SE526227C2 - Metod för rening av rekombinant humant serumalbumin - Google Patents

Description

526 227 2 EP 0 570 916 beskriver också en process för att tillverka rekombinant humant serumalbumin genom genmanipulationstekniker, vari rening utförs genom en kombination av steg i vilken en odlingssupematant är föremål för ultrafiltrering, värmebehandling, syrabehandling och en ytterligare ultrafiltrering, följt av påföljande behandlingar med en katjonbytare, en hydro- fobisk kromatografibärare och en anj onbytare och genom utsaltning. I likhet med ovan- nämnda patent, är emellertid reningsschemat för komplext, tidskrävande och därmed för dyrbart för att tillhandahålla en effektiv procedur för att användas i storskaliga förfaranden.

EP 0 699 687 beskriver en metod för rening av rHSA vari ett odlingsmedium är värme- behandlat för att inaktivera proteaser och därefter är i kontakt med en flödesbädd av katj on- växlingspartiklar. Eluenten kan följ aktligen vara föremål för ultrafiltrering, HIC och anjon- byteskromatografi. Emellertid kommer användning av en flödesbädd att kräva utrustning som är annorlunda jämfört med konventionella packade bäddkromatografiska steg. Därmed finns det fortfarande ett behov av mer effektiva och ekonomiskt attraktiva procedurer för rening av rHSA från en odlingsbuljong.

Sammanfattning av unpfinningen Ett syfte med innevarande uppfinning är att tillhandahålla en reningsmetod för rekombinant HSA som är enkel att anpassa till storskaliga förfaranden. Detta erhålls genom en metod, vilken omfattar utsättandet av en cellkultursupernatant (CCS) omfattande rHSA till följande steg: (a) katjonbyteskromatografi på en bimodal högsaltstolerant matris; (b) hydrofobisk interaktionskromatografi (HIC); (c) anjonbyteskromatografi.

Metoden i enlighet med uppfinningen omfattar färre processteg än ovan diskuterade metoder.

Dessutom tillåter den bimodala högsaltstoleranta katjonbytesmatrisen som används i steg (a) användning av en cellkultursupernatant utan någon ytterligare spädning, vilket är en fördel eftersom detta storligen reducerar den totala volymen och därmed kostnaderna i jämförelse med tidigare prior art-metoder. ; q o n nu o 5 2 5 2 2 7 äß -.I=- IÃÉÉ - 3 Ett annat ssyfte med uppfinningen är att förbättra adsorptionskapaciteten hos kromatografi- stegen som används i reningen av rHSA. Detta kan erhållas genom ovan beskrivna metod vari en katjonbytare, omfattande ligander kända som högsaltsligander (HSL), används i steg (a). Nämnda ligander är bimodala i bemärkelsen att de omfattar åtminstone två ställen som interagerar med den substans som ska isoleras, en tillhandahåller en laddad interaktion och en tillhandahåller en interaktion baserad på vätebindningar och/eller en hydrofob interaktion.

Ett annat syfte med uppfinningen är att vidare sänka falrginnehållet, och mer specifikt att vidare öka renheten hos den slutgiltiga produkten. Detta kan erhållas genom användning av metoden som beskrivits ovan, vari en svag anjonbytare används.

Kort beskrivning av ritningarna Figur 1A-D illustrerar möjliga matrismaterial lämpliga för användning i olika steg av katjonutbyte, hydrofobisk interaktion och anjonbyteskromatograñ enligt uppfinningen.

Figur 2 visar resultaten av katjonbyteskromatografi enligt steg (a) för metoden enligt uppfinningen av en ospädd cellodlingssupematant (CCS). Fraktion 2B innehåller rHSA.

Figur 3 visar resultaten av HIC för fraktion 2B från figur 2. rHSA är eluerad i fraktion 3A.

Figur 4 visar resultaten av anjonbyteskromatograñ av fraktion 3A från figur 3. Renat rHSA är eluerad i fraktion 4B.

Figur 5 visar elektroforesanalyser av huvudfraktionerna som erhållits genom användning av trestegsreningsprotokoll enligt innevarande uppfinning.

Detalierad beskrivning av uppfinningen Ett utförande av innevarande uppfinning är en metod att rena rekombinant humant serum- albumin (rHSA) från en lösning, vilken metod omfattar utsättandet av en cellodlings- supematant (CCS) omfattande rHSA, för följande kromatografisteg (a) katj onutbyte på en bimodal hö gsaltstolerant matris; (b) hydrofob interaktionskrornatografi (HIC); och | ø a n o. 5 2 5 2 2 7 få -.I=' ' (c) anjonutbyte.

I en specifik utföringsforrn av innevarande metod är konduktiviteten hos CCS ovan omkring 10 mS/cm, såsom ovan omkring 15 och företrädesvis över omkring 20, t.ex. omkring 25-50, eller mer specifikt 25-30 mS/cm, när den tillämpas enligt steg (a), vilket är möjligt tack vare typen av katjonbytare som används, vilken omfattar ligander av typer kända såsom högsalts- ligander (HSL). I enlighet med detta är en viktig fördel med innevarande metod att den undviker behovet att späda ut CCS och därigenom tillåta användningen av mycket reducerade prov-volyrner under katjonbytesstegen, att jämföra med tidigare beskrivna metoder för rening av rHSA.

