ES2953857T3 - Péptidos cíclicos de unión a beta-amiloides y sus usos - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un péptido que comprende al menos un péptido que se une a una especie beta amiloide, teniendo el péptido una secuencia de aminoácidos que está en forma ciclada. Se divulga el uso de los péptidos en medicina, en particular para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Péptidos cíclicos de unión a p-amiloides y sus usos
La invención se refiere a péptidos cíclicos de unión a p-amiloides y su uso.
Estado de la técnica
La ciclación de péptidos mediada por inteína se conoce a partir del documento DE 69930164 T2.
A partir de DeMattos et al. (DeMattos, R.B., Bales, K.R., Cummins, D.J., Dodart, J.-C., Paul, S.M., Holtzman, D.M. (2001). Peripheral anti-A& antibody alters CNS and plasma A& dearance and decreases brain A& burden in a mouse model of Alzheimer's disease. En: PNAS, Vol. 98, S. 8850-8855.) se conocen anticuerpos anti-Ap para el tratamiento de la demencia de Alzheimer.
El documento WO 2013/021353 A1 da a conocer un péptido cíclico que impide la formación de amiloides.
El documento WO 01/34631 A2 da a conocer péptidos cíclicos para impedir la agregación amiloide péptidos cíclicos para impedir la agregación de amiloides.
KAPURNIOTU APHRODITE ET AL: "Conformational restriction via cyclization in beta-amyloid peptide Abeta(1-28) leads to an inhibitor of Abeta(1-28) amyloidogenesis and cytotoxicity.", CHEMISTRY & BIOLOGY FEB 2003, vol. 10, n.° 2, febrero de 2003 (2003-02), páginas 149-159 da a conocer un péptido cíclico beta-amiloide.
RAHIMIPOUR S ET AL: "In Vitro and Mechanistic Studies of an Anti-Amyloidogenic Self-Assembled Cyclic D,L-alpha-Peptide Architecture", BIOPOLYMERS, vol. 100, n.° 3, sp. col. SI, mayo de 2013 (2013-05), página 230 da a conocer péptidos D,L-alfa cíclicos específicos que se unen a Abeta.
El documento WO 02/081505 A2 da a conocer un péptido lineal para la unión a un beta amiloide para el diagnóstico y terapia de Alzheimer.
SIEVERS STUART A ET AL: "Structure-based design of non-natural amino-acid inhibitors of amyloid fibril formation", NATURE, NATURE PUBLISHING GROUP, UNITED KINGDOM, vol. 475, n.° 7354, 1 de julio de 2011 (2011-07-11), páginas 96-100 da a conocer inhibidores de formación fibrillas amiloides.
El documento WO 00/36093 A2 da a conocer la estabilidad de péptidos cíclicos.
El documento DE 102012102998 A1 da a conocer péptidos en forma lineal.
El documento DE 102012102999 A1 da a conocer péptidos en forma lineal.
El documento WO 2014/177127 A1 da a conocer un agente, que contiene al menos una sustancia que es adecuada para inhibir la formación de fibrillas amiloides que aumentan la eficiencia de la infección de un virus o destruirlas. Sin embargo, todavía no hay ningún fármaco disponible eficaz para el tratamiento de la demencia de Alzheimer (EA, demencia de Alzheimer, lat. Morbus Alzheimer). Los medicamentos que se utilizan son, en el mejor de los casos, capaces de aliviar algunos síntomas, pero no pueden ralentizar la progresión de la enfermedad, y mucho menos detenerla.
Hay una serie de sustancias que pueden lograr cierto éxito en la prevención, aunque no necesariamente en el tratamiento, de la demencia de Alzheimer en experimentos con animales.
Una característica de la enfermedad de Alzheimer son los depósitos extracelulares del péptido beta amiloide (péptido A-beta, AI3 o péptido AI3). Esta deposición del péptido Ap en las placas generalmente se encuentra post mortem en los cerebros de los pacientes con EA. Por lo tanto, se consideran diferentes formas del péptido A-beta como, por ejemplo, las fibrillas, responsables de la aparición y progresión de enfermedades. Además, desde hace algunos años, se ven pequeños oligómeros A-beta libremente difusibles como la causa principal del desarrollo y progreso de la EA. Los monómeros AI3 se forman constantemente en el cuerpo humano y probablemente no son tóxicos por sí mismos. Se especula si los monómeros Ap, dependiendo de su concentración, que en última instancia resulta de las velocidades de formación y degradación en el cuerpo, se acumulan de forma aleatoria y, por lo tanto, es más probable
que formen espontáneamente oligómeros Ap con la edad. Una vez formados, los oligómeros AI3 podrían a continuación multiplicarse a través de un mecanismo similar al de los priones y por último provocar la enfermedad. Actualmente, existen algunas sustancias que reducen la concentración de monómeros AI3 de distintas formas, por ejemplo, mediante la inhibición o modulación de Y-secretasa, anticuerpos de unión a AI3, etc., lo que obviamente es suficiente para que los experimentos con animales (en este caso los animales generalmente se tratan antes de que los síntomas de la enfermedad se presenten por completo) tengan un efecto efecto preventivo. En los ensayos clínicos de fase II y III en personas, solo se puede tratar a personas con un diagnóstico claro de la demencia de Alzheimer. Hasta ahora, todas estas sustancias han fallado en conseguir esto. Posiblemente porque después del inicio de la enfermedad, una reducción ligera o moderada de la concentración de monómero AI3 ya no es suficiente para prevenir la formación de cantidades cada vez mayores de oligómeros AH
Hasta ahora no se dispone de posibilidades de diagnosticar la demencia de Alzheimer antes del inicio de los síntomas. La demencia de Alzheimer se reconoce hoy en día principalmente mediante pruebas neuropsicológicas de la persona que ya padece síntomas de demencia. Además, se pueden excluir otras enfermedades, como traumatismos, mediante varios procedimientos de examen. Sin embargo, se sabe que los oligómeros Ap y las subsiguientes fibrillas y placas pueden desarrollarse en el cerebro de los pacientes hasta 20 años antes de la aparición de los síntomas, y pueden causar un daño irreversible. Las sondas moleculares que se inyectan por vía intravenosa en el paciente y que se unen a los oligómeros Ap y las placas después de atravesar la barrera hematoencefálica pueden visualizarse mediante procedimientos de obtención de imágenes y, por tanto, permiten un diagnóstico precoz de la demencia de Alzheimer. Por lo tanto, las sustancias que se unen a AI3 existentes son desventajosamente insuficientemente afines como para evitar la multiplicación de oligómeros AH
Como desventaja, tampoco existen sondas para el procedimiento de obtención de imágenes in vivo que se unan a especies Ap y las hagan visibles. Dado que los oligómeros Ap desempeñan un papel tan importante y temprano en la historia de la enfermedad, esto es precisamente lo conveniente.
