ES2959261T3 - Método para inmovilizar muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico - Google Patents

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Abstract

Un método para inmovilizar células vivas dentro de muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico que comprende las etapas de proporcionar una muestra biológica que contiene un número predeterminado de células para analizar; proporcionar un soporte plano particularmente adecuado para su uso en un dispositivo analítico, comprendiendo el soporte plano una superficie funcionalizada con un revestimiento superficial que comprende un material nanoestructurado; depositar una capa laminar de dicha muestra biológica sobre dicha superficie funcionalizada de dicho soporte plano para provocar que las células contenidas en la muestra biológica se adhieran a la superficie funcionalizada del soporte plano; y colocar un fijador sobre la capa laminar de la muestra biológica. Todas las etapas mencionadas anteriormente se llevan a cabo a una temperatura inferior a al menos 25 °C. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para inmovilizar muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere al campo del análisis instrumental de fluidos biológicos y se ha desarrollado con particular atención a un método para inmovilizar muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico en muestras de biopsia líquida.
TÉCNICA ANTERIOR
Una biopsia líquida consiste en una muestra de fluido biológico extraída de varias partes del cuerpo, por ejemplo, sangre periférica, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, orina, saliva, esputo, lágrimas y líquido seminal, que contiene células de valor diagnóstico potencial para enfermedades específicas o condiciones fisiológicas de interés médico.
El análisis de las células presentes en una muestra de biopsia líquida mediante caracterización inmunológica y molecular se está convirtiendo en un método cada vez más importante en el diagnóstico para el cribado, prevención, identificación y seguimiento de condiciones patológicas, no sólo para realizar el diagnóstico inicial sino también a través de la evaluación de la eficacia de la terapia.
Por ejemplo, se han identificado en diversos fluidos biológicos células tumorales raras conocidas como células tumorales circulantes (CTC) derivadas de tumores sólidos. La investigación científica ha dedicado considerables esfuerzos a desarrollar métodos de aislamiento y análisis que puedan resultar eficaces y válidos, o, mejor dicho, sensibles y específicos, desde el punto de vista clínico.
De manera similar a las células tumorales, se identificaron células fetales circulantes (CFC) en mujeres embarazadas. Las CFC son células raras que pueden aislarse de la sangre materna con una simple muestra de sangre y, por tanto, un método no invasivo. Esta muestra de "biopsia líquida" se puede utilizar para el diagnóstico prenatal no invasivo (NIPD) de aneuploidías cromosómicas u otras anomalías genéticas fetales. El paradigma de que la enumeración de CTC proporciona datos clínicos y diagnósticos sobre la evolución de un tumor específico ha surgido de diversos estudios clínicos. Más recientemente, se demostró que una caracterización proteómica y molecular precisa es esencial para vincular estas células raras con el tumor original y predecir con precisión el resultado de la enfermedad.
Hay muchos enfoques conocidos diferentes con el objetivo final de aislar CTC u otras células raras, caracterizarlas por medios inmunológicos o moleculares y evaluar su importancia clínica en fluidos biológicos. Sin embargo, por definición, se trata de células raras que circulan en la sangre u otros líquidos junto con millones de otras células circulantes que pertenecen, por ejemplo, al compartimento hematopoyético y no se adhieren espontáneamente. Como resultado, aislar e inmovilizar células raras de forma rápida y estable sobre un soporte para pruebas posteriores no es una tarea fácil ni rápida.
El documento "Captura celular mejorada en nanohojas de óxido de grafeno funcionalizadas mediante agrupación de oxígeno" por Neelkanth M. Bardhan et al, publicado el 13 de enero de 2017, divulga un método para capturar células tumorales circulantes en nanohojas de óxido de grafeno funcionalizadas a temperatura ambiente.
