ES2964747T3

ES2964747T3 - Microscopio

Info

Publication number: ES2964747T3
Application number: ES14778778T
Authority: ES
Inventors: Yuichi Taniguchi; Kazuya Nishimura
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 2013-04-05
Filing date: 2014-04-03
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2034-04-03
Also published as: US20180120551A1; JP6086366B2; EP3657229A3; US10712547B2; US9880378B2; US10222601B2; JP2014202967A; US20190162943A1; US20160139394A1; EP2983029A1; EP3657229A2; DE202014011312U1; EP2983029A4; WO2014163159A1; DE202014011332U1; EP2983029B1

Abstract

La presente invención proporciona un microscopio y un método para utilizar el microscopio. El microscopio incluye una parte de colocación de muestras (10) que tiene una superficie de colocación (11) para colocar una muestra (12) y una superficie inferior (13) opuesta a la superficie de colocación, una lente de observación (31) y una unidad óptica. (20) para generar lámina de luz. En el microscopio según la presente invención, la lámina de luz que pasa a través de la parte de colocación de la muestra desde la superficie inferior irradia la muestra, y la luz fluorescente de la muestra pasa a través de la parte de colocación de la muestra hacia la superficie inferior y es recibida por la lente de observación. . De este modo, la presente invención permite observar la muestra sin restricción en el tamaño de la muestra mientras se aprovechan los beneficios de un microscopio SPIM convencional. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Microscopio

Campo técnico

La presente invención se refiere a un microscopio.

Técnica antecedente

Se conoce un microscopio que irradia localmente un plano de observación de una muestra con luz y que recibe fluorescencia irradiada de la muestra. El microscopio, con tal disposición, permite la observación de planos seccionados de una muestra. Tal microscopio, que es capaz de evitar que la luz ilumine esa porción de una muestra que no es un plano de observación, puede reducir el fondo durante la observación de la muestra y también puede reducir, por ejemplo, la acción dañina para una muestra o la atenuación de la fluorescencia que son causadas por la irradiación de la muestra con luz de excitación.

Las Literaturas de patente 1 y 2 y la Literatura no relacionada con patentes 1 describen cada una microscopía de lámina óptica altamente inclinada y laminada para un microscopio óptico, con cuya técnica la luz de iluminación se refracta con el uso de una lente objetivo para irradiar una muestra en una dirección oblicua con respecto al eje óptico de la lente objetivo. La Fig. 18 muestra vistas ampliadas de parte de un microscopio óptico que utiliza la microscopía de lámina óptica laminada altamente inclinada de la Literatura de patente 1. En un caso en el que un microscopio óptico está dispuesto de tal manera que la luz de iluminación entra en una muestra en una dirección tan inclinada como para estar cerca de la perpendicular al eje óptico de la lente objetivo como se ilustra en la Fig. 18, el microscopio óptico puede irradiar una muestra con una luz en forma de capa delgada que tiene un pequeño espesor a lo largo de la dirección del eje óptico de la lente objetivo. De acuerdo con la Literatura de patente 1, el microscopio óptico es capaz de capturar continuamente una imagen de una muestra mientras mueve la posición focal de la lente objetivo para producir una imagen tridimensional a una alta resolución. La Literatura de patente 1 describe en particular que el microscopio óptico es capaz de formar imágenes a nivel de molécula única.

La técnica descrita en la Literatura de patente 1 puede servir para ajustar la posición en una lente objetivo en la que la luz de iluminación de posición entra en la lente objetivo, de modo que el ángulo 0 entre los ejes ópticos de la luz de iluminación refractada y la lente objetivo esté cerca de 90 grados. La técnica, sin embargo, no permite que el ángulo 0 sea exactamente de 90 grados. Por lo tanto, el eje óptico de la luz de iluminación no es paralelo al plano de observación de la lente del objetivo. Esta disposición da como resultado que una imagen esté desenfocada de forma no uniforme en diversos grados sobre el plano de observación, por lo que la imagen tiene una uniformidad de calidad disminuida. Además, la disposición anterior permite que la luz de iluminación ilumine una región de una muestra cuya región es distinta del plano de observación y, por lo tanto, aumenta el fondo, con el resultado de que una imagen de fluorescencia tiene una resolución disminuida. En particular, en el caso de producir una imagen tridimensional, tal imagen tendrá una baja resolución a lo largo de la dirección paralela al eje óptico de la lente objetivo.

La Literatura no relacionada con patentes 2 describe SPIM (microscopio de iluminación de plano selectivo), que irradia una muestra con una luz de hoja en forma de capa delgada, recoge la fluorescencia irradiada con el uso de una lente objetivo que tiene un eje óptico perpendicular al eje óptico de la luz de hoja, y forma una imagen de la fluorescencia recogida con el uso de una cámara. En caso de observar una muestra con el uso del SPIM de la Literatura no relacionada con patentes 2, el SPIM gira el gel de agarosa en el que está incorporada la muestra y, por lo tanto, irradia la muestra con luz de hoja desde varios ángulos, y captura una imagen de la muestra con el uso de una cámara. La Fig. 19 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una parte del microscopio de la Literatura no relacionada con patentes 2 en la que se coloca una muestra. La Literatura de patente 3 describe que en un caso de recolección de luz con el uso de una lente de iluminación e irradiación de una muestra con la luz recolectada en forma de luz de hoja en forma de capa, la luz de hoja tiene un espesor a lo largo de la dirección paralela al eje óptico de la lente objetivo, cuyo espesor depende de la apertura numérica de la lente de iluminación. Esta descripción indica que en un SPIM, aumentar la apertura numérica de la lente de iluminación puede reducir el espesor de la luz de hoja y, por lo tanto, puede reducir el fondo.

Las Literaturas de patente 4 a 6 describen cada una de manera similar un microscopio que recolecta fluorescencia de una muestra con el uso de una lente objetivo que tiene un eje óptico perpendicular al eje óptico de la luz de hoja y que, por lo tanto, produce una imagen tridimensional de la muestra. La Literatura de patente 7 describe un microscopio que comprende una parte de colocación de muestra, una lente de observación y una unidad de iluminación óptica adecuada para generar luz de hoja.

En el caso de irradiar una muestra con luz de hoja en la dirección perpendicular al eje óptico de una lente objetivo como con los microscopios descritos en las Literaturas de patente 3 a 6 y la Literatura no relacionada con patentes 2, es posible reducir el fondo y, como resultado, obtener una alta resolución.

Lista de citas

Literatura de patente 1

Publicación de solicitud de patente japonesa, Tokukai, No. 2003-185930 A (fecha de publicación: 3 de julio de 2003) Literatura de patente 2

Publicación de solicitud de patente japonesa, Tokukai, No. 2005-3909 A (fecha de publicación: 6 de enero de 2005) Literatura de patente 3

Traducción Japonesa de la Solicitud Internacional PCT, Tokuhyo, No. 2006 -509246 (fecha de publicación: 16 de marzo de 2006)

Literatura de patente 4

Publicación de solicitud de patente japonesa, Tokukai, No. 2012-93757 A (fecha de publicación: 17 de mayo de 2012) Literatura de patente 5

Publicación de solicitud de patente japonesa, Tokukai, No. 2012-108491 A (fecha de publicación: 7 de junio de 201 ) Literatura de patentes 6

Publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US2011/0304723 (fecha de publicación: 15 de diciembre de 2011) Literatura de patente 7

Publicación de patente internacional WO 2007/124437 A1 (fecha de publicación: 1 de noviembre de 2007)

Literatura no relacionada con patentes 1

M. Tokunagaet al.,Nature Methods, 5, págs. 159-161, 2008

Literatura no relacionada con patentes 2

Jan Huiskenet al.,SCIENCE 2004 VOL305, pág. 1007-1009, 2004

Compendio de la invención

Problema técnico

El SPIM existente permite la observación de una muestra (por ejemplo, una célula cultivada) incorporada en gel de agarosa como con el SPIM de la Literatura no relacionada con patentes 2 ilustrada en la Fig. 19. Por lo tanto, es difícil observar una muestra tal como una célula en una solución de cultivo cultivada en una placa de Petri mientras se cultiva la muestra. Esto significa que los SPIM convencionales solo tienen aplicaciones de medición limitadas. Además, dado que una célula cultivada incorporada en gel puede comportarse de manera diferente a cuando la célula está en un medio de cultivo, los SPIM convencionales no son adecuados para la observación continua de una célula viva. Además, los SPIM convencionales, que requieren que una muestra se incorpore en un gel que tiene un volumen predeterminado, están problemáticamente limitados en términos del tamaño de una muestra.

En vista de eso, los inventores de la presente invención han estudiado la posibilidad de no incorporar una muestra en gel y observar la muestra colocada en un cubreobjetos plano, de manera similar a una muestra biológica para la observación normal del microscopio, con el uso de una configuración SPIM. En este caso, una lente de objetivo de detección puede orientarse perpendicularmente a la superficie del cubreobjetos para que una imagen de fluorescencia no se vea influenciada por la aberración que se produce cuando la fluorescencia pasa a través del cubreobjetos.

Sin embargo, la luz de hoja es ancha a lo largo de la dirección paralela al eje óptico de la lente del objetivo. Por lo tanto, en un caso en el que la luz irradia una región cerca del cubreobjetos, una porción de tal luz pasa a través de las caras superior e inferior y las caras extremas del cubreobjetos. Por lo tanto, los haces de luz individuales se desplazan en trayectorias ópticas diferentes entre sí debido a la refracción, reflexión y/o similares, de modo que la iluminación de la lámina ha disminuido la calidad. Por lo tanto, la luz de hoja que irradia una muestra tiene un mayor espesor, con el resultado de que no se utilizan suficientemente las ventajas de un SPIM.

