ES2960939T3 - Agentes crioprotectores para formulaciones particuladas - Google Patents

Agentes crioprotectores para formulaciones particuladas Download PDF

Info

Publication number
ES2960939T3
ES2960939T3 ES19718760T ES19718760T ES2960939T3 ES 2960939 T3 ES2960939 T3 ES 2960939T3 ES 19718760 T ES19718760 T ES 19718760T ES 19718760 T ES19718760 T ES 19718760T ES 2960939 T3 ES2960939 T3 ES 2960939T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
composition
mrna
nucleic acid
cationic
formulation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19718760T
Other languages
English (en)
Inventor
Christian Dohmen
Philipp Beck
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ethris GmbH
Original Assignee
Ethris GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ethris GmbH filed Critical Ethris GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2960939T3 publication Critical patent/ES2960939T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1617—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1682—Processes
    • A61K9/1688—Processes resulting in pure drug agglomerate optionally containing up to 5% of excipient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5192—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Se proporciona una composición que comprende (i) una formulación de nanopartículas o micropartículas de un agente terapéuticamente activo que está suspendido en una fase líquida, y (ii) al menos un aditivo crioprotector seleccionado entre alcanos C3-C5 sustituidos por uno o dos grupos hidroxi que estabiliza la formulación de partículas. Aspectos adicionales se refieren a una composición sólida que se puede obtener congelando la composición estabilizada y a procesos para la preparación de las composiciones de acuerdo con la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Agentes crioprotectores para formulaciones particuladas
La presente invención se refiere a composiciones para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad a ser administradas en o a través de las vías respiratorias, y que comprenden una formulación en partículas de un agente terapéuticamente activo que es un ácido nucleico, en particular una formulación que comprende nanopartículas o micropartículas y un aditivo crioprotector. Además, la invención proporciona un dispositivo que comprende tal composición para formar un aerosol o para su nebulización, y un aerosol obtenible a partir del dispositivo.
Las formulaciones de nanopartículas y micropartículas son conocidas por su capacidad para permitir que los agentes terapéuticamente activos entren en el cuerpo mediante la aplicación en el tracto respiratorio o a través de él. Sin embargo, muchos agentes activos formulados como nanopartículas o micropartículas adolecen de una estabilidad limitada a temperatura ambiente, e incluso en estado refrigerado (por ejemplo, a 2-8 °C). Una formulación congelada mejoraría significativamente la estabilidad a largo plazo y, por lo tanto, la aplicabilidad de agentes terapéuticamente activos formulados como nanopartículas o micropartículas. Sin embargo, la congelación en general conduce a procesos de agregación que están acompañados de una pérdida de función. Aunque la adición de aditivos crioprotectores convencionales previene la agregación de partículas durante la congelación (por ejemplo, W. Abdelwahed y otros, Adv. Drug Del. Rev.58 (2006), 1688-1713; JC Kasper y otros, J. Contr. Rei. 151 (2011), 246-255), persisten los problemas de que la formulación resultante no es funcional después de la aplicación pulmonar. Por lo tanto, la estabilización de nano o micropartículas durante la congelación mientras se mantiene su funcionalidad para la aplicación en el tracto respiratorio, o a través de él, no podría lograrse de manera confiable con crioprotectores estándar, tales como los azúcares.
En el contexto de la presente invención, se ha identificado una clase de aditivos que inesperadamente permiten la congelación de formulaciones de nano o micropartículas, mientras mantiene su funcionalidad durante la aplicación en el tracto respiratorio o a través de él. Las composiciones que combinan las formulaciones de partículas con tales aditivos crioprotectores permiten que las formulaciones se almacenen y/o transporten convenientemente en un estado sólido congelado, antes de su aplicación.
Por lo tanto, la presente invención proporciona, de acuerdo con un primer aspecto, un dispositivo para formar un aerosol a partir de una composición particulada suspendida en un líquido o para nebulizar dicha composición, cuyo dispositivo comprende una composición que comprende
(i) una formulación de nano o micropartículas de un agente terapéuticamente activo que está suspendida en una fase líquida, y
(ii) al menos un aditivo crioprotector seleccionado de alcanos C3-C5 sustituidos por uno o dos grupos hidroxi, en el que el agente terapéuticamente activo es un ácido nucleico.
Un aspecto adicional de la invención proporciona un aerosol que se puede obtener a partir del dispositivo de acuerdo con el primer aspecto de la invención de acuerdo con el primer aspecto de la invención. Un aspecto relacionado proporciona una composición como la comprendida por el dispositivo de acuerdo con el primer aspecto de la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad, en el que la composición ha de ser administrada en el tracto respiratorio o a través de este.
A continuación, se proporcionará una descripción detallada de la invención y de sus aspectos discutidos anteriormente. Se apreciará en este contexto que estos aspectos están estrechamente interrelacionados. Por lo tanto, se entenderá que la información detallada que se proporciona con respecto a las características de un aspecto se aplicará también a otros aspectos que se basan en esta característica, a menos que se indique de otra manera.
Agente terapéuticamente activo
Las composiciones para uso de acuerdo con la invención comprenden una formulación de nano o micropartículas de un agente terapéuticamente activo.
En este contexto, la referencia a una actividad terapéutica incluye agentes que se administran a un paciente para tratar una enfermedad o trastorno, así como agentes que se administran para evitar que una enfermedad o trastorno afecten a un paciente.
Un agente terapéuticamente activo para su uso en el contexto de la presente invención es un ácido nucleico.
Entre los ácidos nucleicos como agentes terapéuticamente activos comprendidos en las formulaciones de nano o micropartículas, se da preferentemente al ARN, con mayor preferencia al ARN monocatenario, y con la máxima preferencia al ARNm, incluido el ARNm modificado.
El término "ácido nucleico" abarca todas las formas de tipos de ácidos nucleicos de origen natural, así como ácidos nucleicos sintetizados química y/o enzimáticamente, y también abarca análogos de ácidos nucleicos y derivados de ácidos nucleicos tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), oligonucleósidos tiofosfatos y fosfotriésteres, oligonucleótidos morfolinos, oligonucleótidos catiónicos (documentos US6017700 A, WO/2007/069092), ribo-oligonucleótidos sustituidos o fosforotioatos. Además, el término "ácido nucleico" también se refiere a cualquier molécula que comprende nucleótidos o análogos de nucleótidos. No existen limitaciones en cuanto a la secuencia o al tamaño de un ácido nucleico comprendido en la composición de la presente invención. El ácido nucleico se define predominantemente por el efecto biológico que debe lograr en la diana biológica a la que se suministra la composición de la presente invención. Por ejemplo, en el caso de una aplicación en terapia génica o de ácido nucleico, el ácido nucleico o la secuencia de ácido nucleico se puede definir por el gen o fragmento de gen a ser expresado, o por la sustitución o reparación prevista de un gen defectuoso o cualquier otra secuencia diana de un gen, o por la secuencia diana de un gen a ser inhibida, anulada o regulada por disminución.
El término "ácido nucleico" abarca oligonucleótidos o polinucleótidos, que incluyen ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). En cuanto al ARN, en principio se puede emplear cualquier tipo de ARN en el contexto de la presente invención. En una realización preferente, el ARN es un ARN monocatenario. El término "ARN monocatenario" significa una única cadena consecutiva de ribonucleótidos en contraste con las moléculas de ARN, en las que dos o más cadenas separadas forman una molécula bicatenaria debido a la hibridación de las cadenas separadas. El término "ARN monocatenario" no excluye que la molécula monocatenaria forme en sí misma estructuras bicatenarias tales como bucles, estructuras secundarias o terciarias.
El término "ARN" cubre el ARN que codifica una secuencia de aminoácidos, así como el ARN que no codifica una secuencia de aminoácidos. Se ha sugerido que más del 80 % del genoma contiene elementos funcionales del ADN que no codifican proteínas. Estas secuencias no codificantes incluyen elementos de ADN reguladores (sitios de unión para factores de transcripción, reguladores y correguladores, etc.) y secuencias que codifican transcripciones que nunca se traducen en proteínas. Estas transcripciones, que están codificadas por el genoma y se transcriben en a Rn pero no se traducen en proteínas, se denominan ARN no codificantes (ARNnc). Por lo tanto, en una realización, el ARN es un ARN no codificante. Preferentemente, el ARN no codificante es una molécula monocatenaria. Los estudios demuestran que los ARNnc son actores críticos en la regulación de los genes, el mantenimiento de la integridad genómica, la diferenciación celular y el desarrollo, y están mal regulados en diversas enfermedades humanas. Hay diferentes tipos de ARNnc: ARNnc cortos (20-50 nt), medianos (50-200 nt) y largos (>200 nt). El ARNnc corto incluye microARN (miARN), ARN de interferencia pequeño (ipARN), ARN que interactúa con piwi (piARN) y ARN iniciador de la transcripción (itARN). Los ejemplos de ARNnc medianos son los ARN nucleares pequeños (npARN), los ARN nucleolares pequeños (nupARN), los ARN de transferencia (tARN), los ARN asociados al sitio de inicio de la transcripción (TSSaARN), los ARN pequeños asociados al promotor (PASR) y las transcripciones del promotor corriente arriba (PROMPT). Los ARN no codificantes largos (nclARN) incluyen ARN no codificante intergénico largo (ncilARN), nclARN antisentido, nclARN intrónico, ARN ultraconservados transcritos (T-UCR) y otros (Bhan A, Mandal SS, ChemMedChem. 26 de marzo de 2014. doi: 10.1002/cmdc.201300534). De los ARN no codificantes mencionados anteriormente, sólo el ipARN es bicatenario. Por lo tanto, dado que en una realización preferente el ARN no codificante es monocatenario, es preferente que el ARN no codificante no sea ipARN. En otra realización, el ARN es un ARN codificante, es decir, un ARN que codifica una secuencia de aminoácidos. Tales moléculas de ARN también se denominan ARNm (ARN mensajero) y son moléculas de ARN monocatenarias. Los ácidos nucleicos se pueden preparar mediante metodología de síntesis química y enzimática conocida por un experto en la técnica, o mediante el uso de tecnología recombinante, o se pueden aislar de fuentes naturales, o mediante una combinación de las mismas. Los oligo o polinucleótidos pueden comprender opcionalmente nucleótidos no naturales y pueden ser de mono, bi o triplecatenario. "Ácido nucleico" también se refiere a un oligo o polinucleótidos sentido y antisentido, es decir, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos específica en un ADN y/o ARN.
Preferentemente, el término ácido nucleico en el contexto de la presente invención se refiere a ARN, con mayor preferencia a ARN monocatenario y con la máxima preferencia a ARNm. Se entenderá que, a menos que se indique de otra manera en un contexto específico, el término ARNm, como se usa en la presente memoria, abarca el ARNm modificado. En otras palabras, las nanopartículas o micropartículas usadas en el contexto de la presente invención comprenden preferentemente un ácido nucleico como agente terapéuticamente activo, y el ácido nucleico es preferentemente ARN, con mayor preferencia ARN monocatenario y con la máxima preferencia ARNm, cuyo ARNm puede ser ARNm modificado.
Los ARN mensajeros (ARNm) son copolímeros que están formados por bloques de construcción de fosfato de nucleósido principalmente con adenosina, citidina, uridina y guanosina como nucleósidos, que como portadores intermedios llevan la información genética del ADN en el núcleo de la célula al citoplasma, donde es traducido a proteínas. Por lo tanto, son adecuados como alternativas para la expresión génica.
En el contexto de la presente invención, debe entenderse que ARNm significa cualquier molécula de polirribonucleótido que, si entra en la célula, es adecuada para la expresión de una proteína o fragmento de la misma o es traducible a una proteína o fragmento de la misma. El término "proteína" aquí abarca cualquier tipo de secuencia de aminoácidos, es decir, cadenas de dos o más aminoácidos que están unidos cada uno mediante enlaces peptídicos, y también incluye péptidos y proteínas de fusión.
El ARNm contiene una secuencia de ribonucleótidos que codifica una proteína o un fragmento de la misma cuya función en la célula, o en los alrededores de la célula, es necesaria o beneficiosa, por ejemplo, una proteína cuya falta o forma defectuosa es un desencadenante de una enfermedad o dolencia, cuya provisión puede moderar o prevenir una enfermedad o una dolencia, o una proteína que puede promover un proceso que es beneficioso para el cuerpo, en una célula o sus alrededores. El ARNm puede contener la secuencia de la proteína completa o una variante funcional de la misma. Además, la secuencia de ribonucleótidos puede codificar una proteína que actúa como factor, inductor, regulador, estimulador o enzima, o un fragmento funcional de la misma, donde esta proteína es una cuya función es necesaria para remediar un trastorno, en particular un trastorno metabólico, o para iniciar procesos in vivo, tales como la formación de nuevos vasos sanguíneos, tejidos, etc. Aquí, se entiende que variante funcional significa un fragmento que en la célula puede asumir la función de la proteína cuya función en la célula es necesaria, o cuya falta o forma defectuosa es patogénica. Además, el ARNm también puede tener otras regiones funcionales y/o regiones no codificantes 3' o 5'. Las regiones no codificantes 3' y/o 5' pueden ser las regiones que flanquean naturalmente la secuencia que codifica la proteína o secuencias artificiales que contribuyen a la estabilización del ARN. Los expertos en la técnica pueden determinar las secuencias adecuadas para esto en cada caso mediante experimentos de rutina.
En una realización preferente, el ARNm contiene un capuchón de m7GpppG, un sitio interno de entrada ribosoma (IRES) y/o una cola de poliA en el extremo 3', en particular para mejorar la traducción. El ARNm puede tener más regiones que promuevan la traducción.
En una realización preferente, el ARNm es un ARNm que contiene una combinación de nucleótidos modificados y no modificados. Preferentemente, es un ARNm que contiene una combinación de nucleótidos modificados y no modificados como se describe en el documento WO2011/012316. Se informa que el ARNm descrito en el mismo muestra una estabilidad aumentada y una inmunogenicidad disminuida. En una realización preferente, tal que en un ARNm modificado se modifica del 5 al 50 % de los nucleótidos de citidina y del 5 al 50 % de los nucleótidos de uridina. Los nucleótidos que contienen adenosina y guanosina pueden ser no modificados. Los nucleótidos de adenosina y guanosina pueden ser no modificados o ser parcialmente modificados, y preferentemente están presentes en forma no modificada. Preferentemente del 10 al 35 % de los nucleótidos de citidina y uridina están modificados, y de manera particularmente preferente el contenido de los nucleótidos de citidina modificados se encuentra en un intervalo de 7,5 a 25 %, y el contenido de nucleótidos de uridina modificados en un intervalo de 7,5 a 25 %. Se ha encontrado que, de hecho, un contenido relativamente bajo, por ejemplo solo el 10% de los nucleótidos de citidina y uridina modificados puede lograr las propiedades deseadas. Es particularmente preferente que los nucleótidos de citidina modificados sean los residuos de 5-metilcitidina, y los nucleótidos de uridina modificados sean residuos de 2-tiouridina. Con la máxima preferencia, el contenido de nucleótidos de citidina modificados y el contenido de nucleótidos de uridina modificados es 25 %, respectivamente.
En otra realización preferente, el ARNm puede combinarse con sitios de unión a diana, secuencias de diana y/o con sitios de unión a microARN, para permitir la actividad del ARNm deseado solo en las células relevantes. En una realización preferente adicional, el ARN puede combinarse con microARN o shARN aguas abajo de la cola 3' poliA.
Además, el término "ácido(s) nucleico(s)" puede referirse a ADN o ARN o a sus híbridos o a cualquiera de sus modificaciones conocidos en el estado de la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos US 8278036, WO 2013/052523, WO 2011/012316, US 5525711, US 4711955, US 5792608 o EP 302175, (Lorenz et al. 2004, Bioorg Med Chern Lett, 14, 4975-4977; Soutschek et al. 2004, Nature, 432, 173-178) para ejemplos de modificaciones). Tal(es) molécula(s) de ácido nucleico son mono o bicatenarias, lineales o circulares, naturales o sintéticas y sin limitación de tamaño. Por ejemplo, la(s) molécula(s) de ácido nucleico pueden ser ADN genómico, ADNc, ARNm, ARN antisentido, ribozima o ARN de interferencia pequeños (ipARN), micro ARN, antagomirs o ARN de horquilla corta (hcARN), tARN o ARN largo bicatenario o un constructo de ADN que codifica tal ARN o quimeraplastos (Colestrauss et al. 1996, Science, 273, 1386-1389), o aptámeros, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas ("CRISPR" por RNA-guided sitespecific DnA cleavage) (Cong et al. 2013, Science, 339, 819-823), o ARN y ADN. Tal(es) molécula(s) de ácido nucleico puede estar en forma de plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales, ADN o ARN viral, ADN de bacteriófago, ARNm monocatenario o bicatenario, codificante y no codificante, y oligonucleótido (s), en los que se incluye cualquiera de las modificaciones del estado de la técnica en el esqueleto del azúcar y/o en las bases, como se describe anteriormente, y modificaciones 3' o 5'. En una realización particularmente preferente, el ácido nucleico es ARN, con mayor preferencia ARNm o ipARN, y con la máxima preferencia ARNm.
El(Los) ácido(s) nucleico(s) pueden contener una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que se va a expresar en una célula diana. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir moléculas de ácido nucleico recombinantes; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y. y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989).