A nivel clínico, la morfología celular es otro factor relevante en el análisis celular a partir de una biopsia líquida. Todas las células vivas responden a estímulos externos, por ejemplo, a la adhesión a superficies proteicas o recubrimientos de matrices de anticuerpos, a tratamientos farmacológicos o a condiciones ambientales estresantes debido a flujos o presiones. Esta respuesta biológica a los estímulos externos es capaz de provocar una alteración sustancial en la morfología celular que, a su vez, conduce a un diagnóstico inexacto. Por ejemplo, los documentos CN103667191 (que revela el preámbulo de la reivindicación 1) y CN105950436 divulgan métodos que utilizan una superficie fractal o nanoestructurada, que comprenden una etapa en la que la superficie se prepara mediante la adhesión de anticuerpos específicos, por ejemplo, anti-EpCAM, y/o anticuerpos modificados, antes de depositar la muestra de fluido biológico en dicha superficie.
Por el contrario, para obtener una célula con una característica biológica "inalterada" que corresponda a su condición "in vivo" para fines de evaluación clínica, cualquier manipulación, interacción con estímulos externos y/o tratamiento prolongado de la muestra biológica, que se sabe que inducen tales alteraciones, deben minimizarse.
La citocentrifugación de células vivas es otro método de análisis conocido que cumple estas especificaciones. Mediante la fuerza centrífuga aplicada a la muestra, este método hace que las células presionen contra un soporte, por ejemplo, un portaobjetos de microscopio, y permite su fijación y posterior tinción con métodos inmunológicos (inmunofluorescencia) o moleculares (FISH).
Sin embargo, este método provoca la rotura parcial o total de la célula y altera radicalmente su morfología, dificultando la evaluación diagnóstica del resultado.
Otro método conocido proporciona un fluido biológico que fluye a través de una serie de obstáculos para atrapar células que tienen un tamaño predeterminado mayor que el tamaño de los canales creados entre los obstáculos. Por ejemplo, en el documento WO2013049636 se divulga un sustrato, una extensión acoplada al sustrato y que se extiende hacia afuera desde el sustrato, y un óxido de grafeno funcionalizado dispuesto sobre la extensión. Las extensiones definen una pluralidad de canales y cámaras radiales a través de los cuales fluye el fluido biológico. Además, en el caso de una biopsia líquida para la identificación de CTC, se aplican uno o más marcadores, anticuerpos, antígenos, proteínas o agentes de unión a tumores específicos, por ejemplo, anti-EpCAM, al óxido de grafeno antes de depositar la muestra de fluido biológico en dicha superficie.
De manera similar, en el documento WO2012016136, es conocido proporcionar micro y nanoestructuras que comprenden una serie de obstáculos porosos a través de los cuales puede fluir un fluido biológico. Estos obstáculos son capaces de bloquear mecánicamente las celdas que tienen dimensiones superiores al tamaño del canal creado entre los obstáculos. También en este caso, a los obstáculos se les aplican sustancias que pueden manipular químicamente las células que los atraviesan.
Uno de los principales inconvenientes de las soluciones que seleccionan, capturan, CTC a través de obstáculos insertados en un camino a través del cual fluye una muestra biológica viene dado por la alteración biológica y por tanto morfológica de las propias células sometidas a estrés de flujo. Además, estos métodos, por su naturaleza, seleccionan una población homogénea de células por tamaño o expresión de proteínas superficiales de membrana, no respetando la característica de heterogeneidad que caracteriza a todas las muestras biológicas. Esta heterogeneidad biológica es un dato de importancia clínica que estos métodos no pueden proporcionar.
Dado que numerosos parámetros, incluida la representatividad biológica de la muestra, pueden afectar la precisión del diagnóstico, existe la necesidad de un método que pueda proporcionar una morfología celular altamente precisa durante todo el análisis de una muestra de biopsia líquida y mantener, dentro de la muestra, un alto número de células con características biológicas predeterminadas de valor clínico. En el caso particular de las CTC, la posibilidad de analizar la fracción viva de las células circulantes, que pueden tener diferentes características de tamaño y morfología y expresión proteica, representaría sin duda la herramienta analítica más adecuada para un diagnóstico precoz de posibles procesos metastásicos. Es bien sabido que el proceso metastásico deriva de una o más CTC que son capaces de sobrevivir en el compartimento sanguíneo e invadir los tejidos de los órganos diana para iniciar el proceso de crecimiento del tumor metastásico.
