ES2953527T3 - Optimización de un biosensor de evanescencia - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un dispositivo adaptado para detectar la presencia de complejos fluorescentes de moléculas y ligandos probados en una longitud de onda emitida, en el que la luz emitida se atenúa en la longitud de onda de esta luz emitida. El dispositivo según la invención comprende para este fin uno o varios filtros ópticos que tienen orientaciones específicas con respecto al camino óptico. La presente invención también incluye un método de diagnóstico que utiliza el dispositivo antes mencionado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Optimización de un biosensor de evanescencia

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método de ensayo y a un dispositivo de ensayo, adaptados para la realización de diagnósticos. En particular, se refiere a inmunoensayos que tienen una sensibilidad mejorada en comparación con los inmunoensayos conocidos.

Técnica relacionada

El análisis de sangre humana en busca de marcadores específicos es un método de uso común que respalda los diagnósticos médicos. Se toma una muestra de sangre del paciente y, a continuación, se analiza en un laboratorio para determinar la presencia o ausencia de un marcador de diagnóstico o la cuantificación de un marcador. Para distinguirlos de los procedimientos de diagnóstico in vivo realizados en el propio paciente, los ensayos de laboratorio se conocen como diagnósticos in vitro, comúnmente abreviados como IVD. Una tecnología de ensayos IVD usada comúnmente es ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas) usada para determinar numerosos marcadores en fluidos biológicos y, de esta manera, para respaldar un diagnóstico médico. El ELISA y las tecnologías relacionadas son de uso generalizado. Todos los ELISA usan un pocillo sólido de un volumen de aproximadamente 200 microlitros para examinar una muestra de un paciente. Estos pocillos están realizados en polímeros orgánicos, tal como poliestireno, mediante un proceso de moldeo por inyección.

Los formatos de ensayo típicos usados para los ensayos ELISA inmunológicos son ensayos de tipo sándwich, ensayos competitivos o ensayos de anticuerpos. Un ensayo de tipo sándwich usa dos ligandos, normalmente un par de anticuerpos, ambos específicos para la proteína a medir, cuyos ejemplos son ensayos para la determinación de gonadotropina criónica humana beta, HCG beta, otras hormonas tales como una hormona folículo-estimulante (FSH), hormona luteinizante (LH), los marcadores de infección proteína C reactiva CRP o procalcitonina PCT, proteínas marcadoras para ataque cardiaco, tales como troponina I y troponina T o mioglobina.

Además, los analitos bien conocidos son compuestos de bajo peso molecular, tales como esteroides, fármacos, estupefacientes o vitaminas. Entonces, los ensayos se diseñan como ensayos competitivos.

Los ensayos de anticuerpos son, por ejemplo, la detección de anticuerpos antivirales, dirigidos contra proteínas de virus, tales como el VIH, el VHB o el VHC, o los anticuerpos antibacterianos o antiparasitarios. Además, los ensayos de anticuerpos se usan para la medición de anticuerpos autoinmunes o IgE relacionada con alergias.

Los principios de los diferentes formatos de ELISA son comparables. Un ligando está unido al interior de un pocillo ELISA. Un segundo ligando está en solución y puede reaccionar con el ligando unido o con un analito que se ha unido al ligando inmovilizado. Para un ELISA, el ligando en solución se acopla covalentemente a una enzima, tal como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina.

La difusión hace que el ligando marcado en solución se mueva a las superficies del pocillo y reaccione con el ligando unido a la superficie. Se realiza un ensayo típico en el que, después de un cierto tiempo de reacción, 30-120 min, la solución de analito con exceso de ligando marcado se retira y el pocillo se lava con una solución tampón.

El conjugado ligando-enzima unido y fijado al pocillo se mide haciéndolo reaccionar con un sustrato cromogénico adecuado, proporcionando un producto coloreado adecuado para la cuantificación.

