ES2962578T3 - Método y sistema de identificación y cuantificación de una proteína - Google Patents

Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos y sistemas para identificar y/o cuantificar una proteína. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método y sistema de identificación y cuantificación de una proteína

Campo

La invención se refiere en general a un método de cuantificación de una proteína.

Antecedentes

Los productos biofarmacéuticos a base de proteína deben cumplir normas de pureza muy elevadas. Hay varias impurezas relacionadas con el proceso e impurezas relacionadas con el producto que se encuentran en productos biofarmacéuticos. Estas impurezas no tienen propiedades comparables con las del producto deseado con respecto a la actividad, eficacia y seguridad. Un ejemplo es las modificaciones postraduccionales (PTM) de la proteína que afectan profundamente a las propiedades de la proteína relevantes para su aplicación terapéutica. Otro de dichos ejemplos incluye los contaminantes homodiméricos que pueden estar presentes durante la producción de anticuerpo biespecífico que de forma ideal deben retirarse por purificación posterior. Estas impurezas podrían presentan un modo diferente de acción y toxicidad o inmunogenia potencial en comparación con el producto. Además, pueden tener una estabilidad menor que el producto que presenta un mayor riesgo de agregación e inmunogenia. A pesar de los recientes avances, permanece el reto de desarrollar métodos de ensayo de pureza para evaluación cuantitativa de dichas impurezas. Además, un reto clave en el desarrollo de métodos analíticos para anticuerpos biespecíficos puede ser que el método deba detectar de forma precisa y reproducible las impurezas presentes a un nivel de un 2 % o menor con respecto a las especies deseadas principales. Por lo tanto, es importante supervisar y caracterizar dichas impurezas durante diferentes fases de desarrollo y producción de los fármacos. A pesar de la importancia de las impurezas para la función biológica, su estudio a gran escala se ha visto impedido por la ausencia de métodos adecuados.

Los métodos analíticos para ensayos de pureza deben presentar suficiente precisión y resolución para detectar y cuantificar el producto deseado y sus impurezas. La evaluación de las impurezas, tales como PTM en anticuerpos y homodímeros en anticuerpos biespecíficos, puede ser difícil debido a similitudes entre las propiedades estructurales y fisicoquímicas de dichas impurezas y el producto deseado. El análisis directo de dichas impurezas requiere el aislamiento del producto deseado en una cantidad suficientemente grande para el ensayo, lo que es indeseable y posible solamente en casos seleccionados.

Por tanto, hay una necesidad experimentada desde hace tiempo en la técnica de un método y/o sistema para identificar y cuantificar una proteína - impurezas y/o el producto deseado en productos biofarmacéuticos a base de proteína.

Sumario

El crecimiento en el desarrollo, fabricación y venta de productos biofarmacéuticos a base de proteína ha dado lugar a una demanda creciente de un método y/o sistema para la identificación y cuantificación de impurezas en los productos.

Las realizaciones divulgadas en este documento satisfacen las demandas mencionadas anteriormente al proporcionar métodos para la rápida caracterización de proteínas.

La invención, como se define en las reivindicaciones, proporciona un método para cuantificar una impureza en una muestra.

El método comprende poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional que provoca la separación en modo mixto, lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil para proporcionar un eluyente que incluye la impureza, y cuantificar una cantidad de la impureza en el eluyente usando un espectrómetro de masas, en donde el espectrómetro de masas está acoplado al sistema cromatográfico.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza en una muestra puede comprender poner en contacto dicha muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad de interacción hidrófoba.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza en una muestra puede comprender poner en contacto dicha muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad de interacción entre cargas.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza en una muestra puede comprender poner en contacto de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 100 pg de una muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil que puede ser compatible con un espectrómetro de masas.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil, en donde la fase móvil puede seleccionarse de acetato de amonio, bicarbonato de amonio o formiato de amonio, o combinaciones de los mismos.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil que contiene hasta 600 mM de concentración de sal total.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil con un caudal de 0,2 ml/min a 0,4 ml/min.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la impureza puede ser una impureza relacionada con el producto.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la impureza puede ser una impureza relacionada con el proceso.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la impureza puede ser un producto de degradación de una proteína.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la impureza puede ser un producto de digestión de una proteína.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la impureza puede ser una especie homodimérica de un producto de anticuerpo multiespecífico.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la impureza puede ser una modificación postraduccional de una proteína.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza puede comprender cuantificar una cantidad de la impureza en dicho eluyente usando un espectrómetro de masas, en donde el espectrómetro de masas puede ser un espectrómetro de masas en tándem.

En un aspecto de esta realización, el método para cuantificar una impureza puede comprender cuantificar una cantidad de la impureza en dicho eluyente usando un espectrómetro de masas, en donde el espectrómetro de masas puede ser un espectrómetro de masas natural.

Esta divulgación, al menos en parte, proporciona un método para detectar una impureza en una muestra.

El método puede comprenden poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil para proporcionar un eluyente que incluye la impureza, y cuantificar una cantidad de la impureza en el eluyente usando un espectrómetro de masas.

El método para detectar una impureza en una muestra puede comprender poner en contacto dicha muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad de interacción hidrófoba.

El método para detectar una impureza en una muestra puede comprender poner en contacto dicha muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad de interacción entre cargas.

El método para detectar una impureza en una muestra puede comprender poner en contacto de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 100 pg de una muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional.

El método para detectar una impureza en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil para proporcionar un eluyente que incluye la impureza.

El método para detectar una impureza en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil que puede ser compatible con un espectrómetro de masas.

El método para detectar una impureza en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil, en donde la fase móvil puede seleccionarse de acetato de amonio, bicarbonato de amonio o formiato de amonio, o combinaciones de los mismos.

El método para detectar una impureza en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil que contiene hasta 600 mM de concentración de sal total.

El método para detectar una impureza en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil con un caudal de 0,2 ml/min a 0,4 ml/min.

El método para detectar una impureza puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la impureza puede ser una impureza relacionada con el producto.

El método para detectar una impureza puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la impureza puede ser una impureza relacionada con el proceso.

El método para detectar una impureza puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la impureza puede ser un producto de degradación de una proteína.

El método para detectar una impureza puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la impureza puede ser un producto de digestión de una proteína.

El método para detectar una impureza puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la impureza puede ser una especie homodimérica de un producto de anticuerpo multiespecífico.

El método para detectar una impureza puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la impureza puede ser una modificación postraduccional de una proteína.

El método para detectar una impureza puede comprender detectar una cantidad de la impureza en el eluyente usando un espectrómetro de masas, en donde el espectrómetro de masas puede ser un espectrómetro de masas en tándem.

El método para detectar una impureza puede comprender detectar una cantidad de la impureza en dicho eluyente usando un espectrómetro de masas, en donde el espectrómetro de masas puede ser un espectrómetro de masas natural.

Esta divulgación, al menos en parte, proporciona un método para detectar y/o cuantificar una proteína diana en una muestra.

El método puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil para proporcionar un eluyente que incluye la proteína diana, y detectar y/o cuantificar una cantidad de la proteína diana en el eluyente usando un espectrómetro de masas.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana en una muestra puede comprender poner en contacto dicha muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad de interacción hidrófoba.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana en una muestra puede comprender poner en contacto dicha muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad de interacción entre cargas.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana en una muestra puede comprender poner en contacto de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 100 pg de una muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil para proporcionar un eluyente que incluye la impureza.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil que puede ser compatible con un espectrómetro de masas. En un aspecto específico, el método para detectar y/o cuantificar una proteína diana en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil, en donde la fase móvil puede seleccionarse de acetato de amonio, bicarbonato de amonio o formiato de amonio, o combinaciones de los mismos. En otro aspecto específico, el método para detectar y/o cuantificar una proteína diana en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil que contiene hasta 600 mM de concentración de sal total.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana en una muestra puede comprender lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil con un caudal de 0,2 ml/min a 0,4 ml/min.

El método para detectar una y/o cuantificar una proteína diana puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la proteína diana puede ser un anticuerpo.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la proteína diana puede ser un anticuerpo biespecífico.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la proteína diana puede ser una proteína terapéutica.

El método para detectar una y/o cuantificar una proteína diana puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la proteína diana puede ser una impureza.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la proteína diana puede ser una impureza relacionada con el proceso de un proceso biofarmacéutico de fabricación de una proteína.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la proteína diana puede ser una impureza relacionada con el producto de un proceso biofarmacéutico de fabricación de una proteína.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la proteína diana puede ser un producto de degradación de una proteína.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la proteína diana puede ser un producto de digestión de una proteína.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana puede comprender poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la proteína diana puede ser una especie homodimérica de un producto de anticuerpo multiespecífico.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana puede comprender cuantificar una cantidad de la proteína diana en dicho eluyente usando un espectrómetro de masas, en donde el espectrómetro de masas puede ser un espectrómetro de masas en tándem.

El método para detectar y/o cuantificar una proteína diana puede comprender cuantificar una cantidad de la proteína diana en dicho eluyente usando un espectrómetro de masas, en donde el espectrómetro de masas puede ser un espectrómetro de masas natural.

Esta divulgación, al menos en parte, proporciona una columna cromatográfica de sistema cromatográfico en modo mixto que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional y un espectrómetro de masas.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede comprender una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con funcionalidad de interacción hidrófoba.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede comprender una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con funcionalidad de interacción entre cargas.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede comprender una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional que puede usarse para elución de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 100 pg de una muestra.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede comprender una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto que puede recibir una fase móvil.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede comprender una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto que puede además recibir una muestra que tiene una proteína diana.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede comprender una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto que puede lavarse con una fase móvil.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede comprender un espectrómetro de masas acoplado a una columna cromatográfica que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede comprender un espectrómetro de masas en tándem.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede comprender un espectrómetro natural.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede comprender una columna cromatográfica que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto puede ser compatible con una fase móvil seleccionada de acetato de amonio, bicarbonato de amonio o formiato de amonio, o combinaciones de los mismos.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede comprender una columna cromatográfica que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto puede lavarse usando una fase móvil que contiene hasta 600 mM de concentración de sal total.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede comprender una columna cromatográfica que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional, en donde la columna cromatográfica puede lavarse con una fase móvil con un caudal de 0,2 ml/min a 0,4 ml/min.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa un ejemplo de un sistema usado para cuantificar y/o detectar una proteína usando cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico.

La figura 2 representa un intento por purificar un anticuerpo biespecífico de especies homodiméricas usando una realización ejemplar.

La figura 3 muestra la serie Hofmeister que muestra el efecto de aniones y cationes sobre la precipitación de proteínas (o que promueve la interacción hidrófoba).

La figura 4 muestra un sistema de espectrometría de masas por cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 5 muestra los diagramas del tiempo de retención de ocho mAb en la mezcla de muestra en la columna de SEC BEH200 ejecutada a concentraciones de fase móvil que varían de 30 mM a 300 mM, en donde los dos recuadros representan los cromatogramas de pico base (BPC) del análisis de MM-SEC-MS de los ocho mAb a las correspondientes concentraciones de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 6 muestra el perfil cromatográfico de la muestra de anticuerpo biespecífico usando un sistema de espectrometría de masas por cromatografía por tamaño en modo mixto ejemplar usando fases móviles: 150 mM de concentración de sal total y 450 mM de concentración de sal total.

La figura 7 muestra el cromatograma de iones extraído (XIC) y los espectros de masas naturales del anticuerpo biespecífico, homodímero 1 y homodímero 2 separados y analizados usando una espectrometría de masas por cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 8 muestra la comparación del cromatograma de iones totales (TIC) y los espectros de MS naturales para RP EC-MS en Lumos, SEC-MS en EMR y MM-SEC-MS en EMR de un anticuerpo detectado por espectrometría de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 9 muestra cromatogramas de iones extraídos (XIC) y los espectros de masas naturales de ciclos consecutivos de detección de MM-SEC-MS de un anticuerpo usando Zenix SEC-300, 3 pm, 300 A, 7,8 x 300 mm de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 10 muestra los cromatogramas de iones extraídos (XIC) obtenidos al realizar la detección de especie homodiméricas en un producto de anticuerpo biespecífico de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 11 muestra la comparación de los cromatogramas de iones extraídos (XIC) obtenidos al realizar la detección de especies homodiméricas en un producto de anticuerpo biespecífico usando Zenix SEC-300, 3 pm, 300 A, 7,8 x 300 mm a caudal de 0,4 ml/min y Zenix SEC-300, 3 pm, 300 A, 4,6 x 300 mm a caudal de 0,3 ml/min de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 12 muestra los cromatogramas de iones extraídos (XIC) obtenidos al realizar análisis de MM-SEC-MS de mezcla desglucosilada de anticuerpo biespecífico, homodímero 1 y homodímero 2 usando fase móvil con diferente concentración salina de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 13 muestra el diagrama de tiempo de retención (minutos) de una proteína frente a la concentración de sal total de la fase móvil para una mezcla desglucosilada de anticuerpo biespecífico, homodímero 1 y homodímero 2 al realizar análisis de MM-SEC-MS de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 14 representa un diagrama que muestra la tendencia en el tiempo de retención en función del cambio de la concentración de sal total al realizar análisis de MM-SEC-MS de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 15 representa un diagrama que muestra una tendencia en la diferencia en el tiempo de retención sobre el cambio de concentración de sal total al realizar análisis de MM-SEC-MS de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 16 muestra los cromatogramas de iones extraídos (XIC) obtenidos al realizar análisis de MM-SEC-MS de mezcla desglucosilada de anticuerpo biespecífico, homodímero 1 y homodímero 2 en columna Waters BEH SEC de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 17 muestra el diagrama de tiempo de retención (minutos) de una proteína frente a la concentración de sal total de la fase móvil para una mezcla desglucosilada de anticuerpo biespecífico, homodímero 1 y homodímero 2 al realizar análisis de MM-SEC-MS en columna Waters BEH SEC de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 18 muestra los cromatogramas de iones extraídos (XIC) obtenidos al realizar análisis de MM-SEC-MS de un anticuerpo y su variante oxidada en columna Waters BEH SEC de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 19 muestra el diagrama de tiempo de retención (minutos) de una proteína frente a la concentración de sal total de la fase móvil para un anticuerpo y su variante oxidada al realizar análisis de MM-SEC-MS en columna Waters BEH SEC de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 20 muestra un método de preparación de muestra de la mezcla que contiene anticuerpo biespecífico y sus especies homodiméricas de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 21 muestra análisis de MM-SEC-MS de mezcla a nivel intacto de anticuerpo biespecífico y sus especies homodiméricas usando fase móvil con 300 mM de concentración de sal de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 22 muestra análisis de MM-SEC-MS de mezcla a nivel subunidad de anticuerpo biespecífico y sus especies homodiméricas usando fase móvil con 70 mM de concentración de sal de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 23 muestra los resultados de cuantificación de homodímero de análisis de MM-SEC-MS a nivel intacto de anticuerpo biespecífico y sus especies homodiméricas de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 24 muestra los resultados de cuantificación de homodímero de análisis de MM-SEC-MS a nivel subunidad de anticuerpo biespecífico y sus especies homodiméricas de acuerdo con una realización ejemplar.

La figura 25 muestra el análisis de mezclas de anticuerpos biespecíficos [cuatro diferentes mezclas de bsAb/homodímero H2L2/homodímero H*2L2] por MM-SEC-MS sobre la columna BEH (izquierda) o la columna Zenix (derecha) realizado de acuerdo con realizaciones ejemplares, en donde cada rastro de BPC representa un análisis individual usando la concentración de sal de fase móvil indicada.

