ES2965286T3 - Silenciamiento de NANOS que abate las células germinales - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona animales de ganado y métodos para crear animales receptores para el trasplante de células madre espermatogoniales mediante la modulación del gen NANOS. En una realización, la edición del genoma se realiza para crear animales con inserciones o eliminaciones (indeles) que inactivan o modulan de otro modo la actividad del gen NANOS de modo que los machos resultantes carecen de células germinales funcionales pero conservan células somáticas funcionales, y las hembras son fértiles. Luego, estos machos pueden ser trasplantados con células madre espermatogoniales de donantes y utilizados para la reproducción. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Silenciamiento de NANOS que abate las células germinales

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con un ganado bovino y porcino editado genéticamente que comprende al menos una secuencia cromosómica editada que codifica una proteína NANOS2 (por sus siglas en inglés), en donde la secuencia editada se inactiva. Los métodos de la presente invención proporcionan genes NANOS2 modificados en bovinos y porcinos de modo tal que los machos carecen de células de la línea germinal mientras que las hembras son fértiles. Los machos resultantes están disponibles para el trasplante de células madre espermatogonias y su uso en programas de reproducción.

Antecedentes de la invención

La ganancia genética en ganadería se puede describir como la mejora de las características productivas de una población de generación en generación como resultado de la reproducción selectiva. Explotar este principio es un aspecto importante para que la producción de animales destinados a la alimentación potencie la eficiencia del crecimiento, la salud animal y la calidad del producto para el consumidor, al tiempo que reduce el impacto ambiental. En la producción ganadera, la mayor parte de la ganancia genética se obtiene mediante la reproducción selectiva de toros deseables. De este modo, ampliar la disponibilidad de esperma de sementales individuales puede impactar enormemente en la producción de animales destinados a la alimentación a escala mundial. La metodología de la inseminación artificial (AI, por sus siglas en inglés) se ha explotado en la ganadería comercial para mejorar las características de producción en todo el mundo. A pesar de los avances, el uso expansivo de jabalíes y toros de élite para la AI en la industria ganadera se ha visto obstaculizado por las limitaciones en el número absoluto de espermatozoides que se pueden recolectar de un individuo. En el caso de los jabalíes, los eyaculados se recolectan 1-2 veces por semana y una única eyaculación brinda ~20 dosis de AI. Cada cerda es inseminada 2-3 veces durante un mismo ciclo estral. De este modo, menos de 20 cerdas pueden ser fecundadas cada semana con esperma de un semental deseable. De este modo, enfoques novedosos para aumentar la producción y la disponibilidad de gametos de toros deseables y preservar la línea germinal son de necesidad significativa.

La espermatogénesis produce millones de espermatozoides al día y la base para un número tan vasto se proporciona por la acción de la población espermatogonial indiferenciada que contiene células madre espermatogoniales (SSC, por sus siglas en inglés). Una de las propiedades únicas de las SSC es su capacidad para colonizar el testículo de un animal receptor y regenerar la espermatogénesis tras el trasplante. La metodología de trasplante de SSC se ha desarrollado para modelos de roedores y la adaptación de este enfoque a los cerdos proporcionaría una herramienta de reproducción efectiva para expandir y preservar la línea germinal y el mérito genético de los sementales individuales. Los aspectos críticos para aplicar la metodología de trasplante de SSC son: 1) producción de animales receptores que carecen de una línea germinal endógena, pero poseen poblaciones de células de soporte intactas (es decir, células de Sertoli y de Leydig); 2) expansión de las relativamente escasas SSC de donadoresin vitropara generar un número óptimo que permita un trasplante satisfactorio en varios machos receptores; y 3) inyección de las SSC en los testículos receptores.

La eficiencia de la colonización de la SSC del donador está influida por el ambiente de los testículos receptores. La eliminación de las células germinales endógenas es fundamental para que las SSC del donador se puedan injertar en los túbulos seminíferos de los testículos del receptor. Además, la espermatogénesis se regula por la interacción íntima entre las células germinales y las poblaciones de células de soporte del testículo, incluidas las células de Sertoli y de Leydig. De este modo, la salud de las células somáticas en el momento del trasplante influye en el éxito de la colonización de las SSC del donador. En el caso de los roedores, el tratamiento de machos adultos con fármacos quimiotóxicos, en particular el agente alquilante busulfán, y la irradiación testicular localizada se han usado para preparar efectivamente a los receptores para el trasplante de SSC. Aunque ambos tratamientos resultan en el agotamiento de las células germinales endógenas y las SSC del donador son capaces de injertarse, la función de las células somáticas de soporte a menudo se ve impactada negativamente y siempre permanecen algunas células germinales endógenas, lo que lleva a la regeneración de una mezcla de espermatogénesis endógena y del donador. En ratones, el mayor éxito del trasplante de SSC consiste en usar receptores estériles debido a la inactivación de los genes necesarios para la supervivencia de las células germinales en las fases más tempranas de la espermatogénesis. El abatimiento parcial de la espermatogénesis en la cual persiste la población espermatogonial no es efectiva para preparar a los receptores. En tal caso, se deben seguir usando fármacos quimiotóxicos para eliminar la espermatogonia persistente y abrir así nichos para el injerto de las SSC del donador. Los machos en los cuales la supervivencia de las células germinales primordiales (PGC, por sus siglas en inglés), los gonocitos o las SSC está comprometida constituyen un receptor ideal.

En el caso de los cerdos y otros animales domésticos grandes, el tratamiento con fármacos quimiotóxicos para preparar machos receptores no es factible debido a la necesidad de una dosis elevada de fármacos para la eliminación completa de las células germinales. Estos tratamientos a menudo producen consecuencias no deseadas de toxicidad sobre las células madre de la médula ósea y otras células madre específicas de los tejidos. Adicionalmente, habría que recolectar las heces y la orina como residuos biopeligrosos. La irradiación testicular local es una alternativa potencial que supera las limitaciones del tratamiento con fármacos quimiotóxicos; sin embargo, la dosis de irradiación se debe controlar con precisión y el procedimiento provoca daños en las células de soporte, incluidas las células de Leydig, lo que afecta negativamente a la generación de espermatogénesis derivada del donador. Los receptores ideales son machos que carecen de una línea germinal endógena debido a una deficiencia genética que deja la población de células somáticas de soporte funcionalmente intacta.

Como se puede observar, existe una necesidad en la técnica de los animales en donde el macho no tiene células germinales pero mantiene las células somáticas funcionales y, de este modo, es apto para el trasplante de SSC, mientras que lo ideal es que las hembras sean fértiles.

Breve descripción de la invención

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones no cubiertas por dichas reivindicaciones no se consideran parte de la presente invención.

La presente divulgación proporciona animales y métodos para el trasplante de células madre espermatogonias al crear animales receptores que tienen modulada la expresión de NANOS. Los animales tienen inactivada o modulada de otro modo la actividad del gen NANOS, lo que resulta en machos que carecen de células germinales funcionales pero conservan células somáticas funcionales, y hembras que son fértiles. Estos animales se pueden crear usando cualquiera de un número de protocolos, tales como la tecnología de silenciamiento o la edición genética.

Se describe en la presente un animal de ganado genéticamente editado o modificado que comprende un genoma con inactivación de un gen NANOS selectivo para la función celular de la línea germinal.

En un aspecto, la invención proporciona un animal de ganado editado genéticamente que comprende al menos una secuencia cromosómica editada que codifica una proteína NANOS2, en donde la al menos una secuencia cromosómica editada se inactiva, y en donde el animal de ganado es bovino o porcino.

Una realización de la invención es un proceso de fabricación de un animal de ganado bovino o porcino que comprende introducir en una célula de animal de ganado o embrión de ganado un agente que se une específicamente a un sitio cromosómico objetivo de la célula y causa una rotura de ADN de hebra doble o inactiva de otro modo un gen NANOS2 en el mismo usando métodos de edición de genes, tales como el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas (CRISPR)/Cas (por sus siglas en inglés, respectivamente), nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN, por sus siglas en inglés), nucleasas de dedos de zinc (ZFN, por sus siglas en inglés), o proteínas de fusión de recombinasas.

Se describe en la presente un proceso para producir un donador de esperma masculino para la reproducción de ganado con un componente genético de células madre espermatogonias deseado que comprende: recolectar SSC de un donador masculino deseado, proliferar las SSCin vitro,y, a continuación, el trasplante de SSC del donador a un macho NANOS2 -/- para que se generen colonias espermatogénicas y persistan durante un largo periodo de tiempo con las células de la línea germinal del donador.

Se describe en la presente la producción de animales de ganado que comprende el apareamiento natural y/o la inseminación artificial del ganado hembra con esperma donador del macho receptor NANAOS2 -/-.

También se describe en la presente el uso de uno o máslocide NANOS particulares en tándem con un polipéptido capaz de efectuar la escisión y/o la integración de secuencias específicas de ácido nucleico dentro de loslocide NANOS. Los ejemplos del uso delocide NANOS en tándem con un polipéptido capaz de efectuar la escisión y/o la integración de loslocide NANOS incluyen un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en proteínas de dedos de zinc, meganucleasas, dominios TAL, TALEN, recombinasas de CRISPR/Cas guiadas por a Rn , cierres de leucina, y otras conocidas por los expertos en la técnica. Los ejemplos particulares incluyen una proteína quimérica (“fusión”) que comprende un polipéptido de dominio de unión al ADN específico del sitio y un polipéptido de dominio de escisión (por ejemplo, una nucleasa), tal como una proteína ZFN que comprende un polipéptido de dedos de zinc y un polipéptido de nucleasa FokI (por sus siglas en inglés). En ciertos aspectos, se describen en la presente polipéptidos que comprenden un dominio de unión al ADN que se une específicamente a un gen NANOS2. En algunas realizaciones, tal polipéptido también puede comprender un dominio o semidominio de nucleasa (escisión), (por ejemplo, una ZFN, una recombinasa, una transposasa o una endonucleasa de localización, incluida una endonucleasa de localización con un dominio de unión al ADN modificado, dominios TAL, TALEN, CRISPR/Cas guiada por ARN), y/o un dominio de ligasa, de modo tal que el polipéptido pueda inducir una rotura de hebra doble dirigida, y/o facilitar la recombinación de un ácido nucleico de interés en el sitio de la rotura. En realizaciones particulares, un dominio de unión a ADN que se dirige a unlocusde NANOS2 puede ser un dominio funcional de escisión de ADN. Los polipéptidos anteriores se pueden usar en algunas realizaciones para introducir un ácido nucleico exógeno en el genoma de un organismo huésped (por ejemplo, una especie animal) en uno o máslocide NANOS2. En ciertas realizaciones, los dominios de unión al ADN comprenden una proteína de dedos de zinc con uno o más dedos de zinc (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más dedos de zinc), que se modifica por ingeniería (de forma no natural) para unirse a cualquier secuencia dentro de un gen NANOS2. Cualquiera de las proteínas de dedos de zinc descritas en la presente se puede unir a un sitio objetivo dentro de la secuencia codificante del gen objetivo o dentro de secuencias adyacentes (por ejemplo, el promotor u otros elementos de expresión). En ciertas realizaciones, la proteína de dedos de zinc se une a un sitio objetivo en un gen NANOS2, por ejemplo, aproximadamente 20 bases en el exón 1.

Otras realizaciones se harán evidentes a partir de la descripción detallada de la invención a continuación.

Descripción de las figuras

La Figura 1 es una composición de una alineación de secuencias múltiples de genomas porcinos para identificar posibles polimorfismos de nucleótido único dentro del gen NANOS2 porcino (denotado por puntos rojos) que se podrían usar informativamente en el diseño de reactivos de edición del genoma.

La Figura 2 muestra los resultados de los productos de PCR (por sus siglas en inglés) digeridos en gel de agarosa para identificar los eventos NHEJ (por sus siglas en inglés). Se preparó ADN genómico a partir de células PK15 transfectadas con plásmidos que codifican los pares A, B o C de TALEN, y posteriormente se amplificó con los cebadores para PCR oSL9 y oSL10. Las faltas de concordancia se identificaron por la digestión con la enzima CELI (por sus siglas en inglés).

Las Figuras 3A, 3B y 3C muestran la secuencia de unión del ARN guía (SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16). La Figura 3C muestra el constructo con las guías, el promotor U6 humano, la secuencia de unión del ARNsg (ARN guía único) y la secuencia terminadora. Secuencia del promotor U6 (SEQ ID NO: 18), secuencia objetivo (SEQ ID NO: 19), andamio de ARNg (SEQ ID NO: 20), secuencia terminadora (S<e>Q ID NO: 21).

La Figura 4 muestra los productos de PCR digeridos en gel de agarosa de CRISPR/Cas9 porcino actuando sobre el ADN de las células PK15. Tres plásmidos que codifican la secuencia del ARNsg, una Cas9 impulsada por CAG y una eGFP (por sus siglas en inglés, respectivamente) impulsada por CMV (por sus siglas en inglés) respectivamente se cotransfectaron en las células PK15. La PCR se llevó a cabo en el ADN genómico resultante con los cebadores oSL9 y oSL10. Los productos de PCR digeridos se resolvieron en un gel de agarosa TAE (por sus siglas en inglés) al 2 %. Aunque ambas secuencias guía resultaron en el corte y la formación de NHEJ en el sitio objetivo (indicado por la presencia de productos de digestión de CELI, flechas rojas), sorprendentemente se descubrió que la secuencia del ARNsg en orientación antisentido con respecto a la secuencia codificante fue sustancialmente más eficiente que su homóloga en sentido.

La Figura 5A es un mapa del plásmido pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458). La Figura 5B muestra las anotaciones de la secuencia parcial pX458 (SEQ Id NO: 22); la secuencia de hU6 (SEQ iD NO: 23), la secuencia del ARNg (SEQ ID NO: 24), secuencia terminadora (SEQ ID NO: 25). Las Figuras 5C1-5C3 muestran la secuencia completa del constructo (SEQ ID NO: 43).

Las Figuras 6A y 6B son un gel de productos de PCR de ADN genómico postransfección y mostraron diferencias sustanciales en las eficiencias con las que los ARNsg fueron capaces de inducir la formación de NHEJ en su sitio objetivo como indica la presencia de productos de digestión de las endonucleasas T7 (flechas rojas).

La Figura 7 muestra las deleciones generadas por el uso de diferentes combinaciones de CRISPR. La foto es un gel de ADN genómico si los indels son amplificados con los cebadores oSL86 (SEQ ID NO: 64) y oSL87 (SEQ ID NO: 74) de las seis combinaciones de plásmidos.

La Figura 8 muestra las secuencias de los indels bovinos en comparación con el tipo silvestre (WT, por sus siglas en inglés).

pSL32 y pSL38: WT (SEQ ID NO: 117), CLON 1 (SEQ ID NO: 118); CLON 2 (SEQ ID NO: 119); CLON 3 (SEQ ID NO: 120); CLON 4 (SEQ ID NO: 121); CLON 5 (SEQ ID NO: 122).

pSL32 y pSL39: WT (SEQ ID NO: 123), CLON 1 (SEQ ID NO: 124); CLON 2 (SEQ ID NO: 125); CLON 3 (SEQ ID NO: 126); CLON 4 (SEQ ID NO: 127); CLON 5 (SEQ ID NO: 128).

pSL32 y pSL42 WT (SEQ ID NO: 129), CLON 1 (SEQ ID NO: 130); CLON 2 (SEQ ID NO: 131); CLON 3 (SEQ ID NO: 132); CLON 4 (SEQ ID NO: 133); CLON 5 (SEQ ID NO: 134).

pSL33 y pSL38 WT (SEQ ID NO: 135), CLON 1 (SEQ ID NO: 136); CLON 2 (SEQ ID NO: 137); CLON 3 (SEQ ID NO: 138); CLON 4 (SEQ ID NO: 139); CLON 5 (SEQ ID NO: 140).

pSL33 y pSL39 WT (SEQ ID NO: 141), CLON 1 (SEQ ID NO: 142); CLON 2 (SEQ ID NO: 143); CLON 3 (SEQ ID NO: 144); CLON 4 (SEQ ID NO: 145); CLON 5 (SEQ ID NO: 146).

pSL33 y pSL42 WT (SEQ ID NO: 147), CLON 1 (SEQ ID NO: 148); CLON 2 (SEQ ID NO: 149); CLON 3 (SEQ ID NO: 150); CLON 4 (SEQ ID NO: 151); CLON 5 (SEQ ID NO: 152).

La Figura 9 muestra el direccionamiento a genes mediado por CRISPR dellocusde NANOS2 en embriones porcinos. A) Esquema del promotor de CMV para la expresión en mamíferos, y T7 para la transcripciónin vitrodel vector de expresión Cas9:GFP:etiqueta HA, y NLS: señales de localización nuclear (por sus siglas en inglés, respectivamente) para la localización nuclear de la proteína nucleasa Cas9 expresada. Un casete de expresión de ARN guía único (ARNsg) quimérico impulsado por el promotor T7 que alberga el ARN guía y la secuencia de unión a Cas9. B) Esquema de Cas9, ARNsg mediado por la selección de la secuencia genómica deseada. C) Micrografía de fluorescencia de embriones porcinos de 1 célula, no inyectados (derecha) o inyectados (izquierda) con ARN de ambos casetes del panel A (Cas9:GFP y guía) en el día 2, confirmando la expresión de Cas9:GFP. En el inserto se muestran imágenes de campo claro de los embriones en desarrollo. D) Secuenciación de los embriones inyectados que muestra varios grados de indels, que a menudo son bialélicos. La secuencia de tipo silvestre se muestra en el carril superior con secuencias resaltadas que muestran la secuencia guía objetivo (amarillo) y el motivo PAM (AGG, verde) en orientación antisentido. NANOS2 (SEQ

ID NO: 29); N1-1 (SEQ ID NO: 30); N1-2 (SEQ ID NO: 31); N3-2 (SEQ ID NO: 32); N3-3 (SEQ ID NO: 33); N5-2 (SEQ ID

NO: 34); N5-3 (SEQ ID NO: 35); N6-1 (SEQ ID NO: 36); N7-2 (SEQ ID NO: 37); N7-3 (SEQ ID NO: 38); N10-2 (SEQ ID

NO: 39); N11-2 (SEQ ID NO: 40); N12-2 (SEQ ID NO: 41) N12-3 (SEQ ID NO: 42).

La Figura 10A muestra la secuenciación de embriones porcinos inyectados con dos ARNsg. Como se muestra en la figura, las inyecciones de dos ARNsg resultaron en la deleción de un gran segmento dellocusde NANOS2, y una inserción de secuencia extraña (rojo) en los alelos de NANOS2. NANOS (SEQ ID NO: 26); NN6-1 (SEQ ID NO: 27); NN7-1 y NN7-2

(SEQ ID NO: 28). La figura 10B muestra otra secuencia indel de blastocitos NANOS (SEQ ID NO: 44); N3-1-3 (SEQ ID

NO: 45); N3-2-3 (SEQ ID NO: 46); N3-6-2 (SEQ ID NO: 47); N3-7-3 (SEQ ID NO: 48); N3-8-3 (SEQ ID NO: 49); N3-10-2

(SEQ ID NO: 50); N3-12-2 (SEQ ID NO: 51); N3-12-3 (SEQ ID NO: 52).

La Figura 11 muestra el par (par de nickasas) de ARN guía únicos que se diseñan para dirigirse a hebras opuestas.

Ambos ARNsg se muestran en el recuadro de la figura, con la hebra antisentido resaltada en amarillo. Los motivos PAM

(por sus siglas en inglés) de ambos ARNsg se resaltan en verde. No se identificaron modificaciones en los alrededores del sitio objetivo. ARNsg1 (SEQ ID NO: 53); ARNsg2 (SEQ ID NO: 54); NANOS (SEQ ID NO: 55); N2-3 (SEQ ID NO: 56);

N3-1 (SEQ ID NO: 57); N4-2 (SEQ ID NO: 58); N5-2 (SEQ ID NO: 59); N6-3 (SEQ ID NO: 60); N7-1 (SEQ ID NO: 61).

La Figura 12 muestra la secuencia bovina de NANOS2 con las guías diseñadas y los cebadores de amplificación anotados. Secuencia completa de nucleótidos (SEQ ID NO: 62); NANOS 2 CDS (S<e>Q ID NO: 63); oSL86 (SEQ ID NO:

(SEQ ID NO: (SEQ ID NO:

La Figura 13 muestra el enfoque del sistema CRISPR/Cas para generar lechones silenciados mono- o bialélicos de NANOS2. La secuencia guía de 20 nucleótidos se subraya y el motivo PAM se resalta en amarillo (nota: la guía está en orientación antisentido). La secuencia objetivo CRISPR se subraya dentro del ORF (por sus siglas en inglés) de NANOS2.

Secuencia de ARN guía de CRISPR (SEQ ID NO: 160); ORF de NANOS2 (SEQ Id NO: 1 y 2); secuencia objetivo de CRISPR (SEQ ID NO: 161).

Las Figuras 14A y 14B muestran los genotipos de los lechones silenciados mono- o bialélicos de NANOS2 mediados por CRISPR/Cas. NANOS WT (SEQ ID NO: 163); NANOS cerdo 1-1 (SEQ ID NO: 164); NANOS cerdo 1-2 (SEQ ID NO: 165);

NANOS cerdo 1-3 (SEQ ID NO: 166); NANOS cerdo 2-1 (SEQ ID NO: 167); NANOS cerdo 2-4 (SEQ ID NO: 168); NANOS cerdo 3-1 (SEQ ID NO: 169); NANOS cerdo 4-1 (SEQ ID NO: 170); NANOS cerdo 4-2 (SEQ ID NO: 171); NANOS cerdo

10-1 (SEQ ID NO: 172); NANOS cerdo 10-2 (SEQ ID NO: 173); NANOS cerdo 11-1 (SEQ ID NO: 174); NANOS cerdo 11

4 (SEQ ID NO: 175); NANOS cerdo 12-1 (SEQ ID NO: 176); NANOS cerdo 12-2 (SEQ ID NO: 177); NANOS lechón #1

Alelo-1 (SEQ ID NO: 178); NANOS lechón #1 Alelo-2 (SEQ ID NO: 179); NANOS lechón #2 Alelo-1 (SEQ ID NO: 180);

NANOS lechón #2 Alelo-2 (SEQ ID NO: 181); NANOS lechón #3 Alelo-1 (SEQ ID NO: 182); NANOS lechón #3 Alelo-2

(SEQ ID NO: 183); NANOS lechón #4 Alelo-1 (SEQ ID NO: 184); NANOS lechón #4 Alelo-2 (SEQ ID NO: 185); NANOS lechón #5 Alelo-1 (SEQ ID NO: 186); NANOS lechón #5 Alelo-2 (SEQ ID NO: 187); NANOS lechón #6 Alelo-1 (SEQ ID

NO: 188); NANOS lechón #6 Alelo-2 (SEQ ID NO: 189); NANOS lechón #7 Alelo-1 (SEQ ID NO: 190); NANOS lechón #7 Alelo-2 (SEQ ID NO: 191); NANOS lechón #8 Alelo-1 (SEQ ID NO: 192); NANOS lechón #8 Alelo-2 (SEQ ID NO: 193);

NANOS lechón #9 Alelo-1 (SEQ ID NO: 194); NANOS lechón #9 Alelo-2 (SEQ ID NO: 195); NANOS lechón #10 Alelo-1

(SEQ ID NO: 196); NANOS lechón #10 Alelo-2 (SEQ ID NO: 197); NANOS lechón #11 Alelo-1 (SEQ ID NO: 198); NANOS lechón #11 Alelo-2 (SEQ ID NO: 199).

La Figura 15 muestra los genotipos de los lechones macho y hembra nulos para NANOS2 generados por SCNT (por sus siglas en inglés). En la figura, la secuencia guía de 20 nucleótidos dirigida a NANOS2 (SEQ ID NO: 162) aparece resaltada en verde y subrayada, seguida del motivo PAM de 3 nt (resaltado en azul). En los machos silenciados, ambos alelos tienen deleciones de 7 nt en el ORF de NANOS2 que causan la interrupción del gen NANOS2. En la hembra, un alelo tiene 1 nt de deleción y varias secuencias de nucleótidos alteradas, y el segundo alelo tiene 11 nt de deleción. Juntos, estos alelos hacen que las hembras sean nulas para NANOS2.