Las ventajas de ELISA son una sensibilidad y una especificidad elevadas. Los límites de detección analíticos vienen determinados por los ligandos y sus afinidades. Un componente importante para la calidad son las composiciones de los tampones usados y pueden medirse analitos en el intervalo de 10exp-6 mol/l y 10exp-12 mol/l, en casos excepcionales se han alcanzado límites de detección de 10exp-13 mol/l. A pesar de todas las ventajas de ELISA, la necesidad de numerosas etapas de trabajo es una desventaja. Se requieren varias etapas de pipeteo y lavado para eliminar el exceso de ligandos no unidos y el tiempo para la obtención del resultado está comprendido típicamente en el intervalo de horas antes de que pueda leerse un resultado. Durante este tiempo, un médico responsable del tratamiento debe esperar a un resultado de IVD que apoye o descarte su diagnóstico clínico y, por lo tanto, se retrasa una terapia dirigida basada en evidencias.

Un método mejorado para analitos clínicos es el uso de biosensores. Un método popular es el uso de excitación de campo de evanescencia de analitos unidos y la detección de moléculas unidas en tiempo real, tal como se describe en los documentos EP1079226, EP1204856, EP1371967. Las aplicaciones para ensayos se describen en el documento EP2 639584 y también, por ejemplo, por Schawaller et al. J Allergy Clin Immunol. 2018.

El método se refiere a un formato de inmunoensayo heterogéneo similar a ELISA y se basa en la interacción de un ligando unido a una superficie que reacciona de manera no covalente con al menos un ligando de la solución en contacto con la superficie. La reacción tiene lugar en un pocillo producido a partir de un material sólido ópticamente transparente, tal como vidrio, o preferiblemente realizado a partir de un polímero orgánico, tal como poliestireno, mediante moldeo por inyección. Mientras que el ligando en la solución para un ELISA se marca con una enzima que en la fase de desarrollo revela de manera cuantitativa la enzima unida y, por lo tanto, el analito en ELISA, el biosensor de evanescencia usa la detección de fluorescencia como principio de medición.

El ligando en solución se marca de manera fluorescente y, cuando se une a la superficie de la superficie del detector, el marcador se excita con una fuente de luz adecuada, preferiblemente de longitud de onda de 635 nm, y la fluorescencia emitida se supervisa de manera continua usando un instrumento dedicado. El método permite la supervisión continua en tiempo real de una reacción de unión bioquímica. Esto proporciona varias ventajas, tales como una excitación específica del ligando marcado con fluorescencia unido y, por lo tanto, de los analitos en presencia de un exceso de ligando no unido en la solución. Un resultado sensible y cuantitativo se mide típicamente después de 10 a 20 minutos o, en un entorno más favorable, incluso en un tiempo menor de 10 minutos, mientras que un resultado de ELISA está disponible solo después de horas.

Otra ventaja es que, después de añadir la muestra del paciente y el segundo ligando fluorescente, no se requieren etapas de manipulación de líquidos adicionales como en ELISA. En particular, no se requieren etapas de lavado ni de adición de sustratos enzimáticos. El método usa soluciones acuosas, tales como PBS, puras o con reactivos adicionales, tales como, por ejemplo, detergentes, tensioactivos, proteínas o potenciadores de reacción. Las muestras a medir pueden ser orina, saliva, suero plasmático o sangre solubilizada con detergente.

La principal ventaja de la tecnología radica en el hecho de que, después de la adición de todo el reactivo y para la lectura de la reacción de unión, todos los reactivos están en el pocillo y la señal se mide en presencia de exceso de reactivo de detección presente en el pocillo de medición. Esto se diferencia de ELISA, donde el reactivo detector en exceso añadido debe ser retirado del pocillo antes de que pueda usarse un sustrato detector para visualizar el agente detector unido específicamente. Esto se hace normalmente eliminando el exceso de reactivo detector seguido por varias etapas de lavado para eliminar del pocillo esencialmente todo el exceso de reactivo detector no unido presente. La cantidad de ligando detector, cuando se compara con el ligando detector unido y generador de señal, es mayor que 1. De hecho, su presencia es mayor de 10 veces y, de hecho, puede ser varios órdenes de magnitud mayor que la cantidad real del detector de señal unido al analito.

El documento EP3460456 describe un dispositivo óptico con un fotodetector que comprende una pila de filtros de interferencia.

El documento WO2008099339 divulga un biosensor adaptado para radiaciones fluorescentes.

El documento JP2019039993 describe un biosensor en el que la luz emitida se filtra según su ángulo de incidencia.

