ES2952421T3 - Refuerzo del efecto de las células T modificadas por CAR por medio de vacunación con ácido nucleico - Google Patents

Abstract

La presente invención abarca generalmente el tratamiento de enfermedades dirigiéndose a células que expresan un antígeno en la superficie celular. En particular, la invención se refiere a un método para estimular, cebar y/o expandir células T in vivo modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a un antígeno, que comprende poner en contacto las células T con el antígeno o una variante del mismo in vivo. . En una realización, el antígeno o variante del mismo se proporciona administrando un ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Refuerzo del efecto de las células T modificadas por CAR por medio de vacunación con ácido nucleico

Campo técnico

La presente enseñanza se refiere a métodos y medios para reforzar el efecto de las células T modificadas para expresar receptores de antígenos quiméricos (CAR).

Antecedentes

Las células T juegan un papel central en la inmunidad mediada por células en humanos y animales. El reconocimiento y la unión de un antígeno particular están mediados por los receptores de células T (TCR) expresados en la superficie de las células T El TCR de una célula T puede interactuar con péptidos inmunogénicos (epítopos) unidos a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y presentados en la superficie de las células objetivo. La unión específica del TCR desencadena una cascada de señales dentro de la célula T que conduce a la proliferación y diferenciación en una célula T efectora madura.

Esta diversidad de TCR se obtiene por reordenamiento genético de diferentes segmentos discontinuos de genes que codifican para las diferentes regiones estructurales de los TCR. Los TCR se componen de una cadena a y una cadena p o de una cadena γ y una cadena 6. Las cadenas a/p de TCR están compuestas por una región variable altamente polimórfica en el extremo terminal N involucrada en el reconocimiento de antígenos y una región constante invariable. A nivel genético, estas cadenas se separan en varias regiones, una región variable (V), una región de diversidad (D) (solo cadenas p y 6), una región de unión (J) y una región constante (C). Los genes de la cadena p humana contienen más de 60 segmentos variables (V), 2 de diversidad (D), más de 10 de unión (J) y 2 de región constante (C). Los genes de la cadena a humana contienen más de 50 segmentos V y más de 60 segmentos J pero ningún segmento D, así como un segmento C. Los genes de la cadena p murina contienen más de 30 segmentos variables (V), 2 de diversidad (D), más de 10 de unión (J) y 2 de región constante (C). Los genes de la cadena a murina contienen casi 100 segmentos V, 60 segmentos J, ningún segmento D, pero sí un segmento C. Durante la diferenciación de las células T, se crean genes receptores de células T específicos mediante la reorganización de un gen de la región V, uno de D (solo las cadenas p y 6), uno de J y uno de C. La diversidad de los TCR se amplifica aún más mediante un reordenamiento impreciso de V-(D)-J en el que se introducen y/o eliminan nucleótidos aleatorios en los sitios de recombinación. Dado que el reordenamiento de los loci del gen del TCR ocurre en el genoma durante la maduración de las células T, cada célula T madura solo expresa un TCR α/β o TCR γ/δ específico. La unión del MHC y el antígeno está mediada por las regiones determinantes complementarias 1, 2 y 3 (CDRl, CDR2, CDR3) del TCR. El CDR3 de la cadena p, que es más crítico para el reconocimiento y la unión del antígeno, está codificado por la unión V-D-J del gen de la cadena p del TCR reorganizado.

El TCR es parte de una maquinaria de señalización compleja, que incluye el complejo heterodimérico de las cadenas α y β del TCR , el correceptor CD4 o CD8 y el módulo de transducción de señales de CD3 (Figura 1). Mientras que las cadenas de CD3 transfieren la señal de activación al interior de la célula, el heterodímero a/p de TCR es el único responsable del reconocimiento del antígeno. Por lo tanto, la transferencia de las cadenas a/p de TCR ofrece la oportunidad de redirigir las células T hacia cualquier antígeno de interés.

La inmunoterapia basada en transferencia celular adoptiva (ACT) puede definirse ampliamente como una forma de inmunización pasiva con células T previamente sensibilizadas que se transfieren a receptores no inmunes o al huésped autólogo después de expansión ex-vivo de bajas frecuencias de precursores a números de células clínicamente relevantes. Los tipos de células que se han utilizado para los experimentos de ACT son células asesinas activadas por linfoquinas (LAK) (Mula, JJ et al. (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, SA et al. (1985) N. Engl. J. Med.

313, 1485-1492), linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) (Rosenberg, SA et al., (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159­ 1166), linfocitos de donantes después de un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), así como líneas o clones de células T específicos del tumor (Dudley, ME et al. (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. A 99, 16168-16173). Se demostró que la transferencia adoptiva de células T tiene actividad terapéutica contra infecciones virales humanas tales como el CMV. Si bien la infección por CMV y la reactivación de virus latentes endógenos están controladas por el sistema inmunitario en individuos sanos, da como resultado una morbilidad y mortalidad significativas en individuos inmunocomprometidos, tal como receptores de trasplantes o pacientes con SIDA. Riddell y colaboradores demostraron la reconstitución de la inmunidad viral mediante la terapia de células T adoptivas en pacientes inmunosuprimidos después de la transferencia de clones de células T CD8+ específicos de CMV derivados de donantes de trasplante seropositivos para CMV compatibles con HLA. Riddell, SR (1992) Science 257, 238-241). Como un enfoque alternativo, las poblaciones de células T específicas de CMV o EBV derivadas de donantes policlonales se transfirieron a receptores de trasplantes, lo que resultó en una mayor persistencia de las células T transferidas. Rooney, C.M. et al. (1998) Blood 92, 1549-1555; Peggs, K.S. et al. (2003) Lancet 362, 1375-1377). Para la inmunoterapia adoptiva del melanoma, Rosenberg y colaboradores establecieron un enfoque de ACT basado en la infusión de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) autólogos expandidos in vitro aislados de tumores extirpados en combinación con una quimioterapia no mieloablativa que reduce los linfocitos y dosis altas de IL2. Un estudio clínico publicado recientemente dio como resultado una tasa de respuesta objetiva de ~50 % de los pacientes tratados que padecían melanoma metastásico (Dudley, ME et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23: 2346-2357).

Un enfoque alternativo es la transferencia adoptiva de células T autólogas reprogramadas para expresar un inmunorreceptor reactivo frente a tumores de especificidad definida durante cultivo ex-vivo de corta duración seguido de reinfusión en el paciente (Kershaw MH et al. (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8): 525-41). Esta estrategia hace que la ACT sea aplicable a una variedad de tumores malignos comunes incluso si las células T reactivas al tumor están ausentes en el paciente. Dado que la especificidad antigénica de las células T se basa completamente en el complejo heterodimérico de la cadena a y p del TCR, la transferencia de genes del TCR clonados a las células T ofrece la posibilidad de redirigirlos hacia cualquier antígeno de interés. Por lo tanto, la terapia génica del TCR proporciona una estrategia atractiva para desarrollar inmunoterapia específica de antígeno con linfocitos autólogos como opción de tratamiento. Las principales ventajas de la transferencia de genes del TCR son la creación de cantidades terapéuticas de células T específicas de antígeno en unos pocos días y la posibilidad de introducir especificidades que no están presentes en el repertorio del TCR endógeno del paciente.

Varios grupos demostraron que la transferencia del gen del TCR es una estrategia atractiva para redirigir la especificidad de antígeno de las células T primarias (Morgan, R.A. et al. (2003) J. Inmunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. et al. (2000) J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. et al. (2000) J. Inmunol. 165, 528-532; Kessels, HW et al. (2001) Natl. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. et al. (1986) Nature 320, 232-238). La viabilidad de la terapia génica del TCR en humanos se demostró inicialmente en ensayos clínicos para el tratamiento del melanoma maligno por Rosenberg y su grupo. La transferencia adoptiva de linfocitos autólogos transducidos retroviralmente con TCR específicos de antígenos de melanoma/melanocitos resultó en la regresión del cáncer en hasta el 30 % de los pacientes con melanoma tratados. Morgan, RA et al. (2006) Science 314, 126-129; Johnson, LA et al. (2009) Blood 114, 535-546). Mientras tanto, las pruebas clínicas de la terapia génica del TCR también se extendieron a cánceres distintos del melanoma dirigidos a muchos antígenos tumorales diferentes. Park, T.S. et al., (2011) Trends Biotechnol. 29, 550­ 557).

El uso de enfoques de ingeniería genética para insertar receptores dirigidos a antígenos de especificidad definida en las células T ha ampliado en gran medida las capacidades de refuerzo de ACT. Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) son un tipo de receptor dirigido a antígeno compuesto por dominios de señalización de células T intracelulares fusionados con fracciones de unión a antígeno extracelulares, más comúnmente fragmentos variables de cadena única (scFv) de anticuerpos monoclonales. Los CAR reconocen directamente los antígenos de la superficie celular, independientemente de la presentación mediada por el MHC, lo que permite el uso de una única construcción de receptor específica para cualquier antígeno dado en todos los pacientes. Los CAR iniciales fusionaron dominios de reconocimiento de antígenos a la cadena de activación de CD3Z del complejo del receptor de células T (TCR) (Figura 2). Las iteraciones posteriores de CAR han incluido señales coestimuladoras secundarias junto con CD3Z, incluidos dominios intracelulares de CD28 o una variedad de moléculas de la familia de receptores de TNF tal como 4-1BB (CD137) y OX40 (CD134). Además, los receptores de tercera generación incluyen dos señales coestimuladoras además de CD3Z, más comúnmente de CD28 y 4-1BB. Los CAR de segunda y tercera generación mejoraron drásticamente la eficacia antitumoral, en algunos casos induciendo remisiones completas en pacientes con cáncer avanzado.

En general, se piensa que el número de células T transferidas se correlaciona con las respuestas terapéuticas. Sin embargo, el número de células que se pueden administrar a un paciente para la transferencia de células T adoptivas es limitado y la generación de una gran cantidad de células T para la transferencia de células T adoptivas sigue siendo un desafío. Se podría lograr un aumento sustancial en la persistencia celular cuando los pacientes recibieran un régimen preparatorio de agotamiento de linfocitos antes de la infusión de TIL o células T modificadas por el receptor. Sin embargo, la transferencia de una gran cantidad de células T modificadas en un huésped vacío también presenta el riesgo de eventos adversos graves en caso de que el antígeno objetivo se exprese inesperadamente en un tejido normal relevante. Por lo tanto, sería deseable transferir una cantidad limitada de células T modificadas que puedan expandirse en el paciente después de que se haya demostrado que son seguras. Wang et al. 2015 (Clinic. Cane. Res.

21: 2993-3002) describen una estrategia para estimular las células T con CAR in vivo a través de su receptor nativo de células T, que es específico para un antígeno de citomegalovirus. Smith et al. 2009 (J. Immunotherapy 32: 870­ 874) describen la administración secuencial de linfocitos infiltrantes de tumores autólogos que reconocen el antígeno de diferenciación de melanocitos gp100 junto con una vacuna contra la viruela aviar altamente inmunogénica que expresa un epítopo de gp100. Song et al. 2011 (J. Am. Soc. Gene Therap. 19: 211-217) describen una vacuna adenoviral inductora de Th-1 para reforzar las células T transferidas adoptivamente. Hui-Rong Jiang et al., 2006 (J. Immunology, 177: 4288-4298) describen la combinación de células T que expresan un receptor de antígeno quimérico específico de h5T4 y una vacuna adenoviral que codifica h5T4.

Los presentes inventores encontraron que es posible expandir las células T con CAR transferidas adoptivamente usando vacunación nucleica, en particular vacunación con ARN para proporcionar antígeno para la estimulación de células T con CAR. Después de la transferencia adoptiva de células T con CAR, las células T se someten a una expansión específica de antígeno exponiendo las células T a células, preferiblemente células presentadoras de antígeno, que expresan el antígeno en la superficie celular. Por lo tanto, solo es posible transferir pequeñas cantidades de células T modificadas con CAR al paciente y luego expandir las células T in vivo mediante la administración de una vacuna de ácido nucleico que proporciona un antígeno.

Descripción

Resumen

La presente enseñanza generalmente abarca el tratamiento de enfermedades direccionando células que expresan un antígeno en la superficie celular tales como células enfermas que expresan un antígeno en la superficie celular, en particular células cancerosas que expresan un antígeno tumoral en la superficie celular. Los métodos proporcionan la erradicación selectiva de células que expresan en su superficie un antígeno, minimizando así los efectos adversos para las células normales que no expresan el antígeno. Se administran células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) direccionando a las células a través de la unión al antígeno. Además, se administra el ácido nucleico que codifica al antígeno o una variante del mismo. El ácido nucleico se expresa mediante células objetivo apropiadas para proporcionar antígeno para la estimulación, cebado y/o expansión de células T Las células T estimuladas, cebadas y/o expandidas en el paciente pueden reconocer células que expresan un antígeno en la superficie celular, como las células enfermas, lo que da como resultado la erradicación de las células enfermas. Se puede considerar que el presente enfoque implica inmunización pasiva y activa. El tratamiento que implica la administración de células T modificadas genéticamente para expresar un CAR puede considerarse como una forma de inmunización pasiva. El tratamiento que implica la administración de un ácido nucleico que codifica un antígeno o una variante del mismo, estimulando así una respuesta inmunitaria mediada por células T a una población o tejido de células objetivo, puede considerarse como una forma de inmunización activa.

En un aspecto, la enseñanza se relaciona con un método para estimular, cebar y/o expandir células T in vivo modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a un antígeno, que comprende poner en contacto las células T con el antígeno o una variante del mismo in vivo. En una realización, el antígeno o variante del mismo se proporciona mediante la administración de un ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo. El ácido nucleico se expresa mediante células objetivo apropiadas para proporcionar antígeno o una variante del mismo para la estimulación, cebado y/o expansión de células T

En un aspecto, la enseñanza se refiere a un método para proporcionar una respuesta inmunitaria a una población de células objetivo o tejido objetivo que expresa un antígeno en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido al antígeno y administrar un ácido nucleico que codifica el antígeno o una variante del mismo.

En una realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria mediada por células T En una realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria antitumoral y la población de células objetivo o el tejido objetivo es células tumorales o tejido tumoral.

En un aspecto, la enseñanza se refiere a un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad, trastorno o afección asociada con la expresión o expresión elevada de un antígeno, comprendiendo el método administrar al mamífero células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido al antígeno y administrar un ácido nucleico que codifica el antígeno o una variante del mismo.

En una realización, la enfermedad, trastorno o afección es cáncer.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el antígeno es un antígeno tumoral. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el antígeno se selecciona del grupo que consiste en claudinas, tales como claudina 6, claudina 18.2, CD19, CD20, CD22, CD33, CD123, mesotelina, CEA, c-Met, PSMA, GD-2 y NY-ESO-1. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el antígeno es un antígeno patógeno. El patógeno puede ser un patógeno fúngico, viral o bacteriano.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo se expresa en células del mamífero para proporcionar el antígeno o variante del mismo.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, la expresión del antígeno o variante del mismo es en la superficie celular.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo se expresa transitoriamente en células del mamífero. Por lo tanto, en una realización, el ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo no está integrado en el genoma de las células.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo es ARN, preferiblemente ARN transcrito in vitro.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR y/o el ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo se administran sistémicamente.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, después de la administración sistémica del ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo, se produce la expresión del antígeno o variante del mismo en el bazo. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, después de la administración sistémica del ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo, se produce la expresión del antígeno o variante del mismo en células presentadoras de antígeno, preferiblemente células presentadoras de antígeno profesionales. En una realización, las células presentadoras de antígeno se seleccionan del grupo que consiste en células dendríticas, macrófagos y células B. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, después de la administración sistémica del ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo, no se produce o esencialmente no se produce expresión del antígeno o variante del mismo en pulmón y/o hígado. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, después de la administración sistémica del ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo, la expresión del antígeno o variante del mismo en el bazo es al menos 5 veces la cantidad de expresión en el pulmón.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo se expresa en células del mamífero para proporcionar el antígeno o variante del mismo para la unión de las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR, resultando dicha unión en estimulación, cebado y/o expansión de las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo se formula en un vehículo de administración, tal como en partículas. En una realización, el vehículo de administración comprende al menos un lípido. En una realización, al menos un lípido comprende al menos un lípido catiónico. En una realización, el lípido forma un complejo con y/o encapsula el ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo. En una realización, el lípido está contenido en una vesícula que encapsula el ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo se formula en liposomas.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el método comprende además:

obtener una muestra de células de un mamífero, comprendiendo la muestra células T o progenitores de células T, y transfectar las células con un ácido nucleico que codifica el CAR para proporcionar células T modificadas genéticamente para expresar un CAR.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR se transfectan de forma estable o transitoria con ácido nucleico que codifica el CAR. Por lo tanto, el ácido nucleico que codifica el CAR está integrado o no en el genoma de las células T.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, las células T y/o la muestra de células son del mamífero al que se administran las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR y el ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, las células T y/o la muestra de células son de un mamífero que es diferente al mamífero al que se le administraron las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR y el ácido nucleico que codifica el antígeno o variante del mismo.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR se inactivan para la expresión de un receptor de células T endógeno y/o HLA endógeno.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el CAR comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización de células T En una realización, el dominio de unión al antígeno comprende la secuencia de scFv de un anticuerpo monoclonal contra el antígeno.

En un aspecto, la enseñanza se refiere a un kit que comprende un ácido nucleico que codifica un CAR dirigido a un antígeno o células T modificadas genéticamente para expresar un CAR dirigido a un antígeno y un ácido nucleico que codifica el antígeno o una variante del mismo. En una realización, el kit comprende además instrucciones para el uso del kit en cualquiera de los métodos de enseñanza.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, las células T pueden ser autólogas, alogénicas o singénicas para el mamífero. Las células T pueden estar modificadas genéticamente in vitro para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido al antígeno.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, se expresa un antígeno en una célula enferma tal como una célula cancerosa. En una realización, se expresa un antígeno en la superficie de una célula enferma tal como una célula cancerosa. En una realización, un CAR se une a un dominio extracelular o a un epítopo en un dominio extracelular de un antígeno o una variante del mismo. En una realización, un CAR se une a epítopos nativos de un antígeno o una variante del mismo presente en la superficie de las células vivas. En una realización dicho antígeno es una claudina, en particular la claudina 6 o la claudina 18.2, y dicho CAR se une al primer bucle extracelular de dicha claudina. En una realización, la unión de dicho CAR cuando se expresa por células T y/o está presente en células T a un antígeno o una variante del mismo presente en células tales como células presentadoras de antígeno da como resultado la estimulación, cebado y/o expansión de dichas células T. En una realización, la unión de dicho CAR cuando se expresa por las células T y/o está presente en las células T a un antígeno presente en las células enfermas, tal como las células cancerosas, da como resultado la citólisis y/o la apoptosis de las células enfermas, en donde dichas células T preferiblemente liberan factores citotóxicos, p. ej., perforinas y granzimas.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, un CAR comprende un dominio de unión a antígeno. En una realización, el dominio de unión a antígeno está compuesto por un exodominio de un CAR. En una realización, el dominio de unión al antígeno comprende un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) de un anticuerpo contra el antígeno. En una realización, el dominio de unión a antígeno comprende una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) con especificidad por el antígeno (VH(antígeno)) y una región variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina (VL) con una especificidad por el antígeno (VL(antígeno)). En una realización, dicha región variable de cadena pesada (VH) y la correspondiente región variable de cadena ligera (VL) están conectadas a través de un enlazador peptídico, preferiblemente un enlazador peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos (GGGGS)₃.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, un CAR comprende un dominio transmembrana. En una realización, el dominio transmembrana es una hélice alfa hidrófoba que atraviesa la membrana. En una realización, el dominio transmembrana comprende el dominio transmembrana de CD28 o un fragmento del mismo.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, un CAR comprende un dominio de señalización de células T En una realización, el dominio de señalización de células T se localiza intracelularmente. En una realización, el dominio de señalización de células T comprende CD3-zeta, preferiblemente el endodominio de CD3-zeta, opcionalmente en combinación con CD28. En una realización, el dominio de señalización de células T comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 8 o un fragmento del mismo, o una variante de dicha secuencia o fragmento.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, un CAR comprende un péptido señal que dirige la proteína naciente hacia el retículo endoplásmico. En una realización, el péptido señal precede al dominio de unión al antígeno. En una realización, el péptido señal comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 o un fragmento del mismo, o una variante de dicha secuencia o fragmento.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, un CAR comprende una región espaciadora que une el dominio de unión al antígeno con el dominio transmembrana. En una realización, la región espaciadora permite que el dominio de unión al antígeno se oriente en diferentes direcciones para facilitar el reconocimiento del antígeno. En una realización, la región espaciadora comprende la región bisagra de IgG1. En una realización, la región espaciadora comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 o un fragmento del mismo, o una variante de dicha secuencia o fragmento.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, un CAR comprende la estructura:

NH₂ - péptido señal - dominio de unión a antígeno - región espaciadora - dominio transmembrana ^ - dominio de señalización de células T - COOH.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, un CAR es preferiblemente específico para el antígeno al que se dirige, en particular cuando está presente en la superficie de una célula tal como una célula enferma o una célula presentadora de antígeno.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, un CAR puede expresarse y/o estar presente en la superficie de una célula T, preferiblemente una célula T citotóxica. En una realización, la célula T es reactiva con el antígeno al que se dirige el CAR.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR y/o el ácido nucleico que codifica un antígeno o una variante del mismo, ya sea juntas o separadas entre sí, pueden administrarse en una composición farmacéutica que puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable y puede comprender opcionalmente uno o más adyuvantes, estabilizadores, etc. En una realización, la composición farmacéutica es para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad que involucra un antígeno tal como una enfermedad cancerosa tal como aquellas descritas en el presente documento.

