ES2952598T3 - Edición génica de mutaciones intrónicas profundas - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se proporcionan composiciones, métodos, kits y partículas virales para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una mutación intrónica profunda utilizando repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) - asociadas a CRISPR (Cas) (Cas) (CRISPR) diseñadas y no naturales. Cas) sistema. En algunos aspectos, en el presente documento se proporciona un sistema CRISPER-Cas autolimitante. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Edición génica de mutaciones intrónicas profundas
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a composiciones que comprenden un ácido nucleico que codifica un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)-asociada a CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas) de origen no natural, modificado por ingeniería genética, para uso en métodos para tratar la amaurosis congénita de Leber (LCA) o escindir un ácido nucleico diana en una célula, así como a kits, y a métodos relacionados con los mismos.
Antecedentes de la invención
Las mutaciones en secuencias no codificantes, tales como intrones, se han implicado en una amplia gama de enfermedades. El genoma humano contiene una mayor proporción de intrones más largos que otros organismos tales como gusanos y moscas; más del 90% de los intrones humanos tienen más de 100 nucleótidos de longitud, y teniendo más de un tercio de todos los intrones 2.000 nucleótidos o más (Molecular Biology of the Cell, 6a ed. (Alberts, B. et al. eds., 2014). Además, las mutaciones intrónicas profundas se han identificado como una causa importante y potencialmente ignorada de enfermedades humanas, y gran parte del esfuerzo para identificar mutaciones vinculadas a enfermedades se centró en la secuencia codificante (Homolova, K. et al. (2010) Hum. Mutat. 31:437-444). Debido a la complejidad del ayuste del ARNm en humanos, estas mutaciones intrónicas profundas pueden potencialmente causar una variedad de afecciones patológicas debido a mecanismos que incluyen, entre otros, desestabilización, degradación y ayuste incorrecto del ARNm (por ejemplo, creando un sitio de ayuste críptico). De hecho, algunos han estimado que hasta 5% de las enfermedades mendelianas en seres humanos pueden estar asociadas con una mutación intrónica profunda (Cooper, D.N. et al. (2010) Hum. Mutat. 31:631-655).
Como ejemplo ilustrativo de un trastorno que, en algunos casos, se ha relacionado con una mutación intrónica profunda, la amaurosis congénita de Leber (LCA) es la forma más grave de distrofia retiniana hereditaria, con inicio de síntomas en el primer año de vida (Leber, T.K.G.v. (1869) Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 15:1-25). La agudeza visual en pacientes con LCA rara vez es mejor que 20/400 (Cremers, F.P. et al. (2002) Human molecular genetics 11:1169-1176). LCA afecta aproximadamente a 1 de cada 30.000 personas en la población general, y representa el 5% de todas las distrofias retinianas hereditarias (Koenekoop, R.K. (2004) Survey of ophthalmology 49:379-398). La causa genética más frecuente de LCA, que representa aproximadamente el 15% de todos los casos de LCA en los países europeos y en los Estados Unidos de América, es una mutación intrónica profunda c.2991+1655A>G en el intrón 26 del gen CEP290, que genera un sitio donante de ayuste críptico que da como resultado la inclusión de un exón aberrante que contiene un codón de parada prematuro (p.C998X) para ARNm de CEP290 (den Hollander, A.I. et al. (2006) Am. J. Hum. Genet. 79:556-561; Perrault, I. et al. (2007) Hum. Mutat.
28:416; Stone, E.M. (2007) Am. J. Ophthalmol. 144:791-811; Wiszniewski, W. et al. (2011) Hum. Genet. 129:319-327). La enfermedad de LCA causada por la mutación de CEP290 se conoce como LCA10. El ayuste alternativo del exón críptico en el ARNm de CEP290 ocurre en algunas, pero no en todas, los transcritos de ARNm en los individuos homocigotos afectados (den Hollander, A.I. et al. (2006) Am. J. Hum. Genet. 79:556-561), destacando la naturaleza hipomórfica de esta mutación intrónica
El gen CEP290 humano abarca 54 exones que codifican una proteína de 2479 aminoácidos. CEP290 es una proteína centrosomal que desempeña un papel importante tanto en el ensamblaje del cilio como en el tráfico de proteínas ciliares (Barbelanne, M. et al. (2013) Hum. Mol. Genet. 22:2482-2494; Craige, B. et al. (2010) J. Cell Biol. 190:927-940). En los fotorreceptores, las células de la retina más afectadas por mutaciones de CEP290, CEP290 se localiza en el cilio de conexión (Chang, B. et al. (2006) Hum. Mol. Genet. 15:1847-1857), que conecta el segmento interno y externo de los fotorreceptores.
Actualmente no hay cura para LCA causada por mutación de CEP290. Los dos enfoques preclínicos para abordar esta enfermedad son el aumento de genes y los oligonucleótidos antisentido (AON). El tamaño del ADN complementario (ADNc) de CEP290 humano supera el tamaño de la carga (~4,8 kb) de los virus adenoasociados recombinantes (rAAV). El sistema de vector lentiviral puede acomodar el ADNc de CEP290 de longitud completa; sin embargo, es posible que no pueda controlar con precisión el nivel de expresión de CEP290. Informes anteriores han demostrado que los fotorreceptores son sensibles al nivel de expresión transgénica, y la sobreexpresión de CEP290 es citotóxico (Burnight, E.R. et al. (2014) Gene Ther. 21:662-672; Tan, E. et al. (2001) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.
42:589-600). Una estrategia alternativa es usar los AON para interferir con el ayuste aberrante de CEP290 (Collin, R.W. et al. (2012) Mol. Ther. Nucleic Acids 1 :e14; Gerard, X. et al. (2012) Mol. Ther. Nucleic Acids 1 :e29). Sin embargo, este enfoque requiere inyecciones subretinianas semanales o mensuales durante años por parte de un especialista en retina.
Los métodos para editar o suministrar una carga útil a una secuencia de ácido nucleico diana usando un sistema de CRISPR-Cas se conocen desde el documento WO 2015/070083 A1, aunque este documento no enseña el direccionamiento efectivo de una mutación intrónica en un gen CEP290.
En consecuencia, existe una necesidad urgente de mejores enfoques terapéuticos para el tratamiento de trastornos relacionados con mutaciones intrónicas profundas, tal como LCA10 causada por mutación CEP290.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
En algunos aspectos, la invención proporciona una composición para uso en un método para tratar la amaurosis congénita de Leber (LCA) en un individuo, que comprende:
a) un ácido nucleico que codifica un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)-asociada a CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas), modificado por ingeniería genética, que comprende un primer ARN guía y un segundo ARN guía, en el que el primer ARN guía y el segundo ARN guía se hibridan con hebras opuestas de secuencias de ADN diana que flanquean una mutación intrónica en un gen CEP290; y
b) un casete de expresión de Cas que comprende:
i) una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas, y
ii) un primer sitio diana del ARN guía, en el que el primer a Rn guía o el segundo ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía;
en la que la proteína Cas se expresa a partir del casete de expresión Cas;
en la que la proteína Cas escinde las secuencias de ADN diana que flanquean la mutación, escindiendo así una porción del ADN diana que comprende la mutación; y
en la que la proteína Cas escinde el casete de expresión Cas en el primer sitio diana del ARN guía, reduciendo así la expresión de la proteína Cas, en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión Cas.
En algunas realizaciones, las secuencias guía del primer ARN guía y del segundo ARN guía se hibridan con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana que flanquean una mutación intrónica profunda del gen de la proteína centrosomal de 290 kDa (CEP290), en el que la mutación intrónica profunda es una mutación c.2991+1655A>G. En algunas realizaciones, el primer ARN guía está codificado por ADN que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 41 (para SpCas9), SEQ ID No : 45 (para SaCas9), SEQ ID NO: 46 (para SaCas9), o SEQ ID NO :47 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el primer ARN guía está codificado por ADN que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19 (para SpCas9), SEQ ID NO: 50 (para SaCas9), SEQ ID n O: 51 (para SaCas9), o SEQ ID NO :52 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el segundo ARN guía está codificado por ADN que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 42 (para SpCas9), SEQ ID NO: 43 (para SpCas9), SEQ ID NO: 44 (para SpCas9), SEQ ID NO: 48 (para SaCas9), o SEQ ID NO:49 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el segundo ARN guía está codificado por ADN que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20 (para SpCas9), SEQ ID NO: 21 (para SpCas9), SEQ ID NO: 22 (para SpCas9), SEQ ID NO: 53 (para SaCas9), o SEQ ID NO:54 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el CEP290 es un CEP290 humano. En algunas realizaciones, el CEP290 comprende una mutación intrónica profunda de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:23.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la mutación intrónica profunda se localiza alrededor de 1­ 10.000 nucleótidos, alrededor de 1-1000 nucleótidos, o alrededor de 100-1000 nucleótidos en dirección 3’ de un sitio donante de ayuste de 5' del gen. En algunas realizaciones, la mutación intrónica profunda se localiza alrededor de 1­ 10.000 nucleótidos, alrededor de 1-1000 nucleótidos o alrededor de 100-1000 nucleótidos en dirección 5’ de un sitio aceptor de ayuste de 3' del gen. En algunas realizaciones, la mutación intrónica profunda introduce un sitio donante de ayuste o un sitio aceptor de ayuste en el gen.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la proteína Cas es una proteína Cas9. En algunas realizaciones, la proteína Cas 9 es una proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO: 40), una proteína Cas9 de Staphylococcus aureus (SEQ ID NO: 55), una proteína Cas9 de Streptococcus thermophilus, una proteína Cas9 de Neisseria meningitidis, o una proteína Cas9 de Treponema denticola. En algunas realizaciones, Cas9 tiene codones optimizados para la expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la célula eucariota es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula eucariota es una célula humana.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el sistema de CRISPR-Cas comprende además una o más señales de localización nuclear (NLS(s)). En algunas realizaciones, la proteína Cas comprende uno o más NLS. En algunas realizaciones, la NLS es una secuencia C-terminal en el antígeno T grande de SV40. En algunas realizaciones, la NLS comprende la secuencia PKKKRKV (SEQ ID NO:26) o PKKKRKVEDPKKKRKVD (SEQ ID NO:27).
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el primer ARN guía y/o el segundo ARN guía comprenden se fusionan con una secuencia cr de activación trans (tracr). En algunas realizaciones, la secuencia tracr comprende la secuencia nucleotídica codificada por SEQ ID NO:25.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el sistema de CRISPR-Cas (por ejemplo, el primer ARN guía, el segundo ARN guía y la proteína Cas) forma un complejo con un lípido, un lípido catiónico, un liposoma, un policatión, 0 un agente que mejora la captación celular de ácido nucleico y/o la proteína.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el ácido nucleico que codifica el primer ARN guía, el segundo ARN guía y la proteína Cas se expresan en células eucariotas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el primer ARN guía, el segundo ARN guía y/o la proteína Cas están unidos operativamente a uno o más elementos de control reguladores. En algunas realizaciones, el primer ARN guía y/o el segundo ARN guía están enlazados operativamente a un promotor de ARN polimerasa III. En algunas realizaciones, el promotor de ARN polimerasa III es un promotor U6, 7SK o H1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína Cas se une operativamente a un promotor de ARN polimerasa II. En algunas realizaciones, el promotor de ARN polimerasa II es un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un fragmento de promotor mínimo derivado del promotor de CMV (promotor minCMV), una LTR del RSV, una LTR del MoMLV, un promotor de fosfoglicerato cinasa-1 (PGK), un promotor del virus simio 40 (SV40), un promotor de CK6, un promotor de transtirretina (TTR), un promotor de TK, un promotor de respuesta a tetraciclina (TRE), un promotor de HBV, un promotor de hAAT, un promotor de LSP, promotores quiméricos específicos del hígado (LSP), un promotor de E2F, un promotor de EF1a, un promotor de telomerasa (hTERT), un promotor de ponteciador del citomegalovirus/beta-actina de pollo/promotor de p-globina de conejo (CAG), un promotor de opsina de bastones, un promotor de opsina de cono, un promotor de beta fosfodiesterasa (PDE), un promotor de la retinitis pigmentosa (RP1), o un promotor del gen de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (IRBP).
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas están ubicados en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema. En algunas realizaciones, el vector es un plásmido. En algunas realizaciones, el vector forma un complejo con un sistema de administración. En algunas realizaciones, el vector se compleja con un lípido, un lípido catiónico, un liposoma, un policatión, o un agente que potencia la captación celular de ácido nucleico.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el vector es un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV), un vector adenoviral recombinante, un vector lentiviral recombinante, o un vector del virus del herpes simple recombinante (HSV). En algunas realizaciones, el vector es un vector adenoviral recombinante. En algunas realizaciones, el vector adenoviral recombinante deriva de adenovirus serotipo 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11,7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, o Ad porcino tipo 3. En algunas realizaciones, el vector adenoviral recombinante deriva del adenovirus serotipo 2 o una variante del adenovirus serotipo 5.
En algunas realizaciones, el vector es un vector lentiviral recombinante. En algunas realizaciones, el vector lentiviral recombinante deriva de un lentivirus pseudotipado con el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus del río Ross (RRV), el virus del ébola, el virus de Marburgo, el virus de Mokala, el virus de la rabia, RD114, o variantes del mismo.
En algunas realizaciones, el vector es un vector del rHSV. En algunas realizaciones, el vector de rHSV deriva de rHSV-1 o rHSV-2.
En algunas realizaciones, el vector es un vector del AAV recombinante (rAAV). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas está flanqueado por una o más secuencias de la repetición terminal invertida (ITR) del AAV. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas está flanqueado por dos ITR del a Av . En algunas realizaciones, las ITR de a Av son las ITR de serotipos de cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AA Vrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, un AAV de cabra, AAV bovino, o AAV de ratón. En algunas realizaciones, las ITR de AAV son las ITR de AAV2. En algunas realizaciones, el vector es un vector autocomplementario.
En algunas realizaciones, el vector está encapsulado en una partícula viral. En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula de adenovirus recombinante que encapsula un vector adenoviral recombinante. En algunas realizaciones, la partícula de adenovirus recombinante comprende una cápside de adenovirus de serotipo 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, o Ad porcino tipo 3. En algunas realizaciones, la partícula de adenovirus recombinante comprende una cápside de adenovirus de serotipo 2 o una variante de una cápside de adenovirus de serotipo 5.
En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula lentiviral recombinante que encapsula un vector lentiviral recombinante. En algunas realizaciones, la partícula lentiviral recombinante comprende una cápside pseudotipada con el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus del río Ross (RRV), el virus del ébola, el virus de Marburgo, el virus de Mokala, el virus de la rabia, RD114, o variantes de los mismos.
En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula de HSV recombinante que encapsula un vector de HSV recombinante. En algunas realizaciones, la partícula de HSV recombinante es una partícula de rHSV-1 o una partícula viral de rHSV-2.
En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula viral de AAV recombinante que comprende un vector de AAV recombinante. En algunas realizaciones, la partícula viral de AAV recombinante comprende una cápside de serotipo de AAV de Clados A-F. En algunas realizaciones, la partícula viral de AAV comprende una cápside de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AA Vrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, un AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, o cápside de AAV de ratón rAAV2/HBoV1. En algunas realizaciones, la ITR y la cápside de la partícula viral de rAAV derivan del mismo serotipo de AAV. En algunas realizaciones, la ITR y la cápside de las partículas virales de rAAV derivan de diferentes serotipos de AAV. En algunas realizaciones, la partícula viral de AAV recombinante comprende una cápside de AAV1, a Av 2, AAV8, AAVrh8R, AAV9, y/o AAVrh10. En algunas realizaciones, la cápside de AAV1, AAV2, AAV8, AAVrh8R, AAV9 y/o AAVrh10 comprende una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparano. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende las ITR de AAV2.
En algunas realizaciones, el individuo es un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano. En algunas realizaciones, la composición se administra en el ojo del individuo. En algunas realizaciones, la administración es subretiniana o intravítrea.
En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, la composición se formula para su administración en el ojo del individuo. En algunas realizaciones, la administración se formula para administración subretiniana o intravítrea.
En algunos aspectos, la invención proporciona kits que comprenden la composición de una cualquiera de las realizaciones anteriores. En algunas realizaciones, el kit comprende la composición de una cualquiera de las realizaciones anteriores para uso en cualquiera de los métodos descritos aquí. En algunas realizaciones, el kit comprende además instrucciones de uso.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método in vitro para escindir un ácido nucleico diana en una célula, que comprende suministrar a la célula una cantidad eficaz de una composición que comprende: a) un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)-asociada CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas), modificado por ingeniería genética, no natural, que comprende un primer ARN guía y un segundo ARN guía, en el que el primer ARN guía y el segundo ARN guía se hibridan con hebras opuestas de secuencias de ADN diana que flanquean una mutación intrónica en un gen CEP290; y b) un casete de expresión de Cas que comprende: i) una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas, y ii) un primer sitio diana de ARN guía, en el que el primer ARN guía o el segundo ARN guía se hibrida con el primer sitio diana de ARN guía; en el que la proteína Cas se expresa a partir del casete de expresión de Cas; en el que la proteína Cas escinde las secuencias de ADN diana que flanquean la mutación, escindiendo así una porción del ADN diana que comprende la mutación; y en el que la proteína Cas escinde el casete de expresión de Cas en el primer sitio diana del ARN guía, reduciendo así la expresión de la proteína Cas en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión de Cas. En algunas realizaciones, el casete de expresión de Cas comprende además: iii) un segundo sitio diana del ARN guía, en el que el primer ARN guía o el segundo ARN guía se hibrida con el segundo sitio diana del ARN guía; en el que la proteína Cas escinde el casete de expresión de Cas en los sitios diana del ARN guía primero y segundo, reduciendo así la expresión de la proteína Cas en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión de Cas.
En algunas realizaciones, el primer ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía y el segundo sitio diana del ARN guía. En algunas realizaciones, el segundo ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía y el segundo sitio diana del ARN guía. En algunas realizaciones, el primer ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía, y el segundo ARN guía se hibrida con el segundo sitio diana del ARN guía. En algunas realizaciones, el casete de expresión de Cas comprende además una secuencia de poliadenilación (poliA) unida operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas. En algunas realizaciones, la secuencia de poliA es una secuencia de poliA del SV40. En algunas realizaciones, la escisión del primer o segundo sitio diana del ARN guía por la proteína Cas interrumpe la ligación operativa entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y la secuencia de poliA. En algunas realizaciones, el primer o segundo sitio diana del ARN guía está entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y la secuencia de poliA. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas está ligada operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica una o más señales de localización nuclear (NLS), de modo que la proteína Cas expresada a partir del casete de expresión de Cas se fusiona en el marco con una o más NLS. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica que codifica una o más NLS está entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y una secuencia de poliadenilación (poliA). En algunas realizaciones, el primer o segundo sitio diana del ARN guía está entre la secuencia nucleotídica que codifica la una o más NLS y la secuencia de poliA. En algunas realizaciones, la una o más NLS comprenden una secuencia C-terminal en el antígeno T grande del SV40. En algunas realizaciones, la una o más NLS comprende la secuencia PKKKRKV (SEQ ID NO:26) o PKKKRKVEDPKKKRKVD (SEQ ID NO:27). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el sistema de CRISPR-Cas y/o el casete de expresión de Cas están ligados operativamente a uno o más elementos de control reguladores. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas está ligada operativamente a un promotor. En algunas realizaciones, la escisión del primer o segundo sitio diana del ARN guía por la proteína Cas interrumpe la ligación operativa entre el elemento de control regulador y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas. En algunas realizaciones, el primer o el segundo sitio diana del ARN guía está entre el promotor y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas.
En algunas realizaciones, el casete de expresión de Cas comprende además: iii) un segundo sitio diana del ARN guía, en el que el primer o el segundo ARN guía se hibrida con el segundo sitio diana del ARN guía, y en el que el segundo sitio diana del ARN guía es adyacente a un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) específico para la proteína Cas; en el que la escisión del primer sitio diana del ARN guía por la proteína Cas interrumpe la ligación operativa entre el elemento de control regulador y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas; en el que la escisión del segundo sitio diana del ARN guía por la proteína Cas interrumpe la ligación operativa entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y la secuencia de poliA; y en el que tras la expresión de la proteína Cas y la escisión de las secuencias de ADN diana, la proteína Cas escinde el casete de expresión de Cas en el primer y el segundo sitio diana del ARN guía, reduciendo así la expresión de la proteína Cas, en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión de Cas. En algunas realizaciones, el casete de expresión de Cas comprende además: iii) un segundo sitio diana de ARN guía, en el que el primer ARN guía o el segundo ARN guía se hibrida con el segundo sitio diana de ARN guía; en el que el primer sitio diana del ARN guía está entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y un promotor ligado operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas; en el que el segundo sitio diana del ARN guía está entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y una secuencia de poliA ligada operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas; y en el que la proteína Cas escinde el casete de expresión de Cas en el primer y el segundo sitio diana del ARN guía, reduciendo así la expresión de la proteína Cas, en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión de Cas.
En algunas realizaciones del método anterior, las secuencias guía del primer ARN guía y del segundo ARN guía se hibridan con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana que flanquean una mutación intrónica profunda del gen de la proteína centrosomal de 290 kDa (CEP290), en el que la mutación intrónica profunda es una mutación c.2991+1655A>G. En algunas realizaciones, el primer ARN guía está codificado por ADN que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 41 (para SpCas9), SeQ ID NO: 45 (para SaCas9), SEQ ID NO: 46 (para SaCas9), o SEQ ID NO :47 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el primer ARN guía está codificado por ADN que comprende la secuencia de SEQ ID n O: 19 (para SpCas9), SEQ ID NO: 50 (para SaCas9), SEQ ID NO: 51 (para SaCas9), o SEQ ID NO :52 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el segundo ARN guía está codificado por ADN que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 42 (para SpCas9), SEQ ID NO: 43 (para SpCas9), SEQ iD NO: 44 (para SpCas9), SEQ ID NO: 48 (para SaCas9), o SEQ ID NO:49 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el segundo ARN guía está codificado por ADN que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20 (para SpCas9), SEQ ID NO: 21 (para SpCas9), SEQ ID NO: 22 (para SpCas9), SEQ ID NO: 53 (para SaCas9), o SEQ ID n O:54 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el CEP290 es un CEP290 humano. En algunas realizaciones, el CEP290 comprende una mutación intrónica profunda de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:23.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la mutación intrónica profunda se localiza alrededor de 1­ 10.000 nucleótidos, alrededor de 1-1000 nucleótidos, o alrededor de 100-1000 nucleótidos en dirección 3’ de un sitio donante de ayuste de 5' del gen. En algunas realizaciones, la mutación intrónica profunda se localiza alrededor de 1­ 10.000 nucleótidos, alrededor de 1-1000 nucleótidos o alrededor de 100-1000 nucleótidos en dirección 5’ de un sitio aceptor de ayuste de 3' del gen. En algunas realizaciones, la mutación intrónica profunda introduce un sitio donante de ayuste o un sitio aceptor de ayuste en el gen.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la proteína Cas es una proteína Cas9. En algunas realizaciones, la proteína Cas 9 es una proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO: 40), una proteína Cas9 de Staphylococcus aureus (SEQ ID NO: 55), una proteína Cas9 de Streptococcus thermophilus, una proteína Cas9 de Neisseria meningitidis, o una proteína Cas9 de Treponema denticola. En algunas realizaciones, Cas9 tiene codones optimizados para la expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la célula eucariota es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula eucariota es una célula humana.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el primer ARN guía y/o el segundo ARN guía comprenden se fusionan con una secuencia cr de activación trans (tracr). En algunas realizaciones, la secuencia tracr comprende la secuencia nucleotídica codificada por SEQ ID NO:25.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el sistema de CRISPR-Cas (por ejemplo, el primer ARN guía, el segundo ARN guía y la proteína Cas) forma un complejo con un lípido, un lípido catiónico, un liposoma, un policatión, 0 un agente que mejora la captación celular de ácido nucleico y/o la proteína.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el ácido nucleico que codifica el primer ARN guía, el segundo ARN guía y la proteína Cas se expresan en células eucariotas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el primer ARN guía, el segundo ARN guía y/o la proteína Cas están unidos operativamente a uno o más elementos de control reguladores. En algunas realizaciones, el primer ARN guía y/o el segundo ARN guía están enlazados operativamente a un promotor de ARN polimerasa III. En algunas realizaciones, el promotor de ARN polimerasa III es un promotor U6, 7SK o H1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína Cas se une operativamente a un promotor de ARN polimerasa II. En algunas realizaciones, el promotor de ARN polimerasa II es un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un fragmento de promotor mínimo derivado del promotor de CMV (promotor minCMV), una LTR del RSV, una LTR del MoMLV, un promotor de fosfoglicerato cinasa-1 (PGK), un promotor del virus simio 40 (SV40), un promotor de CK6, un promotor de transtirretina (TTR), un promotor de TK, un promotor de respuesta a tetraciclina (TRE), un promotor de HBV, un promotor de hAAT, un promotor de LSP, promotores quiméricos específicos del hígado (LSP), un promotor de E2F, un promotor de EF1a, un promotor de telomerasa (hTERT), un promotor de ponteciador del citomegalovirus/beta-actina de pollo/promotor de p-globina de conejo (CAG), un promotor de opsina de bastones, un promotor de opsina de cono, un promotor de beta fosfodiesterasa (PDE), un promotor de la retinitis pigmentosa (RP1), o un promotor del gen de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (IRBP).
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas están ubicados en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema. En algunas realizaciones, el vector es un plásmido. En algunas realizaciones, el vector forma un complejo con un sistema de administración. En algunas realizaciones, el vector se compleja con un lípido, un lípido catiónico, un liposoma, un policatión, o un agente que potencia la captación celular de ácido nucleico.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, el vector es un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV), un vector adenoviral recombinante, un vector lentiviral recombinante, o un vector del virus del herpes simple recombinante (HSV). En algunas realizaciones, el vector es un vector adenoviral recombinante. En algunas realizaciones, el vector adenoviral recombinante deriva de adenovirus serotipo 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11,7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, o Ad porcino tipo 3. En algunas realizaciones, el vector adenoviral recombinante deriva del adenovirus serotipo 2 o una variante del adenovirus serotipo 5.
En algunas realizaciones, el vector es un vector lentiviral recombinante. En algunas realizaciones, el vector lentiviral recombinante deriva de un lentivirus pseudotipado con el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus del río Ross (RRV), el virus del ébola, el virus de Marburgo, el virus de Mokala, el virus de la rabia, RD114, o variantes del mismo.
En algunas realizaciones, el vector es un vector del rHSV. En algunas realizaciones, el vector de rHSV deriva de rHSV-1 o rHSV-2.
En algunas realizaciones, el vector es un vector del AAV recombinante (rAAV). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas está flanqueado por una o más secuencias de la repetición terminal invertida (ITR) del AAV. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas está flanqueado por dos ITR del a Av . En algunas realizaciones, las ITR de AAV son las ITR de serotipos de cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AA Vrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, un AAV de cabra, AAV bovino, o AAV de ratón. En algunas realizaciones, las ITR de AAV son las ITR de AAV2. En algunas realizaciones, el vector es un vector autocomplementario.
En algunas realizaciones, el vector está encapsulado en una partícula viral. En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula de adenovirus recombinante que encapsula un vector adenoviral recombinante. En algunas realizaciones, la partícula de adenovirus recombinante comprende una cápside de adenovirus de serotipo 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, o Ad porcino tipo 3. En algunas realizaciones, la partícula de adenovirus recombinante comprende una cápside de adenovirus de serotipo 2 o una variante de una cápside de adenovirus de serotipo 5.
En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula lentiviral recombinante que encapsula un vector lentiviral recombinante. En algunas realizaciones, la partícula lentiviral recombinante comprende una cápside pseudotipada con el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus del río Ross (RRV), el virus del ébola, el virus de Marburgo, el virus de Mokala, el virus de la rabia, RD114, o variantes de los mismos.
En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula de HSV recombinante que encapsula un vector de HSV recombinante. En algunas realizaciones, la partícula de HSV recombinante es una partícula de rHSV-1 o una partícula viral de rHSV-2.
En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula viral de AAV recombinante que comprende un vector de AAV recombinante. En algunas realizaciones, la partícula viral de AAV recombinante comprende una cápside de serotipo de AAV de Clados A-F. En algunas realizaciones, la partícula viral de AAV comprende una cápside de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AA Vrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, un AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, o cápside de AAV de ratón rAAV2/HBoV1. En algunas realizaciones, la ITR y la cápside de la partícula viral de rAAV derivan del mismo serotipo de AAV. En algunas realizaciones, la ITR y la cápside de las partículas virales de rAAV derivan de diferentes serotipos de AAV. En algunas realizaciones, la partícula viral de AAV recombinante comprende una cápside de AAV1, a Av 2, AAV8, AAVrh8R, AAV9, y/o AAVrh10. En algunas realizaciones, la cápside de AAV1, AAV2, AAV8, AAVrh8R, AAV9 y/o AAVrh10 comprende una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparano. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende las ITR de AAV2.
En algunos aspectos, la invención proporciona una composición para uso en un método para escindir un ácido nucleico diana en una célula, que comprende: a) un ácido nucleico que codifica un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)-asociada a CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas), modificado por ingeniería genética, no natural, que comprende un primer ARN guía y un segundo ARN guía, en el que el primer ARN guía y el segundo ARN guía se hibridan con hebras opuestas de secuencias de ADN diana que flanquean una mutación intrónica en un gen CEP290; y b) un casete de expresión de Cas que comprende: i) una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas, y ii) un primer sitio diana de ARN guía, en el que el primer ARN guía o el segundo ARN guía se hibrida con el primer sitio diana de ARN guía; en el que la proteína Cas se expresa a partir del casete de expresión de Cas; en el que la proteína Cas escinde las secuencias de ADN diana que flanquean la mutación, escindiendo así una porción del ADN diana que comprende la mutación; y en el que la proteína Cas escinde el casete de expresión de Cas en el primer sitio diana del ARN guía, reduciendo así la expresión de la proteína Cas en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión de Cas.
En algunas realizaciones, el primer ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía y el segundo sitio diana del ARN guía. En algunas realizaciones, el segundo ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía y el segundo sitio diana del ARN guía. En algunas realizaciones, el primer ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía, y el segundo ARN guía se hibrida con el segundo sitio diana del ARN guía. En algunas realizaciones, el casete de expresión de Cas comprende además una secuencia de poliadenilación (poliA) unida operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas. En algunas realizaciones, la secuencia de poliA es una secuencia de poliA del SV40. En algunas realizaciones, la escisión del primer o segundo sitio diana del ARN guía por la proteína Cas interrumpe la ligación operativa entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y la secuencia de poliA. En algunas realizaciones, el primer o segundo sitio diana del ARN guía está entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y la secuencia de poliA. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas está ligada operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica una o más señales de localización nuclear (NLS), de modo que la proteína Cas expresada a partir del casete de expresión de Cas se fusiona en el marco con una o más NLS. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica que codifica una o más NLS está entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y una secuencia de poliadenilación (poliA). En algunas realizaciones, el primer o segundo sitio diana del ARN guía está entre la secuencia nucleotídica que codifica la una o más NLS y la secuencia de poliA. En algunas realizaciones, la una o más NLS comprenden una secuencia C-terminal en el antígeno T grande del SV40. En algunas realizaciones, la una o más NLS comprende la secuencia PKKKRKV (SEQ ID NO:26) o PKKKRKVEDPKKKRKVD (SEQ ID NO:27). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el sistema CRISPR-Cas y/o el casete de expresión de Cas están ligados operativamente a uno o más elementos de control reguladores. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas está ligada operativamente a un promotor. En algunas realizaciones, la escisión del primer o segundo sitio diana del ARN guía por la proteína Cas interrumpe la ligación operativa entre el elemento de control regulador y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas. En algunas realizaciones, el primer o el segundo sitio diana del ARN guía está entre el promotor y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas.
En algunas realizaciones de las composiciones anteriores, el casete de expresión de Cas comprende además: iii) un segundo sitio diana del ARN guía, en el que el primer o el segundo ARN guía se hibrida con el segundo sitio diana del ARN guía, y en el que el segundo sitio diana del ARN guía es adyacente a un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) específico para la proteína Cas; en el que la escisión del primer sitio diana del ARN guía por la proteína Cas interrumpe la ligación operativa entre el elemento de control regulador y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas; en el que la escisión del segundo sitio diana del ARN guía por la proteína Cas interrumpe la ligación operativa entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y la secuencia de poliA; y en el que tras la expresión de la proteína Cas y la escisión de las secuencias de ADN diana, la proteína Cas escinde el casete de expresión de Cas en el primer y el segundo sitio diana del ARN guía, reduciendo así la expresión de la proteína Cas, en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión de Cas. En algunas realizaciones, el casete de expresión de Cas comprende además: iii) un segundo sitio diana de ARN guía, en el que el primer ARN guía o el segundo ARN guía se híbrida con el segundo sitio diana de ARN guía; en el que el primer sitio diana del ARN guía está entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y un promotor ligado operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas; en el que el segundo sitio diana del ARN guía está entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y una secuencia de poliA ligada operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas; y en el que la proteína Cas escinde el casete de expresión de Cas en el primer y el segundo sitio diana del ARN guía, reduciendo así la expresión de la proteína Cas, en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión de Cas.
En algunas realizaciones, las secuencias guía del primer ARN guía y del segundo ARN guía se hibridan con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana que flanquean una mutación intrónica profunda del gen de la proteína centrosomal de 290 kDa (CEP290), en el que la mutación intrónica profunda es una mutación c.2991+1655A>G. En algunas realizaciones, el primer ARN guía está codificado por ADN que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 41 (para SpCas9), SEQ ID NO: 45 (para SaCas9), SEQ ID NO: 46 (para SaCas9), o SEQ ID NO :47 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el primer ARN guía está codificado por ADN que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19 (para SpCas9), SEQ ID NO: 50 (para SaCas9), SEQ ID n O: 51 (para SaCas9), o SEQ ID NO :52 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el segundo ARN guía está codificado por ADN que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 42 (para SpCas9), SEQ ID NO: 43 (para SpCas9), SEQ ID NO: 44 (para SpCas9), SEQ ID NO: 48 (para SaCas9), o SEQ ID NO:49 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el segundo ARN guía está codificado por ADN que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20 (para SpCas9), SEQ ID NO: 21 (para SpCas9), SEQ ID NO: 22 (para SpCas9), SEQ ID NO: 53 (para SaCas9), o SEQ ID NO:54 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el CEP290 es un CEP290 humano. En algunas realizaciones, el CEP290 comprende una mutación intrónica profunda de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:23.
En algunas realizaciones de las composiciones anteriores, la mutación intrónica profunda se localiza alrededor de 1­ 10.000 nucleótidos, alrededor de 1 -1000 nucleótidos, o alrededor de 100-1000 nucleótidos en dirección 3’ de un sitio donante de ayuste de 5' del gen. En algunas realizaciones, la mutación intrónica profunda se localiza alrededor de 1­ 10.000 nucleótidos, alrededor de 1-1000 nucleótidos o alrededor de 100-1000 nucleótidos en dirección 5’ de un sitio aceptor de ayuste de 3' del gen. En algunas realizaciones, la mutación intrónica profunda introduce un sitio donante de ayuste o un sitio aceptor de ayuste en el gen.
En algunas realizaciones de las composiciones anteriores, la proteína Cas es una proteína Cas9. En algunas realizaciones, la proteína Cas 9 es una proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO: 40), una proteína Cas9 de Staphylococcus aureus (SEQ ID NO: 55), una proteína Cas9 de Streptococcus thermophilus, una proteína Cas9 de Neisseria meningitidis, o una proteína Cas9 de Treponema denticola. En algunas realizaciones, Cas9 tiene codones optimizados para la expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la célula eucariota es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula eucariota es una célula humana.
