JPH02186992A - 複合ウイルスプロモーター - Google Patents
複合ウイルスプロモーターInfo
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- JPH02186992A JPH02186992A JP1002878A JP287889A JPH02186992A JP H02186992 A JPH02186992 A JP H02186992A JP 1002878 A JP1002878 A JP 1002878A JP 287889 A JP287889 A JP 287889A JP H02186992 A JPH02186992 A JP H02186992A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は前期発現プロモーター及び後期発現プロモータ
ーを含んで成るウィルス複合プロモーター及び該複合プ
ロモーターを含んで成るワクシニアウィルスに関する。
ーを含んで成るウィルス複合プロモーター及び該複合プ
ロモーターを含んで成るワクシニアウィルスに関する。
さらに詳しくは、本発明の複合プロモーターは前期発現
プロモーターとしての７．５Ｋｄ蛋白質遺伝子のプロモ
ーター（７，５にプロモーター）の下流側部分と、後期
発現プロモーターとから成る。
プロモーターとしての７．５Ｋｄ蛋白質遺伝子のプロモ
ーター（７，５にプロモーター）の下流側部分と、後期
発現プロモーターとから成る。
ワクシニアウィルスに病原ウィルス由来の抗原遺伝子を
挿入した組換えワクシニアウィルスをワクチンとして使
用することが種々提案されている。
挿入した組換えワクシニアウィルスをワクチンとして使
用することが種々提案されている。
この場合、挿入された抗原遺伝子を動物細胞中で発現せ
しめるなめには、そのワクシニアウィルス自身がコード
しているＲＮＡポリメラーゼのみにより認識されるウィ
ルスプロモーターが！ｚ・須である。
しめるなめには、そのワクシニアウィルス自身がコード
しているＲＮＡポリメラーゼのみにより認識されるウィ
ルスプロモーターが！ｚ・須である。
ウィルスプロモーターはそれが機能する時期により２つ
の範ちゅうに分けられる。一方は、ウィルスが細胞に感
染した後肢ウィルスのＤＮＡの合成が開始される前に機
能するプロモーターであって前期プロモーターと称され
、他方は該ウィルスのＤＮＡの合成の開始後に機能する
プロモーターであって後期プロモーターと称される。前
期プロモーターとしてチミジンキナーゼ遺伝子のプロモ
ーター（ＴＫプロモーター）、ワクシニアウィルスＤＮ
Ａの旧ｎｄＩ［［Ｆ断片由来のプロモーター（Ｆプロモ
ーター）等が知られており、他方後期プロモーターとし
てワクシニアウィルス１１Ｋｄ蛋白質遺伝子のプロモー
ター（Ｌ１１プロモーター）、ＡＴＩプロモーター等が
知られている。また、７．５にプロモーターは前期発現
領域及び後期発現領域を含有し、このプロモーターの内
−３１位からｍＲＮＡ転写開始点くこれを１位とする）
までの部分（下流側部分と称する）により前期発現が得
られることが知られている （Ｍ、＾、Ｃｏｃｈｒａｎ
等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ５４
． ｐ、３０−３７．１９８５）。同様に、ＴＫプロモ
ーターについても、−３２位からｍＲＮＡ転写開始部位
（これを１位とする）までの領域により前期発現プロモ
ーターとしての活性が発揮されることが知られている
（Ｊ、ＰＪｌｅｉｒ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 １５８．
２０８−２ｉ０．１９８７）。Ｂ、Ｃｏｕｐａｒ等、Ｅ
ｕｒ、Ｊ、ｌｎｍｕｎｏｌ、、１６．１４７９−１４８
７．１９８６には、７．５にプロモーター、Ｆプロモー
ター又はＬｌｌプロモーターの下流にインフルエンザウ
ィルス・ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を連結し、ワク
シニアウィルスにおいてＨＡ３ｍ伝子ｍ発子せしめ、発
現生成物による細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導を観察
した場合、７．５にプロモーター、及びＦプロモーター
はＣＴＬを誘導したがＬｌｌプロモーターはＣＴＬを誘
導しなかった旨記載されている。このことは、後期発現
プロモーターによる抗原遺伝子の発現によってはＣＴＬ
誘導により代表される細胞性免疫の誘導が十分に行われ
ないことを示唆している。
の範ちゅうに分けられる。一方は、ウィルスが細胞に感
染した後肢ウィルスのＤＮＡの合成が開始される前に機
能するプロモーターであって前期プロモーターと称され
、他方は該ウィルスのＤＮＡの合成の開始後に機能する
プロモーターであって後期プロモーターと称される。前
期プロモーターとしてチミジンキナーゼ遺伝子のプロモ
ーター（ＴＫプロモーター）、ワクシニアウィルスＤＮ
Ａの旧ｎｄＩ［［Ｆ断片由来のプロモーター（Ｆプロモ
ーター）等が知られており、他方後期プロモーターとし
てワクシニアウィルス１１Ｋｄ蛋白質遺伝子のプロモー
ター（Ｌ１１プロモーター）、ＡＴＩプロモーター等が
知られている。また、７．５にプロモーターは前期発現
領域及び後期発現領域を含有し、このプロモーターの内
−３１位からｍＲＮＡ転写開始点くこれを１位とする）
までの部分（下流側部分と称する）により前期発現が得
られることが知られている （Ｍ、＾、Ｃｏｃｈｒａｎ
等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ５４
． ｐ、３０−３７．１９８５）。同様に、ＴＫプロモ
ーターについても、−３２位からｍＲＮＡ転写開始部位
（これを１位とする）までの領域により前期発現プロモ
ーターとしての活性が発揮されることが知られている
（Ｊ、ＰＪｌｅｉｒ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 １５８．
２０８−２ｉ０．１９８７）。Ｂ、Ｃｏｕｐａｒ等、Ｅ
ｕｒ、Ｊ、ｌｎｍｕｎｏｌ、、１６．１４７９−１４８
７．１９８６には、７．５にプロモーター、Ｆプロモー
ター又はＬｌｌプロモーターの下流にインフルエンザウ
ィルス・ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を連結し、ワク
シニアウィルスにおいてＨＡ３ｍ伝子ｍ発子せしめ、発
現生成物による細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導を観察
した場合、７．５にプロモーター、及びＦプロモーター
はＣＴＬを誘導したがＬｌｌプロモーターはＣＴＬを誘
導しなかった旨記載されている。このことは、後期発現
プロモーターによる抗原遺伝子の発現によってはＣＴＬ
誘導により代表される細胞性免疫の誘導が十分に行われ
ないことを示唆している。
従って本発明は、抗原遺伝子を組み込んだワクシニアウ
ィルスをワクチンとして使用する場合に、該抗原遺伝子
を前期及び後期にわたって発現せしめることができ、従
って体液性免疫及び細胞性免疫の両者を誘導することが
できる新規なウィルスプロモーターを提供するものであ
る。
ィルスをワクチンとして使用する場合に、該抗原遺伝子
を前期及び後期にわたって発現せしめることができ、従
って体液性免疫及び細胞性免疫の両者を誘導することが
できる新規なウィルスプロモーターを提供するものであ
る。
本発明者等は、上記の課題を解決すべく種々のプロモー
ターの組み合わせを検討した結果、後期発現プロモータ
ーと、７．５にプロモーターの前期発現領域（下流側領
域）とを含んで成る複合プロモーターを用いることによ
り上記の目的が達成されることを見出だしな。
ターの組み合わせを検討した結果、後期発現プロモータ
ーと、７．５にプロモーターの前期発現領域（下流側領
域）とを含んで成る複合プロモーターを用いることによ
り上記の目的が達成されることを見出だしな。
従って本発明は、後期発現プロモーター、及び７．５Ｋ
ｄ蛋白質遺伝子のプロモーターの下流側領域を含んで成
るウィルスプロモーターであって、該プロモーターの下
流に外来構造遺伝子が連結された場合に該構造遺伝子を
ウィルス感染の前期及び後期にわたって発現することが
できる複合プロモーターを提供する。
ｄ蛋白質遺伝子のプロモーターの下流側領域を含んで成
るウィルスプロモーターであって、該プロモーターの下
流に外来構造遺伝子が連結された場合に該構造遺伝子を
ウィルス感染の前期及び後期にわたって発現することが
できる複合プロモーターを提供する。
本発明はさらに、前記の複合プロモーター、及び該プロ
モーターの下流に続く任意の外来構造遺伝子を含んで成
るワクシニアウィルスを提供する。
