metilamino)succínico (ácido succínico), tampón de fosfato de potasio, tampón de ácido N-ciclohexil-2-aminoetanosulfónico (CHES), entre otros tipos de soluciones tampón. En determinados casos, la composición fluídica es una solución clasificada con citómetro.

Los kits pueden incluir una composición del reactivo de mareaje. Por ejemplo, la composición del reactivo de mareaje puede ser un fluoróforo, cromóforo, enzima, marcador redox, marcadores radiactivos, marcador acústico, etiqueta Raman (SERS), etiqueta de masa, etiqueta de isótopo, partícula magnética, micropartícula o nanopartícula o una combinación de los mismos. En algunos casos, el reactivo de marcado incluye una biomolécula marcada, tal como un polipéptido, un ácido nucleico y un polisacárido que está marcado con un fluoróforo, cromóforo, enzima, marcador redox, marcadores radiactivos, marcador acústico, etiqueta Raman (SERS), etiqueta de masa, etiqueta de isótopo, partícula magnética, micropartícula o nanopartícula o una combinación de los mismos.

Los diversos componentes de ensayo de los kits pueden estar presentes en recipientes separados, o algunos o todos ellos pueden estar combinarse previamente. Por ejemplo, en algunos casos, uno o más componentes del kit, por ejemplo, cada detector está presente en una bolsa sellada, por ejemplo, una bolsa o sobre de lámina estéril.

Además de los componentes anteriores, los kits de la materia pueden incluir además (en determinadas realizaciones) instrucciones para poner en práctica los procedimientos de la materia. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits de la materia en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una pieza o piezas de papel en las que se imprime la información, en el embalaje del kit, en un prospecto de embalaje y similares. Otra forma más de estas instrucciones es un medio legible por ordenador, por ejemplo, disco flexible, disco compacto (CD), unidad de memoria flash portátil y similares, en los que se ha grabado la información. Aún otra forma más de estas instrucciones que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede usarse por medio de Internet para acceder a la información en un sitio eliminado.

Utilidad

El procedimiento y el sistema encuentran uso en una variedad de aplicaciones donde se desea analizar y clasificar componentes de partículas en una muestra en un medio fluido, tal como una muestra biológica. Las realizaciones de la invención encuentran uso cuando se desea proporcionar un análisis mejorado de la composición de la muestra, precisión en la clasificación de células y detección mejorada de subpartículas.

Las realizaciones de la invención también encuentran uso en aplicaciones en las que pueden desearse células preparadas a partir de una muestra biológica para investigación, ensayos de laboratorio o para su uso en terapia. En algunas realizaciones, los procedimientos y dispositivos de la materia pueden facilitar la obtención de células individuales preparadas a partir de una muestra biológica diana de tejido o fluido. Por ejemplo, los procedimientos y sistemas de la materia facilitan la obtención de células a partir de muestras de tejido o fluido para usarlas como espécimen de investigación o diagnóstico para enfermedades tales como el cáncer. Asimismo, los procedimientos y sistemas de la materia pueden facilitar la obtención de células a partir de muestras de tejido o fluido para su uso en terapia. Los procedimientos y dispositivos de la presente divulgación permiten detectar y recoger células de una muestra biológica (p. ej., órgano, tejido, fragmento de tejido, fluido) con mayor eficacia y bajo coste en comparación con los sistemas de citometría de flujo tradicionales.

Aunque la invención anterior se ha descrito con bastante detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad de comprensión, es evidente para los expertos en la materia a la luz de las enseñanzas de esta divulgación que se pueden realizar determinados cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

En consecuencia, los párrafos anteriores meramente ilustran los principios de la invención. Se apreciará que los expertos en la materia podrán idear varios arreglos que, aunque no se describen o muestran explícitamente en la presente memoria, incorporan los principios de la invención y están incluidos dentro de su alcance.

Por lo tanto, no se pretende que el alcance de la presente invención se limite a las realizaciones ejemplares mostradas y descritas en la presente memoria. Más bien, el alcance de la presente invención se materializa en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para irradiar una muestra que comprende partículas en una corriente de flujo, comprendiendo el procedimiento:

irradiar un dispositivo (16) acústico-óptico con un láser (12); y

aplicar una primera señal de activación de radiofrecuencia (RF1) y por lo menos una segunda señal de activación de radiofrecuencia (RF2) al dispositivo acústico-óptico para generar un primer haz láser desviado angularmente que tiene una intensidad controlada de forma independiente y un segundo haz láser desviado angularmente que tiene una intensidad controlada de forma independiente, en el que el primer haz láser desviado angularmente tiene una intensidad que se basa en la amplitud de la primera señal de activación de radiofrecuencia aplicada y el segundo haz láser desviado angularmente tiene una intensidad que se basa en la amplitud de la por lo menos una segunda señal de activación de radiofrecuencia aplicada,

en el que el primer haz láser desviado angularmente y el segundo haz láser desviado angularmente forman colectivamente un haz (24, 610, 624) de excitación de salida; y