En algunas realizaciones de las composiciones anteriores, el primer ARN guía y/o el segundo ARN guía comprenden se fusionan con una secuencia cr de activación trans (tracr). En algunas realizaciones, la secuencia tracr comprende la secuencia nucleotídica codificada por SEQ ID NO:25.
En algunas realizaciones de las composiciones anteriores, el sistema de CRISPR-Cas (por ejemplo, el primer ARN guía, el segundo ARN guía y la proteína Cas) forma un complejo con un lípido, un lípido catiónico, un liposoma, un policatión, o un agente que mejora la captación celular de ácido nucleico y/o la proteína.
En algunas realizaciones de las composiciones anteriores, el ácido nucleico que codifica el primer ARN guía, el segundo ARN guía y la proteína Cas se expresan en células eucariotas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el primer ARN guía, el segundo ARN guía y/o la proteína Cas están unidos operativamente a uno o más elementos de control reguladores. En algunas realizaciones, el primer ARN guía y/o el segundo ARN guía están enlazados operativamente a un promotor de ARN polimerasa III. En algunas realizaciones, el promotor de ARN polimerasa III es un promotor U6, 7SK o H1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína Cas se une operativamente a un promotor de ARN polimerasa II. En algunas realizaciones, el promotor de ARN polimerasa II es un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un fragmento de promotor mínimo derivado del promotor de CMV (promotor minCMV), una LTR del RSV, una LTR del MoMLV, un promotor de fosfoglicerato cinasa-1 (PGK), un promotor del virus simio 40 (SV40), un promotor de CK6, un promotor de transtirretina (TTR), un promotor de TK, un promotor de respuesta a tetraciclina (TRE), un promotor de HBV, un promotor de hAAT, un promotor de LSP, promotores quiméricos específicos del hígado (LSP), un promotor de E2F, un promotor de EF1a, un promotor de telomerasa (hTERT), un promotor de ponteciador del citomegalovirus/beta-actina de pollo/promotor de p-globina de conejo (CAG), un promotor de opsina de bastones, un promotor de opsina de cono, un promotor de beta fosfodiesterasa (PDE), un promotor de la retinitis pigmentosa (RP1), o un promotor del gen de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (IRBP).
En algunas realizaciones de las composiciones anteriores, el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas están ubicados en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema. En algunas realizaciones, el vector es un plásmido. En algunas realizaciones, el vector forma un complejo con un sistema de administración. En algunas realizaciones, el vector se compleja con un lípido, un lípido catiónico, un liposoma, un policatión, o un agente que potencia la captación celular de ácido nucleico.
En algunas realizaciones de las composiciones anteriores, el vector es un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV), un vector adenoviral recombinante, un vector lentiviral recombinante, o un vector del virus del herpes simple recombinante (HSV). En algunas realizaciones, el vector es un vector adenoviral recombinante. En algunas realizaciones, el vector adenoviral recombinante deriva de adenovirus serotipo 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11,7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, o Ad porcino tipo 3. En algunas realizaciones, el vector adenoviral recombinante deriva del adenovirus serotipo 2 o una variante del adenovirus serotipo 5.
En algunas realizaciones, el vector es un vector lentiviral recombinante. En algunas realizaciones, el vector lentiviral recombinante deriva de un lentivirus pseudotipado con el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus del río Ross (RRV), el virus del ébola, el virus de Marburgo, el virus de Mokala, el virus de la rabia, RD114, o variantes del mismo.
En algunas realizaciones, el vector es un vector del rHSV. En algunas realizaciones, el vector de rHSV deriva de rHSV-1 o rHSV-2.
En algunas realizaciones, el vector es un vector del AAV recombinante (rAAV). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas está flanqueado por una o más secuencias de la repetición terminal invertida (ITR) del AAV. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas está flanqueado por dos ITR del a Av . En algunas realizaciones, las ITR de a Av son las ITR de serotipos de cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AA Vrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, un AAV de cabra, AAV bovino, o AAV de ratón. En algunas realizaciones, las ITR de AAV son las ITR de AAV2. En algunas realizaciones, el vector es un vector autocomplementario.
En algunas realizaciones, el vector está encapsulado en una partícula viral. En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula de adenovirus recombinante que encapsula un vector adenoviral recombinante. En algunas realizaciones, la partícula de adenovirus recombinante comprende una cápside de adenovirus de serotipo 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, o Ad porcino tipo 3. En algunas realizaciones, la partícula de adenovirus recombinante comprende una cápside de adenovirus de serotipo 2 o una variante de una cápside de adenovirus de serotipo 5.
En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula lentiviral recombinante que encapsula un vector lentiviral recombinante. En algunas realizaciones, la partícula lentiviral recombinante comprende una cápside pseudotipada con el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus del río Ross (RRV), el virus del ébola, el virus de Marburgo, el virus de Mokala, el virus de la rabia, RD114, o variantes de los mismos.
En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula de HSV recombinante que encapsula un vector de HSV recombinante. En algunas realizaciones, la partícula de HSV recombinante es una partícula de rHSV-1 o una partícula viral de rHSV-2.
En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula viral de AAV recombinante que comprende un vector de AAV recombinante. En algunas realizaciones, la partícula viral de AAV recombinante comprende una cápside de serotipo de AAV de Clados A-F. En algunas realizaciones, la partícula viral de AAV comprende una cápside de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AA Vrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, un AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, o cápside de AAV de ratón rAAV2/HBoV1. En algunas realizaciones, la ITR y la cápside de la partícula viral de rAAV derivan del mismo serotipo de AAV. En algunas realizaciones, la ITR y la cápside de las partículas virales de rAAV derivan de diferentes serotipos de AAV. En algunas realizaciones, la partícula viral de AAV recombinante comprende una cápside de AAV1, a Av 2, AAV8, AAVrh8R, AAV9, y/o AAVrh10. En algunas realizaciones, la cápside de AAV1, AAV2, AAV8, AAVrh8R, AAV9 y/o AAVrh10 comprende una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparano. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende las ITR de AAV2.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es un diagrama esquemático de la mutación intrónica c.2291+1655 A>G en el gen CEP290. La mutación A>G se produce en la posición 5 del sitio de ayuste 5' de un exón críptico ubicado dentro del intrón 26. La estructura de exón-intrón de la región del exón 26 al exón 27 de CEP290 está representada por recuadros y líneas, respectivamente, junto con el patrón de ayuste para los transcritos de tipo salvaje (línea continua) y mutante (línea discontinua). El nucleótido mutado se indica en negrita y subrayado, y se simboliza con una estrella llena. Las secuencias del sitio de ayuste 5' del exón críptico se presentan junto con sus puntuaciones de fuerza del sitio de ayuste, según lo calculado por BDGP: Predicción del Sitio de Ayuste por Red Neuronal (véanse, por ejemplo, www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html y Reese, M.G. et al. (1997) J. Comput. Biol. 4:311-323). Los nucleótidos exónicos se muestran en letras mayúsculas. Los tamaños de exones e intrones se indican debajo de la figura.
La FIG. 2 es un esquema que muestra la estrategia para eliminar la región del intrón que flanquea la mutación c.2991+1655 A>G de CEP290. Un sgRNA en dirección 5’ dirige la primera escisión de Cas9 ubicada en dirección 5’ de la mutación intrónica, y un sgRNA en dirección 3’ dirige la segunda escisión de Cas9 ubicada en dirección 3’ de la mutación. Tenga en cuenta que el locus de destino en dirección 5’ se puede ubicar en dirección 5’ del exón críptico o dentro del exón críptico. Los dos extremos de escisión se ligan directamente a través del proceso de unión de extremos no homólogos (NHEJ), con un fragmento de intrón que flanquea la mutación c.2991+1655 A>G eliminada. El intrón 26 se elimina posteriormente mediante ayuste de ARN durante el procesamiento de ARNm.
Las FIGS. 3A-3C muestran los niveles de expresión de ARNm (FIGS. 3A y 3B) y de proteína (FIG. 3C) en diferentes líneas celulares. Las FIGS. 3A y 3B muestran gráficos de los niveles de expresión basal de los ARNm de tipo salvaje (FIG. 3A) y mutante (FIG. 3B) en células de tipo salvaje (barras blancas), células heterocigotas para un cromosoma que porta las mutaciones c.2991+1655A>G y c.2991+1666C>G (barras grises), y células c.2991+1655A>G y c.2991+1666C>G homocigotas (células mutantes; barras negras), según lo determinado por RT-qPCR. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de muestras de tres transfecciones independientes (n=3). Las comparaciones se realizaron utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc HSD de Tukey. * = p<0,05, ** = p<0,01, *** = p<0,001. La FIG.
3C es una inmunotransferencia de lisados preparados a partir de células de tipo salvaje (WT), células heterocigotas (Het), y células mutantes (MT). La membrana se sondó para CEP290 (parte superior) y p-actina como control de carga (parte inferior).
Las FIGS.4A y 4B muestran la eficiencia de la eliminación dirigida con sgRNA emparejados y SpCas9, según lo determinado por PCR (FIG. 4A) y secuenciación de próxima generación (FIG. 4B). En la FIG. 4A, se usaron cebadores fuera de las regiones de deleción esperadas. Las bandas superiores son productos de PCR amplificados del intron 26 de CEP290 de tipo salvaje, mientras que las bandas inferiores son productos de PCR amplificados a partir del alelo de CEP290 después de las deleciones genómicas esperadas (etiquetadas como "Wt" y "Trunc", respectivamente). M, escalera de ADN de 1 kb. La FIG. 4B muestra el porcentaje de ADN de tipo salvaje y truncado en células mutantes transfectadas con sgRNA emparejados y SpCas9, según lo determinado por secuenciación de próxima generación (NGS).
Las FIGS. 5A-5C muestran el rescate de la expresión de CEP290 con sgRNA emparejados y SpCas9. Las FIGS. 5A y 5B muestran los niveles de expresión de ARNm de tipo salvaje (FIG. 5A) y mutante (FIG. 5B) en células de tipo salvaje (barras blancas), heterocigotas (barras grises) y mutantes (barras negras) transfectadas con sgRNA emparejados y SpCas9, según lo medido por RT-qPCR. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de muestras de dos transfecciones independientes (n=2). Las comparaciones se realizaron utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc HSD de Tukey. * = p<0,05, ** = p<0,01. La FIG. 5C es una inmunotransferencia de lisados preparados a partir de células mutantes transfectadas con sgRNA emparejados y SpCas9. La membrana se sondó para CEP290 (parte superior) y p-actina como control de carga (parte inferior).
Las FIGS. 6A-6E muestran un sistema de CRISPR-SpCas9 autolimitante. La FIG. 6A es un diagrama esquemático del vector pAAV-SpCas9 utilizado en el sistema de CRISPR-SpCas9 autolimitante. La secuencia de reconocimiento de la nucleasa SpCas9 (secuencia diana de sgRNA más el motivo PAM) se incorpora en el sitio de inserción 1 (entre el promotor minCMV y SpCas9) y/o en el sitio de inserción 2 (entre SpCas9-NLS y SV40 pA). NLS, señal de localización nuclear. SV40 pA, señal de poliadenilación del virus simio 40. La FIG. 6B es una inmunotransferencia de lisados preparados a partir de células mutantes transfectadas con un primer plásmido de empaquetamiento de AAV que expresa el par U1D3 sgRNA, y un segundo plásmido de empaquetamiento de AAV que expresa SpCas9. El plásmido SpCas9 contiene la secuencia de reconocimiento de U1 sgRNA (U1T) y/o la secuencia de reconocimiento de D3 sgRNA (D3T) en los dos sitios de inserción. Las células mutantes transfectadas con el plásmido U1D3 sólo sirvieron aquí como control. La membrana se sondó para SpCas9 (parte superior) y p-actina como control de carga (parte inferior). La FIG. 6C muestra la eliminación dirigida después de que las células mutantes se transfectaron con el par U1D3 sgRNA y SpCas9 autolimitante, según lo determinado por PCR. Las bandas superiores son productos de PCR amplificados a partir de intrón 26 de CEP290 de tipo salvaje, mientras que las bandas inferiores son productos de PCR amplificados a partir de alelo de CEP290 después de la eliminación genómica guiada por U1 y D3 sgRNAs. M, escalera de ADN de 1 kb. Las FIGS. 6D y 6E muestran los niveles de expresión ARNm de tipo salvaje (FIG. 6D) y mutante (FIG. 6E) en células mutantes transfectadas con par U1D3 sgRNA y SpCas9 autolimitante, medido por RT-qPCR. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de muestras de tres transfecciones independientes (n=3). Las comparaciones se realizaron utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc HSD de Tukey. * = p<0,05, ** = p<0,01, *** = p<0,001 en comparación con las células transfectadas con el par U1D3 sgRNA solo.
Las FIGS. 7A y 7B muestran la eliminación de una región en el intron 25 de gen Cep290 en la retina del ratón mediante un sistema de AAV dual. La FIG. 7A es un diagrama esquemático de los AAV duales utilizados en la inyección subretiniana. La FIG. 7B muestra la eliminación dirigida con (1) AAV5-RK-EGFP (control) o AA V5-par U11D11 sgRNA-RK-EGFP y (2) AAV5-SpCas9, según lo determinado por PCR. Las bandas superiores son productos de PCR amplificados a partir de intron 25 de Cep290 de ratón de tipo salvaje, mientras que las bandas inferiores son productos de PCR amplificados a partir de alelo de Cep290 después de la eliminación genómica guiada por los U11 y D11 sgRNA. M, escalera de ADN de 1 kb.
Las FIGS. 8A-8C muestran la eliminación dirigida con Cas9 de S. aureus (SaCas9) y SpCas9, según lo determinado por PCR (FIG. 8A) y por RT-qPCR (FIGS. 8B y 8C). Las células mutantes se transfectaron con pares de sgRNA emparejados junto con SaCas9 o SpCas9. Tenga en cuenta que los sgRNA emparejados y SaCas9 están en un plásmido de empaquetamiento de AAV, mientras que los sgRNA emparejados y SpCas9 están en dos plásmidos de empaquetamiento de AAV separados. En la FIG. 8A, las bandas superiores son productos de PCR amplificados del intron 26 de CEP290 de tipo salvaje, mientras que las bandas inferiores son productos de PCR amplificados a partir del alelo de CEP290 después de las deleciones genómicas esperadas (etiquetadas como "Wt" y "Trunc", respectivamente). M, escalera de ADN de 1 kb. Las FIGS. 8A y 8B mostrar los niveles de expresión de ARNm de tipo salvaje (FIG. 8A) y mutante (FIG. 8B) en células mutantes transfectadas con los sgRNA emparejados junto con SaCas9 (barras blancas) o SpCas9 (barras grises), según lo medido por RT-qPCR. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de muestras de tres transfecciones independientes (n=3). Las comparaciones se realizaron utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc HSD de Tukey. * = p<0,05, ** = p<0,01, *** = p<0,001. # = p<0,05 en comparación con las células mutantes transfectadas con SaCas9 sola.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se describen aquí composiciones, métodos y partículas virales para la edición de mutaciones intrónicas profundas. La composición para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una mutación intrónica profunda en un gen de un individuo puede comprender un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)-asociada a CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas) modificado por ingeniería genética, de origen no natural, que comprende a) un primer ARN guía y un segundo ARN guía, en el que el primer ARN guía y el segundo ARN guía se hibridan con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana que flanquean la mutación intrónica profunda, y b) una proteína Cas, en el que la proteína Cas escinde la molécula de ADN diana en los sitios que flanquean la mutación intrónica profunda, escindiendo así una porción del ADN diana que comprende la mutación intrónica profunda. En otros casos, la composición para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con una mutación intrónica profunda en un gen de un individuo puede comprender un ácido nucleico que codifica un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)-asociada a CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas), modificado por ingeniería genética, no natural, que comprende a) un primer ARN guía y un segundo ARN guía, en el que el primer ARN guía y el segundo ARN guía se hibridan con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana que flanquean la mutación intrónica profunda, y b) un secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas, en el que la proteína Cas escinde la molécula de ADN diana en sitios que flanquean la mutación intrónica profunda, escindiendo así una porción del ADN diana que comprende la mutación intrónica profunda. De acuerdo con la presente invención, el primer ARN guía y el segundo ARN guía se hibridan con hebras opuestas de secuencias de ADN diana que flanquean una mutación intrónica en un gen CEP290.
También se describen aquí composiciones, métodos y partículas virales para tratar enfermedades oculares. En particular, la presente invención proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de LCA. Como se describió anteriormente, la causa genética más frecuente de LCA es una mutación intrónica profunda c.2991+1655A>G en el intrón 26 del gen CEP290, que genera un sitio donante de ayuste críptico que da como resultado la inclusión de un exón aberrante que contiene un codón de parada prematuro (p.C998X) para ARNm de CEP290 (FIG. 1). Los inventores han diseñado un método simple y eficiente para tratar pacientes con LCA que albergan la mutación intrónica c.2991+1655 A>G en el gen CEP290 a través de una deleción de ADN genómico dirigida en células humanas a través de un par de ARN guía únicos (sgRNA) y el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)-proteína asociada a CRISPR (Cas) (FIG. 2). Este enfoque elimina de manera efectiva y permanente la mutación intrónica c.2991+1655 A>G, evitando el ayuste del exón críptico insertado en el ARNm de CEP290, y al mismo tiempo dejando intactos los elementos reguladores genéticos endógenos.
I. Técnicas Generales
Las técnicas y los procesos descritos o referenciados en esta memoria se entienden generalmente bien y se emplean comúnmente utilizando metodología convencional por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M.
Ausubel, et al. eds., 2003); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practica! Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow y Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6a ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (v .T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011).
II. Definiciones
Como se usa aquí, "CRISPR-Cas" se refiere a un complejo de ribonucleoproteína de dos componentes con ARN guía y una Cas endonucleasa. CRISPR se refiere al sistema tipo II de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas. Mientras que CRISPR se descubrió como un sistema de defensa adaptativo que permite que las bacterias y las arqueas detecten y silencien los ácidos nucleicos extraños (por ejemplo, de virus o plásmidos), se ha adaptado para su uso en una variedad de tipos de células para permitir la edición de polinucleótidos de una manera específica de secuencia (véanse, por ejemplo, Jinek, M. et al. (2012) Science 337:816-821 y Ran, F.A. et al. (2013) Nat. Protoc. 8:2281 -2308). En los sistemas de tipo II, el ARN guía interactúa con Cas y dirige la actividad de nucleasa de la enzima Cas hacia secuencias de ADN diana idénticas a las secuencias guía del ARN guía. Guía pares de bases de ARN con la hebra opuesta de la secuencia diana. La actividad de la nucleasa Cas genera entonces una rotura de doble cadena en el ADN diana. En algunas realizaciones, la proteína Cas es una proteína Cas9.
Tal como se usa aquí, "ARN de guía único de CRISPR-Cas" (los términos "ARN de guía único" y "sgRNA" pueden usarse indistintamente aquí) se refiere a una única especie de ARN capaz de dirigir la escisión del ADN diana mediada por Cas. En algunas realizaciones, un único ARN guía puede contener las secuencias necesarias para la actividad de nucleasa Cas (por ejemplo, Cas9) y una secuencia guía idéntica a un ADN diana de interés.
La expresión "ARN quimérico", "ARN guía quimérico", "ARN guía", "ARN guía único" y "ARN guía sintético" se pueden usar indistintamente aquí, y se refieren a la secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia guía, la secuencia tracr, y la secuencia pareja de tracr. La expresión "secuencia guía", como se usa aquí, se refiere a la secuencia de alrededor de 20 pb dentro del ARN guía que especifica el sitio diana, y se puede usar indistintamente con los términos "guía", "espaciador" o "protoespaciador". La expresión "secuencia pareja de tracr" también se puede usar de forma intercambiable con el término "repetición(es) directa(s)".
Como se usa aquí, una "secuencia guía de sgRNA" puede referirse a la secuencia nucleotídica de un sgRNA que se une a la hebra opuesta de una secuencia de ADN diana y dirige la actividad de nucleasa Cas (por ejemplo, Cas9) a ese locus. En algunas realizaciones, la secuencia guía de sgRNA es idéntica a la secuencia diana. No se requiere necesariamente una identidad completa, siempre que exista suficiente similitud para causar la hibridación y promover la formación de un complejo de CRISPR. Una secuencia guía puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o ARN.
Como se usa aquí, un polipéptido "Cas" es un polipéptido que funciona como una nucleasa cuando forma un complejo con un ARN guía, por ejemplo un sgRNA. En algunas realizaciones, el polipéptido Cas es un polipéptido Cas9 (9 asociada a CRISPR, también conocido como Csn1). Cuando se une a una guía crRNA:tracrRNA o una guía única de ARN, los polipéptidos Cas (por ejemplo, Cas9) son capaces de escindir el ADN diana en una secuencia idéntica a la secuencia guía de sgRNA y adyacente a un motivo PAM. A diferencia de otros polipéptidos Cas, los polipéptidos Cas9 son característicos de los sistemas de CRISPR-Cas de tipo II (para obtener una descripción de las proteínas Cas de diferentes sistemas de CRISPR-Cas, véase Makarova, K.S., et al. (2011) Nat. Rev. Microbiol. 9(6):467-77). Como se usa aquí, "Cas" puede referirse al complejo de ribonucleoproteína con un sgRNA o al componente polipeptídico del complejo, a menos que se especifique lo contrario.
La expresión "CRISPR RNA (crRNA)", como se usa aquí, se refiere a un RNA que comprende la secuencia guía utilizada por un sistema de CRISPR-Cas para dirigir la escisión contra una secuencia de ADN diana. La expresión "ARNcr activador en trans (ARNtracr)", como se usa aquí, se refiere a una secuencia que comprende ARN que forma la estructura requerida para el complejo efector de CRISPR-Cas que media en la escisión del ADN. En los sistemas de tipo II de CRISPR-Cas endógenos de bacterias y arqueas, el complejo efector de CRISPR-Cas incluye una proteína Cas (por ejemplo, una proteína Cas9) complejada con dos moléculas de polirribonucleótido: un crRNA y un tracrRNA. El crRNA contiene una secuencia guía de ~20 nucleótidos que media en el reconocimiento de la diana, y una secuencia que forma un dúplex con un tracrRNA. El dúplex crRNA:tracrRNA se une a la proteína Cas, y es necesario para la función del complejo efector de CRISPR-Cas. En algunas realizaciones, las funciones de crRNA y tracrRNA pueden llevarse a cabo por un solo RNA (un solo RNA guía o sgRNA) que contiene tanto la secuencia que media en el reconocimiento de la diana como la secuencia que genera la estructura requerida para el complejo efector de CRISPR-Cas.
La expresión "mutación intrónica profunda", como se usa aquí, se refiere a una mutación dentro de la secuencia intrónica en una región fuera de las secuencias del aceptor de ayuste de tipo salvaje y del donante de ayuste. En algunos casos, una mutación intrónica profunda puede conducir a un ayuste alterado del gen asociado, por ejemplo la inclusión de la secuencia intrónica en el ARNm maduro. En ejemplos no limitantes, la mutación intrónica profunda es mayor que alrededor de 100 pb en dirección 3’ (es decir, 3') a un exón, mayor que alrededor de 100 pb en dirección 5’ (es decir, 5') a un exón, o mayor que alrededor de 100 pb en dirección 3’ de un primer exón y mayor que alrededor de 100 pb en dirección 5’ de un segundo exón.
El término "amaurosis congénita de Leber (LCA)", como se usa aquí, se refiere a un grupo de trastornos de aparición temprana caracterizados por pérdida de visión, disfunción retiniana y nistagmo. Se ha implicado una variedad de mutaciones en LCA, pero LCA generalmente se hereda como un trastorno autosómico recesivo. Para una descripción más detallada y ejemplos de genes y loci de la enfermedad de LCA, véase, por ejemplo, OMIM Entry 204000.
El término "CEP290", como se usa aquí, se refiere al gen que codifica una proteína centrosomal involucrada en la ciliogénesis, también conocida como MKS4, CT87, POC3, rd16, BBS14, LCA10, JBTS5, NPHP6, SLSN6, y 3H11Ag. Las mutaciones en CEP290 se han visto implicadas en LCA. Un ejemplo de tal mutación es la mutación c.2991+1655A>G, que introduce un sitio donante de ayuste críptico, lo que da como resultado la inclusión de un exón aberrante con un codón de terminación prematuro. Véase, por ejemplo, NCBI Gen ID No. 80184 y UniProt ID No.
015078 para ejemplos de secuencias de genes y proteínas humanas, respectivamente. Otros ejemplos de genes CEP290 incluyen, sin limitación, CEP290 de ratón (e.g., NCBI Gene ID No. 216274), CEP290 de rata (e.g., NCBI Gene ID No. 314787), CEP290 de mono Rhesus (e.g., NCBI Gene ID No. 708286), CEP290 de pez zebra (e.g., NCBI Gene ID No. 560588), CEP290 de perro (e.g., NCBI Gene ID No. 482591), CEP290 de chimpancé (e.g., NCBI Gene ID No.
452113), CEP290 de gato (e.g., NCBI Gene ID No. 100113471), CEP290 de pollo (e.g., NCBI Gene ID No. 417887), y CEP290 de vaca (e.g., NCBI Gene ID No. 282707). En algunas realizaciones, un gen CEP290 comprende una mutación intrónica profunda de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:23.
Un "vector", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un plásmido o virus recombinante que comprende un ácido nucleico a ser suministrado a una célula huésped, ya sea in vitro o in vivo.
El término "polinucleótido" o la expresión "ácido nucleico", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, este término o expresión incluye, pero no se limita a, ADN o ARN de cadena sencilla, doble o multi.cadena, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina, u otras bases de nucleótidos naturales, química o bioquímicamente modificadas, no naturales o derivatizadas. La cadena principal del polinucleótido puede comprender azúcares y grupos fosfato (tal como se pueden encontrar típicamente en el ARN o ADN), o grupos azúcar o fosfato modificados o sustituidos. Alternativamente, la cadena principal del polinucleótido puede comprender un polímero de subunidades sintéticas tales como fosforamidatos y, por lo tanto, puede ser un oligodesoxinucleósido fosforamidato (P-NH2) o un oligómero de fosforamidato-fosfodiéster mixto. Además, se puede obtener un polinucleótido de doble cadena a partir del producto polinucleotídico de cadena sencilla de la síntesis química, ya sea sintetizando la cadena complementaria y reasociando las cadenas en condiciones adecuadas, o sintetizando la cadena complementaria de novo utilizando una ADN polimerasa con un cebador apropiado.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos y no se limitan a una longitud mínima. Polímeros de residuos de aminoácidos de este tipo pueden contener residuos de aminoácidos naturales o no naturales e incluyen, pero no se limitan a péptidos, oligopéptidos, dímeros, trímeros y multímeros de residuos de aminoácidos. Tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas quedan abarcados por la definición. Los términos también incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, sialilación, acetilación, fosforilación y similares. Además, para los fines de la presente descripción, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como eliminaciones, adiciones, y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa), a la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, tal como por mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como por mutaciones de huéspedes que producen las proteínas o errores debidos a la amplificación por PCR.
Un "vector viral recombinante" se refiere a un vector de polinucleótido recombinante que comprende una o más secuencias heterólogas (es decir, secuencia de ácido nucleico no de origen viral). En el caso de los vectores AAV recombinantes, el ácido nucleico recombinante está flanqueado por al menos una secuencia repetida terminal invertida (ITR). En algunas realizaciones, el ácido nucleico recombinante está flanqueado por dos ITRs.
Un "vector de AAV recombinante (vector de rAAV)" se refiere a un vector polinucleotídico que comprende una o más secuencias heterólogas (es decir, secuencia de ácido nucleico que no es de origen AAV) que están flanqueadas por al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de AAV. Dichos vectores de rAAV pueden replicarse y empaquetarse en partículas virales infecciosas cuando están presentes en una célula hospedante que ha sido infectada con un virus auxiliar adecuado (o que expresa funciones auxiliares adecuadas) y que expresa productos de los genes rep y cap de AAV (es decir, proteínas AAV Rep y Cap). Cuando un vector rAAV se incorpora en un polinucleótido más grande (p. ej., en un cromosoma o en otro vector tal como un plásmido utilizado para la clonación o transfección), entonces el vector rAAV puede denominarse "pro-vector" que puede ser "rescatado" por replicación y encapsidación en presencia de funciones de empaquetamiento de AAV y funciones auxiliares adecuadas. Un vector de rAAV puede estar en cualquiera de varias formas, que incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cromosomas artificiales lineales, complejados con lípidos, encapsulados dentro de liposomas, y encapsidados en una partícula viral, por ejemplo una partícula AAV. Un vector rAAV puede empaquetarse en una cápside de virus de AAV para generar una "partícula viral adeno-asociada recombinante (partícula de rAAV)".
Un «virus de rAAV» o «partícula viral de rAAV» se refiere a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV y un genoma de vector rAAV encapsidado.
Un "vector adenoviral recombinante" se refiere a un vector polinucleotídico que comprende una o más secuencias heterólogas (es decir, secuencia de ácido nucleico que no es de origen de adenovirus) que están flanqueadas por al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de adenovirus. En algunas realizaciones, el ácido nucleico recombinante está flanqueado por dos secuencias de repetición terminal invertida (ITR). Dichos vectores virales recombinantes pueden replicarse y empaquetarse en partículas virales infecciosas cuando están presentes en una célula hospedante que expresa genes de adenovirus esenciales eliminados del genoma viral recombinante (por ejemplo, genes E1, genes E2, genes E4, etc.). Cuando un vector viral recombinante se incorpora a un polinucleótido más grande (por ejemplo, en un cromosoma o en otro vector, tal como un plásmido utilizado para la clonación o la transfección), entonces el vector viral recombinante se puede denominar "pro-vector" que se puede "rescatar" mediante replicación y encapsidación en presencia de funciones de empaquetamiento de adenovirus. Un vector viral recombinante puede estar en cualquiera de varias formas, que incluyen, entre otras, plásmidos, cromosomas artificiales lineales, complejados con lípidos, encapsulados dentro de liposomas y encapsidados en una partícula viral, por ejemplo una partícula de adenovirus. Un vector viral recombinante se puede empaquetar en una cápside de virus de adenovirus para generar una "partícula adenoviral recombinante".
Un "vector de lentivirus recombinante" se refiere a un vector polinucleotídico que comprende una o más secuencias heterólogas (es decir, secuencia de ácido nucleico que no es de origen de lentivirus) que están flanqueadas por al menos una secuencia de repetición terminal (LTR) de lentivirus. En algunas realizaciones, el ácido nucleico recombinante está flanqueado por dos secuencias repetidas terminales lentivirales (LTR). Dichos vectores virales recombinantes pueden replicarse y empaquetarse en partículas virales infecciosas cuando están presentes en una célula hospedante que ha sido infectada con funciones auxiliares adecuadas. Un vector lentiviral recombinante se puede empaquetar en una cápside de lentivirus para generar una "partícula lentiviral recombinante".
Un "vector de herpes simple recombinante (vector de HSV recombinante)" se refiere a un vector polinucleotídico que comprende una o más secuencias heterólogas (es decir, secuencia de ácido nucleico no de origen de HSV) que están flanqueadas por secuencias repetidas terminales de HSV. Dichos vectores virales recombinantes pueden replicarse y empaquetarse en partículas virales infecciosas cuando están presentes en una célula hospedante que ha sido infectada con funciones auxiliares adecuadas. Cuando un vector viral recombinante se incorpora a un polinucleótido más grande (por ejemplo, en un cromosoma o en otro vector, tal como un plásmido utilizado para la clonación o la transfección), entonces el vector viral recombinante se puede denominar "pro-vector" que se puede "rescatar" mediante replicación y encapsidación en presencia de funciones de empaquetamiento de HSV. Un vector viral recombinante puede estar en cualquiera de varias formas, que incluyen, entre otras, plásmidos, cromosomas artificiales lineales, complejados con lípidos, encapsulados dentro de liposomas y encapsidados en una partícula viral, por ejemplo una partícula HSV. Un vector viral recombinante se puede empaquetar en una cápside de HSV para generar una "partícula viral de herpes simple recombinante".
"Heterólogo" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta de la del resto de la entidad con la que se compara o en la que se introduce o incorpora. Por ejemplo, un polinucleótido introducido mediante técnicas de ingeniería genética en un tipo de célula diferente es un polinucleótido heterólogo (y, cuando se expresa, puede codificar un polipéptido heterólogo). Del mismo modo, una secuencia celular (por ejemplo, un gen o una porción del mismo) que se incorpora a un vector viral es una secuencia nucleotídica heteróloga con respecto al vector.
El término "transgén" se refiere a un polinucleótido que se introduce en una célula y es capaz de transcribirse en ARN y, opcionalmente, traducirse y/o expresarse en condiciones apropiadas. En algunos aspectos, confiere una propiedad deseada a una célula en la que se introdujo, o de otro modo conduce a un resultado terapéutico o diagnóstico deseado. En otro aspecto, se puede transcribir en una molécula que medie en la interferencia de ARN, tal como miARN, ARNip o ARNhc.
Las expresiones "partículas del genoma (gp)", "equivalentes del genoma" o "copias del genoma", tal como se utilizan en referencia a un título viral, se refieren al número de viriones que contienen el genoma de ADN de AAV recombinante, independientemente de la infectividad o funcionalidad. El número de partículas del genoma en una preparación de vector particular puede medirse mediante procedimientos como los descritos en los Ejemplos de esta memoria o, por ejemplo, en Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.
El término "genoma del vector (gv)", como se usa aquí, puede referirse a uno o más polinucleótidos que comprenden un conjunto de secuencias polinucleotídicas de un vector, por ejemplo un vector viral. Un genoma de vector se puede encapsular en una partícula viral. Dependiendo del vector viral particular, un genoma de vector puede comprender ADN de cadena sencilla, ADN de doble cadena o ARN de cadena sencilla o ARN de doble cadena. Un genoma de vector puede incluir secuencias endógenas asociadas con un vector viral particular y/o cualesquiera secuencias heterólogas insertadas en un vector viral particular mediante técnicas recombinantes. Por ejemplo, un genoma de vector de AAV recombinante puede incluir al menos una secuencia de ITR que flanquea un promotor, un relleno, una secuencia de interés (por ejemplo, un iARN), y una secuencia de poliadenilación. Un genoma de vector completo puede incluir un conjunto completo de secuencias de polinucleótidos de un vector. En algunas realizaciones, el título de ácido nucleico de un vector viral puede medirse en términos de vg/mL. Los métodos adecuados para medir este título son conocidos en la técnica (por ejemplo, PCR cuantitativa).
Las expresiones "unidad de infección (ui)", "partícula infecciosa" o "unidad de replicación", tal como se utilizan en referencia a un título viral, se refieren al número de partículas de vector AAV recombinante infecciosas y con capacidad de replicación según lo medido por el ensayo de centro infeccioso, también conocido como ensayo de centro de replicación, tal como se describe, por ejemplo, en McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.
La expresión "unidad transductora (tu)", tal como se utiliza en referencia a un título viral, se refiere al número de partículas de vector AAV recombinante infecciosas que dan como resultado la producción de un producto transgénico funcional según se mide en ensayos funcionales tales como los descritos en los Ejemplos de esta memoria o, por ejemplo, en Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; o en Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (ensayo LFU).
Una secuencia de "repetición terminal invertida" o "ITR" es una expresión bien entendida en la técnica y se refiere a secuencias relativamente cortas que se encuentran en los extremos de los genomas virales que están en orientación opuesta.