La Figura 16 muestra una imagen representativa de cortes transversales de biopsias testiculares de cerdos NANOS2 homocigotos silenciados a los 3 meses de edad. La imagen de la biopsia transversal se generó usando microscopía óptica y muestra los túbulos seminíferos intactos y la presencia de células somáticas de soporte. Además, la Figura 16 muestra la ausencia de múltiples capas de células germinales dentro de los túbulos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá ahora más detalladamente con referencia a los ejemplos que la acompañan. La invención se puede llevar a cabo de muchas formas diferentes y no se debe interpretar como limitada a las realizaciones expuestas en esta solicitud; más bien, estas realizaciones se proporcionan para que esta divulgación satisfaga los requisitos legales aplicables.

Aunque en la memoria descriptiva se emplean términos específicos, se usan únicamente en sentido genérico y descriptivo, y no con fines limitativos.

Las unidades, prefijos y símbolos se pueden indicar en su forma aceptada por el SI. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxilo, respectivamente. Los rangos numéricos mencionados en la memoria descriptiva incluyen los números que definen el rango e incluyen cada número entero dentro del rango definido. Los aminoácidos se pueden referir en la presente por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos, o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica ILTPAC-ILTB (por sus siglas en inglés). Del mismo modo, los nucleótidos se pueden referir por sus códigos de una letra comúnmente aceptados. A menos que se proporcione lo contrario, los términos de software, electricidad y electrónica usados en la presente son los definidos en The New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms (5a edición, 1993). Los términos que se definen a continuación se definen más detalladamente en la memoria descriptiva en su totalidad.

Por “amplificado” se entiende el constructo de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico o múltiples copias complementarias a la secuencia de ácido nucleico usando al menos una de las secuencias de ácido nucleico como molde. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el sistema de reacción en cadena de la ligasa (LCR, por sus siglas en inglés), la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA, por sus siglas en inglés, Cangene, Mississauga, Ontario), los sistemas de Replicasa Q-Beta, el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS, por sus siglas en inglés) y la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA, por sus siglas en inglés). Ver, por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, D. H. Persinget al.,Ed.,American Society for Microbiology,Washington, D. C. (1993). El producto de la amplificación se denomina amplicón.

El término “variantes modificadas de forma conservadora” se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias particulares de ácidos nucleicos, “variantes modificadas de forma conservadora” se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes idénticas o modificadas de forma conservadora de las secuencias de aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican una proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. De este modo, en cada posición en donde una alanina se especifica por un codón, éste se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones del ácido nucleico son “variaciones silenciosas” y representan una especie de variación modificada de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente presente que codifica un polipéptido también, por referencia al código genético, describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico.

Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para la metionina; y UGG, que es normalmente el único codón para el triptófano) se puede modificar para brindar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención está implícita en cada secuencia polipeptídica descrita y se encuentra dentro del alcance de la presente invención.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, adiciona o suprime un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una “variante modificada de forma conservadora” en donde la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. De este modo, cualquier número de residuos de aminoácidos seleccionados entre el grupo de números enteros de 1 a 15 se puede alterar. De este modo, por ejemplo, se pueden realizar 1, 2, 3, 4, 5, 7 o 10 alteraciones.

Las variantes modificadas de forma conservadora típicamente proporcionan una actividad biológica similar a la secuencia polipeptídica no modificada de la que se derivan. Por ejemplo, la especificidad de sustrato, la actividad enzimática o la unión a ligando/receptor es generalmente de al menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de la proteína nativa para su sustrato nativo. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica.

Cada uno de los seis grupos siguientes contiene aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: [1] Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); [2] Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); [3] Asparagina (N), Glutamina (Q); [4] Arginina (<r>), Lisina (K); [5] Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y [6] Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W). Ver también, Creighton (1984) ProteinsW. H. Freeman and Company.

Por “codificación” o “codificado”, con respecto a un ácido nucleico especificado, se entiende que comprende la información para la traducción en la proteína especificada. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias intermedias (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de tales secuencias intermedias no traducidas (por ejemplo, como en el ADNc). La información con la que se codifica una proteína se especifica por el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos se codifica por el ácido nucleico usando el código genético “universal”. Cuando el ácido nucleico se prepara o altera sintéticamente, se pueden aprovechar las preferencias de codones conocidas del huésped contemplado en donde se va a expresar el ácido nucleico.

Como se usa en la presente, “secuencia de longitud completa” en referencia a un polinucleótido especificado o a su proteína codificada significa tener la secuencia completa de aminoácidos de una forma nativa (no sintética), endógena y biológicamente activa de la proteína especificada. Los métodos para determinar si una secuencia es de longitud completa son bien conocidos en la técnica, incluyendo técnicas ejemplares como transferencias tipo Northern o Western, extensión de cebadores, protección S1 y protección de ribonucleasas. La comparación con secuencias homólogas (ortólogas y/o parálogas) de longitud completa conocidas también se puede usar para identificar secuencias de longitud completa de la presente invención. Adicionalmente, las secuencias de consenso presentes en las regiones no traducidas en 5' y 3' del ARNm ayudan a identificar un polinucleótido como de longitud completa. Por ejemplo, la secuencia consenso ANNNNAUGG, en donde el codón subrayado representa la metionina N-terminal, ayuda a determinar si el polinucleótido tiene un extremo 5' completo. Las secuencias de consenso en el extremo 3', como las secuencias de poliadenilación, ayudan a determinar si el polinucleótido tiene un extremo 3' completo.

Como se usa en la presente, “heterólogo” en referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que procede de una especie extraña o, si procede de la misma especie, se modifica sustancialmente con respecto a su forma nativa en composición y/olocusgenómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor enlazado operativamente a un gen estructural heterólogo procede de una especie diferente de aquella de la que se derivó el gen estructural o, si procede de la misma especie, uno o ambos se modifican sustancialmente con respecto a su forma original. Una proteína heteróloga puede proceder de una especie extraña o, si procede de la misma especie, se modifica sustancialmente con respecto a su forma original por intervención humana deliberada.

Por “célula huésped” se entiende una célula que contiene un vector y lleva a cabo la replicación y/o expresión del vector. Las células huésped pueden ser procariotas, tales comoE. coli,o eucariotas, como levaduras, insectos, anfibios o mamíferos.

El término “complejo de hibridación” incluye la referencia a una estructura de ácido nucleico dúplex formada por dos secuencias de ácido nucleico de hebra única, hibridadas selectivamente entre sí.

El término “ introducido” en el contexto de la inserción de un ácido nucleico en una célula equivale a “transfección” o “transformación” o “transducción”, e incluye una referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, en donde el ácido nucleico se puede incorporar al genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial), convertir en un replicón autónomo o expresar transitoriamente (por ejemplo, ARNm transfectado).

El término “aislado” se refiere a un material, tal como un ácido nucleico o una proteína, que está: (1) sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan o interactúan con él como se encuentra en su ambiente natural -el material aislado comprende opcionalmente material que no se encuentra con el material en su ambiente natural-; o (2) si el material se encuentra en su ambiente natural, el material ha sido alterado sintéticamente por intervención humana deliberada a una composición y/o colocado en un lugar de la célula (por ejemplo, genoma u orgánulo subcelular) no nativo de ese material. La alteración para obtener el material sintético se puede realizar en el material interior o extraer de su estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico natural se convierte en un ácido nucleico aislado si se altera, o si se transcribe a partir de ADN que ha sido alterado, por medio de la intervención humana realizada dentro de la célula de la que se origina. Ver, por ejemplo, Compounds and Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, patente de EE. UU. No. 5,565,350;In VivoHomologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarlinget al.,PCT/US93/03868. De la misma manera, un ácido nucleico natural (por ejemplo, un promotor) se aísla si se introduce por medios no naturales en unlocusdel genoma no nativo de ese ácido nucleico. Los ácidos nucleicos “aislados”, como se definen en la presente, también se denominan ácidos nucleicos “heterólogos”.

Como se usa en la presente, “ localizado dentro de la región cromosómica definida por e incluyendo” con respecto a marcadores particulares incluye referencia a una longitud contigua de un cromosoma delimitado por e incluyendo los marcadores indicados.

Como se usa en la presente, “marcador” incluye la referencia a unlocusen un cromosoma que sirve para identificar una posición única en el cromosoma. Un “marcador polimórfico” incluye la referencia a un marcador que aparece en múltiples formas (alelos) de modo tal que diferentes formas del marcador, cuando están presentes en un par homólogo, permiten seguir la transmisión de cada uno de los cromosomas de ese par. Un genotipo se puede definir por el uso de uno o varios marcadores.

Como se usa en la presente, “mutación” hace referencia a alteraciones en la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, como por ejemplo, un gen o una secuencia de ADN codificante (CDS, por sus siglas en inglés), en comparación con la secuencia de tipo silvestre. El término incluye, sin limitación, sustituciones, inserciones, cambios de marco, deleciones, inversiones, translocaciones, duplicaciones, mutaciones del sitio donador de empalme, mutaciones puntuales, o similares.

Como se usa en la presente, el término “ácido nucleico” hace referencia a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma de hebra única o de hebra doble y, a menos que se indique lo contrario, engloba las variantes modificadas de forma conservadora y los análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en el sentido de que se hibridan con los ácidos nucleicos de hebra única de manera similar a los nucleótidos naturales (por ejemplo, los ácidos nucleicos peptídicos).

Por “biblioteca de ácidos nucleicos” se entiende una colección de moléculas aisladas de ADN o ARN que comprenden y representan sustancialmente toda la fracción transcrita de un genoma de un organismo específico. el constructo de bibliotecas de ácidos nucleicos ejemplares, como bibliotecas genómicas y de ADNc, se enseña en referencias estándar de biología molecular como Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol.

152,Academic Press, Inc.,San Diego, CA (Berger); Sambrooket al.,Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2° ed., Vol.

1-3 (1989); y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubelet al.,Eds., Current Protocols, una empresa conjunta entreGreene Publishing Associates, Inc.yJohn Wiley and Sons, Inc.(1994).

Como se usa en la presente, “enlazado operativamente” incluye una referencia a un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, enlazado operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico enlazadas son contiguas y, en caso necesario, unen dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura.

Como se usa en la presente, el término “polinucleótido” hace referencia a un desoxirribopolinucleótido, ribopolinucleótido o variantes modificadas de forma conservadora; el término también se puede referir a análogos de los mismos que tienen la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural en el sentido de que se hibridan, bajo condiciones de hibridación estrictas, a una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a la de los nucleótidos naturales y/o permiten la traducción a los mismos aminoácidos que los nucleótidos naturales. Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen estructural o regulador nativo o heterólogo. A menos que se indique lo contrario, el término incluye una referencia a la secuencia especificada, así como a su secuencia complementaria. Por lo tanto, los ADN o ARN con cadenas principales modificadas para lograr estabilidad o por otras razones son “polinucleótidos” en el sentido que se da a este término en la presente. Asimismo, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como la inosina, o bases modificadas, tales como las bases tritiladas, por citar sólo dos ejemplos, son polinucleótidos como se usa este término en la presente. Se apreciará que se ha hecho una gran variedad de modificaciones al ADN y ARN que sirven para muchos propósitos útiles conocidos por los expertos en la técnica.

El término polinucleótido, como se emplea en la presente, abarca tales formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente, así como las formas químicas de ADN y ARN características de los virus y las células, incluidas, entre otras, las células simples y complejas.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan en la presente indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos también se pueden aplicar a variantes modificadas de forma conservadora y a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales. La naturaleza esencial de tales análogos de aminoácidos naturales es que, cuando se incorporan a una proteína, ésta es específicamente reactiva a los anticuerpos provocados por la misma proteína pero que consiste en su totalidad por aminoácidos naturales. Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” también incluyen modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, la glucosilación, la unión a lípidos, la sulfatación, la gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, la hidroxilación y la ADP-ribosilación. Se apreciará, como es bien sabido y como se ha señalado anteriormente, que los polipéptidos no siempre son totalmente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de la ubiquitización, y pueden ser circulares, con o sin ramificación, generalmente como resultado de eventos posteriores a la traducción, incluyendo eventos naturales de procesamiento y eventos provocados por la manipulación humana que no ocurren naturalmente. Los polipéptidos circulares, ramificados, y ramificados circulares se pueden sintetizar por procesos naturales sin traducción y también por métodos totalmente sintéticos. Además, esta invención contempla el uso tanto de las variantes con metionina como de las variantes sin metionina amino terminal de la proteína de la invención.

Como se usa en la presente, “promotor” hace referencia a una región de ADN situada antes del inicio de la transcripción e involucrada en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Los ejemplos de promotores bajo control del desarrollo incluyen promotores que inician preferentemente la transcripción en ciertos tejidos, tales como testículos, ovarios o placenta. Tales promotores son referidos como “preferidos por los tejidos”. Los promotores que inician la transcripción solamente en ciertos tejidos son referidos como “específicos de tejido”. Un promotor específico de “tipo celular” impulsa principalmente la expresión en ciertos tipos celulares de uno o varios órganos, por ejemplo, las células germinales de los testículos o los ovarios. Un promotor “ inducible” o “reprimible” es un promotor que está bajo control ambiental. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripción por promotores inducibles son el estrés y la temperatura. Los promotores específicos de tejido, preferidos por tejido, específicos de tipo celular e inducibles constituyen la clase de promotores “no constitutivos”. Un promotor “constitutivo” es un promotor activo en la mayoría de las condiciones ambientales.

Como se usa en la presente, “recombinante” incluye la referencia a una célula o vector que ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o que la célula deriva de una célula modificada de esta manera. De este modo, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en forma idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otro modo se expresan anormalmente, se subexpresan o no se expresan en absoluto como resultado de la intervención humana deliberada. El término “recombinante”, como se usa en la presente, no abarca la alteración de la célula o el vector por acontecimientos que ocurren naturalmente (por ejemplo, mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural), como los que se producen sin intervención humana deliberada.

Como se usa en la presente, un “casete de expresión recombinante” es un constructo de ácido nucleico, generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula huésped. El casete de expresión recombinante se puede incorporar a un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN plastidial, virus, o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, un ácido nucleico a transcribir y un promotor.

Los términos “residuo” o “residuo de aminoácido” o “aminoácido” se usan indistintamente en la presente para referirse a un aminoácido que se incorpora a una proteína, polipéptido o péptido (colectivamente “proteína”). El aminoácido puede ser un aminoácido natural y, a menos que se limite de otro modo, puede abarcar análogos no naturales de aminoácidos naturales que pueden funcionar de manera similar a los aminoácidos naturales.

El término “se hibrida selectivamente” incluye la referencia a la hibridación, bajo condiciones de hibridación estrictas, de una secuencia de ácido nucleico con otra secuencia de ácido nucleico u otros biológicos. Cuando se usa un sistema de detección basado en la hibridación, se elige una sonda de ácido nucleico que sea complementaria a una secuencia de ácido nucleico de referencia y, a continuación, por la selección de las condiciones adecuadas, la sonda y la secuencia de referencia se hibridan o se unen selectivamente entre sí para formar una molécula dúplex.

El término “condiciones estrictas” o “condiciones estrictas de hibridación” hace referencia a las condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará con su secuencia objetivo en un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces por encima del fondo). Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán distintas en circunstancias diferentes. Al controlar la exigencia de la hibridación y/o las condiciones de lavado, se pueden identificar secuencias objetivo 100 % complementarias a la sonda (sondeo homólogo).

Alternativamente, las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para permitir cierta falta de concordancia en las secuencias, de modo tal que se detecten grados de similitud más bajos (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, opcionalmente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones estrictas serán aquellas en las cuales la concentración de sal sea menor a aproximadamente 1,5 M del ion Na, típicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración del ion Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayores a 50 nucleótidos). También se pueden conseguir condiciones más estrictas al adicionar agentes desestabilizadores, tal como la formamida. La especificidad típicamente está en función de los lavados posteriores a la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN/ADN, el punto de fusión térmica (Tm, por sus siglas en inglés) se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth and Wahl,Anal. Biochem.,138: 267-284 (1984): Tm [°C] = 81,5 16,6 (log M) 0,41(% GC) - 0,61 (% forma) - 500/L; en donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % Ge es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (con una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de una secuencia objetivo complementaria se hibrida con una sonda perfectamente adaptada. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de faltas de coincidencia; de este modo, la Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con > 90 % de identidad, la Tm se puede disminuir 10 °C. Generalmente, las condiciones estrictas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que la Tm para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente estrictas pueden usar una hibridación y/o lavado de 1 a 4 °C por debajo de la Tm; las condiciones moderadamente estrictas pueden usar una hibridación y/o lavado de 6 a 10 °C por debajo de la Tm; las condiciones poco estrictas pueden usar una hibridación y/o lavado de 11 a 20 °C por debajo de la Tm. Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, los expertos comprenderán que las variaciones en la exigencia de las soluciones de hibridación y/o lavado se describen inherentemente. Una extensa guía sobre la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”,Elsevier,Nueva York (1993); y Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel,et al.,Eds.,Greene PublishingyWiley-Interscience,New York (1995).

Como se usa en la presente, “animal, célula o tejido transgénico” hace referencia a un animal que incluye en su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo se integra de forma estable en el genoma, de modo tal que el polinucleótido se transmite a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo se puede integrar en el genoma solo o como parte de un casete de expresión recombinante. “Transgénico” se usa en la presente para incluir cualquier célula, línea celular, tejido u órgano, cuyo genotipo haya sido alterado por la presencia de un ácido nucleico heterólogo, incluidos los transgénicos inicialmente alterados, así como los creados por cruces sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término “transgénico”, como se usa en la presente, no incluye la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos de reproducción convencionales o por acontecimientos naturales, tales como la fecundación cruzada aleatoria, la infección vírica no recombinante, la transformación bacteriana no recombinante, la transposición no recombinante o la mutación espontánea.

Como se usa en la presente, “vector” incluye una referencia a un ácido nucleico usado en la transfección de una célula huésped y en donde se puede insertar un polinucleótido. Los vectores a menudo son replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado en los mismos.

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre un polinucleótido/polipéptido de la presente invención con un polinucleótido/polipéptido de referencia: (a) “secuencia de referencia”, (b) “ventana de comparación”, (c) “ identidad de secuencia”, y (d) “porcentaje de identidad de secuencia”.

(a) Como se usa en la presente, “secuencia de referencia” es una secuencia definida usada como base para la comparación de secuencias con un polinucleótido/polipéptido de la presente invención. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de una secuencia completa de ADNc o de un gen, o la secuencia completa de ADNc o de un gen.

(b) Como se usa en la presente, “ventana de comparación” incluye la referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia polinucleotídica/polipeptídica, en donde la secuencia polinucleotídica/polipeptídica se puede comparar con una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia polinucleotídica/polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos/aminoácidos contiguos, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o más. Los expertos en la técnica entienden que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de huecos en la secuencia polinucleotídica/polipeptídica, típicamente se introduce una penalización por hueco que se resta del número de coincidencias.

Los métodos de alineación de secuencias para su comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para su comparación se puede realizar por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman,Adv. Appl. Math.2: 482(1981); por el algoritmo de alineación de homología de Needleman and Wunsch,J. Mol. Biol.48: 443 (1970); por el método de búsqueda de similitudes de Pearson and Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci.85: 2444 (1988); y por implementaciones informáticas de estos algoritmos, que incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL (por sus siglas en inglés) en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA (por sus siglas en inglés, respectivamente), y programas afines en el GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versión 10 (disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, EE. UU.). El programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins and Sharp,Gene73: 237-244 (1988); Higgins y Sharp,CABIOS5: 151-153 (1989); Corpet,et al., Nucleic Acids Research16: 10881-90 (1988); Huang,et al., Computer Applications in the Biosciences8: 155-65 (1992), y Pearson,et al., Methods in Molecular Biology24: 307-331 (1994).

La familia de programas BLAST que se puede usar para búsquedas de similitudes en bases de datos incluye: BLASTN para secuencias de consulta de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de nucleótidos; BLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de proteínas; BLASTP para secuencias de consulta de proteínas contra secuencias de bases de datos de proteínas; TBLASTN para secuencias de consulta de proteínas contra secuencias de bases de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de nucleótidos. Ver, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel,et al.,Eds.,Greene PublishingyWiley-Interscience,New York (1995); Altschulet al., J. Mol. Biol.,215: 403-410 (1990); y Altschulet al., Nucleic Acids Res.25: 3389-3402 (1997). Los programas informáticos para realizar análisis BLAST están a disposición del público, por ejemplo, a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information, ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo se ha descrito exhaustivamente en varias publicaciones. Ver, por ejemplo, Altschul SFet al.,Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, 25Nucleic Acids Res.3389 (1997);National Center for Biotechnology Information,TheNcbi Handbook [Internet], Chapter 16: The BLAST Sequence Analysis Tool (McEntyre J, Ostell J, eds., 2002), disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21097Ipdflch16.pdf. El programa BLASTP para secuencias de aminoácidos también se ha descrito con detalle (ver Henikoff and Henikoff (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:10915).

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin and Altschul,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 5873-5877 (1993)). Se pueden emplear varios programas de filtrado de baja complejidad para reducir estos alineamientos de baja complejidad. Por ejemplo, los filtros de baja complejidad SEG (por sus siglas en inglés, Wooten and Federhen,Comput. Chem.,17: 149-163 (1993)) y XNU (Claverie and States,Comput. Chem.,17: 191-201 (1993)) se pueden emplear solos o combinados.

A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de nucleótidos y proteínas que se proporcionan en la presente se calculan usando GAP (GCG Versión 10) con los valores predeterminados. También se puede usar GAP (Programa de Alineación Global, Global Alignment Program) para comparar un polinucleótido o polipéptido de la presente invención con una secuencia de referencia. GAP usa el algoritmo de Needleman and Wunsch(J. Mol. Biol.48: 443 453,1970) para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximice el número de coincidencias y minimice el número de huecos. GAP representa un miembro de la familia de las mejores alineaciones. Puede que haya muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP muestra cuatro figuras de mérito para las alineaciones: calidad, relación, identidad y similitud. La calidad es la métrica maximizada para alinear las secuencias. La relación es la calidad dividida por el número de bases del segmento más corto. El porcentaje de identidad es el porcentaje de símbolos que realmente coinciden. El porcentaje de similitud es el porcentaje de símbolos que son similares. Se ignoran los símbolos que están al otro lado de los huecos. Se puntúa una similitud cuando el valor de la matriz de puntuación de un par de símbolos es mayor o igual a 0,50, el umbral de similitud. La matriz de puntuación usada en la versión 10 del paquete informático Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (ver Henikoff and Henikoff (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 10915).

La alineación múltiple de las secuencias se puede realizar usando el método CLUSTAL de alineación (Higgins and Sharp (1989)Cabios.5: 151-153) con los parámetros predeterminados (GAP PENALTY (penalización por hueco) = 10, GAP LENGTH PENALTY (penalización de longitud de huecos) = 10). Los parámetros por defecto para alineaciones por pares usando el método CLUSTAL incluyen K-TUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW (ventana) = 5 y DIAGONALS SAVED (diagonales guardadas) = 5.

(c) Como se usa en la presente, “ identidad de secuencia” o “ identidad” en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido incluye la referencia a los residuos de las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para obtener la máxima correspondencia en una ventana de comparación especificada. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a las proteínas, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos, en donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustar positivamente para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por este tipo de sustituciones conservadoras tienen “similitud de secuencia” o “similitud”. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Típicamente, esto implica puntuar una sustitución conservadora como una falta de concordancia parcial en lugar de total, aumentando así el porcentaje de identidad de secuencia. De este modo, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico recibe una puntuación de 1 y una sustitución no conservadora recibe una puntuación de cero, una sustitución conservadora recibe una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservadoras se puede calcular de acuerdo con el algoritmo de Meyers and Miller,Computer Applic. Biol. Sci.,4: 11-17 (1988), por ejemplo, como se implementa en el programa PC/Gene (Intelligenetics, Mountain View, California, EE. UU.).

