ES2968371T3 - Derivados de 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino) bencenosulfonamida como inhibidores de la 12-lipoxigenasa - Google Patents

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Diane K Luci
Ajit Jadhav
Theodore Holman
Jerry L Nadler
Michael Holinstat
David Taylor-Fishwick
Anton Simeonov
Adam Yasgar
Steven E Mckenzie
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Eastern Virginia Medical School
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Abstract

Las lipoxigenasas humanas (LOX) son una familia de enzimas que contienen hierro involucradas en catalizar la oxidación de ácidos grasos poliinsaturados para proporcionar los correspondientes metabolitos bioactivos del ácido hidroxieicosatetraenoico (HETE). Estas moléculas de señalización de eicosanoides están involucradas en una serie de respuestas fisiológicas como la agregación plaquetaria, la inflamación y la proliferación celular. El 12-(S)-LOX (12-LOX) de tipo plaquetario es de particular interés debido a su papel demostrado en enfermedades de la piel, diabetes, hemostasia plaquetaria, trombosis y cáncer. En el presente documento se divulga la identificación y optimización de la química medicinal de un armazón a base de 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)bencenosulfonamida. Los compuestos muestran potencia nM contra 12-LOX y una excelente selectividad sobre lipoxigenasas y ciclooxigenasas relacionadas. Además de poseer propiedades ADME favorables, los compuestos también inhiben la agregación inducida por PAR-4 y la movilización de calcio en plaquetas humanas, y reducen el 12-HETE en células beta de ratón/humanas. Los compuestos también se pueden usar en métodos para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno mediado por 12-lipoxigenasa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DES
Derivados de 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino) bence
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las lipoxigenasas son una clase de enzimas que c
estereoespecífica sustratos de ácidos grasos poliinsatur
(Solomon, et al. Chem. Biol. 1997, 4, 795-808; Brash, J.
se oxidan estos sustratos decis,cis-1,4-pentadieno corr
lipoxigenasas humanas: 5-LOX, 12-LOXy 15-LOX-1, oxi
lipoxigenasas intervienen en el primer paso compromet
estas enzimas (eicosanoides) son precursores de hormo
amplia gama defunciones celulares. (Serhan, etal. Che
lipoxigenasas y sus metabolitos bioactivos (por ejemplo,
se han visto implicados en diversas enfermedades infla
Concretamente, la 5-LOX se ha implicado en el cáncer y l
la única enzima lipoxigenasa para la que existe un inhibi
La 15-LOX-1 reticulocitaria desempeña un papel en la at
neuronal asociado a un accidente cerebrovascular isqué
La 12-LOX existe en forma de tres isozimas, de tipo plaq
se encuentra en la rata, el ratón, el cerdo y la vaca, per
1992, 1128, 117-131; Funketal. FEBS Lett. 1997, 402,
Enfermedad cutánea y hemostasia plaquetaria: Además,
la piel y en la hemostasia plaquetaria.
Trasplantes: los inhibidores de la 12-LOX también tiene
por ejemplo, los islotes pueden tratarse ex vivo para mej
Cáncer: Se ha descubierto que la 12-('S)-LOX (12-LO
tumorales, como el cáncer de próstata, el cáncer colorre
al. Histol. Histopathol. 2005, 20, 969-975; Nie, D et al.
Endocrinol. Metab. 1997, 82, 1790-1798; Kamitani et al.
Res. 1999, 59, 6178-6184). Además, los niveles de 12-H
las células cancerosas al facilitar la motilidad de las cél
1995, 96, 133-140; Timár et al. Int. J. Cancer, 1993, 55,
Nie et al. Blood 2000, 95, 2304-2311).
Diabetes: La diabetes de tipo 1 y de tipo 2 son trastorno
reducir la esperanza de vida. Existe una necesidad mé
células beta en estos trastornos metabólicos. la 12-LO
regulados al alza y activados por citoquinas inflamatoria
LOX. El producto 12-HETE resultante provoca una re
actividad metabólica y la muerte de las células p pancreá
(Chen et al. Diabetologia 2005, 48, 486-495). Tanto l
inactivación de 12-LOX ("KO") mostraron una resistenci
los controles, lo que demuestra que la 12-LOX es un reg
Enfermedad renal diabética: Además, los estudios dem
papel en el desarrollo de la enfermedad renal diabé
patogénicos, incluida la disminución de la expresión
Endocrinol. Metab. 2011, 300, E708-E716).
Enfermedad nerviosa diabética: También se ha demostr
primera enzima de la vía del sorbitol, desempeña un
diabetes en el nervio periférico y la médula espinal. (Stav
pues, la inhibición de la 12-LOX resulta atractiva en el tr
Diabetes y enfermedades cardiovasculares: Un inhibid
terapéutico para prevenir y/o tratar cualquiera de las dos f
de la 12-hLOX proporciona un potente enfoque intracel
grandes coágulos en respuesta a una lesión vascular o a
de la 12-hLOX tiene la capacidad de atenuar la formació
y/o las enfermedades cardiovasculares y disminuir signifiCIÓN
lfonamida como inhibidores de la 12-lipoxigenasa
nen hierro no hemo y que oxidan de forma regio y como el ácido araquidónico (AA) y el ácido linoleico (LA). . Chem. 1999, 274, 23679-23682.) La posición en la que onde a la lipoxigenasa requerida, con las tres principales do las posiciones C-5, C-12 y C-15 respectivamente. Las de una cascada de vías metabólicas y los productos de como los leucotrienos y las lipoxinas, que median en una ev. 2011, 111, 5922-5943.) En consecuencia, las enzimas cido hidroxieicosatetraenoico (HETE) y el leucotrieno A4) rias y cánceres.
nfermedades inflamatorias, como el asma, y sigue siendo aprobado por la FDA(Zilueton) en el mercado.
énesis, las enfermedades neurodegenerativas y el daño agudo.
rio, leucocitario y epidérmico, pero la 12-LOX leucocitaria en el ser humano. (Yamamoto Biochim. Biophys. Acta.
166).
2-LOX ha demostrado un papel en las enfermedades de
lidad en escenarios de trasplante/xenotrasplante, donde, la supervivencia antes del trasplante.
e tipo plaquetario se sobre expresa en diversos tejidos el cáncer de mama y el cáncer de pulmón. (Catalano et cer Res. 1998, 58, 4047-4051; Natarajan et al. J. Clin. Exp. Med. Biol. 1999, 469, 593-598; Soriano et al. Cancer se han relacionado con un aumento de la metástasis de tumorales y la angiogénesis. (Nappez et al. Cancer Lett.
3-1010; Honn et al. Exp. Cell. Res. 1994, 214, 120-130;
aves que pueden acarrear complicaciones importantes y no cubierta de identificar nuevas formas de proteger las expresa en los islotes pancreáticos humanos, que son o que provoca un aumento de la translocación de la 12-ión de la secreción de insulina, una disminución de la a través de la amplificación de la respuesta inflamatoria. tones 12-LOX diabéticos no obesos (NOD) como con gnificativa al desarrollo de diabetes en comparación con or en esta enfermedad.
tran que la activación de la vía 12-LOX desempeña un (nefropatía diabética) mediante múltiples mecanismos -cadherina glomerular. (Guo, Q. et al. Am. J. Physiol.
que el aumento de la actividad de la aldosa reductasa, la l clave en la activación de la 12/15-LOX asociada a la uk, R. et al Biochem Pharmacol. 2012, 83, 932-940). Así iento de la enfermedad nerviosa diabética.
lectivo de la 12-LOX proporcionaría un nuevo enfoque as de diabetes (tipo I y tipo II). El desarrollo de inhibidores para disminuir la capacidad de las plaquetas de formar tivación de la vía de la coagulación. Así pues, la inhibición coágulos mediada por plaquetas causada por la diabetes amente la aparición de infarto de miocardio, insuficienciacardíaca congestiva y accidente cerebrovascular. Adem
proteínas 12-LOX y 15-LOX, está regulado al alza en l
podría ser un tratamiento para la insuficiencia cardíaca.
Trombosis: la 12-LOX y su producto 12-HETE han sido
a través de su papel en la regulación de la función pla
calcio). (Brash, A. R. Circulation 1985, 72, 702-707).
responsable de la trombocitopenia inducida por hepari
actividad PLC<y>2 inducida por FcYRIIa que conduce a la
1 y PKC, y la posterior activación de la integrina allbp3,
tratamiento de la TIH. (Yeung, J. et al. Blood 2014, (D
demostrado un papel en las enfermedades de la piel y e
Enfermedad de Alzheimer: la 12-LOX y la 15-LOX se e
informado de que están implicadas en la neurobiologí
amiloide y el procesamiento de APP También se ha des
endógeno de la tau, lo que la convierte en una tera
relacionadas. (Giannopoulos, P.F., et al. Aging Cell 2013
Esteatohepatitis no alcohólica: Se ha demostrado que
protegía a los ratones contra la esteatosis hepática, la
hepática experimental de origen metabólico. (Martínez-tambiénTanaka, N. et al. Hepatology 2012, 56, 118-129)
Una dificultad para poder definir claramente el papel de l
molécula pequeña de la 12-LOX potentes y selectivos.
Un inhibidor de 12-LOX previamente descrito, un com
excelente selectividad, >50-100 veces selectividad sobr
de muchos de los inhibidores descritos anteriormente, lo
no competitivo y no reductor. La separación por HPLC q
para la actividad, siendo el (-)-enantiómero mucho má
respectivamente). (Kenyon, V. et al. J. Med. Chem. 2011
optimizar aún más, dado que sutiles modificaciones est
2011/146618 describe inhibidores de la 12-lipoxigenasa
o trastorno mediado por la 12-lipoxigenasa.
Existe la necesidad de un inhibidor de molécula pequeña
la actividad para tratar o prevenir enfermedades y trastor
debe ser soluble, tener propiedades ADME favorables y
Las plaquetas expresan tres motivos de activación ba
receptores transmembrana (complejo glicoproteína VI (
región Fc de inmunoglobulina gamma de baja afinidad
ITAM en la superficie de las plaquetas da lugar a una ví
activación plaquetaria. Estos receptores intervienen en
tienen funciones fisiológicas no redundantes (pato).
presente en la superficie de las plaquetas humanas,
fisiopatológico en la trombocitopenia inmunomediada
trombocitopenia inmunitaria, la trombocitopenia asociad
La inhibición selectiva de la vía de señalización FcyRII
inmunomediada y la trombosis ha sido un enfoque lar
Blood 2011, 117, 2241-2246).
La heparina se utiliza ampliamente en la clínica para trat
que toman heparina desarrollarán una respuesta inmunit
inducida por heparina (TIH), que puede dar lugar a un a
el sistema inmunitario. El enfoque terapéutico actual par
heparina y su sustitución por inhibidores directos de la
hemorragia grave y deben ser monitorizados en la clíni
heparina sigue siendo el anticoagulante estándar para l
Por lo tanto, también existe la necesidad de enfoque
patogénesis de la TIH.
estudios muestran que el genAlox15, que codifica las ficiencia cardíaca. Así pues, la inhibición de la 12-LOX ma, Y. et al. J.Exp.Med. 2009, 206, 1565-1574).
ados en la modulación de la hemostasia y la trombosis ia (reactividad, formación de coágulos, movilización de ás, el FcYRIIa es el receptor de la plaqueta humana H). Se ha descubierto que 12-LOX es esencial para la ación de la movilización del calcio, la activación de Rap demuestra el papel de los inhibidores de 12-LOX en el .1182/blood-2014-05-575878)). Además, la 12-LOX ha emostasia plaquetaria.
an ampliamente en el sistema nervioso central y se ha la enfermedad de Alzheimer porque modulan la beta rto que la 12-LOX y la 15-LOX modulan el metabolismo a atractiva para tratar el Alzheimer y enfermedades 1082-1090).
rrupción del gen que codifica para la 12-LOX,Alox15,tencia a la insulina y la inflamación en la enfermedad ente, M. et al. Hepatology 2010, 52, 1980-1991véase
LOX en estos sistemas ha sido la falta de inhibidores de
o basado en 8-hidroxiquinoleína(ML127), mostró una xigenasas y ciclooxigenasas relacionadas. A diferencia rimentos cinéticos revelaron queML127era un inhibidor e la molécula de la sonda reveló una preferencia quiral nte que el (+)-enantiómero (<0,5 pM frente a >25 pM, 5485-5497.) Sin embargo, la serie química era difícil de rales conducían a una disminución de la actividad. WO na que son útiles para tratar o prevenir una enfermedad
OX potente y selectivo que pueda optimizarse sin reducir ediados por 12-LOX. El inhibidor de molécula pequeña as propiedades PKin vivo.
en tirosinas inmunorreceptoras (ITAM) que contienen /FcRy, receptor tipo lectina C 2 (CLEC-2) y receptor de FcyRIIa)). La ligación de los receptores que contienen eñalización descendente compartida que culmina en la rsos grados de hemostasia y trombosis; sin embargo, a, un inmunorreceptor de amplia expresión que está no en las de ratón, es más conocido por su papel trombosis; una familia de trastornos que incluye la sepsis y la trombocitopenia inducida por heparina (TIH). las plaquetas para la prevención de la trombocitopenia te buscado para la prevención de la TIH (Reilly et al.,
rombosis. Sin embargo, más del 3-5 % de los pacientes la heparina y correrán un alto riesgo de trombocitopenia cimiento trombótico potencialmente mortal mediado por atamiento de la TIH es la supresión del tratamiento con ina (IDT) que tienen un riesgo inherentemente alto de cluso con esta complicación potencialmente mortal, la ención y el tratamiento de la trombosis.
péuticos novedosos que se dirijan directamente a laLa presente invención proporciona compuestos y procedi
de 12-LOX.
La invención proporciona compuestos que son inhibidor
invención proporciona composiciones que comprenden es
terapéuticos en el tratamiento o prevención de enferm
enfermedades y trastornos mediados por la 12-LOX incl
de las enfermedades y trastornos, así como aquellos en l
mediador directo, resulta de valor terapéutico en el tratam
enfermedades o trastornos incluyen, pero no se limitan a,
enfermedad nerviosa diabética, enfermedad cardiovascu
accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer,
enfermedades de la piel, trombocitopenia inducida por
cáncer de mama y cáncer de pulmón.
La invención actualmente reivindicada proporciona un co os que comprenden compuestos útiles como inhibidores
otentes y selectivos de 12-LOX. Además, la presente ompuestos y el uso de estos compuestos como agentes es y trastornos mediados por la 12-lipoxigenasa. Las aquellos en los que la 12-LOX es un mediador directo ue la inhibición de la 12-LOX, aunque quizás no sea un o prevención de las enfermedades y trastornos. Estas etes tipo 1 , diabetes tipo 2 , enfermedad renal diabética, nsuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, eatohepatitis no alcohólica, hemostasia plaquetaria, ina, trombosis, cáncer de próstata, cáncer colorrectal,
sto de Fórmula (I):
donde R1 es metoxi y R2 es H; y
R3 se selecciona del grupo que consiste e
benzotiazol, 2-tiofeno, 4-metil-2-tiazol, 5-metil-2-t
2- naftaleno, 1,4-bi-fenilo, 3-piperazin-fenilo, 4
quinolina, 8-isoquinolina, 2-piridina, 3-piridi
benzotiazol, 4-fenil-2-tiazol, 3- morfolina-fenilo, 4
3- metoxifenilo, 5-metil-3-isoxazol, 2-pirimidina y
o una sal farmacéuticamente aceptable del mis
del mismo o diastereómeros del mismo.
En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (I) se
N-(benzo[d]tiazol-2-il)-4-[(2-hidroxi-3-metoxibenc
N-(benzo[d]oxazol-2-il)-4-((2-hidroxi-3-metoxibe
N-(1H-benzo/d]imidazol-2-il)-4-((2-hidroxi-3-met
4- (2-hidroxi-3-metoxibencilamino)-N-(tiofen-2-il
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(5-feniltiaz
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(3-metoxif
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilamino)-N-(isoquinolin
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilamino)-N-/eni/benceno
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(naftalen-4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(naftalenenzotiazol, 2-benzoxazol, 2-bencimidazol, 4-metil-2-l, 5-fenil-2-tiazol, 4,5-dimetil-2-tiazol, fenilo, 1-naftaleno, razin-fenilo, 4-piperidin-fenilo, 4-piperazin-3-piridina, 3-3-tercbutil-fenilo, 6-metoxi-2-benzotiazol, 6-fluoro-2-c-piperidin-3-fenilo, 3-piperidin-fenilo, 3- isopropil-fenilo, bi-fenilo;
enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros
cciona del grupo que consiste en
ino]bencenosulfonamida;
mino)bencenosulfonamida;
ncil)amino)bencenosulfonamida;
cenosulfonamida;
il)bencenosulfonamida;
encenosulfonamida;
encenosulfonamida;
nam/cfa;
encenosulfonamida;
encenosulfonamida;
W-([1,r-b¡fen¡1]-4¡l)-4-((2-h¡drox¡-3-metox¡benc¡l)
W-([1,1'-b¡fen¡1]-3¡l)-4-(2-h¡drox¡-3-metox¡benc¡l)
W-(3-(terc-but¡l)fen¡l1)-4-((2-h¡drox¡-3-metox¡ben
4-((2-h¡drox¡-3-metox¡benc¡l)am¡no)-A/-(6-metox¡
4-((2-h¡drox¡-3-metox¡benc¡l)am¡no)-A/-(4-fen¡lt¡a
ferc-6uf/14-(3-(4-((2-h¡drox¡-3-metox¡benc¡l) am¡
4-((2-h¡drox¡-3-metox¡benc¡l)am¡no)-A/-(3-¡soprop
W-(6-fluorobenzo[d]t¡azol-2¡l)-4-(2-h¡drox¡-3-meto
4-((2-h¡drox¡-3-metox¡benc¡l)am¡no)-N-(3-(p¡pera
4-(2-h¡drox¡-3-metox¡benc¡lam¡no)-N-(4-(p¡peraz¡
4-((2-h¡drox¡-3-metox¡benc¡l)am¡no)-N-(4-(p¡per¡d
o una sal farmacéut¡camente aceptable del m¡smo, enant
o d¡astereómeros del m¡smo.
La ¡nvenc¡ón actualmente re¡v¡nd¡cada tamb¡én propor
compuesto, sal, enant¡ómeros, una mezcla de enant
re¡v¡nd¡cada y un portador farmacéut¡camente aceptable.
La ¡nvenc¡ón actualmente re¡v¡nd¡cada proporc¡ona adem
una mezcla de enant¡ómeros del m¡smo, o d¡astereómer
su uso en un proced¡m¡ento para tratar o preven¡r u
comprend¡endo el proced¡m¡ento adm¡n¡strar a un mamíf
ef¡caz de un compuesto, sal del m¡smo, enant¡ómeros
d¡astereómeros del mismo de un compuesto de la prese
por 12-l¡pox¡genasa se selecc¡ona del grupo que co
card¡ovascular, esteatohepat¡t¡s no alcohól¡ca, hemosta
¡nduc¡da por hepar¡na, agregac¡ón plaquetar¡a ¡nduc¡da
de seps¡s; tromboc¡topen¡a asoc¡ada al receptor de la reg
La ¡nformac¡ón técn¡ca que se expone a cont¡nuac¡ón
¡nvenc¡ón re¡v¡nd¡cada en la actual¡dad, que se def¡ne me
ad¡c¡onal se proporc¡ona para s¡tuar la ¡nvenc¡ón re¡v¡nd¡ca
desarrollos técn¡cos relac¡onados.
Las referenc¡as a proced¡m¡entos de tratam¡ento en el p
compuestos y compos¡c¡ones farmacéut¡cas de la ¡nv
proced¡m¡entos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figuras 1A-1D.Muestra el esquema de reacc¡ó
Figura 2.Mov¡l¡zac¡ón de calc¡o ¡nduc¡da por
humanas.