La figura 26 muestra el límite del estudio de detección por MM-SEC-MS para las impurezas homodiméricas en bsAb2 (panel de la izquierda) y bsAb4 (panel de la derecha) usando patrones con adicionales de un 0,01 % y 0,1 %, respectivamente, para análisis realizado de acuerdo con realizaciones ejemplares, en donde los espectros de MS naturales (a, b, c, d, e y f) se promediaron entre las regiones de TIC correspondientes y se mostraron los dos estados de carga más abundantes.

La figura 27 muestra el estudio de cuantificación realizado de acuerdo con realizaciones ejemplares usando homodímeros con adiciones en bsAb2 a relaciones conocidas diluidas en serie (línea gris y valores marcados en el panel de la izquierda) y también se muestran la relaciones medidas de homodímero H2E2 (rojo) y homodímero H*2E2 (azul) con respecto a bsAb2 en función de la intensidad de XIC de los cuatro estados de carga más abundantes en el espectro de masas sin procesar (0,1 % de abundancia relativa de cada homodímero, como un ejemplo mostrado en el panel de la derecha).

Descripción detallada

Las impurezas en los productos biofarmacéuticos pueden provocar cambios que podrían afectar potencialmente a la eficacia, eliminación, seguridad e inmunogenia del producto deseado. Por ejemplo, la oxidación de las cadenas laterales de metionina y triptófano puede afectar a la unión del anticuerpo a receptores de Fc y antígenos (Bertolotti-Ciarletet al.Mol. Immunol. (2009) 46: 1878-1882; Panet al.Protein Sci. (2009) 18: 424-433; Weiet al.Anal. Chem. (2007) 79: 2797-2805; y Wanget al.Mol. Immunol. (2011) 48: 860-866).

Los ensayos tradicionales de pureza de anticuerpos basados en separación tales como métodos basados en electroforesis y cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) carecen de la resolución necesaria para distinguir estas impurezas del producto deseado. El cartografiado de péptidos mediante cromatografía de líquidos en fase inversa (RPLC) acoplada con espectrometría de masas usada para supervisar PTM tiene algunas limitaciones, ya que el proceso de preparación de muestras para RP-LC-MS es largo y, en algunos casos, las condiciones cromatográficas tales como alta temperatura, disolventes orgánicos y pH ácido podrían inducir artefactos de oxidación.

Además, algunos métodos de cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico también pueden usarse para separar impurezas del producto deseado. Las impurezas separadas y el producto deseado pueden analizarse más usando un espectrómetro de masas. Sin embargo, la fase móvil de la columna de cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico no puede inyectarse directamente en el espectrómetro de masas y requiere etapas adicionales incluyendo un cambio en la fase móvil (Véase la figura 1).

Considerando las limitaciones de los métodos existentes, se desarrolló un método eficaz y eficiente para la identificación y cuantificación de impurezas usando un sistema novedoso de espectrometría de masas por cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto como se divulga en este documento. El sistema de espectrometría de masas por cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto mejora la sensibilidad y la capacidad de cuantificar impurezas presentes a niveles muy bajos debido a la separación eficaz en modo mixto y la detección MS en línea sensible, que no puede conseguirse por otros ensayos típicos.

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento en la práctica o ensayo, ahora se describen métodos y materiales particulares.

Debe entenderse que el término “un/o” significa “al menos uno”; y debe entenderse que los términos “alrededor de” y “aproximadamente” permiten la variación convencional como entendería un experto en la materia; y cuando se proporcionan intervalos, se incluyen los valores extremos.

Proteína diana

Se requiere que los productos biofarmacéuticos muestren altos niveles de potencia, pureza y bajo nivel de heterogeneidad estructural. La heterogeneidad estructura a menudo afecta a la bioactividad y eficacia de un fármaco. Por lo tanto, caracterizar y cuantificar la proteína terapéutica y/o las impurezas es importante en el desarrollo de productos farmacéuticos. La heterogeneidad estructural en una proteína puede surgir de modificaciones postraduccionales, así como modificaciones químicas inherentes durante la fabricación y las condiciones de almacenamiento. Para proteínas producidas en la industria biotecnológica, pueden ser necesarias técnicas de separación complementarias tanto para purificar la proteína diana como para dar una imagen precisa de la calidad del producto final. La complejidad del producto elimina el uso de estrategias de separación unidimensionales simples. Por lo tanto, se necesita un método preciso y eficaz de detección y/o cuantificación de la proteína terapéutica y/o las impurezas.

En algunas realizaciones ejemplares, la divulgación proporciona un método para cuantificar y/o detectar una proteína y/o una impureza en una muestra.

Como se usa en este documento, el término “proteína” incluye cualquier polímero de aminoácidos que tenga enlaces amida unidos covalentemente. Las proteínas comprenden una o más cadenas poliméricas de aminoácidos, en general conocidas en la técnica como “polipéptidos”. “Polipéptido” se refiere a un polímero compuesto de residuos aminoacídicos, variantes estructurales de origen natural relacionadas, y análogos de origen no natural sintéticos de los mismos ligados mediante enlaces peptídicos, variantes estructurales de origen natural relacionadas, y análogos de origen no natural sintéticos de los mismos. “Péptidos o polipéptidos sintéticos” se refiere a un péptido o polipéptido de origen no natural. Los péptidos o polipéptidos sintéticos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizados automatizado de polipéptidos. Diversos métodos de síntesis de péptidos en fase sólida son conocidos por los expertos en la materia. Una proteína puede contener uno o múltiples polipéptidos para formar una sola biomolécula funcional. Una proteína puede incluir cualquiera de proteínas bioterapéuticas, proteínas recombinantes usadas en investigación o tratamiento, proteínas de retención y otras proteínas quiméricas de fusión con el receptor de Fc, proteínas quiméricas, anticuerpos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos humanos y anticuerpos biespecíficos. En otro aspecto ejemplar, una proteína puede incluir fragmentos de anticuerpo, nanocuerpos, quimeras de anticuerpo recombinantes, citocinas, quimiocinas, hormonas peptídicas y similares. Las proteínas pueden producirse usando sistemas de producción recombinante basados en células, tales como el sistema de baculovirus en insectos, 9xclusias de levadura (por ejemplo,Pichiasp.), sistemas de mamífero (por ejemplo, células CHO y derivados de CHO como células CHO-K1). Para una revisión reciente que analiza proteínas bioterapéuticas y su producción, véase Ghaderiet al.,“Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation,” (Biotechnol. Genet. Eng. Rev. (2012) 147-75). En algunas realizaciones, las proteínas comprenden modificaciones, aductos y otros restos unidos covalentemente. Esas modificaciones, aductos y restos incluyen, por ejemplo, avidina, estreptavidina, biotina, glucanos (por ejemplo, N-acetilgalactosamina, galactosa, ácido neuramínico, N-acetilglucosamina, fucosa, manosa y otros monosacáridos), PEG, polihistidina, marca FLAG, proteína de unión a maltosa (MBP), proteína de unión a quitina (CBP), glutatión-S-transferasa (GST), epítopo myc, marcadores fluorescentes y otros tintes, y similares. Las proteínas pueden clasificarse en función de las composiciones y la solubilidad y, por tanto, pueden incluir proteínas simples, tales como proteínas globulares y proteínas fibrosas; proteínas conjugadas, tales como nucleoproteínas, glucoproteínas, mucoproteínas, cromoproteínas, fosfoproteínas, metaloproteínas y lipoproteínas; y proteínas derivadas, tales como proteínas derivadas primarias y proteínas derivadas secundarias.

En algunas realizaciones ejemplares, la proteína puede ser un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo multiespecífico, fragmento de anticuerpo, anticuerpo monoclonal o combinaciones de los mismos.

El término “anticuerpo”, como se usa en este documento, incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos ligeras € interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en este documento como HCVR o V<h>) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, C<h>1 , C<h>2 y C<h>3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente memoria como LCVR o V<l>) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio (C<l>1). Las regiones V<h>y V<l>se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones flanqueantes (FR). Cada V<h>y V<l>está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amínico hasta el extremo carboxílico en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-ET-1 grande (o parte de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse de forma natural o artificial. Una secuencia consenso de aminoácidos puede definirse basándose en un análisis de lado a lado de dos o más CDR. El término "anticuerpo”, como se usa en este documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones “parte de unión a antígeno” de un anticuerpo, “fragmento de unión a antígeno” de un antic”erpo y similares, como se usan en este documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintética o genomanipulada que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden derivar, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de genomanipulación recombinantes que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables y opcionalmente constantes de anticuerpo. Dicho ADN es conocido y/o está fácilmente disponible en, por ejemplo, fuentes comerciales, colecciones de<a>D<n>(incluyendo, por ejemplo, colecciones de fagos-anticuerpos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.

Como se usa en este documento, un “fragmento de anticuerpo” incluye una parte de un anticuerpo intacto, tal como, por ejemplo, la región de unión a antígeno o variable de un anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, aunque sin limitación, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento scFv, un fragmento Fv, un diacuerpo dsFv, un fragmento dAb, un fragmento Fd', un fragmento Fd y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, así como triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenarias y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos Fv son la combinación de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, y las proteínas scFv son moléculas polipeptídicas monocatenarias recombinantes en que las regiones variables de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulina están conectadas por un conector peptídico. En algunas realizaciones ejemplares, un fragmento de anticuerpo contiene suficiente secuencia de aminoácidos del anticuerpo precursor del que es un fragmento que se une al mismo antígeno que el anticuerpo precursor; en algunas realizaciones ejemplares, un fragmento que se une al antígeno con una afinidad comparable a la del anticuerpo precursor y/o compite con el anticuerpo precursor por la unión al antígeno. Un fragmento de anticuerpo puede producirse por cualquier medio. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo puede producirse enzimática o químicamente por fragmentación de un anticuerpo intacto y/o puede producirse de forma recombinante a partir de un gen que codifica la secuencia de anticuerpo parcial. Como alternativa o adicionalmente, un fragmento de anticuerpo puede producirse completa o parcialmente de forma sintética. Un fragmento de anticuerpo puede comprender opcionalmente un fragmento de anticuerpo monocatenario. Como alternativa o adicionalmente, un fragmento de anticuerpo puede comprender múltiples cadenas que se unen juntas, por ejemplo, por enlaces disulfuro. Un fragmento de anticuerpo puede comprender opcionalmente un complejo multimolecular. Un fragmento de anticuerpo funcional típicamente comprende al menos aproximadamente 50 aminoácidos y más típicamente comprende al menos aproximadamente 200 aminoácidos.

La expresión “anticuerpo biespecífico” incluye un anticuerpo que puede unirse selectivamente a dos o más epítopos. Los anticuerpos biespecíficos en general comprenden dos cadenas pesadas diferentes, uniéndose específicamente cada cadena pesada a un epítopo diferente - en dos moléculas diferentes (por ejemplo, antígenos) o en la misma molécula (por ejemplo, en el mismo antígeno). Si un anticuerpo biespecífico puede unirse selectivamente a dos epítopos diferentes (un primer epítopo y un segundo epítopo), la afinidad de la primera cadena pesada por el primer epítopo en general será de al menos uno a dos o tres o cuatro órdenes de magnitud menor que la afinidad de la primera cadena pesada por el segundo epítopo, y viceversa. Los epítopos reconocidos por el anticuerpo biespecífico pueden estar en la misma diana o una diana diferente (por ejemplo, en la misma proteína o una diferente). Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse, por ejemplo, combinando cadenas pesadas que reconocen diferentes epítopos del mismo antígeno. Por ejemplo, pueden fusionarse secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias variables de la cadena pesada que reconocen diferentes epítopos del mismo antígeno a secuencias de ácido nucleico que codifican diferentes regiones constantes de la cadena pesada, y dichas secuencias pueden expresarse en una célula que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina. Un anticuerpo biespecífico típico tiene dos cadenas pesadas que tienen cada una tres CDR de la cadena pesada, seguidas de un dominio C<h>1, una bisagra, un dominio C<h>2 y un dominio C<h>3, y una cadena ligera de inmunoglobulina que no confiere especificidad de unión a antígeno, pero que puede asociarse con cada cadena pesada, o que puede asociarse con cada cadena pesada y que puede unirse a uno o más de los epítopos unidos por las regiones de unión a antígeno de la cadena pesada, o que puede asociarse con cada cadena pesada y posibilitar la unión de una o ambas cadenas pesadas a uno o ambos epítopos.

Los bsAb pueden dividirse en dos clases principales, los que portan una región Fc (similar a IgG) y los que carece de una región Fc, siendo normalmente los últimos más pequeños que las moléculas biespecíficas de IgG y similares a IgG que comprenden un Fc. Los bsAb similares a IgG pueden tener diferentes formatos, tales como, aunque sin limitación, triomab, IgG de botón en ojal (kih IgG), crossMab, orth-Fab IgG, Ig de dominios variables dobles (DVD-Ig), Fab dos en uno o de acción doble (dA f ), Fv monocatenario de IgG (IgG-scFv), o KÁ-cuerpos. Los diferentes formatos no similares a IgG incluyen scFv en tándem, formato de diacuerpo, diacuerpo monocatenario, diacuerpos en tándem (TandAb), molécula de redirección de afinidad doble (DART), DART-Fc, nanocuerpos o anticuerpos producidos por el método de acoplar y bloquear (DNL). Fanet al.Y Kontermann y Brinkmann presentan una revisión detallada sobre anticuerpos biespecíficos (Fanet al.“Bispecific antibodies and their applications” J. Hematol. Oncol. (2015) 8:130; Kontermann y Brinkmann. “Bispecific antibodies” Drug Discov. Today (2015) 20: 838-847). Los métodos de producción de bsAb no se limitan a la tecnología de cuadroma basada en la fusión somática de dos líneas celulares diferentes de hibridoma, conjugación química, que implica reticulantes químicos, y estrategias genéticas que utilizan tecnología de ADN recombinante. Ejemplos de bsAb incluyen los divulgados en las siguientes solicitudes de patente: patente de Estados Unidos n.° 8.586.713, presentada el 25 de junio de 2010; publicación de patente de Estados Unidos n.° 2013/0045492, presentada el 5 de junio de 2012; patente de Estados Unidos n.° 9.657.102, presentada el 19 de septiembre de 2013; publicación de patente de Estados Unidos n.° 2016/0024147, presentada el 24 de julio de 2015; publicación de patente de Estados Unidos n.° 2018/0112001, presentada el 22 de septiembre de 2017; publicación de patente de Estados Unidos n.° 2018/0104357, presentada el 22 de septiembre de 2017; publicación de patente de Estados Unidos n.° 2017/0174779, presentada el 21 de diciembre de 2016; publicación de patente de Estados Unidos n.° 2017/0174781, presentada el 21 de diciembre de 2016; patente de Estados Unidos n.° 10.179.819, presentada el 29 de julio de 2016; y publicación de patente de Estados Unidos n.° 2018/0134794, presentada el 15 de noviembre de 2017. Pueden estar presentes niveles bajos de impurezas homodiméricas en varias etapas durante la fabricación de anticuerpos biespecíficos. La detección de dichas impurezas homodiméricas puede ser desafiante cuando se realiza usando análisis de masas intactas debido a las bajas abundancias de las impurezas homodiméricas y la coelución de estas impurezas con especies principales cuando se realiza usando un método cromatográfico de líquidos normal (como se ilustra en la figura 2).

