ES2958398T3 - Procedimiento y dispositivo para determinar el efecto de sustancias activas sobre nematodos y otros organismos en ensayos acuosos - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un aparato (1) y un método para determinar el efecto de ingredientes activos sobre nematodos y otros organismos en pruebas acuosas. El aparato (1) según la invención comprende un soporte (13) para una placa de cultivo celular (30) que tiene varias cavidades (31) en las que se pueden llenar los nematodos con los ingredientes activos, donde la placa de cultivo celular (30)) comprende una parte inferior (33), una parte superior (32) y paredes laterales que se extienden entre la parte inferior (33) y la parte superior (32), una cámara (11) utilizada para capturar imágenes preferiblemente de la parte inferior (33) de la celda. placa de cultivo (30), un dispositivo de iluminación (14) que tiene al menos una primera fuente de luz (15), que ilumina la placa de cultivo celular (30), en el que una primera unidad óptica está dispuesta entre la primera fuente de luz (15) y una primera pared lateral (34) de la placa de cultivo celular (30) en estado ensamblado, guiando dicha unidad óptica la luz de la primera fuente de luz (15) a través de la primera pared lateral (34) en dirección a la parte inferior (33) de la placa de cultivo celular (30). El método según la invención permite investigar simultáneamente muchos principios activos en un tiempo muy corto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento y dispositivo para determinar el efecto de sustancias activas sobre nematodos y otros organismos en ensayos acuosos

La invención se refiere a un procedimiento para determinar el efecto de sustancias activas sobre nematodos y otros organismos en ensayos acuosos.

Muchas especies de nematodos (filarias) son plagas en la agricultura, ya que pueden perjudicar gravemente el metabolismo de las plantas al penetrar en los sistemas radiculares. Ya se han desarrollado diversas sustancias químicas, conocidas como nematicidas, para combatir las infestaciones de nematodos. Sin embargo, existe una gran necesidad de identificar más sustancias activas que puedan combatir eficazmente los nematodos.

De una publicación de Macellino, Gut et al. (Marcellino C, Gut J, Lim KC, Singh R, McKerrow J, et al. (2012) WormAssay: A Novel Computer Application for Whole-Plate Motion-based Screening of Macroscopic Parasites. PLoS Negl Trop Dis 6(1): e1494. doi:10.1371/journal.pntd.0001494), se conoce un dispositivo para determinar el efecto de sustancias activas en gusanos, que comprende un soporte para una placa de cultivo celular con varias cavidades en las que se pueden introducir los gusanos con las sustancias activas. La placa de cultivo celular tiene un lado inferior, un lado superior y paredes laterales que se extienden entre el lado inferior y el lado superior de la placa de cultivo celular. El dispositivo comprende además una cámara que sirve para registrar imágenes del lado inferior de la placa de cultivo celular. Un equipo de iluminación del dispositivo comprende al menos una fuente de luz que ilumina la placa de cultivo celular.

La publicación GB2479628-A describe un procedimiento para determinar el movimiento de un objeto biológico, que comprende captar una serie temporal de imágenes del objeto utilizando una cámara El objeto puede ser un organismo cultivado seleccionado del grupo que consiste en pez cebra o nematodos.

Se ha demostrado que las influencias de interferencia, como las gotas condensadas en una cubierta de lámina de la placa de cultivo celular, pueden afectar en gran medida a los resultados experimentales. Un equipo de iluminación mal ajustado puede hacer que los resultados experimentales sean inutilizables.

Por lo tanto, la invención se basa en el objetivo de proporcionar un procedimiento para determinar el efecto de las sustancias activas sobre los nematodos, mediante el cual se puedan minimizar las influencias de interferencia y, por lo tanto, sea posible una determinación fiable del efecto de las sustancias activas.

Según la reivindicación 1, una primera unidad óptica está dispuesta entre una primera fuente de luz y una primera pared lateral de la placa de cultivo celular en el estado instalado, que dirige la luz de la primera fuente de luz a través de la primera pared lateral en dirección del lado inferior de la placa de cultivo celular. En un ejemplo de realización, la unidad óptica comprende una lente que dirige y/o enfoca la luz de la primera fuente de luz en dirección del lado inferior de la placa de cultivo celular.

