ES2965721T3

ES2965721T3 - Evento de maíz transgénico MON 87419 y procedimientos de uso del mismo

Info

Publication number: ES2965721T3
Application number: ES15764078T
Authority: ES
Inventors: Michael E Goley; Wen C Burns; Jintai Huang; Melinda C Mccann; Aihua Shao; Oscar C Sparks; Martin A Stoecker; Liping Wei
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2014-03-20
Filing date: 2015-03-10
Publication date: 2024-04-16
Anticipated expiration: 2035-03-10
Also published as: MX365442B; US20240279674A1; KR20160134709A; AR118897A2; AR099816A1; MA39747A; AP2016009479A0; AU2015231804A1; PE20211797A1; JP2017512497A; US20150267221A1; EP3119186A4; UY36039A; KR102308359B1; WO2015142571A1; CA2942316C; EP3119186A1; US10113178B2; CL2016002357A1; AU2015231804B2

Abstract

La invención proporciona moléculas de ADN recombinante que son exclusivas del evento MON 87419 de maíz y plantas, partes de plantas, semillas, células y productos agrícolas de maíz transgénicos que contienen el evento MON 87419, así como métodos para usar y detectar el evento MON 87419 de maíz. Las plantas de maíz transgénico que contienen el evento MON 87419 exhiben tolerancia a los herbicidas dicamba y glufosinato. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Evento de maíz transgénico MON 87419 y procedimientos de uso del mismo

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La memoria descriptiva divulga moléculas de ADN recombinante que son únicas para el evento de maíz transgénico MON 87419. La invención también se refiere a plantas, partes, semillas y células de maíz transgénico que contienen el evento MON 87419 de maíz así como procedimientos para su uso. Las plantas de maíz transgénico que contienen el evento MON 87419 de maíz muestran tolerancia a herbicidas dicamba y glufosinato.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El maíz(Zea mays)es un cultivo importante en muchas áreas del mundo. Los procedimientos de la biotecnología han sido aplicados a este cultivo para producir maíz con rasgos deseados. Uno de estos rasgos deseados es la tolerancia a herbicidas. La expresión de un gen heterólogo, también conocido como transgén, para la tolerancia a herbicidas en una planta, puede conferir tolerancia a herbicidas a la planta. Sin embargo, la expresión de un transgén y por lo tanto su efectividad, se pueden ver influenciadas por muchos factores diferentes que incluyen la orientación y composición de la expresión que activa el casete del transgén individual transferido al cromosoma vegetal y la ubicación cromosómica y el resultado genómico de la inserción del transgén. Esto se complica más en plantas transgénicas con múltiples transgenes enlazados molecularmente, donde cada uno confiere un rasgo diferente. En tal situación, la expresión apropiada de cada uno de los transgenes enlazados molecularmente en la planta resultará de la misma inserción de transgenes (también denominada un evento de múltiples genes). En dichos casos, es necesario diseñar y ensayar múltiples casetes de expresión, cada uno con una configuración diferente de transgenes y elementos de expresión, y luego producir y analizar una gran cantidad de eventos de transformación de plantas individuales a través de múltiples generaciones de plantas para seleccionar el evento transgénico que tiene propiedades superiores con relación a cada uno de los rasgos deseados y las características fenotípicas y agrícolas óptimas necesarias para hacerlos adecuados para fines comerciales. Dicha selección requiere la caracterización molecular extensiva así como pruebas de invernadero y campo durante varios años, en múltiples ubicaciones, y bajo una variedad de condiciones de modo que se pueda recabar una cantidad considerable de datos agronómicos, fenotípicos y moleculares. Los datos y observaciones resultantes luego deben ser analizados por equipos de científicos y agrónomos con el objetivo de seleccionar el evento adecuado para el uso agronómico comercial en una amplia gama de germoplasma y en una variedad de condiciones de campo. Una vez seleccionado, el evento comercial que confiere los rasgos deseados se puede introgresar en otras bases genéticas mediante procedimientos de fitomejoramiento, lo cual produce una cantidad de variedades de cultivos diferentes que contienen el rasgo deseable y que se adaptan en forma adecuada a las condiciones de crecimiento locales específicas.

Para producir una planta transgénica que contenga un único evento de transformación, se transfiere una parte de una construcción de a Dn recombinante al genoma de una célula de maíz usando técnicas de transformación vegetal. La célula de maíz se usa posteriormente para producir una planta R<0>única, que luego se puede usar para producir plantas de progenie transgénicas. El genoma de las plantas de progenie contiene el evento único y estas plantas se pueden analizar para determinar el o los rasgos deseados así como el rendimiento agronómico. La efectividad de un evento se puede ver impactada por factorescisy/otranscon relación al sitio de integración en el evento de transformación. El fenotipo conferido por el evento también se puede ver afectado por el tamaño y el diseño de la construcción de ADN, el cual puede variar por la combinación de elementos genéticos en un casete de expresión, la cantidad de transgenes, la cantidad de casetes de expresión y la configuración de dichos elementos y dichos casetes. El rendimiento de un evento dado puede verse adicionalmente complicado por factores como los patrones de desarrollo, diurnos, temporales o espaciales de expresión de un transgén de la planta, o por factores extrínsecos, por ejemplo, condiciones ambientales de crecimiento de las plantas, disponibilidad de agua, disponibilidad de nitrógeno, calor o presión. Por lo tanto, la capacidad para crear un evento que confiere un conjunto deseado de rasgos fenotípicos no es fácilmente predecible.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la invención proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ iD NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10.

[0005] En otro aspecto, la invención proporciona una sonda de ADN de diagnóstico para el evento MON 87419, en la que dicha sonda de ADN comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

[0006] En aún otro aspecto de la invención, se proporciona un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en la que la primera molécula de ADN es un fragmento de SEQ ID NON y la segunda molécula de ADN es un fragmento de el ADN genómico de maíz de SEQ ID NO: 10 del evento MON 87419 de maíz, y en la que la primera y segunda moléculas de ADN comprenden cada una una secuencia de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos para funcionar como cebadores de ADN cuando se usan juntos en una reacción de amplificación con ADN que contiene el evento MON 87419 de maíz para producir un diagnóstico de amplicón para el evento MON 87419 de maíz en una muestra, en el que dicho amplicón comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

Otra realización de la invención es un procedimiento para detectar la presencia del evento MON 87419 de maíz en una muestra de ADN, comprendiendo el procedimiento las etapas de poner en contacto la muestra con la sonda de ADN descrita anteriormente; someter la muestra y la molécula de ADN a condiciones de hibridación estrictas; y detectar la hibridación de la molécula de ADN con una molécula de ADN diana en la muestra, en la que la hibridación de la molécula de ADN con la molécula de ADN diana indica la presencia del evento MON 87419 de maíz en la muestra de ADN.

Aún otra realización de la invención es un procedimiento para detectar la presencia del evento MON 87419 de maíz en una muestra de ADN, comprendiendo el procedimiento las etapas de poner en contacto la muestra con el par de moléculas de ADN descritas anteriormente; realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8; y detectar la presencia del amplicón de ADN en la reacción, en la que la presencia del amplicón de ADN en la reacción indica la presencia del evento MON 87419 de maíz en la muestra de Ad N.

La invención proporciona además un kit de detección de ADN que comprende una molécula de ADN que comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en la que la primera molécula de ADN es un fragmento de SEQ ID NO: 9 y la segunda molécula de ADN es un fragmento del ADN genómico de maíz de SEQ ID NO: 10 del evento de maíz MON 87419, y en la que la primera y segunda moléculas de ADN comprenden cada una una secuencia de ADN de suficiente longitud de nucleótidos contiguos para funcionar como cebadores de ADN cuando se usan juntos en una reacción de amplificación con ADN que contiene el evento MON 87419 de maíz para producir un diagnóstico de amplicón para el evento MON 87419 de maíz en una muestra, en el que dicho amplicón comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y en el que dicho kit de detección de ADN comprende además reactivos para reacciones de diagnóstico.

Aún otra realización de la invención es una planta, semilla, célula o parte de planta de maíz transgénico que comprende una molécula de ADN que tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 10, particularmente en la que la planta, semilla o célula es tolerante al glufosinato o dicamba, o herbicidas glufosinato y dicamba o en la que la planta, semilla, célula o parte de planta de maíz transgénico se define como que comprende el evento de maíz MON 87419, habiéndose depositado una muestra representativa de semilla que comprende dicho evento como número de acceso de ATCC PTA-120860. La planta de maíz transgénica o puede ser un híbrida que tiene al menos una planta parental que comprende el evento de maíz MON 87419.

En aún otra realización, la invención proporciona un procedimiento para proteger el rendimiento de plantas de maíz que comprende plantar maíz transgénico que comprende el evento de maíz MON 87419 en un área y aplicar una dosis eficaz de herbicidas de dicamba, o glufosinato, o de dicamba y glufosinato para controlar las malezas en el área sin dañar el maíz transgénico, en el que el evento de maíz MON 87419 comprende la SEQ ID NO: 10. La dosis efectiva de herbicida glufosinato puede ser un total de aproximadamente 0,05 kilogramos de equivalente de ácido por acre a aproximadamente 7,26 kilogramos de equivalente de ácido por acre de herbicida glufosinato durante una temporada de crecimiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: ilustra la organización del inserto de transgén en el genoma de una planta de maíz que comprende el evento MON 87419 de maíz. Las líneas horizontales corresponden a las posiciones relativas de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10; las flechas gruesas marcadas SQ26644 y SQ26645 representan la posición aproximada de un par de cebadores usado para identificar el maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz; las líneas gruesas cortas enumeradas 14 a 22 representan la posición relativa de secuencias de la construcción recombinante única dentro del inserto de ADN (s Eq ID NO:9) y el número se refiere a SEQ ID NO correspondiente de cada una, respectivamente; las flechas horizontales finas representan la organización relativa de los dos casetes de expresión separados del ADN insertado de transgén heterólogo del evento MON 87419 de maíz y los cuadros indican los elementos diferentes de los dos casetes de expresión; una "P" al principio representa un elemento promotor, una "L" al principio representa un elemento líder, una "I" al principio representa un intrón, un "TS" al principio representa un péptido de tránsito de cloroplasto, una "T" al principio representa un elemento de poliadenilación y terminación de transcripción 3' (3' UTR),patrepresenta la región de codificación para la proteína fosfinotricina acetil transferasa (PAT), ydmorepresenta la región de codificación para la proteína dicamba mono-oxigenasa (DMO).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS

SEQ ID NO:1 es una secuencia de ADN de treinta nucleótidos que representa la unión 5' del ADN genómico de maíz y el inserto de transgén. SEQ ID NO:1 corresponde a las posiciones de nucleótidos 1232 a 1261 de la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:2 es una secuencia de ADN de treinta nucleótidos que representa la unión 3' del ADN genómico de maíz y el inserto de transgén. SEQ ID NO:2 corresponde a las posiciones de nucleótidos 7994 a 8023 de la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:3 es una secuencia de ADN de sesenta nucleótidos que representa la unión 5' del ADN genómico de maíz y el inserto de transgén. SEQ ID NO:3 corresponde a las posiciones de nucleótidos 1217 a 1276 de la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:4 es una secuencia de ADN de sesenta nucleótidos que representa la unión 3' del ADN genómico de maíz y el inserto de transgén. SEQ ID NO:4 corresponde a las posiciones de nucleótidos 7979 a 8038 de la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:5 es una secuencia de ADN de cien nucleótidos que representa la unión 5' del ADN genómico de maíz y el inserto de transgén. SEQ ID NO:5 corresponde a las posiciones de nucleótidos 1197 a 1296 de la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:6 es una secuencia de ADN de cien nucleótidos que representa la unión 3' del ADN genómico de maíz y el inserto de transgén. SEQ ID NO:6 corresponde a las posiciones de nucleótidos 7959 a 8058 de la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:7 es una secuencia de ADN de 1771 nucleótidos que representa 1246 nucleótidos del ADN genómico de maíz flanqueante 5' y 525 nucleótidos del extremo 5' del inserto de transgén.

