ES2952428T3 - Heparina biosintética - Google Patents
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Abstract
La presente divulgación se refiere a la síntesis de heparina, que puede ser bioequivalente a la heparina sódica USP porcina. La síntesis puede implicar tres intermediarios a partir del heparosano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Heparina biosintética
Solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud provisional estadounidense n.° 62/384.341 presentada el 7 de septiembre de 2016.
Campo
La presente divulgación se refiere en general a un campo de la química de polisacáridos y, más particularmente, a la heparina biosintética, que puede ser bioequivalente a la heparina USP porcina; a métodos para elaborar la heparina biosintética; a productos intermedios, que pueden usarse en los métodos de elaboración; y a métodos de uso de la heparina biosintética.
Sumario
Una realización es un glicosaminoglicano que comprende una cantidad de grupo disacárido N-sulfatado (NS), cantidad que es eficaz para producir una heparina biosintética. La cantidad del grupo disacárido del grupo NS puede ser del 78-99 % o del 81-97 % o del 83-95 % o del 85-93 %.
Otra realización es un glicosaminoglicano que comprende una cantidad de grupo disacárido N-sulfatado, 2-sulfatado (NS2S), cantidad que es eficaz para producir una heparina biosintética. La cantidad del grupo disacárido NS2S puede ser del 44-80 % o del 50-78 % o del 55-77 % o del 60-76 %.
Aún otra realización es un glicosaminoglicano que comprende cantidades de grupo disacárido N-sulfatado, 2-sulfatado, 6-sulfatado (NS2S6S) y grupo disacárido N-sulfatado, 6-sulfatado (NS6S), en el que las cantidades son eficaces para producir una heparina biosintética. Las cantidades respectivas del grupo NS6S y los grupos disacáridos Ns2s6S pueden ser del 6-40 % de grupo NS6S y del 31-73 % de grupo NS2S6S; del 6-32 % de grupo NS6S y del 36-70 % de grupo NS2S6S; del 6-26 % de grupo NS6S y del 40-67 % de grupo NS2S6S; o del 6-22 % de grupo NS6S y del 43-64 % de grupo NS2S6S.
Aún otra realización es un método para producir una heparina biosintética, que comprende: a. obtener un glicosaminoglicano que comprende el 31-73 % de grupo disacárido NS2S6S, el 6-40 % de grupo disacárido NS6S, el 0-27 % de grupo NS2S y el 1-22 % de grupo NS; y b. tratar el glicosaminoglicano con una enzima, que es la isoforma 1 de 3-O-sulfotransferasa (3OST-1), en presencia de un donante de sulfato para producir un lote de heparina biosintética.
Aún otra realización es un método para elaborar un segundo producto intermedio de glicosaminoglicano que comprende el 44-80 % de grupo NS2S y el 13-39 % de grupo NS. El método puede comprender a. convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir un primer glicosaminoglicano que comprende el 78-99 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS), en el que la cantidad de residuos de N-acetil glucosamina convertidos corresponde a la cantidad del grupo NS en el primer producto intermedio de glicosaminoglicano; y b. tratar el primer producto intermedio de glicosaminoglicano con dos enzimas, que son C5-epimerasa (C5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST), en presencia de un donante de sulfato para producir el segundo producto intermedio de glicosaminoglicano.
Y aún otra realización es un método para elaborar un tercer producto intermedio de glicosaminoglicano que comprende el 31-73 % de grupo disacárido NS2S6S, el 6-40 % de grupo disacárido NS6S, el 0-27 % de grupo NS2S y el 1-22 % de grupo NS. El método puede comprender el tratamiento de un segundo producto intermedio de glicosaminoglicano que comprende el 44-80 % de grupo NS2S y el 13-39 % de grupo NS con una enzima, que son las isoformas 1 y/o 3 de la 6-O-sulfotransferasa (6OST-1/3), en presencia de un donante de sulfato para convertir el segundo producto intermedio de glicosaminoglicano en el tercer producto intermedio de glicosaminoglicano.
Figuras
La figura 1 muestra esquemáticamente la ruta desde heparosano hasta heparina biosintética (BSH), que puede ser bioequivalente a heparina USP porcina.
La figura 2 ilustra esquemáticamente métodos para el análisis de productos intermedios y heparina biosintética, que puede ser bioequivalente a heparina USP porcina.
La figura 3 muestra espectros de 1D 1H-RMN para heparosano, productos intermedios de NS, NS2S, NS6S, NS2S6S, heparina biosintética, que puede ser bioequivalente a heparina USP porcina y heparina USP porcina.
La figura 4 muestra intervalos de composición a modo de ejemplo de estructuras intermedias de heparina biosintética, que pueden proporcionar propiedades equivalentes a las de la heparina USP porcina.
Descripción detallada
La heparina se usa ampliamente como anticoagulante, tanto en disolución como en dispositivos implantados. Generalmente, la síntesis química de heparina se considera inviable, por lo que la heparina de calidad farmacéutica se ha derivado de una variedad de tejidos animales a lo largo de la historia de producción de heparina. Pero la dependencia de fuentes animales plantea problemas para el control de calidad y el suministro.
La principal fuente de heparina es el intestino porcino, pero también están disponibles la heparina pulmonar e intestinal bovina y la heparina intestinal ovina. La calidad del producto puede variar según los factores ambientales y las subespecies animales, lo que da lugar a dificultades adicionales para la regulación de medicamentos. Las serias preocupaciones sobre las enfermedades priónicas tales como encefalopatía espongiforme bovina (EEB, “enfermedad de las vacas locas”), que provoca la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en los humanos, y el prión de la tembladera en las ovejas, han llevado a una disminución en el uso de tejidos bovinos y ovinos como fuente de heparina.
En 2008, se introdujo un sulfato de condroitina sobresulfatado (OSCS) en la heparina producida a partir de cerdos en China, lo que provocó la muerte de casi 100 estadounidenses y una marcada reducción del suministro de heparina. Esta adulteración deliberada fue muy difícil de detectar ya que la cadena de suministro de tejidos para la heparina en los mataderos carece de supervisión de buenas prácticas de fabricación actuales (BPFa).
Más recientemente, se ha sospechado de la mezcla de heparina obtenida de diferentes especies animales. La heparina pulmonar bovina, la heparina intestinal bovina, la heparina intestinal ovina y la heparina intestinal porcina pueden distinguirse entre sí por su diferente distribución de variantes estructurales del sitio de unión del pentasacárido de antitrombina, así como por diferencias en sus composiciones de disacáridos. Sin embargo, es muy difícil detectar la presencia de pequeñas cantidades de heparina intestinal bovina o heparina intestinal ovina en un producto de heparina intestinal porcina, incluso usando los métodos analíticos actuales más avanzados.
El suministro también es un problema grave. A pesar de los 1200 millones o más de cerdos que se sacrifican cada año en todo el mundo, lo que genera 100 toneladas/año de heparina, es posible que los proveedores comerciales no puedan seguir el ritmo de la creciente demanda mundial, especialmente en los países en desarrollo. Un análisis reciente de participación de mercado mostró que la mayoría de la heparina en bruto proviene de China, que suministra aproximadamente el 57 % del mercado mundial. La susceptibilidad de las poblaciones animales a las enfermedades infecciosas, tales como las epidemias porcinas en China, la sobreexplotación o las preocupaciones ambientales pueden reducir drásticamente el suministro de animales a partir de los cuales puede prepararse la heparina. La escasez puntual de heparina ha llevado a considerar seriamente la reintroducción de la heparina bovina en el mercado estadounidense. Sin embargo, la heparina intestinal bovina no cumple con las especificaciones de heparina USP y esto limita su uso comercial. La aceptación de la heparina intestinal bovina también aumenta el riesgo de mezclar heparinas porcinas y bovinas, lo que es difícil de detectar y altera las propiedades del producto final.
En vista de la necesidad de fuentes alternativas y fiables de heparina bioequivalente, los investigadores han intentado sintetizar heparina a partir de heparosano. Una combinación de etapas químicas y enzimáticas dio un producto que se aproximaba a la heparina pero, hasta donde saben los inventores, la heparina biosintética sintetizada quimioenzimáticamente aún no ha cumplido con el criterio de la USP. Después de una investigación diligente en múltiples ejemplos de prueba, los presentes inventores han sintetizado heparina, que puede cumplir con todos los requisitos de la USP. Los inventores han dilucidado tres productos intermedios con características específicas que pueden ser necesarios para obtener tal heparina bioequivalente.
Definiciones
Para los efectos de la presente solicitud, los siguientes términos tienen las siguientes definiciones:
Tal como se usa en el presente documento, “un” o “uno/una” significa uno o más, a menos que se indique específicamente que significa solo uno.
“Aproximadamente” abarca expresamente la variación típica que el experto entiende que es equivalente a un valor establecido. Cuando se usa un valor numérico, “aproximadamente” abarca ± 20 % o ± 15 % o ± 10 % o ± 8 % o ± 7 % o ± 6 % o ± 5 % o ± 3 % o ± 2 % o ± 1 % del valor indicado.
Cuando se proporciona un % con respecto al contenido de disacáridos, generalmente se refiere al porcentaje mol/mol, a menos que se indique lo contrario.
Tal como se usa en el presente documento, BSH se refiere a heparina biosintética, es decir, heparina elaborada a
través de uno o más procedimientos químicos; un procedimiento enzimático; un procedimiento químico y enzimático combinado; procedimiento de cultivo de células microbianas y de mamíferos. En algunas realizaciones, la heparina biosintética puede comprender heparina que es bioequivalente a la heparina USP porcina, es decir, heparina sódica porcina, por ejemplo, “heparina bioequivalente”.
Tal como se usa en el presente documento, “heparina bioequivalente” (BEqH) es equivalente a la heparina sódica USP porcina en cuanto a niveles de actividad y distribución de peso molecular. En algunas realizaciones, la heparina bioequivalente puede contener grupos disacáridos NS, NS2S, NS6S y NS6S2S en cantidades equivalentes a la heparina USP porcina tal como se da a conocer en la tabla 2 a continuación.
Tal como se usa en el presente documento, el término “lote” puede referirse a una cantidad específica de un fármaco u otro material, tal como la heparina, que se pretende que tenga un carácter y una calidad uniformes, dentro de los límites especificados, y se produce según una única orden de fabricación durante el mismo ciclo de fabricación.
Heparina y heparosano
El heparosano es un grupo de polisacáridos de cadena lineal de longitud heterogénea con la unidad de disacárido de repetición [^4 ) ácido p-D-glucurónico (GlcA) (1^4) N-acetil-a-D-glucosamina (GlcNAc) (1^]n.
La heparina es un grupo heterogéneo de glicosaminoglicanos aniónicos de cadena lineal que tienen propiedades anticoagulantes. La heparina puede digerirse para dar grupos disacáridos distintivos (Yang, B., Chang, Y., Weyers, A. M., Sterner, E. y Linhardt, R. J. (2012) y el análisis se realiza mediante el método de cromatografía de líquidosespectrometría ultravioleta (CL-UV). (P. Mourier et al. Analytical Chemistry Research 3 (2015) 46-53). Los datos obtenidos del método de CL-UV son altamente comparables con el método de cromatografía de líquidosespectrometría de masas (CL-EM) usado convencionalmente. Después de la digestión con una mezcla de tres liasas de heparina, la heparina produce los siguientes disacáridos:
0S [AUA-GlcNAc]
NS: [AUA-GlcNS]
6S [AUA-GlcNAc6S]
2S [AUA2S-GlcNAc]
NS2S [AUA2S-GlcNS]
NS6S [AUA-GlcNS6S]
2S6S [AUA2S-GlcNAc6S]
TriS (NS2S6S) [AUA2S-GlcNS6S]
Donde AUA corresponde a ácido 4-desoxi-a-L-treo-hex-4-enopiranosil urónico. GlcN corresponde a D-glucosamina, Ac corresponde a acetilo y S corresponde a sulfo. En esta memoria descriptiva, el contenido de un disacárido puede calcularse basándose en el contenido total de los ocho disacáridos anteriores.
Debido a que la heparina y el heparosano y los derivados relacionados son moléculas complejas, también pueden caracterizarse según su peso molecular promedio en peso (Mw) y su distribución de peso molecular. La heparina puede caracterizarse además por su actividad anticoagulante.
La norma de la versión 39 (USP39) de la Farmacopea de Estados Unidos, “heparina sódica, USP”, requiere que la heparina tenga niveles específicos de actividad y distribuciones de peso molecular. Según la USP, la heparina tiene un peso promedio de 15.000-19.000 Da; el porcentaje de cadenas de heparina con peso molecular superior a 24.000 Da no es de más del 20 % del total; y la razón de cadenas con pesos moleculares de entre 8.000 y 16.000 Da con respecto a cadenas con pesos moleculares de entre 16.000 y 24.000 Da es de no menos de 1,0.
En la presente invención, la razón de cadenas con pesos moleculares de entre 8.000 y 16.000 Da con respecto a cadenas con pesos moleculares de entre 16.000 y 24.000 Da es de no menos de 1,0, preferiblemente entre 1,0 y 2,5, de 1,0 a 2,0, de 1,2 a 1,8, de 1,4-1,7, de 1,5 o 1,6. La potencia se determina mediante un ensayo biológico usando un patrón de referencia de la USP basándose en unidades de actividad de heparina por miligramo. Estas especificaciones requieren que la actividad anticoagulante de la heparina sobre el factor lia (es decir, anti-IIa) no sea de menos de 180 U/mg, y que la razón de actividad de factor Xa con respecto a factor lia (es decir, anti-Xa/anti-iia) esté entre 0,9 y 1.1.
La monografía USP actual (USP 39) para la heparina sódica porcina no tiene requisitos relacionados con la composición de disacáridos. Sin embargo, es lógico que las propiedades de la heparina se deriven de la estructura. Por tanto, los presentes inventores dilucidaron determinadas características estructurales de la heparina USP
porcina. La tabla 1 muestra el intervalo estadístico de los grupos de disacáridos derivados de la heparina USP porcina después del tratamiento con tres liasas de heparina. Se midieron un total de 15 lotes de heparina USP porcina. Se calcularon la media aritmética (media) y la desviación estándar (DE) de las muestras. La desviación estándar del error analítico se obtuvo basándose en los datos acumulados del presente inventor. Se aplicó la siguiente ecuación en la columna más a la izquierda de la tabla 1 para calcular el intervalo de cada disacárido. Tabla 1. Análisis de composición de lotes de heparina USP porcina y determinación de un intervalo objetivo para una heparina biosintética, que puede ser bioequivalente para heparina USP porcina.
Suponiendo que las 15 muestras de heparina sean representativas, 3 desviaciones estándar abarcan el 99,7 % de la variación esperada.
En algunas realizaciones, el contenido de cada disacárido en la heparina biosintética, que es bioequivalente a la heparina sódica USP porcina, está dentro de 3 desviaciones estándar de la media estimada derivada de la heparina USP, tal como se muestra en la tabla 1 anterior y se proporciona en la tabla 2.
Tabla 2. Composición de las heparinas USP porcinas dentro de la variabilidad de 3 desviaciones estándar.
En algunas realizaciones, el contenido de cada disacárido en la heparina biosintética está dentro de 2,5, 2,0, 1,5 ó 1,0 desviaciones estándar de la media estimada derivada de la heparina USP. En algunas realizaciones, el contenido de cada uno de los principales disacáridos, NS, NS6S, NS2S y TriS, está dentro de 3,0, 2,5, 2,0, 1,5 ó 1,0 desviaciones estándar de la media estimada respectiva derivada de la heparina USP.
Mulloy et al. “USP compendial methods for analysis of heparin: chromatographic determination of molecular weight distributions for heparin sodium” Anal Bioanal Chem (2014) 406:4815-4823, revisaron las distribuciones de tamaño de la heparina sódica USP porcina. Según la figura 3, las especies de 8-16 kDa eran como máximo del 55 %, y las especies de 16-24 kDa no eran de menos del 25 %. Por tanto, la razón 18-16/16-24 fue de 2,2 (es decir, 55/25) en este estudio.
Síntesis de heparina a partir de heparosano
El heparosano es un polisacárido con la unidad de disacárido de repetición [^4 ) ácido p-D-glucurónico (GlcA) (1^4) N-acetil-a-D-glucosamina (GlcNAc) (1^-]n. El heparosano se biosintetiza como una cápsula de polisacárido en bacterias que incluyen Escherichia coli y Pasteurella multicida. Lindahl U et al. (1998) “Regulated diversity of heparan sulfate” J Biol Chem 273(39):24979-24982. Los estudios a escala de laboratorio han demostrado que el heparosano con un peso molecular promedio en peso (Mw) > 10.000, obtenido de la cepa K5 de E. coli puede convertirse quimioenzimáticamente en un polisacárido anticoagulante denominado neoheparina, que no es bioequivalente a la heparina sódica USP porcina. Lindahl et al. (2005) J Med Chem 48 (2): 349-352; Zhang et al.
(2008) Journal of the American Chemical Society 130 (39): 12998-13007; patente estadounidense n.° 6.162.797; documento US 2014/0349962.
Las siguientes referencias describen heparinas biosintéticas, que no son bioequivalentes a la heparina sódica USP porcina. Ninguna describe la producción de los productos intermedios que tienen las propiedades descritas en el presente documento, ni la heparina producida es bioequivalente a la heparina USP porcina. Cuando se informa, el contenido de disacáridos de tales heparinas no está dentro de 1, 2 ó 3 desviaciones estándar de la media estimada derivada de la heparina USP porcina, ni ningún producto intermedio es coherente con los productos intermedios requeridos para la heparina bioequivalente.
Otras diferencias entre la presente invención y la técnica anterior incluyen, entre otras, el tercer producto intermedio NS2S6S, también denominado TriS. Determinados métodos anteriores que usan métodos químicos de sulfatación no pueden producir un producto intermedio NS2S6S que carezca del disacárido 3S. Determinados métodos quimioenzimáticos no controlaron el contenido del grupo disacárido principal en cada etapa quimioenzimática de manera suficiente para obtener el producto intermedio NS2S6S.
