ES2959327T3 - Células madre pluripotentes obtenidas mediante reprogramación no vírica - Google Patents

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Abstract

Se divulgan métodos para reprogramar células somáticas de primates a pluripotencia utilizando un vector episomal que no codifica un virus infeccioso. También se describen células pluripotentes producidas en los métodos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Células madre pluripotentes obtenidas mediante reprogramación no vírica
DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN O AL DESARROLLO CON FONDOS FEDERALES
La presente invención se ha realizado con la financiación del gobierno de los Estados Unidos otorgada por las siguientes agencias: NIH GM081629, RR000167. El gobierno de los Estados Unidos tiene determinados derechos sobre esta invención.
Antecedentes
Las células madre embrionarias (ES,embryonic stem)son muy prometedoras en la ciencia y la medicina debido a su naturaleza pluripotente, es decir, a la capacidad de replicarse indefinidamente y de diferenciarse en células de las tres capas germinales (Thomsonet al.,Science 282:1145-1147 (1998)). La aplicación de las células ES humanas en terapia y medicina regenerativa se complica por la posibilidad de rechazo por parte del sistema inmunitario del receptor. Las células pluripotentes humanas que, desde el punto de vista genético, son sustancialmente idénticas a las de un receptor particular son, por tanto, sumamente deseables. Además, en el diseño de estrategias de tratamiento específicas de los pacientes, la identidad genética puede ser importante para el uso de células ES.
Los primeros intentos de generar células pluripotentes a partir de un individuo primate posnatal emplearon transferencia nuclear somática (véase, p. ej., Byrne, JAet al.,Nature 450:497-502 (2007)) y fusión celular (véase, p. ej., Yu, Jet al.,Stem Cells 24:168-176 (2006)). Sin embargo, el uso clínico de la transferencia nuclear somática no es práctico debido a su baja eficiencia, mientras que la fusión celular da como resultado células casi tetraploides. En 2007, dos grupos de científicos reprogramaron células somáticas de un individuo primate posnatal en células madre pluripotentes (Yuet al.,Science 318:1917-1920 (2007) y Takahashiet al.,Cell 131:861-872 (2007)). Ambos grupos introdujeron y expresaron en células somáticas humanas el ADNc de cuatro factores de transcripción usando un sistema de vectores víricos para expresar transgenes determinantes de fuerza. Los factores de transcripción de Takahashi.et al.eran OCT4,SOX2, c-MycyKLF4,mientras que Yuet al.emplearonOCT4, SOX2, NANOGyLIN28.La expresión de estos conjuntos de factores de transcripción indujo a las células somáticas humanas a adquirir características específicas de las células ES, incluyendo morfología, proliferación y expresión de genes y marcadores de superficie. Las células somáticas reprogramadas de esta manera se denominan células pluripotentes inducidas (iPS,induced pluripotent).La existencia de las células iPS evita la necesidad de blastocistos y reduce las preocupaciones asociadas al rechazo inmunitario.
Poco después, Lowryet al.generaron estirpes celulares iPS específicas del paciente a través de la expresión ectópica de los transgenesOCT4, SOX2, c-mycyKLF4(Lowryet al.,PNAS 105:2883-2888 (2008)). Más recientemente, se han generado células iPS a partir de diversos tipos de células somáticas humanas y murinas diferentes, tales como células epiteliales, fibroblastos, hepáticas, estomacales, neuronales y pancreáticas. Adicionalmente, las células iPS se han diferenciado satisfactoriamente en células de varios linajes(p. ej.,Dimoset al.,Science 321:1218-1221 (2008)). En el documento WO 2009149233 se hace referencia a métodos para la producción de células IPS usando un enfoque no vírico.
Los métodos actuales para generar células iPS emplean vectores retrovíricos tales como los derivados de lentivirus. Estos vectores se integran de forma estable y cambian permanentemente, el ADN de una célula diana en prácticamente cualquier locus cromosómico. Esta interacción no dirigida entre el vector de reprogramación y el genoma se asocia a un riesgo de expresión aberrante de genes celulares, así como a un crecimiento neoplásico causado por la reactivación de genes víricos (Okitaet al.Nature 448:313-317 (2007)).
Por otra parte, la presencia y expresión continua de los transgenes puede interferir con la fisiología de la célula receptora. Adicionalmente, la expresión ectópica de factores de transcripción usados para reprogramar células somáticas, tales comoc-Myc,puede inducir la muerte celular programada (apoptosis) (Askewet al.,Oncogene 6:1915-1922 (1991), Evanet al.,Cell 69:119-128 (1992)). Asimismo, la expresión continua de factores tales comoOCT4puede interferir con la diferenciación posterior de las células iPS.
Es deseable reprogramar las células somáticas a un estado de mayor fuerza sin alterar la composición genética de las células más allá de las alteraciones asociadas a la reprogramación. Recientemente, Stadtfeldet al.generaron células iPS murinas usando un adenovirus no integrador que expresaba transitoriamenteOCT4, SOX2, KLF4yc-Myc(Stadtfeldet al.,Sciencexpress, 25 de sep. de 2008). Hasta ahora, no se han descrito células iPS de primate generadas sin utilizar vectores retrovíricos.