Figura 3.Inh¡b¡c¡ón de 12-HETE en células be
¡nsul¡na est¡mulada por glucosa en ¡slotes huma
Figura 4.Datos c¡nét¡cos en estado estac¡onar¡o
35 (ML355).KM/Vmax(¡ntersecc¡ón x, las un¡d
(pM) es la representac¡ón secundar¡a de los dat
Figura 5.Datos c¡nét¡cos en estado estac¡onar¡o
35 (ML355).i/Vmáx(¡ntersecc¡ón y, las un¡dade
la representa¡ón secundar¡a de los datos de ¡nh¡
Figura 6.Datos c¡nét¡cos en estado estac¡onar¡o
36.KM/Vmax(¡ntersecc¡ón x, las un¡dadesdeK
representac¡ón secundar¡a de los datos de ¡nh¡b¡ no)bencenosulfonam¡da;
no)bencenosulfonam¡da;
am¡no)bencenosulfonam¡da,
zo[d]t¡azol-2-¡l)bencenosulfonam¡da,
2-¡l)bencenosulfonam¡da,
fen¡lsulfonam¡do) fen¡l) p¡per¡d¡n-l-carbox¡lato; n¡l)bencenosulfonam¡da;
enc¡l)am¡no) bencenosulfonam¡da;
-l-¡l)fen¡l)bencenosulfonam¡da;
-¡l)fen¡l)bencenosulfonam¡da; y
4-¡l)fen¡l)bencenosulfonam¡da,
eros del m¡smo, una mezcla de enant¡ómeros del mismo
na compos¡c¡ones farmacéut¡cas que comprenden un eros o d¡astereómeros de la ¡nvenc¡ón actualmente
un compuesto, sal del m¡smo, enant¡ómeros del m¡smo, del mismo de la ¡nvenc¡ón actualmente re¡v¡nd¡cada para enfermedad o trastorno med¡ado por 12-l¡pox¡genasa, del mismo una cant¡dad terapéut¡ca o prof¡láct¡camente el m¡smo, una mezcla de enant¡ómeros del m¡smo, o ¡nvenc¡ón, en el que la enfermedad o trastorno med¡ado ste en d¡abetes t¡po 1 , d¡abetes t¡po 2, enfermedad plaquetar¡a, enfermedades de la p¡el, tromboc¡topen¡a PAR4-AP, trombos¡s, síndrome ant¡fosfolíp¡do; síndrome Fc de la ¡nmunoglobul¡na gamma (FcyRIIa); y cáncer. de, en algunos aspectos, ¡r más allá del alcance de la nte las re¡v¡nd¡cac¡ones adjuntas. La ¡nformac¡ón técn¡ca en un contexto técn¡co más ampl¡o y para ¡lustrar pos¡bles
ente documento deben ¡nterpretarse como referenc¡as a c¡ón actualmente re¡v¡nd¡cada para su uso en d¡chos
ara la síntes¡s de los análogos de la presente ¡nvenc¡ón. R4-AP (A) y agregac¡ón plaquetar¡a (B) en plaquetas
de ratón (A) y en ¡slotes humanos (B, C). Secrec¡ón de (D, E).
ra la determ¡nac¡ón de K¡ para 12-LOX con el compuesto sdeKM/Vmaxson pM/pmol/m¡n/mg) frente a [Inh¡b¡dor] de ¡nh¡b¡c¡ón, que arrojó un K¡ de 0,35 /- 0,08 pM.
ra la determ¡nac¡ón del K¡'para 12-LOX con el compuesto ei/Vmáxson 1/pmol/m¡n/mg) frente a [Inh¡b¡dor] (pM) es ¡ón, que d¡o un K¡ de 0,72 /- 0,1 pM.
ra la determ¡nac¡ón de K¡ para 12-LOX con el compuestomaxson pM/pmol/m¡n/mg) frente a [Inh¡b¡dor] (pM) es la n, que arrojó un K¡ de 0,53 /- 0,2 pM.
Figura 7.Datos cinéticos en estado estacionario pa
36.i/Vmáx(intersección y, las unidades dei/Vm
representaión secundaria de los datos de inhibición
Figura 8.Movilización de calcio inducida por P
humanas. Para A: Se estimularon plaquetas human
en ausencia o presencia de concentraciones cr
disminuyó al aumentar la concentración del compu
citómetro de flujo C6 Accuri. Los experimentos se r
de plaquetas humanas (3 x108 plaquetas/mL) s
Aggregometer (modelo 700D) tras la adición de PA
Figura 9.Inhibición de 12-HETE por el compuesto
fueron tratadas con ácido araquidónico e ionóforo
36.En el gráfico se muestran los niveles de 12-HE
células estimuladas únicamente con AA/IONO. Lo
representativo con cada punto de datos grafica
representativos de cuatro determinaciones experi
dosis menor. Los datos graficados son la media ±
enmascaradas por el símbolo. Los datos se analiz
curva dosis-respuesta, utilizando pendiente de coli
con el programa Prism 5. Además del compuest
condición. El DMSO es también el disolvente del io
Figura 10.Estabilidad del compuesto35 (ML355) m
en solución acuosa (contiene 20 % de acetonitrilo)
pH 2 (pH 7,4) (B) tampón pH 10 (C) tampón PBS
(tampón 1M HEPES, pH 7,3) (E) en presencia de 5
Figuras 11A-11Bmuestran que 12-LOX modula
plaquetas humanas lavadas se pretrataron con D
minutos y se midió la agregación plaquetaria tras la
(Fig. 1 lB) entrecruzamiento de IV.3, un anticuerpo
+ GAM). El panel izquierdo muestra un trazado de
anticuerpos anti-CD9 pretratadas con ML355 o DM
final de plaquetas estimuladas con anti-CD9 que
, ,p < 01.
Figuras 12A-12Cmuestran que las plaquetas m
normal inducida por FcYRIIa. Se realizó una respue
CD9 con plaquetas lavadas de ratones hFcR/ALOX
fibrinógeno (75 jg/mL) yCaCh (1 mM) a las plaq
estimuladas con 0,25, 0,5 y 1 jg/m L de anti-CD9.
12-LOX, FcyRIIa y GAPd H con lisado plaquetario
(Fig. 12B) tiempo de retraso y(Fig. 12C) agregaci
3-6 por grupo). *P<.05
Figuras 13A-13Bmuestran que la activación de Ra
por 12-LOX. Las plaquetas humanas lavadas y pr
reticulación GAM y(Fig. 13A) se evaluó la activació
Se utilizó PAC1-FITC para medir la activación de
compuesto de los cambios de pliegue de PAC1
estimulada. La activación de Rap1 se eliminó utili
Rap1 activa se midió utilizando LI-COR y luego se
para el cambio de pliegues en la actividad Rap1. **
Figuras 14A-14Bmuestran que la secreción de gr
regulada por 12-LOX. Las plaquetas humanas lav
mediante la reticulación de FcyRIIa (IV.3 GAM) y (
un anticuerpo conjugado con P-Selectin-PE en un
secreción de ATP como marcador sustitutivo de
Compuesto de plaquetas teñidas con P-Selectina t
plaquetas tratadas con DMSO o ML355 en las que s
(n=4).
Figuras 15A-15Bmuestran el papel de 12-LOX en
plaquetas humanas lavadas se pretrataron con M determinación de Ki' para 12-LOX con el compuesto n 1/|jmol/min/mg) frente a [Inhibidor] (j M) es la dio un Ki de 0,63 /- 0,1 jM .
P (A) y agregación plaquetaria (B) en plaquetas vadas (1 x106 plaquetas/mL) con 200 jM PAR4-AP es del compuesto36.La movilización de calcio36. El calcio se midió en tiempo real utilizando un on por triplicado. Para B: La agregación plaquetaria ió en tiempo real utilizando un Chronolog Lumi-.
células beta de ratón. Células beta de ratón (BTC3) cio (AA/IONO) solos o en presencia del compuesto presados como porcentaje de los detectados en las os graficados en la figura 3A son un experimento alizado por triplicado. Estos datos trazados son es separadas realizadas cubriendo un intervalo de n=3. Las barras de error de algunos puntos están ediante regresión no lineal para la inhibición de la iable o restringida, R2>0,81. Este análisis se facilitó incluyó DMSO (disolvente de reserva) con cada de calcio (estimulante).
como composición porcentual de la molécula sonda urante el periodo de tiempo indicado en (A) tampón ,4) (D) tampón de ensayo UV-Vis de lipoxigenasa e glutatión (forma reducida).
gregación plaquetaria mediada por FcyRIIa. Las control del vehículo) o MI,355 (20 jM ) durante 15 ulación de FcyRIIa mediante(Fig. 1 lA) anti-CD9 o lonal de ratón FcyRIIa, y cabra antiratón Fab2 (IV.3 ación representativo de plaquetas estimuladas con l panel derecho muestra la agregación plaquetaria n sido tratadas con ML355 (n= 7) o d Ms O (n=4).
requieren 12-LOX para la agregación plaquetaria la dosis de agregación plaquetaria inducida por antihFcR/ALOX12'/' . Antes de la agregación, se añadió(Fig. 12A) Trazados representativos de plaquetas ecuadro: Se realizaron transferencias Western para nes hFcR/ALOX12+/+ o hFcR/ALOX12'/' . Se midió el al en ratones hFcR/ALOX12+/+ o hFcR/ALOX12'/' (n =
integrina aIIbp3 mediada por FcyRIIa es potenciada as con ML355 o DMSO se estimularon con IV.3 y integrina aIIbp3 y(Fig.13B) la activación de Rap1.
3 mediante citometría de flujo. Gráfico de barras en relación con la fluorescencia PAC1-FITC no Ral-GDS y se cubrió con un anticuerpo Rap1. La alizó con respecto a la Rap1 total y no estimulada
densos mediada por la activación de FcyRIIa está y pretratadas con DMSO o ML355 se estimularonA) se midió la secreción de gránulos alfa utilizando etro de flujo, mientras que(Fig. 14B) se midió la creción de gránulos densos en un agregómetro. s con ML355 o DMSO (n=4). Gráfico de barras de ió la secreción deATPtras la reticulación de FcyRIIa
gulación del complejo de señalización FcyRIIa. Las (20 jM ) o con un vehículo de control antes de laestimulación con IV.3 y GAM.(Fig. 15A) Inmuno
reticulación y medición de la fosforilación mediant
tras la reticulación de FcyRIIa en presencia de M
Syk activa (pY323) y total.
Figuras 16A-16Cmuestran que la 12-LOX mod
FcyRIIa en plaquetas humanas. Las plaquetas hu
vehículo de control antes de la estimulación con
de PLCy2 transferencia Western en el que las
detuvieron a los 15, 30, 60 y 300 segundos. Las
la fosforilación de Y759 mediante transferencia W
y los cambios en los pliegues se cuantificaron en
reticulación con IV.3 y GAM, se midió la moviliz
representativas se cuantificaron en cambio de
estimulada durante cuatro minutos. Los gráficos
la movilización del calcio.(Fig. 16C) Se analizó la
con o sin inhibición de l2-LOX. Se utilizó un su
Pleckstrin. La cuantificación de la fosforilación
representan la media ± E.S.M. *P<.05; **P<.01.
La Figura 17es un modelo esquemático del pa
regula la activación temprana de PLCy2 mediad
liberación completa de calcio en las plaquetas.
cPLA2 genere ácidos grasos libres, como el ácid
también depende de la actividad de 12-LOX para
La Figura 18muestra datos de 1H RMN para el c
ML-355(Fig. 18B).
La figura 19muestra la caracterización LC/MS d
La Figura 20muestra datos de 1H RMN para el
36(Fig. 20B).
La figura 21muestra la caracterización LC/MS d
La Figura 22muestra datos de 1H RMN para el
37(Fig. 22B).
La figura 23muestra la caracterización LC/MS d
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se entiende que la presente invención no se limita a la
documento, ya que éstas pueden variar. También debe
documento se utiliza únicamente con el fin de describir re
la presente invención.
En la descripción, se emplean los siguientes términos:
reticulocitaria humana; 15-LOX-2 es 15-lipoxigenasa-2
humana; COX es ciclooxigenasa; NDGA es ácido nordihi
ácido 12-('S)-hidroperoxieicosatetraenoico; 12-HETE es á
Vmax es velocidad máxima (mmol/min); KM es la constant
de enzima activa; IC50 es la constante del inhibidor al 50
es cribado cuantitativo de alto rendimiento; PAR-4 es rec
metanol; EtOAc es acetato de etilo; AcOH es ácido acétic
9,9-dimetilxanteno; y SD es desviación estándar.
Para uso terapéutico, las "sales" de los compuestos de la
decir, las sales se derivarán de un ácido o base fisiológica
que no son fisiológicamente aceptables también pueden
fisiológicamente aceptable. Por lo tanto, todas las sales, de
están dentro del alcance de la presente invención.
Por "diastereómero" se entiende un estereoisómero con d
imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tiene
fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y
separarse mediante procedimientos analíticos de alta resol cipitación de FcyRIIa a los 15, 30 y 60 segundos tras la ansferencia Western.(Fig. 15B) Las plaquetas se lisaron 5 o DMSO y se sometieron a inmunotransferencia para
los componentes de señalización temprana de la vía nas lavadas se pretrataron con ML355 (2o j M) o con un y GAM.(Fig. 16A) Un curso temporal de la activación quetas estimuladas con reticulación de anticuerpos se estras de activación activa de PLCy2 se analizaron para tern. Todas las muestras se normalizaron a PLCy2 total ación con la condición no estimulada.(Fig. 16B) Tras la ión de calcio mediante citometría de flujo. Las curvas gues de calcio libre en relación con la condición no barras representan la relación del cambio del pliegue de tividad PKC en plaquetas humanas lavadas estimuladas ato de PKC como sustituto de la activación de PKC y Pleckstrin se muestra en el panel derecho. Los datos
de 12-LOX en la regulación de la vía FcyRIIa. 12-LOX or la estimulación de FcyRIIa, que es esencial para la lujo de calcio es necesario para que la actividad de la raquidónico (AA). Posteriormente, la activación de Rap1 tivar la integrina aIIbp3 para la agregación plaquetaria.
puesto ML355(Fig. 18A) y RMN 13C para el compuesto
ompuesto ML355 a 220 nm (arriba) y 254 nm (abajo).
mpuesto 36(Fig. 20A) y RMN 13C para el compuesto
ompuesto 36 a 220 nm (arriba) y 254 nm (abajo).
mpuesto 37(Fig. 22A) y RMN 13C para el compuesto
ompuesto 37 a 220 nm (arriba) y 254 nm (abajo).
etodologías particulares, etc. descritas en el presente enderse que la terminología empleada en el presente aciones particulares, y no pretende limitar el alcance de
OX es lipoxigenasa; 15-LOX-1 es 15-lipoxigenasa-1 elial humana; 12-LOX es 12-lipoxigenasa plaquetaria guayarético; AA es ácido araquidónico; 12-HPETE es 12-('S)-hidroxieicosatetraenoico; LA es ácido linoleico; de Henri-Michaelis-Menten; [E] es la concentración total e inhibición; HTS es cribado de alto rendimiento; qHTS tor activado por proteasa-4; EtOH es etanol; MeOH es MW es microondas; Xantphos es 4,5-bis(difenilfosfino)-
esente invención serán fisiológicamente aceptables, es te aceptable. Sin embargo, las sales de ácidos o bases zarse en la preparación o purificación de un compuesto das o no de un ácido o base fisiológicamente aceptable,
o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son propiedades físicas diferentes, por ejemplo, puntos de actividades. Las mezclas de diastereómeros pueden ión, como la electroforesis y la cromatografía.
Los "enantiómeros" se refieren a dos estereoisómer
superponibles entre sí.
El término "portador farmacéuticamente aceptable", tal
disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, ag
retardadores de la absorción para sustancias farmacéuti
Excepto en la medida en que cualquier medio o agente co
su uso en las composiciones terapéuticas. También
composiciones.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refi
documento que es eficaz para prevenir, mejorar, tratar
expresión "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere
documento que es eficaz para inhibir la aparición o progr
"Alquilo" es un hidrocarburo C1-C6 que contiene átomos
ejemplos incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, pro
"Alquenilo" es un hidrocarburo C2-C6 que contiene áto
con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble
se limitan a, etileno o vinilo (--CH=CH2), alilo ( CH2CH2CH2CH2CH=CH2), y similares.
"Alquinilo" es un hidrocarburo C2-C6 que contiene átomo
al menos un sitio de insaturación, es decir, un enlace tri
limitan a, acetilénico (-C= --CH) y propargílico (--CH2C=
"Cicloalquilo" es un sistema de anillos saturados, insatur
de carbono, preferiblemente de 3 a 7 átomos de carbo
ejemplos incluyen, pero no se limitan a, ciclopentenilo
sustituir o más sustituidos.
Por "heterocicloalquilo" se entiende un sistema de anillo
un N, O, S o P El heterociclo incluye por tanto grupos
documento, incluye, pero no se limitan a, los heteroci
HETEROCYCLIC CHEMISTRY (W A. Benjamin, Nueva
CHEMISTRY OF HETEROCYCLIC COMPOUNDS, A S
1950 hasta la actualidad), en particular los volúmenes
HETEROCYCLIC CHEMISTRY (Pergamon Press, 1996);
incluyen, pero no se limitan a, piridilo, dihidropiridil
tetrahidrobiofenilo oxidado con azufre, pirimidinilo, f
benzofuranoilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolin
pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidroturanilo,
tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroqu
tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, pira
pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, in
quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazo
carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fena
isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, p
quimiclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, b
Por "arilo" se entiende un radical hidrocarburo aromáti
eliminación de un átomo de hidrógeno de un único átom
grupos arilo típicos incluyen, pero no se limitan a, radi
antraceno, bifenilo y similares.
Por "heteroarilo" se entiende un radical aromático monov
seleccionados entre N, O, S o P, derivado mediante la
un sistema de anillo aromático parental. Los grupos heter
en anillo (de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroát
de 7 a 10 miembros en anillo (de 4 a 9 átomos de carbo
Los ciclos heteroarilo tienen de 7 a 10 átomos de anil
seleccionados entre N, O y S) dispuestos como un siste
(de 8 a 9 átomos de carbono y de 1 a 2 heteroátomos se
[5,6] o [6 ,6]. El grupo heteroarilo puede estar unido al
nitrógeno, azufre, fósforo u otro mediante un enlace co de un compuesto que son imágenes especulares no
omo se utiliza aquí, se refiere a todos y cada uno de los es antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y ente activas, tal y como son bien conocidos en la técnica. encional sea incompatible con el compuesto, se contempla ueden incorporarse compuestos suplementarios a las
a una cantidad de un compuesto descrito en el presente retrasar la aparición de una enfermedad o afección. La una cantidad de un compuesto descrito en el presente ión de un trastorno.
carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos. Los , isopropilo, terc-butilo y similares.
s de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos ace carbono-carbono, sp2. Los ejemplos incluyen, pero no H2CH=CH2), ciclopentenilo (-C5H7), y 5-hexenilo (-
e carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con sp carbono-carbono. Los ejemplos incluyen, pero no se ), y similares.
s o aromáticos que contiene, por ejemplo, de 3 a 8 átomos y más preferiblemente de 3 a 6 átomos de carbono. Los iclohexenilo. Los grupos alquilo cíclicos pueden estar sin
aturados, insaturados o aromáticos que incluye al menos eroarilo. El heterociclo, tal como se utiliza en el presente s descritos en PAQUETTE, PRINCIPLES OF MODERN rk, 1968), en particular los capítulos 1, 3, 4, 6 , 7 y 9; THE ES OF MONOGRAPHS (John Wiley & Sons, Nueva York, 14,16, 19 y 28; KATRITZKY ET AL., COMPREHENSIVE 82 J. AM. QUÍMCHEM. SOC. 5566(1960). Los heterociclos tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, nilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, tetrahidroruranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, linilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-l,2,5-, isobenzofuranoilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-lizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazolilo, purinilo, 4H-ilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, betalinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, rurazanilo, fenoxazinilo, zolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, isoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo e isatinoilo.
monovalente de 6-20 átomos de carbono derivado de la e carbono de un sistema de anillo aromático parental. Los s derivados del benceno, benceno sustituido, naftaleno,
nte de uno o más átomos de carbono y uno o más átomos inación de un átomo de hidrógeno de un único átomo de rilo pueden ser un monociclo que tenga de 3 a 7 miembros os seleccionados entre N, O, P y S) o un biciclo que tenga y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P y S). (de 6 a 9 átomos de carbono y de 1 a 2 heteroátomos biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6 ,6]; o de 9 a 10 átomos de anillo cionados entre N y S) dispuestos como un sistema biciclo amiaje farmacológico a través de un átomo de carbono, ente estable. Los grupos heteroarilo incluyen, pero no selimitan a, piridilo, isómeros de dihidropiridilo, piridazinil
tiazolilo, isoxazolilo, pirazolilo, isotiazolilo, furanilo, tiofura
A menos que se definan de otro modo, todos los término
tienen el mismo significado que comúnmente entiende u
que pertenece esta invención. Se describen los procedi
ensayo de la presente invención pueden utilizarse c
equivalentes a los aquí descritos.
En un aspecto, la invención actualmente reivindicada incl irimidinilo, pirazinilo, s-triazinilo, oxazolilo, imidazolilo, , tienilo y pirrolilo.
nicos y científicos utilizados en el presente documento ersona con conocimientos ordinarios en la técnica a la s y composiciones preferidos, aunque en la práctica o quiera procedimientos y composiciones similares o
n compuesto de Fórmula (I):
donde R1 es metoxi y R2 es H; y
R3 se selecciona del grupo que consiste e
benzotiazol, 2-tiofeno, 4-metil-2-tiazol, 5-metil-2-t
2- naftaleno, 1,4-bi-fenilo, 3-piperazin-fenilo, 4
quinolina, 8-isoquinolina, 2-piridina, 3-piridi
benzotiazol, 4-fenil-2-tiazol, 3- morfolina-fenilo, 4
3- metoxifenilo, 5-metil-3-isoxazol, 2-pirimidina y
o una sal farmacéuticamente aceptable del mis
del mismo o diastereómeros del mismo.
En una realización de la Fórmula (I), R3 se selecciona
bencimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 3-quinolina, 8-isoqui
En una realización de la Fórmula (I), R3 se selecciona
bencimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 2-tiofeno, fenilo, 1-n
fenilo, 6-metoxi-2-benzotiazol, 6-fluro-2-benzotiazol, 4-fen
En una realización de la Fórmula (I), R3 se selecciona
bencimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 2-tiofeno, fenilo, 1-n
fenilo, 4N-boc-piperidin-3-fenilo y 3-isopropil-fenilo.
En una realización de la Fórmula (I), R3 se selecciona
benzimidazol y 3-isopropil-fenilo.
En una realización de la Fórmula (I), R3 se selecciona
benzimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 2-tiofeno, fenilo, 6-m
En una realización de la Fórmula (I), R3 se selecciona
bencimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 2-tiofeno y fenilo.
En una realización de la Fórmula (I), R3 se selecciona
bencimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 2-tiofeno, fenilo, 1-n
3-piridina.
