ES2964607T3 - Silenciamiento epigenético de NMT2 - Google Patents

Abstract

El hallazgo de que múltiples cánceres carecen de uno de los dos NMT, mientras que los tejidos estromales y normales no, permite el tratamiento de células cancerosas deficientes en NMT2 con un inhibidor de NMT. En el presente documento se muestra que la expresión de NMT2 se reduce o elimina en ciertos cánceres y, en un ejemplo, en linfomas, mediante uno o varios mecanismos epigenéticos. La reducción o eliminación de la expresión de NMT2 hace que los inhibidores de NMT sean sensibles al cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Silenciamiento epigenético de NMT2

Campo

La presente divulgación se refiere en general a procedimientos epigenéticos para el diagnóstico y tratamiento del cáncer.

ANTECEDENTES

El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. La Sociedad Canadiense contra el Cáncer calcula que en 2011 se producirán aproximadamente 170000 nuevos casos de cáncer y aproximadamente 75000 muertes por esta causa.

Se calcula que en 2015 morirán de cáncer aproximadamente 589430 estadounidenses, o aproximadamente 1.620 personas al día. El cáncer es la segunda causa de muerte más frecuente en Estados Unidos, y es responsable de casi 1 de cada 4 fallecimientos.

Los cánceres hematológicos representan aproximadamente el nueve por ciento de los nuevos casos de cáncer y el nueve por ciento de las muertes relacionadas con el cáncer. Un tipo de cáncer hematológico es el linfoma. Los linfomas no Hodgkin agresivos, como el linfoma de Burkitt (BL) y el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), son tratables, pero las terapias actuales son caras, conllevan toxicidades graves y consiguen respuestas muy variables, con lo que la mayoría de los pacientes acaban sufriendo una recaída de la enfermedad. Sólo en Norteamérica hay 78.000 nuevos casos de LNH al año y 600.000 supervivientes de LNH en remisión pero con riesgo continuo de recaída. Es necesario mejorar los tratamientos.

La N-miristoilación de proteínas es una modificación en la que el miristato (un ácido graso saturado de 14 carbonos) se une covalentemente a la glicina terminal NH2 de una variedad de proteínas celulares, virales y onco-proteínas (por ejemplo, tirosina quinasas oncogénicas relacionadas con Src, subunidades G alfa heterotriméricas, etc.).

Las proteínas miristoiladas celulares tienen diversas funciones biológicas en la transducción de señales y la oncogénesis. La modificación de las proteínas por miristoilación es necesaria para la orientación subcelular, la conformación proteica y la actividad biológica de muchas proteínas importantes en las células eucariotas, incluidas las necesarias para la transducción de señales y las funciones reguladoras importantes en el crecimiento celular. Las tirosina quinasas de la familia Src (protooncogenes) se encuentran entre las proteínas miristoiladas más ampliamente estudiadas.

La miristoilación de las proteínas es catalizada por la N-miristoiltransferasa (NMT). La NMT es responsable de esta actividad en las células eucariotas y actúa modificando su polipéptido sustrato tras la eliminación del residuo de metionina iniciador por la metionil aminopeptidasa. Esta modificación se produce principalmente como un proceso cotraduccional, aunque la miristoilación también puede producirse postraduccionalmente tras la escisión proteolítica de las proteínas, normalmente durante la apoptosis. Se han clonado dos isozimas de las enzimas NMT de mamíferos y se designan NMT1 y NMT2. Los NMT desempeñan un papel pro-supervivencia en las células. Las dos NMT están presentes en todas las células normales de mamíferos.

Sigue existiendo la necesidad de compuestos, composición y procedimiento para el tratamiento del cáncer.

Estos antecedentes se facilitan con el fin de dar a conocer información que el Solicitante considera de posible relevancia para la presente invención. No se pretende necesariamente admitir, ni debe interpretarse, que cualquiera de las informaciones precedentes constituya un estado de la técnica contrario a la presente invención.

SUMARIO

En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un procedimiento que comprende: a) poner en contacto una muestra de un sujeto que tiene linfoma, o que se sospecha que tiene linfoma con un reactivo para formar un producto, opcionalmente en forma de complejo, indicativo del estado de metilación del genNMT2presente en la muestra; b) medir el producto formado para determinar un estado de metilación del genNMT2en la muestra; y c) determinar el beneficio del tratamiento con inhibidores de NMT de dicho linfoma en dicho sujeto, donde la determinación del beneficio del tratamiento con inhibidores de NMT se determina por la hipermetilación del genNMT2en dicha muestra, donde la determinación del estado de metilación comprende: i) realizar modificación por bisulfito a un ácido nucleico obtenido de dicha muestra, ii) determinar la metilación del promotor del gen NMT2 utilizando cebadores de PCR y/o sondas específicas para la región promotora del gen NMT2 del paso a), opcionalmente en donde el nivel de metilación de la región promotora se determina en comparación con un control.

En un aspecto, en el paso a) dicho regente comprende cebadores para detectar hipermetilación en el genNMT2. En un aspecto, el paso ii) se lleva a cabo realizando un procedimiento seleccionado de PCR, PCR específica de metilación, PCR específica de metilación cuantitativa (QMSP), PCR específica de metilación en tiempo real, ensayo PCR utilizando una proteína de unión específica de ADN de metilación, PCR cuantitativa, ensayo basado en chip de ADN, pirosecuenciación o secuenciación de bisulfito, en el ácido nucleico modificado con bisulfito del paso b).

En un aspecto, la detección de la hipermetilación del gen NMT2 se realiza con cebadores que comprenden SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.

En un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un inhibidor de NMT para su uso en el tratamiento de un sujeto con un cáncer en el que se determina que el genNMT2en una muestra de dicho sujeto está hipermetilado, en el que el uso comprende además el uso de un inhibidor de histona acetil transferasa, un inhibidor de ADN desmetilasa, y/o un inhibidor de histona desmetilasa, y en el que el estado de metilación se determina mediante un procedimiento que comprende un paso de modificación con bisulfito como se define anteriormente y más adelante.

En un aspecto, dicho inhibidor de NMT comprende una molécula pequeña, un anticuerpo, un fragmento peptídico, un ácido nucleico o combinaciones de los mismos.

En un aspecto dicha molécula pequeña comprende DDD85646, DDD86481, o un derivado de la misma.

En un aspecto, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

En un aspecto, dicho ácido nucleico comprende una molécula de dsARN, una molécula de ARNi, una molécula de miARN, una ribozima, una molécula de ARNhc o una molécula de ARNsi.

En un aspecto, dicho cáncer es un linfoma, un linfoma de células B, un linfoma folicular, un linfoma difuso de células B grandes, un linfoma de células del manto, un linfoma de células B-CLL/SLL, un inmunocitoma/Waldenstrom, un linfoma de células B 20 de tipo MALT/monocitoide, un linfoma de Burkitt, un linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de células grandes, Leucemia mieloide aguda, Leucemia mieloide crónica en fase blástica, Linfoma de Burkitt, Mieloma de células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma adenoescamoso mixto de pulmón, Carcinoma de células pequeñas de pulmón, Pulmón, Carcinoma de células escamosas de esófago, Hueso, Carcinoma Ductal de Mama, Adenocarcinoma Difuso de Estómago, Carcinoma Medular de Tiroides, Carcinoma de Células de Transición del Tracto Urinario, Mieloma, Carcinoma de Células claras de Ovario, Carcinoma de Células de Transición (uréter y cáncer de vejiga), Leucemia Mielógena Crónica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma de mama, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón no microcítico, osteosarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma de endometrio, carcinoma escamoso de esófago.

En un aspecto dicho inhibidor de histona acetil transferasa es ácido anacárdico, CPTH2, MB-3, y/o Curcumina. En un aspecto, dicho inhibidor de la histona desmetilasa es Daminozida, GSK J1, GSK J2, GSK J4, GSK J5, GSK LSD 1 dihidrocloruro, IOX 1, JIB 04, RN 1 dihidrocloruro, TC-E 5002, y/o Tranilcipromina hidrocloruro.

En un aspecto, cuando dicho cáncer es un linfoma, el uso comprende además administrar un tratamiento seleccionado de CHOP (es decir, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona), GAP-BOP (es decir, ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina y prednisona), m-BACOD (es decir, metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona y leucovorina), ProMACE-MOPP (es decir, prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina con MOPP estándar), ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexato y leucovorina) y MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina y leucovorina). Para el linfoma no Hodgkin agresivo recidivante pueden utilizarse las siguientes combinaciones de fármacos quimioterapéuticos con los compuestos y composiciones aquí descritos: IMVP-16 (es decir, ifosfamida, metotrexato y etopósido), MIME (es decir, metilgag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), DHAP (es decir, dexametasona, - 16 citarabina a dosis altas y cisplatino), ESHAP (es decir, etopósido, metilprednisona, citarabina a dosis altas y cisplatino), CEFF(B) (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona y bleomicina) o CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina y prednisona).

En un aspecto, cuando dicho cáncer es la enfermedad de Hodgkin, el uso comprende además administrar un tratamiento seleccionado de VABCD (es decir, vinblastina, doxorrubicina, dacarbazina, lomustina y bleomicina), ABDIC (es decir, doxorrubicina, bleomicina, dacarbazina, lomustina y prednisona), CBVD (es decir, lomustina, bleomicina, vinblastina, dexametasona), PCVP (es decir, vinblastina, procarbazina, ciclofosfamida y prednisona), CEP (es decir, lomustina, etopósido y prednimustina), EVA (es decir, etopósido, vinblastina y doxorrubicina), MOPLACE (es decir, ciclofosfamida, etopósido, prednisona, metotrexato, citaravina y vincristina), MIME (es decir, metil-gag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), MINE (es decir, mitocuazona, ifosfamida, vinorelbina y etopósido), MTX-CHOP (es decir, metotrexato y CHOP), CEM (es decir, lomustina, etopósido y metotrexato), CEVD (es decir, lomustina, etopósido, vindesina y dexametasona), CAVP (es decir, lomustina, melfalán, etopósido y prednisona), EVAP (es decir, etopósido, vinblastina, citarabina y cisplatino) y EPOCH (es decir, etopósido, vincristina, doxorrubicina, ciclofosfamida y prednisona)

En un aspecto, cuando dicho cáncer es cáncer de mama, el uso comprende además el uso de un tratamiento seleccionado entre paclitaxel, docetaxel, paclitaxel unido a nanopartículas de albúmina, capecitabina, doxorrubicina, eribulina, vinorelbina, trastuzumab, carboplatino, cisplatino; terapias endocrinas, como tamoxifeno, anastrozol, letrozol, exemestano, fulvestrant, e inhibidores del ciclo celular, como palbocilib, ribociclib, LEE001 y everolimus; fármacos inhibidores del punto de control inmunitario, como nivolumab y pembrolizumab, individualmente o en combinación. En un aspecto, cuando dicho cáncer es cáncer de pulmón de células pequeñas, el uso comprende además el uso de un tratamiento seleccionado entre carboplatino, cisplatino, etopósido, irinotecán, ya sea individualmente o en combinación.

En un aspecto, cuando dicho cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas, el uso comprende además el uso de un tratamiento seleccionado entre carboplatino, paclitaxel, docetaxel, gefitinib, erlotinib, afatinib, bevacizumab, ramucirumab, osimertinib, necitumumab, crizotinib, ceritinib, alectinib, y fármacos inhibidores de puntos de control inmunitario, incluidos nivolumab, pembrolizumab, ya sea individualmente o en combinación.

En un aspecto, cuando dicho cáncer es carcinoma de vejiga, el uso comprende además el uso de un tratamiento seleccionado entre metotrexato, vincblastina, doxorrubicina, cisplatino; carboplatino y paclitaxel; docetaxel, gemcitabina y cisplatino, ya sea individualmente o en combinación.

En un aspecto dicha muestra biológica comprende, un tejido, un espécimen celular o fluidos incluye células tumorales desprendidas y/o ácidos nucleicos libres, una muestra de sangre, una muestra de sangre fraccionada, una muestra de médula ósea, una muestra de biopsia, una muestra de tejido congelado, un espécimen de tejido fresco, una muestra celular, y/o una sección embebida en parafina.

En un aspecto, el sujeto es un humano.

Otros aspectos y características de la presente divulgación resultarán evidentes para los expertos en la materia tras la revisión de la siguiente descripción de realizaciones específicas junto con las figuras que las acompañan.