CCS kan genom någon fermentationsbuljong från vilken celler företrädesvis har avlägsnats t.ex. genom centrifugering. Därigenom kan ursprunget av rHSA isolerat enligt innevarande uppfinning vara en lämplig värd, såsom mikrobiella celler, såsom Escherishia coli, Bacillus subtilis etc., jästceller, såsom Saccharomyces cerevisiae, Pichía pastoris etc., eller djurcell- linjer. I en föredragen utföringsforrn är värdcellen Pichía pastoris. Metoder att producera en rekombinant värdcell och förhållanden för att från denna uttrycka ett protein såsom rHSA väl kända, se t.ex. ovan nämnda EP O 612 761 som referens till olika patentansökningar inom detta område.

Huvudsyfiet med steg (a) är att eliminera färgade substanser med låg molekylvikt såsom pigment som är negativt laddade. Sålunda använder steg (a) en katjonbytare, vilken omfattar ligander av typer kända som högsaltsligander (HSL). I denna mening hänvisar "högsalt" till ovan nänmda egenskap av hö gsaltkoncentrationstolerans som är karaktäristisk för denna klass av jonbytare. Denna egenskap tillhandahålls genom ligandemas natur, vilken är bimodal i bemärkelsen att varje ligand omfattar två grupper som har förmågan att interagera med den substans som ska isoleras, i detta fall rHSA. Det primära bindningssättet erhålls genom en laddad bíndningsgrupp t.ex. en j onbytesgrupp, följaktligen klassificeras matriser av HSL-typ som jonbytare. Ett annat bindningssätt erhålls genom en sekundär bíndningsgrupp vilken tillhandahåller en ytterligare interaktion med den substans som ska isoleras. Vanligtvis tillhandahåller den andra bindningsgruppen en vätebindning eller en hydrofob interaktion, men andra interaktioner kan vara möjliga vilket ska diskuteras mer i detalj nedan. I denna be- 526 227 5 märkelse kan det noteras att termen "bimodal" används här för att påvisa att två eller fler bindningssätt är involverade, och det är därför inte begränsat till bara två bindningssätt. I innevarande ansökan används katjonbytare av HSL-typ och sådana katjonbytare har beskrivits i detalj, se t.ex. PCT/EP01/08203 (Amersham Pharmacia Biotech AB). En generell beskrivning av detta kommer emellertid att följa nedan.

Den laddade bindningsgruppen som är närvarande hos en katjonisk högsaltsligand (HSL) kan väljas ut från gruppen omfattande sulfonat (-SO3'/-SO3H), sulfat (-OSO3'/-OSO3H), kafooxyiat (Coor-coon), fosfor (-o1>o32'/-o1>o3rr/-o1>o31¶2 ooh fosfooat (Poåv-Po; H/-PO3H2). I en Föredragen utfóringsforrn är katjonbytaren av HSL-typ en svag katjonbytare, dvs. katjonbytare som har ett pKa över 3. I en alternativ utfóringsfonn har starka katjon- bytare ett pKa under 3. Typiska exempel på sådana svaga katjonbytare är karboxylat (-COO' /-cooH), fosfat (-o1>o32'/-o1>o,H-/-o1>o3H2 ooh fosfooat (-1>o32'/-Po3H'/-Po3ri2).

Den andra bindningsgruppen omfattar åtminstone en vätebindande atom, vilken är belägen på ett avstånd av 1-7 atomer från den katjonutbytande gruppen. En vätebindande atom är en atom som har förmågan att delta i en vätebindning (utom väte), se Karger et al., An Introduction into Separation Science, John Wiley & Sons (1973) sid. 42. Den vätebindande atomen kan välj as från gruppen som omfattar heteroatomer, såsom syre (karbonylsyre, etersyre, estersyre, hydroxysyre, sulfonsyre, sulfonamidsyre, sulfoxidsyre, syre i aromatiska ringar etc.), kväve (amidlcväve, kväve i aromatiska ringar etc.), svavel (tioetersvavel, svavel i aromatiska ringar etc.); och sp- och spz-hybridiserade kol; och halogrupper, såsom fluoro-, kloro-, bromo- eller jodo-, företrädesvis fluoro-. Den andra bindningsgruppen innehåller speciellt icke-laddade atomer eller atomer som är laddade genom ett pH~byte.

Stabiliteten hos katjonbytesligandema som används i steg (a) kan i generella tenner definieras som förmågan att motstå 0,1 eller l M NaOH i vatten under åtminstone 40 timmar.

Som illustrativa exempel av lämpliga kemiska ligandstnikturer hos katjonväxlarna använd- bara i steg (a) av innevarande metod, se ovan nämnda PCT/EP0l/08203. I en speciell utföringsfonn av innevarande metod använder steg (a) HSL-katj onbytesliganden illustrerad i F ig. 1A i innevarande beskrivning. o o | Q nu noob 526 227 6 Defmierad med funktionella termer har katj onbytaren som används i steg (a) av innevarande metod förmågan att (a) binda rHSA genom katjonutbyte i en referensvattenlösning vid en jonstyrka motsvarande 0,3 M NaCl och, (b) tillåta en genombrottskapacítet for substansen 2200%, såsom 2300% eller 2500% eller 2l000%, av genombrottskapaciteten hos substansen för en referenskatjonbytare inne- hållande sulfopropylgrupper ~CH2CH2CH2SO§ vid jonstyrkoma som visas ovan.