SEQ ID NO:8 es una secuencia de ADN de 1767 nucleótidos que representa 516 nucleótidos del extremo 3' del inserto de transgén y 1251 nucleótidos del ADN genómico de maíz flanqueante 3'.

SEQ ID NO:9 es una secuencia de ADN de 6762 nucleótidos correspondiente al inserto de transgén del evento MON 87419 de maíz.

SEQ ID NO:10 es una secuencia de ADN de 9259 nucleótidos correspondiente al evento MON 87419 de maíz; la secuencia contiene la secuencia de ADN genómico flanqueante 5' de las posiciones 1 a 1246, el inserto de ADN transgénico de las posiciones 1247 a 8008, y la secuencia de ADN genómico flanqueante 3' de las posiciones 8009 a 9259.

SEQ ID NO:11 es una secuencia de ADN de 33 nucleótidos correspondiente a un cebador denominado SQ26644 y que se utiliza para identificar el ADN del evento MON 87419 de maíz en una muestra; corresponde a las posiciones de 7966 a 7998 de la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:12 es una secuencia de ADN de 24 nucleótidos correspondiente a un cebador denominado SQ26645 y que se utiliza para identificar el ADN del evento MON 87419 de maíz en una muestra; corresponde a las posiciones de 8022 a 8045 de la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:13 es una secuencia de ADN de 19 nucleótidos correspondiente a una sonda denominada PB11207 y que se utiliza para identificar el ADN del evento MON 87419 de maíz en una muestra; corresponde a las posiciones de 8002 a 8020 de la SEQ ID NO:10.

SEQ ID NO:14-22 son secuencias de ADN correspondientes a secuencias únicas dentro del inserto de transgén del evento MON 87419 de maíz.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Se proporcionan las siguientes definiciones y procedimientos para definir mejor la invención y para guiar a los entendidos en la técnica en la práctica de la invención. A menos que se indique lo contrario, los términos se entenderán de acuerdo con el uso convencional que le dan los entendidos en la técnica.

Se usan técnicas modernas de transformación de plantas para generar plantas modificadas genéticamente. El término "transgénico" también se puede usar para referirse a plantas modificadas genéticamente. Durante el proceso de generación de una planta transgénica, se inserta aleatoriamente ADN extraño en el genoma de una célula vegetal. Durante el procedimiento de transformación se transforman muchas células individuales. Debido a la integración aleatoria, se llevará a cabo un evento de recombinación de ADN diferente y único dentro del genoma de cada célula vegetal transformada individual. Luego se genera una planta transgénica completa a partir de una célula transgénica individual simple que necesariamente da como resultado que cada célula de la planta transgénica contenga el ADN insertado exclusivamente como una parte estable de su genoma. El maíz tolerante al herbicida transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz comprende una inserción simple de ADN transgénico en el cromosoma/genoma del germoplasma de maíz. El evento MON 87419 de maíz se produjo por: (i) transformación de miles de células vegetales de maíz con una construcción de ácido nucleico que incluye los transgenes de interés, (ii) regeneración de una población de plantas de maíz que cada una contiene un evento transgénico único, y (iii) análisis, ensayos y selección de varios años para seleccionar un evento que tiene las propiedades agronómicas deseadas, el evento MON 87419 de maíz. El evento MON 87419 de maíz está caracterizado por la secuencia de ADN única de la inserción del transgén en la ubicación particular del genoma de la planta de maíz.

La acción de insertar el ADN transgénico en el genoma de la planta de maíz se logra mediante la transformación vegetal y da como resultado la creación de una nueva secuencia molecular genómica transgénica conocida como "evento". Esta secuencia es única y específica para el evento y se puede identificar fácilmente cuando se compara con la secuencia genómica de maíz original u otros eventos de maíz transgénico. El análisis molecular del evento MON 87419 de maíz identificó el sitio de inserción genómica del ADN insertado (SEQ ID NO:9) y la secuencia de ADN genómico de maíz flanqueante inmediatamente contigua a uno de los lados del ADN insertado (SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8). Esta disposición del ADN insertado con relación al ADN de genoma de planta de maíz de alrededor es por lo tanto específica y única para el maíz tolerante a herbicida transgénico que comprende el evento MON 87419 de maíz. Esta nueva secuencia molecular genómica (SEQ ID NO:10) también es una parte integral del cromosoma de las plantas de maíz tolerantes a herbicida transgénico que comprende el evento MON 87419 de maíz y como tal es estática en la planta y se puede pasar a la progenie de la planta.

La presente divulgación también describe progenie del transformante original que comprende el evento MON 87419 de maíz. Dicha progenie se puede producir mediante la autofecundación de una planta de maíz que comprende el evento MON 87419 de maíz o mediante cruzamiento sexual entre una planta de maíz que comprende el evento MON 87419 de maíz y otra planta que contiene o no el evento MON 87419 de maíz. Esta otra planta puede ser una planta transgénica que comprende el mismo evento o uno diferente o una planta no transgénica, tal como una de una variedad diferente. Incluso después del retrocruzamiento repetido de un padre recurrente, el evento MON 87419 de maíz del progenitor transformado está presente en la progenie de la cruza en la misma ubicación genómica.

Como se usa en la presente, el término “maíz” se refiere aZea mays(también denominado cereal) e incluye todas las variedades vegetales que se pueden crear con maíz.

La invención proporciona una planta de maíz tolerante a herbicida transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz que es tolerante a herbicida dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico) y herbicida glufosinato (ácido 2-amino-4-(hidroximetilfosfinil) butanoico). Dicamba es un herbicida de auxina sintética útil para controlar malezas de hoja ancha. Glufosinato es un herbicida organofosfórico útil para controlar un amplio espectro de pasto anual y perenne y malezas de hoja ancha. El evento MON 87419 de maíz contiene un gen de demetilasa(dmo)deStenotrophomonas maltophiliaque expresa una proteína dicamba mono-oxigenasa (DMO) para conferir tolerancia al herbicida dicamba y una resistencia al gen de bialafos(pat)deStreptomyces viridochromogenesque expresa la proteína fosfinotricina N-acetiltransferasa (PAT) para conferir tolerancia al herbicida glufosinato.

Como se usa en la presente, el término "recombinante" se refiere a un ADN, proteína u organismo no natural, que no se encontraría en la naturaleza normalmente y fue creado por intervención humana. Como se usa en la presente, una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que comprende una combinación de moléculas de ADN que no ocurrirían juntas naturalmente y es resultado de intervención humana, por ejemplo, una molécula de ADN que comprende una combinación de al menos dos moléculas de ADN heterólogas entre sí, tal como una molécula de ADN que comprende un transgén y el ADN genómico vegetal contiguo al transgén. Un ejemplo de una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN que comprende al menos una secuencia que se selecciona de SEQ ID NO:1-10. Como se usa en la presente, una "planta recombinante" es una planta que no existiría normalmente en la naturaleza, es el resultado de intervención humana y contiene una molécula de ADN transgénica. Como resultado de dicha alteración genómica, la planta recombinante es algo nuevo y claramente diferente de la planta salvaje relacionada. Un ejemplo de una planta recombinante es una planta de maíz que contiene el evento MON 87419 de maíz.

Como se usa en la presente, el término "transgén" se refiere a una molécula de ADN incorporada artificialmente en el genoma del organismo como resultado de intervención humana, tal como por procedimientos de transformación vegetal. Un transgén puede ser heterólogo al organismo. El término "inserto de transgén" como se usa en la presente se refiere al transgén insertado por técnicas de transformación vegetal en el genoma de maíz para producir el evento MON 87419 de maíz. La secuencia para este inserto de transgén se proporciona como la s Eq ID NO:9. El término "transgénico" se refiere a que comprende un transgén, por ejemplo, una "planta transgénica" se refiere a una planta que comprende un transgén.

Como se usa en la presente, el término "heterólogo" se refiere a una primera molécula que no está normalmente asociada con una segunda molécula o un organismo en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula de ADN puede derivar de una primera especie e insertarse en el genoma de una segunda especie. La molécula de ADN por lo tanto será heteróloga para el genoma y el organismo.

Como se usa en la presente, el término "quimérico" se refiere a una molécula de ADN simple producida mediante la fusión de una primera molécula de ADN con una segunda molécula de ADN, donde ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encontraría normalmente en esa configuración fusionadas entre sí. La molécula de ADN quimérica es por lo tanto una nueva molécula de ADN que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Un ejemplo de una molécula de ADN quimérica es una molécula de ADN que comprende al menos una secuencia que se selecciona de SEQ ID NO:1-10.

La invención proporciona moléculas de ADN y sus secuencias de ADN correspondientes. Como se usa en la presente, los términos “ADN” y “molécula de ADN” se refieren a una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN). Una molécula de ADN puede ser de origen genómico o sintético, y es por convención del extremo 5' (anterior) al extremo 3' (posterior). Tal como se usa en la presente, el término "secuencia de ADN" se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. La nomenclatura utilizada es la que exige el Título 37 del Código de Reglamentos Federales de Estados Unidos § 1.822 y que se establece en las tablas en la Norma de la OMPI ST25 (1998), Apéndice 2, tablas 1 y 3. Por convención, las secuencias de ADN de la invención y fragmentos de estas se describen con referencia a solo una cadena de las dos cadenas de secuencias de ADN complementarias. Por implicación e intento, las secuencias de complementariedad de las secuencias proporcionadas en la presente (las secuencias de la cadena complementaria), también denominadas en la técnica secuencias de complementariedad inversas, se encuentran dentro del alcance de la técnica y pretenden expresamente estar dentro del alcance de la materia reivindicada. Por lo tanto, como se usa en la presente las referencias a SEQ ID NO:1-10 y SEQ ID NO:14-22 y fragmentos de estas incluyen y se refieren a la secuencia de la cadena complementaria y fragmentos de esta.