La presente invención se ha logrado en vista del problema anterior. Es un objeto de la presente invención proporcionar un microscopio que tenga alta resolución, cuyo microscopio pueda utilizar las ventajas de un SPIM, permita la observación de una muestra, cuya observación esté libre de una restricción del tamaño de una muestra, y permita la observación de, por ejemplo, una célula en una solución de cultivo o una muestra en un cubreobjetos y un miembro incluido en el microscopio.

Solución al problema

La invención se define en la reivindicación 1. Con el fin de resolver el problema anterior, un microscopio de la presente invención es un microscopio, que incluye: una parte de colocación de muestra que tiene una superficie de colocación sobre la cual colocar una muestra y una cara inferior opuesta a la superficie de colocación; una lente de observación para recibir fluorescencia de la muestra; y una unidad óptica para generar luz de hoja que se desplaza en una dirección paralela a un plano de observación de la lente de observación, la luz de hoja que entra en la parte de colocación de muestra desde la cara inferior y que pasa a través de la parte de colocación de muestra para irradiar la muestra, la fluorescencia que pasa a través de la parte de colocación de muestra hacia la cara inferior para ser recibida por la lente de observación.

La disposición anterior permite llevar a cabo una observación sin la necesidad de incorporar una muestra en la parte de colocación de muestras en gel y en un estado en el que se utilizan las ventajas de un SPIM. Además, dado que la disposición anterior permite que la lente de observación se disponga de manera opuesta a una muestra con respecto a la parte de colocación de muestra, el tamaño de una muestra colocada en la parte de colocación de muestra no se limita a un tamaño dentro del intervalo de la distancia de trabajo de la lente de observación.

En el caso de que se vaya a realizar una observación SPIM con una lente objetivo colocada en un eje perpendicular a una superficie de la parte de colocación de la muestra, la luz de hoja interferirá con la parte de colocación de la muestra, con el resultado de una disminución en la calidad de la iluminación de la lámina. Por el contrario, el microscopio de la presente invención, que permite que toda la luz ingrese al plano de observación desde la cara inferior de la parte de colocación de la muestra, permite controlar con éxito el espesor de la luz de hoja incluso en el caso de que se observe una muestra cerca de la parte de colocación de la muestra.

El microscopio de la presente invención puede incluir además: un mecanismo de enfoque para ajustar una relación posicional relativa entre la lente de observación y la muestra, en donde el mecanismo de enfoque cambia la relación posicional a lo largo de una primera dirección, que es paralela a un eje óptico de la lente de observación, y una segunda dirección y una tercera dirección, que definen la superficie de colocación.

Con la disposición anterior, ajustar la relación posicional relativa entre la lente de observación y la parte de colocación de la muestra a lo largo de la segunda dirección y la tercera dirección puede cambiar el campo de visión observado sin cambiar la distancia entre la parte de colocación de la muestra y la lente de observación. La disposición anterior también puede evitar el contacto innecesario entre la parte de colocación de la muestra y la lente de observación mientras el microscopio cambia el campo de visión observado. Al mismo tiempo, ajustar la relación posicional relativa entre la lente de observación y la parte de colocación de la muestra a lo largo de la primera dirección puede lograr el enfoque sin cambiar el campo de visión observado. Por lo tanto, la disposición anterior hace posible capturar imágenes de una muestra seccionada en una pluralidad de planos de observación perpendiculares a la primera dirección para producir una imagen tridimensional de la muestra a una alta resolución.

El microscopio de la presente invención incluye además un dispositivo de retención de fluido para retener fluido entre la lente de observación y la parte de colocación de muestra, en donde el dispositivo de retención de fluido incluye una sección de conexión para la conexión a la lente de observación; una cara del extremo diseñada para orientarse hacia la cara inferior; una ventana de transmisión a través de la cual la luz de hoja entra en la parte de colocación de muestra; y una sección de retención de fluido para retener fluido dentro de sí misma; y en un estado en el que el dispositivo de retención de fluido está conectado a la lente de observación, la cara del extremo es sustancialmente paralela a la cara inferior, la luz de hoja pasa a través de la ventana de transmisión y luego a través de la sección de retención de fluido para irradiar la muestra, y la fluorescencia pasa a través de la sección de retención de fluido para ser recibida por la lente de observación.

Para la medición a una resolución más alta y una sensibilidad más alta, el microscopio de la presente invención puede disponerse preferentemente de manera que la lente de observación sea una lente de inmersión; y la sección de retención de fluido se llena con un líquido correspondiente a la lente de inmersión.

En el caso de que se utilice una lente de inmersión como lente de observación, debe estar presente un líquido correspondiente a la lente de inmersión entre la cara inferior de la parte de colocación de la muestra y la lente. El microscopio de la presente invención está dispuesto de tal manera que la cara inferior de la parte de colocación de la muestra no es perpendicular al eje óptico de la lente de observación. Por lo tanto, puede no ser fácil mantener el líquido correspondiente a la lente de inmersión entre la cara inferior y la lente sin mover (o cambiar la forma de) el líquido al cambiar la relación posicional relativa entre la lente de observación y la parte de colocación de la muestra. Sin embargo, con la disposición anterior, el dispositivo de retención de fluido puede retener el líquido entre la lente de observación y la parte de colocación de la muestra en un estado en el que se mantiene la forma de la superficie del líquido.

El microscopio de la presente invención puede disponerse preferentemente de manera que la sección de retención de fluido se llene de agua; y la parte de colocación de muestra tiene un índice de refracción de 1,28 a 1,38.

El microscopio está dispuesto de tal manera que la lente de observación tiene un eje óptico no ortogonal a la superficie de colocación. En tal caso, surgirá una aberración asimétrica izquierda-derecha según la diferencia entre el índice de refracción del líquido que llena la sección de retención de fluido y el índice de refracción de la parte de colocación de la muestra. Sin embargo, en un caso en el que la sección de retención de fluido está llena de agua, y la parte de colocación de la muestra tiene un índice de refracción de 1,28 a 1,38, que es equivalente al índice de refracción del agua, es posible reducir significativamente la aberración y formar una imagen estable.

El microscopio de la presente invención puede disponerse preferentemente de manera que el plano de observación y la superficie de colocación formen un ángulo dentro de un intervalo de 1 grado a 75 grados.

El ángulo entre el plano de observación, que es paralelo a la dirección de desplazamiento de la luz de la hoja, y la superficie de colocación debe permitir la generación de luz de la hoja que tenga una delgadez suficiente. Por lo tanto, el ángulo entre el plano de observación y la superficie de colocación se ajusta preferentemente de modo que se encuentre dentro del rango de 1 grado a 75 grados en correspondencia con el propósito de la medición.

El microscopio de la presente invención puede disponerse preferentemente de modo que la unidad óptica incluya una placa de superficie óptica que tenga una superficie en la que se dispongan uno o más elementos ópticos para generar la luz de hoja; y la placa de superficie óptica esté orientada de modo que la superficie de la placa de superficie óptica sea paralela al plano de observación.

Con la disposición anterior, el uno o más elementos ópticos se disponen en la superficie de la placa de superficie óptica. Esto permite que la unidad óptica genere luz de hoja que se desplaza en una dirección paralela al plano de observación.

El microscopio de la presente invención puede disponerse preferentemente de modo que el uno o más elementos ópticos incluyan una fuente de luz, un elemento convergente de luz y un elemento de distribución de luz; y el uno o más elementos ópticos opcionalmente incluyen además un prisma de cuña.

También se describe un dispositivo de enfoque para, en un caso en el que se va a observar una muestra en una superficie de colocación de una parte de colocación de muestra, ajustar una relación posicional relativa entre una lente de observación que tiene un eje óptico no ortogonal a la superficie de colocación y la muestra, el dispositivo de enfoque incluye: una primera etapa para cambiar la relación posicional relativa entre la lente de observación y la muestra a lo largo de una primera dirección, que es paralela al eje óptico de la lente de observación; una segunda etapa para cambiar la relación posicional relativa entre la lente de observación y la muestra a lo largo de una segunda dirección y una tercera dirección, que definen la superficie de colocación; y una plantilla para fijar la parte de colocación de la muestra, la plantilla se une a una de la primera etapa y la segunda etapa, la de la primera etapa y la segunda etapa, a la que se une la plantilla, se coloca en una de la primera etapa y la segunda etapa a la que no se une la plantilla.

También se describe un dispositivo de retención de fluido para retener fluido entre una lente de observación y una parte de colocación de muestra que tiene una superficie de colocación en la que colocar una muestra que se va a observar y una cara inferior diseñada para ser opuesta a la superficie de colocación, el dispositivo de retención de fluido incluye una sección de conexión para la conexión a la lente de observación; una cara del extremo diseñada para orientarse hacia la cara inferior; una ventana de transmisión a través de la cual la luz de hoja entra en la parte de colocación de muestra; una sección de retención de fluido para retener fluido dentro de sí misma, en un estado en el que el dispositivo de retención de fluido está conectado a la lente de observación, la cara del extremo es sustancialmente paralela a la cara inferior, la luz de hoja de una unidad óptica pasa a través de la ventana de transmisión y luego a través de la sección de retención de fluido para irradiar la muestra, y la fluorescencia de la muestra pasa a través de la sección de retención de fluido para ser recibida por la lente de observación.

También se describe una unidad óptica que incluye una placa de superficie óptica que tiene una superficie sobre la cual se colocan uno o más elementos ópticos para generar luz de hoja, la placa de superficie óptica está orientada de modo que la superficie de la placa de superficie óptica es paralela a un plano de observación de una lente de observación.

Efectos ventajosos de la invención

Con un modo de la presente invención, es posible observar una muestra en la parte de colocación de muestras sin incorporar la muestra en gel y en un estado en el que se utilizan las ventajas de un SPIM. Además, el tamaño de una muestra colocada en la parte de colocación de la muestra no se limita a un tamaño dentro del rango de la distancia de trabajo de la lente de observación. Esto hace posible observar una muestra en un sustrato plano transparente (parte de colocación de la muestra) de manera similar a un microscopio biológico normal y, por lo tanto, permite la observación de, por ejemplo, una muestra biológica relativamente grande, como un ratón individual.