A la luz de lo anterior, el propósito de esta invención es proporcionar una solución a esta necesidad. Otro objetivo es obtener el resultado con una solución sencilla, racional y a un coste razonable.
Estos propósitos se logran mediante las características de la invención expuestas en la reivindicación independiente. Las reivindicaciones dependientes describen aspectos preferidos y/o particularmente ventajosos de la invención.
DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN
Esta invención proporciona un método para inmovilizar células vivas dentro de muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico que comprende las etapas de:
• proporcionar una muestra biológica que contiene un número predeterminado de células para analizar;
• proporcionar un soporte plano particularmente adecuado para su uso en un dispositivo analítico;
• dicho soporte plano comprende una superficie funcionalizada con un revestimiento superficial que comprende un material nanoestructurado;
• depositar una capa laminar de dicha muestra biológica sobre dicha superficie funcionalizada de dicho soporte plano para provocar que las células contenidas en la muestra biológica se adhieran a la superficie funcionalizada del soporte plano; y
• colocar un fijador sobre la capa laminar de la muestra biológica;
• adherir las células contenidas en la muestra biológica a la superficie funcionalizada del soporte plano,
en el cual el material nanoestructurado de la película se selecciona entre cualquiera de los siguientes: Óxido de zinc (ZnO), dióxido de circonio (ZrO<2>), dióxido de titanio (TiO<2>),
caracterizado por que dichas etapas se llevan a cabo a una temperatura inferior a 25 °C.
Esta solución conserva en la medida de lo posible las características que reflejan la condición original de la muestra porque cada etapa del método se realiza a una temperatura que corresponde sustancialmente a la temperatura ambiente. Por tanto, no es necesario someter las células de la muestra biológica a variaciones de temperatura o tensiones de flujo que puedan alterar la morfología celular. Otro aspecto de esta invención proporciona que haya un intervalo de tiempo de menos de 4 minutos entre la etapa de colocar la capa laminar de muestra biológica sobre el soporte plano y la etapa de colocar el fijador sobre dicha capa laminar.
Gracias a esta solución se consigue asegurar que las células contenidas en la muestra biológica no sufren cambios morfológicos que alteren su estado original "in vivo", reduciendo el tiempo normal de procesamiento hasta en 100 veces respecto a los métodos conocidos de inmovilización de células vivas.
Un aspecto adicional de esta invención proporciona que la relación entre la superficie total del soporte plano y la superficie del soporte plano ocupada por la capa laminar de muestra biológica esté entre 1,5 y 9.
Como resultado de esta solución, el área de superficie del portaobjetos de microscopio disponible para la adhesión celular puede ser de hasta 20 mm x 60 mm y, por lo tanto, se aprovecha al máximo la superficie disponible y se necesitan menos portaobjetos estándar para analizar grandes volúmenes de muestras biológicas.
Otro aspecto de esta invención prevé que el porcentaje de células vivas contenidas en la muestra biológica que permanecen adheridas al revestimiento superficial del soporte plano sea superior al 90 %.
Otro aspecto de esta invención prevé que el porcentaje de células vivas contenidas en la muestra biológica que permanecen adheridas al revestimiento superficial del soporte plano sea igual al 99 %.
Así, dicha solución puede garantizar la fiel representatividad de la muestra del paciente, especialmente en el caso de análisis de células raras en una población de células raras.
Un aspecto adicional de esta invención proporciona que el volumen de la capa laminar de dicha muestra biológica esté entre 1 microlitro y 2 mililitros.
Gracias a esta solución, es posible analizar un amplio espectro de volumen de muestra biológica, obteniendo, para todos, el mismo porcentaje de eficiencia de adhesión y, como resultado, el mismo número de células identificables.
Otro aspecto de esta invención incluye una etapa de asociar una sustancia hidrófoba confinada al soporte plano. El material nanoestructurado de la película se selecciona entre cualquiera de los siguientes: Óxido de zinc (ZnO), dióxido de circonio (ZrO<2>), dióxido de titanio (TiO<2>).
Dicha solución garantiza que los materiales de funcionalización no interfieran con las actividades celulares normales y no reaccionen con los reactivos utilizados para preparar los cultivos celulares. Además, el dióxido de titanio mejora las mediciones basadas en fluorescencia debido a su débil autofluorescencia.