モーターの下流に続く任意の外来構造遺伝子を含んで成
るワクシニアウィルスを提供する。
本発明の複合ウィルスプロモーターは、後期発現を支配
する例えばＡＴＩプロモーターと、前期発現を支配する
７、５にプロモーターの下流側領域とを含んで成る。
する例えばＡＴＩプロモーターと、前期発現を支配する
７、５にプロモーターの下流側領域とを含んで成る。
ｔ′ プロモーター
後期発現プロモーターとしてＡＴＩプロモーター又はそ
の他の後期発現プロモーターを使用することができる。
の他の後期発現プロモーターを使用することができる。
ＡＴＩプロモーターは例えば牛痘ウィルスのゲノムから
クローニングすることができ、このプロモーターを含む
ＡＴＩ遺伝子のクローニング方法、及びＡＴＩプロモー
ターの塩基配列は、特開昭６１−２２２１９４号明細書
（ヨーロッパ出願公開ＩＩｋＬ８７３０８３７２．９）
に詳細に記載されており、そしてこのプロモーターを含
有するプラスミドｐ８２３により形質転換された大腸菌
ニジエリシャ・コリ（Ｅｓｃｌ＋ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）ＪＭ１０９−８２３は工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第１４５９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４５９）としてブタベスト条約に基づき国際寄託されて
いる。従って、ＡＴＩプロモーターは前記プラスミドρ
Ｂ２３から容易に切り出すことができ、また、前記公開
公報に開示されている方法に従って、当業者が容易に入
手することができる牛疫ウィルス株のいずれかから容易
にクローニングすることができる。
クローニングすることができ、このプロモーターを含む
ＡＴＩ遺伝子のクローニング方法、及びＡＴＩプロモー
ターの塩基配列は、特開昭６１−２２２１９４号明細書
（ヨーロッパ出願公開ＩＩｋＬ８７３０８３７２．９）
に詳細に記載されており、そしてこのプロモーターを含
有するプラスミドｐ８２３により形質転換された大腸菌
ニジエリシャ・コリ（Ｅｓｃｌ＋ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）ＪＭ１０９−８２３は工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第１４５９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４５９）としてブタベスト条約に基づき国際寄託されて
いる。従って、ＡＴＩプロモーターは前記プラスミドρ
Ｂ２３から容易に切り出すことができ、また、前記公開
公報に開示されている方法に従って、当業者が容易に入
手することができる牛疫ウィルス株のいずれかから容易
にクローニングすることができる。
回 チプロモーター
本発明においては前期発現プロモーターとして、７．５
にプロモーターの前期発現領域を用いる。ワクシニアウ
ィルス７．５にプロモーターの後期発現、及び前期発現
のそれぞれに必須の領域の同定はすでに行われている
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ、
５４ｐ、３Ｏ−３７（１９８５））。この論文中ではプ
ロモーター領域の下流にクロラムフェニルコール・アセ
チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を連結したも
のをワクシニアウィルスのゲノム中チミジンキナーゼ（
ＴＫ）遺伝子に挿入した組換えワクシニアウィルスを作
製し、ＤＮＡ合成阻害剤である＾ｒａ−Ｃ存在下、及び
非存在下でウィルスを感染させて、ＣＡＴ測定を行った
。前期発現プロモーターに必須な領域の同定には５′側
からの欠失を有するプロモーターでのＣＡＴ遺伝子の発
現量をＣＡＴ測定により決定した。その結果−３１位（
ｍＲＮＡ転写開始点を１位とする）までの欠失では＾ｒ
ａ−Ｃ存在下でのＣＡＴ発現、つまり後期遺伝子発現を
抑制した状態でのＣＡＴ発現は影響をうけないが、−２
４位までの欠失では発現量がほとんど消失しな。したが
って−３１の位置からｍＲＮＡの転写開始点までの配列
が存在しさえすれば、７．５にプロモーターの前期発現
が得られることが判明しな。
にプロモーターの前期発現領域を用いる。ワクシニアウ
ィルス７．５にプロモーターの後期発現、及び前期発現
のそれぞれに必須の領域の同定はすでに行われている
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ、
５４ｐ、３Ｏ−３７（１９８５））。この論文中ではプ
ロモーター領域の下流にクロラムフェニルコール・アセ
チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を連結したも
のをワクシニアウィルスのゲノム中チミジンキナーゼ（
ＴＫ）遺伝子に挿入した組換えワクシニアウィルスを作
製し、ＤＮＡ合成阻害剤である＾ｒａ−Ｃ存在下、及び
非存在下でウィルスを感染させて、ＣＡＴ測定を行った
。前期発現プロモーターに必須な領域の同定には５′側
からの欠失を有するプロモーターでのＣＡＴ遺伝子の発
現量をＣＡＴ測定により決定した。その結果−３１位（
ｍＲＮＡ転写開始点を１位とする）までの欠失では＾ｒ
ａ−Ｃ存在下でのＣＡＴ発現、つまり後期遺伝子発現を
抑制した状態でのＣＡＴ発現は影響をうけないが、−２
４位までの欠失では発現量がほとんど消失しな。したが
って−３１の位置からｍＲＮＡの転写開始点までの配列
が存在しさえすれば、７．５にプロモーターの前期発現
が得られることが判明しな。
この結果に基づいて、本発明においては一３１位の位置
からｍＲＮＡの転写開始点までの配列から成る３６ｍｅ
ｒのＤＮＡ断片及び−３１位の位置からＲｓａ ｌ切断
部位までの配列から成る６９ｒｎｅｒのＤＮＡ断片を１
ヒ学合成し、これをＡＴＩプロモーターに連結し、ＣＡ
Ｔの前期発現を試験し、これらの合成プロモーターによ
りＣＡＴの前期発現が得られることを確認しな。従って
本発明においては、７．５にプロモーターの内、少なく
とも一３１位から下流の領域を含有する任意の領域を前
期発現プロモーターとして使用することができる。
からｍＲＮＡの転写開始点までの配列から成る３６ｍｅ
ｒのＤＮＡ断片及び−３１位の位置からＲｓａ ｌ切断
部位までの配列から成る６９ｒｎｅｒのＤＮＡ断片を１
ヒ学合成し、これをＡＴＩプロモーターに連結し、ＣＡ
Ｔの前期発現を試験し、これらの合成プロモーターによ
りＣＡＴの前期発現が得られることを確認しな。従って
本発明においては、７．５にプロモーターの内、少なく
とも一３１位から下流の領域を含有する任意の領域を前
期発現プロモーターとして使用することができる。
７．５にプロモーターの前期発現領域の化学合成につい
ては実施例１において具体的に記載する。
ては実施例１において具体的に記載する。
１１乙ジｉ二り二
本発明の複合プロモーターは前記の少なくとも１個のＡ
ＴＩプロモーターあるいは他の後期発現プロモーターと
、少なくとも１個の７，５にプロモーターの前期発現領
域を含有すればよい、これら２種類のプロモーターの順
序は特に限定されず、後期発現プロモーターの下流に７
．５にプロモーターの前期発現領域が存在してもよく、
又この逆でもよい。これらのプロモーターは必ずしも１
個ずつである必要はなく、これらの両者又は一方を複数
存在せしめることができる。例えばＡＴＩプロモーター
１個に対して７，５にプロモーターの前期発現領域を１
〜４個存在せしめ、この複合プロモーターの下流にＣＡ
Ｔ遺伝子を存在せしめた場合、７．５にプロモーターの
前期発現領域の個数依存的にＣＡＴの発現量が顕著に増
加することが確認された。
ＴＩプロモーターあるいは他の後期発現プロモーターと
、少なくとも１個の７，５にプロモーターの前期発現領
域を含有すればよい、これら２種類のプロモーターの順
序は特に限定されず、後期発現プロモーターの下流に７
．５にプロモーターの前期発現領域が存在してもよく、
又この逆でもよい。これらのプロモーターは必ずしも１
個ずつである必要はなく、これらの両者又は一方を複数
存在せしめることができる。例えばＡＴＩプロモーター
１個に対して７，５にプロモーターの前期発現領域を１
〜４個存在せしめ、この複合プロモーターの下流にＣＡ
Ｔ遺伝子を存在せしめた場合、７．５にプロモーターの
前期発現領域の個数依存的にＣＡＴの発現量が顕著に増
加することが確認された。
ワクシニアウィルス
本発明の複合プロモーターを、ワクシニアウィルス中で
外来遺伝子、例えば外来抗原遺伝子の上流に存在せしめ
ることにより、該遺伝子を前期及び後期にわたって発現
せしめることができる。この様なワクシニアウィルスと
しては組換えワクシニアウィルスワクチンの製造におい