En una realización, el compuesto de fórmula (I) es
benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-bencimidazol, 4-metil-2-l, 5-fenil-2-tiazol, 4,5-dimetil-2-tiazol, fenilo, 1-naftaleno, razin-fenilo, 4-piperidin-fenilo, 4-piperazin-3-piridina, 3-3-tercbutil-fenilo, 6-metoxi-2-benzotiazol, 6-fluoro-2-c-piperidin-3-fenilo, 3-piperidin-fenilo, 3- isopropil-fenilo, bi-fenilo;
enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros
rupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-, fenilo y 3-isopropil-fenilo.
rupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-no, 2-naftaleno, 3-quinolina, 8-isoquinolina, 3-terc-butiliazol, 4N-boc-piperidin-3-fenilo y 3-isopropil-fenilo. rupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-no, 2-naftaleno, 3-quinolina, 8-isoquinolina, 3-terc-butil-
rupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-
rupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2--2-benzotiazol, 6-fluro-2-benzotiazol y 4-fenil-2-tiazol. rupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-
rupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-no, 2-naftaleno, 3-quinolina, 8-isoquinolina, 2-piridina y
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, enant
o diastereómeros del mismo. Se trata deML355 (compu
En una realización, el compuesto de fórmula (I) es
eros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismoo 35).
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, enant
o diastereómeros del mismo.
En una realización, el compuesto de fórmula (I) es
eros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, enant
o diastereómeros del mismo.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el com
enantiómero y las mezclas racémicas.
Se entiende además que los compuestos y sales an
sustancialmente no compleja, como la forma anhidra.
complejo molecular es un hidrato. Los solvatos farmacé
metanolatos y etanolatos, acetonitrilatos y similares. Esto
La invención actualmente reivindicada se dirige además
farmacéuticamente aceptable y al menos un compuesto
También se divulgan las vías de administración y las dosis
que comprenden los compuestos. Los compuestos de la i
combinación con otros agentes farmacéuticos en un
enfermedades.
Las composiciones farmacéuticas de las invencione
experimentar los efectos beneficiosos de los compuest
humanos y los no humanos, como los animales de comp
Las composiciones farmacéuticas de la invención actual
conocida en la técnica. La dosis administrada depende
tratamiento concurrente, si lo hubiera, de la frecuencia de
Además de los compuestos divulgados en el presente d
reivindicada actualmente pueden comprender además al eros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo
sto o sal incluye cada diastereómero, isómero óptico,
iores pueden formar solvatos, o existir en una forma ndo el disolvente incorporado en el solvato es agua, el camente aceptables incluyen hidratos, alcoholatos como ompuestos también pueden existir en formas polimórficas.
na composición farmacéutica que comprende un portador crito en el presente documento.
cantidades eficaces de las composiciones farmacéuticas ención actualmente reivindicada pueden administrarse en variedad de protocolos para el tratamiento eficaz de
pueden administrarse a cualquier animal que pueda de la invención. Entre estos animales se incluyen los a y de granja.
te reivindicada se administran a un sujeto de una manera de la edad, la salud y el peso del receptor, del tipo de atamiento y de la naturaleza del efecto deseado.
mento, las composiciones farmacéuticas de la invención enos uno de los auxiliares adecuados, incluidos, pero nolimitados a, diluyentes, aglutinantes, estabilizadores,
adyuvantes o similares. Se prefieren auxiliares farmacé
preparación de tales soluciones estériles son bien conoci
tales como, pero no limitados a, REMINGTON'S PHAR
Publishing Co. (1990)). Pueden seleccionarse rutinaria
adecuados para el modo de administración, solubilidad y/
Los excipientes y aditivos farmacéuticos útiles en la pres
proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos y carbohidratos
y oligosacáridos; azúcares derivados tales como alditol
polisacáridos o polímeros de azúcar), que pueden estar p
combinación en intervalos de 1-99.99 % en peso o volum
albúmina sérica, como la albúmina sérica humana (HS
caseína y similares. Los componentes de aminoácidos re
amortiguadora, incluyen alanina, glicina, arginina, betaín
leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspart
Los excipientes carbohidratos adecuados para su uso e
fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbo
trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, como ra
similares; y alditoles, como manitol, xilitol, maltitol, lactitol,
La composición puede contener además, entre otros,
colorantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensi
La composición de la invención actualmente reivindicad
(también conocido como éster metílico del ácido 4-hidroxi
etilparabeno (también conocido como éster etílico del
PARASEPT), propilparabeno (también conocido como é
depropilo; NIPASOL; o PROPYL CHEMOSEPT) y/o buti
4-hidroxibenzoico; p-hidroxibenzoato de propilo; o BUTY
contiene metilparabeno y/o propilparabeno.
Los emulsionantes de la invención reivindicada actualm
isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol b
dimetilformamida, aceites, glicerol, alcohol tetrahidrofur
sorbitán, y mezclas de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden los c
pueden incluir un tampón o un agente de ajuste del pH
ácido o una base orgánicos. Los tampones representativ
cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico,
Tris, clorhidrato de trometamina o tampones de fosfato.
Además, las composiciones farmacéuticas de la invenció
como polivinilpirrolidonas, ficoles (un azúcar polimérico),
ciclodextrina), polietilenglicoles, agentes aromatizante
agentes antiestáticos, tensioactivos (por ejemplo, polisorb
fosfolípidos, ácidos grasos), esteroides (por ejemplo, col
Estos y otros excipientes y/o aditivos farmacéuticos con
conocidos en la técnica, por ejemplo, los enumerados en
(19a ed., Williams & Williams (1995)) y PHYSICIAN'S DE
La invención actualmente reivindicada proporciona com
composiciones conservadas que contienen un cons
adecuadas para uso farmacéutico o veterinario, que co
composición farmacéuticamente aceptable. Las composi
pueden contener opcionalmente al menos un conservant
limitan a, fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocre
formaldehído, clorobutanol, cloruro de magnesio (por eje
y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benceto
mismos en un diluyente acuoso. Puede utilizarse cualqui
como 0,001-5 %, o cualquier intervalo o valor dentro del
2 % m-cresol, 0,1-3 % alcohol bencílico, 0,001-0,5 % tim
similares.
mpones, sales, disolventes lipofílicos, conservantes, camente aceptables. Los ejemplos y procedimientos de en el arte y pueden encontrarse en textos bien conocidos EUTICAL SCIENCES (Gennaro, Ed., 18a edición, Mack te portadores farmacéuticamente aceptables que sean stabilidad del compuesto.
te invención también pueden incluir, pero no se limitan a, . ej., azúcares, incluyendo monosacáridos, di-, tri-, terra-, ácidos aldónicos, azúcares esterificados y similares; y entes solos o en combinación, comprendiendo solos o en Entre los excipientes proteicos ejemplares se incluyen la la albúmina humana recombinante (rHA), la gelatina, la sentativos, que también pueden funcionar con capacidad istidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, lisina, o y similares.
presente invención incluyen monosacáridos tales como y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, sa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y litol, sorbitol (glucitol), mioinositol y similares.
rtadores farmacéuticamente aceptables como agentes etanol, EDTA, tampón citrato, aromatizantes y agua.
ambién puede contener los conservantes metilparabeno zoico,p-hidroxibenzoatode metilo; o METIL PARASEPT), o 4-hidroxibenzoico;p-hidroxibenzoatode etilo; o ETIL r propílico del ácido 4-hidroxibenzoico;p-hidroxibenzoatorabeno (también conocido como éster propílico del ácido HEMOSEPT). En algunas realizaciones, la composición
te incluyen, pero no se limitan a, alcohol etílico, alcohol ílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, ílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de
puestos de la invención actualmente reivindicada también icamente, el tampón es una sal preparada a partir de un incluyen sales de ácidos orgánicos como sales de ácido ido tartárico, ácido succínico, ácido acético o ácido Itálico;
ivindicada pueden incluir excipientes/aditivos poliméricos xtratos (p. ej., ciclodextrinas, como 2-hidroxipropil-.beta.-agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, s como "TWEEN 20" y "TWEEN 80"), lípidos (por ejemplo, terol) y agentes quelantes (por ejemplo, EDTA o EGTA). os adecuados para su uso en la presente invención son MINGTON: THE SCIENCE & PR<a>C<t>ICE OF PHARMACY REFERENCE (52a ed., Medical Economics (1998)).
siciones farmacéuticas estables, así como soluciones y nte, así como composiciones conservadas multiuso renden al menos un compuesto aquí divulgado en una nes farmacéuticas de acuerdo con la presente invención onocido. Entre los conservantes se incluyen, pero no se , alcohol bencílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, , hexahidrato), alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo deshidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los oncentración o mezcla adecuada conocida en la técnica, o. Ejemplos no limitantes incluyen, sin conservante, 0,1 sal, 0,001-2,0 % feno, 0,0005-1,0 % alquilparabeno(s), yOtros excipientes, por ejemplo, agentes de isotonicidad,
pueden añadirse opcionalmente al diluyente. Se s
concentraciones conocidas. Es preferible añadir un tam
Las composiciones farmacéuticas pueden abarcar una
pH 4 a aproximadamente pH 10, específicamente, una
más específicamente, una gama de aproximadamente 6
de la presente invención tienen un pH entre aproximada
incluyen tampones de fosfato, fosfato sódico y solución
Otros aditivos, como solubilizantes farmacéuticamente a
sorbitán), TWEEN 40 (monopahnato de polioxietileno (
sorbitán), Pluronic F68 (copolímeros en bloque de
tensioactivos no iónicos como polisorbato 20 u 80 o pol
en bloque y quelantes como EDTAy EGTA pueden aña
reducir la agregación. Estos aditivos son especialmente
administrar la composición farmacéutica. La presenci
propensión de la composición a agregarse.
La composición de la invención actualmente reivindica
(también conocido como éster metílico del ácido 4-hidroxi
etilparabeno (también conocido como éster etílico del
PARASEPT), propilparabeno (también conocido como
de propilo; NIPa So L; o PROPYL CHEMOSEPT) y/o bu
4-hidroxibenzoico, p-hidroxibenzoato de propilo; o BUT
contiene metilparabeno y/o propilparabeno.
Las composiciones de la invención actualmente reivindi
Como es conocido en la técnica, los liposomas se deriv
Los liposomas están formados por cristales líquidos hidr
acuoso. Puede utilizarse cualquier lípido no tóxico, fi
liposomas. Las presentes composiciones en forma de li
invención actualmente reivindicados, estabilizantes, con
los fosfolípidos y las fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto
liposomas son conocidos en la técnica(véasePrescott
procedimientos de fabricación y los procedimientos de us
para la preparación de liposomas), 4,233,871 (proce
vesículas lipídicas), 4,438,052 (proceso para producir mi
4,532,089 (liposomas de tamaño gigante y procedimient
arrastre liposomal), 5,820,880 (formulaciones liposomal
Durante cualquiera de los procesos de preparación de lo
ser necesario y/o deseable proteger grupos sensibles
puede conseguirse mediante grupos protectores conve
ORGANIC CHEMISTRY (1973); and GREENE AND
(1991). Los grupos protectores pueden eliminarse en
conocidos en la técnica.
El compuesto de la invención actualmente reivindicad
(antes de diluirlo con un diluyente), añadirse al preconc
añadirse a un diluyente antes de mezclarlo con el pre
coadministrarse como parte de una forma de dosific
Opcionalmente, el compuesto de la invención reivindica
y en una segunda cantidad no solubilizada (en suspensi
La formulación farmacéutica también puede contener
comprendan excipientes y auxiliares que faciliten la tra
puedan administrarse a animales, como se describe en
Para la administración oral en forma de comprimido o cá
oral no tóxico farmacéuticamente aceptable, como etano
necesario, también pueden incorporarse a la mezcla a
adecuados. Los aglutinantes adecuados incluyen, sin li
o beta-lactosa; edulcorantes de maíz; gomas natural carboximetilcelulosa; polietilenglicol; ceras y similares.
incluyen, sin limitación, oleato de sodio, estearato de s
sodio, cloruro de sodio y similares. Los desintegrantes in
goma xantana y similares.
mpones, antioxidantes, potenciadores de la conservación, e utilizar un agente isotónico, como la glicerina, en fisiológicamente tolerado para mejorar el control del pH. lia gama de pH, como por ejemplo, de aproximadamente a de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9, y a aproximadamente 8,0. En un aspecto, las formulaciones nte 6,8 y aproximadamente 7,8. Los tampones adecuados na tamponada con fosfato (PBS).
tables como Tween 20 (monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán), TWEEN 80 (monooleato de polioxietileno (20) lioxietileno polioxipropileno), y PEG (polietilenglicol) o mero 184 o 188, polioles PLURONIC®, otros copolímeros e opcionalmente a las composiciones farmacéuticas para es si se utiliza una bomba o un recipiente de plástico para e tensioactivos farmacéuticamente aceptables mitiga la
también puede contener los conservantes metilparabeno nzoico; p-hidroxibenzoato de metilo; o METIL PARASEPT), ido 4-hidroxibenzoico; p-hidroxibenzoato de etilo; o ETIL r propílico del ácido 4-hidroxibenzoico; p-hidroxibenzoato arabeno (también conocido como éster propílico del ácido CHEMOSEPT). En algunas realizaciones, la composición
a también pueden administrarse en forma de liposomas. generalmente de fosfolípidos u otras sustancias lipídicas. dos mono o multilamelares que se dispersan en un medio lógicamente aceptable y metaboizable capaz de formar omas pueden contener, además de los compuestos de la vantes, excipientes y similares. Los lípidos preferidos son turales como sintéticas. Los procedimientos para formar d., METH. CELL BIOL. 14:33 (1976)). Los liposomas, los e describen en Patente de EE.UU. n.° 4.089.8091 (proceso ientos relativos a materiales biológicamente activos en las mixtas), 4,485,054 (grandes vesículas multilamelares), para producirlos), 4,897,269 (sistema de administración de etc.
mpuestos de la invención actualmente reivindicada, puede activos en cualquiera de las moléculas en cuestión. Esto nales, como los descritos en PROTECTIVE GROUPS IN S, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS a etapa posterior conveniente utilizando procedimientos
uede solubilizarse o suspenderse en un preconcentrado ado antes de diluirlo, añadirse al preconcentrado diluido o ncentrado. El compuesto de la invención también puede ión independiente, para obtener un efecto terapéutico. puede estar presente en una primera cantidad solubilizada
rtadores farmacéuticamente aceptables adecuados que formación de los compuestos activos en preparados que resente documento.
la, un compuesto puede combinarse con un portador inerte licerol, agua y similares. Además, cuando se desee o sea inantes, lubricantes, agentes desintegrantes y colorantes ción, almidón; gelatina; azúcares naturales como glucosa y sintéticas como acacia, tragacanto o alginato sódico, s lubricantes utilizados en estas formas de dosificación o, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de yen, sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita,Para la administración oral, la composición también c
incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, fructosa, s
aspartamo, ciclamato sódico y similares, así como sus co
Las suspensiones acuosas, emulsiones y/o elixires para a
diversos agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, t
agentes colorantes, tales como colorantes, colorantes n
agua, glicerina y diversas combinaciones, como se descri
Las composiciones farmacéuticas de la invención que se
oral, pueden presentarse como unidades discretas, como
de las cuales contiene una cantidad predeterminada
suspensión en un líquido acuoso o en un líquido no acuos
agua en aceite, y como bolo, etc.
Un comprimido puede fabricarse por compresión o mold
Los comprimidos pueden prepararse comprimiendo, en
polvo o gránulos, mezclado opcionalmente con un agluti
o agente dispersante. Los comprimidos moldeados pue
mezcla del compuesto en polvo humedecido con un
opcionalmente recubiertos o ranurados y pueden estar for
del compuesto que contienen.
Además, las composiciones que comprenden compuest
permiten la liberación sostenida del compuesto. Los polím
en Brem et al., 74 J. NEUROSURG. 441-46 (1991). Eje
incluyen matrices semipermeables de polímeros hidróf
actualmente reivindicada, cuyas matrices están en fo
microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación so hidroxietilmetacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidas (P
L-glutámico y etil-L-glutamato, etilvinilacetato no degradab
como el LUPRON DEPOT® (Tap Pharmaceuticals, Inc
copolímero de ácido láctico y ácido glicólico y acetato de
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la
estériles acuosas y no acuosas que pueden contener an
que la formulación sea isotónica con la sangre del recept
que pueden incluir agentes de suspensión y agentes esp
unidosis o multidosis, ampollas selladas y viales, y puede
(liofilizado) requiriendo únicamente la adición del portador
de su uso. Las soluciones y suspensiones inyectables ext
y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.
Para la administración parenteral, se desean suspe
administración intravenosa, se emplean preparados isot
composiciones farmacéuticas pueden administrarse por
farmacéutica que comprende un compuesto disuelto en
se utiliza aquí, incluye, entre otras, inyecciones subcu
técnicas de infusión. Los portadores líquidos aceptables
aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo y similares
formal y similares. Las composiciones farmacéuticas pue
el portador líquido de forma que la formulación final conte
un compuesto.
La composición de la invención actualmente reivindicada
como, pero no limitados a, fármacos hidrofílicos, fárm
peptidomiméticos, péptidos, proteínas, toxoides, sueros,
nucleósidos, materiales genéticos y/o combinaciones de l
El agente terapéutico adicional puede solubilizarse o su
diluyente), añadirse al preconcentrado antes de diluirlo,
antes de mezclarlo con el preconcentrado. El agente tera
de una forma de dosificación independiente, para obte
terapéutico(s) adicional(es) puede(n) estar presente(s)
cantidad no solubilizada (en suspensión) Dicho(s) age
agente(s) que tenga(n) valor terapéutico o de otro tipo
mamífero, como por ejemplo arrastres, nutrientes y agent tiene opcionalmente un edulcorante. Los edulcorantes rina sódica, sucralosa (SPLENDA®), sorbitol, manitol, inaciones.
inistración oral de esta invención pueden combinarse con s como, pero no limitados a sabores de naranja o limón, rales o pigmentos, además de los diluyentes tales como en el presente documento.
indica en la actualidad, adecuadas para la administración psulas, grageas, cápsulas lisas o comprimidos, cada una compuesto; como polvo o gránulos; como solución o o como emulsión líquida de aceite en agua o emulsión de
opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. máquina adecuada, el compuesto en forma fluida, como te, lubricante, diluyente inerte, conservante, tensioactivo fabricarse moldeando, en una máquina adecuada, una iluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden estar lados para proporcionar una liberación lenta o controlada
pueden incorporarse en polímeros biodegradables que s biodegradables y sus usos se describen detalladamente os adecuados de composiciones de liberación sostenida s sólidos que contienen un compuesto de la invención a de artículos conformados, por ejemplo, películas o ida incluyen poliésteres, hidrogeles (incluyendo poli(2-nte estadounidense n.° 3.773.919), copolímeros de ácido copolímeros degradables de ácido láctico y ácido glicólico Chicago, Ill.) (microesferas inyectables compuestas de prolida), y poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
inistración parenteral incluyen soluciones de inyección idantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas ntes. Las composiciones pueden presentarse en envases lmacenarse en una condición de secado por congelación uido estéril, agua para inyectables, inmediatamente antes poráneas pueden prepararse a partir de polvos, gránulos
ones y soluciones estériles. Cuando se desea una icos que suelen contener conservantes adecuados. Las a parenteral mediante la inyección de una composición portador líquido inerte. El término "parenteral", tal y como eas, intravenosas, intramusculares, intraperitoneales o luyen, aceites vegetales tales como aceite de cacahuete, sí como disolventes orgánicos tales como solketal, glicerol prepararse disolviendo o suspendiendo el compuesto en a entre aproximadamente 0,005 % y un 30 % en peso de
bién puede incluir agentes terapéuticos adicionales tales os hidrofóbicos, macromoléculas hidrofílicas, citocinas, icuerpos, vacunas, nucleósidos, nucleótidos, análogos de mismos.
enderse en un preconcentrado (antes de diluirlo con un dirse al preconcentrado diluido o añadirse a un diluyente tico adicional también puede coadministrarse como parte un efecto terapéutico. Opcionalmente, el(los) agente(s) una primera cantidad solubilizada y en una segunda (s) terapéutico(s) adicional(es) puede(n) ser cualquier ando se administra(n) a un animal, en particular a un de diagnóstico.
Además del compuesto y las composiciones de la inven
activos adicionales, la formulación farmacéutica tambié
adecuados que comprenden excipientes y auxiliares q
preparaciones mat que pueden administrarse a animales
Las formulaciones farmacéuticas útiles en la invención a
compuesto(s) según esta invención en una cantidad efic
del sujeto que se está tratando.
La invención actualmente reivindicada se refiere además
el presente documento por las siguientes vías, incluid
intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal
intracelebelosa, intracerebroventricular, intracólico, i
intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitonea
intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intra
intranasal, iontoforética o transdérmica.
