ES2959701T3 - Moléculas de ácido nucleico para pseudouridilación - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico para pseudouridilación de una uridina diana en un ARN diana en una célula de mamífero, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una región guía capaz de formar un complejo de ácido nucleico parcialmente bicatenario con el ARN diana que comprende la uridina diana. en el que el complejo de ácido nucleico parcialmente bicatenario es capaz de acoplarse a una enzima de pseudouridilación de mamífero, en el que la región guía ayuda a posicionar la uridina diana en el complejo de ácido nucleico parcialmente bicatenario para que la enzima de pseudouridilación de mamífero la convierta en una pseudouridina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de ácido nucleico para pseudouridilación

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 62/648,648, presentada el 27 de marzo de 2018.

Campo de la invención

La invención está relacionada con el campo de la medicina. Más en particular, la invención se refiere al campo de la pseudouridilación, en el que una molécula de ARN en una célula de mamífero es dirigida por una molécula de ácido nucleico, como un oligonucleótido, para reclutar una pseudouridina sintasa para convertir una uridina específica presente en la secuencia de ARN en pseudouridina. Más específicamente, la invención se refiere a oligonucleótidos y versiones acortadas de los ARNsnos incrustados en el intrón H/ACA de tipo salvaje que promueven la pseudouridilación de una uridina en un ARN diana y procedimientos de uso de los mismos.

Antecedentes de la invención

La pseudouridina (<y>) es el nucleótido modificado postranscripcionalmente más abundante en los ARN estables, incluidos el ARNt, el ARNr, el ARNsn y el ARNm, que constituye aproximadamente el 5% del total de ribonucleótidos. La conversión de uridina en y (pseudouridilación) requiere dos reacciones químicas distintas: la ruptura del enlace glucosídico C1'-N1 y la creación de un nuevo enlace de carbono (C1'-C5) que vuelve a unir la base al azúcar. La pseudouridilación es una verdadera reacción de isomerización, que crea un donante de enlace de hidrógeno adicional y, por lo tanto, influye en una amplia variedad de aspectos funcionales dependiendo del tipo de ARN que lleve la y y de la posición dentro de la secuencia de ARN, como la síntesis de proteínas, el aumento de la lectura del codón de parada y el cambio de marco (Yu y Meier, 2014, RNA Biology 11:1483-1494). La figura 1 muestra las estructuras de la uridina y la<y>. Muchos de los ARNm<ys>residen en regiones codificantes, y la mayoría de ellos responden al estrés ambiental, lo que indica su importancia funcional (Carlile etal. 2014, Nature 515:143-146).

En eucariotas y arqueas, la pseudouridilación es introducida entre otras proteínas por ribonucleoproteínas (RNP<s>) de caja H/ACA, cada una de las cuales contiene un ARN pequeño único (ARN de caja H/ACA, una de las dos clases principales de ARN nucleolares pequeños, o "ARNsnos") y cuatro proteínas centrales (NAP75/dyskerin/Cbf5, Nhp2, Nop10 y Gari). NAP75/dyskerin/Cbf5 cataliza las reacciones químicas, convirtiendo la uridina diana en<y>. El componente de ARN sirve como guía que especifica, mediante la interacción de emparejamiento de bases con su ARN sustrato, la uridina diana para la pseudouridilación (Ge y Yu, 2013, Trends Biochem Sci 38(4):210-218). Basándose en este esquema de emparejamiento de bases guía-sustrato, Karijolich y Yu (2011, Nature 474:395-398) diseñaron un ARN artificial de caja H/ACA para introducir y en el ARNm en un codón de terminación prematura (PTC) en S.cerevisiae.Demostraron que, efectivamente, el<y>se incorporaba al ARNm dela TRM4en el PTC. Notablemente, la PTC pseudouridilada promovió la supresión sin sentido alterando la decodificación de ribosomas (Fernandez et al.

2013, Nature 500:107-110; Wu etal. 2015, Methods in Enzymology 560:187- 217; US 8,603,457). Utilizando una estrategia similar, otros demostraron que los ARN H/ACA artificiales podían pseudouridilar específicamente pre-ARNm tras su microinyección en oocitos deXenopus(Chen et al. 2010, Mol Cell Biol 30:4108-4119). En ambos ejemplos, los ARN H/ACA artificiales se modificaron para alterar los bucles que sirven de secuencia guía, pero por lo demás estos ARNsno no se modificaron y seguían siendo de longitud completa.

Los ARNsnos H/ACA de mamíferos suelen estar incrustados (posicionados) dentro de regiones intrónicas de pre-ARNm de genes codificadores de proteínas. Durante la elongación de la transcripción, varias proteínas con un papel funcional en la pseudouridilación, como la Nop10, la disquerina o la Nhp2, se unen a las secuencias nacientes de ARNsno H/ACA, en particular a sus motivos estructurales centrales. Tras el empalme, los ARN guía se procesan mediante desramificación y procesamiento exonucleoyético, dando lugar a un complejo ARN-proteína denominado "pequeñas ribonucleoproteínas nucleares" (snRNPs, o complejo snRNP). Una vez en la forma madura, estas partículas son traficadas de forma intranuclear desde los lugares de transcripción hasta el lugar donde son funcionalmente activas para la pseudouridilación, principalmente en el nucléolo pero también en los cuerpos de Cajal. Durante el ensamblaje del espliceosoma, estos snRNPs son reclutados secuencialmente sobre un sustrato pre-ARNm, sobre el que se formarán híbridos ARN-ARN cortos que permitirán la especificación de los sitios de pseudouridilación. Los ARNsnos de caja H/ACA no tienen preferencia por la localización relativa a los extremos 5' o 3' del intrón y pueden estar presentes en intrones pequeños o muy grandes, a diferencia de los ARNsnos de caja C/D, que normalmente se localizan 60-90 nucleótidos corriente arriba del sitio de empalme 3' y se codifican en intrones relativamente pequeños. Leverette et al. (1992, Cell 71 (7): 1215-1221) propusieron que algunos ARNsnos podrían estar presentes en regiones intrónicas de pre-ARNms. Kiss y Filipowicz (1995, Genes Dev 9(11): 1411-1424) sugirieron que una determinada secuencia de ARNsno podría ser extirpada y procesada completamente a partir de una región intrónica de cualquier ARNm empalmado activamente. Para demostrar la viabilidad de este enfoque, incrustaron artificialmente varios ARNsnos (U17a, U17b y U19) en el segundo intrón del gen de la p-globina humana y expresaron el vector resultante en células similares a fibroblastos. Tras la transfección, comprobaron que los ARNsnos artificiales intrónicos se procesaban correctamente a partir del intrón de la p-globina humana y que el pre-ARNm de la globina se empalmaba correctamente. En particular, esto no ocurrió cuando la secuencia de ARN guía se incrustó artificialmente en un exón. Darzacq et al. (2002, EMBO J 21(11);2746-2756) corroboraron que otros ARN guía podían insertarse en el segundo intrón del gen de la p-globina humana utilizando un vector de expresión bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV) y administrarse a células de mamífero mediante transfección.

A pesar de lo anterior, y del hecho de que los ARNsnos podrían ser entregados a las células y ser procesados a partir de regiones intrónicas, nadie - hasta donde saben los inventores de la presente invención - ha demostrado nunca la pseudouridilación dirigida utilizando ARNsnos en un sistema de mamíferos.

Los ARNsnos H/ACA artificiales descritos en el estado de la técnica se encuentran típicamente en el rango de aproximadamente 140 nt y consisten en ARN, lo que hace que tiendan a ser bastante inestablesin vivo.Por lo tanto, la fabricación y administración de estas moléculas en un entorno terapéutico sigue siendo un reto.

La publicación de patente internacional WO2007/064952 describe procedimientos para afectar a la expresión o traducción del ARNm mediante la modificación de los transcritos de pre-ARNm o ARNm. M. Xiao et al., RNA, vol. 15, n.° 1, 25 de noviembre de 2008, páginas 176-86 describe la funcionalidad y la especificidad de sustrato de los ARN guía de caja H/ACA humanos. P. Richard et al., Mol. Cell. Biol., vol. 26, n° 7, 14 de marzo de 2006, páginas 2540-9 describe cómo el reconocimiento cotranscripcional de los ARNsnos intrónicos humanos de caja H/ACA se produce de forma independiente del empalme. La publicación de patente internacional WO98/50586 describe un pequeño ácido ribonucleico nucleolar modificado que dirige la conversión de una uridina en una pseudouridina en un ácido nucleico diana que incluye regiones flanqueantes primera y segunda situadas a ambos lados de la uridina. Chen Wang et al., EMBO, vol. 23, n° 8, 25 de marzo de 2004, páginas 1857-67 describe la arquitectura y el ensamblaje de las pequeñas ribonucleoproteínas nucleolares y telomerasas H/ACA de mamíferos. Xinliang Zhao et al., RNA, vol. 8, n° 12, diciembre de 2002, páginas 1515-25 describe cómo un ARN guía H/ACA dirige la pseudouridilación de U2 en dos sitios diferentes de la región de reconocimiento del punto de ramificación en ovocitos deXenopus.Bortolin etal., EMBO, vol. 18, n° 2, 15 de enero de 1999, páginas 457-69 describe los elementos esenciales para la acumulación y la función de los pequeños ARN nucleolares que dirigen la pseudouridilación específica del sitio de los ARN ribosómicos. Jady et al., EMBO, vol. 20, no. 3, 1 de febrero de 2001, páginas 541-51 describe un pequeño ARN guía nucleolar que funciona tanto en la metilación de 2'-0-ribosa como en la pseudouridilación del ARN espliceosomal U5. Scott et al., PLOS Comp. Biol., vol. 5, n° 9, 18 de septiembre de 2009, página e1000507 describe precursores de miARN humanos con características de ARNsno de caja H/ACA. Guowei Wu et al., EMBO, vol. 35, n° 6, 12 de febrero de 2016, páginas 654-67, describe cómo las pseudouridinas en U2 ARNsn estimulan la actividad ATPasa de Prp5 durante el ensamblaje del espliceosoma. Guowei Wu y otros, Prot. Eng., vol 560, 27 de abril de 2015, páginas 187-217, ofrece una revisión de la pseudouridina en el ARNm.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones 1 a 19.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la estructura de la uridina y la pseudouridina (<y>). Se muestran los sitios aceptor de enlace de hidrógeno (a) y donante de enlace de hidrógeno (d)..

La Figura 2 muestra la lista de residuos que participan en la unión del ARN guía. El código de aminoácido de una sola letra va seguido del número de residuo indicado en la estructura de la partícula RNP de la caja H/ACA (PDB ID 2HVY). Los átomos potencialmente implicados en la formación de enlaces de hidrógeno se indican después del número de residuo. Los aminoácidos de la RNP de caja H/ACA de la especie archaeaPyrococcus furiosus (P. furiosus)que poseen la capacidad de generar contactos de enlace de hidrógeno con el esqueleto de oxigenofosfato y las bases del ARN se muestran en el panel izquierdo y derecho, respectivamente. Los círculos vacíos representan posibles enlaces de hidrógeno con el esqueleto de azúcar-fosfato del ARN, mientras que los círculos llenos indican posibles enlaces de hidrógeno con las bases del ARN. Los residuos pertenecientes a la proteína homóloga Cbf5, Nop10 y L7ae se indican con asteriscos, ampersands y hashes, respectivamente. La secuencia de la región guía derivada de humanos, tal y como se muestra aquí tanto en el panel izquierdo como en el derecho es:5'-GGGUCCGCCUUGAGUGCCCGGGUGAGAAGCAUGAUCCCGGGUAAUUAUGGCGGACCCACAG-3' (SEQ ID NO:4).

La figura 3 muestra las posiciones dentro del RNAsno H/ACA deP. furiosusque se examinaron en relación con la conservación de la red de interacción de enlaces de hidrógeno. La secuencia es la misma que en la figura 2. Los círculos vacíos (panel izquierdo) y los círculos rellenos (panel derecho) especifican las posiciones de la columna vertebral del ARN en las que se toleran los enlaces PS y las modificaciones 2'-OMe, respectivamente (sin interrumpir las posibles conexiones intermoleculares). Los círculos abiertos se refieren al enlace Ps tolerado en el lado 3' del nucleótido que está junto al círculo.

La figura 4 muestra la estructura básica del RNAsno humano H/ACA ACA19 (A) unido a sus secuencias diana naturales en el 28S ARNr, con el nucleótido diana mostrado en su forma pseudouridilada (<y>). El RNAsno consiste en dos estructuras en forma de horquilla dentro de las cuales se encuentran los bucles internos de unión a la diana, así como la caja H entre las horquillas y la caja ACA en el extremo 3'. La secuencia de este RNAsno ACA19 de tipo salvaje de longitud completa con la caja H subrayada (en recuadro en la figura) y la caja ACA en negrita (también en recuadro en la figura) es: 5'- GUGCACAUUUCAUUGACCUGCUUUCUUUUAUGUGAGUAGUGUUAUUUCUUAUGUGUGCUA UACAAAUAAUUGAAGGCUAAUUAGCAGUAUAACUAAAUAGUAAUGCUGCCUGUGUCC UUCAGACAAAA-3' (SEQ ID NO:5).

Las dos secuencias 28s ARNr son las siguientes: 5'-aaagugaagaaauucaaugaagcgcggg-3' (SEQ ID NO:6; LI3709; región guía izquierda), y 5'-gaauccgacuguuuaauuaaaaca-3' (SEQ ID NO:7; 113618; región guía derecha). En ambos ARNr 28s está subrayada la uridina que se convierte en pseudo-U.

La estructura básica del ARN guía de pseudouridilación acortado tal y como se describe en el presente documento se muestra a la derecha (B) y tiene la siguiente secuencia, que difiere en el extremo 5' debido a nucleótidos residuales de la transcripción, y que difiere en el bucle diana debido a que la secuencia del ARNm diana difiere de la secuencia del ARNr 28s (SEQ ID NO:7): 5'-GGAAUUGAAGGCU GGUUCGCAGUAUAACUAAAUAGUAAUGCUGCCUGUCCUUCAGACAAAA-3' (SEQ ID NO:8).

La figura 5 muestra los resultados de un ensayo de pseudouridilación de un ARN sustrato marcado radiactivamente utilizando o bien ninguna guía (como control negativo), el ARN guía de pseudouridilación acortado o el ARNsno ACA19 de longitud completa en la cantidad indicada. U y ^ indican la migración de uridina y pseudouridina en la cromatografía en capa fina, respectivamente.

La Figura 6 muestra los cuatro oligonucleótidos editores pseudouridilados ACA19 (psEONs), todos con la secuencia de SEQ ID NO:8, y las posiciones de las modificaciones químicas que se introdujeron: los puntos negros indican modificaciones 2'-OMe en la fracción ribosa de ese nucleótido, y los puntos abiertos indican modificaciones PS del enlace inter-nucleosídico.

La Figura 7 muestra el resultado de la pseudouridilación utilizando los cuatro psEONs ACA19 junto con el ARN guía correspondiente (sin modificaciones químicas) como control positivo y un control negativo (sin a Rn guía). U y ^ indican la migración de uridina y pseudouridina en la cromatografía en capa fina, respectivamente.

La Figura 8 muestra los cuatro CFTR-G542X psEONs (la secuencia del bolsillo guía se cambia para dirigirse al sustrato CFTR en el mismo esqueleto ACA19) y las posiciones de las modificaciones químicas que se introdujeron: los puntos oscuros indican modificaciones 2'-OMe en la fracción ribosa de ese nucleótido, y los puntos abiertos indican modificación fosforotioato del enlace inter-nucleosídico. La secuencia para estos cuatro psEONs es: 5'-GGAAUUGAAGGCCCUUCUGCAGUAUAACUAAAUAGUAAUGCUGCAAGAACCCUUCAGACAAAA-3' (SEQ ID NO:9).