Breve descripción de los dibujos

A continuación, se describirán realizaciones de la presente invención, únicamente a modo de ejemplo, en referencia a las figuras adjuntas, en las que:

La Fig.1 muestra que la expresión de NMT2 está disminuida en varias líneas celulares de cáncer de la base de datos CCLE y en tumores de la base de datos TCGA.NMT2(gris) tiene un intervalo de expresión de ARNm más amplio queNMT1(negro) en líneas celulares de cáncer (Panel A) y tumores (Panel B). Diagrama de cajas de la expresión de ARNm de NMT2 en líneas celulares y tipos tumorales específicos de cáncer. ***, p < 0,0001 frente a todos los tumores mediante prueba t, #, datos no disponibles (Paneles C, D, E). Copias de ARNm de NMT2 determinadas mediante PCR digital de gotitas en varias líneas celulares linfocíticas (Panel F). Actividad NMT específica en las líneas celulares del (Panel G) *, p < 0,05. Los gráficos de Kaplan-Meier muestran la supervivencia libre de progresión (SLP) de 470 pacientes con LDCBG (GSE31312) con alta (rojo; curva superior) frente a baja (azul; curva inferior) expresión de NMT2 (Panel H). El valor p se determinó mediante la prueba de log-rank. Todos los valores son la media ± p.e.m. de 3 experimentos independientes; La Fig.2 muestra una isla CpG en el promotor NMT2 (Panel A). Regulación epigenética deNMT2en líneas celulares y tumores de linfoma (Panel B) La expresión de NMT2 (recuentos normalizados RSEM) en los tumores TCGA se correlaciona negativamente con los valores de metilación de NMT2 (valores beta cg02268561) en la posición 15.212.006 en WSU-DLCL2 (resaltado en rojo en el Panel B). p = 0,0082, análisis de correlación de Spearman, n = 43 de la cohorte TCGA). La secuenciación bisulfito de la región promotora de DAPK1 revela una región promotora altamente metilada que contiene CpG sólo en linfocitos B malignos (Panel C);

La Fig. 3 representa el número de copias de ARNm de NMT2 medidas por PCR digital en varias líneas celulares linfocíticas tras tratamientos de 24 h con DAC en presencia o ausencia de SAHA (Paneles A-D). Niveles de proteína NMT2 evaluados mediante transferencia western en BL2 (Panel E) e IM9 (Panel F) (normalizados con respecto al nivel de GAPDH) tras tratamientos de 24 h como se ha indicado anteriormente. Los valores son la media ± p.e.m. de 3 experimentos independientes. (Panel G) La expresión de NMT2 (recuentos normalizados RSEM) en los tumores TCGA se correlaciona negativamente con los valores de metilación de NMT2 (valores beta cg02268561) en la posición 15.212.006 en WSU-DLCL2 (resaltado en rojo en la Figura 2B). p = 0,0082, análisis de correlación de Spearman, n = 43 de la cohorte TCGA. representa gráficos e inmunotransferencias;

La Fig.4 muestra un diagrama de cajas y bigotes que muestra la distribución de los volúmenes tumorales de ratones individuales en los gráficos de cada grupo (Panel A). Curvas dosis-respuesta de PCLX-001 para xenoinjertos derivados de líneas celulares DOHH2 (Panel B); Curvas dosis-respuesta de terapia combinada de PCLX-001 y DOX para xenoinjertos derivados de líneas celulares DOHH2 (Panel C); y

Fig 5 Curvas dosis-respuesta de PCLX-001 para xenoinjertos derivados de la línea celular BL2 (Panel A). Curvas dosis-respuesta de la terapia combinada PCLX-001 y DOX para xenoinjertos derivados de la línea celular BL2 (Panel B). Actividad específica NMT total en la muestra de tumor BL2 de los paneles A (panel C).

Estrategia de selección de pacientes para la medicina de precisión (Panel D). Identificación de la deficiencia de NMT2 en DLBCLs de tres pacientes mediante inmunohistoquímica (IHC) e hibridación in situ (ISH) de ARN. También se muestra el tumor del paciente DLBCL3 tras el injerto en ratones (Panel E). Curvas dosisrespuesta de PCLX-001 para el xenoinjerto derivado del paciente 3 (Panel F). Tumores representativos de ratones con xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) (Panel G). El tratamiento con PCLX-001 de ratones con PDX de DLBCL3 deficiente en NMT2 induce la apoptosis (aumento de la tinción de caspasa-3 escindida) (panel G) y reduce la proliferación celular (reducción de la tinción de Ki-67) (panel H). Se muestran cortes tumorales teñidos representativos para cada tratamiento (Panel I).

Descripción detallada

Como se describirá con más detalle a continuación, en el presente documento se describen compuestos, composiciones y procedimientos para el tratamiento de un sujeto con cáncer, en los que los procedimientos para el tratamiento no son objeto de ninguna reivindicación. También se describen aquí procedimientos para identificar sujetos con cáncer que son adecuados para el tratamiento con los compuestos, la composición y los procedimientos se describen aquí.

Las células necesitan al menos un NMT para sobrevivir. El descubrimiento de que múltiples tipos de cáncer carecen de una de las dos NMT, mientras que los tejidos estromales y normales no, permite el tratamiento de las células cancerosas deficientes en NMT2 con un inhibidor de NMT. Véase WO2013/013302 y WO2014/067002.

Se demuestra en el presente documento que la expresión de NMT2 se reduce o elimina en ciertos tipos de cáncer, y en un ejemplo los linfomas, a través de un mecanismo(s) epigenético(s). La reducción o eliminación de la expresión de NMT2 hace que el cáncer sea sensible a los inhibidores de NMT.

En algunos ejemplos, la determinación del estado de metilación del genNMT2puede utilizarse para identificar cánceres que responderán al tratamiento con inhibidores de NMT.

Cáncer

El término "cáncer", tal como se utiliza aquí, se refiere a una variedad de afecciones causadas por el crecimiento anormal e incontrolado de células. Las células capaces de provocar cáncer, denominadas "células cancerosas", poseen propiedades características como la proliferación incontrolada, la inmortalidad, el potencial metastásico, un crecimiento y una tasa de proliferación rápidos y/o ciertos rasgos morfológicos típicos. Las células cancerosas pueden estar en forma de tumor, pero dichas células también pueden existir solas dentro de un sujeto, o pueden ser células cancerosas no tumorigénicas. Un cáncer puede detectarse de varias maneras, entre otras, detectando la presencia de un tumor o tumores (por ejemplo, por medios clínicos o radiológicos), examinando células dentro de un tumor o de otra muestra biológica (por ejemplo, de una biopsia de tejido), midiendo marcadores sanguíneos indicativos de cáncer y detectando un genotipo indicativo de cáncer. Sin embargo, un resultado negativo en uno o más de los procedimientos de detección anteriores no indica necesariamente la ausencia de cáncer, por ejemplo, un paciente que ha mostrado una respuesta completa a un tratamiento contra el cáncer puede seguir teniendo un cáncer, como lo demuestra una recaída posterior.

En el procedimiento aquí reivindicado, el cáncer es un linfoma.

El término "linfoma", tal como se utiliza aquí, se refiere a un crecimiento maligno de células B o T en el sistema linfático. "Linfoma" incluye numerosos tipos de tumores malignos, como el linfoma de Hodgkin y el linfoma no Hodgkin. El término "linfoma no Hodgkin", tal y como se utiliza aquí, hace referencia a un crecimiento maligno de células B o T en el sistema linfático que no es un linfoma de Hodgkin (que se caracteriza, por ejemplo, por la presencia de células de Reed-Sternberg en la zona cancerosa). Los linfomas no hodgkinianos engloban más de 29 tipos de linfoma, cuyas distinciones se basan en el tipo de células cancerosas.

En un ejemplo más específico de la presente divulgación, el cáncer es un linfoma B.

Así, en una realización, los procedimientos aquí descritos son adecuados para el tratamiento de un sujeto con linfoma de células B.

Entre los ejemplos de linfomas de células B se incluyen, entre otros, el linfoma folicular, el linfoma difuso de células B grandes, el linfoma de células del manto, el linfoma de células B-CLL/SLL, el inmunocitoma/Waldenstrom y el linfoma de células B de tipo MALT/monocitoide. También se contempla el tratamiento de linfomas pediátricos como el linfoma de Burkitt, el linfoma difuso de células B grandes, el linfoma folicular, el linfoma precursor B-LBL, el linfoma precursor T-LBL y el linfoma anaplásico de células grandes.

En otras realizaciones, el cáncer es un linfoma, un linfoma de células B, un linfoma folicular, un linfoma difuso de células B grandes, un linfoma de células del manto, un linfoma B-CLL/SLL, un inmunocitoma/Waldenstrom, un linfoma de células B tipo MALT/monocitoide, un linfoma de Burkitt, un linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de células grandes, Leucemia mieloide aguda, Leucemia mieloide crónica en fase blástica, Linfoma de Burkitt, Mieloma de células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma adenoescamoso mixto de pulmón, Carcinoma de células pequeñas de pulmón, Pulmón, Carcinoma de células escamosas de esófago, Hueso, Carcinoma Ductal de Mama, Adenocarcinoma Difuso de Estómago, Carcinoma Medular de Tiroides, Carcinoma de Células de Transición del Tracto Urinario, Mieloma, Carcinoma de Células claras de Ovario, Carcinoma de Células de Transición (uréter y cáncer de vejiga), Leucemia Mielógena Crónica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma de mama, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón no microcítico, osteosarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma de endometrio o carcinoma escamoso de esófago.

El término "sujeto" o "paciente", tal como se utiliza aquí, se refiere a un animal, y puede incluir, por ejemplo, animales domesticados, como gatos, perros, etc., ganado (p. ej., ganado vacuno, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.), animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, ratas, cobayas, etc.), mamíferos, mamíferos no humanos, primates, primates no humanos, roedores, aves, reptiles, anfibios, peces y cualquier otro animal. En una realización, el sujeto es un humano.

El término "tratamiento" o "tratar", tal como se utiliza aquí, se refiere a la obtención de resultados beneficiosos o deseados, incluidos los resultados clínicos. A efectos de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, entre otros, el alivio o la mejora de uno o más síntomas, la disminución del grado de la enfermedad, la estabilización (es decir, que no haya empeoramiento) del estado de la enfermedad, la prevención de la propagación de la enfermedad, el retraso o la ralentización de la progresión de la enfermedad, la mejora o la atenuación del estado de la enfermedad y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. "Tratar" y "tratamiento", tal como se utilizan aquí, también incluyen el tratamiento profiláctico. Por ejemplo, un sujeto con cáncer temprano, por ejemplo un linfoma en estadio temprano, puede ser tratado para prevenir la progresión o alternativamente un sujeto en remisión puede ser tratado con un compuesto o composición descrito en el presente documento para prevenir la recurrencia.

El término "muestra" o "muestra biológica", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier muestra de un sujeto, incluyendo pero sin limitarse a una muestra de fluido, célula o tejido que contenga células cancerosas, o que se sospeche que contenga células cancerosas, que pueda ensayarse para determinar la modificación epigenética, los niveles de expresión génica, los niveles de proteínas, los niveles de actividad enzimática y similares. En un ejemplo concreto, la muestra se somete a un ensayo de modificación epigenética. En otro ejemplo específico, la modificación epigenética es la metilación o acetilación. La muestra puede incluir, por ejemplo, una muestra de sangre, una muestra de sangre fraccionada, una muestra de médula ósea, una muestra de biopsia, una muestra de tejido congelado, una muestra de tejido fresco, una muestra de células y/o una sección embebida en parafina, material del que puede extraerse ADN en cantidades suficientes y con la calidad adecuada para permitir la medición de la(s) modificación(es) epigenética(s).

Inhibidores de NMT

En un aspecto específico, dicho inhibidor NMT comprende una molécula pequeña, un anticuerpo, un fragmento peptídico, un ácido nucleico, o combinaciones de los mismos.

En un aspecto específico, dicha molécula pequeña comprende DDD85646, el inhibidor pirazol sulfonamida de NMT deT. brucei[J.A.Frearson et al (2010) Nature.464.728-723)], o un derivado del mismo.

En un aspecto específico, dicha molécula pequeña comprende Trs-DBA.

En un aspecto específico, dicha molécula pequeña comprende DDD86481 (también denominada PCLX-001 y CCI-002 en el presente documento), o un derivado de la misma.

Los resultados se muestran en la Tabla 1.

En un aspecto específico, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

En un aspecto específico, dicho ácido nucleico comprende una molécula de dsARN, una molécula de ARNi, una molécula de miARN, una ribozima, una molécula de ARNhc o una molécula de ARNsi.