A veces puede ser deseable administrar los compuesto
periodos de tiempo prolongados, durante periodos de
Ciertos dispositivos médicos pueden emplearse para pro
de un paciente. Los dispositivos pueden ser una bomba
fármaco y, opcionalmente, componentes de diagnóstico
Pueden utilizarse diversas formas farmacéuticas de li
dosificación puede contener una sal no tóxica farmacé
tenga un bajo grado de solubilidad en los fluidos corporal
ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido ta
poliglutámico, ácidos naftaleno mono- o di-sulfónico, ác
metálico polivalente, como zinc, calcio, bismuto, bario, m
o con un catión orgánico formado a partir de, por e
combinaciones de a) y b), por ejemplo, una sal de tanato
actualmente o una sal relativamente insoluble como las
gel de monoestearato de aluminio con, por ejemplo, acei
entre otras, sales de zinc, sales de tanato de zinc, sales
de liberación lenta para inyección contendría el comp
degradación lenta, no tóxico y no antigénico, como un
formulaciones descritas en la Patente de EE.UU. n° 3.7
los mismos, como los descritos anteriormente, tambié
colesterol, especialmente para su uso en animales. Se co
de depósito o de implante, por ejemplo, liposomas gase
n° 5.770.222; SUSTAINED AND CONTROLLED RELEA
Otros ejemplos incluyen la provisión de los compu
administrados mediante un sistema de liberación so
composición biodegradable puede estar compuesta por
y un disolvente orgánico biocompatible y no tóxico que s
administración puede implantarse en una zona de impla
la composición al fluido tisular circundante a través de u
El término "sitio de implante" se refiere a un sitio en el q
sitio de implantación también puede incluir la incorporaci
un compuesto de la invención actualmente reivindicada c
incorporarse a un recubrimiento de un stent que se impla
sólidos o biodegradables como sustrato sobre el que se a
recubierto, que comprende la composición farmacéutica,
paciente. El término "biodegradable" significa que el ma
con el tiempo por la acción de enzimas, por acción hi
mecanismos similares en el cuerpo humano. Por "bioero
degradará con el tiempo debido, al menos en parte, al
tisulares circundantes, la acción celular y similares. Por
descompuesta y absorbida dentro del cuerpo humano, p
Los materiales no poliméricos que pueden utilizarse
biocompatibles, sustancialmente insolubles en agua y flui
no polimérico puede solubilizarse, al menos parcialment
no poliméricos también son capaces de coagularse o soli
no polimérico se combina con un disolvente orgánico co
la consistencia deseada, desde acuosa a viscosa hasta n actualmente reivindicada, y agentes farmacéuticamente uede contener portadores farmacéuticamente aceptables facilitan el procesamiento de los compuestos activos en omo se describe en el presente documento.
almente reivindicada pueden contener una cantidad de un para tratar o prevenir la afección, trastorno o enfermedad
la administración de al menos un compuesto divulgado en entre otras, oral, parenteral, subcutánea, intramuscular, ntracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, acervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrenal, rina, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual,
e la invención actualmente reivindicada al sujeto durante semana a un año a partir de una única administración. cionar una dosificación continua intermitente o a demanda difusión u otro dispositivo que contenga un depósito de onitorización para regular la administración del fármaco. ación lenta, de depósito o de implante. Una forma de amente aceptable de un compuesto aquí divulgado que (a) una sal de adición ácida con un ácido polibásico como ico, ácido tánico, ácido pamóico, ácido algínico, ácido poligalacturónico y similares; (b) una sal con un catión nesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio y similares, plog., N,N'-dibencil-etilendiamina o etilendiamina; o c) zinc. Además, los compuestos de la invención reivindicada se acaban de describir, pueden formularse en un gel, un de sésamo, adecuado para inyección. Las sales incluyen, pamoato y similares. Otro tipo de formulación de depósito to de sal dispersado o encapsulado en un polímero de ímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, incluidas las 919. Los compuestos o sales relativamente insolubles de pueden formularse en gránulos silásticos de matriz de cen en la literatura otras formulaciones de liberación lenta, s o líquidos.Véase, por ejemploPatente estadounidense DRUG DELIVERY SYSTEMS (1978).
s de la invención actualmente reivindicada para ser nida que contiene una composición biodegradable. La material biodegradable, coagulable en agua, no polimérico miscible a dispersable en un medio acuoso. El sistema de haciendo que el disolvente se disipe, disperse o lixivie de matriz microporosa resultante.
se aplica la composición no polimérica. La implantación o de la composición farmacéutica que comprende al menos un dispositivo sólido. La composición farmacéutica puede en un sujeto. Además, pueden utilizarse otros materiales a la composición farmacéutica. A continuación, el material implanta, se inserta o se encuentra adyacente al sujeto o ial no polimérico y/o la matriz del implante se degradarán lítica simple o catalizada enzimáticamente y/o por otros le" se entiende que la matriz del implante se erosionará o ntacto con sustancias que se encuentran en los fluidos oabsorbible" se entiende que la matriz no polimérica será una célula, un tejido y similares.
la composición son generalmente aquellos que son corporales, y biodegradables y/o bioerodibles. El material n un disolvente orgánico soluble en agua. Los materiales arse para formar una matriz de implante sólida. El material atible y adecuado para formar una composición que tenga masilla o pasta untable.
Los disolventes orgánicos adecuados son aquellos que
disolverán al menos parcialmente el material no poliméri
oscila entre miscible y dispersable. Opcionalmente, se p
para generar poros adicionales en la matriz del implante.
orgánica o inorgánica, farmacéuticamente aceptable, que
disipará desde el material no polimérico coagulante y/o l
el lugar del implante.
Los compuestos de la invención actualmente reivindicada
o terapéutico local o sistémico en el cuerpo de un animal.
descritas en el presente documento, el compuesto es
polimérica para formar una mezcla homogénea y, tras la i
que la matriz sólida se degrada con el tiempo, el com
adyacente, y al tejido u órgano corporal pertinente, ya sea
a una velocidad controlada. La liberación del compuest
compuesto en un medio acuoso, la distribución del comp
la solubilidad y biodegradabilidad de la matriz sólida.Vé
cantidades y concentraciones de los ingredientes de la
eficaces para cumplir la tarea prevista.
En otras realizaciones, los compuestos de la invención
sistemas de administración de agentes bioactivos q
polimérica. Las micropartículas pueden ser microcápsula
técnica. Las micropartículas deben ser capaces de ser
convierta en gel una vez dentro de un entorno biológ
biodegradables. Muchas técnicas de microencapsulación
de micropartículas se enseñan en el arte.Véase, por eje
y 5,665,428.
Una matriz polimérica preferida será biodegradable
experimentará una gelificación térmica reversible a te
polimérica es capaz de liberar la sustancia arrastrada d
polímeros se degradan gradualmente por hidrólisis enz
Véase, por ejemploPatente estadounidense n° 6.287.58
Los procedimientos de preparación de diversas compos
activos son conocidos, o serán evidentes a la luz de la
procedimientos de preparación de dichas composici
farmacéuticos adecuados y sus formulaciones como se d
Martin, E.W., ed., Mack Publishing Company, 19a ed. (19
Los procedimientos de preparación de los preparados
fabrican de una manera conocida, incluidos los procesos
preparaciones farmacéuticas líquidas pueden obtenerse
moliendo opcionalmente la mezcla resultante y procesan
si se desea o es necesario.
Un experto en la materia apreciará que un procedimiento
de las composiciones de la invención a un paciente que
normas actualmente reconocidas en las artes médicas
composiciones farmacéuticas en combinación con un
entenderá que, cuando se administra a un paciente hum
de la invención reivindicada en la actualidad se decidirá d
El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para
el tipo y el grado de respuesta celular que se desea c
empleados; la edad, el peso corporal, el estado general
administración, la vía de administración y la tasa de exc
utilizados en combinación o coincidentes con el agente
médicas. Está dentro de la habilidad de la técnica com
requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y a
deseado.
La dosificación también puede administrarse de forma e
concentración predeterminada de los agentes en la sa
rutinarias en la técnica.
n biocompatibles, farmacéuticamente aceptables y que El disolvente orgánico tiene una solubilidad en agua que e incluir en la composición un agente formador de poros agente formador de poros puede ser cualquier sustancia a sustancialmente soluble en agua o fluido corporal, y se atriz sólida del implante al fluido corporal circundante en
n capaces de proporcionar un efecto biológico, fisiológico n la formulación de algunas composiciones farmacéuticas feriblemente soluble o dispersable en la composición no lantación, se incorpora a la matriz del implante. A medida esto es capaz de liberarse de la matriz al fluido tisular yacente o distante del lugar del implante, preferiblemente e la matriz puede variar en función de la solubilidad del to dentro de la matriz, el tamaño, la forma, la porosidad y, por ejemploPatente estadounidense n° 5.888.533. Las mposición administrada al paciente serán generalmente
ctualmente reivindicada pueden administrarse mediante contienen micropartículas suspendidas en una matriz microesferas o nanoesferas actualmente conocidas en la rastradas intactas dentro de un polímero que sea o se . Las micropartículas pueden ser biodegradables o no lizadas para incorporar un agente bioactivo en un portadorloPatente de EE.UU. n.° 4.652.441; 5,100,669; 4,438,253
presentará solubilidad en agua a baja temperatura y raturas corporales fisiológicas de mamíferos. La matriz ro de su matriz con el tiempo y de forma controlada. Los tica o no enzimática en medios acuosos o fisiológicos.
nes farmacéuticas con una cierta cantidad de principios esente divulgación, para los expertos en la materia. Los s farmacéuticas pueden incorporar otros excipientes ribe en REMINGt On 'S PHARm Ac EUTICAL SCIENCES, .
macéuticos de la invención actualmente reivindicada se nvencionales de mezcla, disolución o liofilización. Así, las binando los compuestos activos con excipientes sólidos, la mezcla de gránulos, tras añadir auxiliares adecuados,
administración de cantidades farmacéuticamente eficaces necesite puede determinarse empíricamente o mediante os agentes pueden administrarse a un paciente como o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Se , el uso diario total de los agentes de las composiciones ro del ámbito del buen juicio médico por el médico tratante. alquier paciente concreto dependerá de diversos factores: eguir; la actividad del agente o composición específicos salud, el sexo y la dieta del paciente; el momento de la ión del agente; la duración del tratamiento; los fármacos pecífico; y factores similares bien conocidos en las artes ar las dosis de los agentes a niveles más bajos que los entar gradualmente las dosis hasta que se logre el efecto
cífica para cada paciente con el fin de proporcionar una re, según se determine mediante técnicas aceptadas yEn general, los compuestos aquí descritos pueden usarse
dosis apropiadas definidas por pruebas rutinarias para o
potencial. El régimen de dosificación que utiliza un com
acuerdo con una variedad de factores que incluyen el tipo
del paciente; la gravedad de la condición a tratar; la vía d
el compuesto particular empleado. Un médico o veterinario
fácilmente la cantidad eficaz de arrastre necesaria para pr
La precisión óptima para lograr concentraciones de fárma
la mínima toxicidad puede requerir un régimen basado en
sitios diana. La distribución, el equilibrio y la eliminació
determinar la concentración óptima para un régimen de trat
documento pueden ajustarse cuando se combinan para lo
diversos agentes terapéuticos pueden optimizarse de fo
sinérgico en el que la patología se reduzca más de lo que l
En particular, la toxicidad y la eficacia terapéutica de un
determinarse mediante procedimientos farmacéuticos est
por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el
eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis e
y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Se prefier
excepto cuando la citotoxicidad del compuesto sea la act
utilizarse compuestos que presenten efectos secundarios
compuestos al lugar del tejido afectado para minimizar el
reducir los efectos secundarios. En general, los compuesto
que se maximice la eficacia y se minimice la toxicidad.
Los datos obtenidos de ensayos en cultivos celulares y e
una gama de dosis para su uso en seres humanos. Las d
de un intervalo de concentraciones circulantes que inclu
variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma far
Para cualquier compuesto utilizado en los procedimientos
puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultiv
para alcanzar un intervalo de concentración plasmática cir
de ensayo que alcanza una inhibición semimáxima de los
puede utilizarse para determinar con precisión las dosis
mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Además, la administración de dosis de las composiciones
utilizando un sistema de modelado farmacocinético/farm
dosificación y puede utilizarse un modelo farma farmacocinético/farmacodinámico de uno o más regímene
de los regímenes de dosificación para la administración
deseada basándose en el perfil farmacocinético/farma
6.747.002.
Se conocen procedimientos en la técnica para determinar
las composiciones farmacéuticas divulgadas o las comb
misma composición. A efectos terapéuticos, el término
significa la cantidad de cada compuesto activo o agente far
biológica o medicinal en un sistema tisular, animal o hu
clínico, que incluye el alivio de los síntomas de la enferme
(es decir, para inhibir la aparición o la progresión de un tras
a la cantidad de cada compuesto activo o agente farmac
aparición o la progresión de un trastorno tal como lo busc
presente invención proporciona además combinaciones de
terapéutico se administra en una cantidad independientem
agente terapéutico de la combinación se administra en
administra solo, pero es terapéutica o profiláctica cuan
terapéutico o agentes terapéuticos adicionales según la i
en una cantidad que es subterapéutica o subprofiláctica si
cuando se administran juntos. Las combinaciones de tre
Los procedimientos de terapia combinada incluyen la adm
todos los agentes activos; la administración esencialmente
de dos o más agentes activos formulados por separado.
los o en combinación con otros agentes terapéuticos en ner una eficacia óptima minimizando cualquier toxicidad esto de la presente invención puede seleccionarse de especie, la edad, el peso, el sexo, la condición médica dministración; la función renal y hepática del paciente; y n conocimientos ordinarios puede determinar y prescribir nir, contrarrestar o detener el progreso de la enfermedad.
dentro del intervalo que produce la máxima eficacia con cinética de la disponibilidad del compuesto a uno o más e un fármaco pueden tenerse en cuenta a la hora de iento. Las dosis de un compuesto descrito en el presente r los efectos deseados. Por otra parte, las dosis de estos independiente y combinarse para lograr un resultado ría si se utilizara cualquiera de los agentes por separado.
ompuesto divulgado en el presente documento pueden ar en cultivos celulares o animales de experimentación, % de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente el efecto tóxico y el terapéutico es el índice terapéutico compuestos que presenten grandes índices terapéuticos, ad o el resultado terapéutico deseado. Aunque pueden xicos, un sistema de administración puede dirigir dichos ño potencial a las células no infectadas y, de este modo, e la presente invención pueden administrarse de manera
dios en animales pueden utilizarse en la formulación de s de tales compuestos se sitúan preferentemente dentro la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede céutica empleada y de la vía de administración utilizada. la presente invención, la dosis terapéuticamente eficaz elular. Puede formularse una dosis en modelos animales lante que incluya la IC50 (la concentración del compuesto tomas) determinada en cultivo celular. Dicha información s en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse
rmacéuticas de la presente invención puede optimizarse odinámico. Pueden elegirse uno o más regímenes de inético/farmacodinámico para determinar el perfil e dosificación. A continuación, puede seleccionarse uno ue logre la respuesta farmacocinética/farmacodinámica inámico particular. Véase Patente estadounidense n°
dosis eficaces con fines terapéuticos y profilácticos para ciones de fármacos divulgadas, formuladas o no en la ntidad conjuntamente eficaz", tal como se utiliza aquí, céutico, solo o en combinación, que provoca la respuesta o que busca un investigador, veterinario, médico u otro o trastorno que se está tratando. Con fines profilácticos no), el término "cantidad conjuntamente eficaz" se refiere tico, solo o en combinación, que inhibe en un sujeto la un investigador, veterinario, médico u otro clínico. Así, la s o más agentes terapéuticos en las que, (a) cada agente te terapéutica o profilácticamente eficaz; (b) al menos un cantidad que es subterapéutica o subprofiláctica si se se administra en combinación con el segundo agente nción; o (c) ambos agentes terapéuticos se administran administran solos, pero son terapéuticos o profilácticos más agentes terapéuticos son análogamente posibles. tración conjunta de una única formulación que contenga multánea de más de una formulación; y la administraciónMás específicamente, las composiciones farmacéuticas
diaria total puede administrarse en dosis divididas de do
durante una semana, un mes o a lo largo de varios mes
determinados como clínicamente relevantes. Las dosi
suspenderse cuando el juicio clínico lo justifique. La d
intervalo de aproximadamente 0,0001 a aproximadame
particularmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 10
aproximadamente 1,0-50 mg o aproximadamente 1,0-Además, las dosis pueden ser de aproximadamente 0,5
5.0- 10 mg/kg por día, o dosis equivalentes según dete
que sea clínicamente relevante.
En el caso de las inyecciones, suele ser convenient
aproximadamente 0,01-30 mg, aproximadamente 0,1-20
60 kg). Las dosis intravenosas pueden incluir un bolo o
administrarse también la dosis calculada para 60 kg.
Como ejemplo no limitante, el tratamiento de seres hum
0 periódica de un compuesto de la presente invención d
El intervalo puede ser más particularmente de aproxim
aproximadamente 0,1-100 mg, aproximadamente 1,0-50
aproximadamente 60 kg). Además, las dosis pueden ser
1.0- 5,0 mg/kg por día, 5,0-10 mg/kg por día, o dosis e
concentración sérica que sea clínicamente relevante.
Específicamente, las composiciones farmacéuticas de la
menos una vez a la semana en el transcurso de varias se
se administran al menos una vez a la semana durant
composiciones farmacéuticas se administran una vez a la
las composiciones farmacéuticas se administran una vez
La invención proporciona además un procedimiento para
12-lipoxigenasa. El procedimiento comprende administra
eficaz de un compuesto de la presente invención.
La enfermedad o trastorno mediado por 12-lipoxigenasa
en el que la producción de ácido 12-hidro hidroxieicosatetraenoico (12(S)-HETE) está implicada e
enfermedades y los trastornos mediados por la 12-LOX i
de las enfermedades y los trastornos, así como aquellos
en el tratamiento o la prevención de las enfermedades y
En una realización, la invención actualmente reivindica
enfermedad o trastorno mediado por 12-lipoxigenasa,
cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de c
enantiómeros, una mezcla de enantiómeros, o diastereó
En una realización, la 12-lipoxigenasa es la 12-lipoxigen
En una realización, la enfermedad o trastorno mediado
en diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2, enfermedad
cardiovascular, enfermedad de Alzheimer, esteatohep
cutáneas, trombocitopenia inducida por heparina, trombo
En una realización, el cáncer se selecciona del grupo q
de mama y cáncer de pulmón.
En una realización, la enfermedad cardiovascular se s
congestiva, infarto de miocardio y accidente cerebrovasc
En una realización, la invención actualmente reivindicad
1 y/o tipo 2, que comprende administrar a un mamífero d
de cualquiera de los compuestos de Fórmula (I), o
diastereómero del mismo.
En una realización, la invención actualmente reivindic
trombosis, que comprende administrar a un mamífero d en administrarse en una única dosis diaria, o la dosis o cuatro veces al día. Las dosis pueden administrarse 6, 9 o 12 meses, o intervalos conocidos en la técnica y den continuarse durante toda la vida del paciente, o iaria de las composiciones puede variar en un amplio 000 mg por paciente y día. El intervalo puede ser más de peso corporal al día, aproximadamente 0,1-100 mg, g al día para adultos (con aproximadamente 60 kg). g/kg por día, aproximadamente 1,0-5,0 mg/kg por día, un profesional, para alcanzar una concentración sérica
ministrarlas por vía intravenosa en una cantidad de aproximadamente 0,1-10 mg al día a adultos (de unos osificación lenta. En el caso de otros animales, puede
animales puede proporcionarse como una dosis única 01 a aproximadamente 1.000 mg por paciente, por día. ente 0,001 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal al día, aproximadamente 1,0-20 mg al día para adultos (con oximadamente 0,5-10 mg/kg por día, aproximadamente entes según determine un profesional, para alcanzar una
ción actualmente reivindicada pueden administrarse al s. En una realización, las composiciones farmacéuticas as semanas a varios meses. En otra realización, las na durante cuatro a ocho semanas. En otra realización, semana durante cuatro semanas.
r o prevenir una enfermedad o trastorno mediado por la mamífero una cantidad terapéutica o profilácticamente
r o prevenir es típicamente una enfermedad o trastorno eicosatetraenoico (12(S)-HPETE) y/o ácido 12-sarrollo o progresión de la enfermedad o trastorno. las n aquellos en los que la 12-LOX es un mediador directo que la inhibición de la 12-LOX tiene un valor terapéutico stornos.
oporciona un procedimiento para tratar o prevenir una omprende administrar a un mamífero del mismo una era de los compuestos de Fórmula (I), o una sal, del mismo.
umana.
12-lipoxigenasa se selecciona del grupo que consiste diabética, enfermedad nerviosa diabética, enfermedad no alcohólica, hemostasia plaquetaria, enfermedades cáncer.
siste en cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer
iona del grupo que consiste en insuficiencia cardíaca
porciona un procedimiento para tratar o prevenir el tipo mo una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz sal, enantiómeros, una mezcla de enantiómeros, o
roporciona un procedimiento para tratar o prevenir la mo una cantidad terapéutica o profilácticamente eficazde cualquiera de los compuestos de Fórmula (I), una sal,
del mismo.
En una realización, la invención actualmente reivindica
plaquetaria inducida por PAR4-AP, que comprende adm
profilácticamente eficaz de cualquiera de los compues
enantiómeros, o diastereómero del mismo.
En una realización, la invención actualmente reivindica
de calcio inducida por PAR4-AP, que comprende admi
profilácticamente eficaz de cualquiera de los compues
enantiómeros, o diastereómero del mismo.
En una realización, los inhibidores de 12-LOX tienen utili
donde los islotes son tratados ex vivo para mejorar la su
La invención actualmente reivindicada se basa, en p
lipoxigenasa plaquetaria (12-LOX), una enzima product
es un componente esencial de la activación plaquetaria
la 12-LOX modula la agregación plaquetaria mediada p
esenciales para mantener la hemostasia tras una infla
FcyRIIa conduce a una activación plaquetaria inmunome
desemboquen en infarto de miocardio y accidente cerebr
mediada por FcyRIIa en las plaquetas limita la trombosi
plaquetaria inmunomediada. Sin embargo, no se sabía
trombosis mediada por FcyRIIa hasta el descubrimien
divulgada pretende explotar este sorprendente descubri
o prevenir una enfermedad o trastorno en el que esté i
trastorno puede ser un trastorno inmunomediado de trom
actualmente reivindicada, se divulgan aquí procedimient
o tratar la trombosis.