Objeto de la invención
El objeto de la invención son los péptidos para
A) la terapia causal de la enfermedad de Alzheimer mediante prevención de la formación de oligómeros o agregados amiloides p (Ap) tóxicos y/o destoxificación de los mismos, o
B) proporcionar un diagnóstico fiable de la demencia de Alzheimer al proporcionar sondas para la obtención de imágenes in vivo.
A continuación, los términos «A-beta», «beta amiloide», «p- amiloide» y «Ap» se utilizan como sinónimos entre sí.
Solución del objeto
El objeto se consigue mediante los péptidos según la invención según la reivindicación 1 de la patente y mediante el kit, mediante la composición, mediante la sonda y los usos de los péptidos según las reivindicaciones dependientes. Las configuraciones ventajosas para ello resultan de las reivindicaciones que se refieren a las mismas.
Descripción de la invención
Los péptidos según la invención comprenden al menos un péptido que se une a una especie beta amiloide, donde el péptido presenta una secuencia de aminoácidos lineal que le permite unirse a A-beta, y esta propiedad se conserva o se mejora al estar el péptido en forma ciclada por enlace covalente, caracterizado por al menos una estructura según la secuencia con SEQ ID NO:5 en forma ciclada.
El péptido D3 con su secuencia lineal se conoce a partir de la publicación WO 02/081505 A2.
Ventajosamente, los péptidos según la invención consisten esencialmente en aminoácidos D-enantioméricos. Para los fines de la presente invención, el término «sustancialmente de aminoácidos D-enantioméricos» significa que los aminoácidos a usar están formados al menos en un 60 %, preferentemente en un 75 %, 80 %, con especial preferencia en un 85 %, 90 %, 95 %, en particular en un 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % por aminoácidos D-enantioméricos. En una configuración de la invención, el péptido ciclado según la invención se une a especies p-amiloides con una constante de disociación (valor Ko) de como máximo 1 μ M, preferiblemente 800, 600, 400, 200, 100, 10 nM,
particularmente preferiblemente 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 pM, particularmente más preferiblemente como máximo 50 pM, lo más preferiblemente como máximo se une a 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3,
2, 1 pM hasta sub-pM, donde se puede asumir cualquier valor intermedio.
La constante de disociación (valor Ko) del péptido ciclado se reduce ventajosamente en comparación con los péptidos de unión con una secuencia lineal, pero en particular en comparación con preferiblemente cada uno de los péptidos lineales de los que se puede derivar el péptido cíclico. A esto se asocian propiedades mejoradas de los péptidos según la invención, tales como afinidad de unión y eficacia de degradación y/o prevención de la formación de especies beta amiloides tóxicas. Esto se aplica en particular, pero no exclusivamente, a un valor Ko más bajo en el sitio de alta afinidad del A-beta (monómero, oligómero y fibrillas).
El péptido según la invención presenta ventajosamente una secuencia de aminoácidos en la que se produce la ciclación de la molécula lineal, p. ej., mediante unión covalente del primer al último aminoácido, p. ej., a través de una reacción de condensación. Por supuesto, hay otras formas de ciclación, p. ej., uniendo otros aminoácidos. La unión del segundo aminoácido con el último aminoácido se menciona solo a modo de ejemplo. Cualquier otra unión posible es igualmente concebible.
En caso de que el primer y el último aminoácido del péptido estén unidos, se propicia de forma ventajosa que no haya extremos abiertos en la cadena peptídica (secuencia de aminoácidos).
Esta medida también tiene el efecto de que todos los péptidos con secuencias de aminoácidos lineales que, después de la ciclación, dan como resultado la misma secuencia de aminoácidos indistinguible, son idénticos en este sentido.
Ejemplo: La secuencia lineal de aminoácidos del péptido D3 conocido es rprtrlhthrnr. El péptido ciclado correspondiente «cD3», unido por un enlace amida entre el grupo amino N-terminal y el grupo carboxilo C-terminal, ya no se puede distinguir de los péptidos ciclados prtrlhthrnrr, rtrlhthrnrrp, trlhthrnrrpr, rlhthrnrrprt, Ihthrnrrprtr, hthrnrrprtrl, thrnrrprtrlh, hrnrrprtrlht, rnrrprtrlhth, nrrprtrlhthr, o rrprtrlhthrn.
La fabricación de péptidos ciclados es estado de la técnica y se puede llevar a cabo, por ejemplo, según el procedimiento descrito en el documento DE 102005049537 A1.
La ciclación a través del primer y último aminoácido del péptido tiene el efecto ventajoso de que ya no hay extremos «abiertos» de la cadena del péptido, que a menudo son puntos de ataque para las actividades de degradación de péptidos en células, animales o seres humanos, p. ej., por aminopeptidasas y carboxipeptidasas.
Los péptidos ciclados tienen ventajosamente mayor estabilidad en animales y seres humanos que los péptidos lineales correspondientes. Sin embargo, este efecto por sí solo no es decisivo para la presente invención, como se explicará a continuación. Además, como se ha mostrado, también solo se aplica al caso de una ciclación de cabeza a cola o de cola a cabeza, en la que ambos extremos del péptido lineal se unen entre sí.
En el contexto de la invención se reconoció más bien que los péptidos ciclados según la invención, en comparación con péptidos de unión lineales a partir de los cuales se deriva el péptido ciclado, se unen con una mayor afinidad a las especies A-beta, aunque en particular también a los oligómeros p-amiloides particularmente tóxicos. Esto significa que el valor Ko de los péptidos ciclados es menor que el de los péptidos lineales y, en particular, es menor que el de los péptidos lineales de los que pueden derivarse.
