ES2957554T3 - Tratamiento y profilaxis de infección por K. pneumoniae - Google Patents

Tratamiento y profilaxis de infección por K. pneumoniae Download PDF

Info

Publication number
ES2957554T3
ES2957554T3 ES18209490T ES18209490T ES2957554T3 ES 2957554 T3 ES2957554 T3 ES 2957554T3 ES 18209490 T ES18209490 T ES 18209490T ES 18209490 T ES18209490 T ES 18209490T ES 2957554 T3 ES2957554 T3 ES 2957554T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
pneumoniae
polypeptide
expression
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES18209490T
Other languages
English (en)
Inventor
Niels Iversen Møller
Andreas Holm Mattsson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evaxion Biotech AS
Original Assignee
Evaxion Biotech AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evaxion Biotech AS filed Critical Evaxion Biotech AS
Application granted granted Critical
Publication of ES2957554T3 publication Critical patent/ES2957554T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0266—Klebsiella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/03—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/26—Klebsiella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/26—Klebsiella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas y ácidos nucleicos derivados de Klebsiella pneumoniae así como a usos terapéuticos y de diagnóstico de las proteínas y ácidos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento y profilaxis de infección por K. pneumoniae
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la profilaxis y la terapia antimicrobiana. En particular, la presente invención se refiere a anticuerpos dirigidos a una proteína derivada de Klebsiella pneumoniae.
Antecedentes de la invención
En la mayoría de los casos, las infecciones bacterianas se tratan con éxito mediante la administración de antibióticos a los pacientes que los necesitan. Sin embargo, debido al uso descuidado o irreflexivo de antibióticos potentes, muchos gérmenes patológicos se vuelven resistentes a los antibióticos con el tiempo. Un ejemplo amenazante es Klebsiella pneumoniae.
El género Klebsiella pertenece a la familia Enterobacteriaceae y se divide en al menos 4 especies. Son bastoncillos rectos, gramnegativos, capsulados, negativos a oxidasas y no móviles. Son anaerobios facultativos, tienen un metabolismo tanto respiratorio como fermentativo. La mayoría de las cepas pueden usar citrato y glucosa como su única fuente de carbono. Algunas cepas pueden fijar nitrógeno. Se encuentran comúnmente en los intestinos, en muestras clínicas, en el suelo, en el agua y en granos. La especie Klebsiella pneumoniae se puede dividir en 3 subespecies; pneumoniae, ozaenae y rhinoscleromatis (Orskov, I. 1984. Genus V. Klebsiella Trevisan 1885, 105. Krieg y Holt (editores) En Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1:461-465). Klebsiella pneumoniae es el patógeno gramnegativo más común que causa neumonía adquirida en la comunidad (Carpenter, J., et al., 1990. Rev Infect. Dis.
12:672-682). Klebsiella también es responsable de aproximadamente el 8 % de todas las infecciones nosocomiales (Sahly, H. y Podschun, R., 1997. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:393-399).
K. pneumoniae es un patógeno oportunista que está asociado a la neumonía, septicemia, meningitis, endocarditis, ventriculitis e infecciones del tracto urinario y heridas. Estas enfermedades son tanto nosocomiales como adquiridas en la comunidad. K. pneumoniae también desempeña un gran papel en dos importantes enfermedades artríticas no reumatoides, la espondilitis anquilosante y el síndrome de Reiter (Schwimmbeck, P. y Oldstone, M., 1989. Current Topics in Microbiology and Immunology. 145:45-56.). A pesar de los antibióticos disponibles, las tasas de mortalidad observadas por neumonía son de aproximadamente el 50 %, pero cuando la bacteriemia por K. pneumoniae ocurre en alcohólicos, la mortalidad se eleva a casi el 100 % (Sahly, H. y Podschun, R., 1997. Clin. Diagn. Lab. Immunol.
4:393-399). La tasa de mortalidad general por bacteriemia por Klebsiella en un estudio fue del 37 % y en otros varió del 25 % al 55 % (Watanakunakron, C. y Jura, J., 1991. Scand. J. Infect. Dis. 23:399-405).
La incidencia de meningitis por K. pneumoniae va en aumento. Un estudio de 3.377 casos de meningitis bacteriana en 1948 solo encontró que 7 fueron por K. pneumoniae. En 1957, K. pneumoniae representó el 1,5 % de todos los casos de meningitis. En un estudio de once años, de 1981 a 1991, el 13% de los casos de meningitis bacteriana comprobados por cultivo fueron por K. pneumoniae. En este estudio se observó un aumento de la incidencia de meningitis por K. pneumoniae, con un 7 % en los primeros 6 años y un 16 % en los últimos 5 años (Tang, L-M y Chen, S.T., 1994. Scand. J. Infect. Dis. 26:95-102).
En los últimos años, las cepas de Klebsiella se han vuelto multirresistentes a muchos antibióticos. En la década de 1970, la resistencia fue principalmente a los antibióticos aminoglucósidos. Desde el año 1982, algunas cepas de Klebsiella se han vuelto resistentes a las cefalosporinas de amplio espectro (Sahly, H. y Podschun, R., 1997. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:393-399). Se ha informado que la resistencia a las cefalosporinas de amplio espectro entre aislados clínicos de Klebsiella en Francia e Inglaterra es del 14 al 16% (Sirot, D. 1995 J. Antimicrob. Chemother.
36:19-34). Dado que Klebsiella es un buen receptor de factores R, se ha ganado resistencia a los p-lactámicos, tetraciclina, cloranfenicoles, ceftazidima, sulfonamidas y trimetoprima. Hoy en día, casi todas las cepas de Klebsiella son resistentes a la ampicilina. (Orskov, I. 1984. Genus V. Klebsiella Trevisan 1885, 105. Krieg y Holt (editores) En Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1:461-465).
La fermentación microbiana es una forma importante de convertir recursos renovables en productos de importancia biológica e industrial. K. pneumoniae se ha usado para convertir azúcares simples en los productos químicos básicos 1,3-propanodiol y 1,2-propanodiol. Estos productos han sido elaborados por fermentación discontinua alimentada de glicerol por K. pneumoniae. (Cameron, D. et al., 1998. Biotechnol. Prog. 14:116-125). Recientemente se han clonado los genes de la ruta del 1,3-propanodiol de K. pneumoniae y se han expresado en tanto E. coli como S. cerevisiae. La ingeniería metabólica de estos genes puede mejorar significativamente el rendimiento y la productividad del producto (Cameron, D. et al., 1998. Biotechnol. Prog. 14:116-125).
Con K. pneumoniae desempeñando el papel principal, el género Klebsiella se está convirtiendo en un patógeno cada vez más importante. Durante los últimos 10 años, el descubrimiento de cepas resistentes a múltiples fármacos ha enfatizado la importancia de este género. Por otro lado, Klebsiella se considera un modelo de infecciones sistémicas causadas por bacterias encapsuladas.
La vacunación se considera un método muy eficaz para prevenir enfermedades infecciosas en la atención sanitaria humana y veterinaria. La vacunación es la administración de cantidades inmunogénicamente eficaces de material antigénico (la vacuna) para producir inmunidad frente a una enfermedad/agente patógeno causante de una enfermedad. Las vacunas han contribuido a la erradicación de la viruela, la casi erradicación de la poliomielitis y el control de una diversidad de enfermedades, incluida la rubéola, sarampión, paperas, varicela, fiebre tifoidea.
Antes de "la era genómica", las vacunas se basaban en microorganismos muertos o vivos atenuados, o partes purificadas de los mismos. Las vacunas de subunidades se consideran una actualización moderna de estos tipos de vacunas, ya que las vacunas de subunidades contienen uno o más antígenos protectores, que son más o menos el punto débil del patógeno. Por consiguiente, para desarrollar vacunas de subunidades, es crítico identificar las proteínas, que son importantes para inducir la protección y eliminar otras.
Se dice que un antígeno es protector si es capaz de inducir protección frente a la exposición posterior a un agente infeccioso causante de enfermedad en un modelo animal apropiado tras la inmunización.
El enfoque empírico para el desarrollo de vacunas de subunidades, que incluye varias etapas, comienza con el cultivo de patógenos, seguido de purificación en componentes y, a continuación, prueba de antígenos para la protección. Además de consumir mucho tiempo y trabajo, este enfoque tiene varias limitaciones que pueden conducir al fracaso. No es posible desarrollar vacunas usando este enfoque para microorganismos, los cuales no se pueden cultivar fácilmente y solo permite la identificación de los antígenos, los cuales se pueden obtener en cantidades suficientes. El enfoque empírico tiene una tendencia a centrarse en las proteínas más abundantes, que en algunos casos no son inmunoprotectoras. En otros casos, el antígeno expresado durante la infección in vivo no se expresa durante el cultivo in vitro. Por otro lado, el descubrimiento de antígenos mediante el uso del enfoque empírico exige una cantidad extrema de proteínas para descubrir los antígenos protectores, que son como encontrar una aguja en el pajar. Esto lo convierte en un enfoque muy costoso y limita el desarrollo de vacunas en torno a enfermedades, que son causadas por patógenos con un gran genoma o áreas de enfermedad, que funcionan mal en una perspectiva rentable.
Objeto de la invención
Es un objeto de las realizaciones de la invención proporcionar polipéptidos antigénicos derivados de K. pneumoniae que pueden servir como constituyentes en vacunas contra infecciones de K. pneumoniae y en el diagnóstico de infecciones de K. pneumoniae. También es un objeto proporcionar ácidos nucleicos, vectores, células transformadas, composiciones de vacunas y otros medios útiles para la clonación molecular, así como para la terapia y el diagnóstico con relevancia para K. pneumoniae.