La disposición anterior evita además una disminución en la calidad de la luz de hoja incluso en un caso en el que se forma una región iluminada cerca de la superficie de colocación de la parte de colocación de la muestra. Por lo tanto, incluso en un caso en el que, por ejemplo, se debe observar una muestra adherida a la parte de colocación de la muestra, es posible observar la muestra en un estado en el que se utilizan las ventajas de un SPIM. Por ejemplo, es posible observar directamente una célula adherente cultivada en una placa de Petri.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una configuración principal de un microscopio de una realización de la presente invención.

La Fig. 2 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una configuración principal de un microscopio de una realización de la presente invención.

La Fig. 3 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una configuración general y una trayectoria óptica de un microscopio de una realización de la presente invención.

La Fig. 4 ilustra las formas de la luz de hoja de un microscopio de una realización de la presente invención.

La Fig. 5 ilustra imágenes de una muestra que se producen con el uso de un microscopio de una realización de la presente invención y distribuciones de intensidad de fluorescencia de la muestra.

La Fig. 6 muestra diagramas que ilustran esquemáticamente una configuración de un microscopio de un ejemplo comparativo.

La Fig. 7 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una configuración de un microscopio de una realización de la presente invención.

La Fig. 8 muestra diagramas que ilustran cómo cambia una imagen en respuesta a un cambio en la relación posicional entre una lente de observación y la parte de colocación de la muestra de un microscopio de una realización de la presente invención.

La Fig. 9 muestra diagramas que ilustran esquemáticamente una configuración principal de un microscopio de una realización de la presente invención.

La Fig. 10 muestra diagramas que ilustran esquemáticamente una configuración principal de un microscopio de una realización de la presente invención.

La Fig. 11 muestra diagramas que ilustran la corrección de aberraciones mediante un microscopio de una realización de la presente invención.

La Fig. 12 muestra diagramas que ilustran cada uno una trayectoria óptica y una distribución de luminancia de un haz de luz en una unidad óptica.

La Fig. 13 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una configuración general y una trayectoria óptica de un microscopio de una variación de la presente invención.

La Fig. 14 muestra diagramas que ilustran cada uno una disposición para curvar un haz de luz en una unidad óptica. La Fig. 15 muestra diagramas, cada uno de los cuales ilustra trayectorias ópticas de haces de luz que tienen diferentes longitudes de onda, cuyos haces de luz se doblan con el uso de un prisma de cuña en una unidad óptica.

La Fig. 16 ilustra un Ejemplo que implica el uso de un microscopio de la presente invención.

La Fig. 17 ilustra un Ejemplo que implica el uso de un microscopio de la presente invención.

La Fig. 18 muestra diagramas que ilustran esquemáticamente una configuración principal de un microscopio óptico basado en una microscopía de lámina óptica laminada altamente inclinada convencional.

La Fig. 19 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una configuración principal de un SPIM convencional.

Descripción detallada

La siguiente descripción trata en detalle una realización de la presente invención con referencia a las Figs. 1 a 5.

La Fig. 1 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una configuración principal y una trayectoria óptica de un microscopio 1 de la presente invención. El microscopio 1 de la presente realización, como se ilustra en la Fig. 1, incluye una parte de colocación de muestra 10 para colocar una muestra, una unidad óptica 20 para irradiar la muestra con luz y una lente de observación 31 para recibir la luz irradiada desde la muestra. La Fig. 1 ilustra una lente de iluminación 26 como un miembro de la unidad óptica 20, cuya lente de iluminación 26 está dispuesta en una abertura para la emisión de luz desde la unidad óptica 20.

La parte de colocación de muestras 10 tiene una superficie de colocación 11 sobre la cual colocar una muestra 12 y una cara inferior 13 opuesta a la superficie de colocación 11. El microscopio 1 de la presente realización, como se ilustra en la Fig. 1, está configurado para ser utilizable como un microscopio invertido de manera que la lente de iluminación 26 y la lente de observación 31 estén dispuestas de manera opuesta a la muestra 12 con respecto a la parte de colocación de muestra 10 (es decir, con respecto al plano que incluye la superficie de colocación 11). La parte de colocación de muestras 10 está hecha total o parcialmente de un material transmisor de luz. La parte de colocación de muestras 10 puede ser un solo cubreobjetos o una cara inferior de una placa de cultivo (que incluye una placa de múltiples pocillos y un dispositivo microfluídico) o parte de la cara inferior. La unidad óptica 20 irradia una muestra 12 con luz de hoja a través de la cara inferior 13 de la parte de colocación de muestras 10. La unidad óptica 20 emite luz de hoja, que entra en la parte de colocación de muestra 10 en la cara inferior 13 y luego sale de la parte de colocación de muestra 10 en la superficie de colocación 11, para irradiar finalmente la muestra 12. La lente de observación 31 recibe fluorescencia irradiada desde la muestra 12 a través de la cara inferior 13 de la parte de colocación de muestras 10. La muestra 12 irradia fluorescencia, que entra en la parte de colocación de muestra 10 en la superficie de colocación 11 y luego sale de la parte de colocación de muestra 10 en la cara inferior 13, para finalmente ser recibida por la lente de observación 31. Además, la lente de iluminación 26 y la lente de observación 31 están orientadas de tal manera que tienen ejes ópticos que son ortogonales entre sí en un plano (es decir, el plano X-Z en la Fig. 1 ). Esta disposición permite que la unidad óptica 20 irradie una muestra con luz de hoja que se desplaza en una dirección paralela a una superficie observada con la lente de observación 31. Además, la lente de observación 31 tiene un eje óptico en una dirección (es decir, la dirección Z' en la Fig. 1 ) inclinada con respecto a la dirección perpendicular a la superficie de colocación 11 (es decir, la dirección Z en la Fig. 1). La Fig. 1 ilustra una realización en la que la dirección Z y la dirección Z' están inclinadas entre sí a 15 grados, y en el plano X-Z, la lente de iluminación 26 tiene un eje óptico en una dirección inclinada a $ = 15 grados con respecto a la superficie de colocación 11 (es decir, el plano X-Y en la Fig. 1 ). Esto significa que el eje óptico de la lente de iluminación 26 es perpendicular al plano Y-Z' en la Fig. 1.

El ángulo $ entre la dirección Z y la dirección Z' no se limita a 15 grados. En un caso en el que el ángulo entre la dirección Z y la dirección Z' es mayor que 15 grados, aumentar la apertura numérica de la lente de iluminación 26 permite la generación de una luz de hoja más delgada. Sin embargo, tal luz de hoja tendrá una profundidad de recolección de luz más pequeña. En el caso de que el ángulo sea menor de 15 grados, es posible reducir la aberración discutida anteriormente y utilizar eficazmente la distancia de trabajo del objetivo para observar una parte más profunda de una muestra. En este caso, sin embargo, solo se puede utilizar una lente objetivo con una apertura numérica más pequeña, de modo que mientras que la luz de la hoja tendrá una mayor profundidad de recolección de luz, la luz de la hoja tendrá un mayor espesor. Por lo tanto, es preferible ajustar el ángulo entre el eje óptico de la lente de iluminación 26 y la superficie de colocación 11 dentro del rango de 1 grado a 75 grados en correspondencia con el propósito de la medición. En particular, en el caso de observar un objeto con un aumento bajo (hasta x20), el ángulo es preferentemente de 1 grado a 10 grados, en el caso de observar un objeto con un aumento alto (x40 o superior) en toda la lente del objetivo, el ángulo es preferentemente de 5 grados a 20 grados, y en el caso de observar un objeto con un aumento alto (x40 o superior) con un fondo bajo, el ángulo es preferentemente de 35 grados a 50 grados.

El microscopio 1 de la presente realización está dispuesto de tal manera que la luz de hoja tiene un eje óptico inclinado con respecto a la superficie de colocación 11. Esta disposición hace posible observar una muestra 12 sin influir en ninguna otra muestra 12 en la parte de colocación de muestras 10 mediante irradiación con luz de hoja. Por lo tanto, el microscopio 1 también es adecuado para la medición que utiliza una placa multipocillo o un dispositivo microfluídico.

La Fig. 2 ilustra esquemáticamente secciones transversales de la muestra 12 y la parte de colocación de muestra 10 en el plano Y-Z', que incluye el eje óptico de la lente de observación 31, y una región iluminada con luz de hoja. La Fig. 2 muestra una dirección Y y una dirección Z' idénticas a las mostradas en la Fig. 1.

La lente de iluminación 26, como se describió anteriormente, emite luz de hoja. Esta luz de hoja forma una delgada región de iluminación en su trayectoria óptica. Como se ilustra en la Fig. 2, suponiendo que en el plano perpendicular al eje óptico de la lente de iluminación 26 (es decir, el plano Y-Z' en la Fig. 2 ), la región iluminada tiene un espesor D y un ancho W, la región iluminada tiene, en el plano Y-Z', una dirección de espesor idéntica a la dirección Z' en la Fig. 2. Esto significa que la lente de observación 31 está orientada de manera que tenga un eje óptico paralelo a la dirección del espesor de la región iluminada (es decir, la dirección Z' en la Fig. 2 ). La irradiación de una muestra 12 con luz de hoja excita el material fluorescente presente en la región iluminada de la muestra 12, de modo que el material fluorescente irradia fluorescencia. La posición de la lente de observación 31 (y la de la lente de iluminación 26, si es necesario) se ajusta de modo que la superficie de enfoque (plano de observación) de la lente de observación 31 se incluya en la región iluminada, y la lente de observación 31 reciba fluorescencia irradiada desde la muestra 12.