Los anticuerpos biespecíficos terapéuticos (bsAb) pueden unirse simultáneamente a dos dianas distintas y se espera que consigan eficacia terapéutica potenciada al ofrecer funcionalidad doble o mecanismos novedosos de acción (Marie Godaret al., Therapeutic bispecific antibody formats: a patent applications review(1994-2017), 28 EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC PATENTS 251-276 (2018)). Hasta la fecha, se han desarrollado más de 60 moléculas biespecíficas y se han evaluado para tratar diversas enfermedades, de las que muchas de ellas adoptan una arquitectura similar a IgG debido a sus ventajas conocidas (estabilidad, semivida en suero, etc.) en aplicaciones terapéuticas (Christoph Spiess, Qianting Zhai y Paul J. Carter,Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies,67 MOLECULAR IMMUNOLOGY 95-106 (2015); MX Sliwkowski y I Mellman,Antibody therapeutics in cancer.,341 SCIENCE 1192-1198 (2013); Paul J. Carter,Potent antibody therapeutics by design,6 NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY 343-357 (2006)). Los anticuerpos biespecíficos frecuentemente se producen en una sola célula al coexpresar diferentes cadenas ligeras y pesadas. Posteriormente, el ensamblaje de la construcción de bsAb requiere el correcto emparejamiento de cadenas ligeras y pesadas afines, así como heterodimerización de dos semimoléculas diferentes. Desafortunadamente, este proceso también puede provocar la formación de construcciones molecular ensambladas incorrectamente, tales como moléculas monoespecíficas (por ejemplo, especies homodiméricas). A diferencia de otras impurezas, la eliminación de especies homodiméricas a través de purificación posterior puede ser desafiante, ya que a menudo presentan propiedades fisicoquímicas muy similares a los productos de bsAb previstos. Para mejorar la fidelidad del emparejamiento de cadenas polipeptídicas y, por lo tanto, favorecer la formación de bsAb, se han desarrollado diversas estrategias en los últimos años (Shixue Chenet al. Immunoglobulin Gamma-Like Therapeutic Bispecific Antibody Formats for Tumor Therapy,2019 JOURNAL OF IMMUNOLOGY RESEARCH 1-13 (2019)). Por ejemplo, el uso de una cadena ligera idéntica para cada brazo de unión a antígeno de los bsAb ha sido particularmente satisfactorio para evitar el emparejamiento incorrecto entre cadenas ligeras y pesadas (A. Margaret Merchantet al., An efficient route to human bispecific IgG,16 NATURE BIOTECHNOLOGy 677-681 (1998)). Además, la heterodimerización de diferentes cadenas pesadas puede facilitarse enormemente usando el diseño de botones en ojales (John B.b. Ridgway, Leonard G. Presta y Paul Carter,Knobsinto-holes’ engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization,9 “PROTEIN ENGINEERING, DESIGN AND SELECTION” 617-621 (1996)), donde se diseñaron mutaciones específicas en la parte Fc del anticuerpo para favorecer la formación de heterodímeros. Como alternativa, al modular la afinidad de unión a proteína A mediante sustituciones aminoacídicas en la parte Fc, también puede aislarse de forma eficaz un bsAb de impurezas homodiméricas durante la etapa de purificación de proteína A (Adam Zwolaket al., Rapid Purification of Human Bispecific Antibodies via Selective Modulation of Protein A Binding1 SCIENTIFIC REPORTS 15521 (2017)). Esta estrategia ya se ha implementado satisfactoriamente para conseguir la producción en masa de bsAb para respaldar estudios clínicos (Andrew D. Tustianet al., Development of purification processes for fully human bispecific antibodies based upon modification of protein A binding avidity,8 mABS 828-838 (2016)).

Los avances en formatos de bsAb novedosos a través de diseño de proteínas y el desarrollo de procesos han posibilitado la producción a gran escala de bsAb terapéuticos con alta pureza. Sin embargo, la presencia de impurezas homodiméricas de baja abundancia en productos farmacológicos de bsAb aún puede ser posible y tiene que supervisarse rutinariamente durante el desarrollo y en ensayo de liberación. Considerados impurezas relacionadas con el producto, los anticuerpos homodiméricos pueden ser muy similares a los bsAb deseados en muchas propiedades, haciendo de su detección y cuantificación una tarea única y desafiante para las técnicas analíticas actuales. Como las especies homodiméricas habitualmente presentan pesos moleculares distintivos en comparación con los correspondientes bsAb, la medición de la masa a nivel de proteína intacta usando técnicas basadas en LC-MS ha sido el método de elección para su caracterización (R. Jeremy Woodset al., LC-MS characterization andpurity assessment of a prototype bispecific antibody,5 mABS 711-722 (2013); Wolfgang Schaeferet al., Heavy and light chain pairing of bivalent quadroma and knobs-into-holes antibodies analyzed by UHR-ESI-QTOF mass spectrometry,8 mABS 49-55 (2015); Frank D. Macchiet al., Absolute Quantitation of Intact Recombinant Antibody Product Variants Using Mass Spectrometry,87 ANALYTICAL CHEMISTRY 10475-10482 (2015); Luis Schachneret al., Characterization of Chain Pairing Variants of Bispecific IgG Expressed in a Single Host Cell by High-Resolution Native and Denaturing Mass Spectrometry,88 ANALYTICAL CHEMISTRY 12122-12127 (2016); Yiyuan Yinet al., Precise quantification of mixtures of bispecific IgG produced in single host cells by liquid chromatography-Orbitrap high-resolution mass spectrometry,8 mABS 1467-1476 (2016); Chunlei Wanget al., A systematic approach for analysis and characterization of mispairing in bispecific antibodies with asymmetric architecture,10 mABS 1226-1235 (2018); Markus Habergeret al., Rapid characterization of biotherapeuticproteins by size-exclusion chromatography coupled to native mass spectrometry,8 mABS 331-339 (2015); Franqois Debaeneet al., Time Resolved Native Ion-Mobility Mass Spectrometry to Monitor Dynamics of IgG4 Fab Arm Exchange and “Bispecific” Monoclonal Antibody Formation, 85 ANALYTICAL CHEMISTRY 9785-9792 (2013)). Por ejemplo, se ha informado por varios laboratorios de que el uso de cromatografía en fase inversa (RPLC) acoplada a un espectrómetro de masas de alta resolución de precisión de masa (HRAM) cuantifica impurezas homodiméricas en muestras de bsAb (Woodset al.,2013,supra,Schachneret al.,2016,supra;Yinet al.,2016,supra).En la mayoría de estos estudios, las impurezas homodiméricas podrían detectar y cuantificarse sin separación cromatográfica de las especies principales de bsAb. De hecho, considerando el gran tamaño (~150 kDa), así como la similitud en las propiedades fisicoquímicas, a menudo puede ser una tarea desafiante conseguir suficiente separación entre anticuerpos homodiméricos y bsAb usando el método de RPLC. Como resultado, los métodos basados en RPLC-MS frecuentemente carecen de sensibilidad en la detección de especies homodiméricas presentes a niveles bajos (el LLOQ más bajo presentado es ~1 % (Schachneret al.,2016,supra;Yinet al.,2016,supra),en gran medida debido a la supresión de iones de las especies de bsAb que coeluyen y abrumadoramente más abundantes. Además, sin separación cromatográfica, la detección de especies homodiméricas con pesos moleculares cercanos al bsAb puede ser particularmente desafiante, ya que las formas variantes del bsAb de las PTM (por ejemplo, 128 Da para Lys C terminal y 162 para glucación) o formación de aductos, podrían interferir potencialmente con el análisis. Finalmente, en casos donde la separación cromatográfica entre el homodímero y bsAb se consigue por el método de RPLC, la cuantificación basada en MS aún podría estar comprometida por la discrepancia en la eficacia de ionización de los anticuerpos que eluyen a diferentes tiempos de retención dentro de diferentes composiciones de disolvente, lo que requiere generar una curva de calibración externa usando patrones con adiciones cuando se realiza la cuantificación (Risto Kostiainen y Tiina J. Kauppila,Effect of eluent on the ionization process in liquid chromatography-mass spectrometry,1216 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A 685-699 (2009)). Como alternativa, la espectrometría de masas natural representa otra técnica valiosa en el análisis de proteínas intactas y se ha integrado en muchos flujos de trabajo analíticos de rutina para la evaluación de la heterogeneidad de anticuerpos monoclonales (mAb) (Habergeret al.,2016,supra;Sara Rosatiet al., Qualitative and Semiquantitative Analysis of Composite Mixtures of Antibodies by Native Mass Spectrometry,84 ANALYTICAL CHEMISTRY 7227-7232 (2012); Anthony Ehkirchet al., Hyphenation of size 12xclusión chromatography to native ion mobility mass spectrometry for the analytical characterization of therapeutic antibodies and related products,1086 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B 176-183 (2018); Guillaume Terral, Alain Beck y Sarah Cianférani,Insights from native mass spectrometry and ion mobility-mass spectrometry for antibody and antibody-based 12xclusió characterization,1032 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B 79-90 (2016); Oscar Hernandez-Albaet al., Native Mass Spectrometry, Ion Mobility, and Collision-Induced Unfolding for Conformational Characterization of IgG4 Monoclonal Antibodies,90 ANALYTICAL CHEMISTRY 8865-8872 (2018)). A causa de la señal más concentrada generada a partir de estados de menor carga, la MS natural puede tener sensibilidad mejorada sobre RPLC-MS. Por ejemplo, Rosatiet al. (supra)informaron del uso de MS natural para estudiar una mezcla binaria de dos anticuerpos IgG1 coexpresados. Sin embargo, sin separación cromatográfica eficaz, la detección y cuantificación de especies homodiméricas presentes a niveles bajos sigue siendo desafiante por las mismas razones analizadas anteriormente.

Hasta la fecha, ha habido informes limitados sobre métodos analíticos que dependan de la separación cromatográfica para la detección y cuantificación de especies homodiméricas en muestras de bsAb. Por ejemplo, la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) (Wanget al.,2018,supra)o la cromatografía de intercambio iónico (lEX) (A. F. Labrijnet al., Efficient generation of stable bispecific IgGl by controlled Fab-arm 12xclusió,110 PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES 5145-5150 (2013); Michael J Grameret al., Production of stable bispecific IgGl by controlled Fab-arm 12xclusió,5 mABS 962-973 (2013)) han demostrado separar bsAb de sus homodímeros si presentan valores suficientemente diferentes en hidrofobia o punto isoeléctrico (pI), respectivamente. Además, los recientes avances en tecnologías de MS lEX-natural en línea (Yuetian Yanet al., Ultrasensitive Characterization of Charge Heterogeneity of Therapeutic Monoclonal Antibodies Using Strong Cation Exchange Chromatography Coupled to Native Mass Spectrometry,90 ANALYTICAL CHEMISTRY 13013-13020 (2018); Florian Füsslet al., Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies Using Direct Coupled pH Gradient Cation Exchange Chromatography to High-Resolution Native Mass Spectrometry,90 ANALYTICAL c He MISTRY 4669-4676 (2018); Aaron O. Baileyet al., Charge variant native mass spectrometry benefits mass 12xclusión and 12xclusi range ofmonoclonal antibody intact mass analysis,10 mABS 1214-1225 (2018)) proporcionan una estrategia eficaz para la detección sensible de especies homodiméricas de nivel bajo en bsAb. Sin embargo, debido a la alta resolución, lEX habitualmente genera un perfil de cargas complicado para cada anticuerpo en función de su heterogeneidad de cargas, que probablemente solaparán entre sí. Además, la cuantificación basada en MS usando esta estrategia puede ser complicada, ya que todas las formas variantes de carga separadas de cada molécula tienen que sumarse para el cálculo. Además, de forma similar a la estrategia basada en RPLC, el método de lEX utiliza una elución en gradiente, lo que probablemente comprometerá la cuantificación basada en MS debido a la diferente eficacia de ionización de los anticuerpos que eluyen en diferentes condiciones de disolvente (por ejemplo, pH o concentraciones de sal). Recientemente, un método de cromatografía en modo mixto basado en SEC (MM-SEC), que separa los analitos tanto por volumen hidrodinámico como por interacciones hidrófobas con la matriz de la columna, se ha aplicado en el estudio de la heterogeneidad de los anticuerpos (Xiaoyu Yanget al., Analysis andpurification ofIgG4 bispecific antibodies by a mixed-mode chromatography,484 ANALYTiCa L BIOCHEMISTRY 173-179 (2015); Cintyu Wong, Camille Strachan-Mills y Sudhir Burman,Facile method of quantification for oxidized tryptophan degradants of monoclonal antibody by mixed mode ultra performance liquid chromatography,1270 JOURnA l OF CHROMATOGRAPHY A 153-161 (2012); Jorge Alexander Pavonet al., Analysis of monoclonal antibody oxidation by simple mixed mode chromatography,1431 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A 154-165 (2016)). Acoplado a la detección de UV o fluorescencia, el método de MM-SEC se aplicó satisfactoriamente para la cuantificación relativa de especies homodiméricas en una muestra de bsAb (Yanget al.,2015,supra).Sin embargo, está claro que la utilidad de este método puede limitarse a casos donde las especies homodiméricas y de bsAb son suficientemente diferentes en hidrofobia, de modo que puede conseguirse separación basal para cuantificación basada en UV o fluorescencia. Además, como la identificación de especies homodiméricas se basada únicamente en la alineación de tiempos de retención frente a los patrones, siembre había riesgo de sobreestimación de la abundancia relativa si coeluían con las formas oligoméricas o truncadas de la molécula de bsAb.

El concepto de cromatografía en modo mixto usando una columna de SEC se origina por las interacciones secundarias indeseadas entre los analitos proteínicos y la matriz de columna. Idealmente, SEC debe separar los analitos proteínicos únicamente en función de su volumen hidrodinámico. En la práctica, las interacciones electrostáticas, hidrófobas y de enlaces de hidrógeno podrían contribuir todas a la retención y separación de proteínas en diferentes grados, dependiendo de la matriz de columna, las condiciones de tampón y las características de la proteína (Alexandre Goyonet al., Unraveling the mysteries of modem size 13xclusión chromatography - the way to achieve confident characterization of therapeutic proteins,1092 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B 368-378 (2018); Tsutomu Arakawaet al., The critical role of mobile 13xcl composition in size 13xclusión chromatography of protein pharmaceuticals,99 JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES 1674-1692 (2010)). Utilizar estas interacciones secundarias durante la separación por SEC al optimizar apropiadamente las condiciones cromatográficas presenta oportunidades de mejorar la separación de los anticuerpos con volumen hidrodinámico similar, pero diferentes características superficiales (por ejemplo, carga e hidrofobia). Al usar fases móviles compatibles con MS, el acoplamiento en línea de SEC en modo mixto con detección por MS natural (MM-SEC-MS) puede tener muchas ventajas sobre los métodos basados en UV, incluyendo la identificación inequívoca de especies homodiméricas mediante mediciones de masas precisas, interferencia mínima de las especies que coeluyen y requisitos menos rigurosos sobre la resolución cromatográfica (Terralet al.,2016,supra;Goyonet al.,2017,supra).

Como se usa en este documento “anticuerpo multiespecífico” o “Mab” se refiere a un anticuerpo con especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. Aunque dichas moléculas normalmente se unirán solo a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAb), anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos y KIH triespecífico también pueden abordarse por el sistema y método divulgados en este documento.

El término “anticuerpo monoclonal”, como se usa en este documento, no está limitado a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma. Un anticuerpo monoclonal puede derivar de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o fágico, por cualquier medio disponible o conocido en la técnica. Los anticuerpos monoclonales útiles con la presente divulgación pueden prepararse usando una amplia diversidad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de presentación en fagos, o una combinación de las mismas.

