RS64420B1 - Pojačavanje efekta car-projektovanih t ćelija putem vakcinacije nukleinskom kiselinom - Google Patents

Pojačavanje efekta car-projektovanih t ćelija putem vakcinacije nukleinskom kiselinom

Info

Publication number
RS64420B1
RS64420B1 RS20230645A RSP20230645A RS64420B1 RS 64420 B1 RS64420 B1 RS 64420B1 RS 20230645 A RS20230645 A RS 20230645A RS P20230645 A RSP20230645 A RS P20230645A RS 64420 B1 RS64420 B1 RS 64420B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
antigen
nucleic acid
car
cell
Prior art date
Application number
RS20230645A
Other languages
English (en)
Inventor
Ugur Sahin
Katharina Reinhard
Petra Simon
Karolina Anna Mroz
Kathleen Hobohm
Original Assignee
Biontech Cell&Gene Therapies Gmbh
Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53175049&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS64420(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biontech Cell&Gene Therapies Gmbh, Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh filed Critical Biontech Cell&Gene Therapies Gmbh
Publication of RS64420B1 publication Critical patent/RS64420B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/00111—Hepatocyte growth factor receptor [HGFR or c-met]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/001112—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/001113—CD22, BL-CAM, siglec-2 or sialic acid- binding Ig-related lectin 2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001124—CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001166—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K39/001168—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
    • A61K39/001182—Carcinoembryonic antigen [CEA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001188—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001193—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; PAP or PSGR
    • A61K39/001195—Prostate specific membrane antigen [PSMA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4203—Receptors for growth factors
    • A61K40/4209—Hepatocyte growth factor receptor [HGFR] or c-met]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4212—CD22, BL-CAM, siglec-2 or sialic acid binding Ig-related lectin 2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4221—CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4224—Molecules with a "CD" designation not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4254—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K40/4255—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4264—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
    • A61K40/4266—Carcinoembryonic antigen [CEA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4274—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; Prostatic acid phosphatase [PAP]; Prostate-specific G-protein-coupled receptor [PSGR]
    • A61K40/4276—Prostate specific membrane antigen [PSMA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/17—Hinge-spacer domain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/22—Intracellular domain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)

Description

Opis
TEHNIČKA OBLAST
[0001] Predmetno učenje se odnosi na postupke i načine za poboljšanje efekta T ćelija projektovanih da eksprimiraju himerne antigenske receptore (CAR).
POZADINA
[0002] T ćelije igraju centralnu ulogu u ćelijski-posredovanom imunitetu kod ljudi i životinja. Prepoznavanje i vezivanje određenog antigena posredovano je T ćelijskim receptorima (TCR) koji se eksprimiraju na površini T ćelija. TCR T ćelije je u stanju da interaguje sa imunogenim peptidima (epitopima) koji su vezani za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i koji su prezentovani na površini ciljnih ćelija. Specifično vezivanje TCR pokreće signalnu kaskadu unutar T ćelije što dovodi do proliferacije i diferencijacije u zrelu efektorsku T ćeliju.
[0003] Ova raznolikost TCR se dobija genetičkim rearanžiranjem različitih diskontinuiranih segmenata gena koji kodiraju različite strukturne regione TCR. TCR su sačinjeni od jednog αlanca i jednog β-lanca ili od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. TCR α/β lanci su sačinjeni od N-terminusnog visoko polimorfnog varijabilnog regiona koji je uključen u prepoznavanje antigena i invarijantnog konstantnog regiona. Na genetičkom nivou, ovi lanci su razdvojeni na nekoliko regiona, varijabilni (V) region, region raznolikosti (D) (samo β- i δ-lanac), spojni region (J) i konstantni (C) region. Geni humanog β-lanca sadrže preko 60 varijabilnih (V) segmenata, 2 segmenta raznolikosti (D), preko 10 spojnih segmenata (J), i 2 segmenta konstantnog regiona (C). Geni humanog α-lanca sadrže preko 50 V segmenata, i preko 60 J segmenata, ali nemaju D segmente, kao i jedan C segment. Geni murinskog β-lanca sadrže preko 30 varijabilnih (V) segmenata, 2 segmenta raznolikosti (D), preko 10 spojnih segmenata (J), i 2 segmenta konstantnog regiona (C). Geni murinskog α-lanca sadrže skoro 100 V segmenata, 60 J segmenata, nemaju D segmente, ali imaju jedan C segment. Tokom diferencijacije T ćelija, specifični geni T ćelijskog receptora stvaraju se rearanžiranjem jednog V, jednog D (samo β- i δ-lanac), jednog J i jednog C regiona gena. Raznovrsnost TCR je dodatno povećana nepreciznim V-(D)-J rearanžmanom pri čemu se nasumični nukleotidi introdukuju i/ili deletiraju na mestima rekombinacije. Pošto se rearanžiranje lokusa TCR gena dešava u genomu tokom maturacije T ćelija, svaka zrela T ćelija eksprimira samo jedan specifični α/β TCR ili γ/δ TCR. Vezivanje MHC i antigena posredovano je pomoću regiona koji određuju komplementarnost 1, 2 i 3 (CDR1, CDR2, CDR3) TCR. CDR3 β-lanca koji je najkritičniji za prepoznavanje i vezivanje antigena kodiran je V-D-J spojem rearanžiranog gena TCR β-lanca.
[0004] TCR je deo kompleksne signalne mašinerije, koja uključuje heterodimerni kompleks TCR α- i β-lanaca, koreceptor CD4 ili CD8 i modul za transdukciju signala CD3 (Slika 1). Dok CD3 lanci prenose aktivacioni signal unutar ćelije, TCR α/β heterodimer je jedini odgovoran za prepoznavanje antigena. Stoga, transfer TCR α/β lanaca nudi mogućnost preusmeravanja T ćelija prema bilo kom antigenu od interesa.
[0005] Imunoterapija zasnovana na adoptivnom ćelijskom transferu (ACT) može se široko definisati kao oblik pasivne imunizacije sa prethodno senzibilizovanim T ćelijama čiji se transfer vrši u neimunske primaoce ili u autolognog domaćina posle ex vivo umnožavanja sa niskih prekursorskih učestalosti na klinički relevantan broj ćelija. Tipovi ćelija koje su upotrebljavane za ACT eksperimente su limfokinom-aktivirane ćelije ubice (LAK) (Mule, J.J. et al. (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A. et al. (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), tumor-infiltrirajući limfociti (TIL) (Rosenberg, S.A. et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), limfociti donora posle transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT) kao i tumor-specifične T ćelijske linije ili klonovi (Dudley, M.E. et al. (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173). Pokazano je da adoptivni T ćelijski transfer ima terapijsku aktivnost prema humanim virusnim infekcijama kao što je CMV. Dok CMV infekciju i reaktivaciju endogenih latentnih virusa kontroliše imunski sistem kod zdravih pojedinaca, to rezultuje značajnim morbiditetom i mortalitetom kod imunokompromitovanih pojedinaca kao što su primaoci transplanta ili pacijenti sa AIDS. Riddell i saradnici su demonstrirali rekonstituciju virusnog imuniteta pomoću adoptivne T ćelijske terapije kod pacijenata sa suprimiranim imunitetom posle transfera CD8+ CMV-specifičnih T ćelijskih klonova poreklom od HLA-podudarnih CMV-seropozitivnih donora transplanta (Riddell, S.R. (1992) Science 257, 238-241). Kao alternativni pristup, izvršen je transfer poliklonalnih CMV- ili EBV-specifičnih populacija T ćelija poreklom od donora primaocima transplanta rezultujući povećanom postojanošću transferisanih T ćelija (Rooney, C.M. et al. (1998) Blood 92, 1549-1555; Peggs, K.S. et al. (2003) Lancet 362, 1375-1377). Za adoptivnu imunoterapiju melanoma, Rosenberg i saradnici su uspostavili ACT pristup koji se oslanja na infuziju in vitro umnoženih autolognih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) izolovanih iz resektovanih tumora u kombinaciji sa nemijeloablativnom limfodepletirajućom hemioterapijom i visokom dozom IL2. Nedavno objavljena klinička studija rezultovala je objektivnom stopom odgovora od ~50% tretiranih pacijenata koji pate od metastatskog melanoma (Dudley, M.E. et al. (2005) J. Clin. Oncol.23: 2346-2357).
[0006] Alternativni pristup je adoptivni transfer autolognih T ćelija koje su reprogramirane da eksprimiraju tumor-reaktivni imunoreceptor definisane specifičnosti tokom kratkotrajne ex vivo kulture praćeno reinfuzijom u pacijenta (Kershaw M.H. et al. (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8): 525-41). Ova strategija čini ACT primenljivim na niz uobičajenih maligniteta čak i ukoliko su tumor-reaktivne T ćelije odsutne kod pacijenta. Pošto se antigena specifičnost T ćelija u potpunosti zasniva na heterodimernom kompleksu TCR α- i β-lanca, transfer kloniranih TCR gena u T ćelije nudi potencijal da se one preusmere na bilo koji antigen od interesa. Prema tome, TCR genska terapija obezbeđuje atraktivnu strategiju za razvoj antigenspecifične imunoterapije sa autolognim limfocitima kao opcijom lečenja. Glavne prednosti transfera TCR gena su stvaranje terapijskih količina antigen-specifičnih T ćelija unutar nekoliko dana i mogućnost introdukovanja specifičnosti koje nisu prisutne u endogenom TCR repertoaru pacijenta.
[0007] Nekoliko grupa je demonstriralo da je transfer TCR gena atraktivna strategija za preusmeravanje antigen-specifičnosti primarnih T ćelija (Morgan, R.A. et al. (2003) J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. et al. (2000) J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. et al. (2000) J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H.W. et al. (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. et al. (1986) Nature 320, 232-238). Rosenberg i njegova grupa su prvobitno demonstrirali izvodljivost TCR genske terapije kod ljudi u kliničkim ispitivanjima za lečenje malignog melanoma. Adoptivni transfer autolognih limfocita retrovirusno transdukovanih sa melanom/melanocit antigen-specifičnim TCR rezultovao je regresijom kancera kod do 30% lečenih pacijenata sa melanomom (Morgan, R.A. et al. (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. et al. (2009) Blood 114, 535-546). U međuvremenu kliničko testiranje TCR genske terapije prošireno je i na druge kancere pored melanoma koja ciljno deluje na mnoge različite tumorske antigene (Park, T.S. et al., (2011) Trends Biotechnol.29, 550-557).
[0008] Upotreba pristupa genetičkog projektovanja za insertovanje receptora definisane specifičnosti koji ciljno deluju na antigen u T ćelije u velikoj meri je proširila potencijalne mogućnosti ACT. Himerni antigenski receptori (CAR) su tip receptora koji ciljno deluju na antigen koji su sačinjeni od unutarćelijskih signalnih domena T ćelija fuzionisanih sa vanćelijskim antigen-vezujućim funkcionalnim grupama, najčešće jednolančanim varijabilnim fragmentima (scFvs) iz monoklonalnih antitela. CAR direktno prepoznaju antigene na površini ćelije, nezavisno od MHC-posredovanog prezentovanja, dozvoljavajući upotrebu konstrukta sa jednim receptorom koji je specifičan za bilo koji dati antigen kod svih pacijenata. Inicijalni CAR su fuzionisali domene za prepoznavanje antigena sa CD3ζ aktivacionim lancem kompleksa T ćelijskog receptora (TCR) (Slika 2). Naredne CAR iteracije su uključivale sekundarne kostimulatorne signale u tandemu sa CD3ζ, uključujući unutarćelijske domene iz CD28 ili različite molekule porodice TNF receptora kao što su 4-1BB (CD137) i OX40 (CD134). Dodatno, receptori treće generacije uključuju dva kostimulatorna signala pored CD3ζ, najčešće iz CD28 i 4-1BB. CAR druge i treće generacije dramatično su poboljšali antitumorsku efikasnost, u nekim slučajevima indukujući potpune remisije kod pacijenata sa uznapredovalim kancerom.
[0009] Generalno se smatra da je broj transferisanih T ćelija u korelaciji sa terapijskim odgovorima. Međutim, broj ćelija koje se mogu primeniti pacijentu za adoptivni T ćelijski transfer je ograničen i generisanje velike količine T ćelija za adoptivni T ćelijski transfer i dalje ostaje izazov. Značajno povećanje postojanosti ćelija moglo bi se postići kada su pacijenti primili limfodepletirajući preparativni režim pre infuzije bilo TIL ili receptorprojektovanih T ćelija. Međutim, transfer velike količine projektovanih T ćelija u praznog domaćina takođe predstavlja rizik od ozbiljnih neželjenih događaja u slučaju da se ciljani antigen neočekivano eksprimira u relevantnom normalnom tkivu. Prema tome, bilo bi poželjno izvršiti transfer ograničene količine projektovanih T ćelija koje se mogu umnožavati u pacijentu pošto se pokaže da su bezbedne. Wang et al. 2015 (Clinic. Cane. Res. 21: 2993-3002) opisuju strategiju stimulisanja CAR T ćelija in vivo putem njihovog nativnog T ćelijskog receptora, koji je specifičan za antigen citomegalovirusa. Smith et al. 2009 (J. Immunotherapy 32: 870-874) opisuju sekvencijalnu primenu autolognih tumor-infiltrirajućih limfocita koji prepoznaju gp100 antigen diferencijacije melanocita zajedno sa visoko imunogenom vakcinom protiv varičela koja eksprimira epitop gp100. Song et al.2011 (J. Am. Soc. Gene Therap. 19: 211-217) opisuje adenovirusnu vakcinu koja indukuje Th-1 za pojačavanje (boosting) adoptivno transferisanih T ćelija. Hui-Rong Jiang et al., 2006 (J. Immunology, 177: 4288-4298) opisuju kombinaciju T-ćelija koje eksprimiraju h5T4 specifični himerni antigenski receptor i adenovirusnu vakcinu koja kodira h5T4.
[0010] Predmetni pronalazači su pronašli da je moguće umnožavati adoptivno transferisane CAR-T ćelije upotrebom nukleinske vakcinacije, posebno RNK-vakcinacije kako bi se obezbedio antigen za CAR-T ćelijsku stimulaciju. Nakon adoptivnog transfera CAR-T ćelija, T ćelije su podvrgnute antigen-specifičnom umnožavanju tako što se T ćelije izlažu ćelijama, poželjno antigen-prezentujućim ćelijama, koje eksprimiraju antigen na površini ćelije. Stoga, moguće je izvršiti transfer samo malih količina CAR-projektovanih T ćelija u pacijenta i zatim umnožavati T ćelije in vivo primenom vakcine nukleinske kiseline koja obezbeđuje antigen.
OPIS
Sažetak
[0011] Predmetno učenje generalno obuhvata lečenje bolesti pomoću ciljnog delovanja na ćelije koje eksprimiraju antigen na površini ćelije kao što su bolesne ćelije koje eksprimiraju antigen na površini ćelije, posebno kancerske ćelije koje eksprimiraju tumorski antigen na površini ćelije. Postupci obezbeđuju selektivnu eradikaciju ćelija koje na svojoj površini eksprimiraju antigen, čime se minimalizuju neželjeni efekti na normalne ćelije koje ne eksprimiraju antigen. Primjenjuju se T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju himerni antigenski receptor (CAR) koji ciljno deluje na ćelije putem vezivanja za antigen. Štaviše, primenjuje se nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu. Nukleinsku kiselinu eksprimiraju odgovarajuće ciljne ćelije kako bi se obezbedio antigen za stimulisanje, prajmovanje i/ili umnožavanje T ćelija. T ćelije stimulisane, prajmovane i/ili umnožene u pacijentu u stanju su da prepoznaju ćelije koje eksprimiraju antigen na površini ćelije, kao što su bolesne ćelije, rezultujući eradikacijom bolesnih ćelija. Može se smatrati da predmetni pristup uključuje pasivnu i aktivnu imunizaciju. Lečenje koje uključuje primenu T ćelija genetički modifikovanih da eksprimiraju CAR može se smatrati oblikom pasivne imunizacije. Lečenje koje uključuje primenu nukleinske kiseline koja kodira antigen ili njegovu varijantu, čime se stimuliše T ćelijama-posredovan imunski odgovor za ciljnu populaciju ćelija ili tkivo, može se smatrati oblikom aktivne imunizacije.
[0012] U jednom aspektu učenje se odnosi na postupak za stimulisanje, prajmovanje i/ili umnožavanje in vivo T ćelija genetički modifikovanih da eksprimiraju himerni antigenski receptor (CAR) koji ciljno deluje na antigen, koji sadrži dovođenje u kontakt T ćelija sa antigenom ili njegovom varijantom in vivo. U jednom primeru izvođenja, antigen ili njegova varijanta se obezbeđuje primenom nukleinske kiseline koja kodira antigen ili njegovu varijantu. Nukleinsku kiselinu eksprimiraju odgovarajuće ciljne ćelije kako bi se obezbedio antigen ili njegova varijanta za stimulisanje, prajmovanje i/ili umnožavanje T ćelija.
[0013] U jednom aspektu učenje se odnosi na postupak za obezbeđivanje imunskog odgovora za ciljnu populaciju ćelija ili ciljno tkivo koji eksprimiraju antigen kod sisara, postupak sadrži primenu sisaru T ćelija genetički modifikovanih da eksprimiraju himerni antigenski receptor (CAR) koji ciljno deluje na antigen i primenu nukleinske kiseline koja kodira antigen ili njegovu varijantu.
[0014] U jednom primeru izvođenja, imunski odgovor je T ćelijama-posredovan imunski odgovor. U jednom primeru izvođenja, imunski odgovor je antitumorski imunski odgovor i ciljna populacija ćelija ili ciljno tkivo su tumorske ćelije ili tumorsko tkivo.
[0015] U jednom aspektu učenje se odnosi na postupak lečenja sisara koji ima bolest, poremećaj ili stanje povezano sa ekspresijom ili povišenom ekspresijom antigena, postupak sadrži primenu sisaru T ćelija genetički modifikovanih da eksprimiraju himerni antigenski receptor (CAR) koji ciljno deluje na antigen i primenu nukleinske kiseline koja kodira antigen ili njegovu varijantu.
[0016] U jednom primeru izvođenja, bolest, poremećaj ili stanje je kancer.
[0017] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, antigen je tumorski antigen. U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, antigen je odabran iz grupe koja se sastoji od klaudina, kao što su klaudin 6, klaudin 18.2, CD19, CD20, CD22, CD33, CD123, mezotelina, CEA, c-Met, PSMA, GD-2, i NY-ESO-1. U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, antigen je patogeni antigen. Patogen može biti gljivični, virusni, ili bakterijski patogen.
[0018] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu eksprimira se u ćelijama sisara kako bi se obezbedio antigen ili njegova varijanta.
[0019] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, ekspresija antigena ili njegove varijante je na površini ćelije.
[0020] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu prolazno se eksprimira u ćelijama sisara. Stoga, u jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu nije integrisana u genom ćelija.
[0021] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu je RNK, poželjno in vitro transkribovana RNK.
[0022] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR i/ili nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu primenjuju se sistemski.
[0023] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, posle sistemske primene nukleinske kiseline koja kodira antigen ili njegovu varijantu, dolazi do ekspresije antigena ili njegove varijante u slezini. U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, posle sistemske primene nukleinske kiseline koja kodira antigen ili njegovu varijantu, dolazi do ekspresije antigena ili njegove varijante u antigen-prezentujućim ćelijama, poželjno profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su odabrane iz grupe koja se sastoji od dendritskih ćelija, makrofaga i B ćelija. U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, posle sistemske primene nukleinske kiseline koja kodira antigen ili njegovu varijantu, ne dolazi ili suštinski ne dolazi ni do kakve ekspresije antigena ili njegove varijante u plućima i/ili jetri. U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, posle sistemske primene nukleinske kiseline koja kodira antigen ili njegovu varijantu, ekspresija antigena ili njegove varijante u slezini je najmanje 5 puta veća od količine ekspresije u plućima.
[0024] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu eksprimira se u ćelijama sisara kako bi se obezbedio antigen ili njegova varijanta za vezivanje od strane T ćelija genetički modifikovanih da eksprimiraju CAR, pri čemu navedeno vezivanje rezultuje stimulacijom, prajmovanjem i/ili umnožavanjem T ćelija genetički modifikovanih da eksprimiraju CAR.
[0025] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu formulisana je u vehikulumu za isporuku kao što su čestice. U jednom primeru izvođenja, vehikulum za isporuku sadrži najmanje jedan lipid. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan lipid sadrži najmanje jedan katjonski lipid. U jednom primeru izvođenja, lipid formira kompleks sa i/ili inkapsulira nukleinsku kiselinu koja kodira antigen ili njegovu varijantu. U jednom primeru izvođenja, lipid je sadržan u vezikuli koja inkapsulira nukleinsku kiselinu koja kodira antigen ili njegovu varijantu. U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu formulisana je u lipozomima.
[0026] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, postupak dodatno sadrži:
dobijanje uzorka ćelija iz sisara, uzorak sadrži T ćelije ili T ćelijske progenitore, i transfektovanje ćelija sa nukleinskom kiselinom koja kodira CAR kako bi se obezbedile T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR.
[0027] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR su stabilno ili prolazno transfektovane sa nukleinskom kiselinom koja kodira CAR. Stoga, nukleinska kiselina koja kodira CAR je integrisana ili nije integrisana u genom T ćelija.
[0028] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, T ćelije i/ili uzorak ćelija su iz sisara kome se primenjuju T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR i nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu. U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, T ćelije i/ili uzorak ćelija su iz sisara koji je različit od sisara kome se primenjuju T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR i nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu.
[0029] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR su inaktivirane za ekspresiju endogenog T ćelijskog receptora i/ili endogenog HLA.
[0030] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, CAR sadrži antigen-vezujući domen, transmembranski domen, i T ćelijski signalni domen. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući domen sadrži scFv sekvencu monoklonalnog antitela za antigen.
[0031] U jednom aspektu učenje se odnosi na komplet koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira CAR koji ciljno deluje na antigen ili T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR koji ciljno deluje na antigen i nukleinsku kiselinu koja kodira antigen ili njegovu varijantu. U jednom primeru izvođenja, komplet dodatno sadrži uputstva za upotrebu kompleta u bilo kom od postupaka iz učenja.
[0032] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, T ćelije mogu biti autologne, alogene ili singene za sisara. T ćelije mogu biti genetički modifikovane in vitro da eksprimiraju himerni antigenski receptor (CAR) koji ciljno deluje na antigen.
[0033] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, antigen se eksprimira u bolesnoj ćeliji kao što je kancerska ćelija. U jednom primeru izvođenja, antigen se eksprimira na površini bolesne ćelije kao što je kancerska ćelija. U jednom primeru izvođenja, CAR se vezuje za vanćelijski domen ili za epitop u vanćelijskom domenu antigena ili njegove varijante. U jednom primeru izvođenja, CAR se vezuje za nativne epitope antigena ili njegove varijante prisutne na površini živih ćelija. U jednom primeru izvođenja navedeni antigen je klaudin, posebno klaudin 6 ili klaudin 18.2, i navedeni CAR se vezuje za prvu vanćelijsku petlju navedenog klaudina. U jednom primeru izvođenja, vezivanje navedenog CAR kada je eksprimiran od strane T ćelija i/ili prisutan na T ćelijama za antigen ili njegovu varijantu prisutnu na ćelijama, kao što su antigen-prezentujuće ćelije, rezultuje stimulacijom, prajmovanjem i/ili umnožavanjem navedenih T ćelija. U jednom primeru izvođenja, vezivanje navedenog CAR kada je eksprimiran od strane T ćelija i/ili prisutan na T ćelijama za antigen prisutan na bolesnim ćelijama, kao što su kancerske ćelije, rezultuje citolizom i/ili apoptozom bolesnih ćelija, pri čemu navedene T ćelije poželjno oslobađaju citotoksične faktore, npr. perforine i granzime.
[0034] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, CAR sadrži antigen-vezujući domen. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući domen je sačinjen od egzodomena CAR. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući domen sadrži jednolančani varijabilni fragment (scFv) antitela za antigen. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući domen sadrži varijabilni region teškog lanca imunoglobulina (VH) sa specifičnošću za antigen (VH(antigen)) i varijabilni region lakog lanca imunoglobulina (VL) sa specifičnošću za antigen (VL(antigen)). U jednom primeru izvođenja, navedeni varijabilni region teškog lanca (VH) i odgovarajući varijabilni region lakog lanca (VL) povezani su putem peptidnog linkera, poželjno peptidnog linkera koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu (GGGGS)3.
[0035] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, CAR sadrži transmembranski domen. U jednom primeru izvođenja, transmembranski domen je hidrofobni alfa heliks koji španuje membranu. U jednom primeru izvođenja, transmembranski domen sadrži CD28 transmembranski domen ili njegov fragment.
[0036] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, CAR sadrži T ćelijski signalni domen. U jednom primeru izvođenja, T ćelijski signalni domen lociran je unutarćelijski. U jednom primeru izvođenja, T ćelijski signalni domen sadrži CD3-zeta, poželjno endodomen CD3-zeta, opciono u kombinaciji sa CD28. U jednom primeru izvođenja, T ćelijski signalni domen sadrži sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 8 ili njen fragment, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta.
[0037] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, CAR sadrži signalni peptid koji usmerava nascentni protein u endoplazmin retikulum. U jednom primeru izvođenja, signalni peptid prethodi antigen-vezujućem domenu. U jednom primeru izvođenja, signalni peptid sadrži sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 5 ili njen fragment, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta.
[0038] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, CAR sadrži spejser region koji povezuje antigen-vezujući domen sa transmembranskim domenom. U jednom primeru izvođenja, spejser region omogućava antigen-vezujućem domenu da se orijentiše u različitim pravcima kako bi se olakšalo prepoznavanje antigena. U jednom primeru izvođenja, spejser region sadrži region zgloba iz IgG1. U jednom primeru izvođenja, spejser region sadrži
1
sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 6 ili njen fragment, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta.
[0039] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, CAR sadrži strukturu:
NH2 - signalni peptid - antigen-vezujući domen - spejser region - transmembranski domen η T ćelijski signalni domen - COOH.
[0040] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, CAR je poželjno specifičan za antigen na koji ciljno deluje, posebno kada je prisutan na površini ćelije kao što je bolesna ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija.