Otro aspecto de esta invención proporciona que las células vivas que permanecen unidas al recubrimiento superficial del soporte plano son células raras.
Como resultado de esta solución, es posible vincular las células raras identificadas en la muestra biológica con el tumor original y predecir con precisión el resultado de la enfermedad y/o el tratamiento médico que se está administrando.
Una realización adicional de esta invención proporciona un método de diagnóstico o pronóstico de un tumor en un paciente, que comprende las etapas de realizar el método informado anteriormente, analizar la muestra biológica para identificar las CTC, enumerar las CTC mediante análisis de imágenes para obtener primeros datos clínicos del paciente.
MEJOR MODO DE REALIZAR LA INVENCIÓN
La invención incluye el suministro de una muestra biológica que contiene un número predeterminado de células vivas para analizar. A lo largo de esta descripción, se entenderá por "muestras biológicas" muestras citológicas de células vivas presentes en diversos fluidos biológicos, por ejemplo, derivadas de biopsia líquida, y desproteinizadas en una solución. Las muestras biológicas se recolectan de humanos y se conservan en recipientes adecuados y en condiciones ambientales predeterminadas hasta el momento de su análisis.
Antes del análisis, las muestras biológicas y, por tanto, las células vivas que contienen pueden someterse a un tratamiento preliminar mediante protocolos estándar, por ejemplo, mediante un procedimiento de lisis de glóbulos rojos si la muestra biológica es sangre. Posteriormente, las células se pueden dispersar en un líquido salino isotónico, por ejemplo, un tampón fosfato.
En otros casos, como, por ejemplo, a modo de ejemplo, pero sin limitación, en presencia de líquido cefalorraquídeo, la muestra biológica no se somete a ningún tratamiento preliminar.
Algunas realizaciones pueden incluir la preparación de una muestra biológica que presumiblemente contiene células raras, por ejemplo, células tumorales raras, es decir, células tumorales circulantes (CTC), derivadas de tumores sólidos. Asimismo, otras realizaciones pueden incluir la preparación de una muestra biológica que presumiblemente contiene células fetales circulantes (CFC).
Algunas realizaciones también pueden incluir el recuento de las células presentes en la muestra biológica. Por ejemplo, en el caso de una muestra de sangre, que normalmente no contiene células raras, las células se cuentan para determinar en las etapas siguientes el número de células que se analizarán.
Una vez que la muestra biológica está lista, se dispensa sobre un soporte plano, por ejemplo, un portaobjetos de microscopio, que es particularmente adecuado para su uso en un instrumento analítico. Después de un intervalo de tiempo predeterminado, las células contenidas en la muestra biológica y depositadas sobre el soporte plano se fijan utilizando un fijador alcohólico o reticulante, se analizan, por ejemplo, pero no de forma limitativa, mediante colorantes celulares, anticuerpos o sondas de ADN/ARN y se visualizan con tinción visible o fluorescente.
Se pueden usar marcadores específicos para las operaciones de análisis para identificar células diana de interés diagnóstico, tales como, por ejemplo, células raras o no raras presentes en los fluidos biológicos.
A continuación, la muestra biológica dispensada sobre el soporte plano se puede analizar bajo un microscopio de fluorescencia automatizado o de campo claro para identificar las células diana basándose en los marcadores de interés específico. Por ejemplo, en el caso de las células tumorales circulantes (CTC) en la sangre, los marcadores panqueratina y CD45 se utilizan para revelar células de origen epitelial o hematopoyético. Mediante análisis de imágenes, se enumeran células raras identificadas como CTC (panqueratina positiva y CD45 negativa) para obtener los primeros datos clínicos sobre la enumeración de CTC en el paciente.
Una vez identificadas las células diana, pueden localizarse en el soporte plano, aislarse mediante micromanipulación o "microdisección láser" y probarse mediante ensayos moleculares hasta secuenciación del genoma unicelular o del transcriptoma.
La caracterización molecular y biológica de células diana que son específicas para estados patológicos particulares representa los datos analíticos para el diagnóstico de enfermedades en el contexto de la medicina personalizada.