(d) Como se usa en la presente, “porcentaje de identidad de secuencia” significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en el cual la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idénticos aparecen en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

Como se usa en la presente, “edición genética”, “gen editado” “editado genéticamente” y “efectores de edición genética” se refieren al uso de nucleasas de origen natural o de modificadas por ingeniería artificial, también referidas como “tijeras moleculares” Las nucleasas crean roturas específicas de hebra doble (DSB, por sus siglas en inglés) en lugares deseados del genoma, lo que en algunos casos aprovecha los mecanismos endógenos de la célula para reparar la rotura inducida por procesos naturales de recombinación homóloga (HR, por sus siglas en inglés) y/o unión de extremos no homólogos (NHEJ). Entre los efectores de edición genética se encuentran las nucleasas de dedos de zinc (ZFN), las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN), el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas/CAS9 (CRISPR/Cas9) y las meganucleasas re-modificadas por ingeniería como endonucleasas homing (por su nombre en inglés). Los términos también incluyen el uso de procedimientos y técnicas transgénicas, incluyendo, por ejemplo, cuando el cambio es relativamente pequeño y/o no introduce ADN de una especie extraña. Los términos “manipulación genética” y “manipulado genéticamente” incluyen las técnicas de edición de genes, así como y/o además de otras técnicas y procesos que alteran o modifican la secuencia de nucleótidos de un gen o genes, o modifican o alteran la expresión de un gen o genes.

Como se usa en la presente, la “tecnología de ADN homing” o “tecnología homing” abarca cualquier mecanismo que permita dirigir una molécula específica a una secuencia de ADN específica, incluidas las proteínas de dedos de zinc (ZF), las meganucleasas activadoras de la transcripción (TALE) y el sistema CRISPR/Cas9.

El término “animal de ganado” incluye los animales criados tradicionalmente en explotaciones ganaderas, tales como el ganado vacuno para carne, el ganado vacuno lechero, los cerdos, las ovejas, las cabras, los caballos, las mulas, los asnos, los búfalos y los camellos. El término también incluye las aves criadas comercialmente para carne o huevos (es decir, pollos, pavos, patos, gansos, gallinas de Guinea y pichones). Esto no incluye ratas, ratones u otros roedores.

Como se usa en la presente, por “blastocisto” se entiende una fase temprana del desarrollo embrionario que comprende una masa celular interna (de la que surge el embrión propiamente dicho) y una cavidad llena de líquido, rodeada típicamente por una única capa de células trofoblásticas. “Developmental Biology”, 6° ed, ed. por Scott F. Gilbert,Sinauer Associates, Inc. Publishers,Sunderland, Mass. (2000)

Como se usa en la presente, “silenciamiento condicional” o “mutación condicional” significa que el silenciamiento o la mutación se consigue cuando se cumplen ciertas condiciones. Estas condiciones incluyen, pero no se limitan a, la presencia de ciertos agentes inductores, recombinasas, antibióticos y ciertos niveles de temperatura o sal.

Por “embrión en fase inicial” se entiende cualquier embrión en las fases embrionarias comprendidas entre el óvulo fecundado y el blastocisto. Típicamente, los embriones en etapa de ocho células y en etapa de mórula son referidos como embriones en etapa temprana.

Por “células germinales embrionarias” o “células EG (por sus siglas en inglés)” se entienden las células derivadas de células germinales primordiales que tienen el potencial de diferenciarse en todos los tipos celulares del cuerpo y son tan susceptibles de modificación genética como las células madre embrionarias, hasta el punto de que a veces se ignora la distinción entre células EG y células ES (por sus siglas en inglés). “Developmental Biology”, 6° ed, ed. por Scott F. Gilbert,Sinauer Associates, Inc. Publishers,Sunderland, Mass. (2000).

Por “Células madre embrionarias” o “células ES” se entienden las células cultivadas derivadas de la masa celular interna de embriones en etapas tempranos, que son susceptibles de modificación genética y que conservan su totipotencia y pueden contribuir a todos los órganos del animal quimérico resultante si se inyectan en el embrión huésped. “Developmental Biology”, 6° ed, ed. por Scott F. Gilbert,Sinauer Associates, Inc. Publishers,Sunderland, Mass. (2000).

Como se usa en la presente, se entiende por “fecundación” como la unión de gametos masculinos y femeninos durante la reproducción que resulta en la formación de un cigoto, la fase de desarrollo más temprana de un embrión. Por “célula extraña” se entiende cualquier célula que se pueda editar genéticamente o que se pueda derivar de una célula editada genéticamente y que pueda contribuir a la línea germinal de un embrión quimérico cuando se inyecta o agrega a un blastocisto/embrión donador. Esto incluye, pero no se limita a, las células madre embrionarias (ES), las células madre de teratocarcinoma, las células germinales primordiales y las células germinales embrionarias (EG).

Por la frase “editado genéticamente” se entiende los animales o embriones o células que presentan una modificación genética deseada, como una mutación o mutaciones de silenciamiento, de desbloqueo, condicional, inducible, transitoria o puntual de cualquier gen o de su mecanismo regulador, o un transgénico con un gen o genes extraños o modificados o secuencias reguladoras, o que haya sufrido una modificación genómica de cualquier forma, que incluye, pero no se limita a, la recombinación, la supresión cromosómica, la adición, la translocación, la reordenación o la adición, deleción o modificación de ácido nucleico, proteína o cualquier otra molécula u orgánulo natural o sintético, o la transferencia citoplasmática o nuclear, que lleve a cambios heredables.

Por “desarrollo de células germinales” se entiende el proceso por el que ciertas células del embrión en fase inicial de desarrollo se diferencian en células germinales primordiales.

Por “migración de células germinales” se entiende un proceso por el cual las células germinales primordiales, tras originarse en el mesodermo extraembrionario, se desplazan hacia atrás en el embrión a través de la alantoides (precursora del cordón umbilical) y continúan migrando a través del saco vitelino adyacente, el intestino posterior y el mesenterio dorsal para alcanzar finalmente la cresta genital (gónada en desarrollo). “Developmental Biology”, 6° edición, ed. por Scott F. Gilbert,Sinauer Associates, Inc., Publishers,Sunderland, Mass. (2000).

Por “célula de la línea germinal” se entiende cualquier célula, en cualquier fase de diferenciación hacia gametos maduros, incluidos los gametos maduros.

Como se usa en la presente, el término “desbloqueo” significa la sustitución de un gen endógeno por un transgén o por el mismo gen endógeno con algunas modificaciones estructurales, pero conservando el control transcripcional del gen endógeno.

Por “silenciamiento” se entiende una alteración de la estructura o del mecanismo regulador de un gen. Los silenciamientos se pueden generar a través de la recombinación homóloga de vectores objetivo, vectores de sustitución o vectores de “golpear y ejecutar” o la inserción aleatoria de un vector trampa de genes que provoque la pérdida completa, parcial o condicional de la función genética. Por “ovogénesis” se entiende el proceso de generación de óvulos maduros a partir de las células germinales primordiales en las hembras.

Por “células germinales primordiales” se entiende aquellas células que surgen en una fase temprana del desarrollo embrionario y que dan lugar al linaje espermatogénico mediante un intermediario gonocito o a la línea germinal femenina a través de un intermediario ovogonio.

Por “espermatogénesis” se entiende un proceso de generación de espermatozoides maduros a partir de células madre espermatogonias en los machos.

Por “tipo silvestre” se entienden los animales y blastocistos, embriones o células derivados de los mismos, que no han sido editados genéticamente y que usualmente son cepas endogámicas y exogámicas desarrolladas a partir de cepas naturales. Una “proteína de unión” es una proteína capaz de unirse a otra molécula. Una proteína de unión se puede unir, por ejemplo, a una molécula de ADN (una proteína de unión a ADN), a una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o a una molécula de proteína (una proteína de unión a proteína). En el caso de una proteína de unión a proteínas, se puede unir a sí misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o se puede unir a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes. Una proteína de unión puede tener más de un tipo de actividad de unión. Por ejemplo, las proteínas de dedos de zinc tienen actividad de unión al ADN, al ARN y a proteínas.

Una “proteína de unión al ADN con dedos de zinc” (o dominio de unión) es una proteína, o un dominio dentro de una proteína más grande, que se une al ADN de una manera específica a la secuencia a través de uno o más dedos de zinc, que son regiones de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión cuya estructura se estabiliza a través de la coordinación de un ion de zinc. El proteína de unión al ADN con dedos de zinc se abrevia a menudo como proteína de dedos de zinc o ZFP.

Un “dominio de unión al ADN TALE” o “TALE” es un polipéptido que comprende uno o más dominios/unidades de repetición TALE. Los dominios de repetición participan en la unión de la TALE a su secuencia de ADN objetivo. Una única “unidad de repetición” (también referida como “repetición”) típicamente tiene una longitud de 33-35 aminoácidos y presenta al menos cierta homología de secuencia con otras secuencias de repetición TALE dentro de una proteína TALE natural.

Los dominios de unión a dedos de zinc y TALE se pueden “modificar por ingeniería” para que se unan a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo, mediante modificaciones por ingeniería (alterando uno o más aminoácidos) de la región de la hélice de reconocimiento de las proteínas naturales dedos de zinc o TALE. Por lo tanto, las proteínas modificadas por ingeniería de unión al ADN (dedos de zinc o TALE) son proteínas que no se producen naturalmente. Los ejemplos no limitantes de métodos de modificación por ingeniería de proteínas de unión al ADN son el diseño y la selección. Una proteína de unión al ADN diseñada es una proteína que no se encuentra en la naturaleza y cuyo diseño/composición resulta principalmente a criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar la información de una base de datos que almacena información de diseños ZFP y/o TALE existentes y datos de unión. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. No.

6,140,081; 6,453,242; y 6,534,261; ver también WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496 y la publicación de EE. UU. No. 20110301073.

Una proteína de dedo de zinc o TALE “seleccionada” es una proteína que no se encuentra en la naturaleza y cuya producción resulta principalmente de un proceso empírico como la visualización de fagos, la trampa de interacción o la selección de híbridos. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 5,789,538; la patente de EE. UU. No. 5,925,523; la patente de EE. UU. No. 6,007,988; la patente de EE. UU. No. 6,013,453; la patente de EE. UU. No. 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197, WO 02/099084 y la publicación de EE. UU. No. 20110301073.

Por “escisión” se entiende la rotura de la cadena principal covalente de una molécula de ADN. La escisión se puede iniciar por una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, la hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Tanto la escisión de hebra única como la de hebra doble son posibles, y la de hebra doble puede ocurrir como resultado de dos eventos de escisión de hebra únicas distintas. La escisión del ADN puede resultar en extremos romos o escalonados. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de fusión se usan para la escisión selectiva de ADN de hebra doble.

Un “semidominio de escisión” es una secuencia polipeptídica que, junto con un segundo polipéptido (idéntico o diferente), forma un complejo con actividad de escisión (preferiblemente actividad de escisión de hebra doble). Los términos “primer y segundo semidominios de escisión”, “semidominios de escisión y -” y “semidominios de escisión derecho e izquierdo” se usan indistintamente para referirse a pares de semidominios de escisión que se dimerizan.

Un “semidominio de escisión modificado por ingeniería” es un semidominio de escisión que ha sido modificado para formar heterodímeros obligatorios con otro semidominio de escisión (por ejemplo, otro semidominio de escisión modificado por ingeniería). Ver también las publicaciones de patentes de EE. UU. No. 2005/0064474, 20070218528, 2008/0131962 y 2011/0201055.

Medios para generar una rotura de hebra doble de ADN: Como se usa en la presente, el término “medios para generar una rotura de hebra doble de ADN” pretende invocar las disposiciones especiales de reivindicación autorizadas por el Congreso en 35 U.S.C. sctn. 112, sexto párrafo. Específicamente, un “medio para generar una rotura de ADN de hebra doble” se refiere a una estructura molecular capaz de escindir ambas hebras de una molécula de ADN de hebra doble. Tales estructuras incluyen dominios polipeptídicos comprendidos dentro de muchas proteínas nucleasas conocidas, por ejemplo, el dominio nucleasa FokI, el dominio catalítico se selecciona del grupo que consiste en las proteínas Mme1, Colicina-E7 (CEA7_ECOLX), Colicina-E9, APFL, EndA, Endo I (END1_EC0LI), Endo G de humano (NUCG_HUMAN), Endo G de bovino (NUCG_BOVINE), R.HinP11, 1-Bas-1, 1-Bmo-1, 1-Hmu1, 1-Tev-1, 1-Tev11, 1-Tev111, 1-Two1, R.Msp1, R.Mva1, NucA, NucM, Vvn, Vvn_CLS, Nucleasa de estafilococos (NUC_STAAU), Nucleasa de estafilococos (NUC_STAHY), Nucleasa de micrococos (NUC_SHIFL), endonucleasa yncB, endodesoxirribonucleasa I (ENRN _BPT7), Metnasa, Nb.BsrDI, BsrDI A, Nt.BspD61 (subunidad grande de R.BspD61), ss.BspD61 (subunidad pequeña de R.BspD61), R.PIe1, Mly1, Alw1, Mva12691, Bsr1, Bsm1, Nb.BtsCI, Nt.BtsCI, R1.Bts1, R2.Bts1, BbvCI subunidad 1, BbvCI subunidad 2, BpulOI subunidad alfa, BpulOI subunidad beta, Bmr1, Bfi1, 1-Cre1, hExo1 (EX01JHUMAN), Exo1 de levadura (EX01_YEAST), Exo1 deE. coli,TREX2 de humano, TREX1 de ratón, TREX1 de humano, TREX1 de bovino, TREX1 de rata, DNA2 de humano, DNA2 de levadura (DNA2 YEAST), (por sus siglas y nombres en inglés, respectivamente).

Medios para reparar una rotura de hebra doble de ADN: Como se usa en la presente, el término “medios para reparar una rotura de hebra doble de ADN” también pretende invocar las disposiciones especiales de reivindicación autorizadas por el Congreso en 35 U.S.C. sctn. 112, sexto párrafo. Específicamente, un “medio para reparar una rotura de ADN de hebra doble” se refiere a una estructura molecular capaz de facilitar/catalizar la unión de los extremos de moléculas de ADN de hebra doble, por ejemplo, por la unión de extremos generados al escindir una única molécula de ADN de hebra doble, o por la unión de un extremo generado al escindir una única molécula de ADN de hebra doble con el extremo de una molécula de ADN de hebra doble exógena. Tales estructuras incluyen dominios polipeptídicos comprendidos en muchas proteínas ligasas conocidas, por ejemplo, la recombinasa Cre (por sus siglas en inglés). En algunos ejemplos, la misma estructura molecular puede servir tanto de medio para generar una rotura de ADN de hebra doble como de medio para reparar una rotura de ADN de hebra doble, en donde la misma estructura facilita tanto la escisión como la reparación de moléculas de ADN de hebra doble (por ejemplo, recombinasa Hin (por sus siglas en inglés)).

La inducción de las roturas de hebra doble específicas del sitio en el genoma induce la ruta de reparación del ADN de la célula huésped que resuelve la rotura de hebra doble a través de la reparación dirigida por homología (HDR, por sus siglas en inglés) o la reparación de unión de extremos no homólogos (NHE<j>). Es posible tener uno o más sitios de escisión de ZFN en la molécula del donador (un único sitio de escisión de ZFN para linealizar toda la molécula del donador, 2 de los mismos sitios de ZFN para liberar un fragmento del ADN donador más pequeño o 2 sitios de ZFN diferentes para liberar un fragmento del donador y un fragmento correspondiente del ADN genómico huésped (sustitución del ADN).

De este modo, el polinucleótido donador puede ser ADN o ARN, de una hebra única y/o de hebra doble y se puede introducir en una célula en forma lineal o circular. Ver, por ejemplo, la publicación de patentes de e E. u U. No.

20100047805 y 20110207221. En ciertas realizaciones de la presente invención también se pueden incluir ácidos nucleicos lineales exógenos (donadores), composiciones que comprenden estos ácidos nucleicos, y métodos de fabricación y uso de estas moléculas lineales de donadores. En ciertas realizaciones, la molécula lineal del donador persiste de forma estable en la célula en la cual se introduce. En otras realizaciones, la molécula lineal del donador se modifica para resistir la escisión exonucleolítica, por ejemplo, al colocar uno o más enlaces fosforotioato fosfodiéster entre uno o más pares de bases en los extremos de la molécula del donador. El ácido nucleico exógeno lineal también puede incluir ADN de una hebra única específico.

Edición genética de NANOS

NANOS es una familia evolutivamente conservada de proteínas de unión a ARN que se expresan específicamente en las células germinales de animales invertebrados y vertebrados. El abatimiento de NANOS y sus ortólogos resulta en la pérdida de células germinales enDrosophila, C. elegans,pez cebra,Xenopus,y ratón. En los humanos, la pérdida de células germinales y la infertilidad se asocian a mutaciones en los genes NANOS.

En los vertebrados, se han identificado tres genes NANOS, entre los cuales NANOS2 y NANOS3 se expresan en las PGC. En ratones, la proteína NANOS3 se detecta por primera vez en las PGC tempranas, persiste durante su migración a la cresta genital, y posteriormente cesa en el día embrionario 15,5 en los machos o antes de E13,5 en las hembras. En cambio, la expresión de NANOS2 se restringe a la gónada masculina. El ARNm de NANOS2 se detecta por primera vez en las células germinales que han colonizado la gónada embrionaria masculina alrededor de E13,0, después de que las células germinales empiecen a interactuar con las células somáticas gonadales. Aunque la expresión disminuye transitoriamente en etapas posteriores de la embriogénesis, el ARNm de NANOS2 es detectable de nuevo en los gonocitos durante el desarrollo neonatal.

El abatimiento de NANOS3 en ratones provoca la pérdida completa de células germinales en ambos sexos debido a la muerte celular apoptótica en alrededor de E8,0. Es importante destacar que la inactivación de NANOS2 en ratones provoca la pérdida de células germinales en embriones masculinos solamente en alrededor de E15,5. De este modo, la línea germinal falta por completo al nacer en los ratones macho, pero las poblaciones de células somáticas de soporte testicular están funcionalmente intactas. Además, los machos y hembras NANOS2 nulos son viables y crecen hasta la madurez normal. Asimismo, las hembras NANOS2 nulas tienen una fertilidad normal. Los solicitantes han demostrado que NANOS2 se expresa específicamente por PGC en embriones de cerdo.

La familia de genes NANOS es conocida, y las secuencias que la codifican están disponibles en Genbank u otras fuentes similares. Las secuencias de ácido nucleico y proteína NANOS1 deSus scrofase divulgan en XM_001928298 y en la presente como SEQ ID NO: 5 y 6. NANOS2 está en XM_003127232.1 o como en la presente SEQ ID NO: 1 y 2, y nAn OS3 en XM_005661246 o SEQ ID NO: 3 y 4, los genes NANOS bovinos están disponibles en NM_001291904 y SEQ ID NO: 9 y 10 (NANOS2); XM_005225796 SEQ ID NO: 11 y 12 (NANOS1); XM_001787922 SEQ ID NO: 13 y 14 (NANOS1 alt).

La presente invención proporciona un animal bovino o porcino editado genéticamente que comprende al menos una secuencia cromosómica editada que codifica una proteína NANOS2, en donde la secuencia cromosómica editada se inactiva. También como se describe en la presente, la secuencia cromosómica editada se puede modificar o comprender una secuencia integrada. Una secuencia cromosómica inactivada se altera de modo tal que la función de la proteína NANOS relacionada con el desarrollo de las células espermatogonias se altera, reducida o eliminada. De este modo, un animal editado genéticamente que comprende una secuencia cromosómica inactivada se puede denominar como “silenciado” o “condicionalmente silenciado” Similarmente, un animal editado genéticamente que comprende una secuencia integrada se puede denominar como “desbloqueado” o “condicionalmente desbloqueado”. Asimismo, un animal editado genéticamente que comprende una secuencia cromosómica modificada puede incluir una o varias mutaciones puntuales objetivo u otras modificaciones que producen un producto proteico alterado. Brevemente, el proceso comprende introducir un embrión o célula de al menos una molécula de ARN que codifica una nucleasa de dedos de zinc dirigida y, opcionalmente, al menos un polinucleótido accesorio. El método comprende además incubar el embrión o la célula para permitir la expresión de la nucleasa de dedos de zinc, en donde una rotura de hebra doble introducida en la secuencia cromosómica objetivo por la nucleasa de dedos de zinc se repara por un proceso de reparación del ADN de unión de extremos no homólogos propenso a errores o un proceso de reparación del ADN dirigido por homología. El método de edición de secuencias cromosómicas que codifican una proteína asociada al desarrollo de la línea germinal usando la tecnología de nucleasas de dedos de zinc dirigidas es rápido, preciso y altamente eficiente.

En algunas realizaciones de la presente invención, al menos unlocusde NANOS2 se usa como sitio objetivo para la edición específica del sitio. Esto puede incluir la inserción de un ácido nucleico exógeno (por ejemplo, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de interés) o deleciones de ácidos nucleicos dellocus.En realizaciones particulares, las inserciones y/o deleciones modifican ellocus.Por ejemplo, la integración del ácido nucleico exógeno y/o la deleción de parte del ácido nucleico genómico pueden modificar ellocuspara producir un gen NANOS2 alterado (es decir, inactivado).

En algunas realizaciones, ellocusde NANOS editado puede comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 148, 149, 150, 151, 152, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 202, 203, o 204. En algunas realizaciones, unlocusde NANOS editado puede comprender una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 148, 149, 150, 151, 152, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 202, 203, o 204. Por ejemplo, en algunas realizaciones, unlocusde NANOS es un homólogo de NANOS (por ejemplo, un ortólogo o un parálogo) que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 85 % idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 148, 149, 150, 151, 152, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 202, 203, o 204. Un homólogo de NANOS puede comprender una secuencia de nucleótidos que sea, por ejemplo, y sin limitación: al menos 80 %; al menos 85 %; al menos aproximadamente 90 %; al menos aproximadamente 91 %; al menos aproximadamente 92 %; al menos aproximadamente 93 %; al menos aproximadamente 94 %; al menos aproximadamente 95 %; al menos aproximadamente 96 %; al menos aproximadamente 97 %; al menos aproximadamente 98 %; al menos aproximadamente 99 %; al menos aproximadamente 99,5 %; 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % y/o al menos aproximadamente 99,9 % idéntica a aproximadamente 20 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 148, 149, 150, 151, 152, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 202, 203, o 204.

Integración dirigida de un ácido nucleico en un locus de NANOS

La integración específica de un ácido nucleico exógeno en unlocusde NANOS2 se puede realizar por cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, la integración de un ácido nucleico exógeno en unlocusde NANOS2 comprende poner en contacto una célula (por ejemplo, una célula aislada o una célula en un tejido u organismo) con una molécula de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico exógeno. En ejemplos, tal molécula de ácido nucleico puede comprender secuencias de nucleótidos que flanquean el ácido nucleico exógeno que facilitan la recombinación homóloga entre la molécula de ácido nucleico y al menos unlocusde NANOS2. En ejemplos particulares, las secuencias de nucleótidos que flanquean el ácido nucleico exógeno que facilitan la recombinación homóloga pueden ser complementarias a nucleótidos endógenos dellocusde NANOS2. En ejemplos particulares, las secuencias de nucleótidos que flanquean al ácido nucleico exógeno que facilitan la recombinación homóloga pueden ser complementarias a nucleótidos exógenos previamente integrados. En algunas realizaciones, una pluralidad de ácidos nucleicos exógenos se pueden integrar en unlocusde NANOS2, tal como en el apilamiento de genes.

La integración de un ácido nucleico en unlocusde NANOS2 puede ser facilitada (por ejemplo, catalizada) en algunas realizaciones por maquinaria celular endógena de una célula huésped, tales como, por ejemplo, y sin limitación, ADN endógeno y enzimas recombinasas endógenas. En algunas realizaciones, la integración de un ácido nucleico en unlocusde NANOS2 se puede ver facilitada por uno o más factores (por ejemplo, polipéptidos) que se proporcionan a una célula huésped. Por ejemplo, se pueden proporcionar polipéptidos de nucleasas, recombinasas y/o ligasas (independientemente o como parte de un polipéptido quimérico) al poner en contacto los polipéptidos con la célula huésped, o al expresar los polipéptidos dentro de la célula huésped. Por consiguiente, en algunos ejemplos, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un polipéptido de nucleasa, recombinasa y/o ligasa se puede introducir en la célula huésped, ya sea simultánea o secuencialmente con un ácido nucleico que se integrará específicamente en el sitio en unlocusde NANOS2, en donde el al menos un polipéptido de nucleasa, recombinasa y/o ligasa se expresa a partir de la secuencia de nucleótidos en la célula huésped.