Como se señaló anteriormente, el ácido nucleico estaría comprendido como un agente terapéuticamente activo preferente en la formulación de nano o micropartículas. En general, los efectos terapéuticos se pueden lograr mediante la interacción del ácido nucleico con moléculas y organelos celulares. Tal interacción sola puede, por ejemplo, activar el sistema inmune innato, como es el caso de ciertos oligonucleótidos CpG y secuencias diseñadas para interactuar específicamente con receptores de tipo toll, y otros receptores extra o intracelulares. Además, la captación o introducción de ácidos nucleicos en las células puede estar destinada a la expresión de secuencias de nucleótidos tales como genes comprendidos en el ácido nucleico, puede estar destinada a la regulación negativa, a silenciar o anular la expresión génica endógena como consecuencia de la presencia intracelular de un ácido nucleico exógeno introducido, o puede estar destinado a la modificación de secuencias de ácido nucleico endógeno tales como reparación, escisión, inserción o intercambio de bases seleccionadas o de tramos completos de secuencias de ácido nucleico endógeno, o puede estar destinado a la interferencia con prácticamente cualquier proceso celular como consecuencia de la presencia e interacción intracelular de un ácido nucleico exógeno introducido. La sobreexpresión de ácidos nucleicos exógenos introducidos puede estar destinada a compensar o complementar la expresión génica endógena, en particular en los casos en los que un gen endógeno es defectuoso o silencioso, lo que conduce a un producto de la expresión génica nula, insuficiente o defectuosa o disfuncional, tal como es el caso con muchas enfermedades metabólicas y hereditarias como fibrosis quística, hemofilia o distrofia muscular, por nombrar algunas. La sobreexpresión de ácidos nucleicos exógenos introducidos también puede pretender que el producto de la expresión interactúe o interfiera con cualquier proceso celular endógeno, tal como la regulación de la expresión génica, la transducción de señales y otros procesos celulares. La sobreexpresión de ácidos nucleicos exógenos introducidos también puede estar destinada a dar lugar a una respuesta inmune en el contexto del organismo en el que reside o se hace residir a una célula transfectada o transducida. Son ejemplos, la modificación genética de células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas, para que presenten un antígeno con fines de vacunación. Otros ejemplos son, la sobreexpresión de citocinas en tumores para provocar una respuesta inmune específica al tumor. Además, la sobreexpresión de ácidos nucleicos exógenos introducidos también puede estar destinada a generar células modificadas genéticamente de forma transitoria, in vivo o ex vivo, para terapias celulares, tales como células T modificadas o precursoras, o células madre u otras células para medicina regenerativa.
La regulación negativa, el silenciamiento o la desactivación de la expresión génica endógena con fines terapéuticos se puede lograr, por ejemplo, mediante la interferencia de ARN (ía Rn ), con ribozimas, oligonucleótidos antisentido, tARN, ARN bicatenario largo donde dicha regulación negativa puede ser específica de secuencia o inespecífica, y también puede conducir a la muerte celular, como es el caso cuando se introducen en las células ARN de doble cadena largos. La regulación negativa, el silenciamiento o la eliminación de la expresión génica endógena o preexistente puede ser útil en el tratamiento de enfermedades adquiridas, hereditarias o que se contraen espontáneamente, incluidas infecciones virales y cáncer. También puede preverse que la introducción de ácidos nucleicos en las células se pueda practicar como medida preventiva para prevenir, por ejemplo, infecciones virales o neoplasias. La regulación negativa, el silenciamiento o la eliminación de la expresión génica endógena se puede ejercer a nivel transcripcional y nivel traduccional. Los expertos en la técnica conocen múltiples mecanismos e incluyen, por ejemplo, modificaciones epigenéticas, cambios en la estructura de la cromatina, unión selectiva de factores de transcripción por el ácido nucleico introducido, hibridación del ácido nucleico introducido con secuencias complementarias en ADN genómico, ARNm u otras especies de ARN por apareamiento de bases, incluidos mecanismos de apareamiento de bases no convencionales, tal como la formación de triple hélice. De manera similar, la reparación de genes, los cambios de base o de secuencia se pueden lograr a nivel genómico y a nivel de ARNm, incluida la omisión de exón. Los cambios de base o de secuencia se pueden lograr, por ejemplo, mediante la escisión del ADN de un sitio específico guiada por ARN, mediante mecanismos de corte y pegado que aprovechan el trans-empalme, el trans-empalme en ribozimas, los quimeraplastos, el trans-empalme de ARN mediado por esplisosomas o al aprovechar el grupo II o los intrones reorientados, o al aprovechar la mutagénesis de inserción mediada por virus, o al aprovechar la inserción genómica dirigida mediante el uso de sistemas de integrasa procariota, eucariota o viral. Como los ácidos nucleicos son los portadores de los planes de construcción de los sistemas vivos y participan en muchos procesos celulares de manera directa e indirecta, en teoría cualquier proceso celular puede verse influido por la introducción de ácidos nucleicos en las células desde el exterior. En particular, esta introducción se puede llevar a cabo directamente in vivo y ex vivo en cultivo de células u órganos, seguido del trasplante de tales órganos o células modificados a un receptor. Las formulaciones de nano o micropartículas para su uso en el contexto de la presente invención, con ácidos nucleicos como agente terapéuticamente activo, pueden ser útiles para todos los propósitos descritos anteriormente.
Se entenderá que las formulaciones de nano o micropartículas para su uso en el contexto de la presente invención pueden comprender un único agente terapéuticamente activo, pero alternativamente pueden comprender una combinación de dos o más agentes terapéuticamente activos, por ejemplo, en forma de partículas que comprenden dos o más tipos de agentes terapéuticamente activos combinados en partículas individuales, o en forma de una mezcla de partículas que difieren en el tipo de agente terapéuticamente activo contenido en el mismo.
La formulación de partículas
Las composiciones de acuerdo con la invención (es decir, la composición en suspensión y la composición sólida) comprenden una formulación de nano o micropartículas del agente terapéuticamente activo. Como entenderá el lector experto, "o" se usa en este contexto de una manera no exclusiva, a menos que se indique específicamente lo contrario. Por lo tanto, la referencia a formulaciones de nano o micropartículas incluye formulaciones que contienen nanopartículas que comprenden el agente terapéuticamente activo, formulaciones que contienen micropartículas que comprenden el agente terapéuticamente activo, y formulaciones que contienen tanto nanopartículas como micropartículas que comprenden el agente terapéuticamente activo. Por motivos de conveniencia, la "formulación de nano o micropartículas" puede abreviarse en la discusión de la invención en la presente memoria como "formulación de partículas" o "formulación partículada". De manera similar, las nanopartículas o micropartículas pueden denominarse "las partículas".
Las partículas de la formulación de nano o micropartículas pueden contener el agente terapéuticamente activo como único componente. Sin embargo, es preferente que las partículas contengan el agente terapéuticamente activo en combinación con uno o más componentes adicionales. Estos componentes adicionales son típicamente componentes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, excipientes o aditivos que son farmacéuticamente aceptables.
La formulación de nano o micropartículas en la composición de acuerdo con la invención comprende nanopartículas 0 micropartículas que contienen el agente terapéuticamente activo. La formulación de partículas puede consistir en tales nanopartículas o micropartículas. Como se usa en la presente memoria, el término nanopartículas se refiere generalmente a partículas con un diámetro en el intervalo de tamaño nanométrico, es decir, un diámetro de 1 nm o más, e inferior a 1.000 nm. El término micropartículas se refiere generalmente a partículas con un diámetro en el intervalo de tamaño micrométrico, es decir, un diámetro de 1.000 nm o más, y 100 pm o menos.
La formulación de nano o micropartículas muestra típicamente un diámetro promedio de partículas en el intervalo de 1 a 4.000 nm, con mayor preferencia de 2 a 2.500 nm y con la máxima preferencia de 5 a 1.000 nm.
El límite superior para el diámetro de las partículas individuales en la formulación de nanopartículas o micropartículas es preferentemente de 20 pm, con mayor preferencia de 10 pm y con la máxima preferencia de 5 pm. Por lo tanto, como se entenderá por lo anterior, una formulación de partículas muy preferente sería una con un diámetro promedio de partículas en el intervalo de 5 a 1.000 nm, y partículas con un diámetro máximo de partícula de 5 pm.
Los diámetros de partícula y el diámetro promedio de partículas de la formulación de nano o micropartículas como se menciona en la presente memoria se pueden determinar convenientemente mediante la dispersión dinámica de la luz (DLS). Generalmente, los diámetros y el diámetro medio a los que se hace referencia en la presente memoria se indican como diámetros hidrodinámicos de las partículas en estado suspendido, determinados mediante la dispersión dinámica de la luz. Dado que el equipo de medición (por ejemplo, Malvern ZetaSizer) tiene en cuenta el efecto de la temperatura al informar los resultados, los diámetros medidos generalmente no dependen de la temperatura. Sin embargo, la medición se realiza normalmente a temperatura ambiente (25 °C). Como medio de suspensión para las mediciones de DLS, se puede usar, por ejemplo, agua, o agua que contenga el aditivo crioprotector, según sea apropiado. En el caso de una composición sólida congelada, los diámetros de las partículas se determinan típicamente después de descongelar la composición. En los casos donde se indica un tamaño promedio de partículas o un diámetro promedio de partículas, el promedio es típicamente el promedio z, a menos que se indique de otra manera.
Preferentemente, la formulación de nanopartículas o micropartículas tiene una carga activa, expresada como el peso del agente terapéuticamente activo al peso total de las partículas en la formulación de partículas, en el intervalo de 0,1 a 95 % (p/p), con mayor preferencia de 0,5 a 90 % (p/p), con la máxima preferencia de 1 a 80 % (p/p).
Además del agente terapéuticamente activo, las partículas de la formulación de nano o micropartículas para su uso en el contexto de la presente invención pueden comprender uno o más componentes adicionales, por ejemplo, excipientes o aditivos que son típicamente componentes farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, dichos componentes adicionales pueden facilitar el transporte a sitios específicos o promover la absorción adicional de las partículas en sitios específicos, después de que se hayan administrado a un paciente, o pueden ayudar a estabilizar las partículas o el agente terapéuticamente activo contenido en el mismo.
Un componente útil para las partículas que comprenden el ácido nucleico es un vector viral. Tales vectores virales son conocidos en la técnica, como se discute, por ejemplo, en el artículo de revisión de A.C. Silva et al., Current Drug Metabolism, 16, 2015, 3-16, y en la bibliografía allí comentada.
Además, se establecen diversos polímeros como excipientes para la formulación de agentes terapéuticamente activos en formulaciones de partículas que comprenden nanoparticulas o micropartículas.
Tales polímeros también pueden proporcionar un componente adicional para las formulaciones particuladas, como se usan en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, los excipientes poliméricos adecuados incluyen polímeros que se pueden reabsorber en el cuerpo después de la administración de las partículas a un paciente, tales como polímeros, incluidos polímeros naturales, formados a partir de aminoácidos, carbohidratos o de ácido láctico y/o glicólico.
Para la formulación de partículas que comprende un ácido nucleico, preferentemente ARN, con mayor preferencia ARN monocatenario y con la máxima preferencia ARNm, como agente terapéuticamente activo, un componente adicional preferente es un excipiente catiónico. Tal excipiente catiónico y un ácido nucleico, que proporciona cargas negativas, pueden formar un complejo juntos. Se entenderá que la referencia a un excipiente catiónico no excluye la presencia de grupos aniónicos o de regiones neutras en el excipiente respectivo, siempre que los grupos catiónicos estén presentes en un número suficientemente alto para proporcionar una carga catiónica global del excipiente.
Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferente, las formulaciones de nano o micropartículas mencionadas en el contexto de la presente invención son formulaciones de partículas que comprenden un ácido nucleico, preferentemente ARN, con mayor preferencia ARN monocatenario, y con la máxima preferencia ARNm, como el agente terapéuticamente activo en forma de un complejo formado por el ácido nucleico y un oligómero o polímero catiónico, preferentemente un polímero, como excipiente catiónico. En la técnica, un complejo tal como este se denomina poliplex.
Tales poliplexos, y oligómeros o polímeros adecuados que pueden formarlos, son conocidos en la técnica. Los ejemplos de oligómeros o polímeros catiónicos adecuados para la formación de poliplexos, que también se pueden usar en las formulaciones de partículas mencionadas en el contexto de la presente invención, se discuten en A.C. Silva et al., Current Drug Metabolism, 16, 2015, 3-16, y en la bibliografía allí citada, en J.C. Kasper et al., J. Contr. Rei.
151 (2011), 246-255, en el documento WO 2014/207231 y en la literatura mencionada en el mismo, y en el documento WO 2016/097377 y en la literatura mencionada en el mismo.
Los oligómeros o polímeros catiónicos adecuados incluyen en particular oligómeros o polímeros catiónicos que comprenden una pluralidad de unidades en las que está contenido un grupo amino. Los grupos amino pueden protonarse para proporcionar la carga catiónica del polímero.
En un poliplex formado a partir de un ácido nucleico y un oligómero o polímero catiónico que comprende una pluralidad de unidades en las que está contenido un grupo amino, la relación N/P del número de átomos de nitrógeno de amina en el oligómero o polímero catiónico al número de grupos fosfato en el ácido nucleico está preferentemente en el intervalo de 1 a 100, con mayor preferencia de 2 a 80, y con la máxima preferencia de 3 a 60.
Entre los oligómeros o polímeros catiónicos que comprenden una pluralidad de grupos amino, son preferentes los oligómeros o polímeros que comprenden una pluralidad de unidades seleccionadas independientemente de los siguientes (1), (2), (3) y (4):
en el que uno o más de los átomos de nitrógeno de las unidades repetidas (1), (2), (3) y/o (4) pueden protonarse para proporcionar la carga catiónica del polímero.
Particularmente preferentes como oligómeros o polímeros catiónicos para la provisión de una formulación de partículas son las siguientes cuatro clases de oligómeros o polímeros que comprenden una pluralidad de unidades en las que está contenido un grupo amino.
Como primera clase preferente, se menciona la poli(etilenimina) ("PEI"), que incluye la poli (etilenimina) ramificada ("brPEI").
La segunda clase preferente de oligómeros o polímeros catiónicos son oligómeros o polímeros que comprenden una pluralidad de grupos de la siguiente fórmula (II) como cadena lateral y/o como grupo terminal, como se divulgan en el documento WO 2014/207231 (solicitante ethris GmbH ):
en el que las variables a, b, p, m, n y R2 a R6 se definen como sigue, independientemente para cada grupo de fórmula (II) en una pluralidad de tales grupos:
a es 1 y b es un número entero de 2 a 4; o a es un número entero de 2 a 4 y b es 1,
p es 1 o 2,
m es 1 o 2; n es 0 o 1 y m+n es > 2; y
R2 a R5 se seleccionan, independientemente entre sí, de hidrógeno; un grupo -CH<2>-CH(OH)-R7,
-CH(R7)-CH<2>-OH, -CH<2>-CH<2>-(C=O)-O-R7, -CH<2>-CH<2>-(C=O)-NH-R7 o -CH<2>-R<7>en el que R7 se selecciona de alquilo C3-C18 o alquenilo C3-C18 que tiene un doble enlace C-C; un grupo protector para un grupo amino; y una cadena de poli(etilen glicol);
R6 se selecciona de hidrógeno; un grupo -CH<2>-CH(OH)-R7,-CH (R7)-CH-OH, -CH<2>-CH<2>-(C=O)-O-R7,-CH<2>-CH<2>-(C=O)-NH-R7 o -CH<2>-R<7>en el que R7 se selecciona de alquilo C3-C18 o alquenilo C3-C18 que tiene un doble enlace C-C; un grupo protector para un grupo amino; -C(NH)-NH<2>; una cadena de poli(etilen glicol); y un ligando receptor,
y en el que uno o más de los átomos de nitrógeno indicados en la fórmula (II) pueden protonarse para proporcionar un grupo catiónico de fórmula (II).
Con respecto a las definiciones preferentes adicionales de estos oligómeros o polímeros, y de las variables contenidas en la fórmula (II) anterior, la divulgación respectiva en el documento WO 2014/207231 también se aplica a la invención descrita en la presente memoria, a menos que se indique específicamente de otra manera. También, en términos de las composiciones que contienen ácidos nucleicos y estos oligómeros y polímeros en forma de poliplexos, la información proporcionada en el documento WO 2014/207231 es aplicable para las formulaciones de partículas mencionadas en la presente memoria.
La tercera clase preferente de oligómeros o polímeros catiónicos son oligómeros o polímeros que comprenden una pluralidad de grupos de la siguiente fórmula (III) como unidades repetidas, como se divulgan en el documento WO 2014/207231 (solicitante ethris GmbH):
en el que las variables a, b, p, m, n y R2 a R5 se definen como sigue, independientemente para cada grupo de fórmula (III) en una pluralidad de tales grupos:
a es 1 y b es un número entero de 2 a 4; o a es un número entero de 2 a 4 y b es 1,
p es 1 o 2,
m es 1 o 2; n es 0 o 1 y m+n es > 2; y
R2 a R5 se seleccionan, independientemente entre sí, de hidrógeno; un grupo -CH<2>-CH(OH)-R7,
-CH(R7)-CH<2>-OH, -CH<2>-CH<2>-(C=O)-O-R7 o -CH<2>-CH<2>-(C=O)-NH-R7 o -CH<2>-R7 en el que R7 se selecciona de alquilo C3-C18 o alquenilo C3-C18 que tiene un doble enlace C-C; un grupo protector para un grupo amino; -C(NH)-NH<2>; y una cadena de poli(etilen glicol);
y en el que uno o más de los átomos de nitrógeno indicados en la fórmula (III) pueden estar protonados para proporcionar un grupo catiónico de fórmula (III).
Con respecto a las definiciones preferentes adicionales de estos oligómeros o polímeros, y de las variables contenidas en la fórmula (III) anterior, la divulgación respectiva en el documento WO 2014/207231 también se aplica a la invención descrita en la presente memoria, a menos que se indique específicamente lo contrario. También, en términos de las composiciones que contienen ácidos nucleicos y estos oligómeros y polímeros en forma de poliplexos, la información proporcionada en el documento WO 2014/207231 es aplicable para las formulaciones de partículas mencionadas en la presente memoria.