Durante muchas fases de producción de compuestos biofarmacéuticos, pueden formarse impurezas. Las impurezas derivadas de biotecnología pueden ser muy difíciles de caracterizar y cuantificar, porque a menudo están presentes a niveles muy bajos, y porque pueden representar especies o mezclas de especies muy complicadas. También puede ser muy difícil obtener un patrón de referencia auténtico de los picos de impurezas. Sin embargo, caracterizar completamente una cantidad vestigial de una proteína de impureza, se convierte en un proceso muy lento, largo y a menudo muy caro. A menudo, la impureza puede incluir variantes, isoformas, productos de degradación, impurezas relacionadas con el producto, relacionadas con el proceso, modificaciones postraduccionales minoritarias, agregados o fragmentos recortados de la proteína recombinante intacta. Hay un número casi infinito de posibles impurezas, de las que la mayoría podrían ser conocidas, pero no todas.

Como se usa en este documento, la expresión “proteína diana” puede incluir el producto deseado o una impureza o ambas.

Como se usa en este documento, la expresión “producto deseado” se refiere a la proteína que tiene la estructura, función o perfil de eficacia deseado.

Como se usa en este documento, el término “ impureza” puede incluir cualquier proteína indeseable presente en el producto biofarmacéutico. La impureza puede incluir impurezas relacionadas con el proceso y el producto. La impureza puede ser además de estructura conocida, parcialmente caracterizada o sin identificar. Las impurezas relacionadas con el proceso pueden derivar del proceso de fabricación y puede incluir las tres categorías principales: derivadas de sustrato celular, derivadas de cultivo celular y derivadas posteriormente. Las impurezas derivadas de sustrato celular incluyen, aunque sin limitación, proteínas derivadas del organismo hospedador y de ácido nucleico (ADN genómico de la célula hospedadora, vector o ADN total). Las impurezas derivadas de cultivo celular incluyen, aunque sin limitación, inductores, antibióticos, suero y otros componentes del medio. Las impurezas derivadas posteriormente incluyen, aunque sin limitación, enzimas, reactivos de procesamiento químico y bioquímico (por ejemplo, bromuro de cianógeno, guanidina, agentes oxidantes y reductores), sales inorgánicas (por ejemplo, metales pesados, arsénico, ion no metálico), disolventes, vehículos, ligandos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales), y otras sustancias lixiviables. Las impurezas relacionadas con el producto (por ejemplo, precursores, determinados productos de degradación) pueden ser variantes moleculares que surgen durante la fabricación y/o almacenamiento, que no tienen propiedades comparables con las del producto deseado con respecto a la actividad, eficacia y seguridad. Dichas variantes pueden necesitar un esfuerzo considerable en aislamiento y caracterización para identificar el tipo de modificación o modificaciones. Las impurezas relacionadas con el producto pueden incluir formas truncadas, formas modificadas y agregados. Las formas truncadas se forman por enzimas hidrolíticas o sustancias químicas que catalizan la escisión de enlaces peptídicos. Las formas modificadas incluyen, aunque sin limitación, formas desamidadas, isomerizadas, con enlaces S-S acoplados incorrectamente, oxidadas o conjugadas alteradas (por ejemplo, glucosilación, fosforilación). Las formas modificadas también pueden incluir cualquier forma de modificación postraduccional. Los agregados incluyen dímeros y múltiplos mayores del producto deseado. (Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, ICH agosto de 1999, U.S. Dept, of Health and Humans Services).

Como se usa en este documento, la expresión general “modificaciones postraduccionales” o “PTM” se refieren a modificaciones covalentes que experimentan los polipéptidos, durante (modificación cotraduccional) o después (modificación postraduccional) su síntesis ribosómica. Las PTM se introducen en general por enzimas específicas o rutas enzimáticas. Muchas se producen en el sitio de una secuencia proteínica característica específica (secuencia distintiva) dentro de la cadena principal proteínica. Se han registrado varios cientos de PTM, y estas modificaciones influyen invariablemente en algún aspecto de la estructura o función de una proteína (Walsh, G. “Proteins” (2014) segunda edición, publicado por Wiley and Sons, Ltd., ISBN: 9780470669853). Las diversas modificaciones postraduccionales incluyen, aunque sin limitación, escisión, extensiones N terminales, degradación proteínica, acilación del extremo N, biotinilación (acilación de residuos de lisina con una biotina), amidación del extremo C, glucosilación, yodación, unión covalente de grupos prostéticos, acetilación (la adición de un grupo acetilo, habitualmente en el extremo N de la proteína), alquilación (la adición de un grupo alquilo (por ejemplo, metilo, etilo, propilo) habitualmente en residuos de lisina o arginina), metilación, adenilación, ADP-ribosilación, reticulaciones covalentes dentro, o entre, cadenas polipeptídicas, sulfonación, prenilación, modificaciones dependientes de vitamina C (hidroxilaciones de prolina y lisina y amidación carboxiterminal), modificación dependiente de vitamina K en donde la vitamina K es un cofactor en la carboxilación de residuos de ácido glutámico que provoca la formación de un<y>-carboxiglutamato (un residuo glu), glutamilación (enlace covalente de residuos de ácido glutámico), glicilación (enlace covalente de residuos de glicina), glucosilación (adición de un grupo glucosilo a asparagina, hidroxilisina, serina o treonina, produciendo una glucoproteína), isoprenilación (adición de un grupo isoprenoide tal como farnesol y geranilgeraniol), lipoilación (unión de una funcionalidad lipoato), fosfopanteteinilación (adición de un resto de 4'-fosfopanteteinilo de coenzima A, como en ácido graso, policétido, péptido no ribosómico y biosíntesis de leucina), fosforilación (adición de un grupo fosfato, habitualmente a serina, tirosina, treonina o histidina), y sulfatación (adición de un grupo sulfato, habitualmente a un residuo de tirosina). Las modificaciones postraduccionales que cambian la naturaleza química de los aminoácidos incluyen, aunque sin limitación, citrulinación (la conversión de arginina en citrulina por desiminación), y desamidación (la conversión de glutamina en ácido glutámico o asparagina en ácido aspártico). Las modificaciones postraduccionales que implican cambios estructurales incluyen, aunque sin limitación, formación de puentes disulfuro (enlace covalente de dos aminoácidos cisteína) y escisión proteolítica (escisión de una proteína en un enlace peptídico). Determinadas modificaciones postraduccionales implican la adición de otras proteínas o péptidos, tal como ISGilación (enlace covalente a la proteína ISG15 (gen estimulado por interferón)), SUMOilación (enlace covalente a la proteína SUMO (modificador pequeño relacionado con ubicuitina)) y ubicuitinación (enlace covalente a la proteína ubicuitina). Véase http://www.uniprot.org/docs/ptmlist para un vocabulario controlado más detallado de PTM seleccionadas por UniProt.

Cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto

Como se usa en este documento, el término "cromatografía" se refiere a un proceso en que una mezcla química portada por un líquido o gas puede separarse en componentes como resultado de la distribución diferencial de las entidades químicas según fluyen alrededor o sobre un líquido estacionario o fase sólida.

Como se usa en este documento, la expresión "cromatografía en modo mixto (MMC)" o "cromatografía multimodal" incluye un método cromatográfico en que los solutos interactúan con la fase estacionaria a través de más de un modo o mecanismo de interacción. La MMC puede usarse como herramienta alternativa o complementaria a la cromatografía tradicional en fase inversa (RP), de intercambio iónico (lEX) y en fase normal (NP). A diferencia de la cromatografía RP, NP e lEX, en que la interacción hidrófoba, la interacción hidrófila y la interacción iónica, respectivamente, son los modos de interacción dominantes, la cromatografía en modo mixto puede emplear una combinación de dos o más de estos modos de interacción. Los medios de cromatografía en modo mixto pueden proporcionar selectividad única que no puede reproducirse por cromatografía en modo único. La cromatografía en modo mixto también puede proporcionar ahorros potenciales en los costes y flexibilidad de funcionamiento en comparación con los métodos basados en afinidad.

La expresión "cromatografía de exclusión por tamaño" o "SEC" o "filtración en gel" incluye una técnica cromatográfica en columna de líquido que puede clasificar las moléculas de acuerdo con su tamaño en solución.

Como se usa en este documento, las expresiones "resina de cromatografía SEC" o "medios de cromatografía SEC" se usan indistintamente en este documento y pueden incluir cualquier tipo de fase sólida usada en SEC, que separa la impureza del producto deseado (por ejemplo, un contaminante homodimérico para un producto de anticuerpo biespecífico). El volumen de la resina, la longitud y diámetro de la columna a usar, así como la capacidad dinámica y el caudal pueden depender de varios parámetros tales como el volumen de fluido a tratar, la concentración de proteína en el fluido a someter al proceso de la invención, etc. La determinación de estos parámetros para cada etapa pertenece a las habilidades normales de los expertos en la materia.

Como se usa en este documento, la expresión "cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto" o "MM-SEC" puede incluir cualquier método cromatográfico que separe las proteínas a través de una interacción adicional distinta de la separación basada en su tamaño. La interacción adicional o secundaria puede explotar uno o más de los siguientes mecanismos: intercambio aniónico, intercambio catiónico, interacción hidrófoba, interacción hidrófila, interacción entre cargas, enlaces de hidrógeno, unión pi-pi y afinidad por metales. La resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto puede referirse a cualquier tipo de fase sólida usada para la separación por MM-SEC. Ejemplos no limitantes son Sepax Zenix SEC-300, Waters Be H 300 o Agilent Bio SEC-3.

Como se usa en este documento, la expresión "funcionalidad hidrófoba" se refiere a la interacción hidrófoba de la proteína con la resina cromatográfica de SEC como interacción secundaria. La funcionalidad hidrófoba también puede impactar significativamente sobre la forma del pico, lo que puede tener un efecto pronunciado sobre la capacidad resolutiva del proceso. Las interacciones hidrófobas son las más fuertes a la alta fuerza iónica de la fase móvil. Para seleccionar una fase móvil que incluya funcionalidad hidrófoba en una resina, pueden disponerse diversos iones en una denominada serie solúfoba dependiendo de si promueven interacciones hidrófobas (efectos de desalado) o alteran la estructura del agua (efecto caótropo) y dan lugar al debilitamiento de la interacción hidrófoba (como se ilustra en la figura 3). Los cationes se clasifican en términos de efecto de desalado creciente como Ba++; Ca++; Mg++; Li+; Cs+; Na+; K+; Rb+; NH4+, mientras que los aniones pueden clasificarse en términos de efecto caótropo creciente como PO-; SO4"; CH3CO2'; Cl-; Br; NO3"; ClO4-; I-; SCN-. En general, los sulfatos de Na, K o NH4 promueven de forma eficaz la interacción de ligando-proteína en HIC. Pueden formularse sales que influyen en la fuerza de la interacción dada por la siguiente relación:

(NH4)2SO4>Na2SO4>NaCl>NH4Cl>NaBr>NaSCN.

Espectrometría de masas

Como se usa en este documento, la expresión "espectrómetro de masas" incluye un dispositivo que puede detectar especies moleculares específicas y medir sus masas precisas. Se entiende que el término incluye cualquier detector molecular en que pueda eluirse un polipéptido o péptido para la detección y/o caracterización. Un espectrómetro de masas puede incluir tres partes principales: la fuente de iones, el analizador de masas y el detector. La función de la fuente de iones es crear iones en fase gaseosa. Los átomos de analito, las moléculas o grupos pueden transferirse en fase gaseosa e ionizarse simultáneamente (como en ionización por electronebulización). La elección de la fuente de iones depende mucho de la aplicación.

Como se usa en este documento, la expresión "analizador de masas" incluye un dispositivo que puede separar especies, es decir, átomos, moléculas o grupos, de acuerdo con su masa. Ejemplos no limitantes de analizadores de masas que podrían emplearse para la secuenciación rápida de proteínas son tiempo de vuelo (TOF), sector magnético/eléctrico, filtro de masas de cuadrupolo (Q), retención de iones de cuadrupolo (QIT), orbitrap, resonancia de ciclotrón de iones con transformada de Fourier (FTICR), y también la técnica de espectrometría de masas con acelerador (AMS).

Como se usa en este documento, la expresión "espectrometría de masas en tándem" incluye una técnica donde se obtiene información estructural sobre moléculas de muestra usando múltiples fases de selección de masas y separación de masas. Un requisito previo es que las moléculas de muestra pueden transferirse a la fase gaseosa e ionizarse intactas y que pueden inducirse para que se desintegren de alguna manera predecible y controlable después de la primera etapa de selección de masas. Puede realizarse MS/MS multifase, o MSn seleccionando en primer lugar y aislando un ion precursor (MS2), fragmentándolo, aislando un ion de fragmento primario (MS3), fragmentándolo, aislando un fragmento secundario (MS4), y así sucesivamente siembre que se puede obtener información significativa o la señal del ion de fragmento sea detectable. La MS en tándem se ha realizado satisfactoriamente con una amplia diversidad de combinaciones de analizador. Lo que los analizadores combinan para una determinada aplicación se determina por muchos factores diferentes, tales como sensibilidad, selectividad y velocidad, pero también el tamaño, el coste y la disponibilidad. Las dos categorías principales de métodos de MS en tándem son tándem en el espacio y tándem en el tiempo, pero también hay híbridos donde se acoplan en el espacio analizadores en tándem en el tiempo o con analizadores en tándem en el espacio.

En algunas realizaciones ejemplares, puede realizarse espectrometría de masas en condiciones naturales.

Como se usa en este documento, la expresión "condiciones naturales" o "MS natural" o "ESI-MS natural" puede incluir realizar espectrometría de masas en condiciones que conservan las interacciones no covalentes en un analito. Para una revisión detallada sobre MS natural, remítase a la revisión: Elisabetta Boeri Erba y Carlo Petosa,The emerging role of native mass spectrometryin characterizing the structure and dynamics of macromolecular complexes,24 PROTEIN SCIENCE 1176-1192 (2015). Algunas de las distinciones entre ESI natural y ESI regular se ilustran en la tabla 1 (Hao Zhanget al., Native mass spectrometry of photosynthetic pigment-protein complexes,587 FEES Fetters 1012-1020 (2013)).

Tabla 1.

Realizaciones ejemplares

Las realizaciones divulgadas en este documento proporcionan métodos para cuantificar una impureza en una muestra.

Como se usa en este documento, se entiende que los términos "incluyen", "incluye" e "incluyendo" no son limitantes y se entiende que significan "comprenden", "comprende" y "comprendiendo", respectivamente.

La invención proporciona métodos para cuantificar una impureza en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional que provoca la separación en modo mixto; lavar la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil para proporcionar un eluyente que incluye la impureza; y cuantificar una cantidad de la impureza en el eluyente usando un espectrómetro de masas, en donde el espectrómetro de masas está acoplado al sistema cromatográfico.

En este documento también se divulgan métodos para detectar o cuantificar una proteína diana en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía en modo mixto, lavar la resina de cromatografía en modo mixto usando una fase móvil para proporcionar un eluyente que incluya la proteína diana, y detectar o cuantificar la proteína diana en el eluyente usando un espectrómetro de masas.

En algunas realizaciones ejemplares específicas, el sistema cromatográfico puede comprender una resina de cromatografía de exclusión por tamaño con una funcionalidad de interacción hidrófoba.

En algunas realizaciones ejemplares específicas, el sistema cromatográfico puede comprender una resina de cromatografía de exclusión por tamaño con una funcionalidad de interacción entre cargas.

En algunas realizaciones ejemplares, el método para detectar o cuantificar una impureza en una muestra puede incluir una impureza que puede incluir al menos una proteína indeseable. La o las impurezas pueden ser de estructura conocida, o estar parcialmente caracterizadas o estar sin identificar.