De acuerdo con una de las realizaciones preferidas de la presente invención, el método para inmovilizar células vivas dentro de muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico comprende una primera etapa de proporcionar un soporte plano particularmente adecuado para recibir una muestra biológica.
El soporte plano es un soporte llano, alargado en dirección preferente, y de muy pequeño espesor, por ejemplo y no como limitación, con un espesor de aproximadamente 1 mm. El soporte plano no comprende ninguna forma de límite de contención física con paredes y techo.
El soporte plano está fabricado preferentemente de un material transparente, como por ejemplo cuarzo, algunos tipos de plástico o, preferentemente, vidrio. El tamaño del soporte plano puede variar dentro de amplios límites, aunque, preferiblemente, es similar al soporte usado para análisis automatizado en los campos médico y biológico, de modo que el soporte plano de la presente invención será particularmente adecuado para su uso en un dispositivo analítico y capaz de ser manipulado con los medios automatizados que ya se utilizan en el campo. Por ejemplo, el soporte plano puede tener unas dimensiones laterales de 25 x 76 mm y un espesor de 1 mm.
El soporte plano comprende al menos una superficie nanoestructurada plana, es decir, funcionalizada, es decir, una superficie plana a la que se aplica un revestimiento superficial, por ejemplo, una película, que comprende un material nanoestructurado. De acuerdo con la presente invención, el recubrimiento superficial comprende uno de óxido de zinc (ZnO), dióxido de circonio (ZrO<2>), preferiblemente dióxido de titanio (TiO<2>), en forma de película. La película de material nanoestructurado, así como la superficie llana nanoestructurada, comprende nanopartículas con una distribución de tamaño inferior a 50 nm, y tiene un espesor entre 20 nm y 200 nm, preferentemente entre 40 nm y 60 nm, con una rugosidad superficial entre 2 nm y 30 nm, preferentemente entre 5 nm y 15 nm.
Se pueden usar diferentes técnicas para depositar la película de material nanoestructurado sobre la superficie plana del soporte plano, incluyendo, entre otras, pulverización catódica, deposición por láser pulsado (PLD) o, preferiblemente, deposición de nanopartículas en un haz supersónico usando una fuente de cúmulo de microplasma pulsado (PMCS).
La película de material nanoestructurado, así como la superficie nanoestructurada plana, se trata preferiblemente con plasma de oxígeno para aumentar su hidrofilicidad.
La superficie nanoestructurada plana define un área delimitada que tiene un tamaño predeterminado. La superficie llana nanoestructurada puede definir un área correspondiente al área de todo el soporte plano, o puede definir un área que tiene un tamaño menor que el área de todo el soporte plano.
El método para inmovilizar células vivas dentro de muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico comprende una segunda y posterior etapa de depósito, en la que una cantidad predeterminada de muestra biológica se deposita directamente sobre la superficie llana nanoestructurada.
De acuerdo con una característica de esta invención, se puede dispensar una capa laminar de muestra biológica, depositándose así, sobre el soporte plano y, por tanto, sobre la superficie nanoestructurada plana. En toda esta descripción, la capa laminar se interpretará como una cantidad de sustancia en la que los tamaños laterales de dicha sustancia son mayores que el espesor de dicha sustancia.
El volumen de la capa laminar de muestra biológica dispensada, así depositada, sobre el soporte plano puede variar ampliamente tanto de acuerdo con el área de la superficie nanoestructurada plana del soporte plano como de acuerdo con la cantidad de muestra biológica que tiene ser analizados para obtener los resultados deseados.
El método para inmovilizar células vivas dentro de muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico incluye un tercer y posterior etapa de adherir o inmovilizar células vivas contenidas en la muestra biológica a la superficie llana nanoestructurada. Durante esta etapa, la capa laminar de muestra biológica se deja reposar sobre dicha superficie nanoestructurada plana durante un intervalo de tiempo predeterminado, permitiendo que las células contenidas en la muestra biológica toquen la superficie y se adhieran, y así se inmovilicen, a la nanosuperficie plana.
