ES2963232T3 - Promotor derivado de poxvirus y vector que lo comprende - Google Patents

Promotor derivado de poxvirus y vector que lo comprende Download PDF

Info

Publication number
ES2963232T3
ES2963232T3 ES16803687T ES16803687T ES2963232T3 ES 2963232 T3 ES2963232 T3 ES 2963232T3 ES 16803687 T ES16803687 T ES 16803687T ES 16803687 T ES16803687 T ES 16803687T ES 2963232 T3 ES2963232 T3 ES 2963232T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
vector
nucleic acid
acid molecule
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16803687T
Other languages
English (en)
Inventor
Sujeong Kim
Minjung Kim
Hwanjun Choi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kolon Life Science Inc
Original Assignee
Kolon Life Science Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kolon Life Science Inc filed Critical Kolon Life Science Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2963232T3 publication Critical patent/ES2963232T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
    • C12N15/8636—Vaccina virus vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a un promotor derivado de poxvirus, un vector que lo comprende, un método para expresar un gen extraño en una célula usando el promotor y un uso del vector para prevenir o tratar enfermedades. El promotor según la presente invención se puede utilizar para inducir fuertemente la expresión génica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Promotor derivado de poxvirus y vector que lo comprende
Campo Técnico
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que consiste de, en dirección 5' a 3':
- una molécula de ácido nucleico de fusión de SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2,
- una molécula de ácido nucleico de fusión de SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3,
- una molécula de ácido nucleico de fusión de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3,
- una molécula de ácido nucleico de fusión de SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 2,
- una molécula de ácido nucleico de fusión de SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 1,
- una molécula de ácido nucleico de fusión de SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3, o
- una molécula de ácido nucleico de fusión de SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 1.
La invención también se refiere a un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico y a un hospedero transformado con dicho vector.
Antecedentes de la Técnica
La terapia génica es un método para tratar o prevenir diversas enfermedades tales como defectos genéticos, enfermedades infecciosas, tumor, enfermedades cardiovasculares y similares al administrar material genético tal como ADN y ARN en un cuerpo humano. El suministro génico efectivo y la inducción o regulación de la expresión génica es importante en la terapia génica. Una sustancia usada para suministrar un gen en una célula se denomina un vector. Los vectores de suministro génico se dividen en gran medida en dos categorías, un vector no viral y un vector viral.
Como vectores virales para el suministro génico o la expresión génica en mamíferos, se han usado retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes simple, lentivirus y poxvirus. Entre ellos, el poxvirus se usa ampliamente para el suministro génico y el desarrollo de agentes terapéuticos, ya que tiene una gran capacidad de inserción, excelente suministro génico y eficiencia de expresión, y alta seguridad, y permite la producción de virus con títulos altos.
Los virus que pertenecen a poxviridae incluyen ortopoxvirus, avipoxvirus, parapoxvirus, capripoxvirus, suipoxvirus, etc. Y los virus que pertenecen al ortopoxvirus incluyen el virus de la viruela, el virus vaccinia, etc. El virus vaccinia que pertenecen al ortopoxvirus se ha usado para la prevención de la viruela y recientemente se ha desarrollado como vector de suministro génico mediante el uso de tecnología de ingeniería genética.
La principal ventaja del vector de virus vaccinia es que pueden introducirse genes grandes en comparación con otros virus (por ejemplo, pueden introducirse genes al menos 10 veces más grandes en comparación con los virus adenoasociados) y pueden infectarse diversas células con el virus. Además, el virus vaccinia se considera ideal para su uso como un vector de vacuna, ya que puede inducir una respuesta inmunitaria efectiva. Por ejemplo, una compañía bávara nórdica realiza ensayos clínicos en pacientes con tumores de próstata mediante el uso de un vector MVA que expresa antígenos tumorales tales como PSA o PAP como vacuna contra el cáncer. Además, se han desarrollado vacunas contra el ántrax, vacunas contra el virus de la fiebre hemorrágica y vacunas contra el virus de la estomatitis epidémica, etc. Recientemente, el virus vaccinia también se ha desarrollado como virus oncolítico y está bajo investigación en ensayos clínicos. Como ejemplo, Sillajen (nombre antiguo: Jennerex) ha desarrollado JX-594, un virus oncolítico, y han llevado a cabo o han completado diversos ensayos clínicos del mismo en pacientes con tumor de hígado, tumor de colon, tumor pediátrico y melanoma.
El vector de suministro génico ideal debería suministrar un gen a una célula diana con una alta eficiencia de transducción y exhibir un alto nivel de expresión del gen diana, de modo que pueda lograrse un buen efecto terapéutico. Además, la manipulación y producción del vector debería ser sencilla. En particular, para aumentar la eficacia terapéutica mediante la expresión de un antígeno o un gen terapéutico, el nivel de expresión del gen debe ser alto. Para ello, se requiere una alta eficiencia de transducción mediante un vector de suministro génico y un alto nivel de expresión genética controlada por un promotor fuerte.
Los promotores comunes usados para la expresión génica incluyen el promotor HCMV, EF-1 alfa, CAG y PGK. Sin embargo, en el caso del poxvirus, la transcripción génica tiene lugar en el citoplasma y, por lo tanto, los promotores anteriores no funcionan en el vector de virus vaccinia y debe usarse un promotor derivado de poxvirus. Los promotores derivados de poxvirus representativos incluyen los promotores p7.5, pE/L, pHyb y p11. El documento Xu y otros, 2002 describe la caracterización de los promotores del virus vaccinia y la identificación de sus correspondientes factores de transcripción. El documento US2014/271549 describe métodos para aumentar la eficacia terapéutica de la terapia viral al administrar un antibiótico efectivo contra bacterias comensales con la terapia viral. El documento US2013/280170 describe métodos de formación de imagen para la terapia de virus oncolíticos. El documento CN101418314 describe un vector de expresión de una cepa de vacuna contra la viruela caprina.