En algunas realizaciones ejemplares, la impureza puede ser una impureza relacionada con el producto. La impureza relacionada con el producto puede ser variantes moleculares, precursores, productos de degradación, proteína fragmentada, producto digerido, agregados, forma con modificación postraduccional o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones ejemplares específicas, la impureza puede ser una impureza relacionada con el proceso. La impureza relacionada con el proceso puede incluir impurezas derivadas del proceso de fabricación, es decir, ácido nucleicos y proteínas de la célula hospedadora, antibióticos, suero, otros componentes de medio, enzimas, reactivos de procesamiento químico y bioquímico, sales inorgánicas, disolventes, vehículos, ligandos y otras sustancias lixiviables usadas en el proceso de fabricación.

En algunas realizaciones ejemplares, la impureza puede ser una proteína con un pI en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 9,0. En un aspecto, la impureza puede ser una proteína con un pI de aproximadamente 4,5, aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,7, aproximadamente 5,8, aproximadamente 5,9, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,1, aproximadamente 6,2, aproximadamente 6,3, aproximadamente 6,4, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,7, aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,9, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,4, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,6, aproximadamente 7,7, aproximadamente 7,8, aproximadamente 7,9, aproximadamente 8,0, aproximadamente 8,1, aproximadamente 8,2, aproximadamente 8,3, aproximadamente 8,4, aproximadamente 8,5, aproximadamente 8,6, aproximadamente 8,7, aproximadamente 8,8, aproximadamente 8,9 o aproximadamente 9,0.

En algunas realizaciones ejemplares, la impureza puede ser una especie homodimérica. En un aspecto, la impureza puede ser una especie homodimérica, que puede formarse durante la producción de un anticuerpo biespecífico. En otro aspecto, el número de impurezas en la muestra puede ser al menos dos.

En algunas realizaciones ejemplares, la cantidad de la muestra cargada en el sistema cromatográfico puede variar de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 100 pg. En una realización ejemplar, la cantidad de la muestra cargada en el sistema cromatográfico puede ser aproximadamente 10 pg, aproximadamente 12,5 pg, aproximadamente 15 pg, aproximadamente 20 pg, aproximadamente 25 pg, aproximadamente 30 pg, aproximadamente 35 pg, aproximadamente 40 pg, aproximadamente 45 pg, aproximadamente 50 pg, aproximadamente 55 pg, aproximadamente 60 pg, aproximadamente 65 pg, aproximadamente 70 pg, aproximadamente 75 pg, aproximadamente 80 pg, aproximadamente 85 pg, aproximadamente 90 pg, aproximadamente 95 pg o aproximadamente 100 pg.

En algunas realizaciones ejemplares, la fase móvil usada para eluir la impureza puede ser una fase móvil que puede ser compatible con un espectrómetro de masas.

En algunas realizaciones ejemplares específicas, la fase móvil puede ser acetato de amonio, bicarbonato de amonio o formiato de amonio, o combinaciones de los mismos. En un aspecto, la concentración total de la fase móvil puede variar hasta aproximadamente 600 mM. En un aspecto específico, la concentración total de la fase móvil puede ser aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, 7 mM, aproximadamente 8 mM, 9 mM, aproximadamente 10 mM, 12,5 mM, aproximadamente 15 mM, 17,5 mM, aproximadamente 20 mM, 25 mM, aproximadamente 30 mM, 35 mM, aproximadamente 40 mM, 45 mM, aproximadamente 50 mM, 55 mM, aproximadamente 60 mM, 65 mM, aproximadamente 70 mM, 75 mM, aproximadamente 80 mM, 75 mM, aproximadamente 95 mM, 100 mM, aproximadamente 1100 mM, 120 mM, aproximadamente 130 mM, 140 mM, aproximadamente 150 mM, 160 mM, aproximadamente 170 mM, 180 mM, aproximadamente 190 mM, 200 mM, aproximadamente 225 mM, 250 mM, aproximadamente 275 mM, 300 mM, aproximadamente 325 mM, 350 mM, aproximadamente 375 mM, 400 mM, aproximadamente 425 mM, 450 mM, aproximadamente 475 mM, 500 mM, aproximadamente 525 mM, 550 mM, aproximadamente 575 mM o aproximadamente 600 mM.

En algunas realizaciones ejemplares, la fase móvil puede tener un caudal de aproximadamente 0,1 ml/min a aproximadamente 0,4 ml/min. En una realización ejemplar, el caudal de la fase móvil puede ser aproximadamente 0,1 ml/min, aproximadamente 0,15 ml/min, aproximadamente 0,20 ml/min, aproximadamente 0,25 ml/min, aproximadamente 0,30 ml/min, aproximadamente 0,35 ml/min o aproximadamente 0,4 ml/min.

El método para cuantificar una impureza comprende cuantificar una cantidad de la impureza en el eluyente usando un espectrómetro de masas. En un aspecto, el espectrómetro de masas puede ser un espectrómetro de masas en tándem. En otro aspecto, el espectrómetro de masas puede comprender un nanopulverizador.

En algunas realizaciones ejemplares, el eluyente puede comprender una proteína diana además de la impureza. En un aspecto, la proteína diana puede incluir un anticuerpo, anticuerpo biespecífico, fragmento de anticuerpo o un anticuerpo multiespecífico. En un aspecto específico, la proteína diana puede ser un anticuerpo monoclonal. En un aspecto específico, la proteína diana puede ser un anticuerpo terapéutico. En un aspecto específico, la proteína diana puede ser una proteína de inmunoglobulina. En otro aspecto específico, la proteína de inmunoglobulina puede ser IgG1. En otro aspecto específico más, la proteína de inmunoglobulina puede ser IgG4. En un aspecto, la proteína diana puede ser un anticuerpo biespecífico. En un aspecto específico, el anticuerpo biespecífico puede ser anticuerpo monoclonal anti-CD20/CD3. En un aspecto, la proteína diana puede ser un anticuerpo generado usando la línea celular de fibroblastos de ratón MG87. En un aspecto, la proteína diana puede ser un fragmento de anticuerpo formad por digestión del anticuerpo.

En un aspecto, la proteína diana puede ser una proteína modificada postraduccionalmente. En un aspecto específico, la proteína modificada postraduccionalmente puede formarse por escisión, extensiones N terminales, degradación proteínica, acilación del extremo N, biotinilación, amidación del extremo C, oxidación, glucosilación, yodación, unión covalente de grupos prostéticos, acetilación, alquilación, metilación, adenilación, ADP-ribosilación, reticulaciones covalentes dentro, o entre, cadenas polipeptídicas, sulfonatación, prenilación, modificaciones dependientes de vitamina C, modificación dependiente de vitamina K, glutamilación, glicilación, glucosilación, desglucosilación, isoprenilación, lipoilación, fosfopanteteinilación, fosforilación, sulfatación, citrulinación, desamidación, formación de puentes disulfuro, escisión proteolítica, ISGilación, SUMOilación o ubicuitinación (enlace covalente a la proteína ubicuitina).

En otro aspecto, la proteína diana puede ser un producto de degradación de una proteína.

En otro aspecto más, la proteína diana puede ser una impureza encontrada en un producto biofarmacéutico. En un aspecto específico, la proteína diana puede ser una impureza encontrada durante la fabricación del producto biofarmacéutico.

En un aspecto, la proteína diana puede ser una proteína con un pI en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 9,0.

En un aspecto, la proteína diana puede ser una impureza relacionada con el producto. La impureza relacionada con el producto puede ser variantes moleculares, precursores, productos de degradación, proteína fragmentada, producto digerido, agregados, forma con modificación postraduccional o combinaciones de los mismos.

En un aspecto, la proteína diana puede ser una impureza relacionada con el proceso. La impureza relacionada con el proceso puede incluir impurezas derivadas del proceso de fabricación, es decir, ácido nucleicos y proteínas de la célula hospedadora, antibióticos, suero, otros componentes de medio, enzimas, reactivos de procesamiento químico y bioquímico, sales inorgánicas, disolventes, vehículos, ligandos y otras sustancias lixiviables usadas en el proceso de fabricación.

En un aspecto, el número de impurezas en la muestra puede ser al menos dos.

En un aspecto, la proteína modificada postraduccionalmente puede formarse por oxidación de una proteína.

En otro aspecto, la proteína diana puede incluir un producto de degradación.

En otro aspecto, el producto de degradación puede incluir una modificación postraduccional de una proteína terapéutica.

En algunas realizaciones ejemplares, lavar la resina de cromatografía en modo mixto usando una fase móvil requiere menos de aproximadamente 30 minutos. En un aspecto, el tiempo requerido para lavar la resina de cromatografía en modo mixto usando una fase móvil puede ser aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 11 minutos, aproximadamente 12 minutos, aproximadamente 13 minutos, aproximadamente 14 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 16 minutos, aproximadamente 17 minutos, aproximadamente 18 minutos, aproximadamente 19 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 21 minutos, aproximadamente 22 minutos, aproximadamente 23 minutos, aproximadamente 24 minutos, aproximadamente 25 minutos, aproximadamente 26 minutos, aproximadamente 26 minutos, aproximadamente 27 minutos, aproximadamente 28 minutos, aproximadamente 29 minutos o aproximadamente 30 minutos.

En algunas realizaciones ejemplares, el sistema cromatográfico puede usarse para al menos aproximadamente 3 ciclos de muestra sin limpieza. En un aspecto, el sistema cromatográfico puede usarse para al menos aproximadamente 3 ciclos de muestra, al menos aproximadamente 4 ciclos de muestra, al menos aproximadamente 5 ciclos de muestra, al menos aproximadamente 6 ciclos de muestra, al menos aproximadamente 7 ciclos de muestra o al menos aproximadamente 8 ciclos de muestra, sin limpieza.

Se entiende que los métodos no se limitan a ninguna de la proteína, impureza, columna mencionada anteriormente y que los métodos para detectar o cuantificar pueden realizarse por cualquier medio adecuado.

En este documento se divulga un sistema cromatográfico en modo mixto que comprende una columna cromatográfica110que puede lavarse usando una fase móvil para proporcionar un eluyente que incluye una proteína diana y un espectrómetro de masas120acoplado a la columna cromatográfica (como se ilustra en la figura 4). En un aspecto, la columna cromatográfica110puede tener la capacidad de ponerse en contacto con una muestra usando un dispositivo de carga de muestras100.

La cantidad de la muestra que puede cargarse en la columna cromatográfica110puede variar de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 100 pg. En una realización ejemplar, la cantidad de la muestra que puede cargarse en la columna cromatográfica110puede ser aproximadamente 10 pg, aproximadamente 12,5 pg, aproximadamente 15pg,aproximadamente 20 pg, aproximadamente 25 pg, aproximadamente 30 pg, aproximadamente 35pg,aproximadamente 40 pg, aproximadamente 45 pg, aproximadamente 50 pg, aproximadamente 55pg,aproximadamente 60 pg, aproximadamente 65 pg, aproximadamente 70 pg, aproximadamente 75pg,aproximadamente 80 pg, aproximadamente 85 pg, aproximadamente 90 pg aproximadamente 95 pg o aproximadamente 100 pg.

La columna cromatográfica110puede tener la capacidad de lavarse con una fase móvil. En un aspecto, la fase móvil puede ser acetato de amonio, bicarbonato de amonio o formiato de amonio, o combinaciones de los mismos. En un aspecto, la concentración total de la fase móvil que puede usarse con la columna cromatográfica110puede variar hasta aproximadamente 600 mM. En un aspecto específico, la concentración total de la fase móvil que puede usarse con la columna cromatográfica110puede ser aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, 7 mM, aproximadamente 8 mM, 9 mM, aproximadamente 10 mM, 12,5 mM, aproximadamente 15 mM, 17,5 mM, aproximadamente 20 mM, 25 mM, aproximadamente 30 mM, 35 mM, aproximadamente 40 mM, 45 mM, aproximadamente 50 mM, 55 mM, aproximadamente 60 mM, 65 mM, aproximadamente 70 mM, 75 mM, aproximadamente 80 mM, 75 mM, aproximadamente 95 mM, 100 mM, aproximadamente 1100 mM, 120 mM, aproximadamente 130 mM, 140 mM, aproximadamente 150 mM, 160 mM, aproximadamente 170 mM, 180 mM, aproximadamente 190 mM, 200 mM, aproximadamente 225 mM, 250 mM, aproximadamente 275 mM, 300 mM, aproximadamente 325 mM, 350 mM, aproximadamente 375 mM, 400 mM, aproximadamente 425 mM, 450 mM, aproximadamente 475 mM, 500 mM, aproximadamente 525 mM, 550 mM, aproximadamente 575 mM o aproximadamente 600 mM. En otro aspecto, la fase móvil que puede usarse con la columna cromatográfica110puede tener un caudal de 0,1 ml/min a 0,4 ml/min. En un aspecto específico, el caudal de la fase móvil que puede usarse con la columna cromatográfica110puede ser aproximadamente 0,1 ml/min, aproximadamente 0,15 ml/min, aproximadamente 0,20 ml/min, aproximadamente 0,25 ml/min, aproximadamente 0,30 ml/min, aproximadamente 0,35 ml/min o aproximadamente 0,4 ml/min. En otro aspecto, la fase móvil que puede usarse con la columna cromatográfica110puede usarse para eluir la impureza.

La columna cromatográfica110puede tener la capacidad de acoplarse con un espectrómetro de masas120. En un aspecto, el espectrómetro de masas120puede comprender un nanopulverizador.

El espectrómetro de masas120puede ser un espectrómetro de masas en tándem.

El espectrómetro de masas120puede ser un espectrómetro de masas natural.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección140y/o cuantificación130de una proteína diana (véase la figura 4). En un aspecto, el sistema cromatográfico en modo mixto puede usarse para la detección140y/o cuantificación130de una proteína diana.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección140y/o cuantificación130de un anticuerpo monoclonal.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección140y/o cuantificación130de un anticuerpo terapéutico.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de una proteína de inmunoglobulina. En un aspecto, el sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de una proteína IgG1. En otro aspecto, el sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de una proteína IgG4. En otro aspecto, el sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de un anticuerpo biespecífico. En otro aspecto más, el sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de un anticuerpo monoclonal anti-CD20/CD3.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de un fragmento de anticuerpo formado por digestión del anticuerpo. En un aspecto, el sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de una proteína diana, que puede ser una proteína modificada postraduccionalmente. En otro aspecto, el sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de una proteína diana, que puede ser un producto de degradación de una proteína. En otro aspecto más, el sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de una proteína diana que puede ser una impureza encontrada en un producto biofarmacéutico. En otro aspecto, el sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de una proteína diana que puede ser una impureza encontrada durante la fabricación del producto biofarmacéutico.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de una proteína diana que puede ser una proteína con un pI en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 9,0.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de una proteína diana que puede ser una impureza relacionada con el producto. La impureza relacionada con el producto puede ser variantes moleculares, precursores, productos de degradación, proteína fragmentada, producto digerido, agregados, forma con modificación postraduccional o combinaciones de los mismos.

El sistema cromatográfico en modo mixto puede tener capacidad de detección 140 y/o cuantificación 130 de una proteína diana que puede ser una impureza relacionada con el proceso. La impureza relacionada con el proceso puede incluir impurezas derivadas del proceso de fabricación, es decir, ácido nucleicos y proteínas de la célula hospedadora, antibióticos, suero, otros componentes de medio, enzimas, reactivos de procesamiento químico y bioquímico, sales inorgánicas, disolventes, vehículos, ligandos y otras sustancias lixiviables usadas en el proceso de fabricación. En un aspecto, el número de impurezas en la muestra puede ser al menos dos.