El método para inmovilizar células vivas dentro de muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico incluye un cuarto y posterior etapa de fijación de las células vivas, en el que las células vivas contenidas en la muestra biológica y adheridas, o inmovilizadas, sobre la superficie la superficie llana nanoestructurada en la fase anterior se fija mediante la aplicación de una sustancia fijadora, por ejemplo, con un fijador alcohólico o reticulante.
De acuerdo con la invención, todos las etapas que preceden a la etapa de analizar la muestra biológica mediante un instrumento se llevan a cabo a una temperatura inferior a 25 °C. En particular, la etapa de dispensar una capa laminar de muestra biológica sobre el soporte plano para que las células contenidas en la muestra biológica se adhieran al recubrimiento superficial del soporte plano, y la etapa de posicionar un fijador sobre la capa laminar de la muestra biológica, se realiza a una temperatura inferior a 25 °C, preferentemente entre 18 °C y 25 °C, e incluso más preferentemente entre 21 °C y 25 °C. La etapa de inmovilización de las células sobre la superficie llana nanoestructurada se realiza a una temperatura inferior a 25°C, preferentemente entre 18 °C y 25 °C, incluso más preferiblemente entre 21 °C y 25 °C. Además, la etapa de inmovilizar las células sobre la superficie nanoestructurada plana se lleva a cabo sin posicionar el soporte plano en un dispositivo de incubación de células, y, en general, sin ninguna etapa intermedia de incubación.
De acuerdo con otra característica particularmente ventajosa de esta invención, el intervalo de tiempo predeterminado entre la etapa de dispensar la capa laminar de muestra biológica sobre el soporte plano y la etapa de colocar el fijador sobre dicha capa laminar se puede reducir significativamente en comparación a la técnica anterior. En particular, dicho intervalo de tiempo puede ser inferior a 5 minutos, preferentemente inferior a 4 minutos.
Aún más preferentemente, el intervalo de tiempo predeterminado de la etapa de adhesión o inmovilización del método de la presente invención, es decir, el intervalo de tiempo predeterminado en el que la capa laminar de muestra biológica se deja estacionaria sobre dicha superficie llana nanoestructurada, es menos de 5 minutos, incluso más preferiblemente menos de 4 minutos.
Varios experimentos realizados por el Solicitante han demostrado cómo se pueden lograr tales intervalos de temperatura y tales intervalos de tiempo utilizando un soporte plano que tiene dimensiones laterales iguales a 25 mm x 76 mm y sobre el cual se coloca una capa laminar de muestra biológica de un volumen entre 1 μl y se pueden dispensar 2 ml.
El efecto sorprendente que también revelaron los experimentos es que tales intervalos de temperatura y, en particular, intervalos de tiempo permiten que las células vivas contenidas en la muestra biológica se adhieran, o se inmovilicen, a la superficie nanoestructurada plana con un porcentaje superior al 90 %, y en muchos casos, con un porcentaje igual al 99 %.
En los métodos y sistemas conocidos, se requiere un intervalo de tiempo mucho más largo para permitir que las células se fijen en el soporte plano en un número suficiente para ser significativo en las etapas de análisis posteriores. En los métodos y sistemas del tipo conocido, el uso de intervalos de tiempo idénticos al método de la presente invención, si bien redujeron el deterioro celular, no permitieron la adhesión de células vivas en un porcentaje tal que constituyera un dato analítico válido para el diagnóstico de enfermedades en el campo de la medicina personalizada, especialmente en el caso del análisis de células raras en una población de células raras.
Tales experimentos también han revelado cómo la relación entre el área superficial total del soporte plano y el área superficial del soporte plano ocupada por la capa laminar de muestra biológica puede estar preferiblemente entre 1,5 y 9. El método para inmovilizar células vivas dentro de muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico de acuerdo con la presente invención no incluye ninguna etapa en la que la superficie llana nanoestructurada del soporte plano se prepare mediante la adhesión de anticuerpos específicos, por ejemplo anti-EpCAM, y/o anticuerpos modificados, antes de una fase de deposición de la muestra de fluido biológico sobre dicha superficie.