Como se usa en la presente, el término "fragmento" se refiere a una parte más pequeña de una totalidad. Por ejemplo, fragmentos de la SEQ ID NO:10 incluirían secuencias que son al menos alrededor de 20 nucleótidos consecutivos, al menos alrededor de 25 nucleótidos consecutivos, al menos alrededor de 30 nucleótidos consecutivos, al menos alrededor de 35 nucleótidos consecutivos, al menos alrededor de 40 nucleótidos consecutivos, al menos alrededor de 45 nucleótidos consecutivos, al menos alrededor de 50 nucleótidos consecutivos, al menos alrededor de 60 nucleótidos consecutivos, al menos alrededor de 70 nucleótidos consecutivos, al menos alrededor de 80 nucleótidos consecutivos, al menos alrededor de 90 nucleótidos consecutivos, o al menos alrededor de 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia completa de la SEQ ID NO:10.

La secuencia de ADN correspondiente a la secuencia de ADN completa del inserto de transgén y los segmentos sustanciales del ADN genómico de maíz que flanquea cada extremo del inserto de transgén se proporciona como la SEQ ID NO:10. Las secuencias de ADN del ADN genómico de maíz enlazadas físicamente por enlazador de unión de fosfodiéster y que flanquean por lo tanto el extremo 5' del inserto de transgén se proporcionan como las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, y SEQ ID NO:7. La secuencia de ADN del ADN genómico de maíz enlazada físicamente por enlazador de unión de fosfodiéster y que flanquea por lo tanto el extremo 3' del inserto de transgén se proporciona como la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, y SEQ ID NO:8.

El maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz comprende dos regiones denominadas uniones. Una "unión" es donde un extremo del inserto de transgén se conectó con el ADN genómico. Una unión abarca o se extiende a través de una parte del inserto de transgén y el ADN genómico flanqueante contiguo y como tal es el punto de conexión de estos dos como una molécula contigua. Una unión está en el extremo 5' del inserto de transgén y una está en el extremo 3' del inserto de transgén, denominadas en la presente unión 5' y 3', respectivamente. Una "secuencia de unión" se refiere a una secuencia de ADN de cualquier longitud que abarca la unión 5' o 3' de un evento. Las secuencias de unión del evento MON 87419 de maíz son fácilmente evidentes para un experto en la técnica usando la SEQ ID NO:10. Ejemplos de secuencias de unión del evento MON 87419 de maíz se proporcionan como la SEQ ID NO:1-8. La Figura 1 ilustra la disposición física de la SEQ ID NO:1-10 colocada de 5' a 3'. La invención por lo tanto proporciona una molécula de ADN que contiene al menos una de las secuencias de ADN establecidas en la SEQ ID NO:1-8.

Las secuencias de unión del evento MON 87419 de maíz pueden estar presentes como parte del genoma de una planta, semilla o célula de maíz transgénico, que contiene el evento MON 87419 de maíz. La identificación de cualesquiera una o más de las SEQ ID NO:1-8 en una muestra derivada de una planta, parte de planta, semilla o célula de maíz transgénico indica que el ADN se obtuvo de maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz y diagnostica la presencia del evento MON 87419 de maíz.

El evento MON 87419 de maíz contiene secuencias que son únicas para el inserto de transgén, específicamente las SEQ ID NO:14-22. Estas secuencias son únicas para la configuración quimérica específica de varios promotores, intrones, péptidos de direccionamiento de cloroplastos (CTP), señal de terminación 3', los genespatydmodentro del inserto de transgén del evento. La Figura 1 ilustra la posición relativa de cada una de estas secuencias de inserto de transgén único con respecto a la SEQ ID NO:9.

Se proporcionan ejemplos de moléculas de ADN que se pueden usar como cebadores o sondas para diagnosticar la presencia en una muestra de ADN derivado del evento MON 87419 de maíz. Dichos cebadores o sondas son específicos para una secuencia de ácido nucleico diana y como tales son útiles para la identificación del evento MON 87419 de maíz mediante procedimientos descritos aquí.

Un “cebador” es una molécula de ADN que está diseñada para su uso en procedimientos de apareamiento o hibridación que implican reacción por amplificación. Una reacción por amplificación es una reacciónin vitroque amplifica ADN de plantilla para producir un amplicón. Como se usa en la presente, un “amplicón” es una molécula de ADN que se ha sintetizado utilizando técnicas de amplificación. Los amplicones de la invención tienen una secuencia de ADN que comprende una o más de las SEQ ID NO:1-10, o fragmentos de estas. Un par de cebadores se pueden utilizar con ADN de plantilla, por ejemplo una muestra de ADN genómico de maíz, en una reacción por amplificación, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para producir un amplicón, donde el amplicón producido puede tener una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia del ADN de plantilla ubicada entre los dos sitios en donde los cebadores se hibridaron con la plantilla. Un cebador se diseña típicamente para hibridarse a una cadena de ADN diana de complementario para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana. La presencia de un cebador es un punto de reconocimiento por una polimerasa para comenzar la extensión del cebador usando la cadena de ADN diana como una plantilla. Los pares de cebador se refieren al uso de dos cebadores que se unen a cadenas opuestas de un segmento de nucleótido de cadena doble con el fin de amplificar el segmento de nucleótido entre ellos. Ejemplos de secuencias de cebadores se proporcionan como las SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12. El par de cebadores proporcionado como las SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12 es útil como una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, donde la primera molécula de ADN es un fragmento de la SEQ ID NO:9 y la segunda molécula de ADN es un fragmento del ADN genómico de maíz de la SEQ ID NO:10, y cada una tiene suficiente longitud para funcionar como cebadores de ADN cuando se usan juntas en una reacción por amplificación con ADN que contiene el evento MON 87419 de maíz para producir un amplicón que diagnostica el evento MON 87419 de maíz en una muestra. La secuencia de ADN genómico de maíz del evento MON 87419 de maíz se proporciona como las posiciones 1-1246 y 8009-9259 de la SEQ ID NO:10.

Una “sonda” es una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una cadena de un ácido nucleico diana y útil en procedimientos de detección de hibridación. Las sondas de acuerdo con la invención no solo incluyen ácidos desoxirribonucleico o ribonucleico sino también incluyen poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN diana y la detección de tal unión puede ser útil para detectar la presencia o ausencia de la secuencia de ADN diana. Una sonda puede estar unida a una molécula señalizadora o indicadora detectable convencional, tal como un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima. Un ejemplo de secuencia de ADN útil como sonda para detectar un evento MON 87419 de maíz se proporciona como SEQ ID NO:13.

En la técnica se conocen procedimientos para diseñar y usar cebadores y sondas, y las moléculas de ADN que comprenden fragmentos de SEQ ID NO:1-10 y útiles como cebadores y sondas para detectar el evento MON 87419 de maíz pueden ser fácilmente diseñadas por un experto en la técnica.

Las moléculas de ADN y secuencias de ADN correspondientes provistas en la presente son por ende útiles para identificar el evento MON 87419 de maíz en plantas, células, semillas o partes de maíz transgénicas; seleccionar las variedades de maíz o híbridos que comprenden el evento MON 87419 de maíz; y detectar la presencia o ausencia del evento MON 87419 de maíz en una muestra.

Tal como se usa en la presente, el término "aislado" se refiere a separar una molécula de otras moléculas normalmente asociadas con esta en su estado original o natural. El término "aislado" por lo tanto se puede referir a una molécula de ADN que fue separada de otra/s molécula/s de ADN que normalmente están asociadas con esta en su estado original o natural. Tal molécula de ADN puede estar presente en un estado recombinado, tal como una molécula de ADN recombinante. Por lo tanto, las moléculas de ADN fusionadas a secuencias reguladoras o codificantes que no están normalmente asociadas, por ejemplo como resultado de técnicas recombinantes, se consideran aisladas, aun cuando están integradas como un transgén en el cromosoma de una célula o presentes con otras moléculas de ADN.

La invención proporciona plantas, semillas, células vegetales y partes de planta de maíz que contienen el evento MON 87419 de maíz. Se depositó una muestra representativa de semilla de maíz transgénico tolerante a herbicida que comprende evento MON 87419 de acuerdo con el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC®). El depósito ATCC asignó la Designación de Depósito de Patente PTA-120860 a la semilla de la planta de maíz transgénico tolerante a herbicida que contiene el evento MON 87419 de maíz. Las plantas, semillas, células vegetales, partes de la planta de la invención contienen una cantidad detectable de ADN que tiene al menos una de las secuencias provistas como SEQ ID NO: 10. Las plantas, semillas, células vegetales y partes de la planta de la invención pueden también contener uno o más rasgos transgénicos adicionales, particularmente los introducidos al cruzar una planta de maíz que contiene el evento MON 87419 de maíz con otra planta que contiene uno o más rasgos transgénicos adicionales. Tales rasgos incluyen de modo no taxativo mayor resistencia a insectos, mayor eficacia del uso del agua, mayor rendimiento, mayor resistencia a las sequías, mayor calidad de semilla, mayor calidad nutricional, producción de semillas híbridas y/o mayor tolerancia a herbicidas, donde el rasgo se mide con respecto a una planta de maíz que carece de tal rasgo transgénico.

Las plantas de la invención pueden usarse para producir progenie que contiene el evento MON 87419 de maíz. Como se usa en la presente, "progenie" incluye cualquier planta, semilla, y célula vegetal que comprende el evento MON 87419 de maíz heredado de una plata antecesora, indicada por la planta que comprende una molécula de ADN que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 10. Las plantas, progenie y semillas pueden ser homocigotas o heterocigotas para el evento MON 87419 de maíz. Las plantas de progenie pueden cultivarse a partir de semillas producidas por una planta de maíz que contiene el evento MON 87419 de maíz o a partir de semillas producidas por una planta de maíz fertilizada con polen que contiene el evento MON 87419 de maíz.

Como se usa en la presente, una "parte de la planta" de la invención es cualquier parte derivada de una planta de maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz. Las partes de la planta incluyen de modo no taxativo, polen, óvulo, vaina, flor, raíces, tallos, fibras y hojas. Las partes de la planta pueden ser viables o no viables.