Breve sumario
La presente invención proporciona una población enriquecida de células pluripotentes inducidas de primate que, desde el punto de vista genético, son sustancialmente idénticas a las de un individuo posnatal, en donde la población se produce de acuerdo con un método que comprende las etapas de:
introducir una pluralidad de vectores episomales no víricos que codifican uno o más factores determinantes de la fuerza en las células somáticas de primate en condiciones suficientes para expresar los factores determinantes de la fuerza, reprogramando así las células somáticas para producir células pluripotentes de primate;
en donde al menos algunas de las células pluripotentes inducidas de primate en la población enriquecida, comprenden una o más copias de la pluralidad de vectores episomales no víricos;
en donde la pluralidad de vectores episomales no víricos se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un primer vector que comprende, en orden, un primer promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un segundo promotor, el antígenoTdeSV40,IRES2 yKLF4,un segundo vector que comprende, en orden, un tercer promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un cuarto promotor,NANOG,IRES2 yKLF4,y un tercer vector que comprende, en orden, un quinto promotor,c-Myc,iRe S 2 yLN28,en donde no es preciso que los promotores sean idénticos;
(b) un primer vector que comprende, en orden, un primer promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un segundo promotor,KLF4,IRES2,c-Myc,un tercer promotor,NANOG,IRES2 yLN28,un segundo vector que comprende, en orden, un cuarto promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un quinto promotor, el antígenoTdeSV40,IRES2 yKLF4,en donde no es preciso que los promotores sean idénticos; y
(c) un primer vector que comprende, en orden, un primer promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un segundo promotor,NANOG,IRES2 yLN28,un segundo vector que comprende, en orden, un tercer promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un cuarto promotor, el antígenoTdeSV40,IRES2 yKLF4,y un tercer vector que comprende, en orden, un quinto promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un sexto promotor,c-Myc,IRES 2 yKLF4,en donde no es preciso que los promotores sean idénticos.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos y expresiones técnicas y científicas usadas en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque a continuación se describen materiales y métodos adecuados para la práctica o ensayo de la presente invención, pueden utilizarse otros materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que son bien conocidos en la técnica.
Otros objetivos, ventajas y rasgos distintivos de la presente invención, se pondrán de manifiesto a partir de la siguiente memoria descriptiva junto con los dibujos que se adjuntan.
Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos
Las figuras 1A-B ilustran el efecto sobre la eficiencia de la reprogramación de diferentes secuencias de nucleótidos que unen transgenes en el vector o vectores suministrado(s) durante los métodos de reprogramación.
Las figuras 2A-C ilustran el efecto sobre la eficiencia de la reprogramación de la expresión de los genesc-Myc, KLF-4y del antígeno T grande de SV40 en fibroblastos de prepucio de recién nacido humano.
Las figuras 3A-C ilustran una construcción adecuada para transportar transgenes a células somáticas de acuerdo con el método, expresión temporal de un transgén mediado por un vector episomal y el efecto de la cantidad de vector en la supervivencia celular después de la nucleofección.
Las figuras 4A-D ilustran la reprogramación de fibroblastos de prepucio de recién nacido humano con expresión transgénica mediada por vector episomal.
Las figuras 5A-B ilustran construcciones relacionadas que albergan un casete de expresión útil en los métodos de reprogramación.
Descripción detallada
En el presente documento se describe un método para producir una célula pluripotente de primate que incluye la etapa de suministrar a una célula somática de primate un conjunto de transgenes suficientes para reprogramar la célula somática a un estado pluripotente, transportándose los transgenes en al menos un vector episomal que no codifica un virus infeccioso, y recuperando células pluripotentes. Las referencias del presente documento a un vector "no vírico" o a una construcción "no vírica", indican que el vector o la construcción no puede codificar un virus infeccioso.
En el presente documento también se describe una población enriquecida de células pluripotentes reprogramadas reabastecibles de un primate, incluido un primate humano, en donde, a diferencia de las células iPS existentes, el al menos un vector, incluyendo cualquier elemento del mismo que tenga una fuente o derivación vírica está sustancialmente ausente en las células pluripotentes. Como se usa en el presente documento, esto significa que las células reprogramadas contienen menos de una copia del vector episomal por célula, y preferentemente, ningún vector episomal residual en las células. Dado que el reparto asimétrico durante la división celular diluye el vector, se pueden obtener fácilmente células reprogramadas cuyo vector se haya perdido. Como se indica en otra parte del presente documento, en muy raras ocasiones un vector de reprogramación puede integrarse en el genoma de la célula, pero las células que tienen un vector integrado pueden evitarse detectando la ausencia del vector. Adicionalmente, a diferencia de las células ES existentes, las células pluripotentes de primate son, desde el punto de vista genético, sustancialmente idénticas a las células somáticas de un feto o individuo posnatal. Pueden obtenerse células fetales, p. ej., de líquido amniótico. Las células de la población enriquecida no se distinguen fácilmente de las células ES e iPS de primate existentes desde el punto de vista morfológico (es decir, forma redonda, nucleolos grandes y citoplasma escaso) o por propiedades de crecimiento (es decir, tiempo de generación; las células ES tienen un tiempo de generación de aproximadamente diecisiete a dieciocho horas). Al igual que las células iPS y las células ES, las células reprogramadas también expresan marcadores específicos de células pluripotentes (p. ej.,OCT-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81,pero noSSEA-1).A diferencia de las células ES, las células reprogramadas no derivan inmediatamente de embriones. Como se usa en el presente documento, "no derivan inmediatamente de embriones" significa que el tipo de célula inicial para producir las células pluripotentes es una célula no pluripotente, tal como una célula multipotente o una célula terminalmente diferenciada, tal como células somáticas obtenidas de un feto o individuo posnatal. Al igual que las células iPS, las células pluripotentes producidas en el método pueden expresar transitoriamente una o más copias de factores determinantes de la fuerza seleccionados durante su derivación.