En otra realización preferida de la invención, la afinidad de la unión de los péptidos ciclados según la invención aumenta en un 1 %, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, en particular 10 %, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,
26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, en particular 100 %, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110,
111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133,
134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156,
157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179,
180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, en particular
200 %, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221,222,
223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245,
246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268,
269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291,
292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, en particular 300 %, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311,
312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334,
335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357,
358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, en particular 400 %, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, incluso ventajosamente en un 500 %, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, en particular ventajosamente un 600 %, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608 , 609, 610, 611, 612 , 613 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694 695, 696, 697, 698, 699, en particular ventajosamente un 700 %, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, incluso en particular ventajosamente un 800 %, 801, 802 , 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881,882, 883, 884, 885, 886, 887, 888, 889, 890, 891,892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, incluso en particular ventajosamente un 900 %, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923, 924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 953, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 972, 973, 974, 975, 976, 977, 978, 979, 980, 981, 982, 983, 984, 985, 986, 987, 988, 989, 990, 991, 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, o incluso en un 1.000 %, o incluso en un 10.000 % o incluso hasta en un 100.000 % o 1.000.000 % en comparación con los péptidos lineales de los que pueden derivarse, donde se puede asumir cada valor intermedio. Esto se aplica en particular, pero no exclusivamente, a una afinidad más alta en el sitio de alta afinidad del A-beta (monómero, oligómero, fibrillas etc.).
Esto se indica mediante un valor Ko convenientemente reducido. El valor de Ko como medida de la afinidad de la unión del péptido ciclado a las especies beta amiloides y en particular al oligómero beta amiloide, en comparación con un péptido de unión lineal, preferiblemente con respecto a cada péptido de unión lineal a partir del cual se puede derivar el péptido ciclado, disminuye en un 1 %, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, en particular en un 10 %, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, en particular en un 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5 %, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 hasta en un 99,99 o incluso en un 99,999 %.
Estos valores Ko más bajos se refieren de forma ventajosa particularmente, pero no exclusivamente, al sitio de alta afinidad de las A-beta (monómero, oligómero, fibrillas, etc.).
Por lo tanto, los péptidos ciclados según la invención se pueden usar más eficazmente como sondas para fines de diagnóstico que los péptidos de unión lineales, en particular también más eficazmente que sus homólogos de péptidos lineales de los que pueden derivarse (misma secuencia de aminoácidos).
En particular, sin embargo, también pueden usarse como agentes terapéuticos de manera más eficiente que los péptidos lineales, en particular más eficientemente que sus homólogos de péptidos lineales de los que pueden derivarse.
En el contexto de la invención, se reconoció además que dichos péptidos ciclados según la invención en comparación con péptidos lineales, pero en particular en comparación con sus homólogos peptídicos con una secuencia lineal a partir de los cuales se pueden derivar, además también previenen con una mayor efectividad o eficacia la formación de oligómeros beta amiloides particularmente tóxicos o propician su destrucción y/o destoxificación. Esta eficacia se aumenta en particular en un 1 %, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, en particular en un 10 %, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,
83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, de forma particularmente ventajosa incluso en un 100 %.
Para ello se fracciona, por ejemplo, una muestra con los distintos confórmeros Ap en el caso más sencillo. En cada fracción, distintos confórmeros, como monómeros, oligómeros, fibrillas o agregados superiores, se enriquecen según la etapa de fraccionamiento y luego se pueden determinar con precisión.
El término «determinado exactamente» incluye una etapa de calibración en el fraccionamiento por moléculas de tipo y comportamiento conocidos. Después del fraccionamiento, solo queda presente un tipo de confórmeros Ap en cada fracción, p. ej., monómeros, oligómeros o fibrillas, etc.
Por ejemplo, en una centrifugación en gradiente de densidad como etapa de fraccionamiento, los confórmeros se separan según su valor s o coeficiente de sedimentación. Las moléculas de distintos tamaños pueden tener un radio hidrodinámico idéntico, pero aun así tienen distintos valores s y a continuación también se separan. Mediante calibración con moléculas de valor s conocido, los confórmeros Ap obtenidos mediante centrifugación en gradiente de densidad se determinan exactamente según su valor s.
A continuación, las fracciones obtenidas se tratan con y sin principio activo y, por ejemplo, se determinan mediante RP-HPLC. De esta manera se puede determinar la eficacia del principio activo.
A continuación, se presenta otro procedimiento. La denominada prueba QIAD (del inglés quantitative determination of interference with A(5 aggregate size distribution) puede utilizarse para el análisis cuantitativo de sustancias activas. El procedimiento para el análisis cuantitativo de la influencia de un principio activo en la distribución del tamaño de partícula de péptidos amiloides y/o proteínas en una muestra presenta las etapas siguientes. Primero, se permite la adición de A-Beta en condiciones controladas, de modo que se formen distintos agregados A-Beta. Las condiciones se eligen de modo que se forme un número particularmente grande de oligómeros A-beta pequeños, en particular citotóxicos. A continuación, se añade a la muestra la sustancia a examinar, por ejemplo, uno de los péptidos ciclados según la invención. El principio activo cambia la distribución del tamaño de partículas en la muestra. Este cambio se determina cuantitativamente. El cambio es una medida de la reducción o incluso la eliminación completa de determinadas especies tóxicas de un determinado tamaño de partícula. El procedimiento QIAD mide el aumento o la disminución de los agregados A-beta de un tamaño de partícula determinado. Si bien inicialmente estaban presentes en la muestra algunos agregados A-beta con un cierto tamaño, estos se reducen o incluso se eliminan por completo bajo la influencia del principio activo. Otros tamaños de partículas aumentan o permanecen constantes bajo la influencia del principio activo. Las partículas que se forman a partir de A-beta se separan preferiblemente entre sí según su radio hidrodinámico de las partículas. Ventajosamente, esto tiene el efecto de que se obtiene una pluralidad de fracciones a partir de la muestra. En las fracciones, las partículas están enriquecidas en péptidos amiloides y/o proteínas con un cierto tamaño agregado. Esta separación de las partículas se puede realizar mediante centrifugación en gradiente de densidad. Las fracciones se separan espacialmente unas de otras, p ej., mediante pipeteado. Finalmente, la concentración de A-beta en la fracción respectiva se determina mediante una desnaturalización completa de la especie A-beta durante una (RP-) HPLC de fase inversa realizada después del fraccionamiento. Los agregados se pueden desnaturalizar completamente, por ejemplo, con acetonitrilo al 30 % y ácido trifluoroacético al 0,1 % a una temperatura de columna de 80 °C y separarse en una columna C8 según la hidrofobicidad. La elución de A-beta se detecta mediante absorción UV a 215 nm. La integración del área de pico se puede realizar mediante el software Agilent Chemstation. La compensación de los valores resultantes con una calibración realizada previamente permite el cálculo de la concentración de A-beta en la fracción respectiva. Para cada fracción, el valor medio de varios, por ejemplo, seis, experimentos realizados independientemente entre sí se puede calcular con la desviación estándar resultante. La ventaja del análisis mediante HμLC es que se puede detectar con mucha sensibilidad (por ejemplo, aproximadamente 20 nM o 1,8 ng de AI31-42) y cuantificarse de forma fiable, independientemente del estado de agregación y del disolvente. Una ventaja decisiva del procedimiento es el acoplamiento de la centrifugación en gradiente de densidad y la HPLC de fase inversa, que también permite una cuantificación fiable de los oligómeros Ap. El efecto según la invención de una mayor eficacia de la eliminación (o formación) de especies beta amiloides y en particular de oligómeros beta amiloides puede producirse con uno de estos procedimientos, pero no exclusivamente con estos procedimientos.