La Figura 9 muestra el resultado de la pseudouridilación utilizando los cuatro psEONs CFTR-G542X en paralelo con el ARN guía correspondiente (sin modificaciones químicas) como control positivo y sin ARN guía como control negativo. U y ^ indican la migración de uridina y pseudouridina en la cromatografía en capa fina, respectivamente.

La Figura 10 muestra los cuatro /dua-W392X psEONs (de izquierda a derecha Idua-A, -B, -C y -D) y las posiciones de las modificaciones químicas que se introdujeron: los puntos negros indican modificaciones 2'-OMe en la fracción ribosa de ese nucleótido, y los puntos abiertos indican modificaciones PS del enlace inter-nucleosídico. La secuencia para estos cuatro psEONs es: 5'-GGAA<u>U<g>A AGGCUCUGCCGCAGUAUAACUAAAUAGUAAUGCUGCGAGUUGUCCUUCAGACAAAA- 3' (SEQ ID NO:10).

La figura 11 muestra el resultado de la pseudouridilación utilizando los cuatro psEONs /dua-W392X (Idua-A, -B, -C y -D) en paralelo con el ARN guía correspondiente (sin modificaciones químicas) como control positivo y sin ARN guía como control negativo. U y ^ indican la migración de uridina y pseudouridina en la cromatografía en capa fina, respectivamente.

La figura 12 muestra una vista esquemática de el constructo puglntron-IDUA que muestra la introducción del inserto pugintron de 131 nt situado entre el sitio Sall en el extremo 5' y el sitio Pstl en el extremo 3', con el exón 1 de 92 nt (E1) y el exón 2 de 223 nt (E2) del gen de la p-globina humana corriente arriba y corriente abajo del mismo, respectivamente. La transcripción está dirigida por un promotor CMV.

La Figura 13 muestra la secuencia completa de nucleótidos del plásmido puglntron-mlDUA (SEQ ID NO:11) como se muestra esquemáticamente en la Figura 12, que lleva el ARN guía que se va a empalmar. Las secuencias de plásmidos se indican en minúsculas. El ARN guía de 131 nt aparece en letra grande. El a Rn guía se empalma con 10 nt corriente arriba y 23 nt corriente abajo. El exón 1 de 92 nt corriente arriba (E1 en la Figura 12) y el exón 2 de 223 nt corriente abajo (E2 en la Figura 12) aparecen en mayúsculas y en negrita. Los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción Sall y Pstl están subrayados.

La Figura 14 muestra la secuencia completa del vector de expresión de intercambio pFLAG-GL39-IDUA objetivo (SEQ ID NO:12; originado a partir de pFLAG2CMV2-HBB). La región PTC mIDUA de 33 nt está en negrita, y el codón de terminación prematura TAG está subrayado.

La figura 15 muestra el análisis RT PCR de los ARNm de p-globina de células HEK293 transfectadas con el plásmido de sustrato de intercambio "GL39-IDUA con o sin puglntronOpt-IDUA. La flecha GL39 indica el producto observado tras la RT-PCR. Los carriles 1 y 3 representan 15 ciclos PCR y los carriles 2 y 4 representan 18 ciclos PCR. El nivel de ARNm de globina se normalizó mediante el control 5S (flecha inferior) y resultó ser de 0,00437 en el carril 2, y de 0,1617 en el carril 4. La modificación del ARN inducida por guías (en este caso: pseudouridilación) suprimió la<n>M<d>y multiplicó por 37 el nivel de ARNm intacto.

La figura 16 muestra el análisis de transferencia western de proteínas de globina marcadas con flag procedentes de células HEK293 transfectadas con el plásmido de intercambio sustrato FLAG-GL39-IDUA y el plásmido guía puglntron-IDUA. Las células se transfectaron con 250 ng de sustrato y 2,5 pg de guía utilizando PEI al 100% de confluencia.

La Figura 17 muestra los resultados de un experimento de extensión de cebadores utilizando ARN total obtenido a partir de células HEK293T transfectadas con el plásmido de intercambio de sustrato GL39-IDUA con puglntron-IDUA como plásmido expresador de ARN guía o pug-CFTR como plásmido de control negativo. El ARN se trató con CMC y la extensión del cebador se llevó a cabo con un cebador específico de globina y con un cebador específico de U6 como control. La posición del producto de 92 nt terminado en el residuo ^-CMCse indica con una flecha. Esta zona vuelve a estar representada en el panel ampliado. GL39+72 es el cebador específico de globina hGI193-209AS. 90, 76 y 67 son referencias de tamaño de una digestión pBR322-Mspl (NEB#N3032).

La Figura 18 muestra los productos de RT-PCR a partir de ARN total obtenido de células transfectadas con el plásmido de sustrato de intercambio GL39-IDUA y el plásmido que expresa el ARN guía puglntron-IDUA o con el psEON Cy3-IDUA-A (en el que el ARN guía no está intrónicamente incrustado). La flecha GL39-IDUA indica el producto observado tras la RT-PCR. El control 5S también se indica con una flecha. No se observaron diferencias cuando las células se lavaron (lavar), o cuando el medio se mantuvo (mantener) sobre las células después de la transfección. RT significa transcriptasa inversa (+ sí, o - no).

La figura 19 muestra el análisis RT-PCR de los ARNm CFTR de células HEK293 transfectadas con plásmido sustrato portador de la mutación CFTR-G542X, sin guía (carriles 2 y 3 a la derecha de la escalera), control negativo pugCFTR (carriles 6 y 7 a la derecha de la escalera) y RNAsno guía portador del plásmido puglntCFTR (carriles 4 y 5 a la derecha de la escalera). La flecha indica el producto observado tras la RT-PCR. El carril 1 después de la escalera representa la PCR sin RT. Los carriles 2, 4 y 6 representan el producto tras 20 ciclos de PCR, mientras que los carriles 1,3,5 y 7 representan el producto obtenido tras 23 ciclos. El panel inferior muestra el control 5S tras 15 y 18 ciclos de<p>C<r>respectivamente (en lugar de 20 y 23). La presencia del ARN guía expresado a partir de puglntCFTR conduce claramente a la supresión NMD, ya que se observa una señal de producto PCR más fuerte.

Descripción detallada

Se sabe que los ARN H/ACA de longitud completa (ARNsno) pueden utilizarse para convertir específicamente una uridina diana en pseudouridina (y ). Cambiando la secuencia de ácido nucleico de los dos bucles principales que sirven de guía para el ARN sustrato natural, se demostró que otras secuencias distintas de la secuencia natural pueden ser pseudouridiladas en sistemas de levadura y Xenopus. Los inventores de la presente invención, teniendo el deseo de realizar pseudouridilación dirigida en sistemas de mamíferos, con ARN diana que son potenciales dianas terapéuticas, se preguntaron si sería posible generar ARN guía de pseudouridilación más pequeños que siguieran siendo catalíticamente activos y quizás incluso tuvieran mayores efectos de pseudouridilación. Además, los inventores se preguntaron si sería posible aumentar la estabilidad y/o especificidad de esos oligonucleótidos más pequeños mediante modificaciones químicas. Si así fuera, podrían utilizarsein vivocomo compuestos farmacéuticamente activos para su aplicación en contextos terapéuticos. Tales guías podrían entonces utilizarse potencialmente en el tratamiento de cualquier trastorno genético en el que una uridina (que puede representar una mutación) se convirtiera en una ip, y de ese modo influir en el contenido de la proteína traducida, o influir en el empalme, o aumentar (o disminuir) la traducción de proteínas a partir del ARNm resultante. Dada la eficacia relativamente baja de los ARNsnos H/ACA en la pseudouridilación como se ha demostrado hasta ahora en la técnica, sigue existiendo la necesidad de mejorar la potencia y las propiedades farmacocinéticas de las guías de pseudouridilación. La presente invención se refiere a tales compuestos guía de pseudouridilación (también denominados en el presente documento oligonucleótidos de edición de pseudouridilación, o psEONs) que son más cortos (con respecto a la longitud del nucleótido) que los utilizados en el arte hasta ahora, que llevan una o más modificaciones químicas que influyen en la eficiencia de la pseudouridilación, o que están incrustados en regiones intrónicas para permitir una entrega eficiente a las células de mamíferos. Según otra realización, se proporciona una secuencia de ácido nucleico que es una guía para la pseudouridilación dirigida, expresada como un constructo de expresión pol-lll, utilizando un promotor pol-lll como U6 o H1. Dicha molécula de ácido nucleico puede proporcionarse como un constructo de expresión, en un plásmido o vector viral, como un vector AAV o similar.

Los ARN H/ACA identificados originalmente ("de longitud completa") tienen una longitud media de 133 nucleótidos y forman una estructura secundaria conservada evolutivamente de horquilla-bisagra-horquilla-cola que lleva una secuencia ANAN NA de consenso en la región de bisagra (caja H) y un triplete ACA exactamente a tres posiciones del extremo 3' (caja ACA). La identificación de las uridinas diana se consigue mediante dos elementos antisentido de 3-10 nucleótidos de longitud en la protuberancia de una o ambas horquillas (bolsillo de pseudouridilación) directamente a 5' y 3' del tallo superior. Estos dos elementos se hibridan con secuencias inmediatamente 5' y un nucleótido 3' de la uridina diana, encuadrándola. Esto posiciona la uridina diana a 14-15 nucleótidos de la caja H o ACA.

Existen muchas modificaciones químicas en la generación de oligonucleótidos recombinantes (monocatenarios y/o antisentido). En la búsqueda de propiedades mejoradas, los inventores de la presente invención descubrieron que una modificación 2'-O-metil (2'-OMe) de la fracción ribosa de los nucleótidos no sólo es compatible con la pseudouridilación dirigida, sino que, sorprendentemente, conduce a una pseudouridilación más eficaz de las moléculas de ARNm diana. Otro hallazgo sorprendente fue que los enlaces entre nucleósidos fosforotioato (PS) también son compatibles con la pseudouridilación dirigida. También pueden utilizarse combinaciones de modificaciones químicas (no naturales), como la ribosa 2'-OMe y los enlaces inter-nucleosídicos PS, sin abolir el compromiso enzimático o la actividad catalítica (pseudouridilación). Los actuales inventores han identificado los lugares preferidos. Mientras que ciertas propiedades beneficiosas de la 2'-OMe y la PS y muchas más modificaciones químicas en los oligonucleótidos antisentido y los ARNsi son conocidas como tales, por ejemplo el aumento de la estabilidad de las nucleasas u otras propiedades farmacocinéticas, la compatibilidad de las mismas con la pseudouridilación, por no hablar del efecto potenciador sobre la catálisis, era desconocida y no se podía predecir. Por lo tanto, además de haber encontrado formas de acortar estos ARN guía artificiales, los presentes inventores han desentrañado formas de modificarlos químicamente para imponer propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas mejoradas. Estas y otras ventajas se desprenderán claramente de la divulgación de la presente invención.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico, capaz de formar un complejo de doble cadena con una molécula de ARN diana en un sistema(por ejemplo, un extracto celular, una célula, un tejido u órgano (por ejemplo, en un chip), un organismo vivo, preferentemente de origen mamífero), y capaz de formar un complejo funcional (/.e. capaz de pseudouridilación) complejo de proteína de ARN (RNP), en el que la molécula de ARN diana comprende una uridina diana para su conversión en ip, en el que la molécula de ácido nucleico es más corta que (preferentemente aproximadamente la mitad de la longitud o menos de) un ARNsno H/ACA natural. Dichas secuencias de ácido nucleico según la invención también se denominarán en el presente documento "oligonucleótidos de edición pseudouridilada", o "psEONs" para abreviar.

La presente invención se refiere a una versión acortada del RNAsno H/ACA de tipo salvaje que comprende sólo una estructura de horquilla con un bucle guía (a diferencia de las dos estructuras de horquilla que se encuentran típicamente en las estructuras naturales de ARN H/ACA y en los ARNsnos artificiales descritos en la técnica). Una realización preferida es una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un nucleótido que lleva una modificación de ribosa 2'-OMe y al menos una modificación de enlace inter-nucleósido PS. Aún más preferidas son las moléculas de ácido nucleico que se acortan y tienen ribosa no natural y/o modificaciones de enlace internucleosídico no naturales.

Los psEON según la invención son preferentemente oligonucleótidos sintéticos. Los psEON según la invención son preferentemente oligorribonucleótidos (ARN completo), pero pueden comprender ADN. Alternativamente, especialmente cuando consisten exclusivamente en nucleótidos o enlaces que pueden expresarse en un sistema biológico, los psEONs pueden expresarsein situ,por ejemplo, a partir de un plásmido o un vector viral. Además, los psEON pueden ser una mezcla de componentes expresados biológicamente y componentes sintéticos, como etiquetas o enlazadores. Los psEON pueden utilizarse como tales ("desnudos"), o conjugados con otros componentes, como ligandos para la orientación, la captación y/o el tráfico intracelular. los psEON pueden usarse en soluciones acuosas (generalmente portadores y/o disolventes farmacéuticamente aceptables), o formularse usando agentes de transfección, liposomas o formas nanoparticuladas (por ejemplo, SNALPs, LNPs y similares). Dichas formulaciones pueden comprender ligandos funcionales para mejorar la biodisponibilidad y similares.

Entre la rica variedad de ARN no codificantes, los pequeños ARN nucleolares se dividen en dos categorías: los ARNsno de caja C/D y los de caja H/ACA. Ambos contribuyen a la modificación de los ARN ribosómicos tras la transcripción. Utilizando las enzimas RNP endógenas, los oligonucleótidos sintéticos pueden imitar potencialmente los ARNsnos H/ACA guía y unirse a las dianas de ARN permitiendo la conversión de uridina en ^ de forma específica para cada sitio. Para convertir la uridina en ^ en las dianas de ARN, los oligonucleótidos modificados químicamente que se asemejan a los ARNsno H/ACA pueden -como se demuestra aquí por primera vez- reclutar enzimas RNP endógenas. Para diseñar tales psEONs, se describe aquí cómo se adoptó un enfoque combinado basado en datos experimentales, análisis estructural y minimización energética de modelos a escala atómica. Se redujo al mínimo la longitud de la secuencia del ARN ACA19 y se comprobó su funcionalidad mediante ensayos enzimáticosin vitro(como se describe a continuación). El análisis estructural se basó en la información publicada por Li y Ye (2006, Nature 443:302-307). En la RNP de caja H/ACA dePyrococcus furiosus (P. furiosus',una especie archaea) sólo 3 proteínas interactúan directamente con el ARN guía, que adopta una estructura de bucle de tallo. Estas proteínas son probablemente la ARNt pseudouridina sintasa B, la proteína de la biogénesis del ribosoma Nop10 y la proteína ribosomal 50S L7ae. El diseño de oligonucleótidos basado en la estructura, tal y como se utiliza en la presente invención, se divide en diferentes partes: una visión general de la red de enlaces de hidrógeno, un análisis paso a paso de la conservación de estructuras proteicas en diferentes organismos archaea-eucariotas, la inserción de modificaciones químicas dentro de la caja H/ACA del RNAsno (controlando así los posibles choques estéricos) y una minimización energética de modelos a escala atómica que incluyen enlaces 2'-OMe y PS.