La unidad óptica puede comprender una lente cilíndrica que se extiende a lo largo de prácticamente toda la longitud de la primera pared lateral de la placa de cultivo celular. La lente cilíndrica puede extenderse paralelamente a la primera pared lateral. Un eje central de la lente cilíndrica se encuentra preferiblemente entre el plano del lado superior de la placa de cultivo celular y el plano del lado inferior de la placa de cultivo celular.

La primera fuente de luz puede comprender un conductor de luz lineal que preferiblemente también se extiende a lo largo de toda la longitud de la primera pared lateral de la placa de cultivo celular. De este modo, la luz se introduce en la placa de cultivo celular a lo largo de toda la primera pared lateral, en cuyo caso la luz se dirige y/o se enfoca en dirección del lado inferior de la placa de cultivo celular debido a la lente cilíndrica. El conductor de luz lineal o su eje central se encuentra preferentemente entre el plano del lado superior y el plano del lado inferior de la placa de cultivo celular soportada por el soporte. Los rayos de luz procedentes del conductor de luz lineal discurren así esencialmente paralelos al lado superior o inferior de la placa de cultivo celular y luego golpean la lente cilíndrica, a través de la cual la luz se dirige luego en dirección del lado inferior.

En un ejemplo de realización, la unidad óptica impide la iluminación directa de una cubierta de cavidad superior de la placa de cultivo celular. Esta cubierta de la cavidad superior puede estar en forma, por ejemplo, de una película sobre la que puede formarse agua de condensación. Sin embargo, una influencia perturbadora de estas gotas condensadas en los resultados del examen puede reducirse o excluirse completamente mediante la iluminación dirigida de la placa de cultivo celular.

Alternativa o adicionalmente, la unidad óptica puede diseñarse de forma que se impida la incidencia directa de la luz en un objetivo de la cámara. Esto también ha resultado ser beneficioso para la calidad y a la confiabilidad de los resultados de la examinación.

En un ejemplo de realización de la invención, la distancia entre la primera fuente de luz y la lente cilíndrica es de 2 a 4 cm. Preferiblemente se prevé un mecanismo de ajuste mediante el cual la distancia entre la fuente de luz y la lente cilíndrica puede ajustarse libremente dentro de ciertos límites. Preferiblemente, no sólo la distancia (horizontal) entre la fuente de luz y la lente cilíndrica, sino también un desplazamiento de altura entre la fuente de luz y la lente cilíndrica pueden ajustarse mediante el mecanismo de ajuste.

En un ejemplo de realización, el soporte está hecho de un material transparente. Preferiblemente, se utiliza un material termoplástico como el PMMA (vidrio acrílico).

El equipo de iluminación puede comprender una segunda fuente de luz y una segunda unidad óptica dispuesta en una segunda pared lateral de la placa de cultivo celular opuesta a la primera pared lateral. La segunda unidad óptica puede ser idéntica a la primera unidad óptica. Asimismo, la disposición de la segunda fuente de luz con respecto a la segunda unidad óptica puede corresponder a la disposición dada entre la primera fuente de luz y la primera unidad óptica.

Debido al gran número de sustancias activas cuyo efecto sobre los nematodos debe investigarse, existe la necesidad de proporcionar un procedimiento que utilice el dispositivo descrito anteriormente, mediante el cual las sustancias activas puedan investigarse en el menor tiempo posible. Por lo tanto, la invención se basa en el objetivo adicional de proporcionar un procedimiento para determinar el efecto de las sustancias activas sobre los nematodos, mediante el cual puedan investigarse tantas sustancias activas como sea posible en un tiempo breve.

Este objetivo se logra mediante el procedimiento según la reivindicación 1.

Ejemplos de realizaciones del procedimiento según la invención pueden deducirse de las reivindicaciones dependientes de la reivindicación 1.

El procedimiento según la invención para determinar el efecto de sustancias activas sobre nematodos y otros organismos en ensayos acuosos prevé en primer lugar llenar al menos una cavidad de una placa de cultivo celular con nematodos y un agente activo. A continuación, la placa de cultivo celular se coloca en un dispositivo según las explicaciones anteriorese. Cabe señalar aquí que, alternativamente, la placa de cultivo celular puede estar dispuesta en un dispositivo que difiere de las realizaciones según las reivindicaciones 1 a 8.