En otro aspecto, la enseñanza proporciona los agentes y composiciones descritos en el presente documento para uso en los métodos descritos en el presente documento.

En un aspecto, la enseñanza se refiere a células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a un antígeno para uso en los métodos de la enseñanza.

En un aspecto, la enseñanza se refiere a un ácido nucleico que codifica un antígeno o una variante del mismo para uso en los métodos de la enseñanza.

Otras características y ventajas de la presente enseñanza serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

Descripción detallada

Aunque la presente enseñanza se describe en detalle a continuación, debe entenderse que esta enseñanza no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en este documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende limitar el alcance de la presente enseñanza que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la materia.

A continuación, se describirán los elementos de la presente enseñanza. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos descritos de diversas formas y las realizaciones preferidas no deben interpretarse como una limitación de la presente enseñanza únicamente a las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción respalda y abarca realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos divulgados y/o preferidos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud debe considerarse divulgada por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario.

Preferiblemente, los términos utilizados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, Ch -4010 Basilea, Suiza.

La práctica de la presente enseñanza empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la bibliografía en este campo (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a edición, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende" y variaciones tales como "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de ningún otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas, aunque en algunas realizaciones puede excluirse dicho otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas, es decir el tema en cuestión consiste en la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas establecidos. Los términos "un" y "uno, una" y "el, la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la enseñanza (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en este documento o claramente contradicho por el contexto. La enumeración de intervalos de valores en este documento tiene la intención de servir simplemente como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en este documento, cada valor individual se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en este documento.

Todos los métodos descritos en este documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en este documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o ejemplo de expresión (p. ej., "tal como"), proporcionado en el presente documento tiene la intención de ilustrar mejor la enseñanza y no impone una limitación en el alcance de la enseñanza reivindicada de otro modo. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse como una indicación de cualquier elemento esencial no reivindicado para la práctica de la enseñanza.

El término "respuesta inmunitaria" se refiere a una respuesta corporal integrada a un antígeno y preferiblemente se refiere a una respuesta inmunitaria celular o a una respuesta inmunitaria tanto celular como humoral. La respuesta inmunitaria puede ser protectora/preventiva/profiláctica y/o terapéutica.

"Proporcionar una respuesta inmunitaria" puede significar que no hubo una respuesta inmunitaria contra un antígeno objetivo, una célula objetivo y/o un tejido objetivo en particular antes de proporcionar una respuesta inmunitaria, pero también puede significar que hubo un cierto nivel de respuesta inmunitaria contra un determinado antígeno objetivo, célula objetivo y/o tejido objetivo particular antes de proporcionar una respuesta inmunitaria y después de proporcionar una respuesta inmunitaria, se refuerza dicha respuesta inmunitaria. Por lo tanto, "proporcionar una respuesta inmunitaria" incluye "inducir una respuesta inmunitaria" y "reforzar una respuesta inmunitaria". Preferiblemente, después de proporcionar una respuesta inmunitaria en un sujeto, dicho sujeto está protegido contra el desarrollo de una enfermedad tal como una enfermedad cancerosa o se mejora la condición de la enfermedad al proporcionar una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, se puede proporcionar una respuesta inmunitaria contra un antígeno tumoral en un paciente que tiene una enfermedad cancerosa o en un sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa. Proporcionar una respuesta inmunitaria en este caso puede significar que la condición de la enfermedad del sujeto mejora, que el sujeto no desarrolla metástasis o que el sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa no desarrolla una enfermedad cancerosa.

"Inmunidad mediada por células" o "inmunidad celular" o términos similares pretenden incluir una respuesta celular dirigida a células caracterizadas por la expresión de un antígeno, en particular caracterizada por la presentación de un antígeno con MHC de clase I o clase II. La respuesta celular se relaciona con células llamadas células T o linfocitos T que actúan como 'colaboradores' o 'asesinos'. Las células T colaboradoras (también denominadas células T CD4+) juegan un papel central en la regulación de la respuesta inmunitaria y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o CTL) matan las células enfermas, como las células cancerosas, evitando la producción de más células enfermas.

El término "antígeno" se refiere a un agente que comprende un epítopo contra el cual se va a generar y/o dirigir una respuesta inmunitaria. Preferiblemente, un antígeno en el contexto de la presente enseñanza es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmune, que es preferiblemente específica para el antígeno o las células que expresan el antígeno, preferiblemente en la superficie celular. El término "antígeno" incluye en particular proteínas y péptidos. Un antígeno es preferiblemente un producto que corresponde o se deriva de un antígeno de origen natural. Dichos antígenos de origen natural pueden incluir o pueden derivarse de alérgenos, virus, bacterias, hongos, parásitos y otros agentes infecciosos y patógenos, o un antígeno también puede ser un antígeno tumoral. De acuerdo con la presente enseñanza, un antígeno puede corresponder a un producto natural, por ejemplo, una proteína viral o una parte de la misma.

El término "patógeno" se refiere a microorganismos patógenos y comprende virus, bacterias, hongos, organismos unicelulares y parásitos. Ejemplos de virus patógenos son el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el citomegalovirus (CMV), el virus del herpes (HSV), el virus de la hepatitis A(HAV), el HBV, el HCV, el virus del papiloma y el virus linfotrófico T humano (HTLV). Los organismos unicelulares comprenden plasmodios, tripanosomas, amebas, etc.

En una realización preferida, un antígeno es un antígeno asociado a una enfermedad. El término "antígeno asociado a una enfermedad" se refiere a todos los antígenos que tienen importancia patológica. En una realización particularmente preferida, un antígeno asociado a una enfermedad está presente en células, tejidos y/u órganos enfermos mientras que no está presente o está presente en una cantidad reducida en células, tejidos y/u órganos sanos y, por lo tanto, puede usarse para direccionamiento a células, tejidos y/u órganos enfermos, p. ej., por células T que portan un CAR dirigido al antígeno. En una realización, un antígeno asociado a una enfermedad está presente en la superficie de una célula enferma.

En una realización preferida, un antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno asociado a un tumor, es decir, un constituyente de células cancerosas que puede derivarse del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular, en particular aquellos antígenos que se producen, preferiblemente en gran cantidad, como antígenos de superficie en las células cancerosas.

En el contexto de la presente enseñanza, el término "antígeno tumoral" o "antígeno asociado a tumor" se refiere a proteínas que, en condiciones normales, se expresan específicamente en un número limitado de tejidos y/u órganos o en etapas de desarrollo específicas, por ejemplo, el antígeno tumoral puede expresarse específicamente en condiciones normales en el tejido del estómago, preferiblemente en la mucosa gástrica, en los órganos reproductores, por ejemplo, en los testículos, en el tejido trofoblástico, por ejemplo, en la placenta, o en las células de la línea germinal, y se expresan o se expresan de forma aberrante en uno o más tejidos tumorales o cancerosos. En este contexto, "un número limitado" preferiblemente significa no más de 3, más preferiblemente no más de 2. Los antígenos tumorales en el contexto de la presente enseñanza incluyen, por ejemplo, antígenos de diferenciación, preferiblemente antígenos de diferenciación específicos del tipo de célula, es decir, proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en un determinado tipo de célula en una determinada etapa de diferenciación, antígenos de cáncer/testículo , es decir, proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en los testículos y, a veces, en la placenta, y antígenos específicos de la línea germinal. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno tumoral se asocia preferiblemente con la superficie celular de una célula cancerosa y preferiblemente no se expresa o se expresa raramente en tejidos normales. Preferiblemente, el antígeno tumoral o la expresión anómala del antígeno tumoral identifica las células cancerosas. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno tumoral que es expresado por una célula cancerosa en un sujeto, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad cancerosa, es preferiblemente una proteína propia en dicho sujeto. En realizaciones preferidas, el antígeno tumoral en el contexto de la presente enseñanza se expresa en condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es esencial, es decir, tejidos u órganos que cuando son dañados por el sistema inmunitario no conducen a la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son o son difícilmente accesibles para el sistema inmunitario. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del antígeno tumoral es idéntica entre el antígeno tumoral que se expresa en tejidos normales y el antígeno tumoral que se expresa en tejidos cancerosos.

Ejemplos de antígenos tumorales que pueden ser útiles en la presente enseñanza son p53, ART-4, BAGE, betacatenina/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, ^c A^s P-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, las proteínas de la superficie celular de la familia de las claudinas, tal como CLAUDINA-6, CLAUDINA-18.2 y CLAUDINA-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100 , HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (o hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferiblemente MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 o MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MAGE-1/Melan-A, MC1R, miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 menor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinasa 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVINA, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE y WT. Los antígenos tumorales particularmente preferidos incluyen CLAUDINA-18.2 (CLDN18.2) y CLAUDINA-6 (CLDN6).

El término "CLDN", como se usa en este documento, significa claudina e incluye CLDN6 y CLDN18.2. Preferiblemente, una claudina es un claudina humana. Las claudinas son una familia de proteínas que son los componentes más importantes de las uniones estrechas, donde establecen la barrera paracelular que controla el flujo de moléculas en el espacio intercelular entre las células de un epitelio. Las claudinas son proteínas transmembrana que abarcan la membrana 4 veces con el extremo terminal N y el extremo terminal C, ambos ubicados en el citoplasma. El primer bucle extracelular, denominado EC1 o ECL1, consta de un promedio de 53 aminoácidos, y el segundo bucle extracelular, denominado EC2 o ECL2, consta de unos 24 aminoácidos. Las proteínas de la superficie celular de la familia de las claudinas se expresan en tumores de diversos orígenes y son particularmente adecuadas como estructuras objetivo en relación con la inmunoterapia contra el cáncer mediada por anticuerpos debido a su expresión selectiva (sin expresión en un tejido normal relevante para la toxicidad) y localización en la membrana plasmática.

CLDN6 y CLDN18.2 se han identificado como expresadas diferencialmente en tejidos tumorales, siendo el estómago el único tejido normal que expresa CLDN18.2 y siendo la placenta el único tejido normal que expresa CLDN6.

CLDN18.2 se expresa selectivamente en tejidos normales en células epiteliales diferenciadas de la mucosa gástrica. CLDN18.2 se expresa en cánceres de diversos orígenes, como carcinoma pancreático, carcinoma esofágico, carcinoma gástrico, carcinoma bronquial, carcinoma de mama y tumores ENT CLDN18.2 es un objetivo valioso para la prevención y/o el tratamiento de tumores primarios, como cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático , cáncer de cabeza y cuello y cánceres de la vesícula biliar y sus metástasis, en particular metástasis de cáncer gástrico tal como tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal y metástasis de ganglios linfáticos.

Se ha encontrado que CLDN6 se expresa, por ejemplo, en cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de piel, melanomas, cáncer de cabeza y cuello, sarcomas, cáncer de vías biliares, cáncer de células renales y cáncer de vejiga urinaria. CLDN6 es un objetivo particularmente preferido para la prevención y/o el tratamiento del cáncer de ovario, en particular el adenocarcinoma de ovario y el teratocarcinoma de ovario, el cáncer de pulmón, incluido el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en particular el carcinoma y adenocarcinoma de pulmón de células escamosas, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de piel, en particular carcinoma de células basales y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, en particular sarcoma y carcinosarcoma sinovial, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga urinaria, en particular carcinoma de células de transición y carcinoma papilar, cáncer de riñón, en particular carcinoma de células renales incluyendo carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, incluyendo cáncer de íleon, en particular adenocarcinoma de intestino delgado y adenocarcinoma de íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, cáncer uterino, tumores de células germinales tales como un teratocarcinoma o un carcinoma embrionario, en particular tumores de células germinales del testículo, y sus formas metastásicas.

El término "CLDN18.2" se refiere preferiblemente a CLDN18.2 humano y, en particular, a una proteína que comprende, preferiblemente que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer bucle extracelular de CLDN18.2 comprende preferiblemente los aminoácidos 27 a 81, más preferiblemente los aminoácidos 29 a 78 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1. El segundo bucle extracelular de CLDN18.2 comprende preferiblemente los aminoácidos 140 a 180 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1. Dichos bucles extracelulares primero y segundo forman preferiblemente la porción extracelular de CLDN18.2.

El término "CLDN6" se refiere preferiblemente a CLDN6 humana y, en particular, a una proteína que comprende, preferiblemente que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer bucle extracelular de CLDN6 comprende preferiblemente los aminoácidos 28 a 80, más preferiblemente los aminoácidos 28 a 76 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3. El segundo bucle extracelular de CLDN6 comprende preferiblemente los aminoácidos 138 a 160, preferiblemente los aminoácidos 141 a 159, más preferiblemente los aminoácidos 145 a 157 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3. Dichos bucles extracelulares primero y segundo forman preferiblemente la porción extracelular de CLDN5.

El término "variante" de acuerdo con la enseñanza se refiere, en particular, a mutantes, variantes de corte y empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellos que están naturalmente presentes. Una variante alélica se relaciona con una alteración en la secuencia normal de un gen, cuyo significado a menudo no está claro. La secuenciación completa del gen a menudo identifica numerosas variantes alélicas para un gen dado. Un homólogo de especie es un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos con una especie de origen diferente a la de un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos dada. El término "variante" abarcará cualquier variante modificada postraduccionalmente y variantes de conformación.

Un antígeno o variante del mismo codificado por el ácido nucleico que se va a administrar de acuerdo con la enseñanza, es decir, un antígeno de vacuna, debe dar como resultado la estimulación, cebado y/o expansión de células T modificadas con CAR. Dichas células T estimuladas, cebadas y/o expandidas deben dirigirse contra un antígeno objetivo, en particular un antígeno objetivo expresado en células, tejidos y/u órganos enfermos, es decir, un antígeno asociado a la enfermedad. Por lo tanto, un antígeno de la vacuna puede corresponder al antígeno asociado a la enfermedad, o puede ser una variante del mismo. En una realización, dicha variante es inmunológicamente equivalente al antígeno asociado a la enfermedad. En el contexto de la presente enseñanza, el término "variante de un antígeno" significa un agente que da como resultado la estimulación, cebado y/o expansión de células T modificadas con CAR que estimularon, cebaron y/o expandieron las células T que se dirigen al antígeno, es decir un antígeno asociado a una enfermedad, en particular cuando se expresa en células, tejidos y/u órganos enfermos. Por lo tanto, el antígeno de la vacuna codificado por el ácido nucleico que se va a administrar de acuerdo con la enseñanza puede ser idéntico al antígeno asociado a la enfermedad, puede comprender el antígeno asociado a la enfermedad o una porción del mismo o puede comprender un antígeno que es homólogo al antígeno asociado a la enfermedad o una porción del mismo. Si el antígeno de la vacuna codificado por el ácido nucleico que se administrará de acuerdo con la enseñanza comprende una porción del antígeno asociado a la enfermedad o una porción de un antígeno que es homólogo al antígeno asociado a la enfermedad, dicha porción puede comprender el epítopo del antígeno asociado a la enfermedad al que se dirige el CAR de las células T modificadas con CAR. Por lo tanto, de acuerdo con la enseñanza, un antígeno codificado por el ácido nucleico a administrar puede comprender un fragmento inmunogénico de un antígeno asociado a una enfermedad tal como un fragmento peptídico de un antígeno asociado a una enfermedad. Un "fragmento inmunogénico de un antígeno" de acuerdo con la enseñanza se refiere preferiblemente a una porción o fragmento de un antígeno que es capaz de estimular, cebar y/o expandir las células T que portan un CAR que se une al antígeno o a las células que expresan el antígeno. Se prefiere que el antígeno de la vacuna (similar al antígeno asociado a la enfermedad) pueda expresarse en la superficie de una célula tal como una célula presentadora de antígeno para proporcionar el epítopo relevante para la unión de CAR a las células T El antígeno de la vacuna codificado por el ácido nucleico a administrar de acuerdo con la enseñanza puede ser un antígeno recombinante.

El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente, tal como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente, exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo del efecto inmunológico. En el contexto de la presente enseñanza, el término "inmunológicamente equivalente" se usa preferiblemente con respecto a los efectos o propiedades inmunológicas de antígenos o variantes de antígenos usados para la inmunización. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos es inmunológicamente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia si dicha secuencia de aminoácidos cuando se expone al sistema inmunitario de un sujeto, tal como las células T que portan un CAR que se une a la secuencia de aminoácidos de referencia o las células que expresan la secuencia de aminoácidos de referencia induce una reacción inmunitaria que tiene la especificidad de reaccionar con la secuencia de aminoácidos de referencia. Por lo tanto, una molécula que es inmunológicamente equivalente a un antígeno exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos con respecto a la estimulación, cebado y/o expansión de las células T modificadas con CAR que el antígeno al que se dirigen las células T modificadas con CAR.

De acuerdo con la enseñanza, el antígeno o variante del mismo debería ser reconocible por un CAR. Preferiblemente, el antígeno o variante del mismo, si es reconocido por un CAR, es capaz de inducir, en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, estimulación, cebado y/o expansión de la célula T que porta el CAR que reconoce el antígeno o variante del mismo. En el contexto de las realizaciones de la presente enseñanza, el antígeno o variante del mismo está preferiblemente presente en la superficie de una célula, preferiblemente una célula presentadora de antígeno. El reconocimiento del antígeno en la superficie de una célula enferma puede provocar una reacción inmunitaria contra el antígeno (o la célula que expresa el antígeno).

De acuerdo con los diversos aspectos de la enseñanza, el objetivo es preferiblemente proporcionar una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas que expresan un antígeno tumoral tal como CLDN6 o CLDN18.26 y tratar una enfermedad cancerosa que involucra células que expresan un antígeno tumoral tal como CLDN6 o CLDN18.2. Preferiblemente, la enseñanza implica la administración de células T modificadas con CAR dirigidas contra células cancerosas que expresan un antígeno tumoral tal como CLDN6 o CLDN18.2.

De acuerdo con la enseñanza, el término "cáncer positivo para antígeno tumoral" o términos similares significa un cáncer que involucra células cancerosas que expresan un antígeno tumoral, preferiblemente en la superficie de dichas células cancerosas. Las células cancerosas que expresan un antígeno tumoral en la superficie pueden ser el objetivo de células inmunorreactivas que portan un c A r dirigido al antígeno tumoral.

"Superficie celular" se usa de acuerdo con su significado normal en la técnica y, por lo tanto, incluye el exterior de la célula que es accesible para la unión por proteínas y otras moléculas. Un antígeno se expresa en la superficie de las células si está ubicado en la superficie de dichas células y es accesible para la unión, p. ej., mediante anticuerpos específicos de antígeno añadidos a las células. En una realización, un antígeno expresado en la superficie de las células es una proteína de membrana integral que tiene una porción extracelular reconocida por un CAR.

El término "porción extracelular" o "exodominio" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a una parte de una molécula tal como una proteína que se enfrenta al espacio extracelular de una célula y preferiblemente es accesible desde el exterior de dicha célula, por ejemplo, mediante la unión de moléculas tales como anticuerpos ubicados fuera de la célula. Preferiblemente, el término se refiere a uno o más bucles o dominios extracelulares o a un fragmento de los mismos.

Los términos "porción" o "parte" se usan en este documento de manera intercambiable y se refieren a un elemento continuo o discontinuo de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos. El término "fragmento" se refiere a un elemento continuo de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos. Una porción, parte o fragmento de una estructura preferiblemente comprende una o más propiedades funcionales, p. ej., propiedades antigénicas, inmunológicas y/o de unión, de dicha estructura. Una porción o parte de una secuencia proteica comprende preferiblemente al menos 6, en particular al menos 8, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 50 o al menos 100 aminoácidos consecutivos y/o no consecutivos de la secuencia de proteína. Un fragmento de una secuencia proteica comprende preferiblemente al menos 6, en particular al menos 8, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 50 o al menos 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia de proteína.