El documento de M Schawaller et al. “Evanescent wave-based technology for the rapid detection and sensitive quantification of biological analytes” J. Allergy Clin. Inmunol. Vol 141, n° 2, páginas 817-820, proporciona información general acerca de los métodos de biodetección.

La medición de una pequeña señal específica en la señal de fondo de una gran cantidad de exceso de detector es una tarea técnica desafiante y todavía no se ha resuelto una optimización cuidadosa de la reducción de la señal no específica del exceso de reactivo.

Breve divulgación de la invención

Un objetivo de la presente invención es la provisión de un dispositivo que supere las deficiencias y las limitaciones del estado de la técnica.

Otro objetivo de la invención es la provisión de un método que permita detectar un ligando unido en presencia de un ligando no unido.

La presente invención tiene como objetivo además proporcionar un método rápido y fiable que permita reducir el número de etapas en comparación con los métodos conocidos.

En particular, el presente método permite una reducción óptima de la luz difusa.

Según un aspecto, el presente método y el presente dispositivo permiten reducir la intensidad de la luz de excitación que se mide en la unidad de detección. Por ejemplo, en el diseño presentado, la trayectoria óptica de las luces de excitación no se dirige directamente hacia la unidad detectora. Además, una abertura puede limitar la cantidad de luz de excitación que irradia hacia el detector. Todavía otra manera adecuada de reducir la intensidad de la luz de excitación que entra a la superficie del detector es hacer uso de la diferente longitud de onda de la luz EXC de excitación en base a que la luz fluorescente emitida tiene una longitud de onda diferente. Cuando es absorbida por el fluoróforo, la luz de excitación de longitud de onda de 635 nm genera una luz emitida que tiene una longitud de onda diferente en comparación con la luz de excitación. En particular, puede tener una longitud de onda más larga. Esto puede usarse de manera favorable para filtrar los fotones de excitación en función de la energía como discriminador y, por lo tanto, como discriminador de la longitud de onda. Esto se consigue típicamente mediante el uso de un filtro específico de longitud de onda y filtros paso banda. Dichos filtros paso banda o filtros de interferencia pueden estar fácilmente disponibles comercialmente.

Estos filtros se colocan en el haz de luz de emisión de manera que estén dispuestos perpendicularmente en un ángulo de p =90 grados con respecto a la luz emitida dirigida hacia la unidad de detección. De manera alternativa, uno o varios de los filtros ópticos están inclinados en un ángulo diferente de 90° con respecto a la trayectoria óptica.

El dispositivo reivindicado en el presente documento está adaptado para detectar la presencia de complejos fluorescentes de moléculas y ligandos en una longitud de onda emitida, dicho dispositivo comprende un haz emisor de luz adaptado para irradiar los complejos fluorescentes en dicha longitud de onda emitida, y un detector adaptado para detectar la fluorescencia de los complejos. El dispositivo reivindicado comprende además al menos un filtro óptico que permite absorber específicamente las longitudes de onda de la luz emitida. El término "absorber" debería entenderse como absorber o reducir parcialmente la intensidad de la luz emitida.

Preferiblemente, el presente dispositivo permite detectar los complejos fluorescentes de las moléculas de ensayo y el ligando unido en presencia de ligando fluorescente no unido. Los ligandos fluorescentes no unidos incluyen el ligando que permanece en la solución de ensayo o unido de manera no covalente sobre el soporte, en sitios diferentes de la molécula sometida a ensayo.

El al menos un filtro 101, 201 óptico del presente dispositivo puede disponerse de manera que el plano de su superficie sea ortogonal a la trayectoria de la luz. En una disposición preferida, el presente dispositivo comprende un primer filtro óptico, adaptado para absorber o atenuar específicamente la luz emitida, en el que dicho primer filtro óptico está dispuesto en un ángulo ortogonal a la trayectoria óptica. De manera alternativa, el primer filtro óptico puede disponerse de manera que su superficie plana forme un ángulo con respecto a la trayectoria de la luz mayor de 10 grados y diferente de 90 grados.