Una pluralidad de imágenes digitales, secuenciales en el tiempo, se toman ahora de la placa de cultivo celular, preferiblemente desde el lado inferior. Estas imágenes se binarizan, asignándose cada píxel de una imagen a un primer grupo (por ejemplo, "negro") o a un segundo grupo (por ejemplo, "blanco"). Durante la binarización, puede definirse/fijarse un valor umbral, en cuyo caso un píxel cuya intensidad sea inferior a este valor umbral se cuenta como fondo, mientras que un píxel cuya intensidad sea superior a este valor umbral se asigna a los nematodos. El nivel del valor umbral depende así de la iluminación de la placa de cultivo celular y, por tanto, del equipo de iluminación utilizado.

Antes de binarizar las imágenes se utiliza un filtro morfológico de procesamiento de imágenes. En este caso se filtran los objetos cuyo tamaño es mayor que el de los organismos examinados. Por consiguiente, se necesita una variable de entrada para este paso de procesamiento, mediante la cual se especifica el tamaño de los organismos examinados.

Después de la binarización se determina una primera curva de medición para una primera serie de tomas y esta primera curva de medición se refiere a al menos una cavidad y, por lo tanto, a la sustancia activa que se ha introducido previamente en esta cavidad. La primera serie de tomas comprende una imagen básica y varias imágenes posteriores, en donde cada imagen posterior se compara con la imagen básica en el procedimiento diferencial y respectivamente se determina un número de píxeles diferenciales Además, se determina al menos una segunda curva de medición relacionada con la cavidad para una segunda serie de tomas, en donde una imagen posterior de la primera serie se utiliza como imagen de base para la segunda serie y al menos otra imagen posterior de la primera serie se utiliza como imagen posterior de la segunda serie. Por último, la determinación de una curva promediada de efectúa sobre la base de la primera curva de medición y la al menos segunda curva de medición.

Utilizando una sola imagen para diferentes curvas de medición puede mantenerse bajo el número de imágenes que deben tomarse y, por tanto, el tiempo necesario para ello. Mediante la creación de varias curvas de medición, que luego se incluyen en una curva promediada, la varianza estadística o dispersión puede reducirse hasta tal punto que pueden hacerse declaraciones iniciales reproducibles y fiables sobre el efecto de la sustancia activa sobre la base de la curva promediada.

En una realización de la invención, para la imagen base de la segunda serie, se utiliza una primera imagen posterior de la primera serie, que sigue inmediatamente a la imagen base de la primera serie (es decir, no hay imágenes tomadas entretanto). Además, para la segunda serie, salvo la primera imagen posterior de la primera serie, todas las imágenes posteriores de la primera serie se utilizan como imágenes posteriores de la segunda serie. A continuación, la segunda serie sólo se completará con una imagen posterior adicional. Por ejemplo, si la primera serie consta de una imagen de base y 9 imágenes posteriores, entonces las 9 imágenes posteriores de la primera serie se utilizan para la segunda serie, en donde la primera imagen posterior de la primera serie se utiliza como imagen de base de la segunda serie y las 8 imágenes posteriores restantes de la primera serie se utilizan todas como imágenes posteriores de la segunda serie. Para que la segunda serie tenga también 9 imágenes posteriores, ésta debe completarse con una imagen adicional. Así pues, para crear la primera curva de medición y la segunda curva de medición, cada una con 10 puntos (incluido el punto cero) que representan el número de píxeles diferenciales en diferentes puntos temporales, basta con un total de 11 imágenes temporalmente consecutivas.

Puede determinarse un periodo de toma entre la imagen de base y la última imagen posterior de una serie de tal manera que en este periodo de toma se alcance un valor límite asintótico para el número de píxeles diferenciales para una cavidad en la que están presentes nematodos no tratados. Los fondos del valor límite asintótico se explicarán utilizando el ejemplo de una cavidad en la que, para simplificar las cosas, sólo se ha introducido un nematodo:

Si, por ejemplo, se pueden asignar 50 píxeles blancos a este único nematodo, el número máximo de píxeles diferenciales resultantes de la comparación de una imagen básica (en el momento t = 0) con una imagen posterior conmutada a continuación es de 100. El número 100 resulta cuando el nematodo se ha desplazado completamente de su posición original (tiempo t = 0). Por un lado, los 50 píxeles blancos originales del nematodo son ahora negros. Por otro lado, otros 50 píxeles que antes eran negros ahora son blancos debido a la nueva posición del nematodo. Si este nematodo sigue moviéndose, el número de píxeles diferenciales permanece constante. En este modelo simplificado, el periodo de toma corresponde al tiempo que tarda un nematodo no tratado en desplazarse completamente desde su posición original (definida por la imagen de base). Preferentemente, se suelen introducir entre 50 y 100 nematodos en una cavidad, de modo que el valor asintótico no tiene que corresponder necesariamente al doble del número de píxeles clasificados como "blancos". Sin embargo, resulta que el número de píxeles diferenciales se acerca a un límite asintótico.

Puede especificarse un intervalo de tiempo total entre la imagen de base de la primera serie y una última imagen posterior de una última serie, que puede ser aproximadamente el doble de un periodo de toma (por ejemplo, en un intervalo comprendido entre 1,5 y 2,5).

El intervalo de tiempo entre dos imágenes sucesivas puede ser constante y puede ser de 1 a 5 segundos. Una serie de imágenes puede comprender de 8 a 12 imágenes. La curva media puede determinarse sobre la base de 8 a 12 curvas de medición.

Por ejemplo, si se determina un período de tiempo de toma de 30 segundos para una cavidad con nematodos no tratados en la que se alcanza el umbral asintótico, el período de tiempo total puede ser de 60 segundos. En el caso de un intervalo de tres segundos entre dos imágenes temporalmente consecutivas se obtiene, por lo tanto, un número de 11 imágenes por serie (una imagen básica y 10 imágenes posteriores, en donde la imagen básica se toma en el momento t = 0) para un período de tiempo de toma. Con un período de tiempo total de 60 segundos, en el que la primera imagen se toma en el momento t = 0 y la última imagen se toma en el momento t = 60 segundos, se obtiene un total de 21 imágenes, a partir de las cuales se obtienen 11 curvas de medición con 11 puntos de medición cada una (incluido el punto cero).

La invención se explicará más detalladamente con referencia a los ejemplos de realización mostrados en las figuras. Se muestran:

Figura 1

muestra esquemáticamente en sección transversal un ejemplo de realización para el dispositivo;

Figura 2

muestra esquemáticamente la disposición de una placa de cultivo celular y un equipo de iluminación del dispositivo según la figura 1;

Figura 3

muestra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización del procedimiento según la invención; y

Figura 4

muestra una curva de medición para una cavidad con nematodos no tratados y una curva de medición para nematodos tratados con una sustancia activa.

La figura 1 muestra esquemáticamente, en sección transversal, un dispositivo para determinar el efecto de sustancias activas sobre nematodos. El dispositivo 1 tiene una carcasa 10 en la que está dispuesta una cámara 11 con un objetivo 12. Además, en la carcasa 10 se prevé un soporte 13 para una placa de cultivo celular 30, que comprende una pluralidad de cavidades 31. La placa de cultivo celular 30 tiene un lado superior 32 y un lado inferior 33. . La placa de cultivo celular 30 tiene un lado superior 32 y un lado inferior 33. Cuatro paredes laterales están dispuestas entre el lado superior 32 y el lado inferior 33 de la placa de cultivo celular 30 rectangular, de las cuales una primera pared lateral 34 y una segunda pared lateral 35 opuesta pueden verse en la representación de la figura 1.

Un equipo de iluminación 14 que comprende una primera fuente de luz 15 y una segunda fuente de luz 16 también está dispuesto en la carcasa 10. Entre la primera fuente de luz 15 y la primera pared lateral 34, como parte de una primera unidad óptica, está dispuesta una lente cilindrica 17 que, al igual que la primera fuente de luz 15, se extiende a lo largo de toda la longitud de la primera pared lateral 34. Entre la segunda fuente de luz 16 y la segunda pared lateral 35 también está dispuesta una lente cilíndrica 18.