En una realización particularmente preferida de la invención, los efectos mencionados de mayor afinidad y eficacia de la eliminación y destoxificación (o formación) incluso ocurren in vitro y/o in vivo.
El péptido ciclado puede presentar un grupo enlazador. El término grupo enlazador significa preferiblemente: aminoácidos individuales adicionales en moléculas tales como, p. ej., D3, que pueden usarse per se en el tratamiento de la demencia de Alzheimer para unirse a componentes A-beta. La unión del péptido ciclado a A-beta no debería
verse afectada por el aminoácido adicional.
A continuación, se muestran algunas secuencias ejemplares para péptidos cíclicos que se pueden usar, no obstante, no según la invención:
cD3: rprtrlhthrnr (SEQ ID NO: 8; no según la invención),
cRD2: ptlhthnrrrrr (SEQ ID NO: 3, no según la invención) o múltiplos y homólogos de los mismos.
En una configuración particularmente ventajosa de la invención, el péptido según la invención presenta al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más bloques de construcción de péptidos, cada uno de los cuales se une eficazmente a AI3 por separado, donde pueden ser bloques de construcción de péptidos idénticos o no idénticos. Estos bloques de construcción de péptidos están acoplados linealmente cabeza a cabeza, cola a cola o cabeza a cola y se ciclan como un todo por enlace covalente, con o sin bloques de construcción de enlazador adicionales (p. ej., uno o más aminoácidos), p. ej., sobre ambos extremos.
Los al menos dos conjuntos de péptido-monómero pueden ser a su vez covalentes o no covalentes, p. ej., estar unidos entre sí mediante un grupo biotina y un tetrámero de estreptavidina. Los péptidos se caracterizan por unidades que están acopladas linealmente cabeza a cabeza, cola a cola o cabeza a cola.
Según la invención es la secuencia
cD3, rprtrlhthrnrr (SEQ ID NO: 5)
Cualquier combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de estas secuencias en forma cíclica también puede formar el péptido según la invención.
Son de mencionar nada más que a modo de ejemplo, no según la invención:
cRD2D3: ptlhthnrrrrrrprtrlhthrnr (SEQ ID NO: 1)*
cD3D3: rprtrlhthrnrrprtrlhthrnr (SEQ ID NO: 2)*
cRD2: ptlhthnrrrrr (SEQ ID NO: 3)*
cRD2RD2, ptlhthnrrrrrptlhthnrrrrr (SEQ ID NO: 4)*
cD3p, rprtrlhthrnrp (SEQ ID NO: 6)*
cD3a, rprtrlhthrnra (SEQ ID NO: 7)*
cD3: rprtrl hthrnr (SEQ ID NO: 8)*
cDB3, rpitrlrthqnr (SEQ ID NO: 9)*
cDB3DB3, rpitrlrthqnrrpitrlrthqnr (SEQ ID NO: 10)*
cD3(p2k), rkrtrlhthrnr (SEQ ID NO: 11)*
o múltiplos y homólogos de los mismos.
(* = no según la invención)
Cualquier combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de las secuencias descritas anteriormente en forma ciclada también puede formar un péptido no según la invención.
Dado que la molécula diana del tratamiento terapéutico es preferiblemente un oligómero AI3 y, por tanto, naturalmente, una diana multivalente, en una configuración particularmente preferida de la invención se utiliza la sustancia oligomérica AI3 presente para el tratamiento, es decir, la destrucción, que consta de varias copias de una unidad de unión a oligómero AI3 que ya es eficaz o de varias unidades de unión a oligómero AI3 distintas que ya son eficaces. Estos péptidos también se ciclan. En este caso, el péptido según la invención comprende así una pluralidad de bloques de construcción de péptidos que se unen eficazmente a especies AI3 y en particular oligómeros, cada uno de los cuales está formado por aminoácidos y está ciclado globalmente por enlace covalente.
En otra variante no según la invención, los bloques de construcción de péptidos presentan fragmentos de las secuencias mencionadas o presentan secuencias homólogas a las secuencias mencionadas anteriormente.
Para los fines de la invención, «secuencias homólogas» u «homólogos» significa que una secuencia de aminoácidos tiene una identidad con una de las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente de los monómeros de al menos un 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 %, En lugar del término «identidad», se usan los términos «homólogo» u «homología» como sinónimos en esta descripción. La identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos se calcula por comparación utilizando el programa BESTFIT basado en el algoritmo de Smith, T.F. y Waterman, M.S. (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)) con los siguientes parámetros para los aminoácidos: Gap
creation penalty: 8 y Gap extensión penalty: 2; y el siguiente parámetro para los ácidos nucleicos: Gap creation penalty: 50 y Gap extension penalty: 3. Preferentemente, la identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o secuencias de polipéptidos se define por la identidad de la secuencia de ácido nucleico/secuencia de polipéptidos en toda la longitud de la secuencia, según se calcula por comparación utilizando el programa GAP basado en el algoritmo de Needleman, S.B. y Wunsch, C.D. (J. Mol. Biol. 48: 443 -453) con los siguientes parámetros para los aminoácidos: Gap creation penalty: 8 y Gap extension penalty: 2; y los siguientes parámetros para los ácidos nucleicos: Gap creation penalty: 50 y Gap extension penalty: 3.
Dos secuencias de aminoácidos son iguales en el sentido de la presente invención si tienen la misma secuencia de aminoácidos.