En el presente documento se describen nuevos métodos de reprogramación de células somáticas de primate diferenciadas en células de primate reprogramadas que están sustancialmente exentas de los vectores usados en su producción, introduciendo factores determinantes de la fuerza en un vector no vírico que está presente durante la reprogramación, pero que está sustancialmente ausente en las células reprogramadas. Como se usa en el presente documento, "reprogramación" se refiere a un proceso genético mediante el cual las células somáticas diferenciadas se convierten en células desdiferenciadas que tienen una mayor fuerza que las células de las que derivan.
De manera ventajosa, las células de mayor fuerza producidas en el método, son células pluripotentes euploides. Como se usa en el presente documento, la expresión "células pluripotentes" se refiere a una población de células que expresan marcadores específicos de células pluripotentes, que tienen una morfología celular característica de las células indiferenciadas (es decir, colonia compacta, relación alta entre el núcleo y el citoplasma y un nucléolo prominente) y pueden diferenciarse en las tres capas germinales (p. ej., endodermo, mesodermo y ectodermo). Cuando se introducen en un animal inmunodeprimido, tal como un ratón con SCID(severe combined immunodeficiency,inmunodeficiencia combinada grave), las células pluripotentes forman teratomas que normalmente contienen células o tejidos característicos de las tres capas germinales. Un experto habitual en la materia puede evaluar estas características utilizando técnicas comúnmente utilizadas en la materia. Véase, p. ej., Thomsonet al.,citados anteriormente. Las células pluripotentes son capaces tanto de proliferar en cultivos celulares como de diferenciarse hacia una variedad de poblaciones celulares de linaje restringido que presentan propiedades multipotentes. Las células pluripotentes tienen mayor fuerza que las células somáticas multipotentes, que en comparación están más diferenciadas, pero que no están terminalmente diferenciadas. En el presente documento los productos pluripotentes de los métodos de reprogramación de células somáticas de primate se denominan "células pluripotentes de primate reprogramadas" o células pluripotentes inducidas (iPS). Dichas células son adecuadas para su uso en aplicaciones de investigación y terapéuticas actualmente contempladas para células ES humanas o células iPS existentes.
Las células somáticas diferenciadas, incluyendo las células de un feto, de un recién nacido, de un primate joven o adulto, incluyendo las de un ser humano, son células de partida adecuadas en los métodos. Como células somáticas adecuadas se incluyen, pero limitación, células de médula ósea, células epiteliales, células endoteliales, fibroblastos, células hematopoyéticas, queratinocitos, células hepáticas, células intestinales, células mesenquimatosas, células precursoras mieloides y células del bazo. Otra célula somática adecuada es una célula mesenquimatosa CD29+ CD44+ CD166+ CD105+ CD73+ y CD31- que se adhiere a un sustrato. Como alternativa, las células somáticas pueden ser células que pueden por sí mismas proliferar y diferenciarse en otros tipos de células, incluyendo células madre sanguíneas, células madre de músculo/hueso, células madre de cerebro y células madre de hígado. Usando métodos generalmente conocidos en la bibliografía científica, las células somáticas adecuadas son receptivas, o pueden hacerse receptivas, para la absorción de factores determinantes de la fuerza, incluido el material genético que codifica los factores. Los métodos para mejorar la absorción pueden variar según el tipo de célula y el sistema de expresión. Los expertos en la materia conocen bien condiciones ilustrativas que se utilizan para preparar células somáticas receptivas que tengan una eficacia de transducción adecuada. Las células somáticas de partida pueden tener un tiempo de generación de veinticuatro horas aproximadamente.
Para su uso en terapia, los vectores descritos en el presente documento pueden construirse y diseñarse utilizando métodos generalmente conocidos en la bibliografía científica para aumentar su seguridad, incluir marcadores de selección y enriquecimiento, si se desea, y para optimizar la expresión de las secuencias de nucleótidos contenidas en ellos. Los vectores deben incluir componentes estructurales que permitan al vector autorreplicarse en las células somáticas de partida. Por ejemplo, la conocida combinación Epstein Barr oriP/Antígeno-1 Nuclear (EBNA-1) (véase, p. ej., Lindner, S.E. y B. Sugden, The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells, Plasmid 58:1 (2007)) es suficiente para dar soporte a la autorreplicación de vectores y también pueden emplearse otras combinaciones que se sabe que funcionan en mamíferos, en particular células de primate. El experto en la materia conoce bien técnicas estándar para la construcción de vectores de expresión adecuados para su uso en la presente invención y pueden encontrarse en publicaciones tales como Sambrook J,et al.,"Molecular cloning: a laboratory manual", (3a ed. Cold Spring harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001).