[0041] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, CAR može biti eksprimiran od strane i/ili biti prisutan na površini T ćelije, poželjno citotoksične T ćelije. U jednom primeru izvođenja, T ćelija je reaktivna sa antigenom na koji ciljno deluje CAR.
[0042] U jednom primeru izvođenja svih aspekata učenja, T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR i/ili nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu, bilo zajedno ili odvojeno jedno od drugog mogu se primenjivati u farmaceutskoj kompoziciji koja može sadržati farmaceutski prihvatljiv nosač i može opciono sadržati jedan ili više adjuvanasa, stabilizatora itd. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je za upotrebu u lečenju ili preveniranju bolesti koja uključuje antigen kao što je bolest kancera kao što je ona koja je ovde opisana.
[0043] U daljem aspektu, učenje obezbeđuje agense i kompozicije koje su ovde opisane za upotrebu u postupcima koji su ovde opisani.
[0044] U jednom aspektu, učenje se odnosi na T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju himerni antigenski receptor (CAR) koji ciljno deluje na antigen za upotrebu u postupcima iz učenja.
[0045] U jednom aspektu, učenje se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira antigen ili njegovu varijantu za upotrebu u postupcima iz učenja.
[0046] Ostala svojstva i prednosti trenutnog učenja biće očigledni iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.
Detaljan opis
[0047] Iako je predmetno učenje detaljno opisano u nastavku, treba razumeti da ovo učenje nije ograničeno na posebne metodologije, protokole i reagense koji su ovde opisani pošto oni mogu da variraju. Takođe treba razumeti da je terminologija koja se ovde upotrebljava samo u svrhu opisivanja određenih primera izvođenja, i nije namenjena da ograniči obim predmetnog učenja koje će biti ograničeno samo priloženim patentnim zahtevima. Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde upotrebljavaju imaju ista značenja koja uobičajeno razumeju oni sa prosečnim iskustvom u struci.
[0048] U nastavku, biće opisani elementi predmetnog učenja. Ovi elementi su nabrojani sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, treba razumeti da se mogu kombinovati na bilo koji način i u bilo kom broju kako bi se kreirali dopunski primeri izvođenja. Različito opisani primeri i poželjni primeri izvođenja ne bi trebalo da se tumače tako da ograničavaju predmetno učenje samo na eksplicitno opisane primere izvođenja. Ovaj opis treba razumeti tako da podržava i obuhvata primere izvođenja koji kombinuju eksplicitno opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem objavljenih i/ili poželjnih elemenata. Štaviše, bilo koje permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati objavljenim u opisu predmetne prijave osim ukoliko kontekst ne ukazuje drugačije.
[0049] Poželjno, termini koji se ovde upotrebljavaju su definisani kao što je opisano u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Švajcarska.
[0050] Praksa predmetnog učenja će koristiti, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke biohemije, ćelijske biologije, imunologije, i tehnike rekombinantne DNK koje su objašnjene u literaturi u ovoj oblasti (uporediti, npr. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
[0051] Duž ove specifikacije i patentnih zahteva koji slede, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadržati" i varijacije kao što su "sadrži" i "koji sadrži", razumeće se da podrazumevaju uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka iako u nekim primerima izvođenja takav drugi član, ceo broj ili korak ili grupa članova, celih brojeva ili koraka može biti isključen, tj. predmetna tema se sastoji u uključivanju navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Termini neodređenih i određenih članova i slične reference koje se upotrebljavaju u kontekstu opisa učenja (naročito u kontekstu patentnih zahteva) treba da se tumače tako da pokrivaju i jedninu i množinu, osim ukoliko je ovde drugačije naznačeno ili je jasno u suprotnosti sa kontekstom. Navođenje opsega vrednosti ovde je samo namenjeno da služi kao stenografski postupak za pojedinačno upućivanje na svaku zasebnu vrednost koja spada u opseg. Osim ukoliko nije ovde drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost je uključena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena.
[0052] Svi postupci koji su ovde opisani mogu se izvesti u bilo kom pogodnom redosledu osim ukoliko nije ovde drugačije naznačeno ili je drugačije jasno u suprotnosti sa kontekstom. Upotreba bilo kog i svih primera, ili primernog jezika (npr. "kao što je"), koji je ovde obezbeđen, ima za cilj samo da bolje ilustruje učenje i ne predstavlja ograničenje obima učenja koje je inače zahtevano patentom. Nijedan jezik u specifikaciji ne bi trebalo da se tumači kao da ukazuje na bilo koji element za koji se ne zahteva zaštita patentom bitan za praksu učenja.
[0053] Termin "imunski odgovor" označava integrisani telesni odgovor na antigen i poželjno označava ćelijski imunski odgovor ili ćelijski kao i humoralni imunski odgovor. Imunski odgovor može biti zaštitni/preventivni/profilaktički i/ili terapijski.
[0054] "Obezbeđuje imunski odgovor" može značiti da nije bilo imunskog odgovora prema određenom ciljnom antigenu, ciljnoj ćeliji i/ili ciljnom tkivu pre obezbeđivanja imunskog odgovora, ali takođe može značiti da je postojao određeni nivo imunskog odgovora prema određenom ciljnom antigenu, ciljnoj ćeliji i/ili ciljnom tkivu pre obezbeđivanja imunskog odgovora i posle obezbeđivanja imunskog odgovora navedeni imunski odgovor je pojačan. Stoga, "obezbeđivanje imunskog odgovora" uključuje "indukovanje imunskog odgovora" i "pojačavanje imunskog odgovora". Poželjno, posle obezbeđivanja imunskog odgovora kod subjekta, navedeni subjekt je zaštićen od razvoja bolesti kao što je bolest kancera ili se stanje bolesti poboljšava obezbeđivanjem imunskog odgovora. Na primer, imunski odgovor prema tumorskom antigenu može biti obezbeđen kod pacijenta koji ima bolest kancera ili kod subjekta koji je u riziku od razvoja bolesti kancera. Obezbeđivanje imunskog odgovora u ovom slučaju može značiti da se stanje bolesti subjekta poboljšava, da subjekt ne razvija metastaze, ili da subjekt koji je u riziku od razvoja bolesti kancera ne razvija bolest kancera.
[0055] "Ćelijski-posredovan imunitet" ili "ćelijski imunitet", ili slični termini podrazumevaju da uključuju ćelijski odgovor usmeren na ćelije koje karakteriše ekspresija antigena, posebno koje karakteriše prezentovanje antigena sa MHC klase I ili klase II. Ćelijski odgovor se odnosi na ćelije zvane T ćelije ili T-limfociti koje deluju ili kao "pomoćničke" ili "ubice". Pomoćničke T ćelije (takođe označene CD4<+>T ćelije) igraju centralnu ulogu regulisanjem imunskog odgovora i ćelije ubice (takođe označene citotoksične T ćelije, citolitičke T ćelije, CD8<+>T ćelije ili CTL) ubijaju bolesne ćelije kao što su kancerske ćelije, prevenirajući proizvodnju više bolesnih ćelija.
1
[0056] Termin "antigen" se odnosi na agens koji sadrži epitop prema kome treba da se generiše i/ili usmeri imunski odgovor. Poželjno, antigen u kontekstu predmetnog učenja je molekul koji, opciono posle obrade, indukuje imunsku reakciju, koja je poželjno specifična za antigen ili ćelije koje eksprimiraju antigen, poželjno na površini ćelije. Termin "antigen" uključuje posebno proteine i peptide. Antigen je poželjno proizvod koji odgovara ili je poreklom od antigena koji se javlja u prirodi. Takvi antigeni koji se javljaju u prirodi mogu uključivati ili mogu biti poreklom od alergena, virusa, bakterija, gljivica, parazita i drugih infektivnih agenasa i patogena ili antigen takođe može biti tumorski antigen. U skladu sa predmetnim učenjem, antigen može odgovarati proizvodu koji se javlja u prirodi, na primer, virusnom proteinu, ili njegovom delu.
[0057] Termin "patogen" se odnosi na patogene mikroorganizme i sadrži viruse, bakterije, gljivice, jednoćelijske organizme, i parazite. Primeri za patogene viruse su virus humane imunodeficijencije (HIV), citomegalovirus (CMV), virus herpesa (HSV), hepatitis A-virus (HAV), HBV, HCV, papiloma virus, i humani T-limfotrofni virus (HTLV). Jednoćelijski organizmi sadrže plazmodije, tripanozome, amebe, itd.
[0058] U poželjnom primeru izvođenja, antigen je antigen povezan sa bolešću. Termin "antigen povezan sa bolešću" označava sve antigene koji su od patološkog značaja. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, antigen povezan sa bolešću je prisutan u bolesnim ćelijama, tkivima i/ili organima dok nije prisutan ili je prisutan u redukovanoj količini u zdravim ćelijama, tkivima i/ili organima i stoga se može upotrebljavati za ciljno delovanje na bolesne ćelije, tkiva i/ili organe, npr. pomoću T ćelija koje nose CAR koji ciljno deluje na antigen. U jednom primeru izvođenja, antigen povezan sa bolešću je prisutan na površini bolesne ćelije.
[0059] U poželjnom primeru izvođenja, antigen je tumorski antigen ili antigen povezan sa tumorom, tj. konstituent kancerskih ćelija koji može biti poreklom od citoplazme, površine ćelije i ćelijskog nukleusa, posebno oni antigeni koji se proizvode, poželjno u velikim količinama, kao površinski antigeni na kancerskim ćelijama.
[0060] U kontekstu predmetnog učenja, termin "tumorski antigen" ili "antigen povezan sa tumorom" odnosi se na proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili u specifičnim razvojnim stadijumima, na primer, tumorski antigen može biti pod normalnim uslovima specifično eksprimiran u tkivu želuca, poželjno u mukozi želuca, u reproduktivnim organima, npr. u testisima, u trofoblastnom tkivu, npr. u placenti, ili u ćelijama germinativne linije, i eksprimira se ili se aberantno eksprimira u jednom ili više tumorskih ili kancerskih tkiva. U ovom kontekstu, "ograničeni broj" poželjno znači ne više od 3, poželjnije ne više od 2. Tumorski antigeni u kontekstu predmetnog učenja uključuju, na primer, antigene diferencijacije, poželjno antigene diferencijacije specifične za tip ćelije, tj. proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u određenom tipu ćelije u određenom stadijumu diferencijacije, antigene kancera/testisa, tj. proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u testisima, a ponekad i u placenti, i antigene specifične za germinativnu liniju. U kontekstu predmetnog učenja, tumorski antigen je poželjno povezan sa površinom kancerske ćelije i poželjno se ne eksprimira ili se samo retko eksprimira u normalnim tkivima. Poželjno, tumorski antigen ili aberantna ekspresija tumorskog antigena identifikuje kancerske ćelije. U kontekstu predmetnog učenja, tumorski antigen koji eksprimira kancerska ćelija kod subjekta, npr. pacijenta koji pati od bolesti kancera, poželjno je sopstveni protein kod navedenog subjekta. U poželjnim primerima izvođenja, tumorski antigen u kontekstu predmetnog učenja eksprimira se pod normalnim uslovima specifično u tkivu ili organu koji nije esencijalan, tj. tkivima ili organima koji kada su oštećeni imunskim sistemom ne dovode do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koji nisu ili su teško dostupni imunskom sistemu. Poželjno, amino-kiselinska sekvenca tumorskog antigena je identična između tumorskog antigena koji se eksprimira u normalnim tkivima i tumorskog antigena koji se eksprimira u kancerskim tkivima.
[0061] Primeri za tumorske antigene koji mogu biti korisni u predmetnom učenju su p53, ART-4, BAGE, beta-katenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, proteini površine ćelije iz porodice klaudina, kao što su KLAUDIN-6, KLAUDIN-18.2 i KLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (ili hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, poželjno MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, ili MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Miozin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 minor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinaza 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 ili RU2, SAGE, SART-1 ili SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE i WT. Posebno poželjni tumorski antigeni uključuju KLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) i KLAUDIN-6 (CLDN6).
[0062] Termin "CLDN" kao što se ovde upotrebljava znači klaudin i uključuje CLDN6 i CLDN18.2. Poželjno, klaudin je humani klaudin. Klaudini su porodica proteina koji su najvažnije komponente čvrstih spojeva, gde uspostavljaju paraćelijsku barijeru koja kontroliše
1
protok molekula u međućelijskom prostoru između ćelija epitela. Klaudini su transmembranski proteini koji španuju membranu 4 puta sa N-terminusnim i C-terminusnim krajem koji su locirani u citoplazmi. Prva vanćelijska petlja, označena EC1 ili ECL1, sastoji se u proseku od 53 amino-kiseline, i druga vanćelijska petlja, označena EC2 ili ECL2, sastoji se od oko 24 amino-kiseline. Proteini površine ćelije iz porodice klaudina eksprimiraju se u tumorima različitog porekla, i posebno su pogodni kao ciljne strukture u vezi sa antitelomposredovanom kancerskom imunoterapijom zbog svoje selektivne ekspresije (bez ekspresije u normalnom tkivu što je relevantno za toksičnost) i lokalizacije u ćelijskoj membrani.
[0063] CLDN6 i CLDN18.2 su identifikovani kao diferencijalno eksprimirani u tumorskim tkivima, pri čemu je jedino normalno tkivo koje eksprimira CLDN18.2 želudačno i jedino normalno tkivo koje eksprimira CLDN6 je placenta.
[0064] CLDN18.2 se selektivno eksprimira u normalnim tkivima u diferenciranim epitelskim ćelijama mukoze želuca. CLDN18.2 se eksprimira u kancerima različitog porekla kao što su karcinom pankreasa, karcinom jednjaka, karcinom želuca, bronhijalni karcinom, karcinom dojke, i ORL tumori. CLDN18.2 je vredan cilj za prevenciju i/ili lečenje primarnih tumora, kao što su kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer jajnika, kancer kolona, kancer jetre, kancer glave i vrata, i kanceri žučne kese, i njihove metastaze, posebno metastaze kancera želuca kao što su Krukenberg tumori, peritonealne metastaze, i metastaze u limfnim čvorovima.
[0065] Pronađeno je da se CLDN6 eksprimira, na primer, kod kancera jajnika, kancera pluća, kancera želuca, kancera dojke, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera kože, melanoma, kancera glave i vrata, sarkoma, kancera žučnih kanala, kancera bubrežnih ćelija, i kancera mokraćne bešike. CLDN6 je posebno poželjan cilj za prevenciju i/ili lečenje kancera jajnika, posebno adenokarcinoma jajnika i teratokarcinoma jajnika, kancera pluća, uključujući sitnoćelijski kancer pluća (SCLC) i nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), posebno karcinoma pločastih ćelija pluća i adenokarcinoma, kancera želuca, kancera dojke, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera kože, posebno karcinoma bazalnih ćelija i karcinoma pločastih ćelija, malignog melanoma, kancera glave i vrata, posebno malignog pleomorfnog adenoma, sarkoma, posebno sinovijalnog sarkoma i karcinosarkoma, kancera žučnih kanala, kancera mokraćne bešike, posebno karcinoma prelaznih ćelija i papilarnog karcinoma, kancera bubrega, posebno karcinoma bubrežnih ćelija uključujući svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija i papilarni karcinom bubrežnih ćelija, kancera kolona, kancera tankog creva, uključujući kancer ileuma, posebno adenokarcinoma tankog creva i adenokarcinoma ileuma, embrionalnog karcinoma testisa, horiokarcinoma placente, kancera grlića materice, kancera
1
testisa, posebno seminoma testisa, teratoma testisa i kancera embrionalnog testisa, kancera uterusa, tumora germinativnih ćelija kao što je teratokarcinom ili embrionalni karcinom, posebno tumora germinativnih ćelija testisa, i njihovih metastatskih oblika.
[0066] Termin "CLDN18.2" se poželjno odnosi na humani CLDN18.2, i, posebno na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od amino-kiselinske sekvence u skladu sa SEQ ID NO: 1 na listi sekvenci ili varijante navedene amino-kiselinske sekvence. Prva vanćelijska petlja CLDN18.2 poželjno sadrži amino-kiseline 27 do 81, poželjnije amino-kiseline 29 do 78 iz amino-kiselinske sekvence koja je pokazana u SEQ ID NO: 1. Druga vanćelijska petlja CLDN18.2 poželjno sadrži amino-kiseline 140 do 180 iz amino-kiselinske sekvence koja je pokazana u SEQ ID NO: 1. Navedene prva i druga vanćelijska petlja poželjno formiraju vanćelijski deo CLDN18.2.
[0067] Termin "CLDN6" se poželjno odnosi na humani CLDN6, i, posebno na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od amino-kiselinske sekvence SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 3 na listi sekvenci ili varijante navedene amino-kiselinske sekvence. Prva vanćelijska petlja CLDN6 poželjno sadrži amino-kiseline 28 do 80, poželjnije amino-kiseline 28 do 76 iz amino-kiselinske sekvence koja je pokazana u SEQ ID NO: 2 ili iz amino-kiselinske sekvence koja je pokazana u SEQ ID NO: 3. Druga vanćelijska petlja CLDN6 poželjno sadrži aminokiseline 138 do 160, poželjno amino-kiseline 141 do 159, poželjnije amino-kiseline 145 do 157 iz amino-kiselinske sekvence koja je pokazana u SEQ ID NO: 2 ili iz amino-kiselinske sekvence koja je pokazana u SEQ ID NO: 3. Navedene prva i druga vanćelijska petlja poželjno formiraju vanćelijski deo CLDN6.
[0068] Termin "varijanta" u skladu sa učenjem odnosi se, posebno, na mutante, splajs varijante, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrste i homologe vrste, posebno one koje su prirodno prisutne. Alelna varijanta se odnosi na alternaciju u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Kompletno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiselinska sekvenca sa različitom vrstom porekla od one date sekvence nukleinske kiseline ili amino-kiselinske sekvence. Termin "varijanta" obuhvataće sve posttranslaciono modifikovane varijante i konformacione varijante.
[0069] Antigen ili njegova varijanta kodirana nukleinskom kiselinom koja se primenjuje u skladu sa učenjem, tj. antigen vakcine, treba da rezultuje stimulacijom, prajmovanjem i/ili umnožavanjem CAR-projektovanih T ćelija. Navedene stimulisane, prajmovane i/ili umnožene T ćelije treba da budu usmerene prema ciljnom antigenu, posebno ciljnom antigenu koji se eksprimira na bolesnim ćelijama, tkivima i/ili organima, tj. antigenu povezanim sa
1
bolešću. Stoga, antigen vakcine može odgovarati antigenu povezanim sa bolešću, ili može biti njegova varijanta. U jednom primeru izvođenja, takva varijanta je imunološki ekvivalentna antigenu povezanim sa bolešću. U kontekstu predmetnog učenja, termin "varijanta antigena" znači agens koji rezultuje stimulacijom, prajmovanjem i/ili umnožavanjem CAR-projektovanih T ćelija koji je stimulisao, prajmovao i/ili umnožio T ćelije koje ciljaju antigen, tj. antigen povezan sa bolešću, posebno kada se eksprimira na bolesnim ćelijama, tkivima i/ili organima. Stoga, antigen vakcine kodiran nukleinskom kiselinom koja se primenjuje u skladu sa učenjem može biti identičan antigenu povezanim sa bolešću, može sadržati antigen povezan sa bolešću ili njegov deo ili može sadržati antigen koji je homologan sa antigenom povezanim sa bolešću ili njegovim delom. Ukoliko antigen vakcine kodiran nukleinskom kiselinom koja se primenjuje u skladu sa učenjem sadrži deo antigena povezanog sa bolešću ili deo antigena koji je homologan antigenu povezanim sa bolešću, navedeni deo može sadržati epitop antigena povezanog sa bolešću na koji CAR iz CAR-projektovanih T ćelija ciljno deluje. Stoga, u skladu sa učenjem, antigen kodiran nukleinskom kiselinom koja se primenjuje može sadržati imunogeni fragment antigena povezanog sa bolešću, kao što je peptidni fragment antigena povezanog sa bolešću. "Imunogeni fragment antigena" u skladu sa učenjem poželjno se odnosi na deo ili fragment antigena koji je sposoban da stimuliše, prajmuje i/ili umnožava T ćelije koje nose CAR koji se vezuje za antigen ili ćelije koje eksprimiraju antigen. Poželjno je da se antigen vakcine (slično antigenu povezanim sa bolešću) može eksprimirati na površini ćelije kao što je antigen-prezentujuća ćelija tako da se obezbedi relevantni epitop za vezivanje od strane CAR na T ćelijama. Antigen vakcine kodiran nukleinskom kiselinom koja se primenjuje u skladu sa učenjem može biti rekombinantni antigen.
[0070] Termin "imunološki ekvivalentno" znači da imunološki ekvivalentan molekul kao što je imunološki ekvivalentna amino-kiselinska sekvenca pokazuje ista ili suštinski ista imunološka svojstva i/ili ispoljava iste ili suštinski iste imunološke efekte, npr. u odnosu na tip imunološkog efekta. U kontekstu predmetnog učenja, termin "imunološki ekvivalentno" poželjno se upotrebljava u odnosu na imunološke efekte ili svojstva antigena ili varijanti antigena koji se upotrebljavaju za imunizaciju. Na primer, amino-kiselinska sekvenca je imunološki ekvivalentna referentnoj amino-kiselinskoj sekvenci ukoliko navedena aminokiselinska sekvenca kada se izloži imunskom sistemu subjekta kao što su T ćelije koje nose CAR koji se vezuje za referentnu amino-kiselinsku sekvencu ili ćelije koje eksprimiraju referentnu amino-kiselinsku sekvencu indukuje imunsku reakciju koja ima specifičnost reagovanja sa referentnom amino-kiselinskom sekvencom. Stoga, molekul koji je imunološki
1
ekvivalentan antigenu pokazuje ista ili suštinski ista svojstva i/ili ispoljava iste ili suštinski iste efekte u pogledu stimulacije, prajmovanja i/ili umnožavanja CAR-projektovanih T ćelija kao antigen na koji ciljno deluju CAR-projektovane T ćelije.
[0071] U skladu sa učenjem, antigen ili njegova varijanta treba da bude prepoznatljiv od strane CAR. Poželjno, antigen ili njegova varijanta, ukoliko je prepoznata od strane CAR, može da indukuje u prisustvu odgovarajućih kostimulatornih signala stimulaciju, prajmovanje i/ili umnožavanje T ćelije koja nosi CAR koji prepoznaje antigen ili njegovu varijantu. U kontekstu primera izvođenja predmetnog učenja, antigen ili njegova varijanta poželjno je prisutan na površini ćelije, poželjno antigen-prezentujuće ćelije. Prepoznavanje antigena na površini bolesne ćelije može rezultovati imunskom reakcijom prema antigenu (ili ćeliji koja eksprimira antigen).
[0072] U skladu sa različitim aspektima učenja, cilj je poželjno da se obezbedi imunski odgovor prema kancerskim ćelijama koje eksprimiraju tumorski antigen kao što je CLDN6 ili CLDN18.2 i da se leči bolest kancera koja uključuje ćelije koje eksprimiraju tumorski antigen kao što je CLDN6 ili CLDN18.2. Poželjno, učenje uključuje primenu CAR-projektovanih T ćelija koje ciljno deluju prema kancerskim ćelijama koje eksprimiraju tumorski antigen kao što je CLDN6 ili CLDN18.2.
[0073] U skladu sa učenjem, termin "kancer pozitivan na tumorski antigen" ili slični termini znače kancer koji uključuje kancerske ćelije koje eksprimiraju tumorski antigen, poželjno na površini navedenih kancerskih ćelija. Na kancerske ćelije koje eksprimiraju tumorski antigen na površini mogu ciljno delovati imunoreaktivne ćelije koje nose CAR koji ciljno deluje na tumorski antigen.
[0074] "Površina ćelije" se upotrebljava u skladu sa svojim normalnim značenjem u struci, i stoga uključuje spoljašnjost ćelije koja je dostupna za vezivanje od strane proteina i drugih molekula. Antigen se eksprimira na površini ćelija ukoliko je lociran na površini navedenih ćelija i dostupan je za vezivanje od strane npr. antigen-specifičnih antitela koja se dodaju ćelijama. U jednom primeru izvođenja, antigen eksprimiran na površini ćelija je integralni membranski protein koji ima vanćelijski deo koji je prepoznat od strane CAR.
[0075] Termin "vanćelijski deo" ili "egzodomen" u kontekstu predmetnog učenja označava deo molekula kao što je protein koji je okrenut prema vanćelijskom prostoru ćelije i poželjno je dostupan sa spoljašnje strane navedene ćelije, npr. od strane vezujućih molekula kao što su antitela koja su locirana van ćelije. Poželjno, termin označava jednu ili više vanćelijskih petlji ili domena ili njihov fragment.
1
[0076] Termini "porcija" ili "deo" se ovde upotrebljavaju naizmenično i označavaju kontinuirani ili diskontinuirani element strukture kao što je amino-kiselinska sekvenca. Termin "fragment" označava kontinuirani element strukture kao što je amino-kiselinska sekvenca. Porcija, deo ili fragment strukture poželjno sadrži jedno ili više funkcionalnih svojstava, npr. antigena, imunološka i/ili vezujuća svojstva navedene strukture. Porcija ili deo proteinske sekvence poželjno sadrži najmanje 6, posebno najmanje 8, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 50, ili najmanje 100 uzastopnih i/ili neuzastopnih amino-kiselina proteinske sekvence. Fragment proteinske sekvence poželjno sadrži najmanje 6, posebno najmanje 8, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 50, ili najmanje 100 uzastopnih amino-kiselina proteinske sekvence.
[0077] U skladu sa učenjem, antigen se (suštinski) ne eksprimira u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije ispod granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije suviše nizak kako bi omogućio vezivanje od strane antigen-specifičnih antitela koja se dodaju ćeliji. U skladu sa učenjem, antigen se eksprimira u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije iznad granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije dovoljno visok da omogući vezivanje od strane antigen-specifičnih antitela koja se dodaju ćeliji. Poželjno, antigen eksprimiran u ćeliji je eksprimiran ili izložen, tj. prisutan na površini navedene ćelije i, stoga, dostupan za vezivanje od strane antigenspecifičnih molekula kao što su antitela ili CAR molekuli koji se dodaju ćeliji.
[0078] "Ciljna ćelija" će značiti ćeliju koja je cilj za imunski odgovor kao što je ćelijski imunski odgovor. Ciljne ćelije uključuju bilo koju nepoželjnu ćeliju kao što je kancerska ćelija. U poželjnim primerima izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira ciljni antigen koji je poželjno prisutan na površini ćelije.