て常用される任意のワクシニアウィルス株を用いること
ができる９本発明の複合プロモーターにより発現せしめ
るウィルス遺伝子としては、例えば牛皮ウィルスのフュ
ージョン蛋白質遺伝子、牛皮ウィルスのへマグルチニン
遺伝子、ウシ白血病ウィルス表面抗原遺伝子、成人Ｔ細
胞白血病ウィルス表面抗原遺伝子、エイズウィルス表面
抗原遺伝子、エイズウィルスのコア蛋白質遺伝子、サル
エイズウイルス表面抗原遺伝子、インフルエンザウィル
スのへマグルチニン遺伝子等が挙げられるがこれらに限
らない。
外来遺伝子、例えば外来抗原遺伝子の上流に存在せしめ
ることにより、該遺伝子を前期及び後期にわたって発現
せしめることができる。この様なワクシニアウィルスと
しては組換えワクシニアウィルスワクチンの製造におい
て常用される任意のワクシニアウィルス株を用いること
ができる９本発明の複合プロモーターにより発現せしめ
るウィルス遺伝子としては、例えば牛皮ウィルスのフュ
ージョン蛋白質遺伝子、牛皮ウィルスのへマグルチニン
遺伝子、ウシ白血病ウィルス表面抗原遺伝子、成人Ｔ細
胞白血病ウィルス表面抗原遺伝子、エイズウィルス表面
抗原遺伝子、エイズウィルスのコア蛋白質遺伝子、サル
エイズウイルス表面抗原遺伝子、インフルエンザウィル
スのへマグルチニン遺伝子等が挙げられるがこれらに限
らない。
組換えワクシニアウィルスの作製は常用の相同性組換え
法により行うことができる。例えば、ワクシニアウィル
スゲノム中の該ウィルスの増殖のなめに必須でない遺伝
子、例えばヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子又はチミジン
キナーゼ（ＴＫ）遺伝子を含有するプラスミドの該遺伝
子中に本発明の複合プロモーター及び任意の外来遺伝子
が挿入されている組換えプラスミドを作製し、このプラ
スミドとワクシニアウィルスとの相同性組換えにより、
ワクシニアウィルスのゲノム中のＨＡ遺遺伝ススＴＫ遺
伝子中に前記複合プロモーター及び外来遺伝子が挿入さ
れた組換えワクシニアウィルスを作製することができる
。
法により行うことができる。例えば、ワクシニアウィル
スゲノム中の該ウィルスの増殖のなめに必須でない遺伝
子、例えばヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子又はチミジン
キナーゼ（ＴＫ）遺伝子を含有するプラスミドの該遺伝
子中に本発明の複合プロモーター及び任意の外来遺伝子
が挿入されている組換えプラスミドを作製し、このプラ
スミドとワクシニアウィルスとの相同性組換えにより、
ワクシニアウィルスのゲノム中のＨＡ遺遺伝ススＴＫ遺
伝子中に前記複合プロモーター及び外来遺伝子が挿入さ
れた組換えワクシニアウィルスを作製することができる
。
組換えは常用のトランスフェクション法により行うこと
ができる。例えば相同性組換え領域としてワクシニアウ
ィルスのＨＡＡ伝子を使用する場合、ワクシニアウィル
スを培養された動物細胞、例えばサル腎臓細胞ｃｖ−ｉ
又はウサギ腎臓細胞ＲＫ１３に感染せしめ、次にリン酸
カルシウム法によりプラスミドをトランスフェクトし、
候補組換えウィルスを得る。次にこれらの候補ウィルス
を動物細胞、例えばＲＫ１３細胞のモルレーヤーに感染
せしめてプラークを形成せしめ、ニワトリ赤血球が吸着
しない（ＨＡ−）ウィルスを選択する。また、相同性組
換え領域としてワクシニアウィルスのＴＫ遺伝子を使用
する場合には、ワクシニアウィルスをＴＫ−突然変異動
物細胞に感染せしめ、次にリン酸カルシウム法によりプ
ラスミドをトランスフェクトし、ＢＵｄＲ（ブロモデオ
キシウリジン）の存在下で培養し、ＴＫ−株を選択する
ことにより候補組換ウィルスを得ることができる。
ができる。例えば相同性組換え領域としてワクシニアウ
ィルスのＨＡＡ伝子を使用する場合、ワクシニアウィル
スを培養された動物細胞、例えばサル腎臓細胞ｃｖ−ｉ
又はウサギ腎臓細胞ＲＫ１３に感染せしめ、次にリン酸
カルシウム法によりプラスミドをトランスフェクトし、
候補組換えウィルスを得る。次にこれらの候補ウィルス
を動物細胞、例えばＲＫ１３細胞のモルレーヤーに感染
せしめてプラークを形成せしめ、ニワトリ赤血球が吸着
しない（ＨＡ−）ウィルスを選択する。また、相同性組
換え領域としてワクシニアウィルスのＴＫ遺伝子を使用
する場合には、ワクシニアウィルスをＴＫ−突然変異動
物細胞に感染せしめ、次にリン酸カルシウム法によりプ
ラスミドをトランスフェクトし、ＢＵｄＲ（ブロモデオ
キシウリジン）の存在下で培養し、ＴＫ−株を選択する
ことにより候補組換ウィルスを得ることができる。
本発明の複合プロモーターを用いて組換えワクシニアウ
ィルスを作製し、これを哺乳類に接種することにより、
該組換えワクシニアウィルスに組み込まれた抗原遺伝子
を前期及び後期にわたって発現せしめることができ、体
液性免疫のみならず細胞性免疫をも惹起することができ
る。
ィルスを作製し、これを哺乳類に接種することにより、
該組換えワクシニアウィルスに組み込まれた抗原遺伝子
を前期及び後期にわたって発現せしめることができ、体
液性免疫のみならず細胞性免疫をも惹起することができ
る。
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
７．５に前期発現プロモーターとして、−３１位から始
まって下流に伸びる６９ｍｅｒの二本鎖ＤＮＡ断片（７
，５ＥΔと称する）（第１図Ａ）、及び−３１位から始
まって下流に伸びる３６ｍｅｒの二本鎖ＤＮ’Ａ断片（
７，５ＥＢと称する）（第１図Ｂ）を次の様にして合成
した。
まって下流に伸びる６９ｍｅｒの二本鎖ＤＮＡ断片（７
，５ＥΔと称する）（第１図Ａ）、及び−３１位から始
まって下流に伸びる３６ｍｅｒの二本鎖ＤＮ’Ａ断片（
７，５ＥＢと称する）（第１図Ｂ）を次の様にして合成
した。
次の５種類のオリゴヌクレオチド：
階Ｉ ＧＡＴＣＣＧＴ＾＾＾＾ＧＴΔＣ＾＾＾＾ＴΔＴ
ＡＴＴＣＴ＾＾ＴＴＴＡＴＴＧ１１＆ｌＬ２ ＣＡＣ
ＧＧＴ＾＾ＧＧ＾＾ＧＴＡＧΔ＾ＴＣＡＴ＾＾＾Ｇ八Δ
ＣＡＧＴＧ隘３ ＧＡＴＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴへＴ
ＧＡＴＴＣＴＡＣＴＴＣＣＴＴＡＣ磁４ ＣＧＴＧＣ
八ΔＴ＾へ＾ＴＴＡＧ＾八ＴＡＴへＴＴＴＴＣＴＡＣＴ
ＴＴＴＡＣＧＮ［Ｌ５ ＧＡＴＣＣ＾＾Ｔ＾＾＾ＴＴ
ＡＧＡＡＴＡＴ八ＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＧをホ
スへアミダイト法により合成した。０．１００（３，７
μｇ）ずつの各オリゴヌクレオチドを別々に、５０ ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ｃｉ’（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ
ＭｇＣＬ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール
、５０ｍＭ ＡＴＰ及び２μ！のＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（宝酒造製、１０ユニット／μｍ）を含む全
容２０μ！の反応混合物中で３７℃にて１時間インキュ
ベートすることによりキナーゼ処理した。上記の反応混
合物中１と迎４、隘２と階３、及び隘１と階５を、それ
ぞれ５μｐずつ混合して７０℃にて２０分間加熱するこ
とにより酵素を失活せしめると共にアニールせしめた。
ＡＴＴＣＴ＾＾ＴＴＴＡＴＴＧ１１＆ｌＬ２ ＣＡＣ
ＧＧＴ＾＾ＧＧ＾＾ＧＴＡＧΔ＾ＴＣＡＴ＾＾＾Ｇ八Δ
ＣＡＧＴＧ隘３ ＧＡＴＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴへＴ
ＧＡＴＴＣＴＡＣＴＴＣＣＴＴＡＣ磁４ ＣＧＴＧＣ
八ΔＴ＾へ＾ＴＴＡＧ＾八ＴＡＴへＴＴＴＴＣＴＡＣＴ
ＴＴＴＡＣＧＮ［Ｌ５ ＧＡＴＣＣ＾＾Ｔ＾＾＾ＴＴ
ＡＧＡＡＴＡＴ八ＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＧをホ
スへアミダイト法により合成した。０．１００（３，７
μｇ）ずつの各オリゴヌクレオチドを別々に、５０ ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ｃｉ’（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ
ＭｇＣＬ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール
、５０ｍＭ ＡＴＰ及び２μ！のＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（宝酒造製、１０ユニット／μｍ）を含む全
容２０μ！の反応混合物中で３７℃にて１時間インキュ