Resumen de la invención
La presente invención se define mediante las reivindicaciones anexas.
Solución al Problema
La presente invención se refiere a un promotor derivado de poxvirus que puede inducir fuertemente la expresión de un gen diana, un vector plasmídico que comprende el promotor y un vector de poxvirus obtenido mediante recombinación homóloga del vector plasmídico con el poxvirus (que incluye el poxvirus mutante). En la presente descripción se describe un método para generar el promotor y el vector, y también el uso de un fármaco antitumoral o una vacuna que es un vector de poxvirus en el que se introdujo un gen o antígeno terapéutico.
La molécula de ácido nucleico que regula la expresión genética, es decir, un promotor, de acuerdo con la presente invención se refiere a un promotor que puede inducir un alto nivel de expresión genética, en comparación con otros promotores de poxvirus conocidos. Por lo tanto, cuando se usan en un vector de poxvirus, puede aumentarse el nivel de expresión del gen diana bajo el control del promotor y puede potenciarse el efecto terapéutico del vector que contiene el promotor. Cuando se usa un vector de poxvirus, preferentemente un vector de virus vaccinia para la terapia génica, la selección del promotor es importante para potenciar la expresión de un gen administrado por el vector.
A continuación, la presente invención se describirá con más detalle.
En un aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que regula la expresión genética (es decir, un promotor) derivada de poxvirus, por ejemplo, virus vaccinia, que puede expresar un gen diana con alta eficiencia.
El promotor como se describe en la presente descripción puede ser una molécula de ácido nucleico que comprende dos o más polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en los polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3. Además, puede ser una molécula de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1; y uno o más polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en los polinucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3. Puede ser una molécula de ácido nucleico formada combinando y uniendo dos o más polinucleótidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en los polinucleótidos de la s Eq ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3. La molécula de ácido nucleico según la presente invención está en una dirección de 5' a 3', la molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3, una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3, una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 2, una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 1, una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3, y una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 1.
La molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 se deriva del promotor del gen I1L del virus vaccinia y comprende la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la Tabla 1 más abajo. La molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2 se deriva del promotor del gen E3L del virus vaccinia y comprende la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la Tabla 1 más abajo. La molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3 se deriva del promotor del gen B 19R del virus vaccinia y comprende la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la Tabla 1 más abajo. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender al menos uno o más polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en los polinucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3 que están unidos al extremo 3' del polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 en una dirección de 5' a 3'. Por ejemplo, puede ser una molécula de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de la SEQ ID NO: 9 o 10.
T l 11
Como se usa en la presente descripción, el término "poxvims" se refiere a un virus que pertenece a poxviridae. De acuerdo con una modalidad preferida, el poxvirus de acuerdo con la invención puede incluir ortopoxvirus, avipoxvirus, parapoxvirus, capripoxvirus y suipoxvirus, preferentemente ortopoxvirus, que incluye virus de la viruela y virus vaccinia, y con mayor preferencia virus vaccinia.
El poxvirus de acuerdo con la presente invención incluye poxvirus de tipo salvaje o diversos poxvirus mutantes. La forma mutante del virus puede ser aquella en la que algunos genes han sido eliminados, sustituidos o insertados. Por ejemplo, en el caso del virus vaccinia, se ha intentado desarrollar como un fármaco antitumoral que se replica en las células tumorales sólo en dependencia de la presencia o ausencia de un gen específico. Por tanto, pueden usarse diversas formas mutantes del virus, así como también virus de tipo salvaje.
El vector de poxvirus de acuerdo con la presente invención comprende además un polinucleótido de un gen diana. En una modalidad de la presente invención, el gen diana es un gen cuya expresión se induce bajo el control del promotor de acuerdo con la presente invención, y puede usarse para tener efectos terapéuticos mediante el suministro génico o la expresión génica. Por ejemplo, el gen diana puede ser un polinucleótido que codifica un antígeno tumoral [por ejemplo, MUC1, hTERT, antígeno carcinoembrionario (CEA)], un inductor de la respuesta inmunitaria [por ejemplo, interleucina (IL) -12, factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), o PD-1 soluble], un factor inhibidor del crecimiento tumoral [por ejemplo, inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), inhibidor de las isoenzimas M2 de piruvato quinasa (PKM2) o inhibidor de la piruvato deshidrogenasa quinasa (PDK)], un factor inductor de apoptosis [por ejemplo, TRAIL, timidina quinasa (TK) o citocina desaminasa (CD)], o factores que pueden ser útiles para aumentar la actividad del virus en los tejidos tumorales [por ejemplo, metaloproteinasa de matriz (MMP), hialuronidasa o relaxina].
En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un vector que comprende un promotor de acuerdo con la presente invención.
El vector puede comprender además un gen diana unido al promotor. El vector puede comprender además un gen tal como EGFP, DsRed, LacZ o GusA, que es un marcador de selección.
Como se usa en la presente descripción, el término "vector", "vector de suministro génico" o "vector génico" se refiere a una sustancia que puede suministrar un transgén a una célula u organismo diana.
El vector abarca vectores tanto virales como no virales. El vector no viral puede ser un plásmido. El vector viral puede ser un vector de poxvirus, preferentemente un vector de virus vaccinia.