Polipéptidos de unión al ADN

En algunas realizaciones, la integración en un sitio específico se puede lograr usando factores capaces de reconocer y unirse a secuencias de nucleótidos particulares, por ejemplo, en el genoma de un organismo huésped. Por ejemplo, muchas proteínas comprenden dominios polipeptídicos que son capaces de reconocer y unirse al ADN en un sitio específico. Una secuencia de ADN que es reconocida por un polipéptido de unión a ADN se puede referir como secuencia “objetivo”. Los dominios polipeptídicos que son capaces de reconocer y unirse al ADN en un sitio específico generalmente se pliegan correctamente y funcionan independientemente para unirse al ADN en un sitio específico, incluso cuando se expresan en un polipéptido distinto de la proteína de la que se aisló originalmente el dominio. Similarmente, las secuencias objetivo para el reconocimiento y la unión por polipéptidos de unión al ADN son generalmente capaces de ser reconocidas y unidas por tales polipéptidos, incluso cuando están presentes en grandes estructuras de ADN (por ejemplo, un cromosoma), particularmente cuando el sitio en donde se encuentra la secuencia objetivo es uno conocido por ser accesible a las proteínas celulares solubles (por ejemplo, un gen).

Mientras que los polipéptidos de unión al ADN identificados a partir de proteínas que existen en la naturaleza se unen típicamente a una secuencia o motivo nucleotídico discreto (por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de consenso), existen métodos y se conocen en la técnica para modificar muchos de estos polipéptidos de unión al ADN para que reconozcan una secuencia o motivo nucleotídico diferente. Los polipéptidos de unión al ADN incluyen, por ejemplo, y sin limitación: dominios de unión al ADN de dedos de zinc; cierres de leucina; dominios de unión al ADN de UPA; g A iN; TAL; LexA; un represor Tet; LacR (por sus siglas en inglés, respectivamente); y un receptor de hormonas esteroideas.

En algunos ejemplos, un polipéptido de unión al ADN es un dedo de zinc. Los dedos de zinc se pueden diseñar para que se unan específicamente a una gran variedad de sitios del ADN. Los polipéptidos de dedo de zinc Cys2His2 canónicos (así como los Cys3His no canónicos) se unen al ADN al insertar una hélice alfa en el surco principal de la doble hélice del ADN objetivo. El reconocimiento del ADN por un dedo de zinc es modular; cada dedo se pone en contacto principalmente con tres pares de bases consecutivos en el objetivo, y unos pocos residuos clave en el polipéptido median el reconocimiento. Al incluir múltiples dominios de unión al ADN de dedos de zinc en una endonucleasa objetivo, la especificidad de unión al ADN de la endonucleasa objetivo se puede incrementar aún más (y, por lo tanto, también se puede incrementar la especificidad de cualquier efecto regulador genético conferido por el mismo). Ver, por ejemplo, Urnovet al.(2005)Nature435:646-51. De este modo, uno o más polipéptidos de unión al ADN con dedos de zinc se pueden diseñar y usar de modo tal que una endonucleasa objetivo introducida en una célula huésped interactúe con una secuencia de ADN que sea única dentro del genoma de la célula huésped.

Preferiblemente, la proteína dedos de zinc no es natural, ya que se diseña para unirse a un sitio objetivo elegido. Ver, por ejemplo, Beerliet al.(2002)Nature Biotechnol.20:135-141; Paboet al.(2001)Ann. Rev. Biochem.70:313-340; Isalanet al.(2001)Nature Biotechnol.19:656-660; Segalet al.(2001)Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637; Chooet al.(2000)Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416; las patentes de EE. UU. No. 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; y las publicaciones de patentes de EE. UU. No. 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.

Un dominio de unión de dedos de zinc modificado por ingeniería puede tener una especificidad de unión novedosa, en comparación con una proteína de dedos de zinc natural. Los métodos de modificación por ingeniería incluyen, pero no se limitan a, el diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de tripletes (o cuadrupletes) y secuencias individuales de aminoácidos de dedos de zinc, en donde cada secuencia de nucleótidos de tripletes o cuadrupletes se asocia a una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc que se unen a la secuencia particular de tripletes o cuadrupletes. Ver, por ejemplo, las patentes de EE. UU. No. 6,453,242 y 6,534,261.

Los métodos de selección ejemplares, incluidos los sistemas de visualización de fagos y de dos híbridos, se describen en las patentes de EE. UU. No. 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; y 6,242,568; así como WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2,338,237. Además, se ha descrito el potenciamiento de la especificidad de unión de los dominios de unión de dedos de zinc, por ejemplo, en el documento de propiedad compartida WO 02/077227.

Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios de dedos de zinc y/o las proteínas de dedos de zinc con múltiples dedos se pueden unir entre sí usando cualquier secuencia enlazadora adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Ver también las patentes de EE. UU. No. 6,479,626; 6,903,185; y 7.153.949 para secuencias enlazadoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en la presente pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.

La selección de los sitios objetivo, las ZFP y los métodos de diseño y construcción de proteínas de fusión (y los polinucleótidos que las codifican) son conocidos por los expertos en la técnica y se describen detalladamente en las patentes de EE. UU. No. 6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.

Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios de dedos de zinc y/o las proteínas de dedos de zinc con múltiples dedos se pueden unir entre sí usando cualquier secuencia enlazadora adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Ver también las patentes de EE. UU. No. 6,479,626; 6,903,185; y 7.153.949 para secuencias enlazadoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en la presente pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.

En algunos ejemplos, un polipéptido de unión al ADN es un dominio de unión al ADN de GAL4 (por sus siglas en inglés). GAIN es un transactivador modular enSaccharomyces cerevisiae,pero también funciona como transactivador en muchos otros organismos. Ver, por ejemplo, Sadowskiet al.(1988)Nature335:563-4. En este sistema regulador, la expresión de los genes que codifican las enzimas de la ruta metabólica de la galactosa en S.cerevisiaese regula estrictamente por la fuente de carbono disponible. Johnston (1987)Microbiol. Rev.51:458-76. El control transcripcional de estas enzimas metabólicas está mediado por la interacción entre la proteína reguladora positiva, GAL4, y una secuencia de ADN simétrica de 17 pb a la que GAL4 se une específicamente (el UAS, por sus siglas en inglés).

GAIN nativa consiste en 881 residuos de aminoácidos, con un peso molecular de 99 kDa. GAL4 comprende dominios funcionalmente autónomos, cuyas actividades combinadas explican la actividad de GAL4in vivo.Ma and Ptashne (1987)Cell48:847-53); Brent and Ptashne (1985)Cell43(3 Pt 2):729-36. Los 65 aminoácidos N-terminales de GAIN comprenden el dominio de unión al ADN de GAlN. Keeganet al.(1986)Science231:699-704; Johnston (1987)Nature328:353-5. La unión específica a la secuencia requiere la presencia de un catión divalente coordinado por 6 residuos Cys presentes en el dominio de unión al ADN. El dominio que contiene cationes coordinados interactúa y reconoce un triplete CCG conservado en cada extremo del UAS de 17 pb mediante el contacto directo con el surco principal de la hélice de ADN. Marmorsteinet al.(1992)Nature356:408-14. La función de unión al ADN de la proteína posiciona los dominios activadores transcripcionales C-terminales en las proximidades del promotor, de modo tal que los dominios activadores pueden dirigir la transcripción.

Otros polipéptidos de unión a ADN que se pueden usar en ciertas realizaciones incluyen, por ejemplo, y sin limitación, una secuencia de unión de un gen inducible por AVRBS3 (por sus siglas en inglés); una secuencia de unión consenso de un gen inducible por AVRBS3 o una secuencia de unión sintética creada a partir de la misma (por ejemplo, dominio de unión a ADN de UPA); TAL; LexA (ver, por ejemplo, Brent and Ptashne (1985),supra);LacR (ver, por ejemplo, Labowet al.(1990)Mol. Cell. Biol.10:3343-56; Bairnet al.(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88(12):5072-6); un receptor de hormonas esteroideas (Elllistonet al.(1990)J. Biol. Chem.265:11517-121); el represor de Tet (patente de EE. Uu . No.

6,271,341) y un represor de Tet mutado que se une a una secuencia operadora de Tet en presencia, pero no en ausencia, de tetraciclina (Tc, por sus siglas en inglés); el dominio de unión al ADN de NF-kappaB; y componentes del sistema regulador descrito en Wanget al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91(17):8180-4, que usa una fusión de GAL4, un receptor hormonal, y VP16 (por sus siglas en inglés).

En ciertas realizaciones, el dominio de unión al ADN de una o más de las nucleasas usadas en los métodos y composiciones descritos en la presente comprende un dominio de unión al ADN con un efector TAL natural o modificado por ingeniería (no natural). Ver, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. No. 20110301073.

En otras realizaciones, la nucleasa comprende un sistema CRISPR/Cas. Ellocusde CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas), que codifica componentes de ARN del sistema, y ellocusde Cas (asociado a CRISPR), que codifica proteínas (Jansenet al.,2002.Mol. Microbiol.43: 1565-1575; Makarovaet al.,2002.Nucleic Acids Res.30: 482-496; Makarovaet al.,2006.Biol.Direct 1: 7; Haftet al.,2005.PLoS Comput. Biol.1: e60) constituyen las secuencias genéticas del sistema de nucleasas de CRISPR/Cas. Loslocide CRISPR en huéspedes microbianos contienen una combinación de genes Cas, así como elementos de ARN no codificante capaces de programar la especificidad de la escisión del ácido nucleico mediada por CRISPR.

CRISPR de tipo II es uno de los sistemas mejor caracterizados y lleva a cabo la rotura selectiva de la hebra doble de ADN en cuatro pasos secuenciales. En primer lugar, dos ARN no codificantes, la matriz preARNcr y el ARNtracr, se transcriben a partir dellocusde CRISPR. En segundo lugar, el ARNtracr se hibrida con las regiones repetidas del preARNcr y media el procesamiento del preARNcr en ARNcr maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales. En tercer lugar, el complejo maduro ARNcr:ARNtracr dirige a Cas9 hacia el ADN objetivo a través del emparejamiento de bases de Wastson-Crick entre el espaciador del ARNcr y el protoespaciador del ADN objetivo junto al motivo adyacente al protoespaciador (PAM), un requisito adicional para el reconocimiento del objetivo. Por último, Cas9 se encarga de escindir el ADN objetivo para crear una rotura de hebra doble en el protoespaciador. La actividad del sistema CRISPR/Cas comprende tres pasos: (i) inserción de secuencias de ADN extrañas en la matriz de CRISPR para prevenir futuros ataques, en un proceso llamado “adaptación”, (ii) expresión de las proteínas pertinentes, así como expresión y procesamiento de la matriz, seguido de (iii) interferencia mediada por el<a>R<n>con el ácido nucleico extraño. De este modo, en la célula bacteriana, varias proteínas Cas se involucran en la función natural del sistema CRISPR/Cas y desempeñan papeles en funciones, tales como la inserción del ADN extraño, etc.

En ciertas realizaciones, la proteína Cas puede ser un “derivado funcional” de una proteína Cas natural. Un “derivado funcional” de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. Los “derivados funcionales” incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. Una actividad biológica contemplada en la presente es la capacidad del derivado funcional para hidrolizar un sustrato de ADN en fragmentos. El término “derivado” abarca tanto las variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido como las modificaciones covalentes y las fusiones de los mismos. Los derivados adecuados de un polipéptido Cas o de un fragmento del mismo incluyen, pero no se limitan a, mutantes, fusiones, modificaciones covalentes de la proteína Cas o de un fragmento de la misma. La proteína Cas, que incluye la proteína Cas o un fragmento de la misma, así como los derivados de la proteína Cas o un fragmento de la misma, se pueden obtener a partir de una célula o sintetizar químicamente o por una combinación de estos dos procedimientos. La célula puede ser una célula que produce naturalmente la proteína Cas, o una célula que produce naturalmente la proteína Cas y se modifica genéticamente para producir la proteína Cas endógena a un nivel de expresión más alto o para producir una proteína Cas a partir de un ácido nucleico introducido exógenamente, cuyo ácido nucleico codifica una Cas que es igual o diferente de la Cas endógena. En algunos casos, la célula no produce naturalmente la proteína Cas y se modifica genéticamente para que produzca una proteína Cas.

En realizaciones particulares, un polipéptido de unión a ADN reconoce específicamente y se une a una secuencia nucleotídica objetivo comprendida dentro de un ácido nucleico genómico de un organismo huésped. En algunos ejemplos, se puede encontrar cualquier número de instancias discretas de la secuencia de nucleótidos objetivo en el genoma huésped. La secuencia de nucleótidos objetivo puede ser poco frecuente en el genoma del organismo (por ejemplo, pueden existir en el genoma menos de aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2, o aproximadamente 1 copia(s) de la secuencia objetivo). Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos objetivo se puede localizar en un sitio único dentro del genoma del organismo. Las secuencias de nucleótidos objetivo pueden estar, por ejemplo, y sin limitación, dispersas aleatoriamente por el genoma unas con respecto a otras; localizadas en diferentes grupos de ligación en el genoma; localizadas en el mismo grupo de ligación; localizadas en diferentes cromosomas; localizadas en el mismo cromosoma; localizadas en el genoma en sitios que se expresan bajo condiciones similares en el organismo (por ejemplo, bajo el control de los mismos factores reguladores, o sustancialmente idénticos desde el punto de vista funcional); y localizadas muy próximas entre sí en el genoma (por ejemplo, las secuencias objetivo pueden estar comprendidas dentro de ácidos nucleicos integrados como concatémeros enlocigenómicos).

Endonucleasas selectivas

En realizaciones particulares, un polipéptido de unión a ADN que reconoce y se une específicamente a una secuencia nucleotídica objetivo puede estar comprendido dentro de un polipéptido quimérico, con el fin de conferir una unión específica a la secuencia objetivo al polipéptido quimérico. En ejemplos, tal polipéptido quimérico puede comprender, por ejemplo, y sin limitación, polipéptidos de nucleasas, recombinasas y/o ligasas, como estos polipéptidos se describen anteriormente. Los polipéptidos quiméricos que comprenden un polipéptido de unión al ADN y un polipéptido de nucleasa, recombinasa y/o ligasa también pueden comprender otros motivos y/o dominios polipeptídicos funcionales, tales como, por ejemplo, y sin limitación: una secuencia espaciadora colocada entre los polipéptidos funcionales en la proteína quimérica; un péptido líder; un péptido que dirige la proteína de fusión a un orgánulo (por ejemplo, el núcleo); polipéptidos que se escinden por una enzima celular; etiquetas peptídicas (por ejemplo, Myc, His, etc.); y otras secuencias de aminoácidos que no interfieren con la función del polipéptido quimérico.

Los polipéptidos funcionales (por ejemplo, polipéptidos de unión al ADN y polipéptidos de nucleasa) en un polipéptido quimérico pueden estar unidos operativamente. En algunas realizaciones, los polipéptidos funcionales de un polipéptido quimérico se pueden enlazar operativamente por su expresión a partir de un único polinucleótido que codifica al menos los polipéptidos funcionales ligados entre sí dentro del marco, con el fin de crear un gen quimérico que codifica una proteína quimérica. En realizaciones alternativas, los polipéptidos funcionales de un polipéptido quimérico se pueden enlazar operativamente por otros medios, tal como por reticulación de polipéptidos expresados independientemente.

En algunas realizaciones, un polipéptido de unión a ADN, o ARN guía que reconoce específicamente y se une a una secuencia nucleotídica objetivo, puede estar comprendido dentro de una proteína natural aislada (o mutante de la misma), en donde la proteína natural aislada o mutante de la misma también comprende un polipéptido de nucleasa (y también puede comprender un polipéptido de recombinasa y/o ligasa). Los ejemplos de tales proteínas aisladas incluyen TALEN, recombinasas (por ejemplo, recombinasas Cre, Hin, Tre, y Flp, por sus siglas en inglés, respectivamente), CRISPR/Cas9 guiada por ARN, y meganucleasas.

Como se usa en la presente, el término “endonucleasa objetivo” se refiere a proteínas aisladas naturales o de modificadas por ingeniería y mutantes de las mismas que comprenden un polipéptido de unión al ADN o ARN guía y un polipéptido nucleasa, así como a polipéptidos quiméricos que comprenden un polipéptido de unión al ADN o ARN guía y una nucleasa. En ciertas realizaciones se puede usar cualquier endonucleasa objetivo que comprenda un polipéptido de unión a ADN o ARN guía que reconozca específicamente y se una a una secuencia nucleotídica objetivo comprendida dentro de unlocusde NANOS2 (por ejemplo, ya sea porque la secuencia objetivo está comprendida dentro de la secuencia nativa en ellocus,o bien porque la secuencia objetivo se haya introducido en ellocus,por ejemplo, por recombinación).

Algunos ejemplos de polipéptidos quiméricos que pueden ser útiles en realizaciones particulares de la invención incluyen, sin limitación, combinaciones de los siguientes polipéptidos: polipéptidos de unión a ADN de dedos de zinc; un polipéptido de nucleasa FokI; dominios TALE; cierres de leucina; motivos de unión a ADN de factores de transcripción; y dominios de reconocimiento y/o escisión de ADN aislados de, por ejemplo, y sin limitación, una TALEN, una recombinasa (por ejemplo, Cre, Hin, RecA, Tre y Flp), CRISPR/Cas9 guiada por ARN, una meganucleasa, y otras conocidas en la técnica. Los ejemplos particulares incluyen una proteína quimérica que comprende un polipéptido de unión al ADN específica del sitio y un polipéptido de nucleasa. Los polipéptidos quiméricos se pueden modificar por ingeniería por métodos conocidos por los expertos en la técnica para alterar la secuencia de reconocimiento de un polipéptido de unión al ADN incluido en el polipéptido quimérico, con el fin de dirigir el polipéptido quimérico a una secuencia nucleotídica de interés particular.

En ciertas realizaciones, el polipéptido quimérico comprende un dominio de unión al ADN (por ejemplo, un dedo de zinc, un dominio efector de TAL, etc.) y un dominio de nucleasa (escisión). El dominio de escisión puede ser heterólogo al dominio de unión al ADN, por ejemplo, un dominio de unión al ADN de dedos de zinc y un dominio de escisión de una nucleasa o un dominio de unión al ADN y un dominio de escisión de TALEN, o un dominio de unión al ADN de meganucleasa y un dominio de escisión de una nucleasa diferente. Los dominios de escisión heterólogos se pueden obtener a partir de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Las endonucleasas ejemplares de las que se puede derivar un dominio de escisión incluyen, pero no se limitan a, las endonucleasas de restricción y las endonucleasas homing. Ver, por ejemplo, 2002-2003 Catalogue,New England Biolabs,Beverly, Mass.; y Belfortet al.(1997)Nucleic Acids Res.

25:3379-3388. Se conocen otras enzimas que escinden el ADN (por ejemplo, nucleasa 51; nucleasa de judía mungo; ADNasa I pancreática; nucleasa de micrococos; endonucleasa HO de levadura; ver también Linnet al.(eds.) Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993). Una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) se pueden usar como fuente de dominios de escisión y semidominios de escisión.

Similarmente, un semidominio de escisión se puede derivar de cualquier nucleasa o porción de la misma, como se ha expuesto anteriormente, que requiera dimerización para la actividad de escisión. En general, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden semidominios de escisión. Alternativamente, se puede usar una única proteína que comprende dos semidominios de escisión. Los dos semidominios de escisión se pueden derivar de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma), o cada semidominio de escisión se puede derivar de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios objetivo para las dos proteínas de fusión están preferiblemente dispuestos, uno respecto del otro, de modo tal que la unión de las dos proteínas de fusión a sus respectivos sitios objetivo coloca los semidominios de escisión en una orientación espacial entre sí que permite a los semidominios de escisión formar un dominio de escisión funcional, por ejemplo, al dimerizar. De este modo, en ciertas realizaciones, los bordes cercanos de los sitios objetivo están separados por 5-8 nucleótidos o por 15-18 nucleótidos. Sin embargo, cualquier número integral de nucleótidos, o pares de nucleótidos, puede intervenir entre dos sitios objetivo (por ejemplo, de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En general, el sitio de escisión se encuentra entre los sitios objetivo.

Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unirse a secuencias específicas de ADN (en un sitio de reconocimiento), y de escindir el ADN en o cerca del sitio de unión, por ejemplo, de modo tal que una o más secuencias exógenas (donadores/transgenes) se integren en o cerca de los sitios de unión (objetivo). Ciertas enzimas de restricción (por ejemplo, las de tipo IIS) escinden el ADN en sitios alejados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de unión y de escisión separables. Por ejemplo, la enzima de tipo IIS FokI cataliza la escisión de hebra doble de ADN, a 9 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en una hebra y a 13 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en la otra. Ver, por ejemplo, las patentes de EE. UU. No. 5,356,802; 5,436,150 y 5,487,994; así como Liet al.(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:4275-4279; Liet al.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:2764-2768; Kimet al.(1994a)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:883-887; Kimet al.(1994b)J. Biol. Chem.269:31,978-31,982. De este modo, en una realización, las proteínas de fusión comprenden el dominio de escisión (o el semidominio de escisión) de al menos una enzima de restricción de tipo IIS y uno o más dominios de unión a dedos de zinc, que pueden o no estar modificados por ingeniería.

Una enzima de restricción de tipo IIS ejemplar, cuyo dominio de escisión es separable del dominio de unión, es FokI. Esta enzima en particular es activa como dímero. Bitinaiteet al.(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA95: 10,570-10,575. Por consiguiente, a efectos de la presente divulgación, la porción de la enzima FokI usada en las proteínas de fusión divulgadas se considera un semidominio de escisión. Por lo tanto, para la escisión selectiva de hebra doble y/o la sustitución selectiva de secuencias celulares usando fusiones dedo de zinc-FokI, se pueden usar dos proteínas de fusión, cada una de las cuales comprende un semidominio de escisión de FokI, para reconstituir un dominio de escisión catalíticamente activo. Alternativamente, también se puede usar una única molécula polipeptídica con un dominio de unión al ADN y dos semidominios de escisión de FokI.

Un dominio de escisión o un semidominio de escisión puede ser cualquier porción de una proteína que retiene la actividad de escisión, o que retiene la capacidad de multimerizarse (por ejemplo, dimerizarse) para formar un dominio de escisión funcional.

En la publicación de patente de EE. UU. No. 20070134796 se describen enzimas de restricción de tipo IIS ejemplares.

Otras enzimas de restricción también contienen dominios separables de unión y escisión, y se contemplan en la presente divulgación. Ver, por ejemplo, Robertset al.(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420.

En ciertas realizaciones, el dominio de escisión comprende uno o más semidominios de escisión modificados por ingeniería (también referidos como mutantes del dominio de dimerización) que minimizan o previenen la homodimerización, como se describe, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. No. 20050064474; 20060188987 y 20080131962.

Alternativamente, las nucleasas se pueden ensamblarin vivoen el sitio objetivo del ácido nucleico usando la tecnología llamada “enzima de división” (ver, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. No. 20090068164). Los componentes de tales enzimas de división se pueden expresar en constructos de expresión separados, o se pueden unir en un marco de lectura abierto en donde los componentes individuales se separan, por ejemplo, por un péptido 2A de autoescisión o una secuencia IRES (por sus siglas en inglés). Los componentes pueden ser dominios individuales de unión a dedos de zinc o dominios de un dominio de unión a ácido nucleico meganucleico.

Nucleasas con dedos de zinc

En realizaciones específicas, un polipéptido quimérico es una nucleasa de dedos de zinc (ZFN) diseñada a medida que se puede diseñar para producir una rotura de hebra doble de ADN específica en donde se puede integrar un ácido nucleico exógeno, o ADN del donador (ver la publicación de patente de EE. UU. de propiedad compartida 20100257638). Los ZFN son polipéptidos quiméricos que contienen un dominio de escisión inespecífico de una endonucleasa de restricción (por ejemplo, FokI) y un polipéptido de dominio de unión al ADN de dedos de zinc. Ver, por ejemplo, Huanget al.(1996)J. Protein Chem.15:481-9; Kimet al.(1997a)Proc. Natl. Acad. Sci. USA94:3616-20; Kimet al.(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:1156-60; Kimet al.(1994)Proc Natl. Acad. Sci. USA91:883-7; Kimet al.(1997b)Proc. Natl. Acad. Sci. USA94:12875-9; Kimet al.(1997c)Gene203:43-9; Kimet al.(1998)Biol. Chem.379:489-95; Nahon and Raveh (1998)Nucleic Acids Res.26:1233-9; Smithet al.(1999)Nucleic Acids Res.27:674-81. En algunas realizaciones, los Z<f>N comprenden dominios de unión al ADN de dedos de zinc no canónicos (ver la publicación de patente de EE. UU. de propiedad compartida 20080182332). La endonucleasa de restricción FokI se debe dimerizar mediante el dominio nucleasa para escindir el ADN e introducir una rotura de hebra doble. Por consiguiente, las ZFN que contienen un dominio nucleasa de una endonucleasa de este tipo también requieren la dimerización del dominio de nucleasa para escindir el ADN objetivo. Maniet al.(2005)Biochem. Biophys. Res. Commun.334:1191-7; Smithet al.(2000)Nucleic Acids Res.28:3361-9. La dimerización del ZFN se puede ver facilitada por dos sitios de unión al ADN adyacentes y de orientación opuesta. Id.