La cuarta clase preferente de oligómeros o polímeros catiónicos es proporcionada por un copolímero estadístico como se divulga en el documento WO 2016/097377 (solicitante ethris GmbH). Comprende una pluralidad de unidades repetidas (a) seleccionadas independientemente de unidades repetidas de las siguientes fórmulas (a1) y (a2):
y una pluralidad de unidades repetidas (b) seleccionadas independientemente de unidades repetidas de las siguientes fórmulas (b1) a (b4):
y la relación molar de la suma de las unidades repetidas (a) a la suma de las unidades repetidas (b) se encuentra dentro del intervalo de 0,7/1,0 a 1,0/0,7, y uno o más de los átomos de nitrógeno de las unidades repetidas (a) y/o (b) contenidos en el copolímero pueden protonarse para proporcionar un copolímero catiónico.
Con respecto a las definiciones preferentes adicionales de este copolímero, la divulgación respectiva en el documento WO 2016/097377 también se aplica a la invención descrita en la presente memoria, a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se indica en el mismo, un copolímero particularmente preferente es un copolímero lineal que comprende unidades repetidas (a1) y (b1), o que consta de unidades repetidas (a1) y (b1). También, en términos de las composiciones que contienen ácidos nucleicos y estos oligómeros y polímeros en forma de poliplexos, la información proporcionada en el documento WO 2016/097377 es aplicable para las formulaciones de partículas mencionadas en la presente memoria.
De acuerdo con otra realización preferente, las formulaciones de nano o micropartículas mencionadas en el contexto de la presente invención son formulaciones de partículas que comprenden un ácido nucleico, preferentemente ARN, con mayor preferencia ARN monocatenario, y con la máxima preferencia ARNm, como agente terapéuticamente activo en la forma de un complejo formado por el ácido nucleico y un lípido catiónico o un lipidoide catiónico como un excipiente catiónico. A menos que se defina de otra manera, tales complejos comprenden en particular lipoplejos, liposomas y nanopartículas lipídicas ("LNP") que comprenden un complejo del ácido nucleico y un lípido catiónico o un lipidoide catiónico.
Los lípidos catiónicos o lípidos catiónicos y lipidoides adecuados, que también pueden utilizarse para la formación de un complejo con ácido nucleico en el contexto de la presente invención, son conocidos en la técnica y se discuten, por ejemplo, en A.C. Silva et al., Current Drug Metabolism, 16, 2015, 3-16, y en la bibliografía mencionada en la misma, en los documentos US 2017/0267631, WO 2016/081029, WO 2011/071860, WO 2016/118697, US 8450298 B2, WO 2014/207231 y en E.R. Lee et al., Human Gene Therapy 7:1701-1717, September 10, 1996. El término “ lipidoide” se establece para sustancias que no tienen la estructura de un lípido, pero muestran las características de un lípido.
Una clase preferente de lípidoides para su uso en las formulaciones de partículas que contienen un ácido nucleico, preferentemente ARN, con mayor preferencia ARN monocatenario, con la máxima preferencia ARNm, como agente terapéuticamente activo en forma de complejo con el lipidoide catiónico, por ejemplo, como lipoplex, liposoma o LNP, son lipidoides que tienen la estructura de la siguiente fórmula (IV), como se divulga en el documento WO 2014/207231 (solicitante: ethris GmbH):
en el que las variables a, b, p, m, n y R1 a R6 son lo definido a continuación: a es 1 y b es un número entero de 2 a 4; o a es un número entero de 2 a 4 y b es 1,
p es 1 o 2,
m es 1 o 2; n es 0 o 1 y m+n es > 2; y
R1 a R6 se seleccionan independientemente entre sí entre hidrógeno; un grupo-CH<2>-CH(OH)-R7,
-CH(R7)-CH<2>-OH, -CH<2>-CH<2>-(C=O)-O-R7, -CH<2>-CH<2>-(C=O)-NH-R7 o -CH<2>-R<7>en el que R7 se selecciona de alquilo C3-C18 o alquenilo C3-C18 que tiene un doble enlace C-C; un grupo protector para un grupo amino; -C(NH)-NH<2>; una cadena de poli (etilen glicol); y un ligando de receptor; con la condición de que al menos dos residuos entre R1 a R6 son un grupo -CH<2>-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH<2>-OH, -CH<2>-CH<2>-(C=O)-O-R7, -CH<2>-CH<2>-(C=O) -NH-R7 o-CH<2>-R<7>en el que R7 se selecciona de alquilo C3-C18 o alquenilo C3-C18 que tiene un doble enlace C-C;
y en el que uno o más de los átomos de nitrógeno indicados en la fórmula (IV) pueden protonarse para proporcionar un lípidoide catiónico de fórmula (IV).
Con respecto a las definiciones preferentes adicionales de estos lípidoides, y de las variables contenidas en la fórmula (IV) anterior, la divulgación respectiva en el documento WO 2014/207231 también se aplica a la invención descrita en la presente memoria, a menos que se indique específicamente de otra manera. También, en términos de las composiciones que contienen ácidos nucleicos y estos lípidoides en forma de complejos, por ejemplo, en forma de lipoplexos, liposomas o LNP, la información proporcionada en el documento WO 2014/207231 es aplicable para las formulaciones de partículas mencionadas en la presente memoria.
Otro tipo preferente de lípido para la provisión de un complejo de un ácido nucleico con un lípido catiónico, que puede estar contenido en las formulaciones de partículas a las que se hace referencia en la presente memoria, es el lípido catiónico Genzyme Lipid 67 (GL67). Este lípido derivatizado catiónicamente es muy útil para la complejación de ácidos nucleicos, preferentemente ARN, con mayor preferencia ARN monocatenario y con la máxima preferencia ARNm.
Para una formulación de partículas que comprende un complejo de un ácido nucleico formado con un lípido catiónico o un lípido catiónico que contiene grupos amino, por ejemplo, con un lípidoide de fórmula (IV), la relación N/P en el lipoplex es preferentemente de 1 a 100, con más preferencia de 2 a 80, y con la máxima preferencia las relaciones N/P son de 3 a 60.
Como componentes opcionales que pueden estar contenidos en las formulaciones de partículas que comprenden el agente terapéuticamente activo en forma de un complejo de un ácido nucleico con un lípido catiónico o lipidoide catiónico, tal como un lipoplex, LNP o liposoma, se pueden mencionar los lípidos auxiliares. Pueden seleccionarse, por ejemplo, entre uno o más esteroles (tal como colesterol o dexmetasona), lípidos neutros (tal como DMPE, DOPE, DS<p>E, DPPE, DMPC, DOPC, DSPC o DPPC), esfingolípidos y lípidos pegilados (tal como DMG-PEG, DMPE-PEG o Ceramida-PEG). Tales lípidos auxiliares se pueden usar solos o en combinación de dos o más tipos de los mismos. También son útiles como excipientes para una formulación particulada de un agente terapéuticamente activo, que comprende lípidos o lípidoides catiónicos los copolímeros de polietilenglicol (PEG) y unidades de alquileno.
Otros componentes adecuados para la formación de dichos complejos son referidos en A.C. Silva et al., Current Drug Metabolism, 16, 2015, 3-16, y en la bibliografía allí comentada.
Preferentemente, la formulación de partículas que comprende un complejo de un ácido nucleico con un lípido catiónico o un lípido catiónico contiene el ácido nucleico en una cantidad tal que la relación entre el peso total de lípidos y lipidoides (incluidos los lípidos auxiliares presentes), y el peso del ácido nucleico está en el intervalo de 0,1 a 200, con mayor preferencia de 0,2 a 150, y con la máxima preferencia de 0,5 a 100.
A la luz de la discusión anterior, será evidente que también es preferente una formulación de nano o micropartículas para su uso en el contexto de la presente invención, en la que el agente terapéuticamente activo es ARNm, y el ARNm está comprendido en la formulación de partículas en la forma de un complejo con un polímero u oligómero catiónico, o en la forma de un complejo con un lípido catiónico o un lipidoide catiónico. Con respecto a los tipos adecuados y preferentes de excipiente catiónico, se mantiene la aplicación de las consideraciones anteriores. También, para estas formulaciones de partículas preferentes, las partículas en la formulación de partículas muestran típicamente un diámetro promedio de partículas en el intervalo de 1 a 4.000 nm, con mayor preferencia de 2 a 2.500 nm, y con la máxima preferencia de 5 a 1.000 nm. El límite superior para el diámetro de las partículas en la formulación de nano o micropartículas es preferentemente de 20 pm, con más preferencia de 10 pm y con la máxima preferencia de 5 pm.
Además del agente terapéuticamente activo, la formulación de partículas puede comprender, como aditivo opcional o como aditivos opcionales, uno o más componentes que ejercen una función efectora durante el suministro del agente terapéutico, y preferentemente durante el suministro de un ácido nucleico como agente terapéutico hacia y dentro de la célula. Tales componentes pueden ser, pero sin limitación, polianiones, lípidos como se describieron anteriormente, policationes adicionales distintos de los discutidos anteriormente para la formación de poliplexos, tal como péptidos catiónicos, oligómeros o polímeros protectores, poloxámeros (también conocidos como plurónicos), poloxaminas, ligandos dirigidos, agentes endosomolíticos, péptidos de señal y penetrantes de células, nanopartículas magnéticas y no magnéticas, inhibidores de ARNasa, colorantes fluorescentes, radioisótopos o agentes de contraste para obtención de imágenes médicas. El término "función efectora" abarca cualquier función que apoye la consecución de un efecto biológico pretendido del agente terapéuticamente activo de la composición en o dentro de una diana biológica, o en los alrededores de una diana biológica. Por ejemplo, se han formulado composiciones para la administración de ácidos nucleicos para comprender ácidos nucleicos no codificantes o polianiones de ácidos no nucleicos como materiales de relleno (Kichler et al. 2005, J Gene Med, 7, 1459-1467). Tales materiales de relleno son adecuados para reducir la dosis de un ácido nucleico que tiene un efecto biológico pretendido, mientras se mantiene la extensión o grado de ese efecto obtenido a una dosis de ácido nucleico más alta, en ausencia de dicho material de relleno. También se han usado polianiones de ácido no nucleico para obtener una expresión génica in vivo prolongada con una toxicidad reducida (Uchida et al. 2011, J Control Release, 155, 296-302). Las formulaciones de partículas de la presente invención que comprenden un complejo de un ácido nucleico con un polímero u oligómero catiónico también pueden comprender lípidos catiónicos, aniónicos o neutros como es el caso de los lipopoliplexos (Li y Huang en "Nonviral vectors for Gene Therapy", Academic Press 1999, Capítulo 13, 295-303). Los lipopoliplexos se pueden preparar ventajosamente a partir de polímeros correspondientes a las fórmulas (II), o (III) como se muestra anteriormente con los lípidos correspondientes a la fórmula (IV), como se muestra anteriormente. Además, la formulación de partículas usadas en la presente invención puede comprender oligocationes o policationes distintos de los discutidos anteriormente para la formación de poliplexos. Tales policationes adicionales pueden ser útiles para lograr un grado deseado de compactación de un ácido nucleico o, en el caso de péptidos policatiónicos, pueden tener una función de señal de localización nuclear como la descrita anteriormente (Ritter et al. 2003, J Mol Med, 81, 708-717). Los polímeros de protección, como el poli (etilen glicol) (PEG), también pueden estar comprendidos en las formulaciones de partículas usadas en el contexto de la presente invención y se usan frecuentemente para estabilizar, por ejemplo, complejos de ácidos nucleicos con excipientes catiónicos contra la agregación y/o interacciones no deseadas en un entorno biológico (opsonización), por ejemplo interacciones con componentes del suero, células sanguíneas o matriz extracelular. La protección también puede ser adecuada para reducir la toxicidad de las composiciones que comprenden ácido nucleico (Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192). Por ejemplo, los polímeros de protección tales como PEG se pueden acoplar covalentemente directamente a otros oligómeros o polímeros, o a lípidos o lipidoides que pueden estar presentes en las formulaciones de partículas. El acoplamiento se puede lograr en la cadena principal del polímero, preferentemente, si es factible, a los extremos terminales de una cadena principal de polímero o un dendrímero. Sin embargo, el acoplamiento también se puede lograr con los grupos amino contenidos en las fórmulas (1) a (4), (II), (III), (IV) o cualquiera de (a1), (a2) o (b1) a (b4) descrito anteriormente.
Otros ejemplares de polímeros de protección descritos en la bibliografía que pueden ser componentes útiles para una formulación de partículas que comprende un complejo de un ácido nucleico con un excipiente catiónico, incluye hidroxietil almidón (HES; Noga et al. Journal of Controlled Release, 2012. 159(1): 92-103, un polipéptido pAs (polipéptido Pro, Ala, Ser: Schlapschy et al. Protein Eng Des Sei. 2013 Agosto; 26 (8): 489-501 o Polysarcosine (Psar,: Heller et al. Macromol Biosci 2014; 14: 1380-1395).
Los ligandos dirigidos pueden ser útiles, por ejemplo, en formulaciones de partículas para la administración de ácido nucleico para la transfección preferencial y mejorada de las células diana (Philipp and Wagner in “Gene and Cell
Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy”, 3rd Edition, Chapter 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009). Un ligando dirigido puede ser cualquier compuesto que confiera a las composiciones de la presente invención una función de reconocimiento a diana y/o de unión a diana, de manera directa o indirecta. Los ejemplos de ligandos dirigidos son los análogos de prostaciclina desvelados en el documento WO 2011/076391, tal como Iloprost o Treprostinil. Un anticuerpo también puede actuar como un ligando dirigido. Como ligandos para nanopartículas o micropartículas, se pueden mencionar el ácido fólico y la N-acetil galactosamina. En términos más generales, una diana es una estructura biológica distinta, a la cual un ligando dirigido puede unirse específicamente a través de interacción molecular, y donde tal unión conducirá finalmente a la acumulación preferencial del agente terapéutico, como un ácido nucleico, comprendido en la composición en un tejido diana y/o en o dentro de una célula diana. De manera similar a las cadenas de PEG (o HES y PSar), los ligandos dirigidos se pueden acoplar, por ejemplo, a los extremos terminales de una cadena principal de polímero o un dendrímero. Sin embargo, el acoplamiento también se puede lograr con los grupos de fórmulas (1) a (4), (II), (III), (IV) o cualquiera de (a1), (a2) o (b1) a (b4) descrito arriba.
Además, agentes endosomolíticos como los péptidos endosomolíticos (Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21 35) o cualquier otro compuesto que sea adecuado para mejorar la liberación endosómica de un ácido nucleico endocitosado, son componentes útiles de las composiciones de la presente invención. De manera similar, los péptidos de penetración celular (en otro contexto también conocidos como dominios de transducción de proteínas) (Lindgren et al. 2000, Trends Pharmacol Sci, 21, 99-103) pueden ser componentes útiles de la composición de la presente invención para mediar la administración intracelular de un ácido nucleico. El denominado péptido TAT cae dentro de esta clase y también tiene una función de localización nuclear (Rudolph et al. 2003, J Biol Chern, 278, 11411-11418).
Aditivo crioprotector
Como un componente adicional, además de la formulación de nano o micropartículas, las composiciones de acuerdo con la invención comprenden un aditivo crioprotector que se selecciona de alcanos C3-C5 sustituidos por uno o dos grupos hidroxilo. Como entenderá el lector experto, estos alcanos sustituidos pueden ser alcanos lineales o ramificados. Tienen de 3 a 5 átomos de carbono. En función del número de sustituyentes hidroxilo, pueden denominarse mono o dialcoholes, o como alcanoles o alcanodioles.
Preferentemente, el aditivo crioprotector comprende al menos un grupo hidroxilo secundario (por ejemplo, un grupo hidroxilo secundario y no más, o un grupo hidroxilo secundario y uno primario, o dos grupos hidroxilo secundarios).
Con mayor preferencia, el aditivo crioprotector se selecciona entre 1,2-propanodiol, 2-propanol, 1,2-butanodiol y 1,3-butanodiol. Con la máxima preferencia, el aditivo crioprotector es 1,2-propanodiol.
Composiciones
Como se señaló anteriormente, la invención hace uso de una composición de suspensión que comprende la formulación de nano o micropartículas del agente terapéuticamente activo y el aditivo crioprotector que se han discutido con más detalle anteriormente.
Dado que las composiciones para su uso en la invención contienen un agente terapéuticamente activo y son adecuadas para la administración del agente terapéuticamente activo a un paciente, pueden denominarse composiciones terapéuticas o composiciones farmacéuticas.
En particular, la composición de suspensión para su uso en la presente invención comprende:
(i) una formulación de nano o micropartículas de un agente terapéuticamente activo que está suspendida en una fase líquida, y
(ii) al menos un aditivo crioprotector seleccionado de alcanos C3-C5 sustituidos por uno o dos grupos hidroxilo.
Como se apreciará, la información relativa a realizaciones adecuadas y preferentes del agente terapéutico, de su formulación de partículas y del aditivo crioprotector continúa aplicándose en este contexto.
La composición en suspensión comprende preferentemente las partículas de la formulación de partículas en una cantidad que proporcione el agente terapéuticamente activo, que está contenido en la formulación de partículas, a una concentración de 0,01 a 50 mg/ml, con mayor preferencia de 0,02 a 30 mg/ml, con base en el volumen total de la composición.
El aditivo crioprotector está contenido preferentemente en la composición en suspensión a una concentración de 0,5 a 50 % p/v, con mayor preferencia de 1 a 40 % p/v, con la máxima preferencia de 1 a 30 % p/v, donde el valor porcentual indica el peso del aditivo crioprotector en g por 100 ml del volumen total de la composición. Típicamente, el aditivo crioprotector está contenido, preferentemente disuelto, en la fase líquida en la que se suspende la formulación de partículas. Sin embargo, también puede estar asociado parcialmente con las partículas suspendidas en la fase líquida.