En los métodos, material genético que codifica un conjunto de factores determinantes de la fuerza se suministra a las células somáticas a través de uno o más vectores de reprogramación. Como factores determinantes de la fuerza adecuados pueden incluirse, pero sin limitación, OCT-4, SOX2, LIN28, NANOG, c-Myc, KLF4 y combinaciones de los mismos. Cada factor determinante de la fuerza puede introducirse en las células somáticas como un transgén de polinucleótido que codifica el factor determinante de la fuerza, unido operativamente a un promotor heterólogo que puede conducir la expresión del polinucleótido en la célula somática. Aunque el antígeno T de SV40 no es de por sí un factor determinante de la fuerza, se introduce ventajosamente en las células somáticas ya que proporciona a las células una condición suficiente para promover la supervivencia celular durante la reprogramación mientras se expresan los factores determinantes de la fuerza. Otras condiciones suficientes para la expresión de los factores incluyen las condiciones de cultivo celular descritas en los ejemplos.
Los vectores de reprogramación adecuados son vectores episomales, tales como plásmidos, que no codifican la totalidad o parte de un genoma vírico lo suficiente como para dar lugar a un virus infeccioso o competente para la replicación, aunque los vectores pueden contener elementos estructurales obtenidos de uno o más virus. Se pueden introducir uno o una pluralidad de vectores de reprogramación en una sola célula somática. Se pueden proporcionar uno o más transgenes en un solo vector de reprogramación. Un promotor transcripcional fuerte y constitutivo puede proporcionar control transcripcional a una pluralidad de transgenes, que puede proporcionarse como un casete de expresión. Los diferentes casetes de expresión de un vector pueden estar bajo el control transcripcional de diferentes promotores fuertes y constitutivos, que pueden ser copias del mismo promotor o pueden ser promotores distintos. En la técnica se conocen diversos promotores heterólogos y pueden usarse dependiendo de factores tales como el nivel de expresión deseado del factor determinante de la fuerza. Puede ser ventajoso, como se ilustra más adelante, controlar la transcripción de diferentes casetes de expresión usando distintos promotores que tengan distintas fortalezas en las células somáticas diana. Otra consideración en la selección del promotor o de los promotores transcripcionales es la velocidad a la que el promotor o los promotores se silencia en las células somáticas diana. El experto apreciará que puede ser ventajoso reducir la expresión de uno o más transgenes o casetes de expresión de transgenes después de que el producto del gen o de los genes haya completado o sustancialmente completado su papel en el método de reprogramación. Son promotores ilustrativos el promotor del factor de elongación EF1a humano, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus CMV y el promotor CAG de albúmina de pollo, y promotores homólogos correspondientes de otras especies. En las células somáticas humanas, tanto el promotor de EF1a como el de CMV son promotores fuertes, aunque el promotor de CMV se silencia de una manera más eficaz que el promotor de EF1a, de modo que la expresión de los transgenes bajo el control del primero se desactiva antes que la de los transgenes bajo el control del segundo.
Los factores determinantes de la fuerza pueden expresarse en las células somáticas en una proporción relativa que puede variarse para modular la eficiencia de la reprogramación. Por ejemplo, la eficiencia de la reprogramación de la células somáticas es cuatro veces mayor cuandoOCT-4ySOX2están codificados en una sola transcripción en un solo vector en una proporción de 1:1 que cuando los dos factores se proporcionan en diferentes vectores, de tal forma que la proporción de absorción de los factores en células individuales es incontrolada. Preferentemente, cuando una pluralidad de transgenes está codificada en una sola transcripción, se proporciona un sitio de entrada interno al ribosoma secuencia arriba del transgén o transgenes distal(es) del promotor transcripcional. Aunque la proporción relativa de factores puede variar dependiendo de los factores suministrados, un experto habitual en posesión de esta divulgación puede determinar una proporción de factores óptima.
El experto apreciará que la ventajosa eficiencia de introducir todos los factores a través de un solo vector en lugar de a través de una pluralidad de vectores, pero que a medida que aumenta el tamaño total del vector, se hace cada vez más difícil introducir el vector. El experto también apreciará que la posición de un factor en un vector puede influir en su expresión temporal y en la eficiencia de reprogramación resultante. Por lo tanto, los solicitantes emplearon diversas combinaciones de factores en combinaciones de vectores. En el presente documento se muestran varias de estas combinaciones para dar soporte a la reprogramación.
Después de la introducción del (los) vector(es) de reprogramación y mientras se reprograman las células somáticas, los vectores pueden persistir en las células diana mientras los transgenes introducidos se transcriben y traducen. La expresión transgénica puede regularse a la baja o desactivarse ventajosamente en células que han sido reprogramadas a un estado pluripotente. El (los) vector(es) de reprogramación puede(n) permanecer extracromosómico(s). Con una eficiencia extremadamente baja, el (los) vector(es) puede(n) integrarse en el genoma de la célula. El (los) vector(es) de reprogramación se replica(n) de manera coordinada con el genoma de la célula receptora y, por lo tanto, son razonablemente estables durante aproximadamente dos semanas, más tiempo que los vectores episomales que no pueden replicar su ADN. No obstante, dado que los vectores no se reparten uniformemente en la división celular, en ausencia de presión selectiva, las células pierden el (los) vector(es) episomal(es), por lo que en el método pueden recuperarse fácilmente células pluripotentes sin vectores. Por ejemplo, normalmente se requieren de dos a tres semanas para que los plásmidos episomales basados en oriP/EBNA-1 se mantengan de manera estable en las células somáticas. Durante las dos o tres primeras semanas, las células pierden rápidamente los plásmidos episomales. Una vez estabilizadas las células, éstas siguen perdiendo vector episomal a un ritmo de ~5 % por generación.