La columna cromatográfica 110 puede usarse para al menos aproximadamente 3 ciclos de muestra sin limpieza. En un aspecto, la columna cromatográfica 110 puede usarse para al menos aproximadamente 3 ciclos de muestra, al menos aproximadamente 4 ciclos de muestra, al menos aproximadamente 5 ciclos de muestra, al menos aproximadamente 6 ciclos de muestra, al menos aproximadamente 7 ciclos de muestra o al menos aproximadamente 8 ciclos de muestra, sin limpieza.

Se entiende que el sistema no se limita a ninguna de la proteína, impureza, fase móvil o columna cromatográfica mencionada anteriormente.

El marcaje consecutivo de las etapas del método proporcionado en este documento con números y/o letras no pretende limitar el método o cualquier realización del mismo al orden indicado particular.

La divulgación se entenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan para describir la divulgación en mayor detalle. Están destinados a ilustrar y no deben interpretarse como limitantes del alcance de las reivindicaciones.

Ejemplos

Materiales. Se proporcionó agua desionizada por un sistema de purificación de agua integrado Milli-Q instalado con filtro MilliPak Express 20 (MilliporeSigma, Burlington, MA). Se adquirieron acetato de amonio (calidad LC/MS), ácido acético y bicarbonato de amonio (calidad LC/MS) de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Se adquirió péptido N-glucosidasa F (PNGasa F) de New England Biolabs Inc (Ipswich, MA). El tampón Tris-HCl 1 M Invitrogen™ UltraPure™, pH 7,5 se obtuvo de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Todos los anticuerpos monoclonales y biespecíficos, incluyendo las subclases de IgG1 e IgG4 se produjeron en Regeneron.

Preparación de muestra. Para reducir la heterogeneidad de masas introducida por la presencia de dos glucanos N-ligados en la parte Fc, cada muestra de anticuerpo o mezcla de anticuerpos se trató con PNGasa F (1 miliunidad lUB por 10 pg de proteína) a 45 °C en Tris-HCl 100 mM (pH 7,5) durante 1 hora. Para preparar los patrones con adición de mezclas de bsAb, la sustancia farmacéutica de bsAb en primer lugar se purificó adicionalmente usando cromatografía analítica de intercambio catiónico (SCX) para retirar cualquier impureza homodimérica residual del proceso de fabricación a gran escala. Las condiciones detalladas para el fraccionamiento por SCX se muestran a continuación. Después del fraccionamiento, tanto a los bsAb purificados como a los patrones homodiméricos correspondientes se les intercambió el tampón ere a 50 mM de tampón Tris-HCl (pH 7,5) y cada uno se ajustó a 6 pg/pl en función de las concentraciones determinadas por Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). Posteriormente, los bsAb y los dos homodímeros correspondientes se mezclaron a una relación de 1:1:1. Finalmente, se realizaron diluciones secuenciales usando una solución de 2 pg/pl de bsAb para preparar una se rie de patrones con adiciones con los niveles de homodímeros variando de un 0,1 % a un 10 %.

Purificación de bsAb a partir de la sustancia farmacéutica de bsAb por SCX.Para purificación adicional del bsAb de cada muestra de bsAb, se realizó cromatografía analítica de intercambio catiónico fuerte (SCX) en un sistema Waters I-Class UPLC equipado con un detector de matriz de fotodiodos (PDA) (Waters, Milford, MA, EE. UU.). Antes de la inyección de la muestra, la temperatura del compartimento de la columna se estableció a 45 °C y se preacondicionó una columna de intercambio catiónico fuerte YMC-BioPro SP-F (100 mm x 4,6 mm, 5 pm) (YMC Co., LTD., Kioto, Japón) con fase móvil A (acetato de amonio 20 mM, el pH se ajustó hasta 5,6 con ácido acético 20 mM) a un caudal de 0,4 ml/min. Tras la inyección de una alícuota (200 pg) de las muestras de proteína, el gradiente se mantiene a un 100 % de fase móvil A durante 2 minutos seguido de un aumento lineal hasta un 100 % de fase móvil B (acetato de amonio 140 mM, bicarbonato de amonio 10 mM, pH 7,4) en 16 minutos. El gradiente se mantuvo a un 100 % de fase móvil B durante 4 minutos y después se volvió a un 100 % de fase móvil A para reacondicionar la columna durante 7 minutos antes de la siguiente inyección. Al bsAb fraccionado entonces se le intercambió el tampón al mismo tampón que las muestras homodiméricas emparejadas incorrectamente antes de mezcla para preparar los patrones con adiciones.

Método de MM-SEC-MS.Se realizó cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto en un sistema Waters I-Class UPLC equipado con detector de matriz de fotodiodos (PDA) (Waters, Milford, MA, EE. UU.). Se usó un espectrómetro de masas Thermo Exactive Plus EMR equipado con una fuente de iones Nanospray Flex™ (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania) para la medición de masas. Antes de la inyección de la muestra, la columna (Waters BEH200 SEC 4,6 x 300 mm, 200 A, 1,7 pm o Sepax Zenix SEC-3004,6 x 300 mm, 300 A, 3 pm) se preequilibró a un caudal de 0,2 ml/min usando fase móvil basada en acetato de amonio y bicarbonato de amonio de concentraciones variables (30 mM a 450 mM). Esto se consiguió por procesamiento a un porcentaje fijo de fase móvil B usando un sistema de disolvente doble (fase móvil A: agua; fase móvil B: acetato de amonio 420 mM y bicarbonato de amonio 30 mM). Tras la inyección de una muestra de anticuerpo (2-10 pg), se ejecutó un método de elución isocrática durante 24 minutos. Para posibilitar la detección simultánea de UV y MS, se aplicó un divisor posterior a la columna (relación ~200:1) después de la separación por SEC para reducir el flujo hasta ~1 pl/min para análisis nano-ESI-MS, mientras se desvía el alto flujo restante al detector de PDA para la supervisión de UV a 280 nm. Un emisor PicoTip desechable (sin recubrir, punta: 10±1 pm) (New Objective, Inc., Woburn, MA, EE. UU.) se usó para conseguir nano-ESI. Para el análisis espectrométrico de masas, la resolución se estableció a 17500, el voltaje de pulverización capilar se estableció a 1,5 kV, la energía de fragmentación en la fuente se estableció a 100, la energía de colisión se estableció a 10, la temperatura del capilar se estableció a 350 °C, el nivel de RF de S-lens se estableció a 200 y la presión de gases de retención de HCD se estableció a 3. Los espectros de masas se adquirieron con una ventana de intervalom/zentre 2000 y 15000.

Ejemplo 1. Interacciones secundarias durante SEC usando tampón compatible con MS.

Una superficie proteínica es muy heterogénea y consiste en muchos grupos funcionales distintos que pueden contribuir a los enlaces de hidrógeno (grupos hidroxilo, amina y amida), interacciones electrostáticas (grupos cargados) e hidrófobas (grupos hidrófobos) con la matriz de columna de SEC basada en sílice o polisacárido. Estas interacciones, en general, tienen diferente fuerza de unión y son muy dependientes del pH, la temperatura y la composición de la fase móvil usadas en la aplicación de SEC. Por ejemplo, cuando se realiza a pH casi neutro, los grupos de silanol de una columna de SEC basada en sílice pueden estar cargados negativamente y, por lo tanto, promueven una interacción electrostática con proteínas básicas. Para suprimir dicha interacción, frecuentemente se requirieron fases móviles con fuerza iónica moderada (Goyonet al.,2018,supra)o pH bajo (menos de 5) (Pavonet al.,2016,supra)en el pasado.

Más recientemente, mediante derivatización superficial de sílice (tal como cadenas de alquilo cortas o enlace de grupos funcionales), los grupos silanol residual de una columna de SEC moderna pueden blindarse de forma eficaz y, por lo tanto, reducir drásticamente la presencia de interacciones electrostáticas. Sin embargo, esos grupos químicos recién introducidos también podrían provocar otras interacciones secundarias potenciadas (por ejemplo, interacción hidrófoba) con el analito proteínico, como se presenta en estudios recientes (Yanget al.,2015,supra;Yan Heet al. On-line coupling of size exclusión chromatography with mixed-mode liquid chromatography for comprehensive profiling of biopharmaceutical drug product,1262 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A 122-129 (2012)). Como se resume por Arakawaet al.,las interacciones electrostáticas dominan a bajas concentraciones de sal, mientras que las interacciones hidrófobas se ven favorecidas con fases móviles de alta fuerza iónica, particularmente cuando se usan sales de clasificación superior en la serie Hofmeister (véase la figura 3). Aunque la elección de sales compatibles con la aplicación de SEC-MS en línea en general está limitada (por ejemplo, formiato de amonio, acetato de amonio y bicarbonato de amonio), diferentes tipos de interacciones secundarias entre los analitos proteínicos y la matriz de columna aún podrían modularse variando las concentraciones de sal y explorarse para propósitos de separación de proteínas.

Para evaluar las interacciones en modo mixto asociadas con la concentración de sal, se analizó una mezcla de ocho anticuerpos (ambas subclases IgG1 e IgG4) con diferentes características superficiales en una columna Waters BEH200 SEC usando fases móviles basadas en acetato de amonio y bicarbonato de amonio de concentraciones variables de 30 mM a 300 mM, un intervalo que es factible para el posterior análisis de MS natural. La relación molar entre el acetato de amonio y el bicarbonato de amonio se mantuvo constante a 14:1 para conseguir un valor de pH de aproximadamente 7,4. El comportamiento cromatográfico de los ocho mAb se ilustró representando sus tiempos de retención en SEC, determinados por cromatogramas de iones extraídos (XIC), frente a la concentración de fase móvil (figura 5). Globalmente, los ocho mAb se separaron de la mejor manera cuando se realizó SEC usando una concentración de sal en la fase móvil de 30 mM. Según aumentaba la concentración de sal, los perfiles de elución de los ocho mAb se volvían más convergentes y menos resueltos (recuadros en la figura 5). Estos desplazamientos en los tiempos de retención podían explicarse por los cambios en las interacciones secundarias entre la molécula de mAb y la matriz de columna. Por un lado, como los grupos silanol residuales de la matriz de columna quedan cargados negativamente a pH 7,4, podían interactuar con la superficie proteínica cargada positivamente mediante interacción electrostática. Esta interacción se potencia cuando se usa concentración de sal menor. Por otro lado, la interacción hidrófoba entre la molécula de mAb y la matriz de columna podría promoverse cuando se usan concentraciones de sal mayores. De forma interesante, en función de sus valores de pI, estos ocho mAb pueden clasificarse en tres grupos diferentes, donde se observaron relaciones similares entre el tiempo de retención y la concentración de sal. El primer grupo incluye las tres moléculas de mAb ácidas, mAb5 (pI = 6,3), mAb6 (pI 6,4) y mAb1 (pI = 6,7), que se espera que alberguen menos cargas positivas en la superficie proteínica a pH 7,4 y, por lo tanto, presentaban mínimas interacciones electrostáticas con la matriz de columna. Como se muestra en la figura 5, estas tres moléculas mostraron todas una tendencia creciente del tiempo de retención según aumentaba la concentración de sal, lo que indica que, como se eliminan las interacciones electrostáticas débiles a fuerza iónica mayor, la interacción hidrófoba desempeña una función dominante durante la separación por SEC. Por el contrario, las tres moléculas de mAb básicas, mAb3 (pI = 8,0), mAb4 (pI = 8,3) y mAb8 (pI = 7,6), que se espera que alberguen más cargas positivas en la superficie proteínica a pH 7,4, mostraron todas una tendencia decreciente en el tiempo de retención según aumentaba la concentración de sal. Esta correlación inversa entre la concentración de sal y el tiempo de retención se atribuyó principalmente a la interacción electrostática dominante, que se promovía a baja concentración de sal y se suprimía a alta concentración de sal. Finalmente, a diferencia de los mAb ácidos o básicos, mAb2 (pI = 7,3) y mAb7 (pI = 6,9) representan un grupo "neutro", que probablemente alberga una cantidad moderada de cargas positivas en la superficie proteínica y, por lo tanto, presentaba un nivel medio de interacciones electrostáticas con la matriz de columna. Este grupo de moléculas mantuvo un tiempo de retención relativamente inalterado a concentraciones variables de sal (de 30 mM a 300 mM). En este caso, según aumentaba la concentración de sal, el aumento en la interacción hidrófoba era probablemente cercano a y contrarrestando la disminución en la interacción electrostática, lo que da lugar a un pequeño desplazamiento en el tiempo de retención. Estos resultados indicaron que, al modular apropiadamente las concentraciones de sal, podría ser posible separar o separar parcialmente diferentes anticuerpos (por ejemplo, bsAb frente a homodímeros) usando interacciones en modo mixto en una columna de SEC para posterior análisis de MS.

Aunque parece que se conseguía mayor resolución cromatográfica a bajas concentraciones de sal en una columna Waters BEH, tiene que tenerse precaución con los mAb básicos, ya que pueden producirse colas en picos importantes en esas condiciones y podría influir significativamente en la recuperación de la proteína (Alexandre Goyonet al., Characterization of 30 therapeutic antibodies andrelatedproducís by size exclusión chromatography: Feasibility assessment for future mass spectrometry hyphenation,1065-1066 JOURNAL OF CHROMATOGrA p HY B 35-43 (2017)).

Ejemplo 2. Detección de variante de O-glucano de un anticuerpo biespecífico Ab biespecífico usando MM-SEC-MS

2.1 Preparación de muestra de anticuerpo biespecífico

El anticuerpo biespecífico anti-CD20 x anti-CD3 (bsAb1) es un anticuerpo (Ab) de longitud completa biespecífico de CD20xCD3 estabilizado en la bisagra basado en un isotipo IgG4 modificado para reducir la unión a Fc. Está diseñado para unirse a linfocitos T (mediante CDS) y células que expresan CD20. El anticuerpo biespecífico se produjo siguiendo la metodología como se describe por Smithet al.(Sci. Rep. (2015) 5:17943).

2.2 MM-SEC-MS

El análisis usando MM-SEC-MS se realizó de forma isocrática usando una columna Zenix SEC-300 MK (7,8 x 300 nm, 3 pm) en el sistema como se describe anteriormente. La elución se supervisó por UV a 280 nm.

Se realizaron dos conjuntos de experimentos. En el primer experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 140 mM y bicarbonato de amonio 10 mM y en el segundo experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 420 mM y bicarbonato de amonio 30 mM. La elución se realizó a un caudal de 0,4 ml/min. El equilibrado se realizó usando la fase móvil.

Para ciclos analíticos, las cargas de inyección consistían en 100 |jg de la proteína total. La elución se realizó usando un gradiente isocrático que consiste en acetato de amonio (tampón A) y bicarbonato de amonio (tampón B). Los datos de espectrometría de masas se analizaron usando el programa informático Intact de Protein Metrics.

Los dos ciclos con fases móviles de diferente concentración revelaron que una mayor concentración de sal puede potenciar la interacción hidrófoba durante la separación por SEC como se observa por el tiempo de elución del anticuerpo biespecífico en diferentes fases móviles. Este efecto dio lugar a una separación aumentada entre el anticuerpo biespecífico y su variante de O-glucano (véase la figura 6).

Ejemplo 3. Detección de especies homodiméricas usando Zenix SEC-300, 3 pm, 300 A, 7,8 x 300 mm

3.1 Preparación de muestra de anticuerpo biespecífico y patrones de mezcla de homodímeros

Se generan dos impurezas homodiméricas durante la producción del anticuerpo biespecífico (bsAb1) (Fc*/Fc): homodímero 1 (Fc*-Fc*) y homodímero 2 (Fc/Fc) (véase la figura 2).