Mediante el dispositivo 10 es posible tomar una pluralidad de imágenes digitales de la placa de cultivo celular 30 en sucesión en el tiempo con la cámara 11, y las imágenes se toman desde el lado inferior 33 de la placa de cultivo celular 30. Por consiguiente, la cámara 11 con su objetivo 12 está dispuesta debajo del soporte 13 para la placa de cultivo celular 30. El dispositivo 10 comprende medios, que no se muestran aquí, para almacenar y procesar las imágenes tomadas por la cámara 11. Alternativamente, el dispositivo 10 puede estar conectado a medios (informáticos) correspondientes.

La figura 2 muestra a escala ampliada la disposición de la placa de cultivo celular 30 y del equipo de iluminación 14 con la primera fuente de luz 15 y la segunda fuente de luz 16. Las cavidades individuales 31 de la placa de cultivo celular 30 se llenan con una solución acuosa 36 que contiene de 50 a 100 nematodos y una sustancia activa a investigar. La figura 2 muestra ocho cavidades 31 dispuestas en una serie; doce series dispuestas una al lado de la otra darían como resultado un total de 96 cavidades 31 individuales. Son posibles otras cuadrículas para la placa de cultivo celular 30, por ejemplo una cuadrícula de 4x6 o 6x8.

En las diferentes cavidades 31 pueden envasarse diferentes ingredientes activos. También puede haber cavidades en las que sólo haya nematodos en la solución acuosa sin sustancia activa.

Las lentes cilíndricas 17, 18 hacen que la luz de las fuentes de luz 15, 16 se dirija en dirección del lado inferior 33. . Las lentes cilíndricas 17, 18 impiden que la luz de las fuentes de luz 15, 16 alcance directamente el lado superior 32 de la placa de cultivo celular 30, en cuyo caso, en el lado superior 32, se prevé una lámina 37 que cubre las cavidades individuales 31 desde arriba. Además, las lentes cilíndricas 17, 18 o la disposición de las lentes cilíndricas 17, 18 se diseñan de tal manera que ninguna luz incide directamente en el objetivo 12 de la cámara 11. Los números 17a y 17b indican los rayos de luz que salen de la lente cilíndrica 17. Los rayos de salida correspondientes de la lente cilíndrica 18 se indican mediante los números 18a, 18b.

De la figura 2 se desprende que las lentes cilíndricas 17, 18, al menos sus ejes centrales que se extienden perpendicularmente al plano de dibujo, están dispuestas entre el lado superior 32 y el lado inferior 33 de la placa de cultivo celular 30 cuando la placa de cultivo celular 30 se encuentra en el soporte 13 del dispositivo 10 previsto para ello.

La figura 3 muestra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización del procedimiento según la invención. El diagrama de flujo comienza con un bloque de inicio 100. En el bloque 101, se determina un valor asintótico AW por medio de nematodos no tratados. El valor asintótico AW es el número máximo de píxeles diferenciales que puede resultar cuando se compara una imagen posterior con una imagen base. La figura 4 muestra dicho valor asintótico AW para una curva de medición 50 de nematodos no tratados. Los puntos de medición individuales representan el número de píxeles diferenciales que resultan de la comparación de las imágenes posteriores registradas en diferentes momentos con una imagen base registrada en el momento t = 0. El valor asintótico AW está vinculado a un período de tiempo de toma TA dentro del cual la curva de medición 50 alcanza el valor límite asintótico AW, al menos aproximadamente. En el presente ejemplo, el período de tiempo de toma debe ser de 27 segundos, y el intervalo entre dos imágenes posteriores adyacentes o el intervalo entre la primera imagen posterior y la imagen de base (t = 0) debe ser de tres segundos. Así, un número nAW de imágenes por curva de medición, incluida la imagen base (t = 0), es igual a 10.

La figura 4 también muestra una curva de medición 51 ejemplar (promediada) para nematodos tratados. Puede observarse que la curva de medición 51 pasa por debajo de la curva de medición 50 para los nematodos no tratados, ya que los nematodos tratados se mueven más lentamente o algunos de ellos ya no se mueven. Cuanto menor sea el área bajo la curva de medición 51 en relación con el área bajo la curva de medición de los nematodos no tratados, mayor será el efecto de la sustancia activa correspondiente. No obstante, la curva de medición 51 promediada se analizará con más detalle más adelante.