En Bhaskar, U. et al. (2015). Carbohydrate Polymers, 122, 399-407, las principales composiciones de disacáridos tales como NS6S, NS2S, NS2S6S del producto intermedio pre-3OST son del 7,8, del 15,7 y del 67,9 % (p/p), respectivamente. La “heparina” resultante no es bioequivalente a la heparina USP porcina, y la composición de disacáridos del producto intermedio pre-3OST en esta referencia es diferente del tercer producto intermedio NS2S6S/TriS requerido para la heparina bioequivalente. La actividad anti-IIa más alta notificada para la “heparina” preparada en esta referencia fue de 151 U/mg, que es de menos de las 180 U/mg requeridas, por lo que no es equivalente a la heparina USP porcina. Además, el peso molecular del producto preparado por Bhaskar et al. fue >25.000 Dal.
En Zhang, Z., et al (2008) Journal of the American Chemical Society, 130(39), 12998-13007, la “heparina”, un homólogo del tercer producto intermedio NS2S6S, no contiene el grupo N-acetilo que representa 0S, 2S, 6S y 2S6S. La “heparina” resultante no es bioequivalente a la heparina USP porcina, y los disacáridos del producto intermedio pre-3OST en esta referencia no pueden cumplir con los requisitos del tercer producto intermedio NS2S6S requerido para la heparina bioequivalente. Se determinó que la actividad de esta heparina era de 180 U/mg mediante el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) basado en coágulos. Este ensayo no es equivalente a la actividad anti-IIa descrita en la USP actual, por lo que no está claro si cumpliría con las especificaciones de actividad para la heparina USP porcina. Además, en este estudio no se realizó ningún ensayo anti-Xa, por lo que no se define una razón anti-Xa/anti-IIa de esta “heparina”. En resumen, en ausencia de un grupo N-acetilo y sin actividades anti-IIa y anti-Xa definidas, esta heparina no es bioequivalente a la heparina USP porcina.
J Med Chem 48 (2): 349-352 (2005), muestra una molécula de “neoheparina” con un peso molecular de aproximadamente 8.000; anti-Xa 162; anti-IIa 62; anti-Xa/anti IIa 2.6, es decir, no bioequivalente. Teniendo en cuenta la diferencia de peso molecular y actividad anticoagulante de la reacción posterior a 3OST en el procedimiento quimioenzimático entre la neoheparina y la heparina bioequivalente, el producto intermedio pre-3OST de neoheparina es diferente al tercer producto intermedio NS2S6S requerido para la heparina bioequivalente.
La patente estadounidense n.° 6.162.797 proporciona un derivado de heparina obtenido por sulfatación química por etapas de heparosano N-desacetilado y N-sulfatado epimerizado. Sin embargo, este derivado tiene anti-Xa 500-600, anti-IIa 250-320 (aunque en la memoria descriptiva se usó “APTT” en lugar de anti-IIa, y es muy probable que “APTT” debería haber sido anti-IIa), es decir, no bioequivalente. De ello se deduce que este documento no enseña ni sugiere un producto intermedio equivalente al tercer producto intermedio NS2S6S requerido para la heparina bioequivalente. Esta patente tampoco enseña el primer producto intermedio (NS) o el segundo producto intermedio divulgado a continuación.
El documento US 2014/0349962 A1 muestra un derivado de heparina, “mitrina”, obtenido por funcionalización quimioenzimática de heparosano. La “mitrina” es un hexasacárido libre del grupo ácido idurónico sulfatado en 2-O con mayor actividad anti-Xa que la heparina estadounidense. Por tanto, este documento no enseña ni sugiere el segundo producto intermedio (NS2S) o un producto intermedio equivalente al tercer producto intermedio (NS2S6S). Por tanto, mientras que las “heparinas biosintéticas” descritas en las referencias anteriores comparten algunas propiedades con la heparina USP porcina, no son químicamente equivalentes o bioequivalentes a la heparina USP porcina. Las referencias anteriores tampoco enseñan ni sugieren qué factores faltan, qué etapas modificar o cómo modificarlas, para elaborar heparina biosintética. Los productos intermedios biosintéticos de heparina descritos en el presente documento no se encuentran en los productos intermedios de producción de heparina in vivo. En particular, los productos intermedios de heparina natural se unen a un ligador de proteoglicano, (Sugahara K, Kitagawa H. (2002) Heparin and heparan sulfate biosynthesis. IUBMB Life, 54(4): 163-75), y por tanto, no existen en forma libre con las especificaciones dadas en la presente invención. Por tanto, la heparina biosintética no es un producto natural.
Los presentes inventores han generado heparina biosintética, que puede ser bioequivalente a la heparina USP
porcina. Los inventores han elucidado tres productos intermedios, que pueden ser esenciales para la síntesis de heparina, que es bioequivalente a la heparina USP porcina, a través de procedimientos quimioenzimáticos a partir de heparosano. Estos productos intermedios, que se marcan a continuación según sus grupos disacáridos dominantes como un producto intermedio NS, un producto intermedio NS2S y un producto intermedio NS2S6S (o un producto intermedio TriS), se caracterizan por intervalos específicos de especies de azúcar modificadas, tales como grupos disacáridos. Pueden caracterizarse además por sus propiedades y distribuciones de pesos moleculares. Estos productos intermedios pueden no tener actividades anticoagulantes mediadas por antitrombina.
La presente divulgación se refiere a la síntesis de heparina biosintética a partir de heparosano, tal como la derivada del heparosano exopolisacárido bacteriano, y la dilucidación de las propiedades de los productos intermedios clave, que pueden ser necesarios para obtener heparina bioequivalente. En algunas realizaciones, la heparina biosintética puede cumplir con los requisitos de actividad de la Farmacopea de EE.UU. (USP), específicamente la actividad anticoagulante de la heparina sobre el factor IIa (es decir, anti-IIa) de no menos o más de 180 U/mg, y la razón de actividad de factor Xa con respecto a factor IIa (es decir, anti-Xa/anti-IIa) está entre 0,85-1,15 ó 0,9 y 1,1 o de aproximadamente 1,0. La heparina biosintética también puede cumplir con los requisitos de la distribución del peso molecular de la USP: un peso promedio de 15.000-19.000 Da; el porcentaje de cadenas de heparina con un peso molecular superior a 24.000 Da no es de más del 20 % del total (incluyendo en el presente documento del 0-15 %, del 0-10 % y del 5-10 %); y la razón de cadenas con pesos moleculares de entre 8.000 y 16.000 Da con respecto a cadenas con pesos moleculares de entre 16.000 y 24.000 Da es de no menos de 1,0 (incluyendo en el presente documento entre 1,0 y 2,5; de 1,0 a 2,0, de 1,2 a 1,8, de 1,4-1,7, de 1,5 o 1,6). Por tanto, la heparina biosintética puede ser bioequivalente a la heparina USP porcina.
En una realización, el primer producto intermedio NS puede ser un material glicosaminoglicano que comprende una cantidad eficaz de grupos disacáridos N-sulfatados (NS). Por ejemplo, los grupos disacáridos N-sulfatados (NS) pueden constituir del 78-99,5 % o del 78-99 % o del 81-97 % o del 83-95 % o del 84-94 % o del 85-93 % o del 84-87 % o del 85-86 % o del 87,5-94 % o del 90-93,5 % o del 90,5-93 % o del 90,3-91,3 % o del 92,2-93,2 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos del primer producto intermedio NS. En algunas realizaciones relacionadas, el resto del primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar. En todos los casos, el NS debe contener algunos grupos NAc medibles.
Las propiedades de peso molecular del primer producto intermedio pueden ser apropiadas para formar una heparina biosintética que pueda cumplir con las especificaciones de peso molecular para la heparina sódica USP porcina usando, por ejemplo, uno de los métodos divulgados a continuación.
En algunas realizaciones, el primer producto intermedio NS es un material glucosaminoglicano que comprende el 84.7- 93,8 % en peso de grupos disacáridos N-sulfatados (NS). En realizaciones relacionadas, el resto es un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar.
En algunas realizaciones, el primer producto intermedio NS puede incluir del 83,4-87,4 % o del 83,9-86,9 t % o del 84,4-86,4 % o del 84,9-85,9 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS. El resto de tal primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar.
En algunas realizaciones, el primer producto intermedio NS puede incluir del 87,9 % al 92,9 % o del 88,4 % al 92,4 % o del 88,9 % al 91,9 % o del 89,4 % al 91,4 % o del 89,9 % al 90,9 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS. El resto de tal primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar.
En algunas realizaciones, el primer producto intermedio NS puede incluir del 88,8-94,7 % o del 89,3 %-94,2 % o del 89.8- 93,7 % o del 90,3 %-93,2 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS. El resto de tal primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar.
En algunas realizaciones, el primer producto intermedio NS puede incluir del 88,8-92,8 % o del 89,3-92,3 % o del 89.8- 91,8 % o del 90,3-91,3 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS. El resto de tal primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar.
En algunas realizaciones, el primer producto intermedio puede incluir del 90,1-94,7 % o del 90,6-94,2 % o del 91,1 %-93,7 % o del 91,6 %-93,2 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS. El resto de tal primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar.
Otra realización puede ser un segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano, que puede ser un material de glicosaminoglicano que comprende una cantidad eficaz de grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado (NS2S). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado (NS2S) puede constituir el 4480 % o el 45-79 % o el 50-78 % o el 50-77 % o el 55-78 % o el 55-76 % o el 58-77 % o el 59-76 % o el 60-75 % o el 58-62 % o el 59-61 % o el 65-77 % cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos del segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano.
El segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano también puede comprender un grupo disacárido NS además del grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado (NS2S). Por ejemplo, el grupo disacárido NS puede constituir el 12-40 % o el 13-39 % o el 15-34 % o el 15-29 % o el 16-29 % o el 16-26 % o el 17-25 % o el 16-18 % o el 19-26 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos del segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano. Cada uno de los intervalos para el grupo disacárido NS puede usarse con cada uno de los intervalos anteriores para el grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado (NS2S).
Además del grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado (NS2S) y el grupo disacárido NS, el segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano también puede incluir uno o más grupos disacáridos de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menores sin modificar y grupo disacárido NAc (2S) 2-O-sulfatado. En determinadas realizaciones, los únicos componentes del segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano distintos del grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado (NS2S) y el grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado (NS2S) pueden ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar y/o grupo disacárido (2S) NAc 2-O-sulfatado. En algunas realizaciones, la cantidad combinada de grupos disacáridos 0S y 2S puede ser del 0,4-25 % o del 4-24 % o del 5-24 % o del 6-20 % o del 6-18 % o del 6-16 % o del 7-23 % o del 7-20 % o del 7-17 % o del 7-15 % del segundo producto intermedio NS2S.
Las propiedades de peso molecular del segundo producto intermedio pueden ser apropiadas para formar una heparina biosintética que pueda cumplir con las especificaciones de peso molecular para la heparina sódica USP porcina usando, por ejemplo, uno de los métodos divulgados a continuación.
En algunas realizaciones, el segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender del 73,8 75,3 % en peso de grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado (NS2S) y del 18,5-20,2 % en peso de grupo disacárido NS. El resto del segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender, o consistir en un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar y un grupo disacárido NAc (2S) 2-O-sulfatado.
En algunas realizaciones, el segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender del 57,5 62,5 % o del 58-62 % o del 58,5-61,5 % o del 59-61 % o del 59,5-60,5 % o un valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS2S. Además, el segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender del 23,2-27,2 % o del 23,7-26,7 % o del 24,2-26,2 % o del 24,7-25,7 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS. El resto del segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender, o consistir en un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar y/o un grupo disacárido NAc (2S) 2-O-sulfatado. La cantidad combinada de grupos 0S y 2S puede constituir desde el 13,3-16,3 % o del 13,8-15,8 % o del 14,3-15,3 % del segundo producto intermedio.
En algunas realizaciones, el segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender del 65,8 77,4 % o del 66,3-76,9 % o del 66,8-76,4 % o del 67,3-75,9 % o un valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS2S. Además, el segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender del 14,8-26 % o del 15,3-25,5 % o del 15,8-25 % o del 16,3-24,5 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS. El resto del segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender, o consistir en un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar y/o un grupo disacárido NAc (2S) 2-O-sulfatado. La cantidad combinada de grupos 0S y 2S puede constituir desde el 5,6 10,8 % o del 6,1-10,3 % o del 6,6-9,8 % del segundo producto intermedio.
En algunas realizaciones, el segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender del 65,8 74,4 % o del 66,3-73,9 % o del 66,8-73,4 % o del 67,3-72,9 % o un valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS2S. Además, el segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender del 17,9-26 % o del 18,4-25,5 % o del 18,9-25 % o del 19,4-24,5 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS. El resto del segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender, o consistir en un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar y/o un grupo disacárido NAc (2S) 2-O-sulfatado. La cantidad combinada de grupos 0S y 2S puede constituir desde el 5,6 10,8 % o del 6,1-10,3 % o del 6,6-9,8 % del segundo producto intermedio.
En algunas realizaciones, el segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender del 73,4 77,4 % o del 73,9-76,9 % o del 74,4-76,4 % o del 74,9-75,9 % o un valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS2S. Además, el segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender del 14,8-18,8 % o del 15,3-18,3 % o del 15,8-17,8 % o del 16,3-17,3 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos de grupos disacáridos NS. El resto del segundo producto intermedio NS2S de glicosaminoglicano puede comprender, o consistir en un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar y/o un grupo disacárido NAc (2S) 2-O-sulfatado. La cantidad combinada de grupos 0S y 2S puede constituir desde el 5,8-9,8 % o del 6,3-9,3 % o del 6,8-8,8 % del segundo producto intermedio.
El segundo producto intermedio puede ser apropiado para formar heparina con requisitos de tamaño y actividad coherentes con la heparina USP porcina. En otras palabras, el segundo producto intermedio puede ser tal que puede formarse heparina con requisitos de tamaño y actividad coherentes con la heparina sódica USP porcina usando, por ejemplo, uno de los métodos divulgados a continuación. Por ejemplo, el segundo producto intermedio puede tener un peso molecular promedio en peso apropiado para formar un producto final de heparina con requisitos de tamaño y actividad coherentes con la heparina sódica USP porcina. La cantidad eficaz de grupos disacáridos N-sulfatados, 2-O-sulfatados (NS2S) en el segundo producto intermedio puede ser tal que puede formarse heparina con requisitos de tamaño y actividad coherentes con la heparina sódica USP porcina usando, por ejemplo, uno de los métodos divulgados a continuación.
Otra realización es un tercer producto intermedio NS2S6S de glicosaminoglicano que puede ser un material de glicosaminoglicano que comprende cantidades eficaces de grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado, 6-O-sulfatado (NS2S6S o también conocido como TriS) y grupo disacárido N-sulfatado, 6-O-sulfatado (NS6S). Por ejemplo, el grupo disacárido NS2S6S puede constituir el 30-74 % o el 31-73 % o el 36-70 % o el 40-67 % o el 40 66 % o el 42-65 % o el 44-64 % o el 42-45 % o el 48-65 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos del tercer producto intermedio NS2S6S de glicosaminoglicano. El grupo disacárido NS6S puede constituir el 5-40 % o el 5-32 % o el 5-26 % o el 5-23 % o el 5-7 % o el 8-16 % o el 18-23 % o el 6-69 % o el 6-32 % o el 6-26 % o 6-21 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos del tercer producto intermedio NS2S6S de glicosaminoglicano. Cada uno de los intervalos para el grupo disacárido NS6S puede usarse con cada uno de los intervalos anteriores para el grupo disacárido NS2S6S.
Preferiblemente, el tercer producto intermedio NS2S6S de glicosaminoglicano no contiene grupos disacáridos 3S. Además de los grupos disacáridos NS2S6S y NS6S, el tercer producto intermedio NS2S6S de glicosaminoglicano también puede comprender un grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado (NS2S) y/o un grupo disacárido NS. El grupo disacárido NS2S puede constituir el 1-28 % o el 1-27 % o el 4-28 % o el 8-28 % o el 10-28 % o el 11-28 % o el 12-27 % o el 11-22 % o el 19-27 % o el 3-23 % o el 5-19 % o el 7-16 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos del tercer producto intermedio NS2S6S de glicosaminoglicano. El grupo disacárido NS puede constituir el 0,5-23 % o el 0,5-20 % o el 0,5-19 % o el 0,5-18 % o el 0,5-17 % o el 1-21% o el 1-19 % o el 1-18 % o el 1-17 % o el 1-15 % o cualquier valor o subintervalo dentro de estos intervalos del tercer producto intermedio NS2S6S de glicosaminoglicano.
Además de los grupos disacáridos NS2S6S, NS6S, NS2S y NS, el tercer producto intermedio NS2S6S de glicosaminoglicano puede comprender uno o más de grupos disacáridos 0S, 2S, 6-O-sulfatados, NAc (6S) y 2-O-sulfatados, 6-O-sulfatados, NAc (2S6S). En determinadas realizaciones, los únicos componentes del tercer producto intermedio NS2S6S de glicosaminoglicano pueden ser (a) 0S; (b) 6S; (c) 2S; y/o (d) 2S6S. La cantidad total de (a) 0S; (b) 6S; (c) 2S; y/o (d) 2S6S en el tercer producto intermedio NS2S6S de glicosaminoglicano puede ser, por ejemplo, del 28 % o menos o del 27 % o menos o del 23 % o del 19 % o del 16 %. En algunas realizaciones, la cantidad combinada de (a) 0S; (b) 6S; (c) 2S; y (d) 2S6S en el tercer producto intermedio NS2S6S de glicosaminoglicano puede ser del 0,5-28 % o del 1-27 % o del 2-24 % o del 3-23 % o del 4-20 % o del 5-19 % o del 8-17 % o del 7-16 % o cualquier valor o subintervalos dentro de estos intervalos.
En algunas realizaciones, el tercer producto intermedio puede comprender el 57,4-62,0 % en peso (el 53,3-59,4 % en moles) de grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado, 6-O-sulfatado (NS2S6S o también conocido como TriS), el 17,7-22,2 % en peso (10,6-15,1 % en mol) de grupo disacárido N-sulfatado, 6-O-sulfatado (NS6S), el 8,4-10,9 % en peso (12,0-13,8 % en mol) de grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado (NS2S) y el 3,1-8,1 % en peso (5,0 12,2 % en mol) de grupo disacárido NS. En realizaciones relacionadas, el resto puede comprender o consistir en grupos disacáridos 0S, 2S, 6-O-sulfatados, NAc (6S) y 2-O-sulfatados, 6-O-sulfatados, NAc (2S6S). En una realización adicional, el tercer producto intermedio (NS2S6S) comprende no más del 10 % en peso del total de secuencias de disacáridos menores seleccionadas de (a) 0S; (b) 6S; (c) 2S; y/o (d) 2S6S. Preferiblemente, tal tercer producto intermedio no contiene grupos disacáridos 3S.