PCT/EP01/08203 beskriver en sådan referensjonbytare i mer detalj. Nivån av katjon- utbytesligander i katjonbytaren som används i den uppñnningsrika metoden är vanligtvis vald från intervallet 1-4000 umol/ml matris, såsom 2-500 umol/ml matris, med preferans för 5- 300 umol/ml matris. Möjliga och föredragna intervall är bland andra, bestämt genom matrisens egenskaper, liganden etc. Sålunda är nivån av katjonbytesliganderna vanligen inom intervallet 10-300 för agarosbaserade matriser. För dextranbaserade matriser är intervallet typiskt 10-600 umol/ml matris.

Ovan nämnda PCT/EP01/08203 omfattar också en utfórli g diskussion av matrismaterial som är användbara med katjonbytare av HSL-typ. I korthet kan sådana matriser baseras på organiska eller oorganiska material. Det är företrädesvis hydrofilt och i formen av en polymer, vilken är olöslig och mer eller mindre uppsvällbar i vatten. Hydrofoba polymerer som har deriverats för att bli mer hydrofila är inkluderade i denna definition. Lämpliga inkluderande polyrnerer är polyhydroxypolymerer, t.ex. baserade på polysackarider, såsom agaros, dextran, cellulosa, stärkelse, pullulan etc. och fiillständigt syntetiska polymerer, såsom polyakrylamid, polymetakrylamid, po1y(hydroxyalky1vinyleter), poly(hydroxyalkylakrylater) och poly1netakrylater(t.ex. polyglycídylrnetakrylat), polyvinylalkoholer och polymerer baserade på styren och divinylbensener, och co-polymerer i vilka två eller fler av monomererna motsvarar ovan nämnda polymerer. Polymerer, som år vattenlösliga, kan deriveras for att bli olösliga, t.ex. genom tvärbindning och genom koppling till en olöslig kropp via adsorption eller kovalent bindning. Hydrofila grupper kan introduc- eras på hydrofoba polymerer (t.ex. på co-polymerer av monovinyl- och divinylbensener) genom polymerisation av monomerer som har grupper vilka kan konverteras till OH, eller genom hydrofilisering av den slutgiltiga polymeren, t.ex. genom adsorption av lämpliga oense o : ø ø nu ønoøn 0 525 227 '-.=' -.I=~ .LÉÅÉÉ-ÄÉ 7 föreningar, såsom hydrofila polymerer. Ett illustrativt exempel på en lämplig matris är den kommersiellt tillgängliga pärl-Sepharose, vilken är agarosbaserad och tillgänglig från Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige. Lämpliga oorganiska material för att användas som stödmatriser är kisel, zirkoniumoxid, grafit, tantaloxid etc.

Ovan nämnda PCT/EP01/08203 omfattar en utförlig beskrivning av beredningen av katjonbytare av HSL-typ. Dessutom ges en övergripande beskrivning av metoder för irnmobilisering av ligandbildande föreningar till ytor i G. Hermanson, T. Mallia, A.K. & Smith, P.K., (eds.), Immobilisation Aflinity Lígand Techniques, Academic Press, INC, 1992.

Som nämns ovan är en av fördelama med jonbytare av HSL-typ att det är möjligt att köra adsorption på en kolonn, dvs. bindning av rHSA till liganden, vid förhöjda jonstyrkor järnfört med vad som normalt har använts för konventionella katjonbytare, t.ex. för den tidigare beskrivna sulfopropylkatjonbytaren som diskuterats ovan. Den exakta jonstyrkan som ska användas under bindningen beror på proteinets egenskaper och typen och koncentrationen av liganden på matrisen. Användbara jonstyrkor motsvarar ofiza NaCl-koncentrationer (rent vatten) 20,1 M, såsom 20,3 M eller till och med 20,5 M. Desorption kan utföras t.ex. genom ökning av jonstyrka och/eller genom byte av pH. Typiska salter att använda för byte av jonstyrka är valda bland lösliga ammonium- eller metallsalter av fosfat, sulfat etc., särskilt alkalimetaller och/eller salter av alkaliska jordartsmetaller. Samma salter kan också användas i adsorptionsstegen, men då ofta vid lägre koncentrationer.

I en utföringsform av innevarande metod, är mängden katjonbytesmatris som används i steg (a) omkring hälften av mängden HIC-matris som används i steg (b). Följaktligen är en fördel av innevarande uppfinning den enastående bindningskapaciteten av den bimodala katjon- bytesmatrisen som underlättar en reduktion av volymen och därmed utförandckostnader jämfört med konventionella katjonbytare. I närvaro av en hög saltkoncentration, såsom en konduktivitet på omkring 25-30 mS/cm, är adsorptionen av kommersiellt tillgänglig SP Sepharose för rHSA omkring 2-4 mg/ml packad gel, medan den av högsaltsligandprototypen (fig. 1A) har visat sig vara åtminstone 50 mg/ml. Följaktligen underlättar användningen av birnodala högsaltsliglander (HSL) och signifikant förbättrar reningsprocessen och reducerar kostnadema för utförandet i stor skala. o o o o o o o g 526 227 8 En utföringsforrn av innevarande metod omfattar vännebehandling av CCS före steg (a).