Tras determinar el valor asintótico AW sobre la base de nematodos no tratados y tras determinar el número de imágenes nAW por curva de medición o por serie (bloque 101), se registra un cierto número de imágenes imagen_1 a imagen_x en el bloque 102 según la figura 3. En este punto, cabe señalar que la cámara 11 crea una imagen completa de la placa de cultivo celular 30 con todas las cavidades en un punto en el tiempo, en cuyo caso las imágenes imagen_1 a imagen_x se recortan o se crean a partir de esta imagen completa para cada cavidad individual. A continuación, estas imágenes se binarizan en el bloque 103. Durante la binarización, los píxeles individuales se asignan a los nematodos (píxel blanco) o al fondo (píxel negro). La binarización en el bloque 103 debe ir precedida de la definición de un valor umbral para la intensidad del píxel, mediante el cual los píxeles pueden dividirse en "blancos" y "negros".

Para una primera curva de medición m = 1 (véase el bloque 104), las imágenes imagen_2 a imagen_nAW se utilizan ahora determinando el número de píxeles diferenciales entre inicialmente una primera imagen posterior imagen_2 y la imagen base imagen_1 mediante un procedimiento diferencial (véase el bloque 105 y el bloque 106). El bloque 106 se recorre varias veces en un bucle para determinar el número de píxeles diferenciales para varias imágenes posteriores (imagen_2 - imagen_1; imagen_3 - imagen_1; imagen_4 - imagen_1; ...; imagen_nAW - imagen_1). Se sale del bucle 107 cuando el número de imágenes de la primera curva de medición ha alcanzado el valor n = nAW m -1 y la consulta 108 prevista dentro del bucle 107 no puede responderse con un "sí". En este caso todos los valores están presentes para crear la primera curva de medición m = 1 (cf. bloque 109).

Tras crear la primera curva de medición m=1, se crean ahora otras curvas de medición mediante el bucle 110 (m = 2, m = 3, ..., m = mmax). Una segunda curva de medición se basa en las imágenes diferenciales imagen_3 - imagen_2; imagen_4 - imagen_2; ...; imagen_nAW+1 - imagen_2. Así, por ejemplo, la imagen_3 se utiliza para generar tanto la primera curva de medición m = 1 como también la segunda curva de medición m = 2.

Si una consulta 111 dentro del bucle 110 no puede responderse con un "sí", se sale del bucle 110. Todas las curvas de medición 1, 2, ..., mmax están ahora disponibles, de modo que en el bloque 112 puede realizarse un promedio de estas series de medición. Se ha comprobado que este promedio de las series de medición individuales, que en su mayor parte utilizan las mismas imágenes, puede reducir considerablemente la dispersión estadística. Así, con un total de m+nAW-1 imágenes, pueden generarse m series de medición respectivamente con nAW puntos de medición (incluido el punto cero). En el bloque 113, se lleva a cabo el cálculo de la integral de la curva promediada, y esta integral puede compararse con el área bajo la curva de medición 50 para nematodos no tratados (véase el bloque 114).

Si se supone que la serie de medición 51 de la figura 4 antes mencionada corresponde a la serie de medición promediada según el bloque 112 y el área bajo la curva de medición 50 comprende I50 = 100 unidades de área y el área bajo la curva de medición (promediada) comprende I51 = 65 unidades de área, entonces puede hacerse una afirmación sobre la eficacia de la sustancia activa según la siguiente fórmula: (I50(no tratados) - I51(tratados)/I50(no tratados) -100%. En el ejemplo numérico utilizado como base aquí, resultaría entonces un valor de 35%.

Así, por ejemplo, en una placa de cultivo celular con 96 cavidades, pueden examinarse simultáneamente casi 100 sustancias activas. Para la toma de las imágenes, que son necesarias para generar un número suficiente de series de medición con un número suficiente de puntos de medición para obtener resultados estadísticamente consistentes, a veces bastan 60 segundos. La invención permite así una investigación rápida y eficaz del efecto de los sustancias activas sobre los nematodos u organismos similares.

Lista de signos de referencia

1.

Dispositivo

10.

Carcasa

11.

Cámara

12.

Objetivo

13.

Soporte

14.

Equipos de iluminación

15.

Primera fuente de luz

16.

Segunda fuente de luz

17.