De acuerdo con la enseñanza, un antígeno no se expresa (sustancialmente) en una célula si el nivel de expresión está por debajo del límite de detección y/o si el nivel de expresión es demasiado bajo para permitir la unión por anticuerpos específicos de antígeno añadidos a la célula. De acuerdo con la enseñanza, un antígeno se expresa en una célula si el nivel de expresión está por encima del límite de detección y/o si el nivel de expresión es lo suficientemente alto como para permitir la unión por anticuerpos específicos de antígeno añadidos a la célula. Preferiblemente, un antígeno expresado en una célula se expresa o expone, es decir, está presente en la superficie de dicha célula y, por lo tanto, está disponible para unirse a moléculas específicas de antígeno tales como anticuerpos o moléculas CAR añadidas a la célula.

"Célula objetivo" significará una célula que es una objetivo para una respuesta inmunitaria tal como una respuesta inmunitaria celular. Las células objetivo incluyen cualquier célula indeseable tal como una célula cancerosa. En realizaciones preferidas, la célula objetivo es una célula que expresa un antígeno objetivo que preferiblemente está presente en la superficie celular.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, es decir, a una parte o fragmento de la molécula que es reconocida, es decir, unida, por el sistema inmunitario, por ejemplo, que es reconocida por un anticuerpo o CAR. Por ejemplo, los epítopos son los sitios tridimensionales discretos en un antígeno, que son reconocidos por el sistema inmunitario. Los epítopos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión a los primeros pero no a los últimos se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Preferiblemente, un epítopo es capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra el antígeno o una célula que expresa el antígeno. Preferiblemente, el término se refiere a una porción inmunogénica de un antígeno. Un epítopo de una proteína tal como un antígeno tumoral comprende preferiblemente una porción continua o discontinua de dicha proteína y tiene preferiblemente entre 5 y 100, preferiblemente entre 5 y 50, más preferiblemente entre 8 y 30, lo más preferiblemente entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferiblemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud.

"Procesamiento de antígeno" se refiere a la degradación de un antígeno en productos de procesamiento, que son fragmentos de dicho antígeno (p. ej., la degradación de una proteína en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (p. ej., mediante unión) con moléculas del MHC para presentación por células, preferiblemente células presentadoras de antígeno a células T específicas.

Una célula presentadora de antígeno (APC) es una célula que muestra antígeno en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en su superficie. Las células T pueden reconocer este complejo usando su receptor de células T (TCR). Las células presentadoras de antígeno procesan antígenos y los presentan a las células T De acuerdo con la enseñanza, el término "célula presentadora de antígeno" incluye células presentadoras de antígeno profesionales y células presentadoras de antígeno no profesionales.

Las células presentadoras de antígeno profesionales son muy eficientes para internalizar el antígeno, ya sea por fagocitosis o por endocitosis mediada por receptor, y luego muestran un fragmento del antígeno, unido a una molécula del MHC de clase II, en su membrana. La célula T reconoce e interactúa con el complejo de molécula del MHC de clase II - antígeno en la membrana de la célula presentadora de antígeno. Luego, la célula presentadora de antígeno produce una señal coestimuladora adicional, lo que conduce a la activación de la célula T La expresión de moléculas coestimuladoras es una característica definitoria de las células presentadoras de antígeno profesionales.

Los tipos principales de células presentadoras de antígeno profesionales son las células dendríticas, que tienen la gama más amplia de presentación de antígenos y son probablemente las células presentadoras de antígeno más importantes, los macrófagos, las células B y ciertas células epiteliales activadas.

Las células presentadoras de antígeno no profesionales no expresan constitutivamente las proteínas del MHC de clase II necesarias para la interacción con las células T no modificadas; estas se expresan sólo tras la estimulación de las células presentadoras de antígeno no profesionales por ciertas citoquinas tales como IFN^y.

Las células dendríticas (DC) son poblaciones de leucocitos que presentan antígenos capturados en tejidos periféricos a las células T a través de vías de presentación de antígeno del MHC de clase II y I. Es bien sabido que las células dendríticas son potentes inductores de respuestas inmunes y la activación de estas células es una etapa crítica para la inducción de inmunidad antitumoral.

Las células dendríticas y los progenitores pueden obtenerse de sangre periférica, médula ósea, células infiltrantes de tumores, células infiltrantes de tejidos peritumorales, nódulos linfáticos, bazo, piel, sangre del cordón umbilical o cualquier otro tejido o fluido adecuado. Por ejemplo, las células dendríticas pueden diferenciarse ex vivo añadiendo una combinación de citocinas tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o TNFα a cultivos de monocitos extraídos de sangre periférica. Alternativamente, las células positivas para CD34 recolectadas de sangre periférica, sangre de cordón umbilical o médula ósea pueden diferenciarse en células dendríticas agregando al medio de cultivo combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNFα, ligando CD40, LPS, ligando flt3 y/u otro u otros compuestos que induce o inducen la diferenciación, maduración y proliferación de células dendríticas.

Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", que pueden usarse como una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, esta nomenclatura no debe interpretarse para excluir todas las posibles etapas intermedias de diferenciación.

Las células dendríticas inmaduras se caracterizan por ser células presentadoras de antígeno con una alta capacidad de captación y procesamiento de antígenos, lo que se correlaciona con la alta expresión del receptor de Fcy y del receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una menor expresión de estos marcadores, pero una alta expresión de moléculas de la superficie celular responsables de la activación de las células T, tales como el MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (p. ej., CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (p. ej., CD40, CD80, CD86 y 4-1 BB).

La maduración de las células dendríticas se conoce como el estado de activación de las células dendríticas en el que tales células dendríticas presentadoras de antígeno conducen al cebado de las células T, mientras que la presentación por células dendríticas inmaduras da como resultado la tolerancia. La maduración de las células dendríticas es causada principalmente por biomoléculas con características microbianas detectadas por receptores innatos (ADN bacteriano, ARN viral, endotoxina, etc.), citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IFN), ligación de CD40 en la superficie de la célula dendrítica por CD40L, y sustancias liberadas por células que sufren muerte celular estresante. Las células dendríticas se pueden obtener mediante el cultivo de células de la médula ósea in vitro con citocinas, tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral alfa.

El término "inmunogenicidad" se refiere a la eficacia relativa de un antígeno para inducir una reacción inmunitaria.

El término "funciones efectoras inmunitarias" en el contexto de la presente enseñanza incluye cualquier función mediada por componentes del sistema inmunitario que resulten, por ejemplo, en la destrucción de células enfermas tales como células tumorales, o en la inhibición del crecimiento tumoral y/o o inhibición del desarrollo tumoral, incluyendo inhibición de la diseminación tumoral y metástasis. Preferiblemente, las funciones efectoras inmunitarias en el contexto de la presente enseñanza son funciones efectoras mediadas por células T Tales funciones comprenden en el caso de una célula T colaborador (célula T CD4+) la liberación de citoquinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B, y en el caso de CTL la eliminación de células, es decir, células caracterizadas por la expresión de un antígeno, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforina, producción de citocinas tales como IFN-^y y TNF-a, y destrucción citolítica específica de células objetivo que expresan antígeno.

El término "célula inmunorreactiva" o "célula efectora inmunológica" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a una célula que ejerce funciones efectoras durante una reacción inmunológica. Una "célula inmunorreactiva" preferiblemente es capaz de unirse a un antígeno tal como un antígeno expresado en la superficie de una célula y mediar en una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, tales células secretan citoquinas y/o quimioquinas, matan microbios, secretan anticuerpos, reconocen células infectadas o cancerosas y, opcionalmente, eliminan tales células. Por ejemplo, las células inmunorreactivas comprenden células T (células T citotóxicas, células T colaboradoras, células T infiltrantes de tumores), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas. Preferiblemente, en el contexto de la presente enseñanza, "células inmunorreactivas" son células T, preferiblemente células T CD4+ y/o CD8+. De acuerdo con la enseñanza, el término "célula inmunorreactiva" también incluye una célula que puede madurar en una célula inmune (tal como una célula T, en particular una célula T colaboradora o una célula T citolítica) con una estimulación adecuada. Las células inmunorreactivas comprenden células madre hematopoyéticas CD34+, células T inmaduras y maduras y células B inmaduras y maduras. La diferenciación de precursores de células T en células T citolíticas, cuando se exponen a un antígeno, es similar a la selección clonal del sistema inmunitario.

Preferiblemente, una "célula inmunorreactiva" reconoce un antígeno con cierto grado de especificidad, en particular si está presente en la superficie de células presentadoras de antígeno o células enfermas tales como células cancerosas. Preferiblemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno sea sensible o reactiva. Si la célula es una célula T colaboradora (célula T CD4+), tal capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la liberación de citoquinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B. Si la célula es un CTL, dicha capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la eliminación de células, es decir, células caracterizadas por la expresión de un antígeno, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforina. De acuerdo con la enseñanza, la capacidad de respuesta de CTL puede incluir flujo de calcio sostenido, división celular, producción de citoquinas tales como IFN-^y y TNF-a, sobrerregulación de marcadores de activación tales como CD44 y CD69, y destrucción citolítica específica de células objetivo que expresan antígeno. La capacidad de respuesta de CTL también se puede determinar utilizando un indicador artificial que indica con precisión la capacidad de respuesta de CTL. Dichos CTL que reconocen un antígeno y son sensibles o reactivos también se denominan "CTL sensibles a antígeno" en el presente documento.

Una "célula linfoide" es una célula que, opcionalmente después de una modificación adecuada, por ejemplo, después de la transferencia de un receptor de células T o CAR, es capaz de producir una respuesta inmunitaria tal como una respuesta inmunitaria celular, o una célula precursora de dicha célula, e incluye linfocitos, preferiblemente linfocitos T, linfoblastos y células plasmáticas. Una célula linfoide puede ser una célula inmunorreactiva como se describe en el presente documento. Una célula linfoide preferida es una célula T que puede modificarse para expresar un receptor de células T o CAR en la superficie celular. En una realización, la célula linfoide carece de expresión endógena de un receptor de células T.

Los términos "célula T" y "linfocito T" se usan indistintamente en el presente documento e incluyen células T colaboradoras (células T CD4+) y células T citotóxicas (CTL, células T CD8+) que comprenden células T citolíticas.

Las células T pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos y juegan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos, tales como las células B y las células asesinas naturales, por la presencia de un receptor especial en su superficie celular llamado receptores de células T (TCR). El timo es el principal órgano responsable de la maduración de las células T. Se han descubierto varios subconjuntos diferentes de células T, cada uno con una función distinta.

Las células T colaboradoras ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluida la maduración de las células B en células plasmáticas y la activación de las células T citotóxicas y los macrófagos, entre otras funciones. Estas células también se conocen como células T CD4+ porque expresan la proteína CD4 en su superficie. Las células T colaboradoras se activan cuando se les presentan antígenos peptídicos por moléculas del MHC de clase II que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC). Una vez activadas, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas que regulan o ayudan en la respuesta inmunitaria activa.

Las células T citotóxicas destruyen células infectadas por virus y células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Estas células también se conocen como células T CD8+, ya que expresan la glicoproteína CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus objetivos al unirse al antígeno asociado con el MHC de clase I, que está presente en la superficie de casi todas las células del cuerpo.

La mayoría de las células T tienen un receptor de células T (TCR) que existe como un complejo de varias proteínas. El receptor de células T real se compone de dos cadenas peptídicas separadas, que se producen a partir de los genes alfa y beta de los receptores de células T independientes (TCRa y TCRp) y se denominan cadenas a y p del TCR. Las células T ^y6 (células T gamma delta) representan un pequeño subconjunto de células T que poseen un receptor de células T distinto (TCR) en su superficie. Sin embargo, en las células T ^y6, el TCR se compone de una cadena ^y y una cadena 6. Este grupo de células T es mucho menos común (2% del total de células T) que las células T ap.

Todas las células T se originan a partir de células madre hematopoyéticas en la médula ósea. Los progenitores hematopoyéticos derivados de las células madre hematopoyéticas pueblan el timo y se expanden por división celular para generar una gran población de timocitos inmaduros. Los primeros timocitos no expresan ni CD4 ni CD8 y, por lo tanto, se clasifican como células doblemente negativas (CD4-CD8-). A medida que avanzan en su desarrollo, se convierten en timocitos doblemente positivos (CD4+CD8+) y finalmente maduran a timocitos positivos simples (CD4+CD8- o CD4-CD8+) que luego se liberan del timo a los tejidos periféricos.

Las células T generalmente se pueden preparar in vitro o ex-vivo, utilizando procedimientos estándar. Por ejemplo, las células T se pueden aislar de la médula ósea, la sangre periférica o una fracción de la médula ósea o de la sangre periférica de un mamífero, tal como un paciente, usando un sistema de separación de células comercialmente disponible. Alternativamente, las células T pueden derivarse de humanos, animales no humanos, líneas celulares o cultivos relacionados o no relacionados. Una muestra que comprende células T puede ser, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC).

Las células T a usar de acuerdo con la enseñanza pueden expresar un receptor de células T endógeno o pueden carecer de expresión de un receptor de células T endógeno.

Los ácidos nucleicos tales como el ARN que codifica un CAR pueden introducirse en las células T o en otras células con potencial lítico, en particular las células linfoides.

El término "CAR dirigido a un antígeno" se refiere a un CAR que, cuando está presente en una célula inmunorreactiva, tal como una célula T, reconoce el antígeno, tal como en la superficie de las células presentadoras de antígeno o células enfermas, tales como las células cancerosas, de modo que la célula inmunorreactiva se estimula, ceba y/o expande o ejerce funciones efectoras de células inmunorreactivas como se describió anteriormente.

El término "célula T específica de antígeno" o términos similares se refieren a una célula T que, en particular cuando se le proporciona un CAR, reconoce el antígeno al que se dirige el CAR, como en la superficie de células presentadoras de antígeno o células enfermas como células cancerosas y ejerce preferiblemente funciones efectoras de células T como se ha descrito anteriormente. Se considera que las células T y otras células linfoides son específicas para el antígeno si las células matan las células objetivo que expresan un antígeno. La especificidad de las células T puede evaluarse usando cualquiera de una variedad de técnicas estándar, por ejemplo, dentro de un ensayo de liberación de cromo o ensayo de proliferación. Como alternativa, se puede medir la síntesis de linfocinas (como el interferón y).

El término "complejo principal de histocompatibilidad" y la abreviatura "MHC" incluyen moléculas del MHC clase I y MHC clase II y se relacionan con un complejo de genes que se presenta en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas del MHC son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígeno o células enfermas en reacciones inmunitarias, en las que las proteínas o moléculas del MHC se unen a péptidos y los presentan para que los reconozcan los receptores de células T Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y muestran tanto antígenos propios (fragmentos peptídicos de la propia célula) como antígenos ajenos (p. ej., fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T.

De acuerdo con la enseñanza, el término "receptor de antígeno quimérico (CAR)" es sinónimo de los términos "receptor de células T quimérico" y "receptor de células T artificial".

Estos términos se relacionan con receptores modificados, que confieren una especificidad arbitraria, como la especificidad de un anticuerpo monoclonal, a una célula efectora inmunitaria, tal como una célula T. De esta manera, se puede generar una gran cantidad de células T específicas de cáncer para la transferencia de células adoptivas. Por lo tanto, un CAR puede estar presente en las células T, p. ej., en lugar de o además receptor de células T propio de la célula T. Dichas células T no requieren necesariamente el procesamiento y la presentación de un antígeno para el reconocimiento de la célula objetivo, sino que pueden reconocer preferiblemente con especificidad cualquier antígeno presente en una célula objetivo. Preferiblemente, dicho CAR se expresa en la superficie de las células. A los efectos de la presente enseñanza, las células T que comprenden un CAR están comprendidas por el término "célula T" como se usa en el presente documento.

De acuerdo con la enseñanza, el término "CAR" (o "receptor de antígeno quimérico") se refiere a un receptor artificial que comprende una sola molécula o un complejo de moléculas que reconoce, es decir, se une a una estructura objetivo (por ejemplo, un antígeno) en una célula objetivo tal como una célula cancerosa (por ejemplo, mediante la unión de un dominio de unión a antígeno a un antígeno expresado en la superficie de la célula objetivo) y puede conferir especificidad a una célula efectora inmunitaria tal como una célula T que expresa dicho CAR en la superficie celular. Preferiblemente, el reconocimiento de la estructura objetivo por un CAR da como resultado la activación de una célula efectora inmunitaria que expresa dicho CAR. Un CAR puede comprender una o más unidades de proteína, comprendiendo dichas unidades de proteína uno o más dominios como se describe en el presente documento. El término "CAR" no incluye receptores de células T.

En una realización, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal se fusiona con la transmembrana y el endodominio de CD3-zeta. Dichas moléculas dan como resultado la transmisión de una señal zeta en respuesta al reconocimiento por parte del scFv de su antígeno objetivo en una célula objetivo y la destrucción de la célula objetivo que expresa el antígeno objetivo. Los dominios de reconocimiento de antígenos que también se pueden usar incluyen, entre otros, cadenas sencillas alfa y beta del receptor de células T (TCR). De hecho, casi cualquier cosa que se una a un objetivo dado con alta afinidad puede usarse como un dominio de reconocimiento de antígeno.

Después del reconocimiento del antígeno, los receptores se agrupan y se transmite una señal a la célula. A este respecto, un "dominio de señalización de células T" es un dominio, preferiblemente un endodominio, que transmite una señal de activación a la célula T después de que se une el antígeno. El componente de endodominio más utilizado es CD3-zeta.

La terapia de transferencia de células adoptivas con células T modificadas con CAR que expresan receptores de antígenos quiméricos es una terapia anticancerígena prometedora, ya que las células T modificadas con CAR pueden modificarse para dirigirse a prácticamente cualquier antígeno tumoral. Por ejemplo, las células T del paciente pueden modificarse genéticamente (modificadas genéticamente) para expresar ^c A^r dirigidos específicamente hacia antígenos en las células tumorales del paciente y luego infundirse de nuevo en el paciente.

De acuerdo con la enseñanza, un CAR puede reemplazar la función de un receptor de células T como se describió anteriormente y, en particular, puede conferir reactividad tal como actividad citolítica a una célula tal como una célula T como se describió anteriormente. Sin embargo, en contraste con la unión del receptor de células T a un complejo péptido antigénico-MHC como se describió anteriormente, un CAR puede unirse a un antígeno, en particular cuando se expresa en la superficie celular.

La cadena CD3 zeta de glicoproteína de superficie de células T es una proteína que en humanos está codificada por el gen CD247. CD3-zeta junto con los heterodímeros alfa/beta y gamma/delta del receptor de células T y CD3-gamma, CD3-delta y CD3-epsilon, forma el complejo receptor de células T-CD3. La cadena zeta juega un papel importante en el acoplamiento del reconocimiento de antígenos a varias vías de transducción de señales intracelulares. El término "CD3-zeta" se refiere preferiblemente a CD3-zeta humano y, en particular, a una proteína que comprende, preferiblemente que consiste en la secuencia de aminoácidos de la ^s E^q ID NO: 8 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.

CD28 (grupo de diferenciación 28) es una de las moléculas expresadas en las células T que proporcionan señales coestimuladoras, que son necesarias para la activación de las células T CD28 es el receptor de ^c D80 (B7.1) y CD86 (B7.2). La estimulación a través de CD28 además del receptor de células T (TCR) puede proporcionar una potente señal coestimuladora a las células T para la producción de diversas interleucinas (en particular, IL-6). El término "CD28" se refiere preferiblemente a CD28 humano y, en particular, a una proteína que comprende, preferiblemente que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.

De acuerdo con la enseñanza, los CAR generalmente pueden comprender tres dominios.

El primer dominio es el dominio de unión que reconoce y se une al antígeno.

El segundo dominio es el dominio de coestimulación. El dominio de coestimulación sirve para mejorar la proliferación y la supervivencia de los linfocitos citotóxicos tras la unión de CAR a una fracción objetivo. La identidad del dominio de coestimulación está limitada solo porque tiene la capacidad de reforzar la proliferación y supervivencia celular tras la unión de la fracción objetivo por el ^c A ^r . Los dominios de coestimulación adecuados incluyen CD28, CD137 (4-1BB), un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), CD134 (OX40), un miembro de la superfamilia de receptores TNFR, y CD278 (ICOS), una molécula coestimuladora de la superfamilia CD28 expresada en células T activadas. El experto en la materia comprenderá que las variantes de secuencia de estos dominios de coestimulación señalados se pueden usar sin afectar negativamente a la enseñanza, donde las variantes tienen la misma o similar actividad que el dominio en el que se modelan. Dichas variantes tendrán al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio del que derivan. En algunas realizaciones de la enseñanza, las construcciones de CAR comprenden dos dominios de coestimulación.

Si bien las combinaciones particulares incluyen todas las variaciones posibles de los cuatro dominios señalados, los ejemplos específicos incluyen CD28+CD137 (4-1BB) y CD28+CD134 (OX40).