Una secuencia de "repetición terminal invertida (ITR) de AAV", una expresión bien entendida en la técnica, es una secuencia de aproximadamente 145 nucleótidos que está presente en ambos extremos del genoma de AAV de cadena sencilla nativo. Los 125 nucleótidos más externos de la ITR pueden estar presentes en cualquiera de dos orientaciones alternativas, lo que conduce a la heterogeneidad entre diferentes genomas de AAV y entre los dos extremos de un solo genoma de AAV. Los 125 nucleótidos más exteriores también contiene varias regiones más cortas de autocomplementariedad (designados regiones A, A’, B, B’, C, C’ y D), permitiendo que se produzca el apareamiento intracatenario de bases dentro de esta porción de la ITR.
Una "secuencia de resolución terminal" o "trs" es una secuencia en la región D de la ITR de AAV que es escindida por proteínas rep de AAV durante la replicación del ADN viral. Una secuencia de resolución terminal mutante es refractaria a la escisión por proteínas rep de AAV.
Un "virus auxiliar" para AAV se refiere a un virus que permite que AAV (que es un parvovirus defectuoso) sea replicado y empaquetado por una célula huésped. Se ha identificado un cieerto número de estos virus auxiliares, incluyendo adenovirus, virus herpes y poxvirus tales como la vaccinia. Los adenovirus abarcan un cierto número de subgrupos diferentes, aunque el adenovirus tipo 5 del subgrupo C (Ad5) es el más comúnmente utilizado. Se conocen numerosos adenovirus de origen humano, mamífero no humano y aviar y están disponibles en depósitos tales como la ATCC. Los virus de la familia del herpes, que también están disponibles en depósitos tales como ATCC, incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple (HSV), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV) y virus de la pseudorrabia (PRV).
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia de polipéptido o ácido nucleico de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos o nucleótidos en la secuencia del polipéptido o ácido nucleico de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar sustitución conservadora alguna como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos se puede lograr de diversas formas que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando programas de software de computadora disponibles públicamente, por ejemplo, los descritos en Current Protocols in Molecular Biology ( Ausubel et al., eds., 1987), Sup. 30, sección 7.7.18, Tabla 7.7.1, e incluyendo el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (Dn As TAR). Un ejemplo de un programa de alineamiento es Al IGN Plus (Scientific and Educational Software, Pensilvania). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo los algoritmos necesarios para lograr el alineamiento máximo a lo largo de toda la longitud de las secuencias que se están comparando. Para los fines de esta memoria, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de la secuencia de ácido con respecto, con o contra una secuencia de aminoácidos B) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y, en donde X es el número de residuos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias en ese alineamiento de A y B del programa, y en que Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. Para los fines de este memoria, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico C dada con respecto, con o contra una secuencia de ácido nucleico D dada (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de ácido nucleico C dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de ácido nucleico con respecto, con o contra una secuencia de ácido nucleico D dada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción W/Z, en que W es el número de nucleótidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias en el alineamiento del programa de C y D, y en que Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácido nucleico de D a C.
Una molécula "aislada" (p. ej., ácido nucleico o proteína) o célula significa que ha sido identificada y separada y/o recuperada de un componente de su entorno natural.
Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, incluidos los resultados clínicos (por ejemplo, mejora de los síntomas, logro de criterios de valoración clínicos, y similares). Puede administrarse una cantidad eficaz en una o más administraciones. En términos de un estado patológico, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para mejorar, estabilizar o retrasar el desarrollo de una enfermedad.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos, y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinadas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.
Tal como se utiliza en esta memoria, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta descripción, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, entre otros, el alivio de los síntomas, la disminución de la extensión de la enfermedad, la estabilización (por ejemplo, no empeora) del estado de la enfermedad, prevención de la propagación (por ejemplo, metástasis) de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "tratamiento profiláctico" se refiere a un tratamiento en el que se sabe o se sospecha que un individuo tiene o está en riesgo de tener un trastorno, pero no ha mostrado síntomas o tiene síntomas mínimos del trastorno. Un individuo que se somete a un tratamiento profiláctico puede recibir tratamiento antes de la aparición de los síntomas.
Como se usa aquí, un agente "terapéutico" (por ejemplo, un polipéptido, ácido nucleico o transgén terapéutico) es aquel que proporciona un resultado clínico beneficioso o deseado, tales como los resultados clínicos ejemplares descritos anteriormente. Como tal, se puede utilizar un agente terapéutico en un tratamiento tal como se describe arriba.
La expresión "retina central", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la mácula externa y/o la mácula interna y/o la fóvea. La expresión "tipos de células de la retina central", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a tipos de células de la retina central, tales como, por ejemplo, RPE y células fotorreceptoras.
El término "mácula" se refiere a una región de la retina central en primates que contiene una mayor concentración relativa de células fotorreceptoras, específicamente bastones y conos, en comparación con la retina periférica. La expresión "mácula externa", tal como se utiliza en esta memoria, también puede denominarse "mácula periférica". La expresión "mácula interna", tal como se utiliza en esta memoria, también puede denominarse "mácula central".
El término "fóvea" se refiere a una pequeña región en la retina central de primates de aproximadamente igual o menos de 0,5 mm de diámetro que contiene una mayor concentración relativa de células fotorreceptoras, específicamente conos, en comparación con la retina periférica y la mácula.
La expresión "espacio subretiniano", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la ubicación en la retina entre las células fotorreceptoras y las células del epitelio pigmentario de la retina. El espacio subretiniano puede ser un espacio potencial, tal como antes de cualquier inyección subretiniana de fluido. El espacio subretiniano también puede contener un fluido que se inyecta en el espacio potencial. En este caso, el fluido está "en contacto con el espacio subretiniano". Las células que están "en contacto con el espacio subretiniano" incluyen las células que bordean el espacio subretiniano, tales como RPE y células fotorreceptoras.
El término "ampolla", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un espacio de fluido dentro del espacio subretiniano de un ojo. Se puede crear una ampolla mediante una sola inyección de líquido en un solo espacio, mediante múltiples inyecciones de uno o más fluidos en el mismo espacio, o mediante múltiples inyecciones en múltiples espacios, que cuando se reubican crean un espacio total de líquido útil para lograr un efecto terapéutico sobre la porción deseada del espacio subretiniano
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en esta memoria incluye (y describe) realizaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".
Tal como se utiliza en esta memoria, la forma en singular de los artículos "un", "una" y "el", “la” incluye referencias en plural, a menos que se indique lo contrario.
Se entiende que los aspectos y realizaciones de la invención descritos en esta memoria incluyen aspectos y realizaciones "que comprende", "que consiste" y/o "que consiste esencialmente en".
III. CRISPR-Cas
Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren a sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)-asociada a CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas), modificados por ingeniería genética, no naturales. Estos sistemas pueden ser utilizados, entre otros, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con una mutación intrónica profunda en un gen de un individuo, por ejemplo una enfermedad o trastorno ocular asociado con una mutación intrónica profunda. En algunos casos, los sistemas de CRISPR-Cas incluyen un primer ARN guía y un segundo ARN guía, en los que el primer ARN guía y el segundo ARN guía se hibridan con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana que flanquean la mutación intrónica profunda; y una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas, en los que la proteína Cas escinde la molécula de ADN diana en sitios que flanquean la mutación intrónica profunda, escindiendo así una porción del ADN diana que comprende la mutación intrónica profunda.
Como se describió anteriormente, los sistemas de CRISPR-Cas se descubrieron originalmente como una defensa adaptativa contra ácidos nucleicos extraños en bacterias y arqueas. De hecho, se han identificado loci de CRISPR en más de 40 procariotas (véanse, por ejemplo, Jansen, R. et al. (2002) Mol. Microbiol. 43:1565-1575, y Mojica, FJ et al. (2005) J. Mol. Evol. 60:174-182), incluyendo sin limitación Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacteriumn, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thernioplasnia, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifrx, Porphvromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myrococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema, y Thermotoga.
En bacterias, Cas (por ejemplo, las proteínas Cas9) se unen a dos ARN guía diferentes: un ARN de CRISPR (ARNcr) y un ARNcr transactivador (ARNtracr). Los pares de bases de los ribonucleótidos ARNcr y ARNtracrRNA forman una estructura necesaria para la escisión del ADN diana mediada por Cas. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que un único ARN guía (sgRNA) puede diseñarse para formar la estructura ARNcr:ARNtracr y la escisión directa del Ad N diana mediada por Cas (Jinek, M., et al. (2012) Science 337(6096):816-21). Dado que la especificidad de la actividad de la nucleasa Cas está determinada por el ARN guía, el sistema de CRISPR-Cas se ha explorado como una herramienta para dirigir roturas de ADN de doble cadena en células heterólogas, lo que permite la edición genómica personalizable (Mali, P., et al. (2013) Science 339(6121):823-6). Se pueden encontrar descripciones adicionales de sistemas de CRISPR-Cas ejemplares y métodos de uso relacionados con ellos, entre otros, en la patente U.S. No. 8.697.359. En algunas realizaciones, un ARN guía como se describe aquí (por ejemplo, un primer o segundo ARN guía) comprende un único ARN guía (sgRNA) que comprende un ARN CRISPR (ARNcr) y un crRNA transactivador (ARNtracr). En algunas realizaciones, un ARN guía como se describe aquí (por ejemplo, un primer o segundo ARN guía) se fusiona con una secuencia cr de activación trans (tracr). En algunas realizaciones, la secuencia cr activadora de trans (tracr) comprende la secuencia de SEQ ID NO: 25.
Como tal, los sistemas de CRISPR-Cas descritos aquí pueden contrastar con un sistema de CRISPR-Cas natural por muchas razones. Por ejemplo, entre otras, los sistemas de CRISPR-Cas de la presente descripción pueden incluir uno o más ARN guía que se hibridan con una secuencia no natural (por ejemplo, un intrón eucariótico). Los sistemas de CRISPR-Cas de origen natural reconocen secuencias a las que las bacterias y las arqueas suelen estar expuestas, como la secuencia de plásmidos o fagos. Además, muchos de los sistemas de CRISPR-Cas de la presente descripción incluyen un único ARN guía, mientras que los sistemas de CRISPR-Cas que se producen de forma natural normalmente implican ARN de CRISPR (ARNcr) y ARNcr de transactivación (ARNtracr) separados.
Un sistema de CRISPR-Cas descrito aquí puede ser autolimitante. Por ejemplo, como se describe a continuación, un sistema de CRISPR-Cas puede incluir uno o más ARN guía que se hibridan con secuencias diana dentro del propio sistema, por ejemplo secuencia o secuencias cuya escisión afecta el nivel de expresión de los componentes del sistema, tal como una proteína Cas. Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que dado que el sistema de CRISPR-Cas no necesita expresarse de forma persistente en una célula hospedante, puede ser ventajoso la manipulación del sistema para que sea "autolimitante" (por ejemplo, caracterizado por una persistencia y/o expresión reducida), por ejemplo para reducir los efectos no deseados, reducir el potencial de respuestas inmunitarias no deseadas y/o problemas de seguridad, etc.
En un sistema de CRISPR-Cas autolimitante, el complejo de CRISPR-Cas se dirige a uno o más sitios en el vector utilizado para expresar uno o más componentes del propio complejo. Por lo tanto, tras la expresión de los ARN guía y la proteína Cas, el sistema de CRISPR-Cas se dirige a un locus de interés (por ejemplo, el sitio de una mutación como se describe aquí), así como a una o más dianas en el vector Cas, lo que finalmente conduce a la escisión del vector de Cas y a la reducción o eliminación de la expresión de la proteína Cas (después de la escisión en el locus de interés). El Ejemplo 3, más abajo, demuestra que un sistema de CRISPR-Cas autolimitante de este tipo se caracteriza por un tiempo de persistencia de Cas reducido, al mismo tiempo que permite una escisión efectiva en la o las secuencias diana de interés (por ejemplo, escisión de una mutación intrónica profunda).
Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren a un sistema de CRISPR-Cas autolimitante para uso en métodos para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una mutación en un gen de un individuo. Por ejemplo, la mutación puede ser una secuencia no deseada (por ejemplo, una mutación intrónica profunda) que se escinde del gen del individuo mediante el sistema de CRISPR-Cas. En otras realizaciones, la mutación puede ser una mutación sin sentido, puntual, u otra mutación que se corrige mediante el sistema de CRISPR-Cas (por ejemplo, reparación de ADN homólogo en la secuencia de a Dn escindida, particularmente si se incluye un molde de homología). En algunas realizaciones, el sistema de CRISPR-Cas está en una composición. En algunas realizaciones, la composición se administra al individuo en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Las composiciones para uso de acuerdo con la invención incluyen a) un ácido nucleico que codifica un sistema de CRISPR-Cas que comprende un primer ARN guía y un segundo ARN guía, en el que el primer ARN guía y el segundo ARN guía se hibridan con hebras opuestas de secuencias de ADN diana que flanquean una mutación intrónica en un gen CEP290; y b) un casete de expresión de Cas. El casete de expresión de Cas incluye una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas, y un sitio diana de ARN guía. El primer o segundo a Rn guía se hibrida con el sitio diana del ARN guía, lo que permite que el sistema de CRISPR-Cas catalice la escisión en el sitio diana del ARN guía. El sitio diana del ARN guía también puede incluir un motivo adyacente de protoespaciador (PAM), específico para la proteína Cas, adyacente a la secuencia que se hibrida con el ARN guía. Tras la expresión de la proteína Cas, la proteína Cas escinde las secuencias de ADN diana que flanquean la mutación, escindiendo así una porción del ADN diana que comprende la mutación. Tras la expresión de la proteína Cas, la proteína Cas también escinde el casete de expresión de Cas en el sitio diana del ARN guía, lo que reduce la expresión de la proteína Cas. Como tal, la expresión de Cas aumenta inicialmente después de la introducción del casete de expresión de Cas en la célula, pero a medida que la proteína Cas se acumula en la célula, la proteína Cas escinde el casete de expresión de Cas. A medida que la proteína Cas interrumpe más casete de expresión de Cas, se reduce la expresión de proteína Cas adicional (es decir, Cas limita la expresión de su propio casete de expresión, y puede considerarse un casete de expresión de Cas autolimitante). En algunas realizaciones, la expresión de la proteína Cas se caracteriza por un aumento inicial, seguido de una disminución de la expresión tras la escisión en el sitio diana del ARN guía. Como se describe aquí, la reducción de la expresión de la proteína Cas puede referirse a la reducción de la cantidad y/o persistencia de la proteína Cas. De acuerdo con la invención, la expresión de la proteína Cas se reduce en comparación con antes de la escisión del casete de expresión de Cas (por ejemplo, en comparación con la expresión inicial de Cas). En algunas realizaciones, la expresión de la proteína Cas puede reducirse en comparación con el uso de un casete de expresión de Cas que carece del sitio diana del ARN guía. En algunas realizaciones, la composición que comprende un casete de expresión de Cas autolimitante se puede usar para escindir un ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, la composición se puede usar para escindir un ácido nucleico diana in vitro o in vivo. Visto desde este aspecto, la presente invención proporciona un método in vitro para escindir un ácido nucleico diana en una célula, que comprende suministrar a la célula una cantidad eficaz de una composición como se define en las reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones, la composición puede usarse para escindir un ácido nucleico diana que comprende una mutación (por ejemplo, una mutación intrónica profunda). Por ejemplo, el casete de expresión de Cas autolimitante se usa para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una mutación en un ácido nucleico.
En algunas realizaciones, el casete de expresión de Cas incluye además un segundo sitio diana del ARN guía, en el que el primer ARN guía o el segundo ARN guía se hibrida con el segundo sitio diana del ARN guía, y en el que el segundo sitio diana del ARN guía es adyacente a un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) específico para la proteína Cas. Tras la expresión de la proteína Cas, la proteína Cas escinde las secuencias de ADN diana que flanquean la mutación, escindiendo así una porción del ADN diana que comprende la mutación. Además, tras la expresión de la proteína Cas, la proteína Cas escinde el casete de expresión de Cas en ambos sitios diana del ARN guía, lo que reduce la expresión de la proteína Cas. Como se ejemplifica a continuación, un ARN guía puede hibridar con dos sitios diana de ARN guía; un primer ARN guía puede hibridarse con un primer sitio diana de ARN guía, y un segundo ARN guía puede hibridarse con un segundo sitio diana de ARN guía; o un segundo ARN guía puede hibridarse con un primer sitio diana de ARN guía, y un primer ARN guía puede hibridarse con un segundo sitio de ARN guía.
En algunas realizaciones, el casete de expresión de Cas puede incluir uno o más promotores, potenciadores, intrones, secuencias de poliadenilación (poliA), terminadores, elementos reguladores presentes en regiones no traducidas 5' o 3', etc., útiles para dirigir/promover la expresión de la proteína Cas. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas se puede unir operativamente a un promotor. En algunas realizaciones, un sitio diana del ARN guía puede estar entre el promotor y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas, lo que da como resultado una disminución de la expresión de la proteína Cas tras la escisión. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína Cas disminuye mediante la escisión de la unión operativo entre el promotor y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas se puede unir operativamente a una secuencia de poliA. En algunas realizaciones, un sitio diana del ARN guía puede estar entre la secuencia de poliA y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas, lo que da como resultado una disminución de la expresión de la proteína Cas tras la escisión. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína Cas disminuye por la escisión del enlace operable entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y la secuencia de poliadenilación. En algunas realizaciones, un primer sitio diana del ARN guía puede estar entre el promotor y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas, y un segundo sitio diana del ARN guía puede estar entre la secuencia de poliA y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas, lo que da como resultado una disminución de la expresión de la proteína Cas tras la escisión. En algunas realizaciones, la proteína Cas puede fusionarse en marco con una o más NLS, y un sitio diana de ARN guía puede estar entre la secuencia que codifica la una o más NLS y una secuencia de poliA (particularmente si las NLS se fusionan con el extremo C-terminal de la proteína Cas), lo que da como resultado una disminución de la expresión de la proteína Cas fusionada con NLS tras la escisión.
Como se describe aquí, un sistema de CRISPR-Cas, tal como un sistema de CRISPR-Cas autolimitante, puede codificarse en uno o más vectores, tales como cualquiera de los vectores o vectores/partículas virales descritos aquí. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el primer y segundo ARN guía puede estar en el mismo vector que el casete de expresión de Cas. En otras realizaciones, el ácido nucleico que codifica el primer y segundo ARN guía puede ser un vector diferente al casete de expresión de Cas. Por ejemplo, los ARN guía primero y segundo pueden estar codificados por un primer vector de rAAV, y el casete de expresión de Cas puede estar codificado por un segundo vector de rAAV. En algunas realizaciones, la célula diana puede transfectarse con ambos vectores, lo que conduce a la expresión del sistema de CRISPR-Cas autolimitante.
La proteína Cas puede escindir la molécula de ADN diana en los sitios que flanquean una mutación (por ejemplo, una mutación intrónica profunda), escindiendo así una porción del ADN diana que comprende la mutación. Por ejemplo, un proceso de reparación de ADN, tal como la unión de extremos no homólogos (NHEJ), puede reparar la secuencia de ADN escindida uniendo los extremos escindidos, escindiendo así la porción del ADN diana que comprende la mutación intrónica profunda. En otros ejemplos, la reparación de ADN homólogo puede reparar la secuencia de ADN escindida, particularmente si se incluye un molde de homología. Como se describe y ejemplifica aquí, el uso de dos ARN guía que flanquean una secuencia de ADN diana (por ejemplo, una secuencia que tiene una mutación intrónica profunda) permite la escisión de una parte de la secuencia de ADN diana, tal como la secuencia que tiene la mutación intrónica profunda (véanse también Brandl, C. et al. (2014) FEBS Open Bio. 5:26-35; Zheng, Q. et al. (2014) Biotechniques 57:115-124, para obtener descripciones de estrategias ejemplares de eliminación de genes utilizando sistemas de CRISPR-Cas). La porción escindida de la secuencia de ADN diana puede comprender ADN intrónico. En algunas realizaciones, la porción escindida de la secuencia de ADN diana consiste únicamente en ADN intrónico.
El primero y/o el segundo ARN guía pueden hibridarse con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana que flanquean la mutación (por ejemplo, una mutación intrónica profunda). Sin desear limitarse a la teoría, se cree que el primer y/o el segundo ARN guía pueden hibridar con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana ubicadas dentro del intrón a cualquier distancia de la mutación intrónica profunda. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo ARN guía se hibridan con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana entre 1 par de bases y alrededor de 10.000 pares de bases de la mutación intrónica profunda. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo ARN guía se hibridan con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana ubicadas a menos de alrededor de cualquiera de las siguientes distancias de la mutación intrónica profunda (en nucleótidos): 10.000; 9.500; 9.000; 8.500; 8.000; 7.500; 7.000; 6.500; 6.000; 5.500; 5.000; 4.500; 4.000; 3.500; 3.000; 2.500; 2.000; 1.500; 1.000; 950; 900; 850; 800; 750; 700; 650; 600; 550; 500; 450; 400; 350; 300; 250; 200; 150; 100; 95; 90; 85; 80; 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4; 3; 2; o cualquier valor entre ellos. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo ARN guía se hibridan con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana ubicadas a más de cualquiera de alrededor de las siguientes distancias de la mutación intrónica profunda (en nucleótidos): 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60; 65; 70; 75; 80; 85; 90; 95; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 550; 600; 650; 700; 750; 800; 850; 900; 950; 1.000; 1.500; 2.000; 2.500; 3.000; 3.500; 4.000; 4.500; 5.000; 5.500; 6.000; 6.500; 7.000; 7.500; 8.000; 8.500; 9.000; 9.500; o cualquier valor entre ellos. Es decir, el primer y/o el segundo ARN guía pueden hibridarse con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana ubicadas a una distancia de la mutación intrónica profunda que puede ser cualquiera de un intervalo de distancias (en nucleótidos) que tiene un límite superior de 10.000; 9.500; 9.000; 8.500; 8.000; 7.500; 7.000; 6.500; 6.000; 5.500; 5.000; 4.500; 4.000; 3.500; 3.000; 2.500; 2.000; 1.500; 1.000; 950; 900; 850; 800; 750; 700; 650; 600; 550; 500; 450; 400; 350; 300; 250; 200; 150; 100; 95; 90; 85; 80; 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4; 3; 2; o cualquier valor entre ellos, y un límite inferior seleccionado independientemente de 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60; 65; 70; 75; 80; 85; 90; 95; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 550; 600; 650; 700; 750; 800; 850; 900; 950; 1.000; 1.500; 2.000; 2.500; 3.000; 3.500; 4.000; 4.500; 5.000; 5.500; 6.000; 6.500; 7.000; 7.500; 8.000; 8.500; 9.000; 9.500; o cualquier valor intermedio, en el que el límite inferior es menor que el límite superior.
Los ejemplos no limitativos de proteínas Cas incluyen Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocidas como Csn1 y Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15 , Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos de las mismas, o versiones modificadas de las mismas. Estas enzimas son comúnmente conocidas en la técnica.
En algunas realizaciones, la proteína Cas (por ejemplo, la enzima CRISPR) es una proteína Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR no modificada tiene actividad de escisión de ADN, tal como Cas9. Ejemplos de proteínas Cas9 incluyen, sin limitación, Cas9 de S. pyogenes (véase, por ejemplo, base de datos SwissProt n° de acceso Q99ZW2), Cas9 de S. aureus (véase, por ejemplo, N.° de acceso de GenBank CCK74173), Cas9 de S. thermophylus (véase, por ejemplo, base de datos SwissProt N° de acceso G3ECR1), Cas9 de N. meningitidis (véase, por ejemplo, número de acceso de UniProt C9X1G5), y Cas9 de T. denticola (véase, por ejemplo, número de acceso de GenBank EMB41078). En algunas realizaciones, la Cas9 es de S. pyogenes o S. pneumoniae. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas cadenas en la ubicación de una secuencia diana, tal como dentro de la secuencia diana y/o dentro del complemento de la secuencia diana. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o ambas cadenas dentro de alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, o más pares de bases del primer o último nucleótido de una secuencia diana.
En algunas realizaciones, una secuencia codificante de enzima que codifica una proteína Cas de la presente descripción tiene codones optimizados para la expresión en una célula particular, tal como una célula eucariota. Las células eucarióticas pueden ser las de un organismo particular o derivadas de él, tal como un mamífero, incluyendo, entre otros, seres humanos, ratones, ratas, conejos, perros, o primates no humanos. En general, la optimización de codones se refiere a un proceso de modificación de una secuencia de ácido nucleico para mejorar la expresión en las células hospedantes de interés mediante la sustitución de al menos un codón de la secuencia nativa por codones que se usan con más frecuencia o mucha frecuencia en los genes de esa célula hospedante, al tiempo que se mantiene la secuencia de aminoácidos nativa. Varias especies exhiben un sesgo particular para ciertos codones de un aminoácido particular. Las tablas de uso de codones están fácilmente disponibles, por ejemplo, en la "Base de datos de uso de codones", y estas tablas se pueden adaptar de varias maneras (véase, por ejemplo, Nakamura, Y. et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:292). También están disponibles algoritmos informáticos para la optimización de codones de una secuencia particular para la expresión en una célula hospedante particular, tales como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, Pa.).
En algunas realizaciones, la proteína Cas es una proteína de fusión que comprende uno o más dominios proteicos heterólogos (por ejemplo, alrededor de o más de alrededor de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios, además de la enzima CRISPR). Una proteína de fusión Cas puede comprender cualquier secuencia de proteína adicional y, opcionalmente, una secuencia enlazadora entre dos dominios cualesquiera. Los ejemplos de dominios de proteínas que pueden fusionarse con una proteína Cas incluyen, entre otros, etiquetas de epítopos, secuencias de genes informadores, y dominios de proteínas que tienen una o más de las siguientes actividades: actividad de metilasa, actividad de desmetilasa, actividad de activación de la transcripción, actividad de represión de la transcripción, actividad del factor de liberación de transcripción, actividad de modificación de histonas, actividad de escisión de ARN, y actividad de unión de ácidos nucleicos. Los ejemplos de etiquetas de epítopos incluyen, sin limitación, etiquetas de histidina (His), etiquetas V5, etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina (HA) de la gripe, etiquetas Myc, etiquetas VSV-G, y etiquetas de tiorredoxina (Trx). Los ejemplos de genes informadores incluyen, sin limitación, glutatión-5-transferasa (GST), peroxidasa de rábano picante (HRP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, luciferasa, y proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP, CFP, YFP, BFP, etc.). Una proteína Cas puede fusionarse con una secuencia genética que codifica una proteína o un fragmento de una proteína que se une a moléculas de ADN o se une a otras moléculas celulares, incluyendo, pero sin limitarse a, la proteína de unión a maltosa (MBP), la etiqueta S, el dominio de unión al ADN Lex A (DBD), fusiones del dominio de unión al ADN GAL4A, y fusiones de la proteína BP16 del virus del herpes simple (HSV). En algunas realizaciones, la proteína Cas se modifica para una función mejorada.
En algunas realizaciones, la proteína Cas es una proteína Cas mutante. En algunas realizaciones, la proteína Cas (por ejemplo, un proteína Cas9) es un mutante de nickasa (Ran et al., 2013 Cell 156(6): 1380-9). En algunas realizaciones, se usa un mutante nickasa Cas9 con pares de ARN guía para introducir roturas de doble cadena dirigidas, con escisión reducida de ADN fuera de la diana.
En algunas realizaciones, la proteína Cas es una variante de proteína Cas de alta fidelidad que alberga alteraciones de aminoácidos y muestra una actividad robusta en la diana pero una escisión insignificante fuera de la diana (Slaymaker, I.M. et al. (2016) Science 351(6268):84-88; Kleinstiver, B.P. et al. (2016) Nature 529:490-495).
En algunas realizaciones, el sistema de CRISPR-Cas comprende además una o más señales de localización nuclear (NLS(s)). Por ejemplo, la proteína Cas (por ejemplo, una proteína Cas9) puede comprender una o más NLS. Ejemplos de plásmidos que incluyen un Cas9 con una NLS se pueden encontrar en Ran, F.A. et al. (2013) Nat. Protoc. 8:22812308. En la técnica se conocen una variedad de NLS adecuadas para una variedad de células hospedantes. Por ejemplo y sin limitación, la NLS puede ser una NLS de SV40 (por ejemplo, como se describe en Mali, P., et al. (2013) Science 339(6121):823-6), una NLS monopartita de antígeno T grande de SV40, una NLS de nucleoplasmina, y una NLS de hnRNP A1. Las secuencias de NLS ejemplares que se pueden usar incluyen, entre otras, PKKKRKV (SEq ID NO: 26) o PKKKRKVEDPKKKRKVD (SEQ ID NO: 27) (véase, por ejemplo, Jinek, M. et al. (2013) eLife 2:e00471).
La formación de un complejo de CRISPR (que comprende una secuencia guía hibridada con la hebra opuesta de una secuencia diana y complejada con una o más proteínas Cas) generalmente da como resultado la escisión de una o ambas hebras en o cerca (por ejemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 o más pares de bases de) la secuencia diana en un sistema de CRISPR endógeno. También se cree que la secuencia tracr, que puede comprender la totalidad o una parte de una secuencia tracr de tipo salvaje, puede formar parte de un complejo de CRISPR, tal como por hibridación a lo largo de al menos una parte de la secuencia tracr con toda o una parte de una secuencia pareja de tracr, por ejemplo una secuencia pareja de tracr ligada operativamente a una secuencia guía.
En general, una secuencia pareja de tracr puede incluir cualquier secuencia que tenga suficiente complementariedad con una secuencia tracr para promover la escisión de una secuencia guía flanqueada por secuencias pareja de tracr en una célula que contiene la secuencia tracr correspondiente; la formación de un complejo de CRISPR que comprende la secuencia pareja de tracr hibridada con la secuencia tracr en una secuencia diana; o ambos. En algunas realizaciones, la secuencia tracr tiene suficiente complementariedad con una secuencia pareja de tracr para hibridarse y participar en la formación de un complejo de CRISPR. Como se describe a continuación con respecto a las secuencias diana, se cree que se necesita una complementariedad suficiente al menos para ser funcional (es decir, no se requiere una complementariedad completa entre las secuencias tracr y pareja de tracr).
Generalmente, el grado de complementariedad se refiere a la alineación óptima de la secuencia pareja de tracr y la secuencia tracr, a lo largo de la longitud de la más corta de las dos secuencias. La alineación óptima puede determinarse mediante cualquier algoritmo de alineación adecuado (por ejemplo, como se describe aquí), y puede explicar además las estructuras secundarias, tal como la autocomplementariedad dentro de la secuencia tracr o la secuencia pareja de tracr. En algunas realizaciones, la secuencia tracr es alrededor de o más de alrededor de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia tracr tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencia a lo largo de la secuencia pareja de tracr cuando se alinea de manera óptima (por ejemplo, según lo determinado por cualquiera de los ejemplos de métodos de alineación descritos aquí).
Sin pretender ceñirse a la teoría, se cree que cualquier secuencia de ADN diana deseada de interés puede ser objeto de una secuencia guía de sgRNA, y que el único requisito para una secuencia de ADN diana es la presencia de un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) adyacente a la secuencia diana de sgRNA (Mali, P., et al. (2013) Science 339(6121):823-6). Se sabe que diferentes complejos de Cas tienen diferentes motivos PAM. Por ejemplo, Cas9 de Streptococcus pyogenes tiene un motivo PAM de dinucleótido GG. Para más ejemplos, el motivo PAM de Cas9 de S. aureus es GRRT, en el que R es una purina (A o G), el motivo PAM de Cas9 de N. meningitidis es GATT, el motivo PAM de Cas9 de S. thermophylus es AGAA, y el motivo PAM de Cas9 de T. denticola es AAAAC.
En general, una secuencia guía puede ser cualquier secuencia polinucleotídica que tenga suficiente similitud con una secuencia polinucleotídica diana para hibridarse con la hebra opuesta de la secuencia diana y la unión directa, específica de secuencia, de un complejo de CRISPR a la secuencia diana. En algunas realizaciones, el grado de identidad entre una secuencia guía y su secuencia diana correspondiente es alrededor de o mayor que alrededor de 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99%, o más cuando se alinean de manera óptima utilizando un algoritmo de alineación adecuado. La alineación óptima puede determinarse con el uso de cualquier algoritmo adecuado para alinear secuencias; los ejemplos no limitativos incluyen el algoritmo de Smith-Waterman, el algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmos basados en la transformación de Burrows-Wheeler (por ejemplo, el alineador de Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, e La ND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn), Maq (disponible en maq.sourceforge.net), y similares.
En algunas realizaciones, una secuencia guía es alrededor de o más de alrededor de cualquiera de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia guía tiene menos de alrededor de cualquiera de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 o menos nucleótidos de longitud. Los ensayos para determinar la capacidad de una secuencia guía para dirigir la unión directa, específica de secuencia, de un complejo de CRISPR a una secuencia diana son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los componentes de un sistema de CRISPR suficientes para formar un complejo de CRISPR, incluida la secuencia guía que se analizará, se pueden proporcionar a una célula hospedante que tenga la secuencia diana correspondiente, tal como por transfección con vectores que codifican los componentes de la secuencia de CRISPR, seguido de una evaluación de la escisión preferencial dentro de la secuencia diana, por ejemplo como se describe en la patente U.S. No. 8.697.359.
En algunas realizaciones, un ARN guía de la presente descripción (por ejemplo, un primer ARN guía) comprende las secuencias de SEQ ID NO: 41 (para SpCas9), SEQ ID NO: 45 (para SaCas9), SEQ ID NO: 46 (para SaCas9), o SEQ ID NO: 47 (para SaCas9). En algunas realizaciones, un ARN guía de la presente descripción (por ejemplo, un primer ARN guía) comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19 (para SpCas9), SEQ ID NO: 50 (para SaCas9), SEQ ID NO: 51 (para SaCas9) o SEQ ID NO: 52 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el ARN guía comprende 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, eliminaciones o inserciones de las secuencias de SEQ ID NO: 41 (para SpCas9), SEQ ID NO: 45 (para SaCas9), SEQ ID NO :46 (para SaCas9), SEQ ID NO:47 (para SaCas9), SEQ ID NO:19 (para SpCas9), SEQ ID NO:50 (para SaCas9), SEQ ID NO:51 (para SaCas9) o SEQ iD NO: 52 (para SaCas9), al tiempo que mantiene su función como ARN guía para la escisión de Cas del gen CEP290. En algunas realizaciones, el ARN guía es una variante del ARN guía de SEQ ID NO: 41 (para SpCas9), SEQ ID NO: 45 (para SaCas9), SEQ ID NO: 46 (para SaCas9), SEQ ID NO: 47 (para SaCas9), SEQ iD NO: 19 (para SpCas9), SEQ iD NO: 50 (para SaCas9), SEQ ID NO: 51 (para SaCas9) o SEQ ID NO: 52 (para SaCas9), con función mejorada como ARN guía para la escisión de Cas del gen CEP290.
En algunas realizaciones, un ARN guía de la presente descripción (por ejemplo, un segundo ARN guía) comprende las secuencias de SEQ ID NO: 42 (para SpCas9), SEQ ID NO: 43 (para SpCas9), SEQ ID NO: 44 (para SpCas9), SEQ ID NO: 48 (para SaCas9), o SeQ ID n O: 49 (para SaCas9). En algunas realizaciones, un ARN guía de la presente descripción (por ejemplo, un segundo ARN guía) comprende las secuencias de SEQ ID NO: 20 (para SpCas9), SEQ ID NO: 21 (para SpCas9), SEQ ID NO: 22 (para SpCas9), SEQ ID NO: 53 (para SaCas9), o s Eq ID NO: 54 (para SaCas9). En algunas realizaciones, el ARN guía comprende 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, deleciones o inserciones de las secuencias de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18, al tiempo que mantiene su función como ARN guía para la escisión de Cas del gen CEP290. En algunas realizaciones, el ARN guía es una variante del ARN guía de SEQ ID NO: 42 (para SpCas9), SEQ ID NO: 43 (para SpCas9), SEQ ID NO: 44 (para SpCas9), SEQ ID NO: 48 (para SaCas9), SEQ ID NO:49 (para SaCas9), SEQ ID NO: 20 (para SpCas9), SEQ iD NO: 21 (para SpCas9), SEQ iD NO: 22 (para SpCas9), SEQ ID NO: 53 (para SaCas9), o SEQ ID NO: 54 (para SaCas9), con función mejorada como ARN guía para la escisión de Cas del gen CEP290.