El microscopio 1 de la presente realización permite la observación de una muestra 12 colocada en la parte de colocación de muestras 10 sin la necesidad de incorporar la muestra en un gel y en un estado donde se utilizan las siguientes ventajas de un SPIM: (1) Un SPIM, que permite la observación con irradiación de luz débil, permite la reducción de la acción dañina a una muestra o la atenuación de la fluorescencia; (2) un SPIM es capaz de producir una imagen tridimensional rápidamente; y (3) un SPIM es capaz de observar una muestra a una alta resolución. Además, el microscopio 1 de la presente realización está dispuesto de manera que la lente de observación 31 esté dispuesta de manera opuesta a una muestra 12 con respecto al plano que incluye la superficie de colocación 11. Por lo tanto, el área por encima de la muestra 12 está abierta, de modo que el tamaño de una muestra 12 colocada en la parte de colocación de muestras 10 no se limita a un tamaño dentro del rango de la distancia de trabajo de la lente de observación 31. Además, la lente de iluminación 26, como se describió anteriormente, está dispuesta de manera opuesta a una muestra 12 con respecto al plano que incluye la superficie de colocación 11, por lo que su luz de hoja irradia la muestra 12 a través de la cara inferior 13. Esta disposición permite que toda la luz de hoja ingrese al plano de observación desde la cara inferior 13 de la parte de colocación de muestras 10 y, por lo tanto, permite que el espesor de la luz de hoja se controle con éxito incluso en un caso en el que la lente de iluminación 26 tenga una gran apertura numérica.

La Fig. 3 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una configuración general y una trayectoria óptica de un microscopio 1 de la presente realización. El microscopio 1, como se ilustra en la Fig. 3, incluye la unidad óptica 20 y una sección de observación 30 que incluye la lente de observación 31. La unidad óptica 20 genera luz de hoja, que irradia una muestra 12. La sección de observación 30 recibe fluorescencia de la muestra 12 en la lente de observación 31 para formar una imagen. La siguiente descripción trata sobre las disposiciones de una unidad óptica y una sección de observación que son preferibles para su uso en la configuración general del microscopio 1 de la presente realización y las propiedades de la luz de hoja para el caso en que el microscopio 1 incluya tal unidad óptica y sección de observación preferibles.

La unidad óptica 20 incluye una sección de fuente de luz visible 21, una sección de ajuste de luz visible 22, una sección de fuente de luz IR 23, una sección de ajuste de luz IR 24, un espejo dicroico (DM) 25 y una lente de iluminación 26 (lente objetivo de iluminación).

La sección de fuente de luz visible 21 incluye una fuente de luz láser de 592 nm 211, una fuente de luz láser de 560 nm 212, una fuente de luz láser de 514 nm 213, una fuente de luz láser de 450 nm 214, una fuente de luz láser de 405 nm 215, espejos 216 a 219 y los DM 1A a 4A. La sección de fuente de luz visible 21 está dispuesta de tal manera que las fuentes de luz láser 211 a 215 emiten rayos láser que tienen diferentes longitudes de onda, y los rayos láser son reflejados por las superficies reflectantes de los espejos 216 a 219 y/o las superficies reflectantes de los DM 1A a 4A para reflejar rayos de luz que tienen las longitudes de onda, de modo que las trayectorias ópticas de los rayos láser que tienen diferentes longitudes de onda están alineadas entre sí. La sección de fuente de luz visible 21 emite así un haz láser compuesto a la sección de ajuste de luz visible 22 a través de un obturador 220 y un espejo 221.

La sección de ajuste de luz visible 22 incluye una lámina de filtro 222, un espejo de barrido unidimensional 223, una lente 224, un iris 225, un espejo 226 y una lente 227. La sección de ajuste de luz visible 22 permite que un rayo láser de la sección de fuente de luz visible 21 golpee el espejo de barrido unidimensional 223 a través de la lámina de filtro 222. El espejo de barrido unidimensional 223 es un espejo para escanear el haz láser unidimensionalmente sobre su superficie reflectante. El espejo de barrido unidimensional 223 es, por ejemplo, un espejo MEMS, un espejo piezoeléctrico o un espejo galvánico. La superficie reflectante del espejo de barrido unidimensional 223 cambia unidimensionalmente en función de una función senoidal, de modo que la luz reflejada por el espejo de barrido unidimensional 223 es un haz de luz que tiene una trayectoria óptica con un ancho fijo. La sección de ajuste de luz visible 22 está dispuesta de tal manera que los haces de luz son reflejados por el espejo de barrido unidimensional 223 en su superficie reflectante, enfocados por la lente 224, pasados a través del iris 225, reflejados por el espejo 226 en su superficie reflectante, convertidos por la lente 227 en luz paralela que tiene un ancho, y luego emitidos hacia el DM 25. En un caso en el que la sección de fuente de luz visible 21 incluye una gran cantidad de fuentes de luz láser, se puede usar preferentemente una lente acromática para cada una de la lente 224 y la lente 227. Además, el espejo de barrido unidimensional 223 puede reemplazarse con, por ejemplo, una lente cilíndrica, un deflector acústico-óptico o una rejilla de difracción para el ajuste del ancho de la luz de la hoja. En otras palabras, la unidad óptica 20 para la presente invención incluye un espejo de barrido unidimensional, una lente cilíndrica, un deflector acústico-óptico, una rejilla de difracción o similar como un elemento de distribución de luz.

La sección de fuente de luz IR 23 incluye una sección de fuente de luz láser IR 231 y un espejo 232. La sección de fuente de luz IR 23 está dispuesta de tal manera que la sección de fuente de luz láser IR 231 emite un rayo láser IR, y el espejo 232 refleja el rayo láser IR en su superficie reflectante, de modo que el rayo láser IR se emite hacia la sección de ajuste de luz IR 24.

La sección de ajuste de luz IR 24 incluye un espejo de barrido unidimensional 241, una lente IR 242, un espejo 243, una lente IR 244 y un espejo 245. La sección de ajuste de luz IR 24 está dispuesta de tal manera que la sección de fuente de luz IR 23 emite un rayo láser IR, y el espejo de barrido unidimensional 241 refleja el rayo láser IR en su superficie reflectante, de modo que el rayo láser IR tendrá una trayectoria óptica con un ancho fijo. La sección de ajuste de luz IR 24 está dispuesta además de tal manera que el haz de luz IR reflejado por el espejo de barrido unidimensional 241 en su superficie reflectante es enfocado por la lente IR 242, reflejado por el espejo 243 en su superficie reflectante, convertido por la lente 244 en luz paralela que tiene un ancho, reflejado por el espejo 245 en su superficie reflectante, y luego emitido hacia el DM 25. El microscopio 1 de la presente realización puede disponerse alternativamente de manera que una muestra radie fluorescencia a través de excitación multifotónica. En este caso, se puede utilizar preferentemente una lente acromática para cada una de la lente IR 242 y la lente IR 244 también. Dado que tal excitación multifotónica requiere una fuente de luz para un rango de onda IR y la corrección de la aberración cromática, la sección de fuente de luz IR 23 y la sección de ajuste de luz IR 24 deben diseñarse independientemente de la sección de fuente de luz visible 21 y la sección de ajuste de luz visible 22.

El DM 25 es un espejo dicroico que refleja un haz de luz visible y pasa un haz de luz IR a través de sí mismo. El DM 25 pasa, a través de una superficie del mismo, un haz de luz IR desde la sección de ajuste de luz IR 24 y en la otra superficie, refleja un haz de luz visible desde la sección de ajuste de luz visible 22 para alinear las trayectorias ópticas del haz de luz IR y el haz de luz visible entre sí y luego emitir el haz de luz IR y el haz de luz visible hacia la lente de iluminación 26.

La lente de iluminación 26 enfoca el haz de luz IR y el haz de luz visible en la luz de hoja y emite tal luz de hoja hacia una muestra 12.

Los elementos ópticos individuales incluidos en la unidad óptica 20, tales como fuentes de luz, lentes y espejos, pueden disponerse en una superficie de una placa de superficie óptica. En este caso, la placa de superficie óptica está orientada de tal manera que la superficie sobre la que se disponen los elementos ópticos es paralela al plano de observación. Esta disposición permite la generación de luz de hoja que se desplaza en la dirección paralela al plano de observación y simplifica el paso de ajustar la configuración de los elementos ópticos. La unidad óptica 20 de la presente realización se puede unir a un microscopio vertical general o microscopio invertido para la práctica de la presente invención.

La presente realización tiene una configuración de ejemplo en la que una lente de iluminación 26 está dispuesta en la abertura para la emisión de luz desde la unidad óptica 20. Sin embargo, la unidad óptica 20 puede configurarse sin la lente de iluminación 26. En el caso de que no se utilice la lente de iluminación 26, el ajuste de la configuración de la lente 227 y la lente IR 244 en la Fig. 3 puede cambiar adecuadamente el espesor de la luz de hoja que emitirá la unidad óptica 20. Cada una de las lentes incluidas en la unidad óptica 20 puede reemplazarse con un prisma cónico o rejilla de difracción como un elemento óptico (elemento convergente de luz) que enfoca la luz de manera similar a una lente para la generación de la luz de hoja.

<Sección de observación>

La sección de observación 30 incluye la lente de observación 31 (lente objetivo de detección), un cubo de espejo de fluorescencia 32, un espejo 33, una lente de formación de imágenes 34 y una cámara CCD 35. La lente de observación 31 refracta la luz irradiada desde una muestra 12 y emite la luz refractada hacia el cubo de espejo de fluorescencia (filtro de fluorescencia) 32. El cubo de espejo de fluorescencia 32 pasa, a través de sí mismo, solo la fluorescencia de la muestra 12 fuera de la luz de la lente de observación 31. La sección de observación 30 está dispuesta de tal manera que la lente de formación de imágenes 34 recoge la fluorescencia del cubo de espejo de fluorescencia 32, y luego el espejo 33 refleja la fluorescencia recogida en su superficie reflectante, de modo que la fluorescencia reflejada entra en la cámara CCD 35. La sección de observación 30, a través de esta operación, forma una imagen a partir de la fluorescencia irradiada desde la muestra 12.