[0079] Termin "epitop" označava antigenu determinantu u molekulu kao što je antigen, tj. deo u ili fragment molekula koji je prepoznat, tj. vezan, od strane imunskog sistema, na primer, koji je prepoznat od strane antitela ili CAR. Na primer, epitopi su diskretna, trodimenzionalna mesta na antigenu, koja su prepoznata od strane imunskog sistema. Epitopi se uobičajeno sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su amino-kiseline ili bočni lanci šećera i uobičajeno imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prvi, ali ne i za potonji, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Poželjno, epitop je sposoban da izazove imunski odgovor prema antigenu ili ćeliji koja eksprimira antigen. Poželjno, termin se odnosi na imunogeni deo antigena. Epitop proteina kao što je tumorski antigen poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinuirani deo navedenog proteina i poželjno je dužine između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30,
2
najpoželjnije između 10 i 25 amino-kiselina, na primer, epitop može biti poželjno dužine 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 amino-kiselina.
[0080] "Obrada antigena" označava degradaciju antigena u proizvode obrade, koji su fragmenti navedenog antigena (npr. degradacija proteina u peptide) i povezivanje jednog ili više ovih fragmenata (npr. putem vezivanja) sa MHC molekulima za prezentovanje od strane ćelija, poželjno antigen-prezentujućih ćelija specifičnim T ćelijama.
[0081] Antigen-prezentujuća ćelija (APC) je ćelija koja prikazuje antigen u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) na svojoj površini. T ćelije mogu prepoznati ovaj kompleks upotrebom svog T ćelijskog receptora (TCR). Antigen-prezentujuće ćelije obrađuju antigene i prezentuju ih T ćelijama. U skladu sa učenjem, termin "antigen-prezentujuća ćelija" uključuje profesionalne antigen-prezentujuće ćelije i neprofesionalne antigen-prezentujuće ćelije.
[0082] Profesionalne antigen-prezentujuće ćelije su veoma efikasne u internalizaciji antigena, bilo fagocitozom ili receptorom-posredovanom endocitozom, i zatim prikazivanju fragmenta antigena, vezanog za MHC molekul klase II, na svojoj membrani. T ćelija prepoznaje i interaguje sa kompleksom antigen-MHC molekul klase II na membrani antigen-prezentujuće ćelije. Dodatni kostimulatorni signal zatim proizvodi antigen-prezentujuća ćelija, što dovodi do aktivacije T ćelije. Ekspresija kostimulatornih molekula je definišuća odlika profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija.
[0083] Glavni tipovi profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija su dendritske ćelije, koje imaju najširi opseg prezentovanja antigena, i verovatno su najvažnije antigen-prezentujuće ćelije, makrofagi, B ćelije, i određene aktivirane epitelske ćelije.
[0084] Neprofesionalne antigen-prezentujuće ćelije ne eksprimiraju konstitutivno proteine MHC klase II potrebne za interakciju sa naivnim T ćelijama; oni se eksprimiraju samo nakon stimulacije neprofesionalnih antigen-prezentujućih ćelija pomoću određenih citokina kao što je IFNγ.
[0085] Dendritske ćelije (DC) su populacije leukocita koje T ćelijama prezentuju antigene uhvaćene u perifernim tkivima preko puteva prezentovanja antigena i MHC klase II i klase I. Dobro je poznato da su dendritske ćelije moćni induceri imunskih odgovora i da je aktivacija ovih ćelija kritičan korak za indukciju antitumorskog imuniteta.
[0086] Dendritske ćelije i progenitori mogu se dobiti iz periferne krvi, kostne srži, ćelija koje infiltriraju tumor, ćelija koje infiltriraju peritumorsko tkivo, limfnih čvorova, slezine, kože, krvi pupčane vrpce ili bilo kog drugog pogodnog tkiva ili tečnosti. Na primer, dendritske ćelije se mogu diferencirati ex vivo dodavanjem kombinacije citokina kao što su GM-CSF, IL4, IL-13 i/ili TNFα kulturama monocita koji su sakupljeni iz periferne krvi. Alternativno, CD34 pozitivne ćelije sakupljene iz periferne krvi, krvi pupčane vrpce ili kostne srži mogu se diferencirati u dendritske ćelije dodavanjem medijumu za kulturu kombinacija GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 liganda, LPS, flt3 liganda i/ili drugog(ih) jedinjenja koja indukuju diferencijaciju, maturaciju i proliferaciju dendritskih ćelija.
[0087] Dendritske ćelije su pogodno kategorisane kao "nezrele" i "zrele" ćelije, što se može upotrebljavati kao jednostavan način za razlikovanje između dva dobro okarakterisana fenotipa. Međutim, ovu nomenklaturu ne treba tumačiti tako da isključuje sve moguće intermedijarne stadijume diferencijacije.
[0088] Nezrele dendritske ćelije su okarakterisane kao antigen-prezentujuće ćelije sa visokim kapacitetom za preuzimanje i obradu antigena, što je u korelaciji sa visokom ekspresijom Fcγ receptora i receptora manoze. Zreli fenotip tipično karakteriše niža ekspresija ovih markera, ali visoka ekspresija molekula ćelijske površine odgovornih za aktivaciju T ćelija, kao što su MHC klase I i klase II, adhezivnih molekula (npr. CD54 i CD11) i kostimulatornih molekula (npr. CD40, CD80, CD86 i 4-1 BB).
[0089] Maturacija dendritskih ćelija se označava kao status aktivacije dendritskih ćelija u kome takve antigen-prezentujuće dendritske ćelije dovode do prajmovanja T ćelija, dok prezentovanje od strane nezrelih dendritskih ćelija rezultuje tolerancijom. Maturacija dendritskih ćelija je uglavnom uzrokovana biomolekulima sa mikrobnim odlikama koje detektuju urođeni receptori (bakterijska DNK, virusna RNK, endotoksin, itd.), proinflamatornim citokinima (TNF, IL-1, IFN), ligacijom CD40 na površini dendritske ćelije pomoću CD40L, i supstancama koje se oslobađaju iz ćelija koje prolaze kroz stresnu ćelijsku smrt. Dendritske ćelije se mogu dobiti kultivisanjem ćelija kostne srži in vitro sa citokinima, kao što su faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF) i faktor nekroze tumora alfa.
[0090] Termin "imunogenost" se odnosi na relativnu efikasnost antigena da indukuje imunsku reakciju.
[0091] Termin "imunske efektorske funkcije" u kontekstu predmetnog učenja uključuje sve funkcije posredovane komponentama imunskog sistema koje rezultuju, na primer, ubijanjem bolesnih ćelija kao što su tumorske ćelije, ili inhibicijom rasta tumora i/ili inhibicijom razvoja tumora, uključujući inhibiciju diseminacije tumora i metastaza. Poželjno, imunske efektorske funkcije u kontekstu predmetnog učenja su efektorske funkcije posredovane T ćelijama. Takve funkcije sadrže u slučaju pomoćničke T ćelije (CD4<+>T ćelije) oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8<+>limfocita (CTL) i/ili B-ćelija, i u slučaju CTL eliminaciju ćelija, tj. ćelija koje karakteriše ekspresija antigena, na primer, putem apoptoze ili ćelijske lize posredovane perforinom, produkcija citokina kao što su IFN-γ i TNF-α, i specifično citolitičko ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju antigen.
[0092] Termin "imunoreaktivna ćelija" ili "imunska efektorska ćelija" u kontekstu predmetnog učenja odnosi se na ćeliju koja vrši efektorske funkcije tokom imunske reakcije. "Imunoreaktivna ćelija" poželjno je sposobna da vezuje antigen kao što je antigen eksprimiran na površini ćelije i posreduje u imunskom odgovoru. Na primer, takve ćelije sekretuju citokine i/ili hemokine, ubijaju mikrobe, sekretuju antitela, prepoznaju inficirane ili kancerske ćelije, i opciono eliminišu takve ćelije. Na primer, imunoreaktivne ćelije sadrže T ćelije (citotoksične T ćelije, pomoćničke T ćelije, T ćelije koje infiltriraju tumor), B ćelije, ćelije prirodne ubice, neutrofile, makrofage, i dendritske ćelije. Poželjno, u kontekstu predmetnog učenja, "imunoreaktivne ćelije" su T ćelije, poželjno CD4<+>i/ili CD8<+>T ćelije. U skladu sa učenjem, termin "imunoreaktivna ćelija" takođe uključuje ćeliju koja može da sazri u imunsku ćeliju (kao što je T ćelija, posebno pomoćnička T ćelija, ili citolitička T ćelija) uz odgovarajuću stimulaciju. Imunoreaktivne ćelije sadrže CD34<+>hematopoetske matične ćelije, nezrele i zrele T ćelije i nezrele i zrele B ćelije. Diferencijacija prekursora T ćelija u citolitičku T ćeliju, kada su izloženi antigenu, slična je klonskoj selekciji imunskog sistema.
[0093] Poželjno, "imunoreaktivna ćelija" prepoznaje antigen sa određenim stepenom specifičnosti, posebno ukoliko je prisutan na površini antigen-prezentujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su kancerske ćelije. Poželjno, navedeno prepoznavanje omogućava ćeliji koja prepoznaje antigen da se odazove ili reaguje. Ukoliko je ćelija pomoćnička T ćelija (CD4<+>T ćelija), takav odziv ili reaktivnost može uključivati oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8<+>limfocita (CTL) i/ili B-ćelija. Ukoliko je ćelija CTL, takav odziv ili reaktivnost može uključivati eliminaciju ćelija, tj. ćelija koje karakteriše ekspresija antigena, na primer, putem apoptoze ili ćelijske lize posredovane perforinom. U skladu sa učenjem, CTL odziv može uključivati kontinuirani fluks kalcijuma, deobu ćelija, proizvodnju citokina kao što su IFN-γ i TNF-α, povećanje ekspresije aktivacionih markera kao što su CD44 i CD69, i specifično citolitičko ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju antigen. CTL odziv se takođe može odrediti upotrebom veštačkog reportera koji tačno ukazuje na CTL odziv. Takvi CTL koji prepoznaju antigen i koji se odazivaju ili reaguju se takođe ovde nazivaju "CTL koji se odazivaju na antigen".
[0094] "Limfoidna ćelija" je ćelija koja je, opciono posle odgovarajuće modifikacije, npr. posle transfera T ćelijskog receptora ili CAR, sposobna da proizvede imunski odgovor kao što je ćelijski imunski odgovor, ili prekursorske ćelije takve ćelije, i uključuje limfocite, poželjno
2
T limfocite, limfoblaste, i plazmocite. Limfoidna ćelija može biti imunoreaktivna ćelija kao što je ovde opisano. Poželjna limfoidna ćelija je T ćelija koja se može modifikovati da eksprimira T ćelijski receptor ili CAR na površini ćelije. U jednom primeru izvođenja, limfoidnoj ćeliji nedostaje endogena ekspresija T ćelijskog receptora.
[0095] Termini "T ćelija" i "T limfocit" se ovde upotrebljavaju naizmenično i uključuju pomoćničke T ćelije (CD4<+>T ćelije) i citotoksične T ćelije (CTL, CD8<+>T ćelije) koje sadrže citolitičke T ćelije.
[0096] T ćelije pripadaju grupi belih krvnih zrnaca poznatih kao limfociti, i igraju centralnu ulogu u ćelijski-posredovanom imunitetu. Mogu se razlikovati od drugih tipova limfocita, kao što su B ćelije i ćelije prirodne ubice po prisustvu specijalnih receptora na površini ćelije koji se zovu T ćelijski receptori (TCR). Timus je glavni organ odgovoran za maturaciju T ćelija. Otkriveno je nekoliko različitih podskupova T ćelija, svaki sa različitom funkcijom.
[0097] Pomoćničke T ćelije pomažu drugim belim krvnim zrncima u imunološkim procesima, uključujući maturaciju B ćelija u plazmocite i aktivaciju citotoksičnih T ćelija i makrofaga, između ostalih funkcija. Ove ćelije su takođe poznate kao CD4<+>T ćelije pošto eksprimiraju CD4 protein na svojoj površini. Pomoćničke T ćelije postaju aktivirane kada im se prezentuju peptidni antigeni od strane molekula MHC klase II koji se eksprimiraju na površini antigenprezentujućih ćelija (APC). Kada se aktiviraju, one se brzo dele i sekretuju male proteine zvane citokini koji regulišu ili pomažu u aktivnom imunskom odgovoru.
[0098] Citotoksične T ćelije uništavaju ćelije inficirane virusima i tumorske ćelije, i takođe su umešane u odbacivanje transplanta. Ove ćelije su takođe poznate kao CD8<+>T ćelije pošto eksprimiraju CD8 glikoprotein na svojoj površini. Ove ćelije prepoznaju svoje ciljeve vezivanjem za antigen povezan sa MHC klase I, koji je prisutan na površini skoro svake ćelije tela.
[0099] Većina T ćelija ima T ćelijski receptor (TCR) koji postoji kao kompleks nekoliko proteina. Sam T ćelijski receptor je sačinjen od dva odvojena peptidna lanca, koji se proizvode sa nezavisnih gena T ćelijskih receptora alfa i beta (TCRα i TCRβ) i nazivaju se αi β-TCR lancima. γδ T ćelije (gama delta T ćelije) predstavljaju mali podskup T ćelija koje poseduju poseban T ćelijski receptor (TCR) na svojoj površini. Međutim, u γδ T ćelijama, TCR je sačinjen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T ćelija je mnogo ređa (2% od ukupnih T ćelija) od αβ T ćelija.
[0100] Sve T ćelije su poreklom od hematopoetskih matičnih ćelija u kostnoj srži. Hematopoetski progenitori poreklom od hematopoetskih matičnih ćelija naseljavaju timus i umnožavaju se deobom ćelija kako bi generisali veliku populaciju nezrelih timocita. Najraniji timociti ne eksprimiraju ni CD4 ni CD8, pa su stoga klasifikovani kao dvostruko negativne (CD4-CD8-) ćelije. Kako napreduju u svom razvoju, one postaju dvostruko pozitivni timociti (CD4<+>CD8<+>), i konačno sazrevaju u jednostruko pozitivne (CD4<+>CD8<->ili CD4-CD8<+>) timocite koji se zatim oslobađaju iz timusa u periferna tkiva.
[0101] T ćelije se generalno mogu pripremiti in vitro ili ex vivo, upotrebom standardnih procedura. Na primer, T ćelije mogu biti izolovane iz kostne srži, periferne krvi ili frakcije kostne srži ili periferne krvi sisara, kao što je pacijent, upotrebom komercijalno dostupnog sistema za odvajanje ćelija. Alternativno, T ćelije mogu biti poreklom od srodnih ili nesrodnih ljudi, ne-humanih životinja, ćelijskih linija ili kultura. Uzorak koji sadrži T ćelije mogu, na primer, biti mononukleusne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0102] T ćelije koje se upotrebljavaju u skladu sa učenjem mogu da eksprimiraju endogeni T ćelijski receptor ili može da im nedostaje ekspresija endogenog T ćelijskog receptora.
[0103] Nukleinske kiseline kao što je RNK koja kodira CAR mogu se introdukovati u T ćelije ili druge ćelije sa litičkim potencijalom, posebno u limfoidne ćelije.
[0104] Termin "CAR koji ciljno deluje na antigen" odnosi se na CAR koji kada je prisutan na imunoreaktivnoj ćeliji kao što je T ćelija prepoznaje antigen kao što je na površini antigenprezentujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su kancerske ćelije, tako da se imunoreaktivna ćelija stimuliše, prajmuje i/ili umnožava ili ispoljava efektorske funkcije imunoreaktivnih ćelija kao što je prethodno opisano.
[0105] Termin "antigen-specifična T ćelija" ili slični termini odnose se na T ćeliju koja, posebno kada je obezbeđena sa CAR, prepoznaje antigen na koji CAR ciljno deluje, kao što je na površini antigen-prezentujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su kancerske ćelije i poželjno ispoljava efektorske funkcije T ćelija kao što je prethodno opisano. Smatra se da su T ćelije i druge limfoidne ćelije specifične za antigen ukoliko ćelije ubijaju ciljne ćelije koje eksprimiraju antigen. Specifičnost T ćelija može da se proceni upotrebom bilo koje od različitih standardnih tehnika, na primer, unutar testa oslobađanja hroma ili testa proliferacije. Alternativno, može se izmeriti sinteza limfokina (kao što je interferon-γ).
[0106] Termin "glavni kompleks histokompatibilnosti" i skraćenica "MHC" uključuju molekule MHC klase I i MHC klase II i odnose se na kompleks gena koji se javlja kod svih vertebrata. MHC proteini ili molekuli su važni za signalizaciju između limfocita i antigenprezentujućih ćelija ili bolesnih ćelija u imunskim reakcijama, pri čemu MHC proteini ili molekuli vezuju peptide i prezentuju ih za prepoznavanje T ćelijskim receptorima. Proteini koje kodira MHC eksprimiraju se na površini ćelija, i prikazuju T ćeliji i sopstvene antigene
2
(peptidne fragmente iz same ćelije) i nesopstvene antigene (npr. fragmente invazivnih mikroorganizama).
[0107] U skladu sa učenjem, termin "himerni antigenski receptor (CAR)" je sinonim za termine "himerni T ćelijski receptor" i "veštački T ćelijski receptor".
[0108] Ovi termini se odnose na projektovane receptore, koji daju proizvoljnu specifičnost kao što je specifičnost monoklonalnog antitela na imunskoj efektorskoj ćeliji kao što je T ćelija. Na ovaj način se može generisati veliki broj kancer-specifičnih T ćelija za adoptivni ćelijski transfer. Stoga, CAR može biti prisutan na T ćelijama, npr. umesto ili pored sopstvenog T ćelijskog receptora T ćelije. Takve T ćelije ne zahtevaju nužno obradu i prezentovanje antigena za prepoznavanje ciljne ćelije već pre mogu da prepoznaju poželjno sa specifičnošću bilo koji antigen koji je prisutan na ciljnoj ćeliji. Poželjno, navedeni CAR se eksprimira na površini ćelija. U svrhu predmetnog učenja, T ćelije koje sadrže CAR su sadržane terminom "T ćelija" kao što se ovde upotrebljava.
[0109] U skladu sa učenjem, termin "CAR" (ili "himerni antigenski receptor") odnosi se na veštački receptor koji sadrži jedan molekul ili kompleks molekula koji prepoznaje, tj. vezuje se za ciljnu strukturu (npr. antigen) na ciljnoj ćeliji kao što je kancerska ćelija (npr. vezivanjem antigen-vezujućeg domena za antigen koji se eksprimira na površini ciljne ćelije) i može dati specifičnost imunskoj efektorskoj ćeliji kao što je T ćelija koja eksprimira navedeni CAR na površini ćelije. Poželjno, prepoznavanje ciljne strukture od strane CAR rezultuje aktivacijom imunske efektorske ćelije koja eksprimira navedeni CAR. CAR može sadržati jednu ili više proteinskih jedinica navedene proteinske jedinice sadrže jedan ili više domena kao što je ovde opisano. Termin "CAR" ne uključuje T ćelijske receptore.
[0110] U jednom primeru izvođenja, jednolančani varijabilni fragment (scFv) poreklom od monoklonalnog antitela fuzionisan je za CD3-zeta transmembranski i endodomen. Takvi molekuli rezultuju sprovođenjem zeta signala kao odgovora na prepoznavanje od strane scFv njegovog antigenskog cilja na ciljnoj ćeliji i ubijanje ciljne ćelije koja eksprimira ciljni antigen. Domeni za prepoznavanje antigena koji se takođe mogu upotrebljavati uključuju, između ostalog, alfa i beta pojedinačne lance T ćelijskog receptora (TCR). U stvari skoro sve što vezuje dati cilj sa visokim afinitetom može se upotrebljavati kao domen za prepoznavanje antigena.
[0111] Nakon prepoznavanja antigena, receptori se grupišu i signal se sprovodi u ćeliju. U tom pogledu, "T ćelijski signalni domen" je domen, poželjno endodomen, koji sprovodi aktivacioni signal T ćeliji pošto je antigen vezan. Najčešće upotrebljavana endodomenska komponenta je CD3-zeta.
2
[0112] Terapija adoptivnog ćelijskog transfera sa CAR-projektovanim T ćelijama koje eksprimiraju himerne antigenske receptore je obećavajući terapeutik protiv kancera, pošto CAR-modifikovane T ćelije mogu biti projektovane da ciljaju praktično bilo koji tumorski antigen. Na primer, T ćelije pacijenta mogu biti genetički projektovane (genetički modifikovane) da eksprimiraju CAR specifično usmerene prema antigenima na tumorskim ćelijama pacijenta, i zatim infuzijom vraćene u pacijenta.
[0113] U skladu sa učenjem, CAR može zameniti funkciju T ćelijskog receptora kao što je prethodno opisano i, posebno, može dati reaktivnost kao što je citolitička aktivnost ćeliji kao što je T ćelija kao što je prethodno opisano. Međutim, za razliku od vezivanja T ćelijskog receptora za antigeni peptid-MHC kompleks kao što je prethodno opisano, CAR se može vezati za antigen, posebno kada se eksprimira na površini ćelije.
[0114] Glikoprotein površine T ćelije CD3-zeta lanac je protein koji je kod ljudi kodiran genom CD247. CD3-zeta zajedno sa T ćelijskim receptorom alfa/beta i gama/delta heterodimerima i CD3-gama, -delta i -epsilon, formira T ćelijski receptor-CD3 kompleks. Zeta lanac igra važnu ulogu u kuplovanju prepoznavanja antigena sa nekoliko unutarćelijskih puteva transdukcije signala. Termin "CD3-zeta" se poželjno odnosi na humani CD3-zeta, i, posebno, na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od amino-kiselinske sekvence SEQ ID NO: 8 na listi sekvenci ili varijante navedene amino-kiselinske sekvence.
[0115] CD28 (klaster diferencijacije 28) je jedan od molekula eksprimiranih na T ćelijama koji obezbeđuju kostimulatorne signale, koji su neophodni za aktivaciju T ćelija. CD28 je receptor za CD80 (B7.1) i CD86 (B7.2). Stimulacija preko CD28 pored T ćelijskog receptora (TCR) može da obezbedi snažan kostimulatorni signal T ćelijama za proizvodnju različitih interleukina (posebno IL-6). Termin "CD28" se poželjno odnosi na humani CD28, i, posebno, na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od amino-kiselinske sekvence SEQ ID NO: 7 na listi sekvenci ili varijante navedene amino-kiselinske sekvence.
[0116] U skladu sa učenjem, CAR generalno mogu sadržati tri domena.
[0117] Prvi domen je vezujući domen koji prepoznaje i vezuje antigen.
[0118] Drugi domen je kostimulacioni domen. Kostimulacioni domen služi za pojačavanje proliferacije i preživljavanja citotoksičnih limfocita nakon vezivanja CAR za ciljanu funkcionalnu grupu. Identitet kostimulacionog domena je ograničen samo po tome što ima sposobnost da pojača ćelijsku proliferaciju i preživljavanje nakon vezivanja ciljane funkcionalne grupe od strane CAR. Pogodni kostimulacioni domeni uključuju CD28, CD137 (4-1BB), član porodice receptora faktora nekroze tumora (TNF), CD134 (OX40), člana TNFR-superporodice receptora, i CD278 (ICOS), kostimulatorni molekul CD28-
2
superporodice eksprimiran na aktiviranim T ćelijama. Osoba sa iskustvom će razumeti da se varijante sekvenci ovih napomenutih kostimulacionih domena mogu upotrebljavati bez negativnog uticaja na učenje, gde varijante imaju istu ili sličnu aktivnost kao domen na kome su modelirane. Takve varijante će imati najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom domena iz kog su poreklom. U nekim primerima izvođenja učenja, CAR konstrukti sadrže dva kostimulaciona domena.
[0119] Dok posebne kombinacije uključuju sve moguće varijacije četiri napomenuta domena, specifični primeri uključuju CD28+CD137 (4-1BB) i CD28+CD134 (OX40).
[0120] Treći domen je aktivacioni signalni domen (ili T ćelijski signalni domen). Aktivacioni signalni domen služi za aktiviranje citotoksičnih limfocita nakon vezivanja CAR za antigen. Identitet aktivacionog signalnog domena je ograničen samo po tome što ima sposobnost da indukuje aktivaciju odabranog citotoksičnog limfocita nakon vezivanja antigena od strane CAR. Pogodni aktivacioni signalni domeni uključuju CD3 [zeta] lanac T ćelija i Fc receptor [gama]. Stručnjak sa iskustvom će razumeti da se varijante sekvenci ovih napomenutih aktivacionih signalnih domena mogu upotrebljavati bez negativnog uticaja na učenje, gde varijante imaju istu ili sličnu aktivnost kao domen na kome su modelirane. Takve varijante će imati najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa amino-kiselinskom sekvencom domena iz kog su poreklom.
[0121] CAR iz predmetnog učenja mogu sadržati tri domena, zajedno u obliku fuzionog proteina. Takvi fuzioni proteini će generalno sadržati vezujući domen, jedan ili više kostimulacionih domena, i aktivacioni signalni domen, povezanih u smeru N-terminus ka C-terminusu. Međutim, CAR iz predmetnog učenja nisu ograničeni na ovaj aranžman i drugi aranžmani su prihvatljivi i uključuju vezujući domen, aktivacioni signalni domen, i jedan ili više kostimulacionih domena. Razumeće se da pošto vezujući domen mora biti slobodan da vezuje antigen, postavljanje vezujućeg domena u fuzioni protein će generalno biti takvo da se postiže prikaz regiona na spoljašnjosti ćelije. Na isti način, pošto kostimulacioni i aktivacioni signalni domeni služe da indukuju aktivnost i proliferaciju citotoksičnih limfocita, fuzioni protein će generalno prikazati ova dva domena u unutrašnjosti ćelije. CAR mogu uključivati dodatne elemente, kao što je signalni peptid kako bi se osigurao pravilan eksport fuzionog proteina na površinu ćelije, transmembranski domen kako bi se osiguralo da se fuzioni protein zadržava kao integralni membranski protein, i domen zgloba (ili spejser region) koji daje fleksibilnost vezujućem domenu i omogućava snažno vezivanje za antigen.