irradiar la muestra en la corriente de flujo con el haz de excitación de salida,

en el que la amplitud de una o más de la primera señal de activación de radiofrecuencia y la por lo menos segunda señal de activación de radiofrecuencia se ajustan de modo que dicho haz de excitación de salida comprende el primer haz láser desviado angularmente que tiene una primera intensidad y el segundo haz láser desviado angularmente que tiene una segunda intensidad.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los haces láser desviados angularmente están separados espacialmente y por lo menos parcialmente superpuestos.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que los haces láser desviados angularmente en el haz (24, 610, 624) de excitación de salida tienen un perfil de intensidad predeterminado que comprende una intensidad creciente desde el centro hasta los bordes del haz (24, 610, 624) de excitación de salida a lo largo del eje horizontal.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada señal de activación de radiofrecuencia es independientemente de aproximadamente 1 MHz a aproximadamente 250 MHz y cada señal de activación de radiofrecuencia tiene una amplitud que es independientemente de aproximadamente 0,1 voltios a aproximadamente 40 voltios.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende ajustar la anchura espacial del haz de excitación de salida.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende:

detectar luz de la muestra en la corriente de flujo.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, que además comprende monitorizar la luz detectada de la muestra en la corriente de flujo para detectar la deriva espacial del haz de excitación de salida.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que además comprende:

producir un primer haz láser dividido que comprende un primer conjunto de haces láser desviados angularmente y un segundo haz láser dividido que comprende un segundo conjunto de haces láser desviados angularmente a partir del haz de excitación de salida;

invertir el primer haz láser dividido; y

combinar ópticamente el primer haz láser dividido invertido con el segundo haz láser dividido para producir un haz de excitación de salida combinado,

en el que el primer conjunto de haces láser desviados angularmente se invierte y se superpone con el segundo conjunto de haces láser desviados angularmente.

9. Un sistema que comprende:

un láser (12);

un dispositivo (16) acústico-óptico; y

un generador (18) de radiofrecuencia configurado para aplicar una primera señal de activación de radiofrecuencia (RF1) y por lo menos una segunda señal de activación de radiofrecuencia (RF2) al dispositivo acústico-óptico para generar un primer haz láser desviado angularmente que tiene una intensidad controlada de forma independiente y un segundo haz láser desviado angularmente que tiene una intensidad controlada de forma independiente, en el que el primer haz láser desviado angularmente tiene una intensidad que se basa en la amplitud de la primera señal de activación de radiofrecuencia aplicada y el segundo haz láser desviado angularmente tiene una intensidad que se basa en la amplitud de la por lo menos una segunda señal de activación de radiofrecuencia aplicada:

una célula (26) de flujo configurada para propagar una muestra que comprende partículas en una corriente de flujo; y un

controlador (20, 608) que comprende un procesador que tiene una memoria acoplada de forma operativa al procesador en el que la memoria comprende instrucciones almacenadas en la misma, que cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador ajuste la amplitud de una o más de la primera señal de activación de radiofrecuencia y la por lo menos una segunda señal de activación de radiofrecuencia para generar un haz (24, 610, 624) de excitación de salida que comprende el primer haz láser desviado angularmente que tiene una primera intensidad y el segundo haz láser desviado angularmente que tiene una segunda intensidad.

10. El sistema de la reivindicación 9, en el que el dispositivo acústico-óptico es un deflector (16, 604) acústico-óptico.

11. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en el que el controlador (20, 608) está configurado para producir haces láser desviados angularmente en el haz (24, 610, 624) de excitación de salida que tienen un perfil de intensidad predeterminado que comprende una intensidad creciente del centro hasta los bordes del haz (24, 610, 624) de excitación de salida a lo largo del eje horizontal.

12. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que además comprende:

un detector para detectar luz de la muestra en la corriente de flujo.

13. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que además comprende:

un divisor de haz para producir un primer haz láser dividido que comprende un primer conjunto de haces láser desviados angularmente y un segundo haz láser dividido que comprende un segundo conjunto de haces láser desviados angularmente a partir del haz de excitación de salida;

un primer componente de ajuste óptico para invertir el primer haz láser dividido; y

un segundo componente de ajuste óptico para combinar ópticamente el primer haz láser dividido invertido con el segundo haz láser dividido para producir un haz de excitación de salida combinado,

en el que el primer conjunto de haces láser desviados angularmente se invierte y se superpone con el segundo conjunto de haces láser desviados angularmente.

14. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13,

en el que la memoria comprende instrucciones almacenadas en la misma, que cuando son ejecutadas por el procesador, hacen que el procesador:

a) ajuste la anchura espacial del haz de excitación de salida; o

b) hacen que el procesador monitorice la luz detectada de la muestra en la corriente de flujo para detectar la deriva espacial del haz (24, 610, 624) de excitación de salida y ajustan la posición espacial del haz (24, 610, 624) de excitación de salida en el corriente de flujo cuando se detecta deriva espacial mediante el ajuste de la frecuencia de las señales de activación de radiofrecuencia aplicadas.