La siguiente descripción se refiere a la luz de hoja del microscopio 1 de la presente realización. La fluorescencia irradiada desde esa porción de una muestra que no es el plano de observación compone el fondo para el plano de observación de la lente de observación 31. Para reducir el fondo, la región iluminada tiene preferentemente un grosor pequeño. El microscopio 1 de la presente realización forma una región iluminada que tiene un espesor D de 3 pm o menos.

La Fig. 4 ilustra las formas de la luz de hoja del microscopio 1 de la presente realización. (a) de la Fig. 4 muestra un diagrama (A1) que ilustra esquemáticamente una trayectoria óptica de la luz de la hoja y una imagen de fluorescencia (A2) formada por la sección de observación 30 para un caso en el que el barrido por el espejo de barrido unidimensional está apagado. (b) de la Fig. 4 muestra un diagrama (B1) que ilustra esquemáticamente una trayectoria óptica de la luz de la hoja y una imagen de fluorescencia (B2) formada por la sección de observación 30 para un caso en el que el barrido por el espejo de barrido unidimensional está encendido. La dirección X' en la Fig. 4 indica la dirección del eje óptico de la lente de iluminación, y la dirección Y en la Fig. 4 es idéntica a la de las Figs. 1 a 3. Las imágenes de fluorescencia de la Fig. 4 son imágenes de fluorescencia que se han producido irradiando, con luz láser (592 nm), una solución acuosa que contiene moléculas de fluorescencia (rodamina), solución acuosa que se intercala entre la parte de colocación de la muestra 10 y un portaobjetos de vidrio y con el uso de la cámara CCD 35, capturando una imagen de fluorescencia irradiada desde la muestra. También ajustando el ancho de barrido del espejo de barrido unidimensional 233, es posible controlar el ancho W de una región iluminada con luz de hoja. La Fig. 4 ilustra una imagen de fluorescencia para un caso en el que el espejo de barrido unidimensional 233 ha escaneado haces de luz unidimensionalmente de modo que la región iluminada con luz de hoja tiene un ancho W de 100 pm a lo largo de la dirección Y. Además, también al controlar el iris 225 para abrirlo o cerrarlo, se puede controlar el ancho W de la región iluminada con luz de hoja. Además, la lente de iluminación puede estar provista de un tope de apertura unido a la misma de modo que el control del tope de apertura pueda ajustar el espesor D y la profundidad de recolección de luz de la región iluminada con luz de hoja. La reducción de la apertura del tope de apertura aumenta el grosor D y la profundidad de recolección de luz de la luz de la hoja.

La Fig. 5 ilustra propiedades de la luz de hoja del microscopio 1 de la presente realización. La dirección X' en la Fig. 5 es idéntica a la de la Fig. 4, y la dirección Z' en la Fig. 5 es idéntica a las de las Figs. 1 a 3. (a) de la Fig. 5 muestra imágenes de una muestra en el plano X'-Y que se producen escaneando la parte de colocación de la muestra con respecto a la luz de la hoja. (b) de la Fig. 5 muestra imágenes de una muestra en el plano X'-Z' que se producen como se indicó anteriormente. Las imágenes de (a) y (b) de la Fig. 5 son imágenes de fluorescencia producidas escaneando la parte de colocación de la muestra 10 a lo largo de la dirección Z' en pasos de 1 pm para perlas de fluorescencia diminutas (D = 0,04 pm) fijadas en 1 % en peso de gel de agarosa y con el uso de la cámara CCD 35, capturando una imagen de fluorescencia irradiada desde la muestra.

(c) de la Fig. 5 es un gráfico indicativo de una distribución de la intensidad de fluorescencia de las imágenes a lo largo de la dirección X'. (d) de la Fig. 5 es un gráfico indicativo de una distribución de la intensidad de fluorescencia de las imágenes a lo largo de la dirección Z'. Un análisis de las distribuciones de intensidad de fluorescencia en (c) y (d) de la Fig. 5 muestra que la intensidad de fluorescencia a lo largo de la dirección X tiene un ancho de valor medio de 0,87 pm y que la intensidad de fluorescencia a lo largo de la dirección Z tiene un ancho de valor medio de 2,6 pm. Los resultados del análisis demuestran que la región iluminada con luz de hoja por el microscopio 1 tiene un ancho de 2,6 pm a lo largo de la dirección Z.

[Ejemplos comparativos]

La Fig. 6 muestra diagramas que ilustran cada uno esquemáticamente una configuración de un microscopio de un ejemplo comparativo. (a) de la Fig. 6 ilustra una configuración de un microscopio como primer ejemplo comparativo. (b) de la Fig. 6 ilustra una configuración de un microscopio como un segundo ejemplo comparativo. (c) de la Fig. 6 ilustra una configuración de un microscopio como un tercer ejemplo comparativo.

El microscopio ilustrado en (a) de la Fig. 6 como primer ejemplo comparativo está dispuesto de tal manera que la lente de observación 31' tiene un eje óptico que no es ortogonal al eje óptico de la lente de iluminación 26' y que no es paralelo a la dirección del espesor de una región iluminada en un plano perpendicular al eje óptico de la lente de iluminación 26'. Esta disposición da como resultado que una imagen esté desenfocada de forma no uniforme en diversos grados sobre el plano de observación, por lo que la imagen tiene una uniformidad de calidad disminuida. Además, la disposición anterior permite que la luz de hoja irradie esa porción de una muestra que no es el plano de observación, con el resultado de un fondo grande.

El microscopio ilustrado en (b) de la Fig. 6 como el segundo ejemplo comparativo está dispuesto de tal manera que la lente de observación 31' tiene un eje óptico que es ortogonal al eje óptico de la lente de iluminación 26' y que es paralelo a la dirección del espesor de una región iluminada en un plano perpendicular al eje óptico de la lente de iluminación 26'. Sin embargo, la lente de iluminación 26' está dispuesta en el mismo lado que una muestra con respecto a un plano que incluye la superficie de colocación.

El microscopio ilustrado en (c) de la Fig. 6 como el tercer ejemplo comparativo está dispuesto de tal manera que la lente de observación 31' tiene un eje óptico que es ortogonal al eje óptico de la lente de iluminación 26' y que es paralelo a la dirección del espesor de una región iluminada en un plano perpendicular al eje óptico de la lente de iluminación 26'. Sin embargo, la lente de iluminación 26' y la lente de observación 31' están dispuestas en el mismo lado que una muestra con respecto a un plano que incluye la superficie de colocación.

El microscopio como segundo ejemplo comparativo y el microscopio como tercer ejemplo comparativo están dispuestos de manera que la lente de iluminación esté dispuesta en el mismo lado que una muestra con respecto al plano que incluye la superficie de colocación. Dado que el aumento de la apertura numérica de la lente de iluminación amplía la trayectoria óptica de la luz de hoja a lo largo de la dirección Z, el microscopio como segundo ejemplo comparativo y el microscopio como tercer ejemplo comparativo permitirán que parte de la luz de hoja sea separada por la parte de colocación de la muestra antes de iluminar un plano de observación. La luz de hoja resultante tendrá un gran espesor y, por lo tanto, iluminará una región de una muestra cuya región es distinta del plano de observación, con el resultado de un fondo grande. En particular, en el caso de observar una muestra en las proximidades de la superficie de colocación, la lente de iluminación debe tener un eje óptico cerca del plano que incluya la superficie de colocación para que la muestra tenga una región iluminada cerca de la superficie de colocación. En el caso de que la lente de iluminación tenga un eje óptico cerca de la superficie de colocación, es más probable que la luz de hoja esté separada por la superficie de colocación antes de iluminar el plano de observación. Los microscopios como el segundo ejemplo comparativo y el tercer ejemplo comparativo son, como se describió anteriormente, incapaces de observar una muestra a una alta resolución al aumentar la apertura numérica de la lente de iluminación. En particular, los microscopios como el segundo ejemplo comparativo y el tercer ejemplo comparativo no permiten la observación de una muestra a una alta resolución en las proximidades de la superficie de colocación.

[Realización adicional]

La siguiente descripción trata en detalle otra realización de la presente invención con referencia a las Figs. 7 a 10. Por conveniencia de explicación, a cualquier miembro de la presente realización que sea idéntico en función a un miembro correspondiente descrito para la Modalidad 1 se le asigna un número de referencia idéntico y no se describe aquí.

La Fig. 7 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una configuración de un microscopio 100 de la presente realización. El microscopio 100, como se ilustra en la Fig. 7, incluye una mesa de eliminación de vibraciones 101, un cuerpo de microscopio 102 en la mesa de eliminación de vibraciones 101 y un condensador 103 para irradiar una muestra 12 desde arriba.

El microscopio 100 incluye además una primera etapa 110 y una segunda etapa 120 juntas como un mecanismo de enfoque para ajustar la relación posicional relativa entre una parte de colocación de muestra 10 y una lente de observación 31. La primera etapa 110 se coloca en la segunda etapa 120. La primera etapa 110 incluye una plantilla para fijar la parte de colocación de muestras 10, y la parte de colocación de muestras 10 se fija a la primera etapa 110 por medio de la plantilla.

La primera etapa 110 es capaz de cambiar la posición de la parte de colocación de muestra 10 con respecto a la lente de observación 31 a lo largo de una primera dirección (es decir, la dirección Z' en la Fig. 7 ), que es idéntica a la dirección del eje óptico de la lente de observación 31. La segunda etapa 120 es capaz de cambiar la posición de la parte de colocación de muestra 10 con respecto a la lente de observación 31 a lo largo de una segunda dirección y una tercera dirección (es decir, la dirección X y la dirección Y en la Fig. 7 ) que definen una superficie de colocación de la parte de colocación de muestra 10.