También se divulga un procedimiento para inhibir o dis
contactar una plaqueta con un inhibidor de 12-lipoxige
inmunomediada. En algunas realizaciones, la activación
de un receptor FcyRIIa.
Un compuesto o agente se considera un inhibidor de la
menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %,
menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %,
compuesto orgánico, un compuesto inorgánico, un com
mismas, anticuerpos o fragmentos de los mismos, ác
péptidos), o cualquier combinación de los mismos. Un i
Ejemplos no limitantes de inhibidores de la 12-LOX incl
8), 15(S)-HETrE (N° CAS 13222-49-6), ácido cafeico (N
CAS 305-01-1), 3,4-dihidroxibencilidencianoacetato de
ferúlico (N° CAS 1135-24-6), Gosipol (N° CAS 303-45-7)
5), ácido 8,11,14-eicosatriynoico (N° CAS 34262-64-1),
estructura química de ML355 se describe en Luci et al. (J
íntegramente por referencia.
Los inhibidores de 12-LOX también se divulgan, por e
US4605669, US4623661, CA1327204, US2007011196
US5574062, EP0416609, US4822811, EP0456760, US
enseñanzas sobre los inhibidores de la 12-LOX.
En algunas realizaciones, un inhibidor de 12-LOX utiliz
combinación de inhibidores de 12-LOX. En algunas
inhibidores de la 12-LOX se optimizan para proporcionar
Se ha descubierto que al menos algunos de los inhibido
y buena eliminación del organismo (Luci et al., J Med
terapéuticos de los procedimientos aquí divulgados.
En algunas realizaciones, el inhibidor de 12-LOX entra e
pueden obtenerse de un sujeto y luego cultivarse en un
de Petri). El contacto in vitro puede utilizarse para aplic
12-LOX.
tiómeros, una mezcla de enantiómeros, o diastereómero
oporciona un procedimiento para reducir la agregación ar a un mamífero del mismo una cantidad terapéutica o e Fórmula (I), una sal, enantiómeros, una mezcla de
porciona un procedimiento para reducir la movilización r a un mamífero del mismo una cantidad terapéutica o e Fórmula (I), una sal, enantiómeros, una mezcla de
n escenarios de trasplante/xenotrasplante, por ejemplo, vencia antes del trasplante.
en el sorprendente descubrimiento de que la 12(S)-oxilipina altamente expresada en la plaqueta humana, iada por FcyRIIa. Por ejemplo, la Fig. 11 muestra cómo yRIIa. Sin querer ceñirnos a la teoría, las plaquetas son n o lesión de la vasculatura. La activación del receptor , que puede dar lugar a complicaciones trombóticas que ular. Se ha demostrado que la inhibición de la activación el principal objetivo para la prevención de la activación la 12-LOX estuviera implicada en la patogénesis de la los inventores. En consecuencia, la tecnología aquí to y proporcionar procedimientos novedosos para tratar ada una vía mediada por FcYRIIa. Dicha enfermedad o openia y trombosis. En algunos aspectos de la invención vedosos para inhibir la activación plaquetaria y prevenir
r la activación plaquetaria, el procedimiento comprende En algunas realizaciones, la activación plaquetaria es uetaria inmunomediada es el resultado de la activación
X si disminuye la función o actividad de la 12-LOX en al nos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al enos un 95 %. Un inhibidor de la 12-LOX puede ser un o biológico (por ejemplo, proteínas o fragmentos de las nucleicos, análogos de ácidos nucleicos, sacáridos o or de la 12-LOX también puede ser sintético o natural. ETYA(N° CAS: 1191-85-1), baicaleína (N° CAS 491-67 331-39-5), CDC (N° CAS 132465-11-3), esculetina (N° N° CAS 132464-92-7), ETI (N° CAS 13488-22-7), ácido EDC (N° CAS 132465-10-2), Hinokitiol (N° CAS 499-44 dorina A, ML355, y una combinación de los mismos. La Chem. 2014, 57, 495-506), cuyo contenido se incorpora
lo, en US20130096159, WO1990012008, US6217875, 4897422, US20060193797, US5120752, US5112848, 03 cuyo contenido se incorpora por referencia para sus
ara los procedimientos aquí divulgados puede ser una tas realizaciones, las proporciones de mezcla de los áximos efectos terapéuticos.
e 12-LOX (por ejemplo, ML355) muestran baja toxicidad m. 2014, 57, 495-506), lo que demuestra los valores
tacto con la plaqueta in vitro. Por ejemplo, las plaquetas iente (por ejemplo, una placa de 96 pocillos o una placa es como la evaluación de la eficacia del inhibidor de laEn algunas realizaciones, el inhibidor de 12-LOX entra e
contacto in vivo puede ser en un sujeto que toma heparin
trombocitopenia y trombosis inmunomediado.
La activación plaquetaria puede evaluarse o medirse m
plaquetaria puede cuantificarse mediante factores como
de forma de las plaquetas puede evaluarse mediante c
plaquetaria puede medirse en un agregómetro plaquet
midiendo los niveles en sangre u orina de productos
ejemplo, los componentes del gránulo alfa, la tromboglo
forma soluble de la molécula de adhesión P-selectina).
se describen en US7011938, WO1996012956 y US6391
Como los inhibidores de la 12-LOX pueden inhibir o
inmunitario, otro aspecto de la invención se refiere a
trombocitopenia y trombosis mediado por el sistema i
necesita una cantidad eficaz de un inhibidor de l
inmunomediada y trastornos de trombosis son, entre otro
antifosfolípido, el síndrome de sepsis, la trombosis asocia
y la púrpura trombótica trombocitopénica.
En algunas realizaciones, un trastorno de trombocitopeni
sujeto por el uso de una o más heparinas o derivad
trombocitopenia y trombosis inmunomediado es la tromb
La TIH es un trastorno resultante de la administración d
un recuento bajo de plaquetas (por ejemplo, <100.000 pl
los términos "TIH" y "trombocitopenia y trombosis in
Paradójicamente, la medicación anticoagulante y la trom
trombosis potencialmente mortales. Los fenómenos tro
arterias y microvasculatura. En algunos casos de TIH, los
clínicos manifiestos, como TVP/EP, infarto de miocardio
trombos se encuentran en la microvasculatura, con efect
suprarrenal seguida de hemorragia, necrosis cutánea) o
Se encontró que la TIH ocurría en el 1 % al 3 % de los p
de los pacientes que recibían heparina de bajo peso mole
estándar para la TIH. Algunos procedimientos de diagnó
y WO2013165969. También se han desarrollado siste
aparición de TIH en diversas situaciones (Elalamy I, et a
Natl Med. 1998,182, 1517-1533). Por ejemplo, en un siste
como la evolución del recuento de plaquetas, el desarroll
Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz pue
modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros
un intervalo de concentración y una vía de administració
determinar las dosis y vías de administración útiles en
eficaz depende del efecto terapéutico deseado.
Los regímenes de dosificación de un inhibidor de 12-L
deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o pro
pueden administrarse varias dosis divididas a lo lar
proporcionalmente según indiquen las exigencias de
composiciones parenterales en forma de unidades de
dosificación.
Un médico o veterinario con conocimientos ordinarios
cantidad eficaz necesaria de la composición farmacéutic
de un inhibidor de la 12-LOX a niveles inferiores a los
incrementar gradualmente la dosis hasta conseguir el ef
Un médico o veterinario con conocimientos ordinarios
iniciar la administración de una composición farmacéutic
cuenta que el momento de la administración suele de
composición farmacéutica que comprende un inhibidor d
o más síntomas de TIH (por ejemplo, un descenso en el ntacto con la plaqueta in vivo. En estas realizaciones, el l sujeto podría necesitar tratar o prevenir un trastorno de
nte diversos procedimientos. Por ejemplo, la activación mbio de forma y la tendencia a la agregación. El cambio etría de flujo o microscopía electrónica. La agregación La activación plaquetaria también puede cuantificarse abólicos plaquetarios o biomarcadores relevantes (por a beta y el factor plaquetario 4, el tromboxano B2 o la os procedimientos para medir la activación plaquetaria
inuir la activación plaquetaria mediada por el sistema procedimiento para tratar o prevenir un trastorno de itario, que comprende administrar a un sujeto que lo -lipoxigenasa. Algunos ejemplos de trombocitopenia trombocitopenia inducida por heparina (TIH), el síndrome anticuerpos monoclonales terapéuticos o de diagnóstico
trombosis inmunomediado puede desencadenarse en el e las mismas. En estas realizaciones, el trastorno de penia inducida por heparina (TIH).
tratamiento con heparina, y consiste en el desarrollo de tas por mililitro en la sangre). En el presente documento, as por heparina (TIHIT)" se utilizan indistintamente. openia no se manifiestan como hemorragias, sino como ticos son multifocales y afectan, por ejemplo, a venas, bos se forman en lechos macrovasculares con síntomas s o isquemia de las extremidades. En otros casos, los ue son manifiestos clínicamente (por ejemplo, trombosis anecen subclínicos.
ntes que recibían heparina no fraccionada, y en el 0,1 % . Actualmente no existe un procedimiento de diagnóstico para HIT se divulgan, por ejemplo, en WO2001004159 de puntuación clínica para predecir la probabilidad de nn. Med. 2000, 32, 60-67; .Samama M, et al., Bull Acad e puntuación clínica, se otorgan puntuaciones a factores trombosis y otras causas de trombocitopenia.
timarse inicialmente en ensayos de cultivo celular o en rdos. El modelo animal también se utiliza para conseguir seables. Esta información puede utilizarse después para s sujetos. Generalmente, la cantidad terapéuticamente
ueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima tica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse situación terapéutica. Puede ser ventajoso formular ficación para facilitar la administración y uniformizar la
la materia puede determinar y prescribir fácilmente la r ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar las dosis sarios para conseguir el efecto terapéutico deseado e deseado.
materia también puede determinar fácilmente cuándo e comprende un inhibidor de 12-LOX. Debe tenerse en der de los resultados del diagnóstico. Por ejemplo, la -LOX puede administrarse cuando se han producido uno ento de plaquetas).
El procedimiento aquí divulgado puede usarse en comb
trastorno de trombocitopenia y trombosis inmunomediad
para tratar la TIH es la supresión del tratamiento con hep
(por ejemplo, danaparoide, argatroban o lepirudina). Cab
trastorno de trombocitopenia y trombosis inmunomediado
(por ejemplo, fondaparinux) para el tratamiento de la TIH
(por ejemplo, estreptoquinasa o uroquinasa), tromboem
inhibidores de GPIIb/IIIa.
Otro aspecto de la invención reivindicada en la actualida
de un evento trombótico, infarto de miocardio o acciden
sujeto que lo necesita de una cantidad eficaz de un inhi
puede conducir a la formación de trombos, que pueden
infarto de órganos, gangrena de extremidades u otras co
En algunos aspectos de todas las realizaciones, el s
realizaciones, el sujeto es un ser humano.
En algunos aspectos de todas las realizaciones, el sujet
de un trastorno de trombocitopenia y trombosis inmuno
sujeto recibe tratamiento con heparina. En algunos aspec
ortopédica. Se sabe que los pacientes de cirugía orto
pacientes que reciben heparina por otras razones médica
Aunque se pueden utilizar procedimientos y materiales s
prueba de esta divulgación, a continuación se descri
"comprende" significa "incluye" La abreviatura "e.g." deri
ejemplo no limitativo. Así, la abreviatura "e.g." es sinónim
Aunque las realizaciones preferidas se han representado
para los expertos en la materia que se pueden realizar
sin apartarse del espíritu de la invención y, por lo tanto, s
define en las reivindicaciones que siguen. Además, en l
aquellos con conocimientos ordinarios en la materia qu
ilustradas pueden modificarse aún más para incorpor
realizaciones aquí divulgadas.
Todas las patentes y otras publicaciones; incluyendo r
patentes publicadas, y solicitudes de patentes co-pendie
incorporadas aquí por referencia con el propósito de des
tales publicaciones que podrían ser usadas en conexió
facilitan únicamente para su divulgación antes de la fe
respecto debe interpretarse como una admisión de que lo
en virtud de una invención anterior o por cualquier otra r
del contenido de estos documentos se basa en la informac
alguna sobre la exactitud de las fechas o el contenido de
La descripción de las realizaciones de la divulgación no
precisa divulgada. Si bien las realizaciones específicas y
ilustrativos, son posibles diversas modificaciones equival
los expertos en la materia. Por ejemplo, mientras que lo
orden determinado, otras variantes de realización pueden
pueden realizarse sustancialmente de forma simultánea.
a otros procedimientos o procedimientos, según pro
combinarse para proporcionar otras realizaciones. Aspect
para emplear las composiciones, funciones y conceptos d
aún más realizaciones de la divulgación.
Los elementos específicos de cualquiera de las reali
elementos de otras realizaciones. Además, mientras q
divulgación se han descrito en el contexto de estas real
ventajas, y no todas las realizaciones necesitan necesari
la divulgación.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos ilustran algunas realizaciones y
la materia que pueden realizarse diversas modificaciones, ción con otros procedimientos o terapias para tratar un (por ejemplo, HIT). Por ejemplo, un enfoque terapéutico na y su sustitución por inhibidores directos de la trombina eñalar que la simple retirada de la heparina no pone fin al n otro ejemplo, puede utilizarse un inhibidor del Factor Xa tras terapias incluyen, entre otras, la terapia trombolítica ectomía, plasmaféresis, IgG intravenosa a dosis altas e
e refiere a un procedimiento de tratamiento o prevención cerebrovascular, que comprende la administración a un or de 12-LOX. La activación plaquetaria inmunomediada agular las arterias y provocar ictus, infarto de miocardio, licaciones graves.
o es un mamífero. En algunos aspectos de todas las
uede ser uno que presente uno o más factores de riesgo iado. En algunos aspectos de todas las realizaciones, el de todas las realizaciones, el sujeto se somete a cirugía ica tienen un mayor riesgo de desarrollar TIH que los
ilares o equivalentes a los aquí descritos en la práctica o n procedimientos y materiales adecuados. El término del latín exempli gratia, y se utiliza aquí para indicar un el término "por ejemplo"
escrito en detalle en el presente documento, será evidente rsas modificaciones, adiciones, sustituciones y similares onsideran dentro del alcance de la invención tal como se edida en que no se haya indicado ya, se entenderá por ualquiera de las diversas realizaciones aquí descritas e características mostradas en cualquiera de las otras
rencias bibliográficas, patentes emitidas, solicitudes de s; citadas a lo largo de esta solicitud son expresamente bir y divulgar, por ejemplo, las metodologías descritas en con la tecnología descrita aquí. Estas publicaciones se de presentación de la presente solicitud. Nada a este ventores no tienen derecho a antedatar dicha divulgación ón. Toda declaración relativa a la fecha o representación de que disponen los solicitantes y no constituye admisión tos documentos.
etende ser exhaustiva ni limitar la divulgación a la forma s ejemplos de la divulgación se describen aquí con fines es dentro del ámbito de la divulgación, como reconocerán asos o funciones del procedimiento se presentan en un alizar las funciones en un orden diferente, o las funciones enseñanzas de la presente divulgación pueden aplicarse a. Las diversas realizaciones aquí descritas pueden de la divulgación pueden ser modificados, si es necesario, as referencias anteriores y la aplicación para proporcionar
iones anteriores pueden combinarse o sustituirse por las ventajas asociadas con ciertas realizaciones de la ciones, otras realizaciones pueden también exhibir tales ente exhibir tales ventajas para caer dentro del ámbito de
ectos de la invención. Será evidente para los expertos en iciones, sustituciones y similares sin alterar el alcance dela invención, y tales modificaciones y variaciones están
las reivindicaciones siguientes. Los siguientes ejemplos
34, 57y69-83se proporcionan con fines ilustrativos.
La tecnología descrita en el presente documento se ilus
ningún caso deben interpretarse como limitativos.
La descripción siguiente proporciona la composición de
((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)bencenosulfonamida.
descritos son solubles, tienen propiedades ADME favor
La síntesis del compuesto1implicó una aminaci metoxibezaldehído. Fue necesario un enfoque por etap
(tiazol-2-il)bencenosulfonamida(2) y el benzaldehído n
la imina con borohidruro sódico proporcionó los compue
La posterior reducción de la imina con borohidruro só
(Esquema 1, Procedimiento A). Aunque esta ruta funcio
34) requirieron una ruta alternativa en la que se utilizó
(tiazol-2-il)bencenosulfonamida(3) disponible comercia
proporcionar los productos deseados con un rendimi
modificaciones de la porción tiazol de la molécula q
(Esquema 1, Procedimiento C). Por tanto, la reacción de
con 2-hidroxi-3-metoxibenzaldehído en etanol a reflujo
proporcionó el compuesto5en un 95 % de rendimi
continuación a condiciones de N-arilación catalizadas p
obtener los compuestos35, 38, 44-48, 52, 53, 56-59,
Tetrahedron Lett. 2012, 53, 7-10.) A pesar de la vers
aislados en los que la reacción catalizada por Cu no pr
83), o los bromuros de heteroarilo no estaban fácilment
menos directa calentando cloruro de 4-nitrobenceno-1-durante 1,5 a 8 horas dependiendo de la reactividad de
(Esquema 1, Procedimiento D). La reducción del grupo
con un 10 % de Pd sobre carbono a 50 °C y una presión
que no eran modificables mediante química de flujo, se
que se dispuso de la anilina deseada, se llevó a ca
correspondiente para proporcionar los compuestos3
condiciones específicas para cada paso del Esquema 1,
(1,5 equiv), EtOH, 3-18 h, 100 oC, NaBH (3,0 equiv),
Pd2dba3 (0,02 equiv), NaOtBu (2,5 equiv), 1,4-dioxano,
equiv), EtOH, 6 h, 100 o C, NaBH4 (1,5 equiv), 30 min, 9
R'NH2, piridina, 100 oC, 1,5-18 h. (vi) 10 % Pd/C, MeO
equiv), metanol, 60 oC, 30 min-2 h. (vii) 2-hidroxi-R-ben
Procedimientos sintéticos generales.(Esquema 1,
(0,39 mmol)(2), y benzaldehído requerido (0,67 mmol
calentaron a 100 °C durante 4-18 h. El sólido se dejó e
(0,80 mmol) y se agitó durante 30 min, tiempo durante
resultantes se filtraron, se lavaron con etanol y se purifi
c/ 0,1 % TFAen agua c/ 0,1 % TFA) para dar el product
(Esquema 1, Procedimiento B) Se añadió una solución
en dioxano (1 mL) a una mezcla de terc-butóxido só
(Xantphos) (0,02 mmol).78 mmol), 4,5-bis(difeni tris(dibencilideneacetona)dipaladio(0) (Pd2dba3) (6,27 p
con argón durante 15 min. A continuación se añadió la
calentó a 100 °C durante 30 min en el reactor de microon
ambiente y se filtró a través de celita. Se añadió tiol lig
nuevo a través de una almohadilla de celita, se concentr
c/ 0,1 % TFAen agua c/ 0,1 % TFA) para dar el product
(Esquema 1, Procedimiento C) 4-aminobencenosulfona
(1,00 g, 7,00 mmol) en EtOH (29 mL) se calentó a refl
anaranjada. La mezcla de reacción se enfrió a temperat
mmol) y se agitó durante 30 min más. Después de 30
lava con cantidades copiosas de etanol, se seca al vací
MHz, DMSO.d6) 87,60-7,27 (m, 2H), 6,75-6,40 (m, 4H),
(101 MHz, DMSO) 8 40., 55,32, 108,91, 109,42, 109, idas en el alcance de la invención tal como se define en itan en modo alguno la invención. Los compuestos1 ,8
n más detalle mediante los siguientes ejemplos, que en
ria y el procedimiento de uso en torno a un quimiotipo 4-nuevos quimiotipos para la inhibición de 12-LO aquí y buenas propiedades PKin vivo.
eductora con 4-aminobenzesulfonmida y 2-hidroxi-3-e implicaba la preformación de la imina con4-amino-N-rio durante la noche a 100 °C. La reducción posterior de eseados 1, 8-10 y 14-33 (Esquema 1, Procedimiento A). proporcionó los compuestos deseados1, 8-10y14-33ra la mayoría de los análogos, algunos de ellos(11-13y oplamiento de tipo Buchwald-Hartwig con la4-bromo-N-te y aminas bencílicas sustituidas por 2-metoxi para del 25-40 % (Esquema 1, Procedimiento B). Para las s introducir diversidad en el paso final de la síntesis minobencenosulfonamida(4) disponible comercialmente te 18 h, seguida de tratamiento con borohidruro sódico El derivado de sulfonamida resultante se sometió a utilizando los bromuros de heteroarilo apropiados para, 71, 74y75en buenos rendimientos. (Wang, X. et al. d general de este procedimiento, hubo algunos casos el producto deseado (por ejemplo, los compuestos77ponibles. Para estos compuestos se desarrolló una ruta ilo(6) y las aminas heteroarílicas requeridas a 100 °C ina para dar los derivados de 4-nitrofenil-sulfonamida7se consiguió utilizando el reactor de flujo H-Cube® Pro bar. Alternativamente, para compuestos menos solubles ó una reducción Zn/AcOH a 60 °C en metanol. Una vez na aminación reductora con el derivado bencil amina, 39-43, 49-51, 54, 55, 60, 70, 72, 73 y 76-83.Las o se muestra en la Figura 1, son las siguientes: (i) RCHO 0,6h; (ii) RCH2NH (1,2 equiv), Xantphos (0,06 equiv), 30 min, 100 oC. (iii) 2-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (1,2 (iv) R'Br (1,2 equiv), K2CO3 (2,5 equiv), 80 oC, 6-8 h. (v) Ac, 50 bar, 50 oC o zinc (4.0 equiv.0 equiv), AcOH (4.0 hído (1.2 equiv), EtOH, 18 h, 100 oC, NaBH4 (3.0 equiv).
dimiento A): 4-amino-N-(tiazol-2-il)benceno sulfonamida combinaron en etanol (2 mL) en un tubo sellado y se a temperatura ambiente y se añadió borohidruro sódico al la reacción se volvió clara y luego turbia. Los sólidos mediante HPLC-prep. (gradiente 10-100 % acetonitrilo eado.
romo-N-(tiazol-2-il)benceno sulfonamida (0,31 mmol)(3) (0,78 mmol) y 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno no)-9,9-dimetilxanteno (Xantphos) (0,02 mmol) y en dioxano (1 mL). La mezcla resultante se desgasificó lamina necesaria (0,38 mmol), se selló el recipiente y se iotage®. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura sílice Silicycle® y se agitó durante la noche, se filtró de e purificó por pre-HPLC (gradiente 10-100 % acetonitrilo eado.