Lente cilíndrica (rayos de salida 17a, 17b)

18.

Lente cilindrica (rayos de salida 18a, 18b)

30.

Placa de cultivo celular

31.

Cavidad

32.

Lado superior

33.

Lado inferior

34.

Primera pared lateral

35.

Segunda pared lateral

36.

Solución

37.

Tapa de la cavidad

100.

Bloque inicial

101.

Bloque

102.

Bloque

103.

Bloque

104.

Bloque

105.

Bloque

106.

Bloque

107.

Bucle

108.

Consulta

109.

Bloque

110.

Bucle

111.

Consulta

112.

Bloque

113.

Bloque

114.

Bloque

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para determinar el efecto de sustancias activas sobre nematodos y otros organismos en ensayos acuosos, que comprende las siguientes etapas

a) llenado de al menos una cavidad (31) de una placa de cultivo celular (30) con nematodos y una sustancia activa; b) disposición de la placa de cultivo celular (30) en un dispositivo (1) que comprende:

- un soporte (13) para la placa de cultivo celular (30), en donde la placa de cultivo celular (30) tiene un lado inferior (33), un lado superior (32) y paredes laterales que se extienden entre el lado inferior (33) y el lado superior (32) y los cavidades de la placa de cultivo celular están cerradas por una tapa de cavidades,

- una cámara (11) que sirve para tomar imágenes de la placa de cultivo celular (30)

- un equipo de iluminación (14) que tiene al menos una primera fuente de luz (15) que ilumina la placa de cultivo celular (30); y entre la primera fuente de luz (15) y una primera pared lateral (34) de la placa de cultivo celular (30), en el estado instalado, está dispuesta una primera unidad óptica que dirige la luz de la primera fuente de luz (15) a través de la primera pared lateral (34) en dirección del lado inferior (33) de la placa de cultivo celular (30);

c) toma de varias imágenes de la placa de cultivo celular (30) en sucesión temporal

d) binarización de las imágenes producidas en función de una iluminación de la placa de cultivo celular (30) e) determinación de una primera curva de medición relativa a la cavidad para una primera serie de imágenes, en donde la primera serie comprende una imagen de base y varias imágenes posteriores, en donde cada imagen posterior se compara con la imagen de base en el procedimiento diferencial y se determina un número de píxeles diferenciales f) determinación de al menos una segunda curva de medición relacionada con la cavidad para una segunda serie de imágenes, en donde para la segunda serie se utiliza una imagen posterior de la primera serie como imagen de base y al menos otra imagen posterior de la primera serie como imagen posterior de la segunda serie

g) determinación de una curva promediada sobre la base de la primera curva de medición y de la al menos segunda curva de medición.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque para la imagen de base de la segunda serie se utiliza una primera imagen posterior de la primera serie que sigue inmediatamente a la imagen de base de la primera serie, porque para la segunda serie, excepto para la primera imagen posterior de la primera serie, todas las imágenes posteriores de la primera serie se utilizan como imágenes posteriores de la segunda serie, y porque la segunda serie se complementa con una imagen posterior adicional.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque se establece un período de tiempo de toma (TA) entre la imagen de base y la última imagen posterior de una serie de tal manera que en este período de tiempo de toma (TA) se alcanza un valor límite asintótico AW para el número de píxeles diferenciales para una cavidad en la que se encuentran nematodos no tratados.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque entre la imagen base de la primera serie y una última imagen posterior de una última serie se establece un período de tiempo total que corresponde aproximadamente al doble de un período de tiempo de toma (TA).

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el intervalo de tiempo entre dos imágenes consecutivas es constante y es de 1 a 5 segundos.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque una serie de imágenes comprende de 8 a 12 imágenes.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque la curva promediada se determina sobre la base de 8 a 12 curvas de medida.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la unidad óptica comprende una lente cilíndrica (17) que se extiende sustancialmente por toda la longitud de la primera pared lateral (34) de la placa de cultivo celular (30).

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la primera fuente de luz (15) comprende un conductor de luz lineal.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el equipo de iluminación (13) comprende una segunda fuente de luz (16) y una segunda unidad óptica dispuesta en una segunda pared lateral (35) de la placa de cultivo celular (30) opuesta a la primera pared lateral.