El tercer dominio es el dominio de señalización de activación (o dominio de señalización de células T). El dominio de señalización de activación sirve para activar los linfocitos citotóxicos tras la unión del CAR al antígeno. La identidad del dominio de señalización de activación está limitada únicamente porque tiene la capacidad de inducir la activación del linfocito citotóxico seleccionado tras la unión del antígeno por el CAR. Los dominios de señalización de activación adecuados incluyen la cadena de células T CD3[zeta] y el receptor Fc [gamma]. El experto en la materia comprenderá que las variantes de secuencia de estos dominios de señalización de activación señalados se pueden usar sin afectar negativamente a la enseñanza, donde las variantes tienen la misma o similar actividad que el dominio en el que se modelan. Dichas variantes tendrán al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio del que derivan.

Los CAR de la presente enseñanza pueden comprender los tres dominios, juntos en forma de proteína de fusión. Dichas proteínas de fusión generalmente comprenderán un dominio de unión, uno o más dominios de coestimulación y un dominio de señalización de activación, unidos en una dirección del extremo terminal N al extremo terminal C. Sin embargo, los CAR de la presente enseñanza no se limitan a esta disposición y otras disposiciones son aceptables e incluyen un dominio de unión, un dominio de señalización de activación y uno o más dominios de coestimulación. Se entenderá que debido a que el dominio de unión debe estar libre para unirse al antígeno, la colocación del dominio de unión en la proteína de fusión será generalmente tal que se consiga la presentación de la región en el exterior de la célula. De la misma manera, debido a que los dominios de señalización de coestimulación y activación sirven para inducir la actividad y proliferación de los linfocitos citotóxicos, la proteína de fusión generalmente exhibirá estos dos dominios en el interior de la célula. Los CAR pueden incluir elementos adicionales, tales como un péptido señal para garantizar la exportación adecuada de la proteína de fusión a la superficie celular, un dominio transmembrana para garantizar que la proteína de fusión se mantenga como una proteína de membrana integral y un dominio bisagra (o región espaciadora) que imparte flexibilidad al dominio de unión y permite una fuerte unión al antígeno.

Las células utilizadas en relación con el sistema CAR de la presente enseñanza son preferiblemente células T, en particular linfocitos citotóxicos, preferiblemente seleccionados de células T citotóxicas, células asesinas naturales (NK) y células asesinas activadas por linfoquinas (LAK). Tras la activación, cada uno de estos linfocitos citotóxicos desencadena la destrucción de las células objetivo. Por ejemplo, las células T citotóxicas desencadenan la destrucción de las células objetivo por uno o ambos de los siguientes medios. Primero, tras la activación, las células T liberan citotoxinas como perforina, granzimas y granulisina. La perforina y la granulisina crean poros en la célula objetivo, y las granzimas entran en la célula y desencadenan una cascada de caspasas en el citoplasma que induce la apoptosis (muerte celular programada) de la célula. En segundo lugar, se puede inducir la apoptosis a través de la interacción del ligando Fas-Fas entre las células T y las células objetivo. Los linfocitos citotóxicos serán preferiblemente células autólogas, aunque se pueden utilizar células heterólogas o células alogénicas.

Puede usarse una variedad de métodos para introducir construcciones de CAR en células T que incluyen transfección de ADN no basada en virus, sistemas basados en transposones y sistemas basados en virus. La transfección de ADN no viral tiene un bajo riesgo de mutagénesis por inserción. Los sistemas basados en transposones pueden integrar transgenes más eficientemente que los plásmidos que no contienen un elemento integrador. Los sistemas basados en virus incluyen el uso de retrovirus ^y y vectores lentivirales. Los retrovirus ^y son relativamente fáciles de producir, transducen células T de manera eficiente y permanente, y se ha demostrado preliminarmente que son seguros desde el punto de vista de la integración en células T humanas primarias. Los vectores lentivirales también transducen eficiente y permanentemente las células T pero son más costosos de fabricar. También son potencialmente más seguros que los sistemas basados en retrovirus.

El término "inmunoglobulina" se refiere a proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas, preferiblemente a receptores de antígenos tales como anticuerpos o el receptor de células B (BCR). Las inmunoglobulinas se caracterizan por un dominio estructural, es decir, el dominio de inmunoglobulina, que tiene un pliegue de inmunoglobulina (Ig) característico. El término abarca inmunoglobulinas unidas a la membrana así como inmunoglobulinas solubles. Las inmunoglobulinas unidas a membrana también se denominan inmunoglobulinas de superficie o inmunoglobulinas de membrana, que generalmente forman parte del BCR. Las inmunoglobulinas solubles se denominan generalmente anticuerpos. Las inmunoglobulinas generalmente comprenden varias cadenas, normalmente dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas mediante enlaces disulfuro. Estas cadenas se componen principalmente de dominios de inmunoglobulina, tales como el dominio Vl (cadena ligera variable), dominio C^l (cadena ligera constante), y los dominios C^h (cadena pesada constante) C^h1, C^h2, C^h3 y C^h4. Hay cinco tipos de cadenas pesadas de inmunoglobulina de mamífero, es decir, a, 8, £, ^y y M, que representan las diferentes clases de anticuerpos, es decir, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. A diferencia de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas solubles, las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas de membrana o de superficie comprenden un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático corto en su extremo terminal carboxilo. En los mamíferos hay dos tipos de cadenas ligeras, es decir, lambda y kappa. Las cadenas de inmunoglobulina comprenden una región variable y una región constante. La región constante se conserva esencialmente dentro de los diferentes isotipos de las inmunoglobulinas, donde la parte variable es muy diversa y explica el reconocimiento del antígeno.

El término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos quiméricos. Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el extremo terminal amino hasta el extremo terminal carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluidas varias células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad y afinidad de unión. En una realización, los anticuerpos monoclonales son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano, por ejemplo, un ratón, fusionada con una célula inmortalizada.

El término "anticuerpo recombinante", como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, p. ej., de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatorios recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina con otras secuencias de ADN.

El término "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio) in vitro o por mutación somática in vivo).

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión al antígeno que se deriva sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, donde la estructura restante de la inmunoglobulina de la molécula se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión al antígeno puede comprender dominios variables completos fusionados en dominios constantes o solo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) injertadas en regiones marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión al antígeno pueden ser de tipo silvestre o modificados por una o más sustituciones de aminoácidos, p. ej., modificados para parecerse más a las inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen una o más CDR que están alteradas con respecto al anticuerpo original.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a aquellos anticuerpos en los que una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera es homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase en particular, mientras que el segmento restante de la cadena es homóloga a las secuencias correspondientes en otra. Normalmente, la región variable de las cadenas ligera y pesada imita las regiones variables de los anticuerpos derivados de una especie de mamífero, mientras que las porciones constantes son homólogas a las secuencias de los anticuerpos derivados de otra. Una clara ventaja de tales formas quiméricas es que la región variable puede derivarse convenientemente de fuentes actualmente conocidas usando células B fácilmente disponibles o hibridomas de organismos huéspedes no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Si bien la región variable tiene la ventaja de la facilidad de preparación y la especificidad no se ve afectada por la fuente, la región constante, que es humana, tiene menos probabilidades de provocar una respuesta inmunitaria de un sujeto humano cuando se inyectan los anticuerpos que la región constante de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular.

Los anticuerpos pueden proceder de diferentes especies, incluidas, entre otras, ratón, rata, conejo, conejillo de indias y ser humano.

Los anticuerpos descritos en este documento incluyen anticuerpos IgA tales como IgA1 o IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM e IgD. En varias realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, más particularmente un isotipo IgG1 kappa o IgG1 lambda (es decir, IgG1, ^k, A), un anticuerpo IgG2a (por ejemplo, IgG2a, ^k, A), un anticuerpo IgG2b (por ejemplo, IgG2b, k, A), un anticuerpo IgG3 (por ejemplo, IgG3, k, A) o un anticuerpo IgG4 (por ejemplo, IgG4, k, A).

Los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de unión") o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "fragmento de unión") o términos similares se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos en el término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consisten en los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab')₂, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) fragmentos Fd que consisten en los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consisten en un dominio VH; (vi) regiones determinantes de la complementariedad (CDR) aisladas, y (vii) combinaciones de dos o más CDR aisladas que pueden unirse opcionalmente mediante un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse mediante métodos recombinantes mediante un enlazador sintético que les permite formar una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Houston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85: 5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena sencilla también pretenden estar incluidos en el término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Otro ejemplo son las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido de dominio de unión que se fusiona con un polipéptido de región bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH₂ de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región bisagra y (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región constante CH₂. El polipéptido del dominio de unión puede ser una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión se describen adicionalmente en el documento US 2003/0118592 y el documento US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se seleccionan para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

De acuerdo con la enseñanza, el término "dominio de unión a antígeno" incluye y preferiblemente se refiere a la porción de unión a antígeno de un anticuerpo contra el antígeno, es decir, un anticuerpo que se dirige contra el antígeno y es preferiblemente específico para el antígeno.

El término "dominio de unión" caracteriza en relación con la presente enseñanza una estructura, por ejemplo, de un anticuerpo, que se une a/interactúa con una estructura/antígeno/epítopo objetivo dado. Por lo tanto, el dominio de unión de acuerdo con la enseñanza designa un "sitio de interacción de antígeno".

Los anticuerpos y derivados de anticuerpos son útiles para proporcionar dominios de unión tales como fragmentos de anticuerpos, en particular para proporcionar regiones Vl y Vh .

Un dominio de unión para un antígeno que puede estar presente dentro de un CAR tiene la capacidad de unirse (dirigirse a) un antígeno, es decir, la capacidad de unirse (dirigirse a) un epítopo presente en un antígeno, preferiblemente un epítopo ubicado dentro del dominio extracelular de un antígeno. Preferiblemente, un dominio de unión para un antígeno es específico para el antígeno. Preferiblemente, un dominio de unión para un antígeno se une al antígeno expresado en la superficie celular. En realizaciones particularmente preferidas, un dominio de unión para un antígeno se une a epítopos nativos de un antígeno presente en la superficie de las células vivas.

Todos los anticuerpos y derivados de anticuerpos tales como fragmentos de anticuerpos como se describe en este documento para los fines de la enseñanza están abarcados por el término "anticuerpo".

Los anticuerpos se pueden producir mediante una variedad de técnicas, incluida la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B o técnicas de presentación en fagos usando bibliotecas de genes de anticuerpos.

El sistema animal preferido para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos en la técnica. También se conocen compañeros de fusión (p. ej., células de mieloma murino) y procedimientos de fusión.

Otros sistemas animales preferidos para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales son el sistema de rata y conejo (por ejemplo, descrito en Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 92: 9348 (1995), véase también Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).

Para generar anticuerpos, los ratones pueden inmunizarse con péptidos conjugados con portadores derivados de la secuencia del antígeno, es decir, la secuencia contra la que se dirigen los anticuerpos, una preparación enriquecida de antígeno expresado de forma recombinante o fragmentos del mismo y/o células que expresan el antígeno, como se describe. Alternativamente, los ratones pueden inmunizarse con ADN que codifica el antígeno o fragmentos del mismo. En el caso de que las inmunizaciones que utilizan una preparación purificada o enriquecida del antígeno no den como resultado anticuerpos, los ratones también pueden inmunizarse con células que expresan el antígeno, por ejemplo, una línea celular, para promover respuestas inmunitarias.

La respuesta inmunitaria se puede controlar durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma y suero que se obtienen mediante sangrado de la vena de la cola o retroorbital. Para las fusiones se pueden utilizar ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina. Los ratones se pueden reforzar por vía intraperitoneal o intravenosa con células que expresan antígenos 3 días antes del sacrificio y la extracción del bazo para aumentar la tasa de hibridomas secretores de anticuerpos específicos.

Para generar hibridomas que produzcan anticuerpos monoclonales, pueden aislarse esplenocitos y células de nódulo linfático de ratones inmunizados y fusionarse con una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. A continuación, los hibridomas resultantes pueden examinarse para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. A continuación, los pocillos individuales pueden examinarse mediante ELISA para detectar hibridomas secretores de anticuerpos. Mediante análisis de inmunofluorescencia y FACS utilizando células que expresan antígenos, se pueden identificar anticuerpos con especificidad para el antígeno. Los hibridomas secretores de anticuerpos se pueden volver a sembrar en placa, examinar de nuevo y, si siguen siendo positivos para anticuerpos monoclonales, se pueden subclonar mediante dilución limitante. Los subclones estables pueden luego ser cultivados in vitro para generar anticuerpos en medio de cultivo de tejidos para su caracterización.

La capacidad de los anticuerpos y otros agentes de unión para unirse a un antígeno se puede determinar utilizando ensayos de unión estándar (p. ej., ELISA, transferencia Western, inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo).

El término "unión" de acuerdo con la enseñanza se refiere preferiblemente a una unión específica.

De acuerdo con la presente enseñanza, un agente tal como un CAR es capaz de unirse (dirigirse) a un objetivo predeterminado si tiene una afinidad significativa por dicho objetivo predeterminado y se une a dicho objetivo predeterminado en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" a menudo se mide por la constante de disociación de equilibrio (K^d). Preferiblemente, el término "afinidad significativa" se refiere a la unión a un objetivo predeterminado con una constante de disociación (K^d) de 10-5 M o inferior, 10-6 M o inferior, 10-7 M o inferior, 10-8 M o inferior, 10-9 M o inferior, 10-10 M o inferior, 10-11 M o inferior, o 10-12 M o inferior.

Un agente no es (sustancialmente) capaz de unirse (dirigirse) a un objetivo si no tiene una afinidad significativa por dicho objetivo y no se une significativamente, en particular, no se une de manera detectable, a dicho objetivo en ensayos estándar. Preferiblemente, el agente no se une de manera detectable a dicho objetivo si está presente en una concentración de hasta 2, preferiblemente 10, más preferiblemente 20, en particular 50 o 100 μg/ml o superior. Preferiblemente, un agente no tiene una afinidad significativa por un objetivo si se une a dicho objetivo con una K^d que es al menos 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, o 106 veces superior que la K^d para unirse al objetivo predeterminado al que el agente es capaz de unirse. Por ejemplo, si la K^d para la unión de un agente al objetivo al que el agente es capaz de unirse es 10-7 M, la K^d para unirse a un objetivo por el cual el agente no tiene una afinidad significativa sería de al menos 10-6 M, 10-5 M, 10^-4 M, 10-3 M, 10-2 M, o 10-1 M.

Un agente es específico para un objetivo predeterminado si es capaz de unirse a dicho objetivo predeterminado mientras que no es (sustancialmente) capaz de unirse a otros objetivos, es decir, no tiene una afinidad significativa por otros objetivos y no se une significativamente a otros objetivos en ensayos estándar. Preferiblemente, un agente es específico para un objetivo predeterminado si la afinidad y la unión a dichos otros objetivos no exceden significativamente la afinidad o la unión a proteínas que no están relacionadas con un objetivo predeterminado, como la albúmina de suero bovino (BSA), la caseína o albúmina sérica humana (HSA). Preferiblemente, un agente es específico para un objetivo predeterminado si se une a dicho objetivo con una K^d que es al menos 10 veces, 100 veces, 103veces, 104 veces, 105 veces, o 106 veces más bajo que la Kd para unirse a un objetivo para el que no es específico. Por ejemplo, si la K^d para la unión de un agente al objetivo para el que es específico es 10-7 M, la K^d para unirse a un objetivo para el que no es específico sería al menos 10-6 M, 10-5 M, 10^-4 M, 10-3 M, 10^-2 M, o 10-1 M.

La unión de un agente a un objetivo puede determinarse experimentalmente utilizando cualquier método adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press New York, NY (1984), Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company Nueva York, NY (1992), y los métodos descritos en este documento. Las afinidades pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales, tal como mediante diálisis de equilibrio; utilizando el instrumento BIAcore 2000, siguiendo los procedimientos generales descritos por el fabricante; por radioinmunoensayo utilizando antígeno objetivo radiomarcado; o por otro método conocido por el experto en la materia. Los datos de afinidad pueden analizarse, por ejemplo, por el método de Scatchard et al., Ann New York Acad. ScL, 51: 660 (1949). La afinidad medida de una interacción antígeno-anticuerpo particular puede variar si se mide en diferentes condiciones, por ejemplo, concentración de sal, pH. Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión a antígeno, por ejemplo, K^d, IC50, se preparan preferiblemente con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado.

Preferiblemente, de acuerdo con la enseñanza, se introduce en un mamífero un ácido nucleico como el ARN que codifica un antígeno o una variante del mismo. El ácido nucleico se incorpora a las células presentadoras de antígeno del mamífero (monocitos, macrófagos, células dendríticas u otras células). Se forma un producto de traducción antigénica del ácido nucleico y el producto se muestra en la superficie de las células para que lo reconozcan las células T modificadas con CAR dirigidas al antígeno.

Alternativamente, la presente enseñanza prevé realizaciones en las que un ácido nucleico que expresa un antígeno mencionado en este documento se introduce en células presentadoras de antígeno ex vivo, por ejemplo, células presentadoras de antígeno tomadas de un paciente, y las células presentadoras de antígeno, opcionalmente propagadas clonalmente ex vivo, se trasplantan de nuevo al mismo paciente. Las células transfectadas pueden reintroducirse en el paciente usando cualquier medio conocido en la técnica, preferiblemente en forma estéril mediante administración intravenosa, intracavitaria, intraperitoneal o intratumoral.

Los métodos de la enseñanza pueden implicar una célula presentadora de antígenos para expresar el ácido nucleico que codifica el antígeno o una variante del mismo. Con este fin, los métodos de la enseñanza pueden implicar la introducción de ácidos nucleicos que codifican antígenos en células presentadoras de antígeno tales como células dendríticas. Para la transfección de células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas, se puede usar una composición farmacéutica que comprende ácido nucleico que codifica el antígeno. Se puede administrar a un paciente un vehículo de administración que dirige el ácido nucleico a una célula dendrítica u otra célula presentadora de antígeno, lo que da como resultado una transfección que ocurre in vivo.

De acuerdo con la enseñanza, se prefiere usar formulaciones del ácido nucleico que codifica un antígeno o una variante del mismo que administra el ácido nucleico con alta selectividad a células presentadoras de antígeno tales como células dendríticas (DC) en el bazo después de la administración sistémica. Por ejemplo, las formulaciones de nanopartículas de ARN con un tamaño de partícula definido en las que la carga neta de las partículas es cercana a cero o negativa, como los lipoplejos electrónicamente neutros o cargados negativamente de ARN y liposomas, p. ej., lipoplejos que comprenden DOTMA y DOPE o DOTMA y colesterol conducen a una expresión sustancial de a Rn en las DC del bazo después de la administración sistémica. Se determinó una fuerte expresión en las células objetivo (bazo) mientras que la expresión en otros órganos fue baja.

Como se usa en el presente documento, el término "nanopartícula" se refiere a cualquier partícula que tenga un diámetro que la haga adecuada para la administración sistémica, en particular parenteral, de, en particular, ácidos nucleicos, típicamente un diámetro de menos de 1000 nanómetros (nm). En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene un diámetro de menos de 600 nm. En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene un diámetro de menos de 400 nm.

Como se usa en el presente documento, el término "formulación de nanopartículas" o términos similares se refieren a cualquier sustancia que contiene al menos una nanopartícula. En algunas realizaciones, una composición de nanopartículas es una colección uniforme de nanopartículas. En algunas realizaciones, las composiciones de nanopartículas son dispersiones o emulsiones. En general, se forma una dispersión o emulsión cuando se combinan al menos dos materiales inmiscibles.

El término "lipoplejo" o "lipoplejo de ácido nucleico", en particular "lipoplejo de ARN", se refiere a un complejo de lípidos y ácidos nucleicos, en particular ARN. Los lipoplejos se forman espontáneamente cuando los liposomas catiónicos, que a menudo también incluyen un lípido auxiliar neutro, se mezclan con ácidos nucleicos.

Si la presente enseñanza se refiere a una carga tal como una carga positiva, una carga negativa o una carga neutra o un compuesto catiónico, un compuesto negativo o un compuesto neutro, esto generalmente significa que la carga mencionada está presente a un pH seleccionado, tal como un pH fisiológico. Por ejemplo, el término "lípido catiónico" significa un lípido que tiene una carga neta positiva a un pH seleccionado, tal como un pH fisiológico. El término "lípido neutro" significa un lípido que no tiene carga positiva o negativa neta y puede estar presente en forma de un ión anfótero neutro o sin carga a un pH seleccionado, tal como un pH fisiológico. Por "pH fisiológico" se entiende en el presente documento un pH de aproximadamente 7.5.