La fase líquida de la composición en suspensión para su uso en la presente invención típicamente contiene agua como disolvente. Preferentemente, el agua proporciona el 50 % o más, con mayor preferencia el 70 % o más en volumen (en base al volumen total de la fase líquida a 20 °C). Con mayor preferencia, el agua y el aditivo crioprotector son los únicos disolventes contenidos en la fase líquida.
Como ejemplares de aditivos opcionales adicionales de la fase líquida, se pueden mencionar uno o más seleccionados de sales, azúcares, disolventes orgánicos y tampones.
Como implica el término "suspendido", la formulación de nano o micropartículas del agente terapéuticamente activo forma una fase sólida discontinua en la fase líquida continua.
Generalmente, es preferente que la composición en suspensión se proporcione como una composición de suspensión de dos fases, con una fase líquida continua que comprende el aditivo crioprotector, opcionalmente en combinación con otros aditivos disueltos en el mismo, y la formulación de nano o micropartículas del agente terapéuticamente activo suspendido como una fase sólida discontinua en el mismo.
La composición en suspensión puede almacenarse en forma de una composición sólida que comprende (i) una formulación en nanopartículas o micropartículas del agente terapéuticamente activo, y
(ii) al menos un aditivo crioprotector seleccionado de alcanos C3-C5 sustituidos por uno o dos grupos hidroxi, y que puede obtenerse por la congelación de la composición en suspensión.
La composición sólida contiene los mismos componentes que la composición en suspensión, la que se pueden congelar para obtener la composición sólida. Por lo tanto, la información relativa a realizaciones adecuadas y preferentes del agente terapéutico, de su formulación de partículas, del aditivo crioprotector, y de la fase líquida y sus componentes proporcionados para la composición en suspensión continúa aplicándose a la composición sólida. Sin embargo, como apreciará el lector experto, la composición sólida y la composición en suspensión difieren en que la fase líquida de la composición en suspensión se ha solidificado en la composición sólida. En esa medida, la composición sólida contiene una dispersión de la formulación de nano o micropartículas del agente terapéutico en una fase sólida continua de un líquido congelado. De acuerdo con lo anterior, el aditivo ciroprotector está contenido típicamente en la fase continua en la que se dispersa la formulación de partículas.
En vista de lo anterior, resultará más evidente que las composiciones también son preferentes como la composición en suspensión para su uso de acuerdo con la invención que comprenden (i) una formulación de nano o micropartículas en la que el agente terapéuticamente activo es ARNm, y el ARNm está comprendido en la formulación de partículas en forma de complejo con un polímero u oligómero catiónico, o en forma de complejo con un lípido catiónico o un lipidoide catiónico, y (ii) 1,2 propanodiol como un aditivo crioprotector. Con respecto a los tipos adecuados y preferentes del polímero u oligómero catiónico, y con respecto a los tipos preferentes de lípidos catiónicos y lípidos catiónicos, se siguen aplicando las consideraciones anteriores. También, para estas composiciones preferentes, las partículas en la formulación de partículas muestran típicamente un diámetro promedio de partículas en el intervalo de 1 a 4.000 nm, con mayor preferencia de 2 a 2.500 nm y con la máxima preferencia de 5 a 1.000 nm. El límite superior para el diámetro de las partículas en la formulación de nano o micropartículas es preferentemente de 20 pm, con más preferencia de 10 pm y con la máxima preferencia de 5 pm.
Aspectos farmacéuticos
La composición en suspensión para su uso en la presente invención es adecuada para administrar el agente terapéuticamente activo contenido en el mismo a un individuo. Como se explicó anteriormente, la composición tiene la ventaja inesperada, en comparación con las composiciones de partículas que contienen otros crioprotectores, de que se puede mantener en un estado congelado, mientras se previene la agregación de las partículas durante o después de la congelación, y mientras se administra la funcionalidad a la vía respiratoria se mantiene el tracto, en particular la administración pulmonar o la administración nasal. Por lo tanto, una vía de administración preferente para la composición en suspensión es la administración al tracto respiratorio o a través de este, en particular la administración pulmonar o la administración nasal.
El agente terapéuticamente activo es un ácido nucleico, preferentemente ARN, con mayor preferencia un ARN monocatenario, y con la máxima preferencia ARNm, y el ácido nucleico puede ser administrado a las células diana en el tracto respiratorio o a través de este. El término "administrado a las células diana" significa preferentemente transferencia del ARN, preferentemente ARN monocatenario tal como ARNm, en la célula.
La composición puede ser administrada al sujeto en una dosis adecuada. El régimen de dosificación será determinado por el médico de cabecera y los factores clínicos. Como se conoce bien en la técnica médica, las dosificaciones para cada sujeto dependen de muchos factores, incluido el tamaño del sujeto, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto en particular que se administrará, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general, y otros fármacos que se administren simultáneamente. Una dosis típica de sustancias terapéuticamente activas puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 1 ng a varios gramos. Aplicado al caso preferente de terapia con ARN(m), la dosificación de un ARN(m) para la expresión o para la inhibición de la expresión debe corresponder a este intervalo; sin embargo, se prevén dosis por debajo o por encima de estos ejemplares de intervalos, especialmente considerando los factores antes mencionados. Generalmente, el régimen como una administración regular de la composición farmacéutica debe estar en el intervalo de 0,01 pg a 10 mg unidades por kilogramo de peso corporal por día. Si el régimen es una infusión continua, también debe estar en el intervalo de 1 pg a 10 mg unidades por kilogramo de peso corporal, respectivamente. El progreso puede monitorearse mediante evaluación periódica. La dosificación variará, pero una dosis preferente para la administración de ARN(m) como constituyente de la composición de la presente invención es de aproximadamente de 106 a 1019 copias de la molécula de ARN(m).
Los dispositivos para formar un aerosol a partir de una composición particulada suspendida en un líquido o para nebulizar dicha composición son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Pueden usarse para lograr la administración de la composición en suspensión para su uso de acuerdo con la invención en el tracto respiratorio o a través de este, en particular la administración pulmonar. Para la administración a través de la nariz, se puede usar, por ejemplo, un dispositivo de pulverización nasal o de infusión nasal.
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a un dispositivo para formar un aerosol a partir de una composición particulada suspendida en un líquido o para nebulizar dicha composición, cuyo dispositivo comprende la composición en suspensión para su uso de acuerdo con la presente invención. El dispositivo es preferentemente un inhalador seleccionado de un inhalador de dosis medida, un nebulizador y un dispositivo de pulverización nasal.
También, para las composiciones utilizadas en los dispositivos anteriores, la información proporcionada anteriormente sobre realizaciones preferentes continúa aplicándose. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones en suspensión preferentes usadas en tales dispositivos comprenden (i) una formulación de nano o micropartículas en la que el agente terapéuticamente activo es ARNm, y el ARNm está comprendido en la formulación de partículas en la forma de un complejo con un polímero catiónico u oligómero, o en la forma de complejo con un lípido catiónico o un lipidoide catiónico, y (ii) 1,2 propanodiol como un aditivo crioprotector. Con respecto a los tipos adecuados y preferentes del polímero u oligómero catiónico, y con respecto a los tipos preferentes de lípidos catiónicos y lípidos catiónicos, se siguen aplicando las consideraciones anteriores. También, para estas composiciones preferentes, las partículas en la formulación de partículas muestran típicamente un diámetro promedio de partículas en el intervalo de 1 a 4.000 nm, con mayor preferencia de 2 a 2.500 nm y con la máxima preferencia de 5 a 1.000 nm. El límite superior para el diámetro de las partículas en la formulación de nano o micropartículas es preferentemente de 20 pm, con más preferencia de 10 pm y con la máxima preferencia de 5 pm.
Como se explicó anteriormente, las composiciones en suspensión para su uso de acuerdo con la invención se pueden administrar convenientemente después de la preparación, almacenamiento en estado congelado, y recuperación mediante descongelación. Sin embargo, se comprenderá que las composiciones en suspensión para su uso de acuerdo con la invención también pueden administrarse directamente después de su preparación, y se ha encontrado que la presencia del alcano C3-C5 sustituido con uno o dos grupos hidroxilo puede tener un efecto beneficioso sobre la eficiencia del agente terapéutico que es un ácido nucleico, preferentemente ARN, más preferentemente ARN monocatenario, y más preferentemente ARNm, incluso en una composición recién preparada.
Por lo tanto, la presente invención también proporciona la composición en suspensión de acuerdo con la presente invención para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad, preferentemente en la que la composición se administra al tracto respiratorio o a través de este. Preferentemente, la composición es para ser administrada a través de administración pulmonar o mediante administración nasal. Los pacientes a los que se puede administrar la composición comprenden animales y humanos.
También, la presente invención hace posible un procedimiento de tratamiento, que comprende administrar la composición en suspensión de la presente invención a un paciente a través de la administración al tracto respiratorio o a través de este, con preferencia a través de la administración pulmonar o nasal, con el fin de tener el agente terapéuticamente activo contenido en dicha composición lo que causa un efecto preventivo o terapéutico. También, en este contexto, el término "paciente" comprende animales y humanos.
También, para las composiciones de acuerdo con la presente invención para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad, continúa aplicándose la información proporcionada anteriormente sobre las realizaciones preferentes. Por los tanto, por ejemplo, las composiciones en suspensión preferentes para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad comprenden (i) una formulación de nano o micropartículas en la que el agente terapéuticamente activo es ARNm, y el ARNm está comprendido en la formulación de partículas en la forma de un complejo con un polímero u oligómero catiónico, o en la forma de un complejo con un lípido catiónico o un lipidoide catiónico, y (ii) 1,2 propanodiol como un aditivo crioprotector. Con respecto a los tipos adecuados y preferentes del polímero u oligómero catiónico, y con respecto a los tipos preferentes de lípidos catiónicos y lípidos catiónicos, se siguen aplicando las consideraciones anteriores. También, para estas composiciones preferentes, las partículas en la formulación de partículas muestran típicamente un diámetro promedio de partículas en el intervalo de 1 a 4.000 nm, con mayor preferencia de 2 a 2.500 nm y con la máxima preferencia de 5 a 1.000 nm. El límite superior para el diámetro de las partículas en la formulación de nano o micropartículas es preferentemente de 20 pm, con más preferencia de 10 pm y con la máxima preferencia de 5 pm.
Como se indicó anteriormente, la administración se puede lograr directamente después de la preparación de la composición, pero el efecto del aditivo crioprotector es pronunciado si la administración se logra después que la composición en suspensión se haya congelado y descongelado al menos una vez.
Al administrar la composición en suspensión para su uso en la presente invención, se pueden tratar o prevenir enfermedades. El término "enfermedad" se refiere a cualquier condición patológica concebible que pueda tratarse, prevenirse o vacunarse al emplear la composición de la presente invención. Dichas enfermedades pueden, por ejemplo, ser heredadas, adquiridas, infecciosas o no infecciosas, relacionadas con la edad, cardiovasculares, metabólicas, intestinales, neoplásicas (en particular cáncer) o genéticas. Una enfermedad puede basarse, por ejemplo, en irregularidades de procesos fisiológicos, procesos moleculares, reacciones bioquímicas dentro de un organismo que a su vez pueden basarse, por ejemplo, en el equipamiento genético de un organismo, en factores conductuales, sociales o ambientales tales como la exposición a los productos químicos o la radiación. La composición en suspensión de acuerdo con la presente invención es particularmente adecuada para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad pulmonar.
Si, de acuerdo con una realización preferente descrita anteriormente, el agente terapéuticamente activo es ARN, con mayor preferencia ARN monocatenario y con la máxima preferencia ARNm, la composición en suspensión de la presente invención puede ser para su uso en una terapia basada en ARN. La molécula de ARN, preferentemente la molécula de ARNm, comprende una secuencia que codifica una proteína y, en consecuencia, se puede usar en terapias basadas en ARN en las que el ARN, preferentemente el ARNm, codifica un polipéptido o proteína terapéutica o farmacéuticamente activo que tiene un efecto terapéutico o preventivo. Por lo tanto, en realizaciones preferentes, la composición en suspensión de la presente invención puede ser para su uso en terapias basadas en ARN, en el tratamiento o la prevención de una enfermedad como se indica en la siguiente tabla. Por consiguiente, las terapias basadas en ARN de acuerdo con la presente invención pueden ser para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad como se indica en la siguiente tabla.
Por lo tanto, la composición en suspensión de la presente invención puede ser para su uso en terapias basadas en ARN, en los casos en los que los defectos genéticos descritos en la siguiente tabla conducen a una enfermedad que luego puede ser tratada o prevenida mediante una terapia de reemplazo de un transcripto/terapia de reemplazo de enzima con la molécula de ARN, preferentemente la molécula de ARNm, de la presente invención, en la que la molécula de ARN codifica una versión intacta de la proteína o un fragmento funcional de la misma, lo que compensa el gen defectuoso desvelado.
En otras realizaciones, la composición en suspensión de la presente invención puede ser para su uso en terapias basadas en ARN de acuerdo con la presente invención en donde el ARN, preferentemente el ARNm, codifica un polipéptido, una proteína o un péptido terapéutica o farmacéuticamente activo, que tiene un efecto terapéutico o preventivo, en el que dicho polipéptido, proteína o péptido se selecciona del grupo codificado por los genes como se indica en la siguiente tabla.
La composición en suspensión de la presente invención es particularmente adecuada para su uso en terapias basadas en ARN en el tratamiento o la prevención de enfermedades pulmonares. Como ejemplares de enfermedades, se pueden mencionar la alfa-1-antitripsina, el asma, la fibrosis quística, la disfunción del metabolismo del surfactante o la disquinesia ciliar primaria, como se enumeran en la siguiente tabla.
En otros ejemplares de realización, la composición en suspensión de la presente invención puede ser para su uso en terapias basadas en ARN en el tratamiento o la prevención de enfermedades lisosomales, como la enfermedad de Gaucher, la enfermedad de Fabry, la MPS I, la MPS II (síndrome de Hunter), la MPS VI y las enfermedades de almacenamiento del glucógeno, como por ejemplo, la enfermedad de almacenamiento del glucógeno tipo I (la enfermedad de von Gierecke), tipo II (la enfermedad de Pompe), tipo III (la enfermedad de Cori), tipo IV (la enfermedad de Andersen), tipo V (la enfermedad de McArdle), tipo VI (la enfermedad de Hers), tipo VII (la enfermedad de Tauri), tipo VII, tipo IX, tipo X, tipo XI (el síndrome de Fanconi-Bickel), tipo XI o tipo 0. Las terapias de reemplazo de transcripciones/terapias de reemplazo de enzimas beneficiosas no afectan el defecto genético subyacente, pero aumentan la concentración de la enzima en la que el paciente es deficiente. Como un ejemplo, en la enfermedad de Pompe, la terapia de reemplazo de transcripción/terapia de reemplazo de enzima reemplaza la deficiencia de la enzima lisosomal alfa-glucosidasa ácida (GAA).
De acuerdo con otros ejemplos, las terapias basadas en ARN de acuerdo con la presente invención pueden ser para su uso en el tratamiento del cáncer, una enfermedad cardiovascular, una infección viral, una disfunción inmunológica, una enfermedad autoinmune, un trastorno neurológico, un trastorno metabólico hereditario o un trastorno genético o cualquier enfermedad donde una proteína o un fragmento de proteína producido en una célula pueda tener un efecto beneficioso para el paciente. Los ejemplos de cáncer incluyen cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de hueso, cáncer de cerebro, cáncer de cuello uterino, cáncer de ano, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de apéndice, cáncer de ojo, cáncer gástrico, leucemia, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de pene, cáncer de páncreas, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de vagina, cáncer de vulva, cáncer de endometrio, cáncer cardíaco y sarcoma. Los ejemplos de enfermedades cardiovasculares incluyen aterosclerosis, enfermedad cardíaca coronaria, enfermedad cardíaca pulmonar y cardiomiopatía. Los ejemplos de disfunciones inmunes y enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, enfermedades reumáticas, esclerosis múltiple y asma. Algunos ejemplos de infecciones víricas incluyen, pero sin limitación, las infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus del herpes simple, el virus del papiloma humano, así como los virus de la hepatitis B y C. Los ejemplos de trastornos neurológicos incluyen, pero sin limitación, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis múltiple, y la demencia. Los ejemplos de trastornos metabólicos hereditarios incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de Gaucher y la Fenilcetonuria.
Tabla:Ejemplos no limitativos de genes humanos y trastornos genéticos
Distrofia miotónica (inicio durante la edad Defecto de la proteína quinasa Distrofia miotónica proteína quinasa adulta tem rana en las células del músculo DMPK autosómica dominante
Neuronas y cerebro
te
Enfermedad Patología Gen, herencia
Enfermedad de Niemann-Pick (tres Defecto en l Esfingomielinasa, autosómica formas distintas A, B, C) colesterol de sosomas, recesiva
acumulación de Esfingomielina
Enfermedad de Tay-Sachs (muerte a los La acumulación del gangliósido Hexosaminidasa A,
4 años) Gm<2>en las células neuronales
autosómico recesivo
Piel
Albinismo Defecto del metabolismo del Deficiencia de tirosinasa,
nitrógeno
autosómico recesivo
Biosíntesis reducida del pigmento OCA2, autosómica recesiva Albinismo, de melanina
Síndrome de Ehlers-Danl fectos en la síntesis de
Epidermólisis ampollosa lisis bullosa
tipo macular (EBM), Epidermólisis (varios tipos, incluidos EB simple, EB de los queratinocitosestabilidad
Unión, EB Distrófica y síndrome de estructural o la adhesión del bullosa 3 progresiva (EBR3), Kindler ueratinocito a
Enfermedades genéticas del hígado
Procedimientos de preparación
La composición para su uso de acuerdo con la presente invención puede prepararse mediante un proceso que comprende
a) proporcionar una formulación de nano o micropartículas de un agente terapéuticamente activo, que está suspendida en una fase líquida, y
b) añadir al menos un aditivo crioprotector seleccionado de alcanos C3-C5 sustituidos por uno o dos grupos hidroxilo a la fase líquida, en el que la adición del aditivo crioprotector a la fase líquida se puede lograr antes, durante o después de proporcionar la formulación de partículas suspendida en la fase líquida,
Con respecto a la provisión de una formulación de partículas de un agente terapéuticamente activo el cual comprende nanopartículas o micropartículas, las técnicas están establecidas en la técnica.