En algunas realizaciones, el tercer producto intermedio puede comprender el 41,5-45,5 % o el 42-45 % o el 42,5 44,5 % o el 43-44 % de grupo disacárido NS2S6S, el 8,5-12,5 % o el 9-12 % o el 9,5-11,5 % el 10-11 % de grupo disacárido NS6S, el 12-15 % o el 12,5-14,5 % o el 13-14 % de grupo disacárido NS2S y el 14,6-18,6 % o el 15,1 18,1 % o el 15,6-17,6 % o el 16,1-17,1 % de grupo disacárido NS. El resto puede comprender o consistir en uno o más de 0S; (b) 6S; (c) 2S; y (d) 2S6S. La cantidad combinada de los grupos 0S, 6S, 2S y/o 2S6S en el tercer producto intermedio puede constituir el 14,4-17,4 % o el 14,9-16,9 % o el 15,4-16,4 % del tercer producto intermedio. Preferiblemente, tal tercer producto intermedio no contiene grupos disacáridos 3S.
En algunas realizaciones, el tercer producto intermedio puede comprender el 51,3-60,3 % o el 51,8-59,8 % o el 52,3 59,3 % o el 52,8-58,8 % de grupo disacárido NS2S6S, el 8,6-13,5 % o el 9,1-13 % o el 9,6-12,5 % o el 10,1-12 % de grupo disacárido NS6S, el 10-15,8 % o el 10,5-15,3 % o el 11-14,8 % o el 11,5-14,3 % de grupo disacárido NS2S y el 7,4-15,2 % o el 7,9-14,7 % o el 8,4-14,2 % o el 8,9-13,7 % o el 8,9-9,9 % o el 11,7-13,7 % de grupo disacárido NS. El resto puede comprender o consistir en uno o más de 0S; (b) 6S; (c) 2S; y (d) 2S6S. En algunas realizaciones, los
grupos 2S6S pueden no estar presentes en el tercer producto intermedio. La cantidad combinada de los grupos 0S, 6S, 2S y/o 2S6S en el tercer producto intermedio puede constituir del 7,3-11,6 % o del 7,8-11,1 % o del 8,3-10,6 % del tercer producto intermedio. Preferiblemente, tal tercer producto intermedio no contiene grupos disacáridos 3S. En algunas realizaciones, el tercer producto intermedio puede comprender el 41,5-65,7 % o el 42-65,2 % o el 42,5 %-64,7 % o el 43-64,2 % de grupo disacárido NS2S6S, el 4,1-23,3 % o el 4,6-22,8 % o el 5,1 %-22,3 % o el 5,6-21,8 % de grupo disacárido NS6S, el 10-28,6 %, el 10,5-28,1 % o el 11-27,6 % o el 11,5-27,1 % o el 11,1-17,8 % o el 19-27,6 % de grupo disacárido NS2S y 0,4-15,9 % o 0,7-15,4 % o 1-14,9 % o 1-14,4 % o 0,4-5,5 % o 10,2 14,9 % de grupo disacárido NS. El resto puede comprender o consistir en uno o más de 0S; (b) 6S; (c) 2S; y (d) 2S6S. En algunas realizaciones, los grupos 2S6S pueden no estar presentes en el tercer producto intermedio. La cantidad combinada de los grupos 0S, 6s , 2S y/o 2S6S en el tercer producto intermedio puede constituir del 5,3 9,7 % o del 5,8-9,2 % o del 6,3-8,7 % del tercer producto intermedio. Preferiblemente, tal tercer producto intermedio no contiene grupos disacáridos 3S.
Las propiedades de peso molecular del tercer producto intermedio pueden ser apropiadas para formar una heparina biosintética que pueda cumplir con las especificaciones de peso molecular para la heparina USP porcina usando, por ejemplo, uno de los métodos divulgados a continuación.
El tercer producto intermedio puede ser apropiado para formar heparina con requisitos de tamaño y actividad coherentes con la heparina USP porcina. En otras palabras, el tercer producto intermedio puede ser tal que puede formarse heparina con requisitos de tamaño y actividad coherentes con la heparina USP porcina. Por ejemplo, el tercer producto intermedio puede tener un peso molecular promedio en peso apropiado para formar un producto de heparina final con requisitos de tamaño y actividad coherentes con la heparina USP porcina. En otras palabras, el tercer producto intermedio puede ser tal que puede formarse heparina con requisitos de tamaño y actividad coherentes con la heparina USP porcina. Las cantidades eficaces de los grupos disacáridos NS2S6S y NS6S en el tercer producto intermedio pueden ser tales que puede formarse heparina con requisitos de tamaño y actividad coherentes con la heparina USP.
Puede ser posible que ninguno de los productos intermedios primero, segundo y tercero posea actividad anticoagulante. Ninguno de estos productos intermedios puede encontrarse en la naturaleza. Los presentes solicitantes han podido obtener heparina, que puede ser heparina USP bioequivalente con requisitos de tamaño y actividad coherentes con la heparina USP porcina usando los tres productos intermedios descritos anteriormente. También se proporcionan métodos para producir heparina, que puede ser bioequivalente a la heparina USP porcina. Una realización puede ser un método para producir heparina, que puede ser bioequivalente a la heparina USP porcina, a partir del tercer producto intermedio NS2S6S. En determinadas realizaciones, el método puede comprender:
(a) obtener un tercer producto intermedio NS2S6S de glicosaminoglicano tal como se divulgó anteriormente; y (b) tratar el tercer producto intermedio NS2S6S con la isoforma 1 de 3-O-sulfotransferasa (3OST-1) en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato (PAPS) para producir heparina, que puede ser bioequivalente a la heparina sódica USP porcina.
En algunas realizaciones, el tratamiento del tercer producto intermedio NS2S6S puede realizarse en presencia de un sistema de reciclaje de PAPS, que puede comprender p-nitrofenilsulfato (PNPS) y PAPS. El sistema de reciclaje de PAPS puede comprender además un catalizador, tal como aril sulfotransferasa IV (AST-IV), que puede usarse para catalizar la conversión de PAP en PAPS usando p-nitrofenilsulfato (PNPS) como donante de sulfato con suficiente PNPS en la reacción basándose en la conversión molar del tercer producto intermedio NS2S6S por la enzima 3OST-1. En algunas realizaciones, el tratamiento puede realizarse sin un sistema de reciclaje de PAPS con suficiente PAPS en la reacción basándose en la conversión molar del tercer producto intermedio NS2S6S por la enzima 3OST-1. En algunas realizaciones, el tratamiento puede realizarse en un tampón de reacción de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) en presencia de la enzima 3OST-1. Pueden usarse otros tampones y concentraciones de tampones adecuados conocidos por los expertos en la técnica, tal como tampón de fosfato. Puede estar presente un donante de sulfato, como PAPS o PAP más PNPS. El tampón puede tener un pH de 7,0 7,4, tal como de aproximadamente 7,2. El tratamiento puede realizarse a una temperatura elevada, tal como de 30 45 °C o de 33-42 °C o de 35-40 °C. Preferiblemente, para el tratamiento se usan enzimas recién preparadas, tales como 3OST-1. Las enzimas pueden estar inmovilizadas o en disolución. Después del tratamiento, el producto del tratamiento que contiene la heparina biosintética puede purificarse para retirar los compuestos posteriores a la reacción, tales como PAP, PAPS, PNPS y/o PNP. En algunas realizaciones, la heparina biosintética producida puede purificarse usando un método cromatográfico tal como cromatografía de intercambio aniónico fuerte, que puede contener una resina de intercambio aniónico, tal como por ejemplo, la resina Q Sepharose. La heparina biosintética producida puede unirse a dicha resina en una solución salina, que puede ser, por ejemplo, una disolución de NaCl. A continuación, la heparina biosintética purificada puede desalinizarse y concentrarse.
En algunas realizaciones, si la actividad deseada, una actividad anticoagulante y/o actividad anti-IIa, no se logra en la heparina producida, el tratamiento puede repetirse para producir heparina con la actividad deseada. Por ejemplo, la heparina producida inicialmente puede tener una razón de actividad de factor Xa con respecto a factor IIa (es decir, anti-Xa/anti-IIa) inferior a 0,9, tal como un valor de 0,6-0,9 ó 0,7-0,9, o superior a 1,1, tal como un valor en intervalos de 1,1-1,5 ó 1,1-1,4 ó 1,1-1,3 ó 1,1-1,2, el tratamiento con 3OST-1 puede repetirse para producir heparina con una razón de actividad de factor Xa con respecto a factor IIa (es decir, anti-Xa/anti-IIa) de 0,9-1,1 o de aproximadamente 1,0.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, el método puede comprender:
(a) obtener un glicosaminoglicano, que preferiblemente no contiene grupos disacáridos 3S, mientras comprende: (i) el 57,4-62,0 % en peso de grupo disacárido N-sulfatado, 2-sulfatado, 6-sulfatado (TriS);
(ii) el 17,7-22,2 % en peso de grupo disacárido N-sulfatado, 6-sulfatado (NS6S);
(iii) el 8,4-10,9 % en peso de grupo disacárido N-sulfatado, 2-sulfatado (NS2S); y
(iv) el 3,1 -8,1 % en peso de grupo disacárido N-sulfatado (NS); y
(v) opcionalmente, la combinación de residuo de glucosamina N-acetilada que contiene grupos disacáridos menores 0S, 2S, 6S y 2S6S que comprenden el resto;
(b) tratar el glicosaminoglicano con la isoforma 1 de 3-O-sulfotransferasa (3OST-1) en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato (PAPS) para generar heparina biosintética, que puede ser bioequivalente a la heparina USP. En la etapa (b), pueden convertirse suficientes residuos de glucosamina en residuos de 3-O-sulfoglucosamina para obtener una heparina, que puede tener actividades anti-IIa de no menos o más de 180 unidades/mg y una razón anti-Xa/anti-IIa de 0,85-1,15 ó 0,9-1,1 o de aproximadamente 1,0.
En algunas realizaciones, el método puede comprender:
(a) obtener un glicosaminoglicano, que preferiblemente no contiene grupos disacáridos 3S, mientras comprende: (i) el 30-74 % o el 31-73 % o el 36-70 % o el 40-67 % o el 40-66 % o el 42-65 % o el 44-64 % o el 42-45 % o el 48 65 % de grupo disacárido NS2S6S,
(ii) el 5-40 % o el 5-32 % o el 5-26 % o el 5-23 % o el 5-7 % o el 8-16 % o el 18-23 % o el 6-39 % o el 6-32 % o el 6-26 % o el 6-21% de grupo disacárido NS6S,
(iii) el 1-28 % o el 1-27 % o el 4-28 % o el 4-27 % o el 8-28 % o el 8-27 % o el 10-28 % o el 11-28 % o el 12-27 % o el 11-22 % o el 19-27 % de grupo disacárido NS2S,
(iv) el 0,5-23 % o el 0,5-20 % o el 0,5-19 % o el 0,5-18 % o el 0,5-17 % o el 1-21 % o el 1-19 % o el 1-18 % o el 1 17 % o el 1-15 % de grupo disacárido NS, y
(v) opcionalmente, uno o más grupos disacáridos 0S, 2S, 6S y 2S6S que comprenden el resto del glicosaminoglicano;
(b) tratar el glicosaminoglicano con la isoforma 1 de 3-O-sulfotransferasa (3OST-1) en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato (PAPS) para generar heparina biosintética, que puede ser bioequivalente a la heparina USP. En la etapa (b), pueden convertirse suficientes residuos de glucosamina en residuos de 3-O-sulfoglucosamina para obtener una heparina, que puede tener actividades anti-IIa de no menos o más de 180 unidades/mg y una razón anti-Xa/anti-IIa de 0,85-1,15 ó 0,9-1,1 o de aproximadamente 1,0.
En algunas realizaciones, el método puede comprender:
(a) obtener un glicosaminoglicano, que preferiblemente no contiene grupos disacáridos 3S, mientras comprende: (i) el 41,5-45,5 % o el 42-45 % o el 42,5-44,5 % o el 43-44 % de grupo disacárido NS2S6S,
(ii) el 8,5-12,5 % o el 9-12 % o el 9,5-11,5 %, el 10-11 % de grupo disacárido NS6S,
(iii) el 12-15 % o el 12,5-14,5 % o el 13-14 % de grupo disacárido NS2S,
(iv) el 14,6-18,6 % o el 15,1-18,1 % o el 15,6-17,6 % o el 16,1-17,1 % de grupo disacárido NS y
(v) opcionalmente, uno o más grupos 0S, 2S, 6S y 2S6S que comprenden el resto del glicosaminoglicano;
(b) tratar el glicosaminoglicano con la isoterma 1 de 3-O-sulfotransferasa (3OST-1) en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato (PAPS) para generar heparina biosintética, que puede ser bioequivalente a la heparina USP. En la etapa (b), pueden convertirse suficientes residuos de glucosamina en residuos de 3-O-sulfoglucosamina para obtener una heparina, que puede tener actividades anti-IIa de no menos o más de 180 unidades/mg y una razón anti-Xa/anti-IIa de 0,85-1,15 ó 0,9-1,1 o de aproximadamente 1,0.
En algunas realizaciones, el método puede comprender:
(a) obtener un glicosaminoglicano, que preferiblemente no contiene grupos disacáridos 3S, mientras comprende: (i) el 51,3-60,3 % o el 51,8-59,8 % o el 52,3-59,3 % o el 52,8-58,8 % de grupo disacárido NS2S6S,
(ii) el 8,6-13,5 % o el 9,1-13 % o el 9,6-12,5 % o el 10,1-12 % de grupo disacárido NS6S,
(iii) el 10-15,8 % o el 10,5-15,3 % o el 11-14,8 % o el 11,5-14,3 % de grupo disacárido NS2S,
(iv) el 7,4-15,2 % o el 7,9-14,7 % o el 8,4-14,2 % o el 8,9-13,7 % o el 8,9-9,9 % o el 11,7-13,7 % de grupo disacárido NS y
(v) opcionalmente, uno o más grupos disacáridos 0S, 2S, 6S y 2S6S que comprenden el resto del glicosaminoglicano;
(b) tratar el tercer producto intermedio NS2S6S con la isoforma 1 de 3-O-sulfotransferasa (3OST-1) en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato (PAPS) para generar heparina biosintética, que puede ser bioequivalente a la heparina USP. En la etapa (b), pueden convertirse suficientes residuos de glucosamina en residuos de 3-O-sulfoglucosamina para obtener una heparina, que puede tener actividades anti-IIa de no menos o más de 180 unidades/mg y una razón anti-Xa/anti-IIa de 0,85-1,15 ó 0,9-1,1 o de aproximadamente 1,0.
En algunas realizaciones, el método puede comprender:
(a) obtener un glicosaminoglicano que preferiblemente no contiene grupos disacáridos 3S, mientras comprende: (i) el 41,5-65,7 % o el 42-65,2 % o el 42,5 %-64,7 % o el 43-64,2 % de grupo disacárido NS2S6S,
(ii) el 4,1-23,3 % o el 4,6-22,8 % o el 5,1 %-22,3 % o el 5,6-21,8 % de grupo disacárido NS6S,
(iii) el 10-28,6 %, el 10,5-28,1 % o el 11-27,6 % o el 11,5-27,1 % o el 11,1-17,8 % o el 19-27,6 % de grupo disacárido NS2S,
(iv) el 0,4-15,9 % o el 0,7-15,4 % o el 1-14,9 % o el 1-14,4 % o el 0,4-5,5 % o el 10,2-14,9 % de grupo disacárido NS y
(v) opcionalmente, uno o más grupos disacáridos 0S, 2S, 6S y 2S6S que comprenden el resto del glicosaminoglicano;
(b) tratar el glicosaminoglicano con la isoforma 1 de 3-O-sulfotransferasa (3OST-1) en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato (PAPS) para generar heparina biosintética, que puede ser bioequivalente a la heparina USP. En la etapa (b), pueden convertirse suficientes residuos de glucosamina en residuos de 3-O-sulfoglucosamina para obtener una heparina, que puede tener actividades anti-IIa de no menos o más de 180 unidades/mg y una razón anti-Xa/anti-IIa de 0,85-1,15 ó 0,9-1,1 o de aproximadamente 1,0.
Otra realización puede ser un método para elaborar un primer producto intermedio NS tal como se divulgó anteriormente. El método puede comprender obtener heparosano y luego convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en el heparosano en residuos de N-sulfo glucosamina para producir el primer producto intermedio NS. La cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a una cantidad de grupo disacárido N-sulfatado (NS) en el primer producto intermedio NS. En realizaciones relacionadas, el primer producto intermedio NS puede elaborarse a partir de heparosano haciendo reaccionar heparosano con reactivos químicos, hidróxido de sodio acuoso y un reactivo de sulfonación, tal como un complejo de trióxido de trietilamina-azufre, en las condiciones apropiadas para convertir los residuos de N-acetil glucosamina en el heparosano en residuos de N-sulfo glucosamina para proporcionar el primer producto intermedio NS. En otra realización, el primer producto intermedio NS puede elaborarse a partir de heparosano haciendo reaccionar heparosano con una disolución de base acuosa, tal como hidróxido de sodio acuoso o hidróxido de potasio acuoso, y N-sulfonatando con fosfoadenosil fosfosulfato (PAPS) usando un catalizador de N-sulfotransferasa. La cantidad convertida de residuos de N-acetil
glucosamina puede corresponder a una cantidad de grupo disacárido N-sulfatado (NS) en el primer producto intermedio NS. En otra realización, el heparosano puede hacerse reaccionar con N-desacetilasa, N-sulfotransferasa (NDST) a los residuos de N-acetilglucosamina en heparosano para producir el primer producto intermedio NS. La cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a una cantidad de grupo disacárido N-sulfatado (NS) en el primer producto intermedio NS. En cada uno de los métodos, puede preferirse que el número de grupos amino no sustituidos que queden después de la N-sulfonación química o enzimática no sea mayor que el número de grupos amino no sustituidos que se encuentran en la heparina sódica USP porcina, uno o menos por cadena (T. Toida, H. Yoshida, H. Toyoda, I. Koshiishi, T. Imanari, R.E. Hileman, J.R. Fromm, R.J. Linhardt, Biochemical Journal, 322, 499-506, 1997). La cantidad de grupos NS del primer producto intermedio producido puede controlarse controlando los procedimientos químicos o enzimáticos. (Z. Wang, et al. (2011), Journal of Biotechnology, 156, 188-196; A. Onishi (2015), Detailed physicochemical and biological analyses of heparins from various sources, tesis doctoral, Instituto Politécnico Rensselaer, Troy, NY, EE. UU.).