Los transportadores de nanopartículas, como los transportadores de lípidos contemplados para su uso en la presente enseñanza, incluyen cualquier sustancia o vehículo con el que se pueda asociar un ácido nucleico como el ARN, por ejemplo, formando complejos con el ácido nucleico o formando vesículas en las que el ácido nucleico está encerrado o encapsulado. Esto puede dar como resultado una mayor estabilidad del ácido nucleico en comparación con el ácido nucleico desnudo. En particular, puede incrementarse la estabilidad del ácido nucleico en la sangre.

Los lípidos catiónicos, los polímeros catiónicos y otras sustancias con carga positiva pueden formar complejos con ácidos nucleicos con carga negativa. Estas moléculas catiónicas pueden usarse para complejar ácidos nucleicos, formando así, p. ej., los llamados lipoplejos o poliplejos, respectivamente, y se ha demostrado que estos complejos liberan ácidos nucleicos en las células.

Las preparaciones de ácido nucleico en nanopartículas para usar en la presente enseñanza pueden obtenerse mediante varios protocolos y a partir de varios compuestos complejantes de ácido nucleico. Los lípidos, polímeros, oligómeros o anfífilos son agentes complejantes típicos. En una realización, el compuesto complejante comprende al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en protamina, polietilenimina, una poli-L-lisina, una poli-L-arginina o una histona.

De acuerdo con la enseñanza, la protamina es útil como agente portador catiónico. El término "protamina" se refiere a cualquiera de varias proteínas fuertemente básicas de peso molecular relativamente bajo que son ricas en arginina y se encuentran asociadas especialmente con el ADN en lugar de histonas somáticas en las células espermáticas de varios animales (como peces). En particular, el término "protamina" se refiere a las proteínas que se encuentran en el esperma de los peces que son fuertemente básicas, son solubles en agua, no se coagulan con el calor y producen principalmente arginina tras la hidrólisis. En forma purificada, se utilizan en una formulación de insulina de acción prolongada y para neutralizar los efectos anticoagulantes de la heparina.

De acuerdo con la enseñanza, el término "protamina" tal como se usa en el presente documento pretende comprender cualquier secuencia de aminoácidos de protamina obtenida o derivada de fuentes nativas o biológicas, incluidos fragmentos de la misma y formas multiméricas de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento de la misma. Además, el término abarca polipéptidos (sintetizados) que son artificiales y están específicamente diseñados para propósitos específicos y no pueden aislarse de fuentes nativas o biológicas.

La protamina utilizada de acuerdo con la presente enseñanza puede ser protamina sulfatada o clorhidrato de protamina. En una realización preferida, la fuente de protamina utilizada para la producción de las nanopartículas descritas en el presente documento es protamina 5000 que contiene protamina a más de 10 mg/ml (5000 unidades neutralizantes de heparina por ml) en una solución salina isotónica.

Los liposomas son vesículas lipídicas microscópicas que a menudo tienen una o más bicapas de un lípido formador de vesículas, tal como un fosfolípido, y son capaces de encapsular un fármaco. Pueden emplearse diferentes tipos de liposomas en el contexto de la presente enseñanza, incluyendo, sin limitarse a ellos, vesículas multilamelares (MLV), vesículas unilamelares pequeñas (SUV), vesículas unilamelares grandes (LUV), liposomas estéricamente estabilizados (SSL), vesículas multivesiculares (MV) y vesículas multivesiculares grandes (LMV), así como otras formas bicapa conocidas en la técnica. El tamaño y la lamelaridad del liposoma dependerán de la forma de preparación y la selección del tipo de vesículas a utilizar dependerá del modo de administración preferido. Hay varias otras formas de organización supramolecular en las que los lípidos pueden estar presentes en un medio acuoso, que comprenden fases lamelares, fases hexagonales y hexagonales inversas, fases cúbicas, micelas, micelas inversas compuestas de monocapas. Estas fases también pueden obtenerse en combinación con ADN o ARN, y la interacción con ARN y ADN puede afectar sustancialmente al estado de fase. Las fases descritas pueden estar presentes en las formulaciones de ácido nucleico en nanopartículas de la presente enseñanza.

Para la formación de lipoplejos de ácidos nucleicos a partir de ácidos nucleicos y liposomas, se puede utilizar cualquier método adecuado para formar liposomas siempre que proporcione los lipoplejos de ácidos nucleicos previstos. Los liposomas se pueden formar usando métodos estándar tales como el método de evaporación inversa (RE^v ), el método de inyección de etanol, el método de deshidratación-rehidratación (DRY), sonicación u otros métodos adecuados.

Después de la formación de los liposomas, los liposomas se pueden dimensionar para obtener una población de liposomas que tengan un intervalo de tamaño sustancialmente homogéneo.

Los lípidos formadores de bicapas suelen tener dos cadenas de hidrocarburo, en particular cadenas de acilo, y un grupo de cabeza, ya sea polar o no polar. Los lípidos formadores de bicapas están compuestos de lípidos naturales o de origen sintético, incluidos los fosfolípidos, tales como la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, el ácido fosfátido, el fosfatidilinositol y la esfingomielina, donde las dos cadenas hidrocarbonadas suelen tener entre 14 y 22 átomos de carbono en longitud, y tienen diversos grados de instauración. Otros lípidos adecuados para usar en la composición de la presente enseñanza incluyen glicolípidos y esteroles tales como colesterol y sus diversos análogos que también pueden usarse en los liposomas.

Los lípidos catiónicos suelen tener una fracción lipofílica, tal como un esterol, una cadena de acilo o diacilo, y tienen una carga positiva neta global. El grupo de cabeza del lípido normalmente lleva la carga positiva. El lípido catiónico tiene preferiblemente una carga positiva de 1 a 10 valencias, más preferiblemente una carga positiva de 1 a 3 valencias y más preferiblemente una carga positiva de 1 valencia. Los ejemplos de lípidos catiónicos incluyen, pero no se limitan a, 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio-propano (DOTMA); dimetildioctadecilamonio (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP); 1,2-diaciloxi-3-dimetilamoniopropanos; 1,2-dialquiloxi-3-dimetilamonio-propanos; cloruro de dioctadecildimetilamonio (DODAC), 1,2-dimiristoiloxipropil-1,3-dimetilhidroxietilamonio (DMRIE) y trifluoroacetato de 2,3-dioleoiloxi-N-[2(esperminacarboxamida)etil]-N,N-dimetil-1-propanamio (Do SpA). Los preferidos son DOTMA, DOTAP, DODAC y Do SpA. El más preferido es DOTMA.

Además, las nanopartículas descritas en el presente documento incluyen preferiblemente además un lípido neutro en vista de la estabilidad estructural y similares. El lípido neutro puede seleccionarse apropiadamente en vista de la eficiencia de suministro del complejo de ácido nucleico-lípido. Los ejemplos de lípidos neutros incluyen, entre otros, 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), diacilfosfatidil colina, diacilfosfatidil etanol amina, ceramida, esfingomielina, cefalina, esterol y cerebrósido. Se prefiere DOPE y/o DOPC. El más preferido es DOPE. En el caso de que un liposoma catiónico incluya tanto un lípido catiónico como un lípido neutro, la relación molar del lípido catiónico al lípido neutro puede determinarse de manera apropiada en vista de la estabilidad del liposoma y similares.

De acuerdo con una realización, las nanopartículas descritas en este documento pueden comprender fosfolípidos. Los fosfolípidos pueden ser un glicerofosfolípido. Los ejemplos de glicerofosfolípido incluyen, sin limitarse a ellos, tres tipos de lípidos: (i) fosfolípidos zwitteriónicos, que incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolina (PC), fosfatidilcolina de yema de huevo, PC derivada de soja en forma natural, parcialmente hidrogenada o totalmente hidrogenada, dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), esfingomielina (SM); (ii) fosfolípidos cargados negativamente: que incluyen, por ejemplo, fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilglicerol (PG), dipalmipoilo PG, dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG); derivados sintéticos en los que el conjugado da lugar a un fosfolípido zwitteriónico cargado negativamente, tal es el caso de metoxi-polietileno, glicol-diestearoil fosfatidiletanolamina (mPEG-DSPE); y (iii) fosfolípidos catiónicos, que incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolina o esfingomielina cuyo fosfomonoéster era O-metilado para formar los lípidos catiónicos.

La asociación del ácido nucleico con el transportador lipídico puede ocurrir, por ejemplo, cuando el ácido nucleico llena los espacios intersticiales del transportador, de modo que el transportador atrapa físicamente al ácido nucleico, o mediante enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno, o mediante adsorción por enlaces no específicos. Cualquiera que sea el modo de asociación, el ácido nucleico debe conservar sus propiedades terapéuticas, es decir, de codificación de antígenos.

En realizaciones particulares, el ácido nucleico que codifica un antígeno o una variante del mismo se administra antes, simultáneamente y/o después de la administración de células T modificadas con CAR. Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica un antígeno o una variante del mismo se administra después de la administración de células T modificadas con CAR.

Las células T modificadas con CAR y el ácido nucleico que codifica un antígeno o una variante del mismo pueden estar presentes en una composición común, es decir, mezclados entre sí. Además, también se contemplan realizaciones de acuerdo con la enseñanza en las que las células T modificadas con CAR y el ácido nucleico que codifica un antígeno o una variante del mismo están presentes juntos, pero no en la misma composición. Dichas realizaciones se refieren en particular a kits con al menos dos contenedores, donde un contenedor contiene una composición que comprende las células T modificadas con CAR y otro contenedor contiene una composición que comprende el ácido nucleico que codifica un antígeno o una variante del mismo.

De acuerdo con la enseñanza, el ácido nucleico que codifica un antígeno o una variante del mismo en una realización es ARN, preferiblemente ARNm. El ARN se obtiene preferiblemente por transcripción in vitro.

El término "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, pretende incluir ADN y ARN tales como ADN genómico, ADNc, ARNm, moléculas sintetizadas químicamente y producidas de forma recombinante. Un ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de cadena doble. El ARN incluye ARN transcrito in vitro (ARN IVT) o ARN sintético. De acuerdo con la enseñanza, un ácido nucleico es preferiblemente un ácido nucleico aislado.

Los ácidos nucleicos pueden estar comprendidos en un vector. El término "vector", como se usa en el presente documento, incluye cualquier vector conocido por el experto en la materia, incluidos vectores de plásmidos, vectores de cósmidos, vectores de fagos tales como fagos lambda, vectores virales tales como vectores adenovirales o baculovirales, o vectores cromosómicos artificiales tales como cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC) o cromosomas artificiales P1 (PAC). Dichos vectores incluyen tanto vectores de expresión como de clonación. Los vectores de expresión comprenden plásmidos así como vectores virales y generalmente contienen una secuencia de codificación deseada y secuencias de ADN apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia de codificación unida operativamente en un organismo huésped particular (por ejemplo, bacterias, levaduras, plantas, insectos o mamíferos) o en sistemas de expresión in vitro. Los vectores de clonación se utilizan generalmente para modificar y amplificar un determinado fragmento de ADN deseado y pueden carecer de las secuencias funcionales necesarias para la expresión de los fragmentos de ADN deseados.

En el contexto de la presente enseñanza, el término "ARN" se refiere a una molécula que comprende residuos de ribonucleótidos y que preferiblemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de ribonucleótidos. "Ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término incluye ARN de doble cadena, ARN de cadena sencilla, ARN aislado tal como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de forma recombinante, así como ARN modificado que difiere del ARN natural por la adición, eliminación, sustitución y/o o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el o los extremos de un ARN o internamente, por ejemplo, en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos no naturales o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden denominarse análogos o análogos del ARN natural.

De acuerdo con la presente enseñanza, el término "ARN" incluye y preferiblemente se relaciona con "ARNm" que significa "ARN mensajero" y se relaciona con un "transcrito" que puede producirse usando ADN como plantilla y codifica un péptido o proteína. El ARNm normalmente comprende una región 5' no traducida (5'-UTR), una región codificante de proteína o péptido y una región 3' no traducida (3'-UTR). El ARNm tiene un tiempo medio limitado en células e in vitro. Preferiblemente, el ARNm se produce mediante transcripción in vitro utilizando una plantilla de ADN. En una realización de la enseñanza, el ARN se obtiene por transcripción in vitro o síntesis química. La metodología de transcripción in vitro es conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, existe una variedad de kits de transcripción in vitro disponibles comercialmente.

En una realización de la presente enseñanza, el ARN es ARN autorreplicante, tal como ARN autorreplicante de cadena sencilla. En una realización, el ARN autorreplicante es ARN de cadena sencilla de sentido positivo. En una realización, el ARN autorreplicante es ARN viral o ARN derivado de ARN viral. En una realización, el ARN autorreplicante es ARN genómico alfaviral o se deriva de ARN genómico alfaviral. En una realización, el ARN autorreplicante es un vector de expresión génica viral. En una realización, el virus es el virus del bosque de Semliki. En una realización, el ARN autorreplicante contiene uno o más transgenes, al menos uno de dichos transgenes que codifican los agentes descritos en el presente documento. En una realización, si el ARN es ARN viral o se deriva de ARN viral, los transgenes pueden reemplazar parcial o completamente secuencias virales tales como secuencias virales que codifican proteínas estructurales. En una realización, el ARN autorreplicante es ARN transcrito in vitro.

Para aumentar la expresión y/o la estabilidad del ARN utilizado de acuerdo con la presente enseñanza, puede modificarse, preferiblemente sin alterar la secuencia del péptido o proteína expresado.

El término "modificación" en el contexto del ARN como se usa de acuerdo con la presente enseñanza incluye cualquier modificación del ARN que no esté presente de forma natural en dicho ARN.

En una realización de la enseñanza, el ARN usado de acuerdo con la enseñanza no tiene 5-trifosfatos desprotegidos. La eliminación de dichos 5-trifosfatos sin protección puede lograrse tratando el ARN con una fosfatasa.

El ARN de acuerdo con la enseñanza puede tener ribonucleótidos naturales o sintéticos modificados para aumentar su estabilidad y/o disminuir la citotoxicidad. Por ejemplo, en una realización, en el ARN usado de acuerdo con la enseñanza, la 5-metilcitidina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por citidina. Como alternativa o adicionalmente, en una realización, en el ARN usado de acuerdo con la enseñanza, la pseudouridina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por uridina.

En una realización, el término "modificación" se refiere a proporcionar un ARN con una protección de 5' o un análogo del protector de 5'. El término "protector de 5'" se refiere a una estructura de protección que se encuentra en el extremo 5' de una molécula de ARNm y generalmente consta de un nucleótido de guanosina conectado al ARNm a través de un enlace de 5' inusual con trifosfato 5'. En una realización, esta guanosina está metilada en la posición 7. El término "protector de 5' convencional" se refiere a un protector de 5' de ARN de origen natural, preferiblemente al protector 7-metilguanosina (m7G). En el contexto de la presente enseñanza, el término "protector de 5'" incluye un análogo del protector de 5' que se parece a la estructura del protector del ARN y se modifica para poseer la capacidad de estabilizar el ARN si se une al mismo, preferiblemente in vivo y/o en una célula.

Proporcionar un ARN con un protector de 5' o un análogo de protector de 5' se puede lograr mediante la transcripción in vitro de una plantilla de ^a Dⁿ en presencia de dicho protector de 5' o análogo de protector de 5', donde dicho protector de 5' es incorporado cotranscripcionalmente en la cadena de ARN generada, o el ARN puede generarse, por ejemplo, mediante transcripción in vitro, y el protector de 5' puede unirse al ARN después de la transcripción usando enzimas de protección, por ejemplo, enzimas de protección del virus vacuna.

El ARN puede comprender otras modificaciones. Por ejemplo, una modificación adicional del ARN utilizado en la presente enseñanza puede ser una extensión o un truncamiento de la cola de poli(A) natural o una alteración de las regiones no traducidas (UTR) 5' o 3', tal como la introducción de una UTR que no está relacionada con la región codificante de dicho ARN, por ejemplo, la inserción de una o más, preferiblemente dos copias de una 3'-UTR derivada de un gen de globina, tal como alfa2-globina, alfa1-globina, beta-globina, preferiblemente beta-globina, más preferiblemente beta-globina humana.

Por lo tanto, para aumentar la estabilidad y/o la expresión del ARN usado de acuerdo con la presente enseñanza, puede modificarse para que esté presente junto con una secuencia de poli-A, preferiblemente con una longitud de 10 a 500, más preferiblemente de 30 a 300, incluso más preferiblemente de 65 a 200 y especialmente de 100 a 150 residuos de adenosina. En una realización especialmente preferida, la secuencia de poli-A tiene una longitud de aproximadamente 120 residuos de adenosina. Además, la incorporación de dos o más regiones no traducidas (UTR) 3' en la región no traducida 3' de una molécula de ARN puede dar como resultado una mejora en la eficiencia de la traducción. En una realización particular, la 3'-UTR se deriva del gen de la p-globina humana.

El término "estabilidad" del ARN se relaciona con la "vida media" del ARN. La "vida media" se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad o número de moléculas. En el contexto de la presente enseñanza, la vida media de un ARN es indicativa de la estabilidad de dicho ARN. La vida media del ARN puede influir en la "duración de la expresión" del ARN. Se puede esperar que el ARN que tiene una vida media prolongada se exprese durante un período de tiempo prolongado.

En el contexto de la presente enseñanza, el término "transcripción" se refiere a un proceso en el que el código genético en una secuencia de ADN se transcribe en ARN. Posteriormente, el ARN puede traducirse en proteína. De acuerdo con la presente enseñanza, el término "transcripción" comprende “transcripción in vitro", donde el término “transcripción in vitro" se refiere a un proceso en el que el ARN, en particular el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema libre de células, preferiblemente usando extractos celulares apropiados. Preferiblemente, los vectores de clonación se aplican para la generación de transcritos. Estos vectores de clonación se designan generalmente como vectores de transcripción y, de acuerdo con la presente enseñanza, están abarcados por el término "vector".

El término "traducción" de acuerdo con la enseñanza se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una cadena de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para producir un péptido o proteína.

Los ácidos nucleicos pueden, de acuerdo con la enseñanza, estar presentes solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, que pueden ser homólogos o heterólogos. En realizaciones preferidas, un ácido nucleico se une funcionalmente a secuencias de control de expresión que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico. El término "homólogo" significa que los ácidos nucleicos también están enlazados funcionalmente de forma natural y el término "heterólogo" significa que los ácidos nucleicos no están enlazados funcionalmente de forma natural.

Un ácido nucleico y una secuencia de control de la expresión están "funcionalmente" unidos entre sí, si están unidos covalentemente entre sí de tal forma que la expresión o transcripción de dicho ácido nucleico está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia de control de la expresión. Si el ácido nucleico se va a traducir en una proteína funcional, entonces, con una secuencia de control de la expresión unida funcionalmente a una secuencia de codificación, la inducción de dicha secuencia de control de la expresión da como resultado la transcripción de dicho ácido nucleico, sin provocar un cambio de marco en la secuencia de codificación o dicha secuencia codificante no puede traducirse en la proteína o el péptido deseado.

El término "secuencia de control de la expresión" o "elemento de control de la expresión" comprende, de acuerdo con la enseñanza, promotores, sitios de unión a ribosomas, reforzadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de un ARNm. En realizaciones particulares de la enseñanza, las secuencias de control de la expresión pueden regularse. La estructura exacta de las secuencias de control de la expresión puede variar en función de la especie o el tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias 5' no transcritas y 5' y 3' no traducidas que están involucradas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tal como la caja TATA, secuencia de protección, secuencia CAAT y similares. Más específicamente, las secuencias de control de la expresión no transcritas en 5' comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico unido funcionalmente. Las secuencias de control de la expresión también pueden comprender secuencias reforzadoras o secuencias activadoras secuencia arriba.

El término "expresión" se usa de acuerdo con la enseñanza en su significado más general y comprende la producción de ARN y/o péptidos o proteínas, por ejemplo, mediante transcripción y/o traducción. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o proteínas. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable. De acuerdo con la enseñanza, el término expresión también incluye una "expresión aberrante" o "expresión anormal".

"Expresión aberrante" o "expresión anormal" significa, de acuerdo con la enseñanza, que la expresión está alterada, preferiblemente aumentada, en comparación con una referencia, por ejemplo, un estado en un sujeto que no tiene una enfermedad asociada con la expresión aberrante o anormal de una determinada proteína, por ejemplo, un antígeno tumoral. Un aumento de la expresión se refiere a un aumento de al menos un 10 %, en particular de al menos un 20 %, de al menos un 50 % o de al menos un 100 %, o más. En una realización, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano está reprimida.