3.2 MM-SEC-MS

La adquisición usando MM-SEC-MS se realizó de forma isocrática usando una columna Zenix SEC-300 MK (7,8 x 300 nm, 3 jm ) en el sistema como se describe anteriormente. La elución se supervisó por UV a 280 nm.

Se realizaron dos conjuntos de experimentos. En el primer experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 140 mM y bicarbonato de amonio 10 mM y en el segundo experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 420 mM y bicarbonato de amonio 30 mM. La elución se realizó a un caudal de 0,4 ml/min.

Para ciclos analíticos, las cargas de inyección consistían en 50 jg de la proteína total. La elución se realizó usando un gradiente isocrático que consiste en acetato de amonio (tampón A) y bicarbonato de amonio (tampón B). Similar a los resultados obtenidos de 2.2, los dos ciclos con fases móviles de diferente concentración revelaron que una mayor concentración de sal puede potenciar la interacción hidrófoba durante la separación por SEC como se observa por los tiempos de elución del anticuerpo biespecífico y los homodímeros en las diferentes fases móviles. La fase móvil con una concentración de sal total de 450 mM realizó una separación mejorada del homodímero 1 y el homodímero 2 del anticuerpo biespecífico (véase la figura 7).

Ejemplo 4. Comparación de la detección de impurezas homodiméricas en el anticuerpo biespecífico usando MM-SEC-MS, SEC-MS y RP LC-MS.

4.1 Preparación de muestra de anticuerpo biespecífico y patrones de mezcla de homodímeros

La muestra se preparó usando la metodología ilustrada en el ejemplo 3.

4.2 RP LC-MS

La muestra se diluyó hasta 0,5 mg/ml. Esta solución se inyectó a 0,5 jg para análisis de LC-MS. El experimento de LC-MS se realizó en espectrómetro de masas ThermoFisher Fusion Lumos T ribrid. La columna Waters BioResolveTM de mAb de polifenilo, 450 A, 2,7 jm 2,1 x 50 mm (P.N. 186008944) se usó para separación en fase inversa. La temperatura de la muestra se estableció a 5 °C y la temperatura de la columna se estableció a 80 °C. La fase móvil A fue un 0,1 % de FA en agua, la fase móvil B fue un 0,1 % de FA en acetonitrilo. El experimento de espectrometría de masas se realizó en modo positivo. Las condiciones de la fuente de iones de MS se establecieron como sigue: voltaje de pulverización a 3,8 kV, temperatura del tubo de transferencia de iones a 325 °C, temperatura del vaporizador a 250 °C, gas de recubrimiento a 40 (Arb), gas aux. a 10 (Arb), gas de arrastre a 2 (Arb), lente de RF (%) a 60 y energía de fragmentación de fuente a 40 V. Los datos de MS se adquirieron por orbitrap en modo de alto intervalo de masa con intervalo de m/z a 1500-4000. La resolución se estableció a 15000 en m/z 200 con 10 microbarridos, la diana de AGC fue 105, el tiempo de inyección máximo fue 50 ms. Los datos de espectrometría de masas se analizaron usando el programa informático Xcalibur.

4.3 SEC-MS

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se realizó en la columna ACQUITY LfPEC Protein BEH SEC (200 A, 1,7 jm , 4,6 mm x 300 mm) usando fase móvil compuesto de acetato de amonio 140 mM y bicarbonato de amonio 10 mM. Los experimentos de SEC se realizaron en un sistema Waters Acquity UPEC I-class a temperatura ambiente, con detección de longitud de onda a 280 nm, un caudal de 0,2 ml/min y una carga de inyección de proteína de 50 jg .

4.4 MM-SEC-MS

El ciclo analítico en el sistema de MM-SEC-MS se realizó de forma isocrática usando una fase móvil que contenía acetato de amonio 420 mM y bicarbonato de amonio 30 mM usando una metodología ilustrada en el ejemplo 3.2.

4.5 Resultados

La comparación del cromatograma de iones totales (TIC) y los espectros de MS natural para RP EC-MS en Lumos (véase la figura 8), SEC-MS en EMR y MM-SEC-MS en EMR muestra la separación significativa y la detección de homodímero del anticuerpo biespecífico. El espectrograma de masas sin procesar de RP LC-MS no pudo diferenciar entre los homodímeros y el anticuerpo biespecífico. El espectro de masas sin procesar de SEC-MS pudo separar y detectar homodímero 1 y el anticuerpo biespecífico, pero la separación no fue suficiente para separar y detectar homodímero 2 y el anticuerpo biespecífico. Solamente los espectros de masas sin procesar de MM-SEC-MS mostraron suficiente separación y detección de homodímero 1, homodímero 2 y el anticuerpo biespecífico. Esta comparación proporciona una prueba de hipótesis de la superioridad de MM-SEC-MS sobre SEC-MS y RP EC-MS para la detección de impurezas en productos biofarmacéuticos.

Ejemplo 5. Ciclos consecutivos de detección por MM-SEC-MS usando Zenix SEC-300, 3 pm, 300 A, 7,8 x 300 mm

Para evaluar la calidad de los datos de detección en ciclos consecutivos, se realizaron tres ciclos analíticos de la muestra que contenía Ab biespecífico, homodímero 1 y homodímero 2 (preparada como se ilustra en 4.1) usando el sistema de MM-SEC-MS. Los ciclos analíticos se realizaron usando la metodología ilustrada en 4.2 y fase móvil que comprendía acetato de amonio 280 mM y bicarbonato de amonio 20 mM.

Los espectros de masas sin procesar y el cromatograma de iones extraídos (XIC) para los tres ciclos mostraron una disminución en la calidad de los datos y en la relación de señal a ruido (véase la figura 9). Este efecto podría deberse al uso de una columna grande (7,8 x 300 mm) que requiere una gran cantidad de muestra de proteína (~50 pg) para garantizar la intensidad de MS, lo que puede dar lugar a precipitación de la proteína a la alta concentración de sal y, por lo tanto, requiere limpieza más frecuente del trayecto del flujo (máx. 3 muestras procesadas antes de la limpieza).

Además, la columna grande y el caudal bajo relativo que el nanodivisor puede manejar (máx ~0,4 ml/min) dio lugar a una anchura de pico amplia (~1,5 min), que afecta a la intensidad y resolución de MS en algunos casos. El tiempo de elución tardío también ralentizó el tiempo de análisis global (30 min cada muestra).

Ejemplo 6. Detección de especies homodiméricas usando Zenix SEC-300, 3 pm, 300 A, 4,6 x 300 mm

6.1 Preparación de muestra de anticuerpo biespecífico y patrones de mezcla de homodímeros

El anticuerpo biespecífico y los patrones de mezcla de homodímeros pueden prepararse por métodos ilustrados en 3.1.

6.2 MM-SEC-MS

La adquisición usando MM-SEC-MS se realizó de forma isocrática usando una columna Zenix SEC-300 MK (4,6 x 300 nm, 3 pm) en el sistema como se describe anteriormente. La elución se supervisó por LTV a 280 nm.

Se realizaron cuatro conjuntos de experimentos. En el primer experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 140 mM y bicarbonato de amonio 10 mM, en el segundo experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 280 mM y bicarbonato de amonio 20 mM, en el tercer experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 420 mM y bicarbonato de amonio 30 mM y en el segundo experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 560 mM y bicarbonato de amonio 40 mM. La elución se realizó a un caudal de 0,3 ml/min.

Para ciclos analíticos, las cargas de inyección consistían en 10 pg de la proteína. La elución se realizó usando un gradiente isocrático que consiste en acetato de amonio (tampón A) y bicarbonato de amonio (tampón B). El uso de concentraciones mayores de 150 mM de concentración de sal total muestra una separación y detección mejoradas de los homodímeros y anticuerpo biespecífico (véase la figura 10). El tiempo total para el análisis usando la columna más pequeña (4,6 x 300 nm) disminuyó hasta aproximadamente 18 minutos y la anchura del pico disminuye hasta menos de 1 minuto, en comparación con el tiempo total para el análisis y la anchura del pico usando la columna más grande (7,8 x 300 nm). Las representaciones de las diferencias se muestran en la figura 11.

Ejemplo 7. Análisis por MM-SEC-MS de mezcla desglucosilada de anticuerpo biespecífico, homodímero 1 y homodímero 2 en columna Zenix-SEC

7.1 Preparación de mezcla desglucosilada de anticuerpo biespecífico, homodímero 1 y homodímero 2

Cada proteína se trató con péptido N-glucosidasa F (PNGasa F; 1 miliunidad lUB por 10 pg de proteína) a 45 °C durante 1 hora para retirar completamente las cadenas de glucano de cada región constante de la cadena pesada.

7.2 MM-SEC-MS

La adquisición usando MM-SEC-MS se realizó de forma isocrática usando una columna Zenix SEC-300 MK (4,6 x 300 nm, 3 pm) en el sistema como se describe anteriormente. La elución se supervisó por LTV a 280 nm.

Se realizaron seis conjuntos de experimentos. En el primer experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 9,3 mM y bicarbonato de amonio 0,7 mM, en el segundo experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 46,7 mM y bicarbonato de amonio 3,3 mM, en el tercer experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 93,3 mM y bicarbonato de amonio 6,7 mM, en el cuarto experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 186,7 mM y bicarbonato de amonio 13,3 mM, en el quinto experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 280 mM y bicarbonato de amonio 20 mM, y en el sexto experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 420 mM y bicarbonato de amonio 30 mM. La elución se realizó a un caudal de 0,3 ml/min.

Para ciclos analíticos, las cargas de inyección consistían en 10 pg de la proteína.

El uso de 10 mM de concentración de sal total muestra separación significativa del homodímero 1, anticuerpo biespecífico y homodímero 2. A concentración de sal 10 mM, el homodímero 2 tenía un tiempo de retención posterior que el anticuerpo biespecífico, que mostraba un tiempo de retención posterior que el homodímero 1. Sin embargo, a concentraciones mayores de 10 mM, el homodímero 1 tenía un tiempo de retención posterior que el anticuerpo biespecífico, que mostró un tiempo de retención menos que el homodímero 2 (véase la figura 12 y figura 13). Este efecto podría deberse al diferente tipo de interacción: carga, forma o hidrofobia de las tres proteínas con la resina de cromatografía de exclusión por tamaño usada. La carga en la proteína a una concentración de sal dada depende de sus valores de pI (tabla 2). Se obtuvieron separaciones significativas usando fase móvil con baja concentración de sal de 10 mM o usando fase móvil con alta concentración de sal mayor de 100 mM. A menores concentraciones de sal, la retención puede estar impulsada por la interacción entre cargas. Por ejemplo, las moléculas básicas pueden separarse usando fase móvil con menor concentración de sal, en el sistema de MM-SEC-MS. A mayores concentraciones de sal, la retención está impulsada por la interacción hidrófoba. Por ejemplo, las moléculas ácidas o hidrófobas pueden separarse usando fase móvil con mayor concentración de sal, en el sistema de MM-SEC-MS (véase la figura 14 y figura 15).

Una separación ideal por SEC debe basarse solamente en el volumen hidrodinámico de la proteína, y no debe desearse ninguna otra interacción entre la proteína y la fase estacionaria. Como la matriz de columna basada en sílice podría presentar cargas negativas debido a los grupos silanol (características de intercambio iónico), la derivatización de las partículas de sílice ayuda a reducir el efecto de silanol, pero al mismo tiempo podría introducir un nuevo mecanismo de interacción (hidrofobia). Por tanto, esto puede crear resinas de SEC que tengan funcionalidad, como se observa con las columnas Zenix-SEC. Esto explica la diferencia en el orden de elución de las proteínas con diferentes concentraciones cuando se realiza en una columna Zenix-SEC.

Tabla 2.

Ejemplo 8. Análisis por MM-SEC-MS de mezcla desglucosilada de anticuerpo biespecífico, homodímero 1 y homodímero 2 en columna Waters BEH SEC

8.1 Preparación de mezcla desglucosilada de anticuerpo biespecífico, homodímero 1 y homodímero 2.

La mezcla desglucosilada se preparó usando la misma metodología que en 7.1.

8.2 MM-SEC-MS

La adquisición usando MM-SEC-MS se realizó de forma isocrática usando una columna Waters BEH SEC en el sistema como se describe anteriormente. La elución se supervisó por UV a 280 nm.

Se realizaron seis conjuntos de experimentos. En el primer experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 14 mM y bicarbonato de amonio 1 mM, en el segundo experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 18,7 mM y bicarbonato de amonio 1,3 mM, en el tercer experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 28 mM y bicarbonato de amonio 2 mM, en el cuarto experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 70 mM y bicarbonato de amonio 5 mM, en el quinto experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 93,3 mM y bicarbonato de amonio 6,7 mM, y en el sexto experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 280 mM y bicarbonato de amonio 20 mM. La elución se realizó a un caudal de 0,2 ml/min.

Para ciclos analíticos, las cargas de inyección consistían en 10 pg de la proteína.

El uso de 15 mM de concentración de sal total muestra separación significativa del homodímero 1, anticuerpo biespecífico y homodímero 2. A concentración de sal 15 mM, el homodímero 2 tenía un tiempo de retención anterior al del anticuerpo biespecífico, que mostraba un tiempo de retención anterior al del homodímero 1. Al aumentar la concentración de la fase móvil, se redujeron las diferencias en los tiempos de retención. Además, a una concentración de sal de 300 mM de la fase móvil, el homodímero 1 tenía un tiempo de retención anterior al del anticuerpo biespecífico, que mostró un tiempo de retención anterior al del homodímero 2 (véase la figura 16 y figura 17). Como se describe en la figura 14 y figura 15, este efecto se debe al desarrollo de una interacción adicional sobre la columna de SEC. La interacción adicional depende de la concentración de sal de la fase móvil. A concentraciones menores, predominan las interacciones entre cargas en la columna y estas determinan la retención de las proteínas en la columna.

Ejemplo 9. Análisis por MM-SEC-MS de una molécula de IgG1 y su variante oxidada en columna Waters BEH SEC

9.1 Preparación de una variante oxidada de una molécula de IgG1 - Ab1

Ab1 se trató con péptido N-glucosidasa F (PNGasa F; 1 miliunidad lUB por 10 pg de proteína) a 45 °C durante 1 hora para retirar completamente las cadenas de glucano de cada región constante de la cadena pesada.

9.2 MM-SEC-MS

La adquisición usando MM-SEC-MS se realizó de forma isocrática usando una columna Waters BEH SEC en el sistema como se describe anteriormente. La elución se supervisó por UV a 280 nm.

Se realizaron tres conjuntos de experimentos. En el primer experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 93,3 mM y bicarbonato de amonio 6,7 mM, en el segundo experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 140 mM y bicarbonato de amonio 10 mM, y en el tercer experimento, el sexto experimento, la fase móvil comprendía acetato de amonio 280 mM y bicarbonato de amonio 20 mM. La elución se realizó a un caudal de 0,2 ml/min.

Para ciclos analíticos, las cargas de inyección consistían en 10 pg de la proteína.

Hay una separación significativa del anticuerpo Ab1 y su variante oxidada en el sistema de MM-SEC-MS usando concentración de sal 100 mM, 150 mM y 300 mM de la fase móvil (véase la figura 18, panel superior). El pI del anticuerpo IgG1 Ab1 es 8,65. Para moléculas de IgG1 con mayor pI, la interacción de cargas desempeña una función más dominante en comparación con las moléculas de IgG4, que tienen bajos valores de pI.