En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un vector de poxvirus en el que se introduce un promotor de acuerdo con la presente invención. En una modalidad específica, se proporciona un vector de poxvirus construido mediante recombinación homóloga de un vector plásmido que incluye un promotor de la presente invención con un poxvirus de tipo salvaje o diversos poxvirus mutantes.
La recombinación del vector plasmídico con el poxvirus puede llevarse a cabo mediante un método convencional. Otra modalidad de la presente invención se refiere a una célula hospedera que comprende el vector plasmídico o el vector de poxvirus, en donde el hospedero puede ser un microorganismo, una célula de mamífero o una línea celular derivada de un mamífero, y el mamífero puede ser un ser humano.
En la presente descripción se describe un método de propagación de un vector de poxvirus, que comprende las etapas de (i) introducir un vector de poxvirus de acuerdo con la presente invención en células, (ii) cultivar las células en las condiciones adecuadas para permitir que se produzca el vector de poxvirus, y (iii) recuperar el vector poxvirus del cultivo celular.
El poxvirus puede recuperarse de las células, pero también puede recuperarse del sobrenadante del cultivo. Un método comúnmente usado es romper las células infectadas con los virus y luego recolectar los viriones en el lisado celular y luego purificar los viriones mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica (métodos cromatográficos, métodos de ultracentrifugación, etc.).
En la presente descripción se describe una composición que comprende un poxvirus de acuerdo con la presente invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La composición de acuerdo con la presente descripción se usa en terapia génica para prevenir o tratar diversas enfermedades, más específicamente defectos genéticos, tumores, enfermedades cardiovasculares y enfermedades infecciosas.
La presente invención se puede aplicar como agente terapéutico o vacuna para la prevención o tratamiento de diversas enfermedades al introducir un gen terapéutico o un antígeno en un vector de poxvirus, preferentemente un virus vaccinia. Además, la presente invención puede usarse para el desarrollo de un virus oncolítico.
La composición de acuerdo con la presente descripción puede formularse para administración local o parenteral, o tracto digestivo u otras numerosas vías de administración. Por ejemplo, pueden ser posibles las rutas intragástrica, subcutánea, intracardíaca, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonar e intrabronquial. La administración puede realizarse como una administración única o como administraciones repetidas de una o más dosis con un intervalo de tiempo específico. La vía de administración y la dosificación apropiadas pueden decidirse en dependencia de diversos factores, tales como la enfermedad, el paciente, el vector de suministro o el o los genes diana que se suministrarán. El fármaco basado en partículas virales de acuerdo con la presente descripción puede formularse en cantidades de entre 104 y 1014 ufp (unidades formadoras de placa), ventajosamente entre 105 y 1013 ufp, y preferentemente entre 106 y 1012 ufp.
La composición también puede comprender diluyentes, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables y solubilizantes, estabilizadores y conservantes. Para la inyección se prefieren formulaciones en soluciones acuosas, no acuosas o isotónicas. Esto puede proporcionarse como una dosis única o como dosis múltiples en forma líquida o seca (polvo, liofilización, etc.) que puede reconstituirse con un diluyente adecuado en el momento de su uso.
Como se usa en la presente descripción, "suministro génico" se refiere a la introducción (en vivo o en vitro) de un gen o fragmento de gen natural, sintético o recombinante en una célula, que es una forma en que el gen introducido exhibe su función. El gen o fragmento de gen introducido de acuerdo con la presente invención incluye ADN o ARN que tiene una secuencia específica, o cualquier ácido nucleico sintético equivalente.
En la presente descripción, el virus usado para propagar un vector de suministro génico puede ser un virus de tipo salvaje o mutante. Como se usa en la presente descripción, "eficiencia de suministro génico" se refiere a la eficiencia de "suministro génico" del vector, y puede detectarse mediante la evaluación de la función del gen como indicador (por ejemplo, en el caso de un vector de expresión, la expresión de una proteína codificada y/o la actividad de su proteína, etc.).
En la presente descripción se divulga un método para el suministro génico en tejidos animales aislados que comprende las etapas de propagar un vector de suministro génico que comprende un gen diana e introducir el gen en el tejido animal a través del vector de suministro génico.
Cuando el vector de suministro génico de acuerdo con la presente invención se usa como una composición para terapia génica, la administración de acuerdo con la presente invención puede llevarse a cabo mediante una administración local (por ejemplo, administración intratumoral, intrahepática, intramuscular e intracerebral), que incluye inyección directa o administración intravascular (por ejemplo, intraarterial, intravenosa o intraportal) de una suspensión de vector en una solución tal como PBS (solución salina tamponada con fosfato) y una solución salina. En una modalidad, los vectores de suministro génico se producen generalmente en formas de dosificación unitaria para inyección (soluciones, suspensiones o emulsiones acuosas) y se formulan al mezclar los vectores de suministro génico con diluyentes farmacéuticamente aceptables. En la presente descripción, preferentemente no se incluyen en la producción ningún agente oxidante ni otros ingredientes que se sabe que son perjudiciales para el vector de suministro génico. La composición farmacéutica que comprende el vector de suministro génico se almacena generalmente en una solución acuosa o en forma liofilizada en una ampolla o en un vial sellado con un contenedor que tiene unidades de dosis única o múltiple.