En ejemplos particulares, un método para la integración específica del sitio de un ácido nucleico exógeno en al menos unlocusde NANOS2 de un huésped comprende introducir en una célula del huésped una ZFN, en donde la ZFN reconoce y se une a una secuencia nucleotídica objetivo, en donde la secuencia nucleotídica objetivo está comprendida dentro de al menos unlocusde NANOS2 del huésped. En ciertos ejemplos, la secuencia de nucleótidos objetivo no está comprendida en el genoma del huésped en ninguna otra posición que no sea el al menos unlocusde NANOS2. Por ejemplo, un polipéptido de unión a ADN de la ZFN se puede modificar por ingeniería para reconocer y unirse a una secuencia de nucleótidos objetivo identificada dentro del al menos unlocusde NANOS2 (por ejemplo, al secuenciar ellocusde NANOS2). Un método para la integración específica del sitio de un ácido nucleico exógeno en al menos unlocusde realización de NANOS2 de un huésped que comprende introducir en una célula del huésped una ZFN, también puede comprender introducir en la célula un ácido nucleico exógeno, en donde la recombinación del ácido nucleico exógeno en un ácido nucleico del huésped que comprende el al menos unlocusde NANOS2 se ve facilitada por el reconocimiento específico del sitio y la unión de la ZFN a la secuencia objetivo (y la posterior escisión del ácido nucleico que comprende ellocusde NANOS2).

Ácidos nucleicos exóaenos opcionales para la integración en un locus de NANOS

Las realizaciones de la invención pueden incluir uno o más ácidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en: un ácido nucleico exógeno para la integración específica de sitio en al menos unlocusde NANOS2, por ejemplo, y sin limitación, un ORF; un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa objetivo; y un vector que comprende al menos uno de uno o ambos de los anteriores. De este modo, los ácidos nucleicos particulares para su uso en algunas realizaciones incluyen secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido, secuencias de nucleótidos estructurales y/o sitios de reconocimiento y unión de polipéptidos de unión a ADN.

Moléculas de ácido nucleico exógeno opcionales para la integración en sitios específicos

Como se ha indicado anteriormente, se proporciona la inserción de una secuencia exógena (también llamada “secuencia donador” o “donador” o “transgén”), por ejemplo, para la expresión de un polipéptido, la corrección de un gen mutante o para aumentar la expresión de un gen de tipo silvestre. Es evidente que la secuencia donador no es típicamente idéntica a la secuencia genómica en donde se coloca. Una secuencia del donador puede contener una secuencia no homóloga flanqueada por dos regiones de homología para permitir una HDR eficiente en el lugar de interés. Adicionalmente, las secuencias donadores pueden comprender una molécula vectorial con secuencias que no sean homólogas a la región de interés en la cromatina celular. Una molécula del donador puede contener varias regiones discontinuas de homología con la cromatina celular. Por ejemplo, para la inserción dirigida de secuencias que normalmente no están presentes en una región de interés, dichas secuencias pueden estar presentes en una molécula del ácido nucleico donador y flanqueadas por regiones de homología con la secuencia de la región de interés.

El polinucleótido del donador puede ser ADN o ARN, de una hebra única o de hebra doble y se puede introducir en una célula en forma lineal o circular. Ver, por ejemplo, las publicaciones de patentes de Ee . Uu . No. 20100047805, 20110281361, 20110207221 y la solicitud de Ee . UU. con No. de serie 13/889,162. Si se introduce en forma lineal, los extremos de la secuencia del donador se pueden proteger (por ejemplo, de la degradación exonucleolítica) por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se adicionan uno o más residuos de dideoxinucleótidos al extremo 3' de una molécula lineal y/o se ligan oligonucleótidos autocomplementarios a uno o ambos extremos. Ver, por ejemplo, Changet al.(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:4959-4963; Nehlset al.(1996)Science272:886-889. Los métodos adicionales para proteger los polinucleótidos exógenos de la degradación incluyen, pero no se limitan a, la adición de grupos amino terminales y el uso de enlaces internucleotídicos modificados, tales como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos y residuos de O-metilrribosa o desoxirribosa.

Un polinucleótido se puede introducir en una célula como parte de una molécula vectorial que contiene secuencias adicionales, tales como, por ejemplo, orígenes de replicación, promotores y genes que codifican la resistencia a los antibióticos. Asimismo, los polinucleótidos donadores se pueden introducir como ácido nucleico desnudo, como ácido nucleico complejado con un agente, tal como un liposoma o poloxámero, o se pueden suministrar mediante virus (por ejemplo, adenovirus, AAV, herpes virus, retrovirus, lentivirus y lentivirus con defecto de integrasa (IDLV, por sus siglas en inglés)).

Generalmente, el donador se integra de modo tal que su expresión esté impulsa por el promotor endógeno en el sitio de integración, es decir, el promotor que impulsa la expresión del gen endógeno en donde se integra el donador (por ejemplo, NANOS). Sin embargo, será evidente que el donador puede comprender un promotor y/o potenciador, por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor inducible o específico de tejido.

Asimismo, aunque no son necesarias para la expresión, las secuencias exógenas también pueden incluir secuencias reguladoras transcripcionales o traslacionales, por ejemplo, promotores, potenciadores, aislantes, sitios de entrada de ribosomas internos, secuencias que codifican péptidos 2A y/o señales de poliadenilación.

Los ácidos nucleicos exógenos que se pueden integrar de manera específica al sitio en al menos unlocusde NANOS2, con el fin de modificar ellocusde NANOS2, en las realizaciones incluyen, por ejemplo, y sin limitación, ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de interés; ácidos nucleicos que comprenden un gen agronómico; ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de ARNi; o ácidos nucleicos que interrumpen el gen NANOS2.

En algunas realizaciones, un ácido nucleico exógeno se integra en unlocusde NANOS2, con el fin de modificar ellocusde NANOS2, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de interés, de modo tal que la secuencia de nucleótidos se expresa en el huésped a partir dellocusde N<a>N<o>S2. En algunos ejemplos, el polipéptido de interés (por ejemplo, una proteína extraña) se expresa a partir de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés en cantidades comerciales. En tales ejemplos, el polipéptido de interés se puede extraer de la célula huésped, tejido o biomasa.

Moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa objetivo

En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa objetivo se puede diseñar por manipulación (por ejemplo, ligación) de secuencias de nucleótidos nativas que codifican polipéptidos comprendidos en la endonucleasa objetivo. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de un gen que codifica una proteína que comprende un polipéptido de unión al ADN se puede inspeccionar para identificar la secuencia de nucleótidos del gen que corresponde al polipéptido de unión al ADN, y esa secuencia de nucleótidos se puede usar como elemento de una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa objetivo que comprende el polipéptido de unión al ADN. Alternativamente, la secuencia de aminoácidos de una endonucleasa objetivo se puede usar para deducir una secuencia de nucleótidos que codifique la endonucleasa objetivo, por ejemplo, de acuerdo con la degeneración del código genético.

En moléculas de ácido nucleico ejemplares que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa objetivo, el último codón de una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido nucleasa, y el primer codón de una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de unión al ADN, pueden estar separados por cualquier número de tripletes de nucleótidos, por ejemplo, sin codificar un intrón o un “codón de paro” De la misma manera, el último codón de una secuencia de nucleótidos que codifica una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de unión al ADN, y el primer codón de una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido nucleasa, pueden estar separados por cualquier número de tripletes de nucleótidos. En estas y otras realizaciones, el último codón de la última (es decir, la secuencia más 3' del ácido nucleico) de una primera secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido nucleasa, y una segunda secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido de unión a ADN, se pueden fusionar en registro de fase con el primer codón de otra secuencia codificante polinucleotídica directamente contigua a la misma, o separada de ella por no más de una secuencia peptídica corta, tal como la codificada por un enlazador nucleotídico sintético (por ejemplo, un enlazador nucleotídico que se pueda haber usado para lograr la fusión). Los ejemplos de tales secuencias polinucleotídicas adicionales incluyen, por ejemplo, y sin limitación, etiquetas, péptidos objetivo y sitios de escisión enzimática. Asimismo, el primer codón más 5' (en la secuencia de ácido nucleico) de las secuencias polinucleotídicas primera y segunda se puede fusionar en registro de fase con el último codón de otra secuencia codificante polinucleotídica directamente contigua a la misma, o separada de la misma por no más de una secuencia peptídica corta.

Una secuencia que separa secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos funcionales en una endonucleasa objetivo (por ejemplo, un polipéptido de unión al ADN y un polipéptido nucleasa) puede, por ejemplo, consistir en cualquier secuencia, de modo tal que no sea probable que la secuencia de aminoácidos codificada altere significativamente la traducción de la endonucleasa objetivo. Debido a la naturaleza autónoma de los polipéptidos nucleasa conocidos y de los polipéptidos de unión al ADN conocidos, las secuencias intervinientes no interferirán en ejemplos con las funciones respectivas de estas estructuras.

Otros métodos de silenciamiento

Se pueden usar otras técnicas conocidas en la técnica para inactivar genes con el fin de crear animales silenciados y/o introducir constructos de ácido nucleico en animales para producir animales fundadores y crear líneas animales, en donde el constructo silenciado o de ácido nucleico se integra en el genoma. Tales técnicas incluyen, sin limitación, la microinyección pronuclear (la patente de EE. UU. No. 4,873,191), transferencia de genes a líneas germinales mediada por retrovirus (Van der Puttenet al.(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA82, 6148-1652), direccionamiento genético en células madre embrionarias (Thompsonet al.(1989)Cell56, 313-321), electroporación de embriones (Lo (1983)Mol. Cell. Biol.3, 1803-1814), transferencia genética mediada por espermatozoides (Lavitranoet al.(2002)Proc. Natl. Acad. Sci. USA99, 14230-14235; Lavitranoet al.(2006)Reprod. Fert. Develop.18, 19-23), y la transformaciónin vitrode células somáticas, tales como células del cúmulo o mamarias, o células madre adultas, fetales o embrionarias, seguida de trasplante nuclear (Wilmutet al.(1997)Nature385, 810-813; y Wakayamaet al.(1998)Nature394, 369-374). La microinyección pronuclear, la transferencia genética mediada por espermatozoides y la transferencia nuclear de células somáticas son técnicas especialmente útiles. Un animal genómicamente modificado es un animal en donde todas sus células tienen la modificación genética, incluidas las células de su línea germinal. Cuando se usan métodos que producen un animal que es mosaico en su modificación genética, los animales pueden ser endogámicos y la progenie que es genómicamente modificada se puede seleccionar. La clonación, por ejemplo, se puede usar para hacer un animal mosaico si sus células se modifican en el estado de blastocisto, o se puede producir una modificación genómica cuando se modifica una única célula. Los animales modificados para que no maduren sexualmente pueden ser homocigotos o heterocigotos para la modificación, dependiendo del enfoque específico que se use. Si se inactiva un gen concreto por una modificación de silenciamiento, normalmente se requeriría la homocigosidad. Si un gen concreto se inactiva por una estrategia de interferencia de ARN o dominante negativa, la heterocigosidad es a menudo adecuada.

Típicamente, en la microinyección de embriones/cigotos, se introduce un constructo de ácido nucleico o ARNm en un óvulo fecundado; se usan óvulos fecundados de 1 o 2 células, ya que los pronúcleos que contienen el material genético de la cabeza del espermatozoide y del óvulo son visibles dentro del protoplasma. Los óvulos fecundados en etapa pronuclear se pueden obtenerin vitrooin vivo(es decir, recuperados quirúrgicamente del oviducto de animales donadores). Los óvulos fecundadosin vitrose pueden producir de la siguiente manera. Por ejemplo, los ovarios porcinos se pueden recolectar en un matadero y mantenerse a 22-28 °C durante el transporte. Los ovarios se pueden lavar y aislar para la aspiración folicular, y los folículos de 4-8 mm se pueden aspirar en tubos de centrífuga cónicos de 50 mL usando agujas de calibre 18 y bajo vacío. El líquido folicular y los ovocitos aspirados se pueden enjuagar a través de prefiltros con TL-HEPES (por sus siglas en inglés), comerciales (Minitube, Verona, Wis.). Los ovocitos rodeados de una masa cumular compacta se pueden seleccionar y colocar en TCM-199 OOCYTE MATURATION MEDILTM (por su nombre en inglés), (Minitube, Verona, Wis.) suplementado con 0,1 mg/mL de cisteína, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico, 10 % de fluido folicular porcino, 50 pM de 2-mercaptoetanol, 0,5 mg/mL de AMPc, 10 lU/mL de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG, por sus siglas en inglés) y 10 lU/mL de gonadotropina coriónica humana (hCG, por sus siglas en inglés) por aproximadamente 22 horas en aire humidificado a 38,7 °C y 5 % de CO2. Subsecuentemente, los ovocitos se pueden trasladar a un nuevo medio de maduración TCM-199, que no contiene AMPc, PMSG o hCG y se incubarán por 22 horas más. Los ovocitos maduros se pueden despojar de sus células del cúmulo por agitación en vórtex en hialuronidasa al 0,1 % por 1 minuto.

En el caso de los cerdos, los ovocitos maduros se pueden fecundar en 500 pL de Minitube PORCPRO IVF MEDIUM SYSTEM (por su nombre en inglés), (Minitube, Verona, Wis.) en placas de fecundación Minitube de 5 pozos. Como preparación para la fecundaciónin vitro(IVF, por sus siglas en inglés), el semen de jabalí recién recolectado o congelado se puede lavar y resuspender en el medio PORCPRO IVF (por su nombre en inglés) hasta obtener 4x10x5 espermatozoides. Las concentraciones de esperma se pueden analizar por análisis de semen asistido por ordenador (SPERMVISION, Minitube, Verona, Wis.). La inseminaciónin vitrofinal se puede realizar en un volumen de 10 pL con una concentración final de aproximadamente 40 espermatozoides móviles/ovocitos, dependiendo del jabalí. Incubar todos los ovocitos fecundados a 38,7 °C en una atmósfera con 5,0 % de CO2 por 6 horas. Seis horas después de la inseminación, los presuntos cigotos se pueden lavar dos veces en NCSU-23 y trasladar a 0,5 mL del mismo medio. Este sistema puede producir 20-30 % de blastocistos de forma rutinaria en la mayoría de jabalíes con una tasa de inseminación polispérmica del 10-30 %.

Los constructos de ácido nucleico linealizados o el ARNm se pueden inyectar en uno de los pronúcleos o en el citoplasma. Posteriormente, los óvulos inyectados se pueden transferir a una hembra receptora (por ejemplo, a los oviductos de una hembra receptora) y dejar que se desarrollen en la hembra receptora para producir los animales transgénicos. En particular, los embriones fecundadosin vitrose pueden centrifugar a 15.000 x g por 5 minutos para sedimentar los lípidos y permitir la visualización del pronúcleo. Los embriones se pueden inyectar con un inyector Eppendorf FEMTOJET y cultivar hasta la formación del blastocisto. Se pueden registrar los índices de escisión embrionaria y de formación y calidad de los blastocistos.

Los embriones se pueden transferir quirúrgicamente a úteros de receptoras asincrónicas. Típicamente, se pueden depositar 100-200 (por ejemplo, 150-200) embriones en la unión ampolla- istmo del oviducto usando un catéter TOMCAT® de 13,97 cm [5,5 pulgadas]. Tras la intervención quirúrgica, se puede realizar un examen ecográfico del embarazo en tiempo real.

En la transferencia nuclear de células somáticas, una célula transgénica (por ejemplo, una célula porcina o bovina transgénica), tales como un blastómero embrionario, un fibroblasto fetal, un fibroblasto de oreja de adulto o una célula de la granulosa que incluye un constructo de ácido nucleico descrito anteriormente, se puede introducir en un ovocito enucleado para establecer una célula combinada. Los ovocitos se pueden enuclear por la disección parcial de la zona próxima al cuerpo polar y la posterior extracción del citoplasma en la zona de disección. Típicamente, se usa una pipeta de inyección con una punta biselada afilada para inyectar la célula transgénica en un ovocito enucleado detenido en la meiosis 2. En algunas convenciones, los ovocitos detenidos en la meiosis 2 se denominan óvulos. Tras producir un embrión porcino o bovino (por ejemplo, al fusionar y activar el ovocito), el embrión se transfiere a los oviductos de una hembra receptora, aproximadamente 20 a 24 horas después de la activación. Ver, por ejemplo, Cibelliet al.(1998)Science280, 1256-1258 y la patente de EE. UU. No. 6,548,741. En el caso de los cerdos, se puede comprobar el embarazo de las hembras receptoras aproximadamente 20-21 días después de la transferencia de los embriones.

Se pueden usar técnicas de reproducción estándar para crear animales homocigotos para el ácido nucleico exógeno a partir de los animales fundadores heterocigotos iniciales. Sin embargo, la homocigosis puede no ser necesaria. Los cerdos transgénicos en la presente descritos se pueden cruzar con otros cerdos de interés.

En algunas realizaciones, un ácido nucleico de interés y un marcador seleccionable se pueden proporcionar en transposones separados y proporcionar a embriones o células en cantidades desiguales, en donde la cantidad de transposón que contiene el marcador seleccionable excede con mucho (5-10 veces el exceso) al transposón que contiene el ácido nucleico de interés. Las células o animales transgénicos que expresan el ácido nucleico de interés se pueden aislar basados en la presencia y expresión del marcador seleccionable. Dado que los transposones se integrarán en el genoma de forma precisa y no enlazada (eventos de transposición independientes), el ácido nucleico de interés y el marcador seleccionable no están enlazados genéticamente y se pueden separar fácilmente por la segregación genética a través de la reproducción estándar. De este modo, se pueden producir animales transgénicos que no estén obligados a conservar marcadores seleccionables en generaciones subsecuentes, una cuestión que suscita cierta preocupación desde el punto de vista de la seguridad pública.

Una vez generado el animal transgénico, la expresión de un ácido nucleico exógeno se puede valorar usando técnicas estándar. La selección inicial se puede realizar por el análisis de transferencia tipo Southern para determinar si se ha producido o no la integración del constructo. Para una descripción del análisis de transferencia tipo Southern, ver las secciones 9.37-9.52 de Sambrooket al.,1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2° ed,Cold Spring Harbor Press,Plainview; N.Y. Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también se pueden usar en la examinación inicial. La PCR se refiere a un procedimiento o técnica en la cual se amplifican ácidos nucleicos objetivo. Generalmente, la información de la secuencia de los extremos de la región de interés o más allá se emplea para diseñar cebadores oligonucleotídicos que son idénticos o similares en secuencia a las hebras opuestas del molde a amplificar. La PCR se puede usar para amplificar secuencias específicas tanto de ADN como de ARN, incluidas secuencias de ADN genómico total o de a Rn celular total. Los cebadores típicamente tienen entre 14 y 40 nucleótidos de longitud, pero pueden variar desde 10 nucleótidos hasta cientos de nucleótidos. La PCR se describe, por ejemplo, en PCR Primer: A Laboratory Manual, ed. Dieffenbach and Dveksler,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995. Los ácidos nucleicos también se pueden amplificar por reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de hebra, replicación de secuencia autosostenida o amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico. Ver, por ejemplo, Lewis (1992)Genetic Engineering News12,1; Guatelliet al.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:1874; y Weiss (1991)Science254:1292. En la fase de blastocisto, los embriones se pueden procesar individualmente para su análisis por PCR, hibridación en transferencia tipo Southern y PCR de tipo splinkerette (ver, por ejemplo, Dupuyet al. Proc Natl Acad Sci USA(2002) 99:4495).

La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido en los tejidos de cerdos transgénicos se puede valorar usando técnicas que incluyen, por ejemplo, el análisis de transferencia tipo Northern de muestras de tejido obtenidas del animal, el análisis de hibridaciónin situ,el análisis de transferencia tipo Western, inmunoensayos, tales como los ensayos inmunoenzimáticos y la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés).

ARN de interferencia

Se conocen una variedad de sistemas de ARN de interferencia (ARNi). El ARN de hebra doble (ARNds) induce la degradación específica de la secuencia de los transcritos de genes homólogos. El complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés) metaboliza el ARNds en pequeños ARN de interferencia de 21-23 nucleótidos (ARNip). El RISC contiene una ARNasa de hebra doble (ARNasa-ds, por ejemplo, Dicer) y una ARNasa-ss (por ejemplo, Argonauta 2 o Ago2). El RISC usa la hebra antisentido como guía para encontrar un objetivo escindible. Se conocen tanto los ARNip como los microARN (miARN). Un método de inactivación de un gen en un animal editado genéticamente comprende inducir ARN de interferencia contra un gen y/o ácido nucleico objetivo de modo tal que se reduce la expresión del gen y/o ácido nucleico objetivo.

Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico exógena puede inducir una interferencia de ARN contra un ácido nucleico que codifica un polipéptido. Por ejemplo, se puede usar pequeños ARN de interferencia de hebra doble (ARNip) o ARN de horquilla pequeña (ARNsh) homólogo a un ADN objetivo para reducir la expresión de ese ADN. Los constructos para el ARNip se pueden producir como se describe, por ejemplo, en Fireet al.(1998)Nature391:806; Romano and Masino (1992)Mol. Microbiol.6:3343; Cogoniet al.(1996)Em Bo J.15:3153; Cogoni and Masino (1999)Nature399:166; Misquitta and Paterson (1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA96:1451; y Kennerdell and Carthew (1998)Cell95:1017. Los constructos para el ARNsh se pueden producir como describen McIntyre and Fanning (2006)BMC Biotechnology6:1. En general, los ARNsh se transcriben como una molécula de ARN de una hebra única que contiene regiones complementarias, que se pueden recocer y formar horquillas cortas.

La probabilidad de encontrar un único ARNip o miARN funcional dirigido a un gen específico es alta. La predictibilidad de una secuencia específica de ARNip, por ejemplo, es de aproximadamente el 50 %, pero se pueden fabricar varios ARN de interferencias con la seguridad de que al menos uno de ellos será efectivo.

Se describen en la presente una célulain vitro,una célulain vivoy un animal editado genéticamente, tal como un animal de ganado, que expresan un ARNi dirigido contra un gen neuroendocrino selectivo para la maduración sexual. Se describe en la presente además un ARNi dirigido contra un gen del grupo que consiste en Gpr54, Kiss1 y GnRH1 (por sus siglas en inglés, respectivamente). El ARNi puede ser, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en ARNip, ARNsh, ARNd, RISC y miARN.

Sistemas inducibles

Se puede usar un sistema inducible para controlar la expresión de un gen de maduración sexual. Se conocen varios sistemas inducibles que permiten el control espacio-temporal de la expresión de un gen. Varios han demostrado ser funcionalesin vivoen animales transgénicos.

Un ejemplo de sistema inducible es el sistema promotor de tetraciclina (tet)-on, que se puede usar para regular la transcripción del ácido nucleico. En este sistema, un represor Tet mutado (TetR) se fusiona con el dominio de activación de la proteína transactivadora VP16 del virus del herpes simple para crear un activador transcripcional controlado por tetraciclina (tTA), que está regulado por tet o doxiciclina (dox). En ausencia de antibiótico, la transcripción es mínima, mientras que en presencia de tet o dox, la transcripción es inducida. Los sistemas inducibles alternativos incluyen los sistemas de ecdisona o rapamicina. La ecdisona es una hormona de la muda de los insectos cuya producción está controlada por un heterodímero del receptor de la ecdisona y el producto del gen ultraespiráculo (USP, por sus siglas en inglés). La expresión se induce por el tratamiento con ecdisona o un análogo de la ecdisona como la muristerona A. El agente que se administra al animal para activar el sistema inducible se denomina agente inductor.