(4) (1,00 g, 5,81 mmol), 2-hidroxi-3-metoxibenzaldehído urante 4 h hasta que la reacción es una mezcla turbia mbiente antes de añadir borohidruro sódico (0,33 g, 8,71 forma un sólido blanco que se recoge por filtración y se utiliza tal cual en reacciones posteriores. 1H RMN (400 (t,J= 7,63 Hz, 1H), 4,18 (s, 2H), y 3,65 (s, 3H); 13C RMN 11,29, 111,40, 121,05, 125,05, 127,49, 129,92, 150,17,152,36, 152,36.37, 55,32, 108,91, 109,42, 109,55, 111,2
156,94; Tiempo de retención LC-MS (Procedimiento 1): metoxibencilamino)bencenosulfonamida(5) (0,58 mmol dimetiletilendiamina (0,29 mmol) y yoduro de cobre(I) (0,
sellaron en un tubo sellado de 5 mL. La reacción se cale
LC/MS. Una vez completada, la mezcla heterogénea se
La solución se pasó por un cartucho tiol (barrido de met
salmuera. El material crudo se purificó mediante HPLC-p
0,1 % TFA) para dar el producto deseado.
(Esquema 1, Procedimiento D:Ejemplo)N-(benzo[d]ti
solución agitada de benzo[d]tiazol-2-amina (0,50 g, 3,35
de 4-nitrobenceno sulfonilo (6) (0,82 g, 3,68 mmol) en tr
75 min a 100 °C, se enfrió a temperatura ambiente, tras l
se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 h y d
etanol y se secó a presión reducida durante la noche par
d6) 88,90 (ddt,J= 0,75, 1,63 y 5,59 Hz, 1H), 8,54, 8,41-1H), 7,45-7,34 (m, 1H), 7,31-7,19 (m, 1H); Tiempo de
(M+H)+ = (Calculado para C1aH1üN3O4S2 , 336.0107) e
4-am/no-N-(benzo[d]tiazol-2-il)bencenosulfonamida:
nitrobencenosulfonamida (0,20 g, 0,60 mmol), zinc (0,16
(3 mL), y la mezcla se calentó a 60 °C durante 2 h. La
celita, se lavó con metanol caliente, se concentró y se p
0,1 %NH4OHen agua c/0,1 %NH4OH) para dar el produ
2- il)-4-nitrobencenosulfonamida se disolvió en MeOH/
por el reactor de flujo H-Cube Pro® utilizando un CatCart
a 0,9 mL/min. La solución se concentró para dar un sólid
MHz, DMSO-d6) 87,49-7,34 (m, 3H), 7,18 (ddd,J= 0,5
1H), 6,83 (ddd,J= 1,20, 7,25, y 7,68 Hz, 1H), 6,51
(Procedimiento 2): 3.933 min; HRMS:m/z(M+H)+ = (Calc
N-(benzo[d]tiazol-2-M)-4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)a
representativo)(35, ML355):la 4-amino-N-(benzo[d]tiaz
3- metoxibenzaldehído (0,075 g, 0,491 mmol) se calen
reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente antes
más.98 mmol), y se agitó durante 6 h adicionales. Tra
metanol y agua, después se agitó durante 20 min, los s
concentró a presión reducida para proporcionar un sólid
(gradiente 10-100 % acetonitrilo c/ 0,1 % TFAen agua c/
DMSO-d6) 812,86 (s, 1H), 8,73 (d,J= 0,5 Hz, 1H), 7,75
(m, 1H), 7,28-7,16 (m, 2H), 6,93-6,79 (m, 2H), 6,78-6,55
4,23 (d,J= 5,8 Hz, 2H) y 3,78 (s, 3H); 13C RMN (DMS
119,0, 111,4, 110,9, 56,2 y 40,6; tiempo de retención
(Calculado para C21H1gN3O4S2, 441.0817) encontrado
Procedimientos generales para la química.Todas las r
presión positiva de nitrógeno con material de vidrio seca
se obtuvieron de fuentes comerciales y se utilizaron t
semipreparativo de Waters. La columna utilizada fue un
de 45 mL/min. La fase móvil consistió en acetonitrilo y ag
la purificación se utilizó un gradiente de 10 % a 50 % de
mediante detección UV (220 nm). El análisis analítico
diferentes denominados Procedimientos 1 y 2 de Control
en un HPLC Agilent 1290 Infinity Series.<u>U<p>LC Gradie
trifluoroacético) en agua durante 3.5 minutos tiempo de
una columna C18 Phenomenex Kinetex de 1,7 micras (
el análisis se realizó en un Agilent 1260 con un gradient
0,025 % de ácido trifluoroacético) en agua (que contiene
de ejecución a un caudal de 1 mL/min. Se utilizó una c
temperatura de 50 °C. La determinación de la pureza se r
para el procedimiento 1 como para el procedimiento
espectrómetro de masas Agilent 6130 con ionización p
ensayo tienen una pureza superior al 95 % según ambos
se registraron en un espectrómetro Varian 400 (100) MH
en el sistema LC/MS de tiempo de vuelo Agilent 6210.
1,40, 121,05, 125,05, 127,49, 129,92, 150,17, 152,36 y 6 min. Procedimiento general:(Paso iv)4-(2-hidroxi-3-muro de arilo (0,70 mmol), K2CO3 (1,45 mmol), N,N'-mol) en 1,4-dioxano (1,5 mL) se colocaron bajo N2 y se 70 °C durante 6 a 8 h y se monitorizó mediante análisis a temperatura ambiente, se filtró y se lavó con dioxano. se diluyó con AcOEt y se lavó con NH4Cl (2X), agua y gradiente 10-100 % acetonitrilo c/ 0,1 % TFAen agua c/
2-il)-4-mtrobencenosulfonamida (7):(Paso V) A una ol) en piridina (1,60 mL, 20,08 mmol) se añadió cloruro rtes iguales. La mezcla de reacción se calentó durante se formó un precipitado amarillo. La mezcla de reacción s el sólido amarillo se recogió por filtración, se lavó con 1,10 del producto deseado. 1H RMN (400 MHz, DMSO. m, 1H), 8,13-7.96 (m, 2H), 7,82 (dq,J= 0,80, y 7,96 Hz, ción LC-MS (Procedimiento 1): 3.272 min; HRMS:m/zado 336.0107.
so VI) Se disolvió N-(benzo[d]tiazol-2-il)-4-39 mmol), ácido acético (0,14 mL, 2,39 mmol) en MeOH la heterogénea se filtró a través de una almohadilla de usando HPLC-prep. (gradiente 10-100 % acetonitrilo c/ seado. Reducción alterna de nitro: LaA/-(benzo[d]tiazol-/THF (1:1:1) para dar una solución 0,05 M que se pasó 0 % de Pd/C, 70 mm a 50 bar y 50 °C durante dos ciclos rillo pálido en un rendimiento cuantitativo. 1H RMN (400 1, y 8,00 Hz, 1H), 7,03 (ddd,J= 1,33, 7,24, y 7.97 Hz, (m, 2H), 5,42 (s, 2H); Tiempo de retención LC-MS para C13H12N3O2S2 , 306.0365) encontrado 306.0360.
bencenosulfonamida(etapa VII, ejemplo l)bencenosulfonamida (0,10 g, 0,33 mmol), el 2-hidroxien EtOH (1,5 mL) a 90 °C durante 18 h. La mezcla de adir NaBH4 (0,04 g, 0,98 mmol), y se agitó durante 6 h rido este tiempo, la mezcla de reacción se apagó con se filtraron a través de celita, se recogió el filtrado y se rillo. El material crudo se purificó mediante HPLC-prep. TFA) para dar el producto deseado. 1H RMN (400 MHz,J= 0,6, 1,2 y 7,9 Hz, 1H), 7,54-7,46 (m, 2H), 7,40-7,31 4H), 4,23 (d, J = 5,8 Hz, 2H) y 3,78 (s, 3H).55 (m, 4H), 8 ppm 152,4, 147,7, 144,3, 128,2, 125,7, 122,9, 120,4, (procedimiento 1): 2.260 min; HRMS:m/z(M+H)+ = 819.
iones sensibles al aire o a la humedad se realizaron bajo horno. Los reactivos químicos y los disolventes anhidros al. La purificación preparativa se realizó en un HPLC nomenex Luna C18 (5 micras, 30 x 75 mm) a un caudal ada uno con un 0,1 % de ácido trifluoroacético). Durante nitrilo en 8 minutos. La recogida de fracciones se activó la pureza se determinó mediante dos procedimientos alidad Final. Procedimiento 1: Los análisis se realizaron rgo Equivalente 4 % a 100 % acetonitrilo (0.05 % ácido ción de 4 minutos con un flujo de 0.8 mL/min. Se utilizó 100 mm) a una temperatura de 50 °C. Procedimiento 2: 7 minutos de 4 % a 100 % de acetonitrilo (que contiene % de ácido trifluoroacético) durante 8 minutos de tiempo a Phenomenex Luna C18 (3 micras, 3 x 75 mm) a una ó utilizando un detector de matriz de diodos Agilent tanto a determinación de la masa se realizó utilizando un ectrospray en modo positivo. Todos los análogos para edimientos analíticos. los espectros de RMN de 1Hy 13C espectrometría de masas de alta resolución se registróDescripción de las realizaciones de la presente inve y divulgación:
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilamino)-M-(tiazol-2-il)bencmetoxibenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58
6,62 (m, 3H), 6,60-6,45 (m, 4H), 4,19 (d,J= 5,91 Hz, 2
2): 4.394 min; HRm S:m/z(M+H)+ = (Calculado para
proporcionado con fines ilustrativos.
ulfonamida (1):Procedimiento A: utilizando 2-hidroxi-3-, 1H), 7,44-7,33 (m, 2H), 7,00 (d,J= 4.20 Hz, 1H), 6,85 ,77 (s, 3H); Tiempo de retención LC-MS (Procedimiento 8N3O4S2 392.0733) encontrado, 392.0726. Compuesto
4-(bencilamino)-M-(tiazol-2-il)benceno sulfonamida
(400 MHz, DMSO-d6) 512,39 (s, 1H), 7,48-7,39 (m, 2H)
Hz, 1H), 6,62-6,54 (m, 2H), y 4,29 (d,J= 5,61 Hz, 2
HRMS:m/z(M+H)+ = (Calculado para C16H16N3O2S2
con fines ilustrativos.
(8):Procedimiento A: utilizando benzaldehído; 1H RMN -7,13 (m, 6H), 6,99 (t,J=6.00 Hz, 1H), 6,71 (d,J= 4,60 mpo de retención<l>C-MS (procedimiento 2): 4.780 min; 678) encontrado, 346.0672. Compuesto proporcionado
4-(2-hidroxibencilamino)-M-(tiazol-2-il)benceno suhidroxibenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5
1H), 7,03 (ddd,J= 1.75, 7,32, y 8,01 Hz, 1H), 6,92-6,6
5,68 Hz, 2h ); Tiempo de retención LC-MS (Procedimi
C i6H16N3O3S2 362.0628) encontrado, 362.0620. Commida (9):Procedimiento A: utilizando 2-s, 1H), 7,44-7,35 (m, 2H), 7,13 (dd,J= 1,65, y 7,55 Hz, 4H), 6,52-6,41 (m, 2H), 6,38-6,29 (m, 2H), y 4,17 (d,J= 2): 4.213 min; HRm S:m/z(M+H)+ = (Calculado para proporcionado con fines ilustrativos.
4-(3-metoxibencilamino)-M-(tiazol-2-il)benceno sudimetoxifenil)metanamina; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d
1H), 6,99 (t,J= 6,06 Hz, 1H), 6,93-6.85 (m, 2H), 6,79 (
6,55 (m, 2H), 4,27 (d,J= 5,92 Hz, 2H), y 3,72 (s, 3H)
HRm S:m/z(M+Na)+ = (Calculado para C17H17
proporcionado con fines ilustrativos.
mida (10):Procedimiento B: utilizando (3-,48-7,41 (m, 2H), 7,27-7,19 (m, 1H), 7,18 (d,J= 4,63 Hz, = 1,10, y 2,48 Hz, 1H), 6,73 (d,J= 4,60 Hz, 1H), 6,63 po de retención LC-Ms (Procedimiento 2): 4.777 min; o3s2 398.0604) encontrado, 398.0584. Compuesto
4-(2-metoxibencilamino)-M-(tiazol-2-il)benceno sulfdimetoxifenil)metanamina; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d
(dd,J= 1,03, y 8.26 Hz, 1H), 6,90-6,76 (m, 2H), 6,71 (d,
y 3,81 (s, 3H); tiempo de retención<l>C-MS (procedim
C17H18N3O3S2 376.0784) encontrado, 376.0765. Comida TFA (11):Procedimiento B: utilizando 2-2,39 (s, 1H), 7,48-7,39 (m, 2H), 7,26-7,12 (m, 3H), 6,98 ,63 Hz, 1H), 6,59-6,50 (m, 2H), 4,23 (d,J= 5,89 Hz, 2H), 2): 4.888 min; HRMS:m/z(M+H)+ = (Calculado para proporcionado con fines ilustrativos.
4-(2,3-dimetoxibencilammo)-W-(tiazol-2-il)bencenodimetoxifenil)metanamina; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d
6,90 (m, 2H), 6,87-6.79 (m, 2H), 6,73 (d,J= 4,58 Hz, 1
(d,J= 13,99 Hz, 6H); Tiempo de retención lC-MS (Pr
para C18H20N3O4S2406.0890) encontrado, 406.0885.
namida (12):Procedimiento B: utilizando 2,3-,46 (d,J= 8,78 Hz, 2H), 7,18 (d,J=4,63 Hz, 1H), 7,06 59 (d,J= 8,84 Hz, 2H), 4,28 (d,J= 5,90 Hz, 2H), y 3,78 miento 2): 4.756 min; Hr MS:m/z(M+H)+ = (Calculado uesto proporcionado con fines ilustrativos.
4-(2-ammobencilammo)-M-(tiazol-2-il)benceno sulfformilfenil)carbamato de terc-butilo y eliminando el carb
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 57,54-7,37 (m, 3H), 7.2
1H), 6,74 (d,J= 4,61 Hz, 1H), 6,65-6,50 (m, 3H), y 4,23
min; H<r>M<s>:m/z(M+H)+ = (Calculado para C i6
proporcionado con fines ilustrativos.
ida (13):Procedimiento A: utilizando (2-o subsiguiente con HCl 4 M en dioxano durante 30 min. (m, 3H), 6,96 (d,J= 7,86 Hz, 1H), 6,86 (h,J= 7,06 Hz, H); tiempo de retención LC-MS (procedimiento 1): 1.863 O2S2 361.0787) encontrado, 361.0784. Compuesto
4-(3-hidroxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)benceno suhidroxibenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59
(t,J= 7.77 Hz, 1H), 6,97 (t,J= 5,90 Hz, 1H), 6,79-6,6
retención LC-M<s>(Procedimiento 1): 1.775 min; H<r>M<s>
encontrado, 362.0614. Compuesto proporcionado con fimida (14):Procedimiento A: utilizando 3-, 1H), 7,51-7,37 (m, 2H), 7,18 (d,J=4,62 Hz, 1H), 7,10 3H), 6,66-6,49 (m, 3H), y 4,31-4,14 (m, 2H); Tiempo de (M+H)+ = (Calculado para C16H16N3O3S2 362.0628) lustrativos.
4-(2-ammo-3-metoxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)benc
metoxi-2-nitrobenzaldehído; Una solución hete il)bencenosulfonamida (0,075 g, 0.178 mmol) en MeOH
mmol) se agitó durante 30 min, se filtró a través de c
mediante pre-HPLC (gradiente 10-100 % acetonitrilo c/
deseado; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 57,44 (d,J=
7,81 Hz, 1H), 6,75-6,67 (m, 3H), 6,56 (d,J= 8,82 Hz,
(Procedimiento 1): 2.775 min; HRMS:m/z(M+H)+ = (Cal
Compuesto proporcionado con fines ilustrativos.
lfonamida TFA (15):Procedimiento A: utilizando 3-ea de 4-(3-metoxi-2-nitrobenzilamino)-N-(tiazol-2-L), AcOH (0,102 mL, 1,784 mmol) y zinc (0,023 g, 0,357 se lavó con MeOH. El filtrado se concentró y purificó % TFA en agua c/ 0,1 % TFA) para obtener el producto Hz, 2H), 7,17 (d,J= 4,61 Hz, 1H), 6,78 (dd,J= 1,23, y ,16 (s, 2H), y 3,77 (s, 3H); tiempo de retención LC-MS o para C17H19N403S2391.0893) encontrado, 391.0874.
4-(3-hidroxi-4-metoxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)benc
4-metoxi-benzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)
6.95-6,74 (m, 2H), 6,77-6,62 (m, 4H), 6,62-6,49 (m, 2H),ulfonamida (16):Procedimiento A: utilizando 3-hidroxi-6 (s, 1H), 7,52-7,32 (m, 2H), 7,15 (d,J=4,61 Hz, 1H), (d,J= 5,92 Hz, 2H), y 3,70 (s, 3H); tiempo de retenciónLC-MS (procedimiento 2): 4.123 min; HRMS:m/z(M+
392.0719. Compuesto proporcionado con fines ilustrativ (Calculado para C i7H18N3O4S2 392.0733) encontrado,
4-((1H-mdol-7-il)metilammo)-M-(tiazol-2-il)bencenosu
carbaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 57,51-7,3
6,85 (m, 2H), 6.70 (d,J= 4,62 Hz, 1H), 6,67-6,57 (m, 2
2H); Tiempo de retención lC-MS (Procedimiento 2): 4.8
385.0787) encontrado, 385.0774. Compuesto proporciomida (17):Procedimiento A: utilizando 1H-indol-7-4H), 7,36-7,31 (m, 1H), 7,16 (t,J= 4,53 Hz, 1H), 6,95 44 (dd,J= 1,83, y 3,08 Hz, 1H), y 4,53 (d,J= 5,67 Hz, ; HRMS:m/z(M+H)+ = (Calculado para C18H17N4O2S2 con fines ilustrativos.
4-(2,3-diclorobencilammo)-M-(tiazol-2-il)bencenosulfdiclorobenzaldehído; tiempo de retención LC-MS (Proce
C16H14ChN3O2S2413.9899) encontrado, 413.9907. Coida (18):Procedimiento A: utilizando 2,3-nto 2): 5.786 min; HRMS:m/z(M+H)+ = (Calculado para sto proporcionado con fines ilustrativos.
4-(3-cloro-2-hidroxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)bencehidroxibenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 57
(m, 1H), 6.87 (d,J= 3,82 Hz, 1H), 6,76 (t,J= 7,77 Hz,
2<h>); Tiempo de retención LC-MS (Procedimiento
C16H14ClN3NaO3S2419.0085) encontrado, 419.0047.
fonamida (19):Procedimiento A: utilizando 3-cloro-2-35 (m, 2H), 7,21 (dd,J= 1,63, y 7,94 Hz, 1H), 7,13-7,02 6,51-6,43 (m, 2H), 6,35 (d,J= 3,82 Hz, 1H), y 4,25 (s, 076 min; HRMS:m/z(M+Na)+ = (Calculado para uesto proporcionado con fines ilustrativos.
4-(3-fluoro-2-hidroxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)benchidroxibenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5
(m, 1H), 6,72 (t,J=7,94 Hz, 1H), 6,51-6,38 (m, 3H), 6,
retención LC-MS (procedimiento 1): 2.076 min;<h>R<m>S
encontrado, 380.0521. Compuesto proporcionado con filfonamida (20):Procedimiento A: utilizando 3-fluoro-2-s, 1H), 7,49-7,33 (m, 2H), 7,08-6,93 (m, 2H), 6,91-6.80J=3,80 Hz, 1H), y 4,23 (d,J=3,52 Hz, 2H); tiempo de (M+H)+ = (Calculado para C16H15FN3O3S2 380.0533) strativos.