Upphettning kan utföras direkt, t.ex. medan värdcellema fortfarande är närvarande eller efter avlägsnande av dessa, såsom genom centrifugering, ultrafiltrering eller någon annan lämplig metod. Upphettningen kan utföras vid 50-100°C under en tidsperiod på från l minut upp till flera timmar, företrädesvis vid 60-75°C under 20 minuter till 3 timmar och mest företrädesvis vid omkring 68°C under omkring 30 minuter. Uppvärmningen sker enklast genom ett vattenbad som är försett med en termostat. I en utföringsforrn, är en stabilisator tillsatt före uppvärmning, såsom natriumkaprylat vid ett pH på omkring 6,0. Andra stabilisatorer kan användas, såsom acetyltryptofan, organiska karboxylsyror etc. Efter uppvärmning justeras pH hos CCS företrädesvis till ett lägre värde lämpligt för den påföljande adsorptionen av en katjonbytare, såsom pH 4,5.

I en annan uttöringsform av innevarande metod är produkten från steg (a), dvs. traktionen bunden till kolonnen omfattande HSL-typmatrisen, upphettad före steg (b). F öreträdesvis tillsätts ett reducerande ämne såsom cystein. Andra exempel på användbara reducerande ärrmen är merkaptoetanol, reducerad glutation etc. Syftet med detta är att underlätta avlägsnandet av färgade substanser under steg (b). Denna värmebehandling är vanligtvis utförd enligt ovan, även om man i den föredragna utföringsforrnen använder en något lägre temperatur såsom omkring 60°C under en något längre tidsperiod såsom omkring 60 minuter.

Som nämnts ovan, använder steg (b) i innevarande metod hydrofob interaktionskromatografi (HIC). Huvudsyftet i steg (b) är att avlägsna proteolytiska nedbrytningsprodukter av rHSA, vilkens produkter vanligtvis är i storleken omkring 10-50 kDa. HIC är en välkänd princip inom kromatografin, och erbjuder ett användbart verktyg för separation baserad på olikheter i ythydrofobicitet. Många biomolekyler som anses vara hydrofila har visat sig fortfarande ha tillräcklig med hydrofoba grupper för att tillåta interaktion med hydrofoba ligander fastade på den kromatografiska matrisen. HIC har redan föreslagits för rening av rHSA, se t.ex. EP 0 699 687. Jämfört med andra välkända separationsprinciper, t.ex. omvänd faskromatografi (reverse phase chromatography), använder HIC en mycket lägre ligand-densitet på matrisen.

Denna egenskap befrämjar en högre selektivitetsgrad, vilken tillåter milda eluerings- förhållanden för att underlätta bevarandet av den biologiska aktiviteten hos det intressanta proteinet. I detta sammanhang används HIC-steget för att adsorbera ovan nämnda nosa-o o 526 227 9 proteolytiska nedbrytningsprodukter av rHSA, medan fiilllängds-rHSA elueras i den obundna fraktionen. Den hydrofoba interaktionen mellan rHSA och den immobiliserade liganden på matrisen förstärks genom en liten ökning av jonstyrkan hos de använda buffertama. Det finns många separationsmaterial idag kommersiellt tillgängliga för HIC, och innevarande uppfinning är inte begränsad till någon specifik matris och/eller ligand. Sålunda, i generella termer, kan matrisen som används i steg (b) vara baserad på ett organiskt eller oograniskt material. I fallet med organiska material kan det t.ex. vara en nativ polymer såsom agaros, dextran, cellulosa, stärkelse etc., eller en syntetisk polymer såsom divinylbensen, styren etc. I fallet med oorganiska matrismaterial, är kisel välkänt och ofia använt material. I en fördelaktig utföringsform är matrisen tvärbunden agaros vilken är kommersiellt tillgänglig från ett antal företag såsom Sepharosem från Amersham Biosciences (Uppsala, Sverige). I en utföringsfonn uppvisar den HIC-matris som används i steg (b) en eller fler hydrofoba ligander med förmågan att inter-agera med rHSA, vald från gruppen som omfattar fenyl, butyl såsom n-butyl, oktyl, såsom n-oktyl etc., företrädesvis på en agarosmatris. Altemativt är hydrofoba li gander såsom etrar, isopropyl eller fenyl närvarande på en divinylbensenmatris såsom Sourcem från Arnersham Biosciences (Uppsala, Sverige). Iden mest föredragna utföringsformen används fenyl-ligander på en tvärbunden agarosmatris vid steg (b). Matrisen omfattar företrädesvis porösa pärlor, vilka kan ha ett vatteninnehåll på omkring över 90%, företrädesvis omkring 94%. Medelpartikelstorleken kan t.ex. vara mellan 10 och 150 pm mätt på en våt pärla, företrädesvis under 100, såsom omkring 90 pm. Li ganddensiteten på matrisen kan t.ex. vara mellan 20 och 60, såsom omkring 40 pmol/ml gel. Som ett specifikt exempel används matrisen Phenyl Sepharosem 6 Fast Flow från Amersham Biosciences (Uppsala, Sverige). I detta specifika fall används det benämnda Fast Flow som matris vars tvärbindning har optimerats för att ge en processanpassad flödeskaraktäristika med typiska flödes- hastigheter på 300-400 cm/tim. genom en 15 centimeters bäddhöjd vid ett tryck på 1 bar.