Se distinguen dos categorías de enlaces de hidrógeno. El primer grupo conecta la espina dorsal de oxígeno-fosfato del ARN con la proteína. El segundo grupo une los residuos a las bases del oligonucleótido. En general, estos dos conjuntos de interacciones se consideran en la técnica como no específicas y específicas, respectivamente. La estructura cristalina de una RNP de caja H/ACA deP. furiosuses la única estructura del conjunto de proteínas de pseudouridilación unidas a ARN disponible actualmente en la técnica. Estructura libre del complejo Cbf5-Nop10-Gar1 deSaccharomyces cerevisiae(Li et al. 2011, Genes Dev 25:2409-2421) pone de manifiesto importantes similitudes estructurales en cuanto a la disposición de las proteínas para ambos sistemas. Las superposiciones de las diferentes estructuras de las proteínas RNP de la caja H/ACA se realizaron utilizando la rutina de superposición de TINKER (Pappu et al. 1998, J Phys Chern B 102:9725-9742). Esta disposición estructural conservada sugiere que la unión del ARN puede apoyarse en interacciones similares. Aunque la transposición de los requisitos estructurales (para la fijación del ARN guía) de las arqueas a los organismos eucariotas no es trivial, la extrapolación de este análisis sigue siendo valiosa con el apoyo de alineaciones de secuencias primarias y comparaciones de estructuras secundarias y terciarias. En la estructura cristalina de una RNP de caja H/ACA, el ARN guía es contactado principalmente por tres proteínas Cbf5, Nop10 y L7ae. La alineación de la secuencia primaria de estas tres proteínas con sus homólogos correspondientes de humanos, levaduras y arqueas indicó un alto nivel de similitud (datos no mostrados). Además, las estructuras secundarias de las tres proteínas de levaduras y arqueas parecían comparables a las encontradas en la alineación de la secuencia primaria. Dado que no se disponía de la información estructural de las proteínas humanas Cbf5, Nop10 y Nhp2 (homóloga de la Archaeal L7ae), sus estructuras secundarias se predijeron utilizando un servidor de predicción de estructuras secundarias de proteínas (JPred) y se compararon con las estructuras secundarias previstas de las proteínas correspondientes de levaduras y arqueas. La comparación reveló que las tres proteínas tienen estructuras secundarias muy similares. Además, los residuos de aminoácidos identificados de las tres proteínas en contacto con el ARN guía en la RNP de la caja H/ACA parecían muy bien conservados en sus homólogos humanos y de levadura, lo que sugiere que las tres proteínas pueden reconocer su ARN guía de una manera muy similar.

Para definir los puntos de anclaje importantes entre el ARN guía y las proteínas, se investigaron las características tridimensionales del ARN unido. Así pues, independientemente de la secuencia primaria seleccionada para el diseño del ARN terapéutico, es necesario adoptar una estructura tridimensional idéntica a la mostrada para el sistema archaea. Esta afirmación es válida principalmente para las partes comunes de ARN cubiertas por proteínas homólogas observadas en ambos sistemas, esdecir,Cbf5 y Nop10. Para ampliar la validez del análisis, se identificaron cadenas polipeptídicas equivalentes a la proteína L7ae deP. furiosusen diferentes eucariotas (proteínas homólogas en la levadura y el ser humano). Evidentemente, la transposición directa de la información estructural de la arquea al organismo de la levadura es algo especulativo y podrían producirse variaciones locales. La densidad de contactos específicos es mayor en las proximidades del motivo ACA y en la unión entre el tallo superior y el bucle más pequeño. Este último elemento corresponde al tetra-bucle de la levadura. Curiosamente, la disposición de la estructura secundaria propuesta para el ARN guía ACA19 acortado no encaja con las características y restricciones tridimensionales detectadas en la RNP de caja H/ACA de las arqueas. Sin embargo, la flexibilidad del oligonucleótido parece ser un parámetro crucial para el anclaje y el ARN guía ACA19 probablemente experimenta ajustes conformacionales para acomodarse al complejo proteico.

Para apoyar el diseño de oligonucleótidos basado en la estructura y facilitar la transferencia del mapa de enlaces de hidrógeno intermoleculares a eucariotas, en la Figura 2 se muestra la lista de residuos que participan en la unión del ARN guía. Los aminoácidos de la RNP de caja H/ACA de archaea que interactúan con el esqueleto de oxígeno-fosfato y las bases del ARN se muestran en los paneles izquierdo y derecho, respectivamente. el 70% de los contactos entre las bases y la proteína implican a los grupos amida y carboxilo de los residuos, lo que sugiere que un conjunto limitado de residuos conservados puede impulsar el reconocimiento de las bases. Sin embargo, la unión de la columna vertebral del ARN está mediada en un 85% por las cadenas laterales de aminoácidos. Sorprendentemente, la unidad Nop10 sólo interactúa de forma inespecífica con el oligonucleótido guía (por lo tanto, no con las bases). El análisis debe tener en cuenta otras alineaciones de secuencias primarias entre proteínas homólogas de distintos organismos. Algunos residuos conservados pueden favorecer los contactos nucleótido-proteína que son cruciales para la función del oligonucleótido terapéutico. Además, los elementos de estructura secundaria predichos pueden ayudar a considerar algunas variaciones potenciales en la conformación local del ARN.

El estudio estructural inicial allanó el camino para la aplicación de modificaciones químicas relevantes que apoyan la función del oligonucleótidoin vivo.Clásicamente, durante la primera etapa del diseño de oligonucleótidos terapéuticos, y así se ha demostrado en la técnica, las fracciones de azúcares modificados con 2'-OMe y los enlaces PS contribuyen a mejorar la resistencia frente a la actividad ARNasa, favorecen la unión a proteínas y facilitan la captación. Sin embargo, nunca se ha sugerido ni demostrado que tales modificaciones pudieran utilizarse y fueran compatibles con el acoplamiento de proteínas y la actividad catalítica en el contexto de complejos de enzimas pseudouridilatadoras. Siguiendo la Figura 3, se examinaron las posiciones dentro del ARN H/ACA deP. furiosusen relación con la conservación de la red de interacción de enlaces de hidrógeno. Se introdujeron modificaciones químicas para el modelo de ARN H/ACA que se pensó que participaban en la funcionalización de los oligonucleótidos terapéuticos. La generación de modelos a escala atómica mediante la inserción de modificaciones químicas en el ARN arqueal de bucle peduncular se realizó utilizando el software Avogadro. El modelo RNP de caja H/ACA resultante se minimizó energéticamente con el campo de fuerza Amber99 plus GBSA, implementado en el paquete TINKER (Pappu et al.

1998). En el panel izquierdo de la Figura 3, los círculos vacíos indican dónde se toleran los enlaces PS sin alterar la red de enlaces de hidrógeno proteína-ARN. En el panel derecho, los círculos rellenos muestran posiciones en las que la inserción del grupo 2'-OMe no debería interferir con el reconocimiento del ARN (sin impedimentos estéricos). Cabe señalar que la red de enlaces de hidrógeno intra-ARN puede contribuir a la estabilización del oligonucleótido, pero no se ha tenido en cuenta en esta evaluación.

La invención se refiere a una molécula de ácido nucleico para la pseudouridilación de una uridina diana en un ARN diana en una célula de mamífero, en la que la molécula de ácido nucleico consiste en una región guía única correspondiente a una de las dos estructuras de horquilla del ARNsno H/ACA de tipo salvaje, en la que la molécula de ácido nucleico es capaz de formar un complejo de ácido nucleico parcialmente bicatenario con el ARN diana que comprende la uridina diana, en el que el complejo de ácido nucleico parcialmente bicatenario puede participar en una enzima de pseudouridilación de mamífero, en el que la región guía ayuda a posicionar la uridina diana en el complejo de ácido nucleico parcialmente bicatenario para que la enzima de pseudouridilación de mamífero la convierta en pseudouridina. El complejo de ácido nucleico parcialmente bicatenario es preferentemente ARN/ARN. El complejo ARN/ARN es capaz de reclutar, o involucrarse con, una enzima de pseudouridilación que preferentemente está presente de forma natural en la célula de mamífero, pero que puede ser, en otra realización, cointroducida con la molécula de ácido nucleico en la célula de mamífero. Preferentemente, la célula de mamífero en la que tiene lugar la pseudoruridilación es una célula humana. En un aspecto preferido, la enzima de pseudouridilación forma parte de un complejo de ribonucleoproteína (RNP) capaz de actuar sobre un H/ACA-RNAsno. En un aspecto particularmente preferido, la molécula de ácido nucleico es más corta que un ARNsno H/ACA de tipo silvestre y comprende uno o más nucleósidos y/o enlaces inter-nucleosídicos que no están modificados naturalmente en comparación con el ARNsno H/ACA de tipo silvestre. No natural significa que la modificación no está presente por naturaleza en un ARNsno de tipo salvaje. La modificación se introduce preferentemente para hacer que la molécula de ácido nucleico sea más estable frente a la descomposición por enzimas ARNasa. En otro aspecto preferido, la región guía única es la estructura de horquilla en la parte terminal 3' del ARNsno H/ACA de tipo silvestre, preferentemente en la que el nucleótido terminal 5' corresponde a un nucleótido de una región entre las dos estructuras de horquilla del ARNsno H/ACA de tipo silvestre. La molécula de ácido nucleico según la invención, consta preferentemente de 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 nucleótidos. Cuando la molécula de ácido nucleico según la presente invención comprende una modificación no natural, la modificación no natural comprende, en una realización, una modificación en la fracción de ribosa, preferentemente en la que se sustituye el 2'-OH de la fracción de azúcar. Las modificaciones particularmente preferidas de la fracción de ribosa son sustituciones 2'-OMe y/o 2'-MOE.-La persona experta puede aplicar una variedad de modificaciones, dependiendo de la eficacia con la que la molécula de ácido nucleico de la presente invención sea capaz de dar pseudouridilación en una célula particular y/o en el contexto de una enzima de pseudouridilación particular. En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende uno o más enlaces inter-nucleosídicos no naturales, como un enlace fosforotioato (PS).

Cuando la molécula de ácido nucleico se sitúa en una secuencia intrónica a partir de la cual se expresa, y cuando la secuencia intrónica se sitúa entre una secuencia exónica A corriente arriba y una secuencia exónica B corriente abajo, el intrón puede comprender (además de la molécula de ácido nucleico de la presente invención, que comprende la región guía) nucleótidos adicionales. Dado que la región guía se expresa a partir de la secuencia del intrón, dichos nucleótidos adicionales pueden seleccionarse para obtener la expresión más eficiente a partir del intrón. Preferiblemente, la secuencia exón AIintrónIexón B está presente en un vector, preferentemente un plásmido o un vector viral. Este vector puede utilizarse para introducir la secuencia exón-intrón-exón en la célula. Los intrones y exones adicionales pueden estar presentes en dicho vector. En una realización particularmente preferida, la secuencia del exón A (corriente arriba del intrón que lleva el ácido nucleico que codifica la molécula de ácido nucleico (que se expresa después de la transcripción)) comprende o consiste en el exón 1 del gen de la p-globina humana, y la secuencia del exón B (corriente abajo del intrón que lleva el ácido nucleico que codifica la molécula de ácido nucleico (que se expresa después de la transcripción)) comprende o consiste en el exón 2 del gen de la p-globina humana. El experto sabe que los vectores pueden transportar ADN o ARN, y generalmente se utilizan para expresar la molécula de ácido nucleico de la presente invención después de que el vector se procese en la célula en la que se introduce. Por lo general, esto se consigue mediante la transcripción del ADN o ARN presente en el vector. Los vectores virales (que pueden utilizarse para infectar las células diana a tratar), o los plásmidos pueden introducirse en la célula de diversas formas, conocidas por el experto en la materia. Utilizando las enseñanzas de la presente divulgación, el experto puede determinar si el RNAsno de longitud sustancialmente completa es activo en pseudouridilación. Cuando el ARNsno se sitúa en un intrón, como se describe en el presente documento, la molécula de ácido nucleico está presente preferentemente en un vector, como un plásmido, y en el que la molécula de ácido nucleico se transcribe a partir de un promotor CMV o pol-lll, preferentemente un promotor U6 o un promotor H1. Cuando el ácido nucleico comprende una región guía única, también puede administrarse en forma libre (o "desnudo", sin el contexto de un vector), o ser entregado a una célula por otros medios, como liposomas, o nanopartículas, o utilizando iontoforesis.

En una realización particularmente preferida, la región guía presente en la molécula de ácido nucleico de la presente invención es capaz de formar un complejo parcialmente de doble cadena (ARN/ARN) con el ARN diana, que comprende una mutación que está asociada con un trastorno genético. Un ejemplo no limitante, pero preferido, de tal mutación da lugar a un codón de terminación prematura (PTC), en el que el PTC es la causa del trastorno genético, y en el que la uridina diana se encuentra en el PTC. La conversión de la uridina diana en una PTC de este tipo en una pseudouridina, mediante el uso de los medios y procedimientos de la presente invención, da lugar entonces a una lectura adecuada del marco de lectura durante la traducción, proporcionando así una proteína de longitud completa (parcial o totalmente) funcional.

La molécula de ácido nucleico según la invención es, en una realización de la invención, para uso en el tratamiento, retraso o mejora de la fibrosis quística, síndrome de Hurler, deficiencia de alfa-1-antitripsina (A1AT), Enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, albinismo, esclerosis lateral amiotrófica, asma, p-talasemia, síndrome de Cadasil, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), Atrofia muscular espinal distal (AMED), Distrofia muscular de Duchenne/Becker, Epidermólisis bullosa distrófica, Enfermedad de Fabry, Trastornos asociados al factor V de Leiden, Poliposis adenomatosa familiar, Galactosemia, Enfermedad de Gaucher, Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, Hemofilia, Hemocromatosis hereditaria, Síndrome de Hunter, Enfermedad de Huntington, Enfermedad inflamatoria intestinal (EII), Síndrome de poliaglutinación hereditaria, una Amaurosis congénita de Leber, Síndrome de Lesch-Nyhan, Síndrome de Lynch, Síndrome de Marfan, Mucopolisacaridosis, a Distrofia muscular, Distrofia miotónica tipos I y II, neurofibromatosis, enfermedad de Niemann-Pick tipo A, B y C, cáncer relacionado con NY-eso1, síndrome de Peutz- Jeghers, fenilcetonuria, enfermedad de Pompe, enfermedad ciliar primaria, Trastornos relacionados con la mutación de la protrombina, como la mutación G20210A de la protrombina, hipertensión pulmonar, retinosis pigmentaria (autosómica dominante), enfermedad de Sandhoff, síndrome de inmunodeficiencia combinada grave (SCID), anemia falciforme, atrofia muscular espinal, enfermedad de Stargardt, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de Usher, inmunodeficiencia ligada al cromosoma X, síndrome de Sturge-Weber o cáncer.

En otra realización más, la invención se refiere a un procedimiento in vitro para convertir una uridina en una molécula de ARN diana en una pseudouridina, que comprende los pasos de poner en contacto un ARN diana que comprende una uridina diana con una molécula de ácido nucleico según la invención en presencia de una enzima de pseudouridilación o complejo RNP y permitir que la uridina se convierta de este modo, preferentemente en el que la enzima de pseudouridilación o complejo RNP está presente en una célula de mamífero, preferentemente una célula humana. En un procedimiento preferido según la invención, la enzima de pseudouridilación o el complejo RNP está presente de forma natural en la célula de mamífero.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico según la invención, y uno o más de un portador, estabilizador o disolvente farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la materia.