El término "específicamente expresada" significa que una proteína esencialmente solo se expresa en un tejido u órgano específico. Por ejemplo, un antígeno tumoral expresado específicamente en la mucosa gástrica significa que dicha proteína se expresa principalmente en la mucosa gástrica y no se expresa en otros tejidos o no se expresa de manera significativa en otros tipos de tejidos u órganos. Por lo tanto, una proteína que se expresa exclusivamente en las células de la mucosa gástrica y en un grado significativamente menor en cualquier otro tejido, como los testículos, se expresa específicamente en las células de la mucosa gástrica. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral también puede expresarse específicamente en condiciones normales en más de un tipo de tejido u órgano, tal como en 2 o 3 tipos de tejido u órganos, pero preferiblemente en no más de 3 tipos de tejido u órgano diferentes. En este caso, el antígeno tumoral se expresa entonces específicamente en estos órganos. Por ejemplo, si un antígeno tumoral se expresa en condiciones normales, preferiblemente en un grado aproximadamente igual en pulmón y estómago, dicho antígeno tumoral se expresa específicamente en pulmón y estómago.

De acuerdo con la enseñanza, el término "codificante de ácido nucleico" significa que el ácido nucleico, si está presente en el entorno apropiado, preferiblemente dentro de una célula, puede expresarse para producir una proteína o un péptido que codifica.

Los ácidos nucleicos descritos en este documento pueden ser moléculas recombinantes y/o aisladas.

Una "molécula aislada", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que está sustancialmente libre de otras moléculas tales como otro material celular.

El término "recombinante" en el contexto de la presente enseñanza significa "fabricado mediante ingeniería genética". Preferiblemente, un "objeto recombinante" tal como una célula recombinante en el contexto de la presente enseñanza no se produce de forma natural.

El término "de origen natural", como se utiliza en el presente documento, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (incluidos los virus) y puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio se produce de forma natural.

El término "autólogo" se usa para describir cualquier cosa que se derive del mismo sujeto. Por ejemplo, "trasplante autólogo" se refiere a un trasplante de tejido u órganos derivados del mismo sujeto. Dichos procedimientos son ventajosos porque superan la barrera inmunológica que, de lo contrario, da como resultado el rechazo.

El término "alogénico" se usa para describir cualquier cosa que se deriva de diferentes individuos de la misma especie. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos.

El término "singénico" se usa para describir cualquier cosa que se derive de individuos o tejidos que tengan genotipos idénticos, es decir, gemelos idénticos o animales de la misma cepa endogámica, o sus tejidos.

El término "heterólogo" se usa para describir algo que consta de múltiples elementos diferentes. Como ejemplo, la transferencia de la médula ósea de un individuo a un individuo diferente constituye un trasplante heterólogo. Un gen heterólogo es un gen derivado de una fuente distinta del sujeto.

El término "transfección" se refiere a la introducción de ácidos nucleicos, en particular ARN, en una célula.

Para los fines de la presente enseñanza, el término "transfección" también incluye la introducción de un ácido nucleico en una célula o la captación de un ácido nucleico por dicha célula, donde la célula puede estar presente en un sujeto, por ejemplo, un paciente. Por lo tanto, de acuerdo con la presente enseñanza, una célula para la transfección de un ácido nucleico descrito en este documento puede estar presente in vitro o in vivo, por ejemplo, la célula puede formar parte de un órgano, un tejido y/o un organismo de un paciente. De acuerdo con la enseñanza, la transfección puede ser transitoria o estable. Para algunas aplicaciones de transfección, es suficiente que el material genético transfectado se exprese solo de forma transitoria. Dado que el ácido nucleico introducido en el proceso de transfección normalmente no se integra en el genoma nuclear, el ácido nucleico extraño se diluirá por mitosis o se degradará. Las células que permiten la amplificación episomal de ácidos nucleicos reducen en gran medida la tasa de dilución. Si se desea que el ácido nucleico transfectado permanezca realmente en el genoma de la célula y sus células hijas, debe producirse una transfección estable. El ARN se puede transfectar en células para expresar transitoriamente su proteína codificada.

De acuerdo con la presente enseñanza, puede usarse cualquier técnica útil para introducir, es decir, transferir o transfectar ácidos nucleicos en las células. Preferiblemente, el ARN se transfecta en células mediante técnicas estándar. Tales técnicas incluyen electroporación, lipofección y microinyección. En una realización particularmente preferida de la presente enseñanza, el a Rn se introduce en las células mediante electroporación. La electroporación o electropermeabilización se relaciona con un aumento significativo en la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular causada por un campo eléctrico aplicado externamente. Por lo general, se usa en biología molecular como una forma de introducir alguna sustancia en una célula. De acuerdo con la enseñanza, se prefiere que la introducción de ácido nucleico que codifica una proteína o péptido en las células dé como resultado la expresión de dicha proteína o péptido.

El término "péptido" de acuerdo con la enseñanza comprende oligo y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente 3 o más, preferiblemente 4 o más, preferiblemente 6 o más, preferiblemente 8 o más, preferiblemente 9 o más, preferiblemente 10 o más, preferiblemente 13 o más, preferiblemente 16 más, preferiblemente 21 o más y hasta preferiblemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferiblemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptidos" y "proteínas" son sinónimos y se usan indistintamente en este documento.

La enseñanza dada en este documento con respecto a secuencias de aminoácidos específicas, por ejemplo, las que se muestran en la lista de secuencias, debe interpretarse de modo que también se relacione con variantes de dichas secuencias específicas que dan como resultado secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que presentan propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos específicas. Una propiedad importante es retener la unión de un péptido a su objetivo.

Los expertos en la técnica apreciarán que, en particular, las secuencias de las secuencias de CDR, las regiones hipervariables y variables pueden modificarse sin perder la capacidad de unirse a una objetivo. Por ejemplo, las regiones CDR serán idénticas o muy homólogas a las regiones de los anticuerpos parentales. Por "altamente homólogo" se contempla que se pueden realizar de 1 a 5, preferiblemente de 1 a 4, tales como 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones en las c Dr .

Para los fines de la presente enseñanza, las "variantes" de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de eliminación de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos. Las variantes de eliminación de aminoácidos que comprenden la eliminación en el extremo terminal N y/o el extremo terminal C de la proteína también se denominan variantes de truncamiento en el extremo terminal N y/o el extremo terminal C.

Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de las variantes de la secuencia de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible la inserción aleatoria con la selección apropiada del producto resultante.

Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones en el extremo terminal amino y/o el extremo terminal carboxilo de uno o más aminoácidos, tales como 1,2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos.

Las variantes de eliminación de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tal como la eliminación de 1,2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos. Las eliminaciones pueden estar en cualquier posición de la proteína.

Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de al menos un residuo de la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar. Se da preferencia a que las modificaciones estén en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no se conservan entre proteínas o péptidos homólogos y/o a la sustitución de aminoácidos por otros que tengan propiedades similares. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteínas son cambios de aminoácidos conservadores, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de forma similar. Un cambio conservativo de aminoácido implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales.

Los aminoácidos naturales generalmente se dividen en cuatro familias: ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares sin carga (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.

Preferiblemente, el grado de similitud, preferiblemente de identidad entre una secuencia de aminoácidos dada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de dicha secuencia de aminoácidos dada será al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. El grado de similitud o identidad se da preferiblemente para una región de aminoácidos que es al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o aproximadamente 100 % de la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos de referencia consta de 200 aminoácidos, el grado de similitud o identidad se proporciona preferiblemente para al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180 o aproximadamente 200 aminoácidos, preferiblemente aminoácidos continuos. En realizaciones preferidas, el grado de similitud o identidad se da para la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. La alineación para determinar la similitud de la secuencia, preferiblemente la identidad de la secuencia, se puede realizar con herramientas conocidas en la técnica, preferiblemente usando la mejor alineación de la secuencia, por ejemplo, usando Align, usando la configuración estándar, preferiblemente EMBOSS::needle, Matriz: Blosum62, apertura de hueco 10.0, extensión de hueco 0.5.

"Similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos. "Identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias.

El término "identidad porcentual" pretende indicar un porcentaje de residuos de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido después de la mejor alineación, siendo este porcentaje puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen aleatoriamente y sobre toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se realizan convencionalmente comparando estas secuencias después de haberlas alineado óptimamente, realizándose dicha comparación por segmento o por "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para comparación puede realizarse, además de manualmente, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, AdsApp. Math. 2, 482, mediante el algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85, 2444, o mediante programas informáticos que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, dividiendo este número por el número de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Las secuencias homólogas de aminoácidos presentan de acuerdo con la enseñanza al menos el 40 %, en particular al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % y preferiblemente al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos 99 % de identidad de los residuos de aminoácidos.

De acuerdo con la enseñanza, una variante, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína tiene preferiblemente una propiedad funcional de la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la que se ha derivado, es decir, es funcionalmente equivalente. En una realización, una variante, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína es inmunológicamente equivalente a la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la que se deriva. En una realización, la propiedad funcional es una propiedad inmunológica.

El término "derivada" significa de acuerdo con la enseñanza que una entidad particular, en particular una secuencia particular, está presente en el objeto del que se deriva, en particular un organismo o molécula. En el caso de secuencias de aminoácidos, especialmente regiones de secuencias particulares, "derivada" en particular significa que la secuencia de aminoácidos relevante se deriva de una secuencia de aminoácidos en la que está presente.

El término "célula" o "célula huésped" se refiere preferiblemente a una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no ha liberado sus componentes intracelulares normales, tal como enzimas, orgánulos o material genético. Preferiblemente, una célula intacta es una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferiblemente, dicho término se refiere de acuerdo con la enseñanza a cualquier célula que pueda transfectarse con un ácido nucleico exógeno. Preferiblemente, la célula cuando se transfecta con un ácido nucleico exógeno y se transfiere a un receptor puede expresar el ácido nucleico en el receptor. El término "célula" incluye células bacterianas; otras células útiles son células de levadura, células fúngicas o células de mamífero. Las células bacterianas adecuadas incluyen células de cepas bacterianas gramnegativas tales como cepas de Escherichia coli, Proteus y Pseudomonas, y cepas bacterianas grampositivas tales como cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus y Lactococcus. Las células fúngicas adecuadas incluyen células de especies de Trichoderma, Neurospora y Aspergillus. Las células de levadura adecuadas incluyen células de especies de Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe), Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris y Pichia methanolica) y Hansenula. Las células de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS, HEK 293 y similares. Sin embargo, también se pueden usar células de anfibios, células de insectos, células de plantas y cualquier otra célula usada en la técnica para la expresión de proteínas heterólogas. Las células de mamíferos son particularmente preferidas para la transferencia adoptiva, tales como células de seres humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivarse de un gran número de tipos de tejidos e incluyen células primarias y líneas celulares tales como células del sistema inmunitario, en particular células presentadoras de antígeno tales como células dendríticas y células T, células madre tales como células madre hematopoyéticas y células madre mesenquimales y otros tipos de células. Una célula presentadora de antígeno es una célula que muestra antígeno en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad en su superficie. Las células T pueden reconocer este complejo usando su receptor de células T (TCR).

Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico expresa preferiblemente el péptido o la proteína codificada por el ácido nucleico.

El término "cebado" se refiere a un proceso en el que una célula T tiene su primer contacto con su antígeno específico y provoca la diferenciación en células T efectoras.

El término "expansión clonal" o "expansión" se refiere a un proceso en el que se multiplica una entidad específica. En el contexto de la presente enseñanza, el término se utiliza preferiblemente en el contexto de una respuesta inmunológica en la que los linfocitos son estimulados por un antígeno, proliferan y se amplifica el linfocito específico que reconoce dicho antígeno. Preferiblemente, la expansión clonal conduce a la diferenciación de los linfocitos.

"Reducir" o "inhibir", tal como se usa en el presente documento, significa la capacidad de causar una disminución general, preferiblemente del 5 % o más, del 10 % o más, del 20 % o más, más preferiblemente del 50 % o más, y lo más preferiblemente del 75 %. o más, en el nivel. El término "inhibir" o frases similares incluye una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.

Términos tales como "aumentar" o "mejorar" se refieren preferiblemente a un aumento o mejora de aproximadamente al menos un 10 %, preferiblemente al menos un 20 %, preferiblemente al menos un 30 %, más preferiblemente al menos un 40 %, más preferiblemente al menos un 50 %, incluso más preferiblemente al menos el 80%, y lo más preferiblemente al menos el 100%.

Los agentes, composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar a un sujeto con una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad caracterizada por la presencia de células enfermas que expresan un antígeno. Las enfermedades particularmente preferidas son las enfermedades cancerosas.

Los agentes, composiciones y métodos descritos en este documento también se pueden usar para inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en este documento.

El término "enfermedad" se refiere a una afección anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad a menudo se interpreta como una afección médica asociada con síntomas y signos específicos. Una enfermedad puede ser causada por factores originarios de una fuente externa, tal como una enfermedad infecciosa, o puede ser causada por disfunciones internas, tal como enfermedades autoinmunes. En los humanos, "enfermedad" a menudo se usa de manera más amplia para referirse a cualquier afección que causa dolor, disfunción, angustia, problemas sociales o la muerte del individuo afectado, o problemas similares para quienes están en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, a veces incluye lesiones, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, síntomas aislados, conductas desviadas y variaciones atípicas de estructura y función, mientras que en otros contextos y para otros fines pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades generalmente afectan a las personas no solo físicamente, sino también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva de la vida y la personalidad. De acuerdo con la enseñanza, el término "enfermedad" incluye enfermedades infecciosas y enfermedades cancerosas, en particular aquellas formas de cáncer descritas en este documento. Cualquier referencia en el presente documento a cáncer o formas particulares de cáncer también incluye metástasis de cáncer de las mismas.

Una enfermedad a tratar de acuerdo con la enseñanza es preferiblemente una enfermedad que implica un antígeno. "Enfermedad que involucra un antígeno", "enfermedad asociada con la expresión o expresión elevada de un antígeno" o expresiones similares significan de acuerdo con la enseñanza de que el antígeno se expresa en células de un tejido u órgano enfermo. La expresión en células de un tejido u órgano enfermo puede aumentar en comparación con el estado en un tejido u órgano sano. En una realización, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano está reprimida. De acuerdo con la enseñanza, las enfermedades que implican un antígeno incluyen enfermedades infecciosas y enfermedades cancerosas, en las que el antígeno asociado a la enfermedad es preferiblemente un antígeno del agente infeccioso y un antígeno tumoral, respectivamente. Preferiblemente, una enfermedad que involucra un antígeno es preferiblemente una enfermedad que involucra células que expresan un antígeno, preferiblemente en la superficie celular.

El término "sano" o "normal" se refiere a condiciones no patológicas, y preferiblemente significa no infectado o no canceroso.

Los términos "enfermedad cancerosa" o "cáncer" se refieren o describen la afección fisiológica en un individuo que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más particularmente, los ejemplos de tales cánceres incluyen cáncer de hueso, cáncer de sangre, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, carcinoma de los órganos sexuales y reproductivos, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea cáncer de glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), cáncer neuroectodérmico, tumores del eje espinal, glioma, meningioma y adenoma hipofisario. El término "cáncer" de acuerdo con la enseñanza también comprende metástasis de cáncer. Preferiblemente, una "enfermedad cancerosa" se caracteriza por células que expresan un antígeno tumoral y una célula cancerosa expresa un antígeno tumoral.

En una realización, una enfermedad cancerosa es una enfermedad maligna que se caracteriza por las propiedades de anaplasia, invasividad y metástasis. Un tumor maligno puede contrastarse con un tumor benigno no canceroso en que una malignidad no está autolimitada en su crecimiento, es capaz de invadir los tejidos adyacentes y puede ser capaz de diseminarse a tejidos distantes (hacer metástasis), mientras que un tumor benigno no tiene ninguna de esas propiedades.

De acuerdo con la enseñanza, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a una hinchazón o lesión formada por un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas o células tumorales). Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida e incontrolada y continúa creciendo después de que cesan los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una falta parcial o total de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal y, por lo general, forman una masa distinta de tejido, que puede ser benigno, premaligno o maligno.

De acuerdo con la enseñanza, un "carcinoma" es un tumor maligno derivado de células epiteliales. Este grupo representa los cánceres más comunes, incluidas las formas comunes de cáncer de mama, próstata, pulmón y colon.

El "adenocarcinoma" es un cáncer que se origina en el tejido glandular. Este tejido también forma parte de una categoría de tejido más grande conocida como tejido epitelial. El tejido epitelial incluye piel, glándulas y una variedad de otros tejidos que recubren las cavidades y órganos del cuerpo. El epitelio se deriva embriológicamente del ectodermo, endodermo y mesodermo. Para clasificarse como adenocarcinoma, no es necesario que las células formen parte de una glándula, siempre que tengan propiedades secretoras. Esta forma de carcinoma puede ocurrir en algunos mamíferos superiores, incluidos los humanos. Los adenocarcinomas bien diferenciados tienden a parecerse al tejido glandular del que se derivan, mientras que los poco diferenciados pueden no hacerlo. Al teñir las células de una biopsia, un patólogo determinará si el tumor es un adenocarcinoma o algún otro tipo de cáncer. Los adenocarcinomas pueden surgir en muchos tejidos del cuerpo debido a la naturaleza ubicua de las glándulas dentro del cuerpo. Si bien es posible que cada glándula no secrete la misma sustancia, siempre que la célula tenga una función exocrina, se considera glandular y, por lo tanto, su forma maligna se denomina adenocarcinoma. Los adenocarcinomas malignos invaden otros tejidos y, a menudo, hacen metástasis si se les da el tiempo suficiente para hacerlo. El adenocarcinoma de ovario es el tipo más común de carcinoma de ovario. Incluye los adenocarcinomas serosos y mucinosos, el adenocarcinoma de células claras y el adenocarcinoma endometrioide.

El linfoma y la leucemia son tumores malignos derivados de las células hematopoyéticas (formadoras de sangre).

El tumor blástico o blastoma es un tumor (generalmente maligno) que se asemeja a un tejido inmaduro o embrionario. Muchos de estos tumores son más comunes en niños.

Por "metástasis" se entiende la propagación de células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales endoteliales para ingresar a la cavidad corporal y los vasos, y luego, después de ser transportado por la sangre, infiltración de órganos objetivo. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor en el sitio objetivo depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo se produce incluso después de la extirpación del tumor primario porque las células o los componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar un potencial metastásico. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la enseñanza se refiere a "metástasis a distancia" que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la enseñanza se refiere a la metástasis en los ganglios linfáticos.

Una recaída o recurrencia ocurre cuando una persona se ve afectada nuevamente por una afección que la afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha padecido una enfermedad tumoral, ha recibido un tratamiento exitoso de dicha enfermedad y vuelve a desarrollar dicha enfermedad, dicha enfermedad recién desarrollada puede considerarse como recaída o recurrencia. Sin embargo, de acuerdo con la enseñanza, una recaída o recurrencia de una enfermedad tumoral puede ocurrir, pero no necesariamente, en el sitio de la enfermedad tumoral original. Por lo tanto, por ejemplo, si una paciente ha sufrido un tumor de ovario y ha recibido un tratamiento exitoso, una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor de ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor también incluye situaciones en las que un tumor aparece en un sitio diferente al sitio del tumor original así como en el sitio del tumor original. Preferiblemente, el tumor original para el que el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.

El término "tratamiento" o "tratamiento terapéutico" se refiere a cualquier tratamiento que mejora el estado de salud y/o prolonga (aumenta) la vida útil de un individuo. Dicho tratamiento puede eliminar la enfermedad en un individuo, detener o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, inhibir o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas en un individuo y/o disminuir la recurrencia en un individuo que actualmente tiene o que ha tenido previamente una enfermedad.

Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se refieren a cualquier tratamiento que pretende prevenir que ocurra una enfermedad en un individuo. Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se usan en el presente documento de manera intercambiable.

Los términos "individuo" y "sujeto" se usan en el presente documento de manera intercambiable. Se refieren a seres humanos, primates no humanos u otros mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, cerdos, ovejas, caballos o primates) que pueden padecer o son susceptibles a una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) pero puede o no tener la enfermedad o el trastorno. En muchas realizaciones, el individuo es un ser humano. A menos que se indique lo contrario, los términos "individuo" y "sujeto" no denotan una edad particular y, por lo tanto, abarcan adultos, ancianos, niños y recién nacidos. En realizaciones preferidas de la presente enseñanza, el "individuo" o "sujeto" es un "paciente". El término "paciente" significa de acuerdo con la enseñanza un sujeto a tratar, en particular un sujeto enfermo.

Por "estar en riesgo" se entiende un sujeto, es decir, un paciente, que se identifica que tiene una probabilidad superior a la normal de desarrollar una enfermedad, en particular cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido, o que actualmente tiene, una enfermedad, en particular cáncer, es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, ya que tal sujeto puede continuar desarrollando una enfermedad. Los sujetos que actualmente tienen, o que han tenido un cáncer también tienen un mayor riesgo de metástasis de cáncer.