Las propiedades de peso molecular del primer producto intermedio producido pueden ser tales que sean apropiadas para formar una heparina biosintética que pueda cumplir con las especificaciones de peso molecular para la heparina USP porcina usando, por ejemplo, uno de los métodos divulgados a continuación.
El heparosano usado en los métodos de la presente divulgación puede ser, por ejemplo, heparosano producido usando bacterias, tales como Escherichia coli (E. coli) o Pasteurella multocida. Por ejemplo, el heparosano puede producirse a partir de E. coli K5 o E. coli Nissle 1917. Antes de la producción del primer producto intermedio, el heparosano puede someterse a N-desacetilación y despolimerización tal como se describe, por ejemplo, en Z. Wang et al (2011), Journal of Biotechnology, 156, 188-196.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un primer producto intermedio NS que comprende el 84,7-93,8 % en peso de un grupo disacárido N-sulfatado (NS). El resto del primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar. El método puede comprender convertir el 84,7-93,8 % en peso de los residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir un heparosano N-sulfatado, N-desacetilado. En realizaciones relacionadas, el primer producto intermedio NS puede elaborarse a partir de heparosano haciendo reaccionar el heparosano con reactivos químicos, hidróxido de sodio acuoso y un reactivo de sulfonación tal como el complejo de trióxido de trietilamina-azufre en las condiciones apropiadas para convertir el 84,7-93,8 % en peso de los residuos de N-acetil glucosamina en heparosano en residuos de N-sulfo glucosamina para producir el primer producto intermedio NS. Alternativamente, el heparosano puede hacerse reaccionar con N-desacetilasa, N-sulfotransferasa (NDST) para convertir el 84,7-93,8 % en peso de los residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir el primer producto intermedio NS.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un primer producto intermedio NS que comprende el 78-99,5 % o el 78-99 % o el 81-97 % o el 83-95 % o el 84-94 % o el 85-93 % o el 84-87 % o el 85 86 % o el 87,5-94 % o el 90-93,5 % o el 90,5-93 % o el 90,3-91,3 % o el 92,2-93,2 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS). El resto del primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar. El método puede comprender convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, para producir un heparosano N-desacetilado, N-sulfatado. En realizaciones relacionadas, el primer producto intermedio NS puede elaborarse a partir de heparosano haciendo reaccionar heparosano con reactivos químicos, hidróxido de sodio acuoso y un reactivo de sulfonación tal como el complejo de trióxido de trietilaminaazufre en las condiciones apropiadas para convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, en residuos de N-sulfo glucosamina para producir el primer producto intermedio NS. Alternativamente, el heparosano puede hacerse reaccionar con N-desacetilasa, N-sulfotransferasa (NDST) para convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, para producir el primer producto intermedio NS.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un primer producto intermedio NS que comprende el 83,4-87,4 % o el 83,9-86,9 % o el 84,4-86,4 % o el 84,9-85,9 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS). El resto del primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar. El método puede comprender convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, para producir un heparosano N-desacetilado, N-sulfatado. En realizaciones relacionadas, el primer producto intermedio NS puede elaborarse a partir de heparosano haciendo reaccionar heparosano con reactivos químicos, hidróxido de sodio acuoso y un reactivo de sulfonación tal como el complejo de trióxido de trietilamina-azufre en las condiciones apropiadas para convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, en residuos de N-sulfo glucosamina para producir el primer producto intermedio NS. Alternativamente, el heparosano puede hacerse reaccionar con N-desacetilasa, N-sulfotransferasa (NDST) para convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, para producir el primer producto intermedio NS. El primer producto intermedio NS producido puede tener un peso molecular promedio en peso que sea suficiente para convertirse a través del procedimiento para dar BSH con las propiedades
de peso molecular apropiadas.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un primer producto intermedio NS que comprende del 87,9 % al 92,9 % o del 88,4 % al 92,4 % o del 88,9 % al 91,9 % o del 89,4 % al 91,4 % o del 89,9 % al 90,9 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS). El resto del primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar. El método puede comprender convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, para producir un heparosano N-desacetilado, N-sulfatado. En realizaciones relacionadas, el primer producto intermedio NS puede elaborarse a partir de heparosano haciendo reaccionar heparosano con reactivos químicos, hidróxido de sodio acuoso y un reactivo de sulfonación tal como el complejo de trióxido de trietilamina-azufre en las condiciones apropiadas para convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, en residuos de N-sulfo glucosamina para producir el primer producto intermedio NS. Alternativamente, el heparosano puede hacerse reaccionar con N-desacetilasa, N-sulfotransferasa (NDST) para convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, para producir el primer producto intermedio NS. El primer producto intermedio NS producido puede tener un peso molecular promedio en peso que sea suficiente para convertirse a través del procedimiento para dar BSH con las propiedades de peso molecular apropiadas.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un primer producto intermedio NS que comprende el 88,8-94,7 % o el 89,3 %-94,2 % o el 89,8-93,7 % o el 90,3 %-93,2 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS). El resto del primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar. El método puede comprender convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, para producir un heparosano N-desacetilado, N-sulfatado. En realizaciones relacionadas, el primer producto intermedio NS puede elaborarse a partir de heparosano haciendo reaccionar heparosano con reactivos químicos, hidróxido de sodio acuoso y un reactivo de sulfonación tal como el complejo de trióxido de trietilamina-azufre en las condiciones apropiadas para convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, en residuos de N-sulfo glucosamina para producir el primer producto intermedio NS. Alternativamente, el heparosano puede hacerse reaccionar con N-desacetilasa, N-sulfotransferasa (NDST) para convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, para producir el primer producto intermedio NS.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un primer producto intermedio NS que comprende el 88,8-92,8 % o el 89,3-92,3 % o el 89,8-91,8 % o el 90,3-91,3 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS). El resto del primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar. El método puede comprender convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, para producir un heparosano N-desacetilado, N-sulfatado. En realizaciones relacionadas, el primer producto intermedio NS puede elaborarse a partir de heparosano haciendo reaccionar heparosano con reactivos químicos, hidróxido de sodio acuoso y un reactivo de sulfonación tal como el complejo de trióxido de trietilamina-azufre en las condiciones apropiadas para convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, en residuos de N-sulfo glucosamina para producir el primer producto intermedio NS. Alternativamente, el heparosano puede hacerse reaccionar con N-desacetilasa, N-sulfotransferasa (NDST) para convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, para producir el primer producto intermedio NS.
En algunas realizaciones, la conversión de heparosano en el primer producto intermedio puede implicar la obtención o preparación de una disolución de heparosano. La disolución puede tener una concentración del 0,05-12 % o del 0,1-10 % o del 0,1-5 % o del 0,1-3 % o del 0,5-2 % de heparosano. El disolvente puede ser, por ejemplo, agua o un disolvente basado en agua. Por tanto, la disolución puede ser una disolución acuosa. La disolución puede hacerse reaccionar con una base, tal como hidróxido de sodio o hidróxido de potasio. La reacción puede realizarse a temperatura elevada tal como, por ejemplo, de 30-70 °C o de 40-65 °C o de 50-55 °C. Luego, puede añadirse un ácido, tal como, por ejemplo, HCl, a la mezcla de reacción para ajustar el pH a aproximadamente 7. El producto puede exponerse a la reacción de N-sulfonación, que puede realizarse, por ejemplo, usando uno o más reactivos de N-sulfonación, que pueden ser, por ejemplo, trióxido de azufre o un complejo de trióxido de azufre de azufre, tal como complejo de amina de azufre. Los ejemplos no limitativos de complejos de azufre-amina incluyen un complejo de sulfuro-trialquilamina, tal como, por ejemplo, complejo de azufre-trimetilamina, complejo de trióxido de azufredimetiletilamina, y complejo de trióxido de azufre-metildietilamina, así como complejo de arilo que contiene trióxido de azufre-amina, tal como complejo de trióxido de azufre-piridina. Luego, el producto de la N-sulfonación puede fraccionarse para producir las propiedades de peso molecular deseadas.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un primer producto intermedio NS que comprende el 90,1-94,7 % o el 90,6-94,2 % o el 91,1 %-93,7 % o el 91,6 %-93,2 % de grupo disacárido N-sulfatado
(NS). El resto del primer producto intermedio NS puede ser un grupo disacárido de glucosamina N-acetilada (NAc) (0S) menor sin modificar. El método puede comprender convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, para producir un heparosano N-desacetilado, N-sulfatado. En realizaciones relacionadas, el primer producto intermedio NS puede elaborarse a partir de heparosano haciendo reaccionar heparosano con reactivos químicos, hidróxido de sodio acuoso y un reactivo de sulfonación tal como el complejo de trióxido de trietilamina-azufre en las condiciones apropiadas para convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, en residuos de N-sulfo glucosamina para producir el primer producto intermedio NS. Alternativamente, el heparosano puede hacerse reaccionar con N-desacetilasa, N-sulfotransferasa (NDST) para convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano, cantidad que corresponde a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio, para producir el primer producto intermedio NS.
Otra realización puede ser un método para elaborar un segundo producto intermedio NS2S tal como se divulgó anteriormente. El método puede comprender (a) convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir un primer producto intermedio NS (la cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a una cantidad de grupo disacárido N-sulfatado (NS) en el primer producto intermedio NS) y luego (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (C5-epi) y/o 2-O-sulfotransferasa (2OST), para producir el segundo producto intermedio NS2S. En algunas realizaciones, las longitudes de cadena o el segundo producto intermedio pueden no ser apreciablemente diferentes de las longitudes de cadena del primer producto intermedio. Preferiblemente, el tratamiento implica las enzimas C5-epi y 2OST.
La conversión de heparosano en el primer producto intermedio puede realizarse tal como se comentó anteriormente.
En algunas realizaciones, el tratamiento puede realizarse en presencia de un sistema de reciclaje de PAPS, que puede comprender p-nitrofenilsulfato (PNPS) y PAPS. El sistema de reciclaje de PAPS puede comprender además un catalizador, tal como aril sulfotransferasa IV (AST-IV), que puede usarse para catalizar la conversión de PAP en PAPS usando PNPS como donante de sulfato en la reacción basada en la conversión molar del primer producto intermedio por las enzimas C5-epi y 2OST. En algunas realizaciones, el tratamiento puede realizarse sin un sistema de reciclado de PAPS pero con una cantidad suficiente de PAPS en la reacción basada en la conversión molar del primer producto intermedio NS2S6S. En algunas realizaciones, el tratamiento puede realizarse, por ejemplo, en un tampón, tal como el tampón de reacción del ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES). En presencia de las enzimas C5 epi y 2OST, pueden usarse otros tampones y concentraciones de tampones adecuados, tal como conocen los expertos en la técnica. Puede estar presente un donante de sulfato, tal como PAPS o PAP más PNPS. El tampón puede tener un pH de 7,0-7,4, tal como de aproximadamente 7,2. El tratamiento puede realizarse a una temperatura elevada, tal como de 30-45 °C o 33-42 °C o 35-40 °C. Preferiblemente, para el tratamiento se usan enzimas recién preparadas, tales como C5 epi y/o 2OST Las enzimas pueden estar inmovilizadas o en disolución. Después del tratamiento, el producto del tratamiento que contiene el segundo producto intermedio puede purificarse para retirar los compuestos posteriores a la reacción, tales como PAP, PAPS, PNPS y/o PNP. El segundo producto intermedio purificado puede recogerse y concentrarse para su uso posterior, tal como el análisis y/o la producción de un tercer producto intermedio.
En algunas realizaciones, si no se logran las características de disacárido deseadas, tal como un porcentaje de NS2S, en el glicosaminoglicano producido como resultado del tratamiento, el tratamiento puede repetirse para producir un glicosaminoglicano con características de disacárido, tal como un porcentaje de NS2S deseado para el segundo producto intermedio.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un segundo producto intermedio NS2S que comprende el 73,8-75,3 % en peso de grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado (NS2S) y el 18,5-20,2 % en peso de grupo disacárido NS. El resto en el segundo producto intermedio NS2S puede comprender, o consistir en un grupo disacárido NAc (0S) menor no modificado y/o un grupo disacárido NAc (2S) 2-O-sulfatado. Este método puede comprender: (a) convertir el 84,7-93,8 % en peso de los residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir el primer producto intermedio NS; y (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (C5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST), en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS) para producir el segundo producto intermedio NS2S. Preferiblemente, el tratamiento implica las enzimas C5-epi y 2OST.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un segundo producto intermedio NS2S que comprende el 44-80 % o el 45-79 % o el 50-78 % o el 50-77 % o el 55-78 % o el 55-76 % o el 58-77 % o el 59-76 % o el 60-75 % o el 58-62 % o el 59-61% o el 65-77 % grupos disacáridos NS2S y el 12-40 % o el 13-39 % o el 15 34 % o el 15-29 % o el 16-29 % o el 17-25 % o el 16-26 % o el 16-18 % o el 19-26 % de grupos disacáridos NS. El resto en el segundo producto intermedio NS2S puede comprender, o consistir en un grupo disacárido NAc (0S) menor no modificado y/o un grupo disacárido NAc (2S) 2-O-sulfatado. Este método puede comprender: (a) convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir el primer producto intermedio NS que comprende el 78-99,5 % o el 78-99 % o el 81-97 % o el 83-95 % o el 84-94 % o el 85-93 % o el 84-87 % o el 85 86 % o el 87,5-94 % o el 90-93,5 % o el 90,5-93 % o el 90,3-91,3 % o el 92,2-93,2 % de grupo disacárido Nsulfatado (NS) (la cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio); y (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (C5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST), en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS), para producir el segundo producto intermedio NS2S. Preferiblemente, el tratamiento implica las enzimas C5-epi y 2OST.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un segundo producto intermedio NS2S que comprende el 57,5-62,5 % o el 58-62 % o el 58,5-61,5 % o el 59-61 % o el 59,5-60,5 % de grupos disacáridos NS2S y el 23,2-27,2 % o el 23,7-26,7 % o el 24,2-26,2 % o el 24,7-25,7 % de grupos disacáridos NS. El resto en el segundo producto intermedio NS2S puede comprender, o consistir en un grupo disacárido NAc (0S) menor no modificado y/o un grupo disacárido NAc (2S) 2-O-sulfatado. Este método puede comprender: (a) convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir el primer producto intermedio NS que comprende el 83,4-87,4 % o el 83,9-86,9 % o el 84,4-86,4 % o el 84,9-85,9 % de N-sulfatado grupo disacárido (Ns ) (la cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio); y (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (C5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST), en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS) para producir el segundo producto intermedio NS2S. Preferiblemente, el tratamiento implica las enzimas C5-epi y 2OST.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un segundo producto intermedio NS2S que comprende el 65,8-77,4 % o el 66,3-76,9 % o el 66,8-76,4 % o el 67,3-75,9 % de grupos disacáridos NS2S y el 14,8 26 % o el 15,3-25,5 % o el 15,8-25 % o el 16,3-24,5 % de grupos disacáridos NS. El resto en el segundo producto intermedio NS2S puede comprender, o consistir en un grupo disacárido NAc (0S) menor no modificado y/o un grupo disacárido NAc (2S) 2-O-sulfatado. Este método puede comprender: (a) convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir el primer producto intermedio NS que comprende desde el 88,8 94,7 % o del 89,3 %-94,2 % o del 89,8-93,7 % o del 90,3 %-93,2 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS) (la cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio); y (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (C5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST), en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS), para producir el segundo producto intermedio NS2S. Preferiblemente, el tratamiento implica las enzimas C5-epi y 2OST.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un segundo producto intermedio NS2S que comprende el 65,8-74,4 % o el 66,3-73,9 % o el 66,8-73,4 % o el 67,3-72,9 % de grupos disacáridos NS2S y el 17,9 26 % o el 18,4-25,5 % o el 18,9-25 % o el 19,4-24,5 % de grupos disacáridos NS. El resto en el segundo producto intermedio NS2S puede comprender, o consistir en un grupo disacárido NAc (0S) menor no modificado y/o un grupo disacárido NAc (2S) 2-O-sulfatado. Este método puede comprender: (a) convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir el primer producto intermedio NS que comprende desde el 88,8 92,8 % o el 89,3-92,3 % o el 89,8-91,8 % o el 90,3-91,3 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS) (la cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio); y (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (C5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST), en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS), para producir el segundo producto intermedio NS2S. Preferiblemente, el tratamiento implica las enzimas C5-epi y 2OST.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un segundo producto intermedio NS2S que comprende el 73,4-77,4 % o el 73,9-76,9 % o el 74,4-76,4 % o el 74,9-75,9 % de grupos disacáridos NS2S y el 14,8 18,8 % o el 15,3-18,3 % o el 15,8-17,8 % o el 16,3-17,3 % de grupos disacáridos NS. El resto en el segundo producto intermedio NS2S puede comprender, o consistir en un grupo disacárido NAc (0S) menor no modificado y/o un grupo disacárido NAc (2S) 2-O-sulfatado. Este método puede comprender: (a) convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir el primer producto intermedio NS que comprende desde el 90,1-94,7 % o el 90,6-94,2 % o el 91,1 %-93,7 % o el 91,6 %-93,2 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS) (la cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio); y (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (C5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST), en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS), para producir el segundo producto intermedio NS2S. Preferiblemente, el tratamiento implica las enzimas C5-epi y 2OST.