Cuando la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico según la presente invención para su uso en el tratamiento de la fibrosis quística (FQ), en una realización aún más preferida, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico según la invención para su uso en el tratamiento de la f Q en las que PTC tales como las enumeradas en la Tabla 1, y más preferentemente las mutaciones G542X (UGA), W1282X (UGA), R553X (UGA), R1162X (UGA), Y122X (UÁA), W1089X, W846X, y W401X se modifican mediante pseudouridilación a codones codificantes de aminoácidos, y permitiendo así la traducción a proteínas de longitud completa. Por ejemplo, está bien establecido en la técnica que los codones y AA y yAG se traducen ambos a serina o treonina, mientras que un y GA se traduce a tirosina o fenilalanina, en lugar de considerarse un codón de parada (Karijolich y Yu, 2011). Por lo tanto, la pseudouridilación de los PTC a cualquiera de estos codones que contienen y generará la lectura durante la traducción o, en otras palabras, suprimirá la terminación de la traducción de la proteína y/o la degradación potencial del ARNm por la desintegración mediada por el sinsentido. Por lo tanto, en un aspecto preferido, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico según la invención, tal como un psEON como se describe en el presente documento, para su uso en el tratamiento de la FQ, en el que la molécula de ácido nucleico permite la conversión de una uridina presente en un PTC presente en el ARNmCFTR(pre-) a un<y>, y en el que el PTC da lugar a la terminación temprana de la traducción que finalmente causa la enfermedad. También se divulga un procedimiento in vitro para la pseudouridilación de al menos una uridina diana presente en un PTC en un ARN diana en una célula, el procedimiento comprende los pasos de proporcionar a la célula una molécula de ácido nucleico según la invención; permitir la captación por la célula de la molécula de ácido nucleico (por ejemplo mientras es transportada por un vector de entrega); permitir el recocido de la molécula de ácido nucleico según la invención al ARN diana; permitir que una RNP guiada por ARN guía seudouridile la uridina diana en el ARN diana a una<y>; y opcionalmente identificar la presencia de la y en el ARN diana, preferentemente en el que el último paso comprende evaluar la presencia de una proteína funcional, alargada, de longitud completa y/o de tipo salvaje cuando la uridina diana se localiza en un PTC; evaluar si el empalme del pre-ARNm fue alterado por la pseudouridilación; o utilizar una lectura funcional, en el que el ARN diana después de la molécula diana pseudouridilada codifica una proteína funcional, de longitud completa, alargada y/o de tipo salvaje. Preferentemente, la célula en la que tiene lugar la pseudouridilación, utilizando procedimientos y medios in vitro de la presente invención, es una célula humana. En una realización preferida, el psEON según la invención (especialmente cuando se aplica en forma "desnuda") comprende al menos 50 nucleótidos y es más corto que 100 nucleótidos, más preferentemente más corto que 60 nucleótidos.

Como será fácilmente evidente para el lector experto, la invención permite combinar diferentes moléculas de ácido nucleico según la invención, diseñadas para diferentes uridinas diana en uno y el mismo o diferentes ARN diana. Las diferentes moléculas de ácido nucleico según la invención pueden utilizarse simultáneamente en una única composición o en composiciones separadas, o consecutivamente. Las moléculas de ácido nucleico, como los psEON según la invención, pueden combinarse con otras formas de tratamiento, incluidas otras formas de tratamiento con oligonucleótidos.

Tabla 1. Lista de mutaciones PTC en CFTR humano que pueden ser objeto de pseudouridilación utilizando una molécula de ácido nucleico según la presente invención.

Es un aspecto importante de la invención que el psEON, aunque no esté incrustado en una secuencia intrón, comprenda uno o más nucleótidos con una o más modificaciones de las fracciones de azúcar o nucleobase, o uno o más enlaces internucleotídicos con modificaciones. De este modo, un solo nucleótido del psEON puede tener uno o más azúcares o bases modificados. Dentro del psEON, uno o más nucleótido(s) puede(n) tener dicha(s) modificación(es) de azúcar o base, y uno o más enlace(s) internucleotídico(s) puede(n) tener modificaciones. A modo de ejemplo, la modificación del azúcar puede comprender una modificación 2'-O-alquilo (como una modificación 2'-OMe), la modificación de la base puede implicar la sustitución de una base citidina por una 5-metilcitidina, y la modificación del enlace inter-nucleótido puede implicar la sustitución del enlace fosfodiéster por un enlace PS (no natural).

Los psEONs de la presente invención consisten en una región guía única, y preferentemente la región guía está localizada en la parte terminal 3' de un RNAsno wt H/ACA. Por lo tanto, es un aspecto preferido de la invención que el psEON comprenda una única estructura de horquilla (en contraste con la situación de tipo salvaje en la que el RNAsno contiene dos estructuras de horquilla), en la que la estructura de horquilla en el psEON representa la horquilla en la parte 3' del RNAsno wt H/ACA, y en la que el extremo 5' del psEON comienza en cualquier posición entre los dos tallos que se encuentran en el RNAsno wt H/ACA. Preferentemente, en un aspecto, el psEON de la presente invención no comprende una caja H completa en su extremo 5', pero sí comprende una caja ACA de tipo salvaje en su extremo 3'. En otro aspecto preferido, comprende una caja H completa en el extremo 5', pero carece de una caja ACA completa en el extremo 3'. Esto concuerda con las interacciones conocidas de la pseudouridina sintasa, disquerina, dos de las cuales se unen a los ARNsnos naturales H/ACA de tal forma que una se une a la horquilla 5' y a la caja H, mientras que la otra se une a la horquilla 3' y a la caja ACA.

Una característica mejorada de los psEONs de la presente invención es el uso de modificaciones nucleotídicas específicas en puntos predefinidos para asegurar la estabilidad, así como la correcta unión a proteínas y la actividad de pseudouridilación. Estos cambios pueden variar y pueden incluir modificaciones en la columna vertebral del psEON, en la fracción de azúcar de los nucleótidos, así como en las nucleobases. También pueden estar distribuidos de forma variable a lo largo de la secuencia del psEON, dependiendo del objetivo y de las estructuras secundarias. Es posible que se necesiten modificaciones químicas específicas para apoyar las interacciones de diferentes residuos de aminoácidos dentro de los dominios de unión al ARN. Por ejemplo, los enlaces PS entre nucleótidos, y/o las modificaciones 2'-OMe pueden tolerarse en algunas partes de la psEON, mientras que en otras partes deben evitarse para no perturbar interacciones cruciales de la enzima con los grupos fosfato y/o 2'-OH. El experto en la materia será capaz -con los conocimientos disponibles en la materia y basándose en las enseñanzas de la presente divulgaciónde determinar si una determinada posición dentro del psEON es adecuada para la modificación 2'-OMe y o si un determinado enlace inter-nucleósido debe o no tener una modificación PS. Las modificaciones también deben seleccionarse de forma que eviten la degradación de los psEON. También pueden ser necesarias modificaciones nucleotídicas específicas para potenciar la actividad de pseudouridilación en ARN sustratos en los que la secuencia diana no es óptima para la edición.

La presente invención, en un aspecto, se relaciona con ARNs guía de edición pseudouridilados que pueden ser entregados mientras están incrustados en intrones artificiales que están flanqueados por exones de un gen especificado y/o particularmente seleccionado. De este modo, el ARN guía puede expresarse en células de mamífero a partir de un vector como un plásmido o un vector viral que contenga esta secuencia exón-intrón-exón. Como demostraron por primera vez los inventores de la presente invención, fue posible obtener una pseudouridilación dirigida de forma específica para cada secuencia utilizando un ARN guía incrustado en un intrón. Este enfoque puede aplicarse ahora potencialmente para promover, por ejemplo, la supresión del PTC como terapia novedosa en enfermedades genéticas causadas por mutaciones del PTC.

La presente invención se ejemplifica mediante, pero no se limita a, la inversión del efecto de las mutaciones de parada sin sentido que normalmente conducen a la terminación de la traducción y la degradación del ARNm (a través del decaimiento mediado por el sinsentido, véase más adelante). En otro aspecto, la pseudouridilación dirigida puede actuar como un medio para recodificar codones que contienen uridina como un medio para modular la función de la proteína a través de la sustitución de aminoácidos, por ejemplo, en regiones cruciales de proteínas tales como centros activos de proteínas quinasas.

Se sabe por la técnica que las secuencias de ARN guía de pseudouridilación expresadas de forma natural (ARNsnos de caja H/ACA) en células de mamíferos se procesan a menudo a partir de intrones de pre-ARNm. El proceso de ensamblaje se produce por la unión de varias proteínas con una función en la pseudouridilación en ARNs guía caja H/ACA para formar snRNPs. Este proceso tiene lugar durante la transcripción y antes del empalme. Después de que el intrón que contiene ARN guía se empalme y se desramifique, las exonucleasas de procesamiento degradan el intrón en sus extremos 5' y 3'. Sin embargo, las proteínas snRNP asociadas protegen las secuencias de ARN guía caja H/ACA de la degradación, permitiendo la formación del complejo snRNP maduro. Las secuencias de ARNsno pueden insertarse en los intrones de un gen que no es (o puede ser) su entorno natural, como la p-globina humana (Kiss y Filipowicz. 1995) sin dejar de dar lugar a snRNPs completamente maduras. Según la presente invención, los ARN guía de edición pseudouridilados pueden incrustarse en intrones no hospedadores flanqueados por exones de genes. Un ejemplo no limitativo de un gen humano que cumple esta función es el gen de la p-globina. Dichos constructos pueden administrarse y expresarse en una célula de mamífero, por ejemplo utilizando un plásmido o vector viral para expresar ARNsnos de caja H/ACA totalmente funcionales que lleven en su bolsillo de pseudouridilación una secuencia de nucleótidos complementaria a la región del ARN diana de forma específica para la secuencia, en un entorno terapéutico.

Una de las consecuencias de las mutaciones que dan lugar a PTC en la secuencia codificante de un gen es la disminución de los niveles de ARNm. Esto se debe a un mecanismo conocido como descomposición mediada por el sinsentido (NMD, por sus siglas en inglés), que es un mecanismo de vigilancia celular en mamíferos que impide que se traduzcan los transcritos que no se han procesado correctamente. Se calcula que un tercio de los trastornos genéticos son el resultado de una mutación que da lugar a un PTC (como, por ejemplo, en la fibrosis quística, la retinosis pigmentaria y la beta-talasemia). En un escenario normal, los complejos de unión de exones (EJC) se forman durante el empalme. Después, durante la primera ronda de traducción, los ribosomas desplazan estos EJC. Por otro lado, cuando un PTC se localiza a más de 50-54 nucleótidos corriente arriba del último EJC, la vía NMD se desencadena mediante la formación de un complejo de terminación formado por factores NMD asociados al EJC. Cuando esto ocurre durante la primera ronda pionera de traducción y los ribosomas coexisten con al menos un EJC corriente abajo de su ubicación, se desencadena la actividad de descifrado y exonucleasa de 5'-a-3' y también la desadenilación de la cola y la descomposición del transcrito mediada por la exonucleasa de 3'-a-5'. Por lo tanto, para abordar los trastornos genéticos mencionados, o cualquier trastorno que se deba a una mutación similar, es crucial la inhibición de esta vía de forma específica para cada gen y secuencia. La presente invención se ejemplifica mediante la recodificación de un PTC, que resulta en un aumento de los niveles de ARNm, y en la lectura traslacional del ARNm recodificado en una proteína de longitud completa. Para evaluar la supresión de NMD, se utilizó un conocido ensayo reportero de inhibición de NMD (Zhang etal. 1998, RNA4(7):801-815), y también puede evaluarse la lectura traslacional de un gen portador de un PTC. Como ejemplo, se utilizó como secuencia diana el gen de la p-globina humana con una mutación sin sentido en el codón 39 del exón 2. Sin corrección, esta mutación sin sentido conduce a una menor abundancia de ARNm (como resultado de la NMD), así como a una proteína truncada. Como se muestra aquí, la corrección de la mutación mediante pseudouridilación dirigida permite que la proteína de longitud completa se traduzca a partir del ARNm e inhibe la vía NMD, ya que los niveles de ARNm aumentan. Los inventores de la presente invención introdujeron una secuencia oligonucleotídica editora pseudouridilizante de 131 nt en la posición del intrón 1-2 original de 130 nt del gen de la p-globina humana, que se encuentra entre el exón 1 y el exón 2. La secuencia de ARN guía incrustada en el intrón tiene el sitio donante de empalme situado corriente arriba (directamente corriente abajo del exón 1), un sitio de bifurcación, un tracto de polipirimidina (región rica en Py) y un aceptor de empalme situado directamente corriente arriba del exón 2 (Figura 12). El experto entiende que la región pTc de el constructo de pglobina humana puede intercambiarse por cualquier otro modelo o ARN diana terapéuticamente relevante de interés. Como se muestra aquí, a modo de ejemplo, la mutación de terminación mmlDUA- W392X se introdujo en el codón 39 del gen de la p-globina humana, sirviendo como diana. Se demuestra que esta PTC podría pseudouridilarse con éxito con un ARN guía de edición incrustado en un intrón de un gen huésped no natural, de forma específica para la secuencia. La pseudouridilación dirigida provocó un aumento de los niveles de ARNm(es decir, lainhibición de la NMD) y la síntesis de la proteína completa.

Los ARNsnos, cuando están incrustados en una secuencia intrónica, pueden ser aplicados para la pseudouridilación en una célula después de que la secuencia exón-intrón-exón sea administrada a la célula. Puede presentarse en forma de ácido nucleico desnudo. Otra forma de introducir estos constructos (secuencias exón-intrón-exón) en la célula (in vitro, ex vivooin vivo) es utilizando un vehículo de introducción, como un vector vírico. Un vector viral preferido se basa en el virus adeno-asociado (AAV). Otro vector viral preferido es, por ejemplo, un vector retroviral como un vector lentivirus y similares. Asimismo, los plásmidos, cromosomas artificiales y plásmidos utilizables para la recombinación homóloga dirigida y la integración en el genoma humano de las células pueden aplicarse adecuadamente para el suministro de un ARNsno como se define en el presente documento.

Típicamente, cuando el ARNsno se administra mediante un vector viral, está en forma de un transcrito de ARN que comprende la secuencia de un oligonucleótido según la invención en una parte del transcrito. Un vector AAV según la invención es un vector AAV recombinante y se refiere a un vector AAV que comprende parte de un genoma AAV que comprende una secuencia exón-intrón-exón según la invención encapsulada en una cubierta proteica de proteína de cápside derivada de un serotipo AAV. Parte de un genoma AAV puede contener las repeticiones terminales invertidas (ITR) derivadas de un serotipo de virus adeno-asociado, como<a>A<v>1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y otros. La cubierta proteica compuesta por la proteína de la cápside puede derivarse de un serotipo de AAV como AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y otros. La cubierta proteica también puede denominarse cubierta proteica de la cápside. El vector AAV puede tener uno o preferentemente todos los genes AAV de tipo salvaje suprimidos, pero aún puede comprender secuencias de ácido nucleico ITR funcionales. Las secuencias ITR funcionales son necesarias para la replicación, rescate y empaquetamiento de los viriones AAV. Las secuencias ITR pueden ser secuencias de tipo salvaje o pueden tener al menos un 80%, 85%, 90%, 95, o 100% de identidad de secuencia con secuencias de tipo salvaje o pueden ser alteradas por ejemplo en la inserción, mutación, deleción o sustitución de nucleótidos, siempre y cuando sigan siendo funcionales. En este contexto, la funcionalidad se refiere a la capacidad de dirigir el empaquetamiento del genoma en la cubierta de la cápside y, a continuación, permitir su expresión en la célula huésped a infectar o célula diana. En el contexto de la invención, una cubierta de proteína de cápside puede ser de un serotipo diferente al del genoma ITR del vector AAV. Un vector AAV según la presente invención puede estar compuesto, por tanto, de una cubierta de proteína de cápside, es decir,la cápside icosaédrica, que comprende proteínas de cápside (VP1, VP2, y/o VP3) de un serotipo AAV, porejemploel serotipo AAV 2, mientras que las secuencias ITRs contenidas en ese vector AAV2 pueden ser cualquiera de los serotipos a Av descritos anteriormente, incluyendo un vector AAV2. Así pues, un "vector AAV2" comprende una cubierta de proteína de cápside de serotipo 2 de AAV, mientras que, porejemplo,un "vector AAV5" comprende una cubierta de proteína de cápside de serotipo 5 de AAV, por lo que cualquiera de ellos puede encapsular cualquier ITR de genoma de vector AAV según la invención. Preferentemente, un vector AAV recombinante según la invención comprende una cubierta de proteína de cápside de AAV serotipo 2, 5, 8 o AAV serotipo 9 en el que el genoma AAV o ITRs presentes en dicho vector AAV se derivan de AAV serotipo 2, 5, 8 o AAV serotipo 9; dicho vector AAV se denomina AAV2/2, AAV 2/5, AAV2/8, AAV2/9, AAV5/2, AAV5/5, AAV5/8, AAV 5/9, AAV8/2, AAV 8/5, AAV8/8, AAV8/9, AAV9/2, AAV9/5, AAV9/8, o un vector AAV9/9.