En algunas realizaciones, la secuencia tracr y la secuencia pareja de tracr están contenidas dentro de un solo transcrito, de modo que la hibridación entre las dos produce un transcrito que tiene una estructura secundaria (por ejemplo, una horquilla). En algunas realizaciones, las secuencias formadoras de bucles para uso en estructuras de horquilla tienen una longitud de cuatro nucleótidos. En algunas realizaciones, las secuencias que forman bucles tienen la secuencia GAAA. Sin embargo, pueden usarse secuencias de bucle más largas o más cortas, así como secuencias alternativas. Los ejemplos de otras secuencias formadoras de bucles incluyen, sin limitación, CAAA y AAAG. En algunas realizaciones, el transcrito o la secuencia polinucleotídica transcrita tiene al menos dos o más horquillas, por ejemplo dos, tres, cuatro o cinco horquillas. En algunas realizaciones, el transcrito individual incluye además una secuencia de terminación de la transcripción, por ejemplo una secuencia de poliT, tal como seis nucleótidos T.
IV. Mutaciones intrónicas profundas
Ciertos casos de la presente descripción se refieren a mutaciones intrónicas profundas, mientras que las reivindicaciones adjuntas se refieren específicamente a una mutación intrónica en un gen CEP290. Como se describió anteriormente, una mutación intrónica profunda puede conducir a la inclusión aberrante de una secuencia intrónica en un ARNm maduro (por ejemplo, ayustado). Por ejemplo, una mutación intrónica profunda puede introducir en un gen un sitio donante de ayuste, un sitio aceptor de ayuste, o un sitio potenciador de ayuste. Como resultado, la secuencia intrónica puede incluirse como un exón críptico. Normalmente, esto da como resultado un polipéptido mutado, particularmente si el exón críptico incluye una mutación de desplazamiento del marco de lectura o un codón de parada prematuro.
Como se describió anteriormente, una mutación intrónica profunda se refiere a una mutación fuera de las secuencias del aceptor de ayuste y del donante de ayuste de tipo salvaje, es decir, a diferencia de una mutación en un aceptor de ayuste o en un donante de ayuste endógeno. Típicamente, una mutación intrónica profunda ocurre a cierta distancia de los sitios donantes/aceptores de ayuste endógenos.
En algunas realizaciones, una mutación intrónica profunda se localiza al menos alrededor de a 100 nucleótidos de un sitio donante de ayuste 5' del gen. En algunas realizaciones, una mutación intrónica profunda se localiza al menos alrededor de a 100 nucleótidos de un sitio aceptor de ayuste 3' del gen. En algunas realizaciones, una mutación intrónica profunda se localiza al menos alrededor de a 100 nucleótidos de un donante de ayuste en 5' y al menos a alrededor de 100 nucleótidos de un sitio aceptor de ayuste en 3' del gen. En algunas realizaciones, una mutación intrónica profunda se produce en más de alrededor de 100 nucleótidos, más de alrededor de 150 nucleótidos, más de alrededor de 200 nucleótidos, más de alrededor de 250 nucleótidos, más de alrededor de 300 nucleótidos, más de alrededor de 350 nucleótidos, más de alrededor de 400 nucleótidos, más de alrededor de 450 nucleótidos, más de alrededor de 500 nucleótidos, más de alrededor de 550 nucleótidos, más de alrededor de 600 nucleótidos, más de alrededor de 650 nucleótidos, más de alrededor de 700 nucleótidos, más de alrededor de 750 nucleótidos, más de alrededor de 800 nucleótidos, más de alrededor de 850 nucleótidos, más de alrededor de 900 nucleótidos, más de alrededor de 950 nucleótidos, más de alrededor de 1.000 nucleótidos, más de alrededor de 1.500 nucleótidos, más de alrededor de 2.000 nucleótidos, más de alrededor de 2.500 nucleótidos, más de alrededor de 3.000 nucleótidos, más de alrededor de 3.500 nucleótidos, más de alrededor de 4.000 nucleótidos, más de alrededor de 4.500 nucleótidos, más de alrededor de 5.000 nucleótidos, más de alrededor de 5.500 nucleótidos, más de alrededor de 6.000 nucleótidos, más de alrededor de 6.500 nucleótidos, más de alrededor de 7.000 nucleótidos, más de alrededor de 7.500 nucleótidos, más de alrededor de 8.000 nucleótidos, más de alrededor de 8.500 nucleótidos, más de alrededor de 9.000 nucleótidos, más de alrededor de 9.500 nucleótidos, más de alrededor de 10.000 nucleótidos, más de alrededor de 15.000 nucleótidos, más de alrededor de 20.000 nucleótidos, más de alrededor de 25.000 nucleótidos, más de alrededor de 30.000 nucleótidos, más de alrededor de 35.000 nucleótidos, más de alrededor de 40.000 nucleótidos, más de alrededor de 45.000 nucleótidos, más de alrededor de 50.000 nucleótidos, más de alrededor de 55.000 nucleótidos, más de alrededor de 60.000 nucleótidos, más de alrededor de 65.000 nucleótidos, más de alrededor de 70.000 nucleótidos, más de alrededor de 75.000 nucleótidos, más de alrededor de 80.000 nucleótidos, o más de alrededor de 85.000 nucleótidos de un aceptor de ayuste endógeno y/o sitio donante de ayuste (por ejemplo, un sitio donante de ayuste en 5' y/o un sitio aceptor de ayuste en 3').
En algunas realizaciones, una mutación intrónica profunda se produce a una distancia de un aceptor de ayuste endógeno y/o sitio donante de ayuste (por ejemplo, un sitio donante de ayuste en 5' o un aceptor de ayuste en 3') que es menor que cualquiera de las siguientes distancias (en nucleótidos): 85.000; 80.000; 75.000; 70.000; 65.000; 60.000; 55.000; 50.000; 45.000; 40.000; 35.000; 30.000; 25.000; 20.000; 15.000; 10.000; 9.500; 9.000; 8.500; 8.000; 7.500; 7.000; 6.500; 6.000; 5.500; 5.000; 4.500; 4.000; 3.500; 3.000; 2.500; 2.000; 1.500; 1.000; 950; 900; 850; 800; 750; 700; 650; 600; 550; 500; 450; 400; 350; 300; 250; 200; o 150. En algunas realizaciones, una mutación intrónica profunda se produce a una distancia de un aceptor de ayuste endógeno y/o sitio donante de ayuste que es mayor que cualquiera de las siguientes distancias (en nucleótidos): 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000; 1.500; 2.000; 2.500; 3.000; 3.500; 4.000; 4.500; 5.000; 5.500; 6.000; 6.500; 7.000; 7.500; 8.000; 8.500; 9.000; 9.500; 10.000; 15.000; 20.000; 25.000; 30.000; 35.000; 40.000; 45.000; 50.000; 55.000; 60.000; 65.000; 70.000; 75.000; o 80.000. Es decir, la distancia desde la mutación intrónica profunda hasta el aceptor de ayuste endógeno y/o sitio donante de ayuste (por ejemplo, un sitio donante de ayuste en 5') puede ser cualquiera de un intervalo de distancias (en nucleótidos) que tiene un límite superior de 85.000; 80.000; 75.000; 70.000; 65.000; 60.000; 55.000; 50.000; 45.000; 40.000; 35.000; 30.000; 25.000; 20.000; 15.000; 10.000; 9.500; 9.000; 8.500; 8.000; 7.500; 7.000; 6.500; 6.000; 5.500; 5.000; 4.500; 4.000; 3.500; 3.000; 2.500; 2.000; 1.500; 1.000; 950; 900; 850; 800; 750; 700; 650; 600; 550; 500; 450; 400; 350; 300; 250; 200; o 150, y un límite inferior seleccionado independientemente de 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900; 950; 1.000; 1.500; 2.000; 2.500; 3.000; 3.500; 4.000; 4.500; 5.000; 5.500; 6.000; 6.500; 7.000; 7.500; 8.000; 8.500; 9.000; 9.500; 10.000; 15.000; 20.000; 25.000; 30.000; 35.000; 40.000; 45.000; 50.000; 55.000; 60.000; 65.000; 70.000; 75.000; o 80.000; en el que el límite inferior es menor que el límite superior.
Los métodos, kits, composiciones y partículas virales descritos aquí pueden usarse, entre otros, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con una mutación intrónica profunda, por ejemplo en un gen de un individuo. En la técnica se conocen diversas mutaciones intrónicas profundas. Las mutaciones intrónicas profundas ejemplares asociadas con la enfermedad se proporcionan en la Tabla 1 a continuación (tenga en cuenta que las mutaciones específicas, los genes y los tamaños de intrones proporcionados en la Tabla 1 se refieren a la secuencia de ADN humano como referencia).
Tabla 1. Enfermedades ejemplares asociadas con mutaciones intrónicas profundas.
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Una enfermedad o trastorno asociado con una mutación intrónica profunda puede seleccionarse de afibrinogenemia, síndrome de Alport, esclerosis lateral amiotrófica, ataxia telangiectasia, poliquistosis renal autosómica recesiva, síndrome de Barth, beta-talasemia, afibrinogenemia congénita, síndrome de cataratas congénitas, dismorfia facial y neuropatía, trastorno congénito de la glicosilación tipo Ia, trastorno congénito de la glicosilación tipo II, fibrosis quística, deficiencia de dihidropteridina reductasa, enfermedad de Fabry, trastorno plaquetario familiar con predisposición a leucemia mielógena aguda, anemia de Fanconi, síndrome de Gitelman, insensibilidad a la hormona del crecimiento, ataxia de Friedrich, hemofilia A, anemia megaloblástica hereditaria 1, síndrome de Hermansky-Pudlak, homocitinuria, enfermedad de orina de jarabe de arce, síndrome de Marfan, deficiencia de metionina sintasa, acidemia metilmalónica, deficiencia de proteína trifuncional mitocondrial, mucupolisacaridosis tipo II, enfermedad multi-minicore, distrofia muscular, neurofibromatosis tipo I, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, albinismo ocular tipo I, deficiencia de ornitina delta-aminotransferasa, predisposición a lupus eritematoso sistémico, acidemia propiónica, tumores rabdoides, síndrome de Schwartz-Jampel, síndrome de Stickler, lupus eritematoso sistémico, esclerosis tuberosa, síndrome de Werner, hiperinmunoglobulinemia M ligada al cromosoma X, o hipofosfatemia ligada al cromosoma X. La mutación intrónica profunda puede ser una mutación intrónica profunda presentada en la Tabla 1.
La enfermedad o trastorno asociado con una mutación intrónica profunda puede ser una enfermedad ocular. Tal como se usa aquí, la expresión "enfermedad ocular" se usa en el sentido más amplio, y puede referirse a una enfermedad que se origina en cualquier estructura del ojo, o que da como resultado una condición patológica de la misma, incluyendo, entre otros, la córnea, el iris, el cristalino, la retina, nervio óptico, humor acuoso, conjuntiva, uno o más músculos oculares, esclerótica, cuerpo vítreo, mácula, fóvea, cuerpo ciliar, uno o más ligamentos o zónulas del ligamento suspensorio, pupila, cámara anterior y/o cámara posterior. En la Tabla 2, a continuación, se proporcionan ejemplos de mutaciones intrónicas profundas asociadas con enfermedades oculares (tenga en cuenta que las mutaciones, genes y tamaños de intrones específicos proporcionados en la Tabla 2 se refieren a la secuencia de ADN humano como referencia).
Tabla 2. Enfermedades oculares asociadas con mutaciones intrónicas profundas.
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La enfermedad ocular puede ser amaurosis congénita de Leber, atrofia óptica, retinitis pigmentosa, retinoblastoma, enfermedad de Stargardt, síndrome de Usher, o retinosis pigmentaria ligada al cromosoma X. La mutación intrónica profunda puede ser una mutación intrónica profunda presentada en la Tabla 2.
En un aspecto, la invención proporciona una composición para uso en un método para tratar la enfermedad ocular de amaurosis congénita de Leber, como se expone en las reivindicaciones adjuntas. La amaurosis congénita de Leber (LCA) se refiere a un grupo de trastornos oculares caracterizados por síntomas tales como pérdida severa de la visión, nistagmo, disfunción retiniana, fotofobia, signo oculodigital (por ejemplo, frotar, pinchar, y presionar el ojo) y queratocono. LCA típicamente se presenta al nacer, con pérdida de visión profunda y nistagmo. Si bien los casos de LCA generalmente se heredan como un trastorno autosómico recesivo, se han implicado mutaciones en una variedad de loci genéticos. Por ejemplo, la Tabla 3 enumera algunos de los loci implicados en formas de LCA.
Tabla 3. Loci de la enfermedad de LCA.
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El tipo más frecuente de LCA es causado por una mutación en CEP290, que codifica una proteína centrosomal que juega un papel importante en el desarrollo del centrosoma y los cilios (véase, por ejemplo, NCBI Gene ID No. 80184 y UniProt ID No. 015078 para ejemplos de secuencias de genes y proteínas humanas, respectivamente). CEP290 es esencial en la formación del cilio primario en la membrana celular, que juega un papel importante en los fotorreceptores en la parte posterior de la retina, y en el riñón, el cerebro y muchos otros órganos del cuerpo. CEP290 también se conoce como MKS4, CT87, POC3, rd16, BBS14, LCA10, JBTS5, NPHP6, SLSN6, y 3H11Ag. En algunas realizaciones, la mutación causante es una mutación c.2991+1655A>G que introduce un sitio donante de ayuste críptico, lo que da como resultado la inclusión de un exón aberrante con un codón de terminación prematuro. En algunas realizaciones, las secuencias guía del primer ARN guía y del segundo ARN guía se hibridan con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana que flanquean una mutación intrónica profunda del gen de la proteína centrosomal 290 kDa (CEP290). En ciertas realizaciones, la mutación intrónica profunda es una mutación c.2991+1655A>G. En algunas realizaciones, el CEP290 es un CEP290 humano (véase, por ejemplo, la secuencia de CEP290 humano de acuerdo con la secuencia de referencia NCBI NG_008417). En algunas realizaciones, el CEP290 comprende una mutación intrónica profunda de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:23.
Ciertos casos de la presente descripción, que no están incluidos en las reivindicaciones adjuntas, se refieren a métodos para generar un modelo in vitro de una enfermedad ocular asociada con una mutación intrónica profunda en un gen. En algunos casos, los métodos incluyen la introducción en células eucariotas de ácido nucleico que codifica un sistema de CRISPR-Cas, en el que el sistema de CRISPR-Cas comprende i) un único ARN guía para secuencias de ADN diana de un intrón en el gen, ii) una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas, iii) un oligonucleótido monocatenario que comprende una plantilla de reparación dirigida por homología (HDR) que comprende brazos de homología que flanquean una mutación intrónica deseada y un motivo adyacente protoespaciador (PAM); y aislar células que comprenden la mutación incorporada en el gen. Los métodos ejemplares relacionados con este enfoque se ilustran en los Ejemplos a continuación. Como se describió anteriormente, la escisión de ADN mediada por CRISPR-Cas puede repararse mediante NHEJ, lo que da como resultado, por ejemplo, escisión de una secuencia de ADN diana. Sin embargo, la escisión del ADN mediada por CRISPR-Cas también puede repararse mediante la reparación dirigida por homología (HDR), lo que da como resultado, por ejemplo, la introducción de una secuencia presente en la plantilla de HDR (por ejemplo, una mutación intrónica profunda introducida). Véase, p.ej., Ran, F.A. et al. (2013) Nat. Protoc. 8:2281-2308. Estos métodos pueden incluir cualquier característica, aspecto o elemento descrito aquí con respecto a los métodos de tratamiento, partículas virales, composiciones y kits.
Una plantilla de reparación dirigida por homología (HDR) puede tomar una variedad de formas, tal como un polinucleótido de ADN bicatenario, o un oligonucleótido de ADN monocatenario (ssODN). La plantilla de HDR puede incluir uno o más brazos de homología que flanquean una mutación intrónica deseada. Estos brazos de homología pueden estar en la dirección sentido o antisentido, con respecto al locus diana. En algunos casos, uno o más brazos de homología pueden tener al menos alrededor de 40 pares de bases, al menos alrededor de 50 pares de bases, al menos alrededor de 60 pares de bases, al menos alrededor de 70 pares de bases, al menos alrededor de 80 pares de bases, al menos alrededor de 90 pares de bases, o al menos unos 100 pares de bases lejos del locus diana.
La plantilla de HDR también puede incluir un motivo adyacente protoespaciador (PAM). En algunas realizaciones, el PAM comprende una mutación para evitar la escisión del oligonucleótido monocatenario por una proteína Cas expresada en las células. Por ejemplo, el PAM puede estar mutado de tal manera que la proteína Cas expresada particular no escinda la plantilla de HDR, o puede estar mutado de tal manera que una secuencia de identificación (por ejemplo, un sitio de restricción único, como se ilustra en los Ejemplos a continuación) se introduce en la edición mediada por CRISPR-Cas de un locus genómico.
Puede utilizarse cualquier célula eucariota adecuada para el modelo in vitro. En algunos casos, la célula eucariota es una célula de mamífero o humana. En algunos casos, la célula eucariota es una línea celular, tal como una línea celular humana (por ejemplo, HeLa, A549, 293, etc.), una línea celular de mamífero, una línea celular de vertebrado, o una línea celular de insecto (por ejemplo, Sf9 o S2). En algunos casos, la célula eucariota es una célula retiniana (por ejemplo, una célula WERI), tal como una célula fotorreceptora.
V. Métodos de administración
Ciertos casos de la presente descripción se refieren generalmente al tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con una mutación intrónica profunda en un gen de un individuo. Los métodos para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una mutación intrónica profunda en un gen de un individuo pueden comprender administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de la presente descripción, por ejemplo una composición que comprende ácido nucleico que codifica un sistema de CRISPR-Cas de origen no natural modificado por ingeniería genética de la presente descripción. El ácido nucleico que codifica el sistema de CRISPR-Cas de origen no natural modificado por ingeniería genética puede ser ADN o ARN. La proteína Cas puede administrarse como una proteína.
Vectores
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas están ubicados en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema. En algunas realizaciones, uno o más vectores que conducen la expresión de uno o más elementos de un sistema de CRISPR se introducen en una célula de manera que la expresión de los elementos del sistema de CRISPR dirige la formación de un complejo de CRISPR en uno o más sitios diana. Por ejemplo, una enzima Cas, una secuencia guía unida a una secuencia pareja de tracr, y una secuencia tracr pueden estar cada una ligada operativamente a elementos reguladores separados en vectores separados. Alternativamente, dos o más de los elementos descritos anteriormente pueden expresarse a partir de elementos reguladores iguales o diferentes, y/o pueden combinarse en un solo vector, opcionalmente con uno o más vectores adicionales que proporcionen cualquier componente del sistema de CRISPR no incluido en el primer vector. Los elementos del sistema de CRISPR que se combinan en un vector pueden disponerse en cualquier orientación adecuada. Por ejemplo, la secuencia codificante de un elemento puede ubicarse en la misma cadena o en la opuesta de la secuencia codificante de un segundo elemento, y/o orientarse en la misma dirección o en dirección opuesta.
En algunas realizaciones, un solo promotor dirige la expresión de un transcrito que codifica una proteína Cas y una o más de la secuencia guía, la secuencia pareja de tracr (opcionalmente ligada operativamente a la secuencia guía) y una secuencia tracr incrustada dentro de una o más secuencias intrónicas (por ejemplo, cada una en un intrón diferente, dos o más en al menos un intrón, o todas en un solo intrón). En algunas realizaciones, la proteína Cas, la secuencia guía, la secuencia pareja de tracr y la secuencia tracr se unen operativamente y se expresan a partir del mismo promotor. En algunas realizaciones, el primer ARN guía, el segundo ARN guía y/o el ácido nucleico que codifica la proteína Cas están unidos operativamente a uno o más elementos de control reguladores y/o promotores.
En algunas realizaciones, el vector es un plásmido.
En algunas realizaciones, el primer ARN guía, el segundo ARN guía y la proteína Cas se expresan en células eucariotas. En algunas realizaciones, el primer ARN guía, el segundo ARN guía y la proteína Cas se unen operativamente a uno o más promotores que permiten la expresión en una célula eucariota. En la técnica se conoce una variedad de promotores que se expresan en células eucariotas. A continuación se proporcionan ejemplos de promotores, sin limitación.
En algunas realizaciones, el primer ARN guía y/o el segundo ARN guía están enlazados operativamente a un promotor de ARN polimerasa III. Los promotores de la ARN polimerasa III pueden incluir un promotor de longitud completa o un fragmento del mismo suficiente para impulsar la transcripción por parte de la ARN polimerasa III. Para obtener una descripción más detallada de los tipos de promotores de la ARN polimerasa III, las características estructurales y las interacciones con la ARN polimerasa III, así como los promotores adecuados de la ARN polimerasa III, véase Schramm, L. y Hernandez, N. (2002) Genes Dev. 16:2593-620. Se puede usar cualquier promotor de ARN polimerasa III adecuado conocido en la técnica, incluidos, entre otros, promotores para un ARNt, ARN 5S, ARNsn U6, H1, 7SK, ARNasa P, el componente de ARN de la partícula de reconocimiento de señales, y ARNsno (véase, por ejemplo, Ma, H. et al. (2014) Mol. Ther. Nucleic Acids 3:e161). En algunas realizaciones, el promotor de la ARN polimerasa III es un promotor U6, H1 o 7SK. En algunas realizaciones, el primer ARN guía y/o el segundo ARN guía están enlazados operativamente a un terminador de ARN polimerasa III. Los ejemplos de terminadores de ARN polimerasa III pueden incluir, entre otros, una cadena de nucleótidos de uridina de al menos 5-6 bases de longitud (para obtener más información sobre los terminadores de ARN polimerasa III, véase Marck, C., et al. (2006) Nucleic Acids Res 34(6):1816-35).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína Cas se une operativamente a un promotor de ARN polimerasa II. Los promotores de la ARN polimerasa II pueden incluir un promotor de longitud completa o un fragmento del mismo suficiente para impulsar la transcripción por parte de la ARN polimerasa II. Se puede usar cualquier promotor de ARN polimerasa II adecuado conocido en la técnica, incluyendo, entre otros, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), el fragmento de promotor mínimo derivado del promotor de CMV (promotor minCMV), la LTR de RSV, la LTR de MoMLV, el promotor de fosfoglicerato cinasa-1 (PGK), un promotor del virus del simio 40 (SV40) y un promotor de CK6, un promotor de transtirretina (TTR), un promotor de TK, un promotor de respuesta a tetraciclina (TRE), un promotor de HBV, un promotor de hAAT, un promotor de LSP, promotores quiméricos específicos del hígado (LSP), el promotor E2F, el promotor de la telomerasa (hTERT); el promotor del potenciador de citomegalovirus/betaactina de pollo/p-globina de conejo (promotor CAG; Niwa et al., Gene, 1991, 108(2): 193-9), y el promotor del factor de elongación 1 -alfa (EFl-alfa) (Kim et al., Gene, 1990, 91 (2):217-23 y Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10). En algunas realizaciones, el promotor comprende un promotor de p-glucuronidasa humana o un potenciador de citomegalovirus enlazado a un promotor de p-actina de pollo (CBA). El promotor puede ser un promotor constitutivo, inducible o reprimible. En algunas realizaciones, el promotor es capaz de expresar el ácido nucleico heterólogo en una célula del ojo. En algunas realizaciones, el promotor es capaz de expresar el ácido nucleico heterólogo en células fotorreceptoras o el RPE. En realizaciones, el promotor es un promotor de rodopsina cinasa (RK); por ejemplo, un promotor de RK humana. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de opsina; por ejemplo, un promotor de opsina humana o un promotor de opsina de ratón. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de opsina de bastón, un promotor de opsina de cono, un promotor de beta fosfodiesterasa (PDE), un promotor de retinitis pigmentosa (RP1), o un promotor del gen de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (IRBP).
Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión génica, y pueden ser regulados por compuestos suministrados exógenamente, factores ambientales tales como la temperatura o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o sólo en células en replicación. Promotores inducibles y Sistemas inducibles están disponibles de una diversidad de fuentes comerciales, que incluyen, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito muchos otros sistemas y un experto en la técnica puede seleccionarlos fácilmente. Ejemplos de promotores inducibles regulados por promotores suministrados exógenamente incluyen el promotor de metalotionina de oveja (MT) inducible por zinc, el promotor del virus del tumor mamario de ratón inducible por dexametasona (Dex) (MMTV), el sistema promotor de la polimerasa T7 (documento WO 98/10088); el promotor de insectos ecdisona (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), el sistema reprimible por tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), el sistema inducible por tetraciclina (Gossen et al., Science, 268: 1766-1769 (1995), véase también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2 : 512-518 (1998)), el sistema inducible por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997) y Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997 )) y el sistema inducible por rapamicina (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Aún otros tipos de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son aquellos que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o sólo en células en replicación.
En otra realización, se utilizará el promotor nativo, o un fragmento del mismo, para el transgén. El promotor nativo puede utilizarse cuando se desee que la expresión del transgén imite la expresión nativa. El promotor nativo puede utilizarse cuando la expresión del transgén deba regularse temporalmente o en el desarrollo, o de una manera específica para el tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una realización adicional, también pueden utilizarse otros elementos de control de la expresión nativos, tales como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias consenso de Kozak para imitar la expresión nativa.
En algunas realizaciones, las secuencias reguladoras imparten capacidades de expresión génica específicas para el tejido. En algunos casos, las secuencias reguladoras específicas para el tejido se unen a factores de transcripción específicos para el tejido que inducen la transcripción de una manera específica para el tejido. Tales secuencias reguladoras específicas de tejido (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) son bien conocidas en la técnica. Ejemplos de secuencias reguladoras específicas de tejido incluyen, pero no se limitan a, los siguientes promotores específicos de tejido: promotor neuronal tal como enolasa específica de neurona (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13 :503-15 (1993)), promotor del gen de la cadena ligera del neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), y el promotor del gen vgf específico de la neurona (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)). En algunas realizaciones, el promotor específico para el tejido es un promotor de un gen seleccionado de: núcleos neuronales (NeuN), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), poliposis coli adenomatosa (APC) y molécula adaptadora de unión a calcio ionizada 1 (Iba-1). Otros promotores específicos para el tejido apropiados resultarán evidentes para el experto en la materia. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de beta-actina de pollo.
La presente descripción contempla el uso de un genoma viral recombinante para la introducción de una o más secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, un ARN guía y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas) para el empaquetamiento en una partícula viral, por ejemplo una partícula viral descrita a continuación. El genoma viral recombinante puede incluir cualquier elemento para establecer la expresión del ARN guía y/o la secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas, por ejemplo un promotor, una ITR, un elemento de unión al ribosoma, un terminador, un potenciador, un marcador de selección, un intrón, una señal de poliA, y/o un origen de replicación. A continuación se describen con mayor detalle elementos del genoma viral ejemplares y métodos de administración para una variedad de partículas virales.
Sistemas de administración no virales
También se pueden usar métodos de transferencia de genes no virales convencionales para introducir ácidos nucleicos en células o tejidos diana. Los sistemas de suministro de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ARN (por ejemplo, un ARN guía o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas), ácido nucleico desnudo (por ejemplo, ADN o ARN), y ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) complejado a un sistema de suministro. Por ejemplo, el vector puede formar un complejo con un lípido (por ejemplo, un lípido catiónico o neutro), un liposoma, un policatión, una nanopartícula, o un agente que potencia la captación celular de ácido nucleico. El vector puede formar un complejo con un agente adecuado para cualquiera de los métodos de administración descritos aquí.
Los métodos de administración no viral de ácidos nucleicos incluyen lipofección, nucleofección, microinyección, biolística, nanopartículas (véase, por ejemplo, Jin, S. et al. (2009) Methods Mol. Biol. 544:547-557), virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o conjugados de lípido:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, y captación de ADN potenciada por agentes. La lipofección se describe, por ejemplo, en las patentes U.S. Nos.
5.049.386, 4.946.787; y 4.897.355), y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Lipofectamine®, Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección de polinucleótidos con reconocimiento de receptor eficiente incluyen los de Felgner, documento WO 91/17424; documento WO 91/16024.
La preparación de complejos de lípido:ácido nucleico, incluyendo los liposomas dirigidos, tales como los complejos de inmunolípidos, es bien conocida por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995): Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res.
52:4817-4820 (1992); patentes U.S. Nos. 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, y 4.946.787).
Otros compuestos que pueden formar complejos con un vector de la presente descripción incluyen, sin limitación, un péptido catiónico (por ejemplo, poli-L-lisina), una sal (por ejemplo, fosfato de calcio), DEAE dextrano, un dendrímero (por ejemplo, poliamidoamina o PAMAM), polietilenglicol, polietilenimina (PEI), y conjugados de los mismos, y similares. Para una discusión más detallada de tales agentes, véase, por ejemplo, Luo, D. y Saltzman, W.M. (2000) Nature Biotechnology 18:33-37.'
En algunas realizaciones, el ácido nucleico se encuentra en una formulación farmacéutica. En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Soportes de este tipo son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15a edición, págs. 1035-1038 y 1570­ 1580). En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un ácido nucleico descrito aquí y un vehículo farmacéuticamente aceptable son adecuadas para inyección ocular. Soportes farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceite, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y similares. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa, polietilenglicol (PEG) y glicerol como soportes líquidos, particularmente para soluciones inyectables. La composición farmacéutica puede comprender, además, ingredientes adicionales, por ejemplo conservantes, tampones, agentes de tonicidad, antioxidantes y estabilizadores, agentes humectantes o clarificantes no iónicos, agentes que aumentan la viscosidad y similares. Las composiciones farmacéuticas descritas en esta memoria pueden envasarse en dosis unitarias únicas o en formas de múltiples dosis. Las composiciones se formulan generalmente como solución estéril y sustancialmente isotónica.
Partículas virales
En algunas realizaciones, el vector es un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV), un vector adenoviral recombinante, un vector lentiviral recombinante, o un vector del virus del herpes simple recombinante (HSV).
Partículas de rAAV
En algunas realizaciones, el vector es un vector del AAV recombinante (rAAV). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas está flanqueado por una o más secuencias de la repetición terminal invertida (ITR) del AAV. En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula de AAV recombinante que comprende un ácido nucleico que comprende un transgén flanqueado por una o dos ITR. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas está flanqueado por dos ITR del AAV.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende uno o dos ARN guía de la presente descripción y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas de la presente descripción, componentes ligados operativamente en la dirección de la transcripción, secuencias de control que incluyen secuencias de inicio y terminación de la transcripción, por lo tanto formando un casete de expresión. El casete de expresión está flanqueado en el extremo 5' y 3' por al menos una secuencia de ITR de AAV funcional. Por "secuencias de ITR de AAV funcionales" se entiende que las secuencias de ITR funcionan según lo previsto para el rescate, la replicación y el empaquetamiento del virión de AAV. Véanse Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; y Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16: 10-16. Para poner en práctica algunos aspectos de la invención, los vectores recombinantes comprenden al menos todas las secuencias de AAV esenciales para la encapsidación y las estructuras físicas para la infección por el rAAV. Las ITR de AAV para uso en los vectores descritos aquí no necesitan tener una secuencia nucleotídica de tipo salvaje (por ejemplo, como se describe en Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801), y pueden alterarse mediante la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos, o las ITR de AAV pueden derivar de cualquiera de varios serotipos de AAV. Actualmente se conocen más de 40 serotipos de AAV y se siguen identificando nuevos serotipos y variantes de los serotipos existentes. Véase, Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854­ 6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081 -6; y Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810.
El uso de cualquier serotipo de AAV se considera dentro del alcance de la presente invención. En algunas realizaciones, un vector de rAAV es un vector derivado de un serotipo de AAV, que incluye, entre otros, las ITR de AAV son AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AA Vrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV Dj , las ITR de AAV de cabra, AAV de bovino o AAV de ratón, o similares. En algunas realizaciones, el ácido nucleico en el AAV comprende una ITR de AAV, las ITR son AAV1, a Av 2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AA Vrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, un AAV de cabra, AAV bovino o AAV de ratón, o similares. En ciertas realizaciones, las ITR de AAV son ITR de AAV2.
En algunas realizaciones, un vector puede incluir un ácido nucleico de relleno. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de relleno puede codificar una proteína verde fluorescente. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de relleno puede ubicarse entre el promotor y uno o más de uno o dos ARN guía de la presente descripción y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas de la presente descripción.
En la práctica, la invención puede emplear partículas virales que comprenden un genoma autocomplementario recombinante. En algunas realizaciones, el vector es un vector autocomplementario. Partículas virales de AAV con genomas y métodos de auto-complementación del uso de genomas de AAV auto-complementados se describen en las Patentes de EE.UU. N2s 6.596.535; 7.125.717; 7.765.583; 7.785.888; 7.790.154; 7.846.729; 8.093.054; y 8.361.457; y Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105- 2111. Un rAAV que comprende un genoma autocomplementario formará rápidamente una molécula de ADN bicatenario en virtud de sus secuencias parcialmente complementarias (por ejemplo, complementando cadenas codificantes y no codificantes de un transgén). En algunas realizaciones, la partícula viral de AAV comprende un genoma de AAV, en el que el genoma de rAAV comprende una primera secuencia polinucleotídica heteróloga (por ejemplo, uno o dos ARN guía de la presente descripción y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas de la presente descripción) y una segunda secuencia polinucleotídica heteróloga (por ejemplo, la cadena no codificante o antisentido de uno o dos ARN guía de la presente descripción y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas de la presente descripción), en el que la primera secuencia polinucleotídica heteróloga puede formar pares de bases dentro de la cadena con la segunda secuencia polinucleotídica a lo largo de la mayor parte o la totalidad de su longitud.
En algunas realizaciones, la primera secuencia polinucleotídica heteróloga y una segunda secuencia polinucleotídica heteróloga están unidas por una secuencia que facilita el apareamiento de bases intracatenario; por ejemplo, una estructura de ADN en horquilla. Las estructuras de horquilla son conocidas en la técnica, por ejemplo en moléculas de siRNA. En algunas realizaciones, la primera secuencia polinucleotídica heteróloga y una segunda secuencia polinucleotídica heteróloga están unidas por una ITR mutada (por ejemplo, la ITR derecha). La ITR mutada comprende una deleción de la región D que comprende la secuencia de resolución terminal. Como resultado, al replicar un genoma viral de AAV, las proteínas rep no escindirán el genoma viral en la ITR mutada y, como tal, un genoma viral recombinante que comprende lo siguiente en orden 5’ a 3' se empaquetará en una cápside viral: una ITR de AAV, la primera secuencia polinucleotídica heteróloga que incluye secuencias reguladoras, la ITR de AAV mutada, el segundo polinucleótido heterólogo en orientación inversa al primer polinucleótido heterólogo y una tercera ITR de AAV.
En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico heteróloga y una segunda secuencia de ácido nucleico heteróloga están unidas por una ITR mutada (por ejemplo, la ITR derecha). En algunas realizaciones, la ITR comprende la secuencia polinucleotídica 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCC CACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG - 3' (SEQ ID NO:24). La ITR mutada comprende una deleción de la región D que comprende la secuencia de resolución terminal. Como resultado, al replicar un genoma viral de AAV, las proteínas rep no escindirán el genoma viral en la ITR mutada y, como tal, un genoma viral recombinante que comprende lo siguiente en orden 5’ a 3' se empaquetará en una cápside viral: una ITR de AAV, la primera secuencia polinucleotídica heteróloga que incluye secuencias reguladoras, la ITR de AAV mutada, el segundo polinucleótido heterólogo en orientación inversa al primer polinucleótido heterólogo y una tercera ITR de AAV.