Sumario de la invención
El(los) presente(s) inventor(es) ha(n) encontrado que K. pneumoniae, en particular K. pneumoniae resistente a los fármacos, expresa diversas proteínas supuestamente expuestas en la superficie hasta ahora desconocidas que son candidatas como dianas de vacunas, así como candidatas como agentes inmunizantes para la preparación de anticuerpos que se dirigen a K. pneumoniae.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un anticuerpo, que es
i) un anticuerpo policlonal en el que los anticuerpos se unen específicamente a un polipéptido de K. pneumoniae, y que carece esencialmente de anticuerpos que se unen específicamente a otros polipéptidos de K. pneumoniae distintos de dicho polipéptido, o
ii) un anticuerpo monoclonal aislado o un análogo de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de K. pneumoniae,
en donde dicho polipéptido de K. pneumoniae consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, para su uso en un método de profilaxis, tratamiento o mejora de la infección por K. pneumoniae, en particular la infección por K. pneumoniae multirresistente, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo a un individuo que lo necesite.
Leyendas de las figuras
Las Figs. 1-6 muestran gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier en grupos de ratones sometidos a infección por exposición a K. pneumoniae, es decir, el gráfico de supervivencia correspondiente a los datos de las tablas 1-6 en el presente documento.
Las Figs. 1 y 3-6 muestran los gráficos de supervivencia de los experimentos 1 y 3-6, respectivamente, donde los ratones recibieron la exposición infecciosa por vía intranasal, mientras que la Fig. 2 muestra los gráficos de supervivencia de los ratones expuestos por vía intraperitoneal.
Divulgación detallada de la invención
Definiciones
El término "polipéptido" en el presente contexto pretende significar péptidos cortos de 2 a 10 residuos de aminoácidos, oligopéptidos de 11 a 100 residuos de aminoácidos y polipéptidos de más de 100 residuos de aminoácidos. Por otro lado, el término también pretende incluir proteínas, es decir, biomoléculas funcionales que comprenden al menos un polipéptido; cuando comprende al menos dos polipéptidos, estos pueden formar complejos, estar enlazados covalentemente, o pueden estar enlazados no covalentemente. El(los) polipéptido(s) de una proteína pueden estar glicosilados y/o lipidados y/o comprender grupos protésicos.
El término "subsecuencia" significa cualquier tramo consecutivo de al menos 3 aminoácidos o, cuando sea relevante, de al menos 3 nucleótidos, derivado directamente de una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico naturales, respectivamente.
La expresión "secuencia de aminoácidos" es el orden en que los residuos de aminoácidos, conectados mediante enlaces peptídicos, están situados en la cadena en péptidos y proteínas.
El término "adyuvante" tiene su significado habitual en la técnica de la tecnología de vacunas, es decir, una sustancia o una composición de materia que 1) no es capaz por sí misma de generar una respuesta inmunitaria específica contra el inmunógeno de la vacuna, pero que es 2), no obstante, capaz de potenciar la respuesta inmunitaria contra el inmunógeno. O bien, en otras palabras, la vacunación con el adyuvante solo no proporciona una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno, la vacunación con el inmunógeno puede o no dar lugar a una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno, pero la vacunación combinada con inmunógeno y adyuvante induce una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno que es más fuerte que la inducida por el inmunógeno solo.
La "identidad de secuencia" se determina en el contexto de la presente invención comparando 2 secuencias alineadas de forma óptima de igual longitud (por ejemplo, ADN, ARN o aminoácido) de acuerdo con la siguiente fórmula: (Nref -Ndif)100/Nref, en donde Nref es el número de residuos en una de las 2 secuencias y Ndif es el número de residuos que no son idénticos en las dos secuencias cuando se alinean en toda su longitud y en la misma dirección. Entonces, dos secuencias 5-ATTCGGAACC-3' y 5-ATACGGGACC-3' proporcionarán una identidad de secuencia del 80 % (Nref=10 y Ndif=2).
Un "conjunto de aminoácidos" significa dos o más aminoácidos unidos entre sí por medios físicos o químicos.
La "conformación 3D" es la estructura tridimensional de una biomolécula tal como una proteína. En polipéptidos/proteínas monoméricos, la conformación 3D también se denomina "la estructura terciaria" e indica las ubicaciones relativas en el espacio tridimensional de los residuos de aminoácidos que forman el polipéptido.
Un "vehículo inmunogénico" es una molécula o fracción a la que se puede acoplar un inmunógeno o un hapteno para potenciar o permitir la provocación de una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno/hapteno. Los vehículos inmunogénicos son, en los casos clásicos, moléculas relativamente grandes (tales como el toxoide tetánico, KLH, toxoide diftérico, etc.) que puede fusionarse o conjugarse con un inmunógeno/hapteno, que no es suficientemente inmunogénico por derecho propio - normalmente, el vehículo inmunogénico es capaz de provocar una fuerte respuesta de linfocitos T auxiliares contra la sustancia combinada constituida por el inmunógeno y el vehículo inmunogénico, y esto a su vez proporciona respuestas mejoradas contra el inmunógeno por parte de los linfocitos B y los linfocitos citotóxicos. Más recientemente, las grandes moléculas portadoras han sido sustituidas hasta cierto punto por los llamados epítopos T auxiliares promiscuos, es decir, péptidos más cortos que son reconocidos por una gran fracción de haplotipos HLA en una población y que provocan respuestas de linfocitos T auxiliares.
Una "respuesta de linfocitos T auxiliares" es una respuesta inmunitaria provocada sobre la base de un péptido, que es capaz de unirse a una molécula MHC de clase II (por ejemplo, una molécula de HLA de clase II) en una célula que presenta antígeno y que estimula los linfocitos T auxiliares en una especie animal como consecuencia del reconocimiento del receptor de linfocitos T del complejo entre el péptido y la molécula MHC de Clase II presente.
Un "inmunógeno" es una sustancia en cuestión que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria adaptativa en un hospedador, cuyo sistema inmunitario se enfrenta al inmunógeno. Como tales, los inmunógenos son un subconjunto del género más grande "antígenos", que son sustancias que pueden ser reconocidas específicamente por el sistema inmunitario (por ejemplo, cuando se unen a anticuerpos o, como alternativa, cuando fragmentos de antígenos unidos a moléculas MHC están siendo reconocidos por receptores de linfocitos T) pero que no son necesariamente capaces de inducir inmunidad - un antígeno es, sin embargo, siempre capaz de provocar inmunidad, lo que significa que un hospedador que tiene una inmunidad de memoria establecida contra el antígeno generará una respuesta inmunitaria específica contra el antígeno.
Un "hapteno" es una molécula pequeña, que no puede inducir ni provocar una respuesta inmunitaria, pero si se conjuga con un vehículo inmunogénico, pueden inducirse anticuerpos o TCR que reconozcan el hapteno tras la confrontación del sistema inmunitario con el conjugado vehículo y hapteno.
Una "respuesta inmunitaria adaptativa" es una respuesta inmunitaria en respuesta a la confrontación con un antígeno o inmunógeno, donde la respuesta inmunitaria es específica para los determinantes antigénicos del antígeno/inmunógeno - ejemplos de respuestas inmunitarias adaptativas son la inducción de la producción de anticuerpos específicos de antígeno o la inducción/activación específica a antígeno de linfocitos T auxiliares o linfocitos citotóxicos.
Una "respuesta inmunitaria adaptativa protectora" es una respuesta inmunitaria específica a antígeno inducida en un sujeto como una reacción a la inmunización (artificial o natural) con un antígeno, donde la respuesta inmunitaria es capaz de proteger al sujeto frente a exposiciones posteriores con el antígeno o un agente relacionado con la patología que incluye el antígeno. Normalmente, la vacunación profiláctica tiene como objetivo establecer una respuesta inmunitaria adaptativa protectora contra uno o varios patógenos.
"Estimulación del sistema inmunitario" significa que una sustancia o composición de materia presenta un efecto general, un efecto inmunoestimulador no específico. Diversos adyuvantes y supuestos adyuvantes (tales como determinadas citocinas) comparten la capacidad de estimular el sistema inmunitario. El resultado del uso de un agente inmunoestimulante es un mayor "estado de alerta" del sistema inmunitario, lo que significa que la inmunización simultánea o posterior con un inmunógeno induce una respuesta inmunitaria significativamente más eficaz en comparación con el uso aislado del inmunógeno.
La hibridación en "condiciones estrictas" se define en el presente documento como la hibridación realizada en condiciones en las que una sonda se hibridará con su secuencia diana, en un grado detectablemente mayor que en otras secuencias. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia diana y diferirán dependiendo de la estructura del polinucleótido. Mediante el control de la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, se pueden identificar secuencias diana que son un 100 % complementarias a una sonda (sondado homólogo). Como alternativa, se pueden ajustar las condiciones de rigurosidad para permitir cierto grado de emparejamiento erróneo en secuencias, de tal forma que se detectan grados de similitud menores (sondado heterólogo). La especificidad es normalmente la función de los lavados después de la hibridación, siendo factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Generalmente, las condiciones estrictas de temperatura de lavado se seleccionan para que sean de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 2 °C por debajo del punto de fusión (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. El punto de fusión, o desnaturalización, del ADN se produce en un intervalo de temperatura estrecho y representa la alteración de la doble hélice en sus hebras simples complementarias. El proceso se describe por la temperatura del punto medio de transición, Tm, que también se llama temperatura de fusión. En la técnica hay disponibles fórmulas para la determinación de las temperaturas de fusión.