Más preferentemente, un vector AAV recombinante según la invención comprende una cubierta de proteína de cápside de AAV serotipo 2 y el genoma AAV o ITRs presentes en dicho vector se derivan de AAV serotipo 5; dicho vector se denomina vector AAV 2/5. Más preferentemente, un vector AAV recombinante según la invención comprende una cubierta de proteína de cápside de AAV serotipo 2 y el genoma AAV o ITRs presentes en dicho vector se derivan de AAV serotipo 8; dicho vector se denomina vector AAV 2/8. Más preferentemente, un vector AAV recombinante según la invención comprende una cubierta de proteína de cápside del serotipo 2 de AAV y el genoma AAV o ITRs presentes en dicho vector se derivan del serotipo 9 de AAV; dicho vector se denomina vector AAV 2/9. Más preferentemente, un vector AAV recombinante según la invención comprende una cubierta de proteína de cápside de AAV serotipo 2 y el genoma AAV o ITRs presentes en dicho vector se derivan de AAV serotipo 2; dicho vector se denomina vector AAV 2/2. Una molécula de ácido nucleico que alberga una secuencia exón-intrón-ARN guía-intrón-exón según la invención representada por una secuencia de ácido nucleico de elección se inserta preferentemente entre el genoma AAV o las secuencias ITR identificadas anteriormente, por ejemplo un constructo de expresión que comprende un elemento regulador de la expresión unido de forma operable a una secuencia codificante y a una secuencia de terminación 3'. "Funciones auxiliares AAV" se refiere generalmente a las correspondientes funciones AAV necesarias para la replicación y empaquetamiento AAV suministradas al vector AAVen trans.Las funciones auxiliares AAV complementan las funciones AAV que faltan en el vector AAV, pero carecen de ITRs AAV (que son proporcionadas por el genoma del vector AAV). Las funciones auxiliares de AAV incluyen los dos ORF principales de AAV, a saber, la región codificanterepy la región codificantecapo secuencias funcionales sustancialmente idénticas a las mismas. Las regiones Rep y Cap son bien conocidas en la técnica. Las funciones AAV auxiliar pueden suministrarse en un constructo AAV auxiliar, que puede ser un plásmido.

La introducción del constructo auxiliar en la célula huésped puede producirse, por ejemplo, por transformación, transfección o transducción antes o simultáneamente a la introducción del genoma AAV presente en el vector AAV identificado en el presente documento. Así pues, los constructos auxiliares de AAV de la invención pueden elegirse de forma que produzcan la combinación deseada de serotipos para la cubierta de proteína de cápside del vector AAV, por un lado, y para el genoma de AAV presente en dicha replicación y empaquetamiento del vector AAV, por otro. El "virus AAV auxiliar" proporciona funciones adicionales necesarias para la replicación y el empaquetamiento del AAV.

Entre los virus auxiliares AAV adecuados se encuentran los adenovirus, los virus del herpes simple (como los tipos 1 y 2 del VHS) y los virus vaccinia. Las funciones adicionales proporcionadas por el virus auxiliar también pueden introducirse en la célula huésped mediante vectores, como se describe en el documento US 6,531,456.

Preferentemente, un genoma AAV tal como está presente en un vector AAV recombinante según la invención no comprende ninguna secuencia de nucleótidos que codifique proteínas virales, como los genesrep(replicación) ocap(cápside) de AAV. Un genoma AAV puede incluir además un gen marcador o informador, como por ejemplo un gen que codifique un gen de resistencia a los antibióticos, una proteína fluorescente(p. ej. gfp)o un gen que codifique un producto detectable y/o seleccionable química, enzimáticamente o de otro modo

(por ejemplo, lacZ, aph, etc.)conocidos en la técnica. Un vector AAV preferido según la invención es un vector AAV, preferentemente un vector Aa V2/5, AAV2/8, AAV2/9 o AAV2/2.

Definiciones de los términos aquí utilizados

Los términos "adenina", "guanina", "citosina", "timina", "uracilo" e "hipoxantina" (la nucleobase de la inosina) utilizados en el presente documento se refieren a las nucleobases como tales.

Los términos "adenosina", "guanosina", "citidina", "timidina", "uridina", "pseudouridina" e "inosina" se refieren a las nucleobases unidas al azúcar (desoxi)ribosil.

El término "nucleósido" se refiere a la nucleobase unida al azúcar (desoxi)ribosil.

El término "nucleótido" se refiere al respectivo nucleobase-(desoxi)ribosil-fosfoenlazador, así como a cualquier modificación química de la fracción ribosa o del grupo fosfo. Así, el término incluiría un nucleótido que incluya una fracción de ribosilo bloqueada (que comprenda un puente 2'-4', que comprenda un grupo metileno o cualquier otro grupo, bien conocido en la técnica), un nucleótido que incluya un enlazador que comprenda un fosfodiéster, fosfotriester, fosforo(di)tioato, metilfosfonatos, enlazadores fosforamidato, y similares.

A veces, los términos adenosina y adenina, guanosina y guanina, citosina y citidina, uracilo y uridina, timina y timidina, inosina e hipoxantina, se utilizan indistintamente para referirse a la nucleobase, nucleósido o nucleótido correspondiente. La pseudouridina suele denominarse ^ o 5-ribosiluracilo.

A veces, los términos nucleobase, nucleósido y nucleótido se utilizan indistintamente, a menos que el contexto exija claramente lo contrario. Los términos "ribonucleósido" y "desoxirribonucleósido", o "ribosa" y "desoxirribosa" se utilizan en la técnica.

Siempre que se haga referencia a un "oligonucleótido", se entenderá tanto los oligorribonucleótidos como los desoxioligorribonucleótidos, a menos que el contexto indique lo contrario. Siempre que se haga referencia a un "oligorribonucleótido" puede comprender las bases A, G, C, II o I. Siempre que se haga referencia a un "desoxioligorribonucleótido" puede comprender las bases A, G, C, T o I. En un aspecto preferido, el EON de la presente invención es un oligorribonucleótido que puede comprender modificaciones químicas, y puede incluir desoxinucleótidos (ADN) en ciertas posiciones especificadas.

Cuando se hace referencia a nucleótidos en el oligonucleótido, se incluyen citosina, 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, pirrolocitidina y p-D-glucosil-5-hidroxi-metilcitosina; cuando se hace referencia a adenina, se incluyen 2-aminopurina, 2,6- diaminopurina, 3-deazaadenosina, 7-deazaadenosina, 8-azidoadenosina, 8-metiladenosina, 7- aminometil-7-deazaguanosina, 7-deazaguanosina, N6-metiladenina y 7-metiladenina; cuando se hace referencia al uracilo, se incluyen el 5-metoxiuracilo, el 5-metiluracilo, el dihidrouracilo, el pseudouracilo y el tienouracilo, el dihidrouracilo, el 4-tiouracilo y el 5-hidroximetiluracilo; cuando se hace referencia a la guanosina, se incluyen la 7-metilguanosina, la 8-aza-7-deazaguanosina, la tienoguanosina y la 1-metilguanosina.

Siempre que se haga referencia a nucleósidos o nucleótidos, se incluyen los derivados de la ribofuranosa, como las variantes 2'-desoxi, 2'-hidroxi y 2'-0 -sustituidas, como la 2'-O-metil (2'-OMe), así como otras modificaciones, incluidas las variantes con puente 2'-4'.

Siempre que se haga referencia a oligonucleótidos, los enlaces entre dos mono-nucleótidos pueden ser enlaces fosfodiéster, así como modificaciones de los mismos, incluyendo, fosfodiéster, fosfotriester, fosforo(di)tioato, metilfosfonato, enlaces fosforo-amidato, y similares.

El término "que comprende" engloba tanto "que incluye" como "que consiste en", porejemplo,una composición "que comprende X" puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, porejemplo,X Y.

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, porejemplo,x+10%.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", porejemplo,una composición que esté "sustancialmente exenta de Y" puede estar completamente exenta de Y. Cuando proceda, la palabra "sustancialmente" puede omitirse en la definición de la invención.

El término "complementario", tal como se utiliza aquí, se refiere al hecho de que la molécula de ácido nucleico según la invención hibrida en condiciones fisiológicas con la secuencia de ARN diana y/o con sus propias secuencias internas, especialmente dentro de la estructura de horquilla. El término no significa que todos y cada uno de los nucleótidos de la molécula de ácido nucleico tengan un emparejamiento perfecto con su nucleótido opuesto en la secuencia diana o dentro de la estructura de horquilla. En otras palabras, mientras que una molécula de ácido nucleico según la invención puede ser complementaria a una secuencia diana, puede haber no coincidenciaes, bamboleos y/o protuberancias entre la molécula de ácido nucleico de la presente invención y la secuencia diana, mientras que en condiciones fisiológicas esa molécula de ácido nucleico sigue hibridándose con la secuencia diana de tal manera que las enzimas celulares pueden convertir la uridina diana en una ^. Por lo tanto, el término "sustancialmente complementaria" también significa que, a pesar de la presencia de los no coincidenciaes, bamboleos y/o protuberancias, la molécula de ácido nucleico según la presente invención tiene suficientes nucleótidos coincidentes con la secuencia diana como para que, en condiciones fisiológicas, la molécula de ácido nucleico hibride con el ARN diana. Como se muestra en el presente documento, una molécula de ácido nucleico puede ser complementaria, pero también puede comprender uno o más no coincidenciaes, bamboleos y/o protuberancias con la secuencia diana, siempre que en condiciones fisiológicas la molécula de ácido nucleico de la presente invención sea capaz de hibridarse con su diana.

El término "corriente abajo" en relación con una secuencia de ácido nucleico significa más allá a lo largo de la secuencia en la dirección 3'; el término "corriente arriba" significa lo contrario. Por lo tanto, en cualquier secuencia que codifique un polipéptido, el codón de inicio se encuentra corriente arriba del codón de parada en la cadena sentido, pero corriente abajo del codón de parada en la cadena antisentido.

Las referencias a la "hibridación" suelen referirse a la hibridación específica y excluyen la hibridación inespecífica. La hibridación específica puede producirse en condiciones experimentales elegidas, utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, para garantizar que la mayoría de las interacciones estables entre la sonda y la diana se produzcan cuando la sonda y la diana tengan al menos un 70%, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90% de identidad de secuencia.

El término "no coincidenciae" se utiliza aquí para referirse a nucleótidos opuestos en un complejo de ARN bicatenario que no forman pares de bases perfectos según las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick. Los nucleótidos que no coinciden son los pares G-A, C-A, U-C, A-A, G-G, C-C, U-U. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico según la presente invención comprenden menos de cuatro no coincidenciaes, por ejemplo 0, 1 o 2 no coincidenciaes. Los pares de bases bamboleantes son: Pares de bases G-ll, l-ll, l-A y l-C.

El término "mutación de empalme" se refiere a una mutación en un gen que codifica para un pre-ARNm, en el que la maquinaria de empalme es disfuncional en el sentido de que la eliminación de intrones del pre-ARNm está perturbada y debido al empalme aberrante, por ejemplo, se impide la traducción de una proteína plenamente funcional, ya sea por formación de una proteína disfuncional o por ausencia de la proteína. A menudo, tales proteínas disfuncionales se degradan rápidamente y no tienen ninguna actividad funcional, como se discute aquí, y los ARNm empalmados aberrantemente también pueden degradarse rápidamente. En un aspecto preferido, las mutaciones de empalme a las que se dirigen las moléculas de ácido nucleico de la presente invención y mediante los procedimientos de la presente invención están presentes en el gen CFTR humano. El experto conoce procedimientos para determinar si se restablece o no el empalme normal.

Un psEON libre (o desnudo) según la presente invención puede modificarse químicamente casi en su totalidad, por ejemplo proporcionando nucleótidos con una fracción de azúcar 2'-O-metilada (2'-OMe) y/o con una fracción de azúcar 2'-O-metoxietilada (2'-MOE).

Se conocen varias químicas y modificaciones en el campo de los oligonucleótidos que pueden utilizarse fácilmente de acuerdo con la invención. Los enlaces internucleosídicos regulares entre los nucleótidos pueden alterarse por monoo di-tioación de los enlaces fosfodiéster para producir ésteres de fosforotioato o ésteres de fosforoditioato, respectivamente. Son posibles otras modificaciones de los enlaces internucleosídicos, como la amidación y los enlaces peptídicos. En un aspecto preferido, los psEONs de la presente invención tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más enlaces fosforotioato entre los nucleótidos más terminales del psEON (por lo tanto, preferentemente tanto en el extremo 5' como en el 3'), lo que significa que en el caso de tres enlaces fosforotioato, los últimos cuatro nucleótidos están enlazados en consecuencia. El experto entenderá que el número de dichos enlaces puede variar en cada extremo, dependiendo de la secuencia diana, o basándose en otros aspectos, como la toxicidad. Sin embargo, es un aspecto de la invención que el psEON comprenda uno o más enlaces PS entre cualquier posición en sus siete nucleótidos terminales.

El azúcar ribosa puede modificarse por sustitución de la fracción2'-0 con un alquilo inferior (C1- 4, como 2'-OMe), alquenilo (C2-4), alquinilo (C2-4), metoxietilo (2'-metoxietoxi; o 2'-O- metoxietilo; o 2'-MOE), u otro sustituyente. Los sustituyentes preferidos del grupo 2' OH son un grupo metilo, metoxietilo o 3,3'-dimetilalilo. Este último es conocido por su propiedad de inhibir la sensibilidad a las nucleasas debido a su voluminosidad, al tiempo que mejora la eficacia de la hibridación. Alternativamente, pueden aplicarse secuencias de ácido nucleico bloqueadas (LNA), que comprenden un enlace intramolecular de puente 2'-4' (normalmente un puente de metileno entre el oxígeno 2' y el carbono 4') dentro del anillo de ribosa. Las nucleobases de purina y/o las nucleobases de pirimidina pueden modificarse para alterar sus propiedades, por ejemplo mediante aminación o desaminación de los anillos heterocíclicos. Otras modificaciones que pueden estar presentes en los psEONs de la presente invención son azúcares modificados 2'-F, BNA y cEt. Las químicas y formatos exactos pueden depender de cada constructo oligonucleotídico y de cada aplicación, y pueden elaborarse de acuerdo con los deseos y preferencias de los expertos en la materia.

En un aspecto preferido, el psEON de la presente invención comprende 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 nucleótidos.