En algunas realizaciones, el vector está encapsulado en una partícula viral. En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula viral de AAV recombinante que comprende un vector de AAV recombinante. Se utilizan diferentes serotipos de AAV para optimizar la transducción de células diana concretas o para dirigirse contra tipos de células específicos dentro de un tejido diana particular (por ejemplo, un tejido ocular). Una partícula de rAAV puede comprender proteínas virales y ácidos nucleicos virales del mismo serotipo o un serotipo mixto. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una partícula de rAAV puede comprender proteínas de la cápside de AAV2 como se define aquí y al menos una ITR de AAV2, o puede comprender proteínas de la cápside de AAV2 y al menos una ITR de AAV1. Cualquier combinación de serotipos de AAV para la producción de una partícula de rAAV se proporciona en esta memoria como si cada combinación se hubiera establecido expresamente en esta memoria. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV pueden comprender una cápside de AAV2 como se define aquí. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV pueden comprender una cápside de AAVrh8R como se define aquí.
En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una cápside de AAV1, una cápside de AAV2, una cápside de AAV3, una cápside de AAV4, una cápside de AAV5, una cápside de AAV6 (por ejemplo, una cápside de AAV6 de tipo salvaje o una variante de la cápside de AAV6 al como ShH10, como se describe en U.S. PG Pub.
2012/0164106), una cápside de AAV7, una cápside de AAV8, una cápside de AAVrh8, una cápside de AAVrh8R, una cápside de AAV9 (por ejemplo, una cápside de AAV9 de tipo salvaje o una cápside de AAV9 modificada como se describe en U.S. pG Pub. 2013/0323226), una cápside de AAV10, una cápside de AA Vrh10, una cápside de AAV11, una cápside de AAV12, una cápside de tirosina mutante, una cápside de unión a heparina mutante, una cápside de AAV2R471A, una cápside de AAVAAV2/2-7m8, una cápside de AAV DJ (por ejemplo, una cápside de AAV-DJ/8, una cápside de AAV-DJ/9, o cualquier otra de las cápsides descritas en U.S. PG Pub. 2012/0066783), una cápside de AAV2 N587A, una cápside de AAV2 E548A, una cápside de AAV2 N708A, una cápside de AAV V708K, una cápside de AAV de cabra, una cápside quimérica de AAV1/AAV2, una cápside de AAV bovino, una cápside de AAV de ratón, una cápside de rAAV2/HBoV1, o una cápside de AAV descrita en la patente U.S. No. 8.283.151 o Publicación Internacional No. WO/2003/042397. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside mutante mantiene la capacidad de formar una cápside de AAV. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende la cápside mutante de tirosina de AAV5 (Zhong L. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(22):7827-7832. En realizaciones adicionales, la partícula de rAAV comprende proteínas de la cápside de un serotipo de AAV de Clados A-F (Gao y col., J. Virol. 2004, 78(12):6381). En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende una proteína de la cápside de AAV1 o un mutante de la misma. En otras realizaciones, la partícula de rAAV comprende una proteína de la cápside de AAV2 o un mutante de la misma. En algunas realizaciones, el serotipo de AAV es AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, o AAVrh10. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende una cápside de serotipo 1 de AAV (AAV1). En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende una cápside de serotipo 2 de AAV (AAV2). En algunas realizaciones, la partícula viral de AAV recombinante comprende una cápside de AAV1, AAV2, a Av 8, AAVrh8R, AAV9, y/o AA Vrh10. En algunas realizaciones, la cápside de Aa V1, AAV2, AAV8, AAVrh8R, AAV9 y/o AA Vrh10 comprende una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparano, por ejemplo como se describe más abajo.
Se sabe que la cápside de AAV (por ejemplo, AAV2, AAVrh8R, etc.) incluye tres proteínas de la cápside: VP1, VP2 y VP3. Estas proteínas contienen cantidades significativas de secuencias de aminoácidos solapantes y secuencias N-terminales únicas. Una cápside de AAV2 incluye 60 subunidades dispuestas por simetría icosaédrica (Xie, Q., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci.99(16):10405-10). Se ha encontrado que VP1, VP2 y VP3 están presentes en una relación de 1:1:10.
Se sabe que la unión entre las proteínas de la cápside de AAV2 y HSPG se produce a través de interacciones electrostáticas entre los residuos básicos de la proteína de la cápside de AAV2 y los residuos de glucosaminoglicanos cargados negativamente (Opie, SR et al., (2003) J. Virol. 77:6995-7006; Kern, A et al., (2003) J. Virol. 77:11072-11081). Residuos de la cápside específicos implicados en estas interacciones incluyen R484, R487, K532, R585 y R588. Se ha demostrado que mutaciones en estos residuos reducen la unión de AAV2 a las células Hela y al propio heparán (Opie, SR et al., (2003) J. Virol. 77:6995-7006; Kern, A et al., (2003) J. Virol. 77:11072-11081; documento w O 2004/027019 A2, Patente de EE.UU. N° 7.629.322). Además, sin desear estar ligado a la teoría, se cree que la o las sustituciones de aminoácidos en uno o más de los residuos correspondientes a los aminoácidos 484, 487, 532, 585 o 588, la numeración basada en la numeración VP1 de AAV2 puede modular las propiedades de transducción de los tipos de cápside de AAV que no se unen a HSPG, o pueden modular las propiedades de transducción de los tipos de cápside de AAV independientemente de su capacidad para unirse a HSPG.
En algunas realizaciones, una partícula de rAAV porta una mutación en una proteína de la cápside en un resto que interactúa con HSPG o en uno o más de los restos correspondientes a los aminoácidos 484, 487, 532, 585 o 588, numeración basada en la numeración VP1 de AAV2. En consecuencia, en algunas realizaciones, tras la administración, el ácido nucleico heterólogo codificado por el vector de rAAV se expresa a un nivel de expresión aumentado, en comparación con el nivel de expresión de un ácido nucleico heterólogo de una partícula de rAAV que comprende una cápside de rAAV que comprende una proteína de la cápside de rAAV de referencia (por ejemplo, una proteína de la cápside de rAAV de tipo salvaje). En algunas realizaciones, la expresión del ácido nucleico se incrementa en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 75% o al menos aproximadamente un 100%. En algunas realizaciones, tras la administración, la partícula de rAAV provoca una neuroinflamación reducida, en comparación con una partícula de rAAV que comprende una proteína de la cápside de rAAV de referencia (por ejemplo, una proteína de la cápside de rAAV de tipo salvaje). En algunas realizaciones, la neuroinflamación se reduce en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 75% o al menos aproximadamente un 100%. Una proteína de la cápside de rAAV de referencia adecuada puede incluir cualquier proteína de la cápside que carece de una o más sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones que interactúan con un proteoglicano de heparán sulfato (la cápside de referencia puede contener una o más sustituciones de "fondo" que no alteran la unión a HSPG).
En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende a) una cápside de rAAV que comprende proteínas de la cápside de rAAV que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones que interactúan con un proteoglicano de sulfato de heparano, y b) un vector de rAAV que comprende el ácido nucleico heterólogo y al menos una repetición terminal invertida AAV.
En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos reducen la unión de la partícula de rAAV al proteoglicano de heparán sulfato en aproximadamente al menos un 10%, aproximadamente al menos un 25%, aproximadamente al menos un 50%, aproximadamente al menos un 75% o aproximadamente al menos un 100%. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos reducen la unión de la partícula de rAAV al proteoglicano de heparán sulfato en aproximadamente al menos un 10%, aproximadamente al menos un 15%, aproximadamente al menos un 20%, aproximadamente al menos un 25%, aproximadamente al menos un 30%, aproximadamente al menos un 35%, aproximadamente al menos un 40%, aproximadamente al menos un 45%, aproximadamente al menos un 50%, aproximadamente al menos un 55%, aproximadamente al menos un 60%, aproximadamente al menos un 65%, aproximadamente al menos un 70%, aproximadamente al menos un 75%, aproximadamente al menos un 80%, aproximadamente al menos un 85%, aproximadamente al menos un 90%, aproximadamente al menos un 95% o aproximadamente al menos el 100% (en comparación con la unión de una partícula de rAAV que comprende una cápside de tipo salvaje). En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos reducen la unión de la partícula de rAAV al proteoglicano de heparán sulfato en uno cualquiera de aproximadamente 10% a aproximadamente 100%, aproximadamente 20% a aproximadamente 100%, aproximadamente 30% a aproximadamente 100%, aproximadamente 40% a aproximadamente 100%, aproximadamente 50% a aproximadamente 100%, aproximadamente 60% a aproximadamente 100%, aproximadamente 70% a aproximadamente 100%, aproximadamente 80% a aproximadamente 100%, aproximadamente 90% a aproximadamente 100%, aproximadamente 10 % a aproximadamente 90%, aproximadamente 20% a aproximadamente 90%, aproximadamente 30% a aproximadamente 90%, aproximadamente 40% a aproximadamente 90%, aproximadamente 50% a aproximadamente 90%, aproximadamente 60% a aproximadamente 90%, aproximadamente 70% a aproximadamente 90%, aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, aproximadamente 10% a aproximadamente 80%, aproximadamente 20% a aproximadamente 80%, aproximadamente 30% a aproximadamente 80%, aproximadamente 40% a aproximadamente 80%, aproximadamente 50% a aproximadamente 80%, aproximadamente 60% a aproximadamente 80%, aproximadamente 70% a aproximadamente 80%, aproximadamente 10% a aproximadamente 70%, aproximadamente 20% a aproximadamente 70%, aproximadamente 30% a aproximadamente 70%, aproximadamente 40% a aproximadamente 70%, aproximadamente 50% a aproximadamente 70%, aproximadamente 60% a aproximadamente 70%, aproximadamente 10% a aproximadamente 60%, aproximadamente 20% a aproximadamente 60%, aproximadamente 30% a aproximadamente 60%, aproximadamente 40% a aproximadamente 60%, aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, aproximadamente 30% a aproximadamente 50%, aproximadamente 40% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 40%, aproximadamente 20% a aproximadamente 40%, aproximadamente 30% a aproximadamente 40%, aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, aproximadamente 20% a aproximadamente 30% o aproximadamente 10% a aproximadamente 20% (en comparación con la unión de una partícula de rAAV que comprende una cápside de tipo salvaje). En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos resulta en una unión no detectable de la partícula de rAAV al proteoglicano de heparán sulfato en comparación con la unión de una partícula de rAAV de tipo salvaje. Se conocen en la técnica medios para medir la unión de partículas de AAV a HSPG; p. e j, la unión a un medio de cromatografía de heparán sulfato o la unión a una célula que se sabe que expresa HSPG en su superficie. Por ejemplo, véase Opie, SR et al., (2003) J. Virol. 77:6995-7006 y Kern, A et al., (2003) J. Virol. 77:11072-11081.
En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una o más sustituciones de aminoácidos de proteínas de la cápside que reducen o anulan la unión de la partícula de rAAV al proteoglicano de sulfato de heparano, y/o en las que una o más sustituciones de aminoácidos están en la posición 484, 487, 532, 585 o 588, numeración basada en la numeración VP1 de AAV2. Tal como se utiliza en esta memoria, "numeración basada en VP1 de AAV2" se refiere al aminoácido de la proteína de la cápside mencionada correspondiente al aminoácido mencionado de VP1 de AAV2. Por ejemplo, si una o más sustituciones de aminoácidos están en la posición 347, 350, 390, 395, 448, 451,484, 487, 527, 532, 585 y / o 588, numeración basada en VP1 de AAV2, entonces la una o más sustituciones de aminoácidos están en el o los aminoácidos de la proteína de la cápside mencionada correspondiente a los aminoácidos 347, 350, 390, 395, 448, 451, 484, 487, 527, 532, 585 y/o 588 de VP1 de AAV2. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos están en la posición 484, 487, 532, 585 o 588 de VP1 de AAV2. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos están en la posición 484, 487, 532, 585 o 588 de VP1 de AAV3, numeración basada en VP1 de AAV2. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos están en la posición 485, 488, 528, 533, 586 o 589, numeración basada en la numeración VP1 de AAVrh8R. En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 585 y/o 588 (numeración basada en VP1 de AAV2) se reemplazan por restos de arginina (por ejemplo, S586 y/o T589 para AAV1 o AAV6; S586 y/o A589 para AAV9; A586 y/o T589 para AAVrh8R; Q588 y/o T591 para AAV8; y Q588 y/o A591 para AAVrh10). En otras realizaciones, uno o más aminoácidos (por ejemplo, arginina o lisina) en la o las posiciones correspondientes a los aminoácidos 484, 487, 527 y/o 532 (numeración basada en VP1 de AAV2) son reemplazadas por aminoácidos no cargados positivamente tal como alanina (por ejemplo, R485, R488, K528 y/o K533 para AAV1 o AAV6; R485, R488, K528 y/o R533 para AAV9 o AAVrh8R; y R487, R490, K530 y/o R535 para AAV8 o AAVrh10).
Otras partículas virales
En algunas realizaciones, el vector es un vector adenoviral recombinante. En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula adenoviral. En algunas realizaciones, la partícula adenoviral es una partícula adenoviral recombinante, por ejemplo un vector polinucleotídico que comprende uno o dos ARN guía de la presente descripción y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas de la presente descripción entre dos ITR. En algunas realizaciones, la partícula adenoviral carece o contiene una copia defectuosa de uno o más genes E1, lo que hace que la replicación del adenovirus sea defectuosa. Los adenovirus incluyen un genoma de ADN lineal bicatenario dentro de una cápside icosaédrica grande (~950 Á) sin envoltura. Los adenovirus tienen un genoma grande que puede incorporar más de 30 kb de secuencia heteróloga (por ejemplo, en lugar de la región E1 y/o E3), haciéndolos especialmente adecuados para su uso con genes heterólogos más grandes. También se sabe que infectan células en división y que no se dividen y no se integran naturalmente en el genoma hospedante (aunque las variantes híbridas pueden poseer esta capacidad). En algunas realizaciones, el vector adenoviral puede ser un vector adenoviral de primera generación con una secuencia heteróloga en lugar de E1. En algunas realizaciones, el vector adenoviral puede ser un vector adenoviral de segunda generación con mutaciones o deleciones adicionales en E2A, E2B y/o E4. En algunas realizaciones, el vector adenoviral puede ser un vector adenoviral de tercera generación o eviscerado que carece de todos los genes de codificación viral, conservando sólo las ITR y la señal de empaquetamiento, y que requiere un adenovirus auxiliar para la replicación in trans, y empaquetamiento. Se ha investigado el uso de partículas adenovirales como vectores para la transfección transitoria de células de mamíferos, así como vectores de terapia génica. Para una descripción más detallada, véase, por ejemplo, Danthinne, X. e Imperiale, M.J. (2000) Gene Ther.
7:1707-14 y Tatsis, N. y Ertl, H.C. (2004) Mol. Ther. 10:616-29.
En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula adenoviral recombinante que comprende un ácido nucleico que comprende uno o dos ARN guía de la presente descripción y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas de la presente descripción. El uso de cualquier serotipo de adenovirus se considera dentro del alcance de la presente invención. En algunas realizaciones, el vector adenoviral recombinante es un vector derivado de un serotipo de adenovirus, incluidos, entre otros, los serotipos de adenovirus 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31,8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino o Ad porcino tipo 3. En algunas realizaciones, el vector adenoviral recombinante deriva del adenovirus serotipo 2 o una variante del adenovirus serotipo 5.
En algunas realizaciones, el vector está encapsulado en una partícula viral. En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula de adenovirus recombinante que encapsula un vector adenoviral recombinante. En algunas realizaciones, las partículas virales recombinantes comprenden una partícula adenoviral en combinación con una o más proteínas de la cápside viral extrañas. Tales combinaciones pueden denominarse partículas adenovirales recombinantes pseudotipadas. En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside viral extrañas usadas en partículas adenovirales recombinantes pseudotipadas derivan de un virus extraño o de otro serotipo de adenovirus. En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside viral extrañas derivan de, entre otros, reovirus tipo 3. En las siguientes referencias se pueden encontrar ejemplos de combinaciones de vector y proteínas de la cápside utilizadas en partículas de adenovirus pseudotipadas (Tatsis, N. et al. (2004) Mol. Ther. 10(4):616-629 and Ahi, Y. et al. (2011) Curr. Gene Ther. 11 (4):307-320). Se pueden utilizar diferentes serotipos de adenovirus para optimizar la transducción de células diana concretas o para dirigirse a tipos de células específicos dentro de un tejido diana particular (por ejemplo, un tejido enfermo). Los tejidos o células diana de serotipos de adenovirus específicos incluyen, entre otros, pulmón (por ejemplo HuAd3), bazo e hígado (por ejemplo HuAd37), músculo liso, sinoviocitos, células dendríticas, células cardiovasculares, líneas de células tumorales (por ejemplo HuAd11) y células dendríticas (por ejemplo HuAd5 pseudotipado con reovirus tipo 3, HuAd30 o HuAd35). Para una descripción posterior, véanse Ahi, Y. et al. (2011) Curr. Gene Ther. 11(4):307-320, Kay, M. et al. (2001) Nat. Med. 7(1):33-40, y Tatsis, N. et al. (2004) Mol. Ther.
10(4):616-629. En algunas realizaciones, la partícula de adenovirus recombinante puede contener una cápside de un serotipo de adenovirus que incluye, sin limitación, 2, 1, 5, 6, 19, 3, 11, 7, 14, 16, 21, 12, 18, 31, 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24-30, 37, 40, 41, AdHu2, AdHu 3, AdHu4, AdHu24, AdHu26, AdHu34, AdHu35, AdHu36, AdHu37, AdHu41, AdHu48, AdHu49, AdHu50, AdC6, AdC7, AdC69, Ad bovino tipo 3, Ad canino tipo 2, Ad ovino, o Ad porcino tipo 3. En algunas realizaciones, la partícula de adenovirus recombinante comprende una cápside de adenovirus de serotipo 2 o una variante de una cápside de adenovirus de serotipo 5.
En algunas realizaciones, el vector es un vector lentiviral recombinante. En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula lentiviral. En algunas realizaciones, la partícula lentiviral es una partícula lentiviral recombinante, por ejemplo un vector polinucleotídico que comprende uno o dos ARN guía de la presente descripción y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas de la presente descripción entre dos LTR. Los lentivirus son retrovirus de ssRNA de sentido positivo con un genoma de aproximadamente 10 kb. Se sabe que los lentivirus se integran en el genoma de células en división y que no se dividen. Las partículas lentivirales se pueden producir, por ejemplo, mediante la transfección de múltiples plásmidos (normalmente, el genoma lentiviral y los genes necesarios para la replicación y/o el empaquetamiento se separan para evitar la replicación viral) en una línea celular de empaquetamiento, que empaqueta el genoma lentiviral modificado en partículas lentivirales. En algunas realizaciones, una partícula lentiviral puede referirse a un vector de primera generación que carece de la proteína de la envoltura. En algunas realizaciones, una partícula lentiviral puede referirse a un vector de segunda generación que carece de todos los genes excepto las regiones gag/pol y tat/rev. En algunas realizaciones, una partícula lentiviral puede referirse a un vector de tercera generación que sólo contiene los genes rev, gag y pol endógenos y tiene una LTR quimérica para la transducción sin el gen tat (véase Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72:8463-71). Para una descripción adicional, véase Durand, S. y Cimarelli, A. (2011) Viruses 3:132-59.
En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula lentiviral recombinante que comprende un ácido nucleico que comprende uno o dos ARN guía de la presente descripción y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas de la presente descripción. El uso de cualquier vector lentiviral se considera dentro del alcance de la presente invención. En algunas realizaciones, el vector lentiviral deriva de un lentivirus que incluye, sin limitación, virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), virus de la inmunodeficiencia humana-2 (VIH-2), virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV), virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV), virus de la enfermedad de Jembrana (JDV), virus Visna (VV), y virus de la artritis encefalitis caprina (CAEV).
En algunas realizaciones, el vector está encapsulado en una partícula viral. En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula lentiviral recombinante que encapsula un vector lentiviral recombinante. En algunas realizaciones, las partículas virales recombinantes comprenden un vector de lentivirus en combinación con una o más proteínas de la cápside viral extrañas. Tales combinaciones pueden denominarse partículas lentivirales recombinantes pseudotipadas. En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside viral extrañas usadas en partículas lentivirales recombinantes pseudotipadas derivan de un virus extraño. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral extraña utilizada en partículas lentivirales recombinantes pseudotipadas es la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-GP). VSV-GP interactúa con un receptor celular ubicuo, proporcionando un amplio tropismo tisular a las partículas lentivirales recombinantes pseudotipadas. Además, se cree que VSV-GP proporciona una mayor estabilidad a las partículas lentivirales recombinantes pseudotipadas. En otras realizaciones, las proteínas de la cápside viral extrañas derivan de, entre otros, el virus de Chandipura, el virus de la rabia, el virus de Mokola, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus del río Ross (RRV), el virus de Sindbis, el virus del bosque de Semliki (SFV), el virus de la encefalitis equina venezolana, virus del ébola Reston, virus del ébola Zaire, virus de Marburgo, virus de Lassa, virus de la leucosis aviar (ALV), retrovirus de la oveja Jaagsiekte (JSRV), virus de la leucemia murina de Moloney (MLV), virus de la leucemia del simio Gibbon (GALV), retrovirus endógeno felino (RD114), virus linfotrópico T humano 1 (HTLV-1), virus espumoso humano, virus de Maedi-visna (MVV), SARS-CoV, virus de Sendai, virus sincitial respiratorio (RSV), virus de la parainfluenza humana tipo 3, virus de la hepatitis C (HCV), virus de la gripe, virus de la peste aviar (FPV), o nucleopoliedro virus múltiple de Autographa californica (AcMNPV).
En algunas realizaciones, el vector lentiviral recombinante deriva de un lentivirus pseudotipado con el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus del río Ross (RRV), el virus del ébola, el virus de Marburgo, el virus de Mokala, el virus de la rabia, RD114, o variantes del mismo. Se pueden encontrar ejemplos de combinaciones de vector y de proteínas de la cápside utilizadas en partículas de Lentivirus pseudotipadas, por ejemplo en Cronin, J. et al. (2005). Curr. Gene Ther. 5(4):387-398. Se pueden usar diferentes partículas lentivirales recombinantes pseudotipadas para optimizar la transducción de células diana particulares o para dirigirse contra tipos de células específicos dentro de un tejido diana particular (por ejemplo, un tejido enfermo). Por ejemplo, los tejidos a los que se dirigen partículas lentivirales recombinantes pseudotipadas específicas incluyen, entre otros, hígado (por ejemplo, pseudotipada con una proteína de VSV-G, LCMV, RRV o SeV F), pulmón (por ejemplo, pseudotipada con una proteína de Ébola, Marburgo, SeV F y HN, o JSRV), células de los islotes pancreáticos (por ejemplo pseudotipada con una proteína de LCMV), sistema nervioso central (por ejemplo, pseudotipada con una proteína de VSV-G, LCMV, Rabia o Mokola), retina (por ejemplo, pseudotipada con una proteína de VSV-G o Mokola), monocitos o músculo (por ejemplo, pseudotipada con una proteína de Mokola o Ébola), sistema hematopoyético (por ejemplo, pseudotipada con una proteína de RD114 o GALV), o células cancerosas (por ejemplo, pseudotipada con una proteína de GALV o LCMV). Para una descripción adicional, véanse Cronin, J. et al. (2005). Curr. Gene Ther. 5(4):387-398 y Kay, M. et al. (2001) Nat. Med. 7(1):33-40. En algunas realizaciones, la partícula lentiviral recombinante comprende una cápside pseudotipada con el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus del río Ross (RRV), el virus del ébola, el virus de Marburgo, el virus de Mokala, el virus de la rabia, RD114, o variantes de los mismos.
En algunas realizaciones, el vector es un vector del rHSV. En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula del virus del herpes simple (HSV). En algunas realizaciones, la partícula de HSV es una partícula de rHSV, por ejemplo un vector polinucleotídico que comprende uno o dos ARN guía de la presente descripción y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas de la presente descripción entre dos TR. El HSV es un virus de ADN bicatenario envuelto con un genoma de aproximadamente 152 kb. De forma ventajosa, aproximadamente la mitad de sus genes no son esenciales, y pueden eliminarse para adaptarse a la secuencia heteróloga. Las partículas de HSV infectan las células que no se dividen. Además, establecen de forma natural la latencia en las neuronas, viajan por transporte retrógrado, y pueden transferirse a través de las sinapsis, lo que las hace ventajosas para la transfección de neuronas y/o enfoques de terapia génica que involucran el sistema nervioso. En algunas realizaciones, la partícula de HSV puede tener replicación defectuosa o replicación competente (por ejemplo, competente para un solo ciclo de replicación a través de la inactivación de uno o más genes tardíos). Para una descripción más detallada, véase Manservigi, R. et al. (2010) Open Virol. J. 4: 123-56.
En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula de rHSV que comprende un ácido nucleico que comprende uno o dos ARN guía de la presente descripción y/o una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas de la presente descripción. El uso de cualquier vector HSV se considera dentro del alcance de la presente invención. En algunas realizaciones, el vector HSV deriva de un serotipo de HSV, incluidos, entre otros, HSV-1 y HSV-2.
En algunas realizaciones, el vector está encapsulado en una partícula viral. En algunas realizaciones, la partícula viral es una partícula de HSV recombinante que encapsula un vector de HSV recombinante. En algunas realizaciones, las partículas virales recombinantes comprenden un vector del HSV en combinación con una o más proteínas de la cápside viral extrañas. Tales combinaciones pueden denominarse partículas de rHSV seudotipadas. En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside viral extrañas usadas en partículas de rHSV seudotipadas derivan de un virus extraño o de otro serotipo de HSV. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside viral extraña utilizada en una partícula de rHSV seudotipada es una glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-GP). VSV-GP interactúa con un receptor celular ubicuo, proporcionando un amplio tropismo tisular a partículas de rHSV seudotipadas. Además, se cree que VSV-GP proporciona una mayor estabilidad a las partículas de rHSV seudotipadas. En otras realizaciones, la proteína de la cápside viral extraña puede ser de un serotipo de HSV diferente. Por ejemplo, un vector HSV-1 puede contener una o más proteínas de la cápside de HSV-2. Se pueden usar diferentes serotipos de HSV para optimizar la transducción de células diana particulares o para dirigirse contra tipos de células específicos dentro de un tejido diana particular (por ejemplo, un tejido enfermo). Los tejidos o células diana de serotipos de adenovirus específicos incluyen, entre otros, el sistema nervioso central y las neuronas (por ejemplo, VHS-1). Para una descripción más detallada, véanse Manservigi, R. et al. (2010) Open Virol J 4: 123-156, Kay, M. et al. (2001) Nat. Med. 7(1):33-40, y Meignier, B. et al. (1987) J. Infect. Dis. 155(5):921-930. En algunas realizaciones, la partícula de HSV recombinante es una partícula de rHSV-1 o una partícula viral de rHSV-2.
Producción de partículas virales
Se conocen numerosos métodos en la técnica para la producción de partículas de vectores adenovirales. Por ejemplo, para un vector adenoviral eviscerado, el genoma del vector adenoviral y el genoma del adenovirus auxiliar pueden transfectarse en una línea celular de empaquetamiento (por ejemplo, una línea celular 293). El genoma del adenovirus auxiliar puede contener sitios de recombinación que flanquean su señal de empaquetamiento, y ambos genomas pueden transfectarse en una línea celular de empaquetamiento que expresa una recombinasa (por ejemplo se puede usar el sistema Cre/loxP), de manera que el vector adenoviral de interés se empaqueta de manera más eficiente que el adenovirus auxiliar (véase, por ejemplo, Alba, R. et al. (2005) Gene Ther. 12 Suppl 1: S18-27). Los vectores adenovirales se pueden recolectar y purificar usando métodos estándar, tales como los descritos aquí.
Se conocen numerosos métodos en la técnica para la producción de partículas de vectores lentivirales. Por ejemplo, para un vector lentiviral de tercera generación, un vector que contiene el genoma lentiviral de interés con los genes gag y pol se puede cotransfectar en una línea celular de empaquetamiento (por ejemplo, una línea celular 293) junto con un vector que contiene un gen rev. El genoma lentiviral de interés también contiene una LTR quimérica que promueve la transcripción en ausencia de Tat (véase Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72:8463-71). Los vectores lentivirales se pueden recolectar y purificar usando métodos (por ejemplo, Segura MM, et al., (2013) Expert Opin Biol Ther.
13(7):987-1011) descritos aquí.
En la técnica se conocen numerosos métodos para la producción de partículas de HSV. Los vectores de HSV se pueden recolectar y purificar usando métodos estándar, tales como los descritos aquí. Por ejemplo, para un vector de HSV defectuoso en la replicación, un genoma de HSV de interés que carece de todos los genes tempranos inmediatos (IE) puede transfectarse en una línea celular complementaria que proporciona los genes necesarios para la producción de virus, tales como ICP4, ICP27 y ICP0 (véase, por ejemplo, Samaniego, L.A. et al. (1998) J. Virol. 72:3307-20). Los vectores de HSV se pueden recolectar y purificar utilizando los métodos descritos (por ejemplo, Goins, WF et al., (2014) Herpes Simplex Virus Methods in Molecular Biology 1144:63-79).
Se conocen numerosos métodos en la técnica para la producción de vectores de rAAV, que incluyen transfección, producción de líneas celulares estables y sistemas de producción de virus híbridos infecciosos que incluyen híbridos de adenovirus-AAV, híbridos de herpesvirus-AAV (Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71 (11 ):8780-8789), e híbridos de baculovirus-AAV. Todos los cultivos de producción de rAAV para la producción de partículas de virus rAAV requieren; 1) células hospedantes adecuadas, 2) función de virus auxiliar adecuada, 3) genes y productos génicos rep y cap de AAV; 4) un ácido nucleico (tal como un ácido nucleico terapéutico) flanqueado por al menos una secuencia de ITR de AAV (por ejemplo, un genoma de vector de rAAV sobredimensionado); y 5) medios y componentes de medios adecuados para apoyar la producción de rAAV. En algunos casos, la célula hospedante adecuada es una célula hospedante de primate. En algunos casos, la célula hospedante adecuada es una línea celular derivada de ser humano, tales como células HeLa, A549, 293 o Perc.6. En algunos casos, la función de virus auxiliar adecuada la proporcionan adenovirus mutantes o de tipo salvaje (tales como adenovirus sensibles a la temperatura), virus del herpes (HSV), baculovirus, o una construcción de plásmido que proporciona funciones auxiliares. En algunos casos, los productos de los genes rep y cap de AAV pueden ser de cualquier serotipo de AAV. En general, pero no es obligatorio, el producto del gen rep del AAV es del mismo serotipo que las ITR del genoma del vector del rAAV, siempre que los productos del gen rep puedan funcionar para replicar y empaquetar el genoma del rAAV. Se pueden utilizar medios adecuados conocidos en la técnica para la producción de vectores rAAV. Estos medios incluyen, sin limitación, medios producidos por Hyclone Laboratories y JRH, incluyendo el medio de Eagle modificado (MEM), el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), formulaciones personalizadas, tales como las descritas en la Patente de EE.UU. N° 6.566.118 y medios SFM Sf-900 II, tal como se describe en la Patente de EE.UU. N° 6.723.551, particularmente con respecto a formulaciones de medios personalizados para uso en la producción de vectores AAV recombinantes. En algunos casos, las funciones auxiliares de AAV son proporcionadas por adenovirus o HSV. En algunos casos, las funciones auxiliares de AAV son proporcionadas por baculovirus, y la célula hospedante es una célula de insecto (por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda (Sf9)). Ejemplos de funciones auxiliares de adenovirus para la replicación de AAV incluyen funciones E1A, funciones E1B, funciones E2A, funciones VA, y funciones E4orf6. Los baculovirus disponibles en depósitos incluyen virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica.
Las partículas de rAAV se pueden producir utilizando métodos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 6.566.118; 6.989.264; y 6.995.006. En la práctica, las células hospedantes para producir partículas de rAAV incluyen células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, microorganismos, y levaduras. Células huésped también pueden ser células de empaquetamiento en las que los genes rep y cap de a Av se mantienen de forma estable en la célula huésped o células productoras en las que el genoma del vector AAV se mantiene de forma estable. Células de empaquetamiento y productoras ejemplares se derivan de células 293, A549 o HeLa. Vectores AAV se purifican y formulan utilizando técnicas estándares conocidas en la técnica.
Las partículas de rAAV se pueden producir mediante un método de transfección triple, tal como el método de transfección triple ejemplar proporcionado más abajo. Brevemente, se puede transfectar un plásmido que contiene un gen rep y un gen de la cápside, junto con un plásmido adenoviral auxiliar (por ejemplo, utilizando el método del fosfato de calcio) en una línea celular (por ejemplo, células HEK-293), y el virus puede recogerse y opcionalmente purificarse.
Las partículas de rAAV se pueden producir mediante un método de línea de células productoras (véase, por ejemplo, Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269). Brevemente, una línea celular (por ejemplo, una línea celular HeLa) puede transfectarse de forma estable con un plásmido que contiene un gen rep, un gen de la cápside, y una secuencia transgénica promotora. Las líneas celulares pueden cribarse para seleccionar un clon líder para la producción de rAAV, que luego puede expandirse a un biorreactor de producción e infectarse con un adenovirus (por ejemplo, un adenovirus de tipo salvaje) como auxiliar para iniciar la producción de rAAV. El virus se puede recolectar posteriormente, el adenovirus se puede inactivar (por ejemplo, por calor) y/o eliminar, y las partículas de rAAV pueden purificarse. En algunos casos, la línea celular productora deriva de células HeLa, 293, A549 o Perc.6. En algunos casos, la línea celular productora se adapta para crecer en suspensión. En algunos casos, las funciones auxiliares de AAV son proporcionadas por adenovirus, HSV o baculovirus.
En algunos casos, las partículas de rAAV se recogen entre alrededor de 48 horas y alrededor de 96 horas después de la provisión de funciones auxiliares. Por ejemplo, en algunos casos, las partículas de rAAV se recogen alrededor de 48 horas, alrededor de 60 horas, alrededor de 72 horas, alrededor de 84 horas o alrededor de 96 horas después de la provisión de funciones auxiliares. En algunos casos, las partículas de rAAV se recolectan alrededor de 48 horas y alrededor de 96 horas, alrededor de 48 horas y alrededor de 84 horas, alrededor de 48 horas y alrededor de 72 horas, alrededor de 48 horas y alrededor de 60 horas, alrededor de 60 horas y alrededor de 96 horas, alrededor de 60 horas y alrededor de 84 horas, alrededor de 60 horas y alrededor de 72 horas, alrededor de 72 horas y alrededor de 96 horas, alrededor de 72 horas y alrededor de 84 horas, o alrededor de 84 horas, y alrededor de 96 horas después de la provisión de funciones auxiliares.
Medios de cultivo de producción de rAAV adecuados de la presente divulgación pueden complementarse con suero o proteínas recombinantes derivadas de suero a un nivel de 0,5% -20% (v/v o p/v). Alternativamente, como se conoce en la técnica, los vectores rAAV pueden producirse en condiciones libres de suero, a los que también se alude como medios sin productos derivados de animales. Una persona con experiencia normal en la técnica puede apreciar que los medios comerciales o personalizados diseñados para apoyar la producción de vectores de rAAV también pueden complementarse con uno o más componentes de cultivo celular conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, glucosa, vitaminas, aminoácidos y/o factores de crecimiento, con el fin de aumentar el título de rAAV en cultivos de producción.