En el presente contexto, el término "animal" pretende indicar, en general, una especie animal (preferentemente mamífero), tal como Homo sapiens, Canis domesticus, etc. y no solo un animal. Sin embargo, el término también indica una población de dicha especie animal, ya que es importante que los individuos inmunizados generen una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno.
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos compuestos por al menos un sitio de combinación de anticuerpos. Un "sitio de combinación de anticuerpos" es el espacio de unión tridimensional con una forma de superficie interna y una distribución de carga complementaria a las características de un epítopo de un antígeno, lo que permite una unión del anticuerpo con el antígeno. "Anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos de vertebrados, anticuerpos híbridos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos alterados, anticuerpos univalentes, proteínas Fab y anticuerpos de dominio único.
"Unión específica" indica unión entre dos sustancias que va más allá de la unión de cualquiera de ellas a sustancias elegidas al azar y también va más allá de la simple asociación entre sustancias que tienden a agregarse porque comparten la misma hidrofobicidad o hidrofilicidad global. Como tal, la unión específica generalmente implica una combinación de interacciones electrostáticas y de otro tipo entre dos áreas conformacionalmente complementarias en las dos sustancias, lo que significa que las sustancias pueden "reconocerse" entre sí en una mezcla compleja.
El término "vector" se usa para referirse a una molécula de ácido nucleico portadora en la que se puede insertar una secuencia de ácido nucleico heteróloga para su introducción en una célula donde se pueda replicar y expresar. El término indica además determinados vehículos biológicos útiles para el mismo fin, por ejemplo. vectores virales y fagos - estos dos agentes infecciosos son capaces de introducir una secuencia de ácido nucleico heteróloga.
La expresión "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico capaz de transcribirse. En algunos casos, cuando el producto de transcripción es una molécula de ARNm, esto se traduce a su vez en una proteína, polipéptido o péptido.
Realizaciones específicas de la invención
Epítopos
La SEQ ID NO: 2 incluye determinantes antigénicos (epítopos) que son reconocidos como tales por anticuerpos y/o cuando se unen a moléculas MHC por receptores de linfocitos T. Para los fines de la presente invención, los epítopos de linfocitos B (es decir, epítopos de unión a anticuerpo) son de particular relevancia.
Es relativamente sencillo identificar epítopos lineales de linfocitos B - un enfoque muy simple supone que en los anticuerpos generados contra K. pneumoniae o las proteínas derivadas de K. pneumoniae divulgadas en el presente documento se ensaya la unión a péptidos oligoméricos superpuestos derivados de SEQ ID NO: 2. De este modo, se pueden identificar las regiones del polipéptido de K. pneumoniae que son responsables o contribuyen a la unión a los anticuerpos.
Como alternativa o adicionalmente, se puede producir versiones mutadas del polipéptido, por ejemplo, versiones en las que cada residuo único distinto a alanina en SEQ ID NO: 2 tiene mutación puntual a alanina - este método también ayuda a identificar epítopos de linfocitos B ensamblados complejos; este es el caso cuando la unión del mismo anticuerpo se modifica intercambiando aminoácidos en diferentes áreas del polipéptido de longitud completa.
También, se pueden emplear métodos in silico para la predicción de epítopos de linfocitos B: los sistemas útiles de última generación para la predicción del giro p se proporcionan en Petersen B. et al. (noviembre de 2010), Plos One 5(11): el5079; predicción de los epítopos de linfocitos B lineales, véase: Larsen J.E.P et al. (abril de 2006), Immunome Research, 2:2; predicción de aminoácidos expuestos a disolvente: Petersen B. et al (julio 2009), BMC Structural Biology, 9:51.
Los vectores de la invención
Los vectores útiles en la producción del anticuerpo para su uso en la invención, se encuentran en varias categorías indicadas a continuación. Un vector preferido comprende en enlace operable y en la dirección 5'-3', una región de control de la expresión que comprende un potenciador/promotor para impulsar la expresión del fragmento de ácido nucleico que codifica el polipéptido que se une al anticuerpo de la invención, opcionalmente una secuencia codificante de péptido señal, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido que se une al anticuerpo de la invención y, opcionalmente, un terminador. Por consiguiente, dicho vector constituye un vector de expresión útil para efectuar la producción en células del polipéptido que se une al anticuerpo de la invención. Dado que el polipéptido es de origen bacteriano, la producción recombinante se efectúa convenientemente en células hospedadores bacterianas, por lo que en el presente documento se prefiere que la región de control de la expresión impulse la expresión en células procariotas tales como una bacteria, por ejemplo, en E. coli. Sin embargo, si el vector es para impulsar la expresión en células de mamíferos (como sería el caso de un vector de vacuna de ADN), la región de control de expresión debe adaptarse a este uso particular.
De todas formas, determinados vectores útiles en la invención son capaces de replicación autónoma.
También, el vector útil en la invención puede ser uno que sea capaz de integrarse en el genoma de una célula hospedadora - esto es particularmente útil si el vector se usa en la producción de células transformadas de forma estable, donde la progenie también incluirá la información genética introducida a través del vector. Como alternativa, los vectores incapaces de integrarse en el genoma de una célula hospedadora de mamífero son útiles, por ejemplo, vacunación de ADN.
Normalmente, el vector seleccionado del grupo que consiste en un virus, tal como un virus atenuado (que en sí mismo puede ser útil como agente de vacuna), un bacteriófago, un plásmido, un minicromosoma y un cósmido.
Los vectores particularmente interesantes son los vectores virales (en particular, aquellos útiles como agentes de vacuna). Estos pueden seleccionarse del grupo que consiste en un vector de retrovirus, tal como un vector de lentivirus, un vector de adenovirus, un vector de virus adenoasociado y un vector de poxvirus. Se prefieren determinados vectores del virus de la viruela, en particular, vectores del virus Vaccinia. Un vector de virus Vaccinia particularmente preferido es un vector de Vaccinia Ankara (MVA) modificado.
A continuación, se proporciona una discusión más detallada de los vectores: El polipéptido unido por el anticuerpo para el uso de la invención puede estar codificado por una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, SEQ ID NO: 32 o 64) comprendida en un vector. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "heteróloga", lo que significa que está en un contexto ajeno a la célula en la que se está introduciendo el vector, que incluye una secuencia homóloga a una secuencia en la célula, pero en una posición dentro de la célula hospedadora donde normalmente no se encuentra. Los vectores incluyen a Dn desnudo, ARN, plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales y virus vegetales) y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Un experto en la materia estaría podría construir un vector a través de técnicas recombinantes estándar (por ejemplo, Sambrook et al, 2001; Ausubel et al., 1996). Además de codificar el polipéptido unido por el anticuerpo para el uso de esta invención, un vector puede codificar secuencias polipeptídicas tales como una etiqueta o un péptido potenciador de la inmunogenicidad (por ejemplo, un vehículo inmunogénico o un compañero de fusión que estimula el sistema inmunitario, tal como una citocina o un fragmento activo de la misma). Los vectores útiles que codifican dichas proteínas de fusión incluyen vectores pIN (Inouye et al, 1985), vectores que codifican un tramo de histidinas, y vectores pGEX, para su uso en la generación de proteínas de fusión solubles de glutatión S transferasa (GST) para posterior purificación y separación o escisión.
Los vectores se pueden usar en una célula hospedadora para producir un polipéptido que se une al anticuerpo para el uso de la invención que se puede purificar posteriormente para administrarlo a un sujeto.
Los vectores de expresión pueden contener una diversidad de "secuencias de control", que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un determinado organismo hospedador. Además de las secuencias de control que rigen la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que también cumplan otras funciones, y se describen a continuación.
1. Promotores y potenciadores
Un "promotor" es una secuencia de control. El promotor es normalmente una región de una secuencia de ácido nucleico en la que se controlan el inicio y la tasa de transcripción. Puede contener elementos genéticos a los que se pueden unir proteínas y moléculas reguladoras, tales como la ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Las expresiones "situado/a de forma funcional" "unido/a de forma funcional", "bajo control", y "bajo control transcripcional" significa que un promotor está en una ubicación y/u orientación funcional correctas en relación con una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio y la expresión transcripcional de esa secuencia. Un promotor puede usarse o no junto con un "potenciador", que se refiere a una secuencia reguladora de acción en cis implicada en la activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleico.
Un promotor puede ser uno asociado de forma natural con un gen o una secuencia, que puede obtenerse aislando las secuencias 5' no codificantes ubicadas en dirección 5' del segmento codificante y/o exón. Dicho promotor puede denominarse "endógeno". De forma similar, un potenciador puede ser uno asociado de forma natural con una secuencia de ácido nucleico, ubicado en dirección 3' o 5' de esa secuencia. Como alternativa, se obtendrán determinadas ventajas colocando el segmento de ácido nucleico codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo, que se refiere a un promotor que normalmente no está asociado con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Un potenciador recombinante o heterólogo también se refiere a un potenciador no asociado normalmente con una secuencia de ácido nucleico en su estado natural. Dichos promotores o potenciadores pueden incluir promotores o potenciadores de otros genes, y promotores o potenciadores aislados de cualquier otra célula procariota, vírica o eucariota, y los promotores o potenciadores no "naturales", es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras de la transcripción y/o mutaciones que alteran la expresión. Además de producir secuencias de ácido nucleico de promotores y potenciadores de forma sintética, pueden producirse secuencias usando clonación recombinante y/o tecnología de amplificación de ácido nucleico, incluyendo PCR™, en relación con las composiciones divulgadas en el presente documento (véase la patente de EE. UU. N.° 4.683.202, la Patente de EE. UU. 5.928.906). Naturalmente, puede ser importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija(n) efectivamente la expresión del segmento de ADN en el tipo celular u organismo elegido para la expresión. En general, los expertos en la materia de la biología molecular conocen el uso de promotores, potenciadores y combinaciones de tipos celulares para la expresión de proteínas (véase Sambrook et al, 2001). El promotor empleado puede ser constitutivo, específico de tejido, o inducible y, en determinadas realizaciones, puede dirigir un alto nivel de expresión del segmento de ADN introducido en condiciones específicas, tal como la producción a gran escala de proteínas o péptidos recombinantes.