El sistema inducible por tetraciclina y el sistema de recombinasa Cre/loxP (constitutivo o inducible) se encuentran entre los sistemas inducibles más usados. El sistema inducible por tetraciclina implica un transactivador controlado por tetraciclina (tTA)/tTA inversa (rtTA). Un método para usar estos sistemasin vivoconsiste en generar dos líneas de animales editados genéticamente. Una línea animal expresa el activador (tTA, rtTA o recombinasa Cre) bajo el control de un promotor seleccionado. Otro conjunto de animales transgénicos expresan el aceptor, en el cual la expresión del gen de interés (o del gen que se desea modificar) está bajo el control de la secuencia objetivo para los transactivadores tTA/rtTA (o está flanqueada por secuencias loxP). El apareamiento de las dos cepas de ratones permite controlar la expresión genética.

Los sistemas reguladores dependientes de tetraciclina (sistemas tet) se basan en dos componentes, es decir, un transactivador controlado por tetraciclina (tTA o rtTA) y un promotor dependiente de tTA/rtTA que controla la expresión de un ADNc corriente abajo, de forma dependiente de tetraciclina. En ausencia de tetraciclina o sus derivados (como la doxiciclina), la tTA se une a las secuencias tetO, lo que permite la activación transcripcional del promotor dependiente de la tTA. Sin embargo, en presencia de doxiciclina, la tTA no puede interactuar con su objetivo y no se produce la transcripción. El sistema tet que usa tTA se denomina tet-Off, porque la tetraciclina o la doxiciclina permiten la regulación transcripcional a la baja. La administración de tetraciclina o sus derivados permite el control temporal de la expresión del transgénin vivo.rtTA es una variante de tTA que no es funcional en ausencia de doxiciclina, sino que requiere la presencia del ligando para la transactivación. Por ello, este sistema tet se denomina tet-On. Los sistemas tet se han usadoin vivopara la expresión inducible de varios transgenes, que codifican, por ejemplo, genes reporteros, oncogenes o proteínas involucradas en una cascada de señalización.

El sistema Cre/lox usa la recombinasa Cre, que cataliza la recombinación de sitios específicos mediante el cruce entre dos secuencias de reconocimiento Cre distantes, es decir, sitios loxP. Una secuencia de ADN introducida entre las dos secuencias loxP (denominado ADN flanqueado) es removida por recombinación mediada por Cre. El control de la expresión de Cre en un animal transgénico, ya sea por control espacial (con un promotor específico de tejido o célula) o temporal (con un sistema inducible), tiene como resultado el control de la escisión del ADN entre los dos sitios loxP. Una de sus aplicaciones es la inactivación condicional de genes (silenciamiento condicional). Otro enfoque es la sobreexpresión de proteínas, en donde se inserta un codón de paro flanqueado con la secuencia del promotor y el ADN de interés. Los animales editados genéticamente no expresan el transgén hasta que se expresa Cre, lo que provoca la escisión del codón de paro flanqueado. Este sistema se ha aplicado a la oncogénesis específica de tejidos y a la expresión controlada de receptores antigenéticos en linfocitos B. También se han desarrollado recombinasas Cre inducibles. La recombinasa Cre inducible solamente se activa por la administración de un ligando exógeno. Las recombinasas Cre inducibles son proteínas de fusión que contienen la recombinasa Cre original y un dominio específico de unión a ligando. La actividad funcional de la recombinasa Cre depende de un ligando externo capaz de unirse a este dominio específico de la proteína de fusión.

Se describen en la presente una célulain vitro,una célulain vivoy un animal editado genéticamente, tal como un animal de ganado, que comprenden un gen neuroendocrino selectivo para la maduración sexual que está bajo el control de un sistema inducible. La modificación genética de un animal puede ser genómica o en mosaico. Se describe en la presente además un gen del grupo formado por Gpr54, Kiss1 y GnRH1 que está bajo el control de un sistema inducible. El sistema inducible puede ser, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en Tet-On, Tet-Off, Cre-lox y Hif1 alfa.

Vectores y ácidos nucleicos

Se pueden introducir una variedad ácidos nucleicos en las células con fines de silenciamiento, para inactivar un gen, para obtener la expresión de un gen o para otros fines. Como se usa en la presente, el término ácido nucleico incluye ADN, ARN y análogos de ácidos nucleicos, y ácidos nucleicos que son de hebra doble o de hebra única (es decir, una hebra única en sentido o en antisentido). Los análogos del ácido nucleico se pueden modificar en el resto de la base, el resto del azúcar o la cadena principal de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, la hibridación o la solubilidad del ácido nucleico. Las modificaciones en el resto de la base incluyen la desoxiuridina para la desoximidina, y la 5-metil-2'-desoxicitidina y la 5-bromo-2'-doxicitidina para la desoxicitidina. Las modificaciones del resto del azúcar incluyen la modificación del 2'-hidroxilo del azúcar ribosa para formar azúcares 2'-O-metilo o 2'-O-alilo. La cadena principal de desoxirribosa fosfato se puede modificar para producir ácidos nucleicos morfolinos, en donde cada resto de la base base se une a un anillo morfolino de seis miembros, o ácidos nucleicos peptídicos, en donde la cadena principal de desoxifosfato se sustituye por una cadena principal pseudopeptídica y se conservan las cuatro bases. Ver, Summerton and Weller (1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7(3):187; y Hyrupet al.(1996)Bioorgan. Med. Chem.4:5. Además, la cadena principal de desoxifosfato se puede sustituir, por ejemplo, por una cadena principal de fosforotioato o fosforoditioato, una fosforoamidita o una cadena principal de fosfotriester de alquilo.

La secuencia de ácido nucleico objetivo puede estar enlazada operativamente a una región reguladora, tal como un promotor. Las regiones reguladoras pueden ser regiones reguladoras porcinas o de otras especies. Como se usa en la presente, el término “enlazado operativamente” se refiere al posicionamiento de una región reguladora en relación con una secuencia de ácido nucleico de modo tal que permita o facilite la transcripción del ácido nucleico objetivo.

Cualquier tipo de promotor se puede enlazar operativamente a una secuencia de ácido nucleico objetivo. Los ejemplos de promotores incluyen, sin limitación, promotores específicos de tejido, promotores constitutivos, promotores inducibles y promotores que responden o no responden a un estímulo particular. Los promotores específicos de tejido adecuados pueden resultar en la expresión preferente de un transcrito de ácido nucleico en las células beta e incluyen, por ejemplo, el promotor de la insulina humana. Otros promotores específicos de tejido pueden resultar en una expresión preferente en, por ejemplo, hepatocitos o tejido cardíaco y pueden incluir los promotores de albúmina o de cadena pesada de alfamiosina, respectivamente. En otras realizaciones, se puede usar un promotor que facilite la expresión de una molécula de ácido nucleico sin una especificidad tisular o temporal significativa (es decir, un promotor constitutivo). Por ejemplo, un promotor de beta-actina, tal como el promotor del gen de la beta-actina de pollo, el promotor de la ubiquitina, el promotor de miniCAG, el promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, por sus siglas en inglés) o el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa (PGK, por sus siglas en inglés), así como promotores virales como el promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simple (VHS-TK), el promotor del SV40 o un promotor del citomegalovirus (CMV). En algunas realizaciones, se usa como promotor una fusión del promotor del gen de la beta actina de pollo y el potenciador del CMV. Ver, por ejemplo, Xuet al.(2001)Hum. Gene Ther.12:563; y Kiwakiet al.(1996)Hum. Gene Ther.7:821.

Otras regiones reguladoras que pueden ser útiles en los constructos de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, secuencias de poliadenilación, secuencias de control de la traducción (por ejemplo, un segmento interno de entrada al ribosoma, IRES), potenciadores, elementos inducibles o intrones. Estas regiones reguladoras pueden no ser necesarias, aunque pueden aumentar la expresión al afectar a la transcripción, la estabilidad del ARNm, la eficiencia de la traducción o similares. Tales regiones reguladoras se pueden incluir en un constructo de ácido nucleico como se desee para obtener una expresión óptima de los ácidos nucleicos en las células. Sin embargo, a veces se puede obtener una expresión suficiente sin esos elementos adicionales.

Se puede usar un constructo de ácido nucleico que codifique péptidos señal o marcadores seleccionables. Los péptidos señal se pueden usar de modo tal que un polipéptido codificado se dirija a una localización celular concreta (por ejemplo, la superficie celular). Los ejemplos no limitantes de marcadores seleccionables incluyen puromicina, ganciclovir, adenosina deaminasa (ADA, por sus siglas en inglés), aminoglucósido fosfotransferasa (neo, g 418, APH, por sus siglas en inglés), dihidrofolato reductasa (DHFR, por sus siglas en inglés), higromicina-B-fosfotransferasa, timidina cinasa (TK) y xantina-guanina fosforribosiltransferasa (XGPRT, por sus siglas en inglés). Estos marcadores son útiles para seleccionar transformantes estables en cultivo. Otros marcadores seleccionables incluyen polipéptidos fluorescentes, tal como la proteína verde fluorescente o la proteína amarilla fluorescente.

En algunas realizaciones, una secuencia que codifica un marcador seleccionable puede estar flanqueada por secuencias de reconocimiento para una recombinasa, tales como, por ejemplo, Cre o Flp. Por ejemplo, el marcador seleccionable puede estar flanqueado por sitios de reconocimiento loxP (sitios de reconocimiento de 34 pb reconocidos por la recombinasa Cre) o sitios de reconocimiento FRT de modo tal que el marcador seleccionable pueda ser removido del constructo. Ver, Orban,et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1992) 89:6861, para una revisión de la tecnología Cre/lox, y Brand and Dymecki,Dev. Cell(2004) 6:7. También se puede usar un transposón con un transgén activable por Cre o Flp interrumpido por un gen marcador seleccionable para obtener animales transgénicos con expresión condicional de un transgén. Por ejemplo, un promotor que impulse la expresión del marcador/transgén puede ser ubicuo o específico de un tejido, lo que resultaría en la expresión ubicua o específica de un tejido del marcador en animales F0 (por ejemplo, cerdos). La activación tisular específica del transgén se puede lograr, por ejemplo, al cruzar un cerdo que exprese de forma ubicua un transgén interrumpido por un marcador con un cerdo que exprese Cre o Flp de forma tisular específica, o al cruzar un cerdo que exprese un transgén interrumpido por un marcador de forma tisular específica con un cerdo que exprese de forma ubicua la recombinasa Cre o Flp. La expresión controlada del transgén o la escisión controlada del marcador permiten la expresión del transgén.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico exógeno codifica un polipéptido. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido puede incluir una secuencia de etiqueta que codifica una “etiqueta” diseñada para facilitar la manipulación subsecuente del polipéptido codificado (por ejemplo, para facilitar la localización o la detección). Las secuencias de etiquetas se pueden insertar en la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, de modo tal que la etiqueta codificada se localice en el extremo carboxilo o amino del polipéptido. Los ejemplos no limitantes de etiquetas codificadas incluyen glutatión S-transferasa (GST, por sus siglas en inglés) y la etiqueta FLAG™ (Kodak, New Haven, Conn.).

Los constructos de ácido nucleico se pueden metilar usando una metilasa CpG SssI (New England Biolabs, Ipswich, Mass.). En general, el constructo de ácido nucleico se puede incubar con S-adenosilmetionina y SssI CpG-metilasa en un amortiguador a 37 °C. La hipermetilación se puede confirmar al incubar el constructo con una unidad de endonucleasa HinP11 por 1 hora a 37 °C y analizándola por electroforesis en gel de agarosa.

Los constructos de ácido nucleico se pueden introducir en células animales embrionarias, fetales o adultas de cualquier tipo, incluyendo, por ejemplo, células germinales, tales como un ovocito o un óvulo, una célula progenitora, una célula madre adulta o embrionaria, una célula germinal primordial, una célula renal como una célula PK-15, una célula islote, una célula beta, una célula hepática o un fibroblasto, tal como un fibroblasto dérmico, usando varias técnicas. Los ejemplos no limitantes de técnicas incluyen el uso de sistemas de transposones, virus recombinantes que pueden infectar células, o liposomas u otros métodos no virales como electroporación, microinyección, o precipitación de fosfato de calcio, que son capaces de suministrar ácidos nucleicos a las células.

En los sistemas de transposones, la unidad transcripcional de un constructo de ácido nucleico, es decir, la región reguladora enlazada operativamente a una secuencia de ácido nucleico exógena, está flanqueada por una repetición invertida de un transposón. Varios sistemas de transposones, que incluyen, por ejemplo, Sleeping Beauty (por su nombre en inglés, ver, la patente de EE. UU. No. 6,613,752 y la publicación de EE. UU. No. 2005/0003542); Frog Prince (por su nombre en inglés, Miskeyet al.(2003)Nucleic Acids Res.31:6873); Tol2 (Kawakami (2007)Genome Biology8(Suppl.1): S7; Minos (Pavlopouloset al.(2007)Genome Biology8(Suppl.1):S2); Hsmar1 (Miskeyet al.(2007)Mol Cell Biol.27:4589); y Passport se han desarrollado para introducir ácidos nucleicos en células, incluidas células de ratón, humanas y porcinas. El transposón de Sleeping Beauty es especialmente útil. Una transposasa se puede suministrar como una proteína, codificada en el mismo constructo de ácido nucleico que el ácido nucleico exógeno, se puede introducir en un constructo de ácido nucleico separada, o suministrarse como un ARNm (por ejemplo, un ARNm transcritoin vitroy taponado).

Los elementos aislantes también se pueden incluir en un constructo de ácido nucleico para mantener la expresión del ácido nucleico exógeno e inhibir la transcripción no deseada de genes huésped. Ver, por ejemplo, la publicación de EE. UU. No. 2004/0203158. Típicamente, un elemento aislante flanquea cada lado de la unidad transcripcional y es interno a la repetición invertida del transposón. Entre los ejemplos no limitativos de elementos aislantes se incluyen los elementos aislantes de tipo región de fijación de matriz (MAR, por sus siglas en inglés) y los elementos aislantes de tipo borde. Ver, por ejemplo, las patentes de EE. UU. No. 6,395,549, 5,731,178, 6,100,448, y 5,610,053, y la publicación de EE. UU. No.

2004/0203158.

Los ácidos nucleicos se pueden incorporar a vectores. Un vector es un término amplio que incluye cualquier segmento específico de ADN diseñado para pasar de un portador a un ADN objetivo. Un vector se puede referir como un vector de expresión, o sistema vectorial, que es un conjunto de componentes necesarios para provocar la inserción de ADN en un genoma u otra secuencia de ADN objetivo, como un episoma, un plásmido o incluso un segmento de ADN de virus/fagos. Los sistemas vectoriales, tales como los vectores virales (por ejemplo, retrovirus, virus adenoasociados y virus fago integradores), y los vectores no virales (por ejemplo, transposones) usados para el suministro de genes en animales tienen dos componentes básicos: 1) un vector compuesto de ADN (o ARN que se transcribe inversamente en un ADNc) y 2) una transposasa, recombinasa u otra enzima integrasa que reconoce tanto el vector como una secuencia de ADN objetivo e inserta el vector en la secuencia de ADN objetivo. Los vectores a menudo contienen uno o más casetes de expresión que comprenden una o más secuencias de control de la expresión, en donde una secuencia de control de la expresión es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y/o traducción de otra secuencia de ADN o ARNm, respectivamente.

Se conocen muchos tipos diferentes de vectores. Por ejemplo, se conocen los plásmidos y los vectores virales, por ejemplo, los vectores retrovirales. Los plásmidos de expresión de mamíferos típicamente tienen un origen de replicación, un promotor adecuado y un potenciador opcional, los sitios de unión a ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de empalme, secuencias de terminación transcripcional y secuencias 5' flanqueantes no transcritas. Algunos ejemplos de vectores son: plásmidos (que también pueden ser portadores de otro tipo de vector), adenovirus, virus adenoasociados (AAV, por sus siglas en inglés), lentivirus (por ejemplo, VIH-1 modificado, VIS o VISF, por sus siglas en inglés, respectivamente), retrovirus (por ejemplo, ASV, ALV o MoMLV, por sus siglas en inglés, respectivamente) y transposones (por ejemplo, Sleeping Beauty, elementos P, Tol-2, Frog Prince, piggyBac (por su nombre en inglés).

Como se usa en la presente, el término ácido nucleico se refiere tanto al ARN como al ADN, incluyendo, por ejemplo, el ADNc, el ADN genómico, el ADN sintético (por ejemplo, sintetizado químicamente), así como los ácidos nucleicos naturales y los modificados químicamente, por ejemplo, las bases sintéticas o las cadenas principales alternativos. Una molécula de ácido nucleico puede ser de hebra doble o de hebra única (es decir, de hebra única en sentido o antisentido). El término transgénico se usa en la presente en sentido amplio y se refiere a un organismo editado genéticamente u organismo modificado genéticamente cuyo material genético ha sido alterado usando técnicas de ingeniería genética. Un animal silenciado es, por lo tanto, transgénico independientemente de si los genes o ácidos nucleicos exógenos se expresan o no en el animal o en su progenie.

Animales fundadores, líneas de animales, rasgos y reproducción

Los animales fundadores se pueden producir por clonación y otros métodos descritos en la presente. Los fundadores pueden ser homocigotos para una modificación genética, tal como en el caso de que un cigoto o una célula primaria sufran una modificación homocigota. Del mismo modo, también se pueden hacer fundadores que sean heterocigotos. En el caso de los silenciamientos de NANOS, los fundadores son preferiblemente heterocigotos. Los fundadores pueden estar genómicamente modificados, lo que significa que todas las células de su genoma han sufrido modificaciones. Los fundadores pueden ser mosaicos para una modificación, tal como puede ocurrir cuando los vectores se introducen en una de las pluralidades de células de un embrión, típicamente en la etapa de blastocisto. La progenie de animales mosaicos se puede analizar para identificar la progenie genómicamente modificada. Se establece una línea animal cuando se ha creado un grupo de animales que se pueden reproducir sexualmente o por técnicas de reproducción asistida, con progenie heterogénea u homocigota que exprese sistemáticamente la modificación.

En el ganado, se sabe que muchos alelos están relacionados con varios rasgos, tales como los de producción, los de tipo, los de manejabilidad, y otros rasgos funcionales. Los expertos están acostumbrados a controlar y cuantificar estos rasgos, por ejemplo, Visscheret al., Livestock Production Science,40 (1994) 123-137, las patentes de EE. UU. No.

7,709,206, US 2001/0016315, US 2011/0023140, y US 2005/0153317. Una línea animal puede incluir un rasgo elegido entre un rasgo del grupo que consiste en un rasgo de producción, un rasgo de tipo, un rasgo de trabajabilidad, un rasgo de fertilidad, un rasgo de manejabilidad, y un rasgo de resistencia a enfermedades. Otros rasgos incluyen la expresión de un producto genético recombinante.

Los animales con un rasgo o rasgos deseados se pueden modificar para prevenir su maduración sexual. Dado que los animales son estériles hasta que maduran, es posible regular la madurez sexual como medio de controlar la diseminación de los animales. De este modo, los animales reproducidos o modificados para poseer uno o varios rasgos se pueden proporcionar a los receptores con un riesgo reducido de que éstos los reproduzcan y se apropien del valor de los rasgos. Se describe en la presente la modificación genética del genoma de un animal con la modificación que comprende un gen de maduración sexual inactivado, en donde el gen de maduración sexual en un animal de tipo silvestre expresa un factor selectivo para la maduración sexual. Se describe en la presente además el tratamiento del animal al administrar un compuesto para remediar una deficiencia causada por la pérdida de expresión del gen para inducir la maduración sexual en el animal.

La reproducción de animales que requieren la administración de un compuesto para inducir la madurez sexual se puede realizar ventajosamente en un centro de tratamiento. El centro de tratamiento puede aplicar protocolos estandarizados en poblaciones bien controladas para producir eficientemente animales consistentes. La progenie animal se puede distribuir a una pluralidad de lugares para su reproducción. Las granjas y los granjeros (término que incluye a los ranchos y a los ganaderos) pueden así encargar un número deseado de progenie con un rango especificado de edades y/o pesos y/o rasgos y hacer que se les suministre en el momento y/o lugar deseados. Los destinatarios, por ejemplo, los ganaderos, pueden entonces criar los animales y suministrarlos en el mercado como deseen.

Se describe en la presente el suministro (por ejemplo, a una o más lugares, a una pluralidad de granjas) de un animal de ganado genéticamente editado que tiene un gen neuroendocrino inactivado selectivo para la maduración sexual. También se describe en la presente el suministro de animales con una edad comprendida entre 1 día y 180 días. El animal puede tener uno o más rasgos (por ejemplo, uno que exprese un rasgo deseado o un rasgo de alto valor o un rasgo novedoso o un rasgo recombinante). También se describe en la presente el suministro de dicho animal y/o su reproducción.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertos atributos particulares y/o realizaciones. Los ejemplos no se deben interpretar como una limitación de la divulgación a las características o realizaciones particulares ejemplificadas.

Ejemplo 1

Diseño, construcción y prueba de reactivos TALEN NANOS2 porcinos

NANOS2 porcino se localiza en el cromosoma 6 y constituye un único exón que codifica una proteína de 138 aminoácidos. Se llevó a cabo una alineación múltiple de secuencias de cerdos independientes para identificar posibles polimorfismos de un único nucleótido (señalados con puntos rojos en la Figura 1) y, en la medida de lo posible, se evitaron durante la selección de los sitios de unión de TALEN. Se identificaron sitios potenciales para la unión de TALEN NANOS2 porcinos cerca del extremo 5' del gen usando la herramienta disponible gratuitamente en www.zifit.partners.org. Se construyeron tres pares de TALEN usando el protocolo de ensamblaje de Golden Gate TALEN (Cermaket al, NAR2011 39(12):e82). El ensamblaje de TALEN derecho se clonó en el vector de destino pCAG-T7-TALEN (Sangamo)-FokI-KKR-Destino y el izquierdo en pCAG-T7-TALEN (Sangamo)-FokI-ELD-Destino. Se realizó una digestión de restricción diagnóstica usando las enzimas BspeI y StuI/AatII (por sus siglas en inglés, respectivamente), y los clones positivos se confirmaron por secuenciación del ADN. TALEN NANOS2 porcino.

A SEQ ID NO: 75

TGCCATGCAGCTGCCACCCTTTGACATGT GGAAGGACTACTTCAACCTGAGCCA 18:18:18

A Izquierda

1) NG1-NN2-HD3-HD4-NI5-NG6-NN7-HD8-NI9-NN10--pFUS_A

2) HD1-NG2-NN3-HD4-HD5-NI6-HD7--pFUS_B7

A Derecha

1) NG1-NN2-NN3-HD4-NG5-HD6-NI7-NN8-NN9-NG10--pFUS_A

2) NG1-NN2-NI3-NI4-NN5-NG6-NI7--pFUS_B7

B SEQ ID NO: 78

TTTGACAT GT GGAAGGACT ACTTCAACCTGAGCCAGGT GGTGTTGGGACTGA 18:16:18

B Izquierda

1) NG1-NG2-NG3-NN4-NI5-HD6-NI7-NG8-NN9-NG10--pFUS_A

2) NN1-NN2-NI3-NI4-NN5-NN6-NI7--pFUS_B7

B Derecha

1) NG1-HD2-NI3-NN4-NG5-HD6-HD7-HD8-NI9-NI10--pFUS_A

2) HD1-NI2-HD3-HD4-NI5-HD6-HD7--pFUS_B7

C SEQ ID NO: 81

TCAACCTGAGCCAGGTGGTGTTGGGACT GATCCAGAATCGTCGACAAGGGCCA 18:17:18

C Izquierda

1) NG1-HD2-NI3-NI4-HD5-HD6-NG7-NN8-NI9-NN10-pFUS_A

2) HD1-HD2-NI3-NN4-NN5-NG6-NN7-pFUS_B7

C Derecha

1) NG1-NN2-NN3-HD4-HD5-HD6-NG7-NG8-NN9-NG10-pFUS_A

2) HD1-NN2-NI3-HD4-NN5-NI6-NG7-pFUS_B7

Las células PK15 de riñón porcino se cultivaron en DMEM (por sus siglas en inglés) con alto contenido en glucosa (Life Technologies, #31966) suplementado con 10 % de suero fetal bocino, 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina en una incubadora humidificada a 37 °C con 5 % de CO2. Un microgramo de ADN de plásmido maxiprep libre de endotoxinas que codifica cada mitad de los pares A, B o C de TALEN, junto con 1 pg de un plásmido que codifica una eGFP dirigida por CMV se cotransfectaron en 6x105 de células PK15 usando un electroporador Neon ajustado a 2 pulsos de 1400 mV por 20 ms cada uno. Las células transfectadas se recuperaron en medio completo sin antibiótico. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se transfirieron de 37 °C a una incubadora de 30 °C y se mantuvieron allí por 48 horas. Las células GFP ve (por sus siglas en inglés) se aislaron por clasificación celular activada por fluorescencia, se expandieron por cultivo y se preparó ADN genómico usando el kit Qiagen Dneasy Blood and Tissue. La PCR se llevó a cabo en el ADN genómico usando la polimerasa de alta fidelidad Accuprime con los cebadores PCR oSL9 y oSL10.