[0122] Ćelije koje se upotrebljavaju u vezi sa CAR sistemom iz predmetnog učenja poželjno su T ćelije, posebno citotoksični limfociti, poželjno odabrani od citotoksičnih T ćelija, ćelija
2
prirodnih ubica (NK), i limfokinom-aktiviranih ćelija ubica (LAK). Nakon aktivacije, svaki od ovih citotoksičnih limfocita pokreće destrukciju ciljnih ćelija. Na primer, citotoksične T ćelije pokreću destrukciju ciljnih ćelija na jedan ili oba od sledećih načina. Prvo, nakon aktivacije T ćelije oslobađaju citotoksine kao što su perforin, granzimi, i granulizin. Perforin i granulizin stvaraju pore u ciljnoj ćeliji, i granzimi ulaze u ćeliju i pokreću kaskadu kaspaza u citoplazmi koja indukuje apoptozu (programiranu ćelijsku smrt) ćelije. Drugo, apoptoza se može indukovati putem interakcije Fas-Fas liganda između T ćelija i ciljnih ćelija. Citotoksični limfociti će poželjno biti autologne ćelije, iako se mogu upotrebljavati heterologne ćelije ili alogene ćelije.
[0123] Mogu se upotrebljavati različiti postupci za introdukovanje CAR konstrukata u T ćelije uključujući transfekciju DNK koja nije zasnovana na virusu, sisteme zasnovane na transpozonu i sisteme zasnovane na virusima. Transfekcija DNK koja nije zasnovana na virusu ima nizak rizik od insercione mutageneze. Sistemi zasnovani na transpozonu mogu efikasnije da integrišu transgene od plazmida koji ne sadrže integracioni element. Sistemi zasnovani na virusima uključuju upotrebu γ-retrovirusa i lentivirusnih vektora. Relativno je lako proizvesti γ-retroviruse, efikasno i trajno transdukuju T ćelije, i preliminarno su se pokazali bezbednim sa stanovišta integracije u primarnim humanim T ćelijama. Lentivirusni vektori takođe efikasno i trajno transdukuju T ćelije, ali su skuplji za proizvodnju. Takođe su potencijalno bezbedniji od sistema koji su zasnovani na retrovirusima.
[0124] Termin "imunoglobulin" se odnosi na proteine superporodice imunoglobulina, poželjno na antigenske receptore kao što su antitela ili B ćelijski receptor (BCR). Imunoglobulini se karakterišu strukturnim domenom, tj. domenom imunoglobulina, koji ima karakterističan imunoglobulinski (Ig) nabor. Termin obuhvata imunoglobuline vezane za membranu, kao i solubilne imunoglobuline. Imunoglobulini vezani za membranu se takođe nazivaju površinski imunoglobulini ili membranski imunoglobulini, koji su generalno deo BCR. Solubilni imunoglobulini se generalno nazivaju antitelima. Imunoglobulini generalno sadrže nekoliko lanaca, tipično dva identična teška lanca i dva identična laka lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Ovi lanci su prvenstveno sačinjeni od domena imunoglobulina, kao što su VL(varijabilni laki lanac) domen, CL(konstantni laki lanac) domen, i CH(konstantni teški lanac) domeni CH1, CH2, CH3, i CH4. Postoji pet tipova teških lanaca imunoglobulina sisara, tj. α, δ, ε, γ, i μ koji doprinose različitim klasama antitela, tj. IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM. Za razliku od teških lanaca solubilnih imunoglobulina, teški lanci membranskih ili površinskih imunoglobulina sadrže transmembranski domen i kratki citoplazmatski domen na svom karboksi-terminusu. Kod sisara postoje dva tipa lakih lanaca,
2
tj. lambda i kapa. Lanci imunoglobulina sadrže varijabilni region i konstantni region. Konstantni region je suštinski konzerviran unutar različitih izotipova imunoglobulina, pri čemu je varijabilni deo veoma raznolik i doprinosi prepoznavanju antigena.
[0125] Termin "antitelo" označava glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Termin "antitelo" uključuje monoklonalna antitela, rekombinantna antitela, humana antitela, humanizovana antitela, i himerna antitela. Svaki teški lanac sastoji se od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Svaki laki lanac sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. VH i VL regioni se mogu dodatno podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regionima koji određuju komplementarnost (CDR), ispresecane regionima koji su više konzervirani, nazvanim regioni okvira (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FR, koji su aranžirani od amino-terminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.
[0126] Termin "monoklonalno antitelo" kao što se ovde upotrebljava označava preparat molekula antitela jednomolekulske kompozicije. Monoklonalno antitelo pokazuje jedinstvenu specifičnost i afinitet vezivanja. U jednom primeru izvođenja, monoklonalna antitela su proizvedena od strane hibridoma koji uključuje B ćeliju dobijenu od ne-humane životinje, npr. miša, fuzionisanu sa imortalizovanom ćelijom.
[0127] Termin "rekombinantno antitelo", kao što se ovde upotrebljava, uključuje sva antitela koja se pripremaju, eksprimiraju, stvaraju ili izoluju pomoću rekombinantnih načina, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomska u odnosu na gene imunoglobulina ili hibridoma koji je od njih pripremljen, (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane da eksprimira antitelo, npr. iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke antitela, i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje splajsovanje sekvenci gena imunoglobulina za druge sekvence DNK.
[0128] Termin "humano antitelo", kao što se ovde upotrebljava, je namenjen da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci humanog imunoglobulina germinativne linije. Humana antitela mogu uključivati amino-kiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama humanog imunoglobulina germinativne linije (npr.
mutacije introdukovane nasumičnom mutagenezom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo).
[0129] Termin "humanizovano antitelo" označava molekul koji ima antigen-vezujuće mesto koje je suštiniski izvedeno iz imunoglobulina ne-humane vrste, pri čemu je preostala imunoglobulinska struktura molekula zasnovana na strukturi i/ili sekvenci humanog imunoglobulina. Antigen-vezujuće mesto može sadržati bilo kompletne varijabilne domene fuzionisane za konstantne domene ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDR) koji su graftovani na odgovarajuće regione okvira u varijabilnim domenima. Antigenvezujuća mesta mogu biti divljeg tipa ili modifikovana pomoću jedne ili više aminokiselinskih supstitucija, npr. modifikovana da više liče na humane imunoglobuline. Neki oblici humanizovanih antitela imaju očuvane sve CDR sekvence (na primer humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDR iz antitela miša). Drugi oblici imaju jedan ili više CDR koji su izmenjeni u odnosu na prvobitno antitelo.
[0130] Termin "himerno antitelo" označava ona antitela kod kojih je jedan deo svake od amino-kiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima koja su poreklom od određene vrste ili pripadaju određenoj klasi, dok je preostali segment lanca homologan odgovarajućim sekvencama u drugom. Tipično varijabilni region i lakih i teških lanaca oponaša varijabilne regione antitela poreklom iz jedne vrste sisara, dok su konstantni delovi homologni sekvencama antitela poreklom iz druge. Jedna jasna prednost ovakvih himernih oblika je da se varijabilni region može pogodno izvesti iz trenutno poznatih izvora upotrebom lako dostupnih B-ćelija ili hibridoma iz ne-humanih organizama domaćina u kombinaciji sa konstantnim regionima poreklom od, na primer, preparata humanih ćelija. Dok varijabilni region ima prednost lakoće pripreme i na specifičnost ne utiče izvor, konstantni region koji je humani, manje je verovatno da će izazvati imunski odgovor kod čoveka kada se antitela injektiraju nego što bi to bio slučaj sa konstantnim regionom iz nehumanog izvora. Međutim, definicija nije ograničena na ovaj konkretan primer.
[0131] Antitela mogu biti poreklom iz različitih vrsta, uključujući ali bez ograničavanja na miša, pacova, zeca, zamorca i čoveka.
[0132] Ovde opisana antitela uključuju IgA kao što su IgA1 ili IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, i IgD antitela. U različitim primerima izvođenja, antitelo je IgG1 antitelo, konkretnije IgG1, kapa ili IgG1, lambda izotip (tj. IgG1, κ, λ), IgG2a antitelo (npr. IgG2a, κ, λ), IgG2b antitelo (npr. IgG2b, κ, λ), IgG3 antitelo (npr. IgG3, κ, λ) ili IgG4 antitelo (npr. IgG4, κ, λ).
1
[0133] Termini "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "vezujući deo") ili "antigenvezujući fragment" antitela (ili jednostavno "vezujući fragment") ili slični termini označavaju jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen. Pokazano je da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvršiti od strane fragmenata antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata koji su obuhvaćeni terminom "antigenvezujući deo" antitela uključuju (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji se sastoje od VL, VH, CL i CH domena; (ii) F(abꞌ)2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; (iii) Fd fragmente koji se sastoje od VH i CH domena; (iv) Fv fragmente koji se sastoje od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragmente (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), koji se sastoje od VH domena; (vi) izolovane regione koji određuju komplementarnost (CDR), i (vii) kombinacije dva ili više izolovanih CDR koji opciono mogu biti spojeni pomoću sintetičkog linkera. Štaviše, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani odvojenim genima, oni mogu biti spojeni, upotrebom rekombinantnih postupaka, pomoću sintetičkog linkera koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kome se VL i VH regioni sparuju da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr. Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Takođe je namenjeno da takva jednolančana antitela budu obuhvaćena terminom "antigen-vezujući fragment" antitela. Dodatni primer su vezujući domen imunoglobulin fuzioni proteini sa koji sadrže (i) polipeptid vezujućeg domena koji je fuzionisan za polipeptid regiona zgloba imunoglobulina, (ii) CH2 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan za region zgloba, i (iii) CH3 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan za CH2 konstantni region. Polipeptid vezujućeg domena može biti varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. Vezujući domen imunoglobulin fuzioni proteini dodatno su objavljeni u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela dobijaju se upotrebom konvencionalnih tehnika poznatih osobama sa iskustvom u struci, i fragmenti se pregledaju za korišćenje na isti način kao i intaktna antitela.
[0134] U skladu sa učenjem, termin "antigen-vezujući domen" uključuje i poželjno se odnosi na antigen-vezujući deo antitela za antigen, tj. antitelo koje je usmereno prema antigenu i poželjno je specifično za antigen.
[0135] Termin "vezujući domen" karakteriše u vezi sa predmetnim učenjem strukturu, npr. antitela, koja se vezuje za/interaguje sa datom ciljnom strukturom/antigenom/epitopom. Stoga, vezujući domen u skladu sa učenjem označava "mesto interakcije sa antigenom".
2
[0136] Antitela i derivati antitela su korisni za obezbeđivanje vezujućih domena kao što su fragmenti antitela, posebno za obezbeđivanje VL i VH regiona.
[0137] Vezujući domen za antigen koji može biti prisutan unutar CAR ima sposobnost vezivanja za antigen (na koji ciljno deluje), tj. sposobnost vezivanja za epitop (na koji ciljno deluje) koji je prisutan u antigenu, poželjno epitop koji je lociran unutar vanćelijskog domena antigena. Poželjno, vezujući domen za antigen je specifičan za antigen. Poželjno, vezujući domen za antigen se vezuje za antigen koji se eksprimira na površini ćelije. U posebno poželjnim primerima izvođenja, vezujući domen za antigen se vezuje za nativne epitope antigena koji je prisutan na površini živih ćelija.
[0138] Sva antitela i derivati antitela, kao što su fragmenti antitela, kao što je ovde opisano u svrhu učenja obuhvaćeni su terminom "antitelo".
[0139] Antitela se mogu proizvesti pomoću različitih tehnika, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonalnih antitela, npr. standardnu tehniku hibridizacije somatskih ćelija Kolera (Kohler) i Milštajna (Milstein), Nature 256: 495 (1975). Iako su procedure hibridizacije somatskih ćelija poželjne, u principu, mogu se koristiti druge tehnike za proizvodnju monoklonalnih antitela, npr. virusna ili onkogena transformacija B-limfocita ili tehnike displeja faga upotrebom biblioteka gena antitela.
[0140] Poželjni životinjski sistem za pripremu hibridoma koji sekretuju monoklonalna antitela je murinski sistem. Proizvodnja hibridoma kod miša je veoma dobro uspostavljena procedura. Protokoli i tehnike imunizacije za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u struci. Takođe su poznati fuzioni partneri (npr. murinske ćelije mijeloma) i procedure fuzije.
[0141] Drugi poželjni životinjski sistemi za pripremanje hibridoma koji sekretuju monoklonalna antitela su pacovski i zečji sistem (npr. opisano u Spieker-Polet et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), videti takođe Rossi et al. Am J. Clin. Pathol, 124: 295 (2005)).
[0142] Kako bi se generisala antitela, miševi mogu biti imunizovani sa nosač-konjugovanim peptidima koji su poreklom od sekvence antigena, tj. sekvence prema kojoj antitela treba da budu usmerena, obogaćenim preparatom rekombinantno eksprimiranog antigena ili njegovih fragmenata i/ili ćelijama koje eksprimiraju antigen, kao što je opisano. Alternativno, miševi mogu biti imunizovani sa DNK koja kodira antigen ili njegove fragmente. U slučaju da imunizacije upotrebom prečišćenog ili obogaćenog preparata antigena ne rezultuju antitelima, miševi takođe mogu biti imunizovani sa ćelijama koje eksprimiraju antigen, npr. ćelijskom linijom, kako bi se promovisali imunski odgovori.
[0143] Imunski odgovor se može pratiti tokom protokola imunizacije u uzorcima plazme i seruma koji se dobijaju uzimanjem krvi iz repne vene ili retroorbitalnog dela. Za fuzije se mogu upotrebljavati miševi sa dovoljnim titrima imunoglobulina. Miševi se mogu bustovati intraperitonealno ili intravenski sa ćelijama koje eksprimiraju antigen 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine kako bi se povećala stopa hibridoma koji sekretuju specifična antitela.
[0144] Kako bi se generisali hibridomi koji proizvode monoklonalna antitela, mogu se izolovati splenociti i ćelije limfnih čvorova iz imunizovanih miševa i fuzionisati sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mijeloma miša. Rezultujući hibridomi se zatim mogu pregledati za proizvodnju antigen-specifičnih antitela. Pojedinačni bunarići se zatim mogu pregledati pomoću ELISA na hibridome koji sekretuju antitela. Pomoću imunofluorescencije i FACS analize upotrebom ćelija koje eksprimiraju antigen, mogu se identifikovati antitela sa specifičnošću za antigen. Hibridomi koji sekretuju antitela mogu se zasejati na druge ploče, ponovo pregledati, i ukoliko su još pozitivni na monoklonalna antitela, mogu biti podklonirani pomoću ograničenog razblaženja. Stabilni podklonovi se zatim mogu kultivisati in vitro kako bi se generisalo antitelo u medijumu za kulturu tkiva za karakterizaciju.
[0145] Sposobnost antitela i drugih vezujućih agenasa da vezuju antigen može se odrediti upotrebom standardnih testova vezivanja (npr. ELISA, Western blot, imunofluorescencija i analiza protočnom citometrijom).
[0146] Termin "vezivanje" u skladu sa učenjem poželjno se odnosi na specifično vezivanje.
[0147] U skladu sa predmetnim učenjem, agens kao što je CAR je sposoban da se vezuje za (ciljno deluje na) unapred određeni cilj ukoliko ima značajan afinitet za navedeni unapred određeni cilj i vezuje se za navedeni unapred određeni cilj u standardnim testovima. "Afinitet" ili "afinitet vezivanja" se često meri pomoću ravnotežne konstante disocijacije (KD). Poželjno, termin "značajan afinitet" označava vezivanje za unapred određeni cilj sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-5>M ili nižom, 10<-6>M ili nižom, 10<-7>M ili nižom, 10<-8>M ili nižom, 10<-9>M ili nižom, 10<-10>M ili nižom, 10<-11>M ili nižom, ili 10<-12>M ili nižom.
[0148] Agens nije (suštinski) sposoban da se vezuje za (ciljno deluje na) cilj ukoliko nema značajan afinitet za navedeni cilj i ne vezuje se značajno, i posebno se ne vezuje detektabilno, za navedeni cilj u standardnim testovima. Poželjno, agens se ne vezuje detektabilno za navedeni cilj ukoliko je prisutan u koncentraciji do 2, poželjno 10, poželjnije 20, posebno 50 ili 100 μg/ml ili više. Poželjno, agens nema značajan afinitet za cilj ukoliko se vezuje za navedeni cilj sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 10<3>puta, 10<4>puta, 10<5>puta, ili 10<6>puta viša od KDza vezivanje za unapred određeni cilj za koji je agens sposoban da se vezuje.
4
Na primer, ukoliko je KDza vezivanje agensa za cilj za koji je agens sposoban da se vezuje 10<-7>M, KDza vezivanje za cilj za koji agens nema značajan afinitet bio bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M, ili 10<-1>M.
[0149] Agens je specifičan za unapred određeni cilj ukoliko je sposoban da se vezuje za navedeni unapred određeni cilj dok nije (suštinski) sposoban da se vezuje za druge ciljeve, tj. nema značajan afinitet za druge ciljeve i ne vezuje se značajno za druge ciljeve u standardnim testovima. Poželjno, agens je specifičan za unapred određeni cilj ukoliko afinitet za i vezivanje za takve druge ciljeve ne premašuje značajno afinitet za ili vezivanje za proteine koji nisu srodni sa unapred određenim ciljem kao što je albumin goveđeg seruma (BSA), kazein ili albumin humanog seruma (HSA). Poželjno, agens je specifičan za unapred određeni cilj ukoliko se vezuje za navedeni cilj sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 10<3>puta, 10<4>puta, 10<5>puta, ili 10<6>puta niža od KDza vezivanje za cilj za koji nije specifičan. Na primer, ukoliko je KDza vezivanje agensa za cilj za koji je specifičan 10<-7>M, KDza vezivanje za cilj za koji nije specifičan bio bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M, ili 10<-1>M.
[0150] Vezivanje agensa za cilj može se odrediti eksperimentalno upotrebom bilo kog pogodnog postupka; videti, na primer, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" u Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), i postupaka koji su ovde opisani. Afiniteti se mogu lako odrediti upotrebom konvencionalnih tehnika, kao što je ravnotežna dijaliza; upotrebom BIAcore 2000 instrumenta, upotrebom opštih procedura koje je naveo proizvođač; radioimunološkim testom upotrebom radioaktivno obeleženog ciljnog antigena; ili drugim postupkom koji je poznat stručnjaku sa iskustvom. Podaci o afinitetu mogu se analizirati, na primer, pomoću postupka iz Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Izmereni afinitet određene antitelo-antigen interakcije može da varira ukoliko se meri pod različitim uslovima, npr. koncentracija soli, pH. Stoga, merenja afiniteta i drugih parametara vezivanja antigena, npr. KD, IC50, poželjno se vrše sa standardizovanim rastvorima antitela i antigena, i standardizovanim puferom.
[0151] Poželjno, u skladu sa učenjem, nukleinska kiselina kao što je RNK koja kodira antigen ili njegovu varijantu introdukuje se u sisara. Nukleinska kiselina se preuzima u antigenprezentujuće ćelije (monocite, makrofage, dendritske ćelije ili druge ćelije) sisara. Formira se antigenski proizvod translacije nukleinske kiseline i proizvod se prikazuje na površini ćelija za prepoznavanje od strane CAR-projektovanih T ćelija usmerenih na antigen.
[0152] Alternativno, predmetno učenje predviđa primere izvođenja u kojima se nukleinska kiselina koja eksprimira ovde navedeni antigen introdukuje u antigen-prezentujuće ćelije ex vivo, npr. antigen-prezentujuće ćelije uzete iz pacijenta, i antigen-prezentujuće ćelije, opciono klonalno propagirane ex vivo, se transplantiraju nazad u istog pacijenta. Transfektovane ćelije se mogu reintrodukovati u pacijenta upotrebom bilo kog načina koji je poznat u struci, poželjno u sterilnom obliku intravenskom, intrakavitarnom, intraperitonealnom ili intratumorskom primenom.
[0153] Postupci iz učenja mogu uključivati antigen-prezentujuću ćeliju za ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira antigen ili njegovu varijantu. U tom cilju, postupci iz učenja mogu uključivati introdukovanje nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene u antigenprezentujuće ćelije, kao što su dendritske ćelije. Za transfekciju antigen-prezentujućih ćelija, kao što su dendritske ćelije, može se upotrebljavati farmaceutska kompozicija koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antigen. Pacijentu može biti primenjen vehikulum za isporuku koji cilja nukleinsku kiselinu na dendritsku ili drugu antigen-prezentujuću ćeliju, što rezultuje transfekcijom koja se dešava in vivo.
[0154] U skladu sa učenjem, poželjno je upotrebljavati formulacije nukleinske kiseline koja kodira antigen ili njegovu varijantu koje isporučuju nukleinsku kiselinu sa visokom selektivnošću do antigen-prezentujućih ćelija kao što su dendritske ćelije (DC) u slezini posle sistemske primene. Na primer, nanočestične RNK formulacije sa definisanom veličinom čestica pri čemu je neto naelektrisanje čestica blizu nule ili negativno, kao što su elektroneutralni ili negativno naelektrisani lipopleksi od RNK i lipozoma, npr. lipopleksi koji sadrže DOTMA i DOPE ili DOTMA i holesterol, dovode do značajne ekspresije RNK u DC slezine posle sistemske primene. Određena je jaka ekspresija u ciljnim ćelijama (slezina), dok je ekspresija u drugim organima bila niska.
[0155] Kao što se ovde upotrebljava, termin "nanočestica" označava bilo koju česticu koja ima prečnik koji čini česticu pogodnom za sistemsku, posebno parenteralnu, primenu, posebno, nukleinskih kiselina, tipično prečnika manjeg od 1000 nanometara (nm). U nekim primerima izvođenja, nanočestica ima prečnik manji od 600 nm. U nekim primerima izvođenja, nanočestica ima prečnik manji od 400 nm.
[0156] Kao što se ovde upotrebljava, termin "nanočestična formulacija" ili slični termini označavaju bilo koju supstancu koja sadrži najmanje jednu nanočesticu. U nekim primerima izvođenja, nanočestična kompozicija je uniformna kolekcija nanočestica. U nekim primerima izvođenja, nanočestične kompozicije su disperzije ili emulzije. Generalno, disperzija ili emulzija se formira kada se kombinuju najmanje dva nemešljiva materijala.
[0157] Termin "lipopleks" ili "lipopleks nukleinske kiseline", posebno "RNK lipopleks", označava kompleks lipida i nukleinskih kiselina, posebno RNK. Lipopleksi se formiraju spontano kada se katjonski lipozomi, koji često uključuju i neutralni "pomoćnički" lipid, pomešaju sa nukleinskim kiselinama.
[0158] Ukoliko predmetno učenje označava naelektrisanje kao što je pozitivno naelektrisanje, negativno naelektrisanje ili neutralno naelektrisanje ili katjonsko jedinjenje, negativno jedinjenje ili neutralno jedinjenje, to generalno znači da je pomenuto naelektrisanje prisutno pri odabranoj pH, kao što je fiziološka pH. Na primer, termin "katjonski lipid" znači lipid koji ima neto pozitivno naelektrisanje pri odabranoj pH, kao što je fiziološka pH. Termin "neutralni lipid" znači lipid koji nema neto pozitivno ili negativno naelektrisanje i može biti prisutan u obliku nenaelektrisanog ili neutralnog amfoternog jona pri odabranoj pH, kao što je fiziološka pH. Pod "fiziološkom pH" ovde se podrazumeva pH od oko 7,5.
[0159] Nanočestični nosači kao što su lipidni nosači koji su predviđeni za upotrebu u predmetnom učenju uključuju sve supstance ili vehikulume sa kojima nukleinska kiselina kao što je RNK može biti povezana, npr. formiranjem kompleksa sa nukleinskom kiselinom ili formiranjem vezikula u kojima je nukleinska kiselina zatvorena ili inkapsulirana. Ovo može rezultovati povećanom stabilnošću nukleinske kiseline u poređenju sa golom nukleinskom kiselinom. Posebno, može se povećati stabilnost nukleinske kiseline u krvi.
[0160] Katjonski lipidi, katjonski polimeri i druge supstance sa pozitivnim naelektrisanjem mogu da formiraju komplekse sa negativno naelektrisanim nukleinskim kiselinama. Ovi katjonski molekuli se mogu upotrebljavati za kompleksiranje nukleinskih kiselina, čime se formiraju npr. takozvani lipopleksi ili polipleksi, respektivno, i pokazano je da ovi kompleksi isporučuju nukleinske kiseline u ćelije.
[0161] Nanočestični preparati nukleinske kiseline za upotrebu u predmetnom učenju mogu se dobiti različitim protokolima i od različitih jedinjenja za kompleksiranje nukleinskih kiselina. Lipidi, polimeri, oligomeri, ili amfipili su tipični agensi za kompleksiranje. U jednom primeru izvođenja, jedinjenje za kompleksiranje sadrži najmanje jedan agens odabran iz grupe koju čine protamin, polietilenimin, poli-L-lizin, poli-L-arginin ili histon.
[0162] U skladu sa učenjem, protamin je koristan kao agens katjonski nosač. Termin "protamin" označava bilo koji od različitih jako baznih proteina relativno niske molekulske težine koji su bogati argininom i koji se nalaze povezani naročito sa DNK umesto somatskih histona u ćelijama sperme različitih životinja (kao što su ribe). Posebno, termin "protamin" označava proteine koji se nalaze u spermi ribe koji su jako bazni, solubilni u vodi, ne koagulišu se toplotom, i daju uglavnom arginin nakon hidrolize. U prečišćenom obliku, oni se upotrebljavaju u dugotrajnoj formulaciji insulina i za neutralizaciju antikoagulantnih efekata heparina.
[0163] U skladu sa učenjem, termin "protamin", kao što se ovde upotrebljava, podrazumeva da sadrži bilo koju amino-kiselinsku sekvencu protamina dobijenu iz ili poreklom od nativnih ili bioloških izvora uključujući njene fragmente i multimerne oblike navedene aminokiselinske sekvence ili njenog fragmenta. Štaviše, termin obuhvata (sintetisane) polipeptide koji su veštački i specifično dizajnirani za specifične svrhe i ne mogu se izolovati iz nativnih ili bioloških izvora.
[0164] Protamin koji se upotrebljava u skladu sa predmetnim učenjem može biti sulfatni protamin ili hidrohlorid protamin. U poželjnom primeru izvođenja, izvor protamina koji se upotrebljava za proizvodnju ovde opisanih nanočestica je protamin 5000 koji sadrži protamin pri više od 10 mg/ml (5000 heparin-neutrališućih jedinica po ml) u izotoničnom rastvoru soli.