El método para inmovilizar células vivas dentro de muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico de acuerdo con la presente invención no incluye ninguna etapa en la que se haga que el fluido biológico fluya sobre la superficie llana nanoestructurada. En particular, el método de la presente invención no comprende ninguna etapa en la que el fluido biológico se hace volar a través de una serie de obstáculos para retener células que tienen un tamaño predeterminado mayor que el tamaño del canal creado entre los obstáculos.
De acuerdo con otra característica particularmente ventajosa de la presente invención, la superficie llana nanoestructurada del soporte plano de la presente invención no comprende superficies o recubrimientos de matrices de anticuerpos proteicos. De acuerdo con otra característica especialmente ventajosa de la presente invención, las células vivas contenidas en el fluido biológico no están sometidas durante la etapa de adhesión o de inmovilización a condiciones de estrés ambientales debidas a flujos o presiones.
Todas estas condiciones son esenciales para proporcionar una muestra de células que sea representativa para pruebas clínicas, con una mínima perturbación del estado biológico, y para superar las limitaciones descritas con otros métodos de inmovilización y aislamiento conocidos.
Una ventaja adicional de los resultados obtenidos con el método de la presente invención consiste en la cantidad de muestras biológicas, y, por tanto, en la cantidad de soportes planos, a analizar para obtener un diagnóstico preciso. Por ejemplo, se requiere una gran cantidad de células para identificar células raras en muestras provenientes de una biopsia líquida, por ejemplo, sangre periférica. Cuando la muestra biológica es sangre, el número de células debe ser de aproximadamente 30 a 40 millones de glóbulos blancos (leucocitos).
A través del presente método, se puede inmovilizar un número significativo de células por soporte plano, por ejemplo, igual a al menos 2,0-3,0 millones por soporte plano. Por lo tanto, la prueba en una muestra de sangre podría completarse con sólo 10-15 soportes planos. Por el contrario, en los métodos de citocentrifugación conocidos, el número de células por soporte plano es tan bajo que hace imposible manipular y analizar la muestra de biopsia líquida del paciente.
Además, la tinción con marcador de un menor número de muestras biológicas posibilita una gestión automatizada, asociada a un menor consumo de volumen de reactivo, lo que se traduce en un importante ahorro de costes.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el método para inmovilizar células vivas dentro de muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico también comprende una etapa de asociar una sustancia hidrófoba confinada al soporte plano. Una sustancia hidrofóbica confinada es cualquier sustancia que comprende un compuesto hidrofóbico o un grupo funcional que debido a su estructura no muestra afinidad por el agua.
Numerosos experimentos realizados por el Solicitante han demostrado que la sustancia hidrófoba de confinamiento es preferiblemente a base de alcohol y convenientemente disuelta en un disolvente volátil.
La disposición de la sustancia hidrófoba confinada sobre el soporte plano define uno o más límites de contención que impiden el paso de un líquido acuoso. Los límites de contención pueden definir una o más áreas de superficie que son variables en forma y tamaño y a las que se puede confinar una capa laminar de la muestra biológica sin ningún otro elemento límite de contención física.
Después de aplicar la sustancia hidrófoba de confinamiento, el soporte plano se seca de modo que el disolvente volátil se disuelva. Por lo tanto, el límite de contención, cuando está seco, forma una capa molecular que está sustancialmente al ras con la superficie del soporte plano.
De esta forma, es posible depositar sobre el soporte plano varias capas laminares que pueden ser de la misma muestra biológica o cada una de una muestra biológica diferente, manteniéndolas separadas entre sí. Además, es posible crear superficies de diferentes tamaños y que contengan diferentes volúmenes de líquido biológico. Esta solución es particularmente eficaz en los casos en los que el soporte plano debe manipularse con una plataforma de manipulación de líquidos automatizada estándar.
La etapa de asociar una sustancia hidrófoba confinada al soporte plano tiene lugar preferiblemente después de la etapa de proporcionar el soporte plano y antes de la etapa de depositar una capa laminar de muestra biológica sobre el soporte plano.
Un efecto sorprendente adicional que han demostrado las pruebas realizadas por el Solicitante es que el método para inmovilizar células vivas dentro de muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico de la presente invención permite que sólo células vivas se adhieran a la superficie llana nanoestructurada del soporte plano.