Ejemplos de elementos inducibles, que son regiones de una secuencia de ácido nucleico que pueden activarse en respuesta a un estímulo específico, incluyen, aunque no de forma limitativa, la cadena pesada de inmunoglobulina (Banerji et al, 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Toiler et al, 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et al.; 1990), la cadena ligera de inmunoglobulina (Queen et al, 1983; Picard et al, 1984), receptor de linfocito T (Luria et al, 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al.; 1990), HLA DQa y/o DQp (Sullivan et al, 1987), p-interferón (Goodbourn et al, 1986); Fujita et al., 1987; Goodbourn et al, 1988), Interleucina-2 (Greene et al, 1989), receptor de interleucina-2 (Greene et al, 1989; Lin et al., 1990), MHC Clase II 5 (Koch et al, 1989), MHC Clase II HLA-DRa (Sherman et al, 1989), p-Actina (Kawamoto et al, 1988; Ng et al.; 1989), creatina quinasa muscular (MCK) (Jaynes et al, 1988; Horlick et al., 1989; Johnson et al, 1989), prealbúmina (transtiretina) (Costa et al, 1988), elastasa I (Omitz et al, 1987), metalotioneína (MTII) (Karin et al, 1987; Culotta et al, 1989), colagenasa (Pinkert et al, 1987; Angel et al, 1987), albúmina (Pinkert et al, 1987; Tranche et al, 1989, 1990), afetoproteína (Godbout et al, 1988; Campere et al, 1989), y-globina (Bodine et al, 1987; Perez-Stable et al, 1990), pglobina (Trudel et al, 1987), c-fos (Cohen et al, 1987), c-HA-ras (Triesman, 1986; Deschamps et al, 1985), insulina (Edlund et al, 1985), molécula de adhesión de células neurales (NCAM) (Hirsh et al, 1990), a-antitripsina (Larimer et al, 1990), histona H2B (TH2B) (Hwang et al, 1990), colágeno de ratón y/o Tipo I (Ripe et al, 1989), proteínas reguladas por glucosa (GRP94 y GRP78) (Chang et al, 1989), hormona de crecimiento de rata (Larsen et al, 1986), amiloide A en suero humano (<s>A<a>) (Edbrooke et al, 1989), troponina I (TN I) (Yutzey et al, 1989), factor de crecimiento derivado de plaquetas (Pd Gf ) (Pech et al, 1989), distrofia muscular de Duchenne (Klamut et al, 1990), SV40) (Banerji et al, 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffner et al, 1988), polioma (Swartzendruber et al, 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell et al, 1988), retrovirus (Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Choi et al, 1988; Reisman et al., 1989), virus del papilloma(Campo et al, 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos y Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens et al., 1987), virus de la Hepatitis B (Bulla et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988), virus de la inmunodeficiencia humana (Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989), citomegalovirus (CMV) IE (Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986), virus de la leucemia del mono gibón (Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989).
Los elementos inducibles incluyen, aunque no de forma limitativa, MT II - éster de forbol (TFA)/metales pesados (Palmiter et al., 1982; Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989); MMTV (virus del tumor mamario de ratón) - glucocorticoides (Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Ponta et al., 1985; Sakai et al., 1988), p-interferón - poli(rl)x/poly(rc) (Tavernier et al., 1983); adenovirus 5 E2 - EIA (Imperiale et al., 1984); colagenasa - éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987a); estromelisina - éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987b); SV40 - éster de forbol (TPA) (Angel et al., 1987b); gen murino MX - interferón, virus de la enfermedad de Newcastle (Hug et al., 1988); gen GRP78 - A23187 (Resendez et al., 1988), a-2-macroglobulina - IL-6 (Kunz et al., 1989); vimentina - suero (Rittling et al., 1989); M<h>C Clase I gen H-2Kb - interferón (Blanar et al., 1989); HSP70 - antígeno T grande E1A/SV40 (Taylor et al., 1989, 1990a, 1990b); proliferina - éster de forbol/TPA (Mordacq et al., 1989); factor de necrosis tumoral - PMA (Hensel et al., 1989); y gen de la hormona estimulante de la tiroides a - hormona tiroidea (Chatterjee et al, 1989).
También se contemplan como útiles los promotores de dectina-1 y dectina-2. Además, cualquier combinación de promotor/potenciador (según la base de datos de promotores eucariotas EPDB) también podría usarse para impulsar la expresión de genes estructurales que codifican enzimas de procesamiento de oligosacáridos, proteínas accesorias del plegamiento de proteínas, proteínas marcadoras seleccionables o una proteína heteróloga de interés.
No se cree que el promotor particular que se emplea para controlar la expresión de los polinucleótidos que codifican el péptido o la proteína sea crítico, siempre que sea capaz de expresar el polinucleótido en una célula diana, preferentemente una célula bacteriana. Cuando se dirige a una célula humana, es preferible colocar la región codificante del polinucleótido junto a y bajo el control de un promotor que es capaz de expresarse en una célula humana. En términos generales, dicho promotor podría incluir un promotor bacteriano, humano o viral.
En diversas realizaciones, el promotor génico temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV), el promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous pueden usarse para obtener un alto nivel de expresión de un polinucleótido relacionado con esta invención. También se contempla el uso de otros promotores de fagos bacterianos o celulares virales o de mamíferos, que son bien conocidos en la técnica, para lograr la expresión de polinucleótidos.
En realizaciones en las que se administra un vector a un sujeto para la expresión de la proteína, se contempla que un promotor deseable para su uso con el vector es uno que no está regulado a la baja por citocinas o uno que es lo suficientemente fuerte que, incluso si está regulado a la baja, produce una cantidad eficaz de la proteína/polipéptido que se une al anticuerpo para el uso de la presente invención en un sujeto para provocar una respuesta inmunitaria. Ejemplos no limitativos de estos son CMV
IE y RSV LTR. En otras realizaciones, se emplea un promotor que se regula al alza en presencia de citocinas. El promotor MHC I aumenta la expresión en presencia de IFN-y. Se pueden usar promotores específicos de tejido, particularmente si la expresión es en células en las que es deseable la expresión de un antígeno, tales como células dendríticas o macrófagos. Los promotores MHC I y MHC II de mamíferos son ejemplos de dichos promotores específicos de tejido. 2. Señales de iniciación y sitios de unión al ribosoma interno (IRES)
También se puede requerir una señal de iniciación específica para la traducción eficaz de secuencias codificantes.
Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales de control de traducción exógenas, incluyendo el codón de iniciación ATG.
Un experto en la materia sería capaz de determinar esto fácilmente y de proporcionar las señales necesarias. Es bien sabido que el codón de inicio debe estar "en fase" con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción de todo el inserto. Las señales de control de traducción exógenas y los codones de iniciación pueden ser naturales o sintéticos y pueden funcionar en bacterias o células de mamíferos. La eficacia de expresión se puede mejorar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados.
2. Sitio de clonación múltiple
Los vectores pueden incluir un sitio de clonación múltiple (MCS), que es una región de ácido nucleico que contiene múltiples sitios de enzimas de restricción, de los que cualquiera puede usarse junto con la tecnología recombinante convencional para digerir el vector. (Véase Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998 y Cocea, 1997). Con frecuencia, un vector se linealiza o fragmenta usando una enzima de restricción que corta dentro del MCS para posibilitar que las secuencias exógenas se liguen en el vector. Los expertos en la materia de la tecnología recombinante conocen bien las técnicas que implican enzimas de restricción y reacciones de ligamiento.
3. Sitios de corte y empalme
La mayoría de las moléculas de ARN eucariotas transcritas se someterán a corte y empalme de ARN para eliminar los intrones de los transcritos primarios. Si fuera relevante, en el contexto de la presente invención, los vectores que contienen secuencias eucariotas genómicas pueden requerir sitios de corte y empalme de donantes y/o aceptores para garantizar el procesamiento adecuado del transcrito para la expresión de proteínas. (Véase Chandler et al., 1997).
4. Señales de terminación
Los vectores o las construcciones, en general, comprenderán al menos una señal de terminación. Una "señal de terminación" o "terminador" se compone de las secuencias de ADN implicadas en la terminación específica de un transcrito de ARN por una ARN polimerasa. Por tanto, en determinadas realizaciones, se contempla una señal de terminación que finaliza la producción de un transcrito de ARN. Puede ser necesario un terminador in vivo para lograr niveles de mensaje deseables.
En los sistemas eucariotas, la región del terminador también puede comprender secuencias de ADN específicas que permitan la escisión específica del sitio del nuevo transcrito para exponer un sitio de poliadenilación.