Se pueden preparar fragmentos peptídicos total o parcialmente por síntesis química que encajen en el sitio activo de NMT1. Los fragmentos peptídicos pueden prepararse según procedimientos de síntesis peptídica en fase líquida o sólida establecidos y estándar, que serán conocidos por el trabajador experto.

Los inhibidores del ácido nucleico, o sus complementos, inhiben la actividad o la función regulando a la baja la producción del polipéptido activo. Esto puede controlarse utilizando procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante cribado utilizando PCR en tiempo real como se describe en los ejemplos.

Entre los ejemplos de inhibidores de ácidos nucleicos se incluye la tecnología antisentido o ARNi, cuyo uso para subregular la expresión génica está bien establecido en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido pueden diseñarse para hibridarse con la secuencia complementaria de ácido nucleico, pre-ARNm o ARNm maduro, interfiriendo con la producción del componente de la vía de reparación por escisión de bases, de modo que se reduzca su expresión o se impida total o sustancialmente. Además de dirigirse a la secuencia codificante, las técnicas antisentido pueden utilizarse para dirigirse a las secuencias de control de un gen, por ejemplo en la secuencia flanqueante 5', por lo que los oligonucleótidos antisentido pueden interferir con las secuencias de control de la expresión.

Una alternativa al antisentido es utilizar una copia de todo o parte del gen diana insertada en sentido, es decir, con la misma orientación que el gen diana, para lograr la reducción de la expresión del gen diana por co-supresión.

Además, se puede utilizar el silenciamiento por ARN de doble cadena (ARNdc). El silenciamiento mediado por ARNdc es específico de un gen y a menudo se denomina ARN de interferencia (ARNi).

En otro ejemplo, se utiliza ácido nucleico que al transcribirse produce una ribozima, capaz de cortar el ácido nucleico en un sitio específico y, por lo tanto, también útil para influir en el NMT.

En otro ejemplo, pueden emplearse pequeñas moléculas de ARN para regular la expresión génica. Entre ellas figuran la degradación selectiva de los ARNm mediante pequeños ARN de interferencia (siARN), el silenciamiento génico postranscripcional (PTG), la represión traslacional de los ARNm mediante microARN (miARN) y el silenciamiento génico transcripcional selectivo.

En otro ejemplo, puede utilizarse la expresión de una molécula de ARN de horquilla corta (ARNhc) en la célula. Un ARNhc está formado por repeticiones invertidas cortas separadas por una pequeña secuencia en bucle. Una repetición invertida es complementaria al gen diana. En la célula, el ARNhc es procesado por DICER en un ARNsi que degrada el ARNm del gen NMT diana y suprime su expresión. En una realización preferida, el ARNhc se produce endógenamente (dentro de una célula) por transcripción a partir de un vector.

El término "inhibir" o "inhibidor", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier procedimiento o técnica que inhiba la síntesis, los niveles, la actividad o la función de la proteína, así como a los procedimientos de inhibición de la inducción o estimulación de la síntesis, los niveles, la actividad o la función de la proteína de interés, por ejemplo NMT1. El término también se refiere a cualquier vía metabólica o reguladora, que puede regular la síntesis, los niveles, la actividad o la función de la proteína de interés. El término incluye la unión con otras moléculas y la formación de complejos. Por lo tanto, el término "inhibidor" se refiere a cualquier agente o compuesto cuya aplicación provoque la inhibición de la función de una proteína o de la función de una vía proteica. Sin embargo, el término no implica que todas y cada una de estas funciones deban inhibirse al mismo tiempo.

Administración y composiciones farmacéuticas

Los compuestos y/o composiciones para su uso en el presente documento pueden proporcionarse en una cantidad de efecto farmacéutico adecuada para su administración a un sujeto.

El término "cantidad farmacéuticamente eficaz" como se usa en el presente documento se refiere a aquella cantidad de fármaco o agente farmacéutico que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que está siendo buscada, por ejemplo, por un investigador o un médico. Esta cantidad puede ser una cantidad terapéuticamente eficaz.

Los compuestos y composiciones se proporcionan en una forma farmacéuticamente aceptable.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se utiliza en la presente memoria para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificaciones (tales como dosificaciones unitarias) que son adecuadas para la utilización en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, proporcionales a una relación razonable de beneficio/riesgo. Cada portador, excipiente, etc. también debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación.

La dosis real administrada, y la velocidad y el tiempo de administración, dependerán de la naturaleza y la intensidad de la enfermedad que se esté tratando. La prescripción de tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., es responsabilidad de los médicos generales y otros médicos y normalmente tiene en cuenta el trastorno que se va a tratar, el estado del paciente individual, el lugar de administración, el procedimiento de administración y otros factores conocidos por los médicos.

Un compuesto o composición puede ser administrada sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultánea o secuencialmente, dependiendo de la condición a tratar.

Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de unidades de dosificación y se pueden preparar mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en el campo de la farmacia/microbiología. Tales procedimientos incluyen el paso de asociar el compuesto activo con un portador, que puede constituir uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el agente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, moldeando el producto.

Los compuestos y composiciones pueden administrarse a un sujeto por cualquier vía de administración conveniente, ya sea sistémica/periférica o en el sitio de acción deseado, incluyendo, entre otras, oral (por ejemplo, por ingestión); tópica (incluyendo, por ejemplo, transdérmica, intranasal, ocular, bucal y sublingual); pulmonar (por ejemplo, mediante terapia de inhalación o insuflación utilizando, por ejemplo, un aerosol, por ejemplo, a través de la boca o la nariz); rectal; vaginal; parenteral, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intradérmica, intruscular, intraarterial, intracardíaca. a través de la boca o la nariz); rectal; vaginal; parenteral, por ejemplo, por inyección, incluyendo subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intracardíaca, intratecal, intraespinal, intracapsular, subcapsular, intraorbital, intraperitoneal, intratraqueal, subcuticular, intraarticular, subaracnoidea e intraesternal; por implante de un depósito / por ejemplo, subcutáneo o intramuscular.

Las formulaciones para administración oral en la presente invención se pueden presentar como: unidades discretas tales como cápsulas, bolsitas o comprimidos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada del agente activo; tal como polvo o gránulos; como solución o suspensión del agente activo en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite; o como bolo, etc.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral (por ejemplo, por inyección, incluyendo cutánea, subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica), incluyen soluciones acuosas y no acuosas isotónicas, libres de pirógenos, estériles para inyección que pueden contener antioxidantes, tampones, conservantes, estabilizadores, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y espesantes, y liposomas u otros sistemas microparticulados diseñados para dirigir el compuesto a los componentes sanguíneos o a uno o más órganos. Ejemplos de vehículos isotónicos adecuados para su uso en tales formulaciones incluyen la inyección de cloruro sódico, la solución de Ringer o la inyección de Ringer lactato.

Las formulaciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales herméticamente cerrados, y pueden conservarse en condición deshidratada por congelación (liofilizada) que únicamente requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección inmediatamente antes de ser utilizadas. Pueden prepararse soluciones y suspensiones para inyección improvisadas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles. Las formulaciones pueden presentarse en forma de liposomas u otros sistemas microparticulados diseñados para dirigir el compuesto activo a los componentes sanguíneos o a uno o más órganos. Las composiciones que comprenden los compuestos aquí divulgados pueden utilizarse en los procedimientos aquí descritos en combinación con regímenes quimioterapéuticos estándar o junto con radioterapia.

Terapia de combinación

En el caso del cáncer, y por ejemplo del linfoma, en un paciente, los tratamientos conocidos dependen del sujeto a tratar, del tipo de enfermedad y de su estadio. El trabajador especializado conoce las modalidades de tratamiento existentes para diversos tipos de cáncer, incluido, por ejemplo, el linfoma. Por consiguiente, los tratamientos conocidos para el cáncer pueden utilizarse junto con los inhibidores de NMT aquí descritos.

Las combinaciones de fármacos comunes para el tratamiento de linfomas incluyen, entre otras, CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona), GAP-BOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina y prednisona), m-BACOD (metotrexato, procarbazina, bleomicina, vincristina y prednisona), ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina y prednisona), m-BACOD (es decir, metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona y leucovorina), ProMACE-MOPP (es decir, prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina con MOPP estándar), ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexato y leucovorina) y MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina y leucovorina). Para el linfoma no Hodgkin agresivo recidivante pueden utilizarse las siguientes combinaciones de fármacos quimioterapéuticos con los compuestos y composiciones aquí descritos: IMVP-16 (es decir, ifosfamida, metotrexato y etopósido), MIME (es decir, metilgag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), DHAP (es decir, dexametasona, - 16 citarabina a dosis altas y cisplatino), ESHAP (es decir, etopósido, metilprednisona, citarabina a dosis altas y cisplatino), CEFF(B) (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona y bleomicina) y CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina y prednisona).

Los tratamientos de quimioterapia de rescate utilizados para ciertos linfomas, como la enfermedad de Hodgkin recidivante y resistente, incluyen, entre otros, VABCD (es decir, vinblastina, doxorrubicina, dacarbazina, lomustina y bleomicina), ABDIC (es decir, doxorrubicina, bleomicina, dacarbazina, lomustina y prednisona), CBVD (es decir, lomustina, bleomicina, vinblastina, dexametasona), PCVP (es decir, vinblastina, procarbazina, ciclofosfamida y prednisona), CEP (es decir, lomustina, etopósido y prednimustina), EVA (es decir, etopósido, vinblastina y doxorrubicina), MOPLACE (es decir, ciclofosfamida, etopósido, prednisona, metotrexato, citaravina y vincristina), MIME (es decir, metil-gag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), MINE (es decir, mitocuazona, ifosfamida, vinorelbina y etopósido), MTX-CHOP (es decir, metotrexato y CHOP), CEM (es decir, lomustina, etopósido y metotrexato), CEVD (es decir, lomustina, etopósido, vindesina y dexametasona), CAVP (es decir, lomustina, melfalán, etopósido y prednisona), EVAP (es decir, etopósido, vinblastina, citarabina y cisplatino) y EPOCH (es decir, etopósido, vincristina, doxorrubicina, ciclofosfamida y prednisona).

El tratamiento del cáncer de mama incluye el tratamiento con paclitaxel, docetaxel, paclitaxel unido a nanopartículas de albúmina, capecitabina, doxorrubicina, eribulina, vinorelbina, trastuzumab, carboplatino, cisplatino; terapias endocrinas, como tamoxifeno, anastrozol, letrozol, exemestano, fulvestrant, e inhibidores del ciclo celular, como palbocilib, ribociclib, LEE001 y everolimus; fármacos inhibidores del punto de control inmunitario, como nivolumab y pembrolizumab, individualmente o en combinación.

El tratamiento para el cáncer de pulmón de células pequeñas incluye el tratamiento con carboplatino, cisplatino, etopósido, irinotecán, ya sea individualmente o en combinación.

El tratamiento para el cáncer de pulmón de células no pequeñas incluye el tratamiento con carboplatino, paclitaxel, docetaxel, gefitinib, erlotinib, afatinib, bevacizumab, ramucirumab, osimertinib, necitumumab, crizotinib, ceritinib, alectinib y fármacos inhibidores del punto de control inmunitario, incluidos nivolumab, pembrolizumab, ya sea individualmente o en combinación.

El tratamiento para el carcinoma de vejiga incluye el tratamiento con metotrexato, vincblastina, doxorrubicina, cisplatino; carboplatino y paclitaxel; docetaxel, gemcitabina y cisplatino, ya sea individualmente o en combinación.

Mecanismos epigenéticos

Como se ha mencionado anteriormente, se demuestra en el presente documento que la expresión deNMT2(es decir, la expresión del genNMT2) se reduce o elimina en ciertos tipos de cáncer, y en un ejemplo los linfomas, a través de un mecanismo(s) epigenético(s). La reducción o eliminación de la expresión deNMT2hace que el cáncer sea sensible a los inhibidores de NMT.

El término "epigenético", tal y como se utiliza aquí, se refiere a la(s) modificación(es) en la expresión génica que es independiente de la secuencia de ADN.

Los factores epigenéticos incluyen modificaciones en la expresión génica controladas por cambios en la metilación del ADN (hipermetilación o hipometilación) y la estructura de la cromatina.

Por ejemplo, se sabe que los patrones de metilación del ADN se correlacionan con la expresión génica. La metilación del ADN se produce en la posición 5 de las citosinas en los sitios CpG.

En otro ejemplo, los cambios epigenéticos son patrones o niveles de acetilación alterados.

Mecanismos epigenéticos - metilación

La determinación del estado de metilación del genNMT2puede utilizarse para identificar cánceres que responderán al tratamiento con inhibidores de NMT.