ベートすることによりキナーゼ処理した。上記の反応混
合物中１と迎４、隘２と階３、及び隘１と階５を、それ
ぞれ５μｐずつ混合して７０℃にて２０分間加熱するこ
とにより酵素を失活せしめると共にアニールせしめた。
こうして３種類のアニール生成物Ｎ１１＋４、凰２＋３
、及び階１＋５を得た。
、及び階１＋５を得た。
３μｇのベクタープラスミドｐＵｃ１３のＤＮＡを、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１Ｃｊ！（ｐＨ８，０）、７ ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２２．１００ｍＭＮａＣ１，２ζｎＭ
２−メルカプトエタノール及び１０ユニツトのＢａｍ
ＨＩを含む５０μｌの反応混合物中で３７℃にて２時間
消化し、次にＩ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，０
＞中でアルカリ性ホスファターゼ（大腸菌Ａ１９〉によ
り６５℃にて１時間脱リン酸化した。
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１Ｃｊ！（ｐＨ８，０）、７ ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２２．１００ｍＭＮａＣ１，２ζｎＭ
２−メルカプトエタノール及び１０ユニツトのＢａｍ
ＨＩを含む５０μｌの反応混合物中で３７℃にて２時間
消化し、次にＩ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，０
＞中でアルカリ性ホスファターゼ（大腸菌Ａ１９〉によ
り６５℃にて１時間脱リン酸化した。
反応混合物を２回フェノール抽出し、１回フェノール／
クロロホルム抽出した後、エタノール沈澱によりＤＮＡ
を回収しな。このＤＮＡを３０μｌのＴＥＭ衝液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃ１（ｐＨ８，０）、１ｍＭＥ
ＤＴ八〕に溶解へた。
クロロホルム抽出した後、エタノール沈澱によりＤＮＡ
を回収しな。このＤＮＡを３０μｌのＴＥＭ衝液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃ１（ｐＨ８，０）、１ｍＭＥ
ＤＴ八〕に溶解へた。
この溶液１μβずつを前記の２μりのアニール生成物阻
１＋４、隘２＋３、又は隘１＋５と混合し、蒸留水を加
えて７．５μｌとした後、ＴＡＫＡＲ＾・ライゲーショ
ンキットを用いて連結反応を行った。
１＋４、隘２＋３、又は隘１＋５と混合し、蒸留水を加
えて７．５μｌとした後、ＴＡＫＡＲ＾・ライゲーショ
ンキットを用いて連結反応を行った。
このライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を
形質転換し、形質転換体からプラスミドを回収し、これ
らを制限酵素Ｂａ＋ｎＨＩで消化することにより６９ｂ
ｐ断片、又は３６ｂｐ断片が挿入されていることを確認
した。さらにジデオキシ法により塩基配列の決定を行い
、前記プラスミドが第１図に示す７．５ＥＡ又は７．５
ＥＢのＤＮＡ断片を含有していることを確認し、これら
のプラスミドを含有する大腸菌をそれぞれＪＭ１０９−
７．５Ｅ＾、及びＪＭ１０９−７．５ＥＢと命名しな。
形質転換し、形質転換体からプラスミドを回収し、これ
らを制限酵素Ｂａ＋ｎＨＩで消化することにより６９ｂ
ｐ断片、又は３６ｂｐ断片が挿入されていることを確認
した。さらにジデオキシ法により塩基配列の決定を行い
、前記プラスミドが第１図に示す７．５ＥＡ又は７．５
ＥＢのＤＮＡ断片を含有していることを確認し、これら
のプラスミドを含有する大腸菌をそれぞれＪＭ１０９−
７．５Ｅ＾、及びＪＭ１０９−７．５ＥＢと命名しな。
これらの大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを加
えたＬＢ培地（１１中に５ｇの酵母エキス、Ｌｏｇのバ
クトドリブトン及び１０８のＮａＣ１を含有する）６０
ｍｌ中で一夜培養し、この培養菌体からアルカリ−９Ｄ
Ｓ法によりプラスミドを回収し、それぞれｐ１３−７．
５Ｅ＾及びｐ１３−７．５ＥＢと命名した。
えたＬＢ培地（１１中に５ｇの酵母エキス、Ｌｏｇのバ
クトドリブトン及び１０８のＮａＣ１を含有する）６０
ｍｌ中で一夜培養し、この培養菌体からアルカリ−９Ｄ
Ｓ法によりプラスミドを回収し、それぞれｐ１３−７．
５Ｅ＾及びｐ１３−７．５ＥＢと命名した。
参考例１で得たプラスミドｐＳＦＣＡＴを前記のように
してＢａｍｔｌ Ｉで消化して線状化しそして脱リン酸
化しな。実施例１で得たプラスミドｐ１３−７．５Ｅ＾
及びｐ１３−７．５ＥＢのそれぞれを１３ａｍｌｌ Ｉ
で消化し、そして２０％ポリアクリルアミドゲルにより
分離し、それぞれ６９ｂｐ ＤＮＡ断片（７，５ＥＡ
）及び３６ｂｐＤＮＡ断片（７，５ＥＢ）を含有するゲ
ル片を切り出し、そしてゲルと等量の０．５Ｍ ＮＨ
，０＾Ｃ及び１＋ｎＭ ＥＤＴΔを含有する溶液によ
り４℃にて一夜抽出した。この６９ｂｐ ＤＮＡ［ｒ
片又は３６ｂｐ ＤＮＡ［ｒ片と前記線状化されたｐ
ＳＦＣＡＴの各０，１μｇずつをＴ 八Ｋ Ａ Ｒ、’
１ライゲーションキットにより一夜連結し、この反応混
合物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し／ご。
してＢａｍｔｌ Ｉで消化して線状化しそして脱リン酸
化しな。実施例１で得たプラスミドｐ１３−７．５Ｅ＾
及びｐ１３−７．５ＥＢのそれぞれを１３ａｍｌｌ Ｉ
で消化し、そして２０％ポリアクリルアミドゲルにより
分離し、それぞれ６９ｂｐ ＤＮＡ断片（７，５ＥＡ
）及び３６ｂｐＤＮＡ断片（７，５ＥＢ）を含有するゲ
ル片を切り出し、そしてゲルと等量の０．５Ｍ ＮＨ
，０＾Ｃ及び１＋ｎＭ ＥＤＴΔを含有する溶液によ
り４℃にて一夜抽出した。この６９ｂｐ ＤＮＡ［ｒ
片又は３６ｂｐ ＤＮＡ［ｒ片と前記線状化されたｐ
ＳＦＣＡＴの各０，１μｇずつをＴ 八Ｋ Ａ Ｒ、’
１ライゲーションキットにより一夜連結し、この反応混
合物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し／ご。
形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、そしてＣＡ
Ｔ３１！伝子の５′側の１７塩基ＧＧＴＧＧＴＡＴＡＴ
ＣＣＡＧＴＧＡから成るオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いて塩基配列の決定を行った。ＡＴＩプロモ
ーターの転写方向ど同一の方向に合成プロモーターＰ７
．５ＥＡ又はＰ）、５ＥＢを１個又は複数個含有するプ
ラスミドを得、次の様に命名した。
Ｔ３１！伝子の５′側の１７塩基ＧＧＴＧＧＴＡＴＡＴ
ＣＣＡＧＴＧＡから成るオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いて塩基配列の決定を行った。ＡＴＩプロモ
ーターの転写方向ど同一の方向に合成プロモーターＰ７
．５ＥＡ又はＰ）、５ＥＢを１個又は複数個含有するプ
ラスミドを得、次の様に命名した。
プロモーター 個数 プラスミド名
Ｐ７．５ＥΔ １ ｐＳＦ・＾１・ＣＡＴ
Ｐ７．５Ｅ＾ ３ ｐＳＦ・＾３・ＣＡＴ
Ｐ７．５ＥＩ３ １ ｐＳＦ−８１・ＣＡ
ＴＰ７．５ＥＢ ４ ｐＳＦ−８４・Ｃ
ＡＴ組換ワクシニアウィルスを、Ｒ，Ｃｏｎｄｉｔ等、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 １５５． ｐ９７−１０５．１９
８６に記載されている方法に従って、イソ−β−チオセ
ミカルバゾン（Ｉ ＢＴ）依存性ワクシニアウィルスＷ
Ｒ株を感染させた細胞にワクシニアウィルス野性型ＷＲ
株のゲノムＤＮＡ及び組換え用プラスミドを同時トラン
スフェクションすることにより作製した。
Ｐ７．５Ｅ＾ ３ ｐＳＦ・＾３・ＣＡＴ
Ｐ７．５ＥＩ３ １ ｐＳＦ−８１・ＣＡ
ＴＰ７．５ＥＢ ４ ｐＳＦ−８４・Ｃ
ＡＴ組換ワクシニアウィルスを、Ｒ，Ｃｏｎｄｉｔ等、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 １５５． ｐ９７−１０５．１９
８６に記載されている方法に従って、イソ−β−チオセ
ミカルバゾン（Ｉ ＢＴ）依存性ワクシニアウィルスＷ
Ｒ株を感染させた細胞にワクシニアウィルス野性型ＷＲ
株のゲノムＤＮＡ及び組換え用プラスミドを同時トラン
スフェクションすることにより作製した。
ゲノムＤＮＡの調製は次の様にして行った。
１４本のルー（Ｒｏｕに）ボトルにウサギ腎細胞系（Ｒ
Ｋ１３）を増殖せしめ、これにワクシニアウィルス野性
型ＷＲ株を感染せしめた。ワクシニアウィルス感染細胞