Con respecto a los procesos para la provisión de formulaciones de partículas de ácido nucleico como un agente terapéutico, preferentemente ARN, con mayor preferencia ARN monocatenario y con la máxima preferencia ARNm, se puede hacer referencia nuevamente a la bibliografía discutida anteriormente, tal como A.C. Silva et al., Current Drug Metabolism, 16, 2015, 3-16, y la bibliografía a la que se hace referencia en este, J.C. Kasper et al., J. Contr. Rei.
151 (2011), 246-255, el documento WO 2014/207231 y la bibliografía mencionada en el mismo, el documento WO 2016/097377 y en la bibliografía mencionada en el mismo, los documentos US 2017/0267631, WO 2016/081029, WO 2011/071860, WO 2016/118697, US 8450298 B2 y E.R. Lee et al., Human Gene Therapy 7:1701-1717, September 10, 1996.
Las formulaciones de partículas preferentes que contienen ácido nucleico, preferentemente ARN, con mayor preferencia ARN monocatenario, y con la máxima preferencia ARNm como agente activo en forma de un complejo con un polímero catiónico, oligómero, lípido o lipidoide, como poliplexos, lipoplexos, liposomas o LNP, pueden formarse convenientemente mediante el uso de un autoensamblaje de un ácido nucleico cargado negativamente con un oligómero, polímero, lípido o lipidoide cargado positivamente.
El autoensamblaje puede ocurrir al mezclar las soluciones de los componentes. El autoensamblaje se puede lograr, por ejemplo, mediante la mezcla a mano con el uso de pipeta y agitación/agitación con vórtice, o con el uso de un dispositivo automático para micromezcla tal como se describe, por ejemplo, por Hirota et al. (Hirota et al. 1999, Biotechniques, 27, 286-290) o Kasper et al. (Kasper et al. 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185) o mediante el enfoque de microfluidos, según lo revisado porXuan et al. (Xuan et al. 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16). Para incorporar componentes adicionales, además del ácido nucleico y el oligómero, polímero, lípido o lipidoide para ser incorporados en las partículas de la formulación de partículas, se puede usar la mezcla secuencial. En este caso, puede añadirse cualquier componente adicional después del autoensamblaje del oligómero, polímero, lípido o lipidoide y el ácido nucleico, o puede añadirse a cualquiera de estos antes de mezclar.
Por ejemplo, la formación de poliplexos puede lograrse convenientemente al mezclar una solución que contiene el ácido nucleico en agua y una solución que contiene el polímero u oligómero catiónico en agua.
También para la formación de liposomas, se encuentran disponibles técnicas establecidas. Incluyen, por ejemplo, la rehidratación de lípidos o componentes de lípidos, tales como lípidos o películas de lípidos, seguida de técnicas de homogeneización como, por ejemplo, ultrasonidos o extrusión, cuando sea necesario. Los enfoques alternativos son la infusión de lípidos o de componentes lipidoides disueltos en disolventes orgánicos, en agua o una solución acuosa.
Como un ejemplar del procedimiento, en el que se puede confiar la formación de nanopartículas lipídicas o lipoplexos, se puede mencionar el procedimiento de desplazamiento de disolvente.
Las partículas que dependen de un vector viral pueden proporcionarse mediante procedimientos biológicos conocidos.
Como ejemplos adicionales para la preparación de una formulación de partículas, las partículas que comprenden un agente terapéuticamente activo se pueden formar mediante la emulsión de una solución que contiene el agente activo, opcionalmente en combinación con un agente formador de matriz, seguido de la solidificación de las partículas. La solidificación se puede lograr, por ejemplo, al eliminar un disolvente de una fase oleosa emulsionada en la que está contenido un material formador de matriz, o al reticular o polimerizar componentes para la formación de una matriz. También los materiales y procedimientos para la formación de formulaciones liposomales son conocidos por el facultativo experto.
El aditivo crioprotector se puede añadir convenientemente a la fase líquida en la que se suspende la formulación de nano o micropartículas o en la que se va a proporcionar la suspensión. En otras palabras, la adición del aditivo crioprotector a la fase líquida se puede realizar antes, durante o después de proporcionar la formulación de partículas suspendida en la fase líquida.
Una composición sólida adecuada para almacenar la composición para uso de acuerdo con la presente invención puede prepararse mediante un proceso, que comprende:
una primera etapa para preparar una composición según lo descrito con anterioridad por un proceso que comprende
a) proporcionar una formulación de nano o micropartículas de un ácido nucleico como un agente terapéuticamente activo que está suspendida en una fase líquida, y
b) añadir al menos un aditivo crioprotector seleccionado de alcanos C3-C5 sustituidos por uno o dos grupos hidroxi a la fase líquida, en el que la adición del aditivo crioprotector a la fase líquida se puede lograr antes, durante o después de proporcionar la formulación de partículas suspendida en la fase líquida, y una segunda etapa de congelación de la composición obtenida en la primera etapa.
Con respecto la primera etapa, se entenderá que la información que se proporciona anteriormente con respecto a la preparación de la composición en suspensión se aplica igualmente para la preparación de la composición sólida.
La etapa de congelación como segunda etapa se logra típicamente sometiendo la composición en suspensión a temperaturas suficientemente frías (por ejemplo, -10 °C o menos, preferentemente -20 °C o menos) en un recipiente adecuado. Como medio refrigerante, se puede usar, por ejemplo, aire frío o líquidos fríos.
De hecho, como ya se ha explicado, la composición sólida es una composición que permite almacenar una formulación en partículas de un agente terapéuticamente activo que contiene nanopartículas o micropartículas. En ese sentido, se comprenderá que una composición en suspensión para uso de acuerdo con la invención también puede recuperarse de la composición sólida por la descongelación de la composición sólida.
Por lo tanto, una composición para su uso de acuerdo con la invención también puede prepararse mediante un proceso que comprende:
una primera etapa para preparar una composición según lo descrito con anterioridad por un proceso que comprende
a) proporcionar una formulación de nano o micropartículas de un ácido nucleico como un agente terapéuticamente activo que está suspendida en una fase líquida, y
b) añadir al menos un aditivo crioprotector seleccionado de alcanos C3-C5 sustituidos por uno o dos grupos hidroxi a la fase líquida, en el que la adición del aditivo crioprotector a la fase líquida se puede lograr antes, durante o después de proporcionar la formulación de partículas suspendida en la fase líquida, una segunda etapa de congelación de la composición obtenida en la primera etapa, y una tercera etapa de descongelación de la composición congelada obtenida en la segunda etapa.
Procedimientos y usos
La composición para su uso de acuerdo con la invención, es decir, una composición que comprende
(i) una formulación de nano o micropartículas de un agente terapéuticamente activo que está suspendida en una fase líquida, y
(ii) al menos un aditivo crioprotector seleccionado de alcanos C3-C5 sustituidos por uno o dos grupos hidroxi, puede conservarse por la congelación de la composición.
Continúa aplicando la información proporcionada anteriormente con respecto a las realizaciones adecuadas y preferentes del agente terapéutico, de su formulación de partículas, del aditivo crioprotector, en la fase líquida, en los procedimientos disponibles para proporcionar la composición, y en la etapa de congelación.
Como entenderá el lector experto, el término "conservación" indica en este contexto que las características terapéuticas relevantes de la formulación de partículas del agente terapéuticamente activo se retienen en un grado sustancial, preferentemente completamente retenidas, durante su almacenamiento. El procedimiento de conservación de la formulación de partículas implica típicamente, además, el almacenamiento de la composición congelada mientras se retiene en su estado congelado durante un período de tiempo deseado, por ejemplo, durante varias horas, días, semanas, meses o incluso años.
Ejemplos
Abreviaturas
Abreviatura Descripción
TA Temperatura ambiente
ARNm Ácido ribonucleico mensajero
brPEI Polietilenimina ramificada
FLuc Luciferasa de luciérnaga
sin sin
ARNqm ácido ribonucleico químicamente modificado
FLuc Luciferasa de luciérnaga
PG 1,2-propanodiol, propilen glicol
N/P Relación de nitrógeno amínico portador a fosfato
Ejemplo I: Cribado de diferentes clases de moléculas como aditivos crioprotectores para formulaciones de nano o micropartículas.
Formación del complejo
Se formaron complejos de poli(etilenimina) ramificada (brPEI) y ARNm que codifica la luciferasa, a una concentración final de 0,25 mg/ml. En un procedimiento de mezcla estándar, el ARNm se diluyó con agua hasta una concentración de 0,5 mg/ml. Se preparó el mismo volumen de solución de brPEI a una concentración de 0,65 mg/ml en agua. Se formaron nanopartículas o micropartículas mediante la inyección de la solución de ARNm en la solución de brPEI, seguido de su mezcla con el uso de una pipeta electrónica (Mettler-Toledo, E4 LTS 1.000 j L). Después de mezclar, los complejos se incubaron durante 20 minutos en hielo antes de su uso.
Mediciones de tamaño
Para la determinación del diámetro de las partículas, se llenaron 100<j>L de una suspensión de las partículas en una cubeta (Brand, UV-cuvette Micro) y se midieron usando un Malvern ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments), lo que da los diámetros hidrodinámicos y el diámetro hidrodinámico promedio (promedio z) en nm. Como medio de suspensión, se usó agua o agua que contiene un aditivo crioprotector, como se indica.
Desafío de congelación-descongelación
La formulación se diluyó 1:2 con soluciones de aditivo 2X (20/10/2 %) (Tabla 1), y se dividió por duplicado. Se usó una muestra de cada formulación resultante para la determinación del tamaño (Malvern Zetasizer NanoZS) en presencia de aditivo. Las muestras restantes se congelaron a -20 °C durante 16 h, se descongelaron a TA y se almacenaron inmediatamente en hielo antes de que las soluciones alcanzaran TA.
Luego, cada formulación descongelada se usó para la determinación del tamaño (Malvern Zetasizer NanoZS) y se comparó con respecto al % de desviación de tamaño de las formulaciones antes de congelar y después de descongelar, de acuerdo con la siguiente ecuación, en la que dh indica el diámetro promedio de partículas z:
/ (después de congelación) \
desviación de tamaño \% \ - ~ r
V«/i~ (,—antes d .e congel .ación) ~ 1 / J 1)1100 %
Ensayo de transfección y de actividad de la luciferasa
Las células A549 se cultivaron en medio MEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %, y 1%de estreptomicina/penicilina a 37 °C y 5 % de CO<2>. Las células se sembraron a 20.000 células/pocillo en 100 j l de medio, en una placa de 96 pocillos, 24 h antes de la transfección. El día de la transfección, el medio se reemplazó con MEM sin FBS y penicilina/estreptomicina seguido de la adición de ARNm acomplejado, 60 jl/pocillo, por duplicado. 4 h después de la transfección, el medio se reemplazó con MEM con FBS al 10 % y P/S al 1 %. Las placas se incubaron durante 24 h a 37 °C y 5 % de CO<2>. Después de 24 h de incubación, se retiró el medio y las células se lisaron en 100 j l de tampón de lisis (Tris HCl 25 mM, TritonX-100 al 0,1 %, pH 7,8) y se incubaron en un agitador de placas durante 30 min a 600 rpm. A continuación, se transfirieron 50 j l del lisado de células de cada pocillo a una placa de 96 pocillos, y se midió la actividad de luciferasa de luciérnaga indicadora mediante la intensidad de bioluminiscencia en un Tecan Infinite 200 PRO, después de la adición de tampón de luciferina (D-luciferina 0,47 mM, Coenzima A 0,27 mM, DTT 3,33 mM, ATP 0,53 mM, MgCO<3>1,1 mM, MgSO<4>2,7 mM, Tricina 20 mM, EDTA 0,1 mM).
Preparación de muestras para los experimentos in vivo
Los complejos se prepararon como se describe en "formación de complejos" y "desafío de congelacióndescongelación" con la siguiente modificación. Se prepararon 4 ml de solución compleja a una concentración de ARNm de 0,5 mg/ml y se diluyeron 1:2 con una solución de aditivo doblemente concentrado para dar como resultado una concentración final de ARNm de 0,25 mg/ml (8 ml). Las muestras se mantuvieron congeladas hasta su nebulización a los animales.
Nebulización
Los animales se colocaron en una cámara de dosificación en masa de tamaño pequeño Buxco (Data Sciences International, Alemania). Las formulaciones se descongelaron a temperatura ambiente, se colocaron en hielo triturado antes de alcanzar la temperatura ambiente y luego se nebulizaron usando un nebulizador Aeroneb Solo (Aeroneb, Alemania), a una velocidad de circulación de aire de 3 L/min y un ciclo de trabajo del 100 %.
Medición de bioluminiscencia en pulmones explantados
24 h después de la aplicación, los animales se colocaron bajo anestesia completa mediante inyección intraperitoneal de Fentanilo/Midazolam/Medetomidina (0,05/5,0/0,5 mg/kg de peso corporal). Se aplicaron 50 jL de D-Luciferina (30 mg/ml disueltos en solución salina tamponada con fosfato, pH 7) a través de la vía de inhalación (inhalación de la solución después de que se aplicó directamente en las fosas nasales) y se aplicaron 100 jL de D-Luciferina sistémicamente mediante inyección intraperitoneal. 10 minutos después de la administración de la luciferina, los ratones se sacrificaron a través de dislocación cervical. Después de la perfusión con PBS a través del corazón derecho, se explantaron los pulmones. La bioluminiscencia se midió usando un Xenogen MS Luminar XR (Caliper LifeSciences) con un binning fijado en 8 y un tiempo de exposición de 5 min. La bioluminiscencia se cuantificó y analizó con el uso del Living Image Software 4.4 (Xenogen). En el caso de imágenes sobresaturadas (detección de expresión fuera del intervalo lineal), el tiempo de exposición se redujo a 1 min. La bioluminiscencia se midió como el flujo total de órganos (en fotones/seg). Para el análisis solo se usaron imágenes sin sobresaturación. Los pulmones se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C.
Actividad de la luciferasa en pulmones homogeneizados
Se pesaron los órganos descongelados y la mitad de los pulmones explantados se homogenizó en tampón de lisis usando un homogeneizador FastPrep -24 (MP Biomedicals). El luminómetro Lumat LB 9507 (Berthold Technologies) añadió automáticamente 100 jL de tampón de luciferina a 75 jL de lisados centrifugados. La actividad de la luciferasa se midió en RLU/s y se convirtió en RLU/órgano.
Resultados
Se demostró la capacidad de prevenir la agregación de partículas de formulaciones de polímero/ARNm después de un ciclo de congelación-descongelación para diferentes tipos de aditivos, incluyendo los compuestos establecidos como aditivos crioprotectores en la técnica. La composición que usa 1,2-propanodiol es una composición de acuerdo con la invención, las otras composiciones son composiciones de referencia. Se evaluaron los diámetros de partículas hidrodinámicas antes de la congelación. Después de 16 h a -20 °C, se descongelaron las formulaciones y se midió nuevamente el diámetro de partícula hidrodinámico. Las diferencias de tamaño entre las partículas antes de la congelación y después de la descongelación se muestran en la Tabla 1b. Los números altos indican un gran aumento de tamaño y, por lo tanto, de agregación.
Tabla 1a: Tamaño estándar de un complejo recién preparado en agua medido con el ZetaSizer Nano ZS (Malvern)
Tabla 1b: Desviación del tamaño de partícula después de un ciclo de congelación-descongelación en comparación con complejos frescos en diferentes tipos y concentraciones de aditivos.
Prueba de congelación-descongelación (-20 °C) de formulaciones de brPEI 25kDa/ARNm N/P 10 a una concentración de ARNm de 0,25 mg/ml que contienen el % (p/v) indicado de aditivo. La a-lactosa monohidrato y el D-Manitol se probaron a concentraciones reducidas debido a su limitada solubilidad en agua. El cloruro de sodio se probó a concentraciones reducidas para permanecer dentro del intervalo de concentración isotónica. n = 1.
Composición de referencia
Tabla 2: Relaciones en peso en el experimento anterior de ARNm/polímero/1,2-propanodiol.
Un aumento del tamaño de más del 100 % (100% diámetro doble) se definió como proceso de agregación. Los aditivos que resultan en una diferencia de tamaño por debajo de este umbral se seleccionaron para probarsein vitro,para la eficiencia de transfección en células A549 después de un ciclo de congelación-descongelación (Figura 1 y Tabla 3). Los azúcares no se probaronin vitro.
La Figua 1 muestra la eficiencia de la transfección en células A549 de las formulaciones de brPEI/FLuc ARNm N/P 10 que contienen aditivos.
Tabla 3: Datos tabulados de la Figura 1.
*composición de referencia
A partir de los datos tabulados, se puede ver que todos los aditivos retuvieron la eficiencia de transfección y, por lo tanto, se seleccionaron para probarlos mediante nebulización en ratones. Se nebulizaron 8 ml de solución compleja que contenía 2 mg de ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga en un grupo de ratones BALB/c (n = 3). 24 h después del tratamiento, los ratones se sacrificaron. Se analizó la eficiencia de la entrega del ARNma travésde la cuantificación de la actividad de la luciferasa en el órgano extirpado (por Ivis), así como en el homogeneizado de órganos (ver Figura 2 y Tabla 4). Las relaciones en peso de ARNm/polímero/1,2-propanodiol empleadas se indican en la Tabla 5.