La divulgación describe un producto básico que se produce a partir de maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz. Los productos básicos descritos contienen una cantidad detectable de a Dn que comprende una secuencia de ADN que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1-10. Como se usa en la presente, un “producto básico” se refiere a cualquier composición o producto que comprende material derivado de una planta de maíz transgénica, semilla de maíz, célula vegetal de maíz o parte de la planta de maíz que contienen el evento MON 87419 de maíz. Los productos básicos incluyen de modo no taxativo semillas procesadas, granos, partes de la planta y alimento. El maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz puede usarse para fabricar cualquier producto básico típicamente adquirido del maíz. Un producto básico descrito en el presente documento contendrá una cantidad detectable de ADN correspondiente al evento MON 87419 de maíz. La detección de uno o más de este ADN en una muestra puede usarse para determinar el contenido o la fuente de producto básico. Puede usarse cualquier procedimiento estándar de detección de moléculas de ADN, incluyendo los procedimientos de detección descritos en la presente.

La invención provee procedimientos para controlar malezas que usan glufosinato o dicamba, o herbicidas glufosinato y dicamba con maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz. Se provee un procedimiento para controlar malezas en un área, tal como un campo, que consiste en plantar plantas de maíz transgénico que contienen el evento MON 87419 de maíz en un área y aplicar una dosis eficaz como herbicida de glufosinato o dicamba, o herbicidas glufosinato y dicamba a un área a los efectos de controlar malezas en el área sin dañar las plantas de maíz transgénico que contienen el evento MON 87419 de maíz. Tal aplicación de glufosinato o dicamba, o herbicidas glufosinato y dicamba puede ser pre-aparición (cualquier momento luego de que se planta la semilla de maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz y antes de que aparecen las plantas de maíz transgénico que contienen el evento MON 87419 de maíz) o post-aparición (cualquier momento luego de que aparecen las plantas de maíz transgénico que contienen el evento MON 87419 de maíz). Una dosis eficaz como herbicida de glufosinato para usar en el área para controlar malezas debe consistir en un intervalo de alrededor de 0,1 libra de ácido equivalente por acre (ae/ac) hasta tanto como alrededor de 16 libras ae/ac de glufosinato en una temporada de cultivo. Una dosis eficaz como herbicida de dicamba para usar en el área para controlar malezas debe consistir en un intervalo de alrededor de 0,1 libra ae/ac hasta tanto como alrededor de 16 libras ae/ac de dicamba en una temporada de cultivo. Múltiples aplicaciones de glufosinato o dicamba, o herbicidas glufosinato y dicamba pueden usarse durante una temporada de cultivo, por ejemplo, dos aplicaciones (tales como una aplicación pre-plantación y una aplicación post aparición o una aplicación pre-aparición y una aplicación post-aparición) o tres aplicaciones (tales como una aplicación pre-plantación, una aplicación pre-aparición y una aplicación post-aparición).

Como se usa en la presente, el "ingrediente activo" o "ai" es el componente de una formulación herbicida responsable de la actividad herbicida, a menudo medido en libras por galón o aplicado como libras por acre. Para herbicidas que son ácidos (por ejemplo, moléculas que tienen un grupo carboxilo como parte de su estructura), el grupo ácido se convierte a menudo en (puede remplazarse por los iones deseados para formar) una sal o (hacerse reaccionar con un alcohol para formar) un éster durante el proceso de formulación. Esto puede alterar no solo las características químicas de una molécula herbicida particular, sino también la masa. Sin embargo, el ácido correspondiente es la parte activa como herbicida de la formulación y la equivalencia de la actividad herbicida entre diferentes ingredientes activos puede calcularse usando el equivalente ácido como la unidad de medición estándar. El término “equivalente ácido” o “ae” significa la parte de un ingrediente activo en una formulación que teóricamente podría convertirse nuevamente en el ácido correspondiente. Las tasas de aplicación de herbicida pueden expresarse como “equivalente ácido por acre” (abreviarse como “ae/ac”) o como “ingrediente activo por acre” (abreviado como “ai/ac”).

Se describen procedimientos para producir una planta de maíz transgénico tolerante a herbicida que contiene el evento MON 87419 de maíz. La progenie producida a través de estos procedimientos pueden ser plantas híbridas o varietales; se pueden cultivar de semillas producidas por una planta de maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz o de semillas producidas por una planta de maíz fertilizada con polen de una planta de maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz; y pueden ser homocigotas o heterocigotas para el evento MON 87419 de maíz. Las plantas pueden autopolinizarse (también denominado "autofecundación") o polinizarse de manera cruzada (también denominarse "cruzamiento"). Las plantas de maíz transgénico que contienen el evento MON 87419 de maíz pueden autopolinizarse para generar una verdadera línea de reproducción de plantas que son homocigotas para el evento MON 87419 de maíz. La autofecundación provoca la progenie conocida como "engendrada por endogamia" y se usa para producir líneas endogámicas que son genéticamente uniformes. De manera alternativa, las plantas de maíz transgénico que contienen el evento MON 87419 de maíz pueden cruzarse (engendrarse con otra planta que sea transgénica o no transgénica) para producir un varietal o una semilla híbrida. Las plantas de semillas y de progenie realizadas por estos procedimientos contendrían el evento MON 87419 de maíz y pueden entonces tratarse con glufosinato o dicamba, o herbicidas glufosinato y dicamba. El tratamiento con glufosinato o dicamba, o herbicidas glufosinato y dicamba puede usarse para seleccionar progenie que sea tolerante. De manera alternativa, estas plantas de progenie pueden analizarse usando procedimientos de diagnóstico para seleccionar plantas o semillas que contengan el evento MON 87419 de maíz.

Las plantas, semillas, células vegetales y partes de la planta de la invención pueden también contener uno o más rasgos transgénicos de maíz adicionales, particularmente los introducidos al cruzar la planta de maíz que contiene el evento MON 87419 de maíz con otra planta de maíz que contiene uno o más rasgos transgénicos adicionales. Tales rasgos transgénicos de maíz incluyen de modo no taxativo mayor resistencia a insectos, mayor eficacia del uso del agua, mayor rendimiento, mayor resistencia a las sequías, mayor calidad de semilla, mayor calidad nutricional, producción de semillas híbridas y tolerancia a herbicidas, donde el rasgo se mide con respecto a una planta de maíz que carece de tal rasgo transgénico. Tales rasgos transgénicos de maíz son conocidos por un experto en la técnica; por ejemplo, una lista de tales rasgos la provee el Servicio de Inspección de Salud Animal y Vegetal (APHIS) del Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) y puede encontrarse en su sitio web en http://www.aphis.usda.gov. Por ende dos plantas transgénicas pueden cruzarse para producir progenie que contenga dos o más rasgos transgénicos de segregación independiente. Se contemplan también el retrocruzamiento a una planta parental y el cruzamiento con una planta no transgénica, así como la propagación vegetativa. Las descripciones de procedimientos de reproducción que se usan comúnmente para obtener diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de varias referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).

Las plantas, semillas, células, partes de la planta de la invención pueden usarse para la detección de ADN y moléculas de proteínas que indican la presencia del evento MON 87419 de maíz. Tal detección se realizaría usando las secuencias de ADN provistas en la presente y las respectivas secuencias de proteínas DMO y PAT codificadas por el inserto de transgén que se provee como SEQ ID NO:9. La detección de la presencia del evento MON 87419 de maíz puede realizarse usando procedimientos conocidos en la técnica, tal como amplificación térmica de ácido nucleico, técnicas de hibridación de ácido nucleico (tal como transferencia northern y análisis southern), técnicas de detección de proteínas (tales como transferencia western, inmunoprecipitación, y técnicas basadas en el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)) o usando los procedimientos de detección y/o los kits de detección provistos en la presente. Un procedimiento proporciona el contacto de una muestra de ADN con un par de cebadores que es capaz de producir un amplicón de ADN del maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz, realizar una reacción de amplificación y por ende producir un amplicón de ADN que comprende al menos una de las secuencias de ADN provistas como SEQ ID NO:1-8 y 10, y luego detectar la presencia o ausencia de la molécula de amplicón y opcionalmente confirmar en la secuencia del amplicón una secuencia que comprende al menos una de las secuencias provistas como SEQ ID NO:1-8 y 10. La presencia de tal amplicón diagnostica la presencia de ADN específico para el maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz y por ende material biológico en la muestra que deriva del maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz. Otro procedimiento proporciona el contacto de una muestra de ADN con una sonda de ADN, sometiendo la sonda y la muestra de ADN a condiciones de hibridación rigurosas, y luego detectar la hibridación entre la sonda y la muestra de ADN diana. La detección de hibridación diagnostica la presencia de ADN específico para el maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz en la muestra de ADN.

Se proporcionan kits de detección de ADN para el evento MON 87419 de maíz. También se pueden desarrollar variantes de tales kits usando las composiciones y procedimientos divulgados en la presente y los procedimientos conocidos en la técnica de detección de ADN. Los kits de detección de ADN pueden aplicarse a procedimientos para reproducir plantas de maíz transgénico que contienen el evento MON 87419 de maíz. Tales kits contienen cebadores o sondas de ADN que comprenden fragmentos de SEQ ID NO:1-8 y 10. Un ejemplo de tal kit comprende al menos una molécula de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ iD NO:10 para funcionar como una sonda de ADN útil para detectar la presencia y/o ausencia en una muestra del ADN derivado de plantas de maíz transgénico tolerantes a herbicidas que contienen el evento MON 87419 de maíz. Una molécula de ADN suficiente para el uso como una sonda de ADN que es útil para determinar, detectar o diagnosticar la presencia y/o ausencia en una muestra de maíz transgénico tolerante a herbicidas que contiene el ADN del evento MON 87419 de maíz se proporciona como SEQ ID NO:13. Otras sondas pueden diseñarse fácilmente por un experto en la técnica y deben comprender al menos alrededor de quince nucleótidos de SEQ ID NO:10 y ser lo suficientemente únicos para maíz transgénico tolerante a herbicidas que contiene el ADN del evento MON 87419 de maíz para identificar ADN que deriva del evento MON 87419 de maíz. Otro tipo de kit comprende un par de cebadores útil para producir un amplicón útil para detectar la presencia o ausencia en una muestra del evento MON 87419 de maíz. Tal kit emplearía un procedimiento que comprende poner en contacto una muestra de ADN diana con un par de cebadores, luego realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico suficiente para producir un amplicón que comprende una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia que se selecciona de SEQ ID NO:1-8 y 10, y luego detectar la presencia o ausencia del amplicón. Tal procedimiento puede también incluir secuenciar el amplicón o un fragmento de este. Otros pares de cebadores pueden diseñarse fácilmente por un experto en la técnica y deben comprender al menos veinte nucleótidos de SEQ ID NO:10 y ser lo suficientemente únicos para maíz transgénico tolerante a herbicidas que contiene el ADN del evento MON 87419 de maíz para detectar el evento MON 87419 de maíz. Los kits de la invención pueden también comprender reactivos para realizar las reacciones de detección o diagnóstico descritas en la presente o instrucciones para el uso del kit y su contenido.