Las células pluripotentes producidas en el método pueden cultivarse en cualquier medio que soporte el crecimiento de células pluripotentes, incluyendo, pero sin limitación, un medio definido, tal como TeSR™ (StemCell Technologies, Inc.; Vancouver, Canadá), mTeSR™ (StemCell Technologies, Inc.) y medio sin suero Stemline® (Sigma; St. Louis, Mo.), o un medio acondicionado tal como medio acondicionado de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF,mouseembryonic fibroblast).Como se usa en el presente documento, un "medio definido" se refiere a una formulación bioquímicamente definida que únicamente comprende constituyentes bioquímicamente definidos que pueden incluir constituyentes de composición química conocida o constituyentes derivados de fuentes conocidas. Como se usa en el presente documento, "medio acondicionado" se refiere a un medio de crecimiento que además se complementa con factores solubles de células cultivadas en el medio. Como alternativa, las células pueden mantenerse en los MEF en medio de cultivo.
La invención se entenderá más completamente si se consideran los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Diseño y construcción de casetes de expresión
Se crearon estructuras de casetes de expresión adecuadas utilizando métodos convencionales mediante amplificación directa por reacción en cadena de la polimerasa (PCR,polymerase chain reaction)de marcos abiertos de lectura (ORF,open reading frames)de algunos o todos los transgenes, utilizando como cebadores las primeras y últimas 20 22 bases de la región codificante, y desde los sitios de entrada internos a los ribosomas enumerados en la Tabla 1. Las fuentes del antígeno T de SV40 y de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana, los plásmidos pBABE-puro SV40 LT y pBABE-higro-hTERT, están disponibles en el comercio de Addgene, Inc, Cambridge, m A, como plásmidos 13970 y 1773, respectivamente. Las fuentes de IRES1 e IRES2, los plásmidos pIRESpuro3 y pIRES2EGFP, están disponibles en el comercio de Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA. El segmento 2 del virus de la fiebre aftosa, se sintetizó químicamente. Los casetes de expresión en marco se describen utilizando los códigos expuestos más adelante en la Tabla 1. Por ejemplo, "E-02S" se refiere a un casete de expresión que tiene un promotor de EF1a cadena arriba de las regiones codificantes de OCT4 y SOX2, con IRES2 entre ellas. Del mismo modo, "C-M2K" se refiere a un casete de expresión que tiene un promotor de CMV cadena arriba de las regiones codificantes de c-Myc y Klf4, con IRES2 entre ellas. En varias construcciones, ninguna de las cuales se utilizó en la reprogramación posterior, se empleó un casete de expresión O2S variante ("O2S(2)") que difería de O2S en que contenía un casete promotor TK - Hig - TK poliA (compárense las figuras 5A y 5B). Se seleccionaron casetes que tenían las estructuras indicadas para su uso posterior en métodos de reprogramación mediante determinación empírica de los niveles de expresión de diversos factores. El promotor designado como EF2 (SEQ ID NO:12) era una ligera variante del promotor de EF1a conocido (SEQ ID NO:11) que no difería de EF1a en cuanto a su actividad y que no se utilizó en ensayos de reprogramación posteriores con vectores episomales, más adelante. F2A es un enlazador peptídico que facilita la cotraducción de distintas regiones codificantes expresadas a partir de una sola transcripción. Se probó F2A, pero no se utilizó en ensayos de reprogramación posteriores utilizando vectores episomales. Se probó IRES1, pero no se utilizó en ensayos de reprogramación posteriores utilizando vectores episomales.
Los efectos relativos de varios promotores, las secuencias IRES, y las disposiciones transgénicas en la expresión de los ORF cadena arriba y cadena abajo, se evaluaron clonando por separado varios casetes de expresión transgénica en pSin4, un vector basado en lentivirus modificado, para probar su capacidad en cuanto a reprogramar células somáticas humanas después de la transfección, como se ha descrito anteriormente (Yuet al.,citados anteriormente). Se transfectaron células 293FT con vectores plasmídicos lentivíricos que expresabanOCT4ySOX2unidos por IRES1 o IRES2 usando SuperFect (Qiagen, Valencia, CA), como se muestra más adelante. Las células se recogieron dos días después de la transfección. La figura 1A muestra un análisis de transferencia Western de OCT-4 y SOX2 en células 293FT. Carril 1,pSIN4-EF2-OCT4-IRES1-SOX2;carril 2,pSIN4-EF2-OCT4-IRES2-SOX2;carril 3,pSIN4-EF2-OCT4 F2A-SOX2;carril 4,pSIN4-EF2-OCT4-IRES1-PURO;carril 5,pSIN4-EF2-SOX2-IRES1-PURO;carril 6, sin plásmido (control). El anticuerpo monoclonal de ratón anti-OCT4 humano (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, sc-5279) y el anticuerpo policlonal de cabra anti-SOX2 humano (1:500, R&D Systems, Minneapolis, MN AF2018) se utilizaron para detectar la expresión relativa de OCT4 y SOX2 respectivamente.