El presente dispositivo comprende además dos o más unidades de filtrado óptico individuales que absorben la luz emitida en la longitud de onda de dicha luz emitida. Estas unidades de filtrado individuales pueden ser filtros ópticos idénticos o diferentes al primer filtro óptico. Preferiblemente, son específicos para la longitud de onda de la luz emitida.

En una realización preferida, las unidades de filtrado individuales, dispuestas además del primer filtro óptico, están orientadas de manera que el plano de su superficie esté inclinado con respecto a la trayectoria óptica en un ángulo mayor de 10 grados, preferiblemente mayor de 20 grados, y diferente de 90. Las unidades de filtrado individuales se colocan preferiblemente después del primer filtro óptico en la trayectoria de la luz emitida. Ambas unidades de filtrado individuales tienen una orientación angular diferente del primer filtro óptico. Preferiblemente, las orientaciones de cada una de estas unidades de filtrado individuales difieren entre sí.

En particular, los ángulos de inclinación de la unidad de filtrado individual están girados entre sí más de 30 grados con respecto al eje óptico. Más particularmente, los ángulos de inclinación de la unidad de filtrado individual están girados entre sí en más de 15 grados y menos de 180 grados, o en más de 30 y menos de 120 grados. Los ángulos de inclinación de las unidades de filtrado individuales pueden girarse entre sí, por ejemplo, en un ángulo de 90 grados.

La presente divulgación abarca también un método de detección de un complejo de una molécula sometida a ensayo y un ligando específico unido a dicha molécula sometida a ensayo. En el presente método, el complejo que comprende la molécula sometida a ensayo y el ligando se inmoviliza sobre una superficie. De esta manera, el presente método comprende una etapa de inmovilización del complejo de la molécula sometida a ensayo y su ligando. Esta etapa de inmovilización puede comprender, por ejemplo, la etapa de presentar una superficie que contiene al menos un compañero L1 de reacción unido a la superficie, seguida de poner en contacto dicha superficie con una solución que contiene la molécula a ensayar y un ligando L2 marcado con fluorescencia. El ligando marcado con fluorescencia se une al ligando L2 inmovilizado sobre la superficie, bien solo o bien en combinación con la molécula a ensayar para formar un complejo.

El presente método incluye una etapa de irradiación, en la que la superficie que comprende el complejo inmovilizado de la molécula sometida a ensayo y su ligando fluorescente se irradia a una longitud de onda predeterminada. En esta etapa de irradiación, la intensidad de la luz emitida es atenuada por medio de uno o más filtros ópticos, dispuestos tal como se ha descrito anteriormente. Esta etapa de irradiación puede ocurrir sin etapas de lavado, lo que significa que la mezcla que comprende ligandos fluorescentes libres, ligando fluorescente unido individualmente sobre la superficie y complejos de ligando inmovilizado y moléculas sometidas a ensayo es sometida a la irradiación.

A continuación, la fluorescencia resultante es detectada en una etapa de detección, usando un detector óptico adecuado. El detector óptico puede ser específico de la longitud de onda del complejo fluorescente de la molécula sometida a ensayo y su ligando. La longitud de onda del complejo fluorescente de la molécula sometida a ensayo y su ligando puede ser idéntica a la longitud de onda de la luz emitida o diferente de la longitud de onda de la luz emitida. La longitud de onda del complejo fluorescente de la molécula sometida a ensayo y su ligando es preferiblemente diferente de la longitud de onda de la luz emitida que es atenuada por el dispositivo descrito anteriormente.

Breve descripción de los dibujos

Las realizaciones ejemplares de la invención se divulgan en la descripción y se ilustran mediante los siguientes dibujos:

• Figura 1: Vista esquemática del dispositivo según la presente invención;

• Figuras 2a, 2b, 2c: Vista esquemática del dispositivo según la presente invención según una realización;

• Figuras 3a, 3b, 3c: Vista esquemática del dispositivo según la presente invención según otra realización;

• Figura 4: Vista esquemática del dispositivo según la presente invención según otra realización.