Ejemplos de modificaciones químicas en los psEON de la presente invención son modificaciones de la fracción de azúcar, incluyendo la reticulación de sustituyentes dentro de la fracción de azúcar (ribosa) (p. ej. como en LNA o ácidos nucleicos bloqueados, BNA, cEt y similares), por sustitución del átomo 2'-0 con grupos alquilo (p. ej. 2'-O-metilo), alquinilo (2'-O-alquinilo), alquenilo (2'-O-alquenilo), alcoxialquilo (p. ej. 2'-O-metoxietilo, 2'-MOE), con una longitud como la especificada anteriormente, y similares. En el contexto de la presente invención, una "modificación" de azúcar también comprende la 2' desoxirribosa (como en el ADN). Además, el grupo fosfodiéster de la columna vertebral puede modificarse por tioación, ditiación, amidación y similares para producir enlaces internucleosídicos de fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato, etc. Los enlaces internucleosídicos pueden sustituirse total o parcialmente por enlaces peptídicos para dar lugar a secuencias de ácido peptidonucleico y similares. Alternativamente, o además, las nucleobases pueden modificarse por (de)aminación, para producir inosina o 2'6'- diaminopurinas y similares. Otra modificación puede ser la metilación del C5 en la fracción de citidina del nucleótido, para reducir las posibles propiedades inmunogénicas que se sabe que están asociadas a las secuencias CpG.

El grado de reclutamiento y redirección de las entidades de pseudouridilación residentes en la célula puede regularse mediante la dosificación y el régimen de dosificación del ARNsno. Esto es algo que debe determinar el experimentador(in vitro)o el clínico, normalmente en ensayos clínicos de fase I y/o II.

La invención se refiere a la modificación de secuencias de ARN diana en células eucariotas, preferentemente metazoos, más preferentemente mamíferos. En principio, la invención puede utilizarse con células de cualquier especie de mamífero, pero se utiliza preferentemente con una célula humana. La invención puede utilizarse con células de cualquier órgano, por ejemplo, piel, pulmón, corazón, riñón, hígado, páncreas, intestino, músculo, glándula, ojo, cerebro, sangre y similares. La invención es particularmente adecuada para modificar secuencias en células, tejidos u órganos implicados en un estado de enfermedad de un sujeto (humano), por ejemplo cuando el sujeto humano padece FQ. Dichas células incluyen, entre otras, las células epiteliales del pulmón. La célula puede localizarsein vitrooin vivo.Una ventaja de la invención es que puede utilizarse con célulasin situen un organismo vivo, pero también con células en cultivo. En algunas realizaciones, las células se tratan exvivoy después se introducen en un organismo vivo (por ejemplo, se reintroducen en un organismo del que procedían originalmente). La invención también puede utilizarse para editar secuencias de ARN diana en células dentro de un denominado organoide. Los organoides pueden considerarse tejidos tridimensionales derivados in vitro, pero se manipulan utilizando condiciones específicas para generar tejidos individuales aislados (por ejemplo, véase Lancaster y Knoblich. 2014, Science 345 (6194): 1247125). En un contexto terapéutico son útiles porque pueden derivarsein vitrode las células de un paciente, y los organoides pueden reintroducirse en el paciente como material autólogo, que tiene menos probabilidades de ser rechazado que un trasplante normal. La célula que se va a tratar suele presentar una mutación genética. La mutación puede ser heterocigota u homocigota. La invención se utilizará normalmente para modificar mutaciones puntuales.

La invención se utiliza para realizar un cambio en una secuencia de ARN diana en una célula eucariota mediante el uso de un oligonucleótido que es capaz de dirigirse a un sitio a editar y reclutar entidades de edición de ARN residentes en la célula para llevar a cabo la(s) reacción(es) de edición. La secuencia de ARN diana puede contener una mutación que se desee corregir o alterar, como una mutación puntual (una transición o una transversión). El ARN diana puede ser cualquier secuencia de ARN celular o viral, pero lo más habitual es que sea un pre-ARNm o un ARNm con función codificante de proteínas. La secuencia diana es endógena a la célula eucariota, preferentemente mamífera, más preferentemente humana.

La cantidad de ácido nucleico a administrar, la dosis y el régimen de dosificación pueden variar según el tipo de célula, la enfermedad a tratar, la población diana, el modo de administración (por ejemplo, sistémico frente a local), la gravedad de la enfermedad y el nivel aceptable de actividad secundaria, pero pueden y deben evaluarse por ensayo y error durante la investigación in vitro, en ensayos preclínicos y clínicos. Los ensayos son especialmente sencillos cuando la secuencia modificada da lugar a un cambio fenotípico fácilmente detectable. Es posible que dosis más altas de ácido nucleico compitan por unirse a una entidad editora de ácido nucleico dentro de una célula, agotando así la cantidad de la entidad que está libre para participar en la pseudouridilación, pero los ensayos rutinarios de dosificación revelarán cualquier efecto de este tipo para una molécula de ácido nucleico dada y una diana dada.

Una técnica de ensayo adecuada consiste en administrar la molécula de ácido nucleico según la invención a extractos celulares, líneas celulares o un organismo de ensayo y, a continuación, tomar muestras de biopsia en distintos momentos. La secuencia del ARN diana puede evaluarse en la muestra de biopsia y la proporción de células que presentan la modificación puede seguirse fácilmente. Una vez realizado este ensayo una vez, se pueden conservar los conocimientos y realizar futuros partos sin necesidad de tomar muestras de biopsia. Un procedimiento de la invención puede así incluir un paso de identificación de la presencia del cambio deseado en la secuencia de ARN diana de la célula, verificando así que la secuencia de ARN diana ha sido modificada. El cambio puede evaluarse a nivel de la proteína (longitud, glicosilación, función o similares), o mediante alguna lectura funcional, como una(n) corriente(s) (inducible(s)), cuando la proteína codificada por la secuencia de ARN diana es un canal iónico, por ejemplo.

En el caso de la función CFTR, un ensayo de cámara de llssing o una prueba NPD en un mamífero, incluidos los seres humanos, son bien conocidos por un experto en la materia para evaluar la restauración o ganancia de función.

Después de que se haya producido la pseudouridilación en una célula, el ARN modificado puede diluirse con el tiempo, por ejemplo debido a la división celular, la vida media limitada de los ARN editados, etc. Así, en términos terapéuticos prácticos, un procedimiento de la invención puede implicar la administración repetida de un oligonucleótido hasta que se hayan modificado suficientes ARN diana para proporcionar un beneficio tangible al paciente y/o mantener los beneficios a lo largo del tiempo.

Las secuencias de ácido nucleico (oligonucleótidos, ARNsnos modificados; psEONs; vectores como los aquí descritos con secuencias exón-intrón-exón, pol-ll, o constructos de expresión impulsados por pol-lll) de la invención son particularmente adecuados para uso terapéutico, y así la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido o vector portador de la invención y un portador o disolvente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones de la invención, el portador o disolvente farmacéuticamente aceptable puede ser simplemente una solución salina. Puede ser isotónica o hipotónica, especialmente para el parto pulmonar. La invención también proporciona un dispositivo de administración (por ejemplo, jeringa, inhalador, nebulizador) que incluye una composición farmacéutica de la invención.

La invención también proporciona un oligonucleótido de la invención para su uso en un procedimiento para hacer un cambio en una secuencia de ARN diana en un mamífero, preferentemente una célula humana, como se describe en el presente documento.

La introducción de la molécula de ácido nucleico según la presente invención en la célula se realiza mediante procedimientos generales conocidos por el experto en la materia. Tras la pseudouridilación, la lectura del efecto (alteración de la secuencia del ARN diana) puede monitorizarse de diferentes maneras. Por lo tanto, el paso de identificación de si la pseudouridilación deseada de la uridina diana ha tenido lugar realmente depende generalmente de la posición de la uridina diana en la secuencia de ARN diana, y del efecto que se produce por la presencia de la uridina (mutación puntual, PTC). Por lo tanto, en un aspecto preferido, dependiendo del efecto final de la conversión de U a y , el paso de identificación comprende: evaluar la presencia de una proteína funcional, alargada, de longitud completa y/o de tipo salvaje; evaluar si el empalme del pre-ARNm fue alterado por la pseudouridilación; o utilizar una lectura funcional, en la que el ARN diana después de la pseudouridilación codifica una proteína funcional, de longitud completa, alargada y/o de tipo salvaje. La evaluación funcional de cada una de las enfermedades mencionadas en el presente documento se realizará generalmente según procedimientos conocidos por el experto.

La molécula de ácido nucleico, como un constructo o vector de expresión de oligonucleótidos de edición pseudouridilada (psEON) según la invención, se administra adecuadamente en solución acuosa, por ejemplo solución salina, o en suspensión, que comprende opcionalmente aditivos, excipientes y otros ingredientes, compatibles con el uso farmacéutico, a concentraciones que oscilan entre 1 ng/ml y 1 g/ml, preferentemente entre 10 ng/ml y 500 mg/ml, más preferentemente entre 100 ng/ml y 100 mg/ml. La dosis puede oscilar convenientemente entre aproximadamente 1 pg/kgy aproximadamente 100 mg/kg, preferentemente entre aproximadamente 10 pg/kgy aproximadamente 10 mg/kg, más preferentemente entre aproximadamente 100 pg/kgy aproximadamente 1 mg/kg. La administración puede ser por inhalación (por ejemplo, mediante nebulización), intranasal, oral, por inyección o infusión, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intracraneal, intravítrea, intramuscular, intratraqueal, intraperitoneal, intrarrectal y similares. La administración puede ser en forma sólida, en forma de polvo, píldora o en cualquier otra forma compatible con el uso farmacéutico en humanos. La invención es especialmente adecuada para tratar enfermedades genéticas, como la fibrosis quística.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico, como un psEON, constructo de expresión o vector, puede administrarse sistémicamente, pero es más típico administrar un oligonucleótido a células en las que se observa el fenotipo de la secuencia diana. Por ejemplo, las mutaciones enCFTRcausan la FQ, que se observa principalmente en el tejido epitelial pulmonar, por lo que con una secuencia diana deCFTRes preferible administrar el constructo de oligonucleótidos específica y directamente a los pulmones. Esto puede lograrse convenientemente por inhalación, por ejemplo, de un polvo o aerosol, normalmente mediante el uso de un nebulizador. Son especialmente preferibles los nebulizadores que utilizan una malla vibratoria, como el PARI eFlow (Rapid) o el i-neb de Respironics. Es de esperar que la administración inhalada de constructos de oligonucleótidos según la invención también pueda dirigirse a estas células de manera eficiente, lo que en el caso de la orientación del genCFTRpodría conducir a la mejora de los síntomas gastrointestinales también asociados con la FQ. En algunas enfermedades, la capa de mucosidad presenta un mayor grosor, lo que provoca una menor absorción de medicamentos a través del pulmón. Una de estas enfermedades es la bronquitis crónica, otro ejemplo es la fibrosis quística. Existen diversos normalizadores de la mucosidad, como DNasas, solución salina hipertónica o manitol, que se comercializa con el nombre de Bronchitol. Cuando los normalizadores del moco se utilizan en combinación con constructos de oligonucleótidos pseudouridilatadores, como los constructos psEON según la invención, podrían aumentar la eficacia de esos medicamentos. Por consiguiente, la administración de un constructo de oligonucleótidos según la invención a un sujeto, preferentemente un sujeto humano, se combina preferentemente con normalizadores de moco, preferentemente los normalizadores de moco descritos en el presente documento. Además, la administración de los constructos de oligonucleótidos según la invención puede combinarse con la administración de moléculas pequeñas para el tratamiento de la FQ, como compuestos potenciadores, por ejemplo Kalydeco (ivacaftor; VX-770), o compuestos correctores, por ejemplo VX-809 (lumacaftor) y/o VX-661. Alternativamente, o en combinación con los normalizadores del moco, puede aplicarse la administración en partículas o nanopartículas penetrantes del moco para la administración eficaz de moléculas pseudouridilatadoras a las células epiteliales de, por ejemplo, pulmón e intestino. En consecuencia, la administración de un constructo oligonucleotídica según la invención a un sujeto, preferentemente un sujeto humano, utiliza preferentemente la entrega en partículas o nanopartículas penetrantes en el moco. Las infecciones pulmonares crónicas y agudas suelen estar presentes en pacientes con enfermedades como la fibrosis quística. Los tratamientos antibióticos reducen las infecciones bacterianas y sus síntomas, como el engrosamiento de la mucosidad y/o la formación de biopelículas. El uso de antibióticos en combinación con constructos de oligonucleótidos según la invención podría aumentar la eficacia de la pseudouridilación debido a un acceso más fácil de las células diana para el constructo de oligonucleótidos. Por consiguiente, la administración de un constructo oligonucleotídica según la invención a un sujeto, preferentemente un sujeto humano, se combina preferentemente con un tratamiento antibiótico para reducir las infecciones bacterianas y los síntomas de las mismas, como el espesamiento de la mucosidad y/o la formación de biopelículas. Los antibióticos pueden administrarse por vía sistémica, local o ambas. Para su aplicación en pacientes con FQ, los constructos oligonucleotídicas según la invención, o los constructos oligonucleotídicas empaquetadas o complejas según la invención pueden combinarse con cualquier normalizador de moco, como una DNasa, manitol, solución salina hipertónica y/o antibióticos y/o una molécula pequeña para el tratamiento de la FQ, como compuestos potenciadores, por ejemplo ivacaftor, o compuestos correctores, por ejemplo lumacaftor y/o VX-661. Para aumentar el acceso a las células diana, podría aplicarse un lavado bronquioalveolar (BAL) para limpiar los pulmones antes de la administración del oligonucleótido según la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Diseño de oligonucleótidos guía pseudouridilizantes derivados de la estructura del ARN nucleolar pequeño (ARNsno) para la conversión de una uridina específica en ARN diana ACA19 a ip.

Los inventores de la presente invención se preguntaron si sería posible inducir la pseudouridilación utilizando un ARNsno de caja H/ACA acortado. Para ello, se diseñó un ARN guía de pseudouridilación en el que se eliminaron la horquilla 5' del ARNsno ACA19 de longitud completa y la mayor parte de la caja H (Figura 4). El ARN guía acortado y el ARNsno de longitud completa se produjeron mediante transcripciónin vitrocon ARN polimerasa T7. Para las pruebas en lisados celulares, se produjo un ARN de sustrato corto para estas guías mediante transcripciónin vitroutilizando ARN polimerasa T7 (en presencia de[o:-32P]UTP) o mediante ligadura en dos piezas. Para esto último, en primer lugar, un oligonucleótido de ARN sintético, que termina en su extremo 5' en la uridina que se va a pseudouridilar, se marcó radiactivamente en el grupo hidroxilo 5' con un fosfato [y-32P] utilizando polinucleótido quinasa T4. A continuación, el oligonucleótido de ARN marcado radiactivamente se ligó en su extremo 5' al grupo hidroxilo 3' de otro oligonucleótido de ARN para formar el ARN sustrato. Para ello, se unieron los oligonucleótidos de ARN con un oligonucleótido de ADN puente de 30 nt, de forma que la mitad 5' (15 nt) del oligonucleótido de ADN puente se uniera con el fragmento 3' de ARN y la mitad 3' (15 nt) del oligonucleótido de ADN puente se uniera con el fragmento 5' de ARN, y luego se les suministró ADN ligasa T4 para unir covalentemente los oligonucleótidos de ARN. El sustrato de ARN ligado y marcado radiactivamente tiene entonces la secuencia 5'-AGGGGAACCCCACAGUCGAACCAAAACAAA-3' (SEQ ID NO:1), en la que la uridina diana (que contiene el fosfato radiactivo en su lado 5') está subrayada. A continuación, este ARN de sustrato se purificó de los demás ácidos nucleicos separándolo, cortándolo de un gel de poliacrilamida desnaturalizante, eluyéndolo del gel y concentrándolo finalmente por precipitación con etanol.