Como se usa en la presente, la expresión "que comprende" significa "que incluye pero no se limita a".

Información de depósito

Se realizó un depósito de una muestra que representa la semilla de maíz transgénico que comprende el evento MON 87419 de maíz de acuerdo con el Tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) que tiene una dirección en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EUA, código postal 20110. La Designación de Depósito de Patente de ATCC (número de acceso) para semillas que comprenden el evento MON 87419 de maíz es PTA-120860 y la fecha de depósito fue 17 de enero de 2014. El depósito se mantendrá en las instalaciones por un período de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o mientras la patente esté vigente, cualquiera sea el período más largo.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se incluyen para describir la invención de manera más completa.

Ejemplo 1: Producción y selección del evento MON 87419

Este ejemplo describe la producción, análisis y selección de maíz transgénico que contiene el evento MON 87419, un evento que puede proveer tolerancia a ambos herbicidas dicamba y glufosinato. Se resume la producción y análisis de decenas de miles de plantas individuales durante múltiples años mediante las rigurosas pruebas de campo, fenotípicas y moleculares necesarias para la selección final del evento MON 87419 de maíz.

Los vectores de transformación que contienen una variedad de diferentes casetes de expresión se diseñaron y analizaron para confirmar su utilidad para expresar los genesdmoypat.Usando estos datos, se seleccionaron combinaciones de elementos de expresión y se construyeron ocho vectores de transformación diferentes y transformaron en maíz. Estos vectores analizaron promotores y terminadores en varias combinaciones con las dos regiones codificantes para el genpaty el gendmo(Tabla 1). Las plantas resultantes se analizaron para determinar la expresión proteica y dos vectores (mostrados como A y B en Tabla 1) se seleccionaron para determinar la transformación de maíz comercial.

Tabla 1. Configuración de casete de los vectores de transformación.

Se produjeron más de trece mil plantas de maíz transformadas únicas usando los dos vectores (A y B) seleccionados. En las plantas existe a menudo una amplia variación en los niveles de expresión de un gen introducido entre eventos individuales, y la expresión génica puede directamente correlacionarse de manera positiva o negativa con el fenotipo de la planta que contiene el evento. Es sabido que la expresión de genes extraños en las plantas está influenciada, entre otras cosas, por su posición cromosómica. Por esta razón, fue necesario tamizar una gran cantidad de plantas individuales que contenían eventos de inserción aleatorios a lo largo de varios años y locaciones para identificar el evento óptimo. El evento MON 87419 de maíz transgénico se creó mediante la transformación mediada porAgrobacteriumde embriones inmaduros de maíz LH244. En la técnica se conocen procedimientos para transformar maíz. Las células de maíz se transformaron y regeneraron en plantas de maíz intactas. Se seleccionaron plantas con raíz con características fenotípicas normales. Miles de eventos independientes e individuales se transplantaron luego a la tierra para su crecimiento y evaluación adicional.

Tabla 2. Proceso de selección de evento

Mediante el proceso de selección de eventos, se llevaron a cabo el análisis molecular así como también ensayos de campo para evaluar fenotipo, agronomía y eficacia de los eventos, a menudo simultáneamente (Tabla 2). Las 13.000 plantas R0 de maíz transformadas únicas e individuales se analizaron primero por PCR para seleccionar eventos con copia simple del inserto de transgén (copia simple de primer pase). Esto dio como resultado el avance de 2.998 eventos. La siguiente selección fue la tolerancia de spray herbicida R0 realizada en un invernadero. Las plantas se analizaron para detectar la tolerancia tanto a glufosinato (herbicida Ignite® 280) y dicamba (herbicida Clarity®) usando una mezcla de tanque de glufosinato (0,9 lb ai/ac) y dicamba (2,0 lb ae/ac) rociada en la etapa de crecimiento V1/V2. Las plantas que mostraron >15% de daño se descartaron, y se seleccionaron 1.440 eventos para análisis adicional. Se llevó a cabo un análisis molecular detallado inicial y se incluyó identificación y confirmación de secuencias, y una segunda verificación de cantidad de copias y ausencia de estructura principal. Este análisis resultó en 184 eventos que contienen solo una copia única del inserto de transgén seleccionado para avanzar. El análisis southern en ADN extraído de eventos R0 se realizó para confirmar adicionalmente la cantidad de copias de inserto de transgén y para confirmar la ausencia de estructura principal de transformación. Según esto, se seleccionaron 112 eventos para avanzar a R1 para análisis adicional. Plantas R0 se autopolinizaron y la semilla se recogió para ensayos R1.

Simultáneamente con todos los ensayos de campo, hubo análisis moleculares adicionales en curso. Se llevó a cabo análisis northern para detectar y medir transcripciones de ARNm de los genespatydmo.La secuenciación de proteínas de extremo N de las proteínas PAT y DMO purificadas de plantas transgénicas que contenían eventos seleccionados se llevó a cabo para confirmar la secuencia de proteínas recombinantes. El análisis western para detectar las proteínas PAT y d Mo se realizó con muestras de plantas transgénicas. La secuenciación de todo el transgén y ambos extremos 5' y 3' del inserto se llevó a cabo y posteriormente se usó para desarrollar procedimientos para detectar eventos individuales. El análisis southern en profundidad se realizó en plantas R1 para confirmar la cantidad de copias y la ausencia de estructura principal.

Para los tamices tempranos de ensayos de campo R1, de los 112 eventos seleccionados del tamizaje R082 eventos se seleccionaron según el retorno de semillas y consideraciones de tamaño en el vivero. Las plantas R1 se segregaron, y por ende fueron nulas, hemicigotas u homocigotas para un evento. Los 82 eventos en las plantas R1 se evaluaron en un tamiz de eficacia de campo con altas tasas de aplicación de herbicida. El daño de las plantas se evaluó siguiendo tratamientos con varias combinaciones de glufosinato (Ignite 280) y dicamba (Clarity) (tasas de aplicación de campo etiquetadas con hasta 20X de glufosinato y hasta 16X de dicamba) y con tiempo de aplicación en varias etapas de crecimiento de V1/V2 a V8/V10. Las valoraciones del daño se tomaron 10 a 14 días luego de la aplicación de herbicida. Las valoraciones de daño estándar incluyen la puntuación de porcentaje de clorosis, malformación y reproducción. Los promedios generales para múltiples plantas que contienen el mismo evento se usaron para seleccionar eventos para avanzar. Las aplicaciones de herbicida a tasas 2X generalmente produjeron menos de 10% de daño, y la aplicación de herbicida a las tasas 16X y 20X produjeron puntuaciones de daño de más de 10%. Además de las pruebas de eficacia, se recogió la puntuación agronómica para cada planta y se correlacionó con el evento que contenía. Los criterios de puntuación agronómica que se evaluaron incluyeron la altura de las plantas, altura de las espigas, porcentaje de humedad, peso de prueba, días para 50% polen, y días para 50% seda. Según el análisis de los datos recogidos de los ensayos de campo R1 y el análisis molecular, se seleccionaron 44 eventos para avanzar a R2 para análisis adicional. Plantas R1 se autopolinizaron y la semilla se recogió para ensayos R2.

En los tamices tempranos de ensayos de campo R2, los eventos R2 y F1 (de un cruzamiento R1) se evaluaron en tamices de eficacia de campo en tres locaciones (dos estados y Puerto Rico). El daño de las plantas se evaluó siguiendo tratamientos con varias combinaciones de tasas de aplicación y tiempos de aplicación de glufosinato y dicamba. Las plantas R2 son homocigotas para el evento, y la tasa de fallo de tolerancia a herbicidas luego de la aplicación de herbicida fue baja, confirmando los resultados de R1. Los datos agronómicos se recogieron y puntuaron como en los ensayos de campo de R1. El análisis molecular adicional, que incluye análisis de expresión de genes, también se usó para seleccionar plantas que contenían los mejores eventos. Según el análisis de los datos recogidos de los ensayos de campo R2 y F1 y el análisis molecular, se seleccionaron 42 eventos para avanzar a R3 para análisis adicional. Plantas R2 se autopolinizaron y la semilla se recogió para ensayos R3.

Para los ensayos de campo avanzados, se llevaron a cabo ensayos de campo agronómico endogámico e híbrido y de eficacia endogámica e híbrida. Los ensayos de campo agronómico se realizaron durante la misma temporada que los ensayos de campo de eficacia. Todos los ensayos de campo usaron un diseño de bloque completo aleatorizado y se condujeron en múltiples locaciones. Para los ensayos de campo agronómicos y de eficacia, se recogió la puntuación agronómica durante toda la temporada de ensayo de campo, y al final de la temporada se determinó el rendimiento (rendimiento de eficacia o rendimiento agronómico). Los ensayos de campo de eficacia se condujeron para evaluar el daño en cultivos 10 a 14 días luego de la aplicación de herbicida, valorizaciones del daño de los cultivos y rendimiento. La valoración del daño de los cultivos diana fue una puntuación de menos de 10% para el avance del evento. Para ensayos de campo agronómicos, las parcelas se mantuvieron libres de malezas y no se aplicó ningún herbicida glufosinato o dicamba durante la temporada de cultivo. Los ensayos de campo agronómicos de híbridos incluyeron controles de un híbrido comparable (control de híbridos) producido usando las mismas líneas de maíz originales usadas para realizar el cruzamiento de híbridos transgénicos, pero que no contenían un evento transgénico. Los controles endogámicos fueron un innato comparable a las líneas endogámicas transgénicas.

Se llevó a cabo un meta-análisis usando el agregado de datos de ensayos de campo multi-temporada, multi-locación. La Tabla 3 ilustra la cantidad de replicaciones para las que se repitió una observación para el tipo de ensayo de campo particular para plantas que contienen alguno de los eventos. Para cada uno de los dos eventos, hubo 135 puntos de datos registrados para rendimiento agronómico de híbridos, 933 puntos de datos para eficacia de híbridos, 179 puntos de datos para agronomía endogámica, 30 puntos de datos para eficacia endogámica, y 16 puntos de datos para pruebas de presión basadas en eventos de tasas de aplicación de herbicida para maíz que contiene el evento.

Tabla 3. Replicaciones de ensayos de campo para dos eventos finales.