Emellertid kan fackmannen inom detta område med lätthet anpassa sådana processparametrar beroende på skalan av utförandet. Detta steg kan utföras vid ett pH på omkring 4-8, såsom 6,5-7, och vid en saltkoncentration på omkring 0,01 till 0,5 M, såsom 0,05 till 0,2 M.

Såsom också nämnts ovan använder steget (c) av innevarande metod en anjonbytare, företrädesvis en svag anjonbytare, för att avlägsna smärre föroreningar från steg (b), och speciellt för att avlägsna oönskade föreningar såsom pigment med låg molekylvikt. 526 227 10 Uppfinningen är inte begränsad till användningen av något specifikt anjonbytesmaterial, så länge som det uppvisar tillräcklig mängd ligander med förmågan att binda föreningar med negativ laddning som är oönskade i den slutgiltiga rHSA-produkten.

Anjonbyteskromatografisteget kan t.ex. utföras vid ett pH på omkring 5,0-8,0 och en saltkoncentration på 0,01 till 0,2 M för avlägsnande av föroreningar. Beträffande matris- materialet kan det vara av något organiskt eller oorganiskt material, som diskuterades ovan. I en föredragen utföringsform, omfattar matrisen porösa pärlor av tvärbunden agaros såsom SepharoseTM från Amersham Biosciences (Uppsala, Sverige). Li gandema som är fästade därpå är svaga anjonbytare, av vilken bindningsgnippen är t.ex. en primär eller sekundär arnin. En sådan bindningsgrupp kan vara fäst vid matrisen t.ex. via en alkylkedja med en etergrupp närmast matrisen. Litteraturen beskriver många sätt att fästa en bindningsgrupp till en matris via distanshållare, armar etc., och som nämnts ovan är innevarande uppfinning inte begränsad till någon specifik struktur. I en illustrativ utföringsforrn används agarospärlor som har ligander enligt följande formuia -o-CHZCHZ-NRQHgZH, avs. DEAB sepharoseTM från Amersham Biosciences. Denna utföringsfonn resulterar i rHSA i både den bundna och den obundna fraktionen som elueras från kolonnen, vilket för vissa applikationer är tillfredsställande.

Emellertid använder en alternativ utföringsform, vilken är mer fördelaktig beträffande renhet hos den slutliga produkten, en agarospärla som har li gander som omfattar tvâ estergmpper, och företrädesvis också två hydroxylgrupper. Bindningsgmppcn är då företrädesvis en primär amin. Fördelen med denna utföringsform är att rHSA kommer endast vara närvarande i den fraktion som är moderat bunden till matrisen, vilket resulterar i en mycket förbättrad renhet och utförandebekvämlighet. En illustrativ generell formel för denna senast nämnda utföringsfonn visas i figur 1, emellertid är det förstått att innevarande uppfinning också omfattar en metod vari liknande strukturer använda i steg (c).

Emellertid är det förstått att innevarande uppfinning också omfattar användning av matriser liknande de ovan nämnda, vilka har sitt ursprung från samma generella ligandstruktur.

Dessutom är benämningen "Gel" i formeln i figur 1A är menad att inkludera någon matris, som nämnts ovan i samband med steg (b). Ett kommersiellt tillgängligt exempel på en matris omfattande ovan nämnda ligand är Butyl Sepharosem (Amersham Biosciences, Uppsala, O < n n nu 526 227 11 Sverige). I experimenten som presenteras nedan användes en ligand vars densitet var 160 umol/ml. Följaktligen verkar det som att särskilt fördelaktiga resultat kan erhållas genom optimering av liganddensiteten hos matrisen. Det verkar också som när den först nämnda typen av anjonbytare används dvs. DEAE-typen av matriser, behövs en större volym såsom omkring 3 gånger volymen, att jämföra med det senast nämnda Butyl Sepharose-mediet.

Följaktligen använder den föredragna utföringsforrnen hos innevarande metod en sekundär amin som anjonbytande grupp under steg (c) och en liganddensitet på åtminstone 100 jtmol/ml.

I en särskild utföringsfonn är liganddensiteten hos anjonbytaren i området 50-300, såsom 100-200 och företrädesvis omkring 160 pmol/ml. En fördel är att den renade rHSA kan då bara återvinnas från den bundna fraktionen från steg (c), att jämföra med t.ex. DEAE då det kan finnas i både bundna och obundna fraktioner.

Detaljerad beskrivning av ritningar Fig. 1A-D illustrerar möjliga ligandstrukturer lämpliga att använda i innevarande metod.

Särskilt i fig. lA visas en katjonbytare med hög saltligand (HSL)-typ, fig. IB visar en hydrofob interaktionskromatografimatris kallad Phenyl Sepharose, och fi g. 1C och 1D visar två alternativa anjonbytare nämligen en generell formel inkluderande strukturen för den kommersiellt tillgängliga DEAE-Sepharos (fig. IC när n=0) och den modifierade Butyl Sepharose, vilken omfattar en ökad liganddensitet, vilken beskrivs nedan.

F ig. 2 visar resultaten från steg (a), dvskatjonbyteskromatografi av 147 ml icke spådd cellodlingssupematant (CCS) på en 20 ml kolonn omfattande en katjonbytesmatris med ligandstrukturen illustrerad i fi g. 1A. Fraktionen lB innefattande rHSA vilken är tydligt separerad från förorenin garna presenterade genom fraktion 2A.