El término "estado de metilación", tal como se utiliza aquí, se refiere al nivel de metilación de residuos de citosina en sitios CpG en un gen, por ejemploNMT2.Los sitios CpG incluyen pares CpG, islas CpG y costas de islas CpG. El término "isla CpG" se refiere a una región de ADN genómico que contiene un alto porcentaje de sitios CpG en relación con la incidencia media de CpG genómico

En el ejemplo de los pares CpG, el estado de metilación puede ser metilado o no metilado. En el ejemplo de islas CpG o costas de islas CpG, o a cualquier tramo de residuos, el estado de metilación se refiere al nivel de metilación, que es la concentración relativa o absoluta de C metilado en la isla CpG particular o costa de isla CpG o tramo de residuos en una muestra biológica.

La metilación de un sitio CpG o isla CpG en un promotor típicamente reduce o elimina la expresión del gen.

Los sitios CpG o islas CpG pueden rodear la región 5' de la región codificante del gen, así como la región 3' de la región codificante. En consecuencia, los sitios CpG o islas CpG se pueden encontrar en múltiples regiones de una secuencia de ácido nucleico, incluyendo aguas arriba de las secuencias codificantes en una región reguladora que incluye una región promotora, en las regiones codificantes (por ejemplo, exones), aguas abajo de las regiones codificantes en, por ejemplo, regiones potenciadoras, y en intrones. Todas estas regiones pueden evaluarse para determinar su estado de metilación, según proceda.

Los niveles de metilación del genNMT2, por ejemplo hipermetilación deNMT2o hipometilación deNMT2,pueden determinarse por cualquier medio adecuado para reflejar el nivel de expresión deNMT2.

El término "nivel de expresión", tal como se utiliza aquí, se refiere al nivel de expresión génica.

El término "gen", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que comprende secuencias codificantes necesarias para la producción de un polipéptido como NMT2, ARN (por ejemplo, incluyendo pero no limitado a, ARNm, ARNt y ARNr) o precursor. El polipéptido puede estar codificado por una secuencia codificadora de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificadora, siempre que se mantenga la actividad o propiedad funcional deseada (por ejemplo, actividad enzimática, unión de ligandos, transducción de señales, inmunogenicidad, etc.) de la longitud completa o del fragmento. El término también engloba la región codificante de un gen estructural y las secuencias incluidas adyacentes a la región codificante en los extremos 5' y 3' por una distancia de aproximadamente 1 kb, y en algún ejemplo superior a 1 kb, en cada extremo de forma que el gen corresponda a la longitud del ARNm de longitud completa.

El término "hipermetilación", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al estado medio de metilación correspondiente a un aumento de la presencia de 5-metil citidina en uno o más de los sitios CpG CpG o islas CpG dentro de una secuencia de ADN, por ejemplo el genNMT2, de una muestra de ADN de prueba, en relación con la cantidad de 5-metil citidina en el sitio CpG o isla CpG correspondiente dentro de una muestra de ADN "normal" y/o de control.

En algún ejemplo, la hipermetilación se refiere a un grado de aproximadamente 1 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o más de aproximadamente 95 % mayor que el grado de metilación de citosinas típicamente esperado u observado para el sitio o sitios CpG que se están evaluando. Se apreciará que la metilación varía en diferentes condiciones metabólicas, estrés, etc., como sabría un trabajador experto. En algún ejemplo, la hipermetilación se refiere a la metilación en una sola citidina.

El término "hipometilación", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al estado medio de metilación correspondiente a una presencia disminuida de 5-metil citidina en uno o más de los sitios CpG CpG o islas CpG dentro de una secuencia de ADN, por ejemplo el genNMT2, de una muestra de ADN de prueba, en relación con la cantidad de 5-metil citidina en el sitio CpG o isla CpG correspondiente dentro de una muestra de ADN "normal" y/o de control. Típicamente los motivos CpG residen cerca del sitio de inicio de la transcripción, por ejemplo, dentro de aproximadamente 3 kbp, dentro de aproximadamente 2.5 kbp, dentro de aproximadamente 2 kbp, dentro de aproximadamente 1.5 kbp, dentro de aproximadamente 1 kbp, dentro de aproximadamente 750 bp, o dentro de aproximadamente 500 bp

En algunos ejemplos, las islas CpG tienen menos de 100 pares de bases, entre 100 y 200 pares de bases, entre 200 y 300 pares de bases, entre 300 y 500 pares de bases, entre 500 y 750 pares de bases; entre 750 y 1000 pares de bases; 100 o más pares de bases de longitud.

En algunos ejemplos, el estado de metilación del genNMT2se determina como hipermetilación. En algunos ejemplos, se determina que el estado de metilación deNMT2es de hipometilación.

En el ejemplo en el que se determina que la metilación del genNMT2en una muestra es hipermetilación, se reduce o elimina la expresión deNMT2.

En el ejemplo en el que se determina que la metilación del genNMT2en una muestra es una hipometilación, la expresión deNMT2no se reduce ni se elimina.

El término "expresión reducida", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un nivel de expresión menor de un gen en una muestra biológica, en comparación con la expresión en una muestra de control o de referencia. El estado de metilación del genNMT2en una muestra puede determinarse utilizando una amplia gama de dispositivos y procedimientos adecuados de cuantificación o detección de metilación, como sería conocido por el trabajador experto.

Los dispositivos adecuados incluyen, entre otros, la tecnología lab-on-chip, las tecnologías microfluídicas, la tecnología biomonitor, las tecnologías de reconocimiento de protones (p. ej., Ion Torrent) y/u otros procedimientos de secuenciación altamente paralelos y/o profundos.

Los procedimientos conocidos de análisis de metilación del ADN incluyen MALDI-TOFF, MassARRAY, Methy Light, análisis cuantitativo de alelos metilados (QAMA), ensayo enzimático de metilación regional (ERMA), HeavyMethyl, QBSUPT, MS-SNuPE, MethylQuant, secuenciación PCR cuantitativa y sistemas de microarreglos basados en oligonucleótidos.

Otros procedimientos de análisis de metilación del ADN incluyen la PCR específica de metilación (MSP), la secuenciación con bisulfito (también denominada secuenciación del ADN tratado con bisulfito para convertir la citosina metilada en uracilo), la pirosecuenciación, el análisis con enzimas de restricción del ADN sensible a la metilación, la pirosecuenciación cuantitativa con bisulfito, la PCR de secuenciación genómica con bisulfito y el AQAMA. Pueden utilizarse procedimientos adecuados para un procedimiento de modificación con bisulfito como el que se reivindica en el presente documento.

En algunos ejemplos, la determinación del estado de metilación del gen NMT2 comprende la determinación de la frecuencia de metilación de la isla CpG o de la orilla de la isla CpG. La determinación del nivel de un polímero de ácido nucleico con metilación alterada se lleva a cabo de diversas maneras, y como se ha indicado anteriormente, incluyendo pero sin limitarse a, PCR específica de metilación, PCR cuantitativa específica de metilación, análisis de enzimas de restricción de ADN sensibles a la metilación, pirosecuenciación cuantitativa con bisulfito, secuenciación de próxima generación y PCR de secuenciación genómica con bisulfito.

Las endonucleasas de restricción sensibles a la metilación pueden utilizarse para detectar motivos de dinucleótidos CpG metilados. Dichas endonucleasas pueden escindir preferentemente sitios de reconocimiento metilados en relación con sitios de reconocimiento no metilados, Ejemplos no limitantes incluidos son Aat II, Ace III, Ad I, Acl I, Age I, Alu I, Asc I, Ase1, AsiS I, Ban I, Bbe I, BsaA I, BsaH I, BsiE I, BsiWI, BsrVI, BssK 1, BstB I, BstN I, Bs I, Cla I, Eae I, Eag I, Fau I, Fsel, Hha !, mPl I, HinC II, Hpa 11, Npy99 I, HpyCAIV, Kas I,Mbo I, Mlu I, MapA 11. Msp I, Nae I, Nar I, Not 1, Pml I, Pstl, Pvu I, Rsr II, Sac II, Sap I, Sau3A I, Sfll, Sfo I, SgrA I, Sma I SnaB I, Tsc I, Xma I, y Zra I. Las eendonucleasas escinden preferentemente los sitios de reconocimiento no metilados en relación con los metilados. Entre los ejemplos no limitantes se incluyen Ace II, Ava I, BssH II, BstU I, Hpa II, Not I y Mho I.

Pueden utilizarse reactivos químicos que modifiquen selectivamente la forma metilada o no metilada de los motivos dinucleótidos CpG. Los productos modificados pueden detectarse directamente, o tras una reacción posterior que crea productos fácilmente distinguibles. Para detectar productos modificados se pueden utilizar medios que detecten alteraciones del tamaño y/o de la carga, como la electroforesis, la cromatografía y la espectrometría de masas, entre otros. Algunos ejemplos de estos reactivos químicos para la modificación selectiva son los iones hidrazina y bisulfito. El ADN modificado con hidracina puede tratarse con piperidina para escindirlo. El ADN tratado con iones bisulfito puede tratarse con álcali. Otros medios de detección que dependen de secuencias específicas son la hibridación, la amplificación, la secuenciación y la reacción en cadena de la ligasa. Se pueden utilizar combinaciones de estas técnicas según se desee.

NMT2 modificación epigenética - un marcador para uno o más de diagnóstico, pronóstico, clasificación, estratificación, o seguimiento, de un cáncer en un sujeto.

La determinación del estado de metilación deNMT2puede utilizarse para monitorizar la eficacia de un régimen terapéutico, por ejemplo, un agente quimioterapéutico o un agente biológico, como un inhibidor de NMT.

La determinación del estado de metilación deNMT2también puede utilizarse para determinar qué régimen terapéutico o preventivo emplear en un paciente.

La determinación del estado de metilación deNMT2también puede usarse para estratificar a los pacientes en grupos para probar agentes y determinar su eficacia en varios grupos de pacientes. Tales usos caracterizan el cáncer en categorías basadas en los genes, que son silenciados epigenéticamente y/o la cantidad de silenciamiento de los genes. En el caso de un diagnóstico o una caracterización, la información que comprende datos o conclusiones puede escribirse o comunicarse por vía electrónica u oral. La identificación puede estar asistida por una máquina. La comunicación de los datos o conclusiones puede realizarse, por ejemplo, de un laboratorio clínico a una consulta clínica, de un clínico a un paciente o de un especialista a un generalista. La forma de comunicación de los datos o conclusiones puede implicar normalmente un soporte tangible o actos humanos físicos.

En un ejemplo, una muestra de prueba obtenible de tejido o especímenes celulares o fluidos incluye células tumorales desprendidas y/o ácidos nucleicos libres que son liberados de células tumorales muertas o dañadas.

Los ácidos nucleicos incluyen ARN, ADN genómico, ADN mitocondrial, de cadena simple o doble. Puede utilizarse cualquier espécimen de ácido nucleico en forma purificada o no purificada obtenido a partir de dicha muestra. Las muestras de ensayo pueden contener células cancerosas o precancerosas o ácidos nucleicos procedentes de ellas. En un ejemplo concreto, se aísla ADN genómico.

Los agentes desmetilantes pueden ponerse en contacto con células in vitro o in vivo con el fin de restaurar la expresión génica normal de la célula o para la validación de la metilación. Los agentes desmetilantes adecuados incluyen, entre otros, la 5-aza-2'-deoxicitidina, la 5-azacitidina, la cebularina, la procaína y la L-metionina. Esta reacción puede utilizarse para el diagnóstico, para determinar la predisposición y para determinar los regímenes terapéuticos adecuados.

En un ejemplo, la determinación del estado de metilación de NMT2 es para determinar la(s) condición(es) del riesgo de desarrollar cáncer, metástasis, recaída tumoral, predicción de la respuesta a un tratamiento, la identificación y/o selección de un cáncer, tal como linfoma, la selección de un régimen de tratamiento adecuado, estratificación de un paciente, y el tratamiento de un paciente.