4-(3-bromo-2-hidroxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)benc
2-hidroxibenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5
(dd,J= 1,59, y 7,90 Hz, 1H), 7,58 (d,J=4.61 Hz, 1H), 7
Hz, 1H), 6,96 (d,J= 8,89 Hz, 2H), y 4,69 (d,J= 5,79
min; HRMS:m/z(M+H)+ = (Calculado para C16H
proporcionado con fines ilustrativos.
lfonamida, (21):Procedimiento A: utilizando 3-bromos, 1H), 8,16-8,02 (m, 1H), 7,86 (d,J= 8,75 Hz, 2H), 7,79 d,J= 1,56, y 7,59 Hz, 1H), 7,28 (s, 1H), 7,14 (t,J= 7,78 ); tiempo de retención LC-MS (Procedimiento 2): 4.777 O3S2 441.9712) encontrado, 441.9705. Compuesto
4-(4-bromo-2-hidroxibencilammo)-W-(tiazol-2-il)benc
2-hidroxibenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)
6.99-6,92 (m, 2H), 6,88 (dd,J=1,97, y 8,10 Hz, 1H), 6,65
LC-MS (Procedimiento 1): 2.938 min;<h>R<m>S:m/z(M+H)
441.9704. Compuesto proporcionado con fines ilustrativulfonamida (22):Procedimiento A: utilizando 4-bromo-06 (s, 1H), 7,47-7,34 (m, 2H), 7,03 (d,J= 8,13 Hz, 1H), (m, 4H), y 4,12(d,J=5,91 Hz, 2H); Tiempo de retención Calculado para Ci6H15BrN3O3S2441.9712) encontrado,
4-(2-hidroxi-3-metilbencilammo)-M-(tiazol-2-il)bence
metilbenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,2
6,75 (m, 2H), 6,64-6,48 (m, 3H), 6,44-6,31 (m, 2H), 4,08
6,31 (m, 2H), 4,08 (d,J= 5,76 Hz, 2H), y 2,01 (s, 3<h>)
HRm S:m/z(M+H)+ = (Calculado para C17H18N3O3S2
con fines ilustrativos.
lfonamida (23):Procedimiento A: utilizando 2-hidroxi-3-1H), 7,34-7,21 (m, 2H), 7,00 (d,J= 4,62 Hz, 1H), 6,84 = 5,76 Hz, 1H).84-6,75 (m, 2H), 6,64-6,48 (m, 3H), 6,44 mpo de retención<l>C-<m>S (Procedimiento 1): 2.083 min; 0784) encontrado, 376.0779. Compuesto proporcionado
4-(3-ammo-2-hidroxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)benc
nitrobenzaldehído y reduciendo el nitrogrupo con zinc y
más detalles). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 57,49-7,3
6,85-6,69 (m, 3H), 6,60-6,50 (m, 2H), y 4,28 (s, 2H); tiem
m/z(M+H)+ = (Calculado para C16H17N403S2377.073
ilustrativos.
ulfonamida (24):Procedimiento A: utilizando 2-hidroxi-3-ndiciones de ácido acético (véase el compuesto15para 2H), 7,17 (d,J= 4,65 Hz, 1H), 6,92 (t,J= 8,63 Hz, 2H), e retención LC-MS (Procedimiento 1): 2.263 min; HRm S: contrado, 377.0730. Compuesto proporcionado con fines
4-(2-hidroxi-3-mtrobencilammo)-M-(tiazol-2-il)bencen
nitrobenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 57,8
4.66 Hz, 1H), 7,05-6,88 (m, 2H), 6,72 (d,J= 4,61 Hz, 1
retención lC-MS (procedimiento 2): 4.742 min; Hr Ms
encontrado, 407.0465. Compuesto proporcionado con fifonamida (25):Procedimiento 1A: utilizando 2-hidroxi-3-,J=1,65, y 8,43 Hz, 1H), 7,58-7,24 (m, 3H), 7,17 (d,J= ,67-6,34 (m, 2H), y 4,33 (d,J= 4,46 Hz, 2H); tiempo de (M+H)+ = (Calculado para C16H15N4O5S2 407.0478) lustrativos.
4-(3-alil-2-hidroxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)bencenohidroxibenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 51
Hz, 1H), 6,96 (ddd,J= 1,73, 7,52, y 22,52 Hz, 2H), 6.80
16,79 Hz, 1H), 5,08-4,95 (m, 2H), 4,25 (s, 2H), y 3,34
(Procedimiento 1): 3.155 min; H<r>M<s>:m/z(M+H)+ = (Cal
Compuesto proporcionado con fines ilustrativos.
namida TFA (26):Procedimiento A: utilizando 3-alil-2-(s, 1H), 8,47 (s, 1H), 7,49-7,38 (m, 2H), 7,17 (d,J= 4,61 (m, 3H), 6,61-6,50 (m, 2H), 5,93 (ddt,J= 6,63, 10,04, yJ= 1,44, y 6,58 Hz, 2H); tiempo de retención LC-MS o para C19H20N303S2402.0941) encontrado, 402.0926.
4-(4-cloro-2-hidroxibencilammo)-W-(tiazol-2-il)bencenhidroxibenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 57,
3 H), 6,49-6,20 (m, 4 H), y 4,12 (s, 2 H); tiempo de retenci
= (Calculado para C16H15ClN3O3s2 396.0238) enc
ilustrativos.
onamida (27):Procedimiento A: utilizando 4-cloro-2-J= 8,6 Hz, 2 H), 7,07 (d,J= 8,2 Hz, 1 H), 6,92-6,61 (m, -MS (Procedimiento 2): 4.700 min; HRMS:m/z(M+H)+ o, 396.0220. Compuesto proporcionado con fines
4-(2-hidroxi-4-metoxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)benc
4-metoxi-benzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)
6,87-6,80 (m, 1H), 6,49-6.39 (m, 2H), 6,36 (d,J= 2,47 H
= 5,77 Hz, 2H), y 3,63 (s, 3H); Tiempo de retención L
(Calculado para C i7H18N3O4S2392.0733) encontrado,lfonamida (28):Procedimiento A: utilizando 2-hidroxi-(s, 1H), 7,41-7,32 (m, 2H), 7,00 (d,J= 8,37 Hz, 1H), , 6,34-6,26 (m, 2H), 6,21 (t,J= 5,86 Hz, 1H), 4,07 (d,J(Procedimiento 1): 3.155 min; HRMS:m/z(M+<h>)+ = 15. Compuesto proporcionado con fines ilustrativos.
4-(5-cloro-2-hidroxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)bencenhidroxibenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 51
(m, 2H), 6,64 (d,J= 4,44 Hz, 1H), 6,58-6,48 (m, 2H),
(procedimiento 2): 4.610 min; H<r>M<s>:m/z(M+H)+ =
396.0233. Compuesto proporcionado con fines ilustrativoonamida (29):Procedimiento A: utilizando 5-cloro-2-s, 1H), 7,48-7,37 (m, 2H), 7,13-7,00 (m, 3H), 6.89-6,76 17 (d,J= 5,97 Hz, 2H); tiempo de retención LC-MS ulado para C16H1<s>CI<n>3<o>3S2 396.0238) encontrado,
4- (2-hidroxi-5-metoxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)ben
5- metoxibenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)
6,77-6,65 (m, 3H), 6,65-6,48 (m, 4H), 4,15 (d,J= 5,
(Procedimiento 2): 4.137 min; H<r>M<s>:m/z(M+H)+ = (Calc
Compuesto proporcionado con fines ilustrativos.
ulfonamida (30):Procedimiento A: utilizando 2-hidroxi-2 (s, 1H), 7,47-7,38 (m, 2H), 7,08 (d,J= 4.44 Hz, 1H), z, 2H), y 3,56 (s, 3H); Tiempo de retención LC-MS para C17H18N3O4S2392.0733) encontrado, 392.0725.
4-(5-ammo-2-hidroxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)bence
nitrobencilaldehído y reduciendo el nitrogrupo con zinc y
más detalles). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,92 (s, 1
6,92 (m, 2H), 6,86 (d,J= 8.23 Hz, 1H), 6,73 (d,J= 4,66lfonamida (31):Procedimiento A: utilizando 2-hidroxi-5-diciones de ácido acético (véase el compuesto15para 46 (d,J=8,83 Hz, 2H), 7,18 (d,J= 4,64 Hz, 1H), 7,04 ), 6,53 (d,J= 8,83 Hz, 2H), y 4,22 (d,J= 5,77 Hz, 2H);tiempo de retención LC-MS (procedimiento 1): 2.165
377.0737) encontrado, 377.0719. Compuesto proporcio HRMS:m/z(M+H)+ = (Calculado para Ci6H17N4O3S2 con fines ilustrativos.
4-(5-fluoro-2-hidroxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)bencehidroxibenzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59
6,36 (m, 3H), 6,36-6,29 (m, 1H), y 4,14 (d,J= 6,00 Hz,
HRMS:m/z(<m>+H)+ = (Calculado para C16H15FN3O3S2
con fines ilustrativos.
lfonamida (32):Procedimiento A: utilizando 5-fluoro-2-,54 (m, 1H), 7,44-7,33 (m, 2H), 6,92-6,73 (m, 4H), 6,51 empo de retención L<c>-M<s>(Procedimiento 1): 3.017 min; 0533) encontrado, 380.0526. Compuesto proporcionado
4-(2-hidroxi-5-mtrobencilammo)-M-(tiazol-2-il)bencennitrobencilaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 pp
Hz, 1 H), 6,56-6,40 (m, 4 H), 5,74 (s, 1 H), y 4,10 (s, 2
HRMS:m/z(M+H)+ = (Calculado para C16H15N4O5S2
con fines ilustrativos.
fonamida (33):Procedimiento A: utilizando 2-hidroxi-5-2-7,76 (m, 2 H), 7,41 (d,J= 9,0 Hz, 2 H), 6,97 (d,J= 4,3 mpo de retención LC-M<s>(Procedimiento 2): 4.273 min; 478) encontrado, 407.0470. Compuesto proporcionado
4-(2-hidroxi-6-metoxibencilammo)-M-(tiazol-2-il)benc
6-metoxi-benzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)
7,24-7,05 (m, 1H), 6,68 (d,J= 8.87 Hz, 2H), 6,46 (ddd,
(d,J= 5,21 Hz, 2h ) y 3,74 (s, 3H); tiempo de retención
(Calculado para C^H1sN3O4S2392.0733) encontrado,ulfonamida (34):Procedimiento B: utilizando 2-hidroxi-9 (s, 1H), 7,74-7,54 (m, 1H), 7,42 (d,J= 8,79 Hz, 2H), ,93, 7,08 y 8,22 Hz, 2H), 6,22 (d,J= 5,51 Hz, 1H), 4,12 S (procedimiento 1): 2.960 min; HRMS:m/z(M+H)+ = 716. Compuesto proporcionado con fines ilustrativos.
M-(benzo[d]oxazol-2-il)-4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)
utilizando 2-bromobenzoxazol; 1H RMN (600 MHz, DM
Hz, 2H), 7,43 (d,J= 7.93 Hz, 1H), 7,31-7,25 (m, 1H), 7,
= 5,64 Hz, 1H), 6,81 (dd,J=1,72, y 7,88 Hz, 1H), 6,75-(d,J= 5,58 Hz, 2H), y 3,76 (d,J= 2,79 Hz, 3H); 13CN
128,27, 125,73, 125,45, 123,67, 120,40, 119,06, 112,19
LC-MS (procedimiento 2): 4.848 min; H<r m>S:m/z(M+
426.1098.
o)bencenosulfonamida (36):Procedimiento C: ) 5 12,40 (s, 1H), 8,71 (s, 1H), 7,55 (dd,J= 2,60, y 9,29 ,20 (m, 1H), 7,16 (td,J= 1,42, y 7,82 Hz, 1H), 6,86 (t,Jm, 1H), 6,66 (t,J= 7,85 Hz, 1H), 6,61-6,54 (m, 2H), 4,21 151 MHz, DMSO-d6) 5 156.01, 152,37, 147,74, 144,28, ,31, 110,88, 110,59, 56,23 y 41,15; tiempo de retención (Calculado para C21H20N3O5S426.n18) encontrado,
M-(1H-benzofd]imidazol-2-il)-4-((2-hidroxi-3-metoxib
utilizando 2-aminobenzimidazol y 2-hidroxi-3-metoxi-be
7,56-7,49 (m, 2H), 7,22 (dt,J= 3,37, y 5,83 Hz, 2H), 7.
1H), 6,71 (dd,J= 1,59, y 7,73 Hz, 1H), 6,65 (t,J=7,8
RMN (151 MHz, DMSO-d6) 5151,47, 150,22, 147,72, 14
111,46, 111,09, 110,86, 56,23 y 41,32; tiempo de retenc
(Calculado para C21H2<q>N404S, 424.1205) encontrado 4ammo)bencenosulfonamida (37):Procedimiento D: ehído; 1H RMN (600 MHz, DMSO-d6) 5 11,68 (s, 2H), ,J= 3,34, y 5,73 Hz, 2H), 6,79 (dd,J= 1,71, y 7,99 Hz, 1H), 6,58-6,50 (m, 2H), 4,19 (s, 2H), y 3,75 (s, 3H). 13C 130,61, 129,89, 127,61, 125,79, 122,59, 120,44, 119,05,<c>-MS (procedimiento 2): 4.454min; H<r>MS:m/z(M+H)+ 02.
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilammo)-M-(tiofen-2-il)ben
bromotiofeno;<1>H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,73 (s,
Hz, 1 H), 6.83 (dd,J= 2,0 y 7,8 Hz, 1 H), 6,78-6,64 (m,
3,80 (s, 3 H); tiempo de retención LC-MS (procedi
C<1>sH1gN2O4S2, 391.0781) encontrado 391.0773.
ulfonamida (38):Procedimiento C: utilizando 2-, 7,38-7,28 (m, 1 H), 7,05-6,98 (m, 1 H), 6,91 (t,J=6,1 , 6,61-6,52 (m, 2 H), 6,51-6,43 (m, 1 H), 4,25 (s, 2 H) y 1): 2.435 min; h Rm S:m/z(M+H)+ (Calculado para
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)ammo)-M-(4-metilbenzo[
D: utilizando 2-amino-4-metilbenztiazol y 2-hidroxi-3-me
1H), 8,71 (s, 1H), 7,58-7,45 (m, 3H), 7.18-7,05 (m, 2H),
2H), 3,76 (s, 3H), y 2,34 (s, 3H); Tiempo de retenció
(Calculado para C22H22N3O4S2 , 456.1046) encontradozol-2-il)bencenosulfonamida TFA (39):Procedimiento enzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMsO-d6) 5 12,76 (s, (dd,J=1,73, y 7,89 Hz, 1H), 6,76-6,54 (m, 4H), 4,21 (s, MS (Procedimiento 2): 5.522 min; H<r>MS:m/z(M+H)+ 037.
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilammo)-M-(4-metiltiazol-2-utilizando 2-bromo-4-metiltiazol; 1H RMN (400 MHz, DM
6.72 (m, 6 H), 6,61-6,47 (m, 3 H), 6,27 (s, 1 H), 4,20 (
retención LC-m S (procedimiento 1): 1.962 min; Hr M
encontrado 406.0875.
cenosulfonamida TFA (40):Procedimiento C: ) 512,31 (s, 1 H), 8,70 (s, 1 H), 7,48-7,32 (m, 3 H), 6,89 5,90 Hz, 2 H), 3,76 (s, 3 H), y 1,95 (s, 3 H); tiempo dez(M+H)+ (Calculado para C18H20N3O4S2 , 406.0890)
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilammo)-M-(5-metiltiazol-2-utilizando 2-amino-5-metiltiazoly 2-hidroxi-3-metoxi-ben
(s, 1H), 7,46-7.38 (m, 2H), 6,91-6,63 (m, 5H), 6,59-6,51
1,39 Hz, 3H); tiempo de retención LC-<m>S (procedim
C18H20N3O4S2, 406.0890) encontrado 406.0889.
cenosulfonamida TFA (41):Procedimiento D: hído; 1H RMN (400 MHz, DMSo-d6) 512,05 (s, 1H), 8,73 H), 4,20 (d,J= 5,86 Hz, 2H), 3,77 (s, 3H), y 2,13 (d,J= 1): 3.182 min; HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)ammo)-W-(5-femltiazol-utilizando 2-amino-5-feniltiazol y 2-hidroxi-3-metoxi-ben
(s, 1H), 7,68 (s, 1H), 7.56-7,25 (m, 8H), 6,87-6,78 (m,
2H), y 3,76 (s, 3H); tiempo de retención LC-MS (proce
C23H22N3O4S2, 468.1046) encontrado 468.1028.
ncenosulfonamida TFA (42):Procedimiento D: ído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 512,59 (s, 1H), 8,70 ,79-6,62(m, 2H), 6,61-6,53 (m, 2H), 4,21 (d,J= 5,8 Hz, to 2): 5.417 min; HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para
M-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-4-(2-hidroxi-3-metoxibencila
utilizando 2-bromo-4,5-dimetiltiazol; 1H RMN (400 MHz
7,45 (m, 2H), 7.13-6,80 (m, 4H), 6,83-6,62 (m, 2H), 4,53
Tiempo de retención<l>C-MS (Procedimiento 2): 4.859
420.1046) encontrado 420.1037.
bencenosulfonamida TFA (43):Procedimiento C: O-d6) 5 12,25 (s, 1H), 8,94 (d,J= 0,71 Hz, 1H), 7,73 (m, 2H), 3,98 (d,J= 0,60 Hz, 3H), ad 2,35-1,95 (m, 6H); HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para C<i>9H2<i>N304<s>2,
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilammo)-M-(5-metilisoxazo
utilizando 3-amino-5-metilisoxazol y 2-hidroxi-3-metoxi-1,25 Hz, 1H), 8,76 (d,J= 3,84 Hz, 1H), 7,77-7,55 (m, 1
2H), 6,63-6,51 (m, 2H), 6,11-6,02 (m, 1H), 4,27-4,14 (
retención LC-MS (Procedimiento 2): 4.804 min; HR
encontrado 390.1109.
encenosulfonamida TFA (44):Procedimiento D: ldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 10,91 (d,J= 2-7.28 (m, 2H), 7,02 (t,J=5,41 Hz, 1H), 6,77-6,64 (m, ), 3,77 (d,J=1,18 Hz, 3H), y 2,26 (s, 3H); tiempo de/z(M+H)+ (Calculado para C18H20N305S, 390.1118)
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)ammo)-M-(3-metoxifeml
bromo-3-metoxibenceno; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6
7,13-7.03 (m, 1H), 6,95-6,80 (m, 2H), 6,77-6,47 (m, 7H
de retención LC-Ms (procedimiento 2): 5.437 min; HR
encontrado 415.1302.
enosulfonamida(45): Procedimiento C: utilizando 1-87 (s, 1H), 8,73 (d,J= 0,5 Hz, 1H), 7,48-7,36 (m, 2H), (d,J= 5,8 Hz, 2H), 3,78 (s, 3H) y 3,64 (s, 3H); tiempo/z(M+h )+ (Calculado para C21H23N205S, 415.1322)
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilammo)-M-(qumolm-3-il)b
bromoquinolina; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,99
7,33 (m, 3H), 7,17 (dddd,J= 1,31,6,90, 8.19, y 31,70
6,30-6,20 (m, 2H), 6,17-6,10 (m, 2H), 3,76 (s, 2H), y 3,3
min; HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para C23H22N304osulfonamida TFA (46):Procedimiento C: utilizando 3-1,27 Hz, 1H), 8,20 (dd,J= 0,78, y 2,71 Hz, 1H), 7,60 H), 7,09-7,04 (m, 2H), 6,41 (dd,J= 1,94, 7,69 Hz, 1H), H); tiempo de retención LC-Ms (Procedimiento 1): 2.304 .1326) encontrado 436.1316.
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilammo)-N-(isoqumolm-8-ilbromoisoquinolina; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 10,
Hz, 1H), 8,02 (d,J=5,96 Hz, 1H), 7.91-7,73 (m, 2H), 7,
6,61-6,44 (m, 2H), 4,19 (s, 2H), y 3,79 (s, 3H); Tiempo d
(M+Na)+ (Calculado para C2sH2^ a N 3O4S, 458.1145) eenosulfonamida (47):Procedimiento C: utilizando 8-,24 (s, 1H), 9,56 (s, 1H), 8,74 (s, 1H), 8,54 (d,J= 5,95 29 (m, 3H), 6,85 (t,J= 4,80 Hz, 1H), 6,76-6,62 (m, 2H), nción LC-M<s>(Procedimiento 1): 1.914 min; HRMS:m/ztrado 458.1129.
4-(2-hidroxi-3-metoxibencNammo)-N-fen//bencenosu/
bromobenceno; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,85 (s
(m, 2H), 7,06-6,99 (m, 2H), 6.98-6,91 (m, 1H), 6,82 (dd,
4,31-3,99 (m, 2H), y 3,76 (s, 3H); Tiempo de retención
(Calculado para C20H2iN2O4S, 385.1217) encontrado 3m/daTFA (48):Procedimiento C: utilizando , 8,73 (d,J= 2,23 Hz, 1H), 7,42-7,34 (m, 2H), 7,21-7,12 86, y 7,72 Hz, 1H), 6,74-6,64 (m, 2H), 6,57-6,49 (m, 2H),<m>S (Procedimiento 1): 2.750 min; HRMS:m/z(M+H)+ 23.