Cada una de las plantas híbridas que contienen uno de los 23 eventos seleccionados (un subconjunto de los 42 eventos del ensayo de campo R2) se evaluaron ensayos de campo de eficacia contra-temporada y ensayos de campo agronómicos de Año 1 en América del Sur (SA). Los ensayos se realizaron en seis locaciones en un diseño de bloque completo aleatorizado con 4 tratamientos y 2 replicaciones por tratamiento. En los ensayos de campo de eficacia, la formulación con dicamba fue el herbicida Banvel® 4SL y la formulación con glufosinato fue Liberty® 1.67SL. Los tratamientos con herbicida consistieron en lo siguiente: (1) control no tratado; (2) dicamba a 2 lbs ae/acre (ac) PRE (donde PRE se define como en la plantación o antes de la aparición del cultivo) seguido por dicamba a 1 lb ae/ac aplicada en cada VE-V2 seguido por V4 seguido por V8; (3) glufosinato aplicado en 0,8 lb ai/ac a VE-V2 seguido por V4 seguido por V8; y (4) glufosinato aplicado en 0,8 lb ai/ac más dicamba aplicado en 1 lb ae/ac a VE-V2 seguido por V4 seguido por V8. Las valoraciones del daño se tomaron 10 a 14 días luego de la aplicación de herbicida. Los promedios generales para múltiples plantas que contienen el mismo evento se usaron para seleccionar eventos para avance. La valoración del daño de los cultivos diana fue una puntuación de menos de 10%, y la valoración del daño observado fue menor a 1%. Según la puntuación del daño de híbridos, puntuación agronómica, rendimiento de la eficacia, rendimiento agronómico y análisis molecular adicional, se seleccionaron 17 eventos para avanzar.

Las plantas híbridas y endogámicas de los 17 eventos que avanzaron de ensayos de campo de eficacia contra temporada de Año 1 en América del Sur (SA) se evaluaron adicionalmente en los ensayos de campo agronómicos y ensayos de campo de eficacia de Año 1 en Estados Unidos (US). Estos ensayos se realizaron en 2012, que fue una época de severas sequías en Estados Unidos. Los ensayos de campo de eficacia de híbridos se realizaron en 12 locaciones, 2 estados en un diseño de bloque completo aleatorio con 6 tratamientos y 3 replicaciones por tratamiento. Las plantas híbridas que contenían el evento transgénico derivaron tolerancia a glifosato del progenitor masculino en el cruzamiento. En estos ensayos de campo de eficacia, la formulación de glifosato fue Roundup PowerMAX® 4.5SL, la formulación de dicamba fue Clarity 4SL, y la formulación de glufosinato fue Ignite 2802.34SL. Los tratamientos con herbicida consistieron en lo siguiente: (1) control no tratado; (2) glifosato a 3 lbs ae/ac aplicado en V4 seguido por V8; (3) glufosinato a 0,8 lb ai/ac aplicado en V2 seguido por V4 seguido por V8; (4) dicamba a 2 lbs ae/ac aplicado en PRE y luego nuevamente aplicado en V4 seguido por V8; (5) glifosato a 3 lbs ae/ac más dicamba a 1,5 lbs ae/ac aplicado en V2 seguido por V4 seguido por V8; (6) dicamba a 2 lbs ae/ac aplicado en V2 seguido por glufosinato a 0,8 lbs ai/ac más dicamba a 1 lb ae/ac aplicado en etapa de crecimiento V4 seguido por glifosato a 3 lbs ae/ac más dicamba a 1,5 lbs ae/ac aplicado en etapa de crecimiento V8. Las valoraciones del daño se tomaron 10 a 14 días luego de la aplicación de herbicida. Los promedios generales para múltiples plantas que contienen el mismo evento se usaron para seleccionar eventos para avanzar. La valoración del daño de los cultivos diana fue una puntuación de menos de 10%, y la valoración del daño observado fue menor a 1%. Según la puntuación del daño de híbridos, puntuación agronómica, rendimiento de la eficacia, rendimiento agronómico y análisis molecular adicional, se seleccionaron 11 eventos para avanzar.

Luego se llevaron a cabo ensayos de campo de contra-temporada de Año 2 en América del Sur (SA) para evaluar la eficacia de híbridos y rendimiento agronómico endogámico con plantas que contenían estos 11 eventos. Las plantas híbridas que contenían el evento transgénico derivaron tolerancia a glifosato del progenitor masculino en el cruzamiento. Los ensayos de campo de eficacia de híbridos se llevaron a cabo esencialmente como se describe para los ensayos de campo de contra-temporada de año 1 en América del Sur (SA) pero con los siguientes tratamientos con herbicida: (1) control no tratado; (2) glifosato a 3 lbs ae/ac aplicado en V4 seguido por V8; (3) glufosinato a 0,8 lb ai/ac aplicado en V4 seguido por V8; (4) dicamba a 2 lbs ae/ac aplicado en PRE y luego nuevamente aplicado en V4 seguido por V8; (5) glifosato a 3 lbs ae/ac más dicamba a 1,5 lbs ae/ac aplicado en V4 seguido por V8; (6) glufosinato a 0,8 lbs ai/ac más dicamba a 1 lb ae/ac aplicado en V4 seguido por glifosato a 3 lbs ae/ac más dicamba a 1,5 lbs ae/ac aplicado en V8. Las valoraciones del daño se tomaron 10 a 14 días luego de la aplicación de herbicida. Los promedios generales para múltiples plantas que contienen el mismo evento se usaron para seleccionar eventos para avanzar. Según la puntuación del daño de híbridos, puntuación agronómica, rendimiento de la eficacia de híbridos, rendimiento agronómico endogámico y análisis molecular adicional, se seleccionaron 5 eventos para avanzar.

El análisis molecular adicional se completó luego para estos 5 eventos. Los datos moleculares y de campo multi-año para cada uno de los 5 eventos, que incluyen ensayos de campo de eficacia de rasgos híbridos, mediciones de rendimiento endogámico e híbrido, puntuación agronómica, e información molecular se revisaron luego, y se seleccionaron dos eventos para análisis adicional. Ambos eventos se produjeron usando el mismo vector de transformación, y por ende tuvieron el mismo inserto de transgén pero no la misma locación genómica o secuencia flanqueante.

Se llevaron a cabo ensayos de campo agronómico endogámico e híbrido y ensayos de campo de eficacia endogámica e híbrida de Año 2 en Estados Unidos (US) para evaluar estos dos eventos. Los ensayos de eficacia de híbridos se realizaron de manera similar a los ensayos de campo de año 1 en US, pero incluyeron diferentes regímenes de spray. La eficacia se midió por puntuaciones de daño y rendimiento de eficacia de híbridos. También se realizó el análisis molecular adicional para los eventos. Las plantas híbridas que contenían el evento transgénico derivaron tolerancia a glifosato del progenitor masculino en el cruzamiento. Los ensayos de campo de eficacia de híbridos 1 y 2 se realizaron en doce locaciones en dos estados y los ensayos de campo de eficacia de híbridos 3 se llevaron a cabo en treinta y tres locaciones en cuatro estados. En estos ensayos de campo, la formulación de glifosato fue Roundup PowerMAX 4.5SL, la formulación de dicamba fue Clarity 4SL, y la formulación de glufosinato fue Ignite 280 2.34SL. Las aplicaciones de herbicida para los ensayos de eficacia 1 y eficacia 2 (con cruzamientos a dos líneas endogámicas separadas) fueron: (1) control no tratado; (2) glufosinato a 0,4 lb ai/ac aplicado en VE-V2 seguido por V6; (3) glufosinato a 0,8 lb ai/ac aplicado en VE-V2 seguido por V6; (4) dicamba a 0,5 lbs ae/ac aplicado en v 4 seguido por V8; (5) dicamba a 1,0 lbs ae/ac aplicado en V4 seguido por V8; y (6) glifosato a 2,25 lbs ae/ac más dicamba a 1,0 lbs ae/ac aplicado en V4 seguido por V8. Las aplicaciones de herbicida para el ensayo de eficacia 3 (que representa el híbrido de un cruzamiento con una tercera línea endogámica) fueron: (1) control no tratado; (2) dicamba a 0,5 lbs ae/ac aplicado en VE-V2 seguido por glufosinato a 0,4 lb ai/ac aplicado en V6; y (3) dicamba a 1,0 lbs ae/ac aplicado en VE-V2 seguido por glufosinato a 0,8 lb ai/ac aplicado en V6. Las puntuaciones de daño se tomaron 10 a 14 días luego de la aplicación de herbicida y para múltiples plantas que contenían el mismo evento se usaron para seleccionar eventos para avanzar. Se recogieron datos agronómicos y de rendimiento.

Para comparar las puntuaciones de daño de híbridos para los dos eventos, se completó un meta-análisis de los ensayos de campo de eficacia de híbridos múltiple. (Tabla 4) La puntuación de daño se marcó en V8 (donde el análisis V8 comprende el daño cumulativo de aplicaciones de herbicida V2, V4, V6, y V8) con una diferencia estadística menos significativa (LSD a p<0,05). La Muestra 1, Muestra 2, y Muestra 3 representan cruzamientos con 3 líneas originales de maíz endogámico independiente, que se usaron para generar el híbrido para el ensayo de campo indicado. Para cada uno de los ensayos, no se encontró diferencia estadística en la puntuación de daño entre híbridos generados usando un original de maíz transgénico que contenía cualquiera de los dos eventos.

Tabla 4. Meta-análisis de puntuación de daño de ensayos de campo de eficacia de híbridos.

Un meta-análisis del rendimiento de la eficacia de híbridos (bushels/acre) de los ensayos de campo de eficacia múltiple se completó comparando el rendimiento de los híbridos que contenían cada uno de los dos eventos. (Tabla 5) Para cada uno de los ensayos, no se encontró diferencia estadística en el rendimiento de la eficacia de híbridos entre híbridos generados usando un original de maíz transgénico que contenía cualquiera de los dos eventos.

Tabla 5. Meta-análisis de rendimiento de ensayos de campo de eficacia de híbridos.