Además, la presente descripción proporciona un empaque o kit farmacéutico que comprende uno o más contenedores llenos con una o más de las composiciones farmacéuticas como se describen en la presente descripción. Además, el vector de acuerdo con la invención puede usarse junto con otros compuestos terapéuticos. La composición farmacéutica que comprende el vector de suministro génico de acuerdo con la presente invención puede administrarse a un paciente de acuerdo con el diseño clínico óptimo que tiene en cuenta las condiciones clínicas (es decir, la afección que se va a prevenir o tratar) del paciente, el sitio de suministro de la composición que comprende el vector de suministro génico, tejido diana, métodos de administración, programas de administración y otros factores conocidos en la técnica. Por tanto, una "cantidad efectiva" o una dosificación adecuada del vector de suministro génico descrito en la presente invención se determina en base a estas consideraciones.
Efectos ventajosos de la invención
La presente invención se refiere a un promotor para poxvirus y a un vector viral que comprende el promotor, que puede usarse en el tratamiento y prevención de una enfermedad. La eficacia de un agente terapéutico puede mejorarse mediante un alto nivel de expresión genética.
Breve Descripción de las Figuras
La Figura 1 es un gráfico que muestra la comparación de los niveles de expresión de proteínas de luciferasa después de la transfección de una célula de cáncer de cuello uterino humano (célula HeLa) con plásmidos que contienen promotores únicos de acuerdo con el ejemplo 1.
La Figura 2 es un gráfico que muestra la comparación de los niveles de expresión de luciferasa después de la transfección de una célula de cáncer de cuello uterino humano (célula HeLa) con plásmidos que contienen promotores recombinantes, es decir, pGL4.10-pI1L-E3L, pGL4.10-pI1L-B19R, y pGL4.10-pI1L-I1L de acuerdo con el ejemplo 2.
La Figura 3 muestra el tamaño de los fragmentos de ADN de pSP72-p7.5-Luc obtenidos al introducir el promotor p7.5 (un grupo de control) en un vector lanzadera TK (-) del virus vaccinia, que se trató con las enzimas de restricción de ADN Nhel o BamHI/EcoRI.
La Figura 4 muestra el tamaño de los fragmentos de ADN de pSP72-pI1L-E3L-Luc obtenidos al introducir el promotor I1L-E3L del ejemplo 3 en un vector lanzadera TK (-) del virus vaccinia, que se trató con las enzimas de restricción Nhel/Hindlll al mismo tiempo.
La Figura 5 muestra el tamaño de los fragmentos de ADN de pSP72-pI 1L-B 19R-Luc obtenidos al introducir el promotor I1L-B 19R del ejemplo 3 en un vector lanzadera TK (-) del virus vaccinia, que se trató con las enzimas de restricción Nhel/Hindlll en el Mismo tiempo.
La Figura 6 muestra la confirmación por PCR del ADN genómico de los virus vaccinia TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc y TK(-)-pI1L-B19R-Luc en los que se introduce un promotor de grupo de control o el promotor recombinante obtenido en el ejemplo 3.
La Figura 7 muestra los niveles de expresión de ARNm de luciferasa, GFP y beta actina, confirmados por RT-PCR, de los virus vaccinia TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc y TK(-)-pI1L-B19R-Luc en los que se introduce un promotor de grupo de control o el promotor recombinante obtenido en el ejemplo 3.
La Figura 8 muestra el resultado de la transferencia Southern para la confirmación del ADN genómico de los virus vaccinia TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc y TK(-)-pI1L-B19R-Luc en los que se introduce un promotor de grupo de control o el promotor recombinante obtenido en el ejemplo 3.
La Figura 9 muestra un análisis comparativo de los niveles de expresión de luciferasa en una línea celular de cáncer de cuello uterino humano HeLa o una línea celular de cáncer colorrectal humano SW620 tratada con virus vaccinia TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc, y TK(-)-pI1L-B19R-Luc en los que se introduce un promotor de grupo de control o el promotor recombinante obtenido en el ejemplo 3.
Las Figuras. 10a a 10c representan un mapa vectorial de los virus vaccinia TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc y TK(-)-pI1L-B19R-Luc construido al introducirlo dentro de un promotor de un grupo de control o el promotor recombinante obtenido en el ejemplo 3.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
A continuación, la presente invención se explica detalladamente mediante ejemplos.
Ejemplo 1: Preparación de promotores
1-1: Adquisición de genes promotores y construcción de plásmidos
Cada promotor se obtuvo mediante síntesis de genes. La secuencia de nucleótidos fue la siguiente, la síntesis del gen se encargó a Macrogen y se usó MM192E de Bioautomation, Inc. como sintetizador. El gen promotor se basó en la secuencia de ADN genómico de WR (GenBank: AY243312.1), y las secuencias de cada promotor se muestran en la Tabla 2 más abajo.
T l 21
Para la construcción del plásmido, se añadieron secuencias Kpnl y Xhol a los extremos de las secuencias promotoras pE/L y pIIL, y se añadieron secuencias Nhel y Hindlll a los extremos de las otras secuencias promotoras. Cada uno de los genes promotores pE/L y pIIL se insertó en el vector pGL4.10 [luc2] (Promega, EE. UU.) digerido con Kpnl y Xhol, y se obtuvieron los plásmidos pGL4.10-pE/L y pGL4.10-pIIL.
Los genes promotores p7.5, p11, pE3L, pC11R, pF11L y pB19R se insertaron en vectores pGL4.10 [luc2] digeridos con Nhel y Hindlll, respectivamente, y se generaron los plásmidos pGL4.10-p7.5, pGL4.10-p11, pGL4.10-pE3L, pGL4.10-pC11R, pGL4.10-pF11L y pGL4.10-pB19R.