En particular todos los péptidos lineales con secuencias de aminoácidos que, después de la ciclación, dan como resultado la misma secuencia de aminoácidos indistinguible, son idénticos en este sentido. Ejemplo: La secuencia de aminoácido lineal de D3 es rprtrlhthrnr. El péptido ciclado correspondiente «cD3», unido por un enlace amida entre el grupo amino N-terminal y el grupo carboxilo C-terminal, ya no se puede distinguir de los péptidos ciclados prtrlhthrnrr, rtrlhthrnrrp, trlhthrnrrpr, rlhthrnrrprt, Ihthrnrrprtr, hthrnrrprtrl, thrnrrprtrlh, hrnrrprtrlht, rnrrprtrlhth, nrrprtrlhthr, o rrprtrlhthrn. Los efectos positivos de los péptidos ciclados según la invención con respecto a la afinidad y la eficacia también ocurren con respecto a al menos uno, preferiblemente a cada péptido de unión lineal, de los cuales pueden derivarse. Por tanto, en el caso de D3 ciclado frente a péptidos de unión lineal con la secuencia prtrlhthrnrr, rtrlhthrnrrp, trlhthrnrrpr, rlhthrnrrprt, Ihthrnrrprtr, hthrnrrprtrl, thrnrrprtrlh, hrnrrprtrlht, rnrrprtrlhth, nrrprtrlhthr o rrprtrlhthrn. En este contexto, los péptidos ciclados según la invención muestran a) una mayor afinidad de unión a las especies p-amiloides que al menos uno, preferiblemente cada uno de los péptidos lineales de los que pueden derivarse. Los péptidos ciclados según la invención muestran b) una mayor efectividad en la prevención de la formación y/o la toxificación final, en particular de oligómeros p-amiloides, que al menos uno, preferiblemente cada uno de los péptidos de unión lineales a partir de los cuales se puede derivar el péptido ciclado. El D3 ciclado mencionado anteriormente solo debe entenderse como un ejemplo. Por tanto, los efectos se producen en particular, pero no exclusivamente, con los péptidos ciclados con SEQ ID NO: 1-11, donde solo el péptido cíclico de la SEQ ID NO: 5 es según la invención. En una variante, los homólogos se refieren las secuencias retroinversas correspondientes de los bloques de construcción mencionados anteriormente. Según la invención, el término «secuencia retro-inversa» denota una secuencia de aminoácidos que está compuesta de aminoácidos en forma enantiomérica (inversa: la quiralidad del átomo de alfa-C está invertida) y en la que también se ha invertido el orden de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos original (retro = hacia atrás).
Los componentes peptídicos y los polímeros peptídicos según la invención, en general, los péptidos según la invención son adecuados para su uso en medicina.
En una forma de realización, estos son péptidos según la invención para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Otra realización es un péptido según la invención que puede usarse para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt Jakob (CJD), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) u otras enfermedades neurodegenerativas o diabetes.
La presente invención proporciona además un kit que contiene el péptido según la invención. En dicho kit, los péptidos pueden estar empaquetados en contenedores en su caso con/en tampones o soluciones. Todos los componentes del kit pueden envasarse en el mismo envase o por separado. El kit también puede contener instrucciones para su uso. Dicho kit puede, por ejemplo, contener los péptidos según la invención en una ampolla para inyección con un tapón y/o tabique. También puede contener una jeringa desechable, por ejemplo.
La presente invención también se refiere al uso de los péptidos según la invención como sonda para la identificación, determinación cualitativa y/o cuantitativa de, en particular, oligómeros beta amiloides. La presente invención también se refiere a la sonda como tal que contiene el péptido según la invención para la identificación, determinación cualitativa y/o cuantitativa de en particular oligómeros beta amiloides.
Tales sondas son de gran importancia porque permiten el diagnóstico precoz de la demencia de Alzheimer. Con ello, la enfermedad se puede contrarrestar en una etapa muy temprana. Además, se puede seguir el progreso de la enfermedad o un intento de tratamiento o tratamiento.
Tales sondas moleculares contienen el péptido según la invención y pueden, p. ej., inyectarse al paciente por vía intravenosa. Otros componentes de las sondas pueden ser: Tintes, tintes fluorescentes, isótopos radiactivos (por ejemplo, para PET), gadolinio (para RM) y/o componentes que se utilicen para sondas en las pruebas de diagnóstico por imagen. Antes o después de pasar a través de la barrera hematoencefálica, las sondas pueden unirse en particular
a oligómeros y/o placas Ap. Las especies p-amiloides marcadas de esta manera y, en particular, los oligómeros Ap y/o las placas pueden identificarse mediante procedimientos de diagnóstico por imagen tales como, p. ej., SPECT, PET, tAc , RM, espectro infrarrojo cercano, espectroscopia de RM de protones, etc.
Otro objeto de la presente invención es el uso del péptido ciclado para impedir la formación y/o la toxicidad final de oligómeros p-amiloides tóxicos. Por tanto, los péptidos según la invención también se utilizan para formar complejos no tóxicos péptido-oligómero p-amiloide.
La presente invención se refiere también a una composición que contiene el péptido según la invención, en particular para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Alzheimer.
Además, se da a conocer una composición no según la invención que comprende el péptido según la invención, en particular para prevenir oligómeros Ap tóxicos, o para destruir polímeros o fibrillas formadas a partir de los mismos. La «composición» según la invención puede ser, p. ej., una vacuna, un medicamento (p. ej., en forma de comprimido), una solución inyectable, un alimento o suplemento alimenticio, que contiene el péptido según la invención en una formulación que se preparará en base al conocimiento especializado.
Los péptidos según la invención destoxifican los oligómeros Ap o agregados formados a partir de ellos, así como las fibrillas, uniéndolos y convirtiéndolos en compuestos no tóxicos. Las sustancias que pueden inhibir la formación de fibrillas no tienen por qué ser necesariamente capaces de destruir también las fibrillas preformadas, ya que las fibrillas AI3 preformadas son muy estables y sólo pueden volver a destruirse con gran dificultad y lentamente.
Por consiguiente, también se da a conocer un procedimiento no según la invención para la destoxificación de los oligómeros Ap, polímeros o fibrillas formados a partir de los mismos.
Se ha reconocido que, si los oligómeros Ap ya están presentes, el objetivo del tratamiento debe ser abordarlos con sustancias que tengan la mayor afinidad posible por el A-beta. De hecho, la afinidad no puede ser suficientemente alta y la constante de disociación correspondiente del péptido según la invención está entonces en el intervalo pM o incluso inferior.
También se reconoció que una diferencia importante entre prevención y tratamiento radica en la consideración siguiente. Para prevenir la formación de los primeros oligómeros Ap, pueden ser suficientes ligandos Ap incluso menos afines y eficaces. Dado que la formación de un oligómero Ap a partir de varios monómeros Ap es una reacción de muy alto orden, es altamente dependiente de la concentración de monómero Ap. Incluso una pequeña reducción en la concentración de monómero Ap activo puede prevenir así la formación de los primeros oligómeros Ap. Esta es la situación en el caso de la prevención.