Los ensayos de campo de pruebas de presión también se llevaron a cabo con maíz transgénico híbrido que contenía cualquiera de los dos eventos. En las pruebas de presión, se aplicó herbicida ya sea glufosinato (Ignite 280, 2.34SL) o dicamba (Clarity 4SL) a tasas no comercialmente altas. Para ensayos de campo típicos, la tasa 1X para glufosinato fue 0,4 lb ai/ac y la tasa 1X para dicamba fue 0,5 lb ae/ac. Para los ensayos de campo de prueba de presión de glufosinato, se aplicó glufosinato a VE-V2 seguido por V4 seguido por V8 a las siguientes tasas: (1) 1 lb ai/ac (2,5X); (2) 2 lb ai/ac (5X); (3) 4 lb ai/ac (10X); y (4) 8 lb ai/ac (20X). Para los ensayos de campo de prueba de presión de dicamba, se aplicó dicamba a VE-V2 seguido por V4 seguido por V8 a las siguientes tasas: (1) 2 lb ae/ac (4X); (2) 4 lb ae/ac (8X); (3) 8 lb ae/ac (16X); y (4) 16 lb ae/ac (32X). Al final de la temporada, los ensayos de campo de pruebas de presión de híbridos se cosecharon y se determinó el rendimiento (bushels/acre o bu/ac). Un análisis de los datos de rendimiento comparó híbridos que contenían cualquiera de los dos eventos. Para cada uno de los ensayos, no se encontró diferencia estadística en el rendimiento de cualquiera de las tasas de aplicación de herbicida entre híbridos generados usando un original de maíz transgénico que contenía cualquiera de los dos eventos.

Tabla 6. Rendimiento de ensayos de campo de eficacia de híbridos de presión de híbridos.

Se llevaron a cabo ensayos de campo agronómicos de híbridos en 3 grupos con 15 locaciones por grupo en 21 locaciones en 3 estados y se ejecutaron durante la misma época con los ensayos de campo de eficacia de híbridos. Se recogieron medidas agronómicas en toda la temporada de ensayos de campo, y al final de la temporada se determinó el rendimiento agronómico. El meta-análisis en los ensayos de campo agronómicos de híbridos multitemporada y multi-locación se usó para comparar el rendimiento del control de híbridos y los híbridos que contienen cualquiera de los dos eventos. No se encontró diferencia estadística en el rendimiento agronómico de híbridos ya sea entre los híbridos transgénicos o en comparación con los controles de híbridos (Tabla 7).

Tabla 7. Meta-análisis de rendimiento de ensayos de campo agronómico de híbridos.

Los ensayos de campo de eficacia endogámica se llevaron a cabo usando un diseño de bloque completo aleatorio en 6 locaciones, 1 estado. En estos ensayos de campo, la formulación de dicamba fue Clarity 4SL, y la formulación de glufosinato fue Ignite 2802.34SL. La aplicación de herbicida para los ensayos de campo de eficacia endogámica fue glufosinato a 0,8 lb ai/ac y dicamba a 2,0 lbs ae/ac aplicado en VE-V2 seguido por glufosinato a 0,8 lb ai/ac y dicamba a 2,0 Ibs ae/ac aplicado en V8. Al final de la temporada, se midió el rendimiento. Para cada uno de los ensayos, se encontró una diferencia estadística en el rendimiento de la eficacia endogámica al comparar el rendimiento endogámico cosechado de estos ensayos de maíz transgénico que contenía cualquiera de los dos eventos (Tabla 8). Estos datos indican el rendimiento superior del maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz.

Tabla 8. Meta-análisis de rendimiento de ensayos de campo de eficacia endogámica.

Se ejecutaron ensayos de campo agronómicos endogámicos durante la misma temporada con los ensayos de campo de eficacia Año 1 US, ensayos de campo de eficacia Año 1 SA, y ensayos de campo de eficacia Año 2 US (11 locaciones, 1 estado). Las parcelas se establecieron en un diseño de bloque completo aleatorizado llevado a cabo en múltiples locaciones, y los ensayos incluyeron controles de un endogámico comparable a las líneas endogámicas transgénicas. El meta-análisis en los ensayos de campo agronómicos endogámicos multi-temporada y multi-locación se llevó a cabo comparando el rendimiento del control de híbridos y los endogámicos transgénicos generados usando cualquiera de los dos eventos. No se encontró diferencia estadística en el rendimiento agronómico endogámico entre el control y el maíz transgénico que contenía el evento MON 87419 (Tabla 9). Por el contrario, hubo una disminución estadísticamente significativa en el rendimiento en el maíz transgénico que contenía el evento 2 en comparación con cualquiera del control o maíz transgénico que contenía el evento MON 87419. Estos datos indicaron además el rendimiento superior del maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz.

Tabla 9. Meta-análisis de rendimiento de ensayos de campo agronómicos endogámicos.

Ejemplo 2: Caracterización de la secuencia de ADN del evento MON 87419 de maíz

Este ejemplo describe la caracterización molecular extensiva que se llevó a cabo en el evento MON 87419 de maíz. El inserto de transgén del evento MON 87419 de maíz contiene, de la orientación 5' a 3': (i) el promotor (P-ANDge.Ubq1), líder, e intrón (L-I-ANDge.Ubq1) del gen de ubiquitina (Ubq) deAndropogon gerardii;unido operativamente al genpatdeStreptomycesviridochromogenes(CR-STRvi.pat) que codifica una fosfinotricina N-acetiltransferasa (PAT) que confiere tolerancia a herbicida glufosinato; unido operativamente a la señal de poliadenilación (también denominada terminador que dirige la poliadenilación del ARNm) del gen precursor RA5B deOryzasativa(T-Os.Ara5) y (ii) el promotor de la transcripción de longitud completa del virus del rayado clorótico del cacahuete con una región potenciadora duplicada (PClSV); unido operativamente al líder del gen de complejo de cosecha liviana b1 deTriticumaestivum(L-Ta.Lhcb1); unido operativamente al primer intrón del gen de actina 1 deOryzasativa(I-Os.Act1); unido operativamente al péptido de tránsito de cloroplastos de extremo N de Petunia x hybrida gen 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (TS-Ph.ShkG-CTP4); unido operativamente al gendmo Stenotrophomonasmaltophiliaoptimizado para expresión monocotiledónea (CR-STEma.DMO) que codifica una dicamba monooxigenasa (DMO) que confiere tolerancia a herbicida dicamba; unido operativamente a la señal de poliadenilación de proteína 17 de choque térmico deTriticumaestivum(T-Ta.Hsp17). El extremo 5' del inserto de transgén se flanqueó por el borde derecho deAgrobacterium tumifaciensy el extremo 3' del inserto de transgén se flanqueó por el borde derecho deAgrobacterium tumifaciens.

Se llevó a cabo el análisis de transferencia southern para confirmar que el maíz transgénico que contenía el evento MON 87419 de maíz contenía una única copia intacta del inserto de transgén entero sin ninguna estructura principal de vector. Las secuencias flanqueantes se aislaron de los extremos 5' y 3' del inserto, y las respectivas uniones se determinaron usando técnicas de PCR inverso y/o paseo genómico. La locación cromosómica del inserto del evento MON 87419 de maíz se determinó usando PCR inverso para amplificar ADN genómico fuera del sitio de interés. Las secuencias flanqueantes del evento MON 87419 de maíz se mapearon al montaje físico de genoma de maíz conocido y se confirmó que el evento MON 87419 de maíz no estaba dentro de ninguno de los genes conocidos. Esta información de secuencia se usó para diseñar ensayos TAQMAN® de criterio de valoración específicos del evento para identificar la presencia del evento MON 87419 de maíz en una muestra. La información de secuencia del sitio de inserción se usó también para el análisis de bioinformática de la locación cromosómica del evento. La integridad del sitio de inserción se determinó por PCR en el alelo de tipo salvaje usando cebadores específicos de las regiones flanqueantes del evento MON 87419 de maíz. El sitio de inserción de tipo salvaje se usó para mapear al genoma de referencia de maíz el sitio único de la integración de transgén para el evento MON 87419 de maíz. Para asegurar que no se introduzcan alteraciones o mutaciones a ninguna región del transgén durante la transformación, todo el inserto de transgén del evento MON 87419 de maíz se aisló de la planta y se secuenció.

La secuenciación de proteína de extremo N de las proteínas expresadas PAT y DMO se realizó usando extractos de proteínas inmunopurificadas del grano de maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz. Esta secuencia se usó luego para confirmar la secuencia de aminoácidos de extremo N auténtica. El análisis western se llevó a cabo en extractos de proteína de grano de maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz. Esto confirmó que se estaba produciendo una sola proteína de tamaño esperado para PAT y para DMO, respectivamente. Se realizaron ELISA para determinar niveles de proteína en varios tipos de tejido de maíz transgénico (hoja, semilla, raíces y polen) para la proteína PAT o DMO expresada para el evento MON 87419 de maíz. El análisis northern se llevó a cabo en ARN poli-A aislado del grano de maíz transgénico que contiene el evento MON 87419 de maíz. Esto confirmó el tamaño y número de transcripciones para los productos de ARNmpatydmo.Los niveles de expresión de ARN también se midieron por PCR en tiempo real usando muestras de maíz transgénico que contenía el evento MON 87419 de maíz.

Ejemplo 3: Ensayos TAQMAN® de criterio de valoración específico del evento

Este ejemplo describe un procedimiento de amplificación térmico TAQMAN® de criterio de valoración específico del evento desarrollado para identificar maíz transgénico que contenía el evento MON 87419 de maíz en una muestra. Los cebadores de ADN utilizados en el ensayo de criterios de valoración son los cebadores SQ26644 (SEQ ID NO:11) SQ26645 (SEQ ID NO:12) y la sonda marcada con 6-FAM™ PB11207 (SEQ ID NO:13). 6-FAM™ es un producto de tinción fluorescente de Applied Biosystems (Foster City, CA) unido a la sonda de ADN. Para las sondas MGB™ de TAQMAN®, la actividad exonucleasa 5' de Taq ADN polimerasa escinde la sonda del extremo 5', entre el fluoróforo y el inactivador. Cuando se hibridan con la cadena de ADN diana, el inactivador y el fluoróforo se separan lo suficiente para producir una señal fluorescente, liberando así fluorescencia. SQ26644 y SQ26645 al usarse con estos procedimientos de reacción y PB11207 producen un amplicón de ADN que diagnostica el evento MON 87419 de maíz. Los controles para este análisis deben incluir un control positivo que contenga el evento MON 87419 de maíz, un control negativo de maíz no transgénico, y un control negativo que no contenga ADN de plantilla. Adicionalmente, un control para la reacción PCR debería incluir óptimamente Cebadores de control interno y una Sonda de control interno, específicos para un solo gen de copia en el genoma de maíz. Estos ensayos se optimizan para usar con cualquiera de un Sistema PCR 9700 de Applied Biosystems GeneAmp® (ejecutado a máxima velocidad) o ciclador térmico MJ Research DNA Engine PTC-225, pero puede usarse otro equipo.