En ciertas realizaciones de la invención, el estado de metilación se determina en parte o totalmente sobre la base de una comparación con un control. El control puede ser un valor o conjunto de valores relacionados con el grado y/o patrón de metilación en una muestra de control. En ciertas realizaciones de la invención, dicho valor o valores pueden determinarse, por ejemplo, mediante cálculos, utilizando algoritmos, y/o a partir de datos previamente adquiridos y/o archivados. En ciertas realizaciones de la invención, el valor o conjunto de valores para el control se deriva de experimentos realizados en muestras o utilizando un sujeto. Por ejemplo, los datos de control pueden proceder de experimentos con muestras derivadas de tejidos o células comparables, como tejido normal adyacente a tumores. En ciertas realizaciones de la invención, se utiliza un control que comprende ADN que está mayoritariamente o totalmente desmetilado, en uno o más de los sitios CpG analizados. Dicho control puede obtenerse, por ejemplo, de tejidos o células mutantes que carezcan de actividad metiltransferasa y/o de tejidos o células que hayan sido desmetilados químicamente. Por ejemplo, los controles pueden obtenerse a partir de tejidos o células que carezcan de actividad de las metiltransferasas. Pueden utilizarse agentes como la 5-aza-2'-desoxicitidina para desmetilar químicamente el ADN.

En ciertas realizaciones de la invención, se utiliza un control que comprende ADN que está metilado en su mayor parte o en su totalidad, en uno o más de los sitios CpG analizados. Dicho control puede obtenerse, por ejemplo, de células o tejidos que se sabe o se espera que estén mayoritariamente o totalmente metilados en el sitio o sitios CpG de interés. Dicho control también podría obtenerse mediante células o tejidos en los que se hayan alterado y/o manipulado los niveles de metilación.

El presente procedimiento puede utilizarse para predecir la respuesta en un paciente con linfoma al tratamiento con un inhibidor de NMT. En algunos ejemplos, el inhibidor de NMT se utiliza en combinación con al menos una quimioterapia adicional.

La presencia de hipermetilación deNMT2indica que el genNMT2está metilado en mayor medida, lo que permite la intervención con un inhibidor de NMT. Por lo tanto, la presencia de hipermetilación deNMT2indica una respuesta clínica más positiva a dicho tratamiento, mientras que la ausencia de metilación o un nivel inferior de metilación en comparación con una muestra de control indica una respuesta clínica infructuosa al tratamiento con un inhibidor de NMT. Si se determina una respuesta clínica positiva al tratamiento con un inhibidor de NMT, se identifica o selecciona al paciente para un tratamiento con dicho inhibidor de NMT. En otros casos, el paciente no es seleccionado para el tratamiento con un inhibidor de NMT, y uno o más fármacos alternativos o intervenciones médicas pueden ser más beneficiosos para el tratamiento del paciente con cáncer.

En consecuencia, la modificación epigenética de NMT2, específicamente la metilación de NMT2, puede usarse como marcador para uno o más de los diagnósticos, pronósticos, clasificación o monitorización del cáncer en un sujeto. El término "pronóstico", tal como se utiliza aquí, se refiere a la predicción de la probabilidad de muerte o progresión atribuible al cáncer, incluyendo recurrencia, diseminación metastásica y resistencia a fármacos, de una enfermedad neoplásica, como el cáncer de mama.

El término "marcador pronóstico", tal como se utiliza aquí, se refiere a un marcador que informa sobre el resultado de un paciente en ausencia de terapia sistémica o presagia un resultado diferente al de los pacientes sin el marcador, a pesar de la terapia sistémica empírica (no dirigida al marcador).

El término "marcador predictivo" como se usa aquí se refiere a un marcador que predice que la eficacia diferencial (beneficio) de una terapia particular basada en el estado del marcador.

El término "diagnóstico", tal como se utiliza aquí, se refiere a la identificación de un estado molecular y/o patológico, enfermedad o condición, como la identificación de cáncer de mama, u otro tipo de cáncer.

Las pruebas pueden realizarse con fines de diagnóstico o junto con un régimen terapéutico.

Por lo tanto, un procedimiento para predecir la respuesta en un paciente con linfoma al tratamiento con un inhibidor de NMT puede comprender proporcionar una muestra biológica de dicho paciente con linfoma, y determinar en dicha muestra biológica el estado de metilación del genNMT2, y predecir una respuesta clínica positiva a dicho tratamiento, si se determina hipermetilación en el genNMT2.

Un procedimiento para identificar y/o seleccionar un paciente con un linfoma, o tratado para un linfoma adecuado para el tratamiento con un inhibidor de NMT, puede comprender proporcionar una muestra biológica de dicho paciente, y determinar en el estado de metilación del genNMT2, e identificar y/o seleccionar el paciente para el tratamiento con dicho inhibidor de NMT si se determina hipermetilación en el genNMT2.

Un procedimiento para seleccionar un régimen de tratamiento adecuado para un linfoma en un paciente puede comprender proporcionar una muestra biológica de dicho paciente, y determinar en dicha muestra biológica el estado de metilación del genNMT2, y seleccionar un inhibidor NMT para el tratamiento si se determina hipermetilación y/o infraexpresión en el genNMT2.

Un procedimiento de tratamiento de un paciente con linfoma con un inhibidor de NMT puede comprender proporcionar una muestra biológica de dicho paciente, y determinar en dicha muestra biológica el estado de metilación de NMT2,y seleccionar dicho inhibidor de NMT para el tratamiento si se determina hipermetilación enNMT2.

Se apreciará que en algunas circunstancias, un paciente que responde inicialmente al tratamiento con inhibidores de NMT puede recaer. Dicha recaída puede manifestarse de varias formas, entre otras, la reaparición del tumor primario y el desarrollo de metástasis. Además, o alternativamente, puede surgir otro tumor distinto.

Según el presente procedimiento, la administración de un inhibidor de NMT a dicho sujeto está indicada cuando NMT2 está hipermetilado en dicha muestra, opcionalmente en comparación con un control.

Un procedimiento para tratar linfoma en un sujeto, puede comprender: a) obtener ácido nucleico de una muestra del sujeto; b) realizar una modificación por bisulfito al ácido nucleico en el paso a); c) realizar un procedimiento seleccionado de PCR, PCR específica de metilación, PCR específica de metilación cuantitativa (QMSP), PCR específica de metilación en tiempo real, ensayo PCR utilizando una proteína de unión específica de ADN de metilación, PCR cuantitativa, ensayo basado en chip de ADN, pirosecuenciación o secuenciación bisulfítica, en el ácido nucleico modificado con bisulfito del paso b) utilizando cebadores PCR y/o sondas específicas para la región promotora del gen NMT2, e) determinar un nivel de metilación del promotor de la región promotora de NMT2 en la muestra, opcionalmente en comparación con un control, g) tratar a dicho paciente con un inhibidor de NMT cuando se determine que el nivel de metilación del promotor de la región promotora del gen NMT2 en la muestra está hipermetilado.

Un ensayoin vitropara seleccionar un tratamiento para un paciente con linfoma, puede comprender: a) obtener ácido nucleico a partir de una muestra del sujeto; b) realizar la modificación por bisulfito del ácido nucleico en el paso a); c) realizar un procedimiento seleccionado entre PCR, PCR específica de metilación, PCR específica de metilación cuantitativa (QMSP), PCR específica de metilación en tiempo real, ensayo PCR utilizando una proteína de unión específica de ADN de metilación, PCR cuantitativa, ensayo basado en chip de ADN, pirosecuenciación, o secuenciación bisulfítica, en el ácido nucleico modificado con bisulfito del paso b) utilizando cebadores de PCR y/o sondas específicas para la región promotora del gen NMT2, e) determinar un nivel de metilación del promotor de la región promotora de NMT2 en la muestra, opcionalmente en comparación con un control, en el que el tratamiento seleccionado es un inhibidor de NMT cuando se determina que la región promotora del gen NMT2 en la muestra está hipermetilada.

De acuerdo con el procedimiento aquí descrito, se proporciona un ensayo in vitro de una muestra de un paciente para seleccionar un tratamiento para un paciente con linfoma, que comprende: a) realizar la modificación por bisulfito del ácido nucleico de dicha muestra, b) determinar la metilación del promotor del gen NMT2 utilizando cebadores de PCR y/o sondas específicas para la región promotora del gen NMT2 del paso a).

En un aspecto del ensayo, el paso b) se realiza mediante un procedimiento seleccionado de PCR, PCR específica de metilación, PCR específica de metilación cuantitativa (QMSP), PCR específica de metilación en tiempo real, ensayo de PCR utilizando una proteína de unión específica de ADN de metilación, PCR cuantitativa, ensayo basado en chip de ADN, pirosecuenciación o secuenciación de bisulfito, el ácido nucleico modificado con bisulfito del paso a).

En un aspecto, la detección de hipermetilación del genNMT2se realiza con cebadores que comprenden SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.

Un kit para seleccionar un tratamiento adecuado para un linfoma en un paciente, puede comprender: a) uno o más reactivos para determinar el estado de metilación del gen NMT2 a partir de una muestra de dicho paciente, en el que el tratamiento seleccionado es un inhibidor de NMT cuando se determina que la región promotora del gen NMT2 en la muestra está hipermetilada, b) instrucciones para el uso del mismo.

Dichos reactivos pueden comprender cebadores de PCR y/o sondas específicas para la región promotora del gen NMT2.

Mecanismos epigenéticos - acetilación

Como se ha indicado anteriormente, las modificaciones epigenéticas pueden incluir la acetilación de histonas.

Un mecanismo adicional subyacente al silenciamiento génico implica la acetilación de histonas. La acetilación de las histonas está mediada por las histonas acetil transferasas, mientras que los grupos acetilo son eliminados por las histonas desacetilasas (HDAC).

Se muestra aquí que las células de linfoma aumentan aberrantemente la metilación (hipermetilación) y disminuyen la acetilación (hipoacetilación) para silenciar NMT2.

Existen varias clases estructuralmente distintas de inhibidores de HDAC que incluyen, pero no se limitan a, ácido valproico, valproatos, VPA; butiratos, NaB; vorinostat, SAHA; romidepsina, depsipéptido; belinostat, PXD101; tricostatina A, TSA; apicidina; etinostat, MS275; mocetinostat, MGCD0103; panobinostat, LBH589; givinostat, ITF2357; pracinostat, SB939; CHR--3996I; chidamida, CS055, HBI--8000; AR--42; quisinostat, JNJ--26481585; abexinostat, PCI--24782; resminostat, 4SC--201, RAS2410; CG200745; M344, ME--344; WJ25591; A248; NK--HDAC--1; MHY219; Ky--2; HDACi 4b; OBP--801, YM753; DWP0016; BRD8430; largazol; adamantina; serie del trifluorometiloxadiazol (TFMO), p. ej. TMP195; YK--4--272, compuesto 2 (véase Katrina J. Falkenberg1 y Ricky W. Johnstone (2014) NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY. Tomo 13.673- 691;y Andrew A. Lane y Bruce A. Chabner (2009) J Clin Oncol 27:5459-5468.).

Inhibidores de la histona acetil transferasa, inhibidores de la ADN desmetilasa y/o inhibidores de la histona desmetilasa.

Las histonas acetiltransferasas (HAT) son enzimas que acetilan aminoácidos de lisina conservados en proteínas histonas transfiriendo un grupo acetilo desde acetil CoA para formar e-N-acetil lisina. La acetilación de histonas suele estar vinculada a la activación transcripcional. Generalmente se asocian a la eucromatina. Las histonas acetiltransferasas (HAT) actúan como coactivadores transcripcionales. La acetilación de histonas desempeña un papel importante en la regulación de la estructura de la cromatina y está estrechamente regulada por dos clases de enzimas, las histonas acetiltransferasas (HAT) y las histonas desacetilasas (HDAC).

Ejemplos no limitantes de inhibidores HAT incluyen ácido anacárdico, CPTH2, MB-3, y Curcumina (Sigma-Aldrich). Las ADN metiltransferasas son una familia de enzimas que catalizan la transferencia del grupo metilo al ADN. Existen cinco ADN citosina-5-metiltransferasas (DNMT) relacionadas que transfieren un grupo metilo de la S-adenosilmetionina (AdoMet, SAM) a la posición C-5 de la citosina. Se ha demostrado que los inhibidores tienen actividad antiproliferativa.

Ejemplos no limitantes de Inhibidores de ADN Metiltransferasa incluyen 5-azacitidina, zebularina, ácido cafeico purum, ácido clorogénico, galato de (-)-epigalocatequina, hidralazina, clorhidrato de procainamida, clorhidrato de procaína, Psammaplin A, y RG108 (Sigma-Aldrich).