Otra realización puede ser un método para elaborar un tercer producto intermedio NS2S6S tal como se divulgó anteriormente. El método puede comprender (a) convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir un primer producto intermedio NS (la cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a una cantidad de grupo disacárido N-sulfatado (NS) en el primer producto intermedio NS); (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (C5-epi) y/o 2-O-sulfotransferasa (2OST), en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS), para producir el segundo producto intermedio NS2S y (c) tratar el segundo producto intermedio NS2S con una enzima, tal como 6-O-sulfotransferasas 1 y 3 (6OST-1,3), en presencia de un sulfato donante, tal como
fosfosulfato de fosfoadenosilo (PAPS), para producir el tercer producto intermedio NS2S6S.
La conversión del heparosano para producir el primer producto intermedio y el tratamiento del primer producto intermedio pueden realizarse tal como se divulgó anteriormente.
En algunas realizaciones, el tratamiento puede realizarse en presencia de un sistema de reciclaje de PAPS, que puede comprender p-nitrofenilsulfato (PNPS) y PAPS. El sistema de reciclaje de PAPS puede comprender además un catalizador, tal como aril sulfotransferasa IV (AST-IV), que puede usarse para catalizar la conversión de PAP en PAPS usando PNPS como donante de sulfato con una cantidad suficiente de PNPS en la reacción basada en la conversión molar del segundo producto intermedio por una enzima, tal como 6-O-sulfotransferasas 1 y 3 (6OST-1,3). En algunas realizaciones, el tratamiento puede realizarse sin un sistema de reciclaje de PAPS pero con una cantidad suficiente de PAPS en la reacción basada en la conversión molecular del segundo producto intermedio por una enzima, tal como 6-O-sulfotransferasas 1 y 3 (6OST-1,3). En algunas realizaciones, el tratamiento puede realizarse en un tampón, tal como un tampón de reacción de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) en presencia de las enzimas 6OST-1 y 6OST-3. Puede estar presente un donante de sulfato, tal como PAPS o PAP más PNPS. El tampón puede tener un pH de 7,0-7,4, tal como de aproximadamente 7,2. El tratamiento puede realizarse a una temperatura elevada, tal como de 30-45 °C o de 33-42 °C o de 35-40 °C. Preferiblemente, para el tratamiento se usan enzimas recién preparadas, tales como 6OST-1 y/o 6-OST-3. Las enzimas pueden estar inmovilizadas o en disolución. Después del tratamiento, el producto del tratamiento que contiene el tercer producto intermedio puede purificarse para retirar los compuestos posteriores a la reacción, tales como PAP, PAPS, PNPS y/o PNP. El tercer producto intermedio purificado puede concentrarse y recogerse para su uso posterior, tal como el análisis y/o la producción de una heparina biosintética.
En algunas realizaciones, si no se logran las características de disacárido deseadas, tales como los porcentajes de NS2S6S y NS6S, en el glicosaminoglicano producido como resultado del tratamiento del segundo producto intermedio NS, el tratamiento puede repetirse para producir un glicosaminoglicano con características de disacárido, tales como porcentajes de NS2S6S y NS6S deseados para el tercer producto intermedio.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un tercer producto intermedio NS2S6S que comprende el 57,4-62,0 % en peso de grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado, 6-O-sulfatado (NS2S6S), el 17,7-22,2 % en peso de grupo disacárido N-sulfatado, 6-O-sulfatado (NS6S), el 8,4-10,9 % en peso de grupo disacárido N-sulfatado, 2-O-sulfatado (NS2S) y el 3,1 -8,1 % en peso de grupo disacárido NS. El resto del tercer producto intermedio NS2S6S puede comprender, o consistir en uno o más de grupos disacáridos 0S, 2S, 6-O-sulfatados, NAc (6S), 2-O-sulfatados, 6-O-sulfatados, NAc (2S6S). El tercer producto intermedio preferiblemente no contiene grupos disacáridos 3S. Este método puede comprender: (a) convertir el 84,7-93,8 % en peso de los residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir el primer producto intermedio NS; (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (C5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST), en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS), para producir el segundo producto intermedio NS2S; y (c) tratar el segundo producto intermedio NS2S con una enzima, tal como las 6-O-sulfotransferasas 1 y 3 (6OST-1,3), en presencia de un donante de sulfato, tal como fosfosulfato de fosfoadenosilo (PAPS), para producir el tercer producto intermedio NS2S6S.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un tercer producto intermedio NS2S6S que comprende el 30-74 % o el 31-73 % o el 36-70 % o el 40-67 % o el 40-66 % o el 42-65 % o el 44-64 % o el 42-45 % o el 48-65 % de grupo disacárido NS2S6S, el 5-40 % o el 5-32 % o el 5-26 % o el 5-23 % o el 5-7 % o el 8-16 % o el 8-23 % o el 6-39 % o el 6-32 % o el 6-26 % o el 6-21 % de grupo disacárido NS6S, el 1-28 % o el 1-27 % o el 4-28 % o el 4-27 % o el 8-28 % o el 8-27 % o el 10-28 % o el 11-28 % o el 12-27 % o el 11-22 % o el 19-27 % de grupo disacárido NS2S; y el 0,5-23 % o el 0,5-20 % o el 0,5-19 % o el 0,5-18 % o el 0,5-17 % o el 1-21 % o el 1-19 % o el 1-18 % o el 1-17 % o el 1-15 % de grupo disacárido NS. El resto del tercer producto intermedio NS2S6S puede comprender, o consistir en uno o más de grupos disacáridos 0S, 2S, 6-O-sulfatados, NAc (6S), 2-O-sulfatados, 6-O-sulfatados, NAc (2S6S). El tercer producto intermedio preferiblemente no contiene grupos disacáridos 3S. Este método puede comprender: (a) convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir un producto intermedio NS que comprende el 78-99,5 % o el 78-99 % o el 81-97 % o el 83-95 % o el 84-94 % o el 85-93 % o el 84-87 % o el 85-86 % o el 87,5-94 % o el 90-93,5 % o el 90,5-93 % o el 90,3-91,3 % o el 92,2 93,2 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS) (la cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio); (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (C5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST), en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS), para producir un segundo producto intermedio NS2S que comprende el 44-80 % o el 45-79 % o el 50-78 % o el 50-77 % o el 55-78 % o el 55-76 % o el 58-77 % o el 59-76 % o el 60-75 % o el 58-62 % o el 59-61 % o el 65-77 % de grupos disacáridos NS2S y el 12-40 % o el 13-39 % o el 15 34 % o el 15-29 % o el 16-29 % o el 16-26 % o el 17-25 % o el 16-18 % o el 19-26 % de grupos disacáridos NS; y (c) tratar el segundo producto intermedio NS2S con una enzima, tal como 6-O-sulfotransferasas 1 y 3 (6OST-1,3), en presencia de un donante de sulfato, tal como fosfosulfato de fosfoadenosilo (PAPS), para producir el tercer producto intermedio NS2S6S.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un tercer producto intermedio NS2S6S que
comprende el 41,5-45,5 % o el 42-45 % o el 42,5-44,5 % o el 43-44 % de grupo disacárido NS2S6S, el 8,5-12,5 % o el 9-12 % o el 9,5-11,5 %, el 10-11% de grupo disacárido NS6S, el 12-15 % o el 12,5-14,5 % o el 13-14 % de grupo disacárido NS2S y el 14,6-18,6 % o el 15,1-18,1% o el 15,6-17,6 % o el 16,1-17,1 % de grupo disacárido NS. El resto del tercer producto intermedio NS2S6S puede comprender, o consistir en uno o más de grupos disacáridos 0S, 2S, 6-O-sulfatados, NAc (6S), 2-O-sulfatados, 6-O-sulfatados, NAc (2S6S). El tercer producto intermedio preferiblemente no contiene grupos disacáridos 3S. Este método puede comprender: (a) convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir un primer producto intermedio NS que comprende el 83,4-87,4 % o el 83,9-86,9 % o el 84,4-86,4 % o el 84,9-85,9 % de N-sulfatado grupo disacárido (NS) (la cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio); (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (C5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST) en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS), para producir un segundo producto intermedio NS2S que comprende el 57,5-62,5 % o el 58-62 % o el 58,5 61,5 % o el 59-61 % o el 59,5-60,5 % de grupos disacáridos NS2S y el 23,2-27,2 % o el 23,7-26,7 % o el 24,2-26,2 % o el 24,7-25,7 % de grupos disacáridos NS; y (c) tratar el segundo producto intermedio NS2S con una enzima, tal como 6-O-sulfotransferasas 1 y 3 (6OST-1,3), en presencia de un donante de sulfato, tal como fosfosulfato de fosfoadenosilo (PAPS), para producir el tercer producto intermedio NS2S6S.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un tercer producto intermedio NS2S6S que comprende el 51,3-60,3 % o el 51,8-59,8 % o el 52,3-59,3 % o el 52,8-58,8 % de grupo disacárido NS2S6S, el 8,6 13,5 % o el 9,1-13 % o el 9,6-12,5 % o el 10,1-12 % de grupo disacárido NS6S, el 10-15,8 % o el 10,5-15,3 % o el 11-14,8 % o el 11,5-14,3 % de grupo disacárido NS2S y el 7,4-15,2 % o el 7,9-14,7 % o el 8,4-14,2 % o el 8,9-13,7% o el 8,9-9,9 % o el 11,7-13,7 % de grupo disacárido NS. El resto del tercer producto intermedio NS2S6S puede comprender, o consistir en uno o más de grupos disacáridos 0S, 2S, 6-O-sulfatados, NAc (6S), 2-O-sulfatados, 6-O-sulfatados, NAc (2S6S). El tercer producto intermedio preferiblemente no contiene grupos disacáridos 3S. Este método puede comprender: (a) convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir el primer producto intermedio NS que comprende el 88,8-94,7 % o el 89,3 %-94,2 % o el 89,8-93,7 % o el 90,3 %-93,2 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS) (la cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio); (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (C5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST) en presencia de un donante de sulfato, tal como 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS), para producir un segundo producto intermedio NS2S que comprende el 65,8-74,4 % o el 66,3-73,9 % o el 66,8-73,4 % o el 67,3-72,9 % de grupos disacáridos NS2S y el 17,9-26 % o el 18,4-25,5 % o el 18,9-25 % o el 19,4-24,5 % de grupos disacáridos NS; y (c) tratar el segundo producto intermedio NS2S con una enzima, tal como 6-O-sulfotransferasas 1 y 3 (6OST-1,3), en presencia de un donante de sulfato, tal como fosfosulfato de fosfoadenosilo (PAPS), para producir el tercer producto intermedio NS2S6S.
En algunas realizaciones, el método puede ser un método para elaborar un tercer producto intermedio NS2S6S que comprende el 41,5-65,7 % o el 42-65,2 % o el 42,5 %-64,7 % o el 43-64,2 % de grupo disacárido NS2S6S, el 4,1 23,3 % o el 4,6-22,8 % o el 5,1%-22,3 % o el 5,6-21,8 % de grupo disacárido NS6S, el 10-28,6 %, el 10,5-28,1% o el 11-27,6 % o el 11,5-27,1% o el 11,1-17,8 % o el 19-27,6 % de grupo disacárido NS2S y el 0,4-15,9 % o el 0,7-15,4% o el 1-14,9 % o el 1-14,4 % o el 0,4-5,5 % o el 10,2-14,9 % de grupo disacárido NS. El resto del tercer producto intermedio NS2S6S puede comprender, o consistir en uno o más de grupos disacáridos 0S, 2S, 6-O-sulfatados, NAc (6S), 2-O-sulfatados, 6-O-sulfatados, NAc (2S6S). El tercer producto intermedio preferiblemente no contiene grupos disacáridos 3S. Este método puede comprender: (a) convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir el primer producto intermedio NS que comprende el 90,1-94,7 % o el 90,6-94,2 % o el 91,1%-93,7 % o el 91,6 %-93,2 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS) (la cantidad convertida de residuos de N-acetil glucosamina puede corresponder a la cantidad de grupos NS en el primer producto intermedio); (b) tratar el primer producto intermedio NS con una enzima, tal como C5-epimerasa (c5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST), en presencia de un donante de sulfato, 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS), para producir un segundo producto intermedio NS2S que comprende el 65,8-77,4 % o el 66,3-76,9 % o el 66,8-76,4 % o el 67,3-75,9 % de grupos disacáridos NS2S y el 14,8-26 % o el 15,3-25,5 % o el 15,8-25 % o el 16,3-24,5 % de grupos disacáridos NS; y (c) tratar el segundo producto intermedio NS2S con 6-O-sulfotransferasas 1 y 3 (6OST-1,3) en presencia de fosfosulfato de fosfoadenosilo (PAPS) para producir el tercer producto intermedio NS2S6S.
Otra realización puede ser un método para elaborar heparina, que puede ser bioequivalente a la heparina UPS, que comprende tratar el tercer producto intermedio NS2S6S tal como se divulgó anteriormente con una enzima, tal como la isoforma 1 de 3-O-sulfotransferasa (3OST-1), en presencia de un donante de sulfato, tal como PAPS, para convertir los grupos 3-hidroxilo de los residuos de glucosamina en residuos de 3-O-sulfoglucosamina produciendo así heparina, que puede ser bioequivalente a la heparina sódica UPS porcina.
En las reacciones de sulfotransferasa mencionadas anteriormente con 2OST, 3OST-1, una o ambas de 6OST-1 o 6OST-3, las enzimas pueden requerir un donante de sulfato, que normalmente es PAPS, y un sistema de regeneración. Una o más enzimas, tal como 2OST, 3OST-1, una o ambas de 6OST-1 o 6OST-3, y un donante de sulfato, tal como PAPS, pueden estar en disolución. Las enzimas pueden estar inmovilizadas. En algunas realizaciones, las reacciones se realizan in vitro. En otras realizaciones, una o más etapas pueden producirse dentro de un huésped microbiano que codifica para genes para uno o más de NDST, C5-Epi, 2OST, 3OST-1, uno de
6OST-1 o 6OST-3 y una fuente de PAPS.
Aunque los métodos divulgados anteriormente pueden producir heparina, que es bioequivalente a la heparina USP porcina, en algunas realizaciones, la heparina producida puede ser tal que no satisfaga uno o más requisitos de bioequivalencia con la heparina USP porcina.
En algunas realizaciones, el lote de heparina producido puede cumplir con los requisitos de la heparina USP porcina en cuanto al peso molecular y las actividades anticoagulantes, mientras que no cumple con los requisitos de la heparina USP porcina en cuanto a las actividades anti-IIa. Por ejemplo, el lote de heparina producido puede cumplir con los requisitos de la heparina USP porcina en cuanto a peso molecular y actividades anticoagulantes, al mismo tiempo que tiene una razón de actividad de factor Xa con respecto factor IIa (es decir, anti-Xa/anti-IIa) por debajo de 0,9, tal como un valor en intervalos de 0,5-0,9 o de 0,6-0,9 o de 0,7-0,9, o superior a 1,1, tal como un valor en intervalos de 1,1-1,5 o de 1,1-1,4 o de 1,1-1,3 o de 1,1-1,2. Tal lote puede convertirse en un lote de heparina, que puede ser bioequivalente a la heparina USP porcina, con un tratamiento enzimático adicional, tal como el tratamiento con la isoforma 1 de 3-O-sulfotransferasa (3OST-1), que puede realizarse en presencia de un donante de sulfato, tal como PAPS.
En algunas realizaciones, el lote de heparina producido puede cumplir con los requisitos de heparina USP porcina en cuanto a actividades anticoagulantes, mientras que no cumple con los requisitos de heparina USP porcina en cuanto a actividades anti-IIa y peso molecular. Por ejemplo, el lote producido puede tener una razón de actividad de factor Xa con respecto a factor IIa (es decir, anti-Xa/anti-IIa) inferior a 0,9, tal como un valor de 0,5-0,9 o de 0,6-0,9 o de 0,7-0,9, o superior a 1,1, tal como un valor en intervalos de 1,1-1,5 o 1,1-1,4 o 1,1-1,3 o 1,1-1,2 y usando un tratamiento enzimático adicional, tal como el tratamiento con la isoforma 1 de 3-O-sulfotransferasa (3OST-1), que puede realizarse en presencia de un donante de sulfato, tal como PAPS, para proporcionar una razón de actividad de factor Xa con respecto a factor IIa que cumple con los requisitos de heparina USP porcina en cuanto a actividades anti-IIa.
Aunque la heparina producida puede ser bioequivalente a la heparina USP porcina, en algunas realizaciones, la heparina producida puede ser físicamente diferente de la heparina producida naturalmente, tal como la heparina bovina o porcina, que sigue siendo bioequivalente a la heparina USP porcina. Por ejemplo, los presentes métodos pueden permitir producir lotes de heparina, que puede ser bioequivalente a la heparina USP porcina, de modo que los lotes producidos sean más coherentes o uniformes entre sí en cuanto a uno o más de a) composición química, b) peso molecular, tal como peso molecular promedio en peso, y c) distribución de peso molecular en comparación con lotes de heparina producida naturalmente, tales como lotes de heparina intestinal bovina.
Los presentes métodos pueden producir lotes de heparina de al menos 50 mg o al menos 80 mg o al menos 100 mg o al menos 200 mg o al menos 1 g o al menos 2 g.
Los lotes producidos pueden ser coherentes entre ellos en cuanto a peso molecular, composición de disacáridos y actividad biológica. Los lotes producidos de la escala identificada anteriormente pueden cumplir todos los requisitos de la heparina USP porcina, tales como el peso molecular, la composición de disacáridos y los requisitos de actividad biológica. La cantidad de lotes coherentes puede ser de al menos 2 o de al menos 3 o de al menos 5 o de al menos 7 o de al menos 10 o de al menos 12 o de al menos 15 o de al menos 20.
La presente divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende una heparina bioequivalente producida usando los métodos divulgados anteriormente. La composición farmacéutica también puede incluir uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la heparina puede formularse, por ejemplo, en agua o en solución salina isotónica o glucosa. En algunas realizaciones, la composición de heparina puede incluir uno o más conservantes, tal como bisulfito o un antimicrobiano, tal como alcohol bencílico.