Los cultivos de producción de rAAV pueden cultivarse bajo una diversidad de condiciones (a lo largo de un amplio intervalo de temperaturas, durante períodos de tiempo variables y similares), adecuadas para la célula huésped particular que se esté utilizando. Como se conoce en la técnica, los cultivos de producción de rAAV incluyen cultivos dependientes de la unión que pueden cultivarse en recipientes dependientes de la fijación adecuados, tales como, por ejemplo, frascos roll on, filtros de fibra hueca, microsoiportes y biorreactores de lecho empaquetado o de lecho fluidizado. Los cultivos de producción del vector rAAV también pueden incluir células huésped adaptadas a la suspensión, tales como células HeLa, 293 y SF-9, que pueden cultivarse de diversas formas, incluyendo, por ejemplo, matraces giratorios, biorreactores de tanque agitado y sistemas desechables, tales como el sistema de bolsas Wave.
Las partículas del vector de rAAV se pueden recolectar de cultivos de producción de rAAV mediante la lisis de las células hospedantes del cultivo de producción, o mediante la recolección de los medios agotados del cultivo de producción, siempre que las células se cultiven en condiciones conocidas en la técnica para provocar la liberación de partículas de rAAV en los medios a partir de células intactas, tal como se describe con más detalle en la patente U.S. No. 6.566.118). También se conocen en la técnica métodos adecuados para lisar células e incluyen, por ejemplo, múltiples ciclos de congelación/descongelación, tratamiento con ultrasonidos, microfluidización y tratamiento con productos químicos, tales como detergentes y/o proteasas.
En otro caso, las partículas virales se purifican. El término "purificado", como se usa aquí, incluye una preparación de partículas víricas desprovistas de al menos algunos de los otros componentes que también pueden estar presentes, en la que las partículas víricas se producen naturalmente o a partir de las cuales se preparan inicialmente. Así, por ejemplo, las partículas víricas aisladas se pueden preparar utilizando una técnica de purificación para enriquecerlas a partir de una mezcla de origen, tal como un lisado de cultivo o un sobrenadante de cultivo de producción. El enriquecimiento se puede medir de diversas formas, tales como, por ejemplo, mediante la proporción de partículas resistentes a la DNasa (DRPs) o copias del genoma (gc) presentes en una solución, o mediante la infectividad, o se puede medir con relación a una segunda sustancia potencialmente interferente presente en la mezcla fuente, tal como contaminantes, incluyendo los contaminantes del cultivo de producción o los contaminantes en proceso, incluyendo el virus auxiliar, componentes de los medios y similares.
En algunos casos, la cosecha del cultivo de producción viral se aclara para eliminar los restos de células hospedantes. En algunos casos, la recolección del cultivo de producción se clarifica mediante filtración a través de una serie de filtros de profundidad que incluyen, por ejemplo, un filtro de cápsula de calidad DOHC Millipore Millistak HC, un filtro de cápsula de grado A1 HC Millipore Millistak HC y un filtro de 0,2 gm Opticap XL1O de membrana hidrofílica Millipore Express SHC. La clarificación también se puede lograr mediante una diversidad de otras técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como centrifugación o filtración a través de cualquier filtro de acetato de celulosa de 0,2 gm o mayor tamaño de poro conocido en la técnica.
En algunos casos, la cosecha del cultivo de producción viral se trata adicionalmente con Benzonase® para digerir cualquier ADN de alto peso molecular presente en el cultivo de producción. En algunos casos, la digestión con Benzonase® se realiza en condiciones estándar conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, una concentración final de 1 -2,5 unidades/ml de Benzonase® a una temperatura que oscila entre ambiente y 37°C durante un período de 30 minutos a varias horas.
Partículas de rAAV pueden aislarse o purificarse utilizando una o más de las siguientes etapas de purificación: centrifugación en equilibrio; filtración de intercambio aniónico de flujo continuo; filtración de flujo tangencial (TFF) para concentrar las partículas de rAAV; captura de rAAV por cromatografía de apatita; inactivación por calor del virus auxiliar; captura de rAAV por cromatografía de interacción hidrofóbica; intercambio de tampón mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC); nanofiltración; y captura de rAAV mediante cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico o cromatografía de afinidad. Estas etapas pueden utilizarse solas, en diversas combinaciones o en diferentes órdenes. Métodos para purificar partículas de rAAV se encuentran, por ejemplo, en Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232; Patentes de EE.UU. Números 6,989,264 y 8,137,948; y documento WO 2010/148143. Los métodos para purificar partículas de adenovirus se encuentran, por ejemplo, en Bo, H et al., (2014) Eur. J. Pharm. Sci. 67C:119-125. Los métodos para purificar partículas de lentivirus se encuentran, por ejemplo, en Segura MM, et al., (2013) Expert Opin Biol Ther. 13(7):987-1011. Los métodos para purificar partículas de HSV se encuentran, por ejemplo, en Goins, WF et al., (2014) Herpes Simplex Virus Methods in Molecular Biology 1144:63-79.
En algunas realizaciones, la partícula viral está en una formulación farmacéutica. En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a edición, pp. 1035-1038 y 1570-1580). En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden una partícula viral descrita aquí y un vehículo farmacéuticamente aceptable son adecuadas para inyección ocular. Soportes farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceite, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y similares. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa, polietilenglicol (PEG) y glicerol como soportes líquidos, particularmente para soluciones inyectables. La composición farmacéutica puede comprender, además, ingredientes adicionales, por ejemplo conservantes, tampones, agentes de tonicidad, antioxidantes y estabilizadores, agentes humectantes o clarificantes no iónicos, agentes que aumentan la viscosidad y similares. Las composiciones farmacéuticas descritas en esta memoria pueden envasarse en dosis unitarias únicas o en formas de múltiples dosis. Las composiciones se formulan generalmente como solución estéril y sustancialmente isotónica.
VI. Métodos de Tratamiento
Ciertos aspectos de la presente descripción implican la administración a un individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un ácido nucleico que codifica un sistema de CRISPR-Cas no natural modificado por ingeniería genética de la presente descripción, por ejemplo como se describió anteriormente. Se entenderá que, aunque la práctica de la presente invención puede implicar la administración de una composición tal como se define aquí con fines terapéuticos, los métodos de tratamiento como tales no forman parte de la invención reivindicada.
Los aspectos de la presente descripción implican administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una proteína Cas de la presente descripción y uno o más ácidos nucleicos que comprenden un primer ARN guía y un segundo ARN guía, en el que el primer a Rn guía y el segundo ARN guía se hibridan con las hebras opuestas de las secuencias de ADN diana que flanquean una mutación, incluida una mutación intrónica profunda, por ejemplo como se describió anteriormente. Es decir, para cualquiera de los métodos, composiciones y kits de la presente descripción, la proteína Cas puede suministrarse como una secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas, o como un polipéptido. Como ejemplo no limitativo, una proteína Cas puede administrarse con uno o más ARN guía (por ejemplo, un sgRNA) utilizando la administración mediada por lípidos catiónicos (véase, por ejemplo, Zuris, J.A. et al. Nat Biotechnol. 33:73-80). Una proteína Cas puede administrarse en un complejo con uno o más ARN guía, por ejemplo como en un complejo efector CRISPR-Cas. Se apreciará que cualquiera de los métodos de suministro y/o administración descritos a continuación puede usarse para el suministro de una proteína Cas administrada con uno o más ARN guía. En algunos casos, la proteína Cas se expresa a partir de un casete de expresión autolimitante como se describe anteriormente.
La composición que comprende un ácido nucleico que codifica un sistema de CRISPR-Cas no natural modificado por ingeniería genética de la presente descripción (o una composición que comprende una proteína Cas de la presente descripción y uno o más ARN guía de la presente descripción) puede administrarse por vía intravenosa, por vía intramuscular, subcutánea, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantación, por inhalación, por vía intratecal, intraventricular, o intranasal.
En algunos casos, la composición que comprende un ácido nucleico que codifica un sistema de CRISPR-Cas de origen no natural modificado por ingeniería genética de la presente descripción (o una composición que comprende una proteína Cas de la presente descripción y uno o más ARN guía de la presente descripción) se administra por vía subretiniana o intravítrea. Los protocolos de terapia génica para enfermedades de la retina, tales como las enfermedades oculares asociadas con una mutación intrónica profunda, requieren el suministro localizado del ácido nucleico a las células de la retina. Las células que serán el objetivo del tratamiento en estas enfermedades son las células fotorreceptoras en la retina o las células del RPE subyacentes a la retina neurosensorial. El suministro de ácidos nucleicos a estas células requiere una inyección en el espacio subretiniano entre la retina y el RPE.
La presente descripción proporciona composiciones que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos aquí, opcionalmente en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como es bien conocido en la técnica, los excipientes farmacéuticamente aceptables son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz y se pueden suministrar como soluciones o suspensiones líquidas, como emulsiones o como formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de su uso. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o puede actuar como un diluyente. Excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, sustancias tamponantes del pH y tampones. Excipientes de este tipo incluyen cualquier agente farmacéutico adecuado para administración directa al ojo que pueda administrarse sin una toxicidad excesiva. Excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a sorbitol, cualquiera de los diversos compuestos TWEEN y líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Pueden incluirse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una discusión detallada de excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
Generalmente, estas composiciones se formulan para su administración mediante inyección subretiniana. Por consiguiente, estas composiciones se pueden combinar con vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina, solución salina equilibrada de Ringer (pH 7,4) y similares. Aunque no es necesario, las composiciones se pueden suministrar opcionalmente en forma de dosificación unitaria adecuada para la administración de una cantidad precisa.
Métodos de administración subretiniana
Métodos de suministro subretiniano son conocidos en la técnica. Por ejemplo, véase el documento WO 2009/105690. Brevemente, el método general para suministrar una composición (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un sistema de CRISPR-Cas de origen no natural modificado mediante ingeniería genética de la presente descripción, que puede administrarse mediante administración viral o no viral como se describe anteriormente) a la subretina de la mácula y la fóvea puede ilustrarse mediante el siguiente breve esquema. Este ejemplo está destinado meramente a ilustrar determinadas características del método, y de ninguna manera pretende ser limitante.
Generalmente, el vector puede administrarse en forma de una composición inyectada intraocularmente (subretinalmente) bajo observación directa usando un microscopio operativo. Este procedimiento puede implicar una vitrectomía, seguida de la inyección de una suspensión de vector utilizando una cánula fina a través de una o más retinotomías pequeñas en el espacio subretiniano.
Brevemente, se puede suturar una cánula de infusión para mantener un volumen normal del globo por infusión (de, por ejemplo, disolución salina) durante toda la operación. Se realiza una vitrectomía utilizando una cánula de diámetro apropiado (por ejemplo, calibre 20 a 27), en donde el volumen de gel vítreo que se extrae se reemplaza por infusión de solución salina u otra solución isotónica de la cánula de infusión. La vitrectomía se realiza ventajosamente debido a que (1) la eliminación de su corteza (la membrana hialoidea posterior) facilita la penetración de la retina por la cánula; (2) su eliminación y reemplazo por líquido (por ejemplo, disolución salina) crea espacio para acomodar la inyección intraocular del vector, y (3) su eliminación controlada reduce la posibilidad de desgarros de retina y desprendimiento de retina no planificado.
En algunas realizaciones, la composición del vector se inyecta directamente en el espacio subretiniano fuera de la retina central, utilizando una cánula del tamaño de orificio apropiado (por ejemplo, calibre 27-45), creando así una ampolla en el espacio subretiniano. En otras realizaciones, la inyección subretiniana de la composición de vector está precedida por una inyección subretiniana de un pequeño volumen (por ejemplo, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 ml) de un líquido apropiado (tal como disolución salina o disolución de Ringer) en el espacio subretiniano fuera de la retina central. Esta inyección inicial en el espacio subretiniano establece una ampolla de fluido inicial dentro del espacio subretiniano, provocando un desprendimiento de retina localizado en la ubicación de la ampolla inicial. Esta ampolla de líquido inicial puede facilitar la administración dirigida de la composición del vector al espacio subretiniano (al definir el plano de inyección antes de la administración del vector) y minimizar la posible administración del vector en la coroides y la posibilidad de inyección o reflujo en la cavidad vítrea. En algunas realizaciones, esta ampolla de fluido inicial se puede inyectar adicionalmente con fluidos que comprenden una o más composiciones de vector y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales mediante la administración de estos fluidos directamente a la ampolla de fluido inicial con las mismas cánulas de calibre fino u otras adicionales.
La administración intraocular de las composiciones de vector y/o el pequeño volumen inicial de líquido se puede realizar utilizando una cánula de calibre fino (por ejemplo, calibre 27-45) unido a una jeringa. En algunas realizaciones, el émbolo de esta jeringa puede ser accionado por un dispositivo mecanizado, tal como presionando un pedal. La cánula de calibre fino se hace avanzar a través de la esclerotomía, a través de la cavidad vítrea y hacia la retina en un sitio predeterminado en cada sujeto de acuerdo con el área de la retina que se ha de apuntar (pero fuera de la retina central). Bajo visualización directa, la suspensión del vector se inyecta mecánicamente debajo de la retina neurosensorial, provocando un desprendimiento de retina localizado con una retinotomía autosellante no expansiva. Como se señaló anteriormente, la composición del vector puede inyectarse directamente en el espacio subretiniano creando una ampolla fuera de la retina central, o el vector puede inyectarse en una ampolla inicial fuera de la retina central, lo que hace que se expanda (y que expanda el área de desprendimiento de retina). En algunas realizaciones, la inyección de la composición de vector va seguida de la inyección de otro fluido en la ampolla.
Sin desear estar ligado por la teoría, la velocidad y la ubicación de la o las inyecciones subretinianas pueden dar como resultado fuerzas de cizallamiento localizadas que pueden dañar la mácula, la fóvea y/o las células del RPE subyacentes. Las inyecciones subretinianas se pueden realizar a una velocidad que minimice o evite las fuerzas de cizallamiento. En algunas realizaciones, la composición de vector se inyecta durante aproximadamente 15-17 minutos. En algunas realizaciones, el vector se inyecta durante aproximadamente 17-20 minutos. En algunas realizaciones, la composición de vector se inyecta durante aproximadamente 20-22 minutos. En algunas realizaciones, la composición de vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 35 a aproximadamente 65 μl/min. En algunas realizaciones, la composición de vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 35 μl/min. En algunas realizaciones, la composición de vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 40 μl/min. En algunas realizaciones, la composición de vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 45 μl/min. En algunas realizaciones, la composición de vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 50 μl/min. En algunas realizaciones, la composición de vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 55 μl/min. En algunas realizaciones, la composición de vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 60 μl/min. En algunas realizaciones, la composición de vector se inyecta a una velocidad de aproximadamente 65 μl/min. Un experto normal en la técnica reconocería que la velocidad y el tiempo de inyección de la ampolla pueden estar dirigidos, por ejemplo, por el volumen de la composición del vector o el tamaño de la ampolla necesaria para crear suficiente desprendimiento de retina para acceder a las células de la retina central, por el tamaño de la cánula utilizada para administrar la composición del vector, y por la capacidad para mantener con seguridad la posición de la cánula.
En algunas realizaciones de la invención, el volumen de la composición inyectada en el espacio subretiniano de la retina es mayor que aproximadamente uno cualquiera de 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl, 5 μl, 6 μl, 7 μl, 8 μl, 9 μl, 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 50 μl, 75 μl, 100 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl, 500 μl, 6 00 μl, 700 μl, 8 0 0 μl, 900 μl, or 1 ml, o cualquier cantidad intermedia.
En algunas realizaciones, la composición se administra en el ojo (por ejemplo, por administración subretiniana y/o intravítrea) una cantidad eficaz de partículas virales recombinantes que comprenden un vector de la presente descripción. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es al menos aproximadamente cualquiera de 5 x 1012, 6 x 1012, 7 x 1012, 8 x 1012, 9 x 1012, 10 x 1012, 11 x 1012, 15 x 1012, 20 x 1012, 25 x 1012, 30 x 1012 o 50 x 1012 copias de genoma/ml. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es aproximadamente cualquiera de 5 x 1012 to 6 x 1012, 6 x 1012 to 7 x 1012, 7 x 1012 a 8 x 1012, 8 x 1012 a 9 x 1012, 9 x 1012 a 10 x 1012, 10 x 1012 a 11 x 1012, 11 x 1012 a 15 x 1012, 15 x 1012 a 20 x 1012, 20 x 1012 a 25 x 1012, 25 x 1012 a 30 x 1012, 30 x 1012 a 50 x 1012, o 50 x 1012 a 100 x 1012 copias del genoma/ml. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es aproximadamente cualquiera de 5 x 1012 a 10 x 1012, 10 x 1012 a 25 x 1012 o 25 x 1012 a 50 x 1012 copias de genoma/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es al menos aproximadamente cualquiera de 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 10 x 109, 11 x 109, 15 x 109, 20 x 109, 25 x 109, 30 x 109 o 50 x 109 unidades de transducción/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es aproximadamente cualquiera de 5 x 109 a 6 x 109, 6 x 109 a 7 x 109, 7 x 109 a 8 x 109, 8 x 109 a 9 x 109, 9 x 109 a 10 x 109, 10 x 109 a 11 x 109, 11 x 109 a 15 x 109, 15 x 109 a 20 x 109, 20 x 109 a 25 x 109, 25 x 109 a 30 x 109, 30 x 109 a 50 x 109 o 50 x 109 a 100 x 109 unidades de transducción/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es aproximadamente cualquiera de 5 x 109 a 10 x 109, 10 x 109 a 15 x 109, 15 x 109 a 25 x 109 o 25 x 109 a 50 x 109 unidades de transducción/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es al menos aproximadamente cualquiera de aproximadamente 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 10 x 1010, 11 x 1010, 15 x 1010, 20 x 1010, 25 x 1010, 30 x 1010, 40 x 1010 o 50 x 1010 unidades infecciosas/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es al menos cualquiera de aproximadamente 5 x 1010 a 6 x 1010, 6 x 1010 a 7 x 1010, 7 x 1010 a 8 x 1010, 8 x 1010 a 9 x 1010, 9 x 1010 a 10 x 1010, 10 x 1010 a 11 x 1010, 11 x 1010 a 15 x 1010, 15 x 1010 a 20 x 1010, 20 x 1010 a 25 x 1010, 25 x 1010 a 30 x 1010, 30 x 1010 a 40 x 1010, 40 x 1010 a 50 x 1010 o 50 x 1010 a 100 x 1010 unidades infecciosas/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es al menos cualquiera de aproximadamente 5 x 1010 a 10 x 1010, 10 x 1010 a 15 x 1010, 15 x 1010 a 25 x 1010 o 25 x 1010 a 50 x 1010 unidades infecciosas/mL.
En algunas realizaciones, la composición se administra al ojo (por ejemplo, por administración subretiniana y/o intravítrea) de un individuo (por ejemplo, un ser humano) una cantidad eficaz de partículas virales recombinantes que comprenden un vector de la presente descripción. En algunas realizaciones, la dosis de partículas virales administrada al individuo es al menos aproximadamente cualquiera de 1 x 10 8 a aproximadamente 1 x 1 0 13 copias del genoma/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la dosis de partículas virales administrada al individuo es aproximadamente cualquiera de 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1 0 13 copias del genoma/kg de peso corporal.
Se pueden crear una o varias (por ejemplo, 2, 3 o más) ampollas. Generalmente, el volumen total de ampolla o ampollas creadas por los métodos y sistemas descritos aquí no puede exceder el volumen de líquido del ojo, por ejemplo, aproximadamente 4 ml en un sujeto humano típico. El volumen total de cada una de las ampollas individuales puede ser de al menos aproximadamente 0,3 ml, o al menos aproximadamente 0,5 ml con el fin de facilitar un desprendimiento de retina de tamaño suficiente para exponer los tipos de células de la retina central y crear una ampolla de dependencia suficiente para una manipulación óptima. Un experto normal en la técnica apreciará que al crear la ampolla de acuerdo con los métodos y sistemas descritos aquí, se debe mantener la presión intraocular apropiada para evitar dañar las estructuras oculares. El tamaño de cada una de las ampollas individuales puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,2 ml, de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,2 ml, de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 1,2 ml, de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 1,0 ml, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 2,0 ml, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3,0 ml. Así, en un ejemplo, para inyectar un total de 3 ml de suspensión de composición de vector, se pueden establecer 3 ampollas de aproximadamente 1 ml cada una. El volumen total de todas las ampollas en combinación puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,0 ml, aproximadamente 0,8 a aproximadamente 3,0 ml, aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,0 ml, aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3,0 ml, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,5 ml, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,2 ml, aproximadamente 0,9 a aproximadamente 3,0 ml, aproximadamente 0,9 a aproximadamente 2,0 ml, aproximadamente 0,9 a aproximadamente 1,0 ml.
Con el fin de transducir de manera segura y eficiente áreas de la retina objetivo (p. ej., la retina central) fuera del borde de la ubicación original de la ampolla, la ampolla puede manipularse para reposicionar la ampolla en el área diana para la transducción. La manipulación de la ampolla puede ocurrir por la dependencia de la ampolla que es creada por el volumen de la ampolla, el reposicionamiento del ojo que contiene la ampolla, el reposicionamiento de la cabeza del ser humano con un ojo u ojos que contienen una o más ampollas, y/o mediante intercambio fluido-aire. Esto es particularmente relevante para la retina central, ya que este área típicamente resiste el desprendimiento por inyección subretiniana. En algunas realizaciones se utiliza el intercambio de fluido-aire para cambiar la reposición de la ampolla; el líquido de la cánula de infusión se reemplaza temporalmente por aire, por ejemplo, soplando aire sobre la superficie de la retina. A medida que el volumen de aire desplaza el líquido de la cavidad vitrea de la superficie de la retina, el líquido de la cavidad vítrea puede fluir de una cánula. La ausencia temporal de presión del líquido de la cavidad vítrea hace que la ampolla se mueva y gravite hacia una parte dependiente del ojo. Al colocar el globo ocular de manera adecuada, la ampolla de composición del vector subretiniano se manipula para involucrar áreas adyacentes (por ejemplo, la mácula y/o la fóvea). En algunos casos, la masa de la ampolla es suficiente para hacer que gravite, incluso sin el uso del intercambio fluido-aire. El movimiento de la ampolla a la ubicación deseada puede facilitarse, además, alterando la posición de la cabeza del sujeto, para permitir que la ampolla gravite hacia la ubicación deseada en el ojo. Una vez que se logra la configuración deseada de la ampolla, el líquido se devuelve a la cavidad vítrea. El fluido es un fluido apropiado, por ejemplo disolución salina reciente. Generalmente, la composición del vector subretiniano puede dejarse in situ sin retinopexia a la retinotomía y sin taponamiento intraocular, y la retina se volverá a unir espontáneamente en aproximadamente 48 horas.
Mediante la transducción segura y eficaz de células oculares (por ejemplo, RPE y/o células fotorreceptoras de, por ejemplo, la mácula y/o la fóvea) con un vector de la presente descripción, los métodos definidos aquí pueden usarse para tratar a un individuo, por ejemplo un ser humano, que tiene un trastorno ocular asociado con una mutación intrónica profunda, en el que las células transducidas producen el sistema de CRISPR-Cas en una cantidad suficiente para tratar el trastorno ocular.
Se administra una cantidad eficaz de vector (en algunas realizaciones en forma de partículas virales), dependiendo de los objetivos del tratamiento. Por ejemplo, cuando un porcentaje bajo de transducción puede lograr el efecto terapéutico deseado, entonces el objetivo del tratamiento es generalmente alcanzar o superar este nivel de transducción. En algunos casos, este nivel de transducción se puede lograr mediante la transducción de solo aproximadamente 1 a 5% de las células diana, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 20% de las células del tipo de tejido deseado, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 50%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 80%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 95%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 99% de las células del tipo de tejido deseado. Como guía, el número de partículas virales administradas por inyección está generalmente entre aproximadamente 1 x 106 y aproximadamente 1x1014 partículas, entre aproximadamente 1 x 107 y 1x1013 partículas, entre aproximadamente 1 x 109 y 1x1012 partículas o aproximadamente 1 x 1011 partículas. La composición de vector puede administrarse mediante una o más inyecciones subretinianas, ya sea durante el mismo procedimiento o espaciadas por días, semanas, meses o años. En algunas realizaciones, se pueden utilizar múltiples vectores para tratar al ser humano.
En algunas realizaciones, la administración a la retina de una cantidad eficaz de un vector o ácido nucleico de la presente descripción transduce células fotorreceptoras en o cerca del sitio de administración. En algunas realizaciones, se transducen más de aproximadamente cualquiera de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% o 100% de las células fotorreceptoras. En algunas realizaciones, se transducen aproximadamente 5% a aproximadamente 100%, aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, aproximadamente 25% a aproximadamente 75%, aproximadamente 25% a aproximadamente 50% o aproximadamente 30% a aproximadamente 50% de las células fotorreceptoras. Los métodos para identificar células fotorreceptoras transducidas son conocidos en la técnica; por ejemplo, la inmunohistoquímica o el uso de un marcador tal como la proteína fluorescente verde potenciada pueden usarse para detectar la transducción.
En algunas realizaciones de la invención, la composición se administra a la subretina (por ejemplo, el espacio subretiniano) de un mamífero una cantidad eficaz de un vector o ácido nucleico de la presente descripción para tratar a un individuo con un trastorno ocular; por ejemplo, un ser humano con un trastorno ocular asociado con una mutación intrónica profunda. En algunas realizaciones, la composición se inyecta en uno o más lugares de la subretina para permitir la expresión del ácido nucleico en las células fotorreceptoras. En algunas realizaciones, la composición se inyecta en cualquiera de una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, o más de diez ubicaciones en la subretina.
En algunas realizaciones, la composición se administra en más de un lugar de manera simultánea o secuencial. En alguna realización, las inyecciones múltiples no tienen más de una hora, dos horas, tres horas, cuatro horas, cinco horas, seis horas, nueve horas, doce horas o 24 horas de diferencia. En alguna realización, las inyecciones múltiples están espaciadas un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, siete días, diez días, 15 días, 20 días, 25 días o 30 días. En alguna realización, las inyecciones múltiples están espaciadas un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, ocho meses, diez meses u once meses. En alguna realización, las inyecciones múltiples están espaciadas un año, dos años, tres años, cuatro años, cinco años, seis años, ocho años, diez años, 15 años, 20 años, 25 años, 30 años, 35 años, 40 años, 45 años, 50 años, 55 años o 60 años.
Métodos de inyección intravítrea
El método general para la inyección intravítrea puede ilustrarse mediante el siguiente breve esquema. Este ejemplo está destinado meramente a ilustrar determinadas características del método, y de ninguna manera pretende ser limitante. Los procedimientos para la inyección intravítrea son conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Peyman, G.A., et al. (2009) Retina 29(7) :875-912 y Fagan, X.J. y Al-Qureshi, S. (2013) Clin. Experiment. Ophthalmol. 41 (5):500-7).
Brevemente, un sujeto para inyección intravítrea puede prepararse para el procedimiento mediante dilatación de la pupila, esterilización del ojo y administración de anestésico. Puede utilizarse cualquier agente midriático adecuado conocido en la técnica para la dilatación de la pupila. Se puede confirmar una dilatación de la pupila adecuada antes del tratamiento. La esterilización puede lograrse mediante la aplicación de un tratamiento ocular esterilizante, por ejemplo una disolución que contiene yoduro, tal como povidona yodada (BETADINE®). También se puede usar una disolución similar para limpiar el párpado, las pestañas y cualquier otro tejido cercano (por ejemplo, piel). Puede utilizarse cualquier anestésico adecuado, tal como lidocaína o proparacaína, a cualquier concentración adecuada. El anestésico se puede administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, gotas, geles o jaleas tópicos y aplicación subconjuntival del anestésico.
Antes de la inyección, se puede utilizar un espéculo de párpado esterilizado para despejar las pestañas de la zona. El lugar de la inyección se puede marcar con una jeringa. El lugar de la inyección se puede elegir en función del cristalino del paciente. Por ejemplo, el sitio de la inyección puede ser 3-3,5 mm del limbo en pacientes pseudofáquicos o afáquicos, y 3,5-4 mm desde el limbo en pacientes fáquicos. El paciente puede mirar en dirección opuesta al lugar de la inyección.
En algunas realizaciones, la composición se administra en el ojo (por ejemplo, por administración subretiniana y/o intravítrea) una cantidad eficaz de partículas virales recombinantes que comprenden un vector de la presente descripción. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es al menos aproximadamente cualquiera de 5 x 1012, 6 x 1012, 7 x 1012, 8 x 1012, 9 x 1012, 10 x 1012, 11 x 1012, 15 x 1012, 20 x 1012, 25 x 1012, 30 x 1012 o 50 x 1012 copias de genoma/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es aproximadamente cualquiera de 5 x 1012 to 6 x 1012, 6 x 1012 to 7 x 1012, 7 x 1012 a 8 x 1012, 8 x 1012 a 9 x 1012, 9 x 1012 a 10 x 1012, 10 x 1012 a 11 x 1012, 11 x 1012 a 15 x 1012, 15 x 1012 a 20 x 1012, 20 x 1012 a 25 x 1012, 25 x 1012 a 30 x 1012, 30 x 1012 a 50 x 1012, o 50 x 1012 a 100 x 1012 copias del genoma/ml. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es aproximadamente cualquiera de 5 x 1012 a 10 x 1012, 10 x 1012 a 25 x 1012 o 25 x 1012 a 50 x 1012 copias de genoma/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es al menos aproximadamente cualquiera de 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 10 x 109, 11 x 109, 15 x 109, 20 x 109, 25 x 109, 30 x 109 o 50 x 109 unidades de transducción/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es aproximadamente cualquiera de 5 x 109 a 6 x 109, 6 x 109 a 7 x 109, 7 x 109 a 8 x 109, 8 x 109 a 9 x 109, 9 x 109 a 10 x 109, 10 x 109 a 11 x 109, 11 x 109 a 15 x 109, 15 x 109 a 20 x 109, 20 x 109 a 25 x 109, 25 x 109 a 30 x 109, 30 x 109 a 50 x 109 o 50 x 109 a 100 x 109 unidades de transducción/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es aproximadamente cualquiera de 5 x 109 a 10 x 109, 10 x 109 a 15 x 109, 15 x 109 a 25 x 109 o 25 x 109 a 50 x 109 unidades de transducción/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es al menos aproximadamente cualquiera de aproximadamente 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 10 x 1010, 11 x 1010, 15 x 1010, 20 x 1010, 25 x 1010, 30 x 1010, 40 x 1010 o 50 x 1010 unidades infecciosas/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es al menos cualquiera de aproximadamente 5 x 1010 a 6 x 1010, 6 x 1010 a 7 x 1010, 7 x 1010 a 8 x 1010, 8 x 1010 a 9 x 1010, 9 x 1010 a 10 x 1010, 10 x 1010 a 11 x 1010, 11 x 1010 a 15 x 1010, 15 x 1010 a 20 x 1010, 20 x 1010 a 25 x 1010, 25 x 1010 a 30 x 1010, 30 x 1010 a 40 x 1010, 40 x 1010 a 50 x 1010 o 50 x 1010 a 100 x 1010 unidades infecciosas/mL. En algunas realizaciones, el título viral de la composición es al menos cualquiera de aproximadamente 5 x 1010 a 10 x 1010, 10 x 1010 a 15 x 1010, 15 x 1010 a 25 x 1010 o 25 x 1010 a 50 x 1010 unidades infecciosas/mL.
En algunas realizaciones, la composición se administra al ojo (por ejemplo, por administración subretiniana y/o intravítrea) de un individuo (por ejemplo, un ser humano) una cantidad eficaz de partículas virales recombinantes que comprenden un vector de la presente descripción. En algunas realizaciones, la dosis de partículas virales administrada al individuo es al menos aproximadamente cualquiera de 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1013 copias del genoma/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la dosis de partículas virales administrada al individuo es aproximadamente cualquiera de 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1013 copias del genoma/kg de peso corporal.
Durante la inyección, la aguja puede insertarse perpendicularmente a la esclerótica y apuntarse al centro del ojo. La aguja puede insertarse de manera que la punta termine en el vítreo, en lugar de en el espacio subretiniano. Puede utilizarse cualquier volumen adecuado conocido en la técnica para inyección. Después de la inyección, el ojo puede tratarse con un agente esterilizante tal como un antibiótico. También se puede enjuagar el ojo para eliminar el exceso de agente esterilizante.
Estructura de la retina y medios para determinar la efectividad del suministro de ácido nucleico
Se sabe que la retina contiene múltiples capas. Capas de células en la retina pueden incluir la membrana limitante interna, fibra nerviosa, células ganglionares, plexiforme interno, nuclear interno, plexiforme externo, nuclear externo, membrana limitante externa, fotorreceptor y capas de epitelio pigmentario retiniano. La capa más próxima al vítreo es la membrana limitante interna. Esta capa puede contener células de Müller, una clase de glía. La capa de fibras nerviosas puede contener axones de células ganglionares que forman el nervio óptico. La capa de células ganglionares puede incluir células ganglionares y células amacrinas. La capa plexiforme interna puede contener sinapsis entre las dendritas del ganglio y las células amacrinas y axones de las células bipolares. La capa nuclear interna puede contener núcleos celulares de células amacrinas, bipolares y horizontales. La capa plexiforme externa puede contener sinapsis entre las dendritas de las células horizontales y las proyecciones de las células fotorreceptoras. La capa nuclear exterior puede contener cuerpos de células fotorreceptoras. La membrana limitante externa o exterior puede incluir conexiones celulares, tales como uniones adherentes y desmosomas, entre los procesos apicales de las células de Müller y entre estos procesos y los segmentos internos de las células fotorreceptoras. La capa de fotorreceptores, también conocida como la capa de bastones y conos y la membrana de Jacob, puede contener células fotorreceptoras que incluyen bastones y conos. La capa retiniana más distal al vítreo es el epitelio pigmentario de la retina (RPE), que puede incluir una capa de células epiteliales hexagonales que contienen gránulos de pigmento.
También se sabe que la retina contiene muchos tipos de células diferentes. Las neuronas de la retina pueden incluir células fotorreceptoras, células bipolares, células ganglionares, células amacrinas y células horizontales. Las células fotorreceptoras son sensibles a la luz. Pueden sentir la luz y responder transmitiendo señales al nervio óptico a través de las células bipolares y las células ganglionares. Las células fotorreceptoras pueden incluir células de bastón, que generalmente detectan la luz en condiciones de poca luz, y células de cono, que generalmente detectan el color y la percepción de luz más brillante. Las células bipolares pueden recibir información de las células fotorreceptoras y hacer sinapsis con células amacrinas o ganglionares. Las células ganglionares pueden recibir información de células amacrinas o células horizontales, y sus axones forman el nervio óptico. Las células horizontales pueden integrar entradas de múltiples fotorreceptores y ayudar en el ajuste a los niveles de luz. Las células amacrinas son interneuronas que ayudan a regular las células bipolares y proporcionan entradas a las células ganglionares. Las células gliales de la retina pueden incluir células de Müller, astroglia y microglia.
La eficacia del suministro de ácido nucleico mediante inyección subretiniana o intravítrea puede controlarse mediante varios criterios, como se describe aquí. En algunas realizaciones, la eficacia se ensaya detectando la eliminación de la mutación intrónica profunda y/o la secuencia flanqueante en una muestra que incluye una o más células a las que se administraron los ácidos nucleicos. Las deleciones pueden detectarse por cualquier medio conocido en la técnica, incluidos, entre otros, transferencia Southern, PCR, qPCR, secuenciación de ADN (por ejemplo, secuenciación de Sanger y secuenciación de próxima generación), hibridación in situ, micromatrices de ADN, y un ensayo de nucleasa Surveyor (véase, por ejemplo, Ran, F.A. et al. (2013) Nat. Protoc. 8:2281-2308). Los métodos ejemplares se ilustran en los Ejemplos a continuación.