[0165] Lipozomi su mikroskopske lipidne vezikule koje često imaju jedan ili više dvoslojeva lipida koji formira vezikulu, kao što je fosfolipid, i sposobni su da inkapsuliraju lek. Različiti tipovi lipozoma mogu se koristiti u kontekstu predmetnog učenja, uključujući, bez ograničenja na njih, multilamelarne vezikule (MLV), male unilamelarne vezikule (SUV), velike unilamelarne vezikule (LUV), sterički stabilizovane lipozome (SSL), multivezikularne vezikule (MV), i velike multivezikularne vezikule (LMV) kao i druge dvoslojne oblike koji su poznati u struci. Veličina i lamelarnost lipozoma zavisiće od načina pripreme i odabir tipa vezikula koje će se upotrebljavati zavisiće od poželjnog načina primene. Postoji nekoliko drugih oblika supramolekulske organizacije u kojima lipidi mogu biti prisutni u vodenom medijumu, uključujući lamelarne faze, heksagonalne i inverzno heksagonalne faze, kubične faze, micele, reverzne micele sastavljene od monoslojeva. Ove faze se takođe mogu dobiti u kombinaciji sa DNK ili RNK, i interakcija sa RNK i DNK može značajno uticati na fazno stanje. Opisane faze mogu biti prisutne u nanočestičnim formulacijama nukleinske kiseline iz predmetnog učenja.
[0166] Za formiranje lipopleksa nukleinske kiseline od nukleinske kiseline i lipozoma, može se upotrebljavati bilo koji pogodan postupak za formiranje lipozoma sve dok obezbeđuje predviđene lipoplekse nukleinske kiseline. Lipozomi se mogu formirati upotrebom standardnih postupaka kao što su postupak reverzne evaporacije (REV), postupak injektiranja etanola, postupak dehidratacije-rehidratacije (DRY), sonikacija ili drugi pogodni postupci.
[0167] Posle formiranja lipozoma, lipozomi se mogu klasifikovati po veličini kako bi se dobila populacija lipozoma koji imaju suštinski homogen opseg veličine.
[0168] Lipidi koji formiraju dvosloj tipično imaju dva ugljovodonična lanca, posebno acilna lanca, i glavenu grupu, bilo polarnu ili nepolarnu. Lipidi koji formiraju dvosloj sastoje se bilo od lipida koji se javljaju u prirodi ili lipida sintetičkog porekla, uključujući fosfolipide, kao što su fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, fosfatidinska kiselina, fosfatidilinozitol, i sfingomijelin, gde su dva ugljovodonična lanca tipično dužine između 14-22 atoma ugljenika, i imaju različite stepene nezasićenosti. Drugi pogodni lipidi za upotrebu u kompoziciji iz predmetnog učenja uključuju glikolipide i sterole kao što su holesterol i njegovi različiti analozi koji se takođe mogu upotrebljavati u lipozomima.
[0169] Katjonski lipidi tipično imaju lipofilnu funkcionalnu grupu, kao što je sterol, acil ili diacil lanac, i imaju ukupno neto pozitivno naelektrisanje. Glavena grupa lipida tipično nosi pozitivno naelektrisanje. Katjonski lipid poželjno ima pozitivno naelektrisanje od 1 do 10 valenci, poželjnije pozitivno naelektrisanje od 1 do 3 valence, i poželjnije pozitivno naelektrisanje od 1 valence. Primeri katjonskih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na 1,2-di-O-oktadeceniZ-3-trimetilamonijum propan (DOTMA); dimetildioktadecilamonijum (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamonijum-propan (DODAP); 1,2-diaciloksi-3-dimetilamonijum propane; 1,2-dialkiloksi-3-dimetilamonijum propane; dioktadecildimetil amonijum hlorid (DODAC), 1,2-dimiristoiloksipropil-1,3-dimetilhidroksietil amonijum (DMRIE), i 2,3-dioleoiloksi-N-[2(spermin karboksamid)etil]-N,N-dimetil-1-propanamijum trifluoroacetat (DOSPA). Poželjni su DOTMA, DOTAP, DODAC, i DOSPA. Najpoželjniji je DOTMA.
[0170] Pored toga, ovde opisane nanočestice poželjno dodatno uključuju neutralni lipid u pogledu strukturne stabilnosti i slično. Neutralni lipid može biti odgovarajuće odabran u pogledu efikasnosti isporuke kompleksa nukleinska kiselina-lipid. Primeri neutralnih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, 1,2-di-(9Z-oktadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DOPC), diacilfosfatidil holin, diacilfosfatidil etanol amin, ceramid, sfingoemijelin, cefalin, sterol, i cerebrozid. Poželjni su DOPE i/ili DOPC. Najpoželjniji je DOPE. U slučaju gde katjonski lipozom uključuje i katjonski lipid i neutralni lipid, molski odnos katjonskog lipida prema neutralnom lipidu može biti odgovarajuće određen u pogledu stabilnosti lipozoma i slično.
[0171] U skladu sa jednim primerom izvođenja, ovde opisane nanočestice mogu sadržati fosfolipide. Fosfolipidi mogu biti glicerofosfolipidi. Primeri glicerofosfolipida uključuju, bez ograničenja na njih, tri tipa lipida: (i) cviterjonske fosfolipide, koji uključuju, na primer, fosfatidilholin (PC), fosfatidilholin žumanca jajeta, PC poreklom od soje u prirodnom, delimično hidrogenizovanom ili potpuno hidrogenizovanom obliku, dimiristoil fosfatidilholin (DMPC), sfingomijelin (SM); (ii) negativno naelektrisane fosfolipide, koji uključuju, na primer, fosfatidilserin (PS), fosfatidilinozitol (PI), fosfatidinsku kiselinu (PA), fosfatidilglicerol (PG), dipalmipoil PG, dimirstoil fosfatidilglicerol (DMPG); sintetičke derivate u kojima konjugat čini cviterjonski fosfolipid negativno naelektrisanim, kao što je slučaj sa metoksi-polietilen glikol-distearoil fosfatidiletanolaminom (mPEG-DSPE); i (iii) katjonske fosfolipide, koji uključuju, na primer, fosfatidilholin ili sfingomijelin čiji je fosfomonoestar O-metilisan kako bi se formirali katjonski lipidi.
[0172] Povezivanje nukleinske kiseline sa lipidnim nosačem može se dogoditi, na primer, tako što nukleinska kiselina ispunjava intersticijalne prostore nosača, tako da nosač fizički zarobi nukleinsku kiselinu, ili kovalentnom, jonskom, ili vodoničnom vezom, ili putem adsorpcije nespecifičnim vezama. Bez obzira na način povezivanja, nukleinska kiselina mora zadržati svoja terapijska svojstva, tj. kodiranje antigena.
[0173] U određenim primerima izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu primenjuje se pre, istovremeno sa i/ili posle primene CAR-projektovanih T ćelija. Poželjno se nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu primenjuje nakon primene CAR-projektovanih T ćelija.
[0174] CAR-projektovane T ćelije i nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu mogu biti prisutne u zajedničkoj kompoziciji, tj. pomešane zajedno. Štaviše, primeri izvođenja su takođe predviđeni u skladu sa učenjem u kojima su CAR-projektovane T ćelije i nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu prisutne zajedno, ali ne u istoj kompoziciji. Navedeni primeri izvođenja se posebno odnose na komplete sa najmanje dva kontejnera, gde jedan kontejner sadrži kompoziciju koja sadrži CAR-projektovane T ćelije, a drugi kontejner sadrži kompoziciju koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antigen ili njegovu varijantu.
[0175] U skladu sa učenjem, nukleinska kiselina koja kodira antigen ili njegovu varijantu u jednom primeru izvođenja je RNK, poželjno iRNK. RNK se poželjno dobija in vitro transkripcijom.
[0176] Termin "nukleinska kiselina", kao što se ovde upotrebljava, namenjen je da uključuje DNK i RNK kao što su genomska DNK, cDNA, iRNK, rekombinantno proizvedeni i hemijski sintetisani molekuli. Nukleinska kiselina može biti jednolančana ili dvolančana. RNK uključuje in vitro transkribovanu RNK (IVT RNK) ili sintetičku RNK. U skladu sa učenjem, nukleinska kiselina je poželjno izolovana nukleinska kiselina.
[0177] Nukleinske kiseline mogu biti sadržane u vektoru. Termin "vektor" kao što se ovde upotrebljava uključuje bilo koje vektore koji su poznati osobi sa iskustvom uključujući plazmidne vektore, kozmidne vektore, fag vektore kao što je lambda fag, virusne vektore kao što su adenovirusni ili bakulovirusni vektori, ili vektore veštačkog hromozoma kao što su bakterijski veštački hromozomi (BAC), veštački hromozomi kvasca (YAC), ili veštački
4
hromozomi P1 (PAC). Navedeni vektori uključuju ekspresione kao i klonirajuće vektore. Ekspresioni vektori sadrže plazmide kao i virusne vektore i generalno sadrže željenu kodirajuću sekvencu i odgovarajuće DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćinu (npr. bakterija, kvasac, biljka, insekt, ili sisar) ili u in vitro ekspresionim sistemima. Klonirajući vektori se generalno upotrebljavaju za projektovanje i amplifikaciju određenog željenog DNK fragmenta i mogu im nedostajati funkcionalne sekvence potrebne za ekspresiju željenih DNK fragmenata.
[0178] U kontekstu predmetnog učenja, termin "RNK" se odnosi na molekul koji sadrži ribonukleotidne ostatke i poželjno se u potpunosti ili suštinski sastoji od ribonukleotidnih ostataka. "Ribonukleotid" se odnosi na nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2ꞌ-poziciji β-D-ribofuranozil grupe. Termin uključuje dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično prečišćena RNK, suštinski čistu RNK, sintetičku RNK, rekombinantno proizvedenu RNK, kao i modifikovanu RNK koja se razlikuje od RNK koja se javlja u prirodi adicijom, delecijom, supstitucijom i/ili izmenom jednog ili više nukleotida. Takve izmene mogu uključivati adiciju ne-nukleotidnog materijala, kao što je na kraj(eve) RNK ili interno, na primer na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u molekulima RNK takođe mogu da sadrže nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne javljaju u prirodi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ove izmenjene RNK se mogu označiti kao analozi ili analozi RNK koja se javlja u prirodi.
[0179] U skladu sa predmetnim učenjem, termin "RNK" uključuje i poželjno se odnosi na "iRNK" što znači "informaciona RNK" i odnosi se na "transkript" koji se može proizvesti upotrebom DNK kao templata i kodira peptid ili protein. iRNK tipično sadrži 5ꞌ netranslatirani region (5ꞌ-UTR), region koji kodira protein ili peptid i 3ꞌ netranslatirani region (3’-UTR). iRNK ima ograničeni poluživot u ćelijama i in vitro. Poželjno, iRNK se proizvodi in vitro transkripcijom upotrebom DNK templata. U jednom primeru izvođenja učenja, RNK se dobija in vitro transkripcijom ili hemijskom sintezom. Metodologija in vitro transkripcije je poznata osobi sa iskustvom. Na primer, postoji niz kompleta za in vitro transkripciju koji su komercijalno dostupni.
[0180] U jednom primeru izvođenja predmetnog učenja, RNK je samoreplicirajuća RNK, kao što je jednolančana samoreplicirajuća RNK. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK je jednolančana RNK pozitivnog sensa. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK je virusna RNK ili RNK poreklom od virusne RNK. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK je alfavirusna genomska RNK ili je poreklom od alfavirusne genomske RNK. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK je ekspresioni vektor virusnog gena. U jednom primeru izvođenja, virus je virus Semliki šume. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK sadrži jedan ili više transgena, najmanje jedan od navedenih transgena kodira agense koji su ovde opisani. U jednom primeru izvođenja, ukoliko je RNK virusna RNK ili je poreklom od virusne RNK, transgeni mogu delimično ili potpuno zameniti virusne sekvence kao što su virusne sekvence koje kodiraju strukturne proteine. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK je in vitro transkribovana RNK.
[0181] Kako bi se povećala ekspresija i/ili stabilnost RNK koja se upotrebljava u skladu sa predmetnim učenjem, ona se može modifikovati, poželjno bez izmene sekvence eksprimovanog peptida ili proteina.
[0182] Termin "modifikacija" u kontekstu RNK kao što se upotrebljava u skladu sa predmetnim učenjem uključuje bilo koju modifikaciju RNK koja nije prirodno prisutna u navedenoj RNK.
[0183] U jednom primeru izvođenja učenja, RNK koja se upotrebljava u skladu sa učenjem nema nekapovane 5'-trifosfate. Uklanjanje takvih nekapovanih 5'-trifosfata može se postići pomoću tretiranja RNK sa fosfatazom.
[0184] RNK u skladu sa učenjem može imati modifikovane ribonukleotide koji se javljaju u prirodi ili sintetičke ribonukleotide kako bi povećala svoju stabilnost i/ili smanjila citotoksičnost. Na primer, u jednom primeru izvođenja, u RNK koja se upotrebljava u skladu sa učenjem 5-metilcitidin je delimično ili potpuno, poželjno potpuno, supstituisan za citidin. Alternativno ili dopunski, u jednom primeru izvođenja, u RNK koja se upotrebljava u skladu sa učenjem pseudouridin je delimično ili potpuno, poželjno potpuno, supstituisan za uridin.
[0185] U jednom primeru izvođenja, termin "modifikacija" odnosi se na obezbeđivanje RNK sa 5'-kapom ili analogom 5'-kape. Termin "5'-kapa" označava strukturu kape koja se nalazi na 5'-kraju molekula iRNK i generalno se sastoji od nukleotida guanozina povezanog sa iRNK putem neobične 5' do 5' trifosfatne veze. U jednom primeru izvođenja, ovaj guanozin je metilisan na poziciji 7. Termin "konvencionalna 5'-kapa" označava 5'-kapu RNK koja se javlja u prirodi, poželjno 7-metilguanozinsku kapu (m7G). U kontekstu predmetnog učenja, termin "5'-kapa" uključuje analog 5'-kape koji podseća na strukturu kape RNK i modifikovana je da poseduje sposobnost da stabilizuje RNK ukoliko je za nju prikačena, poželjno in vivo i/ili u ćeliji.
[0186] Obezbeđivanje RNK sa 5'-kapom ili analogom 5'-kape može se postići in vitro transkripcijom DNK templata u prisustvu navedene 5'-kape ili analoga 5'-kape, pri čemu se navedena 5'-kapa kotranskripciono inkorporiše u generisani RNK lanac, ili RNK može da se generiše, na primer, in vitro transkripcijom, a 5'-kapa može biti prikačena za RNK posttranskripciono upotrebom enzima za kapovanje, na primer, enzima za kapovanje vakcinija virusa.
[0187] RNK može sadržati dodatne modifikacije. Na primer, dodatna modifikacija RNK koja se upotrebljava u predmetnom učenju može biti produživanje ili skraćivanje poli(A) repa koji se javlja u prirodi ili izmena 5'- ili 3'-netranslatiranih regiona (UTR) kao što je introdukovanje UTR koji nije srodan sa kodirajućim regionom navedene RNK, na primer, insercija jedne ili više, poželjno dve kopije 3'-UTR poreklom od gena globina, kao što su alfa2-globin, alfa1-globin, beta-globin, poželjno beta-globin, poželjnije humani beta-globin.
[0188] Prema tome, kako bi se povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK koja se upotrebljava u skladu sa predmetnim učenjem, ona može biti modifikovana tako da bude prisutna zajedno sa poli-A sekvencom, poželjno imajući dužinu od 10 do 500, poželjnije 30 do 300, još poželjnije 65 do 200 i naročito 100 do 150 adenozinskih ostataka. U naročito poželjnom primeru izvođenja poli-A sekvenca ima dužinu od približno 120 adenozinskih ostataka. Pored toga, inkorporisanje dva ili više 3ꞌ-netranslatiranih regiona (UTR) u 3ꞌ-netranslatirani region molekula RNK može rezultovati poboljšanjem efikasnosti translacije. U jednom posebnom primeru izvođenja, 3'-UTR je poreklom od gena humanog β-globina.
[0189] Termin "stabilnost" RNK se odnosi na "poluživot" RNK. "Poluživot" se odnosi na vremenski period koji je potreban da se eliminiše polovina aktivnosti, količine, ili broja molekula. U kontekstu predmetnog učenja, poluživot RNK je indikativan za stabilnost navedene RNK. Poluživot RNK može uticati na "trajanje ekspresije" RNK. Može se očekivati da će RNK koja ima dugi poluživot biti eksprimirana tokom dužeg vremenskog perioda.
[0190] U kontekstu predmetnog učenja, termin "transkripcija" odnosi se na proces, u kome se genetički kod u DNK sekvenci transkribuje u RNK. Nakon toga, RNK se može translatirati u protein. U skladu sa predmetnim učenjem, termin "transkripcija" sadrži "in vitro transkripciju", pri čemu se termin "in vitro transkripcija" odnosi na proces u kome se RNK, posebno iRNK, in vitro sintetiše u bezćelijskom sistemu, poželjno upotrebom odgovarajućih ćelijskih ekstrakata. Poželjno, klonirajući vektori se primenjuju za generisanje transkripata. Ovi klonirajući vektori su generalno označeni kao vektori transkripcije i u skladu sa predmetnim učenjem obuhvaćeni su terminom "vektor".
[0191] Termin "translacija" u skladu sa učenjem odnosi se na proces u ribozomima ćelije pomoću kog lanac informacione RNK usmerava asembliranje sekvence amino-kiselina kako bi se napravio peptid ili protein.
4
[0192] Nukleinske kiseline mogu, u skladu sa učenjem, biti prisutne same ili u kombinaciji sa drugim nukleinskim kiselinama, koje mogu biti homologne ili heterologne. U poželjnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalno povezana sa sekvencama za kontrolu ekspresije koje mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na navedenu nukleinsku kiselinu. Termin "homologne" znači da su nukleinske kiseline takođe funkcionalno povezane prirodno i termin "heterologne" znači da nukleinske kiseline nisu funkcionalno povezane prirodno.
[0193] Nukleinska kiselina i sekvenca za kontrolu ekspresije su "funkcionalno" povezane jedna sa drugom, ukoliko su kovalentno povezane jedna sa drugom na takav način da je ekspresija ili transkripcija navedene nukleinske kiseline pod kontrolom ili pod uticajem navedene sekvence za kontrolu ekspresije. Ukoliko nukleinska kiselina treba da se translatira u funkcionalni protein, onda, sa sekvencom za kontrolu ekspresije koja je funkcionalno povezana sa kodirajućom sekvencom, indukcija navedene sekvence za kontrolu ekspresije rezultuje transkripcijom navedene nukleinske kiseline, bez uzrokovanja pomeranja okvira u kodirajućoj sekvenci ili navedena kodirajuća sekvenca nije sposobna da se translatira u željeni protein ili peptid.
[0194] Termin "sekvenca za kontrolu ekspresije" ili "element za kontrolu ekspresije" sadrži u skladu sa učenjem promotore, vezujuća mesta ribozoma, pojačivače i druge elemente kontrole koji regulišu transkripciju gena ili translaciju iRNK. U posebnim primerima izvođenja učenja, sekvence za kontrolu ekspresije mogu da se regulišu. Tačna struktura sekvenci za kontrolu ekspresije može da varira u zavisnosti od vrste ili tipa ćelije, ali generalno sadrži 5'-netranskribovane i 5'- i 3'-netranslatirane sekvence koje su uključene u inicijaciju transkripcije i translacije, respektivno, kao što je TATA box, sekvenca kape, CAAT sekvenca, i slično. Specifičnije, 5'-netranskribovane sekvence za kontrolu ekspresije sadrže region promotora koji uključuje promotorsku sekvencu za kontrolu transkripcije funkcionalno povezane nukleinske kiseline. Sekvence za kontrolu ekspresije mogu takođe sadržati pojačivačke sekvence ili uzvodne aktivatorske sekvence.
[0195] Termin "ekspresija" se upotrebljava u skladu sa učenjem u svom najopštijem značenju i sadrži proizvodnju RNK i/ili peptida ili proteina, npr. pomoću transkripcije i/ili translacije. Što se tiče RNK, termin "ekspresija" ili "translacija" se posebno odnosi na proizvodnju peptida ili proteina. Takođe sadrži delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Štaviše, ekspresija može biti prolazna ili stabilna. U skladu sa učenjem, termin ekspresija uključuje i "aberantnu ekspresiju" ili "abnormalnu ekspresiju".
[0196] "Aberantna ekspresija" ili "abnormalna ekspresija" znači u skladu sa učenjem da je ekspresija izmenjena, poželjno povećana, u poređenju sa referencom, npr. stanjem kod subjekta koji nema bolest povezanu sa aberantnom ili abnormalnom ekspresijom određenog proteina, npr. tumorskog antigena. Povećanje ekspresije označava povećanje za najmanje 10%, posebno za najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%, ili više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se nalazi samo u bolesnom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu potisnuta.
[0197] Termin "specifično eksprimiran" znači da se protein suštinski eksprimira samo u specifičnom tkivu ili organu. Na primer, tumorski antigen specifično eksprimiran u mukozi želuca znači da se navedeni protein primarno eksprimira u mukozi želuca i da se ne eksprimira u drugim tkivima ili ne eksprimira u značajnoj meri u drugim tipovima tkiva ili organa. Stoga, protein koji se isključivo eksprimira u ćelijama mukoze želuca i u značajno manjoj meri u bilo kom drugom tkivu, kao što je testis, specifično se eksprimira u ćelijama mukoze želuca. U nekim primerima izvođenja, tumorski antigen takođe može biti specifično eksprimiran pod normalnim uslovima u više od jednog tipa tkiva ili organa, kao što su 2 ili 3 tipa tkiva ili organa, ali poželjno u ne više od 3 različita tipa tkiva ili organa. U ovom slučaju, tumorski antigen se tada specifično eksprimira u ovim organima. Na primer, ukoliko se tumorski antigen eksprimira pod normalnim uslovima, poželjno u približno jednakoj meri u plućima i želucu, navedeni tumorski antigen se specifično eksprimira u plućima i želucu.
[0198] U skladu sa učenjem, termin "kodiranje nukleinske kiseline" znači da nukleinska kiselina, ukoliko je prisutna u odgovarajućem okruženju, poželjno unutar ćelije, može biti eksprimirana da proizvede protein ili peptid koji kodira.
[0199] Nukleinske kiseline koje su ovde opisane mogu biti rekombinantni i/ili izolovani molekuli.
[0200] "Izolovani molekul" kao što se ovde upotrebljava, ima za cilj da označi molekul koji je suštinski bez drugih molekula kao što je drugi ćelijski materijal.
[0201] Termin "rekombinantno" u kontekstu predmetnog učenja znači "napravljen genetičkim projektovanjem". Poželjno, "rekombinantni objekt" kao što je rekombinantna ćelija u kontekstu predmetnog učenja ne javlja se u prirodi.
[0202] Termin "koji se javlja u prirodi" kao što se ovde upotrebljava označava činjenicu da se objekt može naći u prirodi. Na primer, peptid ili nukleinska kiselina koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) i može biti izolovana iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji, je ona koja se javlja u prirodi.
4
[0203] Termin "autologno" se upotrebljava da opiše bilo šta što je poreklom iz istog subjekta. Na primer, "autologni transplant" označava transplant tkiva ili organa poreklom iz istog subjekta. Takve procedure su korisne pošto prevazilaze imunološku barijeru koja inače rezultuje odbacivanjem.
[0204] Termin "alogeno" se upotrebljava da opiše bilo šta što je poreklom iz različitih pojedinaca iste vrste. Za dva ili više pojedinaca se kaže da su alogena jedan u odnosu na drugog kada geni na jednom ili više lokusa nisu identični.
[0205] Termin "singeno" se upotrebljava da opiše bilo šta što je poreklom iz pojedinaca ili tkiva koji imaju identične genotipove, tj. identičnih blizanaca ili životinja istog inbred soja, ili njihovih tkiva.
[0206] Termin "heterologno" se upotrebljava da opiše nešto što se sastoji od više različitih elemenata. Na primer, transfer kostne srži jednog pojedinca u drugog pojedinca predstavlja heterologni transplant. Heterologni gen je gen koji je poreklom iz izvora koji nije subjekt.
[0207] Termin "transfekcija" se odnosi na introdukovanje nukleinskih kiselina, posebno RNK, u ćeliju.
[0208] Za potrebe predmetnog učenja, termin "transfekcija" takođe uključuje introdukovanje nukleinske kiseline u ćeliju ili preuzimanje nukleinske kiseline od strane takve ćelije, pri čemu ćelija može biti prisutna kod subjekta, npr. pacijenta. Stoga, u skladu sa predmetnim učenjem, ćelija za transfekciju nukleinske kiseline koja je ovde opisana može biti prisutna in vitro ili in vivo, npr. ćelija može formirati deo organa, tkiva i/ili organizma pacijenta. U skladu sa učenjem, transfekcija može biti prolazna ili stabilna. Za neke primene transfekcije, dovoljno je da se transfektovani genetički materijal samo prolazno eksprimira. Pošto nukleinska kiselina introdukovana u procesu transfekcije uobičajeno nije integrisana u nukleusni genom, strana nukleinska kiselina će biti razblažena mitozom ili degradirana. Ćelije koje omogućavaju epizomalnu amplifikaciju nukleinskih kiselina u velikoj meri smanjuju stopu razblaženja. Ukoliko se želi da transfektovana nukleinska kiselina zaista ostane u genomu ćelije i njenih ćerki ćelija, mora doći do stabilne transfekcije. RNK se može transfektovati u ćelije kako bi prolazno eksprimirala svoj kodirani protein.
[0209] U skladu sa predmetnim učenjem, može se upotrebljavati bilo koja tehnika korisna za introdukovanje, tj. transferovanje ili transfektovanje, nukleinskih kiselina u ćelije. Poželjno, RNK se transfektuje u ćelije pomoću standardnih tehnika. Takve tehnike uključuju elektroporaciju, lipofekciju i mikroinjekciju. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja predmetnog učenja, RNK se introdukuje u ćelije pomoću elektroporacije. Elektroporacija ili elektropermeabilizacija se odnosi na značajno povećanje električne provodljivosti i
4
permeabilnosti ćelijske membrane uzrokovano električnim poljem primenjenim spolja. Uobičajeno se upotrebljava u molekularnoj biologiji kao način introdukovanja neke supstance u ćeliju. U skladu sa učenjem, poželjno je da introdukovanje nukleinske kiseline koja kodira protein ili peptid u ćelije rezultuje ekspresijom navedenog proteina ili peptida.