En algunas realizaciones, la heparina bioequivalente producida según esta divulgación puede usarse en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, que puede ser, por ejemplo, sal de sodio o sal de potasio. Los ejemplos no limitativos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen litio, sodio, calcio, bario, potasio, magnesio y amonio. En algunas realizaciones, la heparina bioequivalente producida según esta divulgación anterior puede usarse como material de partida para la preparación de una heparina de bajo peso molecular. Esto puede hacerse, por ejemplo, reemplazando simplemente la heparina intestinal porcina con heparina bioequivalente producida según esta divulgación y luego usando uno de los métodos conocidos para la síntesis de una heparina de bajo peso molecular. En una realización, una sal, tal como por ejemplo, una sal de sodio o una sal de potasio, de heparina bioequivalente producida según la presente divulgación puede convertirse en la sal de benztonio que luego puede bencilarse y tratarse con una base, tal como la sal de hidróxido de sodio o hidróxido de potasio, para despolimerizar parcialmente. El producto de heparina de bajo peso molecular resultante se convertiría en una sal, tal como una sal de sodio o una sal de potasio, y se purificaría. Este procedimiento puede producir una heparina de bajo peso molecular, la enoxaparina. Pueden usarse otros procedimientos para convertir la heparina bioequivalente producida según la presente descripción en otras heparinas de bajo peso molecular, tal como, por ejemplo, daltaparina o
tinzaparina.
La presente divulgación también incluye un método para diluir la sangre en un sujeto, tal como un ser humano, que comprende producir heparina bioequivalente usando uno de los métodos divulgados anteriormente y administrar al sujeto una cantidad eficaz de la heparina bioequivalente producida.
La presente divulgación también incluye un método para tratar y/o prevenir una enfermedad o afección, que es susceptible a la heparina, que comprende producir heparina bioequivalente usando uno de los métodos divulgados anteriormente y administrar una cantidad eficaz de la heparina bioequivalente producida a un sujeto, tal como un ser humano. Los ejemplos no limitativos de tal enfermedad o afección incluyen vena profunda, trombosis, embolia pulmonar y tromboembolia arterial.
La heparina bioequivalente también puede usarse en terapia extracorpórea, incluyendo la diálisis renal para pacientes con insuficiencia renal o en la oxigenación de la sangre para pacientes sometidos a derivación cardiopulmonar en cirugía a corazón abierto.
La cantidad eficaz de la heparina bioequivalente puede significar una cantidad que puede ser suficiente para producir un efecto deseado, tal como sangre fluida o tratar una enfermedad o afección, que es susceptible a la heparina.
Las dosis de heparina bioequivalente pueden ser las mismas que las usadas para la heparina USP, que se produce naturalmente, tal como la heparina porcina o bovina.
La heparina bioequivalente puede administrarse usando diversos modos de administración. En algunas realizaciones, la heparina bioequivalente puede administrarse por vía parenteral. Por ejemplo, la heparina bioequivalente puede inyectarse por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular.
La presente divulgación también proporciona una composición que comprende el primer producto intermedio NS tal como se divulgó anteriormente. Tal composición puede comprender al menos el 50 % o al menos el 60 % o al menos el 70 % o al menos el 80 % o al menos el 90 % o al menos el 95 % o al menos el 96 % o al menos el 97 % o al menos el 98 % o al menos el 99 % o al menos el 99,5 % del primer producto intermedio NS. La composición puede ser tal que esté libre o sustancialmente libre de cualquier polisacárido distinto del primer producto intermedio NS. El término “sustancialmente libre” puede significar que ningún otro polisacárido puede detectarse en cantidades medibles. Los métodos de detección pueden incluir espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) o tratamiento con tres heparinas liasas que descomponen la heparina o el producto intermedio de heparina en disacáridos que pueden eliminarse mediante diálisis o cromatografía de exclusión molecular. Otros productos distintos de la heparina o productos intermedios distintos de la heparina serían resistentes al tratamiento con heparina liasa y podrían recuperarse y detectarse usando métodos convencionales, tales como la espectroscopia de RMN.
La presente divulgación también proporciona una composición que comprende el segundo producto intermedio NS2S tal como se divulgó anteriormente. Tal composición puede comprender al menos el 50 % o al menos el 60 % o al menos el 70 % o al menos el 80 % o al menos el 90 % o al menos el 95 % o al menos el 96 % o al menos el 97 % o al menos el 98 % o al menos el 99 % o al menos el 99,5 % del segundo producto intermedio NS2S. El kit o la composición pueden estar libres o sustancialmente libres de cualquier polisacárido distinto del segundo producto intermedio NS2S.
La presente divulgación también proporciona una composición que comprende el tercer producto intermedio NS2S6S tal como se divulgó anteriormente. Tal kit o composición puede comprender al menos el 50 % o al menos el 60 % o al menos el 70 % o al menos el 80 % o al menos el 90 % o al menos el 95 % o al menos el 96 % o al menos el 97 % o al menos 98 % o al menos 99 % o al menos 99,5 % del tercer producto intermedio NS2S6S. El kit o la composición pueden estar libres o sustancialmente libres de cualquier polisacárido distinto del tercer producto intermedio NS2S6S. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el kit o la composición pueden estar libres o sustancialmente libres de heparina.
Las realizaciones descritas en el presente documento se ilustran adicionalmente, aunque de ningún modo se limitan a, los siguientes ejemplos de trabajo.
Ejemplos
Ejemplo 1: Producción de heparosano.
Se usó Escherichia coli K5 (Serovar O10:K5:H4; n.° de ATCC 23506) o Escherichia coli Nissle 1917 (Serovar O6:K5:H1) para la producción de heparosano (Cress, B. F., Toparlak, O. D., Guleria, S., Lebovich, M., Stieglitz, J. T., Englaender, J. A., Jones, J. A., Linhardt, R. J. y Koffas, M. A. G. (2015) CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS
Synthetic Biology. 4, 987-1000; Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S. y Linhardt, R. J. (2010) E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnology and Bioengineering. 107, 964-973; Wang, Z., Dordick, J. S. y Linhardt, R. J. (2011) Escherichia coli K5 heparosan fermentation and improvement by genetic engineering. Bioengineered bugs. 2, 63-67). Se realizaron fermentaciones semicontinuas de alta densidad celular a 5 lo 45-90 l usando un fermentador Eppendorf BioFlo 320 0 Biostat, respectivamente. Las células se cultivaron en un medio definido con glucosa (pH 6,8 ± 0,01), que contenía glucosa (normalmente 20 g/l), fosfato monobásico de potasio (normalmente 13,5 g/l), fosfato de amonio (normalmente 4,0 g/l), sulfato de magnesio heptahidratado (normalmente 1,4 g/l), ácido cítrico (normalmente 1,7 g/l) y disolución de metales traza (normalmente 10,0 ml/l). La disolución de metales traza en HCl 5 M (1,5 l) se componía de FeSO47H2O (15 g), CaCh (3.0 g), ZnSO4.7H2O (3,3 g), MnSO4.H2O (568 mg), CuSO4.5H2O (1,5 g), (NH4)6MoyO24.4H2O (0,15 g) y Na2B4O7.10H2O (0,03 g). Se inocularon matraces de siembra (semilla I), que contenían medios definidos con glucosa (pH 6,8 ± 0,01) con disoluciones madre de glicerol y se incubaron durante 8-16 h a 37 °C en un agitador rotatorio a 200-250 rpm. A continuación, los matraces de siembra (semilla II), que contenían medios definidos con glucosa (pH 6,8 ± 0,01) se inocularon a una densidad de siembra del 10 % de la semilla I y se incubaron durante 8-16 h a 37 °C en un agitador rotatorio a 200-250 rpm. A continuación, se inocularon células de la semilla II a una densidad de siembra del 5-10 % en un fermentador que contenía medio definido con glucosa esterilizado (pH 6,8 ± 0,01). Las células se cultivaron con oxígeno disuelto al 30 %, 37 °C y el pH se mantuvo a 6,8 ± 0,01 usando HCl 2 N/NH4OH 5 M. Se monitorizaron los niveles de oxígeno disuelto, el pH y el crecimiento celular (medido con densidad óptica, DO600nm) a lo largo de la fermentación. Las células se alimentaron exponencialmente y la tasa de alimentación se controló para mantener la concentración de glucosa y el nivel de oxígeno disuelto en el cultivo, con un alimento esterilizado concentrado que contenía glucosa (700 g/l), suplementado con fosfato de potasio monobásico (47 g/l), sulfato de magnesio heptahidrato (20 g/l), tiamina (0,4 g/l) y disolución de metales traza (20 ml/l). Las fermentaciones se detuvieron cuando la DO600 alcanzó 135-200 (normalmente 140). El sobrenadante (que contenía heparosano) se recogió a 4 °C mediante centrifugación. El procedimiento de purificación del heparosano del sobrenadante del cultivo incluyó el blanqueo con hipoclorito de sodio al 1,2 (%, p/p) y la precipitación con sulfato de amonio normalmente al 60 % de saturación. El precipitado se disolvió en agua y se dializó para obtener heparosano (Bhaskar, U. Chemoenzymatic Synthesis of Heparin for a Safer Bioengineered Alternative. Tesis doctoral, Instituto Politécnico Rensselaer, Troy, NY, EE. UU. (2014)).
Ejemplo 2: Producción del producto intermedio n.° 1 (NS).
Se N-desacetiló químicamente el heparosano obtenido del ejemplo 1 y se despolimerizó tal como se informó anteriormente (Z. Wang, J. Li, S. Cheong, U. Bhaskar, A. Onishi, F. Zhang, J. S. Dordick, R. J. Linhardt (2011), Response surface optimization of the heparosan N-deacetylation in producing bioengineered heparin, Journal of Biotechnology, 156, 188-196). Se hizo reaccionar una concentración al 1 % de heparosano con hidróxido de sodio 1 M a una temperatura de 50 a 55 °C durante de 18 a 28 h. Luego, la mezcla de reacción se ajustó a pH 7 con HCl, seguido de 48 h de N-sulfonación química por una cantidad en exceso de complejo de trióxido de trimetilaminaazufre. Luego, se usó la precipitación con etanol para fraccionar el primer producto intermedio NS con las propiedades de peso molecular deseadas (A. Onishi (2015), Detailed physicochemical and biological analyses of heparins from various sources, tesis doctoral, Instituto Politécnico Rensselaer, Troy, NY, EE. UU.). El contenido de grupos disacáridos NS del primer producto intermedio NS fue del 78,3 al 99,3 % en mol. El peso molecular fue de 15.100 a 18.100 Da, el porcentaje de cadenas de polisacáridos de heparina con peso molecular superior a 24.000 fue de 7,0 a 17,4; el porcentaje de cadenas con pesos moleculares que oscilan desde 16.000 hasta 24.000 Da fue de 1,1 a 2,3.
Ejemplo 3: Análisis de disacáridos, análisis de peso molecular y análisis de actividad.
Análisis de disacáridos global
El análisis de disacáridos se usó para medir la composición de disacáridos de heparina USP porcina o productos intermedios de heparina modificada por bioingeniería. Una muestra se digiere en ocho disacáridos constituyentes mediante tratamiento con heparinasas I, II y III. A continuación, los disacáridos generados se separan y miden mediante cromatografía de líquidos de alta presión-espectrometría ultravioleta (HPCL-UV). Para NS (primer producto intermedio), también puede usarse espectroscopia de resonancia magnética nuclear 1H (RMN) para cuantificar los dos disacáridos constitucionales (es decir, 0S y NS). Si bien las composiciones de disacáridos de la invención se describen como % en moles, es bien sabido en la técnica que también pueden describirse como % del área bajo la curva (AUC), como % en peso o mediante otra terminología conocida dentro del alcance de la invención.
Cabe señalar que en la invención, el % de AUC del disacárido es igual al % en mol del disacárido con la suposición de que los ocho disacáridos tienen el mismo coeficiente de extinción molar a 232 nm, lo que se cree que es una suposición adecuada por varias razones. En primer lugar, es bien sabido que cada uno de los ocho disacáridos tiene exactamente un ácido urónico insaturado A-4-5 (AUA) en la estructura. En segundo lugar, un artículo reciente sobre el análisis de disacáridos de heparina indicó que la cuantificación de disacáridos se basa en la suposición de consenso basada en datos de que el coeficiente de extinción molar a 232 nm para los oligosacáridos insaturados A-4-5 es constante” (P. Mourier et al. Quantitative compositional analysis of heparin using exhaustive heparinase digestion and strong anion exchange chromatography. Anal. Chem. Res. 3, 46-53 (2015)). En tercer lugar, hay
coherencia del coeficiente de extinción molar a 232 nm entre cinco oligosacáridos derivados de heparina diferentes (5063 /- 10 %, 5331 /-0,6 %, 5066 /-3,7 %, 5657 /-1,4 % y 5275 /-%, M 'W ) (KG. Rice y R. J. Linhardt. Study of structurally defined oligosaccharide substrates of heparin and heparan monosulfate lyases. Carbohydr. Res. 190, 219-233 (1989)). Por último, en la realidad se usa una suposición casi idéntica en la actual heparina uSp porcina; un método analítico en la heparina USP porcina asume que todos estos ocho disacáridos tienen el mismo coeficiente de extinción molar en la longitud de onda muy cercana a 234 nm (USP40 Chemical Tests, <207> Test for 1,6-Anhydro Derivative for Enoxaparin Sodium, pp 261 -266 (Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos, Rockville, MD, EE. UU., 2017)). En 1H-RMN, el % de AU relativo es equivalente al % en mol.
Análisis de productos intermedios por 1H-RMN
Se realizó 1D 1 H-RMN en las siguientes condiciones: temperatura de 298 K, tiempo de retardo de reciclaje de al menos 2 s, tiempo de adquisición de al menos 0,75 s, número de exploraciones de al menos 16, el disolvente era D2O. Los espectros de 1D1 H-RMN del heparosano purificado, cada producto intermedio, heparina biosintética y heparina porcina USP se muestran en la figura 3. Con cuatro etapas de modificaciones quimioenzimáticas desde el heparosano precursor hasta el producto final, la heparina biosintética resultante tenía una estructura química muy similar en comparación con la heparina porcina USP.
Con respecto al análisis de disacáridos del primer producto intermedio por 1H-RMN, se usó el área del pico del protón H-1 de un residuo de glucosamina para la cuantificación. El protón H-1 de N-acetil glucosamina (disacárido 0S) apareció a aproximadamente 5,31 ppm mientras que el protón H-1 de N-sulfo glucosamina (disacárido NS) apareció a aproximadamente 5,55 ppm. La composición de disacáridos se expresa como % en mol; el % de AUC es equivalente al % en mol.
Análisis de disacáridos por HPCL-UV
Brevemente, las heparinasas digieren una muestra analítica y luego los disacáridos generados se separan y miden mediante intercambio aniónico fuerte (SAX)-HPCL-UV.
Las condiciones analíticas típicas son las siguientes; se debe tener en cuenta que pueden aplicarse las modificaciones menores no esenciales que no afectan las composiciones de disacáridos, tal como una reducción/aumento de escala lineal de la reacción de digestión con heparinasas, el cambio de temperatura de la columna SAX hasta 50 °C.
Se mezcló una muestra analítica (100 |ig) con el tampón de digestión concentrado (la concentración final es NH4OAc 50 mM, CaClz 2 mM), heparinasas I, II y III de Flavobacterium heparinum (> 100 mUI de cada heparinasa, preparado por el laboratorio de presentes inventores tal como se describe en (Zhang, F., et al. Structural characterization of heparins from different commercial sources. Anal. Bioanal. Chem. 401, 2793-2803 (2011)., Zhang Z, XJ, Liu H, Liu J, Linhardt RJ. Quantification of Heparan Sulfate Disaccharides Using Ion-Pairing Reversed-Phase Microflow High-Performance Liquid Chromatography with Electrospray Ionization Trap Mass Spectrometry. Anal. Chem. 81, 4349 4355 (2009)), y agua de manera que el volumen total fue de 200 |il. La mezcla se incubó a 35 °C durante 2 h. Después de la incubación, los disacáridos generados se separaron de las heparinasas mediante el uso de (a) ultrafiltración con una columna de centrifugación con corte de peso molecular de 3 kDa (unidad de filtro centrífuga Amicon Ultra-0.5 con membrana Ultracel-3, EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) o bien, b) incubación a 95 °C durante al menos 5 min seguida de centrifugación. El estudio de comparación directa usando el segundo producto intermedio NS2S, el tercer producto intermedio NS2S6S y la heparina USP mostró que la diferencia entre (a) y (b) era como máximo del 2,6 % p/p. Se inyectaron 20 |il del disacárido generado en una columna de cromatografía SAX (columna de cromatografía Spherisorb-SAX, 4,0 * 250 mm, 5 μm, Waters, Francia). La temperatura de la columna fue de 40 °C. La fase móvil A fue NaH2PO4 1,8 mM ajustada a pH 3,0 con ácido fosfórico y la fase móvil B fue NaH2PO4 1,8 mM ajustada a pH 3,0 con NaClO4 1 M. Se aplicó un gradiente lineal de la fase móvil B (0 min, 3 % de B; 20 min, 35 % de B; 50 min, 100 % de B; 60 min, 3 % B, 80 min, 3 % B) con una velocidad de flujo de 0,45 ml/min. La detección UV se realizó a 232 nm porque el ácido urónico insaturado (AUA) de cada disacárido tiene absorbancia UV a esta longitud de onda. Los patrones de disacáridos se adquirieron de Iduron (Mánchester, RU) para identificar los picos pertenecientes a cada disacárido a 232 nm. Para garantizar la exactitud y precisión del análisis, también se digirió y analizó en cada análisis el principio farmacéutico activo de heparina sódica comercial (Celsus, Cincinnati, OH, EE. UU.). Para asegurar la linealidad del área del pico de HPLC, se analizaron una serie de diluciones de patrones de disacáridos en cada análisis. La composición de disacáridos se expresó en % p/p y/o % en mol. Los valores de % p/p se calcularon basándose en las curvas de calibración mediante una serie de patrones comerciales. Los valores de % en mol se calcularon mediante la siguiente fórmula:
% en mol de disacárido i = (100 x Ai) / (IxAx),
donde Ai es el área del pico a 232 nm del disacárido i. Ax es el área del pico; estando relacionada la suma con los ocho disacáridos que aparecían en las definiciones de la memoria descriptiva. Nuevamente, en la invención, el % de AUC de disacárido es igual al % en mol de disacárido con la suposición de que todos los 8 disacáridos tienen el
mismo coeficiente de extinción molar a 232 nm.