La figura 1B muestra la reprogramación utilizando factores determinantes de la potencia unidos en 0,2 x 106 células mesenquimatosas derivadas (Yuet al.,citados anteriormente,) de células ES humanas con inserción del gen(knockin) Oc T4(solicitud de patente estadounidense n.° 2006/0128018 y Zwaka y Thomson, Nature Biotechnology 21:319-321 (2003)). Esta línea se mantuvo bajo selección con neomicina (geneticina: 100 pg/ml, Invitrogen Corp.). El día 16 después de la transducción se efectuó un recuento de colonias de células iPS humanas. Las combinaciones de genesfueron pSIN4-EF2-OCT4-IRES1-SOX2 (O1S); pSIN4-EF2-OCT4-IRES2-SOX2(O2S);pSIN4-EF2-OCT4-F2A-SOX2(OF2AS);pSIN4-EF2-NANOG-IRES1-LIN28(N1L);pSIN4 EF2 NANOG IRES2 LIN28(N2L);pSIN4-EF2-OCT4-IRES1-PURO(O);pSIN4-EF2-SOX2-IRES1-PURO(S);pSIN4-EF2-NANOG-IRES1-PURO(N);pSIN4-EF2-LIN28-IRES1-PURO(L). La abreviatura utilizada para cada vector plasmídico lentivírico se muestra entre paréntesis después del nombre del vector.
Reprogramación de fibroblastos de prepucio de recién nacido humano utilizando construcciones lentivíricas
Se llevaron a cabo experimentos preliminares de reprogramación introduciendo vectores lentivíricos en fibroblastos de prepucio neonatal humano. La figura 2A muestra queNANOGtiene un intenso efecto positivo sobre la eficiencia de la reprogramación cuandoOCT4, SOX2, LIN28yc-MYCtambién se introducen, y que en combinación conOCT4, SOX2yLIN28, NANOGpuede soportar la reprogramación, incluso en ausencia dec-MYCoKLF4.Las construcciones lentivíricas utilizadas fueronpSIN4-EF2-OCT4-IRES2-SOX2(02S);pSIN4-EF2-NANOG-IRES2LIN28(N2L);pSIN4-EF2-LIN28-IRES1-PURO(L);pSIN4-CMV-c-Myc-IRES1-PURO(M);pSIN4-EF2-KLF4-IRES1-PURO(K). Veintiún días después de la transducción, se efectuó un recuento de las colonias de células iPS humanas positivas a la fosfatasa alcalina. El número de colonias de células iPS se obtuvo de un aporte de 2,5 x 104 fibroblastos de prepucio de recién nacido humano (pase 9). Las barras de color gris claro representan el número total de colonias reprogramadas formadas que tienen una morfología habitual de células ES humanas; las barras de color gris oscuro indican el número de colonias grandes con diferenciación mínima.
La figura 2B evidencia la reprogramación utilizando factores determinantes de la fuerza unidos. Las construcciones lentivíricas utilizadas fueronpSIN4-EF2-c-Myc-IRES2-KLF4(EF2-M2K);pSIN4-CMV-c-Myc-IRES2-KLF4(CMV-M2K);pSIN4-EF2-KLF4-IRES2-c-Myc(EF2-K2M);pSIN4-CMV-KLF 4-IRES2-c-Myc(CMV-K2M);pSIN4-CMV-c-Myc-IRES2LIN28(M2L);pSIN4-EF2-NANOG-IRES2-KLF4(N2K). Catorce días después de la transducción, se efectuó un recuento de las colonias de células iPS humanas positivas a la fosfatasa alcalina. El número de colonias de células iPS se obtuvo de un aporte de aproximadamente 7,0 x 104 fibroblastos de prepucio (pase 12). El asterisco indica que la mayoría de las colonias positivas a la fosfatasa alcalina parecían morfológicamente sueltas.
La figura 2C muestra el efecto de la expresión del gen del antígeno T grande de SV40 sobre la eficiencia de la reprogramación. El antígeno T grande de SV40 impide la inducción de c-Myc en fibroblastos murinos (Hermekinget al.,PNAS 91:10412-10416 (1994)) y mejora la eficiencia de la reprogramación (Hannaet al.,Cell 133:250-264 (2008); Maliet al.,Stem Cells doi: 10.1634/stem-cells.2008-0346 (2008)). Las abreviaturas de las combinaciones de genes son las mismas que las de la figura 2B, con la adición del antígeno T grande (T) de SV40. c-Myc también promueve la proliferación celular. Doce días después de la transducción, se efectuó un recuento de las colonias de células iPS humanas positivas a la fosfatasa alcalina. El número de colonias de células iPS se obtuvo de un aporte de aproximadamente ~3,5 x 104 fibroblastos de prepucio (pase 17). La figura 2C demuestra que, si está presente a los niveles alcanzados durante la reprogramación basada en lentivirus, el antígeno T inhibe las fases finales de la derivación de células iPS. A diferencia de, véase más adelante, el caso en donde el antígeno T no tiene este efecto cuando está presente durante el tiempo de expresión temporal y/o nivel alcanzado durante la reprogramación usando vectores episomales. Por añadidura, el antígeno T impide la apoptosis inducida por c-Myc pero no afecta negativamente a la proliferación celular inducida por c-Myc.