[0210] Termin "peptid" u skladu sa učenjem sadrži oligo- i polipeptide i označava supstance koje sadrže dve ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 9 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 21 ili više i do poželjno 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, posebno 100 amino-kiselina povezanih kovalentno peptidnim vezama. Termin "protein" označava velike peptide, poželjno peptide sa više od 100 amino-kiselinskih ostataka, ali generalno, termini "peptidi" i "proteini" su sinonimi i ovde se upotrebljavaju naizmenično.
[0211] Učenje koje je ovde dato u vezi sa specifičnim amino-kiselinskim sekvencama, npr. onim koje su pokazane u listi sekvenci, treba tumačiti tako da se takođe odnosi na varijante navedenih specifičnih sekvenci koje rezultuju sekvencama koje su funkcionalno ekvivalentne navedenim specifičnim sekvencama, npr. amino-kiselinske sekvence koje pokazuju svojstva identična ili slična onima specifičnih amino-kiselinskih sekvenci. Jedno važno svojstvo je zadržavanje vezivanja peptida za njegov cilj.
[0212] Oni sa iskustvom u struci će ceniti da se posebno sekvence CDR sekvenci, hipervarijabilnih i varijabilnih regiona mogu modifikovati bez gubitka sposobnosti vezivanja za cilj. Na primer, CDR regioni će biti bilo identični ili visoko homologni regionima roditeljskih antitela. Pod "visoko homolognim" se smatra da od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što su 1 do 3 ili 1 ili 2 supstitucije mogu biti napravljene u CDR.
[0213] U svrhe predmetnog učenja, "varijante" amino-kiselinske sekvence sadrže varijante sa insertovanjem amino-kiselina, varijante sa adicijom amino-kiselina, varijante sa delecijom amino-kiselina i/ili varijante sa supstitucijom amino-kiselina. Varijante sa delecijom aminokiselina koje sadrže deleciju na N-terminusnom i/ili C-terminusnom kraju proteina takođe se nazivaju varijante sa skraćenim N-terminusom i/ili C-terminusom.
[0214] Varijante sa insertovanjem amino-kiselina sadrže insertovanu jednu ili dve ili više amino-kiselina u određenu amino-kiselinsku sekvencu. U slučaju da varijante aminokiselinske sekvence imaju inserciju, jedan ili više amino-kiselinskih ostataka se insertuje na određeno mesto u amino-kiselinskoj sekvenci, mada je moguća i nasumična insercija sa odgovarajućim pregledom rezultujućeg proizvoda.
[0215] Varijante sa adicijom amino-kiselina sadrže amino- i/ili karboksi-terminusne fuzije jedne ili više amino-kiselina, kao što su 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više amino-kiselina.
4
[0216] Varijante sa delecijom amino-kiselina karakterišu se uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, kao što je uklanjanje 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više amino-kiselina. Delecije mogu biti na bilo kojoj poziciji proteina.
[0217] Varijante sa supstitucijom amino-kiselina karakterišu se uklanjanjem najmanje jednog ostatka u sekvenci i insertovanjem drugog ostatka na njegovo mesto. Prednost se daje modifikacijama koje su na pozicijama u amino-kiselinskoj sekvenci koje nisu konzervirane između homolognih proteina ili peptida i/ili zameni amino-kiselina drugim amino-kiselinama koje imaju slična svojstva. Poželjno, amino-kiselinske promene u varijantama proteina su konzervativne amino-kiselinske promene, tj. supstitucije slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih amino-kiselina. Konzervativna amino-kiselinska promena uključuje supstituciju jedne iz porodice amino-kiselina koje su srodne po svojim bočnim lancima.
[0218] Amino-kiseline koje se javljaju u prirodi se generalno dele u četiri porodice: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), i nenaelektrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin) amino-kiseline. Fenilalanin, triptofan, i tirozin se ponekad zajedno klasifikuju kao aromatične amino-kiseline.
[0219] Poželjno će stepen sličnosti, poželjno identičnosti između date amino-kiselinske sekvence i amino-kiselinske sekvence koja je varijanta navedene date amino-kiselinske sekvence biti najmanje oko 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99%. Stepen sličnosti ili identičnosti dat je poželjno za amino-kiselinski region koji je najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili oko 100% cele dužine referentne amino-kiselinske sekvence. Na primer, ukoliko se referentna amino-kiselinska sekvenca sastoji od 200 amino-kiselina, stepen sličnosti ili identičnosti daje se poželjno za najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, ili oko 200 amino-kiselina, poželjno kontinuiranih amino-kiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnosti daje se za celu dužinu referentne amino-kiselinske sekvence. Poravnanje za određivanje sličnosti sekvence, poželjno identičnosti sekvence može se obaviti pomoću alata koji su poznati u struci, poželjno upotrebom najboljeg poravnanja sekvence, na primer, upotrebom Align, upotrebom standardnih podešavanja, poželjno EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10,0, Gap Extend 0,5.
4
[0220] "Sličnost sekvence" označava procenat amino-kiselina koje su bilo identične ili koje predstavljaju konzervativne amino-kiselinske supstitucije. "Identičnost sekvence" između dve amino-kiselinske sekvence označava procenat amino-kiselina koje su identične između sekvenci.
[0221] Termin "procenat identičnosti" ima za cilj da označi procenat amino-kiselinskih ostataka koji su identični između dve sekvence koje treba da se porede, dobijen posle najboljeg poravnanja, pri čemu je ovaj procenat čisto statistički i razlike između dve sekvence su raspoređene nasumično i preko cele njihove dužine. Poređenja sekvenci između dve amino-kiselinske sekvence konvencionalno se izvode upoređivanjem ovih sekvenci pošto su optimalno poravnate, pri čemu se navedeno poređenje izvodi po segmentima ili pomoću "prozora poređenja" kako bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sličnosti sekvenci. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može se proizvesti, osim ručno, pomoću algoritma lokalne homologije iz Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, pomoću algoritma lokalne homologije iz Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, pomoću postupka pretrage sličnosti iz Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji upotrebljavaju ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics softverskom paketu, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
[0222] Procenat identičnosti se izračunava određivanjem broja identičnih pozicija između dve sekvence koje se porede, deljenjem ovog broja brojem upoređenih pozicija i množenjem dobijenog rezultata sa 100 kako bi se dobio procenat identičnosti između ove dve sekvence.
[0223] Homologne amino-kiselinske sekvence pokazuju u skladu sa učenjem najmanje 40%, posebno najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% i poželjno najmanje 95%, najmanje 98 ili najmanje 99% identičnosti amino-kiselinskih ostataka.
[0224] U skladu sa učenjem, varijanta, fragment, deo ili porcija amino-kiselinske sekvence, peptida ili proteina poželjno ima funkcionalno svojstvo amino-kiselinske sekvence, peptida ili proteina, respektivno, od kojih je poreklom, tj. njihov je funkcionalni ekvivalent. U jednom primeru izvođenja, varijanta, fragment, deo ili porcija amino-kiselinske sekvence, peptida ili proteina je imunološki ekvivalent amino-kiselinskoj sekvenci, peptidu ili proteinu, respektivno, od kojih je poreklom. U jednom primeru izvođenja, funkcionalno svojstvo je imunološko svojstvo.
[0225] Termin "poreklom" znači u skladu sa učenjem da je određeni entitet, posebno određena sekvenca, prisutan u objektu iz kog je poreklom, posebno u organizmu ili molekulu.
4
U slučaju amino-kiselinskih sekvenci, naročito određenih regiona sekvence, "poreklom" posebno znači da je relevantna amino-kiselinska sekvenca poreklom iz amino-kiselinske sekvence u kojoj je prisutna.
[0226] Termin "ćelija" ili "ćelija domaćin" poželjno se odnosi na intaktnu ćeliju, tj. ćeliju sa intaktnom membranom koja nije oslobodila svoje normalne unutarćelijske komponente kao što su enzimi, organele, ili genetički materijal. Intaktna ćelija je poželjno vijabilna ćelija, tj. živa ćelija sposobna da obavlja svoje normalne metaboličke funkcije. Poželjno navedeni termin se odnosi u skladu sa učenjem na bilo koju ćeliju koja može biti transfektovana sa egzogenom nukleinskom kiselinom. Poželjno, ćelija kada je transfektovana sa egzogenom nukleinskom kiselinom i transferisana u primaoca može da eksprimira nukleinsku kiselinu u primaocu. Termin "ćelija" uključuje bakterijske ćelije; druge korisne ćelije su ćelije kvasaca, ćelije gljivica ili ćelije sisara. Pogodne bakterijske ćelije uključuju ćelije iz gram-negativnih bakterijskih sojeva kao što su sojevi Escherichia coli, Proteus, i Pseudomonas, i grampozitivnih bakterijskih sojeva kao što su sojevi Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus, i Lactococcus. Pogodne ćelije gljivica uključuju ćelije iz vrsta Trichoderma, Neurospora, i Aspergillus. Pogodne ćelije kvasaca uključuju ćelije iz vrsta Saccharomyces (na primer Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (na primer Schizosaccharomyces pombe), Pichia (na primer Pichia pastoris i Pichia metanolicd), i Hansenula. Pogodne ćelije sisara uključuju na primer CHO ćelije, BHK ćelije, HeLa ćelije, COS ćelije, 293 HEK i slično. Međutim, takođe se mogu upotrebljavati ćelije vodozemaca, ćelije insekata, ćelije biljaka, i bilo koje druge ćelije koje se upotrebljavaju u struci za ekspresiju heterolognih proteina. Ćelije sisara su posebno poželjne za adoptivni transfer, kao što su ćelije ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza, i primata. Ćelije mogu biti poreklom iz velikog broja tipova tkiva i uključuju primarne ćelije i ćelijske linije kao što su ćelije imunskog sistema, posebno antigenprezentujuće ćelije kao što su dendritske ćelije i T ćelije, matične ćelije kao što su hematopoetske matične ćelije i mezenhimske matične ćelije i druge tipove ćelija. Antigenprezentujuća ćelija je ćelija koja prikazuje antigen u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti na svojoj površini. T ćelije mogu prepoznati ovaj kompleks upotrebom svog T ćelijskog receptora (TCR).
[0227] Ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline poželjno eksprimira peptid ili protein koji je kodiran nukleinskom kiselinom.
[0228] Termin "prajmovanje" se odnosi na proces pri čemu T ćelija ima svoj prvi kontakt sa svojim specifičnim antigenom i uzrokuje diferencijaciju u efektorske T ćelije.
[0229] Termin "klonsko umnožavanje" ili "umnožavanje" označava proces pri čemu se multiplicira specifični entitet. U kontekstu predmetnog učenja, termin se poželjno upotrebljava u kontekstu imunološkog odgovora u kome se limfociti stimulišu antigenom, proliferišu, i specifični limfocit koji prepoznaje navedeni antigen se amplifikuje. Poželjno, klonsko umnožavanje dovodi do diferencijacije limfocita.
[0230] "Redukovati" ili "inhibirati" kao što se ovde upotrebljava znači sposobnost da uzrokuje sveukupno smanjenje nivoa, poželjno od 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije od 50% ili više, i najpoželjnije od 75% ili više. Termin "inhibirati" ili slične fraze uključuje potpunu ili suštinski potpunu inhibiciju, tj. redukciju na nulu ili suštinski na nulu.
[0231] Termini kao što su "povećati" ili "pojačati" poželjno se odnose na povećanje ili pojačanje za oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 100%.
[0232] Agensi, kompozicije i postupci koji su ovde opisani mogu se upotrebljavati za lečenje subjekta sa bolešću, npr. bolešću koju karakteriše prisustvo bolesnih ćelija koje eksprimiraju antigen. Posebno poželjne bolesti su bolesti kancera.
[0233] Agensi, kompozicije i postupci koji su ovde opisani mogu se takođe upotrebljavati za imunizaciju ili vakcinaciju kako bi se prevenirala bolest koja je ovde opisana.
[0234] Termin "bolest" označava abnormalno stanje koje utiče na telo pojedinca. Bolest se često tumači kao medicinsko stanje povezano sa specifičnim simptomima i znacima. Bolest može biti uzrokovana faktorima koji su prvobitno iz spoljašnjeg izvora, kao što je infektivna bolest, ili može biti uzrokovana unutrašnjim disfunkcijama, kao što su autoimunske bolesti. Kod ljudi, "bolest" se često upotrebljava u širem smislu da označi bilo koje stanje koje uzrokuje bol, disfunkciju, uznemirenost, socijalne probleme, ili smrt pojedinca koji je pogođen, ili slične probleme za one u kontaktu sa pojedincem. U ovom širem smislu, ponekad uključuje povrede, invaliditet, poremećaje, sindrome, infekcije, izolovane simptome, devijantna ponašanja, i atipične varijacije strukture i funkcije, dok se u drugim kontekstima i u druge svrhe ovo može smatrati pojedinačnim kategorijama. Bolesti uobičajeno pogađaju pojedince ne samo fizički, već i emocionalno, pošto dobijanje i život sa mnogim bolestima može izmeniti nečiju perspektivu na život, i nečiju ličnost. U skladu sa učenjem, termin "bolest" uključuje infektivne bolesti i bolesti kancera, posebno one oblike kancera koji su ovde opisani. Svako pozivanje ovde na kancer ili određene oblike kancera takođe uključuje metastaze tog kancera.
1
[0235] Bolest koju treba lečiti u skladu sa učenjem je poželjno bolest koja uključuje antigen. "Bolest koja uključuje antigen", "bolest povezana sa ekspresijom ili povišenom ekspresijom antigena" ili slični izrazi znače u skladu sa učenjem da se antigen eksprimira u ćelijama bolesnog tkiva ili organa. Ekspresija u ćelijama bolesnog tkiva ili organa može biti povećana u poređenju sa stanjem u zdravom tkivu ili organu. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se nalazi samo u bolesnom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu potisnuta. U skladu sa učenjem, bolesti koje uključuju antigen uključuju infektivne bolesti i bolesti kancera, pri čemu je antigen povezan sa bolešću poželjno antigen infektivnog agensa i tumorski antigen, respektivno. Poželjno, bolest koja uključuje antigen poželjno je bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju antigen, poželjno na površini ćelije.
[0236] Termin "zdravo" ili "normalno" označava nepatološka stanja, i poželjno znači neinficirano ili nekancerozno.
[0237] Termini "bolest kancera" ili "kancer" označavaju ili opisuju fiziološko stanje kod pojedinca koje se tipično karakteriše neregulisanim rastom ćelija. Primeri kancera uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom, i leukemiju. Konkretnije, primeri takvih kancera uključuju kancer kostiju, kancer krvi, kancer pluća, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kožni ili intraokularni melanom, kancer materice, kancer jajnika, rektalni kancer, kancer analnog regiona, kancer želuca, kancer kolona, kancer dojke, kancer prostate, kancer materice, karcinom polnih i reproduktivnih organa, Hočkinovu (Hodgkinꞌs) bolest, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer štitne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), neuroektodermalni kancer, tumore kičmene ose, gliom, meningiom, i adenom hipofize. Termin "kancer" u skladu sa učenjem takođe sadrži metastaze kancera. Poželjno, "bolest kancera" je okarakterisana ćelijama koje eksprimiraju tumorski antigen, i ćelija kancera eksprimira tumorski antigen.
[0238] U jednom primeru izvođenja, bolest kancera je maligna bolest koju karakterišu svojstva anaplazije, invazivnosti, i metastaza. Maligni tumor može se razlikovati od nekanceskog benignog tumora po tome što malignitet nije samoograničen u svom rastu, sposoban je da prodre u susedna tkiva, i može biti sposoban da se širi na udaljena tkiva (metastazira), dok benigni tumor nema nijedno od tih svojstava.
[0239] U skladu sa učenjem, termin "tumor" ili "tumorska bolest" označava otok ili leziju formiranu abnormalnim rastom ćelija (zvane neoplastične ćelije ili tumorske ćelije). Pod
2
"tumorskom ćelijom" podrazumeva se abnormalna ćelija koja raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste pošto prestanu stimulusi koji su inicirali novi rast. Tumori pokazuju delimični ili potpuni nedostatak strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom, i uobičajeno formiraju posebnu masu tkiva, koja može biti bilo benigna, premaligna ili maligna.
[0240] U skladu sa učenjem, "karcinom" je maligni tumor poreklom od epitelskih ćelija. Ova grupa predstavlja najčešće kancere, uključujući uobičajene oblike kancera dojke, prostate, pluća i kolona.
[0241] "Adenokarcinom" je kancer koji nastaje u žlezdanom tkivu. Ovo tkivo je takođe deo veće kategorije tkiva poznate kao epitelno tkivo. Epitelno tkivo uključuje kožu, žlezde i razna druga tkiva koja oblažu šupljine i organe u telu. Epitel tokom embrionalnog razvića nastaje od ektoderma, endoderma i mezoderma. Kako bi se klasifikovale kao adenokarcinom, ćelije ne moraju nužno da budu deo žlezde, sve dok imaju sekretorna svojstva. Ovaj oblik karcinoma može se javiti kod nekih viših sisara, uključujući ljude. Dobro diferencirani adenokarcinomi imaju tendenciju da liče na žlezdano tkivo od kog su nastali, dok slabo diferencirani ne moraju. Bojenjem ćelija uzetih biopsijom, patolog će odrediti da li je tumor adenokarcinom ili neki drugi tip kancera. Adenokarcinomi mogu nastati u mnogim tkivima tela zbog sveprisutne prirode žlezda u telu. Iako svaka žlezda možda ne sekretuje istu supstancu, sve dok postoji egzokrina funkcija ćelije, ona se smatra žlezdanom i njen maligni oblik se prema tome naziva adenokarcinom. Maligni adenokarcinomi prodiru u druga tkiva i često metastaziraju ukoliko im se da dovoljno vremena za to. Adenokarcinom jajnika je najčešći tip karcinoma jajnika. Uključuje serozni i mucinozni adenokarcinom, adenokarcinom svetlih ćelija i endometrioidni adenokarcinom.
[0242] Limfom i leukemija su maligniteti koji nastaju od hematopoetskih (krvotvornih) ćelija.
[0243] Blastni tumor ili blastom je tumor (uobičajeno maligni) koji podseća na nezrelo ili embrionalno tkivo. Mnogi od ovih tumora su najčešći kod dece.
[0244] Pod "metastazom" se podrazumeva širenje kancerskih ćelija sa prvobitnog mesta u drugi deo tela. Formiranje metastaza je veoma složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije vanćelijskog matriksa, penetracije bazalnih membrana endotela kako bi ušle u telesnu šupljinu i sudove, i zatim, posle transportovanja krvlju, infiltracije ciljnih organa. Krajnje, rast novog tumora na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Metastaza tumora se često javlja čak i posle uklanjanja primarnog tumora pošto tumorske ćelije ili komponente mogu preostati i razviti metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" u skladu sa učenjem odnosi se na "udaljenu metastazu" koja se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i sistema regionalnih limfnih čvorova. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" u skladu sa učenjem odnosi se na metastazu u limfnim čvorovima.
[0245] Relaps ili recidiv se javlja kada je osoba ponovo pogođena stanjem koje ju je pogađalo u prošlosti. Na primer, ukoliko je pacijent patio od tumorske bolesti, dobio je uspešno lečenje navedene bolesti i ponovo razvije navedenu bolest, navedena novorazvijena bolest može se smatrati relapsom ili recidivom. Međutim, u skladu sa učenjem, relaps ili recidiv tumorske bolesti može, ali ne mora nužno da se javi na mestu prvobitne tumorske bolesti. Stoga, na primer, ukoliko je pacijent patio od tumora jajnika i dobio je uspešno lečenje, relaps ili recidiv može biti pojava tumora jajnika ili pojava tumora na mestu koje je različito od jajnika. Relaps ili recidiv tumora takođe uključuje situacije u kojima se tumor javlja na mestu različitom od mesta prvobitnog tumora, kao i na mestu prvobitnog tumora. Poželjno, prvobitni tumor za koji je pacijent dobio lečenje je primarni tumor, a tumor na mestu različitom od mesta prvobitnog tumora je sekundarni ili metastatski tumor.
[0246] Termin "lečenje" ili "terapijsko lečenje" odnosi se na bilo koje lečenje koje poboljšava zdravstveni status i/ili produžava (povećava) životni vek pojedinca. Navedeno lečenje može eliminisati bolest kod pojedinca, zaustaviti ili usporiti razvoj bolesti kod pojedinca, inhibirati ili usporiti razvoj bolesti kod pojedinca, smanjiti učestalost ili ozbiljnost simptoma kod pojedinca, i/ili smanjiti recidiv kod pojedinca koji trenutno ima ili je ranije imao bolest.
[0247] Termini "profilaktičko lečenje" ili "preventivno lečenje" odnose se na bilo koje lečenje koje je namenjeno da prevenira pojavu bolesti kod pojedinca. Termini "profilaktičko lečenje" ili "preventivno lečenje" ovde se upotrebljavaju naizmenično.
[0248] Termini "pojedinac" i "subjekt" se ovde upotrebljavaju naizmenično. Oni označavaju ljudska bića, ne-humane primate ili druge sisare (npr. miš, pacov, zec, pas, mačka, govedo, svinja, ovca, konj ili primat) koji mogu biti pogođeni ili su podložni bolesti ili poremećaju (npr. kancer), ali mogu ili ne moraju imati bolest ili poremećaj. U mnogim primerima izvođenja, pojedinac je ljudsko biće. Osim ukoliko nije drugačije navedeno, termini "pojedinac" i "subjekt" ne označavaju određeni uzrast, pa stoga obuhvataju odrasle, starije, decu, i novorođenčad. U poželjnim primerima izvođenja predmetnog učenja, "pojedinac" ili "subjekt" je "pacijent". Termin "pacijent" znači u skladu sa učenjem subjekt za lečenje, posebno bolestan subjekt.
[0249] Pod "biti u riziku" se podrazumeva subjekt, tj. pacijent, za kog je identifikovano da ima veće šanse od normalnog da razvije bolest, posebno kancer, u poređenju sa opštom populacijom. Pored toga, subjekt koji je imao ili koji trenutno ima bolest, posebno kancer, je
4
subjekt koji ima povećan rizik za razvoj bolesti, pošto takav subjekt može nastaviti da razvija bolest. Subjekti koji trenutno imaju ili koji su imali kancer takođe imaju povećan rizik od metastaza kancera.
[0250] Termin "imunoterapija" se odnosi na lečenje koje uključuje specifičnu imunsku reakciju.
[0251] U kontekstu predmetnog učenja, termini kao što su "zaštititi", "prevenirati", "profilaktičko", "preventivno" ili "zaštitno" odnose se na prevenciju ili lečenje, ili oba, pojave i/ili propagacije bolesti kod subjekta i, posebno, na minimalizovanje šanse da će subjekt razviti bolest ili na odlaganje razvoja bolesti. Na primer, osoba u riziku od tumora, kao što je prethodno opisano, bila bi kandidat za terapiju za preveniranje tumora.
[0252] Profilaktička primena imunoterapije, na primer, profilaktička primena agensa ili kompozicije iz učenja, poželjno štiti primaoca od razvoja bolesti. Terapijska primena imunoterapije, na primer, terapijska primena agensa ili kompozicije iz učenja, može dovesti do inhibicije napredovanja/rasta bolesti. Ovo sadrži usporavanje napredovanja/rasta bolesti, posebno narušavanje progresije bolesti, što poželjno dovodi do eliminacije bolesti.
[0253] Imunoterapija se može izvesti upotrebom bilo koje od različitih tehnika, u kojima agensi koji su ovde obezbeđeni poželjno funkcionišu da uklone ćelije koje eksprimiraju antigen iz pacijenta. Takvo uklanjanje može se desiti kao rezultat pojačavanja ili indukovanja imunskog odgovora kod pacijenta specifičnog za antigen ili ćeliju koja eksprimira antigen.
[0254] Aktivna imunoterapija je oblik imunoterapije, u kojoj se lečenje oslanja na in vivo stimulaciju endogenog imunskog sistema domaćina da reaguje prema bolesnim ćelijama sa primenom agenasa za modifikaciju imunskog odgovora (kao što su nukleinske kiseline koje kodiraju antigen).
[0255] Pasivna imunoterapija je oblik imunoterapije, u kojoj lečenje uključuje isporuku agenasa sa uspostavljenom tumorsko-imunskom reaktivnošću (kao što su efektorske ćelije) koji mogu direktno ili indirektno posredovati u antitumorskim efektima i ne zavisi nužno od intaktnog imunskog sistema domaćina. Primeri efektorskih ćelija uključuju T limfocite (kao što su CD8<+>citotoksični T limfociti i CD4<+>T-pomoćnički limfociti), i antigen-prezentujuće ćelije (kao što su dendritske ćelije i makrofagi). Veštački T ćelijski receptori koji su specifični za antigen mogu se transferisati u efektorske ćelije za adoptivnu imunoterapiju.
[0256] Termin "imunizacija" ili "vakcinacija" opisuje proces lečenja subjekta u cilju indukovanja imunskog odgovora iz terapijskih ili profilaktičkih razloga.
[0257] Termin "in vivo" se odnosi na situaciju u subjektu.
[0258] Jedinjenja i agensi koji su ovde opisani mogu se primenjivati u obliku bilo koje pogodne farmaceutske kompozicije.
[0259] Farmaceutske kompozicije iz učenja poželjno su sterilne i sadrže efikasnu količinu agenasa koji su ovde opisani i opciono dodatnih agenasa kao što je ovde razmatrano kako bi se generisala željena reakcija ili željeni efekat.
[0260] Farmaceutske kompozicije se uobičajeno obezbeđuju u uniformnom doznom obliku i mogu se pripremiti na način koji je poznat per se. Farmaceutska kompozicija može npr. biti u obliku rastvora ili suspenzije.
[0261] Farmaceutska kompozicija može sadržati soli, puferske supstance, konzervanse, nosače, razblaživače i/ili ekscipijense od kojih su svi poželjno farmaceutski prihvatljivi. Termin "farmaceutski prihvatljiv" označava netoksičnost materijala koji ne interaguje sa dejstvom aktivne komponente farmaceutske kompozicije.