Un ejemplo de condiciones útiles con el procedimiento de ensayo TAQMAN® de criterio de valoración útil para la detección del evento MON 87419 de maíz es del siguiente modo. Paso 1: 18 megohm de agua ajustada para volumen final de 10 pl. Paso 2: 5,0 pl de Mezcla maestra universal 2X (dNTP, enzima, amortiguador) a una concentración final 1X. Paso 3: 0,5 pl de Cebador evento-1 (SQ26644) Cebador evento-2 (SQ26645). La mezcla (resuspendida en 18 megohm de agua a una concentración de 20 uM para cada cebador) a 1,0 pM de concentración final (por ejemplo en un tubo de microcentrífuga, debería agregarse lo siguiente para lograr 500 pl a una concentración final de 20 uM: 100 pl de Cebador SQ26644 a una concentración de 100 pM; 100 pl de Cebador SQ26645 a una concentración de 100 pM; 300 pl de 18 megohm de agua). Paso 4: 0,2 pl de Evento 6-FAM™ MGB Sonda PB11207 (10 uM) (resuspendido en 18 megohm de agua a una concentración de 10 pM a 0,2 pM de concentración final. Paso 5: 0,5 pl de mezcla de Cebador de control interno-1 y Cebador de control interno-2 (resuspendida en 18 megohm de agua a una concentración de 20 mM para cada cebador) a 1,0 pM de concentración final. Paso 6: 0,2 pl de Sonda VIC™ de control interno (10 uM) a 0,2 pM de concentración final (resuspendido en 18 megohm de agua a una concentración de 10 mM). Paso 7: 3,0 pl de ADN extraído (plantilla) para cada muestra con cada uno de los siguiente que comprende 1. Muestras de hojas a analizar; 2. Control negativo (ADN no transgénico); 3. Control negativo de agua (sin plantilla); 4. Maíz transgénico de control positivo que contiene el ADN de evento MON 87419 de maíz. Paso 8: Las condiciones de termociclador son las siguientes: Un ciclo a 50 °C durante 2 minutos; un ciclo a 95 °C durante 10 minutos; diez ciclos de 95 °C durante 15 segundos luego 64 °C durante 1 minuto con (-1 °C/ciclo); treinta ciclos de 95 °C durante 15 segundos luego 54 °C 1 minuto, 10 a 20 ciclos opcionales adicionales (95 °C durante 15 segundos luego 64 °C durante 1 minuto (-1 °C/ciclo) pueden proveer separación de población más diferente durante el análisis EndPoint TaqMan®); ciclo final de 10 °C.

Ejemplo 4: Ensayo de cigosidad

Puede usarse un ensayo de cigosidad para determinar si o no una planta que comprende el evento MON 87419 de maíz es heterocigoto u homocigoto para el evento o el alelo de tipo salvaje. El ensayo de reacción de amplificación puede diseñarse usando la información de secuencia provista en la presente. Por ejemplo, tal ensayo PCR incluiría el diseño de al menos tres cebadores: cebador-1, cebador-2, y cebador-3, donde el cebador-1 es específico para ADN genómico de maíz en el flanco 3' del evento MON 87419 de maíz; el cebador-2 es específico para el inserto de transgén del evento MON 87419 de maíz; y el cebador-3 es específico para el alelo de tipo salvaje. Al usarse como par de cebadores en una reacción de amplificación, el cebador-1 con el cebador-2 producirán un amplicón de PCR específico para el evento MON 87419 de maíz. Al usarse como par de cebadores en una reacción de amplificación, el cebador-1 con el cebador-3 producirán un amplicón de PCR específico para el alelo de tipo salvaje. En una reacción PCR realizada en el ADN genómico de maíz, los respectivos amplicones de PCR generados a partir de (cebador-1 cebador-2) y (cebador-1 cebador-3) diferirán en la secuencia y tamaño del amplicón. Cuando los tres cebadores se incluyen en una reacción PCR con ADN extraído de una planta homocigota para el evento MON 87419 de maíz, solo se generará el amplicón de cebador-1 cebador-2. Cuando los tres cebadores se incluyen en una reacción PCR con ADN extraído de una planta heterocigota para el evento MON 87419 de maíz, se generarán el amplicón de cebador-1 cebador-2 y el cebador-1 cebador-3. Cuando los tres cebadores se mezclan juntos en una reacción PCR con ADN extraído de una planta que es nula para el evento MON 87419 de maíz (que es de tipo salvaje), solo se generará el amplicón de cebador-1 cebador-3.

Otro procedimiento para determinar la cigosidad de una planta de maíz para el evento MON 87419 de maíz es una reacción de amplificación térmica TAQMAN® de criterio de valoración. Para este tipo de ensayo, además de cebadores como se describe anteriormente, el ensayo incluiría dos sondas etiquetadas fluorescentemente. La sonda-1 sería específica para el evento MON 87419 de maíz, y la sonda-2 sería específica para una planta de maíz que es nula para el evento MON 87419 de maíz (de tipo salvaje), y donde las dos sondas contienen diferentes etiquetas fluorescentes, por ejemplo la etiqueta 6-FAM™ o la etiqueta VIC™. Al usarse en una reacción de amplificación térmica TAQMAN® de criterio de valoración, el cebador-1 cebador-2 sonda-1 producirá una primera señal fluorescente específica para el evento MON 87419 de maíz. Al usarse en una reacción de amplificación térmica TAQMAN® de criterio de valoración, el cebador-1 cebador-3 sonda-2 producirá una segunda señal fluorescente específica para el maíz de tipo salvaje. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se incluyen en una reacción de amplificación térmica TAQMAN® de criterio de valoración con ADN extraído de una planta homocigota para el evento MON 87419 de maíz, solo se generará una primera señal fluorescente (específica para el cebador-1 cebador-2 sonda-1). Cuando los tres cebadores se incluyen en una reacción de amplificación térmica TAQMAN® de criterio de valoración con ADN extraído de una planta heterocigota para el evento MON 87419 de maíz, se generarán la primera señal fluorescente (específica para el cebador-1 cebador-2 sonda-1) y la segunda señal fluorescente (específica para el cebador-1 cebador-3 sonda-2). Cuando los tres cebadores se mezclan juntos en una reacción de amplificación térmica TAQMAN® de criterio de valoración con ADN extraído de una planta que es nula para el evento MON 87419 de maíz (de tipo salvaje), solo se generará la segunda señal fluorescente (específica para el cebador-1 cebador-3 sonda-2).

Otro procedimiento para determinar la cigosidad de una planta para el evento MON 87419 de maíz sería el análisis southern. Un experto en la técnica entendería cómo diseñar la o las sondas de hibridación southern específicas para el evento MON 87419 de maíz y una segunda sonda de hibridación southern específica para una planta de maíz que es nula para el evento MON 87419 de maíz (de tipo salvaje). Con análisis southern, una señal detectada solo a partir de la primera sonda de hibridación southern indicará una planta homocigota para el evento MON 87419 de maíz; una señal detectada de la primera sonda de hibridación southern y de la segunda sonda de hibridación southern indicará una planta heterocigota para el evento MON 87419 de maíz; y una señal detectada solo de la segunda sonda de hibridación southern indicará que el ADN se extrajo de una planta que es nula para el evento MON 87419 de maíz (de tipo salvaje).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10.

2. Una sonda de ADN de diagnóstico para el evento MON 87419, en la que dicha sonda de ADN comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

3. Un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en la que la primera molécula de ADN es un fragmento de SEQ ID NO:9 y la segunda molécula de ADN es un fragmento del ADN genómico de maíz de SEQ ID NO: 10 del evento MON 87419 de maíz, y en la que la primera y segunda moléculas de ADN comprenden cada una una secuencia de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos para funcionar como cebadores de ADN cuando se usan juntos en una reacción de amplificación con ADN que contiene el evento MON 87419 de maíz para producir un diagnóstico de amplicón para el evento MON 87419 de maíz en una muestra, en la que dicho amplicón comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

4. Un procedimiento para detectar la presencia del evento de maíz MON 87419 en una muestra de ADN, comprendiendo el procedimiento:

a) poner en contacto la muestra con la molécula de ADN de la reivindicación 2;

b) someter la muestra y la molécula de ADN a condiciones de hibridación estrictas; y

c) detectar la hibridación de la molécula de ADN con una molécula de ADN diana en la muestra, en la que la hibridación de la molécula de ADN con la molécula de ADN diana indica la presencia del evento de maíz MON 87419 en la muestra de ADN.

5. Un procedimiento para detectar la presencia del evento de maíz MON 87419 en una muestra de ADN, comprendiendo el procedimiento:

a) poner en contacto la muestra con el par de moléculas de ADN de la reivindicación 3;

b) realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, S<e>Q ID NO: 2, S<e>Q ID NO: 3, S<e>Q ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8; y

c) detectar la presencia del amplicón de ADN en la reacción, en el que la presencia del amplicón de ADN en la reacción indica la presencia del evento MON 87419 de maíz en la muestra de ADN.

6. Un kit de detección de ADN que comprende:

a) una molécula de ADN que comprende SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, o

b) un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN, en la que la primera molécula de ADN es un fragmento de SEQ ID NO: 9 y la segunda molécula de ADN es un fragmento del ADN genómico de maíz de SEQ ID NO: 10 del evento MON 87419 de maíz, y en el que la primera y segunda moléculas de ADN comprenden cada una una secuencia de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos para funcionar como cebadores de ADN cuando se usan juntos en una reacción de amplificación con ADN que contiene el evento MON 87419 de maíz para producir un diagnóstico de amplicón para el evento MON 87419 de maíz en una muestra, en el que dicho amplicón comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2

comprendiendo además dicho kit de detección de ADN reactivos para reacciones de diagnóstico.

7. Una planta, semilla, célula o parte de planta de maíz transgénico que comprende una molécula de ADN que tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 10.

8. La planta, semilla o célula de maíz transgénica de la reivindicación 7, en la que la planta, semilla o célula es tolerante al glufosinato o dicamba, o a los herbicidas de glufosinato y dicamba.

9. La planta, semilla, célula o parte de planta de maíz transgénico de la reivindicación 7, definida como que comprende el evento de maíz MON 87419, habiéndose depositado una muestra representativa de semilla que comprende dicho evento con el número de acceso de la ATCC pTA-120860.

10. La planta o semilla de maíz transgénica de la reivindicación 9, en la que la planta o semilla de maíz es un híbrido que tiene al menos una planta original que comprende el evento de maíz MON 87419.

11. Un procedimiento para proteger el rendimiento de plantas de maíz que comprende plantar maíz transgénico que comprende el evento de maíz MON 87419 en un área y aplicar una dosis efectiva de herbicidas dicamba, o glufosinato, o dicamba y glufosinato para controlar las malezas en el área sin dañar el maíz transgénico, en el que el evento de maíz MON 87419 comprende la SEQ ID NO: 10.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la dosis eficaz de herbicida glufosinato es un total de aproximadamente 0,05 kilogramos de equivalente de ácido por acre a aproximadamente 7,26 kilogramos de equivalente de ácido por acre de herbicida de glufosinato durante una temporada de crecimiento.