El análisis celular se llevó a cabo en los productos de la PCR de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Transgenomic). Los productos de PCR digeridos se resolvieron en un gel de agarosa TAE al 2 % (Figura 2). Sorprendentemente, hubo diferencias sustanciales en la eficiencia con la que los pares TALEN fueron capaces de inducir eventos NHEJ en sus sitios objetivo. Se observó una baja actividad para el par TALEN A (flecha verde, Figura 2), la actividad no fue detectable para el par TALEN B, y fue mejor para el par TALEN C (flechas rojas, Figura 2).

Diseño, construcción y prueba de reactivos CRISPR NANOS2 porcinos

Los posibles sitios objetivo del ARN guía pequeño se identificaron inicialmente basados en la presencia de motivos adyacentes al protoespaciador (PAM) dentro de la secuencia codificante del gen NANOS2 porcino (determinada por la presencia de dos residuos de guanina consecutivos en orientación sentido o antisentido dentro de dicha secuencia codificante). Los sitios identificados de este modo que abarcaban un SNP (por sus siglas en inglés) potencial (como se indica con puntos rojos en la Figura 1) se excluyeron de los análisis posteriores. Cada uno de los sitios restantes se analizó en busca de posibles uniones fuera del objetivo usando el algoritmo BLAST (ncbi.nlm.nih.gov) para analizar el genoma porcino en busca de coincidencias de secuencia. Se seleccionó un sitio de unión del ARNsg que parecía tener una alta especificidad para el gen NANOS2 dentro del genoma porcino. Esta secuencia de 20 pares de bases tuvo fortuitamente una secuencia PAM en cada orientación.

Sitios de unión de NANOS2

5' ccagaatcgtcgacaagggccagagg 3' (SEQ ID NO: 86)

3' ggtcttagcagctgttcccggtctcc 5' (SEQ ID NO: 87)

La secuencia subrayada es el sitio de unión para las secuencias guía NANOS2 porcinas tanto en orientación sentido como antisentido (SEQ ID NO: 86 y 87). En la hebra sentido, el PAM se indica por la secuencia agg 3' del sitio objetivo. En la hebra antisentido, la PAM se indica por la secuencia tgg 3' del sitio objetivo.

Las versiones sentido y antisentido de la secuencia de unión a ARN guía identificada se diseñaron y ordenaron como gBloques (IDT) con el promotor U6 humano impulsando la expresión de la secuencia de unión a ARNsg, un andamio de ARN guía (también referido como dominio de unión a Cas9) y una secuencia terminadora (poli-T) (Figuras 3A y 3B). Los ADN en gBloques se clonaron en un plásmido y se preparó ADN plasmídico libre de endotoxinas (Qiagen), (Figura 3C). Tres plásmidos que codifican la secuencia ARNsg, una Cas9 impulsada por CAG y una eGFP impulsada por CMV respectivamente se cotransfectaron en 6x105 células PK15 usando un electroporador Neon ajustado a 2 pulsos de 1400 mV por 20 ms cada uno. Las células transfectadas se recuperaron en medio completo sin antibiótico. Tres días después de la transfección se aislaron las células positivas para GFP por clasificación celular activada por fluorescencia, se expandieron por cultivo y se preparó ADN genómico usando el kit Qiagen DNeasy Blood and Tissue. La PCR se llevó a cabo a partir de este ADN genómico usando la polimerasa de alta fidelidad Accuprime con los cebadores de PCR oSL9 y oSL10. El análisis celular se llevó a cabo en los productos de la PCR de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Transgenomic). Los productos de PCR digeridos se resolvieron en un gel de agarosa TAE al 2 % (Figura 4). Aunque ambas secuencias guía provocaron el corte y la formación de NHEJ en el sitio objetivo (indicado por la presencia de productos de digestión de CELI, flechas rojas, Figura 4), sorprendentemente se descubrió que la secuencia ARNsg en orientación antisentido con respecto a la secuencia codificante fue sustancialmente más eficiente que su homóloga en sentido.

Ejemplo 2

Diseño, construcción y prueba de reactivos CRISPR NANOS2 bovinos

Los sitios objetivo potenciales para los ARNsg se identificaron inicialmente basados en la presencia de secuencias de PAM dentro de la secuencia codificante del gen NANOS2 bovino o de la secuencia que flanquea inmediatamente a la secuencia codificante. Cada sitio potencial se analizó en busca de posibles uniones fuera del objetivo usando el algoritmo de BLAST (ncbi.nlm.nih.gov) para analizar el genoma bovino en busca de coincidencias de secuencia. Se seleccionaron nueve sitios potenciales de unión del ARNsg (tres 5' a la secuencia codificante, tres dentro de la secuencia codificante, y tres 3' al codón de paro) que parecían tener una alta especificidad para el gen NANOS2 dentro del genoma bovino.

Para cada sitio de unión del ARNsg identificado, se diseñaron 2 secuencias guía: una secuencia de unión de 20-mero, y una secuencia de unión de 19-, 18- o 17-mero. Ver la Tabla 1 y la Figura 12.

Tabla 1

Las secuencias de ARN guía se construyeron como un par de oligonucleótidos que, una vez recocidos, se podían clonar en los sitios BbsI del plásmido px458 (Figura 5A, 5B y 5C). Esto produjo un único plásmido con una secuencia de ARNsg humana impulsada por U6, seguida de una Cas9 impulsada por CAG con una GFP escindible por 2A. La lista de plásmidos se encuentra en la Tabla 2, ver la Figura 12.

Tabla 2

Se transfectó un microgramo de ADN plasmídico miniprep (Qiagen) en 6x105 de células de fibroblastos embrionarios bovinos (BEF, por sus siglas en inglés) usando un electroporador Neon ajustado a un único pulso de 1800 mV por 20 ms. Dos días después de la transfección se preparó ADN genómico con el kit Qiagen DNeasy Blood and Tissue. La PCR se llevó a cabo a partir de este ADN genómico usando la polimerasa de alta fidelidad Accuprime con los cebadores de PCR oSL86 y oSL87.

El análisis de la endonucleasa T7 se llevó a cabo en productos de PCR purificados de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (NEB). Los productos de PCR digeridos se resolvieron en un gel de agarosa TAE al 1,4 % (Figuras 6A y 6B). Sorprendentemente, se descubrieron diferencias sustanciales en las eficiencias con las que los ARNsg fueron capaces de inducir la formación de NHEJ en sus sitios objetivo (indicado por la presencia de productos de digestión de la endonucleasa T7, flechas rojas, Figuras 6A y 6B).

Las secuencias guía con la mayor actividad determinada por el ensayo de la endonucleasa T7 para NHEJ se combinaron en pares, de modo tal que la escisión en ambos sitios objetivo dentro de una célula tiene el potencial de causar una deleción de la secuencia intermedia. Se transfectó un microgramo de cada uno de los plásmidos pSL32 pSL38, pSL32 pSL39, pSL32 pSL42, pSL33 pSL38, pSL33 pSL39 o pSL33 pSL42 en 6x105 células B<e>F. La transfección, el cultivo y la preparación del ADN de las células BEF se realizaron como se ha indicado anteriormente. La PCR se llevó a cabo en ADN genómico usando la polimerasa de alta fidelidad Accuprime con los cebadores de PCR oSL86 y oSL87, y los productos se resolvieron en un gel de agarosa TAE al 1,4 % (Figura 7). Las seis combinaciones de plásmidos demostraron que, además del producto de PCR de longitud completa, las poblaciones celulares transfectadas también albergaron fragmentos truncados del gen NANOS2 de un tamaño específico para la combinación de secuencias de ARNsg empleada (flechas rojas, Figura 7).

Estos fragmentos truncados se removieron del gel y el ADN se separó de la agarosa al centrifugar el fragmento del gel en un filtro de tubo de centrifugado Spin-X (Costar #8163). Los productos purificados se clonaron en un vector pCR 4-TOPO (por su nombre en inglés) usando el kit de clonación TOPO TA para la secuenciación (Invitrogen #45-0030) y se transformaron en células competentes XL-1 Azul (Agilent Technologies #200249). Las bacterias transformadas se sembraron en placas de agar LB (por sus siglas en inglés) con 100 pg/mL de ampicilina y se cultivaron a 37 °C durante la noche. Se seleccionaron cinco colonias de cada placa y se expandieron durante la noche en medio LB con 50 pg/mL de ampicilina. El plásmido se aisló usando un sistema de minipreparación de plásmidos PureYield (Promega #A1223) y se envió para secuenciación (Edinburgh Genomics) usando el cebador oSL86. La alineación de las secuencias demuestra que en cada caso se había producido una deleción dentro de la secuencia objetivo (Figura 8). Se detectó una unión precisa entre los extremos de los fragmentos eliminados en al menos un clon de cada transfección, mientras que otros clones representaron eventos más imprecisos, lo que indica que se produjo una modificación adicional de la secuencia durante el proceso de unión de los extremos. Todos los clones secuenciados a partir de la combinación de pSL33 pSL38 mostraron eventos de unión de extremos idénticos y precisos.

Este enfoque indica que es posible, y posiblemente deseable, provocar deleciones específicas en el gen objetivo que resulten en la pérdida o reducción de la expresión de la proteína codificada o en la alteración de la función de la proteína traducida resultante, como una estrategia adicional a la inducción de NHEJ y las consecuentes mutaciones de cambio de marco.

Ejemplo 3

El sistema CRISPR/Cas para el abatimiento genético

Tras la exitosa validación en cultivo celular, como se muestra en la Figura 4, la secuencia guía se ensambló con un promotor T7 y se sintetizó como un gBloque de IDT technologies. El ensamble con un constructo impulsado por T7 es necesario para la transcripciónin vitroy la producción de ARN. Brevemente, el ARNsg se transcribió usando el kit de transcripciónin vitroT7 (Ambion). De la misma manera, el plásmido Cas9 se obtuvo de Addgene (Plásmido #42234; Nombre: pMJ920), y el ARNm de Cas9 se transcribió usando el kit de transcripciónin vitroT7 Megascript (Figura 9A).

Tanto el ARNm de Cas9 (100 ng/pL) como el ARNsg dirigido a NANOS2 (50 ng/pL) se inyectaron en cigotos porcinos de 1 célula usando un inyector Eppendorf FemtoJet en un ajuste de flujo continuo. Se dejó que los embriones inyectados progresaran hasta la fase de blastocisto (Figura 9C) por 6 días más, se recolectó el ADN y se amplificó por PCR alrededor de la zona objetivo. La presencia de deleciones del gen objetivo (como consecuencia de la reparación por NHEJ) se valoró al secuenciar los amplicones de la PCR. Como se muestra en la Figura 9D, se demostró el éxito del direccionamiento allocusde NANOS2. La secuencia que rodea el sitio objetivo CRISPR en NANOS2 se amplificó usando cebadores específicos del gen, se clonó en el vector PCR2.1 (Invitrogen), se transformó en células DH5a (NEB) y las transformantes se seleccionaron basadas en la resistencia a la kanamicina. Las colonias se cultivaron durante la noche, se miniprepararon y los plásmidos se secuenciaron por secuenciación de Sanger. En la Figura 9, “N” representa el alelo NANOS2, el primer dígito es el número de blastocisto y el segundo número con guión representa el clon bacteriano que contiene el NANOS2 amplificado. En la figura, se muestran secuencias representativas de clones indicando deleciones “-” alrededor del sitio de escisión CRISPR previsto. Las secuencias de 8 blastocistos diferentes mostraron una deleción exitosa y la interrupción del marco de lectura abierto de NANOS2, generando alelos silenciados y se muestran en la Figura 9D.

También se seleccionó una segunda secuencia de ARNsg para NANOS2. GAAGACACCGGAGGGCGTGGTGG (SEQ ID NO: 7). Este objetivo y el objetivo anterior GAATCGTCGACAAGGGCCAGAGG (SEQ ID NO: 8), se coinyectaron juntos en embriones de una célula y se cultivaron hasta que el análisis del ADN de los blastocistos demostró deleciones y silenciamiento de los alelos NANOS2, ver la Figura 10.

Uso de pares de nickasas para dirigirse a genes

La nucleasa Cas9 introduce roturas de hebra doble en el ADN. Por el contrario, la nickasa Cas9 solamente corta (o mella) una de las dos hebras del ADN. Cuando se diseñan contra objetivos muy próximos en hebras opuestas, las nickasas emparejadas pueden introducir roturas de hebra doble y, en consecuencia, generar deleciones con gran precisión. La ventaja de usar nickasas emparejadas contra a nucleasas es que incluso si la nickasa de Cas9 muestra una unión fuera de objetivo, solamente una de las dos hebras se mellará, lo que se puede reparar efectivamente sin causar modificaciones no deseadas en el sitio fuera de objetivo. Sin embargo, cuando se usan combinadas en estrecha proximidad, las nickasas introducen la escisión selectiva del ADN. Se diseñó un par de nickasas dirigidas al gen NANOS2 porcino. Sin embargo, las nickasas no fueron efectivas en la introducción de mutaciones (Figura 11). Se diseñó un par de ARNs guía únicos para dirigirse a hebras opuestas. Ambos ARNsg se muestran en la sección en el recuadro de la Figura 11, con la hebra antisentido resaltada en amarillo. Los motivos PAM de ambos ARNsg se resaltan en verde. No se identificaron modificaciones en los alrededores del sitio objetivo.

Generación de modelos porcinos deficientes en NANOS2

Los ARNsg de CRISPR candidatos y el ARNm de Cas9:GFP se inyectaron en embriones porcinos fecundadosin vitro(Figura 9C). Brevemente, los ovocitos en maduración procedentes de cerdas se compraron a ART Inc. (Madison, WI) y se enviaron al laboratorio durante la noche en su medio de maduración comercial #1. Veinticuatro horas después de haber sido colocados en el medio de maduración #1 (suministrado por ART), se colocaron de 50 a 75 complejos de cúmulosovocitos (COC, por sus siglas en inglés) en 500 pL de medio de cultivo tisular 199 (TCM 199) con 0,14 % de PVA (por sus siglas en inglés), 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico, 0,57 mM de cisteína, 0,5 UI/mL de FSH porcina (por sus siglas en inglés) y 0,5 lU/mL de LH ovina (por sus siglas en inglés) y se cultivaron por 20 horas más a 38,5 °C y 5 % de CO2 en aire, 100 % de humedad. Las COC se agitaron en vórtex en hialuronidasa al 0,1 % en medio amortiguado con HEPES con PVA al 0,01 % por 4 minutos para eliminar las células del cúmulo tras la maduración. Se colocaron grupos de 30-35 ovocitos maduros y denudados en 100 pL de un medio amortiguado con Tris modificado (mTBM, por sus siglas en inglés) y se fecundaron de acuerdo con un protocolo establecido usando semen fresco de jabalí ampliado. Brevemente, 1-2 mL de semen extendido se mezclaron con solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (DPBS, por sus siglas en inglés) con 1 mg/mL de BSA (por sus siglas en inglés) hasta un volumen final de 10 mL y se centrifugaron a 1000xg, 25 °C por cuatro minutos; los espermatozoides se lavaron en DPBS un total de tres veces. Tras el lavado final, los espermatozoides se resuspendieron en medio mTBM y se adicionaron a los ovocitos a una concentración final de5x105 espermatozoides/mL, y se coincubaron por 5 horas a 38,5 °C y 5 % de CO2. Cinco horas después de la fecundación, los presuntos cigotos se inyectaron con ARNm de Cas9 y ARNsg dirigido a NANOS2 y los embriones intactos se transfirieron quirúrgicamente a los oviductos de hembras receptoras sincronizadas por la exposición del tracto reproductivo por incisión en la línea media. Se dejó que los animales se recuperaran de la cirugía y se alojaron en las instalaciones del BARC-USDA (por sus siglas en inglés).

Otra alternativa es usar embriones de una célula fecundadosin vivopara la selección de NANOS2 por CRISPR y la generación de animales editados. Los animales donadores de embriones se sincronizan para el estro y se superovulan alimentándolos primero con Regumate (Alterenogest) por 14-16 días, seguido de inyecciones subcutáneas de PG600 (5 mL) el día 17 y 1000 UI de hCG el día 20. Los animales se reproducen tres veces, una en celo permanente (día 20), y otras dos inseminaciones con 8 horas de diferencia el día 21. Los animales se sacrifican humanitariamente el día 22 y los embriones se recolectan por lavado del oviducto. Los embriones se inyectan con ARNm de CRISPR y se transfieren quirúrgicamente a animales receptores sincronizados (o sustitutos) el mismo día, como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 4

Selección y reproducción de animales

Control de animales

Los animales nacidos vivos tras la transferencia de embriones editados serán genotipados de la siguiente manera. Se tomarán muestras de tejidos (por ejemplo, folículos pilosos, muescas en las orejas, pinzas en la cola, sangre) y se extraerá ADN. El gen NANOS2 se amplificará usando cebadores adecuados y se secuenciará. Los animales se caracterizarán como no editados, editados heterocigotos o editados homocigotos.

Fertilidad de hembras homocigotas editadas en NANOS2

Las hembras homocigotas editadas en NANOS2 serán monitoreadas para detectar la pubertad y la capacidad de ovular ovocitos fértiles. Se comprobará la capacidad de los ovocitos para producir blastocistos tras la fecundaciónin vitro.Por ejemplo, las hembras homocigotas editadas con NANOS2 serán sometidas a hemiovariectomía y se examinará el ovario para ver si la ovogénesis es normal. También se criarán las hembras y se controlará el establecimiento de la gestación. En última instancia, la fertilidad de la hembra homocigota editada en NANOS2 se establecerá mediante la producción de descendencia viva y sana. Esperamos que las hembras homocigotas editadas con NANOS2 tengan una fertilidad normal.

Estructura y función testicular de machos heterocigotos y homocigotos editados en NANOS2

Se monitorearán el crecimiento y las dimensiones de los testículos en machos heterocigotos y homocigotos editados en NANOS2. Esperamos que los machos heterocigotos tengan un crecimiento y unas dimensiones testiculares normales, mientras que se espera que los homocigotos muestren un crecimiento testicular reducido y unos testículos pequeños en la pubertad debido a la falta de células germinales. Los machos ejemplo heterocigotos y homocigotos editados en NANOS2 serán sometidos a hemicastración y los testículos examinados citológicamente. Esperamos que los machos heterocigotos muestren una estructura testicular normal con túbulos seminíferos poblados de células de Sertoli y germinales, mientras que se espera que los homocigotos presenten una morfología exclusivamente de células de Sertoli y la ausencia total de células germinales. El volumen y la composición del semen se examinarán tras una recolección de semen adecuada (por ejemplo, vagina artificial, mano enguantada, electroeyaculación). Se espera que los machos heterocigotos tengan volúmenes de semen y recuentos de espermatozoides normales, mientras que los homocigotos mostrarán la ausencia total de espermatozoides.

Trasplante de SSC en los testículos de machos homociaotos editados en NANOS2

Las SSC se cosecharán y propagarán a partir de donadores apropiados, por ejemplo, cerdos Duroc, y las SSC se inyectarán en la red testicular de machos receptores homocigotos editados en NANOS2, por ejemplo, cerdos cruzados Large White * Landrace, a varias edades. En la pubertad o al menos tres meses después del trasplante de SSC, se recolectará semen y se examinará para detectar la presencia de espermatozoides. Si hay espermatozoides, determinaremos su concentración, morfología y motilidad. También determinaremos que los espermatozoides presentes proceden de las SSC del donador y no del receptor, por ejemplo, mostrando la presencia de SNP específicos de Duroc en el gen MC1R para el ejemplo del cerdo. Determinaremos la edad óptima de los cerdos receptores para la máxima producción de espermatozoides, que se debería correlacionar con la eficacia de la colonización de los testículos receptores por las SSC.

Reproducción para la producción de machos homocigotos editados en NANOS2 como receptores de SSC

Se puede producir un suministro de machos homocigotos editados en NANOS2 cruzando hembras homocigotas editadas en NANOS2 con machos heterocigotos editados. El cruce producirá el mismo número de machos y hembras homocigotos y heterocigotos editados. Los machos homocigotos editados se usarán como receptores de SSC, las hembras homocigotas y los machos heterocigotos se usarán como animales reproductores de reemplazo para producir más machos homocigotos editados en NANOS2 como receptores de SSC y las hembras heterocigotas serán sacrificadas.

Ejemplo 5

Generación de animales editados en NANOS2 mediante inyecciones de embriones

Se diseñó un ARNsg quimérico candidato dirigido al exón 1 de NANOS2 porcino basado en el software de libre acceso desarrollado por el Dr. Feng Zhang en el MIT (por sus siglas en inglés, crispr.mit.edu). El ARN guía usado en los estudios de inyección en embriones es: GATCAGTCCCAACACCACCTGG (SEQ ID NO: 160). Tanto la secuencia de ARN guía de CRISPR (SEQ ID NO: 160) y la secuencia objetivo de CRISPR (SEQ ID NO: 161) dentro del ORF de NANOS2 (SEQ ID NO: 1 y 2) se muestran en la Figura 13.

El ARNsg de CRISPR candidato junto con el ARNm Cas9:GFP se transcribieronin vitrousando el kit T7 mMessage Machine (Ambion), se limpiaron con el kit Megaclear (Ambion) y se inyectaron en embriones porcinos fertilizadosin vivode 1 célula. Una cohorte de 12 animales de 8-9 meses de edad se sincronizaron para el celo y se usaron en el experimento. Ocho de los animales sincronizados se criaron para servir de donadores de embriones, mientras que los 4 restantes se sincronizaron pero no se criaron para servir como vientres sustitutos. El estro se sincronizó al alimentar 5 mL del análogo de la progesterona, Regumate (o Matrix) por 14 días. Veinticuatro horas (h) después de la última alimentación con Regumate, se administró a los animales una dosis de PMSG (1200 UI, Sigma) por vía subcutánea, y la ovulación se induce 72 h más tarde por la administración de HCG (1000 UI, Chorulon, Merck) por vía subcutánea. Los animales donadores (n = 8) en celo permanente fueron inseminados artificialmente con semen de jabalí (proporcionado por PIC Genetics). Los embrionesin vivode los animales donadores se recuperaron quirúrgicamente 24 h después de la AI mediante lavado retrógrado con medio estéril PVA TL-Hepes del oviducto. Los embriones derivadosin vivose inyectaron con ARNm de Cas9:GFP y ARNsg dirigido a NANOS2, y se cultivaron en medio PZM358 durante la noche. Un día después de la microinyección, se transfirieron quirúrgicamente 30 embriones a los oviductos de cada animal sustituto.

Para las transferencias de embriones, los cerdos donadores y sustitutos fueron anestesiados con una mezcla de ketamina/xilacina (6,6 mg/kg y 1-2 mg/kg IM) y colocados boca arriba en una mesa quirúrgica. La profundidad adecuada de la anestesia se valoró por el monitoreo de la frecuencia cardiaca, la temperatura, la respiración rítmica completa, la pupila contraída y la reducción o ausencia del reflejo palpebral. El aparato reproductor de las cerdas jóvenes anestesiadas se expuso mediante una incisión abdominal en la línea media. Solamente se expusieron los oviductos y las puntas del útero. En las donadores, los embriones se lavaron retrógradamente a través de la unión útero-tubar, y los embriones se recolectaron del ostium del oviducto. Para la transferencia de embriones a las madres de alquiler, se colocó un catéter tom-cat con los embriones a través del infundíbulo y se depositaron los embriones en el oviducto. Tras el cierre de la incisión en tres capas con suturas absorbibles (USP #3 body wall, #3 fat, #1 sub-q, por sus nombres en inglés), se dejó que los animales se recuperaran. Los embarazos se confirmaron por falta de retorno al estro (21 días) y ecografía a los 28 días tras la transferencia embrionaria. Nuestro primer ensayo de transferencia de embriones ha dado como resultado que 3 de cada 4 animales sustitutos quedaran embarazadas y nacieran 18 lechones editados (Figura 14). Los 18 lechones mostraron modificaciones mono- o bialélicas para NANOS2, destacando eficiencias muy altas de nuestro enfoque.