El microscopio 100, como se describió anteriormente, permite el ajuste de la relación posicional relativa entre la lente de observación 31 y la parte de colocación de muestra 10 a lo largo de cada una de las direcciones primera a tercera. La relación posicional relativa entre la lente de observación 31 y la parte de colocación de muestra 10 puede ajustarse alternativamente fijando la posición de la parte de colocación de muestra 10, colocando la lente de observación 31 y la lente de iluminación 26 respectivamente en la primera etapa 110 y la segunda etapa 120, y cambiando las posiciones de la lente de observación 31 y la lente de iluminación 26.

La Fig. 7 ilustra una realización en la que la primera etapa con una plantilla unida a la misma se coloca en la segunda etapa. La primera etapa y la segunda etapa pueden funcionar como un mecanismo de enfoque adecuado para la presente invención también en un caso en el que se une una plantilla a la segunda etapa siempre que esa segunda etapa se coloque en la primera etapa.

La Fig. 8 muestra diagramas que ilustran cómo cambia la posición de una imagen dentro de un campo de visión idéntico en respuesta a un cambio en la relación posicional entre una lente de observación y una parte de colocación de la muestra. (a) de la Fig. 8 ilustra cómo cambia la posición de una imagen dentro de un campo de visión idéntico en respuesta a un cambio en la posición de una parte de colocación de muestra con respecto a una lente de observación a lo largo de una dirección perpendicular a una superficie de colocación (es decir, la dirección Z en la Fig. 7 ). (b) de la Fig. 8 ilustra cómo cambia la posición de una imagen dentro de un campo de visión idéntico para el microscopio de la presente realización en respuesta a un cambio en la posición de la parte de colocación de la muestra con respecto a la lente de observación a lo largo de la dirección del eje óptico de la lente de observación (es decir, la dirección Z' en la Fig. 7 ).

En un caso en el que la posición de una parte de colocación de muestra se cambia a lo largo de la dirección perpendicular a una superficie de colocación como se ilustra en (a) de la Fig. 8, la posición de una imagen cambia indeseablemente dentro de un campo de visión de una lente de observación. Por el contrario, el microscopio 100, que tiene el mecanismo de enfoque descrito anteriormente, está dispuesto de tal manera que cambiar la posición de la parte de colocación de la muestra a lo largo de la primera dirección (es decir, la dirección del eje óptico de la lente de observación 31) como se ilustra en (b) de la Fig. 8 puede lograr el enfoque sin cambiar la posición de una imagen dentro de un campo de visión observado. Esta disposición permite capturar continuamente una imagen de una muestra para la formación de una imagen tridimensional con la imagen fijada dentro de un campo de visión idéntico.

El microscopio 100, que tiene el mecanismo de enfoque descrito anteriormente, está dispuesto de manera que el ajuste de la relación posicional relativa entre la lente de observación 31 y la parte de colocación de muestra 10 a lo largo de la segunda dirección y la tercera dirección puede cambiar un campo de visión observado sin cambiar la distancia entre la parte de colocación de muestra 10 y la lente de observación 31. Esta disposición puede evitar el contacto innecesario entre la parte de colocación de la muestra 10 y la lente de observación 31 mientras el microscopio 100 cambia el campo de visión observado.

El mecanismo de enfoque como parte del microscopio 100 puede ser alternativamente un dispositivo de enfoque separado para su uso en un microscopio convencionalmente conocido públicamente.

La Fig. 9 muestra diagramas que ilustran esquemáticamente una configuración principal del microscopio 100. (a) de la Fig. 9 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una parte de colocación de muestra y una lente de observación con un dispositivo de retención de fluido conectado a la misma. (b) de la Fig. 9 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una parte de colocación de muestra y una lente de observación para un caso en el que la parte de colocación de muestra está separada de la lente de observación. (c) de la Fig. 9 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una parte de colocación de muestra y una lente de observación para un caso en el que una muestra está cerca de la lente de observación.

El microscopio 100, como se ilustra en (a) de la Fig. 9, incluye un dispositivo de retención de fluido 40 entre la lente de observación 31 y la parte de colocación de muestra 10. La Fig. 10 muestra diagramas que ilustran esquemáticamente el dispositivo de retención de fluido. (a) de la Fig. 10 es una vista en perspectiva del dispositivo de retención de fluido. (b) de la Fig. 10 es una vista superior del dispositivo de retención de fluido conectado a una lente de observación, la vista se toma a lo largo del eje óptico de la lente de observación. (c) de la Fig. 10 es una vista en sección transversal del dispositivo de retención de fluido conectado al microscopio 100 a través de una lente de observación, la vista se toma en un plano definido por el eje óptico de una lente de iluminación y el eje óptico de la lente de observación.

La forma del dispositivo de retención de fluido 40 es, como se ilustra en la Fig. 10, una forma sustancialmente cilíndrica para ajustar con la lente de observación 31 que se va a conectar, y su interior tiene una estructura hueca. El dispositivo de retención de fluido 40 incluye una sección de conexión 41 para la conexión a la lente de observación 31, una cara del extremo 42 en una posición tal que se enfrenta a la cara inferior 13 de la parte de colocación de muestra 10 de modo que la parte de colocación de muestra 10 se coloca en la cara del extremo 42, y una ventana de transmisión 43 que permite que la luz pase a través de la misma. En un estado en el que el dispositivo de retención de fluido 40 está conectado a la lente de observación 31, el hueco forma una sección de retención de fluido 44 para retener el fluido dentro de sí mismo.

La Fig. 9 ilustra una realización en la que la sección de retención de fluido 44 se llena con agua 45, y la lente de observación 31 es una lente de inmersión en agua. La sección de retención de fluido 44 puede llenarse con un fluido correspondiente a la lente que se utilizará; por ejemplo, en un caso en el que la lente de observación 31 es una lente de inmersión en aceite, la sección de retención de fluido 44 puede llenarse con un aceite de inmersión. En un caso en el que la lente de observación 31 es una lente seca, se puede usar el dispositivo de retención de fluido 40, o no es necesario usarlo.

Cuando el microscopio 100 está en un estado en el que el dispositivo de retención de fluido 40 y la parte de colocación de muestra 10 están colocados de modo que la cara del extremo 42 esté orientada hacia la cara inferior 13, el dispositivo de retención de fluido 40 puede retener fluido en la sección de retención de fluido 44 junto con la cara inferior 13. En este estado, la cara del extremo 42 es sustancialmente paralela a la cara inferior 13 de la parte de colocación de muestras 10. Una porción del agua 45 se mantiene entre la cara del extremo 42 y la cara inferior 13 como se ilustra en la Fig. 9 debido a la tensión superficial del agua 45 que llena la sección de retención de fluido 44.

En un caso en el que el microscopio 100 está en un estado en el que el dispositivo de retención de fluido 40 está conectado a la lente de observación 31, la lente de iluminación 26 dispuesta fuera del dispositivo de retención de fluido 40 puede irradiar una muestra 12 con luz de hoja a través de la ventana de transmisión 43 y la sección de retención de fluido 44. Específicamente, el dispositivo de retención de fluido 40 incluye una sección de retención de fluido 44 que es un hueco que se extiende desde la ventana de transmisión 43 hasta la cara del extremo 42 de manera que la luz de hoja de la lente de iluminación 26, cuya luz de hoja ha pasado a través de la ventana de transmisión 43, irradia la muestra 12. Además, el dispositivo de retención de fluido 40 incluye una sección de retención de fluido 44 que es un hueco que se extiende, en el estado en el que el dispositivo de retención de fluido 40 está conectado a la lente de observación 31, desde la cara del extremo 42 hasta la sección de conexión 41 de manera que la fluorescencia de la muestra 12 es recibida por la lente de observación 31. Como se describió anteriormente, el microscopio 100, que incluye el dispositivo de retención de fluido descrito anteriormente, es capaz de retener fluido tal como líquido o gas entre la lente de observación 31 y la parte de colocación de muestra 10 mientras asegura una trayectoria de luz de hoja y una trayectoria de fluorescencia. Además, al llenar la sección de retención de fluido 44 con líquido, la forma de la superficie del líquido no cambia cuando, por ejemplo, se mueve la muestra 12, y la superficie del líquido tiene una forma estable en correspondencia con la forma de la sección de retención de fluido 44. Como se describió anteriormente, en el caso donde el microscopio 100 incluye una lente de inmersión como la lente de observación 31, el microscopio 100, que incluye el dispositivo de retención de fluido descrito anteriormente, puede irradiar una muestra 12 con luz de hoja a través de un líquido que tiene una forma de superficie estable y, por lo tanto, puede formar una región iluminada en una posición deseada.

El dispositivo de retención de fluido como parte del microscopio 100 puede ser alternativamente un dispositivo de retención de fluido separado para su uso en un microscopio convencionalmente conocido públicamente.

La Fig. 11 muestra diagramas que ilustran esquemáticamente una configuración principal del microscopio 100. Cada uno de los diagramas ilustra una trayectoria óptica de fluorescencia de una muestra, el ángulo entre una parte de colocación de la muestra y el eje óptico de una lente de observación, y una imagen formada por una sección de observación.