El término "inmunoterapia" se refiere a un tratamiento que implica una reacción inmunitaria específica.

En el contexto de la presente enseñanza, términos tales como "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo" o "protector" se relacionan con la prevención o el tratamiento o ambos de la ocurrencia y/o propagación de una enfermedad en un sujeto y, en particular, para minimizar la posibilidad de que un sujeto desarrolle una enfermedad o para retrasar el desarrollo de una enfermedad. Por ejemplo, una persona en riesgo de desarrollar un tumor, como se describió anteriormente, sería candidata para una terapia para prevenir un tumor.

Una administración profiláctica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración profiláctica de un agente o composición de la enseñanza, protege preferiblemente al receptor del desarrollo de una enfermedad. Una administración terapéutica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración terapéutica de un agente o composición de la enseñanza, puede conducir a la inhibición del progreso/crecimiento de la enfermedad. Esto comprende la desaceleración del progreso/crecimiento de la enfermedad, en particular una interrupción de la progresión de la enfermedad, que preferiblemente conduce a la eliminación de la enfermedad.

La inmunoterapia se puede realizar utilizando cualquiera de una variedad de técnicas, en las que los agentes proporcionados en el presente documento funcionan preferiblemente para eliminar las células que expresan antígenos de un paciente. Tal eliminación puede tener lugar como resultado de reforzar o inducir una respuesta inmunitaria en un paciente específica para un antígeno o una célula que expresa un antígeno.

La inmunoterapia activa es una forma de inmunoterapia en la que el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema inmunitario del huésped endógeno para que reaccione contra las células enfermas con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmunitaria (como los ácidos nucleicos que codifican un antígeno).

La inmunoterapia pasiva es una forma de inmunoterapia, en la que el tratamiento implica la administración de agentes con reactividad inmunitaria tumoral establecida (tal como células efectoras) que pueden mediar directa o indirectamente los efectos antitumorales y no necesariamente depende de un sistema inmunitario intacto del huésped. Los ejemplos de células efectoras incluyen linfocitos T (tales como linfocitos T citotóxicos CD8+ y linfocitos T colaboradoras CD4+) y células presentadoras de antígeno (tales como células dendríticas y macrófagos). Los receptores de células T artificiales específicos para un antígeno pueden transferirse a células efectoras para inmunoterapia adoptiva.

El término "inmunización" o "vacunación" describe el proceso de tratar a un sujeto con el propósito de inducir una respuesta inmunitaria por razones terapéuticas o profilácticas.

El término "in vivo" se refiere a la situación en un sujeto.

Los compuestos y agentes descritos en el presente documento pueden administrarse en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada.

Las composiciones farmacéuticas de la enseñanza son preferiblemente estériles y contienen una cantidad eficaz de los agentes descritos en este documento y, opcionalmente, de otros agentes como se discute en este documento para generar la reacción deseada o el efecto deseado.

Las composiciones farmacéuticas normalmente se proporcionan en una forma de dosificación uniforme y se pueden preparar de una manera ya conocida. Una composición farmacéutica puede, p. ej., estar en forma de solución o suspensión.

Una composición farmacéutica puede comprender sales, sustancias tampón, conservantes, vehículos, diluyentes y/o excipientes, todos los cuales son preferiblemente farmacéuticamente aceptables. El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.

Las sales que no son farmacéuticamente aceptables pueden usarse para preparar sales farmacéuticamente aceptables y se incluyen en la enseñanza. Las sales farmacéuticamente aceptables de este tipo comprenden de manera no limitativa las preparadas a partir de los siguientes ácidos: ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables también se pueden preparar como sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.

Sustancias tampón adecuadas para usar en una composición farmacéutica incluyen ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.

Los conservantes adecuados para usar en una composición farmacéutica incluyen cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y timerosal.

Una formulación inyectable puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable tal como lactato de Ringer.

El término "vehículo" se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de naturaleza natural o sintética, en el que el componente activo se combina para facilitar, mejorar o permitir la aplicación. De acuerdo con la enseñanza, el término "vehículo" también incluye uno o más rellenos, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidas o líquidas compatibles, que son adecuadas para la administración a un paciente.

Sustancias portadoras posibles para administración parenteral son, por ejemplo, agua estéril, Ringer, lactato de Ringer, solución de cloruro de sodio estéril, polialquilenglicoles, naftalenos hidrogenados y, en particular, polímeros de lactida biocompatibles, copolímeros de lactida/glicólido o copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno.

El término "excipiente", cuando se usa en este documento, pretende indicar todas las sustancias que pueden estar presentes en una composición farmacéutica y que no son ingredientes activos tales como, por ejemplo, vehículos, aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes tensioactivos, conservantes, emulsionantes, tampones, agentes saborizantes o colorantes.

Los agentes y composiciones descritos en el presente documento se pueden administrar por cualquier vía convencional, como por ejemplo por administración parenteral, incluida la inyección o la infusión. La administración es preferiblemente por vía parenteral, p. ej., por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intradérmica o intramuscular.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral normalmente comprenden una preparación acuosa o no acuosa estéril del compuesto activo, que es preferiblemente isotónica con la sangre del receptor. Ejemplos de vehículos y disolventes compatibles son la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, normalmente se utilizan aceites fijos estériles como solución o medio de suspensión.

Los agentes y composiciones descritos en el presente documento se administran en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de una afección particular, la reacción deseada preferiblemente se relaciona con la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en el tratamiento de una enfermedad o de un estado también puede ser el retraso del inicio o la prevención del inicio de dicha enfermedad o dicha afección.

Una cantidad efectiva de un agente o composición descrita en este documento dependerá de la afección a tratar, la severidad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluyendo edad, condición fisiológica, tamaño y peso, la duración del tratamiento, el tipo de una terapia de acompañamiento (si está presente), la vía específica de administración y factores similares. En consecuencia, las dosis administradas de los agentes descritos en el presente documento pueden depender de varios de dichos parámetros. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas alcanzadas por una vía de administración diferente y más localizada).

Los agentes y composiciones descritos en este documento se pueden administrar a pacientes, por ejemplo, in vivo, para tratar o prevenir una variedad de trastornos como los descritos en este documento. Los pacientes preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos que pueden corregirse o mejorarse mediante la administración de los agentes y composiciones descritos en el presente documento. Esto incluye trastornos que involucran células caracterizadas por la expresión de un antígeno.

Por ejemplo, en una realización, los agentes descritos en este documento se pueden usar para tratar a un paciente con una enfermedad cancerosa, por ejemplo, una enfermedad cancerosa como la descrita en este documento caracterizada por la presencia de células cancerosas que expresan un antígeno.

Las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento descritos de acuerdo con la enseñanza también pueden usarse para inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en el presente documento.

La composición farmacéutica de la enseñanza se puede administrar junto con sustancias reforzadoras de la inmunidad complementarias tales como uno o más adyuvantes y puede comprender una o más sustancias reforzadoras de la inmunidad para aumentar aún más su eficacia, preferiblemente para lograr un efecto sinérgico de inmunoestimulación. El término "adyuvante" se refiere a compuestos que prolongan, refuerzan o aceleran una respuesta inmunitaria. Varios mecanismos son posibles a este respecto, dependiendo de los diversos tipos de adyuvantes. Por ejemplo, los compuestos que permiten la maduración de las Dc , p.ej., lipopolisacáridos o ligando CD40, forman una primera clase de adyuvantes adecuados. En general, cualquier agente que influya en el sistema inmunitario del tipo de una "señal de peligro" (LPS, GP98, ARNbc, etc.) o citocinas, tales como GM-CSF, puede utilizarse como adyuvante que permita intensificar y/o influir en una respuesta inmunitaria de manera controlada. Los oligodesoxinucleótidos CpG también pueden usarse opcionalmente en este contexto, aunque deben tenerse en cuenta sus efectos secundarios que se producen en determinadas circunstancias, como se ha explicado anteriormente. Los adyuvantes particularmente preferidos son citocinas, tal como monocinas, linfocinas, interleucinas o quimiocinas, por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFNa, IFNy, GM-CSF, LT-a o factores de crecimiento, por ejemplo, hGH. Otros adyuvantes conocidos son hidróxido de aluminio, adyuvante de Freund o aceite tal como Montanide®, lo más preferido Montanide® ISA51. Los lipopéptidos, tales como Pam3Cys, también son adecuados para usar como adyuvantes en la composición farmacéutica de la presente enseñanza.

La composición farmacéutica se puede administrar localmente o sistémicamente, preferiblemente sistémicamente.

El término "administración sistémica" se refiere a la administración de un agente de manera que el agente se distribuye ampliamente en el cuerpo de un individuo en cantidades significativas y desarrolla un efecto deseado. Por ejemplo, el agente puede desarrollar su efecto deseado en la sangre y/o alcanzar su sitio de acción deseado a través del sistema vascular. Las rutas sistémicas típicas de administración incluyen la administración introduciendo el agente directamente en el sistema vascular o la administración oral, pulmonar o intramuscular en la que el agente se adsorbe, ingresa al sistema vascular y se lleva a uno o más sitios de acción deseados a través de la sangre.

De acuerdo con la presente enseñanza, se prefiere que la administración sistémica sea por administración parenteral. El término "administración parenteral" se refiere a la administración de un agente de manera que el agente no pasa por el intestino. El término "administración parenteral" incluye la administración intravenosa, la administración subcutánea, la administración intradérmica o la administración intraarterial, pero no se limita a las mismas.

La administración también puede realizarse, por ejemplo, por vía oral, intraperitoneal o intramuscular.

Los agentes y composiciones proporcionados en el presente documento pueden usarse solos o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).

La presente enseñanza se describe en detalle mediante las figuras y ejemplos a continuación, que se usan solo con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Debido a la descripción y los ejemplos, otras formas de realización que también están incluidas en la enseñanza son accesibles para el experto en la materia.

Figuras

Figura 1: Representación del complejo TCR-CD3. Los motivos de activación basados en tirosina del inmunorreceptor CD3 intracitoplasmático (ITAM) se indican como cilindros (adaptados de "The T cell receptor facts book", MP Lefranc, G Lefranc, 2001).

Figura 2: El diseño de generaciones sucesivas de los CAR. Representación esquemática de las diferentes generaciones de los CAR (1G, primera generación, 2G, segunda generación, 3G, tercera generación). La primera generación contiene scFv extracelulares y la cadena CD3Z citoplásmica y IZAP70 que media la citotoxicidad, la segunda generación además promueve la proliferación de CD28/PI3K y la tercera generación además 4-1BB u OX40/TRAF mantiene la supervivencia celular (Casucci, M. et al. (2011) 2: 378-382).

Figura 3: Representación esquemática de los diferentes formatos de receptores para la redirección de células T contra un antígeno. Izquierda: un ^c A ^r de segunda generación que consta de un fragmento scFv específico de antígeno, un dominio espaciador derivado de IgG1, un coestimulador de CD28 y un dominio de señalización de CD3Z (CAR-28Z); medio: un nuevo formato de CAR basado en el enlace del scFv con el dominio constante de la cadena TCRp murina y la coexpresión del dominio constante de la cadena TCRa murina (CARICa); derecha: un TCR murino compuesto por cadenas a/p de TCR (mu, TCR murino).

Figura 4: Proliferación de células T específicas de CLDN6 humanas tras el reconocimiento de diferentes cantidades de antígeno. La capacidad de proliferación de células T CD8+ modificadas con CAR de CLDN6 teñidas con CFSE se analizó después del cocultivo con iDC autólogas transfectadas con las cantidades indicadas de ARN IVT CLDN6. (A) La expresión de CLDN6 en iDC transfectadas con cantidades tituladas de ARN de CLDN6 se analizó aproximadamente 20 horas después de la electroporación después de la tinción con un anticuerpo específico de CLDN6 conjugado con Alexa-Fluor-647 (IMAB027, Ganymed). Las células se dividieron en células individuales. (B, C, D) se analizó la expresión superficial de CAR y ^t C^r en células T CD8+ transfectadas con CAR de CLDN6 o un ARN de CAR de control o sin ARN (simulado) después de teñir con anticuerpos específicos de idiotipo conjugados con fluorocromo que detectan CAR de CLDN6 (B) o el CAR de control (C). La expresión superficial del TCR específico de CLDN6 murino se evaluó después de la tinción con un anticuerpo específico de cadena beta de TCR murino (D). Las células se dividieron en linfocitos T CD8+ individuales. (E) Después de 96 h de cocultivo, se analizaron diluciones de CFSE de células T CD8+ usando citometría de flujo. Control positivo: Células T CD8+ transfectadas con un TCR específico de CLDN6; controles negativos: Células T CD8+ transfectadas sin ARN (simulado); Células T CD8+ transfectadas con ARN de CAR de control. (F) Se muestran diagramas de puntos representativos del análisis FACS de células T transfectadas con receptor después del cocultivo con 5 |jg de iDC autólogas transfectadas con ARN IVT de CLDN6. Los números indican porcentajes de las poblaciones parentales.

Figura 5: Expresión superficial de las construcciones de CAR específicas de CLDN6 en células T murinas. Los esplenocitos se transdujeron con vectores retrovirales que contenían los transgenes CAR de CLDN6, CAR de control o eGFP Cuatro días después de la segunda etapa de transducción, las células se tiñeron con anticuerpos anti-CD4 conjugado con APC-Cy7, CD8 conjugado con, PE-Cy7, anti-IgG humano conjugado con PE, que reconocen todas las moléculas de CAR independientemente de su especificidad y CAR anti CLDN6 anti-idiotipo conjugado con DiLight650 (B) o CAR de control anti-idiotipo conjugado con AlexaFluor647 (C), que reconocieron las respectivas moléculas de CAR. La estrategia de selección general se muestra en (A). Los números indican porcentajes de las poblaciones parentales.

Figura 6: Capacidad de proliferación específica de antígeno de las células T murinas transducidas con CAR tras el reconocimiento de sus respectivos antígenos. Las células T transducidas con CAR teñidas con CFSE se cocultivaron con BMDC transfectadas con antígenos específicos o irrelevantes (relación E:T 8:1) y como control negativo las células T se cultivaron sin BMDC. Después de 48 h, se recolectaron las células y se midieron la tinción con CFSE de células T transducidas con CAR de CLDN6 (A) transducidas con CAR de control (B) usando citometría de flujo. Los números indicaron el porcentaje de células expandidas de la población parental (división de una sola célula).

Figura 7: Expansión in situ específica de antígeno de células T con CAR de CLDN6 en ratones inmunocompetentes después de la vacunación con ARN (Lip). Los ratones BALB/c (n = 12/grupo) fueron injertados en forma iv con 5 * 106 células T BALB/c-Thy1.1 transducidas con CLDN6-CAR-effLuc-GFP o CAR-effLuc-eGFP de control, respectivamente. Un día (día 1) después de la ACT, la mitad de los ratones (n = 6) de cada grupo fueron tratados en forma iv con ARN (F12-Lip) que comprende 25 jg de ARN de CLDN6, mientras que la otra mitad se trató con ARN (Lip) que comprende 25 jg de ARN de antígeno de control. En ambos grupos experimentales (ACT de células T con CAR de CLDN6 frente a CAR de control), los ratones tratados con el ARN (Lip) que codifica el antígeno no objetivo respectivo sirvieron como controles negativos. Las intensidades de luminiscencia in vivo se midieron 1 h (día 0) y 72 h (día 3) después de ACT. (A) Resumen esquemático de la configuración experimental. (B) Imágenes de bioluminiscencia (BLI) de ratones en posición lateral en varios puntos de tiempo después de ACT y tratamiento con ARN (Lip) como se indica. Las imágenes sin color representan la intensidad de la luz (negro, menos intenso; blanco hasta gris oscuro, más intenso) que se superpuso sobre la foto de referencia en escala de grises. (C) En el día 3 después del tratamiento con ARN (Lip) (pico de expansión de células T con CAR) se evaluó la emisión de luz de los ratones (media ± SEM). Las diferencias en la emisión de luz de los diferentes grupos tratados se analizaron mediante la prueba t de dos colas, incluida la corrección de Welch.

Figura 8: Expansión in vivo de las células T con CAR mediante la vacunación con ARN (Lip) depende de la cantidad de ARN. Se aplicaron diferentes dosis de ARN (Lip) que comprende ARN de CLDN6 mediante inyección iv en ratones BALB/c (n = 4/grupo/cantidad de ARN) con células T con ^c A^r de CLDN6 Thy1.1+, 1 día después de ACT como se describe en la Figura 7. Los ratones BALB/c (n = 2) que recibieron células T con CAR de CLDN6 pero sin ARN (Lip) sirvieron como control. Se controló la expansión de las células T con CAR de CLDN6 se controlaron in situ usando imágenes de bioluminiscencia basadas en luciferasa y en sangre periférica en el día 3 después de ACT usando citometría de flujo. (A) Imágenes de bioluminiscencia de ratones en posición lateral en varios puntos de tiempo después de ACT y tratamiento con ARN (Lip) como se indica. Las imágenes sin color representan la intensidad de la luz (negro, lo menos intenso; blanco hasta gris oscuro, lo más intenso) que se superpuso sobre las imágenes de referencia en escala de grises. (B) Curso de tiempo de los datos de bioluminiscencia in vivo (n = 4, grupo de control n = 2; media ± SEM). (C) Frecuencias de células T Thy1.1+ transferidas adoptivamente y la composición de las células T CD4 y CD8 de estas células se evaluaron mediante citometría de flujo en sangre periférica 48 h después de la vacunación usando anticuerpos monoclonales CD90.1/Thy1.1 murinos conjugados con PerCP, murinos conjugados con APC-Cy7 y CD8a murinos conjugados con PE-Cy7. Para cada tratamiento, se muestran una transferencia de cebra representativa y un diagrama de puntos. Los números indican el porcentaje de poblaciones parentales (D y E). Se resumen los resultados de citometría de flujo de todos los ratones (media ± DE).

Ejemplos

Las técnicas y métodos utilizados en este documento se describen en este documento o se llevan a cabo de una manera ya conocida y como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Todos los métodos, incluido el uso de kits y reactivos, se llevan a cabo de acuerdo con la información del fabricante, a menos que se indique específicamente.

Ejemplo 1: Materiales y métodos

Células mononucleares de sangre periférica (PBMC), monocitos y células dendríticas (DC)

Las PBMC se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) a partir de capas leucocitarias. Los monocitos se enriquecieron con microesferas anti-CD14 (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Alemania). Las DC inmaduras (iDC) se obtuvieron mediante la diferenciación de monocitos durante 5 días en medio de cultivo suplementado con citoquinas como se describe en Kreiter et al. (2007), Cancer Immunol. Immunother., CII, 56, 1577-87.

Aislamiento y activación de células de bazo

Se aislaron esplenocitos de ratones C57B16 sin modificar y 1 x 107 se transfirieron a medios de cultivo (RPMI1640) y se activaron previamente 24 h con 2 μg/ml de anti-CD3 (eBioscience), 1 μg/ml de anti-CD28 (Novus Biologicals) y 5 ng/ml de IL-7 humana recombinante (rh) y 10 ng/mL de IL-15 rh (Miltenyi).

Transducción retroviral de esplenocitos murinos

Las placas sin tejido se recubrieron con 2.1 μg/cm2 RetroNectin (Clontech) durante la noche a 4 °C. Después del recubrimiento, se eliminó RetroNectin y luego se bloqueó 30 min a temperatura ambiente con 500 μl de PBS/BSA al 2 % [p/v] para cada pocillo. Se eliminó la solución de BSA y los pocillos se lavaron una vez con PBS. La PBS se reemplazó con vectores retrovirales (MLV-E) que contenían los transgenes CAR de CLDN6, CAR de control o de eGFP y la placa se centrifugó 15 min a 1300 xg. Este proceso se repitió 2 veces más con sobrenadante de cultivo viral fresco. Luego, los pozos se enjuagaron cuidadosamente con PBS antes de incubar 1 * 106 esplenocitos murinos activados previamente durante 24 h en pocillos recubiertos. Después de 4 h de incubación, se agregaron los sobrenadantes virales y se realizó la transducción por centrifugación a 300 xg a 37 °C y las células se incubaron 1 hora adicional en la incubadora antes de reemplazar el sobrenadante viral con medios de cultivo que contenían 5 ng/ml de IL-7 y 10 ng/ml. IL-15. Todo el procedimiento de transducción se repitió un día después. Después de la segunda etapa de transducción, el sobrenadante viral se reemplazó por medios de cultivo frescos. Para el ensayo de proliferación basado en CFSE, las células se recolectaron el día 7 después del aislamiento y se limpiaron en Ficoll con Ficoll-Paque PREMIUM (1.084) antes de la tinción con CFSE.