1-2: Evaluación de la actividad de un promotor único
Se midió la cantidad de proteína luciferasa expresada en cada uno de los ocho tipos de plásmidos generados en el ejemplo 1-1 para evaluar la actividad promotora. Se usaron plásmidos que comprendían los promotores pIIL, pE3L, pC11R, pF11L y pB19R, y plásmidos que contenían promotores p7.5, pE/L y p11 conocidos como grupo de control. Para examinar la actividad promotora de los plásmidos, se transfectaron células HeLa con plásmidos, cada uno de los cuales contiene uno de los ocho tipos de promotores preparados en el ejemplo 1-1, y luego se determinaron las cantidades de expresión de luciferasa. Las células HeLa se cultivaron en un medio MEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % y se inocularon en una placa de cultivo de 24 pocillos a 6 * 104 células/pocillo. Al día siguiente, las células se infectaron con virus vaccinia y, después de 6 horas, las células infectadas con virus se transfectaron con plásmidos en los que se había introducido el promotor del virus mediante el uso de una solución de transfección. Después de 24 horas, se retiraron los medios y una porción del lisado celular obtenido al tratar las células con solución de lisis celular se transfirió a una placa de cultivo de 96 pocillos para medir la luciferasa, y se trató la luciferina, que es un sustrato de la enzima luciferasa. La cantidad de luz generada por la degradación del sustrato se midió mediante el uso de un analizador de luciferasa y los resultados medidos para cada promotor se muestran en la Figura 1. La Figura 1 muestra la comparación de los niveles de expresión de luciferasa después de la transfección de células HeLa, que son líneas celulares de cáncer de cuello uterino humano, con plásmidos que contienen los promotores respectivos. p7.5, pE/L y p11 son los promotores usados previamente como grupos de control, y pE3L, pC11R, pF11L, pB19R y pIIL son promotores candidatos usados en grupos experimentales.
Como se muestra en la Figura 1, el nivel de expresión del gen por el plásmido en el que se introdujo pIIL fue aproximadamente tres veces mayor en comparación con el plásmido de control en el que se introdujo el promotor p7.5, pE/L o p11, y la cantidad de expresión génica por el plásmido en el que se introdujo pE3L o pB19R fue similar al del grupo de control.
1-3: Adquisición de genes promotores recombinantes
Para aumentar la actividad promotora, se generaron promotores recombinantes al combinar el promotor I1L, que mostró la actividad más alta como promotor único en el ejemplo 1-2, con el promotor E3L o B19R, que mostró una actividad relativamente alta. Cada promotor se sintetizó de la misma manera que en el ejemplo 1-1, y su secuencia de nucleótidos fue la siguiente.
T l
Para la construcción del plásmido, se añadieron secuencias Nhel y Hindlll a los extremos de cada secuencia promotora recombinante.
Los genes promotores recombinantes pI1L-E3L, pI1L-B19R y pIIL-IIL se insertaron en el vector pGL4.10 [luc2] digerido con Nhel y Hindlll para generar los plásmidos pGL4.10-pI1L-E3L, pGL4.10-pI1L-B19R, y pGL4.10-pI1L-I1L. Ejemplo 2: Evaluación de la actividad promotora
Se midió la cantidad de proteína luciferasa expresada en los tres tipos de plásmidos generados en los ejemplos 1-3 para evaluar la actividad promotora.
Específicamente, para examinar la actividad promotora de los plásmidos, se midieron los niveles de expresión de luciferasa después de la transfección de células HeLa con los plásmidos. Se inocularon células HeLa cultivadas en medio MEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % en una placa de cultivo de 24 pocillos a 6 * 104 células por pocillo. Al día siguiente, las células se infectaron con el virus vaccinia y, después de 6 horas, los plásmidos en los que se introdujo el promotor del virus vaccinia se trataron con células infectadas con virus mediante el uso de una solución de transfección. Después de 2 horas, se eliminó el medio alrededor de las células y una porción del lisado celular obtenido al tratar el lisado celular se transfirió a una placa de cultivo de 96 pocillos para la medición de la luciferasa y se trató la luciferina, que es un sustrato de la enzima luciferasa. La cantidad de luz generada por la degradación del sustrato se midió mediante el uso de un analizador de luciferasa y los resultados medidos para cada promotor se muestran en la Figura 2 y la Tabla 4. La Figura 2 muestra la comparación de las actividades de los promotores recombinantes producidos al combinar pE3L o pB19R, que tiene una actividad relativamente alta, con pIIL, que exhibió la actividad más alta en el ejemplo 1.
Como se muestra en la Figura 2, el plásmido en el que se introdujo el promotor recombinante pI1L-E3L o pI1L-B19R mostró una cantidad de expresión génica aproximadamente 6 veces mayor que la del plásmido en el que se introdujo el promotor p7.5 como grupo de control, y mostró una cantidad de expresión génica aproximadamente 2,4 veces mayor que la del plásmido en el que se introdujo el promotor único pIIL. Además, el plásmido pI1L-I1L preparado al combinar dos copias del promotor pIIL que tiene una alta actividad promotora mostró que el nivel de expresión aumentó aproximadamente 1,5 veces en comparación con el plásmido en el que se introdujo el promotor único pIIL.
T l 4
En el caso de pIIL-IIL obtenido al combinar dos copias de pIIL que tiene la actividad más alta en el ejemplo 1-2, la actividad de la luciferasa fue 8,661,349, que aumenta menos del doble en comparación con pIIL. Sin embargo, cuando pIIL se combinó con E3L o B19R, la actividad aumentó más del doble. Como se muestran en los resultados de la Figura 1, la actividad de p7.5 fue la más alta entre los promotores existentes, pero se confirmó en la Figura 2 que las actividades de todos los promotores usados en el experimento fueron superiores a las de p7.5.