La desmetilación del ADN puede lograrse pasiva o activamente, mediante un proceso independiente de la replicación. Mientras que las metilaciones son realizadas por las Histonas Metil Transferasas (HMTs) usando el donante de metilo ubicuo S-adenosil-metionina, se ha demostrado que dos mecanismos de oxidación diferentes para las Histonas Desmetilasas (HDMs) conducen a la desmetilación. La lisina desmetilasa específica 1 (LSD1/KDM1) fue la primera HDM descubierta. La LSD1 oxida el grupo metil amonio de la lisina catalizando la transferencia global de hidrógeno del grupo metil amino al FAD generando un ion metiliminio. Otros HDM conocidos pertenecen a la familia de proteínas Jumonji, caracterizadas por contener el dominio JmjC

Ejemplos no limitantes de inhibidores de la histona desmetilasa incluyen Daminozida, GSK J1, GSK J2, GSK J4, GSK J5, GSK LSD 1 dihidrocloruro, IOX 1, JIB 04, RN 1 dihidrocloruro, TC-E 5002, Tranilcipromina hidrocloruro (Tocris - A Bio-Techne Brand).

En algunos ejemplos del presente documento, un sujeto con cáncer o sospechoso de tener cáncer se trata con un inhibidor de NMT, como PCLX-001, así como un inhibidor de histona acetil transferasa, un inhibidor de ADN desmetilasa, y/o un inhibidor de histona desmetilasa.

En algunos ejemplos del presente documento, un sujeto con un estado de metilación, que está hipermetilado, se trata con un inhibidor de NMT, tal como PCLX-001, así como un inhibidor de histona acetil transferasa, un inhibidor de ADN desmetilasa, y/o un inhibidor de histona desmetilasa.

Aunque no se desea estar limitado por la teoría, se cree que el inhibidor de histona acetil transferasa, el inhibidor de ADN desmetilasa, y/o el inhibidor de histona desmetilasa mantienen la cromatina en una forma condensada.

Los procedimientos de la invención se practican convenientemente proporcionando los reactivos, compuestos y/o composiciones utilizados en dicho procedimiento en forma de kit. Dicho kit contiene preferentemente la composición. Dicho kit contiene preferiblemente instrucciones para su uso.

Para comprender mejor la invención aquí descrita, se exponen los siguientes ejemplos. Sin embargo, se debe entender que estos ejemplos son solo para fines ilustrativos. Por lo tanto, no deben limitar en modo alguno el alcance de esta invención, cuyo alcance se define en las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS

En los siguientes ejemplos, se emplearon metodologías estándar, como sería apreciado por el trabajador experto.

Ejemplo 1

Niveles de expresión de NMT en la base de datos de 967 líneas celulares de cáncer (CCLE) y 8178 tumores primarios de The Cancer Genome Atlas (TCGA).

En la Figura 1, NMT2 muestra un intervalo muy grande de expresión de ARNm (log2 fluorescencia de microarray normalizada- 3-11) comparado conNMT1(log2 fluorescencia de microarray ~6-9) (Figura 1A). Los valores de expresión de NMT1(negro) yNMT2(gris) son recuentos normalizados RSEM transformados logarítmicamente en relación con TBP (TATA Binding Protein) (Figura 1B). La expresión de ARNm de NMT2de las líneas celulares de varios subtipos de cáncer se representa gráficamente y se compara con el gráfico de las 967 líneas celulares de cáncer (Figuras 1C-E). Se realizaron pruebas T de Student comparando cada grupo con todos los tumores. *** indica valores P < 0,001. La cuantificación absoluta de las copias de ARNmde NMT2(Panel F) se midió mediante PCR de gota digital en las líneas celulares de linfoma de Burkitt Ramos, y BL-2 y linfomas difusos de células B grandes DOHH-2, WSU-DLCL2 en comparación con la línea celular linfocítica B "normal" inmortalizada IM-9 (n=3). Actividad de miristoilación en varias líneas celulares de linfoma de Burkitt Ramos, y BL-2 y linfomas difusos de células B grandes DOHH-2, WSU-DLCL2 en comparación con la línea celular linfocítica B "normal" inmortalizada IM-9 (n=3) (Figura 1G). Expresión de NMT2en relación con la supervivencia libre de progresión en pacientes adultos con LDCBG (Figura 1H). Los gráficos de Kaplan-Meier muestran la SLP de los pacientes con CMDL (GSE31312, n=470) con alta (curva superior) frente a baja (curva inferior) expresión de NMT2 (Figura 1I). Los valores p se determinaron mediante la prueba de intervalos logarítmicos,

Un mecanismo prominente subyacente al silenciamiento génico implica la acetilación de histonas junto con la metilación del ADN, más prominentemente en las islas CpG. Los análisisin silicorevelaron una isla CpG en la región reguladora 5' deNMT2, mostrada en la Figura 2A. La secuenciación bisulfítica del ADN de líneas celulares de linfoma y de células B IM9 inmortalizadas confirmó que el locus NMT2 estaba metilado en las células de linfoma DOHH2 y WSU-DLCL2, pero no en las células BL2 e IM9 benignas (Figura 2B). Para validar el estado de metilación de las líneas celulares, utilizamos DAPK1 como control y descubrimos que sólo estaba altamente metilado en los linfocitos B malignos (Figura 2C)

Por lo tanto, se demuestra aquí que la expresión deNMT2se pierde comúnmente en los linfomas, y que este fenómeno se asocia con una enfermedad más agresiva.

La pérdida de expresión deNMT2en linfomas fue casi completa, sugiriendo silenciamiento epigenético deNMT2en este cáncer.

Para establecer un vínculo directo entre las modificaciones epigenéticas y la regulación de la expresión deNMT2en líneas celulares y tumores de linfoma humano, a continuación tratamos las células con inhibidores de la metilación del ADN y la desacetilación de histonas, deoxiazacitidina (DAC) y ácido hidroxámico suberoilanílido (SAHA), respectivamente. Cada uno de ellos produjo una recuperación dependiente del tiempo y de la concentración de los niveles de ARNm de NMT2 en las células de linfoma, y el tratamiento combinado con DAC y SAHA restauró los niveles de transcripción en las células Ramos, BL2, DOHH2 y WSU-DLCL2 a los de las células IM9 no transformadas (Figura 3A-D). Estos inhibidores actuaron de forma sinérgica cuando se añadieron juntos. El tratamiento de las células BL2 con la combinación de DAC y SAHA multiplicó por 6 la expresión de NMT2, con lo que los niveles de NMT2 se aproximaron a los observados en las células IM-9.

Se midió la cuantificación absoluta de las copias de ARNm de NMT2 en BL2 (Figura 3, panel A) e IM9 (Figura 3, panel B) después del tratamiento de 24 horas con una concentración creciente del agente de desmetilación (DAC) en presencia del inhibidor de la histona desacetilasa (SAHA) (n=3). WSU-DLCL2 se muestra en las figuras 3C y 3D. Cuantificación del nivel de proteína NMT2 en BL2 (Figura 3E) e IM9 (Figura 3F) (normalizado al nivel de GAPDH) después de 24 horas de tratamiento con concentraciones crecientes del agente de desmetilación (DAC) en presencia del inhibidor de la histona desacetilasa (SAHA). Representación gráfica de 3 experimentos independientes con 1 transferencia western representativo.

Usando datos extraídos de muestras de pacientes, encontramos una correlación inversa entre la expresiónNMT2(recuentos normalizados RSEM) y el estado de metilaciónNMT2(valor beta) (coeficiente spearman -0,4; p=0,0082) (Figura 3G).

En las células BL2, el aumento del ARNm de NMT2 tras el tratamiento combinado se asoció con un aumento de los niveles de proteína (Figura 3E-F). Sin embargo, en las células DOHH2, y WSU-DLCL2, no se detectó NMT2 mediante transferencia western a pesar de los aumentos significativos en los niveles de ARNm de NMT2 tras el tratamiento con DAC y/o SAHA. En las muestras de pacientes, la expresión de NMT2 se correlacionó inversamente con el estado de metilación de NMT2 (Figura 3G).

En conjunto, estos resultados sugirieron que las células de linfoma aumentan aberrantemente la metilación y disminuyen la acetilación para silenciarNMT2,y que esta pérdida de expresión se asocia con una enfermedad más agresiva.

Ejemplo 2

A continuación investigamos el potencial terapéutico de DDD86481in vivopara determinar si podía mitigar la progresión tumoral.

Probamos los efectos tumoricidas potenciales de la monoterapia con DDD86481 en dos modelos de xenoinjerto de ratón (CDX) derivados de líneas celulares de linfoma desarrollados mediante la inyección de 1 ×10<7>células BL-2 (BL) o DOHH-2 (DLBCL) por vía subcutánea en el flanco de ratones NODscid inmunocomprometidos. A los ratones portadores del tumor DOHH-2 (125-200 mm<3>) (n=10 por grupo) se les inyectó PCLX-001 por vía subcutánea en el flanco opuesto a dosis de 10, 20, 50 mg por kg (mpk) diarios (QD) o 50 mg por kg (QOD) diarios (cada dos días) o un control salino diario.

Observamos un efecto tumoricida dependiente de la dosis, que adquirió significación estadística (p<0,05) cuando PCLX-001 se administró a 20mpk o 50 mpk QOD.

En ratones portadores de tumores DOHH2 (125-200 mm<3>) (n = 10 ratones por grupo), PCLX-001 inyectado subcutáneamente en el flanco opuesto tuvo un efecto tumoricida significativo a 20 mg/kg diarios o 50 mg/kg en días alternos (p < 0,001) (Figura 4B). Cuando se inyectaba diariamente a 50 mg/kg, el PCLX-001 reducía los tumores en un 70 % (tamaño medio del tumor, 44,0±8,1 mm3 en el día 7). Sin embargo, esto se acompañó de cierta pérdida de peso, lo que obligó a interrumpir el tratamiento durante 5 días (no se muestra). Sin embargo, tras la reanudación del tratamiento, se observó una inhibición media del crecimiento tumoral (IGT) del 95 % en el día 16. Cabe destacar que el volumen tumoral se redujo en 6 de los 10 ratones entre los días 14 y 16, lo que indica que un periodo de tratamiento más largo podría haber resultado beneficioso.

De forma similar, en ratones portadores de BL2 CDXs, PCLX-001 a 20 mg/kg condujo a un 40 % de TGI en el día 9 (p < 0,05) (Figura 5A). El PCLX-001 administrado a 50 o 60 mg/kg durante 13 días consecutivos hizo desaparecer los tumores en 9 de 9 y 7 de 7 ratones, respectivamente. Se desconoce si los cuatro ratones que no sobrevivieron a las dosis diarias más altas murieron por toxicidad del fármaco o por síndrome de lisis tumoral. No obstante, algunos de los ratones murieron, y la dosis de 60 mg/kg diarios no produjo ningún beneficio aparente. Por lo tanto, la dosis máxima tolerada parece ser de 50 mg/kg.

Estos resultados sugieren que el DDD86481 puede reducir o eliminar los tumores de linfoma de células B deficientes en NMT2 in vivo.

PCLX-001 también redujo la actividad específica NMT total en tumores BL2 (p < 0,05) de manera dependiente de la concentración (Figura 5C). Estos resultados en dos modelos independientes de linfoma CDX confirman que PCLX-001 puede erradicar los linfomas de células B deficientes en NMT2 in vivo.

Dado que los CDX carecen de la complejidad de los tumores humanos, se desarrolló una estrategia para identificar a los pacientes con DLBCL deficientes en NMT2 mediante inmunohistoquímica o hibridación in situ de ARN (Figuras 5D y 5E). A continuación, diseccionamos y propagamos uno de estos tumores del paciente "DLCL3" para establecer un modelo de xenoinjerto derivado de paciente (PDX) de DLBCL en ratones NODscid. El volumen tumoral inicial medio fue de 240 mm<3>(Figura 5F).

Los regímenes de tratamiento se evaluaron en grupos de 8 ratones cada uno. A 20 mg/kg diarios durante 21 días, el PCLX-001 provocó un TGI del 60 % (p < 0,001). Con 50 mg/kg diarios durante dos periodos de 9 días separados por una suspensión del tratamiento de 3 días (para permitir que los ratones se recuperaran de la pérdida de peso corporal de casi el 15 %), el PCLX-001 hizo desaparecer los tumores en 6 de los 7 ratones supervivientes en el día 13; un ratón sin tumor detectable murió en el día 7 (Figura 5F). En los tumores PDX de control y tratados con PCLX-001 extirpados quirúrgicamente, confirmamos la reducción del tamaño tumoral dependiente de la concentración (Figura 5G). En el único tumor restante del tratamiento de 50 mg/kg, el PCLX-001 indujo eficazmente la apoptosis (Figura 5H) y redujo la proliferación celular (Figura 5I). Así, los linfomasdeficientes en NMT2pueden identificarse y tratarse en un modelo PDX de ratón. Además, la erradicación de los tumores PDX de DLBCL en 7 de 8 ratones sugiere que la pérdida de expresión deNMT2es un evento impulsor esencial en algunos casos de DLBCL.