Esto señala una polimerasa endógena especializada para agregar un tramo de aproximadamente 200 residuos A (poliA) al extremo 3' del transcrito. Las moléculas de ARN modificadas con esta cola de poliA parecen ser más estables y se traducen de manera más eficaz. Por tanto, en otras realizaciones que implican eucariotas, se prefiere que ese terminador comprenda una señal para la escisión del ARN, y se prefiere más que la señal del terminador potencie la poliadenilación del mensaje.
Los terminadores contemplados para su uso incluyen cualquier terminador de la transcripción conocido descrito en el presente documento o conocido por un experto en la materia, que incluye, aunque no de forma limitativa, por ejemplo, el terminador de la hormona de crecimiento bovino o las secuencias de terminación viral, tales como el terminador SV40. En determinadas realizaciones, la señal de terminación puede ser una falta de secuencia transcribible o traducible, tal como debido a un truncamiento de secuencia.
5. Señales de poliadenilación
En la expresión, particularmente la expresión eucariota (ya que es relevante en la vacunación con ácido nucleico), normalmente se incluirá una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación adecuada del transcrito. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica exitosa de la invención, y/o se puede emplear cualquier secuencia de este tipo. Las realizaciones preferidas incluyen la señal de poliadenilación de SV40 y/o la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, conveniente y/o conocida para funcionar bien en distintas células diana. La poliadenilación puede aumentar la estabilidad del transcrito o puede facilitar el transporte citoplasmático.
6. Orígenes de replicación
Para propagar un vector en una célula hospedadora, puede contener uno o más orígenes de sitios de replicación (a menudo denominados "ori"), que es una secuencia específica de ácido nucleico en la que se inicia la replicación. Como alternativa, se puede emplear una secuencia de replicación autónoma (ARS) si la célula hospedadora es levadura.
7. Marcadores seleccionables y detectables
Las células que contienen una construcción de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une al anticuerpo para el uso de la presente invención pueden identificarse in vitro o in vivo codificando un marcador seleccionable o detectable en el vector de expresión. Cuando se transcribe y traduce, un marcador confiere un cambio identificable a la célula permitiendo una fácil identificación de las células que contienen el vector de expresión. Generalmente, un marcador seleccionable es aquel que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador seleccionable positivo es aquel en el que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador seleccionable negativo es aquel en el que su presencia impide su selección. Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia a fármacos.
Generalmente, la inclusión de un marcador de selección de fármacos ayuda en la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, los marcadores que confieren resistencia a la neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina o histidinol son marcadores seleccionables útiles. Además de los marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de transformantes en función de la implementación de condiciones, otros tipos de marcadores que incluyen marcadores detectables tales como GFP para análisis colorimétrico. Como alternativa, se pueden usar enzimas detectables tales como la timidina quinasa (tk) del virus del herpes simple o la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Un experto en la materia también sabría cómo emplear marcadores inmunológicos que se pueden usar junto con el análisis FACS. No se cree que el marcador usado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica una proteína que se une al anticuerpo de la invención. Los expertos en la materia conocen bien ejemplos adicionales de marcadores seleccionables y detectables.
Células transformadas
Las células transformadas son útiles como organismos para producir el polipéptido que se une al anticuerpo para el uso de la invención, pero también como "recipientes" simples de ácidos nucleicos y vectores que codifican el polipéptido que se une al anticuerpo para el uso de la invención.
Determinadas células transformadas son capaces de replicar el fragmento de ácido nucleico que codifica el polipéptido que se une al anticuerpo para el uso de la invención. Las células transformadas preferidas son capaces de expresar el fragmento de ácido nucleico que codifica el polipéptido que se une al anticuerpo para el uso de la invención.
Para la producción recombinante es conveniente, pero no es un requisito previo, que la célula transformada según sea procariota, tal como una bacteria, pero generalmente pueden usarse tanto células procariotas como células eucariotas.
Las células procariotas adecuadas son células bacterianas seleccionadas del grupo que consiste en Escherichia (tal como E. coli), Bacillus (por ejemplo, Bacillus subtilis), Salmonella y Mycobacterium (preferentemente no patógenos, por ejemplo M. bovis BCG).
Las células eucariotas pueden estar en forma de levaduras (tales como Saccharomyces cerevisiae) y protozoos. Como alternativa, las células eucariotas transformadas se derivan de un organismo multicelular tal como un hongo, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula de mamífero.
Para fines de producción, es ventajoso que la célula transformada que comprende el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se une al anticuerpo para el uso de la invención se transforme de manera estable teniendo el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se une al anticuerpo para el uso de la invención integrado de manera estable en su genoma, y en determinadas realizaciones también se prefiere que la célula transformada secrete o lleve en su superficie el polipéptido que se une al anticuerpo para el uso de la invención, ya que esto facilita la recuperación de los polipéptidos producidos. Una versión particular de esta realización es aquella en la que la célula transformada es una bacteria y la secreción del polipéptido que se une al anticuerpo para el uso de la invención es en el espacio periplásmico.
Como se ha indicado anteriormente, se prefieren las células transformadas de forma estable - estas, entre otras, permiten que se puedan establecer líneas celulares compuestas por células transformadas como se define en el presente documento - dichas líneas celulares son particularmente preferidas.
A continuación, se presentan detalles adicionales sobre las células y las líneas celulares:
Las células adecuadas para la expresión de ácido nucleico recombinante de fragmentos de ácido nucleico son procariotas y eucariotas. Ejemplos de células procariotas incluyen E. coli; miembros del género Staphylococcus, tales como S. epidermis; miembros del género Lactobacillus, tales como L. plantarum; miembros del género Lactococcus, tales como L. lactis; miembros del género Bacillus, tales como B. subtilis; miembros del género Corynebacterium tales como C. glutamicum; y miembros del género Pseudomonas tales como Ps. fluorescens. Ejemplos de células eucariotas incluyen células de mamíferos; células de insecto; células de levadura, tales como miembros del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae), miembros del género Pichia (por ejemplo P. pastoris), miembros del género Hansenula género (por ejemplo H. polymorpha), miembros del género Kluyveromyces (por ejemplo, K. lactis o K. fragilis) y miembros del género Schizosaccharomyces (por ejemplo, S. pombe).
Las técnicas para la producción de genes recombinantes, la introducción en una célula y la expresión de genes recombinantes son bien conocidos en la técnica. Se proporcionan ejemplos de dichas técnicas en referencias, tales como Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002 y Wallace et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" pueden usarse indistintamente. Todas estas expresiones también incluyen su descendencia, que es todas las generaciones posteriores. Se entiende que toda la descendencia puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o accidentales. En el contexto de la expresión de una secuencia de ácido nucleico heteróloga, "célula hospedadora" se refiere a una célula procariota o eucariota, e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula hospedadora puede usarse, y se ha usado, como receptor de vectores o virus. Una célula hospedadora puede "someterse a transfección" o "transformarse", lo que se refiere a un proceso por el cual el ácido nucleico exógeno, tal como una secuencia codificante de proteína recombinante, se transfiere o se introduce en la célula hospedadora. Una célula transformada incluye la célula en cuestión primaria y su descendencia.
Las células hospedadoras pueden derivar de procariotas o eucariotas, incluyendo bacterias, células de levadura, células de insecto y células de mamífero para la replicación del vector o la expresión de parte o la totalidad de la(s) secuencia(s) de ácido nucleico. Numerosas líneas celulares y cultivos están disponibles para su uso como célula hospedadora y se pueden obtener a través de la "American Type Culture Collection" (ATCC), que es una organización que sirve como archivo de cultivos vivos y materiales genéticos (www.atcc.org) o de otras instituciones depositarias tales como "Deutsche Sammlung vor Microorganismen und Zellkulturen" (DSM). Un hospedador apropiado puede ser determinado por un experto en la materia basándose en la estructura del vector y el resultado deseado. Un plásmido o cósmido, por ejemplo, puede introducirse en una célula hospedadora procariota para la replicación de muchos vectores o la expresión de proteínas codificadas. Las células bacterianas usadas como células hospedadoras para la replicación y/o la expresión del vector incluyen cepas de Staphylococcus, DH5a, JMI 09 y KC8, así como varios hospedadores bacterianos disponibles en el mercado, tales como SURE(R) Competent Cells y SOLOP ACK(TM) Gold Cells (STRATAGENE®, La Jolla, CA). Como alternativa, podrían usarse células bacterianas tales como E. coli LE392 como células hospedadoras para virus fagos. Las células de levadura apropiadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe y Pichia pastoris.
Ejemplos de células hospedadoras eucariotas para la replicación y/o la expresión de un vector incluyen HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, -CHO, Saos y PC12. Están disponibles muchas células hospedadoras de diversos tipos de células y organismos y serían conocidas por un experto en la materia. De forma similar, un vector viral puede usarse junto con una célula hospedadora eucariota o procariota, particularmente, uno que sea permisivo para la replicación o expresión del vector.
Algunos vectores pueden emplear secuencias de control que les permiten replicarse y/o expresarse tanto en células procariotas como en células eucariotas. Un experto en la materia comprendería además las condiciones en las que incubar todas las células hospedadoras descritas anteriormente para mantenerlas y permitir la replicación de un vector. También se comprenden y conocen técnicas y condiciones que permitirían la producción a gran escala de vectores, así como la producción de los ácidos nucleicos codificados por vectores y sus polipéptidos, proteínas o péptidos cognados.
Sistemas de expresión
Existen numerosos sistemas de expresión que comprenden al menos una parte o todas las composiciones comentadas anteriormente. Se pueden emplear sistemas basados en procariotas y/o eucariotas para producir secuencias de ácidos nucleicos, o sus polipéptidos, proteínas y péptidos cognados. Muchos de dichos sistemas están disponibles en el mercado y de manera extendida.