Análisis de disacáridos por HPCL-EM
El análisis se realizó tal como se describe en un artículo (Bhaskar, U. Chemoenzymatic Synthesis of Heparin for a Safer Bioengineered Alternative. Tesis doctoral, Instituto Politécnico Rensselaer, Troy, NY (2014).
En detalle, se mezclaron 10 μg de muestra analítica en 25 μl de agua con heparinasas I, II y III de Flavobacterium heparinum (> 10 mUI de cada heparinasa) en 5 μl de tampón concentrado (Tris 25 mM, NaCl 500 mM, imidazol 300 mM, pH 7,4). La mezcla se incubó a 35 °C durante 10 h. Después de la incubación, los disacáridos generados se recuperaron mediante filtración centrífuga con una columna giratoria de corte de peso molecular de 10 kDa (microconcentrador YM-10, EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). El flujo continuo se disolvió en agua a una concentración de 50-100 ng/2 μl para análisis de cromatografía de líquidos (CL)-espectrometría de masas (EM).
El análisis CL-EM se realizó en un instrumento Agilent 1200 LC/MSD (Agilent Technologies, Inc. Wilmington, DE, EE. UU.) equipado con una trampa de iones 6300 y una bomba binaria seguida de un detector UV. La columna usada fue una columna Poroshell 120 C18 (2,1 * 100 mm, 2,7 μm, Agilent, EE. UU.). El eluyente A fue agua/acetonitrilo (85:15) v/v, y el eluyente B fue agua/acetonitrilo (35:65) v/v. Ambos eluyentes contenían tributilamina 12 mM y acetato de amonio 38 mM con pH ajustado a 6,5 con ácido acético. Se usó un gradiente de disolución A durante 5 min seguido de un gradiente lineal de 5 a 15 min (disolución B al 0-40 %) a una velocidad de flujo de 150 μl/min.
Determinaciones de concentración y peso molecular
Los pesos moleculares se determinaron mediante cromatografía de permeación en gel (GPC), según el método monográfico de heparina USP 37, con modificaciones menores no esenciales. Se usó una precolumna TSK SWXI, 6 mm * 4 cm, 7 μm de diámetro en serie con dos columnas analíticas: TSK G4000 SWXI, 7,8 mm * 30 cm, 8 μm en serie con TSK G3000 SWXI, 7,8- mm * 30 cm, 5 μm (Tosoh Corporation, Minato-Ku, Tokio, Japón). Estas columnas se conectaron a un sistema de HPLC que consistía en una bomba Shimadzu LC-20AD, un controlador Shimadzu CBM-20A, un inyector automático Shimadzu SIL-20AHT, un horno de columna Shimadzu CTO-20AC y un detector de índice de refracción Shimadzu RID-20A (Shimadzu, Kioto, Japón). Las columnas y el detector RID se mantuvieron a 30 °C. La fase móvil fue acetato de amonio 0,1 M con azida de sodio al 0,02 % en peso y la velocidad de flujo fue de 0,6 ml/min. Un volumen de inyección de muestra fue de 20 μl. Los cromatogramas de GPC se registraron con el software LC solution versión 5.73 (Shimadzu, Kioto, Japón) y se analizaron con su función “GPC Postrun”. Para la determinación del peso molecular, se usó PR (patrón de referencia) de calibrador de peso molecular de heparina sódica USP como calibrador y PR de identificación de heparina sódica USP (USP, MD, EE. UU.) para confirmar la idoneidad del sistema. Además, se inyectaron PR de identificación de heparina sódica USP preparados en varias concentraciones para obtener una curva de calibración para calcular la concentración de las muestras de reacción usando el área bajo la curva (AUC). Todos los datos pasaron los requisitos de idoneidad del sistema como se indica en la monografía de USP. Para el cálculo se usó una ecuación polinómica de tercer orden. Las definiciones de los parámetros de peso molecular se encuentran a continuación.
El peso molecular promedio en peso (MW) se calcula con
donde Ni es el número de moléculas de peso molecular Mi. M24000 es un porcentaje de cadenas de heparina con peso molecular superior a 24.000 Da. M8000-16000/ M16000-24000 es una razón del porcentaje de heparina con un peso molecular en el intervalo de 8.000 a 16.000 Da, con respecto al porcentaje de heparina con un peso molecular en el intervalo de 16.000 a 24.000 Da.
Medición de actividad anticoagulante in vitro
Las actividades anti-Xa y anti-IIa de las heparinas se determinaron usando kits Anti-Xa (dos etapas) y Anti-IIa (dos etapas) de heparina BIOPHEN (Aniara, West Chester, Ohio). Se usaron 40 mU de ATIII humana en 80 μl de tampón R1 (Tris 0,05 M, NaCl 0,175 M, EDTA 0,0075 M, a pH 8,40 que contenía polietilenglicol al 0,1 % en peso y azida de sodio al 0,02 % en peso como conservante) para el ensayo anti-Xa. Se incubaron 10 mU de ATIII humana en 80 μl de tampón R2 (Tris 0,05 M, NaCl 0,175 M, EDTA 0,0075 M, a pH 8,40 que contiene albúmina de suero bovino al 0,2 % en peso y azida de sodio al 0,02 % en peso como conservante) mezclada con diferentes masas de heparina (intervalo de 0, 5, 10, 15 y 20 ng) durante 2 min a 37 °C. Luego, se añadió factor Xa bovino purificado (320 ng en 40 μl de tampón R1) o trombina humana purificada (960 mU en 40 μl en tampón R2) preincubados a 37 °C y se incubaron durante 2 min antes de añadir el sustrato cromogénico específico para el factor Xa (CS-01(65), 1,2 mM, 40 μl) o el sustrato cromogénico específico para trombina (CS-01(38), 1,25 mM, 40 μl). La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 2 min para el ensayo anti-Xa y 1 min para el ensayo anti-IIa y luego se detuvo con ácido
cítrico (20 mg/ml, 80 |il). La absorbancia se midió a 405 nm. Las actividades anti-Xa y anti-IIa se calcularon usando una curva de calibración de diferentes concentraciones de heparina (0-1 U/ml).
Ejemplo 4: Producción de enzimas (C5-epimerasa, 2OST, 6OST-1, 6OST-3, 3OST-1, AST-IV).
El sedimento celular (10 g de peso húmedo) de enzimas marcadas con MBP (C5 epi, 2OST, 6OST-1 y 6OST-3) se dispersó en 50 ml de tampón de purificación (Tris-HCl 25 mM (BioRad, EE. UU.), NaCl 500 nM (Sigma, EE. UU.), pH 7,5) que contiene inhibidor de proteasa (Sigma, EE. UU.) y 8000 kU/l de ADNasa I (Sigma, EE. UU.). La suspensión celular resultante se pasó a través de un microfuidizador (Microfluidics LM20, EE. UU.) a 15000 psi para la lisis celular. El desecho celular se eliminó por centrifugación a 13000 g durante 30 min a 4 °C. La enzima soluble se purificó usando 10 mL de resina de amilosa (NEB, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante.
El sedimento celular (10 g de peso húmedo) de enzimas marcadas con His6 (3OST-1 y AST-IV) se dispersó en 50 ml de tampón de purificación (Tris-HCl 25 mM, NaCl 500 mM, imidazol 30 mM, pH 7,5) que contenía inhibidor de proteasa y 8000 kU/l de ADNasa I. La lisis celular se realizó tal como se describió anteriormente y la enzima soluble se purificó usando 10 ml de Ni-NTA sepharose (GE Healthcare, Suecia) según el protocolo del fabricante. Las enzimas purificadas se analizaron mediante análisis en gel SDS-PAGE (BioRad, EE. u U.).
Ejemplo 5: Preparación y caracterización de la actividad de catalizadores enzimáticos inmovilizados.
Las enzimas marcadas con His6 (3OST-1 y AST-IV) se eluyeron con tampón Tris-HCl 25 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 500 mM e imidazol 500 mM de perlas de Ni-NTA sepharose y las enzimas marcadas con MBP (C5 epi, 2OST, 6OST-1 y 6OST-3) se eluyeron de resina de amilosa con tampón Tris-HCl 25 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 500 mM y maltosa 40 mM. El tampón de enzimas eluidas se reemplazó con tampón de acoplamiento (tampón de fosfato de sodio (Alfa Aesar, EE. UU.), 100 mM; NaCl, 150 mM; pH 7,5) usando un filtro centrífugo de 10 kDa (Millipore, EE. UU.). Para la inmovilización covalente de enzimas, se incubaron 30-40 mg de microperlas comerciales, por ejemplo, CNBr Sepharose (GE Healthcare, Suecia), Ultralink Biosupport basado en azlactona (ThermoFisher, EE. UU.) y NHS-agarosa (Thermo Fisher, EE. UU.) con 1-2 mg de enzimas individualmente durante 1 h a temperatura ambiente con volteo suave (según las instrucciones del fabricante). Después de la inmovilización covalente, las perlas respectivas se lavaron con tampón de acoplamiento y los grupos funcionales sobrantes en las perlas se extinguieron usando un tampón de extinción (Tris-HCl 100 mM y NaCl 1 M a pH 8,0) (según las instrucciones del fabricante). La eficacia de acoplamiento de las enzimas en las perlas respectivas se calculó midiendo la enzima añadida inicialmente y la enzima no unida en el sobrenadante, los lavados y la disolución de extinción. La cantidad de enzima se calculó usando el análisis de gel SDS-Page mediante el software ImageLab (BioRad, EE. UU.) y el ensayo BCA (Thermo Fisher, EE. UU.). Se usó albúmina de suero bovino (BSA) (ThermoFisher, EE. UU.) como patrón para los cálculos de eficiencia de acoplamiento.
Ejemplo 6: Producción del producto intermedio n.° 2 (NS2S).
Esta etapa de sulfatación puede realizarse con o sin un sistema de reciclaje de PAPS que comprenda PNPS, PAPS y AST-IV inmovilizado. El primer producto intermedio NS se trató con 2OST inmovilizado y C5-epi. Las condiciones detalladas de la reacción enzimática fueron las siguientes en tampón de reacción MES (50 mM, pH 7,2): 1 mg/ml de NS, 0,25 mg/ml de C5 epi, 0,5 mg/ml de 2OST, p-nitrofenilsulfato (PNPS) 10 mM y PAP1 mM (sólo si se aplicó sistema de reciclaje), temperatura de reacción a 37 °C y tiempo de reacción de 24 h. Para las reacciones sin reciclaje, se usaron las mismas condiciones que antes, excepto que en ausencia de PAP, PNPS y AST-IV, el exceso de 1,2 mM de la concentración de PAPS dependía de la tasa de conversión de NS2S objetivo. Se prepararon e inmovilizaron enzimas recién preparadas antes de la reacción tal como se describe en los ejemplos 4 y 5. Para la purificación, se usó una ultrafiltración con membrana MWCO de 5 kDa para retirar compuestos posteriores a la reacción tales como PAP y PAPS (más PNP y PNPS si se aplicó reciclaje). Los retenidos se concentraron y recogieron para el análisis de disacáridos. Esta etapa podría repetirse si el % de NS2S no alcanza el objetivo.
Ejemplo 7: Producción del producto intermedio n.° 3 (NS2S6S y NS6S).
La etapa de reacción para la producción del producto intermedio n.° 3 sigue el método usado para el producto intermedio n.° 2, excepto que NS2S reemplaza a NS y 6OST-1 y 6OST-3 inmovilizadas (ambos a 0,5 mg/ml) reemplazan a C5-epi y 2OST. Esta reacción podría repetirse si el % de NS2S6S (TriS) no alcanza el objetivo.
Ejemplo 8: Producción de heparina biosintética.
La enzima recombinante inmovilizada 3OST-1 se preparó de la misma manera que se menciona en el ejemplo 5. Las reacciones se realizaron en las mismas condiciones que se usaron para el segundo y tercer producto intermedio excepto que las enzimas se reemplazaron con 3OST-1 inmovilizada. La heparina biosintética final se purificó usando cromatografía de intercambio aniónico fuerte (SAX) con resina Q Sepharose. Brevemente, la heparina biosintética se unió a la resina en disolución de NaCl 40 mM seguido de un lavado con disolución de NaCl 400 mM. La heparina biosintética purificada se eluyó usando una disolución de NaCl 4 M seguido de desalinización y concentración. La heparina biosintética purificada se recogió para análisis de composición de disacáridos, análisis de peso molecular y
ensayos de actividad anticoagulante in vitro tal como se indica en el ejemplo 3. Esta etapa podría repetirse si la actividad anticoagulante no alcanzaba la especificación USP.
Ejemplo 9: Métodos precisos para la síntesis de dos heparinas biosintéticas (BSH) con propiedades de actividad y peso molecular que cumplen con las especificaciones de la heparina USP porcina y dos heparinas biosintéticas (BSH) que no cumplen con las especificaciones de actividad y peso molecular de la heparina USP porcina.
Producción de lote h de heparina biosintética
Se trató un total de 40 mg de NS (contenido de NS del 85,4 %) con 2OST y C5-epi en las condiciones descritas en el ejemplo 6. Las condiciones de reacción fueron las siguientes en tampón de reacción MES (50 mM, pH 7,2): 1 mg/ml NS, 0,25 mg/ml de C5 epi, 0,5 mg/ml de 2OST y PAPS 1,45 mM. La reacción se incubó en un rodillo a 37 °C durante 24 h. Las perlas de enzima se retiraron de la solución y se lavaron con 3 volúmenes de columna (CV) de tampón MES 50 mM (pH 7,2) para recuperar el polisacárido. La solución de reacción y el tampón de lavado de 3 CV se combinaron y se cargaron en una columna giratoria de membrana MWCO de 5 kDa para concentrar y eliminar los compuestos posteriores a la reacción. El retenido se recogió y se tomaron muestras para el análisis de disacáridos tal como se menciona en el ejemplo 3. La composición de disacáridos del producto intermedio NS2S resultante se muestra en la tabla 3.
Tabla 3. Resumen del historial de composición de disacáridos y actividad anticoagulante para el lote h de heparina biosintética.
En la segunda etapa enzimática, se trataron 3 mg del producto intermedio NS2S resultante con un contenido de NS2S del 60 % con 6OST-1 y 6OST-3 inmovilizadas para generar el producto intermedio NS2S6S. El método de inmovilización fue tal como se menciona en el ejemplo 5. Las condiciones de la reacción de sulfatación fueron las mismas que las mencionadas en el ejemplo 7. Una vez completada la reacción, el polisacárido se recuperó, purificó y analizó tal como se mencionó anteriormente para la producción de NS2S. La composición de disacáridos de este producto intermedio NS2S6S después del 1er tratamiento con 6OST fue tal como se muestra en la tabla 3. Para aumentar el % de TriS hasta más del 40 %, el tratamiento con 6OST se repitió de nuevo usando el mismo método. El producto intermedio NS2S6S resultante tras el 2° tratamiento obtuvo el 43,5 % del disacárido NS2S6S y el 10,5 % del disacárido NS6S.
Este producto intermedio NS2S6S después del 2° tratamiento con 6OST (85,4-60,0-43,5) se trató adicionalmente con 3OST-1 inmovilizada para generar el lote h de heparina biosintética. La inmovilización de 3OST-1 se realizó tal como se describe en el ejemplo 5. Las condiciones de reacción de sulfatación y los métodos de purificación del lote h de heparina biosintética fueron los mismos que los descritos en el ejemplo 8, y seguidos de peso molecular, la determinación de disacáridos y ensayos de actividad in vitro tal como se menciona en el ejemplo 3. Lote h de heparina biosintética, después del 1er tratamiento con 3OST-1 sólo alcanzó una actividad anti-IIa de 160 U/mg, que es inferior a la especificación de 180 U/mg de heparina USP porcina (tabla 3). Por tanto, el producto intermedio se trató de nuevo con 3OST-1 seguido del uso de la misma purificación y análisis descritos anteriormente. Lote h de heparina biosintética después del 2° tratamiento con 3OST-1 tuvo anti-IIa de 396 U/mg, anti-Xa de 365 U/mg y anti-Xa/anti-IIa de 0,92 con un peso molecular promedio en peso de 17.500 Da, porcentaje de fracciones con Mw superior a 24.000 de 16,8, y la razón entre fracciones con Mw de 8.000 a 16.000 y Mw de 16.000 a 24.000 de 1,3 cada una. Tanto la actividad anticoagulante como las propiedades de peso molecular del lote h de heparina biosintética estaban dentro de las especificaciones de heparina USP porcina.
Producción de lote w de heparina biosintética
Se trató un total de 25 mg de NS (92,7 % de contenido de NS) con 2OST y C5 epi en las condiciones descritas en el ejemplo 6. Brevemente, las condiciones de reacción fueron las siguientes: 1 mg/ml (2,23 mM) de NS, 0,25 mg/ml
C5-epi, 2OST 0,5 mg/ml, AST-IV 0,5 mg/ml, PNPS 10 mM y PAPS 1,61 mM en tampón MES 50 mM (pH 7,2). La reacción se incubó en un rodillo a 37 °C durante 24 h. Las perlas de enzima se retiraron de la disolución y se lavaron con 3 volúmenes de columna (VC) usando tampón MES 50 mM (pH 7,2) para recuperar todos los polisacáridos. La disolución de reacción y el tampón de lavado de 3 VC se combinaron y se cargaron en una columna giratoria de membrana MWCO de 5 kDa para concentrar y retirar los compuestos posteriores a la reacción. El retenido se recogió y se tomaron muestras para el análisis de disacáridos tal como se menciona en el ejemplo 3. La composición de disacáridos del producto intermedio NS2S resultante es tal como se muestra en la tabla 4. Este sustrato después del 1er tratamiento con 2OST/C5-epi sólo alcanzó un % de NS2S del 68,9 %. Por tanto, la reacción de 2OST-1/C5 se repitió dos veces para aumentar el % de NS2S hasta el 75 % usando el mismo método (tabla 4). Un total de 3 mg del producto intermedio NS2S resultante con un grupo disacárido NS2S al 75,4 % se trató adicionalmente con 6OST-1 y 6OST-3 inmovilizadas para generar el producto intermedio NS2S6S. El método de inmovilización fue tal como se menciona en el ejemplo 5. Las condiciones de reacción de sulfatación fueron las mismas que las mencionadas en el ejemplo 7 con el sistema de reciclaje de PAPS. Una vez completada la reacción, el polisacárido se recuperó, purificó y analizó tal como se mencionó anteriormente para la etapa de producción de NS2S. La composición de disacáridos de este producto intermedio NS2S6S después del tratamiento con 6OST-1 y 3 se muestra en la tabla 4, y contenía un 54,5 % de disacárido NS2S6S (TriS) y un 14,3 % de disacárido NS6S.