Ejemplo 3: Vector viral introducido por el promotor
3-1: Construcción del vector lanzadera para el vector viral
Para examinar si el resultado de la evaluación de la actividad del promotor medida mediante el uso del plásmido en el que se introdujo el promotor recombinante puede aplicarse a los virus de la misma manera, se introdujeron juntos el promotor viral de acuerdo con la presente invención y el gen reportero luciferasa en el vector lanzadera del virus pSP72-TK(-) en el que se eliminó el gen TK.
El pGL4.10-p7.5 usado como grupo de control en el ejemplo 1-1 y pGL4.10-pI1L-E3L y pGL4.10-pI1L-B19R obtenidos en el ejemplo 1-3 se cortaron por Nhel y XbaI, y se obtuvieron genes de los promotores y la luciferasa. Los genes así obtenidos se insertaron en vectores lanzadera pSP72-TK(-) cortados por Nhel y XbaI, y finalmente se obtuvieron pSP72-TK(-)-p7.5-Luc, pSP72-TK(-)-pI1L-E3L-Luc, y pSP72-TK(-)-pI1L-B19R-Luc.
3-2: Generación de virus vaccinia recombinante
El vector lanzadera recombinante preparado en el ejemplo 3-1 junto con el virus vaccinia de tipo salvaje se introdujo en las células para preparar un virus recombinante. Se preparó el virus vaccinia recombinante al insertarlo en la posición del gen TK del virus vaccinia mediante recombinación homóloga.
Específicamente, se inocularon células HeLa cultivadas en medio MEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % en una placa de cultivo de 6 pocillos a 3 * 105 células/pocillo. Al día siguiente, se trataron los vectores lanzadera del virus vaccinia pSP72-TK(-)-p7.5-Luc, pSP72-TK(-)-pI1L-E3L-Luc, y pSP72-TK(-)-pI1L-B19R-Luc con una solución de transfección y se infectaron los virus vaccinia a 0,05 MOI, y 4 horas después, el medio de cultivo se reemplazó con medio MEM suplementado con suero bovino fetal al 5 % y luego se cultivó durante 48 horas. Las células cultivadas se retiraron del medio y se congelaron y descongelaron tres veces para obtener virus crudos, que luego se sometieron a un método de aislamiento en placa tres veces para obtener un clon de virus recombinantes puros. Se midió la potencia del virus así obtenido en células Vero mediante el uso del método TCID50, y la estructura se confirmó mediante RT-PCR, PCR de ADN genómico, secuenciación y transferencia Southern, y luego se usó para un experimento. Como resultado, se obtuvieron finalmente TK(-)-p7.5-Luc (Figura 10a), TK(-)-pI1L-E3L-Luc (Figura 10b), TK(-)-pI1L-B19R-Luc (Figura 10c), que son los virus vaccinia recombinantes en los que se introdujo cada promotor y luciferasa.
3-3: Medición de la potencia del virus
La concentración de virus infecciosos se denomina concentración diluida de los virus que infectan el 50 % de las células hospederas cultivadas, es decir, el 50 % de la dosis infecciosa del cultivo de tejidos (TCID50). La potencia de los virus se midió mediante el uso de métodos de TCID50 y se analizaron las características de los virus recombinantes.
Específicamente, las células Vero se cultivaron en una placa de 96 pocillos a 5 * 103 células/pocillo, y los virus se diluyeron respectivamente a 1/10, 1/102, 1/103, 1/104, l / l 05, 1/106, 1/107y 1/108 y luego se infectó en cada pocillo. Después de 4 días, se contó el número de pocillos en los que apareció el CPE (efecto citopático) y se calculó el título. Los resultados de la titulación de virus se muestran en la Tabla 5.
T l
Como se muestra en la Tabla 5, los tres virus recombinantes exhibieron títulos similares, lo que indica que tenían una productividad similar.
3-4: Análisis de la estructura del virus recombinante
Para realizar la PCR del ADN genómico, se extrajo el ADN genómico del virus y se confirmó mediante PCR el tamaño del transgén insertado en lugar del gen TK. La recombinación se confirmó por comparación con el virus IHD-W de tipo salvaje.
Los resultados se muestran en la Figura 6. Como se muestra en la Figura 6 , se confirmó que, en el caso del virus de tipo salvaje, el fragmento de 966 pb se amplificó mediante la PCR, y en el caso del virus recombinante, la longitud del fragmento amplificado mediante la introducción del gen aumentó a 3,1 ~ 3,2 Kb, lo que indica que no había ninguna anomalía en la estructura del ADN.
Las células HeLa se cultivaron en placas de cultivo de 6 pocillos a 3 * 105 células/pocillo para realizar la RT-PCR de ARN viral, y los virus recombinantes que se habían sometido a la medición de títulos anterior se cultivaron durante 48 horas después del tratamiento con 0,05 MOI. Luego, las células se lisaron mediante tratamiento con trizol y se extrajo el ARN y se sintetizó el ADNc en vitro. La estructura del transgén se analizó por PCR mediante el uso del ADN como plantilla y se confirmó la recombinación. La Figura 7 indica que el ARNm de luciferasa y EGFP se expresó bien en los tres tipos de virus recombinantes a diferencia del virus de tipo salvaje en el que no se introdujo ningún gen exógeno.