を５０ｍ１コーニングチユーブに移し、４℃、２０００
ｒｐｍにて１０分間遠心分離し上清を得な。残った沈澱
を１０ｒｎｌのｉ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（（ｐＨ
８，０）に懸濁し、氷上で１５秒ずつ３回超音波処理し
た。これを２０００ｒｐｍにて１ｏ分間遠心分離し、上
清を得、これを前記の上清と一緒にした。この上清を９
００Ｏｒｐｍ （８０００Ｘ Ｇ ）にて３０分間遠心
し、沈澱を１００ｍ１のＴｒｉｓ−１１ｃ１（ｐＨ８，
ｏ）に懸濁した。この懸濁液を氷上で１５秒ずつ４回超
音波処理し、これを３６％ショ糖溶液に上置して１４０
０Ｏｒｐｍ（２８０００ｘ ａ ）にて８０分間遠心し
、沈澱を得た。
Ｋ１３）を増殖せしめ、これにワクシニアウィルス野性
型ＷＲ株を感染せしめた。ワクシニアウィルス感染細胞
を５０ｍ１コーニングチユーブに移し、４℃、２０００
ｒｐｍにて１０分間遠心分離し上清を得な。残った沈澱
を１０ｒｎｌのｉ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（（ｐＨ
８，０）に懸濁し、氷上で１５秒ずつ３回超音波処理し
た。これを２０００ｒｐｍにて１ｏ分間遠心分離し、上
清を得、これを前記の上清と一緒にした。この上清を９
００Ｏｒｐｍ （８０００Ｘ Ｇ ）にて３０分間遠心
し、沈澱を１００ｍ１のＴｒｉｓ−１１ｃ１（ｐＨ８，
ｏ）に懸濁した。この懸濁液を氷上で１５秒ずつ４回超
音波処理し、これを３６％ショ糖溶液に上置して１４０
０Ｏｒｐｍ（２８０００ｘ ａ ）にて８０分間遠心し
、沈澱を得た。
この沈澱を２ｍＭの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃｊ！
（ｐＨ８，ｏ）懸濁し、この懸濁液を氷上で１５秒ず
つ４回超音波処理した。
（ｐＨ８，ｏ）懸濁し、この懸濁液を氷上で１５秒ず
つ４回超音波処理した。
この超音波処理物を４℃、１２０００ｒｐｍ（２０００
Ｘ Ｇ ）にて４５分間、ショ糖密度勾配遠心（２０％
〜４０％）にかけ、沈澱を分離した後、バンドを別の遠
心チユーズに移し、２０ｍ１の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｆ
ＩＣｌ（ｐｔ１８．０）に溶解して４℃、２００００ｒ
ｐｍ （５５０００Ｘ Ｇ ）にて３０分間遠心し沈澱
を得た。この沈澱を前記の沈澱と共に２ｍｎの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−１１ｃ１（ｐＨ８，０）に懸濁し、この
懸濁液を氷上で１５秒ずつ４回超音波処理した。この超
音波処理物を４℃、！２０００ｒｐｍ （２０００ＸＧ
）にて４５分間のショ糖密度勾配遠心（２０％〜４０％
）にかけ、バンドを別の遠心チューブに移し、そして２
０ｎｔ’の１０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ’（ｐＨ８，０
）に溶解した。この溶液を４°ＣＣ１２００００ｒｐ
（５５０００Ｘ Ｇ ）にて３０分間遠心し、沈澱を得
た。この沈澱を５００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＮ （ｐＨ７，５）に溶解し、氷上で１５秒間超音波
処理し、２６０ｎｍの吸光度により測定した場合合計２
０９μｇのＤＮＡを含有するウィルス粒子を得た。
Ｘ Ｇ ）にて４５分間、ショ糖密度勾配遠心（２０％
〜４０％）にかけ、沈澱を分離した後、バンドを別の遠
心チユーズに移し、２０ｍ１の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｆ
ＩＣｌ（ｐｔ１８．０）に溶解して４℃、２００００ｒ
ｐｍ （５５０００Ｘ Ｇ ）にて３０分間遠心し沈澱
を得た。この沈澱を前記の沈澱と共に２ｍｎの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−１１ｃ１（ｐＨ８，０）に懸濁し、この
懸濁液を氷上で１５秒ずつ４回超音波処理した。この超
音波処理物を４℃、！２０００ｒｐｍ （２０００ＸＧ
）にて４５分間のショ糖密度勾配遠心（２０％〜４０％
）にかけ、バンドを別の遠心チューブに移し、そして２
０ｎｔ’の１０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ’（ｐＨ８，０
）に溶解した。この溶液を４°ＣＣ１２００００ｒｐ
（５５０００Ｘ Ｇ ）にて３０分間遠心し、沈澱を得
た。この沈澱を５００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＮ （ｐＨ７，５）に溶解し、氷上で１５秒間超音波
処理し、２６０ｎｍの吸光度により測定した場合合計２
０９μｇのＤＮＡを含有するウィルス粒子を得た。
このウィルス粒子を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７，８）、５ ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤ
Ｓを含有する溶液中で５０μｇ／ｍｌのプロティンキナ
ーゼにと共に３７°Ｃにて一夜インキユベートすること
によりウィルスＤＮＡを抽出した。この反応混合物をフ
ェノール／クロロホルムで３回抽出し、そして水飽和ジ
エチルエーテルで２回抽出した後、エタノール沈澱によ
りＤＮＡを沈澱せしめた。このＤＮＡをＴＥに溶解して
一夜放置しな後ｌ・ランスフェクションの材料として使
用した６ 直径３．５ｃｍのプラスチックシャーレにＣＶ−１細胞
をコンフルエントに増殖させ、この細胞にＩＢＴ依存性
ワクシニアウィルスＷＲ株を０．１ｍ、ｏ、ｉ、で感染
せしめ、１時間後に、リン酸カルシウム法により沈澱せ
しめた、前記のワクシニアウィルス野生型ＷＲ株のゲ／
ムＤＮＡｌ０．＋ｇｒと、１０μｇのｍ換え用７” ラ
スミドｐｓＦ４１ ・ＣＡＴ 、 ｐＳＦ ４３・ＣＡ
Ｔ 。
ｐＨ７，８）、５ ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤ
Ｓを含有する溶液中で５０μｇ／ｍｌのプロティンキナ
ーゼにと共に３７°Ｃにて一夜インキユベートすること
によりウィルスＤＮＡを抽出した。この反応混合物をフ
ェノール／クロロホルムで３回抽出し、そして水飽和ジ
エチルエーテルで２回抽出した後、エタノール沈澱によ
りＤＮＡを沈澱せしめた。このＤＮＡをＴＥに溶解して
一夜放置しな後ｌ・ランスフェクションの材料として使
用した６ 直径３．５ｃｍのプラスチックシャーレにＣＶ−１細胞
をコンフルエントに増殖させ、この細胞にＩＢＴ依存性
ワクシニアウィルスＷＲ株を０．１ｍ、ｏ、ｉ、で感染
せしめ、１時間後に、リン酸カルシウム法により沈澱せ
しめた、前記のワクシニアウィルス野生型ＷＲ株のゲ／
ムＤＮＡｌ０．＋ｇｒと、１０μｇのｍ換え用７” ラ
スミドｐｓＦ４１ ・ＣＡＴ 、 ｐＳＦ ４３・ＣＡ
Ｔ 。
ｐＳＦ−Ｂ１ ・ＣＡＴＸ ？ｉ ｐＳＦ−８４−ｃＡ
Ｔノイずしかトラ混合シて前記細胞にトランスフェクト
した。細胞を室温にて３０分間放１し、培地を加えて３
７℃にて４８時間インキュベートし、プラークを形成せ
しめた。これに０．５％ニワトリ赤血球を加え、赤く染
色しないプラークを選択した。相同性組換えにより生じ
た組換えワクシニアウィルスは、ＨＡ遺伝子が欠損して
いるので赤血球を凝集しない。単一プラークを単離し２
回クローニングして組換えワクシニアウィルスを純化し
、各プラスミドに対応する次の組換えウィルスを得た。
Ｔノイずしかトラ混合シて前記細胞にトランスフェクト
した。細胞を室温にて３０分間放１し、培地を加えて３
７℃にて４８時間インキュベートし、プラークを形成せ
しめた。これに０．５％ニワトリ赤血球を加え、赤く染
色しないプラークを選択した。相同性組換えにより生じ
た組換えワクシニアウィルスは、ＨＡ遺伝子が欠損して
いるので赤血球を凝集しない。単一プラークを単離し２
回クローニングして組換えワクシニアウィルスを純化し
、各プラスミドに対応する次の組換えウィルスを得た。
プラスミド 組換えウィルス
ｐＳＦ・＾１・ＣＡＴ ＩＩＩＲ−３Ｆ・＾１・
ＣＡＴｌ）ＳＦ・＾３・ＣＡＴ 阿Ｒ−Ｓ
Ｆ・＾３・ＣＡＴｐＳＦ−Ｉｌｌ・ＣＡＴ 圓Ｒ
−ＳＦ・Ｂ１・ＣＡＴｐＳＦ・Ｂ４・ＣＡＴ
ＷＲ−３Ｆ−８４・ＣＡＴｌ１ 本発明の組換えウィルス畦−ＳＦ・＾１・ＣＡＴ 。
ＣＡＴｌ）ＳＦ・＾３・ＣＡＴ 阿Ｒ−Ｓ
Ｆ・＾３・ＣＡＴｐＳＦ−Ｉｌｌ・ＣＡＴ 圓Ｒ
−ＳＦ・Ｂ１・ＣＡＴｐＳＦ・Ｂ４・ＣＡＴ
ＷＲ−３Ｆ−８４・ＣＡＴｌ１ 本発明の組換えウィルス畦−ＳＦ・＾１・ＣＡＴ 。
ＷＲ−ＳＦ・＾３・ＣＡＴ 、讐Ｒ−ＳＦ−８１・ＣＡ
Ｔ及び繋Ｒ−ＳＦ・Ｂ４・ＣＡＴ、並びに対照としての
ウィルス−Ｒ−５ＦＣＡＴ（Ａ Ｔ Ｉプロモーター１