Ejemplo 3 - Resultados del xenoinjerto de DLBCL

Siete grupos de ratones SCID hembra (n = 10/grupo) se dosificaron s.c. hasta su finalización de acuerdo con el protocolo DOHH-2-e225 de laTabla 2.

Tabla 2 Protocolo para ratones-DLBCL

La Figura 4Amuestra un gráfico de cajas y bigotes que muestra la distribución de los volúmenes tumorales de ratones individuales en cada grupo.

La Figura 4Bmuestra la mediana de crecimiento tumoral en monoterapia.

La Figura 4Cmuestra el crecimiento tumoral medio en combinación con la terapia.

Eficacia

Crecimiento tumoral en ratones de control (Grupo 1)

Los ratones del Grupo 1 recibieron vehículo en un esquema qd x 16 a partir del Día 1 y sirvieron como grupo de control para el cálculo del porcentaje de TGI y las comparaciones estadísticas. El día 16, la mediana del volumen tumoral (VTM) para el Grupo 1 era de 2213 mm<3>, con un intervalo de 1764 a 2944 mm<3>(Figura 4A).Los tumores se injertaron en los diez ratones de control.. La mediana de crecimiento tumoral para los controles del Grupo 1 fue progresiva desde el tamaño tumoral original 123,4 /- 6,1 mm<3>.

Respuesta al tratamiento con CCI-002 como monoterapia diaria (Grupos 2 y 4)

Los grupos 2 y 4 fueron tratados con CCI-002 a dosis activas de 10 mg/kg y 20 mg/kg, respectivamente, s.c. qd x 16 resultando en MTVs de Día 16 de 1895 y 922 mm<3>. Estos volúmenes tumorales medios (VTM) correspondieron a un IGT no significativo del 14 % para el Grupo 2 (P > 0,05) y a un IGT significativo del 58 % para el Grupo 4 (P < 0,001), lo que dejó a ambos grupos por debajo del umbral potencial de actividad terapéutica. Los tumores se injertaron en todos los ratones tratados.

Respuesta al tratamiento con CCI-002 y doxorrubicina (Grupo 3)

El Grupo 3 fue tratado con una combinación de CCI-002 a una dosis activa de 10 mg/kg s.c. qd x 16 y doxorrubicina i.v. qwk x 3, resultando en un Día 16 MTVs de 864 mm<3>. En el grupo 3 hubo un animal al que se le practicó la eutanasia el día 11 debido a una pérdida de peso excesiva. Ese animal fue muestreado según el protocolo y clasificado como muerte NTR y eliminado de todos los análisis. El grupo 3 tenía un MTV de 864 mm<3>correspondiente a un TGI significativo del 61 % (P < 0,001) que superaba el umbral de actividad terapéutica potencial (Figura 4A). La combinación del Grupo 3 fue significativamente más eficaz que la monoterapia con CCI-002 correspondiente (Grupo 3 frente a 2, P < 0,001), pero no el grupo tratado con doxorrubicina correspondiente (Grupo 3 frente a 7, P > 0,05). Los tumores se injertaron en todos los ratones tratados.

Respuesta al tratamiento con dosis ALTA de CCI-002 en monoterapia (Grupos 5 y 6)

Los grupos 5 y 6 fueron tratados con CCI-002 a una dosis activa de 50 mg/kg s.c. cada dos días qod x 8 o qd x 4/5 días de descanso/qd x 14, respectivamente, resultando en MTVs en el Día 16 de 1018 y 226 mm<3>. Estos MTV correspondieron a TGls significativos del 54 % para el Grupo 5 (P < 0,01) y del 90 % para el Grupo 6 (P < 0,001), con el Grupo 6 por encima del umbral potencial de actividad terapéutica (Figura 4A). Los tumores se injertaron en todos los ratones tratados.

Respuesta al tratamiento con doxorrubicina en monoterapia (Grupo 7)

El Grupo 7 fue tratado con doxorrubicina a 3 mg/kg i.v. qwk x 3 resultando en un Día 16 MTV de 1268 mm<3>correspondiente a un TGI significativo de 43 % (P < 0.05). Los tumores se injertaron en todos los ratones tratados.

Sumario

Este estudio evaluó la actividad del CCI-002 cuando se dosificó como monoterapia y en combinación con doxorrubicina. Los tumores se midieron tres veces por semana hasta el último día del estudio (día 23). El estudio se completó el día 16.

Todas las terapias, excepto el Grupo 2, fueron significativamente superiores al grupo de control tratado con vehículo (P < 0,05). El grupo tratado con CCI-002 a 50 mg/kg s.c. qd x 4/5 días de descanso/qd x 14 (Grupo 6) fue el régimen más eficaz en este estudio con un MTV de 226 mm<3>que correspondió a un TGI del 90 %. Las siguientes terapias más eficaces incluyeron el grupo de combinación de CCI-002 /doxorrubicina (Grupo 3), los grupos tratados con monoterapia con CCI-002 a 20 mg/kg y 50 mg/kg (Grupos 4 y 5) que presentaron valores respectivos de TGI del 61, 58 y 54 % en comparación con los animales tratados como control. No se registraron regresiones durante el estudio.

Todas las terapias probadas en este estudio DOHH-2 fueron toleradas aceptablemente.

Ejemplo 4 - Linfoma de Burkitt

Siete grupos de ratones hembra NOD SCID (n = 10/grupo) se dosificaron s.c. hasta su finalización de acuerdo con el protocolo DOHH-2-e225 de la Tabla 3 (abajo). El plan de tratamiento original para este estudio puede consultarse en la Tabla 3. La Figura 5 muestra el volumen tumoral medio (n=10 por grupo), desde el Día 0 (A. monoterapia y B terapia combinada con doxorrubicina).

Tabla 3-Protocolo ratón -BL-2

Además, para reducir la deshidratación, el primer día de la inyección se retiraron las botellas de agua y se suministró a los ratones una solución rehidratante hecha de NaCl: 4.5g/L (0,45 %final), Glucosa (Dextrosa): 25g/L (2,5 % final) y KCI: 0.75 g/L (0,075 % final).

Resultados

Crecimiento tumoral en ratones de control (Grupo 1)

Los ratones del Grupo 1 recibieron vehículo en un esquema qd x 9 a partir del Día 1 y sirvieron como grupo de control para el cálculo del porcentaje de TGI y las comparaciones estadísticas. El día 9, el volumen tumoral medio (VTA) del Grupo 1 era de 1492 mm<3>, con un intervalo de 685 a 2742 mm<3>. Los tumores se injertaron en los diez ratones de control. La mediana de crecimiento tumoral para los controles del Grupo 1 fue progresiva a partir de un volumen tumoral inicial de 255 mm<3>.

Respuesta al tratamiento con CCI-002 como monoterapia diaria (Grupos 2, 6 y 7)

Los grupos 2, 6 y 7 fueron tratados con CCI-002 a dosis activas de 20 mg/kg, 50 mg/kg y 60 mg/kg, respectivamente, s.c. qd x 16 resultando en MTVs de Día 9 de 918, 74 y 72 mm<3>. Estos volúmenes tumorales medios (VTA) correspondieron a una inhibición relativa significativa del crecimiento tumoral del 38 % para el Grupo 2 (P <###) y a una inhibición relativa altamente significativa del crecimiento tumoral del 95 % para los Grupos 6 y 7 (P < 0,001), lo que dejó a ambos grupos 6 y 7 en el umbral de actividad terapéutica potencial (TGI > 60 %) (Figura 4A). Los tumores se injertaron en todos los ratones tratados. El crecimiento tumoral medio en estos grupos se ilustra en la Figura 4A. La mediana del volumen tumoral alcanzó 0 mm<3>en el día 13 del estudio, por lo que los tratamientos de los grupos 6 y 7 demuestran que CCI-002 provoca una regresión tumoral del 100 %.

Respuesta al tratamiento con doxorrubicina en monoterapia (Grupo 3)

El Grupo 3 fue tratado con doxorrubicina a 4 mg/kg i.v. qwk x 3 resultando en un Día 9 MTV de 1061 mm<3>correspondiente a un TGI significativo de 29 % (P < 0.05). Los tumores se injertaron en todos los ratones tratados. La mediana de crecimiento tumoral en estos grupos se ilustra en la Figura 4A.

Respuesta al tratamiento con la terapia combinada de CCI-002 y doxorrubicina (Grupos 4 y 5)

El grupo 4 fue tratado con una combinación de CCI-002 a una dosis activa de 10 mg/kg s.c. qd x 16 y doxorrubicina i.v. qwk x 3, resultando en un día 9 un volumen tumoral medio (VTA) de 952 mm<3>correspondiente a un TGI significativo del 36 % (P < 0.001)

La combinación del Grupo 4 no fue significativamente más eficaz que la monoterapia con doxorrubicina correspondiente (Grupo 4 frente a 3, P<>0,05##). El grupo 5 se trató con una combinación de CCI-002 a una dosis activa de 20 mg/kg c.s. c.d. x 16 y doxorrubicina i.v. c.s.d. x 3, lo que dio lugar a un volumen tumoral medio (VTA) en el día 9 de 471 mm<3>correspondiente a un TGI significativo del 68 % (P < 0,001) La combinación del grupo 5 fue significativamente más eficaz que la monoterapia con doxorrubicina correspondiente (grupo 5 frente a 3, P <0,05##). Los tumores se injertaron en todos los ratones tratados. El crecimiento tumoral medio en estos grupos (n=10 ratones/grupo) se ilustra en la Figura 5.

Figura 5A. Volumen tumoral medio del grupo (n=10/grupo) durante la duración del tratamiento de ratones NOD SCID inyectados con células BL-2 (tamaño tumoral medio inicial 125 mm<3>). A. CCI-002 en monoterapia y B terapia combinada de CCI-002 con doxorrubicina.

Sumario de Resultados

En general, el artículo de prueba CCI-002 en los grupos de tratamiento de 20 mg/kg, 50 mg/kg y 60 mg/kg produjo actividades antitumorales significativas en el tratamiento del modelo de xenoinjerto subcutáneo de linfoma de Burkitt BL-2 subcutáneo.

El artículo de prueba CCI-002 mostró un efecto dosis-respuesta evidente como monoterapia. Cuando se combinó con doxorrubicina, se observó un efecto sinérgico de las actividades antitumorales a 10 y 20 mg/kg de CCI-002.

En las dosis altas de CCI-002 (50 y 60 mpk), el tratamiento se suspendió durante varios periodos de tiempo para permitir la recuperación de la pérdida de peso corporal y se recuperó el peso corporal "normal".

En cuanto al perfil de seguridad, el artículo de prueba CCI-002 a 20 mg/kg mostró un buen perfil de seguridad. Sin embargo, se observó una grave pérdida de peso corporal (10-30 %) en los animales tratados con CCI-002 a 50 y 60 mg/kg, doxorrubicina 4 mg/kg o en tratamiento combinado. Se observó diarrea en algunos ratones de los grupos 4, 5, 6 y 7. Es importante destacar que, tras la suspensión para el tratamiento de dosificación y rehidratación (concentración final: NaCl 2.5 g/L, Glucosa: 30 g/L) durante dos días en las condiciones de los animales, incluidas la diarrea y la pérdida de peso corporal superior al 15 %, mejoraron por encima del umbral del 15 %.

Materiales y procedimientos

Cultivo celular

Las células L0, IM9, Ramos, BL2, Daudi, KMH2, Jurkat y CEM se adquirieron a la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.) y se mantuvieron en medio RPMI suplementado con 10 % FBS, 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 1 mM de piruvato sódico y 2mM de L-Glutamina. Todas las células utilizadas se mantuvieron a 37°C y 5 % de CO2 en un incubador humidificado.

Lisis celular

Las células se lavaron en PBS frío, se cosecharon, se lisaron en tampón SDS-RIPA al 0,1 % [50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 % Igepal CA-630, 0,5 % NaDC, 2 mM MgCl2, 2 mM EDTA con 1x inhibidor completo de proteasas (Roche Diagnostics)] agitando durante 15 min a 4oC. A continuación, los lisados celulares se centrifugaron a 16.000 g durante 10 min a 4oC y se recogió el sobrenadante postnuclear.