El sistema de células de insecto/baculovirus puede producir un alto nivel de expresión de proteínas de un segmento de ácido nucleico heterólogo, tal como se describe en las patentes de EE. UU. 5.871.986 y 4.879.236, y que se pueden adquirir, por ejemplo, con el nombre MAXBAC® 2.0 de INVITROGEN® y sistema de expresión de baculovirus BACPACK™ de CLONTECH®.
Además de los sistemas de expresión divulgados, otros ejemplos de sistemas de expresión incluyen el sistema de expresión de mamíferos inducible COMPLETE CONTROL™ de STRATAGENE®, que implica un receptor sintético inducible por ecdisona, o su sistema de expresión de pET, un sistema de expresión de E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible está disponible en INVlTROGEN®, que lleva el sistema T-REX™ (expresión regulada por tetraciclina), un sistema de expresión de mamífero inducible que usa el promotor de CMV de longitud completa. INVITROGEN® también proporciona un sistema de expresión de levadura denominado sistema de expresión de Pichia methanolica, que está diseñado para la producción a un alto nivel de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia methanolica. Un experto en la materia sabría cómo expresar un vector, tal como una construcción de expresión, para producir una secuencia de ácido nucleico o su polipéptido, proteína o péptido cognado.
Amplificación de ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos usados como molde para la amplificación pueden aislarse de células, tejidos u otras muestras de acuerdo con metodologías estándar (Sambrook et al, 2001). En determinadas realizaciones, el análisis se realiza en células completas o homogeneizados de tejido o muestras de fluidos biológicos sin una purificación sustancial del ácido nucleico molde. El ácido nucleico puede ser ADN genómico o ARN celular entero o fraccionado. Cuando se usa ARN, puede desearse convertir primero el ARN en un ADN complementario.
El término "cebador", como se usa en el presente documento, pretende abarcar cualquier ácido nucleico que sea capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente de molde. Normalmente, los cebadores son oligonucleótidos de diez a veinte y/o treinta pares de bases de longitud, pero pueden emplearse secuencias más largas. Los cebadores se pueden proporcionar en forma bicatenaria y/o monocatenaria, aunque se prefiere la forma monocatenaria.
Los pares de cebadores diseñados para hibridar selectivamente con ácidos nucleicos correspondientes a secuencias de genes identificados en el presente documento se ponen en contacto con el ácido nucleico molde en condiciones que permiten la hibridación selectiva. Dependiendo de la aplicación deseada, pueden seleccionarse condiciones de hibridación de alta rigurosidad que solo permitirán la hibridación con secuencias que sean completamente complementarias a los cebadores. En otras realizaciones, la hibridación puede ocurrir bajo una rigurosidad reducida para permitir la amplificación de los ácidos nucleicos que contienen uno o más emparejamientos erróneos con las secuencias del cebador. Una vez hibridado, el complejo molde-cebador se pone en contacto con una o más enzimas que facilitan la síntesis de ácido nucleico dependiente de molde. Se llevan a cabo múltiples rondas de amplificación, también denominadas "ciclos", hasta que se produce una cantidad suficiente de producto de amplificación.
El producto de amplificación puede detectarse o cuantificarse. En determinadas aplicaciones, la detección puede realizarse por medios visuales. Como alternativa, la detección puede implicar la identificación indirecta del producto mediante quimioluminiscencia, gammagrafía radiactiva de radiomarcaje incorporado o marcaje fluorescente o incluso mediante un sistema que utilice señales de impulsos eléctricos y/o térmicos (Bellus, 1994).
Están disponibles varios procesos dependientes del molde para amplificar las secuencias de oligonucleótidos presentes en una muestra de molde dada. Uno de los métodos de amplificación mejor conocidos es la reacción en cadena de la polimerasa (denominada PCR(TM)) que se describe en detalle en las patentes de EE. UU. 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, y en Innis et al., 1988.
Los métodos alternativos para la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos diana que se pueden usar en la práctica de la presente invención se divulgan en las patentes de EE. UU. 5.843.650, 5.846.709, 5.846.783, 5.849.546, 5.849.497, 5.849.547, 5.858.652, 5.866.366, 5.916.776, 5.922.574, 5.928.905, 5.928.906, 5.932.451, 5.935.825, 5.939.291 y 5.942.391, la solicitud GB N.° 2.202.328, y en la solicitud PCT N.° PCT/US89/01025,
Métodos de transferencia de genes
Se cree que los métodos adecuados para la administración de ácido nucleico para efectuar la expresión de las composiciones incluyen virtualmente cualquier método por el cual un ácido nucleico (por ejemplo,<a>D<n>, incluyendo vectores virales y no virales) se pueden introducir en una célula, un tejido o un organismo, como se describe en el presente documento o como sería conocido por un experto en la materia. Dichos métodos incluyen, aunque no de forma limitativa, la administración directa de ADN, tal como mediante inyección (patentes de EE. UU. 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), incluyendo la microinyección (Harland y Weintraub, 1985; patente de EE. UU. 5.789.215, incorporada como referencia en el presente documento); mediante electroporación (patente de EE. UU. N.° 5.384.253); mediante precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); usando DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer et al., 1987); mediante transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991); mediante bombardeo con microproyectiles (Solicitudes PCT N.° WO 94/09699 y 95/06128; patentes de EE. UU. 5.610.042; 5.322.7835.563.055, 5.550.318, 5.538.877 y 5.538.880); mediante agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990; patentes de EE. UU. 5.302.523 y 5.464.765); mediante transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de EE. UU. 5.591.616 y 5.563.055); o mediante transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh et al., 1993; patentes de EE. UU. 4.684.611 y 4.952.500); mediante absorción de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus et al., 1985). A través de la aplicación de técnicas como estas, orgánulo(s), célula(s), tejido(s) u organismo(s) pueden transformarse de forma estable o transitoria.
El anticuerpo para el uso de la invención - y su producción/aislamiento
Los anticuerpos dirigidos contra la proteína con SEQ ID NO: 2 son útiles para cromatografía de afinidad, inmunoensayos, y para distinguir/identificar proteínas de Klebsiella, así como para inmunización pasiva y terapia.
Los anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, pueden prepararse mediante métodos convencionales. En general, la proteína se usa primero para inmunizar a un animal adecuado, preferentemente un ratón, rata, conejo o cabra. Se prefieren los conejos y las cabras para la preparación de sueros policlonales debido al volumen de suero obtenible y la disponibilidad de anticuerpos anti-conejo y anti-cabra marcados. La inmunización generalmente se realiza mezclando o emulsionando la proteína en solución salina, preferentemente en un adyuvante, tal como el adyuvante completo de Freund, e inyectando la mezcla o emulsión por vía parenteral (generalmente por vía subcutánea o intramuscular). Una dosis de 50-200 μg/inyección suele ser suficiente. La inmunización generalmente se refuerza de 2 a 6 semanas después con una o más inyecciones de la proteína en solución salina, preferentemente usando adyuvante incompleto de Freund. Como alternativa, se pueden generar anticuerpos por inmunización in vitro usando métodos conocidos en la técnica, que para los fines de esta invención se considera equivalente a inmunización in vivo. El antisuero policlonal se obtiene sangrando al animal inmunizado en un recipiente de vidrio o plástico, incubando la sangre a 25 °C durante una hora, seguido de incubación a 4 °C durante 2-18 horas. El suero se recupera por centrifugación (por ejemplo, 1.000 g durante 10 minutos). Se pueden obtener aproximadamente 20-50 ml por sangrado de conejos.
Los anticuerpos monoclonales se preparan usando el método estándar de Kohler & Milstein [Nature (1975) 256: 495 96], o una modificación del mismo. Normalmente, se inmuniza un ratón o una rata como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, en lugar de sangrar al animal para extraer el suero, se pueden extirpar el bazo (y opcionalmente, varios ganglios linfáticos grandes) y disociar en células individuales. Si se desea, las células del bazo se pueden cribar (después de eliminar las células adherentes no específicamente) aplicando una suspensión celular a una placa o un pocillo recubierto con el antígeno proteico. Los linfocitos B que expresan inmunoglobulina unida a la membrana específica para el antígeno se unen a la placa y no se enjuagan con el resto de la suspensión. Los linfocitos B resultantes, o todas las células del bazo disociadas, a continuación, se inducen a fusionarse con células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, medio de hipexantina, aminopterina, timidina ("HAT"). Los hibridomas resultantes se siembran en placas mediante dilución limitante y se analizan para determinar la producción de anticuerpos, que se unen específicamente al antígeno inmunizante (y que no se unen a antígenos no relacionados). A continuación, los hibridomas que secretan MAb seleccionados se cultivan in vitro (por ejemplo, en botellas de cultivo tisular o reactores de fibra hueca), o in vivo (como ascitis en ratones).
Si se desea, los anticuerpos (ya sean policlonales o monoclonales) pueden marcarse usando técnicas convencionales. Los marcadores adecuados incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radiactivos (particularmente 32p y 125I), reactivos densos en electrones, enzimas y ligandos que tienen compañeros de unión específicos. Las enzimas se detectan normalmente por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante generalmente se detecta por su capacidad para convertir 3,3 ', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. "Compañero de unión específico" se refiere a una proteína capaz de unirse a una molécula de ligando con alta especificidad, como, por ejemplo, en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para el mismo. Otros compañeros de unión específicos incluyen biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y las numerosas parejas receptor-ligando conocidas en la técnica. Debe entenderse que la descripción anterior no pretende categorizar los diversos marcadores en clases distintas, ya que el mismo marcador puede servir en varios modos diferentes. Por ejemplo, 1151 puede servir como marcador radiactivo o como reactivo denso en electrones. HRP puede servir como enzima o como antígeno para un MAb. Además, se pueden combinar diversos marcadores para lograr el efecto deseado. Por ejemplo, MAbs y avidina también requieren marcadores: por tanto, se podría marcar un MAb con biotina y detectar su presencia con avidina marcada con, 125I, o con un MAb anti-biotina marcado con HRP.