Ejemplos de realizaciones de la presente invención

La Fig. 1 muestra la unidad óptica básica usada. La luz emitida desde el dispositivo biosensor hY EX llega al filtro 101 de interferencia. Este filtra la mayoría de los fotones de excitación en base a la longitud de onda y la luz que sale del filtro de interferencia en la parte inferior se enriquece en luz hY EM que constituye la señal útil para el analito fluorescente. La señal útil debería entenderse como la señal específica desde el ligando unido. Pasando a través de una abertura 102 opcional, la luz se mide a continuación usando el detector 103 de luz. Esta disposición es una disposición funcional, pero son posibles mejoras adicionales.

La Figura 2 muestra posibles disposiciones alternativas de filtros de interferencia. La Fig. 2a muestra un filtro plano, la Fig. 2b muestra un filtro 202 inclinado con respecto al haz de luz de la Fig. 1 y la Fig.2c muestra un segundo filtro 203 inclinado. El segundo filtro inclinado difiere del filtro 202 girado que está en el eje xy en 90 grados de manera que los ejes de inclinación forman un ángulo de 90 grados cuando se proyectan sobre el eje xy. Los ángulos p y el ángulo a en los que los filtros se inclinan contra la superficie xy pueden elegirse libremente. Preferiblemente a = p > 10 grados y a = p ≤ 80 grados, más preferiblemente a = p está comprendido entre 10 y 80 grados, más preferiblemente entre 20 y 60 grados e incluso más preferiblemente entre 30 y 45 grados.

La Fig. 3 muestra una posible combinación de 2 filtros de interferencia, tal como se muestra en la Fig. 2. Los filtros representados en la Fig.2b, designados 202, y el filtro 203 de la Fig.2c se combinan en una unidad de filtro de interferencia que consiste en 2 filtros 301 y 302. La Fig. 3a muestra una vista tridimensional de la disposición de los filtros. La Fig. 3b muestra la misma disposición de filtros desde la vista superior a lo largo del eje z mirando hacia abajo a la superficie xy y la Fig. 3c muestra el lado de la misma unidad que forma el lado derecho en la dirección del eje x sobre la superficie yz.

La Fig. 4 es una disposición de tres filtros que comprende un filtro 401 de disposición plana según la Fig. 2a más un segundo filtro 402 inclinado que representa la subunidad 202 de la Figura 2b más un tercer filtro 403 inclinado que representa la subunidad 203 de filtro de la Figura 2c.

El ángulo de inclinación del filtro de interferencia con respecto a la superficie xy, es decir, el ángulo de alfa a en la Figura 2c, respectivamente beta p en la Fig. 2b, tiene valores variables. Cuando se mide una configuración de filtro con a = p = 30 grados en comparación con un filtro plano en la orientación de la superficie xy, se observa una reducción de al menos 2-3 veces en la luz difusa. Además, la variación del ángulo de a=p=30 es aproximadamente dos veces más efectiva para reducir la luz difusa en comparación con una combinación de filtros inclinados con una inclinación de a=p=15 grados.

El dispositivo de la presente divulgación es una mejora en comparación con un diseño de filtro de interferencia individual. En particular, comprende más de un filtro de interferencia. Se usan al menos dos filtros de interferencia en tándem e inclinados en diferentes ángulos con respecto a la luz emitida, de manera que su ángulo p sea diferente de grado y estén inclinados entre 15 y 30 grados en el eje del ángulo de inclinación con respecto a la dirección de la luz emitida. Además, cuando los dos filtros están dispuestos de dicha manera, el eje de inclinación del filtro 1 se gira 90 grados con respecto al ángulo de inclinación del filtro 1. Sorprendentemente, se observa que una combinación de dos filtros conduce a un filtrado muy mejorado y más efectivo de la luz difusa proveniente del dispositivo. Incluso más eficaz para filtrar la luz difusa se muestra en la Fig.4 en una combinación de un filtro 401 de disposición plana combinado con un primer filtro 402 inclinado y combinado con un segundo filtro 403 inclinado con una inclinación de 90 grados.