Todos los detalles pueden ser reemplazados por otros elementos técnicamente equivalentes. Asimismo, los materiales utilizados, así como las eventuales formas y dimensiones, pueden ser cualesquiera, de acuerdo con las necesidades, sin salirse del ámbito de protección de las siguientes reivindicaciones.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Método para inmovilizar células vivas dentro de muestras biológicas con fines analíticos y de diagnóstico que comprende las etapas de:
- proporcionar una muestra biológica que contiene un número predeterminado de células para analizar;
- proporcionar un soporte plano particularmente adecuado para su uso en un dispositivo analítico;
- comprendiendo dicho soporte plano una superficie funcionalizada con un revestimiento superficial que comprende un material nanoestructurado;
- depositar una capa laminar de dicha muestra biológica sobre dicha superficie funcionalizada de dicho soporte plano para provocar que las células contenidas en la muestra biológica se adhieran a la superficie funcionalizada del soporte plano; y
- colocar un fijador sobre la capa laminar de la muestra biológica;
- adherir las células contenidas en la muestra biológica a la superficie funcionalizada del soporte plano, en el cual el material nanoestructurado de la película se selecciona entre cualquiera de los siguientes: Óxido de zinc (ZnO), dióxido de circonio (ZrO<2>), dióxido de titanio (TO<2>),
caracterizado por que dichas etapas se realizan a una temperatura inferior a 25°C.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el intervalo de tiempo entre el posicionamiento de la capa laminar de muestra biológica sobre el soporte plano y el posicionamiento del fijador sobre dicha capa laminar es inferior a 4 minutos.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la relación entre la superficie total del soporte plano y la superficie del soporte plano ocupada por la capa laminar de muestra biológica está entre 1,5 y 9.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que el volumen de la capa laminar de dicha muestra biológica está comprendido entre 1 microlitro y 2 mililitros.
5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende además una etapa de asociación de una sustancia hidrófoba confinada al soporte plano.
6. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las células vivas que permanecen adheridas al revestimiento superficial del soporte plano son células raras.
7. Método de diagnóstico o pronóstico de un tumor en un paciente, que comprende las etapas de realizar el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, analizar la muestra biológica para identificar Células Tumorales Circulantes (CTC), enumerar las CTC mediante análisis de imágenes para obtener las primeras datos clínicos del paciente.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT202100020600A1 (it) * 2021-07-30 2023-01-30 Tethis S P A Apparato e metodo di preparazione di un campione biologico per scopi analitici o diagnostici
US12442729B2 (en) 2023-11-13 2025-10-14 Singular Genomics Systems, Inc. Devices useful for sample manipulation

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0746100B2 (ja) * 1986-12-30 1995-05-17 素秀 高浜 細胞固定・保存液
WO2007009994A1 (en) * 2005-07-21 2007-01-25 Tethis S.R.L. Support having nanostructured titanium dioxide film and uses thereof
WO2010083852A1 (en) * 2009-01-26 2010-07-29 Tethis S.R.L. Functionalized microfluidic device for immunofluorescence
WO2012016136A2 (en) * 2010-07-30 2012-02-02 The General Hospital Corporation Microscale and nanoscale structures for manipulating particles
US10130946B2 (en) * 2011-09-30 2018-11-20 The Regents Of The University Of Michigan System for detecting rare cells
US9645149B2 (en) * 2011-09-30 2017-05-09 The Regents Of The University Of Michigan System for detecting rare cells
CA2858689A1 (en) * 2011-12-09 2013-06-13 The Scripps Research Institute Apparatus, system and method for identifying circulating tumor cells
CN103667191B (zh) * 2012-09-07 2016-08-10 中国科学院化学研究所 利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法
EP2966445B1 (en) 2013-03-08 2018-06-20 Konica Minolta, Inc. Staining agent for staining tissue, production method for staining agent for staining tissue, and tissue staining kit including staining agent for staining tissue
CN105950436B (zh) * 2016-04-20 2018-05-18 吉林大学 用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片及其制备方法

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