Ejemplo 3
Reprogramación de fibroblastos de prepucio de recién nacido humano utilizando construcciones episomales no víricas
Fibroblastos de prepucio de recién nacido humano (Cat. n.° CRL-2097™, ATCC) se mantuvieron en medio de cultivo de fibroblastos de prepucio (DMEM (Cat. n.° 11965, Invitrogen) complementado con suero fetal bovino termoinactivado al 10 % (FBS, HyClone Laboratories, Logan, UT), Glutamax 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM y pmercaptoetanol 0,1 mM).
Diversas combinaciones de factores determinantes de la fuerza proporcionadas como casetes de expresión transgénica construidas como en el Ejemplo 1 y como se detalla a continuación en la Tabla 3, se introdujeron en células somáticas utilizando una construcción episomal pCEP4-EGFP (como se muestra en la figura 3A), lo que dio como resultado una reprogramación con eficiencia variable. pCEP4-EGFP se creó a partir del vector de expresión episomal de mamífero pCEP4 disponible en el comercio (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) insertando la región codificante de EGFP entre los sitios BamHI y NheI de pCEP4. Los vectores episomales de la Tabla 2 se crearon insertando los casetes de expresión designados en pCEP4-EGFP o en una estructura principal relacionada que carecía de P<cmv>(designado pEP4). Véase la figura 3A y las notas a pie de la Tabla 2 para conocer los sitios de clonación en los que se insertaron los casetes de expresión.
Los vectores se introdujeron en los fibroblastos a través de un solo acontecimiento de nucleofección, utilizando el kit Nucleofector para la transfección de fibroblastos dérmicos humanos (fibroblastos dérmicos humanos normales, Amaxa, Inc. Cat. n.° VPD-1001) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la nucleofección, los fibroblastos transfectados (de ~ 0,8 a 1,0 x 106 células cada una) se sembraron inmediatamente en tres placas de 10 cm sembradas con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) irradiados. El medio de cultivo de fibroblastos de prepucio se reemplazó cada dos días. Después de cuatro días, el medio de cultivo de fibroblastos de prepucio se reemplazó por medio de cultivo de células ES humanas (medio de cultivo DMEM/F12 complementado con sustituto de suero desactivado al 20 %, aminoácidos no esenciales 0,1 mM (todo ello de Invitrogen Corp.), Glutamax 1 mM, pmercaptoetanol 0,1 mM y factor de crecimiento de fibroblastos básico de pez cebra (zbFGF, por las siglas del inglés) 100 ng/ml como se ha descrito anteriormente (Amitet al.,Developmental Biology 227:271-278 (2006); Ludwiget al.,Nature Methods 3:637-646 (2006)). Cuando los MEF sembrados ya no podían dar soporte al cultivo de reprogramación, aproximadamente de 8 a 10 días después de la siembra en placa, en su lugar se utilizó medio de cultivo de células ES humanas acondicionado con MEF irradiados. Cuando fue apropiado (aproximadamente de 2 a 3 semanas después de la transfección), los cultivos se tiñeron para detectar fosfatasa alcalina como una señal del desarrollo de colonias de iPS humanas.
Para determinar los parámetros adecuados para introducir construcciones transgénicas, la expresión temporal se evaluó inicialmente midiendo el nivel de EGFP a lo largo del tiempo después de la introducción de EGFP de pEGFP-N2 (control) y se evaluó el vector episomal pCEP4-EGFP en células 293FT (figura 3B).
En experimentos preliminares también se evaluó el efecto de la cantidad de construcción transgénica introducida sobre la supervivencia de las células de fibroblastos de prepucio de recién nacido humano. La figura 3C muestra el efecto de la cantidad de vector episomal pCEP4-EGFP usada sobre la eficiencia de la nucleofección y la supervivencia de fibroblastos de prepucio de recién nacido humano, estimada a partir de la confluencia celular el día después de la nucleofección. En cada pocillo de una placa de 6 pocillos se sembraron aproximadamente 1 x 106 fibroblastos de prepucio nucleofectados. Las líneas grises representan fibroblastos de control no transfectados; las líneas negras representan fibroblastos transfectados.
La figura 4A representa construcciones de expresión transgénica esquemáticas de la Tabla 3 que contienen diversos casetes de expresión que, cuando se introducen en determinadas combinaciones en fibroblastos de prepucio de recién nacido humano, dan como resultado la reprogramación de los fibroblastos en células pluripotentes. Tres combinaciones de vectores de reprogramación episomal introducidos han producido células pluripotentes reprogramadas: (1) pEP4-E-O2S-E-T2K, pEP4-E-O2S-E-N2K and pCEP4-C-M2L; (2) pEP4-E-O2S-C-K2M-E-N2L y pEP4-E-O2S-E-T2K; y (3) pEP4-E-O2S-EN2L, pEP4-E-O2S-E-T2K y pEP4-E-O2S-E-M2K. La Tabla 3 indica la cantidad de cada vector utilizada en cada combinación satisfactoria. Un vector en cada combinación de reprogramación satisfactoria codificó el antígeno T bajo el control del promotor de EF1a.