En el caso de que la lente de observación sea una lente de inmersión, el espacio entre la parte de colocación de la muestra y la lente de observación se llena con el líquido deseado. En este caso, la diferencia entre el índice de refracción de la parte de colocación de la muestra y el del líquido mencionado anteriormente hace que la trayectoria óptica de fluorescencia de una muestra cambie por refracción. Por lo tanto, a pesar de que la parte de colocación de la muestra tiene un plano de observación perpendicular al eje óptico de la lente de observación, la aberración surgirá según la apertura numérica de la lente de observación, con el resultado de imágenes inestables (ver (a) de la Fig. 11 ). Dicha aberración se puede eliminar con el uso de un collar de corrección para la lente de observación. Sin embargo, en el caso de que la parte de colocación de la muestra tenga un plano de observación no perpendicular al eje óptico de la lente de observación (es decir, la parte de colocación de la muestra está inclinada desde un plano perpendicular al eje óptico de la lente de observación), surgirá una aberración asimétrica izquierda-derecha que es extremadamente difícil de eliminar (ver (b) de la Fig. 11 ).

El microscopio 100, en el caso en que la lente de observación sea una lente de inmersión en agua, se dispone preferentemente de modo que la parte de colocación de la muestra esté hecha de un material que tenga un índice de refracción equivalente al del agua (1,28 a 1,38), cuyo material está tipificado por una resina de flúor amorfa que tiene la siguiente fórmula estructural:

La disposición anterior puede evitar la refracción de la luz en la parte de colocación de la muestra y, por lo tanto, puede reducir significativamente la aberración que se produce según la apertura numérica de la lente de observación, permitiendo así que el microscopio forme una imagen estable (ver (c) de la Fig. 11 ). Además, aunque la parte de colocación de la muestra tiene un plano de observación no perpendicular al eje óptico de la lente de observación, la disposición anterior puede evitar la aparición de aberración asimétrica izquierda-derecha (ver (d) de la Fig. 11 ). La resina anterior está disponible comercialmente como CYTOP (marca registrada). La parte de colocación de la muestra del microscopio 100 puede estar hecha alternativamente de otra resina transparente a base de flúor. Además, Lumox puede usarse alternativamente como la parte de colocación de la muestra. En este caso, aunque la parte de colocación de la muestra debe estar hecha de un material que tenga un índice de refracción diferente al del agua, la reducción del espesor de la parte de colocación de la muestra puede reducir el efecto de refracción.

Los ejemplos preferibles específicos de la parte de colocación de la muestra se describieron anteriormente. Sin embargo, la parte de colocación de la muestra no se limita a ellos. La parte de colocación de la muestra puede ser adecuadamente cualquier sustrato plano que sea delgado y transparente y que tenga un índice de refracción (1,28 a 1,38) equivalente al del agua. La parte de colocación de la muestra 10, que tiene la forma de un sustrato plano, requiere tanto resistencia para sostener una muestra como delgadez suficiente para evitar la influencia en la observación. El espesor se encuentra preferentemente dentro del intervalo de 1 pm a 200 pm. En particular, en el caso de observar una muestra en una parte de colocación de muestra 10 como Lumox (marca registrada, con un índice de refracción de 1,36), la parte de colocación de muestra 10 preferentemente tiene un espesor dentro del intervalo de 10 pm a 50 pm para reducir la aberración causada por la parte de colocación de muestra 10 y para permitir una observación estable. En un caso de observar una muestra en una parte de colocación de muestra 10 hecha de CYTOP (marca registrada, con un índice de refracción de 1,34), la parte de colocación de muestra 10 preferentemente tiene un espesor dentro del intervalo de 10 pm a 100 pm para reducir la aberración causada por la parte de colocación de muestra 10 y para permitir una observación estable.

La siguiente descripción trata de otras características de los microscopios 1 y 100 de la presente invención.

(Sección de ajuste de luz visible)

Los microscopios 1 y 100 de la presente invención están dispuestos de tal manera que el espejo de barrido unidimensional 233 refleja, en su superficie reflectante, la luz de las fuentes de luz láser 211 a 215 para distribuir uniformemente la luz en la dirección del eje Y que se muestra en las Figs. 12 y Figura 13.

La Fig. 12 muestra diagramas que ilustran cada uno una trayectoria óptica y una distribución de luminancia de un haz de luz en la unidad óptica. (a) de la Fig. 12 ilustra un haz de luz reflejado en la superficie reflectante de un espejo de barrido unidimensional y una distribución de luminancia de luz. (b) de la Fig. 12 ilustra un haz de luz reflejado en la superficie reflectante de un espejo de barrido unidimensional y que pasa a través de un iris y una distribución de luminancia de luz. El espejo de barrido unidimensional 233 escanea su superficie reflectante unidimensionalmente sobre la base de una función seno. Por lo tanto, como se ilustra en (a) de la Fig. 12, la luz reflejada por el espejo de barrido unidimensional 233 tiene una luminancia más alta en los bordes en la dirección del ancho que en el medio del haz de luz. Los microscopios 1 y 100 de la presente realización están, en vista de eso, ambos dispuestos para producir luz con luminancia uniforme como se ilustra en (b) de la Fig. 12 reflejando la luz en el espejo de barrido unidimensional 233, recolectando la luz en la lente 224 y luego pasando la luz a través del iris 225 para eliminar los bordes del haz de luz en la dirección del ancho.

La siguiente descripción trata en detalle variaciones de la presente invención con referencia a las Figs. 13 a 15. Por conveniencia de explicación, a cualquier miembro de la presente realización que sea idéntico en función a un miembro correspondiente descrito para la Modalidad 1 se le asigna un número de referencia idéntico y no se describe aquí.

La Fig. 13 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una configuración general y una trayectoria óptica de un microscopio 200 de una variación de la presente invención. El microscopio 200, como se ilustra en la Fig. 13, incluye una parte de colocación de muestra 10, una unidad óptica 20A y una sección de observación 30A.

La unidad óptica 20A incluye una sección de fuente de luz visible 21A, una sección de ajuste de luz visible 22A, una sección de fuente de luz IR 23A, una sección de ajuste de luz IR 24A, un espejo dicroico (DM) 25 y una lente de iluminación 26 (lente objetivo de iluminación) y un prisma de cuña 50.

La sección de fuente de luz visible 21A está dispuesta de tal manera que las fuentes de luz láser 211 a 215 emiten rayos láser que tienen diferentes longitudes de onda, y los rayos láser son reflejados por las superficies reflectantes de los espejos 216 y/o las superficies reflectantes de los DM 1A a 4A para reflejar rayos de luz que tienen las longitudes de onda, de modo que las trayectorias ópticas de los rayos láser que tienen diferentes longitudes de onda están alineadas entre sí. La sección de fuente de luz visible 21a está dispuesta de tal manera que los rayos láser que tienen las longitudes de onda y las trayectorias ópticas alineadas entre sí se reflejan en la superficie reflectante de un espejo 217 y luego se componen con el uso del acoplador de fibra 60s y una fibra 61. La sección de fuente de luz visible 21A emite así un haz láser compuesto a la sección de ajuste de luz visible 22A a través de un obturador.

La sección de ajuste de luz visible 22A incluye espejos 70 a 75, un espejo 221, DM 1B a 4B, DM 1C a 4C, una lámina de filtro 222, un espejo de barrido unidimensional 223, una lente 224, un iris 225, un espejo 226 y una lente 227. La sección de ajuste de luz visible 22A está dispuesta para reflejar los rayos láser de la sección de fuente de luz visible 21A en la superficie reflectante del espejo 70 y luego reflejar los rayos láser en las superficies reflectantes de los DM 1B a 4B, los espejos 71 a 75 y los DM 1C a 4C en diferentes ángulos de reflexión correspondientes a las longitudes de onda para separar, entre sí, las trayectorias ópticas de los rayos láser que tienen las diferentes longitudes de onda. La sección de ajuste de luz visible 22A permite que los rayos láser incidan en el espejo de barrido unidimensional 223 a través de la lámina de filtro 222 y, por lo tanto, permite que se emita luz paralela con un ancho fijo hacia el DM 25.

La sección de fuente de luz IR 23A y la sección de ajuste de luz IR 24A son las mismas respectivamente que la sección de fuente de luz IR 23 y la sección de ajuste de luz IR 24 de la Realización 1. La sección de ajuste de luz IR 24A emite un haz de luz IR hacia el DM 25.

El DM 25 pasa un haz de luz IR desde la sección de ajuste de luz IR 24A a través de una superficie del mismo y en la otra superficie, refleja un haz de luz visible desde la sección de ajuste de luz visible 22A para alinear las trayectorias ópticas del haz de luz IR y el haz de luz visible entre sí y luego emitir el haz de luz IR y el haz de luz visible hacia el prisma de cuña 50. El prisma de cuña 50 dobla el haz de luz IR y el haz de luz visible y luego emite el haz de luz IR y el haz de luz visible hacia la lente de iluminación 26.

El microscopio 1 de la realización 1, con el fin de irradiar una muestra 12 con luz de hoja a través de la cara inferior 13 de la parte de colocación de muestra 10, está dispuesto de tal manera que, como se ilustra en la figura 3, la lente de iluminación 26 tiene un eje óptico inclinado en el ángulo $ con respecto a la superficie de colocación 11, y los otros miembros de la unidad óptica 20 también están dispuestos en el ángulo $. Suponiendo que la dirección Z en la Fig. 3 es la dirección vertical, no será fácil disponer los miembros individuales de la unidad óptica 20 con referencia a la dirección Z', que está inclinada en el ángulo $ desde la dirección Z.

En vista de eso, como el microscopio 200 de la variación, el microscopio 1 de la Modalidad 1 puede estar equipado con un prisma de cuña 50 proporcionado entre el DM 25 y la lente de iluminación 26 para doblar los haces de luz entre el DM 25 y la lente de iluminación 26. Esta disposición elimina la necesidad de ajustar las orientaciones de los miembros individuales de la unidad óptica 20 en correspondencia con el ángulo $, facilitando así el montaje de la unidad óptica 20.