F ig. 3 visar resultaten fiån steg (b), dvs., hydrofob interaktionskromatografi (HIC) av fraktion 2B från fig. 2 på en 40 ml kolonn omfattande Phenyl Separahose som visas i fig. IB. Fraktion A representerar rHSA.

Fig. 4 visar resultaten från steg (c), dvs. anjonkromatograñ av fraktion 3A från fig. 3 på en 40 ml kolonn omfattande den modifierade Butyl-Sepharose som beskrivs i den experimentella delen nedan. Den renade rHSA i en fraktion 4B.

CIO z: z: _- _". en: _: un' . evo can z: I I I I o n :z o ' f o en n o o a' ' o u e g .., ' ° ' ' 'I H -f- J.. ' ' 12 Fig. 5 visar nativ PAGE (8-25%) och SDS-PAGE (10-15%) analyser av huvudfraktionerna erhållna med hjälp av trestegsmetoden enligt uppfinningen. För nativ PAGE visualiserad genom silverfärgning (SA), applicerades omkring 3,3 pg protein per fläck. För SDS-PAGE visualiserad genom silverfärgning (SB), applicerades omkring Zpg protein per fläck. För SDS-PAGE visualiserad med Coomassie-färgriing (SC), applicerades omkring 10 pg protein per fläck. 1:CCS; 2:HSL Cat.Ex. (obunden); 3: HSK CaLEx. (bunden); 4: fenyl (obunden; 5.

Fenyl (bunden); 6: HiSub. Butyl; 7: HiSub. Butyl (bunden); 8: HSA (kontroll). Pilarna visar positionerna för rHSA.

EXPERIMENTELL DEL Material och metoder Cellodlingssupernatanten (CCS) innehållande rHSA bereddes genom ferrnentering av genetisk modifierad P. gastori -celler under 2 veckor eller mer, följt av separation av cellerna genom filtrering. CCS, vilken var grön-färgad, delades i alikvoter på omkring 200 ml och lagrades vid -20°C fram till användning. Kvaliteten av CCS bestämdes genom gelñltrering på en analytisk kolonn av Superdexm 200 HR 10/30 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige). Denna analys gav de relativa mängdema av hög molekylär vikt (HMV) och låg molekylär vikt (LMV) föroreningari CCS liksom det ungefärliga innehållet av monomera former av rHSA.

Natriumkaprylat (oktanonsyra, natriumsalt) och L-cystein köptes från SIGMA Chemical Co.

Kromatografiskt renad HSA från human plasma erhölls vänligen genom I. Andersson vid plasmaprocessenheten hos Amersham Biociences, Uppsala Sverige. Proteinkoncentrationen i olika prov bestämdes med hjälp av Bio-Rad Protein Assay kit (känd som Bradford-metoden) Bovint serumalbumin (BSA) användes för att erhålla standaxdkurvan. UV/ Synli g absorptions- mätningar gjordes med hjälp av en Shimadzu UV-l60A-bestärnmande spektrofotometer (Shirnadzu Corporation, Japan). Alla andra kemikalier som användes uppfyllde analytisk eller reagensgrad.

Analytisk elektrofores utfördes med hjälp av ett Phastgel-elektroforessystem och lämpligt PhastGel-medium och buffert-"strips" (alla från Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige).

Elektroforesanalysema utfördes med hjälp av nativ-PAGE (8-25%) eller SDS-PAGE (icke- u | ø o a: 0 526 227 0 c ø o o u no 13 reducerad, 10-15%) geler enligt tillverkarnas rekommendationer. Provmängdema som applicerades per fläck var som följer: omkring 3,3 ug för nativa prov och 2 ug för SDS- behandlade prov, vilka båda fargades med silverfärgningskit (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige); 10 ug för SDS-behandlade prov som hade fárgats med Coomassie Brilliant Blue (CBB).

Masspektrometrisk analys (med avsikt att bestämma massan hos renad rHSA och HSA med plasmaursprung) utfördes av Dr. J. Flensburg vid Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige med hjälp av ett MALDI-TOF-instrument. Peptid-kartläggiiing av den trypsin-digererade nativa och rekombinanta HSA:n utfördes också med hjälp av detta instrument. Resultaten erhållna från den senare analysen användes för att bestämma den mest troliga primära sekvensen av rHSA med hänvisning till de kända sekvensema av trypsinerade peptider genererade från renat HSA.

Matriser och kromatrografisystem Kromatografiexperimenten utfördes vid rumstemperatur (omkring 23 °C med hjälp av ett ÄKTATM Explorer 100 system kontrollerat av UNICORNTM (version 3.1) mjukvara (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige). Separationsmatiisen som användes vid steg (b) är Phenyl Sepharosem 6 Fast Flow (high sub), en vanlig produkt från Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige. Vid steg (c) användes antingen den kommersiellt tillgängliga DEAE SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) eller en modifierad matris: Butyl Sepharosem 6 Fast Flow (Amerscham Biosciences, Uppsala, Sverige) producerades med en ökad liganddensitet (sats U238025:160 umol/ml) att jämföra med den kommersiella produkten (20-40 umol/ml gel). Denna modifierade matris kommer här att benämnas "modifierad Butyl-Sepharose". Vidare använder steg (a) en prototypmatris av HSL-typ, katjonbytare, se fig. 1A. Detta medium packades i en XK26/20 glaskolonn som en tjock suspension i 20% etanol för att erhålla en bäddvolym på 40 ml. En linjär flödes- hastighet på 300 cm/tim. användes. Den packade kolonnen tvättades med omkring 2 bädd- volymer avjoniserat vatten för att eluera det mesta av etanolen och sedan j ämviktad med en lämplig buffertlösning före påsättning av prov. Mängden buffert som behövdes för varje kromatografisteg beroende på olika media visas i Tabell 1 nedan. 526 227 14 Buffertar Buffert A: 25 mM natriumacetat, pH 4,5 Blanda 25 ml 1 M natriumacetat och 40 ml l M ättiksyra och späd till 1 liter med avjoniserat vatten. Konduktivitet: omkring 2 mS/cm vid rumstemperatur (RT).