Viabilidad de las células tratadas con inhibidores de NMT

2 ×10<6>células CEM (leucemia de células T), L0 (células B "normales"), BL2 y Ramos] se cultivaron en placas de 6 pocillos y se incubaron con cantidades crecientes (0, 1, 2 y 5 µg/ml) de Tris-DBA (25) durante 24 horas. Tris-DBA fue un amable obsequio del Dr. Jack Arbiser (Emory University, GA, EE.UU.). se colocaron 1 ×10<5>células [KMH2 (linfoma de Hodgkins), IM9 (célula B "normal"), BL2, Ramos] en placas de 96 pocillos y se trataron con cantidades crecientes de DDD85646, DDD73228 y DDD86481 durante 24, 48 y 72 horas. DDD85646, DDD73228 y DDD86481 fueron amables obsequios de los Dres. David Gray y Paul Wyatt en la Universidad de Dundee, Escocia, Reino Unido.Medición de la viabilidad celular

La viabilidad de las células tratadas con Tris-DBA, DDD73228 y DDD85646 se midió incubando las células tratadas con Tris-DBA utilizando TC10TM Trypan Blue Dye (Biorad, Hercules, CA, USA) según las instrucciones del fabricante. A continuación se cuantificó la viabilidad celular utilizando el contador celular automatizado TC10TM (Biorad). La viabilidad de las células tratadas con DDD86481 se midió con el ensayo de proliferación celular CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive (MTS) de Promega (Madison, Wl, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.

qRT-PCR de líneas celulares de linfoma de células B

Se aisló el ARN de las células IM9, KMH2, Ramos y BL2 utilizando el reactivo TRIzol<®>según los protocolos del fabricante. A continuación, se utilizó el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad con un esquema de cebadores aleatorios de Applied Biosciences para sintetizar ADNc a partir del ARN aislado siguiendo las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT PCR) se prepararon utilizando la mezcla maestra TaqMan<®>Universal Master Mix II y sondas NMT1, NMT2 y 18 Taqman<®>adquiridas a Life Technologies (Carlsbad, CA) y se prepararon tres réplicas de cada reacción de acuerdo con las directrices del proveedor. La PCR qRT se realizó utilizando un termociclador Mastercycler<®>ep realplex (Eppendorf) y los resultados se analizaron utilizando el software Realplex (Eppendorf).

Tratamiento de las células con SAHA

Se sembraron células IM9, BL2 y Ramos a 3x106 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se trataron con 1 □M de ácido hidroxámico de suberoilanilida (SAHA) durante 24 horas. Se añadió la misma cantidad de DMSO a las muestras de control. Las células se lisaron y se sometieron a SDS-PAGE. Se realizó transferencia Western con anticuerpos contra NMT1, NMT2, p21/WAF-1 y GAPDH.

Secuenciación bisulfítica

El ADN de la cromatina se aisló de las células utilizando el kit QlAamp DNA and Blood Mini de Qiagen. El ADN (20 µl; concentración, de 1 ng a 2 µg/µl) se transformó con el kit EpiTech Bisulfite (Qiagen) y se amplificó con cebadores específicos de bisulfito (Tabla 4).

Tabla 4. Cebadores utilizados para la secuenciación por bisulfito.

Los productos de PCR amplificados se limpiaron con el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) y se clonaron con el kit de clonación TA (Life Technologies) y el vector pC 2.1. Las secuencias se analizaron con QUMA.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta Memoria descriptiva son indicativas del nivel de destreza de los expertos en la materia a la que pertenece esta invención.

Las realizaciones descritas anteriormente son sólo ejemplos. Los expertos en la materia pueden introducir alteraciones, modificaciones y variaciones en las realizaciones concretas. El alcance de las reivindicaciones no debe estar limitado por las formas de realización particulares aquí expuestas, sino que debe interpretarse de manera coherente con la memoria descriptiva en su conjunto.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento que comprende:

a) Poner en contacto una muestra obtenida de un sujeto que tiene linfoma, o sospechoso de tener linfoma, con un reactivo para formar un producto, opcionalmente en forma de complejo, indicativo del estado de metilación del genNMT2presente en la muestra;

b) medir el producto formado para determinar un estado de metilación del genNMT2en la muestra; y c) determinar el beneficio del tratamiento con inhibidores de NMT de dicho linfoma en dicho sujeto, donde la determinación del beneficio del tratamiento con inhibidores de NMT se determina por la hipermetilación del genNMT2en dicha muestra,

donde la determinación del estado de metilación comprende:

i) realizar modificación con bisulfito a un ácido nucleico obtenido a partir de dicha muestra,

ii) determinar la metilación del promotor del gen NMT2 utilizando cebadores de PCR y/o sondas específicas para la región promotora del gen NMT2 del paso a), opcionalmente en ek que el nivel de metilación de la región promotora se determina en comparación con un control.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que en el paso a) dicho regente comprende cebadores para detectar hipermetilación en el genNMT2.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el paso ii) se realiza mediante un procedimiento seleccionado entre PCR, PCR específica de metilación, PCR específica de metilación cuantitativa (QMSP), PCR específica de metilación en tiempo real, ensayo PCR utilizando una proteína de unión específica de ADN de metilación, PCR cuantitativa, ensayo basado en chip de ADN, pirosecuenciación o secuenciación bisulfítica, el ácido nucleico modificado con bisulfito del paso i).

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la detección de la hipermetilación del gen NMT2 se realiza con cebadores que comprenden SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho sujetoes un ser humano.

6. Un inhibidor de NMT para su uso en el tratamiento de un sujeto con un cáncer en el que se determina que el genNMT2en una muestra de dicho sujeto está hipermetilado, en el que el uso comprende además el uso de un inhibidor de histona acetil transferasa, un inhibidor de ADN desmetilasa, y/o un inhibidor de histona desmetilasa, y en el que el estado de metilación se determina mediante un procedimiento que comprende:

a) poner en contacto una muestra obtenida del sujeto con un reactivo para formar un producto, opcionalmente en forma de complejo, indicativo del estado de metilación del genNMT2presente en la muestra;

b) medir el producto formado para determinar el estado de metilación del genNMT2en la muestra; donde la determinación del estado de metilación comprende:

i) realizar modificación con bisulfito a un ácido nucleico obtenido a partir de dicha muestra,

ii) determinar la metilación del promotor del gen NMT2 utilizando cebadores de PCR y/o sondas específicas para la región promotora del gen NMT2 del paso a), opcionalmente en ek que el nivel de metilación de la región promotora se determina en comparación con un control.

7. El inhibidor de NMT para uso según la reivindicación 6, en el que el procedimiento para determinar el estado de metilación es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

8. El inhibidor de NMT para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en el que:

(i) dicho inhibidor de NMT comprende una molécula pequeña, un anticuerpo, un fragmento peptídico, un ácido nucleico, o combinaciones de los mismos; y/o

(ii) dicho cáncer es un linfoma, un linfoma de células B, un linfoma folicular, un linfoma difuso de células B grandes, un linfoma de células del manto, un linfoma B-CLL/SLL, un inmunocitoma/Waldenstrom, un linfoma de células B 20 de tipo MALT/monocitoide, un linfoma de Burkitt, un linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de células grandes, Leucemia mieloide aguda, Leucemia mieloide crónica en fase blástica, Linfoma de Burkitt, Mieloma de células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma adenoescamoso mixto de pulmón, Carcinoma de células pequeñas de pulmón, Pulmón, Carcinoma de células escamosas de esófago, Hueso, Carcinoma Ductal de Mama, Adenocarcinoma Difuso de Estómago, Carcinoma Medular de Tiroides, Carcinoma de Células de Transición del Tracto Urinario, Mieloma, Carcinoma de Células claras de Ovario, Carcinoma de Células de Transición (uréter y cáncer de vejiga), Leucemia Mielógena Crónica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma de mama, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de ovario, carcinoma de pulmón no microcítico, osteosarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma de endometrio, carcinoma escamoso de esófago; y/o

(iii) dicho sujeto es un ser humano.

9. El inhibidor de NMT para uso según la reivindicación 8, en el que:

(i) dicha molécula pequeña comprende DDD85646, DDD86481 o un derivado de los mismos;

(ii) dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal; o

(iii) dicho ácido nucleico comprende una molécula de dsARN, una molécula de ARNi, una molécula de miARN, una ribozima, una molécula de ARNhc o una molécula de ARNsi.

10. El inhibidor de NMT para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que:

(i) dicho inhibidor de la histona acetil transferasa es ácido anacárdico, CPTH2, MB-3, y/o Curcumina; o (ii) dicho inhibidor de la histona desmetilasa es Daminozida, GSK J1, GSK J2, GSK J4, GSK J5, GSK LSD 1 dihidrocloruro, IOX 1, JIB 04, RN 1 dihidrocloruro, TC-E 5002, y/o Tranilcipromina hidrocloruro.

11. El inhibidor de NMT para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en el que:

(i) cuando dicho cáncer es un linfoma, el uso comprende además el uso de un tratamiento seleccionado entre CHOP (es decir, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona), GAP-BOP (es decir, ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina y prednisona), m-BACOD (es decir, metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona y leucovorina), ProMACE-MOPP (es decir, prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina con MOPP estándar), ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexato y leucovorina), y MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina y leucovorina), IMVP-16 (i.e., ifosfamida, metotrexato y etopósido), MIME (metilgag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), DHAP (dexametasona, altas dosis de citarabina y cisplatino), ESHAP (etopósido, metilpéptido y cisplatino), etopósido, metilprednisona, citarabina a dosis altas y cisplatino), CEFF(B) (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona y bleomicina) o CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina y prednisona);

(ii) cuando dicho cáncer es la enfermedad de Hodgkin, el uso comprende además el uso de un tratamiento seleccionado entre VABCD (es decir, vinblastina, doxorrubicina, dacarbazina, lomustina y bleomicina), ABDIC (es decir, doxorrubicina, bleomicina, dacarbazina, lomustina y prednisona), CBVD (es decir, lomustina, bleomicina, vinblastina, dexametasona), PCVP (es decir, vinblastina, procarbazina, ciclofosfamida y prednisona), CEP (es decir, lomustina, etopósido y prednimustina), EVA (es decir, etopósido, vinblastina y doxorrubicina), MOPLACE (es decir, ciclofosfamida, etopósido, prednisona, metotrexato, citaravina y vincristina), MIME (es decir, metil-gag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), MINE (es decir, mitocuazona, ifosfamida, vinorelbina y etopósido), MTX-CHOP (es decir, metotrexato y CHOP), CEM (es decir, lomustina, etopósido y metotrexato), CEVD (es decir, lomustina, etopósido, vindesina y dexametasona), CAVP (es decir, lomustina, melfalán, etopósido y prednisona), EVAP (es decir, etopósido, vinblastina, citarabina y cisplatino) y EPOCH (es decir, etopósido, vincristina, doxorrubicina, ciclofosfamida y prednisona);

(iii) cuando dicho cáncer es cáncer de mama, el uso comprende además el uso de un tratamiento seleccionado entre paclitaxel, docetaxel, paclitaxel unido a nanopartículas de albúmina, capecitabina, doxorrubicina, eribulina, vinorelbina, trastuzumab, carboplatino, cisplatino; terapias endocrinas, como tamoxifeno, anastrozol, letrozol, exemestano, fulvestrant, e inhibidores del ciclo celular, como palbocilib, ribociclib, LEE001 y everolimus; fármacos inhibidores del punto de control inmunitario, como nivolumab y pembrolizumab, individualmente o en combinación;

(iv) cuando dicho cáncer es cáncer de pulmón de células pequeñas, el uso comprende además el uso de un tratamiento seleccionado entre carboplatino, cisplatino, etopósido, irinotecán, ya sea individualmente o en combinación;

(v) cuando dicho cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas, el uso comprende además el uso de un tratamiento seleccionado entre carboplatino, paclitaxel, docetaxel, gefitinib, erlotinib, afatinib, bevacizumab, ramucirumab, osimertinib, necitumumab, crizotinib, ceritinib, alectinib, y fármacos inhibidores de puntos de control inmunitario, incluidos nivolumab, pembrolizumab, ya sea individualmente o en combinación; o

(vi) cuando dicho cáncer es carcinoma de vejiga, el uso comprende además el uso de un tratamiento seleccionado entre metotrexato, vincblastina, doxorrubicina, cisplatino; carboplatino y paclitaxel; docetaxel, gemcitabina y cisplatino, ya sea individualmente o en combinación.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el inhibidor de NMT para uso según cualquiera de las reivindicaciones 6-11, en el que dicha muestra comprende un tejido, un espécimen celular o fluidos incluye células tumorales desprendidas y/o ácidos nucleicos libres, una muestra de sangre, una muestra de sangre fraccionada, una muestra de médula ósea, una muestra de biopsia, una muestra de tejido congelado, un espécimen de tejido fresco, una muestra celular y/o una sección embebida en parafina.