[0262] Soli koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu se upotrebljavati za pripremanje farmaceutski prihvatljivih soli i uključene su u učenje. Farmaceutski prihvatljive soli ove vrste sadrže na neograničavajući način one pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, limunske, mravlje, malonske, jantarne kiseline, i slično. Farmaceutski prihvatljive soli takođe se mogu pripremiti kao soli alkalnih metala ili soli zemnoalkalnih metala, kao što su natrijumove soli, kalijumove soli ili kalcijumove soli.
[0263] Pogodne puferske supstance za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji uključuju sirćetnu kiselinu u soli, limunsku kiselinu u soli, bornu kiselinu u soli i fosfornu kiselinu u soli.
[0264] Pogodni konzervansi za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji uključuju benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.
[0265] Injektabilna formulacija može sadržati farmaceutski prihvatljiv ekscipijens kao što je Ringer laktat.
[0266] Termin "nosač" označava organsku ili neorgansku komponentu, prirodne ili sintetičke prirode, u kojoj je aktivna komponenta kombinovana kako bi se olakšala, pojačala ili omogućila primena. U skladu sa učenjem, termin "nosač" takođe uključuje jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih filera, razblaživača ili supstanci za inkapsuliranje, koji su pogodni za primenu kod pacijenta.
[0267] Moguće nosač supstance za parenteralnu primenu su npr. sterilna voda, Ringer, Ringer laktat, sterilni rastvor natrijum hlorida, polialkilen glikoli, hidrogenizovani naftaleni i, posebno, biokompatibilni laktidni polimeri, kopolimeri laktida/glikolida ili kopolimeri polioksietilena/polioksipropilena.
[0268] Termin "ekscipijens" kada se ovde upotrebljava namenjen je da označi sve supstance koje mogu biti prisutne u farmaceutskoj kompoziciji i koje nisu aktivni sastojci kao što su, npr. nosači, bajnderi, lubrikanti, zgušnjivači, površinski aktivni agensi, konzervansi, emulgatori, puferi, agensi za aromatizovanje, ili boje.
[0269] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani mogu se primenjivati bilo kojim konvencionalnim putem, kao što je parenteralna primena uključujući injekciju ili infuziju. Primena je poželjno parenteralno, npr. intravenski, intraarterijski, subkutano, intradermalno ili intramuskularno.
[0270] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu uobičajeno sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je poželjno izotoničan u odnosu na krv primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, uobičajeno se upotrebljavaju sterilna, fiksna ulja kao rastvor ili medijum za suspenziju.
[0271] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani primenjuju se u efikasnim količinama. "Efikasna količina" označava količinu kojom se postiže željena reakcija ili željeni efekat sam ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju lečenja određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se poželjno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo sadrži usporavanje napredovanja bolesti i, posebno, prekidanje ili preokretanje napredovanja bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti ili stanja može takođe biti odlaganje početka ili prevencija početka navedene bolesti ili navedenog stanja.
[0272] Efikasna količina agensa ili kompozicije koji su ovde opisani zavisiće od stanja koje se leči, ozbiljnosti bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanje lečenja, tip prateće terapije (ukoliko postoji), specifičan put primene i slične faktore. U skladu sa tim, doze koje se primenjuju agenasa koji su ovde opisani mogu zavisiti od različitih takvih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna sa inicijalnom dozom, mogu se upotrebljavati više doze (ili efikasno više doze koje se postižu drugačijim, lokalizovanijim putem primene).
[0273] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani mogu se primenjivati pacijentima, npr. in vivo, za lečenje ili prevenciju različitih poremećaja kao što su oni koji su ovde opisani. Poželjni pacijenti uključuju humane pacijente koji imaju poremećaje koji se mogu korigovati ili poboljšati primenom agenasa i kompozicija koji su ovde opisani. Ovo uključuje poremećaje koji uključuju ćelije koje karakteriše ekspresija antigena.
[0274] Na primer, u jednom primeru izvođenja, agensi koji su ovde opisani mogu se upotrebljavati za lečenje pacijenta sa bolešću kancera, npr. bolešću kancera kao što je ovde opisano, koju karakteriše prisustvo kancerskih ćelija koje eksprimiraju antigen.
[0275] Farmaceutske kompozicije i postupci lečenja koji su opisani u skladu sa učenjem takođe se mogu upotrebljavati za imunizaciju ili vakcinaciju kako bi se prevenirala bolest koja je ovde opisana.
[0276] Farmaceutska kompozicija iz učenja može se primenjivati zajedno sa suplementujućim supstancama za pojačanje imuniteta kao što su jedan ili više adjuvanasa i može sadržati jednu ili više supstanci za pojačanje imuniteta kako bi se dodatno povećala njena efikasnost, poželjno kako bi se postigao sinergistički efekat imunostimulacije. Termin "adjuvans" se odnosi na jedinjenja koja produžavaju ili pojačavaju ili ubrzavaju imunski odgovor. U ovom pogledu su mogući različiti mehanizmi, u zavisnosti od različitih tipova adjuvanasa. Na primer, jedinjenja koja omogućavaju maturaciju DC, npr. lipopolisaharidi ili CD40 ligand, čine prvu klasu pogodnih adjuvanasa. Generalno, bilo koji agens koji utiče na imunski sistem tipa "signala opasnosti" (LPS, GP9δ, dsRNA itd.) ili citokina, kao što je GM-CSF, može se upotrebljavati kao adjuvans koji omogućava da se intenzivira imunski odgovor i/ili da se utiče na njega na kontrolisan način. CpG oligodezoksinukleotidi se takođe mogu opciono upotrebljavati u ovom kontekstu, iako se moraju uzeti u obzir njihovi neželjeni efekti koji se javljaju pod određenim okolnostima, kao što je prethodno objašnjeno. Posebno poželjni adjuvansi su citokini, kao što su monokini, limfokini, interleukini ili hemokini, npr. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFNα, IFNγ, GM-CSF, LT-α, ili faktori rasta, npr. hGH. Dodatni poznati adjuvansi su aluminijum hidroksid, Frojndov (Freundꞌs) adjuvans ili ulje kao što je Montanide<®>, najpoželjnije Montanide<®>ISA51. Lipopeptidi, kao što je Pam3Cys, su takođe pogodni za upotrebu kao adjuvansi u farmaceutskoj kompoziciji iz predmetnog učenja.
[0277] Farmaceutska kompozicija se može primeniti lokalno ili sistemski, poželjno sistemski.
[0278] Termin "sistemska primena" označava primenu agensa tako da agens postane široko distribuiran u telu pojedinca u značajnim količinama i razvije željeni efekat. Na primer, agens može da razvije svoj željeni efekat u krvi i/ili da dođe na željeno mesto delovanja putem vaskularnog sistema. Tipični sistemski putevi primene uključuju primenu introdukovanjem agensa direktno u vaskularni sistem ili oralnu, plućnu, ili intramuskularnu primenu pri čemu se agens adsorbuje, ulazi u vaskularni sistem, i prenosi na jedno ili više željenih mesta delovanja putem krvi.
[0279] U skladu sa predmetnim učenjem, poželjno je da je sistemska primena parenteralnom primenom. Termin "parenteralna primena" označava primenu agensa tako da agens ne prolazi kroz creva. Termin "parenteralna primena" uključuje intravensku primenu, subkutanu primenu, intradermalnu primenu ili intraarterijsku primenu, ali nije ograničena na njih.
[0280] Primena se takođe može izvršiti, na primer, oralno, intraperitonealno ili intramuskularno.
[0281] Agensi i kompozicije koji su ovde obezbeđeni mogu se upotrebljavati sami ili u kombinaciji sa konvencionalnim terapijskim režimima kao što su operacija, zračenje, hemioterapija i/ili transplantacija kostne srži (autologna, singena, alogena ili nesrodna).
[0282] Predmetno učenje je detaljno opisano pomoću slika i primera u nastavku, koji se upotrebljavaju samo u svrhu ilustracije i nemaju za cilj da budu ograničavajući. Zahvaljujući opisu i primerima, radniku sa iskustvom dostupni su dodatni primeri izvođenja koji su takođe uključeni u učenje.
SLIKE
[0283]
Slika 1: Prikaz TCR-CD3 kompleksa. Unutarcitoplazmatski motivi aktivacije CD3 imunoreceptora zasnovani na tirozinu (ITAM) označeni su kao cilindri (prilagođeno iz "The T cell receptor facts book", MP Lefranc, G Lefranc, 2001).
Slika 2: Dizajn uzastopnih generacija CAR. Šematski prikaz različitih generacija CAR (1G, prva generacija, 2G, druga generacija, 3G, treća generacija). Prva generacija sadrži vanćelijske scFv i citoplazmatski CD3ζ lanac IZAP70 koji posreduje u citotoksičnosti, druga generacija dodatno CD28/PI3K koji promoviše proliferaciju i treća generacija dodatno i 4-1BB ili OX40/TRAF koji podržavaju preživljavanje ćelija (Casucci, M. et al. (2011) 2: 378-382).
Slika 3: Šematski prikaz različitih formata receptora za preusmeravanje T ćelija prema antigenu. Levo: CAR druge generacije koji se sastoji od scFv fragmenta specifičnog za antigen, spejser domena poreklom od IgG1, kostimulatornog CD28 i CD3ζ signalnog domena (CAR-28ζ); sredina: novi format CAR zasnovan na povezivanju scFv sa konstantnim domenom murinskog TCRβ lanca i koekspresijom konstantnog domena murinskog TCRα lanca (CAR/Cα); desno: murinski TCR koji je sačinjen od TCR α/β lanaca (mu, murinski TCR);
Slika 4: Proliferacija humanih CLDN6-specifičnih T ćelija nakon prepoznavanja različitih količina antigena. Kapacitet proliferacije CFSE obojenih CLDN6-CAR-projektovanih CD8<+>T ćelija analiziran je posle kokulture sa autolognim iDC transfektovanim sa naznačenim količinama CLDN6 IVT RNK. (A) Ekspresija CLDN6 na iDC transfektovanim sa titriranim količinama CLDN6 RNK analizirana je oko 20 h posle elektroporacije posle bojenja sa Alexa-Fluor-647-konjugovanim CLDN6-specifičnim antitelom (IMAB027, Ganymed). Ćelije su gejtovane na pojedinačne ćelije.
(B, C, D) Površinska ekspresija CAR i TCR na CD8<+>T ćelijama transfektovanim bilo sa CLDN6-CAR ili sa kontrola-CAR RNK ili bez RNK (lažno) analizirana je posle bojenja sa fluorohrom-konjugovanim idiotip-specifičnim antitelima koja detektuju bilo CLDN6-CAR (B) ili kontrola-CAR (C). Površinska ekspresija murinskog CLDN6-specifičnog TCR procenjena je posle bojenja antitelom specifičnim za murinski TCR beta lanac (D). Ćelije su gejtovane na pojedinačne CD8<+>T limfocite. (E) Posle 96 h kokulture CFSE razblaženja CD8<+>T ćelija analizirana su upotrebom protočne citometrije. Pozitivna kontrola: CD8<+>T ćelije transfektovane sa CLDN6-specifičnim TCR; negativne kontrole: CD8<+>T ćelije transfektovane bez RNK (lažno); CD8<+>T ćelije transfektovane sa kontrola-CAR RNK. (F) Pokazani su reprezentativni tačkasti grafički prikazi FACS analize T ćelija koje su transfektovane receptorom posle kokulture sa autolognim iDC koje su transfektovane sa 5 μg CLDN6 IVT RNK. Brojevi označavaju procente roditeljskih populacija.
Slika 5: Površinska ekspresija CLDN6-specifičnih CAR konstrukata na murinskim T ćelijama. Splenociti su transdukovani sa retrovirusnim vektorima koji sadrže bilo CLDN6-CAR, kontrola-CAR ili eGFP transgene. 4 dana posle 2. koraka transdukcije, ćelije su obojene sa APC-Cy7-konjugovanim antiCD4, PE-Cy7-konjugovanim CD8, PE-konjugovanim anti-humanim IgG, koji prepoznaju sve CAR molekule nezavisno od njihove specifičnosti i bilo DyLight650-konjugovanim antiidiotip CLDN6 CAR (B) ili AlexaFluor647-konjugovanim anti-idiotip kontrola-CAR (C) antitelima, koja su prepoznala odgovarajuće CAR molekule. Opšta strategija gejtovanja pokazana je na (A). Brojevi označavaju procente roditeljskih populacija.
Slika 6: Kapacitet antigen-specifične proliferacije murinskih CAR-transdukovanih T ćelija nakon prepoznavanja njihovih odgovarajućih antigena. CFSE obojene CAR transdukovane T ćelije kokultivisane su bilo sa specifičnim ili irelevantnim antigenom transfektovanim BMDC (E:T odnos 8:1) i kao negativna kontrola T ćelije su kultivisane bez BMDC. Posle 48 h, ćelije su sakupljene i CFSE bojenje CLDN6-CAR transdukovanih (A) i kontrola-CAR transdukovanih (B) T ćelija izmereno je upotrebom protočne citometrije. Brojevi su označavali procenat umnoženih ćelija roditeljske populacije (jednoćelijski gejt).
Slika 7: Antigen-specifično in situ umnožavanje CLDN6-CAR T ćelija kod imunokompetentnih miševa posle RNK(Lip) vakcinacije. BALB/c-miševi (n=12/grupi) su i.v. graftovani sa 5 x 10<6>CLDN6-CAR-effLuc-GFP ili kontrolnim CAR-effLuc-eGFP transdukovanim BALB/c-Thy1.1<+>T ćelijama, respektivno. Jedan dan (dan 1) posle ACT, polovina miševa (n=6) u svakoj grupi tretirana je i.v. sa RNK (F12-Lip) koja sadrži 25 μg CLDN6 RNK, dok je druga polovina tretirana sa RNK(Lip) koja sadrži 25 μg RNK kontrolnog antigena. U obe eksperimentalne grupe (ACT CLDN6-CAR naspram kontrolnih CAR-T ćelija), miševi tretirani odgovarajućom neciljani antigen-kodirajućom RNK(Lip) služili su kao negativne kontrole. In vivo intenziteti luminescencije izmereni su 1 h (dan 0) i 72 h (dan 3) nakon ACT. (A) Šematski pregled eksperimentalne postavke. (B) Bioluminescentno snimanje (BLI) miševa u lateralnoj poziciji u različitim vremenskim tačkama posle ACT i tretmana sa RNK(Lip) kao što je naznačeno. Slike koje nemaju pravu ili standardnu boju predstavljaju intenzitet svetlosti (crna, najmanje intenzivna; bela do tamnosive, najintenzivnija) koje su postavljene preko referentne fotografije u nijansama sive. (C) Na dan 3 posle RNK(Lip) tretmana (pik umnožavanja CAR T ćelija) procenjena je emisija svetlosti miševa (srednja vrednost ± SEM). Razlike u emisiji svetlosti različitih tretiranih grupa analizirane su upotrebom dvostranog t-testa uključujući Velčovu (Welch) korekciju.
Slika 8: In vivo umnožavanje CAR T ćelija pomoću RNK(Lip) vakcinacije zavisno je od količine RNK. Različite doze RNK(Lip) koja sadrži CLDN6 RNK primenjene su pomoću i.v. injekcije u BALB/c miševe (n=4/grupi/količini RNK) koji su graftovani sa Thy1.1<+>CLDN6-CAR T ćelijama 1 dan nakon ACT kao što je opisano na Slici 7. BALB/c miševi (n=2) koji su primili CLDN6-CAR T ćelije ali bez RNK(Lip) služili su
1
kao kontrola. Umnožavanje CLDN6-CAR T ćelija praćeno je in situ upotrebom bioluminescentnog snimanja zasnovanog na luciferazi i u perifernoj krvi na dan 3 nakon ACT upotrebom protočne citometrije. (A) Bioluminescentno snimanje miševa u lateralnoj poziciji u različitim vremenskim tačkama posle ACT i tretmana sa RNK(Lip) kao što je naznačeno. Slike koje nemaju pravu ili standardnu boju predstavljaju intenzitet svetlosti (crna, najmanje intenzivna; bela do tamnosive, najintenzivnija) koje su postavljene preko referentnih slika u nijansama sive. (B) Vremenski tok podataka in vivo bioluminescencije (n = 4, kontrolna grupa n = 2; srednja vrednost ± SEM). (C) Učestalosti adoptivno transferisanih Thy1.1<+>T ćelija i CD4 i CD8 T ćelijskih kompozicija ovih ćelija procenjene su putem protočne citometrije u perifernoj krvi 48 h posle vakcinacije upotrebom PerCP-konjugovanog murinskog CD90.1/Thy1.1, APC-Cy7-konjugovanog murinskog CD4 i PE-Cy7-konjugovanog murinskog CD8α monoklonalnog antitela. Za svaki tretman, pokazan je reprezentativni zebra blot, kao i tačkasti grafički prikaz. Brojevi označavaju procente roditeljskih populacija (D i E). Rezultati protočne citometrije svih miševa su sumirani (srednja vrednost ± SD).
PRIMERI
[0284] Tehnike i postupci koji su ovde upotrebljeni opisani su ovde ili izvedeni na način poznat per se i kao što je opisano, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Svi postupci, uključujući upotrebu kompleta i reagenasa sprovedeni su u skladu sa informacijama proizvođača osim ukoliko nije specifično naznačeno.
Primer 1: Materijali i postupci
Mononukleusne ćelije periferne krvi (PBMC), monociti i dendritske ćelije (DC)
[0285] PBMC su izolovane pomoću Ficoll-Hipaque (Amersham Biosciences, Uppsala, Švedska) centrifugiranjem u gradijentu gustine iz sloja istaloženih leukocita i krvnih pločica. Monociti su obogaćeni sa anti-CD14 mikroperlama (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Nemačka). Nezrele DC (iDC) su dobijene diferenciranjem monocita tokom 5 dana u citokinom-suplementovanom medijumu za kulturu kao što je opisano u Kreiter et al. (2007), Cancer Immunol. Immunother. CII, 56, 1577-87.
2
Izolovanje i aktivacija ćelija slezine
[0286] Splenociti su izolovani iz naivnih C57B16 miševa i izvršen je transfer 1<∗>10<7>u medijum za kulturu (RPMI1640) i preaktivirani su 24 h sa 2 μg/ml anti-CD3 (eBioscience), 1 μg/ml anti-CD28 (Novus Biologicals) i 5 ng/ml rekombinantnog humanog (rh) IL-7 i 10 ng/ml rh IL-15 (Miltenyi).
Retrovirusna transdukcija murinskih splenocita
[0287] Ploče bez tkiva obložene su sa 2,1 μg/cm<2>RetroNectin (Clontech) preko noći na 4 °C. Posle oblaganja, RetroNectin je uklonjen i zatim blokiran 30 min na sobnoj temperaturi sa 500 μl PBS/2% BSA [tež./zapr.] za svaki bunarić. BSA rastvor je uklonjen i bunarići su jednom isprani sa PBS. PBS je zamenjen retrovirusnim (MLVE) vektorima koji sadrže bilo CLDN6-CAR, kontrola-CAR ili eGFP transgene i ploča je centrifugirana 15 min 1300 xg. Ovaj proces je ponovljen još 2 puta sa svežim supernatantom virusne kulture. Bunarići su zatim pažljivo isprani sa PBS pre nego što je 1x10<6>24 h preaktiviranih murinskih splenocita inkubirano na obloženim bunarićima. Posle 4 h inkubacije, dodati su virusni supernatanti i izvedena je spin transdukcija sa 300 xg 37 °C i ćelije su inkubirane 1 dodatni sat u inkubatoru pre nego što je virusni supernatant zamenjen medijumom za kulturu koji sadrži 5 ng/ml IL-7 i 10 ng/ml IL-15. Ceo postupak transdukcije ponovljen je jedan dan kasnije. Posle drugog koraka transdukcije, virusni supernatant je zamenjen svežim medijumom za kulturu. Za test proliferacije zasnovan na CFSE, ćelije su sakupljene na dan 7 posle izolovanja i očišćene sa Ficoll-Paque PREMIUM (1,084) pre CFSE bojenja.
Generisanje in vitro transkribovane (IVT) RNK i transfer u ćelije
[0288] Generisanje IVT RNK izvedeno je kao što je prethodno opisano (Holtkamp, S. et al. (2006), Blood 108, 4009-4017) i naznačene količine IVT RNK (CLDN6 ili kontrolni antigen u murinskim BMDC: 6 μg; CAR u humanim T ćelijama: 15-20 μg; TCR u humanim T ćelijama: 20 μg svaki lanac; CLDN6 ili gp100 u iDCs: 10 μg) dodate su ćelijama suspendovanim u 250 μl X-VIVO 15 medijuma (Lonza, Basel, Švajcarska) u prethodno ohlađenim sterilnim kivetama za elektroporaciju sa razmakom od 4 mm (Peqlab). Elektroporacija je izvedena sa ECM 830 Square Wave Electroporation System aparatom (BTX) (murinske BMDC: 400 V, 3 ms, 1 impuls, humane T ćelije 500 V, 3 ms, 1 impuls, humane iDC: 300 V, 12 ms, 1 impuls).
Test proliferacije zasnovan na CFSE
[0289] Murinske ćelije su obeležene sa 5 μM CFSE, humane T ćelije sa 0, 8 μM. Obeležene ćelije su isprane i kokultivisane sa IVT-RNK-transfektovanim APC ćelijama (npr. BMDC ili iDC) pri naznačenim odnosima efektor cilj. Posle 2 dana ili 4 dana kokulture, ćelije su sakupljene i proliferacija je analizirana pomoću protočne citometrije na osnovu progresivnog prepolovljavanja fluorescencije CFSE unutar ćerki ćelija nakon deoba ćelija.
Analize protočne citometrije
[0290] Ekspresija na površini ćelija transdukovanih CAR analizirana je upotrebom fluorohrom-konjugovanih idiotip-specifičnih antitela (Ganymed pharmaceuticals) koja prepoznaju scFv fragment i humanih IgG-PE antitela koja prepoznaju IgG1-linker (sadržan u svim CAR konstruktima). Ekspresija CLDN6 na površini ćelija izvedena je upotrebom Alexa-Fluor-647-konjugovanog CLDN6-specifičnog antitela IMAB027 (Ganymed pharmaceuticals). Analiza protočne citometrije izvedena je na FACS CANTO II protočnom citometru upotrebom FACS Diva softvera (BD Biosciences).
Životinje
[0291] Miševi su kupljeni od komercijalnih dobavljača. Tokom eksperimenata upotrebljavane su životinje koje su se podudarale po starosti (8-10 nedelja) i polu (muški ili ženski).
Retrovirusna genska manipulacija i priprema CAR T ćelija za adoptivni T ćelijski transfer
[0292] Splenociti naivnih BALB/c-Thy1.1<+>izolovani su i preaktivirani sa 2 μg/ml Concanavalin A (Sigma-Aldrich) u prisustvu 5 ng/ml rh IL-7 i 1,5-10 ng/ml rh IL-15 (Miltenyi). Preaktivirane ćelije su transdukovane kao što je opisano u odeljku "Retrovirusna transdukcija murinskih splenocita". Retrovirusni vektori sadrže kodiran bilo kontrola-CAR ili CLDN6-CAR kao i pojačanu luciferazu svica (effLuc; Rabinovich B.A. et al. (2008) Proc.
4
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 14342-14346) i eGFP (pojačani zeleni fluorescentni protein) reporterski gen, koji se eksprimira odvojeno upotrebom 'samoisecajućih' T2A-elemenata (Szymczak A.L. et al. (2004) Nat. Biotechnol.22, 589-594). Posle čišćenja fikolom, ćelije su dva puta isprane sa PBS kako bi se uklonili serumski proteini i zatim su pripremljene za adoptivni ćelijski transfer (ACT).
Generisanje lipozomalno formulisane IVT RNK (RNK(Lip))
[0293] Različite količine CLDN6 ili kontrolne-IVT RNK kompleksovane su sa F12-lipozomima koji sadrže DOTMA/DOPE (1,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijum propan / 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (2:1 mol:mol)) kao što je prethodno opisano u WO2013/143683.
Eksperimenti sa miševima
[0294] Izvršen je intravenski (i.v.) transfer 5x10<6>CAR-T2A-effLuc-T2A-eGFP transdukovanih BALB/c-Thy1.1<+>T ćelija u 200 μl u svakog BALB/c miša donora. Nakon toga, miševi su i.v. vakcinisani sa F12:RNK odnosom od 1,3 : 2 RNK(Lip) 24 sata posle adoptivnog T ćelijskog transfera (ACT). Izvedeno je doniranje periferne krvi i bioluminescentno snimanje celog tela.
In vivo snimanje luciferaze (BLI)
[0295] Umnožavanje i distribucija CAR-effLuc-GFP transdukovanih T ćelija procenjeno je pomoću in vivo bioluminescentnog snimanja upotrebom IVIS Lumina sistema za snimanje (Caliper Life Sciences). Ukratko, vodeni rastvor D-luciferina (80 mg/kg telesne težine; Perkin Elmer) injektiran je i.p.1 h (dan 0), 72 h (dan 3) i 96 h (dan 4) posle ACT.5 min nakon toga, emitovani fotoni su kvantifikovani (vreme integracije od 1 min). In vivo bioluminescencija u regionima od interesa (ROI) kvantifikovana je kao prosek radijance (fotoni/s/cm2/sr) upotrebom IVIS Living Image 4.0 softvera. Intenzitet transmitovane svetlosti koja potiče od ćelija koje eksprimiraju luciferazu unutar životinje predstavljen je kao slika u nijansama sive, gde je crna boja najmanje intenzivan, a bela do tamnosiva najintenzivniji signal bioluminescencije. Referentne slike miševa u nijansama sive dobijene su pod LED osvetljenjem pri slabom svetlu. Slike su preklopljene upotrebom Living Image 4.0 softvera.
Protočna citometrija periferne krvi miševa
[0296] Ćelijska kompozicija transferisanih Thy1.1<+>T ćelija procenjena je 72 h (dan 3) posle ACT u hipotonično liziranim uzorcima periferne krvi (ACK pufer; GIBCO). Upotrebljena su fluorohrom-kuplovana monoklonalna antitela koja detektuju murinski CD90.1/Thy1.1 (BD Pharmingen), CD8α (eBioscience) i CD4 (BD Pharmingen). Podaci o protočnoj citometriji dobijeni su na FACS-Canto II analitičkom protočnom citometru i analizirani upotrebom FlowJo X softvera (Tree Star).