個を含み、７．５に前期発現プロモーターが挿入されて
いないウィルス）、ＩＩＩＲ−ＶＲＣＡＴ（７，５にプ
ロモーターを含有する組換えウィルス）、ＷＲ（プロモ
ーター及びＣＡＴ遺伝子が挿入されていないウィルス）
、及びｍｏｃｋ（非感染）を用い、アラビノシルシトシ
ン（八ｒａ−Ｃ）（４０μｓ／ｍＮ）を含有する培地及
び＾ｒａ−Ｃを含有しない培地でのＣＡＴの発現を調べ
た。なお、＾ｒａ−ＣはＤＮＡの合成阻害剤であるため
、その存在下ではウィルスＤＮＡの合成が阻害され、そ
の結果ウィルスＤＮＡの複製の後にのみ機能する後期プ
ロモーターによるＣＡＴ遺伝子の発現が抑制される。
Ｔ及び繋Ｒ−ＳＦ・Ｂ４・ＣＡＴ、並びに対照としての
ウィルス−Ｒ−５ＦＣＡＴ（Ａ Ｔ Ｉプロモーター１
個を含み、７．５に前期発現プロモーターが挿入されて
いないウィルス）、ＩＩＩＲ−ＶＲＣＡＴ（７，５にプ
ロモーターを含有する組換えウィルス）、ＷＲ（プロモ
ーター及びＣＡＴ遺伝子が挿入されていないウィルス）
、及びｍｏｃｋ（非感染）を用い、アラビノシルシトシ
ン（八ｒａ−Ｃ）（４０μｓ／ｍＮ）を含有する培地及
び＾ｒａ−Ｃを含有しない培地でのＣＡＴの発現を調べ
た。なお、＾ｒａ−ＣはＤＮＡの合成阻害剤であるため
、その存在下ではウィルスＤＮＡの合成が阻害され、そ
の結果ウィルスＤＮＡの複製の後にのみ機能する後期プ
ロモーターによるＣＡＴ遺伝子の発現が抑制される。
ＲＫｉ３細胞を直径６ｃｍのプラスチックシャーレ中で
コンフルエンＩ・に増殖せしめ、前記ウィルスを１０ｍ
、ｏ、ｉ、で感染させた後２４時間培養し、細胞を回収
しな。各培養からの細胞を５００μｌの０．２５ＭＴｒ
ｉｓ−１１ＣＮ（ｐＨ７，８）、０．５％トリトンＸ−
１００に懸濁し、この懸濁液を用いてＣＡＴ活性を測定
した。反応組成を、 ５μ！ 細胞懸濁液 ７Ｃ１ｕＩＬＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃ１（ｐｔ（７，８
）５４μｌ 蒸留７に ２０μｍ ４ｍＭ アセチルＧｏΔ１μｍ
１４ｃｍクロラムフェニコール（ＮＥＮ社製、０．１
ｍＣｉ／ ｍＮ）とした。この反応混合物を３７°Ｃに
て１０分間インキュベートした後ただちに酢酸エチルに
よりりロラムフェニコール及びアセチル化されたクロラ
ムフェニコールを抽出して反応を停止した。抽出物を薄
層クロマトグラフィーにより分離し、オートラジオグラ
フィーにかけてスポットの位置を確認した。それぞれの
スポットの放射能を液体シンチレーションカウンターに
より測定し、アセチル化されたクロラムフェニコールの
比率を求め、これをＣＡＴ活性としな。この結果を次の
表に示す。
コンフルエンＩ・に増殖せしめ、前記ウィルスを１０ｍ
、ｏ、ｉ、で感染させた後２４時間培養し、細胞を回収
しな。各培養からの細胞を５００μｌの０．２５ＭＴｒ
ｉｓ−１１ＣＮ（ｐＨ７，８）、０．５％トリトンＸ−
１００に懸濁し、この懸濁液を用いてＣＡＴ活性を測定
した。反応組成を、 ５μ！ 細胞懸濁液 ７Ｃ１ｕＩＬＭ Ｔｒｉｓ−１１ｃ１（ｐｔ（７，８
）５４μｌ 蒸留７に ２０μｍ ４ｍＭ アセチルＧｏΔ１μｍ
１４ｃｍクロラムフェニコール（ＮＥＮ社製、０．１
ｍＣｉ／ ｍＮ）とした。この反応混合物を３７°Ｃに
て１０分間インキュベートした後ただちに酢酸エチルに
よりりロラムフェニコール及びアセチル化されたクロラ
ムフェニコールを抽出して反応を停止した。抽出物を薄
層クロマトグラフィーにより分離し、オートラジオグラ
フィーにかけてスポットの位置を確認した。それぞれの
スポットの放射能を液体シンチレーションカウンターに
より測定し、アセチル化されたクロラムフェニコールの
比率を求め、これをＣＡＴ活性としな。この結果を次の
表に示す。
ＷＲ株感染細胞及び非感染細胞（ｍｏｃｋ）ではＣＡＴ
活性は認められず、表中のＣＡＴ活性が人為的に挿入さ
れなＣＡＴ遺伝子に基づくものであることが確認される
。Δｒｃ−Ｃ非存在下でのＣＡＴ活性はＡＴＩプロモー
ター及び合成プロモーターの両者による発現の結果を表
し、Δｒａ−Ｃ存在下でのＣＡＴ活性は合成プロモータ
ーによる発現の結果を表す。＾ｃａ−Ｃの存在下ではＡ
ＴＩプロモーターによる発現は認められないが７．５に
プロモーターによる発現は認められた。このことよりＡ
ＴＩプロモーターは後期プロモーターとしてのみ機能し
、前期プロモーター活性を有しないことを確認した。
活性は認められず、表中のＣＡＴ活性が人為的に挿入さ
れなＣＡＴ遺伝子に基づくものであることが確認される
。Δｒｃ−Ｃ非存在下でのＣＡＴ活性はＡＴＩプロモー
ター及び合成プロモーターの両者による発現の結果を表
し、Δｒａ−Ｃ存在下でのＣＡＴ活性は合成プロモータ
ーによる発現の結果を表す。＾ｃａ−Ｃの存在下ではＡ
ＴＩプロモーターによる発現は認められないが７．５に
プロモーターによる発現は認められた。このことよりＡ
ＴＩプロモーターは後期プロモーターとしてのみ機能し
、前期プロモーター活性を有しないことを確認した。
本発明の複合プロモーターについて、八ｃａ−Ｃの存在
下では、前期プロモーターとして１個のＰ７．５ε＾（
６９ｍｅｒ合成プロモーター）を含有する冒Ｒ−３Ｆ傾
１・ＣＡＴハＰ７．５７” ｏ モー ターを１個含有
す７）！４１− ＶＲＣＡＴとほぼ同じレベルの発現を
示し、３個のＰ７．５ＥＡを含有するｌ！ＩＲ−ＳＦ・
＾３・ＣＡＴは３〜４倍のＣＡＴの発現を示しな。また
、１個のＰ７．５ＥＢ（３６ｍｅｒ合成プロモーター）
を含有する一Ｒ−ＳＦ−Ｃ１・ＣＡＴではＰ７．５ブロ
モ−９−を１個含有ｔルＷＲ−ＶＲＣＡＴＩ：比ヘテＣ
ＡＴ発現レベルが低かったが、Ｐ７．５ＥＢを４個含有
するＷＲ−ＳＦ−１３４・ＣＡＴは罷−５Ｆ−Ｂｌ・Ｃ
ＡＴに比べて６〜８倍高いレベルのＣＡＴを発現した。
下では、前期プロモーターとして１個のＰ７．５ε＾（
６９ｍｅｒ合成プロモーター）を含有する冒Ｒ−３Ｆ傾
１・ＣＡＴハＰ７．５７” ｏ モー ターを１個含有
す７）！４１− ＶＲＣＡＴとほぼ同じレベルの発現を
示し、３個のＰ７．５ＥＡを含有するｌ！ＩＲ−ＳＦ・
＾３・ＣＡＴは３〜４倍のＣＡＴの発現を示しな。また
、１個のＰ７．５ＥＢ（３６ｍｅｒ合成プロモーター）
を含有する一Ｒ−ＳＦ−Ｃ１・ＣＡＴではＰ７．５ブロ
モ−９−を１個含有ｔルＷＲ−ＶＲＣＡＴＩ：比ヘテＣ
ＡＴ発現レベルが低かったが、Ｐ７．５ＥＢを４個含有
するＷＲ−ＳＦ−１３４・ＣＡＴは罷−５Ｆ−Ｂｌ・Ｃ
ＡＴに比べて６〜８倍高いレベルのＣＡＴを発現した。
これらのことから、前期発現プロモーターの数を増加す
ることにより発現を増強することができることが確認さ
れた。また後期プロモーターであるＡＴＩプロモーター
に前期プロモーターとしての機能を付加することができ
た。前期プロモーター活性も７．５にプロモーターの前
期プロモーターよりも３〜４倍高いものであった。
ることにより発現を増強することができることが確認さ
れた。また後期プロモーターであるＡＴＩプロモーター
に前期プロモーターとしての機能を付加することができ
た。前期プロモーター活性も７．５にプロモーターの前
期プロモーターよりも３〜４倍高いものであった。
Ａｒａ−Ｃ非存在下でのＣＡＴ発現量を＾ｒａ−Ｃ存在
下でのＣＡＴ発現量を差し引いた数値をＡＴＩプロモー
ターによる発現量であると仮定すれば、各組換えウィル
スにおけるＡＴＩプロモーターによる発現量は次の通り
となる。
下でのＣＡＴ発現量を差し引いた数値をＡＴＩプロモー
ターによる発現量であると仮定すれば、各組換えウィル
スにおけるＡＴＩプロモーターによる発現量は次の通り
となる。
組換えウィルス ＡＴＩによる発現レベルＷＲ−Ｓ
ＦＣＡＴ ７６．８ （％）ＷＲ−ＳＦ
・八１・ＣＡＴ ５７．０ＷＲ−
ＳＦ−Ｂｌ・ＣＡＴ ７３．６ＷＲ−ＳＦ・
＾３・ＣＡＴ ５８ 、９１１Ｒ−ＳＦ−Ｂ
４・ＣＡＴ ８８．７ＡＴＩプロモーターに
よる発現は、Ｐ７．５Ｅ＾の挿入により２３〜２６％阻
害されたが、Ｐ７．５ＥＢの挿入による阻害は４〜１１
％でその影響は少なかった。
ＦＣＡＴ ７６．８ （％）ＷＲ−ＳＦ
・八１・ＣＡＴ ５７．０ＷＲ−
ＳＦ−Ｂｌ・ＣＡＴ ７３．６ＷＲ−ＳＦ・
＾３・ＣＡＴ ５８ 、９１１Ｒ−ＳＦ−Ｂ
４・ＣＡＴ ８８．７ＡＴＩプロモーターに
よる発現は、Ｐ７．５Ｅ＾の挿入により２３〜２６％阻
害されたが、Ｐ７．５ＥＢの挿入による阻害は４〜１１
％でその影響は少なかった。
参考例１． プラスミドｐＳＦＣＡＴの作製５μｇのプ
ラスミドｐＣ６をＳａｃ Ｉ及びＢａｍＨＩにより消
化し、Ｅｘｏ ｍヌクレアーゼにて、ＢａＩＩＩＨ（に
より消化された方向に消化し、１本鎖になった部分をＳ
Ｉヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ断
片にて末端を平滑化し、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼに
より連結反応を行った。こうしてプラスミドｐ １３Ｃ
８−２−３２を得た。なお前記プラスミドｐＣ６の作製
方法は特願昭６１−２２２１９４号明細書くヨーロッパ
出願公開Ｎａ８７３０８３７２．９）に記載されている
。
ラスミドｐＣ６をＳａｃ Ｉ及びＢａｍＨＩにより消
化し、Ｅｘｏ ｍヌクレアーゼにて、ＢａＩＩＩＨ（に
より消化された方向に消化し、１本鎖になった部分をＳ
Ｉヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ断
片にて末端を平滑化し、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼに
より連結反応を行った。こうしてプラスミドｐ １３Ｃ
８−２−３２を得た。なお前記プラスミドｐＣ６の作製
方法は特願昭６１−２２２１９４号明細書くヨーロッパ
出願公開Ｎａ８７３０８３７２．９）に記載されている
。
ボックスウィルスＡ型封入体（ＡＴＩ）遺伝子を含有す
るこのプラスミドｐ１３ｃ６−２−３２からのＥｃｏＲ
Ｉ−Ｔａｑ ｌ約６００ｂｐのＤＮＡ断片をＫＩｅｎｏ
ｗ（！７ｒ片により平滑末端にして、ｐｕｃ ｔｓのｌ
ｌ１ｎｃＩ［部位にクローニングすることによりＡＴＩ
遺伝子のプロモーター領域（ＦＡＴＩ＞を含有するプラ
スミドｐ１８＾ＴＩｐｒｏ５３６を得た。このプラスミ
ドを旧ｎｔ［及びＥｃｏＲＩにより消化し、ＰＡＴＩプ
ロモーターを含有する６００ｂｐの１１ｉｎｄｌＩ［−
ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ ＠片をアガロースゲル電気泳動
により単離した。他方ファージＭ１３ｎ＋ｐ１８ａｍ４
（ΔＢ１１ａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ
、）の二本鎖ＤＮＡを旧ｎｄｌｌｌ及びＥｃｏＲＩで消
化して線状化し、これに前記１１ｉｎｄ ｍ −Ｅｃｏ
ＲＩ ｒＩＲ片をＴ４ ＤＮＡリガーゼにより連結して
環状化し、大腸菌ＪＭ １０９に感染させてＸｇａ ｌ
とＩＰＴＧの存在下での白いプラークの形成をみた。白
いプラークより回収した二本Ｂ Ｄ Ｎ Ａにはプロモ
ーター断片が挿入されていることをｔｌｉｎｄｌＨとＥ
ｃｏＲＩの二重消化により確認した。プロモーターを含
むファージＭ１３ｍｐ１８ａｍ４−ＡＴＩｐｒｏ５３６
の一本鎖ＤＮＡを同一のプラークより調製し、鋳型ＤＮ
Ａとした。以下の実験操作は市販のキット（０１ｉＨｏ
ｎｕｃｕｌｅｏｔｉｄｅ ５ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍ１３；＾ｎｇＩｉ
ａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍ１ｔｅｄ）
の実験マニュアルに従った。変異用プライマーとしてプ
ライマー＾ＴＩ２２１ｍｅｒ ５’−＾ΔＴΔ△＾ＴＡ
ＣＡＧＧＴＣＡＣＧΔΔＣＣ−３’を使用した。プライ
マー訂■２の８番目の塩基ＡはＡＴＩプロモーター５３
６の塩基配列中では翻訳開始コドンＡＴＧの最後の塩基
Ｇの位置に相当する。鋳型となるＭ１３＋ｎｐ１８ａｍ
４−＾Ｔｒｐｒｏ５３６５ｓＤＮＡとはこの位置でミス
マツチをおこすことになる。１μｇの鋳型ＤＮＡに対し
て５′末端をリン酸化したプライマーＩ Ｑｐｍｏｌｅ
を加えて、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｉ’（ｐＨ８，ｏ）
、及び１０ ｍＭ ＨｇＣｌ２の存在下でアニール反応
を沸騰水上で開始し、そのまま室温に下がるまで放置し
な。鎖伸長・連結反応を続けて行った。１０μ２の反応
液に１μβの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ・Ｃ＆（ｐＨ８，
０）、１００＋ｎＭ ＨｇＣｌ２．１μｊ２の５ ｍＭ
ｒＡＴＰ、１μ！の５ｍＭｄＮＴＰｓ、１μ！の１０
０ｍＭ ＤＴＴ、及び４μβの蒸留水を添加後氷上に置
き、さらに１０ユニツトのＴ４ ＤＮＡリガーゼと１ユ
ニツトのＤＮＡポリメラーゼのＫ ｌ ｅｎｏｕ＋断片
を加え、１２°Ｃにて１６時間保温した。
るこのプラスミドｐ１３ｃ６−２−３２からのＥｃｏＲ
Ｉ−Ｔａｑ ｌ約６００ｂｐのＤＮＡ断片をＫＩｅｎｏ
ｗ（！７ｒ片により平滑末端にして、ｐｕｃ ｔｓのｌ
ｌ１ｎｃＩ［部位にクローニングすることによりＡＴＩ
遺伝子のプロモーター領域（ＦＡＴＩ＞を含有するプラ
スミドｐ１８＾ＴＩｐｒｏ５３６を得た。このプラスミ
ドを旧ｎｔ［及びＥｃｏＲＩにより消化し、ＰＡＴＩプ
ロモーターを含有する６００ｂｐの１１ｉｎｄｌＩ［−
ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ ＠片をアガロースゲル電気泳動
により単離した。他方ファージＭ１３ｎ＋ｐ１８ａｍ４
（ΔＢ１１ａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ
、）の二本鎖ＤＮＡを旧ｎｄｌｌｌ及びＥｃｏＲＩで消
化して線状化し、これに前記１１ｉｎｄ ｍ −Ｅｃｏ
ＲＩ ｒＩＲ片をＴ４ ＤＮＡリガーゼにより連結して
環状化し、大腸菌ＪＭ １０９に感染させてＸｇａ ｌ
とＩＰＴＧの存在下での白いプラークの形成をみた。白
いプラークより回収した二本Ｂ Ｄ Ｎ Ａにはプロモ
ーター断片が挿入されていることをｔｌｉｎｄｌＨとＥ
ｃｏＲＩの二重消化により確認した。プロモーターを含
むファージＭ１３ｍｐ１８ａｍ４−ＡＴＩｐｒｏ５３６
の一本鎖ＤＮＡを同一のプラークより調製し、鋳型ＤＮ
Ａとした。以下の実験操作は市販のキット（０１ｉＨｏ
ｎｕｃｕｌｅｏｔｉｄｅ ５ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍ１３；＾ｎｇＩｉ
ａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍ１ｔｅｄ）
の実験マニュアルに従った。変異用プライマーとしてプ
ライマー＾ＴＩ２２１ｍｅｒ ５’−＾ΔＴΔ△＾ＴＡ
ＣＡＧＧＴＣＡＣＧΔΔＣＣ−３’を使用した。プライ
マー訂■２の８番目の塩基ＡはＡＴＩプロモーター５３
６の塩基配列中では翻訳開始コドンＡＴＧの最後の塩基
Ｇの位置に相当する。鋳型となるＭ１３＋ｎｐ１８ａｍ
４−＾Ｔｒｐｒｏ５３６５ｓＤＮＡとはこの位置でミス
マツチをおこすことになる。１μｇの鋳型ＤＮＡに対し
て５′末端をリン酸化したプライマーＩ Ｑｐｍｏｌｅ
を加えて、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｉ’（ｐＨ８，ｏ）
、及び１０ ｍＭ ＨｇＣｌ２の存在下でアニール反応
を沸騰水上で開始し、そのまま室温に下がるまで放置し
な。鎖伸長・連結反応を続けて行った。１０μ２の反応
液に１μβの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ・Ｃ＆（ｐＨ８，
０）、１００＋ｎＭ ＨｇＣｌ２．１μｊ２の５ ｍＭ
ｒＡＴＰ、１μ！の５ｍＭｄＮＴＰｓ、１μ！の１０
０ｍＭ ＤＴＴ、及び４μβの蒸留水を添加後氷上に置
き、さらに１０ユニツトのＴ４ ＤＮＡリガーゼと１ユ
ニツトのＤＮＡポリメラーゼのＫ ｌ ｅｎｏｕ＋断片
を加え、１２°Ｃにて１６時間保温した。
ハイブリッドＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し複製さ
せた。このときコンピテント細胞としてｍｉｓｍａｔｃ
ｈ ｒｅｐａｉｒ ｓｙｓｔｅｍ欠損株ＨＢ２１５５、
指示菌としてｎｏｎ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ株である１
１８２１５１を用い、アンバー変異をもたない（−）鎖
のみを選択的に成長させた。（＋）鎖はアンバー変異を
含むためにｎｏｎｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ株では成長でき
ない。特異的に選択されたプラークからＤＮＡを抽出し
て塩基配列を決定したところ７プラークのうち２プラー
クがら抽出したＤＮＡにＡ Ｔ ＧからＡＴＡの点突然
変異が生じていた。ＡＴＩプロモーターに突然変異をも
つファージＭ１３ｍｐ１８−八ＴｌｐｒｏΔ２−９のｄ
ｓＤＮ＾を分離し、これを旧ｎｄＩＩＩ及びＥｃ’ｏＲ
ｌで消化することにより変異を有するＡＴＩプロモータ
ーを含有するＤＮＡ断片を得た。
せた。このときコンピテント細胞としてｍｉｓｍａｔｃ
ｈ ｒｅｐａｉｒ ｓｙｓｔｅｍ欠損株ＨＢ２１５５、
指示菌としてｎｏｎ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ株である１
１８２１５１を用い、アンバー変異をもたない（−）鎖
のみを選択的に成長させた。（＋）鎖はアンバー変異を
含むためにｎｏｎｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ株では成長でき
ない。特異的に選択されたプラークからＤＮＡを抽出し
て塩基配列を決定したところ７プラークのうち２プラー
クがら抽出したＤＮＡにＡ Ｔ ＧからＡＴＡの点突然
変異が生じていた。ＡＴＩプロモーターに突然変異をも
つファージＭ１３ｍｐ１８−八ＴｌｐｒｏΔ２−９のｄ
ｓＤＮ＾を分離し、これを旧ｎｄＩＩＩ及びＥｃ’ｏＲ
ｌで消化することにより変異を有するＡＴＩプロモータ
ーを含有するＤＮＡ断片を得た。
他方、プラスミドｐ［Ｊｃ １８を旧ｎｄＩＩＩ及びＥ
ｃｏＲｌで消化することにより線状化し、これに前記Ｄ
ＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼにより連結することに
よりプラスミドｐ１８＾Ｔｌｐｒｏ＾２−９を得た。
ｃｏＲｌで消化することにより線状化し、これに前記Ｄ
ＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼにより連結することに
よりプラスミドｐ１８＾Ｔｌｐｒｏ＾２−９を得た。
ワクシニアウィルスの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を含有
するプラスミドｐＨ＾１３．１（Ｔｈｅ ＥＭＢＯＪｏ
ｕｒｎａＶｏｌ、６．Ｎｏ、１１．３３７９−３３８４
．１９８７）を制限酵素Ｎｒｕｌで消化して線状化した
。他方変異したＡＴＩプロモーターを含有するプラスミ
ドｐ１８＾ＴＩｐｒｏ＾２−９を１１ｉｎｄＩ［［及び
ＥｃｏＲＩにより消化し、該プロモーターを含有する６
００ｂｐのＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗＩｔＩｉ片により
平滑末端化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより前記の線状
化プラスミドと連結し、ＨＡ遺伝子が変異型プロモータ
ーにより中断されているプラスミドｐＳＦを得た。
するプラスミドｐＨ＾１３．１（Ｔｈｅ ＥＭＢＯＪｏ
ｕｒｎａＶｏｌ、６．Ｎｏ、１１．３３７９−３３８４
．１９８７）を制限酵素Ｎｒｕｌで消化して線状化した
。他方変異したＡＴＩプロモーターを含有するプラスミ
ドｐ１８＾ＴＩｐｒｏ＾２−９を１１ｉｎｄＩ［［及び
ＥｃｏＲＩにより消化し、該プロモーターを含有する６
００ｂｐのＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗＩｔＩｉ片により
平滑末端化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより前記の線状
化プラスミドと連結し、ＨＡ遺伝子が変異型プロモータ
ーにより中断されているプラスミドｐＳＦを得た。
このプラスミドｐＳＦのＨＡ遺伝子とプロモーターの下
流端との間を制限酵素Ｓｍａｌにより切断して線状化し
た。他方、ＣＡＴ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＶ２
ＣＡＴ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２．
ｐｐ１０４４−１０５１．１９８２）を旧ｎｄＩＩＩ及
び５ａｕ３ΔＩにより消化し、ＣＡＴ遺伝子を含有する
７９０ｂｐの旧ｎｄＩ［ｌ −５ａｕ３八Ｉ ＤＮ＾断
片を得た。これらをＫｌｅｎｏｗ断片により平滑末端化
した後Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより連結し、中断された
ＨＡ遺伝子の間に変異型ＡＴＩプロモーター及びＣＡ、
Ｔ遺伝子を含有する発現プラスミドｐＳＦＣＡＴを得
た。
流端との間を制限酵素Ｓｍａｌにより切断して線状化し
た。他方、ＣＡＴ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＶ２
ＣＡＴ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２．
ｐｐ１０４４−１０５１．１９８２）を旧ｎｄＩＩＩ及
び５ａｕ３ΔＩにより消化し、ＣＡＴ遺伝子を含有する
７９０ｂｐの旧ｎｄＩ［ｌ −５ａｕ３八Ｉ ＤＮ＾断
片を得た。これらをＫｌｅｎｏｗ断片により平滑末端化
した後Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより連結し、中断された
ＨＡ遺伝子の間に変異型ＡＴＩプロモーター及びＣＡ、
Ｔ遺伝子を含有する発現プラスミドｐＳＦＣＡＴを得
た。
第１図は、本発明の複合プロモーターの合成りＮＡ部位
の塩基配列を示す。ＡはＰ７．５Ｅ八、ＢはＰ７．５Ｅ
Ｂの塩基配列をそれぞれ示す。 第２図は、プラスミドｐＳＦＣＡＴの作製過程を示す。 第３図は、本発明の複合プロモーターを含むプラスミド
の作製の過程を示す。 第４図は、組換えウィルスの作製過程を示す。 第５図は、実施例５において得た結果を示すグラフであ
る。
の塩基配列を示す。ＡはＰ７．５Ｅ八、ＢはＰ７．５Ｅ
Ｂの塩基配列をそれぞれ示す。 第２図は、プラスミドｐＳＦＣＡＴの作製過程を示す。 第３図は、本発明の複合プロモーターを含むプラスミド
の作製の過程を示す。 第４図は、組換えウィルスの作製過程を示す。 第５図は、実施例５において得た結果を示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、後期発現プロモーター、及び７．５Ｋｄ蛋白質遺伝
子のプロモーターの下流側領域を含んで成るボックスウ
ィルスプロモーターであって、該プロモーターの下流に
外来構造遺伝子が連結された場合に該構造遺伝子をウィ
ルス感染前期及び後期にわたって発現することができる
複合プロモーター。 ２、ボックスウィルスの後期発現プロモーター、及びワ
クシニアウイルスの７．５Ｋｄ蛋白質遺伝子の少なくと
も−３１位の塩基から＋１位の塩基までのプロモーター
領域をこの順序で含んで成る、請求項１に記載の複合プ
ロモーター。 ３、前記７．５Ｋｄ蛋白質遺伝子のプロモーターの下流
側領域が１〜４個存在する、請求項１又は２に記載の複
合プロモーター。 ４、請求項１に記載の複合プロモーター、及び該プロモ
ーターの下流に続く任意の外来構造遺伝子を含んで成る
ワクシニアウイルス。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1002878A JPH02186992A (ja) | 1989-01-11 | 1989-01-11 | 複合ウイルスプロモーター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1002878A JPH02186992A (ja) | 1989-01-11 | 1989-01-11 | 複合ウイルスプロモーター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02186992A true JPH02186992A (ja) | 1990-07-23 |
Family
ID=11541614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1002878A Pending JPH02186992A (ja) | 1989-01-11 | 1989-01-11 | 複合ウイルスプロモーター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02186992A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018516599A (ja) * | 2015-05-29 | 2018-06-28 | コーロン ライフ サイエンス インコーポレイテッドＫｏｌｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ． | ポックスウイルス由来のプロモーターおよびそれを含むベクター |
-
1989
- 1989-01-11 JP JP1002878A patent/JPH02186992A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018516599A (ja) * | 2015-05-29 | 2018-06-28 | コーロン ライフ サイエンス インコーポレイテッドＫｏｌｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ． | ポックスウイルス由来のプロモーターおよびそれを含むベクター |
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