Para realizar la transferencia Southern, se cultivaron células HeLa en una placa de cultivo 75T a 2 * 106 células/pocillo y los virus recombinantes que se habían sometido a la medición de títulos anterior se cultivaron durante 72 horas después del tratamiento con 0,05 MOI. Después de retirar el medio de cultivo celular, las células se congelaron y descongelaron tres veces para obtener el virus. El ADN genómico del virus se extrajo y se cortó con una enzima de restricción Hind III, y las bandas se separaron de agarosa al 0,8 %, se transfirieron a una membrana de nailon, se fijaron a 120 °C y se hibridaron con una sonda marcada con DIG. Después del contacto con el sustrato final tras los procesos de lavado y bloqueo, se identificaron bandas selectivas de ADN. Los resultados del análisis de transferencia Southern se muestran en la Figura 8.
Como se muestra en la Figura 8, en el caso del virus de tipo salvaje, la sonda se unió al fragmento de ADN de 5005 pb, pero en el caso del virus recombinante, la sonda se unió al fragmento de ADN reducido a 1337 pb mediante la introducción del gen. Así, se descubrió que no había ninguna anomalía en la estructura del ADN del sitio donde se introdujo el transgén. El sitio donde se une la sonda está indicado por una flecha azul.
Ejemplo 4: Evaluación del nivel de expresión de proteínas por virus recombinante
Los virus vaccinia recombinantes TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc, TK(-)-pI1L-B19R-Luc construidos en el ejemplo 3-2 se infectaron en una línea celular de cáncer de cuello uterino humano HeLa o línea celular de cáncer de colon humano SW620, y se analizaron los niveles de expresión de luciferasa regulados por los respectivos promotores.
Específicamente, se inocularon células HeLa o células SW620 cultivadas en medio MEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % en una placa de cultivo de 12 pocillos a 2 * 105 células/pocillo. Al día siguiente, se infectaron con cada uno de los virus recombinantes (WT de tipo salvaje, p7.5, I1L-E3L e I1L-B19R) a 1 MOI. Después de 6 horas, se eliminó el medio de cultivo que rodeaba las células y se añadió solución de lisis celular. Una porción de los lisados celulares se transfirió a una placa de cultivo de 96 pocillos para medir la luciferasa y se trató con luciferina, que es un sustrato de la enzima luciferasa. La cantidad de luz generada por la degradación del sustrato se midió mediante el uso de un analizador de luciferasa y los resultados se muestran en la Figura 9. La Figura 9 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión de luciferasa después de que la línea celular de cáncer de cuello uterino humano HeLa o la línea celular de cáncer de colon humano SW620 se infectaran con los virus vaccinia recombinantes TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc, y TK(-)-pI1L-B19R-Luc.
Como se muestra en la Figura 9, los niveles de expresión de luciferasa por el virus recombinante que contiene el promotor pI1L-B19R tanto en HeLa como en SW620 fueron aproximadamente dos veces tan altos como los del virus de control que contiene el promotor p7.5.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico que consiste en, en dirección 5' a 3':
una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO 1 y la SEQ ID NO: 2,
una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO 1 y la SEQ ID NO: 3,
una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO 1, la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3, una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO 1, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 2, una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO 2 y la SEQ ID NO: 1,
una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO 2, la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3, o una molécula de ácido nucleico de fusión de la SEQ ID NO 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 1.
2. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
3. El vector de acuerdo con la reivindicación 2, que es un virus.
4. El vector de acuerdo con la reivindicación 3, que se deriva de un virus de un poxviridae.
5. El vector de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el virus del poxviridae se selecciona del grupo que consiste en los virus de los géneros ortopoxvirus, avipoxvirus, parapoxvirus, capripoxvirus y suipoxvirus.
6. El vector de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el poxvirus es el virus vaccinia.
7. El vector de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además un gen diana unido a la molécula de ácido nucleico.
8. El vector de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el gen diana es un polinucleótido que codifica un antígeno tumoral, un factor inductor de respuesta inmunitaria, un factor inhibidor del crecimiento tumoral, un factor inductor de apoptosis o un factor que puede ayudar a potenciar una actividad de un virus en un tejido tumoral.
9. El vector de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además un sitio de reconocimiento de enzima de restricción en al menos un extremo del ácido nucleico.
10. Una célula hospedera transformada con un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
11. La célula hospedera de acuerdo con la reivindicación 10, que es un microorganismo, una célula de mamífero o una línea celular derivada de un mamífero.