Sin embargo, si ya se han formado oligómeros Ap, estos pueden multiplicarse de manera similar a los priones, lo que no es una reacción de alto orden y, por lo tanto, apenas depende de la concentración de monómero Ap. Esta es la situación en el caso de la terapia. Entonces, si ya han surgido oligómeros A-beta, el objetivo de un tratamiento deberá ser abordarlos con sustancias que tengan la mayor afinidad posible por los oligómeros Ap y/o eliminarlos de manera particularmente eficaz y/o impedir la formación de manera particularmente eficaz. La constante de disociación correspondiente debería estar en el intervalo de pM, sub-μM o nM o incluso inferior. Este es el caso de la presente invención, y los péptidos ciclados según la invención se unen a las especies beta amiloide y en particular a los oligómeros A-beta con una constante de disociación correspondientemente baja en términos de tratamiento.
Debido a su propiedad de unirse tanto a los oligómeros AI3 pequeños, libremente difusibles, como a los oligómeros A beta más grandes y hasta a fibrillas, los péptidos según la invención pueden usarse en todas las etapas de la demencia de Alzheimer. Sobre la base de las enseñanzas de la presente invención, se pueden producir péptidos que también se unan selectivamente a distintas formas de oligómeros AH
Además de los procedimientos ya mencionados para producir los péptidos según la invención, son posibles procedimientos de síntesis de péptidos, la producción recombinante de proteínas y procedimientos de síntesis orgánica reconocidos para los denominados compuestos de bajo peso molecular.
En particular, es concebible una ciclación covalente de esta molécula lineal. De esta manera, en particular, se evitan ventajosamente incluso ambos extremos abiertos de la cadena peptídica. Por un lado, esto aumenta la estabilidad del péptido en animales y seres humanos, lo que conduce a propiedades farmacocinéticas considerablemente más ventajosas. La ciclación también tiene el efecto particularmente ventajoso de que se reduce considerablemente el número de posibles conformaciones del péptido en el estado libre. Esto a su vez reduce la entropía en el estado libre,
lo que a su vez hace que la parte entrópica de la reacción de unión sea más ventajosa en beneficio de la formación del complejo con la molécula diana A-beta. En última instancia, esto aumenta considerablemente la afinidad por la molécula diana en comparación con el péptido de unión lineal del que se puede derivar el péptido ciclado. Lo mismo se aplica a la eficacia de la eliminación y/o la prevención de la formación de especies p-amiloides tóxicas y, en particular, de los oligómeros p-amiloides. Estos efectos según la invención son decisivos y no tanto un posible aumento de la estabilidad, que es simplemente un efecto secundario positivo de la ciclación.
Esta ciclación tiene lugar, p. e., head-to-tail (de cabeza a cola) o tail-to-head (de cola a cabeza) o mediante otras ciclaciones del péptido lineal. Aquí se pueden considerar todas las posibles ciclaciones.
Dado que la molécula diana del tratamiento terapéutico es en particular un oligómero AI3 y, por tanto, naturalmente, una diana multivalente, la idea es producir la sustancia que se utilizará para un tratamiento (destrucción de oligómeros AI3 existentes) a partir de varias copias de una unidad peptídica que ya se una eficazmente al oligómero AI3 , que ventajosamente se cicla adicionalmente. En este caso, el péptido comprende una pluralidad de bloques de construcción de péptidos que, como tales, ya se unen eficazmente a oligómeros AI3, cada uno de los cuales se construye linealmente a partir de aminoácidos y, en su conjunto, está conectado covalentemente a un ciclo entre sus dos extremos restantes.
Esta medida provoca ventajosamente una reducción adicional del Kd . Por tanto, es ventajoso que, al menos teóricamente y en ausencia de influencias interferentes, p. ej., por impedimento estérico, un n-mer de una unidad de unión de oligómero AI3, que se une a oligómeros AI3 con una constante de disociación (Kd) de x, aumente un Kd aparente de x elevado a n.
Hay muchas formas de lograrlo: Las unidades de unión a oligómero AI3, es decir, las unidades de péptido-monómero, pueden ser covalentes o no covalentes, p. ej., estar unidas entre sí mediante un grupo biotina y un tetrámero de estreptavidina.
Se puede lograr un enlace covalente acoplando linealmente las unidades de monómero cabeza a cabeza, cola a cola o cabeza a cola, y en efecto sin un grupo enlazador o con un grupo enlazador. En este caso, también se pueden combinar y ciclar unidades monoméricas no idénticas según la invención.
Ejemplos de realización:
La invención se explica a continuación con más detalle basándose en ejemplos de realización y en las figuras adjuntas. Esto de ninguna manera restringe la invención. Por el contrario, está claro para el experto en la materia que, dentro del alcance de su conocimiento especializado, puede producir otros péptidos que se haya demostrado que se unen eficazmente a especies AI3 en forma ciclada y utilizarlos en la prevención y el tratamiento de la demencia de Alzheimer. Muestran:
Figura 1 cambio en las fracciones de una centrifugación en gradiente de densidad estandarizada después de la adición de D3 lineal (técnica anterior) y cD3 (D3 ciclado; no según la invención). La comparación de la influencia de D3 (barras sombreadas) y cD3 (negras; no según la invención) en la distribución de tamaño de los agregados AI3 (control en blanco) muestra que cD3 elimina los oligómeros en las fracciones 4 a 8 incluso más eficientemente que el D3 lineal. Figura 2: Valor Kd (cinética) del monómero beta amiloide
Figura 3: Valor Kd (cinética) del oligómero beta amiloide
Figura 4: Valor Kd (cinética) de las fibrillas beta amiloides
Figura 5: Laberinto acuático de Morris (MWM)
El péptido lineal enantiomérico D con el nombre D3 se conoce a partir de la publicación WO 02081505 A2. Se identificó mediante una selección de presentación en fagos de imagen especular contra Ap (1-42) predominantemente monomérico, con el objetivo de estabilizarlo mediante la unión y evitar su conversión en agregados de Ap tóxicos. Según el estado actual de los conocimientos, D3 se une preferentemente a los oligómeros Ap particularmente tóxicos, los precipita y los convierte en agregados amorfos no tóxicos, no amiloidogénicos y ThT negativos. En el modelo animal, incluso la administración oral de D3 con el agua potable asegura que los ratones DA transgénicos tratados contengan significativamente menos placas y tengan capacidades cognitivas significativamente mejoradas.
Primer ejemplo de realización (no según la invención):
La primera realización se refiere a mostrar el aumento en la eficacia o eficiencia de D3 en la degradación de oligómeros beta amiloides por ciclación. Para este propósito, los extremos N-terminales y C-terminales del primer y último
aminoácido del péptido de unión lineal D3 se unieron covalentemente mediante un enlace peptídico.