La figura 4B muestra una imagen de microscopia de campo brillante de una colonia habitual, observándose cambios morfológicos 18 días después de la transfección del vector episomal. La figura 4C muestra una imagen de microscopia de campo brillante de una colonia positiva a la fosfatasa alcalina 18 días después de la transfección del vector episomal.
Veinticinco a treinta días después de la transfección, se realizó un pase de los cultivos de reprogramación una vez a placas nuevas de 10 cm con MEF (proporción 1:3), debido a la presencia de muchas colonias de células no iPS con morfologías similares a las de las colonias de células iPS humanas. Después, se seleccionaron colonias para su posterior análisis. La figura 4D muestra una imagen de microscopia de campo brillante de una colonia de células iPS humanas 6 días después del primer pase del cultivo de reprogramación del día 28 posterior a la transfección. La barra de escala representa 0,1 mm. Para un análisis posterior, las células reprogramadas se mantuvieron en cultivo sin alimentador en Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) con medio acondicionado como se ha descrito anteriormente (Xuet al.,Nat. Biotechnol. 19:971 (2001)).
De manera ventajosa, se logró la eficiencia de reprogramación de más del 1 % de las células de fibroblastos de prepucio de recién nacido reprogramadas, en un tiempo de reprogramación significativamente menor que el que se logró usando cuatro combinaciones de genes.
-
continuación
TABLA 2: n r i n i m l
TABLA 3: Combinaciones de construcciones episomales probadas para determinar la actividad de reprogramación
la
EXPERIMENTO 2
continuación
/-: Se observaron muy pocas colonias o ninguna con cambios morfológicos (fig. FIG. 4B).
, + y ++: Se observó un número diferente (de menos a más) de colonias con cambios morfológicos.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Una población enriquecida de células pluripotentes inducidas de primate que, desde el punto de vista genético, son sustancialmente idénticas a las de un individuo posnatal, en donde la población se produce de acuerdo con un método que comprende las etapas de:
introducir una pluralidad de vectores episomales no víricos que codifican uno o más factores determinantes de la fuerza en las células somáticas de primate en condiciones suficientes para expresar los factores determinantes de la fuerza, reprogramando así las células somáticas para producir células pluripotentes de primate;
en donde al menos algunas de las células pluripotentes inducidas de primate en la población enriquecida, comprenden una o más copias de la pluralidad de vectores episomales no víricos;
en donde la pluralidad de vectores episomales no víricos se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un primer vector que comprende, en orden, un primer promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un segundo promotor, el antígenoTdeSV40,IRES2 yKLF4,un segundo vector que comprende, en orden, un tercer promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un cuarto promotor,NANOG,IRES2 yKLF4,y un tercer vector que comprende, en orden, un quinto promotor,c-Myc,IRES 2 yLN28,en donde no es preciso que los promotores sean idénticos;
(b) un primer vector que comprende, en orden, un primer promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un segundo promotor,KLF4,IRES2,c-Myc,un tercer promotor,NANOG,IRES2 yLN28,un segundo vector que comprende, en orden, un cuarto promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un quinto promotor, el antígenoTdeSV40,IRES2 yKLF4,en donde no es preciso que los promotores sean idénticos; y
(c) un primer vector que comprende, en orden, un primer promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un segundo promotor,NANOG,IRES2 yLN28,un segundo vector que comprende, en orden, un tercer promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un cuarto promotor, el antígenoTdeSV40,IRES2 yKLF4,y un tercer vector que comprende, en orden, un quinto promotor,OCT4,IRES2,SOX2,un sexto promotor,c-Myc,IRES 2 yKLF4,en donde no es preciso que los promotores sean idénticos.
2. La población de la reivindicación 1, en donde la pluralidad de vectores episomales no víricos se selecciona del grupo que consiste en: (1) pEP4-E-O2S-E-T2K, pEP4-E-O2S-E-N2K y pCEP4-M2L; (2) pEP4-E-O2S-C-K2M-E-N2L y pEP4-E-O2S-E-T2K; y (3) pEP4-E-O2S-E-N2L, pEP4-E-O2S-E-T2K y pEP4-E-O2S-E-M2K, en donde pEP4 y pCEP4 son plásmidos, E es un promotor de EF1a; O es una región codificante de OCT4, S es una región codificante de SOX2, T es una región codificante del antígeno T de SV40, N es una región codificante de NANOG, K es una región codificante de KLF4, M es una región codificante de c-Myc, C es un promotor de CMV y L es una región codificante de LIN28.
3. La población de la reivindicación 1 o 2, en donde las células somáticas de primate se obtienen de un individuo posnatal.
4. La población de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el primate es un ser humano.
5. La población de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las células son euploides.
6. La población de la reivindicación 1(a), en donde cada uno del primer, segundo, tercer y cuarto promotor es un promotor del gen del factor de elongación la (EF1la).
7. La población de la reivindicación 1(b), en donde cada uno del primer, tercer, cuarto y quinto promotor es un promotor del gen EF1a y en donde el segundo promotor es un promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV).
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