ES16803687T 2015-05-29 2016-05-27 Promotor derivado de poxvirus y vector que lo comprende Active ES2963232T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150076197A KR20160140075A (ko) 2015-05-29 2015-05-29 폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터
PCT/KR2016/005647 WO2016195332A1 (ko) 2015-05-29 2016-05-27 폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2963232T3 true ES2963232T3 (es) 2024-03-25

Family

ID=57441573

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16803687T Active ES2963232T3 (es) 2015-05-29 2016-05-27 Promotor derivado de poxvirus y vector que lo comprende

Country Status (9)

Country Link
US (1) US11001860B2 (es)
EP (1) EP3305904B1 (es)
JP (1) JP6736665B2 (es)
KR (1) KR20160140075A (es)
CN (1) CN107735493B (es)
AU (1) AU2016273577B2 (es)
CA (1) CA2986376C (es)
ES (1) ES2963232T3 (es)
WO (1) WO2016195332A1 (es)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112020014727A2 (pt) * 2018-01-19 2020-12-08 Kolon Life Science, Inc. Vírus vaccinia recombinante e composição farmacêutica compreendendo o mesmo
CN110499297B (zh) * 2019-08-29 2021-07-09 上海市公共卫生临床中心 一种新型溶瘤病毒及其制备方法和应用
TW202122411A (zh) 2019-09-02 2021-06-16 美國亞利桑那州立大學亞利桑那州評議委員會 以黏液瘤(myxoma)病毒治療癌症之新穎溶瘤病毒平臺
JP2024508920A (ja) * 2021-03-01 2024-02-28 オンコミクス セラピューティクス，インク． 多武装の粘液腫ウイルス

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5833975A (en) * 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
JPH02186992A (ja) * 1989-01-11 1990-07-23 Hisatoshi Shida 複合ウイルスプロモーター
US5547862A (en) * 1993-07-29 1996-08-20 Ambion Inc. Vectors containing multiple promoters in the same orientation
US7285526B2 (en) * 1995-07-14 2007-10-23 Meiogen Biotechnology Corporation Interferon antagonists useful for the treatment of interferon related diseases
ATE315660T1 (de) * 2002-05-16 2006-02-15 Bavarian Nordic As Intergene regionen als insertionsstellen im genom von modifiziertem vaccinia virus ankara (mva)
CA2501168A1 (en) * 2002-11-25 2004-06-10 Bavarian Nordic A/S Recombinant poxvirus comprising at least two cowpox ati promoters
EP2363493B1 (en) * 2003-02-20 2012-11-14 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Novel insertion sites in pox vectors
ATE420160T1 (de) * 2003-06-18 2009-01-15 Genelux Corp Modifizierte rekombinante vacciniaviren, verwendungen davon
JP2007503834A (ja) * 2003-09-05 2007-03-01 サノフィ パストゥール リミテッド 黒色腫用の多抗原ベクター
CN101418314A (zh) * 2007-10-24 2009-04-29 石河子大学 山羊痘疫苗株表达载体
NZ592082A (en) 2008-11-27 2013-03-28 Bavarian Nordic As Promoters for recombinant viral expression
US8394385B2 (en) 2009-03-13 2013-03-12 Bavarian Nordic A/S Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic T cell response against recombinant antigen in MVA vaccines
CN102174508A (zh) * 2011-02-23 2011-09-07 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 山羊痘病毒复制非必需区的筛选方法及其通用转移载体
WO2012122649A1 (en) * 2011-03-15 2012-09-20 Ottawa Hospital Research Institute Recombinant orf virus
ES2733211T3 (es) 2011-04-15 2019-11-28 Genelux Corp Cepas clonales de virus vaccinia atenuados y métodos de uso de las mismas
FI20115914L (fi) 2011-09-16 2013-03-17 Oncos Therapeutics Ltd Muunnettu onkolyyttinen virus
WO2013158265A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Genelux Corporation Imaging methods for oncolytic virus therapy
US20140271549A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Aladar A. Szalay Use of Antibiotics to Enhance Treatment With Therapeutic Viruses

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016195332A1 (ko) 2016-12-08
JP2018516599A (ja) 2018-06-28
CA2986376C (en) 2021-10-26
CN107735493A (zh) 2018-02-23
US20180080048A1 (en) 2018-03-22
EP3305904A4 (en) 2019-02-06
US11001860B2 (en) 2021-05-11
CN107735493B (zh) 2021-11-19
AU2016273577B2 (en) 2019-09-26
EP3305904B1 (en) 2023-09-13
JP6736665B2 (ja) 2020-08-05
AU2016273577A1 (en) 2017-11-30
KR20160140075A (ko) 2016-12-07
CA2986376A1 (en) 2016-12-08
EP3305904A1 (en) 2018-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Carroll et al. Poxviruses as expression vectors
ES2883354T3 (es) Vector adenoviral
JP5075839B2 (ja) 癌の処置のための腫瘍崩壊性アデノウイルス
EP2486137B1 (en) Replication-competent ad11p based viral vectors
ES2882538T3 (es) Nuevos virus de la vaccinia modificados por ingeniería genética
CA2568995E (en) Construction of oncolytic adenovirus recombinant specifically expressing immune modulatory factor gm-csf in tumor cells and uses thereof
WO2013038066A1 (en) Modified oncolytic vaccinia virus
CN105765062A (zh) 丝裂原活化蛋白激酶依赖性重组痘苗病毒（md-rvv）及其应用
ES2963232T3 (es) Promotor derivado de poxvirus y vector que lo comprende
ES2996307T3 (en) Fowl adenovirus 9 (fadv-9) vector system and associated methods
US11344589B2 (en) Genetically engineered vaccinia viruses
PT1567653E (pt) Poxvírus recombinante que compreende pelo menos dois promotores do vírus da varíola bovina ati
US11932879B2 (en) Mumps virus as a potential oncolytic agent
CN120380015A (zh) 嵌合痘病毒
ES2617926T3 (es) Modulación de respuestas inmunitarias por la proteína K4 poxvírica
WO2020011754A1 (en) Chimeric vaccinia viruses
ES2231186T3 (es) Agente inmunoterapeutico especifico para organo, tejido y celula para infecciones virales cronicas, asi como enfermedades inflamatorias, degenerativas y proliferativas, especialmente del higado, asi como cancer basado en virus parapox recombinante.
KR101866511B1 (ko) 폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터
ES2325303T3 (es) Vectores adenoviricos lanzadera con e1b suprimida.
ES3018628T3 (es) Adenovirus oncolíticos no humanos y usos de los mismos
CN102108356B (zh) 新颖启动子及包含其之病毒载体
Salem et al. Gene therapy and virus-based cancer vaccines
RU2692628C1 (ru) Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF вируса осповакцины, продуцирующий белок NS1 парвовируса H-1 и обладающий онколитической активностью в отношении глиобластомы человека
ES2367240T3 (es) Vectores adenovíricos para le tratamiento de enfermedades.
WO2026041811A1 (en) Recombinant poxvirus and method for regulating the expression of toxic conditional gene products of said recombinant poxvirus in a producing cell