El D3 ciclado («cD3»; no según la invención) se obtuvo de la empresa peptides&elephants GmbH (en Mühlenberg 11, 14476 Potsdam-Golm, Alemania).
Se utilizó el procedimiento siguiente para producir las fracciones a partir de la centrifugación en gradiente de densidad. Los confórmeros se separaron según su valor s o coeficiente de sedimentación. Las moléculas de distintos tamaños pueden tener un radio hidrodinámico idéntico, pero aun así tienen distintos valores s y a continuación también se separan. Mediante calibración con moléculas de valor s conocido, los confórmeros Ap obtenidos mediante centrifugación en gradiente de densidad se determinan exactamente según su valor s. La centrifugación en gradiente de densidad tiene la ventaja de que permite separar todos los confórmeros AI3 entre sí en una sola etapa del procedimiento. Mediante el uso de un paso de centrifugación en gradiente de densidad antes de la inmovilización, en el que los oligómeros o formas AI3 superiores se colocan en capas sobre un gradiente de densidad preformado y las partículas agregadas contenidas en él se separan por ultracentrifugación según su valor s, se pueden separar entre sí distintos agregados A-beta (oligómeros y fibrillas o agregados amorfos) y fraccionarlos según su coeficiente de sedimentación, que depende entre otras cosas del tamaño de partícula. La fracción con el confórmero AI3 deseado se puede inyectar directamente en una superficie del sensor cargada con estreptavidina para su inmovilización. El gradiente de densidad se preparó superponiendo posteriormente la solución de gradiente de densidad (iodixanol diluido en tampón de fosfato de sodio 1o mM pH 7,4) en concentraciones de 50 % (260 μl), 40 % (260 μl), 30 % (260 jl), 20 % (260 jl), 10 % (260 jl) y 5 % (100 jl) (v/v). A continuación, se pipetearon las muestras sobre el gradiente de densidad y se centrifugó durante 3 horas a 4 °C y 259.000 g. A continuación, se retiraron del gradiente de densidad un total de 14 fracciones de 140 j l cada una de arriba hacia abajo. Los monómeros se pueden encontrar en las primeras fracciones, los oligómeros especialmente a partir de la fracción 4 y las fibrillas se encuentran normalmente en las fracciones 11 a 13.
Las fracciones obtenidas de la centrifugación en gradiente de densidad fueron sin tratar (control: cada columna izquierda, sin llenar) o con el D3 conocido del estado de la técnica (D3, 20 μ M: cada columna central, rayada) o con la variante ciclada de la molécula D3, en la que los extremos N-terminales y C-terminales del primer y último aminoácido estaban unidos covalentemente por un enlace peptídico (cD3, 20 jM: cada columna derecha, negra). El resultado está representado en la Figura 1. Resulta claro que el cD3 ciclado (no según la invención) ventajosamente no muestra influencia sobre la concentración de monómero AI3 de las fracciones 1-2.
Con respecto a las fracciones 4-8 y 4-10, sin embargo, se puede ver ventajosamente una disminución considerable en la concentración de oligómero AH
También se produce un efecto comparable con los restantes péptidos según la invención.
Segundo ejemplo de realización:
Las etapas siguientes se refieren tanto a los estudios de afinidad como a los estudios sobre la degradación de oligómeros beta amiloides particularmente tóxicos.
Producción de monómeros, oligómeros y fibrillas de Ap
Se disolvió 1 mg de AI31-42 liofilizado y AI31-42 biotinilado en el N-terminal en 1 ml de hexafluoroisopropanol al 100 % (HFIP) y se disolvió a temperatura ambiente durante la noche. Para la preparación de oligómeros y fibrillas, se utilizó Ap no biotinilado con Ap biotinilado en el N-terminal en una proporción de 1:10 y se evaporó el HFIP (Concentrator 5301 de Eppendorf). El film de Ap resultante se recogió en una concentración final de 80 jM en tampón de fosfato de sodio (10 mM, pH 7,4) y se incubó (TA, 600 rpm). El tiempo de incubación fue de 3 horas para la preparación de oligómeros y de 24 horas para la preparación de fibrillas. Para la preparación de monómeros, se utilizó AI31-42 biotinilado en el N-terminal al 100 % sin incubación.
Centrifugación en gradiente de densidad
La centrifugación en gradiente de densidad se realizó después de la preparación de Ap para purificar las respectivas especies de Ap según su tamaño. Para ello, se utilizó un gradiente de iodixanol en tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4, con concentraciones crecientes de 50 % a 5 % v/v de iodixanol. Se aplicaron 100 j l de la muestra de Ap y se separaron por ultracentrifugación (3 h, 4 °C, 259.000 g). A continuación, el gradiente se fraccionó en 14 fracciones de 140 j l cada una. Los monómeros Ap están en las dos primeras fracciones superiores, los oligómeros Ap en las fracciones 4 a 6 y las fibrillas Ap en las fracciones 11 a 13.
Inmovilización para espectroscopia SPR (resonancia de plasmón superficial)
Se utilizó un T200 de Biacore (GE Healthcare) para la espectroscopia SPR. Las especies Ap purificadas mediante centrifugación en gradiente de densidad se inmovilizaron directamente mediante acoplamiento biotina-estreptavidina en un Sensor Chip (Series S Sensor Chips SA) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó 1X PBS como tampón de ejecución. La carga se realizó a 25 °C y un caudal de 5 μl/min. Posteriormente, las células de flujo se liberaron de los ligandos unidos de forma no específica durante la noche a un flujo constante de 30 jl/min.
Cinética de unión
La cinética de unión también se midió mediante espectroscopia SPR en un dispositivo T200 de Biacore (GE Healthcare). Las condiciones estándar son 25 °C y un caudal de 30 jl/min. Se recogieron varios liofilizados de los péptidos D en el tampón de ejecución 1X PBS y se diluyeron en serie. El procedimiento utilizado fue la cinética de «ciclo único», donde se bombearon cinco concentraciones crecientes de analito sobre las celdas de flujo inmovilizadas. En función del analito, los tiempos de contacto fueron de 90-120 s para asociación y disociación y de 1800-5400 s para la disociación final. Se hizo referencia a los sensogramas dos veces con la ayuda de una celda de flujo descargada y el tampón de funcionamiento utilizado. La evaluación de las curvas de unión se llevó a cabo mediante modelos de ajuste cinético (modelo de unión heterogénea) por medio del software de evaluación Biacore T200 (versión 2.0).