Tabla 1

Los ejemplos resumidos mostrados en la Tabla 1 muestran un fondo muy reducido que se origina desde la luz de excitación residual derivada que entra al detector de luz. Cuando se compara la eficacia de bloqueo, la unidad de filtro triple es aproximadamente 70 veces más eficaz bloqueando la luz difusa no deseada. Además, la variación de la señal de fondo se reduce de una manera similar y, de esta manera, permite detectar señales incluso muy bajas desde el fondo. Lo mismo se aplica a la señal de fondo, que se reduce, y se mejora la relación señal/ruido desde 14,0 para el dispositivo de un filtro a 45,3 para el dispositivo de tres filtros, es decir, en al menos un factor de 3.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Dispositivo biosensor adaptado para detectar analitos fluorescentes unidos, dicho dispositivo comprende unos medios emisores de luz adaptados para irradiar los analitos fluorescentes unidos a una longitud de onda emitida, y un detector (103) adaptado para detectar una fluorescencia de dichos analitos unidos a la longitud de onda emitida, en el que dicho analito unido se une a un ligando marcado con fluorescencia para formar un complejo fluorescente.

Caracterizado porque comprende:

- un filtro (201,401) de interferencia plano dispuesto en un ángulo ortogonal a la trayectoria óptica o en un ángulo con respecto a la trayectoria de la luz mayor de 10° y diferente de 90°, adaptado para absorber o atenuar específicamente la luz emitida,

- un primer filtro (202, 402) de interferencia inclinado y un segundo filtro (203, 403) de interferencia inclinado, estando dichos filtros de interferencia inclinados, primero y segundo, orientados de manera que el plano de las superficies correspondientes esté inclinado con respecto a la trayectoria óptica en un ángulo mayor de 10° y diferente de 90°, teniendo dichos filtros de interferencia inclinados, primero y segundo, una orientación diferente a la de dicho filtro de interferencia plano y adaptados para absorber la luz emitida en la longitud de onda de dicha luz emitida, y en el que el eje inclinado de dichos filtros de interferencia inclinados primero (202, 402) y segundo (203, 403) se giran entre sí más de 15 grados y menos de 180 grados, y permiten filtrar la mayoría de las longitudes de onda de la luz emitida para enriquecerla con longitudes de onda correspondientes a los analitos unidos.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que dichos filtros de interferencia inclinados primero (202, 402) y segundo (203, 403), o en el que dicho filtro (201) de interferencia plano, filtros de interferencia inclinados primero (202, 402) y segundo se combinan para formar una unidad de interferencia.

3. Dispositivo según una de las reivindicaciones anteriores en el que dichos filtros de interferencia inclinados primero y segundo están inclinados un ángulo mayor de 20 grados o mayor de 30 grados con respecto al eje óptico.

4. Dispositivo según una de las reivindicaciones anteriores y en el que los ángulos de inclinación giran entre sí en más de 30 y menos de 120 grados.

5. Dispositivo según una de las reivindicaciones anteriores y en el que los ángulos de inclinación giran entre sí 90 grados.

6. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los ángulos p y a en los que dichos filtros inclinados se inclinan contra la superficie ortogonal al eje óptico se seleccionan de manera que a = p > 10 grados y a = p ≤ 80 grados, o de manera que a = p esté comprendido entre 20 y 60 grados o entre 30 y 45 grados.

7. Método para determinar la presencia de una molécula sometida a ensayo, comprendiendo dicho método las etapas de

- hacer que la molécula sometida a ensayo forme un complejo con un ligando fluorescente e inmovilizar el complejo resultante de la molécula sometida a ensayo y el ligando fluorescente sobre una superficie,

- irradiar el complejo inmovilizado de la molécula sometida a ensayo y ligando fluorescente con una luz emitida a una longitud de onda predeterminada, y

- detectar la fluorescencia resultante del complejo de molécula sometida a ensayo y su ligando fluorescente unido, caracterizado porque las etapas de irradiación y detección se realizan por medio del dispositivo de una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la luz emitida es atenuada a la longitud de onda de la emisión de luz por medio de al menos un filtro óptico.

8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque la longitud de onda de la luz emitida difiere de la longitud de onda de la luz emitida por el complejo de molécula sometida a ensayo y ligando fluorescente bajo la luz emitida.

9. Método según una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque las etapas de irradiar el complejo inmovilizado de molécula ensayada y ligando fluorescente y detectar la fluorescencia resultante del complejo de molécula ensayada y su ligando fluorescente unido, ocurren en presencia de ligandos no unidos.

10. Método según una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque dicho método carece de etapas de lavado.

11. Método según una de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque se usa como método de diagnóstico.