La Fig. 14 ilustra disposiciones cada una para doblar un haz de luz. (a) de la Fig. 14 ilustra una disposición para curvar un haz de luz reflejando el haz de luz en la superficie reflectante de un espejo. (b) de la Fig. 14 ilustra una disposición para doblar un haz de luz haciendo pasar el haz de luz a través de un prisma de cuña. En un caso en el que un haz de luz para formar una imagen de la letra R se dobla a través de la reflexión en la superficie reflectante de un espejo como se ilustra en (a) de la Fig. 14, la imagen está inclinada con respecto a un plano (plano de irradiación) perpendicular al eje del haz de luz. En un caso en el que un haz de luz que tiene un ancho fijo como en la unidad óptica 20 de cada uno de los microscopios 1 y 100 de la presente invención se dobla a través de la reflexión en la superficie reflectante de un espejo, la dirección del ancho del haz de luz cambia indeseablemente. En este caso, es imposible controlar con éxito el espesor de una región iluminada con luz de hoja emitida por la lente de iluminación 26.

Por el contrario, en el microscopio 1, un haz de luz que tiene un ancho fijo pasa a través del prisma de cuña 50 para doblarse sin cambios en su dirección de ancho.

La Fig. 15 muestra diagramas, cada uno de los cuales ilustra trayectorias ópticas de haces de luz que tienen diferentes longitudes de onda, cuyos haces de luz se doblan con el uso de un prisma de cuña en una unidad óptica. (a) de la Fig. 15 ilustra cómo se cambian las trayectorias ópticas mutuamente alineadas de los rayos láser multiespectrales cuando los rayos láser multiespectrales pasan a través de un prisma de cuña. (b) de la Fig. 15 ilustra cómo se cambian las trayectorias ópticas mutuamente variadas de los rayos láser multiespectrales cuando los rayos láser multiespectrales pasan a través de un prisma de cuña.

La unidad óptica 20 del microscopio 1 de la variación utiliza un prisma de cuña 50 para doblar los haces de luz. En tal caso, dado que el prisma de cuña 50 tiene un índice de refracción que varía según la longitud de onda de la luz, cuando diferentes rayos láser que tienen diferentes longitudes de onda y que tienen la misma trayectoria óptica se doblan al pasar a través del prisma de cuña 50, las trayectorias ópticas de los rayos láser que han pasado a través del prisma de cuña 50 serían diferentes entre sí con respecto a las longitudes de onda como se ilustra en (a) de la Fig. 15. En este caso, la luz de hoja emitida por la unidad óptica 20 forma indeseablemente una región iluminada que tiene un gran espesor.

Por lo tanto, la unidad óptica 20 se dispone preferentemente como se ilustra en (b) de la Fig. 15 de modo que los haces de luz que tienen diferentes longitudes de onda y que tienen diferentes trayectorias ópticas alineadas entre sí se doblen primero con el uso de los DM, espejos y lentes en ángulos predeterminados en correspondencia con respecto a cada longitud de onda de modo que las trayectorias ópticas difieran entre sí en correspondencia con respecto a cada longitud de onda y que los haces de luz se doblen luego con el uso de un prisma de cuña 50. Esta disposición implica ajustar las trayectorias ópticas de los haces de luz con respecto a cada longitud de onda por adelantado con el uso de DM, espejos y lentes, de modo que los haces de luz que tienen las diferentes longitudes de onda que los haces de luz han pasado a través del prisma de cuña tendrán trayectorias ópticas alineadas entre sí.

[Ejemplo 1]

La Fig. 16 ilustra un Ejemplo que implica el uso de un microscopio de la presente invención. (a) de la Fig. 16 muestra imágenes de una célula de levadura en gemación en diferentes planos X'-Y, cuyas imágenes se produjeron escaneando un plano de observación a lo largo de la dirección Z'. (b) de la Fig. 16 muestra una imagen tridimensional de la célula de levadura en gemación.

Las imágenes de la Fig. 16 son imágenes de fluorescencia producidas mediante la irradiación, con luz de hoja, de una célula de levadura en gemación(Saccharomyces cerevisiae:mKate2/pESC-HIS/BY4741) agrupada en las proximidades de la superficie de colocación de la parte de colocación de la muestra mientras se escanea la región iluminada a lo largo de la primera dirección (dirección Z' ) en etapas de 0,25 pm con el uso de la primera etapa 110 y con el uso de la cámara CCD 35, capturando una imagen de fluorescencia irradiada desde la muestra.

El microscopio de la presente invención permite la observación de una muestra en las proximidades de la superficie de colocación de la parte de colocación de muestras (cubreobjetos). El microscopio formó con éxito una imagen de todo el volumen (aproximadamente 6 pm de diámetro) de una célula de levadura en gemación en las proximidades de la superficie de colocación como se describió anteriormente.

[Ejemplo 2]

La Fig. 17 ilustra un Ejemplo que implica el uso de un microscopio de la presente invención. (a) de la Fig. 17 es una imagen de fluorescencia deEscherichia coli.(b) de la Fig. 17 es un perfil de luminancia para la imagen de fluorescencia deEscherichia coli.

El microscopio de la presente invención puede incluir una lente con una gran apertura numérica (por ejemplo, NA = 1,1) como la lente de observación 31, y por lo tanto permite la observación a una alta resolución.

Se realizaron imágenes de fluorescencia de una cepa deEscherichia coli(E. coli: SX4) que expresa un promedio de una molécula de proteína fluorescente por célula. Se produjo una imagen de fluorescencia en este ejemplo de observación fijandoEscherichia colia un cubreobjetos que tenía un índice de refracción bajo e irradiando la muestra con luz de hoja de 514 nm para excitar la muestra. Esta observación dio como resultado la detección de dos puntos brillantes de fluorescencia de molécula única en la célula 1, ningún punto brillante en la célula 2 y uno de esos puntos brillantes en la célula 3 (ver Fig. 17 ).

La presente invención no se limita a la descripción de las realizaciones anteriores, y puede alterarse de diversas maneras dentro del alcance de las reivindicaciones.

Aplicabilidad Industrial

La presente invención permite la observación de una muestra a una alta resolución a un nivel de molécula única, cuya observación está libre de restricciones tales como el tamaño de una muestra. Por lo tanto, la presente invención es aplicable adecuadamente al desarrollo de nuevos medicamentos basados en células.

Lista de Signos de Referencia

1, 100: microscopio

10: parte de colocación de muestras

11: superficie de colocación

12: muestra

13: cara inferior

20: unidad óptica

31: lente de observación

40: dispositivo de retención de fluido

41: sección de conexión

42: cara del extremo

43: ventana de transmisión

44: sección de retención de fluido

45: líquido

110: primera etapa (mecanismo de enfoque, dispositivo de enfoque)

120: segunda etapa (mecanismo de enfoque, dispositivo de enfoque)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un microscopio (1, 100), que comprende:

una parte de colocación de muestras (10) que tiene una superficie de colocación (11) sobre la cual colocar una muestra (12) y una cara inferior (13) opuesta a la superficie de colocación (11);

una lente de observación (31) para recibir fluorescencia de la muestra (12); y una unidad óptica (20) para generar luz de hoja que se desplaza en una dirección paralela a un plano de observación de la lente de observación (31), la luz de hoja que entra en la parte de colocación de la muestra (10) desde la cara inferior (13) y pasa a través de la parte de colocación de la muestra (10) para irradiar la muestra (12),

la fluorescencia que pasa a través de la parte de colocación de la muestra (10) hacia la cara inferior (13) para ser recibida por la lente de observación (31), además el microscopio comprende

un dispositivo de retención de fluido (40) para retener fluido (45) entre la lente de observación (31) y la parte de colocación de muestra (10), en donde el dispositivo de retención de fluido (40) comprende:

una sección de conexión (41) para la conexión a la lente de observación (31);

una cara del extremo diseñada para orientarse a la cara inferior (13);

una ventana de transmisión (43) a través de la cual la luz de hoja entra en la parte de colocación de la muestra (10); y

una sección de retención de fluido (44) para retener el fluido (45) dentro de sí mismo; y

en donde en un estado donde el dispositivo de retención de fluido (40) está conectado a la lente de observación (31), la cara del extremo es sustancialmente paralela a la cara inferior (13), la luz de hoja pasa a través de la ventana de transmisión (43) y luego a través de la sección de retención de fluido (44) para irradiar la muestra (12), y la fluorescencia pasa a través de la sección de retención de fluido (44) para ser recibida por la lente de observación (31).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende:

un mecanismo de enfoque para ajustar una relación posicional relativa entre la lente de observación (31) y la muestra (12),

en donde

el mecanismo de enfoque cambia la relación posicional a lo largo de una primera dirección, que es paralela a un eje óptico de la lente de observación (31), y una segunda dirección y una tercera dirección, que definen la superficie de colocación (11).

3. El microscopio de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:

la lente de observación (31) es una lente de inmersión; y

la sección de retención de fluido (44) se llena con un líquido (45) correspondiente a la lente de inmersión.

4. El microscopio de acuerdo con la reivindicación 3, en donde:

la sección de retención de fluido (44) está llena de agua; y

la parte de colocación de la muestra (10) tiene un índice de refracción de 1,28 a 1,38.

5. El microscopio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,

en donde

el plano de observación y la superficie de colocación (11) forman un ángulo dentro de un intervalo de 1 grado a 75 grados.

6. El microscopio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde:

la unidad óptica (20) comprende una placa de superficie óptica que tiene una superficie sobre la cual se disponen uno o más elementos ópticos para generar la luz de hoja; y

la placa de superficie óptica está orientada de modo que la superficie de la placa de superficie óptica sea paralela al plano de observación.

7. El microscopio de acuerdo con la reivindicación 6, en donde:

el uno o más elementos ópticos comprenden una fuente de luz, un elemento convergente de luz y un elemento de distribución de luz; y

el uno o más elementos ópticos opcionalmente comprenden además un prisma de cuña.