Ejemplo 10. Análisis por MM-SEC-MS de una molécula de IgG1 en columna Waters BEH SEC

10.1 Preparación de la molécula de IgG1 - Ab2

Ab2 se trató con péptido N-glucosidasa F (PNGasa F; 1 miliunidad lUB por 10 pg de proteína) a 45 °C durante 1 hora para retirar completamente las cadenas de glucano de cada región constante de la cadena pesada.

10.2 MM-SEC-MS

La adquisición usando MM-SEC-MS se realizó de forma isocrática usando una columna Waters BEH SEC en el sistema como se describe en el ejemplo 8.2. Comparando los tiempos de retención de las dos moléculas de IgG1 - Ab1 y Ab2, se observó que la molécula Ab2 tenía tiempos de retención más bajos (véase la figura 18, panel inferior).

Esto puede explicarse debido a la diferencia de hidrofobia entre Ab1 y Ab2. Para moléculas más hidrófobas, el efecto de "desalado" empieza a producirse a menor concentración de sal en comparación con las moléculas menos hidrófobas. Este punto también se denomina punto de transición (véase la figura 19).

Ejemplo 11. Cuantificación de impurezas homodiméricas en el anticuerpo biespecífico usando MM-SEC-MS

Los patrones se generaron usando la metodología ilustrada en la figura 20.

La adquisición usando MM-SEC-MS se realizó de forma isocrática usando una columna Zenix SEC-300 MK (4,6 x 300 nm, 3 pm) en el sistema como se describe. Se usaron las fases móviles con concentración de sal 300 mM y concentración de sal 70 mM para eluir las proteínas. Para ambas concentraciones en nivel intacto, así como de subunidad, se observó mayor detección usando MM-SEC-MS en muestras con mayor cantidad de homodímeros (véase la figura 21 y figura 22). A concentración de sal 70 mM para la fase móvil, también se detectó una impureza de Fc adicional del anticuerpo biespecífico.

A nivel intacto, el diagrama de homodímero 1/anticuerpo biespecífico teórico frente a homodímero 1/anticuerpo biespecífico detectado y de homodímero 2/anticuerpo biespecífico teórico frente a homodímero 2/anticuerpo biespecífico detectado mostró una buena linealidad para la cuantificación de homodímeros presentes de un 0,1 % a un 50 % (véase la figura 23).

A nivel subunidad, el diagrama de homodímero 1/anticuerpo biespecífico teórico frente a homodímero 1/anticuerpo biespecífico detectado y de homodímero 2/anticuerpo biespecífico teórico frente a homodímero 2/anticuerpo biespecífico detectado mostró una buena linealidad para la cuantificación de homodímeros presentes de un 0,1 % a un 50 % (véase la figura 24). En comparación con el nivel intacto, se obtuvo mejor precisión a nivel subunidad.

Ejemplo 12. Separación por SEC en modo mixto de anticuerpos biespecíficos y homodiméricos para detección por MS natural.

Se mezclaron cuatro moléculas de bsAb con diferentes valores de pl e hidrofobia (tabla 3) con sus correspondientes anticuerpos homodiméricos y se usaron como los parones de ensayo. Cada molécula de bsAb (HH*L2) contiene dos cadenas ligeras idénticas (FC) y dos cadenas pesadas diferentes (HC y HC*), mientras que cada anticuerpo homodimérico (H2L2 o H*2L2) contiene dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas (HC o HC*).

Tabla 3

Las cuatro mezclas de bsAb se analizaron entonces en la columna Waters BEH usando tres concentraciones de sal diferentes (75 mM, 150 mM y 300 mM), seguida de detección de MS natural en línea. Los cromatogramas de picos base (BPC) resultantes se muestran en los paneles de la izquierda de la figura 25. Coherente con las observaciones del estudio previo, según aumentaba la concentración de sal, las moléculas de mAb con diferentes valores de pI presentaban diferentes tendencias en los tiempos de retención. Aprovechando el diferente comportamiento de retención de cada anticuerpo a concentraciones variables de sal, por lo tanto, exploramos la posibilidad de separar los homodímeros de los bsAb modulando las concentraciones de sal. Por ejemplo, en la mezcla de bsAb2, según disminuía la concentración de sal de 300 mM a 75 mM, las dos moléculas ácidas, homodímero H2L2 (pI = 6,1) y bsAb HH*L2 (pI = 6,5) eluyeron antes ambas, probablemente debido a interacciones hidrófobas reducidas y electrostáticas bajas a baja concentración de sal. En contraste, la molécula neutra, homodímero H*2L2 (pI = 7,2), permanecía casi inalterada en cuanto al tiempo de retención según se modulaba la concentración de sal, presumiblemente porque la interacción hidrófoba reducida estaba contrarrestada por la interacción electrostática potenciada a baja concentración de sal. Además, como el homodímero H2L2 presentaba una disminución más significativa en el tiempo de retención en comparación con el bsAb HH*L2 (posiblemente debido a su menor valor de pI y, por tanto, interacción electrostática más débil), también se consiguió separación mejorada entre los dos a menor concentración de sal. Como resultado, se consiguió buena separación cromatográfica entre ambos homodímeros y bsAb2 a concentración de sal 75 mM.

Asimismo, la separación entre bsAb3 y sus dos homodímeros también mejoró significativamente cuando la concentración de sal disminuía de 300 mM a 75 mM. Esto es porque los tiempos de retención del homodímero H2L2 (pI = 6,6), el bsAb HH*L2 (pI = 7,4) y el homodímero H*2L2 (pI = 8,3) disminuían, permanecían inalterados o aumentaban, respectivamente. Es destacable que, aunque no se consiguiera resolución basal para algunos de los dos ejemplos, la identificación y cuantificación de homodímeros no deben verse influidas significativamente por las especies que coeluyen, ya que serían para cuantificación basada en UV, debido a la alta especificidad de MS como detector.

En la mezcla de bsAb5, de nuevo se consiguió mejor separación a concentración de sal 75 mM en la columna BEH con respecto a la condición de elevada salinidad. Esto es porque las moléculas relativamente básicas, bsAb HH*L2 (pI = 8,1) y homodímero H*2L2 (pI = 8,5), ambas presentaban tiempos de retención cada vez más tardíos, mientras que el homopolímero H2L2 relativamente neutro (pI = 7,4) no mostró cambio en el tiempo de retención según se disminuía la concentración de sal. Sin embargo, a pesar de la buena separación cromatográfica, esta condición no era ideal para la cuantificación de homodímero, ya que la formación de colas en el pico y la pérdida de recuperación de proteína empezaron a producirse para el homodímero H*2L2 a la concentración de sal baja, debido a su alta basicidad. Además, la mezcla de bsAb4 demostró que no podía conseguirse separación mejorada disminuyendo la concentración de sal de 300 mM a 75 mM. Esto se debe probablemente a que las tres moléculas tienen todas pI casi neutros (tabla 3) y, por tanto, presentan un comportamiento de retención similar con los cambios correspondientes de concentración de sal. Aunque reducir más la concentración de sal para potenciar la interacción electrostática puede mejorar la separación, probablemente se producirán colas en los picos importantes, comprometiendo, por tanto, la cuantificación. También es interesante observar que el perfil de elución de la mezcla de bsAb4 se ensanchaba según aumentaba la concentración de sal. A concentración de sal 300 mM, el orden de elución de las tres moléculas se determinó por XIC (datos no mostrados) como homopolímero H*2L2, bsAb HH*L2 y homopolímero H2L2, lo que fue coherente con su clasificación en la hidrofobia determinada por cromatografía de interacción hidrófoba (tabla 3). Por lo tanto, potenciar más la interacción hidrófoba usando una concentración de sal incluso mayor probablemente mejorará la separación de la mezcla de bsAb4 en esta columna. Desafortunadamente, en función de nuestra experiencia, concentraciones de sal mayores de 300 mM habitualmente crean un problema de desolvatación y alteran significativamente la sensibilidad de MS natural.

Para examinar adicionalmente la separación de las mezclas de bsAb, mientras se usaban concentraciones de sal favorables para análisis de MS, se evaluó una columna Sepax Zenix SEC-300 para interacciones en modo mixto. Las microesferas de sílice de 3 pm en esta columna se recubren con una monocapa erguida química unida, que probablemente contribuye a la hidrofobia moderada de esta columna como se presenta en estudios previos (Yanget al.,2016,supra;Wonget al., supra;Pavonet al., supra).A concentraciones de sal 150 mM y 300 mM, cada una de las cuatro mezclas de bsAb se separaron en esta columna para posterior detección de Ms natural, y los BPC generados se muestran en los paneles de la derecha de la figura 25. Como se esperaba, la mezcla de bsAb4 mostró separación mejorada en la columna Zenix en comparación con la columna BEH cuando se hacía funcionar a las mismas concentraciones de sal. El orden de elución de las tres moléculas también fue coherente con su hidrofobia relativa, con el homodímero H2L2 más hidrófobo eluyendo el último. Obsérvese que la resolución cromatográfica de la mezcla de bsAb4 se mejoró más a concentración de sal 300 mM en comparación con aquella a 150 mM, que se espera ya que la concentración de sal mayor promueve la interacción hidrófoba. Además, la mezcla de bsAb5 se resolvió de forma más eficaz en la columna Zenix en comparación con la columna BEH, presumiblemente debido a las grandes diferencias en la interacción hidrófoba con la matriz de columna entre componentes de la mezcla. En resumen, al modular la concentración de sal en dos columnas de SEC con diferentes propiedades, demostramos que puede conseguirse buena separación cromatográfica para las cuatro mezclas de bsAb a concentraciones de sal favorables para la posterior detección por MS natural. También es probable que otras columnas de SEC, no ensayadas en este estudio, pueden ampliar más la aplicabilidad de este método, al ofrecer interacciones novedosas en modo mixto.

Ejemplo 13. Cuantificación de impurezas homodiméricas por MM-SEC-MS natural.

La cuantificación relativa mediante estrategias basadas en MS a menudo requiere una compresión bien caracterizada de la respuesta de MS (por ejemplo, eficacia de ionización y eficacia de transmisión de iones) de cada analito. A causa del tamaño similar, los bsAb y los homodímeros deben presentar una eficacia de transmisión de iones similar durante el análisis de MS natural. Por otro lado, la eficacia de ionización podría verse afectada por la composición del disolvente en el momento de la elución y la presencia de especies que coeluyen. Como el método de MM-SEC-MS utiliza elución isocrática, pueden eliminarse las influencias en la ionización debido a la diferente composición de disolvente, como se observa habitualmente en métodos de elución con gradiente (por ejemplo, lEX-MS). Para evaluar el rendimiento del método de MM-SEC-MS para evaluar la cuantificación relativa de impurezas homodiméricas, se preparó una serie de muestras de bsAb2 con adiciones que contenían impurezas homodiméricas que varían de abundancias relativas de un 0,1 % a un 10 % para el análisis. Se aplicó la columna Waters BEH que usa la fase móvil con concentración de sal 75 mM para conseguir la separación por MM-SEC entre bsAb2 y los correspondientes homodímeros. Para evaluar la cuantificación relativa de cada homodímero presente dentro de las muestras de bsAb2, se generaron los XIC, basados enm/zde los cuatro estados de carga más abundantes de las especies homodiméricas o bsAb2, y las áreas de pico se integraron y usaron para la cuantificación de la cantidad de cada homodímero. Como se muestra en la figura 26, puede conseguirse fácilmente cuantificación fiable de las impurezas homodiméricas que varían de un 0,1 % a un 10 % por este método. Además, incluso a un nivel de adición de un 0,1 %, aún pueden obtenerse espectros de masas naturales de alta calidad de ambas especies homodiméricas H2L2 y H*2L2 (figura 27, panel de la derecha), que da lugar a identificación y cuantificación de alta confianza.

Se ha desarrollado un método de MM-SEC-MS novedosos y se ha evaluado para detección y cuantificación altamente sensible de impurezas homodiméricas en muestras de bsAb. En primer lugar, investigamos las interacciones en modo mixto entre la molécula de anticuerpo y la matriz de columna durante la separación por SEC a diferentes concentraciones de sal. Usando ocho anticuerpos distintos de pI variable, se observó que, en condiciones definidas de pH, las moléculas básicas presentaban interacciones electrostáticas más fuertes con la matriz de columna en comparación con las moléculas ácidas, y dicha interacción puede potenciarse reduciendo la concentración de sal. Por otro lado, aumentar la concentración de sal durante la separación por SEC puede reducir la interacción electrostática, mientras se promueven las interacciones hidrófobas entre el anticuerpo y la matriz de columna. Estas interacciones en modo mixto proporcionan una oportunidad única para separar anticuerpos con volumen hidrodinámico similar, pero diferentes características superficiales. Aprovechando las diferentes propiedades de columna, se consiguió la separación cromatográfica de cuatro mezclas de bsAb mediante el método de MM-SEC usando interacción electrostática o interacción hidrófoba, que se consiguió fácilmente modulando las concentraciones de sal. También demostramos que la separación cromatográfica conseguida era crucial para obtener detección mejorada de impurezas homodiméricas de baja abundancia por posterior análisis de MS natural. En dos ejemplos de bsAb, las impurezas homodiméricas presentes a un 0,01 % (bsAb2) y un 0,1 % (bsAb4) se detectaron satisfactoriamente usando este método de MM-SEC-MS. Según nuestros conocimientos, este nuevo desarrollo representa el método más sensible en la detección de impurezas homodiméricas en muestras de bsAb. Finalmente, usando una serie de patrones con adiciones, demostramos que el método de MM-SEC-MS puede aportar cuantificación fiable de las impurezas homodiméricas presentes a niveles variables. Debido a la alta sensibilidad, puede obtenerse identificación y cuantificación de alta confianza incluso a niveles tan bajos como de un 0,1 %. En resumen, este método de MM-SEC-MS recién desarrollado proporciona una estrategia altamente sensible para la detección y cuantificación de impurezas homodiméricas en muestras de bsAb y, por tanto, puede usarse para respaldar el desarrollo de bsAb terapéuticos. Finalmente, la aplicación de este método podría ampliarse a otras áreas, tales como caracterización de una mezcla de anticuerpos presentes en productos terapéuticos coformulados.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método para cuantificar una impureza en una muestra, comprendiendo dicho método:

poner en contacto dicha muestra con un sistema cromatográfico que tiene una resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto con una funcionalidad adicional que provoca la separación en modo mixto;

lavar dicha resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto usando una fase móvil para proporcionar un eluyente que incluye la impureza; y

cuantificar una cantidad de la impureza en dicho eluyente usando un espectrómetro de masas, en donde el espectrómetro de masas está acoplado al sistema cromatográfico.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la fase móvil usada para eluir la impureza tiene acetato de amonio, bicarbonato de amonio o formiato de amonio, o combinaciones de los mismos.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la fase móvil usada para eluir la impureza tiene una concentración total de menos de aproximadamente 600 mM de acetato de amonio y bicarbonato de amonio.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la fase móvil usada para eluir la impureza tiene un caudal de aproximadamente 0,2 ml/min - aproximadamente 0,4 ml/min.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la cantidad de la muestra cargada en la resina de cromatografía de exclusión por tamaño en modo mixto es de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 100 pg.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la impureza es una impureza relacionada con el producto.

7. El método de la reivindicación 1, en donde la impureza es un homodímero.

8. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra incluye la impureza y al menos una proteína diana que se separan cuando eluyen.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la proteína diana es un anticuerpo.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

11. El método de la reivindicación 8, en donde la proteína diana es un anticuerpo terapéutico.

12. El método de la reivindicación 1, en donde la funcionalidad adicional es una funcionalidad de interacción hidrófoba.

13. El método de la reivindicación 1, en donde la funcionalidad adicional es una funcionalidad de interacción entre cargas.

14. El método de la reivindicación 1, en donde el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas natural.