Para preparar el lisado celular destinado a comprobar la pseudouridilación, las células HeLa se cultivaron en placas de cultivo celular estándar de 10 cm en DMEM con un 10% de FBS hasta una confluencia del 80-100%, tras lo cual se recogieron por raspado y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato. A continuación, se añadieron 200 pl de tampón de extracción (25% de glicerol, 0,42 M de NaCI, 1,5 mM de MgCh, 0,2 mM de EDTA, 20 mM de HEPES (pH 7,9), 0,5 mM de DTT y 0,5 mM de fluoruro de fenilmetano-sulfonilo) a las células, que se agitaron en vórtex en presencia de microesferas de vidrio estériles durante 30 segundos tres veces, cada vez seguidas de una incubación de 30 segundos en hielo. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación y el sobrenadante se recogió para utilizarlo en el ensayo de pseudouridilación.

Para los ensayos de pseudouridilación, se utilizó un tampón de incubación que contenía 200 mM Tris-HCI, pH 8,0, 200 mM acetato de amonio, 10 mM MgCh,4 mM DTT, y 0.2 mM EDTA, complementado con 200 ng del ARNsno H/ACA de longitud completa o del ARN guía acortado,<a>R<n>sustrato según su radiactividad relativa (5000 recuentos por minuto), 250 ng de ARNt de levadura y extracto de células HeLa (concentración final 20%) se mezclaron y se incubaron a 37°C durante 40 min. A continuación, se aisló el ARN de las reacciones mediante extracción con fenolcloroformo y precipitación con etanol. A continuación, el ARN se incubó con nucleasa P1(~300ng) en tampón acetato sódico 20 mM, pH 5,2 durante 1 h a 37 °C para degradar el ARN y liberar los nucleótidos individuales. A continuación, se separaron mediante cromatografía en capa fina (con las proporciones de volumen de disolvente 70:15:15 para alcohol isopropílico:HCI:agua, respectivamente), y los nucleótidos radiactivos se visualizaron mediante autorradiografía. Debido a la diferente migración de las uridinas marcadas y las pseudouridinas derivadas, la conversión del sustrato marcado uridina en pseudouridina puede observarse claramente tanto con el ARNsno H/ACA de longitud completa como con el ARN guía acortado. La Figura 5 muestra que cuando se utiliza un oligonucleótido guía de pseudouridilación acortado, la eficacia de la pseudouridilación es al menos comparable a la observada con las versiones de longitud completa de los ARN guía.

A continuación, se investigó si las modificaciones químicas realizadas en el ARN guía ACA19 acortado serían compatibles con la participación del ARN diana y la formación de un complejo de pseudouridilación catalíticamente activo. Las posiciones de las modificaciones químicas se seleccionaron como se describe en el presente documento. El ARN sustrato y los ensayos experimentales utilizados fueron los mismos que para la comparación anterior del ARNsno H/ACA de longitud completa o del ARN guía acortado. La Figura 6 muestra los cuatro oligonucleótidos editores pseudouridilados ACA19 (psEONs) y las posiciones de las modificaciones químicas que se introdujeron: los puntos negros indican modificaciones 2'-OMe en la fracción ribosa de ese nucleótido, y los puntos abiertos indican modificaciones PS del enlace entre las dos ribosas. La Figura 7 muestra el resultado de la pseudouridilación utilizando los cuatro psEONs ACA19 en paralelo con el ARN guía correspondiente (sin modificaciones químicas) como control positivo y sin ARN guía como control negativo. U y ^ indican la migración de uridina y pseudouridina en la cromatografía en capa fina, respectivamente. Claramente, los psEON modificados químicamente fueron capaces de apoyar la conversión de uridina en pseudouridina, y el primer psEON incluso da una señal de pseudouridilación mucho más fuerte en comparación con el control positivo. El efecto potenciado podría deberse a interacciones específicas de las modificaciones químicas de la psEON dentro del complejo enzimáticamente activo, o a otros efectos, como una mayor resistencia a las nucleasas en los lisados celulares, cada uno de los cuales puede contribuir a la eficacia y/o velocidad de la pseudouridilación.

Ejemplo 2: Diseño de psEONs para la conversión de una uridina específica en un codón de terminación prematura en CFTR humano.

Se investigó si una uridina en un codón de terminación prematura (PTC) del gen CFTR humano podía convertirse en Y. Como ejemplo se seleccionó la mutación CFTR-G542X. Los procedimientos para comprobarlo fueron los descritos en el ejemplo 1.

El ARN sustrato se construyó de forma similar al ejemplo 1 (ligación en dos piezas), siendo la secuencia diana final 5'-GACAAUAUAGUUCUUUGAGAAGGUGGAAUC-3' (uridina diana marcada subrayada; SEQ ID NO:2).

La Figura 8 muestra los cuatro psEONs CFTR-G542X y las posiciones de las modificaciones químicas que se introdujeron: los puntos negros indican modificaciones 2'-OMe en la fracción ribosa de ese nucleótido, y los puntos abiertos indican modificaciones PS del enlace entre las dos ribosas. La Figura 9 muestra el resultado de la pseudouridilación utilizando los cuatro psEONs CFTR-G542X en paralelo con el ARN guía correspondiente (sin modificaciones químicas) como control positivo y sin ARN guía como control negativo. U y y indican la migración de uridina y pseudouridina en la cromatografía en capa fina, respectivamente. Los resultados indican claramente que tres de cada cuatro psEON superan al control positivo, lo que demuestra una vez más que las modificaciones químicas en las posiciones indicadas aumentan la tasa y/o la eficacia de la pseudouridilación en lisados de células de mamífero.

Ejemplo 3: Diseño de ARNsnos para la conversión de una uridina específica en un codón de terminación prematura en el ARN Idua de ratón.

Se investigó si una uridina en un PTC del ARNIduade ratón podía convertirse en<y>. Como ejemplo se seleccionó la mutación /dt/a-W392X en el ARN de ratón, que corresponde a la mutación humanaIDUAW402X conocida por causar el síndrome de Hurler. Para ello, el ARN sustrato se construyó de forma similar al Ejemplo 1 (ligación en dos piezas), con la secuencia final de 5'- GAUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCA-3' (uridina diana marcada subrayada; SEQ ID NO:3).

La Figura 10 muestra los cuatro /dua-W392X psEONs y las posiciones de las modificaciones químicas que se introdujeron: los puntos negros indican modificaciones 2'-OMe en la fracción ribosa de ese nucleótido, y los puntos abiertos indican modificaciones PS del enlace entre las dos ribosas. La Figura 11 muestra el resultado de la pseudouridilación utilizando los cuatro psEONs /dua-W392X en paralelo con el ARN guía correspondiente (sin modificaciones químicas) como control positivo y sin ARN guía como control negativo. II y AP indican la migración de uridina y pseudouridina en la cromatografía en capa fina, respectivamente. Aquí, la intensidad del control negativo es muy baja debido a la pérdida de la muestra durante el paso de precipitación tras la reacción de pseudouridilación. No obstante, los resultados indican claramente que todos los psEONs son capaces de soportar la conversión de una uridina en pseudouridina, e incluso superan al control positivo, demostrando una vez más que las modificaciones químicas en las posiciones indicadas aumentan la tasa y/o la eficiencia de la pseudouridilación en lisados de células de mamífero.

Ejemplo 4: Pseudouridilación dirigida de un vector que contiene codones de terminación prematura mediante ARN guía incrustados en intrónicos.

Clonación de los constructos "puglntron-IDUA"y "puglntronOpt-IDUA" de Exonl/lntrón-guía ARN-lntrÓn/Exon2

El constructo del plásmido puglntron-IDUA se basó en el esqueleto original pdRLuc-GI (Woeller et al. 2008. EMBO Reports 9(5):446-451) y se generó mediante amplificación por PCR y mutagénesis dirigida al sitio, utilizando la polimerasa de ADN HS de fusión PfuUltra II de Agilent. El plásmido pugintrón se generó insertando primero los sitios de restricción Sall y Pstl en el primer intrón de la P-globina humana en el vector parental pdRLuc-GI. Se utilizaron los siguientes cebadores: SDM1-GLintron1- Sal-Pst: 5'-GTAAGTCGACGAATTCTGCAGGCTGCTGGTGG-3' (SEQ ID NO: 13) y SDM2- GLintron1-Sal-Pst: 5'-GCCTGCAGAATTCGTCGACTTACCTGCCCAGG-3' (SEQ ID NO:14). A continuación, el ARN guía se generó mediante PCR utilizando los siguientes cebadores que contienen Sall/Pstl (también se incluyó una secuencia extra rica en Py para el empalme): pug-intron-FwdSall: 5'-GTTGTCGAC GTGGGAGATTCT-3' (SEQ ID NO: 15) y pug-intron-RevExPstl: 5'-AATCTGCAGG GGAAAAGAGAGTCAACCTGTCTGCCTCGT-3' (SEQ ID NO:16). En primer lugar, utilizando un sitio Hindlll situado corriente abajo del sitio de restricción Pstl, pero aún en la región intrónica, se pegó el fragmento Sal l-H indl 11 del vector parental en un vector intermedio (pEGFP-C3). A continuación, el producto PCR de ARN guía digerido con Sall-Pstl se insertó en este vector intermedio. Por último, el fragmento Sall- Hindl 11 se clonó de nuevo en el vector parental de expresión del pugintrón. La Figura 12A muestra el constructo con el promotor CMV corriente arriba, el exón 1 (E1) y el exón 2 (E2) y el inserto puglntron- IDUA en la parte intrónica, con los sitios Sall y Pstl indicados. La Figura 13 muestra la secuencia del plásmido puglntron-IDUA completo (SEQ ID NO:11). Se realizó una versión optimizada de este constructo (creando una secuencia de sitio de empalme 3' más adecuada) ejecutando una PCR utilizando el pugintron-FwdSall como cebador directo (véase más arriba) y el siguiente cebador como cebador inverso (los dos nucleótidos adicionales en comparación con el cebador inverso pug-intron-RevExPstl, véase más arriba, creando una secuencia adicional 5'-AC-3' en el sitio de empalme 3', están subrayados): pug-intronOPT-RevExPstl:

5'-AATCTGCAGGGGAAAAGAGAGTCAGTACCTGTCTGCCTC-3' (SEQ ID NO:21). Los pasos de clonación indicados anteriormente se repitieron para generar el plásmido optimizado puglntronOpt- IDUA, cuya secuencia completa figura en la SEQ ID NO:22 (que incluye el 5'-AC-3' adicional directamente corriente abajo del intrón, en comparación con la SEQ ID NO:11). El control negativo pugCFTR era la versión original del ARN guía que se utilizó para la plantilla PCR del pugintrón. Este constructo se realizó a partir de tres oligos de ADN superpuestos, cuya columna vertebral se originó a partir de pugU2-34/44, para CFTR: pug-NBD1-F1 Hindlll 5'-ATTAAGCTTGT GTGGAGATTCTTCTTCGGACAGAGAGAAACTCTGCTGTG-3' (SEQ ID NO:27), pug-NBD1-

R1 5'-CTGCTGTGTCTGAAAGAAGATCTCCCTAGTGACCCTGCCTTACCTTCTCCGGAC GAA-3' (SEQ ID NO:28) y pug-NBD1-R2BamHI 5'-ATGGATCCACCTGTCTGCC TCGTATTCTTCCGTTACGATTTCTCATTTCGTCCCGG-3' (SEQ ID NO:29), y para IDUA: pug-mmidua-F1Hindlll 5'-ATTAAGCTTGTGTGGGAGATTCTGCCTCGGACAGAGAAACTCT GCTGTG-3' (SEQ ID NQ:30), pug-mmidua-R1 5'-TTCGTCCCGGGGCAGAGAAGGCAGG GTCACTAGGGGAGATCAACTCTCAGACACAGCAG-3' (SEQ ID NO:31) y pug-mmidua- R2 Bam HI 5'-ATGGATCCACCTGTCTGCCTCgtaAACTCCCGTTACGATTTCTCTCATTTC

GTCCCGG-3' (SEQ ID NO:32). A continuación, los productos de 3 piezas-PCR se digirieron con Hindlll y BamHI y se clonaron en pcDNA3.1/Zeo(+).

Clonación del plásmido diana "intercambio GL-IDUA" que comprende el gen de la p-globina humana que alberga una mutación PTC mmlDUA-W392X:

Como secuencia diana para la pseudouridilación se utilizó el constructo que expresa el gen de la p-globina humana (WT y TER; Woeller et al. 2008). En la versión TER del plásmido, que contiene un PTC en el codón 39 de la globina, la secuencia diana (que es el sustrato para el ARN guía) se intercambió por la mutación CFTR-G542X (que sirve como plásmido diana de control negativo) y la mutación mmlDUA-W392X (diana para el plásmido puglntron-IDUA) mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando la polimerasa de ADN HS de fusión Pfullltra II de acuerdo con los protocolos del fabricante (Agilent technologies). Para intercambiar la región sin sentido de 33 nt (posición -15 a PTC (3 nt) a posición 15) en el constructo original pFLAG2CMV2-HBB con la secuencia diana mmlDUA-W392X de 33 nt (marcada en negrita en la Figura 14), se utilizaron los siguientes cebadores para la amplificación: SDM- GL39-SWAPto-mmidua-1: 5'-TGGTGGATGGAGAACAACTCTAGGCAGAGGTCTCAAAGTT TGGGGATCTGTCCACTCC-3' (SEQ ID NO:17) y SDM-GL39-SWAPto-mmidua-2: 5'- CCAAACTTTGAGACCTGCCTAGAGTTGTT CTCCATCCACCAGCAGCCTAAGGGTGG-3' (SEQ ID NO:18). Para la generación del plásmido intercambiado que contiene la mutación CFTR-G542X (intercambio GL-CFTR) se utilizaron los siguientes cebadores: SDM-GL39-SWAPto-NBD1-1 5'-

TGGTGACAATAGTTCTTTGAGAAGGTGGAATCACATTTGGGGATCTGTCCACTCC-3' (SEQ ID NO:33) y SDM-GL39-SWAPto-NBD1-2 5'-CCAAATGTGATTCCACCTTCTC AAAGAACTATTGTCCACCAGCAGCCTAAGGGTGGG-3' (SEQ ID NO:34).

Protocolo de cultivo celular y transfección:

Las células HEK293T y HeLa se cultivaron en DM EM 10% FBS. Las transfecciones transitorias se realizaron utilizando polietilenimina HCI PEI MAX 40000 (PolySciences) como solución madre de 1 mg/mL (pH7). Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos hasta una confluencia elevada (90-100%). Para preparar la solución de transfección, se mezclaron 150 pL de Opti-MEM (sin suero) con 9 pL de solución madre de PEI y la mezcla resultante se incubó a RT durante 5 min. A continuación, se añadieron 100 ng de ADN plasmídico de sustrato (de tipo salvaje o que contenía PTC) y 2 pgde ADN plasmídico que expresaba ARN guía a la mezcla de PEI/medio antes mencionada. La solución resultante se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos, tras lo cual la mezcla se añadió directamente a cada pocillo.