De acuerdo con la invención, el anticuerpo monoclonal o análogo de anticuerpo aislado es preferentemente un anticuerpo monoclonal seleccionado de un anticuerpo multidominio tal como un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, tal como un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano y un anticuerpo de un único dominio de una llama o un camello, o que es un análogo de anticuerpo seleccionado de un fragmento de un anticuerpo tal como Fab o F(ab')<2>, scFV; véase también la definición del término "anticuerpo" presentada anteriormente.
Composiciones para inmunización Las composiciones comprenden antígeno(s) inmunizante(s), inmunógeno(s), polipéptido(s), proteína(s) o ácido(s) nucleico(s), generalmente en combinación con "vehículos farmacéuticamente aceptables", que incluyen cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición individual.
Las composiciones normalmente incluyen un solo antígeno, inmunógeno, polipéptido, proteína, ácido nucleico o vector de la invención, pero las composiciones pueden comprender "cócteles" de los antígenos o de los inmunógenos o de los polipéptidos o de la proteína o de los ácidos nucleicos o de los vectores.
La composición puede ser un vector MVA mencionado en el presente documento, que codifica y puede efectuar la expresión de al menos 2 fragmentos de ácido nucleico.
Otra interesante composición comprende ARN como principio activo, es decir, al menos un ARNm que codifica un polipéptido que se une a un anticuerpo de la invención.
Normalmente los vehículos adecuados son macromoléculas grandes, de metabolización lenta, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros aminoacídicos, agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas) y partículas víricas inactivas.
Los expertos en la materia conocen bien dichos vehículos. Adicionalmente, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes ("adyuvantes"). Por otro lado, el antígeno o inmunógeno puede conjugarse con un toxoide bacteriano, tal como un toxoide del patógeno de la difteria, tétanos, cólera, H. pylori, etc., véase la descripción de vehículos inmunogénicos anteriormente citada.
Por tanto, las composiciones contienen normalmente un adyuvante inmunológico, que es comúnmente un adyuvante a base de aluminio o uno de los otros adyuvantes descritos a continuación:
Como adyuvantes preferidos para mejorar la eficacia de la composición se incluyen, aunque no de forma limitativa: (1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo (véase más adelante) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo, (a) MF59 (documento WO 90/14837; Capítulo 10 en Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell y Newman, Plenum Press 1995), que contiene escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 % (conteniendo opcionalmente varias cantidades de MTP-PE (véase más adelante), aunque no es obligatorio) formuladas en partículas submicrónicas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo HOY (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene escualano al 10 %, Tween 80 al 0,4 %, polímero plurónico bloqueado al 5 % L121, y thr-MDP (véase más adelante) microfluidizado en una emulsión submicrometríca o agitado en vórtex para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande, y (c) sistema adyuvante RIBI (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), trehalosa dimicolato (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL CWS (DetoxTM); (3) pueden usarse adyuvantes de saponina, tales como Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o generarse partículas a partir de los mismos, tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes); (4) adyuvante de Freund completo (CFA) o adyuvante de Freund incompleto (IFA); (5) citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; y (6) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la eficacia de la composición. Se prefieren los adyuvantes Alumbre y MF59™.
Como se ha mencionado anteriormente, los péptidos de muramilo incluyen, aunque no de forma limitativa, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2"-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
Las composiciones inmunogénicas (por ejemplo, el antígeno inmunizante, inmunógeno, polipéptido, proteína o ácido nucleico, vehículo farmacéuticamente aceptable y adyuvante) normalmente contendrá diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, en dichos vehículos puede haber sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tampón del pH y similares.
Normalmente, las composiciones inmunogénicas se preparan como inyectables, ya sea en forma de soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para su disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para potenciar el efecto adyuvante, como se ha indicado anteriormente en vehículos farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones inmunogénicas se administran convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección, ya sea por vía subcutánea, intramuscular o transdérmica/transcutánea (por ejemplo, documento W098/20734). Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas.
Métodos de inmunización y tratamiento
La preparación del anticuerpo para el uso de la invención puede requerir la inducción de inmunidad.
Los métodos de inmunización implican que, cuando un polipéptido que se une a un anticuerpo para el uso de la invención o una composición que comprende dicho polipéptido, se administra a un animal que normalmente recibe entre 0,5 y 5.000 |jg del polipéptido por administración.
El esquema de inmunización puede incluir que el animal reciba una administración de sensibilización y una o más administraciones de refuerzo.
La administración puede tener por objeto inducir anticuerpos específicos para K. pneumoniae, en donde dichos anticuerpos o linfocitos B que producen dichos anticuerpos se recuperan posteriormente del animal.
Pero, la administración también puede tener por objeto inducir anticuerpos específicos para K. pneumoniae, en donde los linfocitos B que producen dichos anticuerpos se recuperan posteriormente del animal y se usan para la preparación de anticuerpos monoclonales.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender anticuerpos para el uso de la invención. Las composiciones farmacéuticas comprenderán una cantidad terapéuticamente eficaz de los mismos.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad profilácticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección deseada o para mostrar un efecto terapéutico o preventivo detectable. El efecto puede ser detectado por, por ejemplo, marcadores químicos o niveles de antígenos. Los efectos terapéuticos también incluyen la reducción de los síntomas físicos, tales como la disminución de la temperatura corporal. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del tamaño y la salud del sujeto, la naturaleza y extensión de la afección, y la terapia o combinación de terapias seleccionadas para la administración. Por tanto, no es útil especificar una cantidad efectiva exacta por adelantado.
Sin embargo, se hace referencia a los intervalos de dosificación de cantidades inmunológicamente efectivas de polipéptidos, véase, anteriormente.
Sin embargo, las cantidades terapéuticamente eficaces para una situación dada se pueden determinar mediante una experimentación rutinaria que se encuentra dentro de la habilidad y el criterio del médico.
Una composición farmacéutica también puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo para la administración de un agente terapéutico, tal como anticuerpos o un polipéptido, genes y otros agentes terapéuticos. La expresión se refiere a cualquier vehículo farmacéutico que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición y que puede administrarse sin producir toxicidad indebida. Los vehículos adecuados pueden ser grandes, de metabolización lenta, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros aminoacídicos y partículas víricas inactivas. Dichos vehículos son bien conocidos por los expertos en la materia.
En el presente documento, pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. En Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991) hay disponible una discusión rigurosa de los excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, en dichos vehículos pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tampón del pH y similares. Normalmente, las composiciones terapéuticas se preparan como inyectables, ya sea en forma de soluciones o suspensiones líquidas; pueden prepararse también formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. Los liposomas están incluidos dentro de la definición de un vehículo farmacéuticamente aceptable.
INFORMACIÓN DE SECUENCIAS
La lista de secuencias incluida establece las secuencias de polipéptidos y ácidos nucleicos divulgados en el presente documento. Para una referencia fácil, las secuencias se presentan a continuación:
Los polipéptidos divulgados en el presente documento tienen o derivan de las siguientes secuencias de aminoácidos:
Los polipéptidos divulgados en el presente documento también se pueden designar de la siguiente manera:
Cuando se designa un fragmento de una de estas proteínas, esto se hace usando la nomenclatura KP1_XXXX-A-p1-p2, donde XXXX es cualquiera de los números de 4 dígitos que siguen a "KP1" en la tabla anterior, y p1 y p2 son los aminoácidos iniciales y finales en relación con la secuencia completa de la proteína. Por ejemplo, KP1_1891-50-200 es el fragmento de KP1_1891 que tiene la secuencia de aminoácidos definida por los residuos 50 a 200 de KP1_1891, es decir, un (poli)péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, residuos 50-200.
Ejemplo
Estudios de exposición en ratones
1. ESTUDIO DE EXPOSICIÓN(K lebsiella pneum oniae -modelo intranasal (IN)):
Cepa de exposición: Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044 (Wu KM et al. (2009), J. Bacteriol, 191:4492-4501).
Estirpe de ratón: BalbC/ByJ (endogámico)
Dosis: 25 |jg en cada inmunización.
Vía de inmunización: 3 x subcutáneo
Intervalo de inmunización: 14 días
Vía de inoculación: intranasal (IN)
Criterio de valoración: Exposición letal
Elección del adyuvante: La inmunización de sensibilización usó Alumbre IFA (adyuvante de Freund incompleto); las inmunizaciones 1' y 2' de refuerzo usaron solo alumbre
Sangrados: Ratón sangrado 4 días antes de la exposición para la prueba ELISA posterior.
Tipo de ensayo clínico: Doble ciego
N.° de ratones por grupo: Como máximo 16 ratones (véase las tablas 1-6 para más detalles)
Periodo de seguimiento: 7 días
2. ESTUDIO DE EXPOSICIÓN(K/ebs/e//apneum oniae -intraperitoneal (Modelo IP)):
Cepa de exposición: Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044
Estirpe de ratón: NMRI (exogámico)
Dosis: 25 jg en cada inmunización.