Las figuras 2-4 muestran los resultados del comportamiento de unión del péptido ciclado según la invención y de los péptidos ciclados no según la invención (estudio de afinidad). Las figuras contienen datos para la evaluación cinética de la fuerza de unión de los distintos candidatos a monómeros beta amiloides (figura 2), oligómeros beta amiloides (figura 3) y fibrillas beta amiloides (figura 4). Las dos constantes de enlace que surgen al ajustar un modelo de enlace heterogéneo se muestran en cada caso y se representan como barras blancas y barras negras. Es importante que aquí se pueda ver una escala logarítmica, lo que significa que pequeñas diferencias en el tamaño de la barra son grandes diferencias en la constante de disociación Kd. Las barras blancas son los sitios de baja afinidad, es decir, los sitios de unión de baja afinidad y su fuerza de unión, y las barras negras muestran los sitios de unión de alta afinidad y su fuerza de unión.
Se muestra que solo en el caso del péptido lineal D3 (no según la invención) es suficiente un modelo de unión homogéneo 1:1 para ajustar las curvas de unión.
También se muestra que, en casi todos los casos, en los péptidos ciclados utilizados, las barras blancas para los sitios de unión de baja afinidad tienen la misma altura. Más bien, las principales diferencias surgen en los sitios de unión de alta afinidad, que se muestran como barras negras.
También está claro que el cD3r cíclico (SEQ ID NO: 5) se desempeña muy bien (Figura 2), es decir, tiene una afinidad particularmente alta.
En el caso de los oligómeros que son particularmente interesantes, el cD3r se une incluso en dos órdenes de magnitud con más fuerza que los otros péptidos ciclados según la invención (Figura 3).
El cD3r también se desempeña muy bien en las fibrillas en comparación con los otros péptidos según la invención, donde como característica especial el péptido cD3P2K (SEQ ID NO: 11; no según la invención) se desempeña extremadamente bien y penetra en el área de unión sub-pM (Figura 4).
Los valores Rmax en las figuras 2-4 indican cómo de fuerte es la contribución del Kd respectivo a la capacidad de carga total. En el ejemplo para los oligómeros (figura 3) se da un Rmax de 79/21 % para el péptido cD3z (no según la invención). cD3z (no según la invención) significa cD3 cero, es decir, D3 ciclado sin enlaces de aminoácidos adicionales. La barra blanca indica que el sitio de baja afinidad en total puede sumar el 79 % de la capacidad de carga total RU y Kd2 en total el 21 % del RU. Esto significa que hay una proporción de aproximadamente 1:4 de sitios de unión para este péptido, es decir, hay aproximadamente 4 veces más sitios de baja afinidad que sitios de alta afinidad. En contraste con esto, los valores Kd1 y los valores Kd2 para el D3 lineal (no según la invención) son los siguientes: Monómero: Kd1=100, Kd2=0
Oligómero: Kd1=100, Kd2=0
Fibrillas: sin determinar
El hecho de que el ajuste de los datos de unión experimentales para el péptido lineal D3 (no según la invención) no dé como resultado un sitio de alta afinidad puede explicarse por el hecho de que no se une al sitio de alta afinidad o que las afinidades por el sitio de alta afinidad y los sitios de baja afinidad son indistinguibles.
A partir de estos datos, está claro que el D3 lineal (no según la invención) en los oligómeros beta amiloides solo se une a un sitio de baja afinidad, pero no a un sitio de alta afinidad.
La Figura 5 muestra datos in vivo de la prueba MWM. La prueba mide la memoria espacial de los animales, en la presente invención ratones APPsDI modificados. Estos ratones muestran anomalías de comportamiento y cambios bioquímicos que expresan un aspecto de la demencia de Alzheimer, a saber, un trastorno de la memoria.
Este mide el tiempo en segundos que necesita el animal para encontrar una plataforma escondida en una cuba de agua justo por debajo de la superficie del agua. Se mide en varias pruebas por día durante varios días consecutivos. A continuación, una evaluación estadística muestra si los animales tratados aprendieron mejor a encontrar la plataforma nuevamente que el grupo control. El tiempo de búsqueda se representa en segundos durante cinco días consecutivos para los ratones que fueron tratados con el péptido cD3r según la invención en comparación con los experimentos con placebo (solución salina).
Los animales tratados con el péptido ciclado cD3r aprendieron significativamente (prueba de Friedmann no paramétrica, significación asintótica de cD3r = 0,014; significación asintótica de la solución salina = 0,238).
Claims (16)
1. Péptido que comprende al menos un péptido que se une a una especie beta amiloide, donde el péptido presenta una secuencia de aminoácidos lineal que le permite unirse a A-beta, y esta propiedad se conserva o se mejora al estar el péptido en forma ciclada por enlace covalente, caracterizado por
al menos una estructura según una de las secuencias con SEQ ID NO:5 en forma ciclada.
2. Péptido según la reivindicación 1,
caracterizado por que
está constituido por aminoácidos D-enantioméricos.
3. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
caracterizado por que
contiene oligómeros beta amiloides con una constante de disociación (valor Ko) de 1 μ M como máximo, preferentemente 800, 600, 400, 200, 100, 10 nM, en particular preferentemente 1.000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 pM, en particular preferiblemente como máximo 50 pM, lo más preferiblemente como máximo 20 pM, preferiblemente sub-pM.
4. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
caracterizado por que
este no presenta extremos abiertos de la cadena del péptido.
5. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
con o sin uno o varios de los grupos enlazadores en posiciones cualesquiera dentro del péptido cíclico.
6. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
caracterizado por
al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más bloques de construcción de péptidos lineales se unen cada uno de manera efectiva a especies AI3, donde el péptido total resultante se enlaza covalentemente y por lo tanto está disponible en forma ciclada.
7. Péptido según la reivindicación anterior,
caracterizado por
la unión de bloques de construcción de péptidos idénticos o no idénticos.
8. Péptido según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores,
caracterizado por
bloques de construcción de péptidos que están enlazados entre sí de forma covalente.
9. Péptido según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores,
caracterizado por
bloques de construcción de péptidos que están acoplados linealmente de cabeza a cabeza, de cola a cola o de cabeza a cola.
10. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para el uso en medicina.
11. Kit que contiene al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Sonda que contiene al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
13. Composición que contiene al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, preferiblemente para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
14. Uso del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como sonda para la identificación, determinación cualitativa y/o cuantitativa de especies beta amiloides.
15. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para el uso en la inhibición de la formación de oligómeros beta amiloides y/o su destrucción y/o su destoxificación.
16. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en la formación de complejos no tóxicos polímero-oligómero beta amiloide.
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