En algunas realizaciones, la eficacia se ensaya funcionalmente. Por ejemplo, después del tratamiento en un sujeto usando los métodos descritos aquí, el sujeto puede ser evaluado para, por ejemplo, una mejora y/o estabilización y/o retraso en la progresión de uno o más signos o síntomas del estado de enfermedad por uno o más parámetros clínicos. Los ejemplos de tales ensayos son conocidos en la técnica, e incluyen tanto medidas objetivas como subjetivas (por ejemplo, informadas al sujeto). Por ejemplo, para medir la eficacia de un tratamiento en la función visual de un sujeto, se pueden evaluar uno o más de los siguientes: la calidad subjetiva de la visión del sujeto o la función mejorada de la visión central (por ejemplo, una mejora en la capacidad del sujeto para leer con fluidez y reconocer rostros), la movilidad visual del sujeto (por ejemplo, una disminución en el tiempo necesario para navegar por un laberinto), agudeza visual (por ejemplo, una mejora en la puntuación LogMAR del sujeto), microperimetría (por ejemplo, una mejora en la puntuación de dB del sujeto), perimetría adaptada a la oscuridad (por ejemplo, una mejora en la puntuación de dB del sujeto), mapeo de matriz fina (por ejemplo, una mejora en la puntuación de dB del sujeto), perimetría de Goldmann (por ejemplo, un tamaño reducido del área escotomatosa (es decir, áreas de ceguera) y mejora de la capacidad de resolver objetivos más pequeños), sensibilidades de parpadeo (por ejemplo, una mejora en Hertz), medidas de autofluorescencia y electrofisiología (por ejemplo, mejora en ERG). En algunas realizaciones, la función visual se mide por la movilidad visual del sujeto. En algunas realizaciones, la función visual se mide por la agudeza visual del sujeto. En algunas realizaciones, la función visual se mide por microperimetría. En algunas realizaciones, la función visual se mide mediante una perimetría adaptada a la oscuridad. En algunas realizaciones, la función visual se mide mediante ERG. En algunas realizaciones, la función visual se mide por la calidad de visión subjetiva del sujeto.
En el caso de enfermedades que dan como resultado una función visual degenerativa progresiva, el tratamiento del sujeto en una edad temprana puede no solo dar como resultado una ralentización o detención de la progresión de la enfermedad, sino que también puede mejorar o prevenir la pérdida de la función visual debido a la ambliopía adquirida. La ambliopía puede ser de dos tipos. En estudios en primates no humanos y gatitos que se mantienen en total oscuridad desde el nacimiento hasta incluso unos pocos meses de edad, los animales, incluso cuando se exponen posteriormente a la luz, son funcionalmente irreversiblemente ciegos, a pesar de tener señales funcionales enviadas por la retina. Esta ceguera se produce porque las conexiones neuronales y la "educación" de la corteza se detienen desde el nacimiento debido a la detención del estímulo. Se desconoce si esta función podría restaurarse alguna vez. En el caso de las enfermedades de la degeneración de la retina, la circuitería de la corteza visual normal se "aprendió" inicialmente o fueron apropiados para el desarrollo hasta el punto en el que la degeneración creó una disfunción significativa. La pérdida de estímulo visual en términos de señalización en el ojo disfuncional crea una disfunción "adquirida" o "aprendida" ("ambliopía adquirida"), lo que resulta en la incapacidad del cerebro para interpretar señales o "utilizar" ese ojo. Se desconoce en estos casos de "ambliopía adquirida" si la mejora de la señalización de la retina como resultado de la terapia génica del ojo ambliópico podría alguna vez resultar en una ganancia de función más normal además de una desaceleración de la progresión o una estabilización del estado de la enfermedad. En algunas realizaciones, el ser humano tratado tiene menos de 30 años de edad. En algunas realizaciones, el ser humano tratado tiene menos de 20 años de edad. En algunas realizaciones, el ser humano tratado tiene menos de 18 años de edad. En algunas realizaciones, el ser humano tratado tiene menos de 15 años de edad. En algunas realizaciones, el ser humano tratado tiene menos de 14 años de edad. En algunas realizaciones, el ser humano tratado tiene menos de 13 años de edad. En algunas realizaciones, el ser humano tratado tiene menos de 12 años de edad. En algunas realizaciones, el ser humano tratado tiene menos de 10 años de edad. En algunas realizaciones, el ser humano tratado tiene menos de 8 años de edad. En algunas realizaciones, el ser humano tratado tiene menos de 6 años de edad.
En algunos trastornos oculares, existe un fenómeno de "célula enfermera", en el que la mejora de la función de un tipo de célula mejora la función de otro. Por ejemplo, la transducción del RPE de la retina central por un ácido nucleico descrito aquí puede mejorar la función de los bastones, y a su vez, la función mejorada de los bastones da como resultado una función mejorada de los conos. Por consiguiente, el tratamiento de un tipo de célula puede dar como resultado una función mejorada en otro.
La selección de un vector y una composición particulares depende de una serie de factores diferentes, incluidos, entre otros, el historial médico del ser humano individual, y las características de la afección y del individuo que se está tratando. La evaluación de características de este tipo y el diseño de un régimen terapéutico apropiado es, en última instancia, responsabilidad del médico que prescribe.
En algunas realizaciones, el ser humano a tratar tiene un trastorno ocular genético (por ejemplo, asociado a una mutación intrónica profunda), pero aún no ha manifestado signos o síntomas clínicos. En algunas realizaciones, el ser humano a tratar tiene un trastorno ocular (por ejemplo, asociado a una mutación intrónica profunda). En algunas realizaciones, el ser humano a tratar ha manifestado uno o más signos o síntomas de un trastorno ocular (por ejemplo, asociado a una mutación intrónica profunda). En algunas realizaciones, se ha identificado una mutación intrónica profunda en el ser humano a tratar.
Las composiciones para uso según la invención se pueden usar solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales para tratar trastornos oculares. El intervalo entre la administración secuencial puede ser en términos de al menos (o, alternativamente, menos de) minutos, horas o días.
En algunas realizaciones, se pueden administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales a la subretina o al vítreo (por ejemplo, mediante administración intravítrea). Los ejemplos no limitantes del agente terapéutico adicional incluyen factores neurotróficos polipeptídicos (por ejemplo, GDNF, CNTF, BDNF, FGF2, PEDF, EPO), factores antiangiogénicos polipeptídicos (por ejemplo, sFlt, angiostatina, endostatina), ácidos nucleicos antiangiogénicos (por ejemplo, siRNA, miRNA, ribozima), por ejemplo ácidos nucleicos antiangiogénicos contra VEGF, morfolinos antiangiogénicos, por ejemplo morfolinos antiangiogénicos contra VEGF, anticuerpos antiangiogénicos y/o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos Fab), por ejemplo anticuerpos antiangiogénicos y/o fragmentos de anticuerpos contra VEGF.
VII. Kits
Las composiciones, los ácidos nucleicos y las partículas víricas que se describen aquí pueden estar contenidos en un kit diseñado para uso en uno de los métodos descritos aquí.
Las composiciones que se utilizan según la invención se pueden envasar además en kits, en los que los kits pueden comprender además instrucciones de uso. En algunas realizaciones, las instrucciones para uso incluyen instrucciones de acuerdo con uno de los métodos descritos en esta memoria.
En algunas realizaciones, los kits contienen además amortiguadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Como es bien conocido en la técnica, los excipientes farmacéuticamente aceptables son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz y se pueden suministrar como soluciones o suspensiones líquidas, como emulsiones o como formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de su uso. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o puede actuar como un diluyente. Excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, sustancias tamponantes del pH y tampones. Excipientes de este tipo incluyen cualquier agente farmacéutico adecuado para administración directa al ojo que pueda administrarse sin una toxicidad excesiva. Excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a sorbitol, cualquiera de los diversos compuestos TWEEN y líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Pueden incluirse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una discusión detallada de excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
En algunas realizaciones, los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir vehículos farmacéuticamente aceptables. Soportes farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceite, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y similares. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa, polietilenglicol (PEG) y glicerol como soportes líquidos, particularmente para soluciones inyectables. También se pueden utilizar ingredientes adicionales, por ejemplo conservantes, tampones, agentes de tonicidad, antioxidantes y estabilizadores, agentes humectantes o clarificantes no iónicos, agentes que aumentan la viscosidad y similares. Los kits descritos en esta memoria pueden envasarse en dosis unitarias únicas o en formas de múltiples dosis. Los contenidos de los kits se formulan generalmente como solución estéril y sustancialmente isotónica.
EJEMPLOS
La invención se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención. Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos aquí son solo para fines ilustrativos, y que varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán evidentes para los expertos en la técnica.
Ejemplo 1: Generación de un modelo in vitro de amaurosis congénita de Leber utilizando tecnología Crispr-Cas9
Métodos
Plásmidos
El plásmido pSpCas9 que expresa SpCas9 se solicitó a Sigma (número de catálogo: CAS9P-1EA). El sitio de restricción BbsI en el poliA de BGH se eliminó utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange Lightning (Stratagene) y un par de cebadores de mutagénesis (SEQ ID NOS: 28-29) siguiendo el protocolo del fabricante. GeneArt (Life Technologies) sintetizó un casete promotor U6-BbsI:BbsI-sgRNA armazón-terminador U6 (SEQ ID NO: 30), y lo insertó en los sitios de restricción Pcil y NruI del plásmido nulo pSpCas9-BbsI para generar un plásmido pSpCas9(BB). Los oligos de sgRNA (SEQ ID NOS: 1-2) se subclonaron entonces en los dos sitios de restricción de BbsI del plásmido pSpCas9 (BB) siguiendo el protocolo descrito anteriormente (Ran, F.A. et al. (2013) Nat. Protoc.
8:2281-2308).
Nucleofección
2.5 microgramos del ADN del plásmido de pSpCas9(BB)-U6-sgRNA y 5 microlitros del ssODN (10 micromolar) (SEQ ID NO: 3) se cotransfectaron en 1 x 106 células HEK 293FT usando el kit L 4D-Nucleofector X la línea celular Amaxa SF (Lonza) y el programa CM-130 en un 4D-Nucleofector System (Lonza), siguiendo el protocolo del fabricante.
Cribado
Para identificar los clones que portaban la mutación c.2991+1655A>G de CEP290, las células se disociaron en células individuales 48 horas después de la cotransfección, y se diluyeron en serie hasta una concentración final de 0,5 células por 100 microlitros para reducir la probabilidad de tener múltiples células por pocillo. Se sembraron 100 microlitros de células diluidas en cada pocillo de nueve placas de 96 pocillos. Las células se expandieron en una incubadora con CO2 al 5%, 37oC durante 2 semanas.
se identificaron 235 clones de células individuales y se sometieron a cribado para la mutación c.2991+1655A>G de CEP290. El ADN genómico se extrajo con la disolución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre) y se amplificó con GoTaq Hot Start Green Master Mix (Promega) y cebadores de PCR que flanquean la mutación intrónica (SEQ ID NOS: 4-5). La amplificación de los productos de la PCR se logró con los siguientes parámetros de ciclo: 1 ciclo a 95°C durante 2 min; 35 ciclos de 95°C durante 30 s, 60°C durante 30 s, y 72°C durante 3 min; 1 ciclo a 72°C durante 15 min. Los productos de PCR se sometieron a digestión con SnaBI y secuenciación de Sanger con un cebador de secuenciación (SEQ ID NO: 6).
RT-qPCR
Los ARNm se extrajeron de células WT, Het y MT utilizando el Mini Kit RNeasy Plus (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se usó 1 microgramo de ARN total para sintetizar ADNc usando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad) siguiendo el protocolo del fabricante. Los cDNA se sometieron a amplificación por PCR en tiempo real en un amortiguador que contenía Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix con ROX bajo (biotium) y cebadores que detectan específicamente ARNm de CEP290 de tipo salvaje (SEQ ID NOS: 7-8) y ARNm de CEP290 mutante (SEQ ID NOS: 9-10), respectivamente, en un sistema de PCR en tiempo real ABI Prism 7500 (Applied Biosystems). Se usaron las siguientes condiciones: 1 ciclo a 50°C durante 2 min; 1 ciclo a 95°C durante 10 min; 40 ciclos de 95°C durante 15 s y 60°C durante 60 s. La especificidad de los productos de amplificación se determinó a partir del análisis de la curva de fusión realizado al final de cada serie utilizando un ciclo a 95°C durante 15 s, 60°C durante 60 s, 95°C durante 15 s y 60°C durante 15 s. Los datos se analizaron usando el software SDS 2.3 (Applied Biosystems). los niveles de expresión de CEP290 se normalizaron a los niveles de expresión de ARNm de PPIA (para las secuencias de los cebadores, véanse SEQ ID NOS: 31-32).
Análisis de Transferencia Western
Las células se lisaron en amortiguador de lisis RIPA (Cell Signaling Technology) complementado con 1 milimol/litro de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF; Cell Signaling Technology) y cóctel inhibidor de proteasa 1X (Cell Signaling Technology) en hielo. A continuación, las células se rasparon, se recogieron en tubos eppendorf, y los lisados se clarificaron mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 6 min a 4°C. Las muestras se prepararon añadiendo el amortiguador de muestra NuPage 4X LDS y el agente reductor NuPage 10X (ambos de Life Technologies), calentando a 70°C durante 10 min y centrifugando a 13.000 rpm durante 1 min. Las muestras de proteína se cargaron en gel NuPAGE 3-8% Tris-Acetato junto con el estándar de proteína preteñido HiMark (ambos de Life Technologies). Las muestras se resolvieron mediante electroforesis en gel a 180 voltios durante 1 hora. El amortiguador de paso usado fue el amortiguador de paso Tris-Acetato SDS (Life Technologies). Para la transferencia, las membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) se trataron brevemente en metanol y se enjuagaron con agua para volverlas hidrófilas. El sándwich de transferencia se preparó intercalando la membrana de PVDF y el gel entre papeles de filtro y esponjas en el módulo de transferencia XCell II (Life Technologies). El amortiguador de transferencia utilizado fue el amortiguador de transferencia NuPage 20X (Life Technologies) con 20% de metanol. La transferencia se realizó a 30 voltios durante 2 horas en XCell SureLock Mini-C6ll (Life Technologies). Después de la transferencia, las membranas de PVDF se bloquearon en amortiguador Pierce TBST (disolución salina amortiguada con Tris con detergente Tween 20; Thermo Fisher Scientific) que contenía leche desnatada en polvo al 1%, agitando a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, las transferencias se incubaron en la disolución de anticuerpo primario preparada en la disolución de bloqueo, agitando durante la noche a 4°C. Los anticuerpos primarios utilizados son un anticuerpo anti-CEP290 policlonal de conejo (un obsequio amable del profesor Hemant Khanna de la Universidad de Massachusetts en Worcester), un anticuerpo anti-Cas9 monoclonal de ratón (clon 7A9; Millipore), un anticuerpo anti-p-actina monoclonal de conejo conjugado con HRP (clon 13E5; Cell Signaling Technology). Los anticuerpos primarios no unidos se lavaron 3 veces durante 10 min cada una con TBST. A continuación, se añadieron a las membranas anticuerpos secundarios (IgG anti-ratón o anti-conejo conjugada con Alexa Fluor 647; Cell Signaling Technology) en disolución de bloqueo, y se mantuvieron en un agitador durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron 3 veces durante 10 min cada una con TBST para reducir el fondo no específico. Las membranas se desarrollaron durante 4 min usando sustrato de transferencia Western de quimioluminiscencia mejorada (ECL) de Pierce (Thermo Fisher Scientific). Las bandas de proteínas en las transferencias se visualizaron finalmente exponiendo la película durante varios intervalos de tiempo en un procesador Kodak X-OMAT 2000. Para volver a sondear una transferencia en busca de anticuerpos anti-p-actina, primero se eliminaron las membranas incubándolas a 37°C durante 30 min en amortiguador de eliminación de transferencia Western Restore (Thermo Fisher Scientific), y después se volvieron a sondar con el anticuerpo anti-p-actina. Los datos de transferencia que se muestran en este trabajo son representativos de al menos tres experimentos independientes.
Resultados
En primer lugar, se utilizó la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 para generar un modelo celular que portaba la mutación de ayuste intrónica c.2991+1655 A>G en CEP290. Este modelo celular es una herramienta valiosa para evaluar tratamientos para pacientes con LCA que albergan la mutación c.2991+1655 A>G en CEP290.
La edición del genoma con el sistema de CRISPR-Cas9 bacteriano tipo II se inicia con la introducción de una ruptura de doble cadena (DSB) en un locus genómico específico definido por la secuencia diana de sgRNA y el motivo adyacente del protoespaciador (PAM), y sigue con la reparación de la DSB a través de reparación dirigida por homología (HDR) o unión de extremos no homólogos (NHEJ) (Jinek, M. et al. (2012) Science 337:816-821; Ran, F.A. et al. (2013) Nat. Protoc. 8:2281-2308). En presencia de un molde de HDR, el sistema de CRISPR-Cas9 se puede utilizar para generar modificaciones precisas y definidas en un lugar específico a través del proceso de HDR.
Para obtener un reemplazo de ADN genómico específico, un plásmido que exprese tanto sgRNA como S. pyogenes Cas9 (SpCas9) junto con el molde de HDR lineal se introdujo en células 293FT mediante nucleofección. El molde de HDR es un oligonucleótido de ADN monocatenario (ssODN; SEQ ID NO: 3) que contiene brazos de homología de 75 pb que flanquean la mutación c.2991+1655A>G junto con PAM mutado (c.2991+1666C>G). El PAM mutado evitaría que el ssODN donante sea degradado por Cas9 en las células, y mientras tanto introduciría un único sitio de restricción SnaBI al intrón 26 de CEP290.
Para obtener células que portan la mutación c.2991+1655A>G de CEP290, se aislaron 235 clones de células individuales y se cribaron a partir de células cotransfectadas con sgRNA/SpCas9 y ssODN. El ADN genómico se extrajo y amplificó con cebadores de PCR que flanqueaban la mutación intrónica (SEQ ID NOS: 4-5). Los productos de PCR se sometieron a digestión con SnaBI y secuenciación de Sanger con un cebador de secuenciación (SEQ ID NO: 6).
Entre los 235 clones de células individuales, un clon contenía las mutaciones c.2991+1655A>G y c.2991+1666C>G en ambos alelos de CEP290 (en lo sucesivo denominados "células mutantes" o "células MT"). Otro clon contenía las dos mutaciones en un alelo de CEP290 y el ADN de CEP290 de tipo salvaje endógeno en el otro alelo (en adelante, las "células heterocigóticas" o las "células Het"). Las células que contenían dos alelos de CEP290 de tipo salvaje endógeno se denominan aquí "células de tipo salvaje" o "células WT".
Los niveles de expresión de los ARNm de CEP290 de tipo salvaje y muíante en células de tipo salvaje, heterocigotas y mutantes, se midieron mediante PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) usando cebadores que detectan ARNm de CEP290 de tipo salvaje (SEQ ID NOS: 7-8) y ARNm de CEP290 mutante (SEQ ID NOS: 9-10), respectivamente. Los resultados se normalizaron a los niveles de expresión de ARNm de PPIA (SEQ ID NOS: 31-32).
En comparación con las células de tipo salvaje, los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje se redujeron en un 27% y un 48% en células heterocigotas y mutantes, respectivamente (FIG. 3A). Como era de esperar, las células de tipo salvaje no expresaron mRNA de CEP290 mutante, mientras que sus niveles eran un 24% más altos en células mutantes que en células heterocigóticas (FIG. 3B). En comparación con las células heterocigotas, las células mutantes expresaron niveles significativamente más bajos de ARNm de CEP290 de tipo salvaje y niveles significativamente más altos de ARNm de CEP290 mutante. Por lo tanto, este modelo celular recapitula el fenotipo en pacientes de LCA que portan la mutación c.2991+1655 A>G, ya que estos pacientes expresan un nivel reducido de ~50% de ARNm de CEP290 de tipo salvaje (den Hollander, den Hollander, A.I. et al. (2006) Am. J. Elum. Genet. 79:556-561).
Los niveles de proteína de CEP290 en células de tipo salvaje, heterocigóticas y mutantes se examinaron mediante análisis de transferencia Western. En comparación con las células de tipo salvaje, los niveles de proteína CEP290 en células heterocigotas y mutantes se redujeron considerablemente (FIG. 3C). Las células mutantes expresaron niveles más bajos de proteína CEP290 en comparación con las células heterocigotas (FIG. 3C). Por lo tanto, los datos de inmunotransferencia son consistentes con los datos de RT-qPCR.
Ejemplo 2: Eliminación dirigida de la mutación c.2991+1655 A>G
Métodos
Plásmidos
Se construyó un vector de expresión todo en uno con el método de clonación Golden Gate como se describió anteriormente (Sakuma, T. et al. (2014) Sci. Rep. 4:5400). Brevemente, GeneArt (Life Technologies) sintetizó un fragmento de ADN que contiene el promotor U6-BbsI:BbsI-sgRNA armazón-terminador U6-promotor CMV (SEQ ID NO: 33), y lo insertó en los sitios de restricción Pcil y NheI del plásmido nulo pSpCas9 descrito anteriormente para generar un plásmido pSpCas9 (BBU) que se utiliza para subclonar las secuencias guía de sgRNA en dirección 5’. Para construir un plásmido pSpCas9(BBD) que se usa para subclonar las secuencias guía de sgRNA en dirección 3’, se realizó una reacción de PCR usando la polimerasa de ADN de alta fidelidad de Phusion (New England BIoLabs Inc) con el ADN del plásmido pSpCas9(BB) como molde de ADN y un par de cebadores de PCR (SEQ ID NOS: 34­ 35). Los parámetros de ciclo fueron: 1 ciclo a 98°C durante 1 min; 35 ciclos de 98°C durante 20 s y 72°C durante 30 s; 1 ciclo a 72°C durante 5 min. El producto de PCR se insertó en los sitios Pcil y KpnI del plásmido pSpCas9(BBU). En este plásmido pSpCas9(BBD), dos sitios BsaI flanquean el sgRNA impulsado por el promotor U6. Los oligos de U1 sgRNA (SEQ ID NOS: 11-12) se hibridaron y después se subclonaron en los dos sitios de restricción BbsI del plásmido pSpCas9(BBU), y los oligos de D1, D2 y D3 sgRNA (SEQ ID NOS: 13-18) se hibridaron y después se subclonaron en los dos sitios de restricción BbsI del plásmido pSpCas9(BBD) siguiendo el protocolo descrito previamente (Ran, F.A. et al. (2013) Nat. Protoc. 8:2281-2308). Los D1-D3 sgRNA resultantes junto con el promotor U6 se cortaron adicionalmente de los plásmidos pSpCas9(BBD) usando la enzima de restricción BsaI, y después se subclonaron en los dos sitios BsaI en el plásmido pSpCas9(BBU)-U1 sgRNA. Los plásmidos pSpCas9(BBUD) resultantes expresan dos sgRNA impulsados por el promotor U6 y un SpCas9 impulsado por el promotor CMV. Los oligos para dos sgRNA de control (SEQ ID NOS: 36-39) se subclonaron en los sitios de restricción BbsI del mismo vector de expresión todo en uno usando el método descrito anteriormente como el plásmido de control.
Transfección y análisis de PCR
Los plásmidos sgRNAs-SpCas9 emparejados se transfectaron en células de tipo salvaje, heterocigotas y mutantes usando el reactivo de transfección Lipofectamine 3000 (Life Technologies) siguiendo el protocolo del fabricante.
48 h después de la transfección, el ADN genómico se extrajo de las células utilizando la disolución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre), y se amplificó con GoTaq Hot Start Green Master Mix (Promega), y cebadores de PCR que flanquean la mutación intrónica (SEQ ID NOS: 4-5). La amplificación de los productos de la PCR se logró con los siguientes parámetros de ciclo: 1 ciclo a 95°C durante 2 min; 35 ciclos de 95°C durante 30 s, 60°C durante 30 s y 72°C durante 3 min; 1 ciclo a 72°C durante 15 min. A continuación, los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa.
Secuenciación de próxima generación (NGS)
Los productos de PCR adquiridos anteriormente se enviaron a ACGT (Wheeling, IL) para la secuenciación NGS. El ADN de la muestra se fragmentó a un tamaño de fragmento diana promedio de 350 pb mediante ultrasonicación, y se usó para construir una biblioteca de secuenciación con el kit de preparación de muestras sin PCR de ADN TruSeq de Illumina. La biblioteca se cuantificó a través de Qubit y 2100 Bioanalyzer, y se cargó en una plataforma Illumina para generar lecturas PE150. Se generaron aproximadamente 150.000 lecturas (± 20%) por muestra. Los Illumina sin procesar se desmultiplexaron y convirtieron al formato .fastq, y se filtraron las lecturas cortas (N<50) y de baja calidad (Q<20) □. Las lecturas filtradas se alinearon con las secuencias de referencia (ADN de tipo salvaje y ADN truncado) utilizando Bowtie2. Para la cuantificación, el número de lecturas alineadas con una secuencia de 40 pb que flanquea el sitio de escisión del U1 sgRNA (20 pb antes y 20 pb después del sitio de escisión) que son exclusivas del ADN de tipo salvaje o del ADN truncado se usó para calcular el porcentaje de ADN de tipo salvaje y truncado en cada muestra.
Resultados
A continuación, el modelo descrito anteriormente se usó para probar el enfoque para generar una eliminación dirigida de la mutación c.2991+1655 A>G.
Un sgRNA en dirección 5’ (U1, SEQ ID NO: 19) que se dirige a un locus dentro del exón críptico se expresó junto con cada uno de los tres sgRNA en dirección 3’ (D1, D2, D3; SEQ ID NOS: 20-22) en el mismo vector que SpCas9. Los pares de sgRNA en dirección 5’ y en dirección 3’ flanquean la mutación c.2991+1655A>G y se predice que generarán deleciones genómicas de 283 pb, 187 pb y 231 pb, respectivamente, como han demostrado estudios previos que la eliminación genómica inducida por sgRNAs emparejados se logra en gran medida mediante la unión precisa de los extremos (Brandl, C. et al. (2014) FEBS Open Bio. 5:26-35; Zheng, Q. et al. (2014) Biotechniques 57:115-124). Se subclonaron dos sgRNA de control en el mismo plásmido que el control.
Los plásmidos sgRNA emparejados-SpCas9 se transfectaron en células de tipo salvaje, heterocigotas y mutantes como se describe anteriormente, seguido de un análisis de PCR utilizando cebadores que flanquean las regiones de deleción (SEQ ID NOS: 4-5). Los fragmentos genómicos truncados y de tipo salvaje se resolvieron mediante electroforesis en gel. Para los tres pares de sgRNA en dirección 5’/dirección 3’ analizados, se detectaron productos de PCR que indican la presencia de deleciones genómicas esperadas, que estaban ausentes en las células transfectadas con los sgRNA de control (FIG. 4A). Estos resultados demuestran que los sgRNA emparejados y SpCas9 son capaces de eliminar la mutación c.2991+1655A>G. El análisis de secuenciación de próxima generación (NGS) de las 4 muestras de PCR preparadas a partir de las células mutantes reveló además que el 60,7%, el 65,9% y el 72,4% de las lecturas de NGS se alinearon con el ADN truncado en las células transfectadas con U1D1, U1D2 y U1D3, respectivamente. Por lo tanto, los tres pares de sgRNA y SpCas9 son muy eficaces para eliminar la mutación c.2991+1655A>G.
Para confirmar que los sgRNA emparejados pudieron rescatar los niveles de expresión del CEP290 de tipo salvaje en células heterocigotas y mutantes, células de tipo salvaje, heterocigotas y mutantes se transfectaron con los plásmidos que expresan sgRNA emparejados y SpCas9, seguido de análisis mediante RT-qPCR para ARNm de CEP290 como se describió anteriormente. Los resultados se normalizaron a los niveles de expresión de ARNm de PPIA.
En comparación con los sgRNA de control, los pares de sgRNA, especialmente el par U1D3, rescataron notablemente los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje (FIG. 5A) y los niveles de ARNm de CEP290 mutante reducidos (FIG.
5B) en células heterocigotas y mutantes. Es importante destacar que ninguno de los tres pares de sgRNA cambió significativamente los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje (FIG. 5A), lo que sugiere que las deleciones genómicas específicas no interfirieron con el ayuste normal de transcritos de CEP290. El par U1D3 sgRNA rescató notablemente los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje en células heterocigotas y mutantes a niveles comparables a los de las células de tipo salvaje (FIG. 5A). El par U1D2 sgRNA también aumentó significativamente los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje en células heterocigotas (FIG. 5A). Los tres pares de sgRNA redujeron significativamente los niveles de ARNm de CEP290 mutante en células heterocigotas (FIG. 5B). Los pares de U1D2 y U1D3 sgRNA redujeron significativamente los niveles de ARNm de CEP290 mutante en células MT (FIG. 5B).
Para confirmar que los sgRNA emparejados pudieron rescatar la expresión de la proteína CEP290 de tipo salvaje en células mutantes, las células mutantes se transfectaron con sgRNA emparejados y SpCas9, y después se sometieron a análisis de transferencia Western como se describe anteriormente. En comparación con los sgRNA de control, los tres pares de sgRNA rescataron la expresión de la proteína CEP290 (FIG. 5C).
Tomados en conjunto, estos datos demuestran que los pares de sgRNA en dirección 5’/dirección 3’, especialmente el par U1D3, son altamente eficientes para prevenir el ayuste del exón críptico mutante y restaurar la expresión de CEP290 de tipo salvaje. Estos resultados demuestran que un par de ARN guía acoplados con Cas9 pueden eliminar de forma permanente la región del intrón que flanquea la mutación c.2991+1655 A>G de CEP290 para prevenir el ayuste del exón críptico insertado en el ARNm de CEP290.
Ejemplo 3: Desarrollo de un sistema de CRISPR-Cas9 autolim itante para lim itar el tiempo de persistencia de SpCas9
Métodos
Plásmidos
Se construyó un plásmido de empaquetamiento de AAV pAAV-minCMV-SpCas9-NLS-SV40 pA para el sistema de Crispr-Cas9 autolimitante. Brevemente, GeneArt (Life Technologies) sintetizó un fragmento de ADN que contiene un fragmento de promotor mínimo derivado del promotor CMV (promotor minCMV) (SEQ ID NO: 56), y se insertó en los sitios de restricción MluI y ApoI del plásmido Sigma pSpCas9 descrito anteriormente para generar un plásmido pminCMV-SpCas9-NLS-BGH pA. A continuación, GeneArt (Life Technologies) sintetizó un fragmento de ADN que contiene la señal poli(A) temprana de SV40 (SV40 pA) (SEQ ID NO: 57), y lo insertó en los sitios de restricción XhoI y BbsI del plásmido anterior para generar un plásmido pminCMV-SpCas9-NLS-SV40 pA. Finalmente, el fragmento minCMV-SpCas9-NLS-SV40 pA se subclonó en un plásmido de empaquetamiento de AAV para generar un pAAV-minCMV-SpCas9-NLS-SV40 pA.
Para construir el plásmido pSpCas9 autolimitante, las secuencias de reconocimiento para la nucleasa SpCas9 (secuencias diana de U1 y D3 sgRNA más motivos PAM correspondientes; SEQ ID NOS: 58-59) se subclonaron en el sitio de inserción 1 (entre el promotor minCMV y SpCas9) y/o el sitio de inserción 2 (entre la señal de localización nuclear (NLS) de SpCas9 y la señal de poli(A) de Sv 40).
El segundo plásmido de empaquetamiento de AAV para el sistema de CRISPR-Cas9 autolimitante es pAAV-U6-U1 sgRNA-U6-D3 sgRNA-BGH pA. Para construir este plásmido, el fragmento U6-U1 sgRNA-U6-D3 sgRNA se cortó del plásmido pSpCas9(BBUD)-U1 D3 usando las enzimas de restricción Pcil y KpnI, y después se subclonó en los sitios EcoRV y KpnI del plásmido de empaquetamiento de AAV para generar un plásmido pAAV-U6-U1 sgRNA-U6-D3 sgRNA. Para fines de titulación de AAV, se clonó un fragmento BGH pA (SEQ ID NO: 60) en los sitios SpeI y HindIII de este plásmido.
Resultados
CRISPR-Cas9 es una poderosa herramienta para la edición del genoma, pero no está claro cómo los pacientes tolerarán la expresión de la proteína bacteriana Cas9. CRISPR-Cas9 funciona rápidamente (horas a días), y no es necesaria su presencia prolongada en las células. Las respuestas inmunitarias no deseadas y los posibles problemas de seguridad pueden deberse a la expresión prolongada de proteína exógena. Por ejemplo, la expresión de la proteína marcadora exógena proteína fluorescente verde (GFP) puede provocar respuestas inmunológicas no deseadas sustanciales (Stripecke R et al. (1999) Gene Ther. 6:1305-1312). Además, un informe reciente sugirió que existe una inducción de inmunidad humoral contra Cas9 y la posible presencia de una respuesta inmune celular específica de Cas9 después de la administración in vivo de CRISPR-Cas9 (Wang, D. et al. (2015) Hum. Gene Ther. 26:432-442). Por lo tanto, un enfoque de "hit and go" en el que se restringe la exposición a la proteína Cas9 puede ser beneficioso para la administración in vivo de CRISPR-Cas9. Tal enfoque de "hit and go" también puede reducir los efectos fuera de la diana, ya que esto reducirá el tiempo de interacción entre Cas9 y las dianas no deseadas.
Para este fin, se desarrollío un sistema de CRISPR-Cas9 autolimitante para limitar el tiempo de persistencia de SpCas9 mediante la incorporación de sitio o sitios de reconocimiento para el o los sgRNA en el propio vector SpCas9, de modo que el vector se cortará y destruirá poco después de que comienza la expresión de SpCas9. El sistema de Crispr-Cas9 autolimitante comprende de dos vectores: un vector pAA V-U6-U1 sgRNA-U6-D3 sgRNA que expresa el par U1 y D3 de sgRNA, y un vector pAAV-minCMV-SpCas9-NLS-SV40 pA que expresa una SpCas9 impulsada por el promotor minCMV. Las secuencias de reconocimiento para el U1 y/o D3 sgRNA (secuencias diana más motivos PAM correspondientes) se incorporan en uno o dos de los dos sitios de inserción en el segundo vector. El sitio de inserción 1 está ubicado entre el promotor minCMV y la secuencia codificante de SpCas9, y el sitio de inserción 2 está ubicado entre la señal de localización nuclear (NLS) y la señal de poli(A) de SV40 (FIG. 6A). Por lo tanto, en este sistema de Crispr-Cas9 autolimitante, los U1 y D3 sgRNA guiarán la proteína SpCas9 tanto para la eliminación genómica dirigida como para la escisión del propio vector de SpCas9 autolimitante, lo que evitará que el vector produzca un exceso de proteína SpCas9.
Para probar el sistema de Crispr-Cas9 autolimitante in vitro, las células mutantes se transfectaron con los dos vectores descritos anteriormente, seguido de un análisis de transferencia Western (FIG. 6B), PCR de ADN genómico (FIG. 6C), y análisis de RT-qPCR para ARNm de CEP290 (FIG. 6D&6E) como se describió anteriormente.
Cuando se insertó una sola secuencia de reconocimiento de sgRNA (U1T o D3T; SEQ ID NOS: 58-59) en el vector de SpCas9 autolimitante, los niveles de proteína SpCas9 se redujeron considerablemente en comparación con el vector de control SpCas9 que no contiene la secuencia de reconocimiento de sgRNA (FIG. 6B). Cuando se insertaron dos U1T, dos D3T o D3T y U1T combinados en el vector de SpCas9 autolimitante, el nivel de proteína SpCas9 casi se eliminó (FIG. 6B). Por lo tanto, el sistema de CRISPR-Cas9 autolimitante puede restringir efectivamente la expresión de SpCas9.