Este producto intermedio NS2S6S se trató adicionalmente con 3OST-1 inmovilizada para generar el lote w de heparina biosintética. La inmovilización de 3OST-1 fue tal como se menciona en el ejemplo 5. Las condiciones de reacción de sulfatación y los métodos de purificación del lote w de heparina biosintética fueron los mismos que en el ejemplo 8 con reciclaje de PAPS, y seguidos de peso molecular, determinación de disacáridos y ensayos de actividad in vitro tal como se menciona en el ejemplo 3. El lote w de heparina biosintética tras el tratamiento con 3OST-1 alcanzó una actividad anti-IIa de 343 U/mg, anti-Xa de 393 U/mg y anti-Xa/anti-IIa de 1,10, con un peso molecular promedio en peso de 15.500 Da, el porcentaje de fracciones con peso molecular superior a 24.000 de 6,6, y la razón entre fracciones con Mw de 8.000 a 16.000 y Mw de 16.000 a 24.000 de 1,7. Tanto la actividad anticoagulante como el Mw del lote w de heparina biosintética estaban dentro de las especificaciones de heparina USP porcina.
Tabla 4. Resumen del historial de composición de disacáridos y actividad anticoagulante para el lote w de heparina biosintética.
En algunos casos de lotes de heparina biosintética, los tratamientos enzimáticos individuales para el segundo y tercer producto intermedio, respectivamente, cumplen con las especificaciones de heparina USP porcina.
Producción del lote 1 de heparina biosintética que no cumple con las especificaciones de actividad y peso molecular de la heparina USP porcina
Se trató un total de 140 mg de NS (92,7 % de contenido de NS) con 2OST-1 y C5-epi en las condiciones mencionadas en el ejemplo 6. Brevemente, las condiciones de reacción fueron las siguientes: 1 mg/ml (2,23 mM) de NS, 0,25 mg/ml de C5 epi, 0,5 mg/ml de 2OST y PAPS 2 mM en tampón MES 50 mM (pH 7,2). La reacción se incubó en un rodillo a 37 °C durante 24 h. Las perlas de enzima se retiraron de la disolución y se lavaron con 3 volúmenes de columna (VC) usando tampón MES 50 mM (pH 7,2) para recuperar todo el sustrato. La disolución de reacción y el tampón de lavado de 3 VC se combinaron y se cargaron en una columna giratoria de membrana MWCO de 5k Da para concentrar y retirar los compuestos posteriores a la reacción. El retenido se recogió y se tomaron muestras para el análisis de disacáridos tal como se menciona en el ejemplo 3. El segundo producto intermedio NS2S alcanzó un 72,4 % de disacáridos NS2S según el análisis de disacáridos (tabla 5).
Un total de 10 mg del producto intermedio NS2S resultante con un contenido de disacárido NS2S del 72,4 % se trató adicionalmente con 6OST-1 y 6OST-3 inmovilizadas para generar el producto intermedio NS2S6S. El método de inmovilización fue tal como se menciona en el ejemplo 5. Las condiciones de la reacción de sulfatación fueron las mismas que las mencionadas en el ejemplo 7. Una vez completada la reacción, el polisacárido se recuperó, purificó y analizó tal como se mencionó anteriormente en la etapa de sulfatación de NS2S. La composición de disacáridos de este producto intermedio NS2S6S después del tratamiento con 6OST-1 y 3 se muestra en la tabla 5 y consistió en el 41,0 % del disacárido NS2S6S (TriS) y el 3,7 % del disacárido NS6S.
Este producto intermedio NS2S6S se trató adicionalmente con 3OST-1 inmovilizada. La inmovilización de 3OST-1 fue tal como se menciona en el ejemplo 5. Las condiciones de reacción de sulfatación y el método de purificación fueron los mismos que en el ejemplo 8, seguidos del peso molecular promedio en peso, la composición del disacárido y ensayos de actividad in vitro tal como se menciona en el ejemplo 3. Este lote posterior al tratamiento con 3OST-1 sólo alcanzó una actividad anti-IIa de 112 U/mg, anti-Xa de 93 U/mg y anti-Xa/anti-IIa de 0,80. Con el fin de aumentar la actividad anti-IIa para cumplir con la especificación de la USP, este lote 1 no equivalente se trató nuevamente con 3OST-1 inmovilizada usando el mismo método que se menciona en el ejemplo 8. Sin embargo, la actividad anti-IIa aún se mantuvo baja (114 U /mg) que no alcanza las 180 U/mg requeridas según las especificaciones de heparina USP porcina.
Tabla 5. Resumen del historial de composición de disacáridos y actividad anticoagulante para el lote 1 de heparina biosintética.
Producción del lote 2 de heparina biosintética que no cumple con las especificaciones de actividad y peso molecular de la heparina USP porcina
Se trató un total de 40 mg de NS (92,7 % de contenido de NS) con 2OST y C5-epi en las condiciones mencionadas en el ejemplo 6. Brevemente, las condiciones de reacción fueron las siguientes: 1 mg/ml (2,23 mM) de NS, 0,25 mg/ml C5 epi, 0,5 mg/ml 2OST y PAPS 2 mM en tampón MES 50 mM (pH 7,2). La reacción se incubó en un rodillo a 37 °C durante 24 h. Las perlas de enzima se retiraron de la disolución y se lavaron con 3 volúmenes de columna (VC) usando tampón MES 50 mM (pH 7,2) para recuperar todos los polisacáridos. La disolución de reacción y el tampón de lavado de 3 VC se combinaron y se cargaron en una columna giratoria de membrana MWCO de 5 kDa para concentrar y retirar los compuestos posteriores a la reacción. El retenido se recogió y se tomó una muestra para el análisis de disacáridos tal como se menciona en el ejemplo 3. El segundo producto intermedio NS2S alcanzó un 81,4 % de disacáridos NS2S según el análisis de disacáridos (tabla 6).
Un total de 3 mg del producto intermedio NS2S resultante con un contenido de disacárido NS2S del 81,4 % se trató adicionalmente con 6OST-1 y 6OST-3 inmovilizadas para generar el producto intermedio NS2S6S. El método de inmovilización fue tal como se menciona en el ejemplo 5. Las condiciones de la reacción de sulfatación fueron las mismas que las mencionadas en el ejemplo 7. Una vez completada la reacción, el polisacárido se recuperó, purificó y analizó como se mencionó anteriormente en la etapa de sulfatación de NS2S. La composición de disacáridos de este producto intermedio NS2S6S después del tratamiento con 6OST-1 y 3 se muestra en la tabla 6 y consistió en el 61,0 % del disacárido NS2S6S (TriS) y el 2,5 % del disacárido NS6S.
Este producto intermedio NS2S6S se trató adicionalmente con 3OST-1 inmovilizada. La inmovilización de 3OST-1 fue tal como se menciona en el ejemplo 5. Las condiciones de reacción de sulfatación y el método de purificación fueron los mismos que en el ejemplo 8, seguidos de peso molecular promedio en peso, el contenido de disacáridos y ensayos de actividad in vitro tal como se menciona en el ejemplo 3. Este lote posterior al tratamiento con 3OST-1 sólo alcanzó una actividad anti-IIa de 49 U/mg, que estaba muy lejos de la especificación de USP de 180 U/mg. Este lote 2 no equivalente demostró no ser equivalente a la heparina USP porcina.
Tabla 6. Resumen del historial de composición de disacáridos y actividad anticoagulante para el lote 2 de heparina biosintética.
GENERACION DE HEPARINA BIOSINTETICA A TRAVES DE TRES PRODUCTOS INTERMEDIOS
Descripción general
A continuación se describen múltiples lotes de heparina biosintética que cumplieron con los requisitos de la USP en cuanto a la actividad biológica y, cuando se midió, en cuanto al peso molecular. La heparina biosintética también exhibió un contenido de disacáridos equivalente a la heparina USP porcina. Estos experimentos se realizaron junto con cromatografía de líquidos de alta resolución y espectroscopia de resonancia magnética nuclear para determinar cuantitativamente el alcance y la naturaleza de la sulfatación.
La generación de heparina biosintética requiere que los productos intermedios generados en cada etapa del procedimiento tengan contenidos de disacáridos específicos. A continuación se describe información específica sobre: (a) el contenido del grupo disacárido NS (todos los contenidos en cuanto a % de la composición total de disacáridos) del primer producto intermedio NS; (b) el contenido del grupo disacárido NS2S y NS del segundo producto intermedio NS2S; y (c) el contenido de grupos disacáridos NS2S6S, NS6S, NS2S y NS del tercer producto intermedio NS2S6S/TriS en la síntesis de heparina bioequivalente. El primer producto intermedio NS tenía el peso molecular promedio en peso (Mw) y la distribución de peso molecular apropiados para proporcionar un segundo y tercer producto intermedio del peso molecular apropiado para proporcionar una heparina biosintética dentro de las especificaciones de la USP.
RESUMEN DE LOTES QUE CUMPLEN CON LAS ESPECIFICACIONES DE HEPARINA USP PORCINA
Los lotes de a, b, c y d se divulgaron en la solicitud provisional de EE. UU. 62/384.341. Los datos de disacáridos en la tabla de esta sección son % en mol. El valor de % en mol que se muestra puede representarse como % p/p tal como aparece en la solicitud provisional de EE. UU. 62/384.341.
g p
Información de resumen:
Tabla 7. Resumen de % de NS en primer producto intermedio NS
Tabla 8. Resumen de % de NS2S, NS en el segundo producto intermedio NS2S
Tabla 9. Resumen de % de TriS, NS, NS2S, NS6S en el tercer producto intermedio NS2S6S
Tabla 10. Resumen de escalas y volúmenes de reacción para heparinas biosintéticas
En resumen, puede ser importante usar el primer producto intermedio NS con un contenido de grupo NS específico, Mw y distribución de peso molecular que se muestra anteriormente para obtener con éxito un segundo y un tercer producto intermedio específicos y, finalmente, producir BSH que pueda cumplir con los criterios de heparina USP. Tabla 11. Datos de disacáridos en % p/p de los lotes a, b, c y d de BSH. Estos lotes se divulgaron en la solicitud provisional estadounidense n.° 62/384.341 y también son BEqH.
El experto en la técnica entenderá que los datos de disacáridos pueden expresarse en % en mol (tal como se usa en
el presente documento) o en % en peso (tal como se usa en la solicitud provisional).
Lotes de heparina biosintética que aparecieron en la solicitud provisional estadounidense n.° 62/384.341 y que no cumplen con las especificaciones de peso molecular y actividad de heparina USP porcina
La solicitud provisional incluía dos lotes que no cumplen con las especificaciones de actividad y peso molecular de la heparina USP porcina. Las tablas 12 y 13 a continuación resumen los datos. Los valores de disacáridos se expresan tanto en % p/p como en % mol.
Tabla 12.
# medido mediante 1H-RMN, * medido mediante CL-EM
# medido mediante 1H-RMN
Tabla 13. Resumen de pesos moleculares
Claims (11)
1. Glicosaminoglicano que comprende el 78-99 %, el 81-97 %, el 83-95 % o el 85-93 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS), teniendo el glicosaminoglicano un peso molecular promedio en peso para formar un producto de heparina final de 15.000-19.000 Da, siendo el porcentaje de cadenas de heparina con peso molecular superior a 24.000 Da de no más del 20 % del total, y siendo la razón de cadenas con pesos moleculares de entre 8.000 y 16.000 con respecto a cadenas con pesos moleculares de 16.000 a 24.000 Da de no menos de 1,0.
2. Glicosaminoglicano que comprende el 44-80 %, el 50-78 %, el 55-77 % o el 60-76 % de grupo disacárido N-sulfatado, 2-sulfatado (NS2S) y grupos disacárido NS, preferiblemente que comprende el 13-39 %, el 14 35 %, el 15-30 % o el 16-26 % de grupo NS, el glicosaminoglicano tiene un peso molecular promedio en peso para formar un producto de heparina final de 15.000-19.000 Da, siendo el porcentaje de cadenas de heparina con un peso molecular superior a 24.000 Da de no más del 20 % del total, y siendo la razón de cadenas con pesos moleculares de entre 8.000 y 16.000 con respecto a cadenas con pesos moleculares de 16.000 a 24.000 Da de no menos de 1,0.
3. Glicosaminoglicano que comprende el 36-70 % de grupo disacárido N-sulfatado, 2-sulfatado, 6-sulfatado (NS2S6S) y el 6-32 % de grupo disacárido N-sulfatado, 6-sulfatado (NS6S), el 40-67 % de grupo disacárido NS2S6S y el 6-26 % de grupo disacárido NS6S, o el 43-64 % de grupo disacárido NS2S6S y el 6-22 % de grupo disacárido NS6S; y grupo disacárido N-sulfatado, 2-sulfatado (NS2S) y grupo disacárido N-sulfatado (NS), que comprende preferiblemente el 0-27 % de grupo NS2S y el 1-22 % de grupo NS o el 12-27 % de grupo NS2S y el 1-17 % de grupo NS, el glicosaminoglicano tiene un peso molecular promedio en peso para formar un producto final de heparina de 15.000-19.000 Da, siendo el porcentaje de cadenas de heparina con un peso molecular superior a 24.000 Da de no más del 20 % del total, y siendo la razón de cadenas con pesos moleculares de entre 8.000 y 16.000 con respecto a cadenas con pesos moleculares de 16.000 a 24.000 Da de no menos de 1,0.
4. Glicosaminoglicano según la reivindicación 3, que no contiene grupos disacáridos 3S.
5. Método para producir una heparina biosintética, que comprende;
a. obtener un glicosaminoglicano que comprende el 36-70 % de grupo disacárido NS2S6S, el 6-32 % de grupo disacárido NS6S, el 0-27 % de grupo NS2S y el 1-22 % de grupo NS;
b. tratar el glicosaminoglicano con una enzima, que es la isoforma 1 de 3-O-sulfotransferasa (3OST-1), en presencia de un donante de sulfato
para producir un lote de heparina biosintética,
en el que el glicosaminoglicano tiene un peso molecular promedio en peso para formar un producto de heparina final de 15.000-19.000 Da, siendo el porcentaje de cadenas de heparina con un peso molecular superior a 24.000 Da de no más del 20 % del total, y siendo la razón de cadenas con pesos moleculares de entre 8.000 y 16.000 con respecto a cadenas con pesos moleculares de 16.000 a 24.000 Da de no menos de 1,0.
6. Método según la reivindicación 5, en el que en la etapa (b) suficientes residuos de glucosamina se convierten en residuos de 3-O-sulfoglucosamina de modo que el lote producido tenga actividades anti-Xa y anti-IIa de no menos de 180 unidades/mg y una razón anti-Xa/anti-IIa de 0,85-1,15; o en el que la razón anti-Xa/anti-IIa es de 0,9-1,1.
7. Método para elaborar un segundo producto intermedio de glicosaminoglicano que comprende el 44-80 % de grupo NS2S y el 13-39 % de grupo NS; comprendiendo el método:
c. convertir una cantidad de residuos de N-acetil glucosamina en heparosano para producir un primer glicosaminoglicano que comprende el 78-99 % de grupo disacárido N-sulfatado (NS), en el que la cantidad de residuos de N-acetil glucosamina convertidos corresponde a la cantidad del grupo NS en el primer producto intermedio de glicosaminoglicano; y
d. tratar el primer producto intermedio de glicosaminoglicano con una enzima, que es C5-epimerasa (C5-epi) y 2-O-sulfotransferasa (2OST), en presencia de un donante de sulfato
para producir el segundo producto intermedio de glicosaminoglicano,
en el que el glicosaminoglicano tiene un peso molecular promedio en peso para formar un producto de heparina final de 15.000-19.000 Da, siendo el porcentaje de cadenas de heparina con un peso molecular
superior a 24.000 Da de no más del 20 % del total, y siendo la razón de cadenas con pesos moleculares de entre 8.000 y 16.000 con respecto a cadenas con pesos moleculares de 16.000 a 24.000 Da de no menos de 1,0.
8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha conversión comprende hacer reaccionar el heparosano con una base y un reactivo de sulfonación o con N-desacetilasa, N-sulfotransferasa (NDST).
9. Método para elaborar un tercer producto intermedio de glicosaminoglicano que comprende el 31-73 % de grupo disacárido NS2S6S, el 6-40 % de grupo disacárido NS6S, el 0-27 % de grupo NS2S y el 1-22 % de grupo NS:
comprendiendo el método tratar un segundo producto intermedio de glicosaminoglicano que comprende el 44-80 % de grupo NS2S y el 13-39 % de grupo NS con una enzima, que son las isoformas 1 y/o 3 de la 6-O-sulfotransferasa (6OST-1/3), en presencia de un donante de sulfato para convertir el segundo producto intermedio de glicosaminoglicano en el tercer producto intermedio de glicosaminoglicano,
en el que el glicosaminoglicano tiene un peso molecular promedio en peso para formar un producto de heparina final de 15.000-19.000 Da, siendo el porcentaje de cadenas de heparina con un peso molecular superior a 24.000 Da de no más del 20 % del total, y siendo la razón de cadenas con pesos moleculares de entre 8.000 y 16.000 con respecto a cadenas con pesos moleculares de 16.000 a 24.000 Da de no menos de 1,0.
10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en el que el donante de sulfato comprende PAPS, preferiblemente en el que PAPS está en una disolución; en el que el donante de sulfato comprende PAP y PNPS; en el que dicho tratamiento se realiza en presencia de un sistema de reciclaje que comprende PAPS, PNPS y un catalizador, preferiblemente en el que el catalizador es aril sulfotransferasa IV (AST-IV); o en el que dicho tratamiento se realiza dentro de una cepa microbiana modificada por ingeniería genética que contiene los genes que codifican para NDST, C5-Epi, 2OST, 3OST-1, uno o ambos de 6OST-1 o 6OST-3, y una fuente de PAPS.
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en el que la enzima está en disolución o inmovilizada.
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