Generación de ARN (IVT) transcrito in vitro y transferencia a las células

La generación de ARN IVT se realizó como se describió anteriormente (Holtkamp, S. et al. (2006), Blood 108, 4009­ 4017) y cantidades indicadas de ARN IVT (CLDN6 o antígeno de control en BMDC murinas: 6 μg; Los CAR en células T humanas: 15-20 μg; los TCR en células T humanas: 20 μg cada cadena; CLDN6 o gp100 en iDC: 10 μg) se añadieron a las células suspendidas en 250 μL de medio X-VIVO 15 (Lonza, Basilea, Suiza) en una cubeta de electroporación estéril de 4 mm de separación enfriada previamente (Peqlab). La electroporación se realizó con un aparato del sistema de electroporación de onda cuadrada ECM 830 (BTX) (BMDC murinas: 400 V, 3 ms, 1 pulso, células T humanas 500 V, 3 ms, 1 pulso, iDC humanas: 300 V, 12 ms, 1 pulso).

Ensayo de proliferación basado en CFSE

Las células murinas se marcaron con CFSE 5 μM, las células T humanas con 0.8 μM. Las células marcadas se lavaron y cocultivaron con células APC transfectadas con ARN IVT (p. ej., BMDC o iDC) en las proporciones de efector objetivo indicadas. Después de 2 días o 4 días de cocultivo, se recogieron las células y se analizó la proliferación mediante citometría de flujo basada en la reducción progresiva a la mitad de la fluorescencia de CFSE dentro de las células hijas después de las divisiones celulares.

Análisis de citometría de flujo

La expresión en la superficie celular de los CAR transducidos se analizó utilizando anticuerpos específicos de idiotipo conjugados con fluorocromo (Ganymed Pharmaceuticals) que reconocen el fragmento scFv y anticuerpos IgG-PE humanos que reconocen el enlazador de IgG1 (contenido en todas las construcciones de CAR). La expresión de CLDN6 en la superficie celular se realizó utilizando el anticuerpo específico de CLDN6 conjugado con Alexa-Fluor-647 IMAB027 (Ganymed Pharmaceuticals). El análisis de citometría de flujo se realizó en un citómetro de flujo FACS CANTO II usando el software FACS Diva (BD Biosciences).

Animales

Los ratones se adquirieron a través de proveedores comerciales. Se usaron animales emparejados por edad (8-10 semanas) y sexo (macho o hembra) a lo largo de los experimentos.

Manipulación de genes retrovirales y preparación de células T con CAR para transferencia de células T adoptivas

Esplenocitos de BALB/c-Thy1.1 sin modificar fueron aislados y activados previamente con 2 μg/ml de concanavalina A (Sigma-Aldrich) en presencia de 5 ng/ml de IL-7 rh y 1.5 - 10 ng/ml de IL-15 rh (Miltenyi). Las células activadas previamente se transdujeron como se describe en la sección "Transducción retroviral de esplenocitos murinos". Vectores retrovirales que contienen CAR de control o CAR de CLDN6 codificados así como luciferasa de luciérnaga mejorada (effLuc; Rabinovich BAet al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 105, 14342-14346) y el gen informador eGFP (proteína fluorescente verde mejorada), que se expresó por separado usando elementos de T2A 'autoescindibles' (Szymczak AL et al. (2004) Nat. Biotechnol. 22, 589-594). Después de la limpieza con Ficoll, las células se lavaron dos veces con PBS para eliminar las proteínas séricas y luego se prepararon para la transferencia celular adoptiva (ACT).

Generación de ARN IVT formulado liposomal (ARN (Lip))

Diferentes cantidades de CLDN6 o ARN IVT de control se complejaron con liposomas F12 que comprenden DOTMNDOPE (1,2-di-O-octadeceni-3-trimetilamonio propano/1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (mol:mol 2:1)) como se describió previamente en el documento WO2013/143683.

Experimentos con ratones

Se transfirieron en forma intravenosa (iv) 5*10® células T BALB/c-Thy1.1 transducidas con CAR-T2A-effLuc-T2A-eGFP en 200 μL en cada ratón donante BALB/c. Posteriormente, los ratones fueron vacunados en forma iv con una proporción F12:ARN de 1.3 : 2 de ARN(Lip) 24 horas después de la transferencia adoptiva de células T (ACT). Se realizaron donación de sangre periférica y bioluminiscencia de cuerpo entero.

Obtención de imágenes de luciferasa in vivo (BLI)

La expansión y distribución de las células T transducidas con CAR-effLuc-GFP se evaluaron mediante obtención de imágenes de bioluminiscencia utilizando el sistema de obtención de imágenes IVIS Lumina (Caliper Life Sciences). Brevemente, se inyectó en forma ip una solución acuosa de D-luciferina (80 mg/kg de peso corporal; Perkin Elmer) 1 h (día 0), 72 h (día 3) y 96 h (día 4) después de ACT. Cinco min después, se cuantificaron los fotones emitidos (tiempo de integración de 1 min). Se cuantificó la bioluminiscencia in vivo en las regiones de interés (ROI) como radiación promedio (fotones/seg/cm2/sr) utilizando el software IVIS Living Image 4.0. La intensidad de la luz transmitida procedente de las células que expresan luciferasa dentro del animal se representó como una imagen en escala de grises, donde el negro es la señal de bioluminiscencia menos intensa y de blanco a gris oscuro la más intensa. Las imágenes de referencia en escala de grises de los ratones se obtuvieron bajo iluminación LED con poca luz. Las imágenes se superpusieron utilizando el software Living Image 4.0.

Citometría de flujo de sangre periférica de ratones

La composición celular de células T Thy1.1+ transferidas se evaluó 72 h (día 3) después de ACT en muestras de sangre periférica sometidas a lisis hipotónica (tampón ACK; GIBCO). Se usaron anticuerpos monoclonales acoplados a fluorocromos que detectan CD90.1/Thy1.1 murinas (BD Pharmingen), CD8a (eBioscience) y CD4 (BD Pharmingen). Los datos de citometría de flujo se adquirieron en un citómetro de flujo analítico FACS-Canto II y se analizaron utilizando el software FlowJo X (Tree Star).

Ejemplo 2: Expansión de células T modificadas con CAR con APC pulsadas con ARN IVT in vitro

Un requisito previo importante para la proliferación y persistencia de las células T modificadas con CAR en el paciente es la presencia de antígeno, como lo demuestran los prometedores resultados de ensayos clínicos de CAR específicos de CD19 en neoplasias malignas hematológicas. En analogía con la expansión de las células T endógenas mediante la inmunización con ARN a través de la estimulación del TCR por complejos MHC-péptido, queríamos analizar si las células T con CAR transferidas adoptivamente también podrían expandirse mediante la vacunación con ARN mediada por liposomas de las células objetivo para proporcionar el antígeno natural expresado en la superficie para la estimulación de células T con CAR. Tal 'cambio' podría hacer posible transferir inicialmente pequeñas cantidades de células T modificadas con CAR a los pacientes. Si esta transferencia no produjera efectos secundarios graves en los pacientes, las células T modificadas podrían expandirse con ARN formulado con liposomas. Además, este método podría ser, en algunas circunstancias, una oportunidad para que los pacientes con tumores eviten la quimioterapia que crea artificialmente espacio para la transferencia de células T adoptivas.

Evaluamos el concepto de expansión in vitro para un CAR que se dirige específicamente al antígeno tumoral CLDN6. El CAR de CLDN6 representa un CAR clásico de segunda generación que contiene las fracciones de señalización y coestimuladoras de CD3Z y CD28, respectivamente. Una eliminación de la fracción de unión a lck en el endodominio de CD28 anula la secreción de IL-2 tras el acoplamiento de CAR para evitar la inducción de células T reguladoras (Kofler D.M. et al., (2011) Molecular Therapy 19 (4), 760-767). Una modificación del dominio 'espaciador' Fc de IgGl en la fracción extracelular del CAR evita la activación 'fuera del objetivo' y el inicio no intencionado de una respuesta inmunitaria innata (Hombach A. et al., (2010) Gene Therapy 17, 1206-1213).

En primer lugar, queríamos analizar si las células T humanas modificadas con CAR también podrían expandirse utilizando células objetivo transfectadas con ARN para proporcionar CLND6 natural para la estimulación de células T con CAR. Un CFSE basado en un ensayo de cocultivo in vitro se realizó utilizando células T CD8+ humanas transfectadas con CLDN6-CAR-ARN junto con iDC autólogas transfectadas con cantidades tituladas de ARN IVT con CLDN6. La expresión superficial de CLDN6 dependiente de la dosis resultante se evaluó mediante citometría de flujo después de la tinción con un anticuerpo específico de CLDN6 (Figura 4A). Como control positivo, se transfectaron células T CD8+ con ARN que codifica un TCR murino específico de CLDN6 restringido por h LA-A*0201 y como control negativo se incluyó un CAR de control. La expresión superficial de los CAR transfectados y el TCR se analizó después de teñir con anticuerpos específicos de idiotipo y específicos de TCR-beta murino (Figura 4^b , C, D). Después de cuatro días de cocultivo, se analizó la proliferación específica de antígeno de todas las células T CD8+ transfectadas con receptor y marcadas con CFSE en respuesta a las iDC que expresan CLDN6 en función de la reducción progresiva a la mitad de la fluorescencia de CFSE mediante citometría de flujo. La proliferación mediada por CAR de CLDN6 de casi todas las células T CD8+ en respuesta a las células objetivo transfectadas con CLDN6 incluso a una concentración de antígeno baja (1 |jg de ARN de CLDN6; 95 %). El porcentaje de células T con CAR de CLDN6 en proliferación fue incluso mayor que la proporción de células T transfectadas con TCR de CLDN6 que sirvieron como control positivo y representaron aproximadamente el 90 %, mientras que el CAR de control no indujo la proliferación tras el contacto con el antígeno CLDN6 (Figura 4E, F).

Este resultado confirmó que las moléculas de CAR pueden inducir fuertemente la proliferación en las células T in vitro después del cocultivo con iDC transfectadas con ARN, la población celular que es principalmente responsable de la captación de ARN en los ganglios linfáticos in vivo después de la vacunación con ARN.

Para traducir nuestra estrategia en un experimento in vivo, primero analizamos la capacidad proliferativa de las células T murinas que expresan CAR de CLDN6 utilizando una configuración experimental similar. Con ese objetivo, se transdujeron esplenocitos de ratones C57B1/6 con vectores retrovirales que contenían CAR de CLDN6 o un CAR de control o sin transgén.

Como los CAR proporcionan unión a antígeno mediada por scFv independiente de MHC o HLA, son funcionales tanto en células T CD4+ y CD8+ Por lo tanto, primero analizamos la expresión de la superficie de CAR en células T CD4+ y CD8+ después de la transducción retroviral de ambos CAR en esplenocitos murinos (Figura 5). Ambas moléculas podrían detectarse en la superficie tanto de células T CD4+ como de CD8+ que usan anticuerpos específicos de CAR (anticuerpos específicos anti-idiotipo y anticuerpos PAN-CAR que reconocen de forma ubicua la región espaciadora de IgGl-Fc que se produce). Se realizó un ensayo de proliferación in vitro basado en CFSE utilizando esplenocitos transducidos con CAR de CLDN6 o CAR de control junto con BMDC transfectadas con ARN de CLDN6 o de control (Figura 6). El CAR de CLDN6 mostró fuertes propiedades proliferativas en respuesta a células objetivo transfectadas con CLDN6 (aproximadamente 78 %), mientras que no se observó proliferación tras el reconocimiento de células objetivo que expresaban el antígeno reconocido por CAR de control. Por el contrario, el CAR de control inició la proliferación (55.4 %) de las células T transducidas exclusivamente en respuesta a las células objetivo que expresaban el antígeno respectivo, mientras que no se observó proliferación después del cocultivo de células objetivo con expresión de CLDN6.

Este resultado confirmó la funcionalidad de CAR de CLDN6 en células T murinas in vitro y demostró que las células T con CAR de CLDN6 murinas pueden proliferar fuertemente en respuesta a las BMDC murinas que expresan el antígeno CLDN6 humano después de la transferencia de ARN. Esto proporciona la base para la prueba de nuestra estrategia propuesta en un ambiente in vivo utilizando la transferencia adoptiva de células T murinas que expresan CAR combinadas con vacunación con ARN formulado con liposomas en un modelo animal singénico.

Ejemplo 3: Expansión de células T modificadas con CAR con APC pulsadas con ARN IVT in vivo

Para probar este concepto innovador en un entorno fisiológico, establecimos un modelo de ratón singénico que es totalmente inmunocompetente y, por lo tanto, refleja más fielmente el estado inmunológico de los pacientes y permite analizar la persistencia de las células T transferidas con CAR.

Se utilizará un antígeno, por ejemplo, ARN formulado con liposomas (ARN(Lip)) que codifica CLDN6, para expandir las células T con CAR in vivo de forma controlada. El ARN (Lip) se dirige selectivamente a las APC como DC en los órganos linfoides secundarios, en particular el bazo. Se espera que la interacción de las células T con CAR con las APC que expresan ectópicamente CLDN6 después de la captación de ARN (Lip) respalde la activación y proliferación adecuadas de las células T con CAR al proporcionar una coestimulación natural in situ. Para facilitar la expansión y el destino de las células T con CAR in vivo, se modificaron el vector pES12.6-CLDN6-CAR y un vector CAR de control para expresar genes informadores de luciferasa (effLuc) y eGFP secuencia abajo del CAR respectivo separado por secuencias virales de T2A. Es de destacar que la expresión de superficie y la especificidad del antígeno de CAR de CLDN6 y el CAR de control no se vieron afectados significativamente por la coexpresión de luciferasa y GFP en células T murinas transducidas con CAR (datos no mostrados).

Ratones BALB/c fueron injertados con 5 * 106 células T murinas a granel Thy1.1 congénicas transducidas con el informador de CAR (aprox. 2.5 * 108 células/kg de peso corporal) sin agotamiento previo de linfocitos. Se administraron en forma retroorbital 200 jL de ARN (Lip) que contenían 25 |jg de CLDN6 humano o un ARN de control en ratones 1 día después de la transferencia adoptiva de células T con CAR (Figura 7A). Luego se rastrearon las células T con CAR in vivo por administración intraperitoneal de 1.66 mg de solución de D-Luciferina por ratón. Una hora después de la ACT, la mayoría de las células T con CAR ya se encontraban en el bazo. Se indujo un aumento significativo (hasta 6 veces) en el flujo total mediante el tratamiento con 25 jg de ARN (Lip) detectado por obtención de imágenes de bioluminiscencia 3 días después de ACT (Figura 7B C). Este efecto se observó en ratones que recibieron células T con CAR de CLDN6 después del tratamiento con ARN (Lip) codificante de CLDN6, así como en ratones que recibieron células T con CAR de control después del tratamiento con ARN (Lip) codificante de ARN de control, pero no en los respectivos grupos de control. Estos datos demuestran que las células T con CAR se pueden expandir con éxito in situ de una manera altamente específica de antígeno. Además, el seguimiento clínico de los cambios en el peso corporal y el estado de salud general de los ratones no reveló ningún efecto negativo evidente de la transferencia de células T con CAR y el tratamiento posterior con ARN (Lip) (datos no mostrados).

Después de haber demostrado que las células T con CAR pueden expandirse con éxito in situ utilizando ARN (Lip) que codifica el antígeno respectivo (prueba de principio), investigamos si este efecto se correlaciona con la cantidad de ARN (Lip) utilizada en un estudio de respuesta a la dosis. Para este propósito, se trataron ratones BALB/c injertados con células T Thy1.1 murinas transducidas con CAR de CDLN6 (como se describió anteriormente) con 0.4-25 jg de ARN(Lip) de CLDN6. Se pudo observar una expansión dependiente de la dosis de las células T con CAR de CLDN6 in situ a través de BLI. Incluso la administración de una dosis baja de ARN codificante de CLDN6 (0.4-1 jg/ratón) condujo a un aumento de la emisión de luz en los ratones en comparación con el grupo no tratado (Figura 8 A+B). Además del cambio en la bioluminiscencia después de la vacunación con ARN (Lip), las frecuencias de células T Thy1.1+ con CAR de CDLN6 adoptivamente transferidas mostraron un aumento de aproximadamente 4.2 veces en sangre periférica 3 días después de ACT en comparación con ratones no vacunados (sin vacunación: células T Thy1.1 de 0.63 ± 0.09%; vacunación con 25 jg de ARN (Lip) de CLDN6: células T Thy1.1+ de 2.65 ± 0.38%; (media ± DE) (Figura 8 C+D). Las células T Thy1.1+ expandidas detectadas en sangre periférica eran principalmente células T con CAR CD8+ citotóxicas, es decir, el tipo de célula que puede ejecutar directamente funciones antitumorales en pacientes en comparación con ratones no vacunados donde prevalecen las células T CD4+ (Figura 8E). El cambio en las subpoblaciones fue claramente dependiente de la concentración.

Estos datos respaldan firmemente la idea de que es factible la expansión controlada de células T con CAR directamente en el paciente utilizando la tecnología de ARN (Lip).

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a un antígeno y/o un ácido nucleico que codifica el antígeno para su uso en un método de tratamiento mediante terapia, proporcionando una respuesta inmunitaria a una población de células objetivo o tejido objetivo que expresa el antígeno en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR mediante administración sistémica y administrar el ácido nucleico que codifica el antígeno, en el que el ácido nucleico que codifica el antígeno es ARN formulado en liposomas,

en las que el receptor de antígeno quimérico comprende preferiblemente un dominio de unión a antígeno, un dominio de señalización y un dominio coestimulador.

2. Las células T y/o el ácido nucleico para el uso de la reivindicación 1, en las que la respuesta inmunitaria es (i) una respuesta inmunitaria mediada por células T y/o (ii) una respuesta inmunitaria antitumoral y la población de células objetivo o el tejido objetivo es células tumorales o tejido tumoral.

3. Células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a un antígeno y/o un ácido nucleico que codifica el antígeno para su uso en un método de tratamiento de un mamífero que tiene una enfermedad, trastorno o afección asociada con la expresión o expresión elevada del antígeno, comprendiendo el método administrar al mamífero las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR mediante administración sistémica y administrar el ácido nucleico que codifica el antígeno, en el que el ácido nucleico que codifica el antígeno es ARN formulado en liposomas,

en las que el receptor de antígeno quimérico comprende preferiblemente un dominio de unión a antígeno, un dominio de señalización y un dominio coestimulador.

4. Las células T y/o el ácido nucleico para uso de la reivindicación 3, en las que la enfermedad, trastorno o afección es cáncer.

5. Las células T y/o el ácido nucleico para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en las que el antígeno es un antígeno tumoral.

6. Las células T y/o el ácido nucleico para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en las que el ácido nucleico que codifica el antígeno se expresa en células del mamífero para proporcionar el antígeno.

7. Las células T y/o el ácido nucleico para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en las que el ácido nucleico que codifica el antígeno es a Rn transcrito in vitro.

8. Las células T y/o el ácido nucleico para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en las que el ácido nucleico que codifica el antígeno se administra sistémicamente, en el que, preferiblemente, después de la administración sistémica del ácido nucleico que codifica el antígeno, la expresión del antígeno en el bazo y/o la expresión del antígeno en células presentadoras de antígeno, preferiblemente se producen células presentadoras de antígeno profesionales.

9. Las células T y/o el ácido nucleico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en las que el ácido nucleico que codifica el antígeno se expresa en células del mamífero para proporcionar el antígeno para la unión de las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR, resultando dicha unión en la estimulación, cebado y/o expansión de las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR.

10. Las células T y/o el ácido nucleico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en las que el método comprende además:

transfectar células con un ácido nucleico que codifica el CAR para proporcionar células T modificadas genéticamente para expresar un CAR,

en las que las células son células obtenidas de una muestra de un mamífero, comprendiendo la muestra células T o progenitores de células T.

11. Las células T y/o el ácido nucleico para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en las que las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR se transfectan de manera estable o transitoria con ácido nucleico que codifica el CAR.

12. Las células T y/o el ácido nucleico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en las que las células T y/o la muestra de células son del mamífero al que se le administran las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR y el ácido nucleico que codifica el antígeno o de un mamífero que es diferente al mamífero al que se le administran las células T modificadas genéticamente para expresar un CAR y el ácido nucleico que codifica el antígeno.

13. Un kit que comprende células T modificadas genéticamente para expresar un CAR dirigido a un antígeno y un ácido nucleico que codifica el antígeno, en el que el CAR comprende preferiblemente un dominio de unión al antígeno, un dominio de señalización y un dominio coestimulador, en el que el kit comprende al menos dos contenedores, donde un contenedor contiene una composición que comprende las células T modificadas con CAR, y otro contenedor contiene una composición que comprende el ácido nucleico que codifica el antígeno, en el que el ácido nucleico que codifica el antígeno es ARN formulado en liposomas.

14. El kit de la reivindicación 13, que además comprende instrucciones para el uso del kit en el método establecido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.