La Figura 2 muestra la eficiencia de la transfecciónin vivode las formulaciones de brPEI/ARNm aplicadas a través de nebulización después de un ciclo de congelación-descongelación.
Se nebulizaron a ratones con 2 mg de ARNm de FLuc complejado con brPEI 25 kDa a N/P 10 y 0,25 mg/ml, después de un ciclo de congelación-descongelación, en presencia de los aditivos indicados. Como referencia, un grupo se trató con partículas recién preparadas sin la adición de aditivos. La alta viscosidad de las formulaciones que contienen 10 % de PEG4k o 10k impidió la nebulización por el nebulizador Aeroneb, n = 3.
Tabla 4: Los datos tabulados de la Figura 2 incluyen datos de bioluminiscencia.
*composición de referencia
Tabla 5: Relaciones en peso en el experimento anterior de ARNm/polímero/1,2-propanodiol.
Discusión y Conclusión
El 1,2-propanodiol (propilen glicol, PG) se ha identificado como un aditivo que previene la agregación de partículas y mantiene la eficiencia de transfección de las formulaciones después de la nebulizaciónin vivo,después de un ciclo de congelación-descongelación, en comparación con nanopartículas o micropartículas de brPEI/ARNm recién formuladas.
Ejemplo II: Comparación de diferentes aditivos relacionados estructuralmente con el 1,2-propanodiol como crioprotectores para nanopartículas o micropartículas.
Formación del complejo
Se formaron complejos de poli(etilenimina) ramificada (brPEI) y ARNm que codifica la luciferasa, a una concentración final de 0,25 mg/ml. En un procedimiento de mezcla estándar, el ARNm se diluyó con agua hasta una concentración de 0,5 mg/ml. Se preparó el mismo volumen de solución de brPEI a una concentración de 0,65 mg/ml en agua. Las nanopartículas se formaron mediante la inyección de la solución de ARNm en la solución de brPEI, seguido de su mezcla con el uso de una pipeta electrónica (Mettler-Toledo, E4 LTS 1000 pL). Después de mezclar, los complejos se incubaron durante 20 minutos en hielo antes de su uso.
Mediciones de tamaño
Para la determinación del diámetro de las partículas, se llenaron 100 pL de una suspensión de las partículas en una cubeta (Brand, UV-cuvette Micro) y se midieron usando un Malvern ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments), lo que da los diámetros hidrodinámicos y el diámetro hidrodinámico promedio (promedio z) en nm. Como medio de suspensión, se usó agua o agua que contiene un aditivo crioprotector, como se indica.
Desafío de congelación-descongelación
La formulación se diluyó 1:2 con soluciones de aditivo 2X (20/10/2 %) (Tabla 6) y se dividió por duplicado. Como la solubilidad de algunos aditivos era limitada, se probaron las siguientes sustancias a concentraciones reducidas (ver la Tabla 6): 2-metil-1,4-butanodiol, pentaeritritol. Se usaron muestras de cada formulación resultante para la determinación del tamaño (Malvern Zetasizer NanoZS) en presencia del aditivo. Las muestras restantes se congelaron a -20 °C durante 16 h, se descongelaron a TA y se almacenaron inmediatamente en hielo antes de que las soluciones alcanzaran TA. Luego se usó una muestra de cada formulación descongelada para la determinación del tamaño (Malvern Zetasizer NanoZS) y se comparó con respecto al % de desviación de tamaño de las formulaciones, antes de congelar y después de descongelar, de acuerdo con la siguiente ecuación, en la que dh indica el diámetro promedio de partículas z:
/dft(después de congelación) \
desviación de tamaño [%] =\«fi (—ant1es de...c.o..n.gelación)” 1/) * 100 %
Preparación de muestras para los experimentos in vivo
Los complejos se prepararon como se describe en "formación de complejos" y "desafío de congelacióndescongelación" con la siguiente modificación. Se prepararon 4 ml de solución compleja a una concentración de 0,5 mg/ml y se diluyeron 1:2 con una solución del aditivo de doble concentración para dar como resultado una concentración final de ARNm de 0,25 mg/ml (8 ml). Las muestras se mantuvieron congeladas hasta su nebulización a los animales.
Nebulización
Los animales se colocaron en una cámara de dosificación en masa de tamaño pequeño Buxco (Data Sciences International, Alemania). Las formulaciones se descongelaron a temperatura ambiente, se colocaron en hielo triturado antes de alcanzar la temperatura ambiente y luego se nebulizaron usando un nebulizador Aeroneb Solo (Aeroneb, Alemania), a una velocidad de circulación de aire de 3 L/min y un ciclo de trabajo del 100 %.
Medición de bioluminiscencia en pulmones explantados
24 h después de la aplicación, los animales se colocaron bajo anestesia completa mediante inyección intraperitoneal de Fentanilo/Midazolam/Medetomidina (0,05/5,0/0,5 mg/kg de peso corporal). Se aplicaron 50 pL de D-Luciferina (30 mg/ml disueltos en solución salina tamponada con fosfato, pH 7) a través de la vía de inhalación (inhalación de la solución después de que se aplicó directamente en las fosas nasales) y se aplicaron 100 pL de D-Luciferina sistémicamente mediante inyección intraperitoneal. 10 minutos después de la administración de la luciferina, los ratones se sacrificaron a través de dislocación cervical. Después de la perfusión con PBS a través del corazón derecho, se explantaron los pulmones. La bioluminiscencia se midió usando un Xenogen IVIS Luminar XR (Caliper LifeSciences) con un binning fijado en 8 y un tiempo de exposición de 5 min. La bioluminiscencia se cuantificó y analizó con el uso del Living Image Software 4.4 (Xenogen). En el caso de imágenes sobresaturadas (detección de expresión fuera del intervalo lineal), el tiempo de exposición se redujo a 1 min. La bioluminiscencia se midió como flujo total por órgano (en fotones/seg). Para el análisis solo se usaron imágenes sin sobresaturación. Los pulmones se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C.
Actividad de la luciferasa en pulmones homogeneizados
Se pesaron los órganos y se homogeneizó la mitad de los pulmones explantados en tampón de lisis, con el uso de un homogeneizador FastPrep ° -24 (MP Biomedicals). El luminómetro Lumat LB 9507 (Berthold Technologies) añadió automáticamente 100 pL de tampón de luciferina a 75 pL de lisados centrifugados. La actividad de la luciferasa se midió en RLU/s y se convirtió en RLU/órgano.
Resultados
El ejemplo I muestra que el 1,2-propanodiol previene la agregación de nano o micropartículas durante la congelación, mientras se mantiene la actividadin vivo,mientras que el glicerol (una molécula con similitud química) evita la agregación durante la congelación sin mantener la actividadin vivo.Los resultados de esta prueba muestran que los alcanoles y alcanodioles C3-C5 relacionados estructuralmente con el 1,2-propanodiol pueden prevenir la agregación durante una prueba de congelación-descongelación y mantener la eficiencia de la transfección después de la nebulización posterior. Se formaron complejos y se mezclaron con las soluciones de aditivo (en agua) para dar como resultado las concentraciones finales de aditivo enumeradas en la Tabla 6.
El diámetro hidrodinámico de las partículas se midió antes de congelar a -20 °C. Después de 16 h, se descongelaron todas las formulaciones y se midió de nuevo el tamaño de partícula. El % de desviación del tamaño antes de congelarfrente adespués de descongelar se muestran en la Tabla 6b. Los números altos indican un gran aumento de tamaño y, por lo tanto, agregación.
Tabla 6A: Tamaño estándar de un complejo recién preparado en agua. Medición por triplicado con ZetaSizer Nano ZS (Malvern)
Tabla 6b: % de desviación del tamaño antes de la congelaciónversusdespués de la descongelación de las concentraciones de aditivo probadas.
El 2-metil-1,4-butanodiol y el Pentaeritritol se probaron a concentraciones reducidas, debido a su limitada solubilidad en agua, n = 1.
*ejemplos de referencia
Un cambio en el tamaño de partícula de más del 100%(100% =diámetro doble) se definió como un proceso de agregación. Los aditivos que resultan en una desviación de tamaño porcentual por debajo de este umbral se seleccionaron para probarlos mediante nebulización en ratones (Figura 3 y Tabla 7).
La Figura 3 muestra la eficiencia de transfecciónen vivode formulaciones de brPEI/ARNm después de un ciclo de congelación-descongelación.
Se nebulizaron a ratones con 2 mg/8 ml de ARNm de FLuc complejado con brPEI 25 kDa a N/P 10 y 0,25 mg/ml después de un ciclo de congelación-descongelación en presencia de los aditivos indicados. 24 h después del tratamiento, se anestesiaron los ratones, se explantaron los pulmones, se homogeneizaron y se midió la actividad luciferasa. n = 3.
Tabla 7: Los datos tabulados de la Figura 3 incluyen datos de bioluminiscencia.
*ejemplos de referencia
Discusión y Conclusión
Dentro de este estudio, se pudo demostrar que los alcanoles/alcanodioles relacionados estructuralmente con el 1,2-propanodiol tienen la capacidad de mantener la eficiencia de la transfección del complejo después de la nebulización a los pulmones murinos, después de un ciclo de congelación-descongelación. Las propiedades biofísicas se analizaron primero antes de la congelación y después de un ciclo de congelación-descongelación, ya que la agregación o la rotura de partículas conducen a formulaciones no funcionales. Los hallazgos del ejemplo I podrían replicarse ya que el 1,2-propanodiol y el glicerol preservan el tamaño de partícula. Como ya se demostró en el estudio anterior, la preservación del tamaño de partícula no resultó automáticamente en partículas funcionales después de la nebulización en ratones.
Ejemplo III: Congelación de formulaciones a concentraciones variables de ARNm y/o relaciones N/P variables.
Formación del complejo
Complejos de (polietilenimina) ramificada (brPEI), P7 (lineal (polietilenimina-co-propilenimina), PM: 20 kDa) o P12 lineal (polietilenimina-co-propilenimina), PM: 24 kDa) con ARNm que codifica luciferasa se formaron a una concentración de 0,25 mg/ml. En un procedimiento de mezcla estándar, el ARNm se diluyó a una concentración de 0,5 mg/ml en agua. Se preparó el mismo volumen de la solución del polímero a una concentración de 0,65 mg/ml en agua. Para formular las nanopartículas, se inyectó la solución de ARNm en la solución de brPEI, seguido de mezclarlos con el uso de una pipeta electrónica (Mettler-Toledo, E4 LTS 1000<j>L). Después de mezclar, los complejos se incubaron durante 20 min en hielo antes de su uso.
Concentración de las formulaciones
Antes de su uso, la membrana de una unidad de filtro de centrifugación Amicon® Ultra-15 (Merck Millipore, membrana PLHK Ultracel-PL, límite de peso molecular de 100 kDa) se lavó con 15 ml de agua (500 * g). Luego, la formulación de poliplex se transfirió a la unidad de filtrado y se centrifugó a 500 x g y 4 °C. En un intervalo de 5 min., se verificó el nivel de líquido para evitar la sobreconcentración y la solución se mezcló completamente con una pipeta de 1 ml. En cada intervalo, se controló la concentración de la muestra mediante evaluación espectrofotométrica de la concentración de ácido nucleico (A<260>). Este proceso se repitió hasta alcanzar la concentración deseada.
Mediciones de tamaño
Para la determinación del diámetro de las partículas, se llenaron 200 j L de una suspensión de las partículas en una cubeta (Brand, UV-cuvette Micro) y se midieron usando un Malvern ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments), lo que da los diámetros hidrodinámicos y el diámetro hidrodinámico promedio (promedio z) en nm. Como medio de suspensión, se usó agua o agua que contiene un aditivo crioprotector, como se indica.
Desafío de congelación-descongelación
Después de una determinación inicial del tamaño del poliplex (Malvern Zetasizer NanoZS), la formulación se distribuye en placas de PCR de bajo perfil de 96 pocillos (transparente, libre de ARNasa y ADNasa) y se diluye 1:2 con soluciones de aditivo 2X (20/10/2%) (Tabla 1). Se usó una muestra de cada formulación resultante para la determinación del tamaño (Malvern Zetasizer NanoZS). Las muestras restantes se congelaron a -20 ° C durante ~ 16 h, se descongelaron a TA y se almacenaron inmediatamente en hielo antes de que las soluciones alcanzaran TA. Luego se usó una muestra de cada formulación descongelada para la determinación del tamaño (Malvern Zetasizer NanoZS) y se comparó con respecto al % de desviación de tamaño de las formulaciones, antes de congelar y después de descongelar, de acuerdo con la siguiente ecuación, en la que dh indica el diámetro promedio de partículas z:
Resultados
En este experimento se pudo demostrar la capacidad de la clase reivindicada de las moléculas identificadas para actuar como crioprotector para nanopartículas o micropartículas, también a una mayor concentración de ARNm y/o una relación N/P reducida. Para ello, se eligió el 1,2-propanodiol como aditivo representativo. La Tabla 8 muestra el % de desviación del tamaño de partícula antes de la congelaciónfrente adespués de la descongelación de complejos congelados a diferentes concentraciones de ARNm (0,25, 1,1 o 2,3 mg/mL) y diferentes relaciones N/P (N/P 4 o 10). Las relaciones en peso de ARNm/polímero/1,2-propanodiol empleadas se indican en la Tabla 9.
Tabla 8:%de desviación de tamaño antes de la congelación versus después de la descongelación, n = 3.
Los datos muestran que todas las condiciones probadas condujeron a evitar la agregación al usar el aditivo.
Tabla 9: Relaciones en peso en el experimento anterior de ARNm/polímero/1,2-propanodiol.
Discusión y Conclusión
El Ejemplo III demuestra que el tamaño de partícula se puede mantener independientemente de la relación de polímero a ARNm, así como de la concentración de ARNm durante la congelación.
Ejemplo IV: Carácter crioprotector de aditivos identificados para diferentes policationes (adición antes de mezclar)
Formación del complejo
Se formaron complejos de polímero catiónico y de ARNm que codifica la luciferasa mediante el uso de tres estructuras poliméricas diferentes: poli(etilenimina) ramificada (brPEI, 25 kDa), poli(etilenimina-propilenimina) lineal (P7, 20 kDa) o poli(etilenimina-propilenimina) lineal. (P12, 24 kDa).
P7 y P12 son polímeros lineales de poli(etilenimina-propilenimina) de la siguiente estructura:
Síntesis:
Se combinó una mezcla de 2-etil-2-oxazolina seca y 2-etil-2-oxazina seca con triflato de metilo en acetonitrilo. La polimerización se llevó a cabo durante 30 h a 130 °C bajo atmósfera de nitrógeno. La polimerización se detuvo mediante la adición de agua e incubación durante 3 h a 130 °C. El polímero se obtuvo mediante tres etapas de precipitación en éter dietílico frío. Para la hidrólisis, el polímero se disolvió en ácido clorhídrico concentrado y se incubó durante 30 h a 130 °C. El pH de la solución de polímero se ajustó a pH 10 con NaOH. La purificación se realizó mediante diálisis contra agua desionizada seguida de liofilización. Mediante la modificación de la relación de 2-etil-2-oxazolina a 2-etil-2-oxazina, la relación de etilenimina (C2) a propilenimina (C3) resultante se puede modificar dentro del polímero. Con la cantidad usada de triflato de metilo se puede controlar el peso molecular.
Los polímeros resultantes tenían las siguientes propiedades:
Los complejos se mezclaron a una concentración final de 0,25 mg/ml en las tres relaciones N/P diferentes 4,<6>y 10. En un procedimiento de mezcla estándar, el ARNm se diluyó en agua hasta una concentración de 0,5 mg/ml. Se preparó el mismo volumen de solución de polímero (ver la concentración en la Tabla 10) en agua que contiene 1,2-propanodiol al 20 % o al 10 % (p/v). Las nanopartículas se formaron mediante la inyección de la solución de ARNm en la solución de polímero, seguido de mezclarlos con el uso de una pipeta electrónica (Mettler-Toledo, E4 LTS 1.000 |jL). Después de mezclar, los complejos se incubaron durante 20 minutos en hielo antes de su uso.
Tabla 10: Concentración de las soluciones de polímero para la preparación de complejos en diferentes proporciones N/P
Mediciones de tamaño
Para la determinación del diámetro de las partículas, se llenaron 100 jL de una suspensión de las partículas en una cubeta (Brand, UV-cuvette Micro) y se midieron usando un Malvern ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments), lo que da los diámetros hidrodinámicos y el diámetro hidrodinámico promedio (promedio z) en nm. Como medio de suspensión, se usó agua o agua que contiene un aditivo crioprotector, como se indica.
Desafío de congelación-descongelación
Se usó una muestra de cada formulación resultante para la determinación del tamaño (Malvern Zetasizer NanoZS). Las muestras restantes se congelaron a -20 °C durante 16 h, se descongelaron a TA y se almacenaron inmediatamente en hielo antes de que las soluciones alcanzaran TA. Luego, se usó una muestra de cada formulación descongelada para la determinación del tamaño (Malvern Zetasizer NanoZS) y se comparó con respecto al % de desviación del tamaño de las formulaciones antes de congelar y después de descongelar, de acuerdo con la siguiente ecuación:
/ (después de congelación) \
desviación de tamaño [%] =w /t (—ant1es de..c..o.n..ge;l"a"c7ió7n\)~ 1/) * 100 %
Preparación de muestras para experimentos in vivo:
Los complejos se prepararon como se describe en "formación de complejos" y "desafío de congelacióndescongelación" a<n>/<p>4 en un volumen de<8>ml. Las muestras se mantuvieron congeladas hasta su nebulización a los animales
Nebulización
Los animales se colocaron en una cámara de dosificación en masa de tamaño pequeño Buxco (Data Sciences International, Alemania). Las formulaciones se descongelaron a temperatura ambiente, se colocaron en hielo triturado antes de alcanzar la temperatura ambiente y luego se nebulizaron usando un nebulizador Aeroneb Solo (Aeroneb, Alemania), a una velocidad de circulación de aire de 3 L/min y un ciclo de trabajo del 100 %.