Buffert B: 50 mM natriumfosfat, 0,1 M NaCl, 10 mM natriumkaprylat, pH 7,0.

Blanda 155 ml 0,2 M Na1HPO4 + 95 ml 0,2 M NaH2PO4 + 5,8 g NaCl + 1,66 g natrium- kaprylat och späd till 1 liter med avjoniserat vatten. Konduktivitet: omkring 16 mS/cm vid rumstemperatur.

Buffert C: 50 mM natriumfosfat, 0,1 M NaCl, pH 6,0 Blanda 212 ml 0,2 M Na2PO4 + 38 ml 0,2 M Na2HlPO4 + 5,8 g NaCl och späd till 1 liter med avjoniserat vatten. Konduktivitet: 14 mS/cm vid rumstemperatur.

Buffert D: 50 mM natriumfosfat, 0,2 M NaCl, pH 6,0.

Blanda 212 ml 0,2 M NaH2PO4 + 38 ml 0,2 M Na2HPO4 + 11,7 g NaCl och späd till 1 liter med avjoniserat vatten. Konduktivitet: 22 mS/cm vid rumstemperatur.

Rengörníng-på-plats (CIP)-lösning 30% isopropanol lösesi l M NaOH-lösning.

Exempel: Rening av rHSA Värmebehandling av cellodlingssupernatant (CCS) Innan katjonbyteskromatografi värmebehandlades CCS främst för att inaktivera proteolytiska enzymer som producerats under fermentering av P. pastoris.

Detta utfördes som följer: Det fiusna CCS-provet tinades och 10 mM Na-kaprylat löstes. pH justerades till 6,0 och värmdes under 30 min. i ett vattenbad (bibehållen temperatur 68°C med hjälp av termostat).

Provet kyldes till rumstemperatur och pH justerades till 4,5.

Om ett konventionellt katjonbytesmedium, såsom SP Sepharose BB, skulle användas under steg (a), skulle man ha behövt späda CCS 2-8 gånger med avjoniserat vatten beroende på den ursprungliga konduktiviteten hos lösningen, för att erhålla en konduktivitet på omkring 5-10 mS/cm (ungefär 1,0 M saltkoncentration). 526 227 15 Emellertid är den HSL-typ-matris som användes enligt innevarande uppfinning mycket tolerantare för en ökad saltkoncentration, och därför kan värmebehandlad CCS normalt appliceras vid steg (a) utan någon ytterligare spädning, så länge konduktiviteten av denna är mindre än 30 mS/cm.

Den delvis renade rHSA som erhölls efier katjonutbyte enligt steg (a) (dvs. fraktionen bunden till HSL-typ-matrisen) var också värmebehandlad före steg (b) enligt följande: Provets pH justerades till 6,0 med l M NaOH och cystein löstes däri till en koncentration på 5 mM för att tjänstgöra som en reducerande agens. Denna lösning värmdes sedan under 60 min. i ett vattenbad som höll 60°C. Huvudsyftet med detta utförande är att underlätta avlägsnandet av färgade substanser genom HIC-matrisen.

Steg tal: Bindning med hjälp av katjonbfleskromatografi Katjonbytesmedium packades i en XK 16/20 kolonn (packad bäddvolym 20 ml) och tvättades med två kolonnvolymer (CV) buffert A för jänwiktning. Värmebehandlad CCS applicerades på kolonnen via en 150 ml SuperloopTM (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) med en flödeshastighet på 300 ml/tim) (150 cm/tim). Mängden applicerad rHSA var omkring l g (dvs. 50 mg rHSA/ml packad gel). Efier provpåsättning, eluerades det obundna materialet med 3 CV buffert A följt av eluering av den bundna rHSA med 5 CV buffert B. De två fraktionema poolades separat och pH hos den bundna fraktionen justerades till 6,0 med en 1 M NaOH-lösning. Lösningen upphettades därefter som beskrivits ovan, kyldes till rumstemperatur och renades ytterligare på en HIC-kolonn som beskrivs nedan. En l ml delmängd från varje poolade fraktion sparades för analytiska syften (dvs. för att bestämma proteinmängd, Agw/Azgo-förhållandet och elektroforetisk analys).