RT-PCR:

Las células HEK293T se transfectaron con el plásmido de sustrato de intercambio GL39-IDUA con o sin el plásmido de expresión de guía puglntronOpt-IDUA como se ha indicado anteriormente. El ARN total se aisló con el reactivo TRIzol™ (Invitrogen). La transcripción inversa se llevó a cabo con la transcriptasa inversa AMV (Promega) y el producto RT se amplificó después por PCR con GoTaq® Green Master Mix (Promega), utilizando de 15 a 23 ciclos. Los ARNm diana de la pseudouridilación se detectaron mediante RT-PCR con el siguiente par de cebadores: Primer delantero: RLuc-GI ex1 S4: 5'- TCTGCCGTTACTGCCCTGTG-3' (SEQ ID NO:19) y cebador inverso: PE-mmiduaPTC+16: 5'- CTTTGAGACCTCTGCC - 3' (SEQ ID NO:20). el ARNr 5S se detectó con fines de normalización con el siguiente par de cebadores: 5SFwd: 5'-GCCATACCACCCTGAACG-3' (SEQ ID NO:23) y 5SRev: 5'-AGCTTCCGAGAT CAGACGAG-3' (SEQ ID NO:24). Los productos de la r T-PCR se separaron mediante electroforesis en gel y se cuantificaron con Image Studio Lite (LI-COR). Los resultados se presentan en la Figura 15 y muestran que cuando el plásmido puglntronOpt-IDUA (aquí puglntOptlDUA) se transfectó con el plásmido diana de intercambio GL39-IDUA (aquí GL39IDUA) en células h Ek293t , se pudo detectar un producto RT- PCR utilizando los cebadores dados anteriormente (dado por la flecha GL39) después de 18 ciclos, pero aún no después de 15 ciclos. Casi no se pudo detectar producto alguno cuando el plásmido de intercambio GL39-IDUA se transfectó sin el plásmido que expresaba el ARN guía transportado por el intrón. Esto indica que la cantidad de ARNm del plásmido de intercambio GL39-IDUA fue mayor en estas células que cuando no se introdujo ARN guía. De hecho, la pseudouridilación del ARN inducida por la guía suprimió la NMD y aumentó el nivel de ARNm intacto 37 veces (0,00437 en el carril 2; 0,1617 en el carril 4, normalizado por el control 5S).Por lo tanto, se concluye que el ARN guía (del plásmido puglntronOpt-IDUA) es capaz de dar lectura, suprimiendo así la NMD, y que se ha producido pseudouridilación. Se obtuvieron resultados similares después de realizar entre 20 y 23 ciclos de PCR, y cuando se utilizó un plásmido portador de una mutación CFTR-G542X como sustrato y se utilizó pugintCFTR como vector de entrega de expresión de ARN guía, véase la Figura 19. En este caso, se utilizaron los siguientes cebadores: NBD1PSU-202Fwd: 5'-CTGGAGCCTTCAGAGG-3' (SEQ ID NO:35) y NBD1PSU+40(491-509)Rev: 5'-GCTCTTGCTAAAGAAATTC-3' (SEQ ID NO:36).

Detección de la proteína completa mediante transferencia western:

Las mismas células HEK293T transfectadas que se utilizaron para la extracción de ARN y la posterior RT-PCR (descrita anteriormente) para determinar la supresión de NMD, se utilizaron para generar lisados de células enteras. Se prepararon en 500 pL de tampón NET2 (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,05% Nonidet™ P40) suplementado con 0,02% SDS. Los lisados celulares se sometieron a sonicación (a nivel 2 durante 10 s) seguida de centrifugación (17.000xg durante 20 min a 4 °C) para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se utilizó como proteína total y se sometió a análisis proteínico. La proteína marcada con FLAG expresada ectópicamente se inmunoprecipitó de la proteína total utilizando agarosa magnética Anti-DYKDDDDK (Thermo Scientific). Las proteínas extraídas e inmunoprecipitadas se separaron en un SDS-PAGE al 15%, se sometieron a inmunotransferencia y los anticuerpos se detectaron con el sustrato de máxima sensibilidad SuperSignal West Femto (Thermo Scientific). La proteína marcada con FLAG se detectó con ANTI-FLAG M2 monoclonal, clon M2 (F1804, SIGMA) como anticuerpo primario e IgG de cabra anti-ratón (H&L) [HRP], pAb (A10093, Genscript) como anticuerpo secundario. El gen de mantenimiento de la tubulina se detectó con fines de normalización (anticuerpo primario: Tubulina-beta, anticuerpo policlonal de conejo #RB-9249-P0 (Thermo Scientific); anticuerpo secundario: Anticuerpo IgG anti-conejo, ligado a HRP #7074S (Cell Signaling)).

Los resultados se muestran en la figura 16. La posición del intercambio de la proteína de longitud completa FLAG-GL39-IDUA viene dada por una flecha. El carril 1 representa células HEK293T que sólo fueron transfectadas con el plásmido de intercambio de sustrato FLAG-GL39-IDUA. El carril 2 representa células HEK293T transfectadas con el plásmido de intercambio de sustrato FLAG-GL39-IDUA el plásmido puglntronOpt-IDUA como vector proveedor de ARN guía. Claramente, se observa un aumento significativo de la abundancia de FLAG-GL39-IDUA, lo que indica que se ha producido una pseudouridilación en el codón de parada UAG presente en el ARN transcrito a partir del plásmido sustrato y que se ha producido una lectura durante la traducción. Esto demuestra que los inventores de la presente invención fueron capaces de pseudoridilar una secuencia diana en células,in vivo,utilizando enzimas endógenas (presentes de forma natural) de edición de ARN (pseudouridilación), y tras proporcionar a dichas células un ARN guía que procedía de su entorno natural: una secuencia intrónica.

Detección de pseudouridilación

Para confirmar que la supresión de NMD (detectada mediante RT-PCR, véase más arriba y la Figura 15) y la aparición de la proteína de longitud completa etiquetada con FLAG (detectada mediante transferencia western, véase más arriba y la Figura 16) eran el resultado de una pseudouridilación real obtenida mediante el uso de un plásmido diana que contenía un codón de terminación prematuro y un ARN guía intrónico para la pseudouridilación, se utilizó un procedimiento de extensión de cebadores modificado con CMC descrito anteriormente por Adachi et al. (2019, Methods Mol Biol 1870:219-235). Este procedimiento de varios pasos se basa en la acilación específica de pseudouridinas utilizando un reactivo que modifica preferentemente las bases de pseudouridina, CMC (o CMCT: /V-ciclohexil-/V'-(2-morfolinoetil) carbodiimida metil-p-toluenosulfonato). Aunque inicialmente también se derivatizan bases como los residuos de uridina, inosina y guanosina, es posible detectar pseudouridinas, ya que sólo éstas permanecerán acetiladas, mientras que el resto de las bases derivatizadas se hidrolizan de nuevo a su forma química natural tras un suave paso de tratamiento alcalino. La forma de mapear la posición de las pseudouridinas es a través de una reacción de extensión del cebador, donde la voluminosidad del CMC en el residuo de pseudouridina puede bloquear la transcripción inversa, generando una parada para la extensión del cebador un nucleótido antes de los sitios CMC-pseudouridina. Dado que los RT-stop naturales también se producen como artefactos generados por estructuras secundarias fuertes, se ejecuta en paralelo un control negativo (sin derivatización CMC) para identificarlos. Este reactivo se utilizó para mapear la posición de todos los residuos de pseudouridina conocidos en el transcriptoma de células humanas (Carlile et al, 2014. Nature 515(7525): 143-146). Para ello, se transfectaron células HEK293<t>con el plásmido de intercambio de sustrato FLAG-GL39-IDUA junto con el plásmido puglntron-IDUA o con pug-CFTR, que sirvió como control negativo, ya que el ARN guía específico de CFTR no debería ser capaz de pseudouridilar la U diana de IDUA en el codón de parada. El ARN total se extrajo como se ha descrito anteriormente. se utilizaron 20 pgde ARN total para el tratamiento con CMC seguido de la extensión del cebador con un cebador específico de globina: hGI193-209AS: 5'-CCGAGCACTTTCTTGCC-3' (SEQ ID NO:25). se utilizaron 10 pg de ARN total para la extensión del cebador de control U6 ARNsn con un cebador específico U6: hU6-86- 105AS: 5'-AATATGGAa Cg CTTCACGAA-3' (SEQ ID NO:26). Los resultados se muestran en la figura 17. La flecha indica la posición del producto donde la extensión del cebador se había detenido debido a la presencia de un residuo ^-CMC. Esto sólo ocurrió en las células que fueron tratadas con CMC y transfectadas con el plásmido de sustrato de intercambio GL39-IDUA y el plásmido que expresa el ARN guía puglntron-IDUA (panel ampliado). No se pudieron detectar bandas en las muestras de células transfectadas con el intercambio GL-IDUA con el control negativo de ARN guía que expresaba el plásmido pug-CFTR. La posición del residuo ^ en relación con el cebador utilizado para la extensión del cebador se conoce con exactitud (92 bases). Estos resultados demuestran claramente que la pseudouridilación ha tenido lugar en células HEK293T que fueron transfectadas con un plásmido diana portador de un codón de parada prematuro en un contexto IDUA y que fueron co-transfectadas con un plásmido portador - en un intrón - de un RNAsno que es, una vez empalmado fuera de la secuencia intrón, capaz de dirigirse a la secuencia sustrato y de pseudouridilar específicamente la U en el codón de parada UAG.

Ejemplo 5: Aumento de los niveles de ARNm tras el tratamiento con ARN guía incrustados en intrones y psEONs.

Además de lo que se ha mostrado en el Ejemplo 4, se probó si un psEON, como se describe en detalle en el presente documento, también podría producir pseudouridilación utilizando el sustrato GL-IDUA en plásmidos de intercambio después de la transfección en células. Para ello, las células HEK293T se transfectaron al 90-100% de confluencia, utilizando PEI en una placa de 6 pocillos, con 500 ng del plásmido de sustrato de intercambio GL-IDUA y 2,5 pgdel plásmido que expresa el ARN guía puglntron-IDUA o se transfectaron con 100 pmol del oligonucleótido Cy3-IDUA-A psEON. Cuatro días después de la transfección, las células se lavaron y se incubaron durante 24 h. El<a>R<n>total se aisló como se ha descrito y la RT-PCR se realizó como se ha indicado anteriormente, con la salvedad de que se realizaron 21 ciclos para todas las muestras. Los productos de la RT-PCR se separaron mediante electroforesis en gel. Los resultados se muestran en la figura 18. Esto indica que cuando no se transfectó ADN (es decir, sin plásmido o psEON, encima del plásmido de sustrato transfectado) no se detectó ningún producto GL39 RT-PCR, aunque el control 5S era abundante. Sin embargo, tras la cotransfección del plásmido que expresa el ARN guía puglntron-IDUA y también tras la cotransfección con el psEON Cy3-iDUA-A, el producto era detectable, lo que indica que se produjo la lectura del ARNm y que se inhibió la NMD. Esto demuestra que los inventores de la presente invención fueron capaces de obtener pseudouridilación no sólo mediante el uso de ARNs guía intrónicamente incrustados, sino también con los psEONs cortos de la presente invención.

EQUIVALENTES

Las realizaciones anteriores deben considerarse en todos los aspectos ilustrativas y no limitativas de la invención aquí descrita. El alcance de la invención viene indicado por las reivindicaciones adjuntas más que por la descripción anterior.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico para la pseudouridilación de una uridina diana en un ARN diana en una célula de mamífero, en la que la molécula de ácido nucleico consiste en una región guía única correspondiente a una de las dos estructuras de horquilla del ARNsno H/ACA de tipo silvestre, en la que la molécula de ácido nucleico es capaz de formar un complejo de ácido nucleico parcialmente bicatenario con el ARN diana que comprende la uridina diana, en el que el complejo de ácido nucleico parcialmente bicatenario puede participar en una enzima de pseudouridilación de mamífero, en el que la región guía ayuda a posicionar la uridina diana en el complejo de ácido nucleico parcialmente bicatenario para que la enzima de pseudouridilación de mamífero la convierta en pseudouridina.

2. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la enzima de pseudouridilación forma parte de un complejo de ribonucleoproteína (RNP) capaz de actuar sobre un H/ACA- RNAsno.

3. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 o 2, en la que la molécula de ácido nucleico comprende uno o más nucleósidos y/o enlaces internucleosídicos que no están modificados naturalmente en comparación con el ARNsno H/ACA de tipo silvestre.

4. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, en la que la región guía única es la estructura en horquilla en la parte terminal 3' del ARNsno H/ACA de tipo silvestre, preferentemente en la que el nucleótido terminal 5' corresponde a un nucleótido de una región entre las dos estructuras en horquilla del ARNsno H/ACA de tipo silvestre.

5. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3 o 4, que consiste en 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 nucleótidos.

6. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en la que la modificación no natural comprende una modificación en la fracción de ribosa, preferentemente en la que el 2'-OH de la fracción de azúcar está sustituido.

7. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, en la que la sustitución es 2'-OMe o 2'-MOE.

8. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en la que la molécula de ácido nucleico comprende uno o más enlaces inter-nucleosídicos no naturales, como un enlace fosforotioato.

9. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico se sitúa en una secuencia de intrón a partir de la cual se expresa, y en la que la secuencia de intrón se sitúa entre una secuencia de exón A corriente arriba y una secuencia de exón B corriente abajo.

10. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9, en la que la secuencia exóexónAIintrónIexón B está presente en un vector, preferentemente un plásmido o un vector viral.

11. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9 o 10, en la que la secuencia del exón A es el exón 1 del gen de la p-globina humana, y la secuencia del exón B es el exón 2 del gen de la p-globina humana.

12. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico está presente en un vector, tal como un plásmido, y en la que la molécula de ácido nucleico se transcribe a partir de un promotor CMV o un promotor pol-lll, preferentemente un promotor U6 o un promotor H1.

13. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la región guía es capaz de formar un complejo parcialmente de doble cadena con el ARN diana, que comprende una mutación asociada a un trastorno genético.

14. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 13, en la que la mutación da lugar a un codón de terminación prematura (PTC), en la que el PTC es la causa del trastorno genético, y en la que la uridina diana se encuentra en el PTC.

15. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su uso en el tratamiento, retraso o mejora de la fibrosis quística, síndrome de Hurler, deficiencia de alfa-1-antitripsina (A1AT), enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, albinismo, esclerosis lateral amiotrófica, asma, talasemia B, síndrome de Cadasil, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), Atrofia muscular espinal distal (AMED), Distrofia muscular de Duchenne/Becker, Epidermólisis bullosa distrófica, Epidermólisis bullosa, Enfermedad de Fabry, Trastornos asociados al factor V de Leiden, Poliposis adenomatosa familiar, Galactosemia, Enfermedad de Gaucher, Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, Hemofilia, Hemocromatosis hereditaria, Síndrome de Hunter, Enfermedad de Huntington, Enfermedad inflamatoria intestinal (EII), Síndrome de poliaglutinación hereditaria, Amaurosis congénita de Leber, Síndrome de Lesch-Nyhan, Síndrome de Lynch, Síndrome de Marfan, Mucopolisacaridosis, Distrofia muscular, Distrofia miotónica tipos I y II, Neurofibromatosis, Enfermedad de Niemann-Pick tipo A, B y C, Cáncer relacionado con NY- eso1, Síndrome de Peutz-Jeghers, Fenilcetonuria, Enfermedad de Pompe, Enfermedad ciliar primaria, Trastornos relacionados con la mutación de la protrombina, como la mutación G20210A de la protrombina, hipertensión pulmonar, retinosis pigmentaria (autosómica dominante), enfermedad de Sandhoff, síndrome de inmunodeficiencia combinada grave (SCID), anemia falciforme, atrofia muscular espinal, enfermedad de Stargardt, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de Usher, inmunodeficiencia ligada al cromosoma X, síndrome de Sturge-Weber o cáncer.

16.Un procedimiento in vitro para convertir una uridina en una molécula de ARN diana en una pseudouridina, que comprende los pasos de poner en contacto un ARN diana que comprende una uridina diana con una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en presencia de una enzima de pseudouridilación o un complejo RNP y permitir que la uridina se convierta de este modo, preferentemente en el que la enzima de pseudouridilación o el complejo RNP está presente en una célula de mamífero, preferentemente una célula humana.

17.El procedimiento según la reivindicación 16, en el que la enzima de pseudouridilación o el complejo RNP está presente de forma natural en la célula de mamífero.

18.Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y uno o más de un portador, estabilizador o disolvente farmacéuticamente aceptable.

19.Una célula de mamífero que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.