Ejemplo 6

Generación de animales editados en NANOS2 mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT)

Se establecieron fibroblastos fetales porcinos (PFF, por sus siglas en inglés) a partir de fetos recuperados de cerdas Duroc embarazadas D35. Una línea candidata de PFF de machos y hembras se nucleofectó con un plásmido de Cas9:GFP impulsado por el promotor CMV (Addgene) y un fragmento de PCR consistente en ARN de guía única impulsado por el promotor hU6 dirigido a NANOS2 (SEQ ID NO: 162). Un día después de la nucleofección, las células nucleofectadas se clasificaron individualmente en cada pozo de una placa de 96 pozos. Las células se alimentaron con medio de crecimiento condicionado de fibroblastos irradiados y se les permitió formar colonias. Tras una semana de cultivo, empiezan a aparecer colonias dentro de los pozos. Las células se propagan clonalmente, se extrae el ADN y se analizan en busca de mutaciones usando secuenciación del ADN. Las células homocigotas nulas para NANOS2 se clonaron por transferencia nuclear de células somáticas para generar lechones machos y hembras nulos para NANOS2. A partir de estos intentos iniciales de SCNT, se generaron un macho superviviente y tres lechones hembra, ver la Figura 15.

Ejemplo 7

Fenotipo testicular de los animales editados en NANOS2

A los 3 meses de edad, se realizó una biopsia y se examinaron morfológicamente los testículos de dos lechones homocigotos bialélicos silenciados en NANOS2. Basados en las observaciones de los cortes transversales de las biopsias usando microscopía óptica (Figura 16), los túbulos seminíferos están intactos y las células somáticas de soporte están presentes. Aunque todavía hay algunas células germinales en los animales homocigotos silenciados, el número parece ser muy reducido en comparación con lo que se observa típicamente en un animal de tipo silvestre a esta edad. De hecho, algunos de los túbulos de los animales homocigotos parecen estar desprovistos de células germinales. Además, los núcleos de las células germinales restantes en los animales homocigotos parecían picnóticos, lo que es indicativo de apoptosis. A los 3 meses de edad, los túbulos seminíferos de los cerdos silvestres típicamente contienen múltiples capas de células germinales en desarrollo, lo que es indicativo de una espermatogénesis activa. Ninguno de los cordones del animal silenciado para NANOS2 contiene múltiples capas de células germinales, lo que sugiere claramente la ausencia de una línea germinal endógena. En conjunto, estas observaciones sugieren que el fenotipo de la pérdida de función de NANOS2 se conserva en animales, incluyendo la pérdida de la línea germinal masculina durante el desarrollo temprano que lleva a un fenotipo de células de Sertoli solamente. Los estudios con ratones han demostrado que los machos con este fenotipo son excelentes huéspedes para la regeneración de una línea germinal donador tras el trasplante de espermatogonias.

Ejemplo 8

Trasplantes con receptores NANOS2 homocigotos silenciados

A los 4 meses de edad, dos lechones silenciados homocigotos recibieron trasplantes de espermatogonias aisladas de los testículos de un lechón macho donador Duroc de 21 días de edad. Brevemente, las células del donador se suspendieron en volúmenes de 1 mL de medio de inyección a 1,4x106 células/mL y se infundieron 600-900 pL de volumen en los túbulos seminíferos mediante inyección guiada por ultrasonidos en la red testicular. Se trasplantó un testículo de cada animal con células del donador y se dejó el testículo contralateral como control no inyectado.

Ejemplo 9

Genes NANOS

NANOS1Sus scrofa

SEQ ID NO: 6

M EAFPW APRSPRRGRVPPPM ALVPS A R Y V S AQGPAHPQPF S SW ND YLGL ATLITK AVDGEPRF GC ARGEDGGGGGGSPP SSSSSSCC SPHAGAGPGALGP ALGPPD YDED D D D D SDEPGSRGRYLGGTLELRALELC ADP SEAGLLEERF AEL SPF AG RATA VLLG W AP AT A AT AE A APREERAP AW A AEPRLH A AF GA AGARLLKPELQ VC VFCRNNKE AVALYTTHILKGPDGRVLCPVLRRYTCPLCGASGDNAHTIKYCPLSKVPPPRSVRD GLPGKKLRSEQ ID NO: 5 ORIGEN

1 cgcagggggc agggccgcgg cagcgaggcc ggggggcggg gaggagcggg gcccgataaa 61 aggcagcgag gcggccccac cccgctgcag gccggcgggc aggctcggcg cgtcctttcc

121 gtccggcccg cgccggcggc ggggaggcgg cgcgcgcggc ccgcagcccg cccatggagg

181 ctttcccctg ggcgccccgc tcgccccgcc gcggccgcgt ccccccgccc atggcgctcg

241 tgcccagcgc ccgctacgtg agcgcccagg gcccggcgca cccgcaaccc ttcagctcgt

301 ggaacgacta cctgggactc gccacgctca tcaccaaggc ggtggacggc gagccgcgct

361 ttggctgcgc ccgcggcgag gacggcggcg gcggcggcgg ctccccaccc tcctcttcct

421 cctcgtcgtg ctgctccccc cacgcggggg ccgggcctgg ggcgctgggg cccgcgctgg

481 ggccacccga ctacgacgag gacgacgacg acgacagcga cgagccgggg tcccggggcc

541 gctacctggg gggcacgctg gagctgcgcg cgctggagct gtgcgcggac ccctcggagg

601 ccgggctgct ggaggagcgc ttcgccgagc tgagcccgtt cgcgggtcgc gccaccgctg

661 tgctgctggg ctgggcaccc gccactgccg ccaccgccga ggcggcaccg cgcgaggagc

721 gggccccggc gtgggcggcc gagccccggc tgcacgcagc ctttggggcg gccggcgccc

781 ggctgctcaa gcccgagctg caggtgtgtg tgttttgccg gaacaacaag gaggcggtgg

841 cgctctacac cacccacatc ttgaagggac ccgacgggcg agtgctgtgc cccgtgctgc

901 gccgctacac gtgtcccctg tgcggcgcca gcggcgacaa cgcgcacacc atcaagtact

961 gcccgctctc caaagtgccg ccgccgcgca gcgtcaggga cggcctgccc ggcaagaagc

1021 tgcgctgagg gcccggactc cggtctgcta ctgccacctg acgccaccag ggtcgccgcc

1081 tgcccaatgt ctagtttggc ctgcgcacca tctctctctc tcgctgctga ggagcgtgga

1141 gctcagctgt tggttgaact tgagatgtac tgattttttt tttttttttt tcaaaagaac

1201 ccggcggtac tgagtccttt cctgtcgaag agcgcttaag actagaagct aaaatcttga

1261 tttgtttatc tctagtttgt gcacatccag acggtgaagg ctgggtgttc gttccactaa

1321 ctgaaatgtg gcaacttaga agtgtttatt tactctatac gtcaacctat tttagatgcg

1381 catcagtata tgaaattgtc tcaatctaat cttggatgtt taattttatg aatggaggca

1441 ctttactagg cctagaatat ttttttaaaa gcctctaaac tgaacttaac tggcgatttt

1501 atggaatgtc agcaaaatga cttttattgt ttgaaacaag taataatatt tctgttgtcc

1561 ttaatcagtt attctaattc caggtgaagc aaccctcacc tgcctggtag catcattaag

1621 tgaaggctta gtaaactttc cagtgttagt ttgggtgggt gttccccccg tggcttgttt

1681 ctgtcctagc tggaggtgta aagatgtaca atctgtggca ggtagaatac agctccttat

1741 ccttttatgt accacatctt ttattactga acgagcaact agcgtttccc atctttcaaa

1801 gtcgtgccag gttatataat attgtgtata cacttggaaa tggtgctgtt taaaagaatt

1861 tgtgtattta tacagtaaca gtatatgaat tcattaatct tgtctt

NANOS2Sus scrofa

SEQ ID NO: 2

M QLPPFDM W KDYFNLSQVVLGLIQNRRQGPEAPGTGEPRPEPPLEQDQGPGERGA SGGLATLCNFCKHNGESRHVYSSHQLKTPEGVVVCPILRHYVCPLCGATGDQAHT LK Y CPLN GGQQ SL YRRSG RN S AGRKVKR

SEQ ID NO: 1 (el sitio objetivo CRISPR está subrayado)

1 atgcagctgc caccctttga catgtggaag gactacttca acctgagcca ggtggtgttg

61 ggactgatccagaatcgtcg acaagggcca gaggccccgggcaccgggga gccaagacct

121 gagcccccac tggagcagga ccagggcccg ggagagcggg gggccagcgg ggggctggcc

181 accctgtgca acttttgcaa acacaatggg gaatctcgcc acgtgtactc ctcgcaccag

241 ctgaagacac cggagggcgt ggtggtgtgt cccatcctac gacactatgt gtgtcccctg

301 tgcggggcca ccggtgacca ggctcacaca ctcaagtact gcccgctcaa cggcggccag

361 cagtctctct atcgccgcag tgggcgcaat tcagccggcc gcaaggtcaa gcgctga

NANOS3Sus scrofa

SEQ ID NO: 4

MHSF GRCIF GGAAASPP VTIRNLPQP APP S SHPLGGIRRELT AQTPGLQREKGRGRG KGIEGRSLGW LGFFSLSALSPGTLCPAM GTFNLW TDYLGLARLVGALRGEEEPETR LDPQP AP VPGPEGQRP SPE S SP APERLC SF CKHN GE SRAIY Q SHVLKDE AGRVLCPI LRDYVCPQCGATRERAHTRRFCPLTSQGYTSVYSYTTRNSAGKKLARPDKARTQD SGHRRGGGGGGASTGSKGAGKSSGTSPSPCCPSTSASEQ ID NO: 3

1 cagcccaccc agggaccatg cattcctttg gcaggtgcat ttttggagga gcagcagcaa

61 gcccccctgt gacaataagg aacctcccac agcctgctcc tccctcttca cacccccttg

121 gaggtataag gagggaactg acagcccaga ctcctgggct ccagagagag aaagggaggg

181 gcagggggaa ggggatagaa ggacgatctt tggggtggct gggtttcttc tctctctctg

241 ccctttcacc tggtacactt tgcccagcca tggggacctt caacctgtgg acagattacc

301 tgggtttggc acgcctggtg ggggctctgc gtggggaaga ggaacctgag acgaggctgg

361 acccccagcc agcaccagtg ccaggaccag agggtcagag gcccagcccg gaatcctcac

421 cagctcctga acgcctgtgc tctttctgca aacataatgg cgaatcccgg gccatctacc

481 agtcccacgt gctcaaggat gaagcgggcc gagttctgtg ccccattctt cgagactacg

541 tgtgccccca gtgcggtgcc acacgcgagc gtgcccatac ccgccgcttc tgccctctca

601 ccagccaggg ctacacctct gtctacagct acaccacccg caactcggcc ggcaagaagc

661 tggcccgccc ggacaaggcg aggacacagg actctggaca tcggcgagga ggaggaggag

721 gaggtgccag cacaggttcc aaaggtgccg ggaagtcttc tggaacttct ccgtctccct

781 gctgtccctc cacttctgcc taagaggctg gcgcgagcag gacggagatg ctgccttcac

841 ctggggatgg ggacccaggc tcagtggagg ctgggtttca gggacgacct acccttcgcg

901 gatccgcccc tgcccccagc ctgggagccc tgcaagggag ccaggcctgg aagctcggcc

961 aaaagagagc cgctcctttc tccccatctc ccaccccaag aaaggaggtg gtcctctggc

1021 aaccctgccc tccttcccca gcgctgggca cccagttagc actcaataaa tac

NANOS2 BOVINO NM_001281904

SEQ ID NO: 10

M QLPPFDM W KDYFNLSQVVLALIQSRGQGLETQGTGEPRPGPHVEQDQGQGGRG AGGGLATLCNFCKHNGESRHVYSSHQLKTPEGVVVCPILRHYVCPLCGATGDQA HTLKYCPLNGGQQSLYRRSGRNSAGRKVKRSEQ ID NO: 9

1 tcagctgctc ctgtctgcgg gcccccagcc cacttctctc cagccaccca ccaccaacac

61 tcccccgggt gccatgcagc tgccaccctt tgacatgtgg aaggactact tcaacctgag

121 ccaagtggtg ctggcactga tccagagtcg ggggcaaggg ttggagaccc aagggactgg

181 ggagccgaga cccgggcccc atgtggagca ggatcagggg cagggcggac gcggggctgg

241 cgggggcctg gccaccctgt gcaacttttg caaacacaat ggagagtctc gccacgtgta

301 ctcctcacac cagctgaaga ccccggaggg cgtggtggtg tgtcccattc tgcggcatta

361 tgtatgtccc ctgtgcgggg ccaccgggga ccaggcccac acactcaagt actgcccact

421 caacggagga cagcagtctc tctaccgccg cagtgggcgc aactcagccg gccgcaaggt

481 caagcgctga agaccgtcag gtacccaccc gctgcagccc caaccctccc tggttcagcc

541 ctcccaag

NANOS 1 bovino

XM_005225796

SEQ ID NO: 12

A A A A AT AE A APREER AP A W AAEPKLH A AS G A A A ARLLKPELQ V C VF CRNNKE A VALYTTHILKGPDGRVLCPVLRRYTCPLCGASGDNAHTIKYCPLSKVPPPPAARPP PRSARDGLPGKKLRSEQ ID NO: 11

1 gccgccgccg cggccaccgc cgaagcagca ccgcgagagg agcgggcccc ggcgtgggcg

61 gccgagccca agctgcacgc cgcctccggg gcggccgccg cccggctgct caagcccgag

121 ctgcaggtgt gcgtgttttg ccggaacaac aaggaggcgg tggcgctcta caccacccac

181 atcctgaagg gacccgacgg gcgggtgctg tgccccgtgc tgcgccggta cacgtgtccc

241 ctgtgcggtg ccagcggcga caacgcgcac accatcaagt actgcccgct ttccaaagtg

301 ccgccgccgc ctgcagcccg cccgccgccg cgcagcgccc gggacggcct gcccggcaag

361 aagctgcgct aagggcccgg accccggtct gctgctgcca cctgatgcca ctggggtagc

421 cgcccgccca ctctcgtgtt tggtctgcgc accatctctt cctcgctgcc ggggagtgtg

481 gagctcgtct tggtttttcc agaggaagcc gacggtaccg agtattttcc taacgaagag

541 cagttgagac tagacgttaa aattttgatt aatgtttcta gtttgtgcac atccagatgg

601 tgaaggctgg gtattccact aactgaaatg tggcaactta gaggcgctgt ggtttattta

661 tacgtcgacc tattttagat gcgcatcagt atgaaattgt ctcagtctaa tcttggatgt

721 ttaattttat gaatggaggc actttactag gtctagaata tttttttaaa agcctctcaa

781 ctgaacttaa aactggcgat tttatggagt gtcagcaaaa tgactatttt attgtctgaa

841 acaatatttc tgttgtcctt acccagttgt aattccaggt gaagccctgc gtggtagcat

901 cattaagtga agacttggta tgctttacag tgttagtttg ggtgggtgtt ccctccttgt

961 ggcttgtttt tgtcctagct ggagatgtat aaaatgtaca atttgtaggt agcaggtaga

1021 atacagctca tgtaccagat ctttttatta ctgaacgagc aactactacc gtttttcccc

1081 tttaaaaata gtgccaagtt ataatcatat tgtgtataca cttgaaaatg gtgctgttta

1141 aaaaaattgt gtatttatac agtaacagta tatgaattca ttaaccttgc ctttaactct

1201 acttggcttt ttctttatgc cccttcctat tccagttctt caaaaatatg tgatacttaa

1261 gatcaaacgg gtgcaataac tcattcactc tgaattgctc catttcaggg tctctaaata

1321 gtggaaatct cattccagct gttgcctctc agactaaatg taagatggaa tcctttgagc

1381 tctggaaggt taatgaaaca actggtgttc aggaaggttc cactctggac tgtgtcagct

1441 ttaaaccatc acagaagtcc tcaaaccagt ataagtacca attaaaggaa ctgactgggt

1501 gtaggggggg taacacaagg aacacagcct ccatctattg tgttcccatt ctcattagaa

1561 gacaaccctt ctggaatccc accagttatt ttcatcggtg agattaaatc taatcttggg

1621 caaa

NANOS1 BOVINO (ALT)

XM_001787922

SEQ ID NO: 14

RYVSTQGP AHPQPF S S W N D YLGL ATLITK AVDGEPRF GC ARGGDGGGDGSPP S S S S S SCC SPHY GAGPGALGP ALGPPD Y D E D D D D D D SDDPGSRSRYLGGALELRALELC ADP AE AGLLEERF AEL SPF AG RA A A VLL GC AP A A A A A AT AE AAPREERAP AW A A EPKLHAASGAAAARLLKPELQVCVFCRNNKEAVALYTTHILKGPDGRVLCPVLRR YTCPLCGASGDNAHTIKYCPLSKVPPPPAARPPPRSARDGLPGKKLRSEQ ID NO: 13

1 cgctacgtga gcacccaggg cccggcgcac ccgcagccct tcagctcgtg gaacgactat

61 ctgggactcg ccacgctcat caccaaggcg gtggacggcg agccgcgctt cggctgcgcc

121 cgcggcgggg acggcggcgg ggacggctcc ccgccttctt cttcctcctc gtcgtgctgc

181 tccccccacg tgggggccgg gcctggggcg ctggggcccg cgctggggcc gcccgactac

241 gacgaggacg acgacgacga cgacagcgac gatccggggt cccggagccg ctacctgggg

301 ggcgcgctgg agctgcgcgc gctggagctg tgcgcggacc ctgccgaggc cgggctgctg

361 gaggagcgtt tcgctgagct gagcccgttc gctggtcgcg ccgctgccgt gcttctgggc

421 tgcgcacccg ccgccgccgc cgcggccacc gccgaagcag caccgcgaga ggagcgggcc

481 ccggcgtggg cggccgagcc caagctgcac gccgcctccg gggcggccgc cgcccggctg

541 ctcaagcccg agctgcaggt gtgcgtgttt tgccggaaca acaaggaggc ggtggcgctc

601 tacaccaccc acatcctgaa gggacccgac gggcgggtgc tgtgccccgt gctgcgccgg

661 tacacgtgtc ccctgtgcgg tgccagcggc gacaacgcgc acaccatcaa gtactgcccg

721 ctttccaaag tgccgccgcc gcctgcagcc cgcccgccgc cgcgcagcgc ccgggacggc

781 ctgcccggca agaagctgcg ctaagggccc ggaccccggt ctgctgctgc cacctgatgc

841 cactggggta gccgcccgcc cactctcgtg tttggtctgc gcaccatctc ttcctcgctg

901 ccggggagtg tggagctcgt cttggttttt ccagaggaag ccgacggtac cgagtatttt

961 cctaacgaag agcagttgag actagacgtt aaaattttga ttaatgtttc tagtttgtgc

1021 acatccagat ggtgaaggct gggtattcca ctaactgaaa tgtggcaact tagaggcgct

1081 gtggtttatt tatacgtcga cctattttag atgcgcatca gtatgaaatt gtctcagtct

1141 aatcttggat gtttaatttt atgaatggag gcactttact aggtctagaa tattttttta

1201 aaagcctctc aactgaactt aaaactggcg attttatgga gtgtcagcaa aatgactatt

1261 ttattgtctg aaacaatatt tctgttgtcc ttacccagtt gtaattccag gtgaagccct

1321 gcgtggtagc atcattaagt gaagacttgg tatgctttac agtgttagtt tgggtgggtg

1381 ttccctcctt gtggcttgtt tttgtcctag ctggagatgt ataaaatgta caatttgtag

1441 gtagcaggta gaatacagct catgtaccag atctttttat tactgaacga gcaactacta

1501 ccgtttttcc cctttaaaaa tagtgccaag ttataatcat attgtgtata cacttgaaaa

1561 tggtgctgtt taaaaaaatt gtgtatttat acagtaacag tatatgaatt cattaacctt

1621 gcctttaact ctacttggct ttttctttat gccccttcct attccagttc ttcaaaaata

1681 tgtgatactt aagatcaaac gggtgcaata actcattcac tctgaattgc tccatttcag

1741 ggtctctaaa tagtggaaat ctcattccag ctgttgcctc tcagactaaa tgtaagatgg

1801 aatcctttga gctctggaag gttaatgaaa caactggtgt tcaggaaggt tccactctgg

1861 actgtgtcag ctttaaacca tcacagaagt cctcaaacca gtataagtac caattaaagg

1921 aactgactgg gtgtaggggg ggtaacacaa ggaacacagc ctccatctat tgtgttccca

1981 ttctcattag aagacaaccc ttctggaatc ccaccagtta ttttcatcgg tgagattaaa

2041 tctaatcttg ggcaaa

Los ejemplos divulgados en la presente se proporcionan a modo de ejemplo y no pretenden limitar el alcance de la invención.

TABLA DE SECUENCIAS

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un animal de ganado editado genéticamente que comprende al menos una secuencia cromosómica editada que codifica una proteína NANOS2, en donde la al menos una secuencia cromosómica editada se inactiva, y en donde el animal de ganado es bovino o porcino.

2. El animal de ganado editado genéticamente de la reivindicación 1, en donde la secuencia cromosómica editada se inactiva, modifica y/o comprende una secuencia integrada o eliminada.

3. El animal de ganado genéticamente editado de la reivindicación 1, en donde el animal de ganado editado comprende dos secuencias cromosómicas editadas que codifican una proteína en NANOS2, en donde las dos secuencias cromosómicas editadas se inactivan, y en donde dicho animal produce células germinales masculinas reducidas o inexistentes, pero conserva la función de las células somáticas.

4. El animal de ganado genéticamente editado de la reivindicación 1, en donde:

a) la secuencia cromosómica editada no contiene ninguna secuencia introducida exógenamente; o

b) el animal editado genéticamente comprende además un sistema de silenciamiento condicional para la expresión condicional de la proteína NANOS2; o

c) la secuencia cromosómica editada comprende una secuencia reportera integrada; o

d) el animal es heterocigoto u homocigoto para al menos una secuencia cromosómica editada.

5. El animal de ganado genéticamente editado de la reivindicación 3, en donde el animal genéticamente editado comprende además células espermatogonias trasplantadas para crear un macho sustituto receptor con línea germinal abatida.

6. El animal genéticamente editado de la reivindicación 1, en donde el animal es porcino, y en donde dicho porcino incluye un gen NANOS2 editado que incluye SEQ ID NO: 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 202, 203, o 204.

7. El animal genéticamente editado de la reivindicación 1, en donde el animal es bovino, y en donde dicho bovino incluye un gen NANOS2 editado de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 148, 149, 150, 151, o 152.

8. Un método para generar un animal de ganado editado genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende:

editar al menos una secuencia cromosómica que codifica una proteína NANOS2 de modo tal que se elimine la función de la proteína NANOS2, siendo el animal de reproducción bovino o porcino.

9. El método de la reivindicación 8, que comprende la edición de dos secuencias cromosómicas que codifican una proteína NANOS2, de modo tal que se elimina la función de la proteína NANOS2, y en donde el animal de ganado editado genéticamente no tiene células espermatogonias funcionales.

10. El método de la reivindicación 8, en donde:

a) dicho animal no produce una cantidad significativa de células espermatogonias; o

b) dicha modificación es por edición genética por el uso de una TALEN, una nucleasa de dedos de zinc y/o una proteína de fusión recombinasa; o

c) dicho gen NANOS2 se edita para incluir una inserción o deleción que causa la inactivación del gen; o

d) dicho paso de modificación de la edición genética incluye el uso de un ARN guía NANOS2 y un polipéptido capaz de efectuar la escisión o integración del objetivo NANOS2; o

e) dicho método de modificación de edición genética es CRISPR/Cas9 guiada por ARN.