Vía de inmunización: 3 x subcutáneo
Intervalo de inmunización: 14 días
Vía de inoculación: intraperitoneal (IP)
Criterio de valoración: Exposición letal
Elección del adyuvante: La inmunización de sensibilización usó Alumbre IFA (adyuvante de Freund incompleto); las inmunizaciones 1' y 2' de refuerzo usaron solo alumbre
Sangrados: Ratón sangrado 4 días antes de la exposición para la prueba ELISA posterior.
Tipo de ensayo clínico: Doble ciego
N.° de ratones por grupo: Como máximo 16 ratones (véase las tablas 1-6 para más detalles)
Periodo de seguimiento: 7 días
Se llevaron a cabo un total de 6 experimentos. Solo el experimento 2 usó el modelo IP, mientras que los experimentos restantes usaron el modelo IN.
Varias de las proteínas ensayadas demostraron ser insolubles en solución salina. En su lugar, se solubilizaron en urea 4 M para evitar la precipitación antes de añadir hidróxido de aluminio. Después de agregar hidróxido de aluminio, la urea se elimina por completo. Las proteínas restantes se solubilizan en solución salina fisiológica.
El protocolo de inmunización se describe a continuación.
1' inmunización:
- Se mezclan 25 jg de proteína (por ratón) con 100 j l de hidróxido de aluminio (Alhydrogel 2,0 %, Brenntag) por 125 jg de proteína y se incuban con rotación de extremo a extremo durante 1 hora.
- Se centrifuga la composición a 1.000 rpm durante 2 minutos y se retira el sobrenadante
- Las perlas de alu se lavan una vez (lentamente) en NaCl al 0,9 % (0,15 M) para retirar el exceso de urea - Se agrega adyuvante incompleto de Freund (Sigma) 1:1 (v/v) y la mezcla resultante se agita a fondo durante 1 hora. - Posteriormente la composición final se inyecta por vía subcutánea
2a y 3a inmunización
- Los ratones reciben inmunización de refuerzo con un intervalo de 2 semanas, usando la misma cantidad de proteína mezclada con hidróxido de aluminio y solución salina fisiológica.
- Posteriormente la composición final se inyecta por vía subcutánea
La siguiente tabla A enumera los inmunógenos usados en cada uno de los estudios de inmunización en 6 experimentos diferentes, así como el valor p para la supervivencia en cada grupo en comparación con los ratones vacunados solo con solución salina tamponada con fosfato.
Los gráficos de supervivencia correspondientes se muestran en las Figs. 1-6, que muestran los resultados de los Experimentos 1-6, respectivamente. Los datos de supervivencia también se indican para cada grupo de ratones en cada experimento en las Tablas 1-6.
(continuación)
(continuación)
T l 1 r i n i n l Ex rim n 1
T l 2 r i n i n l Ex rim n 2
continuación
T l r i n i n l Ex rim n
T l 4 r i n i n l Ex rim n 4
T l r i n i n l Ex rim n
continuación
T l r i n i n l Ex rim n

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo, que es
i) un anticuerpo policlonal en el que los anticuerpos se unen específicamente a un polipéptido de K. pneumoniae, y que carece esencialmente de anticuerpos que se unen específicamente a otros polipéptidos de K. pneumoniae distintos de dicho polipéptido, o
ii) un anticuerpo monoclonal aislado o un análogo de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de K. pneumoniae,
en donde dicho polipéptido de K. pneumoniae consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, para su uso en un método de profilaxis, tratamiento o mejora de la infección por K. pneumoniae, en particular la infección por K. pneumoniae multirresistente, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo a un individuo que lo necesite.
2. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal aislado.
3. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 2, que se selecciona de un anticuerpo multidominio, tal como un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, tal como un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano y un anticuerpo de un único dominio de una llama o un camello.
4. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un análogo de anticuerpo, que se selecciona de un fragmento de un anticuerpo, tal como Fab o F(ab')2y scFV.
ES18209490T 2015-01-12 2016-01-12 Tratamiento y profilaxis de infección por K. pneumoniae Active ES2957554T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15150819 2015-01-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2957554T3 true ES2957554T3 (es) 2024-01-22

Family

ID=52396436

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18209490T Active ES2957554T3 (es) 2015-01-12 2016-01-12 Tratamiento y profilaxis de infección por K. pneumoniae

Country Status (4)

Country Link
US (4) US10434162B2 (es)
EP (3) EP4279080A3 (es)
ES (1) ES2957554T3 (es)
WO (1) WO2016113252A2 (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016113252A2 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting klebsiella pneumoniae

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8200523A (nl) 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
US4879236A (en) 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
AU622104B2 (en) 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
US4952500A (en) 1988-02-01 1990-08-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning systems for Rhodococcus and related bacteria
US5858652A (en) 1988-08-30 1999-01-12 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
ATE398679T1 (de) 1992-07-07 2008-07-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
US5702932A (en) 1992-07-20 1997-12-30 University Of Florida Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA
JP2952041B2 (ja) 1992-07-27 1999-09-20 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル，インコーポレイテッド 培養ダイズ細胞のａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の改良法
DE4228457A1 (de) 1992-08-27 1994-04-28 Beiersdorf Ag Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen
GB9222888D0 (en) 1992-10-30 1992-12-16 British Tech Group Tomography
US5846709A (en) 1993-06-15 1998-12-08 Imclone Systems Incorporated Chemical process for amplifying and detecting nucleic acid sequences
FR2708288B1 (fr) 1993-07-26 1995-09-01 Bio Merieux Procédé d'amplification d'acides nucléiques par transcription utilisant le déplacement, réactifs et nécessaire pour la mise en Óoeuvre de ce procédé.
US5935818A (en) 1995-02-24 1999-08-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecule encoding alternatively spliced prostate-specific membrane antigen and uses thereof
US5928905A (en) 1995-04-18 1999-07-27 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
ATE220424T1 (de) 1994-05-28 2002-07-15 Tepnel Medical Ltd Herstellung von nukleinsaeurekopien
US5656610A (en) 1994-06-21 1997-08-12 University Of Southern California Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue
US5942391A (en) 1994-06-22 1999-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM)
FR2722208B1 (fr) 1994-07-05 1996-10-04 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes, vecteur le contenant et utilisation therapeutique
US5871986A (en) 1994-09-23 1999-02-16 The General Hospital Corporation Use of a baculovirus to express and exogenous gene in a mammalian cell
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5935825A (en) 1994-11-18 1999-08-10 Shimadzu Corporation Process and reagent for amplifying nucleic acid sequences
US5843650A (en) 1995-05-01 1998-12-01 Segev; David Nucleic acid detection and amplification by chemical linkage of oligonucleotides
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
US5612473A (en) 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
US5939291A (en) 1996-06-14 1999-08-17 Sarnoff Corporation Microfluidic method for nucleic acid amplification
US5945100A (en) 1996-07-31 1999-08-31 Fbp Corporation Tumor delivery vehicles
US5849546A (en) 1996-09-13 1998-12-15 Epicentre Technologies Corporation Methods for using mutant RNA polymerases with reduced discrimination between non-canonical and canonical nucleoside triphosphates
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US5849497A (en) 1997-04-03 1998-12-15 The Research Foundation Of State University Of New York Specific inhibition of the polymerase chain reaction using a non-extendable oligonucleotide blocker
US5866366A (en) 1997-07-01 1999-02-02 Smithkline Beecham Corporation gidB
US5916776A (en) 1997-08-27 1999-06-29 Sarnoff Corporation Amplification method for a polynucleotide
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
US5932451A (en) 1997-11-19 1999-08-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Method for unbiased mRNA amplification
US6610836B1 (en) * 1999-01-29 2003-08-26 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid amino acid sequences relating to Klebsiella pneumoniae for diagnostics and therapeutics
CN102015754A (zh) * 2007-05-02 2011-04-13 英特塞尔股份公司 克雷伯菌（Klebsiella）抗原
FR2957821B1 (fr) 2010-03-24 2014-08-29 Inst Francais Du Petrole Nouvelle zone de regeneration du catalyseur divisee en secteurs pour unites catalytiques regeneratives
WO2016113252A2 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting klebsiella pneumoniae

Also Published As

Publication number Publication date
EP3485907B1 (en) 2023-06-28
US10849968B2 (en) 2020-12-01
EP3485907A1 (en) 2019-05-22
EP4279080A2 (en) 2023-11-22
WO2016113252A2 (en) 2016-07-21
US20210052713A1 (en) 2021-02-25
US10434162B2 (en) 2019-10-08
EP4279080A3 (en) 2024-02-21
US12226469B2 (en) 2025-02-18
EP3244918A2 (en) 2017-11-22
WO2016113252A3 (en) 2016-09-09
US20190015496A1 (en) 2019-01-17
US20250205325A1 (en) 2025-06-26
EP3485907C0 (en) 2023-06-28
US20200023049A1 (en) 2020-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11052145B2 (en) Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting Staphylococcus aureus
US20240228554A9 (en) Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
US20240226263A1 (en) Peptides derived from acinetobacter baumannii and their use in vaccination
US20250205325A1 (en) Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting Klebsiella pneumoniae
US10946084B2 (en) Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting Staphylococcus aureus
WO2014191465A1 (en) Peptides derived from lawsonia intracellularis and their use in vaccination
TW201533055A (zh) 衍生自細胞內勞索尼亞氏菌之胜肽及其用於疫苗接種之用途
EP2766388A1 (en) Peptides derived from campylobacter jejuni and their use in vaccination