Regenerering: Kolonnen tvättades med 2 CV buffert E för att eluera mycket starkt bundna substanser och återskapa gelens funktion. Kolonnen tilläts stå över natt i samma lösning och tvättades därefter med 4 CV avjoniserat vatten för att eluera det mesta av NaOH och isopropanol. Den regenererade kolonnen var âterjämviktad med 4 CV buffert A före nästa cykel av adsorption/desorptionsprocessen. 0 O o n .o 526 227 16 Steg B: Reningsstez med hi älv av HIC Den rHSA-innehållande fraktionen från det tidigare steget överfördes till en 150 ml Superloopm och applicerades på en XK26/20-kolonn packad med Phenyl Sepharosem Fast Flow (high sub), packad bäddvolym 40 ml. Kolonnen var töijämviktad med 3 CV buffert C.

Efier provpåsättriing, tvättades kolonnen med 2 CV buffert C för att eluera det icke bundna materialet som innehåller rHSA. Det bundna materialet (som huvudsakligen innehåller den 45 kDa-degraderade forrnen av rHSA) eluerades med 2 CV avjoniserat vatten.

Regenerering: Samma procedur som ovan.

Steg (c t: Ytbehandlingssteg med hjälp av svagt anjonsutbyte De två fraktionema erhållna från tidigare HIC-steg poolades och l ml alikvoter från varje sparades för analytisk bestämning (se ovan). En kolonn (XK26/20) packades med DEAE Sepharosem Fast Flow eller ovan beskrivna modifierade Butyl-Sepharose för att erhålla en packad bäddvolym på 40 mLCVarje packat medium tvättades med 2 CV avjoniserat vatten och sedan med omkring 5 CV Buffert C för att jämvikta dem. Den obundna fraktionen erhölls från HIC-steget och överfördes till en 150 ml Superloop och applicerades till den ena eller den andra av de ovan nämnda kolonnerna. Den obundna fraktionen eluerades med 6 CV buffert C (från DEAE Sepharose Fast F low-kolonnen) eller med 2 CV från den modifierade Butyl-Sepharose-kolonnen. Den bundna fraktionen eluerades med 2 CV av en 2 M NaCl-lös- ning (tör DEAE-kolonnen) eller med 5 CV buffert D för den modifierade Butyl-Sepharose- kolonnen. F lödeshasti gheten bibehölls genomgående till 90 cm/tim.

Regenerering: Samma procedur som ovan.

Elueringsprotokollen optimerade enligt uppfinningen för varje medium som användes är summerade i Tabell 1. Fackmarmen inom området kan lätt skala upp ovan beskrivna process till pilot- eller produktionsskaleutfórande. 526 227 17 Tabell l : Antalet kolonnvolvrner (CV) av iärnvikts-, eluerings- och regenereríngslösningar som erfordras För varje kromatografisteg Matris Ekvilibrat Tvätt Eluering Regenerering Tvätt (buffert) (avjoniserat vatten) HSL-typ av 4 [A] 3 [A] 5 [B] 2 [E] 4 Katjonbytare Phe-Seph 3 [C] 2 [C] 2 [*] 2 [E] 4 DEAE-Seph 5 [C] 6 [C] 2 [**] 2 [E] 4 Modifierad 6 [C] 2 [C] 5 [D] 4 butyl-Seph * Avjoniserat vatten ** 2 M NaCl Efllïë! Eftersom trestegsreningsprocessen är baserad på en stegvis eluering, är den lätt att anpassa till storskaligt utförande. Användning av en högligand-Butyl-Sepharose för steg (c) resulterar i effektivt avlägsnande av LMV-föroreningar som elueras som en grupp i den obundna fifaktionen. Användning av högligand-Butyl-Sepharose resulterar också i ett bättre Ago/Am;- törhållande än vid användning av DEAE-matristypen för steg (c).

Claims (10)

526 222 18 PATENTKRAV

1. En metod för att rena rekombinant humant serumalbumin (rHSA) från en lösning, vilken metod omfattar utsättandet av en cellodlingssupematant (CCS) omfattande rHSA för följande kromatografiska steg: (a) katjonbyte på en bimodal högsaltstolerant matris; (b) hydrofobisk interaktionskromatografi (HIC); och (c) anjonbyte.

2. En metod enligt krav 1, vari konduktiviteten hos CCS är över omkring 10, såsom över omkring 15 och företrädesvis över omkring 20, dvs. omkring 25-50 mS/crn, när den tillsätts steg (a).

3. En metod enligt krav 1 eller 2, vari den bímodala katjonbytesmatrisen har tönnåga att interagera med rHSA genom laddningsinteraktion och genom vätebindning och/eller hydrofob interaktion.

4. En metod enligt något av tidigare krav, vilken också omfattar värmebehandling av CCS före steg (a).

5. En metod enligt något av tidigare krav, vilken också omfattar värmebehandling av CCS före steg (b) i närvaro av ett reduktionsmedel.

6. En metod enligt något av tidigare krav, vari steg (b) använder en HIC-matris omfattande fenyl, alifatiska och/eller heterocykliska ligander.

7. En metod enligt något av tidigare krav, vari mängden katjonbytesmatris som används i steg (a) är omkring halva mängden HIC-matris som används i steg (b).

8. En metod enligt något av tidigare krav, vari steg (c) är ett svagt anjonbytessteg. 526 227 :Iäfï- 19

9. En metod enligt något av tidigare krav, vari liganddensiteten av den svaga anjonbytaren >5O nmol/ml gel/matris, företrädesvis >100 nmol/ml gel/matris och mer företrädesvis omkring 160 nmol/gel/matris.

10. En metod enligt krav 9, vari den renade rHSA är återvunnen endast från den bundna fraktionen från steg (c).