Medición de bioluminiscencia en pulmones explantados
24 h después de la aplicación, los animales se colocaron bajo anestesia completa mediante inyección intraperitoneal de Fentanilo/Midazolam/Medetomidina (0,05/5,0/0,5 mg/kg de peso corporal). Se aplicaron 50 jL de D-Luciferina (30 mg/ml disueltos en solución salina tamponada con fosfato, pH 7) a través de la vía de inhalación (inhalación de la solución después de que se aplicó directamente en las fosas nasales) y se aplicaron 100 jL de D-Luciferina sistémicamente mediante inyección intraperitoneal.<10>minutos después de la administración de la luciferina, los ratones se sacrificaron a través de dislocación cervical. Después de la perfusión con PBS a través del corazón derecho, se explantaron los pulmones. La bioluminiscencia se midió usando un Xenogen MS Luminar XR (Caliper LifeSciences) con un binning fijado en 8 y un tiempo de exposición de 5 min. La bioluminiscencia se cuantificó y analizó con el uso del Living Image Software 4.4 (Xenogen). En el caso de imágenes sobresaturadas (detección de expresión fuera del intervalo lineal), el tiempo de exposición se redujo a 1 min. La bioluminiscencia se midió como flujo total por órgano (en fotones/seg). Para el análisis solo se usaron imágenes sin sobresaturación. Los pulmones se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C.
Actividad de la luciferasa en pulmones homogeneizados
Los órganos se pesaron y la mitad de los pulmones explantados se homogeneizaron en tampón de lisis usando un homogeneizador FastPrep° -24 (MP Biomedicals). El luminómetro Lumat LB 9507 (Berthold Technologies) añadió automáticamente 100 pL de tampón de luciferina a 75 pL de lisados centrifugados. La actividad de la luciferasa se midió en RLU/s y se convirtió en RLU/órgano.
Resultados
Los ejemplos I - III demuestran la eficiencia de los aditivos en la prevención de la agregación mientras se mantiene la eficaciain vivoen diferentes condiciones, únicamente con partículas formadas con poli(etilenimina) ramificada. Para demostrar que la funcionalidad de estos aditivos es independiente de las características del polímero, se probaron diferentes tipos de polímeros. El 1,2-propanodiol fue seleccionado como un aditivo ejemplar. Los polímeros se variaron en el tipo de ramificación (ramificada y lineal), peso molecular (20 kDa, 24 kDa y 25 kDa), composición de monómeros (poli(etilenimina) y poli (etilenimina-propilenimina)), así como la relación N/P (4, 6 y 10). Los polímeros elegidos ya tienen una funcionalidad probada después de la nebulización. Los resultados del % de desviación de tamaño de las partículas antes de congelar y después de descongelar, para dos concentraciones de aditivo diferentes, se muestran como desviación del tamaño en la Tabla 10. También se probó la funcionalidad de la relación N/P (N/P 4)in vivo.En la Figura 4 y en la Tabla 13 se ofrece un sumario de los datos de eficiencia. Las relaciones en peso de ARNm/polímero/1,2-propanodiol empleadas se indican en la Tabla 12 y la Tabla 14b.
Tabla 11: % Desviación de tamaño de formulaciones complejas con diferentes polímeros que contienen 5 % o 10 % (p/v) de 1,2-Propanediol antes de la congelación versus después de la descongelación.
Tabla 12: Relaciones en peso en el experimento anterior de ARNm/polímero/1,2-propanodiol.
La Figura 4 muestra la eficiencia de la transfección in vivo de formulaciones concentradas de polímero/ARNm. Se nebulizaron a ratones con 2 mg de ARNm que codifica para luciferasa de luciérnaga complejado con brPEI 25 kDa/P7/P12 a N/P 4, después de una preparación fresca (0,25 mg/ml de ARNm; 8 ml/grupo) o un ciclo de congelacióndescongelación (1 mg/ml ARNm; 2 ml/grupo), en presencia de los aditivos indicados. 24 h después del tratamiento, se anestesiaron los ratones y se explantaron los pulmones. Se midió la actividad de la luciferasa en homogeneizados de pulmón, n = 3
Tabla 13: Datos tabulados de la Figura 4.
Tabla 14a: Tamaño estándar de un complejo recién preparado medido con ZetaSizer (Malvern)
Tabla 14b: relaciones en peso en el experimento anterior de ARNm/polímero/1,2-propanodiol.
Discusión y Conclusión
Como se muestra en este experimento, el efecto estabilizador del 1,2-propanodiol es independiente del tipo de ramificación del polímero, del peso molecular, de la composición del monómero y de la relación N/P. La variación de todos estos parámetros dio como resultado complejos intactos después de una prueba de congelación y descongelación. Además, la funcionalidad de estos complejos después de la aplicación pulmonar podría demostrarse en experimentosin vivo.No se pudo detectar diferencia significativa en los complejos frescos en comparación con los mismos complejos congelados en 1,2-propanodiol, al 5 % o al 10 %, con respecto a los niveles de expresión de la proteína indicadora. Las diferencias generales de la eficiencia de la poli(etilenimina) ramificadafrente apoli(etilenimina-propilenimina) está en total acuerdo con la declaración del documento WO2013182683A1. Además, este experimento confirmó que el momento de la adición de aditivos no influye en su funcionalidad. Aunque se añadieron aditivos a las nanopartículas después de la complejación en los experimentos I y II, en este experimento se añadió 1,2-propanodiol a la solución de polímero antes de su mezcla con la solución de ARNm.
EjemploV:Estabilidad de complejos congelados(ejemplo de referencia)
Formación del complejo
Se formaron complejos de (polietilenimina) (brPEI) ramificada y ARNm que codifica la luciferasa a una concentración de 0,25 mg/ml. En un procedimiento de mezcla estándar, el ARNm se diluyó en agua hasta una concentración de 0,5 mg/ml. Se preparó el mismo volumen de solución de brPEI a una concentración de 0,65 mg/ml de agua o 10 % de 1,2-propanodiol. Para formular las nanopartículas, se inyectó la solución de ARNm en la solución de brPEI, seguido de mezclarlos con el uso de una pipeta electrónica (Mettler-Toledo, E4 LTS 1000<j>L). Después de mezclar, los complejos se incubaron durante<20>min en hielo antes de su uso.
Desafío de congelación-descongelación
Después de una determinación inicial del tamaño del poliplex (Malvern Zetasizer NanoZS), se almacenaron triplicados de 100 j L de cada formulación, se congelaron a -20 °C durante el tiempo indicado, se descongelaron a TA y se almacenaron inmediatamente en hielo antes de que las soluciones alcanzaran la TA. Luego se usó una muestra de cada formulación descongelada para la determinación del tamaño (Malvern Zetasizer NanoZS) y se comparó con respecto al % de desviación de tamaño de las formulaciones, antes de congelar y después de descongelar, de acuerdo con la siguiente ecuación, en la que dh indica el diámetro promedio de partículas z:
/dft(después de congelación) \
desviación de tamaño \% \ - [~ r~(,a—nte1s■de.c..o.n..ge;la"c"irórn;)~ 1/) * 100 %
Medición de la integridad del ARNm
Las formulaciones de nanopartículas se diluyeron en agua hasta 0,2 mg/ml de ARNm. Se trataron 5 j L de esta dilución con 3 j L de 40 mg/ml de Heparina, 2 j L de Triton X-100 al 2 % v/v, y 10 j L de formamida. La mezcla se incubó durante 15 min a 70 °C para la rotura completa de las partículas y luego se mantuvo en hielo triturado. A continuación, se realizó el análisis de fragmentos de ácido nucleico mediante electroforesis en gel capilar (Advanced Analytical Fragment Analyzer, PROSize 2.0). La señal de ARNm de longitud completa de las formulaciones tratadas (ARNmtratado) se comparó con el del ARNm fresco, no complejado (ARNmref), del mismo lote que se usó para la formulación como referencia y se expresó como integridad del ARNm [%], de acuerdo con la siguiente fórmula:
Integridad
Resultados
Un parámetro crítico para nanopartículas o micropartículas basadas en ARNm es la estabilidad del ARNm en el complejo. Como se muestra en la Tabla 15, almacenar complejos a 25 °C da como resultado una rápida degradación del ARNm complejado. En este experimento se probó la influencia de la capacidad para congelar los complejos sobre la estabilidad del ARN complejado. En el primer grupo, se formaron complejos con ARN y se congelaron después de la adición de 1,2-propanodiol como ejemplar de candidato del grupo de aditivos de buen desempeño. La integridad del ARNm (cantidad de ARNm de longitud completa) en el complejo se probó antes de la congelación y una semana después del almacenamiento a -20 °C. Se midió el ARNm reciente no complejado y se fijó al 100 % como referencia. Los resultados se resumen en la Tabla 16.
En un segundo grupo, el experimento se repitió después de almacenar los complejos durante ocho semanas a -20 °C. Los resultados se muestran en la Tabla 17.
Tabla 15: Integridad del ARNm en complejos a TA.
Tabla 16: Integridad del ARNm en complejos congelados (5 % de 1,2-propanodiol, -20 °C, 1 semanas) versus poliplexos recién preparados o ARNm fresco.
Tabla 17: Integridad del ARNm en complejos congelados (5 % de 1,2-propanodiol, -20 °C, 8 semanas) frente a ARNm fresco.
Discusión y Conclusión
Los experimentos descritos muestran el gran beneficio de la capacidad de congelar nanopartículas o micropartículas para su almacenamiento a largo plazo. Mientras que los complejos almacenados a temperatura ambiente conducen a un proceso de degradación del ARNm en cuestión de horas, los complejos almacenados en un estado congelado dan como resultado un ARNm completamente conservado durante al menos ocho semanas.
Ejemplo VI: 1,2-Propanodiol como crioprotector para formulaciones a base de lípidos
Formación del complejo
Los componentes lipídicos (lípido catiónico, colesterol lipídico auxiliar y PEG-lípido) se solubilizaron y se mezclaron en isopropanol, y se inyectaron en una proporción volumétrica de 1:4 en una solución de ARNm en tampón citrato (ácido cítrico 10 mM, NaCI 150 mM, pH 4,5), dando como resultado una concentración de ARNm de 0,2 mg/ml. Los complejos se incubaron durante 20 min a TA. Después de la incubación, la solución se dializó contra agua durante 16 h. La concentración del ARNm después de la diálisis fue de 0,13 mg/ml. Para alcanzar una concentración de ARNm de 0,2 o 0,5 mg/ml, las partículas se concentraron en un SpeedVac (Concentrator Plus, Eppendorf) a 45 °C.
Mediciones de tamaño
Para la determinación del diámetro de las partículas, se llenaron 200 pL de una suspensión de las partículas en una cubeta (Brand, UV-cuvette Micro) y se midieron usando un Malvern ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments), lo que da los diámetros hidrodinámicos y el diámetro hidrodinámico promedio (promedio z) en nm. Como medio de suspensión, se usó agua o agua que contiene un aditivo crioprotector, como se indica.
Desafío de congelación-descongelación
Las formulaciones se diluyeron 1:2 con 2X (20 o 10 %) soluciones de 1,2-propanodiol y se dividieron en diferentes muestras. Se usaron muestras de cada formulación resultante para la determinación del tamaño (Malvern Zetasizer NanoZS) en presencia del aditivo. Las muestras restantes se congelaron a -20 °C durante 16 h, se descongelaron a TA y se almacenaron inmediatamente en hielo antes de que las soluciones alcanzaran TA. Luego se usó una muestra de cada formulación descongelada para la determinación del tamaño (Malvern Zetasizer NanoZS) y se comparó con respecto al % de desviación de tamaño de las formulaciones, antes de congelar y después de descongelar, de acuerdo con la siguiente ecuación, en la que dh indica el diámetro promedio de partículas z:
Aplicación de pulverización intratraqueal
Se aplicaron 50 pL de solución del complejo por vía intratraqueal, con el uso de un dispositivo MicroSprayer 1A (PennCentury,<e>E.UU.), bajo anestesia por inhalación de isoflurano.
Medición de bioluminiscencia en pulmones explantados
24 h después de la aplicación, los animales se colocaron bajo anestesia completa mediante inyección intraperitoneal de Fentanilo/Midazolam/Medetomidina (0,05/5,0/0,5 mg/kg de peso corporal). Se aplicaron 50 pL de D-Luciferina (30 mg/ml disueltos en solución salina tamponada con fosfato, pH 7) a través de la vía de inhalación (inhalación de la solución después de que se aplicó directamente en las fosas nasales) y se aplicaron 100 pL de D-Luciferina sistémicamente mediante inyección intraperitoneal.<10>minutos después de la administración de la luciferina, los ratones se sacrificarona través dedislocación cervical. Después de la perfusión con PBS a través del corazón derecho, se explantaron los pulmones. La bioluminiscencia se midió usando un Xenogen IVIS Luminar XR (Caliper LifeSciences) con un binning fijado en<8>y un tiempo de exposición de 5 min. La bioluminiscencia se cuantificó y analizó con el uso del Living Image Software 4.4 (Xenogen). En el caso de imágenes sobresaturadas (detección de expresión fuera del intervalo lineal), el tiempo de exposición se redujo a 1 min. La bioluminiscencia se midió como flujo total por órgano (en fotones/seg). Para el análisis solo se usaron imágenes sin sobresaturación. Los pulmones se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C.
Actividad de la luciferasa en pulmones homogeneizados
Los órganos descongelados se pesaron y la mitad de los pulmones explantados se homogeneizó en tampón de lisis con el uso de un homogeneizador FastPrep° -24 (MP Biomedicals). El luminómetro Lumat LB 9507 (Berthold Technologies) añadió automáticamente 100 pL de tampón de luciferina a 75 pL de lisados centrifugados. La actividad de la luciferasa se midió en RLU/s y se convirtió en RLU/órgano.
Resultados
Este ejemplo demostró la idoneidad de los aditivos definidos en la presente memoria como crioprotectores para complejos basados en lípidos. En una primera etapa, se formaron nanopartículas y se desafiaron con un ciclo de congelación-descongelación en presencia o ausencia de aditivos. El tamaño se midió antes de congelar y después de descongelar. Se eligió el 1,2-propanodiol como representante del grupo de sustancias. El experimento se realizó a diferentes concentraciones de complejo (0,2 y 0,5 mg/mL) así como a diferentes concentraciones de aditivos (5 % y 10 % (p/v)). La diferencia de tamaño se resume en la Tabla 18b.
Tabla 18a: Tamaño estándar de un complejo recién preparado medido con el ZetaSizer Nano ZS (Malvern)
Tabla 18b: Desviación de tamaño en%de diferentes formulaciones de poliplex que contienen 5%o 10%de 1,2-propanodiol antes de la congelación versus después de la descongelación.
Como se muestra en la Tabla 18b, el 1,2-propanodiol estabiliza el tamaño de partícula durante una prueba de congelación-descongelación también para complejos basados en lípidos. Por lo tanto, la eficiencia en la transfección después de la liberación pulmonar se probó en una etapa siguiente. Para este propósito, se aplicó una dosis de 10 pg de ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga a ratones BALB/c mediante inyección de micropulverización en la tráquea. En la Figura 5 y en la Tabla 19 se muestran los resultados de la detección de la proteína producida como medida de la eficiencia de entrega y, por lo tanto, la funcionalidad del vehículo.
La Figura 5 muestra la eficiencia de transfección de nano o micropartículasin vivoa base de lípidos después de la congelación con 1,2-propanodiol.
Los complejos que contienen el ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga se prepararon con o sin
1,2-propanodiol y se aplicaron intratraquealmente a ratonesa través demicropulverización después del almacenamiento a 4 °C o de un ciclo de congelación-descongelación. 24 h después del tratamiento, se anestesió a los ratones y se explantaron los pulmones para medir la actividad de luciferasa, n = 3.
Tabla 19: Datos tabulados de la Figura 5 (incluida la bioluminiscencia en pulmones explantados)
Como se puede observar en la Figura 5 y la Tabla 19, los complejos congelados en presencia de
1,2-propanodiol mantuvieron su funcionalidad completa después de la aplicaciónin vivo.Por lo tanto, el aditivo no influye negativamente en la eficiencia de la transfección.
Discusión y Conclusión
Los datos presentados en este ejemplo muestran que el 1,2-propanodiol no solo permite la congelación de complejos basados en polímeros sino también de complejos basados en lípidos, lo que impide que se agreguen y preserva la actividad in vivo.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Eficiencia de transfección, en células A549, de formulaciones de ARNm N/P 10 de brPEI/FLuc que contienen aditivos
Figura 2: Eficiencia de la transfección in vivo de las formulaciones de brPEI/ARNm, después de un ciclo de congelación-descongelación
Figura 3: Eficiencia de la transfección in vivo de las formulaciones de brPEI/ARNm después de un ciclo de congelacióndescongelación. Línea punteada: 50 % de actividad de la partícula fresca.
Figura 4: Eficiencia de la transfección in vivo de las formulaciones concentradas de polímero/ARNm
Figura 5: Eficiencia de transfección in vivo de nano o micropartículas a base de lípidos después de la congelación en 1,2-propanodiol

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo para formar un aerosol a partir de una composición particulada suspendida en un líquido o para nebulizar tal composición, cuyo dispositivo comprende una composición que comprende
(i) una formulación de nano o micropartículas de un agente terapéuticamente activo que está suspendida en una fase líquida, y
(ii) al menos un aditivo crioprotector seleccionado de alcanos C3-C5 sustituidos por uno o dos grupos hidroxi, en el que el agente terapéuticamente activo es un ácido nucleico.
2. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente terapéuticamente activo es ARNm.
3. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la formulación de nano o micropartículas muestra un diámetro de partículas promedio en el intervalo de 1 a 4.000 nm, con mayor preferencia de 2 a 2.500 nm y con la máxima preferencia de 5 a 1.000 nm.
4. El dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las partículas de la formulación de nano o micropartículas comprenden el ácido nucleico y un excipiente catiónico.
5. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que las partículas de la formulación de partículas comprenden el ácido nucleico en forma de un complejo formado por el ácido nucleico y un oligómero catiónico o un polímero catiónico como el excipiente catiónico.
6. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que las partículas de la formulación de partículas comprenden el ácido nucleico en forma de un complejo formado por el ácido nucleico y un lípido catiónico o un lipidoide catiónico como el excipiente catiónico.
7. El dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el aditivo crioprotector comprende al menos un grupo hidroxi secundario.
8. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el aditivo crioprotector se selecciona de 1,2-propanodiol, 2-propanol, 1,2-butanodiol, y 1,3-butanodiol.
9. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el aditivo crioprotector es 1,2-propanodiol.
10. El dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el aditivo crioprotector está contenido a una concentración de 0,5 a 50 % p/v, con base en el volumen de la fase líquida.
11. El dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el dispositivo es un inhalador seleccionado de un inhalador de dosis medida, un nebulizador y un dispositivo de pulverización nasal.
12. Un aerosol que puede obtenerse mediante el dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Una composición para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad, en la que la composición comprende
(i) una formulación de nano o micropartículas de un agente terapéuticamente activo que está suspendida en una fase líquida, y
(ii) al menos un aditivo crioprotector seleccionado de alcanos C3-C5 sustituidos por uno o dos grupos hidroxi, en la que el agente terapéuticamente activo es un ácido nucleico, y en la que la composición se administra a las vías respiratorias o a través de estas.
14. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en la que la composición es para ser administrada a través de la administración pulmonar o a través de la administración nasal.
ES19718760T 2018-04-25 2019-04-25 Agentes crioprotectores para formulaciones particuladas Active ES2960939T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18169325 2018-04-25
EP18189010 2018-08-14
PCT/EP2019/060646 WO2019207061A1 (en) 2018-04-25 2019-04-25 Cryoprotective agents for particulate formulations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2960939T3 true ES2960939T3 (es) 2024-03-07

Family

ID=66240151

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19718759T Active ES2960936T3 (es) 2018-04-25 2019-04-25 Formulaciones a base de lípidos para el suministro de ARN
ES19718760T Active ES2960939T3 (es) 2018-04-25 2019-04-25 Agentes crioprotectores para formulaciones particuladas

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19718759T Active ES2960936T3 (es) 2018-04-25 2019-04-25 Formulaciones a base de lípidos para el suministro de ARN

Country Status (13)

Country Link
US (2) US20210137840A1 (es)
EP (3) EP4311541A3 (es)
JP (2) JP7256824B2 (es)
KR (2) KR20210022535A (es)
CN (2) CN112153986B (es)
AU (2) AU2019258679B2 (es)
BR (2) BR112020021054A2 (es)
CA (1) CA3098259C (es)
ES (2) ES2960936T3 (es)
MX (2) MX2020011167A (es)
PL (1) PL3784285T3 (es)
WO (2) WO2019207060A1 (es)
ZA (2) ZA202006025B (es)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2795110T3 (es) 2011-06-08 2020-11-20 Translate Bio Inc Lípidos escindibles
RU2013154295A (ru) 2011-06-08 2015-07-20 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. КОМПОЗИЦИИ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ И СПОСОБЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ мРНК
BR112014024131A2 (pt) 2012-03-29 2017-07-25 Shire Human Genetic Therapies lipídios catiônicos ionizáveis
RS57739B1 (sr) 2013-03-14 2018-12-31 Translate Bio Inc Kompozicije cftr irnk i postupci i upotrebe u vezi sa njima
BR112015022505A2 (pt) 2013-03-14 2017-10-24 Shire Human Genetic Therapies avaliação quantitativa para eficiência do cap de rna mensageiro
ES2708562T3 (es) 2013-03-14 2019-04-10 Translate Bio Inc Evaluación cuantitativa de la eficacidad de tapa de ARN mensajero
EP3750903A1 (en) 2013-03-14 2020-12-16 Translate Bio, Inc. Ribonucleic acids with 4'-thio-modified nucleotides and related methods
EP3388834B1 (en) 2013-03-15 2020-04-15 Translate Bio, Inc. Synergistic enhancement of the delivery of nucleic acids via blended formulations
JP6506749B2 (ja) 2013-10-22 2019-04-24 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド フェニルケトン尿症のためのｍＲＮＡ療法
CN106413811A (zh) 2013-10-22 2017-02-15 夏尔人类遗传性治疗公司 精氨基琥珀酸合成酶缺乏症的mrna疗法
ES3032935T3 (en) 2013-10-22 2025-07-29 Translate Bio Inc Lipid formulations for delivery of messenger rna
AU2014340149B2 (en) 2013-10-22 2020-12-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. CNS delivery of mRNA and uses thereof
JP6557722B2 (ja) 2014-05-30 2019-08-07 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド 核酸の送達のための生分解性脂質
JP6767976B2 (ja) 2014-12-05 2020-10-14 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド 関節疾患の治療のためのメッセンジャーｒｎａ治療法
EP3469074B1 (en) 2016-06-13 2020-12-09 Translate Bio, Inc. Messenger rna therapy for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
CA3043033A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Translate Bio, Inc. Improved ice-based lipid nanoparticle formulation for delivery of mrna
CA3054321A1 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
EP3638716B1 (en) 2017-06-12 2022-01-05 Translate Bio, Inc. Poly(phosphoesters) for delivery of nucleic acids
EP3641834B1 (en) 2017-06-19 2023-10-04 Translate Bio, Inc. Messenger rna therapy for the treatment of friedreich's ataxia
US11167043B2 (en) 2017-12-20 2021-11-09 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
US20210137840A1 (en) 2018-04-25 2021-05-13 Ethris Gmbh Lipid-based formulations for the delivery of rna
US11964051B2 (en) 2018-05-16 2024-04-23 Translate Bio, Inc. Ribose cationic lipids
JP7488193B2 (ja) 2018-05-24 2024-05-21 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド チオエステルカチオン性脂質
US12240824B2 (en) 2018-05-30 2025-03-04 Translate Bio, Inc. Vitamin cationic lipids
WO2019232208A1 (en) 2018-05-30 2019-12-05 Translate Bio, Inc. Cationic lipids comprising a steroidal moiety
CA3101454A1 (en) 2018-05-30 2019-12-05 Translate Bio, Inc. Messenger rna vaccines and uses thereof
JP7422977B2 (ja) 2018-07-23 2024-01-29 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａ用乾燥粉末製剤
WO2020035460A1 (en) * 2018-08-14 2020-02-20 Ethris Gmbh Lipid-based formulations containing salts for the delivery of rna
KR102950141B1 (ko) 2018-08-24 2026-04-07 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 전령 rna의 정제 방법
EP3849617A1 (en) 2018-09-14 2021-07-21 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of methylmalonic acidemia
KR20210089648A (ko) 2018-11-08 2021-07-16 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 메신저 rna 정제를 위한 방법 및 조성물
CA3119976A1 (en) 2018-11-21 2020-05-28 Translate Bio, Inc. Cationic lipid compounds
WO2020106946A1 (en) 2018-11-21 2020-05-28 Translate Bio, Inc. TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS BY DELIVERY OF NEBULIZED mRNA ENCODING CFTR
JP2022516356A (ja) 2019-01-07 2022-02-25 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド 原発性線毛機能不全症の治療のための組成物および方法
AU2020275885B2 (en) 2019-05-15 2026-02-05 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
CA3146675A1 (en) 2019-07-23 2021-01-28 Translate Bio, Inc. Stable compositions of mrna-loaded lipid nanoparticles and processes of making
EP4031662A1 (en) 2019-09-20 2022-07-27 Translate Bio, Inc. Mrna encoding engineered cftr
WO2021072172A1 (en) 2019-10-09 2021-04-15 Translate Bio, Inc. Compositions, methods and uses of messenger rna
US20230399390A1 (en) 2019-10-24 2023-12-14 Novago Therapeutics Ag Novel anti-nogo-a antibodies
JP2023508881A (ja) 2019-12-20 2023-03-06 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド Ｍｒｎａ担持脂質ナノ粒子を調製する改善されたプロセス
CN115427021A (zh) 2020-02-25 2022-12-02 翻译生物公司 制备负载mrna的脂质纳米颗粒的改进方法
WO2021226468A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 Translate Bio, Inc. Improved compositions for cftr mrna therapy
US12514932B2 (en) 2020-05-14 2026-01-06 Translate Bio, Inc. PEG lipidoid compounds
US20230242624A1 (en) 2020-06-02 2023-08-03 Neurimmune Ag HUMAN ANTIBODIES AGAINST SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS-2 (SARS-CoV-2)
WO2025056938A1 (en) * 2023-09-11 2025-03-20 BioNTech SE Rna compositions for delivery of incretin agents
WO2022082001A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Translate Bio, Inc. Large scale synthesis of messenger rna
AU2021373892A1 (en) 2020-11-09 2023-07-06 Translate Bio, Inc. Improved compositions for delivery of codon-optimized mrna
WO2023009422A1 (en) * 2021-07-26 2023-02-02 Modernatx, Inc. Processes for preparing lipid nanoparticle compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium
WO2025057088A1 (en) * 2023-09-11 2025-03-20 BioNTech SE Rna compositions for delivery of incretin agents
WO2026006617A1 (en) * 2024-06-27 2026-01-02 Genentech, Inc. Lyophilized and frozen mrna-lnp formulations

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
CA1223831A (en) 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
JPS607932A (ja) * 1983-06-29 1985-01-16 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd リポソーム懸濁液およびその製法
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5840710A (en) 1994-12-09 1998-11-24 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing ester or ether-linked lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
JPH11504631A (ja) 1995-04-25 1999-04-27 バイカル インコーポレイテッド Ｄｎａ／脂質複合体の単一バイアル製剤
US6017700A (en) 1995-08-04 2000-01-25 Bayer Corporation Cationic oligonucleotides, and related methods of synthesis and use
PT1023050E (pt) * 1997-06-27 2013-12-04 Abraxis Bioscience Llc Novas formulações de agentes farmacológicos, métodos para a sua preparação e métodos para a sua utilização
TW520294B (en) 1998-01-08 2003-02-11 Res Dev Foundation Stabilization of lipid: DNA formulations during nebulization
JP2008501336A (ja) * 2004-06-02 2008-01-24 ソースフアーム・インコーポレイテツド Ｒｎａを含有する微小胞およびそのための方法
CN1981044B (zh) * 2004-06-07 2010-05-05 普洛体维生物治疗公司 包封干扰rna的脂质
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
CA2631714C (en) 2005-12-02 2014-09-16 Novartis Ag Nanoparticles for use in immunogenic compositions
NZ569138A (en) 2005-12-15 2012-06-29 Centre Nat Rech Scient Cationic oligonucleotides automated methods for preparing same and their uses
CN101686939B (zh) 2007-04-17 2013-03-27 巴克斯特国际公司 用于肺部投送的核酸微粒
GB0801876D0 (en) * 2008-02-01 2008-03-12 Vectura Group Plc Suspension formulations
JP2012505913A (ja) * 2008-10-16 2012-03-08 マリーナ バイオテック，インコーポレイテッド 遺伝子発現を抑制する治療におけるリポソームによる効率的な送達のプロセスおよび組成物
EP3269395A1 (en) 2008-11-07 2018-01-17 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
CA2769670C (en) 2009-07-31 2018-10-02 Ethris Gmbh Rna with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
EP3296398A1 (en) 2009-12-07 2018-03-21 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
AU2012255194B2 (en) * 2011-05-16 2017-01-05 Danmarks Tekniske Universitet Charge triggering of self-organized nanoparticles
DE19216461T1 (de) 2011-10-03 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
GB201118704D0 (en) * 2011-10-28 2011-12-14 Univ Oxford Cystic fibrosis treatment
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US20150126589A1 (en) 2012-06-08 2015-05-07 Ethris Gmbh Pulmonary Delivery of Messenger RNA
EP3388834B1 (en) * 2013-03-15 2020-04-15 Translate Bio, Inc. Synergistic enhancement of the delivery of nucleic acids via blended formulations
US12064484B2 (en) 2013-06-28 2024-08-20 Ethris Gmbh Compositions for introducing RNA into cells
AU2014348212C1 (en) * 2013-11-18 2018-11-29 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
JP2017507946A (ja) * 2014-02-26 2017-03-23 エスリス ゲーエムベーハーｅｔｈｒｉｓ ＧｍｂＨ Ｒｎａを胃腸内投与するための組成物
JP6637988B2 (ja) 2014-11-18 2020-01-29 アークトゥルス セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｒｎａ送達のためのイオン化可能カチオン性脂質
EP3034539A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Compositions for introducing nucleic acid into cells
JP2018509387A (ja) 2015-01-21 2018-04-05 フェーズアールエックス インコーポレイテッド 細胞に治療および診断剤を送達するための方法、組成物、ならびにシステム
EP3247363A4 (en) * 2015-01-21 2018-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2018010815A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Formulation for administration of rna
US11583504B2 (en) * 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
AU2017357758B2 (en) 2016-11-10 2023-11-16 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing mRNA-loaded lipid nanoparticles
US20210137840A1 (en) * 2018-04-25 2021-05-13 Ethris Gmbh Lipid-based formulations for the delivery of rna
WO2020035460A1 (en) 2018-08-14 2020-02-20 Ethris Gmbh Lipid-based formulations containing salts for the delivery of rna

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021522248A (ja) 2021-08-30
AU2019258678A1 (en) 2020-10-15
US20210137846A1 (en) 2021-05-13
CN112153985A (zh) 2020-12-29
EP3784284C0 (en) 2023-08-02
WO2019207060A1 (en) 2019-10-31
MX2020011167A (es) 2021-02-09
BR112020021037A2 (pt) 2021-01-19
US12465568B2 (en) 2025-11-11
CN112153985B (zh) 2024-03-01
WO2019207061A1 (en) 2019-10-31
AU2019258678B2 (en) 2024-08-22
EP3784284B1 (en) 2023-08-02
EP4311541A2 (en) 2024-01-31
KR20210022535A (ko) 2021-03-03
CN112153986A (zh) 2020-12-29
EP3784285C0 (en) 2023-07-26
BR112020021054A2 (pt) 2021-02-17
MX2020011166A (es) 2022-10-19
AU2019258679A1 (en) 2020-10-15
US20210137840A1 (en) 2021-05-13
PL3784285T3 (pl) 2023-12-18
EP3784284A1 (en) 2021-03-03
EP4311541A3 (en) 2024-02-07
CN112153986B (zh) 2024-02-09
CA3098262A1 (en) 2019-10-31
JP2021522228A (ja) 2021-08-30
ZA202006026B (en) 2024-01-31
AU2019258679B2 (en) 2024-08-15
ZA202006025B (en) 2025-12-17
ES2960936T3 (es) 2024-03-07
CA3098259C (en) 2024-02-20
EP3784285A1 (en) 2021-03-03
JP7256824B2 (ja) 2023-04-12
EP3784285B1 (en) 2023-07-26
CA3098259A1 (en) 2019-10-31
KR20210021943A (ko) 2021-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2960939T3 (es) Agentes crioprotectores para formulaciones particuladas
Shi et al. Chemically modified platforms for better RNA therapeutics
ES2887404T3 (es) Composiciones para introducir ácido nucleico en células
US20240156729A1 (en) Formulations for aerosol formation and aerosols for the delivery of nucleic acid
Mohammad Key considerations in formulation development for gene therapy products
Chen et al. The Hydrophobicity of AIE Dye Facilitates DNA Condensation for Carrier‐Free Gene Therapy
CN120754284A (zh) 一种用于肝脏靶向联合递送CRISPR-Cas9系统和单链DNA修复模板的脂质纳米颗粒
WO2018226975A1 (en) Cationic liquid crystalline nanoparticles
Wang et al. Antisense microRNA185 loaded liposome for efficient inhibition of the hepatic endogenous microRNA185 level
ES2983019T3 (es) Formulaciones a base de lípidos que contienen sales para el suministro de ARN
KR20240072931A (ko) 히스티딘을 포함하는 지질 나노입자 및 그 제조방법
RU2820713C2 (ru) Криопротективные агенты для содержащих частицы составов
CN116159145A (zh) 含七叶皂苷和/或其盐化合物的转染复合物在促转染的应用
CA3098262C (en) Cryoprotective agents for particulate formulations
CN114605338B (zh) 一种含尿嘧啶衍生物的纳米粒、核酸纳米复合物及其制备方法和用途
Grant-Serroukh Lipid nanoparticles for mRNA-mediated cancer therapy
Kelly et al. RNAi in respiratory diseases
WO2024153955A1 (en) Therapeutic compositions and methods
Kwok The challenges and current advances in delivering RNAi as therapeutics
Iemsam-Arng et al. Gene and ribonucleic acid therapy
Jia et al. Long-acting anti-colorectal cancer by nanocomplex co-regulating Bmi1 through miR-218 and siCCAT1
Paulmurugan et al. Nanoparticle-Mediated Small RNA Deliveries for Molecular Therapies
WO2025057230A1 (en) Delivery system and method of preparation thereof
CN121102511A (zh) 一种小核酸药物递送系统及其制备方法和应用