Primer 2: Umnožavanje CAR-projektovanih T ćelija sa IVT RNK pulsovanim APC in vitro
[0297] Važan preduslov za proliferaciju i postojanost CAR-projektovanih T ćelija kod pacijenata je prisustvo antigena kao što je demonstrirano obećavajućim rezultatima kliničkog ispitivanja CD19-specifičnih CAR kod hematoloških maligniteta. Analogno umnožavanju endogenih T ćelija pomoću RNK imunizacije putem stimulacije TCR od strane MHC-peptid kompleksa, želeli smo da analiziramo, da li se adoptivno transferisane CAR T ćelije takođe mogu umnožavati upotrebom lipozomima posredovane RNK-vakcinacije ciljnih ćelija kako bi se obezbedio prirodni površinski eksprimiran antigen za stimulaciju CAR T ćelija. Takav "prekidač" bi mogao da omogući inicijalni transfer malih količina CAR-projektovanih T ćelija u pacijente. Ukoliko ovaj transfer ne bi rezultovao ozbiljnim neželjenim efekatima kod pacijenata, projektovane T ćelije bi se tada mogle umnožavati sa lipozomalno formulisanom RNK. Štaviše ovaj postupak bi u nekim okolnostima mogao biti prilika za pacijente sa tumorom da izbegnu hemioterapiju koja veštački stvara prostor za adoptivni T ćelijski transfer.
[0298] Procenjivali smo koncept umnožavanja in vitro za CAR koji specifično cilja tumorski antigen CLDN6. CLDN6-CAR predstavlja klasičan CAR 2. generacije koji sadrži signalne i kostimulatorne funkcionalne grupe CD3ζ i CD28, respektivno. Delecija lck vezujuće funkcionalne grupe u CD28 endodomenu poništava sekreciju IL-2 nakon angažovanja CAR kako bi se prevenirala indukcija regulatornih T ćelija (Kofler D.M. et al., (2011) Molecular Therapy 19 (4), 760-767). Modifikacijom IgGl Fc 'spejser' domena u vanćelijskoj funkcionalnoj grupi CAR izbegava se "nespecifična" (off target) aktivacija i nenamerna inicijacija urođenog imunskog odgovora (Hombach A. et al., (2010) Gene Therapy 17, 1206-1213).
[0299] Prvo smo želeli da analiziramo, da li bi se CAR-projektovane humane T ćelije takođe mogle umnožavati upotrebom RNK-transfektovanih ciljnih ćelija kako bi se obezbedio prirodni CLND6 za stimulaciju CAR T ćelija. In vitro test kokulture zasnovan na CFSE izveden je upotrebom CLDN6-CAR-RNK transfektovanih humanih CD8<+>T ćelija zajedno sa autolognim iDC transfektovanim sa titriranim količinama CLDN6 IVT RNK. Rezultujuća dozno-zavisna površinska ekspresija CLDN6 procenjena je pomoću protočne citometrije posle bojenja sa CLDN6-specifičnim antitelom (Slika 4A). Kao pozitivna kontrola CD8<+>T ćelije su transfektovane sa RNK koja kodira HLA-A*0201-restriktovani CLDN6-specifični murinski TCR i kao negativna kontrola je uključen kontrolni CAR. Površinska ekspresija transfektovanih CAR i TCR analizirana je posle bojenja sa idiotip-specifičnim i murinskim TCR-beta-specifičnim antitelima (Slika 4B, C, D). Posle četiri dana kokulture, analizirana je antigen-specifična proliferacija svih receptor-transfektovanih i CFSE-obeleženih CD8<+>T ćelija kao odgovor na iDC koje eksprimiraju CLDN6 na osnovu progresivnog prepolovljavanja fluorescencije CFSE pomoću protočne citometrije. CLDN6-CAR je posredovao u proliferaciji skoro svih CD8<+>T ćelija kao odgovor na CLDN6-transfektovane ciljne ćelije čak i pri niskoj koncentraciji antigena (1 μg CLDN6 RNK; 95%). Procenat proliferišućih CLDN6-CAR T ćelija bio je čak i viši od udela CLDN6-TCR transfektovanih T ćelija koje su služile kao pozitivna kontrola koja čini oko 90%, dok kontrola-CAR nije indukovao proliferaciju nakon kontakta sa CLDN6 antigenom (Slika 4E, F).
[0300] Ovaj rezultat je potvrdio da CAR molekuli mogu snažno indukovati proliferaciju u T ćelijama in vitro posle kokulture sa RNK-transfektovanim iDC, ćelijskom populacijom koja je uglavnom odgovorna za preuzimanje RNK u limfnim čvorovima in vivo posle RNK vakcinacije.
[0301] Kako bismo preveli našu strategiju u in vivo eksperiment, prvo smo analizirali proliferativni kapacitet murinskih CLDN6-CAR-eksprimirajućih T ćelija upotrebljavajući sličnu eksperimentalnu postavku. U tom cilju splenociti C57B1/6 miševa transdukovani su sa retrovirusnim vektorima koji sadrže bilo CLDN6-CAR ili kontrolni CAR ili su bez transgena.
[0302] Kako CAR obezbeđuju MHC ili HLA nezavisno scFv-posredovano vezivanje antigena, oni su funkcionalni i u CD4<+>i CD8<+>T ćelijama. Prema tome, prvo smo analizirali površinsku ekspresiju CAR na CD4<+>i CD8<+>T ćelijama posle retrovirusne transdukcije oba CAR na murinskim splenocitima (Slika 5). Oba molekula mogu se detektovati na površini CD4<+>kao i na CD8<+>T ćelijama upotrebom CAR-specifičnih antitela (anti-idiotip specifična antitela i PAN-CAR antitelo koja prepoznaju univerzalno prisutni IgG1-Fc spejser region). Test in vitro proliferacije zasnovan na CFSE izveden je upotrebom bilo CLDN6-CAR ili kontrolnih CAR-transdukovanih splenocita zajedno sa CLDN6 ili kontrolnom RNK-transfektovanim BMDC (Slika 6). CLDN6-CAR je pokazao snažna proliferativna svojstva kao odgovor na CLDN6 transfektovane ciljne ćelije (oko 78%), dok nije uočena proliferacija nakon prepoznavanja ciljnih ćelija koje su eksprimirale antigen prepoznat od strane kontrolnog CAR. Nasuprot tome, kontrolni CAR je inicirao proliferaciju (55,4%) transdukovanih T ćelija isključivo kao odgovor na ciljne ćelije koje eksprimiraju odgovarajući antigen, dok se proliferacija nije mogla uočiti posle kokulture CLDN6-eksprimirajućih ciljnih ćelija.
[0303] Ovaj rezultat je potvrdio funkcionalnost CLDN6-CAR u murinskim T ćelijama in vitro i demonstrirao da su murinske CLDN6-CAR T ćelije sposobne da snažno proliferšu kao odgovor na murinske BMDC koje eksprimiraju humani CLDN6 antigen posle RNK transfera. Ovo obezbeđuje osnovu za testiranje naše predložene strategije u in vivo okruženju upotrebom adoptivnog transfera murinskih CAR-eksprimirajućih T ćelija u kombinaciji sa lipozomalno formulisanom RNK-vakcinacijom u singenom životinjskom modelu.
Primer 3: Umnožavanje CAR-projektovanih T ćelija sa IVT RNK pulsovanim APC in vivo
[0304] Kako bismo testirali ovaj inovativni koncept u fiziološkoj postavci, uspostavili smo singeni mišji model koji je potpuno imunokompetentan i, dakle, bliže odražava imunski status pacijenata i omogućava analizu postojanosti transferisanih CAR T ćelija.
[0305] Antigen npr. CLDN6-kodirajuća, lipozomalno formulisana RNK (RNK(Lip)) upotrebljavaće se za umnožavanje CAR T ćelija in vivo na kontrolisan način. RNK(Lip) selektivno cilja APC poput DC u sekundarnim limfoidnim organima, posebno u slezini. Očekuje se da će interakcija CAR-T ćelija sa APC koje ektopično eksprimiraju CLDN6 posle preuzimanja RNK(Lip) podržati adekvatnu aktivaciju i proliferaciju CAR-T ćelija obezbeđivanjem prirodne kostimulacije in situ. Kako bi se olakšalo umnožavanje i sudbina CAR-T ćelija in vivo, pES12.6-CLDN6-CAR vektor i kontrolni CAR vektor modifikovani su da eksprimiraju luciferazu (effLuc) i eGFP reporterske gene nizvodno od odgovarajućeg CAR odvojeno virusnim T2A sekvencama. Treba napomenuti da na površinsku ekspresiju i antigensku specifičnost CLDN6-CAR i kontrolna-CAR nije značajno uticala koekspresija luciferaze i GFP u murinskim CAR-transdukovanim T ćelijama (podaci nisu pokazani).
[0306] BALB/c miševi su graftovani sa 5 x 10<6>CAR-reporter transdukovanih kongenih Thy1.1<+>murinskih ukupnih T ćelija (približno 2,5 x 10<8>ćelija/kg telesne težine) bez prethodne limfo-deplecije. 200 μl RNK(Lip) koja sadrži bilo 25 μg humane CLDN6 ili kontrolne RNK primenjeno je retro-orbitalno miševima 1 dan posle adoptivnog transfera CAR-T ćelija (Slika 7A). CAR-T ćelije su zatim praćene in vivo intraperitonealnom primenom 1,66 mg rastvora D-luciferina po mišu. 1 sat posle ACT, većina CAR-T ćelija je već pronađena u slezini. Značajno (do 6 puta) povećanje ukupnog fluksa indukovano je tretmanom sa 25 μg RNK(Lip) kao što je detektovano bioluminescentnim snimanjem 3 dana posle ACT (Slika 7B+C). Ovaj efekat je uočen za miševe koji su primili CLDN6-CAR T ćelije posle tretmana sa CLDN6-kodirajućom RNK(Lip), kao i za miševe koji su primili kontrolni CAR-T ćelije posle tretmana sa kontrolnom RNK-kodirajućom RNK(Lip), ali ne i za odgovarajuće kontrolne grupe. Ovi podaci demonstriraju da se CAR-T ćelije mogu uspešno umnožavati in situ na način koji je veoma specifičan za antigen. Pored toga, kliničko praćenje miševa u pogledu promena telesne težine i opšteg zdravstvenog statusa nije otkrilo nikakve očigledne negativne efekte transfera CAR-T ćelija i naknadnog tretmana sa RNK(Lip) (podaci nisu pokazani).
[0307] Pošto smo demonstrirali da se CAR-T ćelije mogu uspešno umnožavati in situ upotrebom RNK(Lip) koja kodira odgovarajući antigen (dokaz principa), istražili smo da li je ovaj efekat u korelaciji sa količinom RNK(Lip) koja se upotrebljava u studiji odgovora na dozu. U tu svrhu CLDN6-CAR transdukovanim murinskim Thy1.1<+>T ćelijama-graftovani BALB/c miševi tretirani su (kao što je prethodno opisano) sa 0,4-25 μg CLDN6-RNK(Lip). Dozno-zavisno umnožavanje CLDN6-CAR T ćelija moglo se uočiti in situ putem BLI. Čak je i primena male doze CLDN6-kodirajuće RNK (0,4-1 μg/mišu) dovela do povećanja emisije svetlosti kod miševa u poređenju sa netretiranom grupom (Slika 8 A+B). Pored promene u bioluminescenciji posle RNK(Lip) vakcinacije, učestalosti adoptivno transferisanih CLDN6-CAR Thy1.1<+>T ćelija pokazale su pribl. 4,2 puta povećanje u perifernoj krvi 3 dana nakon ACT u poređenju sa nevakcinisanim miševima (bez vakcinacije: 0,63±0,09% Thy1.1<+>T ćelija; 25 μg CLDN6-RNK(Lip)-vakcinacija: 2,65±0,38% Thy1.1<+>T ćelija; srednja vrednost ± SD) (Slika 8 C+D). Umnožene Thy1.1<+>T ćelije koje su detektovane u perifernoj krvi bile su uglavnom citotoksične CD8<+>CAR-T ćelije, tj. tip ćelija koji može direktno da izvršava antitumorske funkcije kod pacijenata u poređenju sa nevakcinisanim miševima gde preovlađuju CD4<+>T ćelije (Slika 8E). Promena u podpopulacijama bila je jasno zavisna od koncentracije.
[0308] Ovi podaci snažno podržavaju ideju da je izvodljivo kontrolisano umnožavanje CAR-T ćelija direktno u pacijentu upotrebom RNK(Lip) tehnologije.

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju himerni antigenski receptor (CAR) koji ciljno deluje na antigen i/ili nukleinska kiselina koja kodira antigen za upotrebu u postupku lečenja pomoću terapije, obezbeđivanjem imunskog odgovora za ciljnu populaciju ćelija ili ciljno tkivo koji eksprimiraju antigen kod sisara, postupak sadrži primenu sisaru T ćelija genetički modifikovanih da eksprimiraju CAR sistemskom primenom i primenu nukleinske kiseline koja kodira antigen, naznačeno time što je nukleinska kiselina koja kodira antigen RNK formulisana u lipozomima,
pri čemu himerni antigenski receptor poželjno sadrži antigen-vezujući domen, signalni domen i kostimulatorni domen.
2. T ćelije i/ili nukleinska kiselina za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je imunski odgovor (i) T ćelijama-posredovan imunski odgovor i/ili (ii) antitumorski imunski odgovor i ciljna populacija ćelija ili ciljno tkivo su tumorske ćelije ili tumorsko tkivo.
3. T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju himerni antigenski receptor (CAR) koji ciljno deluje na antigen i/ili nukleinska kiselina koja kodira antigen za upotrebu u postupku lečenja sisara koji ima bolest, poremećaj ili stanje povezano sa ekspresijom ili povišenom ekspresijom antigena, postupk sadrži primenu sisaru T ćelija genetički modifikovanih da eksprimiraju CAR sistemskom primenom i primenu nukleinske kiseline koja kodira antigen, naznačeno time što je nukleinska kiselina koja kodira antigen RNK formulisana u lipozomima,
pri čemu himerni antigenski receptor poželjno sadrži antigen-vezujući domen, signalni domen i kostimulatorni domen.
4. T ćelije i/ili nukleinska kiselina za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što je bolest, poremećaj ili stanje kancer.
5. T ćelije i/ili nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time što je antigen tumorski antigen.
6. T ćelije i/ili nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time što se nukleinska kiselina koja kodira antigen eksprimira u ćelijama sisara kako bi se obezbedio antigen.
7. T ćelije i/ili nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačeno time što je nukleinska kiselina koja kodira antigen in vitro transkribovana RNK.
8. T ćelije i/ili nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačeno time što se nukleinska kiselina koja kodira antigen primenjuje sistemski, pri čemu, poželjno, posle sistemske primene nukleinske kiseline koja kodira antigen, dolazi do ekspresije antigena u slezini i/ili ekspresije antigena u antigen-prezentujućim ćelijama, poželjno profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama.
9. T ćelije i/ili nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačeno time što se nukleinska kiselina koja kodira antigen eksprimira u ćelijama sisara kako bi se obezbedio antigen za vezivanje od strane T ćelija genetički modifikovanih da eksprimiraju CAR, navedeno vezivanje rezultuje stimulacijom, prajmovanjem i/ili umnožavanjem T ćelija genetički modifikovanih da eksprimiraju CAR.
10. T ćelije i/ili nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačeno time što postupak dodatno sadrži:
transfektovanje ćelija sa nukleinskom kiselinom koja kodira CAR kako bi se obezbedile T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR,
pri čemu ćelije su ćelije dobijene iz uzorka sisara, uzorak sadrži T ćelije ili progenitore T ćelija.
11. T ćelije i/ili nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, naznačeno time što su T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR stabilno ili prolazno transfektovane sa nukleinskom kiselinom koja kodira CAR.
12. T ćelije i/ili nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačeno time što su T ćelije i/ili uzorak ćelija iz sisara kome se primenjuju T
1
ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR i nukleinska kiselina koja kodira antigen ili iz sisara koji je različit od sisara kome se primenjuju T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR i nukleinska kiselina koja kodira antigen.
13. Komplet koji sadrži T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR koji ciljno deluje na antigen i nukleinsku kiselinu koja kodira antigen, naznačeno time što CAR poželjno sadrži antigen-vezujući domen, signalni domen i kostimulatorni domen, pri čemu komplet sadrži najmanje dva kontejnera, gde jedan kontejner sadrži kompoziciju koja sadrži CAR-projektovane T ćelije, i drugi kontejner sadrži kompoziciju koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antigen, pri čemu je nukleinska kiselina koja kodira antigen RNK formulisana u lipozomima.
14. Komplet prema patentnom zahtevu 13, naznačeno time što dodatno sadrži uputstva za upotrebu kompleta u postupku koji je iznet u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12.
2
RS20230645A 2015-05-11 2016-05-09 Pojačavanje efekta car-projektovanih t ćelija putem vakcinacije nukleinskom kiselinom RS64420B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2015/060356 WO2016180467A1 (en) 2015-05-11 2015-05-11 Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination
PCT/EP2016/060332 WO2016180778A1 (en) 2015-05-11 2016-05-09 Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination
EP16724861.6A EP3294325B1 (en) 2015-05-11 2016-05-09 Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64420B1 true RS64420B1 (sr) 2023-09-29

Family

ID=53175049

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230645A RS64420B1 (sr) 2015-05-11 2016-05-09 Pojačavanje efekta car-projektovanih t ćelija putem vakcinacije nukleinskom kiselinom

Country Status (22)

Country Link
US (2) US10799534B2 (sr)
EP (2) EP4273160A3 (sr)
JP (1) JP6914851B2 (sr)
KR (1) KR102771195B1 (sr)
CN (2) CN107743399B (sr)
AU (3) AU2016259726B2 (sr)
BR (1) BR112017023478A2 (sr)
CA (1) CA2985156A1 (sr)
DK (1) DK3294325T5 (sr)
ES (1) ES2952421T3 (sr)
FI (1) FI3294325T3 (sr)
HR (1) HRP20230902T1 (sr)
HU (1) HUE062646T2 (sr)
LT (1) LT3294325T (sr)
MX (3) MX2017014346A (sr)
NZ (1) NZ775829A (sr)
PL (1) PL3294325T3 (sr)
PT (1) PT3294325T (sr)
RS (1) RS64420B1 (sr)
SI (1) SI3294325T1 (sr)
SM (1) SMT202300257T1 (sr)
WO (2) WO2016180467A1 (sr)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA40921A (fr) * 2014-11-05 2017-09-12 Abbvie Stemcentrx Llc Récepteurs antigéniques chimériques anti-cldn et procédés d'utilisation
WO2016180467A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination
ES2970865T3 (es) 2015-12-16 2024-05-31 Gritstone Bio Inc Identificación, fabricación y uso de neoantígenos
US10188749B2 (en) 2016-04-14 2019-01-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers
CN110121336A (zh) * 2017-01-05 2019-08-13 弗莱德哈钦森癌症研究中心 改善疫苗功效的系统和方法
WO2018166589A1 (en) * 2017-03-15 2018-09-20 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Antigen receptors and uses thereof
CN107177632B (zh) * 2017-05-27 2020-02-07 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于octs技术的髓系白血病car-t治疗载体及其构建方法和应用
WO2019027055A1 (ja) * 2017-08-04 2019-02-07 協和発酵キリン株式会社 核酸含有脂質ナノ粒子
NZ762505A (en) 2017-09-29 2026-03-27 Daiichi Sankyo Co Ltd Antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
EP4576103A3 (en) 2017-10-10 2025-08-27 Gritstone bio, Inc. Neoantigen identification using hotspots
CN111630602A (zh) 2017-11-22 2020-09-04 磨石肿瘤生物技术公司 减少新抗原的接合表位呈递
KR20250099256A (ko) 2018-01-18 2025-07-01 프레드 허친슨 캔서 센터 세포 활성화 상태를 조절함으로써 생체내 면역 세포의 염증 상태의 변경
SG11202007055QA (en) * 2018-03-08 2020-09-29 Phanes Therapeutics Inc Anti-claudin 18.2 antibodies and uses thereof
WO2020041776A1 (en) * 2018-08-24 2020-02-27 La Jolla Institute For Immunology Methods and compositons for modulations of immune response
CA3110946A1 (en) * 2018-08-31 2020-03-05 Invectys SA Method to assess car functionality
TWI868080B (zh) * 2018-10-18 2025-01-01 日商武田藥品工業股份有限公司 T細胞之活性化/增殖方法
US20210363543A1 (en) * 2018-10-30 2021-11-25 Nantbio, Inc. Self Replicating RNA System
FI3920939T3 (fi) 2019-02-08 2025-01-03 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Kimeerisiä anigeenireseptori-modifioituja soluja hoitamaan CLDN6-ekspressoivia syöpiä
EP4414033A3 (en) * 2019-02-08 2024-10-30 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Treatment involving car-engineered t cells and cytokines
CN112237628A (zh) * 2019-07-17 2021-01-19 四川大学华西医院 靶向EBV的LMP2-mRNA纳米疫苗
EP4065157A1 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2021129927A1 (en) * 2019-12-23 2021-07-01 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Treatment with immune effector cells engineered to express an antigen receptor
US20240238418A1 (en) * 2021-05-07 2024-07-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. Car t cell therapy method
TW202307210A (zh) 2021-06-01 2023-02-16 瑞士商諾華公司 Ｃｄ１９和ｃｄ２２嵌合抗原受體及其用途
US20250339533A1 (en) * 2021-06-08 2025-11-06 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Agents and methods for activation and targeting of immune effector cells
CN113687085A (zh) * 2021-08-27 2021-11-23 复旦大学附属中山医院 一种评估实体肿瘤Claudin18.2蛋白表达的方法和应用
WO2024046572A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 BioNTech SE Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6 expressing cancer
JP2024545154A (ja) 2021-12-09 2024-12-05 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア Ｃｌｄｎ６発現がんの処置のためのキメラ抗原受容体改変細胞
JP2024015870A (ja) * 2022-07-25 2024-02-06 株式会社東芝 Ｃａｒ－ｔ細胞を作製する方法、ｃａｒ－ｔ細胞作製用キット及びｃａｒ－ｔ細胞含有率を向上させる方法
WO2025206323A1 (ja) * 2024-03-29 2025-10-02 国立大学法人大阪大学 細胞治療
JP2026046749A (ja) * 2024-09-03 2026-03-13 株式会社東芝 Ｃａｒ－ｔ細胞の増殖方法、並びに、該方法に使用する脂質粒子及びキット

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CN103736086A (zh) 2007-02-15 2014-04-23 曼康公司 用于增强t细胞应答的方法
EP2221375A1 (en) * 2009-02-20 2010-08-25 Ganymed Pharmaceuticals AG Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer
JP2010265327A (ja) * 2010-08-25 2010-11-25 Hokkaido Univ 癌抗原非特異的な標的化ｔ細胞の製造方法及び医薬
PH12013501201A1 (en) * 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
PL3892295T3 (pl) 2011-05-24 2023-07-24 BioNTech SE Zindywidualizowane szczepionki przeciwnowotworowe
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
WO2014055442A2 (en) * 2012-10-01 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
US9657105B2 (en) * 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
WO2015014869A1 (en) 2013-07-30 2015-02-05 Biontech Ag Tumor antigens for determining cancer therapy
US20160367651A1 (en) 2013-10-01 2016-12-22 Mie University T cell inducing vaccine containing an interepitope sequence that promotes antigen presentation
ES2738582T3 (es) * 2014-02-14 2020-01-23 Immune Design Corp Inmunoterapia del cáncer a través de combinación de inmunoestimulación local y sistémica
PT3514172T (pt) * 2014-04-01 2020-04-21 Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh Imunorrecetores específicos de claudina-6 e epítopos de células t
WO2016180467A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination

Also Published As

Publication number Publication date
US20180140634A1 (en) 2018-05-24
WO2016180467A1 (en) 2016-11-17
US12186275B2 (en) 2025-01-07
AU2016259726A1 (en) 2017-11-23
AU2023219951A1 (en) 2023-09-14
CN107743399B (zh) 2022-03-15
HK1247098A1 (zh) 2018-09-21
US20200360438A1 (en) 2020-11-19
CN107743399A (zh) 2018-02-27
MX2023012263A (es) 2023-10-24
SMT202300257T1 (it) 2023-09-06
CA2985156A1 (en) 2016-11-17
HUE062646T2 (hu) 2023-11-28
US10799534B2 (en) 2020-10-13
DK3294325T3 (da) 2023-08-21
ES2952421T3 (es) 2023-10-31
EP3294325A1 (en) 2018-03-21
EP3294325B1 (en) 2023-07-26
LT3294325T (lt) 2023-09-11
BR112017023478A2 (pt) 2018-07-24
FI3294325T3 (fi) 2023-08-15
JP2018515518A (ja) 2018-06-14
EP4273160A3 (en) 2024-04-24
PT3294325T (pt) 2023-08-18
HK1250330A1 (en) 2018-12-14
DK3294325T5 (da) 2024-10-07
WO2016180778A1 (en) 2016-11-17
MX2017014346A (es) 2018-04-11
KR20180027414A (ko) 2018-03-14
AU2016259726B2 (en) 2020-02-27
KR102771195B1 (ko) 2025-02-25
NZ736949A (en) 2025-02-28
AU2020203129B2 (en) 2023-06-01
NZ775829A (en) 2025-02-28
HRP20230902T1 (hr) 2023-11-24
CN114533865A (zh) 2022-05-27
JP6914851B2 (ja) 2021-08-04
SI3294325T1 (sl) 2023-10-30
PL3294325T3 (pl) 2023-10-02
EP4273160A2 (en) 2023-11-08
MX2023012264A (es) 2023-10-24
AU2020203129A1 (en) 2020-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12186275B2 (en) Enhancing the effect of CAR-engineered T cells by means of nucleic acid vaccination
US20230119334A1 (en) Antigen receptors and uses thereof
JP2015509716A (ja) 第二世代キメラ抗原受容体におけるｃｄ２シグナル伝達ドメインの使用
KR102396925B1 (ko) 항원 수용체 및 이의 용도
HK40103250A (en) Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination
HK40072989A (en) Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination
HK1250330B (en) Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination
RU2792042C2 (ru) Антигенные рецепторы и их применения
HK1247098B (en) Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination
HK40018015A (en) Antigen receptors and uses thereof
HK1259455B (en) Antigen receptors and uses thereof