Para confirmar que el sistema de Crispr-Cas9 autolimitante todavía es capaz de inducir la eliminación genómica dirigida y eliminar la mutación c.2991+1655A>G de LCA10, se lleva a cabo un análisis de PCR de ADN genómico en las células mutantes transfectadas con vectores duales (FIG. 6C). La banda de PCR correspondiente al ADN truncado estaba presente tanto en las células transfectadas con el vector SpCas9 de control como en las células transfectadas con los vectores de SpCas9 autolimitantes, lo que sugiere que el sistema de CRISPR-Cas9 autolimitante todavía es capaz de eliminar la mutación intrónica de LCA10 a pesar del corto tiempo de persistencia de SpCas9. Cabe destacar que la deleción genómica observada en FIG. 6C no fue tan robusta como la deleción observada en FIG. 4A. Esto podría deberse a las diferentes condiciones experimentales en estos dos estudios. Primero, usamos un vector todo en uno en FIG. 4A, y usamos vectores duales en FIG. 6C. En segundo lugar, la expresión de SpCas9 fue impulsada por un promotor de CMV en FIG. 4A e impulsada por un promotor minCMV en FIG. 6C.
A continuación, los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje y mutante en células mutantes transfectadas con los vectores duales. En comparación con los U1D3 sgRNA solos (control), el vector de control SpCas9 rescató significativamente los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje en las células mutantes (FIG. 6D). De manera similar, el vector SpCas9 que contiene la secuencia de reconocimiento de D3 sgRNA en cualquiera de los sitios de inserción aumentó significativamente los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje (FIG. 6D). Otros vectores SpCas9 autolimitantes también aumentaron los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas en comparación con el control (FIG. 6D). Además, todos los vectores SpCas9 autolimitantes y el vector SpCas9 de control redujeron significativamente los niveles de ARNm de CEP290 mutante (FIG. 6E).
Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el sistema de Crispr-Cas9 autolimitante puede restringir el tiempo de persistencia de SpCas9, eliminar la mutación LCA10 c.2991+1655A>G, rescatar la expresión de CEP290 de tipo salvaje, y reducir la expresión de CEP290 mutante.
Ejemplo 4: Eliminación dirigida de una región intrónica de gen Cep290 de ratón en la reina del ratón
Métodos
Plásmidos
Se usa un sistema de AAV dual para la eliminación genómica dirigida en la retina del ratón. El primer AAV se produce con el plásmido de empaquetamiento de AAV pAAV-minCMV-SpCas9-NLS-SV40 pA como se describe anteriormente. El segundo AAV se produce con un plásmido de empaquetamiento de AAV pAAV-U6-U11 sgRNA-U6-D11 sgRNA-RK-EGFP-BGH pA. Para construir este plásmido, la secuencia guía de U11 sgRNA (SEQ ID NO: 61) y la secuencia guía de D11 sgRNA (SEQ ID NO: 62) se subclonaron en el plásmido pSpCas9(BBUD) como se describe anteriormente para generar un plásmido pSpCas9(BBUD)-U11D11. Se insertó un fragmento de promotor RK -EGFP-BGH pA (SEQ ID NO: 63) en los sitios KpnI y XhoI de este plásmido, y después todo el casete U6-U11 sgRNA-U6-D11 sgRNA-RK-EGFP-BGH pA se cortó de este plásmido usando las enzimas de restricción Pcil y PmeI, y después se subclonó en los sitios BamHI y SphI del plásmido de empaquetamiento de AAV descrito anteriormente para generar el plásmido final. También se generó un plásmido de control pAAV-RK-EGFP-BGH pA.
Producción de AA V
Los vectores de AAV recombinantes se produjeron mediante transfección triple de células 293 de carcinoma de riñón embrionario humano (HEK-293) como se describió anteriormente (Xiao, X. et al. (1998) J. Virol. 72:2224-2232). Brevemente, se usaron un plásmido de empaquetamiento de AAV, un plásmido que contenía el gen rep del serotipo 2, y un gen de la cápside del serotipo 5, y un plásmido adenoviral auxiliar (Stratagene). El virus se recogió 72 horas después de la transfección, se purificó mediante cromatografía de afinidad AVB Sepharose (GE Healthcare). Los títulos de copia del genoma (GC) de los vectores de AAV se determinaron mediante análisis de PCR cuantitativo basado en TaqMan (Applied Biosystems) como se describió anteriormente (Gerits, A. et al. (2015) Neurophotonics.
2:031209).
Animales
Se adquirieron ratones hembra C57BL/6J de 8-10 semanas de edad de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME), y se mantuvieron en el vivero de Sanofi. Los animales tuvieron acceso libre a alimentos y agua durante el tiempo del estudio. Todos los procedimientos con animales se realizaron de conformidad con la Ley de Bienestar Animal, la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, la Oficina de Bienestar Animal de Laboratorio, y de acuerdo con la Declaración ARVO para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y de la Visión.
Inyección de AA V subretiniana
Los ratones se sedaron usando isoflurano al 3,5% transportado en 800 mililitros/min de oxígeno administrado al animal a través de un cornete nasal. Se indujo midriasis y cicloplejía en ratones con una aplicación tópica de Tropicamide (Alcon, Fort Worth, TX). Se hizo una incisión piloto en la córnea y se dirigió una aguja de punta roma de calibre 33 a través de la incisión, y se avanzó posteriormente entre el iris y la cápsula del cristalino hasta que la punta penetró en la retina neurosensorial posterior. 1 x109 partículas del genoma viral de AAV5-minCMV-SpCas9-NLS-SV40 pA (AAV5-SpCas9 en FIG. 7A) junto con 1x109 partículas del genoma viral de AAV5-U6-U11 sgRNA-U6-D11 sgRNA-RK-EGFP-BGH pA (AAV5-U11 D11 -RK-EGFP en FIG. 7A) o el AAV5-U6-RK-EGFP-BGH pA (AAV5-RK-EGFP de control en FIG.
7B) se suministraron al ojo OS de cada ratón en el volumen de un microlitro durante el tiempo de un segundo. La aguja se mantuvo en su posición durante aproximadamente cinco segundos antes de retirarla. Se dejó que el animal se recuperara de la anestesia antes de regresar a su jaula.
La expresión de EGFP en la retina se evaluó en animales vivos utilizando un microscopio retinal Micron IV (Phoenix Research Labs) dos y cuatro semanas después de la inyección, y los ratones que carecían de expresión de EGFP se excluyeron del estudio. Todos los animales se sacrificaron cuatro semanas después de la inyección.
Disección de retina
Los ojos de los ratones se enuclearon y se colocaron en disolución salina amortiguada con fosfato (PBS). Las retinas se aislaron con microtijeras de disección bajo un microscopio de disección. La capa de epitelio pigmentario de la retina (RPE) se eliminó cuidadosamente.
Expresión de ADN genómico y análisis de PCR
Las retinas se homogeneizaron en disolución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre) con manos de mortero accionadas por un motor inalámbrico (VWR). El ADN genómico se extrajo siguiendo las instrucciones del fabricante (Epicentre), se diluyó a 10 nanogramos/microlitro, y después se amplificó con GoTaq Hot Start Green Master Mix (Promega) y cebadores de PCR que flanqueaban la región eliminada (SEQ ID NOS: 64-65). La amplificación de los productos de la PCR se logró con los siguientes parámetros de ciclo: 1 ciclo a 95°C durante 2 min; 35 ciclos de 95°C durante 30 s, 62°C durante 30 s y 72°C durante 2 min; 1 ciclo a 72°C durante 12 min. A continuación, los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa.
Resultados
Nuestro estudio en el modelo celular de LCA10 apoyó la eficiencia de nuestro enfoque de sgRNA emparejados y SpCas9 para eliminar la mutación LCA10 c.2991+1655A>G in vitro. A continuación, se evalúa nuestro enfoque CRISPR-Cas9 en una configuración in vivo. Dado que actualmente no existe un modelo animal que exprese el exón críptico causado por la mutación de ayuste intrónico LCA10, se prueba si un par de sgRNA junto con SpCas9 podrían inducir una eliminación genómica dirigida en el intrón 25 del gen Cep290 de ratón, que es homólogo al intrón 26 del gen CEP290 humano en el que se encuentra la mutación c.2991+1655A>G.
Decidimos usar vectores de AAV para la administración de genes in vivo debido a su baja inmunogenicidad e intervalo de serotipos que permiten la infección preferencial de ciertos tipos de células. Las células de la retina más afectadas por las mutaciones de CEP290 son fotorreceptores, y estudios previos han demostrado que el serotipo 5 de AAV (AAV5) podría transducir fotorreceptores de manera eficiente con inyección subretiniana (Boye, S.E. et al. (2012) Hum. Gene Ther. 23:1101-1115). Por lo tanto, decidimos usar AAV5 para suministrar SpCas9 y sgRNA emparejados a los fotorreceptores.
Debido a la baja capacidad de empaquetamiento de un vector de AAV (-4,8 kb) y la longitud de la secuencia de codificación de SpCas9, que mide 4,1 kb (véase SEQ ID NO: 40 para la secuencia de aminoácidos), es un reto empaquetar un componente de SpCas9 y dos componentes de U6-sgRNA en un solo vector de AAV. Por lo tanto, utilizamos un sistema de AAV dual para nuestro estudio de validación in vivo (FIG. 7A). El primer vector de AAV es AA V5-U11D11 -RK-EGFP, que expresa un U11 sgRNA en dirección 5’ (SEQ ID NO: 61) y un D11 sgRNA en dirección 3’ (SEQ ID NO: 62), así como un gen informador de EGFP dirigido por un promotor de rodopsina cinasa (RK). Se predice que el par de U11 y D11 sgRNA generará una eliminación genómica de 557 pb en el intrón 25 del gen Cep290 de ratón. También se produjo un AAV de control AAV5-RK-EGFP. El segundo vector de AAV es AAV5-SpCas9, que expresa un SpCas9 impulsado por el promotor minCMV.
AAV5-U11D11-RK-EGFP (o AAV5-RK-EGFP) y AAV5-SpCas9 (1x109 partículas del genoma viral cada una) se coinyectaron en el espacio subretiniano de ratones adultos C57BL/6J. La expresión de EGFP en la retina se evaluó en animales vivos, y los ratones que carecían de expresión de EGFP se excluyeron del estudio. Cuatro semanas después de la inyección, se sacrificó a los animales, y se extrajo el ADN genómico de las retinas, seguido de un análisis de PCR usando cebadores que flanqueaban las regiones de deleción (SEQ ID NOS: 64-65). Los fragmentos genómicos truncados y de tipo salvaje se resolvieron mediante electroforesis en gel. Para los animales inyectados con AAV5-U11D11-RK-EGFP y AAV5-SpCas9, se detectó un producto de PCR que indica la presencia de la deleción genómica esperada con el par de U11 y D11 sgRNA, que estaba ausente en los animales inyectados con AAV5-RK-EGFP y AAV5-SpCas9 (FIG. 7B). Estos resultados demuestran que nuestro sistema de AAV dual es capaz de inducir la eliminación genómica dirigida in vivo.
Ejemplo 5: Empleo de un par de sgRNA en dirección 5’/dirección 3’ y SaCas9 para elim inar la mutación c.2991+1655A>G de LCA10
Métodos
Plásmidos
Para construir el plásmido de SaCas9, se sintetizó un fragmento de armazón minCMV-SaCas9-NLS-FLAG-BGH pA-U6-BsaI:BsaI-sgRNA (SEQ ID NO: 66) en GenScript, y se subclonó en los sitios de restricción Pcil y BbsI del plásmido pSpCas9 de Sigma para reemplazar el casete CMV-SpCas9-BGH pA y generar un plásmido pminCMV-SaCas9-BGH pA-U6. Se identificaron cinco secuencias guía de sgRNA (aU1, aU2, aU3, aD1, aD2; SEQ iD NOS: 45-49) utilizando la herramienta de diseño de edición del genoma en línea de Benchling, y después se subclonaron en los dos sitios de restricción Bsal del plásmido anterior. Para emparejar los sgRNA en dirección 5’ (aU1, aU2, aU3) y los sgRNA en dirección 3’ (aD1, aD2), el casete U6-aD1 sgRNA y el casete U6-aD2 sgRNA se cortaron de sus plásmidos usando las enzimas de restricción Kpnl y Notl, y después se sublonaron en el sitio Notl del plásmido que expresa aU1, aU2 o aU3 sgRNA. Como resultado, generamos seis plásmidos que expresan seis pares de sgRNA diferentes (aU1aD1, aU1aD2, aU2aD1, aU2aD2, aU4aD1, aU4aD2). Finalmente, los fragmentos de sgRNA emparejados con minCMV-SaCas9-BGH pA-U6 en estos seis plásmidos se subclonaron en un plásmido de empaquetamiento de AAV para generar plásmidos de sgRNA emparejados con pAAV-minCMV-SaCas9-BGH pA-U6. También se generó un plásmido de control pAAV-minCMV-SaCas9-BGH pA que no expresa sgRNA.
Resultados
A partir de los estudios anteriores, hemos demostrado que un par de sgRNA en dirección 5’/dirección 3’ podrían guiar de manera eficiente a SpCas9 para eliminar la mutación c.2991+1655A>G de LCA10 y restaurar la expresión de CEP290 de tipo salvaje. La longitud de la secuencia de codificación de SpCas9 (~4,1 kb) dificulta el empaquetamiento de un componente minCMV-SpCas9 y dos componentes U6-sgRNA en un solo vector de AAV. Ran et al. (Ran, F.A. et al. (2015) Nature 520:186-191) descubrió recientemente una enzima Cas9 más corta, Cas9 de S. aureus (SaCas9; 1053 aminoácidos; SEQ ID NO: 55), que también muestra actividad de escisión en células de mamífero. El tamaño más pequeño de SaCas9 hace posible empaquetar un componente minCMV-SaCas9 y dos componentes U6-sgRNA en un solo vector de AAV. Para probar si los sgRNA emparejados y SaCas9 también pueden eliminar la mutación intrónica de LCA10, diseñamos tres secuencias guía de sgRNA en dirección 5’ (aU1, aU2, aU3; SEQ ID NOS: 45-47) y dos secuencias guía de sgRNA en dirección 3’ (aD1, aD2; SEQ ID NOS: 48-49) específicamente para SaCas9 usando la herramienta de diseño de edición de genoma en línea de Benchling. Los sgRNA en dirección 5’/dirección 3’ se emparejaron y subclonaron en el plásmido de empaquetamiento de AAV. Los mismos plásmidos también expresaron un SaCas9 impulsado por el promotor minCMV y optimizado por codón humano (SEQ ID NO: 66).
Los plásmidos sgRNAs emparejados-SaCas9 se transfectaron en células mutantes como se describe anteriormente. Para comparar SaCas9 con SpCas9, las células mutantes también se transfectaron con los plásmidos duales de SpCas9 AAV (pAAV-minCMV-SpCas9 pAAV-par U1D3 sgRNA) o plásmidos individuales solos. El análisis de PCR se realizó usando cebadores que flanqueaban las regiones de deleción (SEQ ID NOS: 4-5). Los fragmentos genómicos truncados y de tipo salvaje se resolvieron mediante electroforesis en gel. Para los pares de sgRNA en dirección 5’/dirección 3’ analizados, se detectaron productos de PCR que indican la presencia de deleciones genómicas esperadas, que estaban ausentes en las células transfectadas con los plásmidos de control (FIG.8A). Estos resultados demuestran que tanto SaCas9 como SpCas9 pueden trabajar con sgRNA emparejados para eliminar la mutación de ayuste intrónico de LCA10.
A continuación, examinamos los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje y mutante en células mutantes transfectadas con plásmidos de empaquetamiento de AAV anteriores. Sorprendentemente, ninguno de los pares de sgRNA en dirección 5’/dirección 3’ aumentó significativamente los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje en comparación con el plásmido SaCas9 solo, aunque el par aU2aD1 y el par aU2aD2 mostraron una tendencia de aumento (FIG. 8B). Por el contrario, los plásmidos AAV duales para SpCas9 rescataron significativamente los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje en comparación con plásmidos individuales (FIG. 8B). Todos los plásmidos sgRNAs emparejados-SaCas9 redujeron significativamente los niveles de ARNm de CEP290 mutante en comparación con el plásmido SaCas9 solo (FlG. 8C). De manera similar, los plásmidos AAV duales para SpCas9 redujeron significativamente los niveles de ARNm de CEP290 mutante en comparación con plásmidos individuales (FlG. 8C). Aunque en el estudio actual SaCas9 no es tan eficiente como SpCas9 en el rescate de los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje en células mutantes, no podemos excluir la posibilidad de que un potente par de sgRNA pueda guiar a SaCas9 para eliminar de manera eficiente la mutación de ayuste intrónico de LCA10 y rescatar significativamente los niveles de ARNm de CEP290 de tipo salvaje en células mutantes.
SECUENCIAS
Todas las secuencias nucleicas se presentan de 5’ a 3’, a menos que se indique lo contrario.
Todas las secuencias de aminoácidos se presentan de N-terminal a C-terminal a menos que se indique lo contrario.
Oligonucleótido de hebra superior para sgRNA utilizado en la reparación dirigida por homología (HDR) (SEQ ID NO: 1)
caccgAAGACACTGCCAATAGGGAT
Oligonucleótido de hebra inferior para sgRNA utilizado en la reparación dirigida por homología (HDR) (SEQ ID NO: 2)
aaacATCCCT ATT GGCAGTGTCTT c
molde de HDR (SEQ ID NO: 3)
Figure imgf000055_0001
Cebador de ácido nucleico directo del intrón 26 de CEP290 (SEQ ID NO: 4) GGTCCCTGGCTTTTGTTCCT
Cebador de ácido nucleico inverso del intrón 26 de CEP290 (SEQ ID NO: 5) CAGGAGGCTGAGGGTGTTTT
Cebador de secuenciación del intrón 26 de CEP290 (SEQ ID NO: 6)
AGTAGAGATGGGGTTTCACC
Cebador de ácido nucleico directo de CEP290 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 7) TGACTGCTAAGTACAGGGACATCTTG
Cebador de ácido nucleico inverso de CEP290 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 8) AGGAGATGTTTTCACACTCCAGGT
Cebador de ácido nucleico directo de CEP290 mutante (SEQ ID NO: 9) CTGGCCCCAGTTGTAATTTGTGA
Cebador de ácido nucleico inverso de CEP290 mutante (SEQ ID NO: 10) CTGTTCCCAGGCTTGTTCAATAGT
Oligonucleótido de cadena superior para el U1 sgRNA (SEQ ID NO: 11) caccGGCGGGTGGATCACGAGTTC
Oligonucleótido de cadena inferior para el U1 sgRNA (SEQ ID NO: 12) aaacGAACTCGTGATCCACCCGCC
Oligonucleótido de cadena superior para el D1 sgRNA (SEQ ID NO: 13) caccgAAAGCTACCGGTTACCTGAA
Oligonucleótido de cadena inferior para el D1 sgRNA (SEQ ID NO: 14) aaacTTCAGGTAACCGGTAGCTTTc
Oligonucleótido de cadena superior para el D2 sgRNA (SEQ ID NO: 15) caccgTCATTCTTGTGGCAGTAAGG
Oligonucleótido de cadena inferior para el D2 sgRNA (SEQ ID NO: 16) aaacCCTTACTGCCACAAGAATGAc
Oligonucleótido de cadena superior para el D3 sgRNA (SEQ ID NO: 17)
caccGGAGTCACATGGGAGTCACA
Oligonucleótido de cadena inferior para el D3 sgRNA (SEQ ID NO: 18)
Figure imgf000056_0006
secuencia de U1 sgRNA (SEQ ID NO: 19)
Figure imgf000056_0005
secuencia de D1 sgRNA (SEQ ID NO: 20)
Figure imgf000056_0004
secuencia de D2 sgRNA (SEQ ID NO: 21
Figure imgf000056_0003
secuencia de D3 sgRNA (SEQ ID NO: 22)
Figure imgf000056_0002
secuencia del intrón 26 de CEP290 (Nota: la mutación c.2991+1655A>G es el 1655° nucleótido en esta secuencia, y está en negrita y subrayado) (SEQ ID NO: 23)
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
s
Figure imgf000057_0002
ecuencia de ITR mutada (SEQ ID NO: 24)
Secuencia tracr (SEQ ID NO: 25)
Figure imgf000057_0003
Secuencias de NLS
PKKKRKV (SEQ ID NO: 26)
PKKKRKVEDPKKKRKVD (SEQ ID NO: 27)
Cebador de ácido nucleico directo para la mutación del sitio de restricción BbsI (SEQ ID NO: 28) GGGAGGATT GGGAAGAGAAT AGCAGGCATGCT G
Cebador de ácido nucleico inverso para la mutación del sitio de restricción BbsI (SEQ ID NO: 29) CAGCATGCCTGCTATTCTCTTCCCAATCCTCCC
casete de promotor U6-BbsI:BbsI-sgRNA armazón-terminador U6 para construir pSpCas9(BB), con la
Figure imgf000058_0001
secuencia del promotor U6 subrayada (SEQ ID NO: 30)
Cebador de ácido nucleico directo de PPIA (SEQ ID NO: 31)
TTCATCTGCACTGCCAAGAC
Cebador de ácido nucleico inverso de PPIA (SEQ ID NO: 32)
TCGAGTTGTCCACAGTCAGC
promotor U6-BbsI:BbsI-sgRNA armazón-terminador U6-promotor CMV para construir pSpCas9(BBU), con la secuencia del promotor U6 y del promotor CMV subrayada (SEQ ID NO: 33)
Figure imgf000058_0002
cebador de ácido nucleico directo para construir pSpCas9(BBD) (SEQ ID NO: 34) ATAACATGTGGTCTCACTCTAGAGGCATGTGAGGGCCTATTTCCC
cebador de ácido nucleico inverso para construir pSpCas9(BBD) (SEQ ID NO: 35) TATGGTACCGGTCTCATAGAGCCATTTGTCTGCAGA
oligonucleótido de hebra superior para el sgRNA de control 1 (SEQ ID NO: 36) caccGCACTACCAGAGCTAACTCA
oligonucleótido de hebra inferior para el sgRNA de control 1 (SEQ ID NO: 37) aaacTGAGTTAGCTCTGGTAGTGC
oligonucleótido de hebra superior para el sgRNA de control 2 (SEQ ID NO: 38) caccgTGCGAATACGCCACGCGAT
oligonucleótido de hebra inferior para el sgRNA de control 2 (SEQ ID NO: 39)
aaacATCGCGTGGCGTATTCGCAc
secuencia de aminoácidos de Cas9 de S. pyogenes (SEQ ID NO: 40)
Figure imgf000059_0001
Secuencia guía/protoespaciadora de U1 sgRNA (SEQ ID NO: 41) GGCGGGTGGATCACGAGTTC
Secuencia guía/protoespaciadora de D1 sgRNA (SEQ ID NO: 42)
AAAGCTACCGGTTACCTGAA
Secuencia guía/protoespaciadora de D2 sgRNA (SEQ ID NO: 43)
TCATTCTTGTGGCAGTAAGG
Secuencia guía/protoespaciadora de D3 sgRNA (SEQ ID NO: 44) GGAGTCACATGGGAGTCACA
Secuencia guía/protoespaciadora de aU1 sgRNA (SEQ ID NO: 45) TTTAACGTTATCATTTTCCCA
Secuencia guía/protoespaciadora de aU2 sgRNA (SEQ ID NO: 46) AGTTTCATTCTGTCACCCAGG
Secuencia guía/protoespaciadora de aU3 sgRNA (SEQ ID NO: 47) AAAAATTAGCCGGGCATGATG
Secuencia guía/protoespaciadora de aD1 sgRNA (SEQ ID NO: 48) TGTAAGACTGGAGATAGAGAC
Secuencia guía/protoespaciadora de aD2 sgRNA (SEQ ID NO: 49) CTTTTGACAGTTTTTAAGGCG
secuencia de aU1 sgRNA (SEQ ID NO: 50)
Figure imgf000059_0002
secuencia de aU2 sgRNA (SEQ ID NO: 51)
Figure imgf000060_0001
secuencia de aU3 sgRNA (SEQ ID NO: 52
Figure imgf000060_0002
secuencia de aD1 sgRNA (SEQ ID NO: 53)
Figure imgf000060_0003
secuencia de aD2 sgRNA (SEQ ID NO: 54)
Figure imgf000060_0004
secuencia de aminoácidos de Cas9 de S. aureus (SEQ ID NO: 55)
Figure imgf000060_0005
Q Q secuencia de promotor minCMV-SpCas9 para construir pAAV-minCMV-SpCas9-NLS-SV40 pA, con el promotor minCMV subrayado (SEQ ID NO: 56)
Figure imgf000060_0006
secuencia de pA de SV40 para construir pAAV-minCMV-SpCas9-NLS-SV40 pA, con señal de poli(A)
Figure imgf000060_0007
temprana de SV40 subrayada (SEQ ID NO: 57)
secuencia de reconocimiento de U1 sgRNA (U1T; secuencia guía de U1 sgRNA PAM) (SEQ ID NO: 58) GGCGGGTGGATCACGAGTTCAGG
secuencia de reconocimiento de D3 sgRNA (D3T; secuencia guía de D3 sgRNA PAM) (SEQ ID NO: 59) GGAGTCACATGGGAGTCACAGGG
Fragmento que contiene pA de BGH, con BGH pA subrayado (SEQ ID NO: 60)
Figure imgf000060_0008
Secuencia guía/protoespaciadora de U11 sgRNA (SEQ ID NO: 61)
GCAT AAGGACT AAAGACCT A
Secuencia guía/protoespaciadora de D11 sgRNA (SEQ ID NO: 62)
GGTAGTGGTTGAACTCACAA
fragmento del promotor RK-intrón quimérico-EGFP- pA de BGH (SEQ ID NO: 63)
Figure imgf000061_0001
cebador de ácido nucleico directo del intrón 25 de Cep290 de ratón (SEQ ID NO: 64) CCCCTCGCCTGTACTGAAAG
cebador de ácido nucleico inverso del intrón 25 de Cep290 de ratón (SEQ ID NO: 65) GCACATCATCTGAGGCAGGT
fragmento de armazón minCMV-SaCas9-NLS-FLAG-BGH pA-U6-BsaI:BsaI-sgRNA, con las secuencias minCMV y SaCas9 subrayadas (SEQ ID NO: 66)
Figure imgf000062_0001

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para uso en un método para tratar la amaurosis congénita de Leber (LCA) en un individuo, que comprende:
a) un ácido nucleico que codifica un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)-asociada a CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas) modificado, que comprende un primer ARN guía y un segundo ARN guía, en el que el primer ARN guía y el segundo ARN guía se hibridan con hebras opuestas de secuencias de ADN diana que flanquean una mutación intrónica en un gen CEP290; y
b) un casete de expresión de Cas que comprende:
i) una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas, y
ii) un primer sitio diana del ARN guía, en el que el primer ARN guía o el segundo ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía;
en la que la proteína Cas se expresa a partir del casete de expresión Cas;
en la que la proteína Cas escinde las secuencias de ADN diana que flanquean la mutación, escindiendo así una porción del ADN diana que comprende la mutación; y
en la que la proteína Cas escinde el casete de expresión Cas en el primer sitio diana del ARN guía, reduciendo así la expresión de la proteína Cas, en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión Cas.
2. Una composición para uso en un método para escindir un ácido nucleico diana en una célula, que comprende: a) un ácido nucleico que codifica un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)-asociada a CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas) modificado, que comprende un primer ARN guía y un segundo ARN guía, en el que el primer ARN guía y el segundo ARN guía se hibridan con hebras opuestas de secuencias de ADN diana que flanquean una mutación intrónica en un gen CEP290; y
b) un casete de expresión de Cas que comprende:
i) una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas, y
ii) un primer sitio diana del ARN guía, en el que el primer ARN guía o el segundo ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía;
en la que la proteína Cas se expresa a partir del casete de expresión Cas;
en la que la proteína Cas escinde las secuencias de ADN diana que flanquean la mutación, escindiendo así una porción del ADN diana que comprende la mutación; y
en la que la proteína Cas escinde el casete de expresión Cas en el primer sitio diana del ARN guía, reduciendo así la expresión de la proteína Cas, en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión Cas.
3. La composición para uso según las reivindicaciones 1 o 2, en la que el casete de expresión de Cas comprende además: iii) un segundo sitio diana de ARN guía, en el que el primer ARN guía o el segundo ARN guía se hibrida con el segundo sitio diana de ARN guía;
en la que la proteína Cas escinde el casete de expresión de Cas en el primer y el segundo sitio diana del ARN guía, reduciendo así la expresión de la proteína Cas, en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión de Cas; y
en la que
el primer ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía y el segundo sitio diana del ARN guía;
el segundo ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía y el segundo sitio diana del ARN guía; o el primer ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía, y el segundo ARN guía se hibrida con el segundo sitio diana del ARN guía.
4. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en la que el casete de expresión de Cas comprende además una secuencia de poliadenilación (poliA) ligada operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas, y en la que la escisión del primer o segundo sitio diana del ARN guía por la proteína Cas interrumpe la ligación operativa entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y la secuencia de poliA.
5. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en la que:
(i) el CEP290 comprende la mutación intrónica profunda de la secuencia expuesta en SEQ ID NO:23;
(ii) el primer ARN guía está codificado por ADN que comprende las secuencias de SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, or SEQ ID NO:52;
(iii) el segundo ARN guía está codificado por ADN que comprende las secuencias de SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:53, o SEQ ID NO:54.
(iv) el primer ARN guía y/o el segundo ARN guía que comprenden se fusionan con una secuencia transactivante cr (tracr), opcionalmente en la que la secuencia tracr comprende la secuencia nucleotídica codificada por SEQ ID NO:25; (v) el ácido nucleico que codifica el primer ARN guía, el segundo ARN guía y la proteína Cas se expresan en células eucariotas;
(vi) el ácido nucleico que codifica el primer ARN guía, el segundo ARN guía y/o la proteína Cas están ligados operativamente a uno o más elementos de control reguladores;
(vii) el primer ARN guía y/o el segundo ARN guía están ligados operativamente a un promotor de ARN polimerasa III, opcionalmente en el que el promotor de ARN polimerasa III es un promotor U6, 7SK o HI;
(viii) el ácido nucleico que codifica la proteína Cas está ligado operativamente a un promotor de ARN polimerasa II, opcionalmente en el que el promotor de ARN polimerasa II es un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un fragmento de promotor mínimo derivado del promotor de CMV (promotor minCMV), una LTR del RSV, una LTR del MoMLV, un promotor de fosfoglicerato cinasa-1 (PGK), un promotor del virus simio 40 (SV40), un promotor de CK6, un promotor de transtirretina (TTR), un promotor de TK, un promotor de respuesta a tetraciclina (TRE), un promotor de HBV, un promotor de hAAT, un promotor de LSP, promotores quiméricos específicos del hígado (LSP), un promotor de E2F, un promotor de EF1 a, un promotor de telomerasa (hTERT), un promotor de ponteciador del citomegalovirus/beta-actina de pollo/promotor de p-globina de conejo (CAG), un promotor de opsina de bastones, un promotor de opsina de cono, un promotor de beta fosfodiesterasa (PDE), un promotor de la retinitis pigmentosa (RP1), o un promotor del gen de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (IRBP).
6. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en la que la proteína Cas es una proteína Cas9, opcionalmente en la que
(i) la proteína Cas 9 es una proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes, una proteína Cas9 de Staphylococcus aureus, una proteína Cas9 de Streptococcus thermophilus, una proteína Cas9 de Neisseria meningitidis, o una proteína Cas9 de Treponema denticola; y/o
(ii) Cas9 tiene codones optimizados para la expresión en una célula eucariota, una célula de mamífero o una célula humana.
7. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el sistema de CRISPR-Cas comprende además una o más señales de localización nuclear (NLS), opcionalmente en la que:
(i) la proteína Cas comprende una o más NLS;
(ii) la NLS es una secuencia C-terminal en el antígeno T grande de SV40; o
(iii) la NLS comprende la secuencia PKKKRKV (SEQ ID NO:26) o PKKKRKVEDPKKKRKVD (SEQ ID NO:27).
8. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en la que el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas están ubicados en el mismo vector o en diferentes vectores del sistema, opcionalmente en la que el vector es un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV), un vector adenoviral recombinante, un vector lentiviral recombinante, o un vector de virus herpes simple recombinante (HSV).
9. La composición para uso según la reivindicación 8, en la que el vector es un vector de AAV recombinante (rAAV), y en la que el ácido nucleico que codifica uno o más del primer ARN guía, el segundo ARN guía o la proteína Cas está flanqueado por uno, dos o más secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de AAV.
10. La composición para uso según la reivindicación 9, en la que las ITR de AAV son las ITR de serotipo de cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrhlO, AAV11, AAV 12, AAV2R471A, AAV DJ, un AAV de cabra, AAV bovino, o AAV de ratón, y en la que el vector está encapsulado en una partícula viral, y la partícula viral de AAV comprende:
(i) una cápside de serotipo rAAV2/HBoV1 de cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrhlO, AAV11, AAV 12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, un AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérica, AAV bovina, o a Av de ratón; o (ii) una cápside de AAV1, AAV2, AAV8, AAVrh8R, AAV9 y/o AAVrhlO, que comprende opcionalmente una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparano, en el que el vector es un vector autocomplementario.
11. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la composición se administra en el ojo del individuo, opcionalmente en el que la administración es subretiniana o intravítrea.
12. Un kit que comprende la composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
13. Un método in vitro para escindir un ácido nucleico diana en una célula, que comprende suministrar a la célula una cantidad eficaz de una composición que comprende:
a) un ácido nucleico que codifica un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)-asociada a CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas) modificado, que comprende un primer ARN guía y un segundo ARN guía, en el que el primer ARN guía y el segundo ARN guía se hibridan con hebras opuestas de secuencias de ADN diana que flanquean una mutación intrónica en un gen CEP290; y
b) un casete de expresión de Cas que comprende:
i) una secuencia nucleotídica que codifica una proteína Cas, y
ii) un primer sitio diana del ARN guía, en el que el primer ARN guía o el segundo ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía;
en la que la proteína Cas se expresa a partir del casete de expresión Cas;
en la que la proteína Cas escinde las secuencias de ADN diana que flanquean la mutación, escindiendo así una porción del ADN diana que comprende la mutación; y
en la que la proteína Cas escinde el casete de expresión Cas en el primer sitio diana del ARN guía, reduciendo así la expresión de la proteína Cas, en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión Cas.
14. El método de la reivindicación 13, en el que el casete de expresión de Cas comprende además:
iii) un segundo sitio diana del ARN guía, en el que el primer ARN guía o el segundo ARN guía se hibrida con el segundo sitio diana del ARN guía;
en la que la proteína Cas escinde el casete de expresión de Cas en el primer y el segundo sitio diana del ARN guía, reduciendo así la expresión de la proteína Cas, en comparación con la expresión de la proteína Cas antes de la escisión del casete de expresión de Cas, y
en donde:
el primer ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía y el segundo sitio diana del ARN guía el segundo ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía y el segundo sitio diana del ARN guía, o el primer ARN guía se hibrida con el primer sitio diana del ARN guía, y el segundo ARN guía se hibrida con el segundo sitio diana del ARN guía.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13-14, en el que el casete de expresión de Cas comprende además una secuencia de poliadenilación (poliA) ligada operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas, en el que la escisión del primer o segundo sitio diana del ARN guía por la proteína Cas interrumpe la ligación operativa entre la secuencia nucleotídica que codifica la proteína Cas y la secuencia de poliA.
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