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(naftalen-1-il)b
naftalen-1-amina y 2-hidroxi-3-metoxi-benzaldehído; 1H
(ddd,J= 0,74, 1,48, y 8,45 Hz, 1H), 7,89-7,82 (m, 1H), 7
y 7,45 Hz, 1H), 6,85 (q,J= 4,87 Hz, 2H), 6,75-6,66 (m,
3H); tiempo de retención LC-MS (Procedimiento 1): 2.7
435.1373) encontrado 435.1392.
nosulfonamida (49):Procedimiento D: utilizando (400 MHz, DMSO-d6) 59,74 (s, 1H), 8,73 (s, 1H), 8,06 ,J=8.15 Hz, 1H), 7,54-7,27 (m, 5H), 7,15 (dd,J= 1,05, 6,57-6,47 (m, 2H), 4,19 (d,J= 5,65 Hz, 2H), y 3,79 (s, in; Hr Ms :m/z(M+h )+ (Calculado para C24H23N2O4S,
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(naftalen-2-il)b
Procedimiento D: utilizando naftalen-2-amina y 2-hidro
10,11 (d,J= 1,4 Hz, 1H), 8,71 (s, 1H), 7,81-7,67 (m, 3H)
(m, 2H), 6,76-6,61 (m, 2H), 6,53 (dd,J= 8,8, 1,7 Hz, 2
(Procedimiento 1): 3.281 min; Hr Ms :m/z(M+H)+ (Calcnosulfonamida (50):
etoxi-benzaldehído; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 -7.30 (m, 5H), 7,27 (dt,J= 1,9, y 8,8 Hz, 1H), 6,94-6,76 ,16 (s, 2H), y 3,77 (s, 3H); tiempo de retención LC-MS para C24h23N204S, 435.1373) encontrado 435.1373.
N-([1,1'-bifenil]-4-il)-4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)ami
bifenil-4-amina y 2-hidroxi-3-metoxibenzaldehído; 1H RM
(m, 8H), 7,34-7,24 (m, 1H), 7,18-7,09 (m, 2H), 6.90 (t,J
2H), 6,61-6,52 (m, 2H), 4,19 (d,J= 5,8 Hz, 2H), y 3,77
min; HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para C26<h>25N204Sncenosulfonamida (51):Procedimiento D: utilizando 0 MHz, DMSO-d6) 59,99 (s, 1H), 8,72 (s, 1H), 7,60-7,35 , Hz, 1H), 6,82 (dd,J= 1,7, y 7,8 Hz, 1H), 6,76-6,62 (m, ); tiempo de retención LC-MS (Procedimiento 2): 6.433 .1530) encontrado 461.1529.
W-([1,T-bifeml]-3-il)-4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amm
bromo-1,1'-bifenilo; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,98
2.2 y 7,6 Hz, 1H), 6,96-6,73 (m, 2H), 6,75-6,49 (m, 4H),
LC-M<s>(procedimiento 2): 6.131 min; HRMS:m/z(M+
461.1521.
ncenosulfonamida (52): Procedimiento C: utilizando 3-H), 8,72 (s, 1H), 7,55-7,19 (m, 11H), 7,06 (ddd,J= 1,5, (d,J= 5,8 Hz, 2H) y 3,78 (s, 3H); tiempo de retención (Calculado para C26H2<s>N204<s>, 461.1530) encontrado
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N (3-(piperazin-1
utilizó 4-(3-bromofenil)piperazin-1-carboxilato de terc-but
HCl 4 M en dioxanos durante 30 min. 1H RMN (400 MH
7,05 (t,J= 8,12 Hz, 1H), 6,95-6,81 (m, 2H), 6,77-6.65 (
3H), 3,21 (s, 8H), y 0,88-0,76 (m, 1H); Tiempo de retenci
(Calculado para C24H29N4O4S, 469.1904) encontrado 4 nil)bencenosulfonamida (53): Procedimiento 1C: se se eliminó el grupo Boc tras la aminación reductora con SO-d6) 59,80 (s, 1H), 8,75 (s, 1H), 7,47-7,38 (m, 2H), ), 6,64-6,51 (m, 4H), 4,20 (d,J=5,58 Hz, 2H), 3,79 (s, -<m>S (Procedimiento 1): 1.660 min; HRMS:m/z(M+H)+ 97.
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilamino)-N (4-(piperazinutilizando 4-(4-aminofenil)piperidin-1-carboxilato de ter
eliminó tras la aminación reductora con HCl 4 M/dioxan
1H), 8,74 (d,J= 0,47 Hz, 1H), 7,39-7,30 (m, 2H), 6,98-6,
5,63 Hz, 2h ), 3,79 (s, 3H), y 3,19 (s, 8H); Tiempo de r
(M+H)+ (Calculado para C24H29N4O4S, 469.1904) enco nil)bencenosulfonamida (54): Procedimiento D: lo y 2-hidroxi-3-metoxibenzaldehído. El grupo Boc se rante 1 h a rt. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 59,50 (s, , 6H), 6,78-6.65 (m, 2H), 6,59-6,50 (m, 2H), 4,20 (d,J= ción LC-MS (Procedimiento 1): 1.648 min; HRMS:m/zo 469.1900.
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)ammo)-M-(4-(piperidm-4
utilizando 4-(4-aminofenil)piperidin-1-carboxilato de ter
eliminó tras la aminación reductora con HCl 4 M en diox
(s, 1H), 8,92 (d, J = 0,5 Hz, 1H), 7,63-7,56 (m, 2H), 7,32-= 5,7 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,57-3,42 (m, 4H), 3,14-3,0
4H), 3,14-3,01 (m, 4H), y 2,90 (d,J= 11,4 Hz, 1H); tiem
m/z(M+H)+ (Calculado para C25H30N3O4S, 468.1952) e l)bencenosulfonamida (55): Procedimiento D: lo y 2-hidroxi-3-metoxibenzaldehído. El grupo Boc se durante 1 h a rt. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 510,03 (m, 6H), 6,95-6,82 (m, 2H), 6,78-6,68 (m, 2H), 4,37 (d, J 4H).37 (d,J= 5,7 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,57-3,42 (m, retención LC-m S (procedimiento 1): 1.710 min; Hr Ms : trado 468.1935.
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilamino)-N-(6-(piperazin-1 -il
utilizando 4-(5-bromopiridin-2-il)piperazin-1-carboxilato
reductora con HCl 4 M/dioxanos durante 1 h. 1H RMN (4 in-3-il)bencenosulfonamida (56): Procedimiento C: rc-butilo, y el grupo Boc se eliminó tras la aminación Hz, DMSO-d6) 59,57 (s, 1H), 9,12 (d,J= 7,21 Hz, 2H),7.74 (d,J =2,65 Hz, 1H), 7,31 (dd,J =4,87, y 7,36 Hz,
6,51 (m, 2H), 4,19 (s, 2H), 3,77 (s, 3H), 3,75-3,53 (
(Procedimiento 1): 1.993 min; HRm S:m/z(M+H)+ (Calc ,07 (s, 1H), 6,89-6,80 (m, 2H), 6,76-6,59 (m, 2H), 6.60 ), y 3,17-3,07 (m, 4H); Tiempo de retención LC-MS para C23H28N5O4S, 470.1857) encontrado 470.1848.
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilammo)-M-(6-metilpiridm-3
bromo-2-metilpiridina; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5
7.47- 7,39 (m, 1H), 7,32-7,23 (m, 2H), 7.18 (dd,J=8,47
6.48- 6,40 (m, 2H), 4,06 (s, 2H), 3,64 (s, 3H), y 2,28 (s,
HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para C20H22N3O4S, 400
fines ilustrativos.
ncenosulfonamida (57): Procedimiento C: utilizando 5-(s, 1H), 8,61 (s, 1H), 8,02 (dd,J= 0,68, 2,63 Hz, 1H), H), 6,70 (dd,J= 1,92, y 7,68 Hz, 1H), 6,63-6,50 (m, 2H), iempo de retención lC-m S (Procedimiento 1): 1.840 min; ) encontrado 400.1315. Compuesto proporcionado con
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilammo)-M-(piridm-2-il)ben
bromopiridina; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,71 (d,
(d,J= 8,70 Hz, 2H), 7.09-6,98 (m, 1H), 6,92-6,79 (m, 3
2H), y 3,77 (s, 3H); Tiempo de retención LC-Ms (Proce
C19H2qN3O4S, 386.1169) encontrado 386.1158.
ulfonamida (58): Procedimiento C: utilizando 2-,54 Hz, 1H), 8,11-7,96 (m, 1H), 7,65-7,58 (m, 1H), 7,52 6-6,63 (m, 2H), 6,58-6,50 (m, 2H), 4,19 (d,J= 5,83 Hz, to 2): 4.540 min; Hr Ms :m/z(M+H)+ (Calculado para
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilammo)-M-(piridm-3-il)ben
bromopiridina; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 10,30 (
2,63, y 8,37 Hz, 1H), 7.46-7,32 (m, 3H), 6,83 (dd,J= 1,9
(s, 2H), 3,77 (s, 3H); Tiempo de retención LC-<m>S (Proc
C19H2qN3O4S, 386.1169) encontrado 386.1166.
ulfonamida (59): Procedimiento C: utilizando 3-, 8,73 (s, 1H), 8,31-8,21 (m, 2H), 7,57 (ddd,J= 1,38, ,71 Hz, 1H), 6,75-6,62 (m, 2H), 6,61-6,51 (m, 2H), 4,19 nto 1): 1.804 min; H<r>MS:m/z(M+H)+ (Calculado para
4-(2-hidroxi-3-metoxibencilammo)-M-(pirimidm-2-il)b
bromopirimidina; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 11,25
2H), 6,99 (dt,J=5,43, y 15.84 Hz, 2H), 6,85 (dd,J= 1,6
(d,J= 5,65 Hz, 2H), y 3,79 (s, 3H); tiempo de retenció
(Calculado para C i8H19N4O4S, 387.1122) encontrado 3 osulfonamida TFA (60): Procedimiento C: utilizando 2-), 8,77 (s, 1H), 8,48 (d,J= 4,83 Hz, 2H), 7,72-7,50 (m, ,85 Hz, 1H), 6,77-6,66 (m, 2H), 6,62-6,56 (m, 2H), 4,23 MS (Procedimiento 2): 4.266 min; HRMS:m/z(M+H)+ 5.
M-(3-(terc-butil)feml)-4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)am
utilizando 1-bromo-3-(terc-butil)benceno; 1H RMN (400
7,14-6,93 (m, 3H), 6.93-6,78 (m, 3H), 6,73-6,60 (m, 2H), encenosulfonamida, TFA (61): Procedimiento C: MSO-d6) 59,71 (s, 1H), 8,71 (s, 1H), 7,42-7,32 (m, 2H), -6,47 (m, 2H), 4,18 (s, 2H), 3,76 (s, 3H) y 1,14 (s, 9H);tiempo de retención LC-MS (procedimiento 2): 6.184
441.0843) encontrado 441.1844.
HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para C24H29N2O4S,
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)ammo)-W-(6-metoxibenz
Procedimiento C: utilizando 2-bromo-6-metoxibenzo[d]tia
= 0,47 Hz, 1H), 7,51-7,41 (m, 2H), 7,38 (d,J= 2,54 Hz,
(m, 2H), 6,61-6,53 (m, 2H), 4,21 (d,J= 5,89 Hz, 2H)
(Procedimiento 2): 5.278 min; Hr MS:m/z(M+H)+ (Calc iazol-2-il)bencenosulfonamida, TFA (62): 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 512,70 (s, 1H), 8,71 (d,J7.14 (d,J= 8,76 Hz, 1H), 6,96-6,78 (m, 3H), 6,76-6,62 5 (s, 3H), y 3,73 (s, 3H); tiempo de retención LC-MS para C22H22N3O5S2, 472.0995) encontrado 472.0998.
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)ammo)-M-(4-femltiazol-2-utilizando 2-bromo-4-feniltiazol; 1H RMN (400 MHz, DMS
6H), 7.08 (d,J=19,97 Hz, 1H), 6,92-6,45 (m, 6H), 4,21
MS (procedimiento 2): 5.200 min; HRMS:m/z(M+H
468.1066.
ncenosulfonamida, TFA (63): Procedimiento C: ) 58,72 (s, 1H), 7,67 (d,J=7,47 Hz, 2H), 7,53-7,24 (m, = 5,55 Hz, 2H) y 3,77 (s, 3H); tiempo de retención LC-Calculado para C23H22N304S, 468.1046) encontrado
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)ammo)-M-(3-morfolmofe
utilizando 4-(3-bromofenil)morfolina; 1H RMN (400 MHz,
7,00 (t,J=8,09 Hz, 1H), 6.82 (dd,J= 1,86, y 7,75 Hz, 2
4H), y 2,98-2,86 (m, 4H); Tiempo de retención LC-m S (
para C24H2sN3O5S, 470.1744) encontrado 470.1753.
encenosulfonamida, TFA (64): Procedimiento C: SO-d6) 5 9,70 (s, 1H), 8,72 (s, 1H), 7,46-7,34 (m, 2H), 76-6,43 (m, 7H), 4,19 (s, 2H), 3,77 (s, 3H), 3,71-3,59 (m, dimiento 2): 4.961 min; Hr Ms :m/z(M+H)+ (Calculado
ferc-butí74-(3-(4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)ammo)fe
Procedimiento C: utilizando terc-butil-4-(3-bromofenil)pip
1H), 7,46-7,28 (m, 2H), 7,08 (t,J= 7,74 Hz, 1H), 6,94-6,
5,82 Hz, 2H), 4,00 (d,J= 12,83 Hz, 2H), 3,76 (s, 3H), 2
1,31 (m, 4H); tiempo de retención LC-MS (Procedimi
C30H3sN3O6S, 568.2476) encontrado 568.2461.
fonamido)feml)piperidm-1-carboxilato (65): -1-carboxilato; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,71 (s, , 6H), 6,75-6,59 (m, 2H), 6.59-6,44 (m, 2H), 4,18 (d,J= ,50 (m, 1H), 1,62 (d,J= 12,87 Hz, 2H), 1,39 (s, 9H), y 2): 6.322 min; HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)ammo)-W-(3-(piperidmutilizando terc-butil-4-(3-bromofenil)piperidin-1-carboxila
4 M/dioxanos durante un periodo de 30 min. 1H RMN (4
J= 7,85 Hz, 1H), 6,99 (t,J=1,96 Hz, 1H), 6,93-6,77 (m,
3,77 (s, 3H), 3,33 (s, 1H), 2,95 (t,J= 12,62 Hz, 2H), 2,
MS (Procedimiento 2): 4.079 min; HRMS:m/z(M+
468.1948.
ml)bencenosulfonamida, TFA (66): Procedimiento 1C: eliminó el grupo Boctras la aminación reductora con HCl Hz, DMSO-d6) 58,73 (s, 1H), 7,53-7,24 (m, 2H), 7,12 (t, 6,73-6,61 (m, 2H), 6,57-6.48 (m, 2H), 4,33-4,01 (m, 2H), 5 (m, 1H), y 1,94-1,43 (m, 4H); tiempo de retención LC-Calculado para C25H30n4o 4S, 468.1952) encontrado
4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N (3-isopropilf
utilizando 1-bromo-3-isopropilbenceno; 1H RMN (400 M
7,07 (t,J= 7,77 Hz, 1H), 6,98-6,75 (m, 4H), 6,73-6.61 (
3H), 2,72 (h,J= 6,82 Hz, 1H), y 1,07 (dd,J= 0,91, y
6.040 min; HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para C23H27 encenosulfonamida, TFA (67): Procedimiento C: MSO-d6) 59,73 (s, 1H), 8,70 (s, 1H), 7,42-7,32 (m, 2H), ), 6,58-6,45 (m, 2H), 4,18 (s, 2H), 3,76 (d,J= 0,87 Hz, z, 6H); Tiempo de retención LC-MS (Procedimiento 2): S, 427.1686) encontrado 427.1680.
M-(6-fluorobenzo[d]tiazol-2-il)-4-((2-hidroxi-3-metoxi
Procedimiento C: utilizando 2-bromo-6-fluorobenzo[d]tia
= 2,43, y 8,51 Hz, 1H), 7,54-7,39 (m, 2H), 7,19 (qd,J=
J= 1,71, y 7,87 Hz, 1H), 6,74-6,63 (m, 2H), 6,60-6,54
retención LC-MS (Procedimiento 2): 5.164 min;<h>R<m>
encontrado 460.0797.
l)ammo) bencenosulfonamida, TFA (68): H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,72 (s, 1H), 7,69 (dd,J8,25, y 8.85 Hz, 3H), 6,88 (t,J=5,68 Hz, 1H), 6,81 (dd, H), 4,21 (d,J= 5,90 Hz, 2H), y 3,76 (s, 3H); tiempo de (M+H)+ (Calculado para C2iH19FN3O4S2, 460.0796)
4-(3-cloro-2-hidroxibencilamino)-N-fenilbencenosulf hidroxibenzaldehído y bromobenceno; 1H RMN (400 M
7,28-7.14 (m, 3H), 7,11-7,01 (m, 3H), 7,01-6,88 (m, 2H)
2H); tiempo de retención LC-M<s>(procedimiento 2): 5.4
389.0721) encontrado 389.0702. Compuesto proporcio ida, TFA (69): Procedimiento C: utilizando 3-cloro-2-MSO-d6) 59,88 (s, 1H), 9,38 (s, 1H), 7,47-7,34 (m, 2H), (t,J=7,78 Hz, 1H), 6,60-6,50 (m, 2H), y 4,29-4,23 (m, ; HRMS:m/z(M+<h>)+ (Calculado para C1gH1sClN2o3S, on fines ilustrativos.
4-(3-cloro-2-hidroxibencilammo)-M-(naftalen-1-il)ben
naftalen-1-amina y 3-cloro-2-hidroxibenzaldehído; 1H R
J=1,20, y 8,53 Hz, 1H), 7,90-7,80 (m, 1H), 7,70 (d,J=sulfonamida, TFA (70): Procedimiento D: utilizando 00 MHz, DMSO-d6) 59,75 (s, 1H), 9.36 (s, 1H), 8,03 (dd, z, 1H), 7,54-7,28 (m, 3H), 7,23 (dd,J=1.58, y 8,01 Hz,1H), 7,15 (dd,J =1,08, y 7,40 Hz, 1H), 7,02 (dd,J =1,5
Hz, 1H), 6,57-6,42 (m, 2H), y 4,24 (d,J= 4,97 Hz, 2H);
HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para C23H20CIN2O3S,
con fines ilustrativos.
7,65 Hz, 1H), 6,90 (t,J= 5.82 Hz, 1H), 6,78 (t,J = 7,79mpo de retención LC-MS (Procedimiento 1): 2.755 min; 878) encontrado 439.0862. Compuesto proporcionado
M-(benzo[d]tiazol-2-il)-4-(3-cloro-2-hidroxibencilamm
utilizando 3-cloro-2-hidroxibenzaldehído y 2-bromobenzo
1H), 7,80-7,69 (m, 1H), 7,59-7,46 (m, 2H), 7,35 (ddd,J
1H), 6,95 (t,J= 5,93 Hz, 1H), 6,78 (t,J= 7,79 Hz, 1H
retención Lc -MS (procedimiento 2): 5.258 min; HRMS:
encontrado 446.0379. Compuesto proporcionado con fin ncenosulfonamida, TFA (71): Procedimiento C: l; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 512,88 (s, 1H), 9,38 (s, 4, 7.44 y 8,26 Hz, 1H), 7,31-7,13 (m, 3H), 7,12-7,02 (m, 9-6,52 (m, 2H) y 4,28 (d,J= 5,72 Hz, 2H); tiempo de (M+H)+ (Calculado para C20H17CIN3O3S2 , 446.0390) strativos.
4-(3-cloro-2-hidroxibencilammo)-M-(naftalen-2-il)benc
naftalen-2-amina y 3-cloro-2-hidroxibenzaldehído; tiemp
m/z(M+H)+ (Calculado para C23H20ClN2O3S, 439.0878
ilustrativos.
sulfonamida, TFA (72): Procedimiento D: utilizando retención LC-MS (Procedimiento 1): 2.637 min; HRMS: contrado 439.0867. Compuesto proporcionado con fines
M-([1,T-bifeml]-4-il)-4-((3-cloro-2-hidroxibencil)ammo)
utilizando bifenil-4-amina y 3-cloro-2-hidroxibenzaldehído
7,61-7,36 (m, 9H), 7.35-7,04 (m, 5H), 6,97 (t,J= 5,8 Hz,
= 5,7 Hz, 2H); tiempo de retención LC-MS (procedim
C25H22CIN2<o>3<s>, 465.1034) encontrado 465.1021. Comp cenosulfonamida, TFA (73): Procedimiento D: RMN (400 MHz, DMSO-CÍ6) 510,03 (s, 1H), 9,37 (s, 1H), , 6,78 (t,J= 7,8 Hz, 1H), 6,62-6,52 (m, 2H), y 4,26 (d,J2): 6.592 min; HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para to proporcionado con fines ilustrativos.
4-(3-cloro-2-hidroxibencilamino)-N-(isoquinolin-8-il)b
3-cloro-2-hidroxibenzaldehído y 8-bromoisoquinolina; 1H
Hz, 1H),8,09 (d,J=6,0 Hz, 1H), 7,99-7.71 (m, 2H), 7,46-1H), 6,78 (t,J= 7,8 Hz, 1H), 6,64-6,39 (m, 2H), y 4,24 (
min; Hr MS:m/z(M+H)+ (Calculado para C22H19
proporcionado con fines ilustrativos.
nosulfonamida, TFA (74): Procedimiento C: utilizando N (400 MHz, DMSO-CÍ6) 59,60 (s, 1H), 8,55 (d,J= 6,0 (m, 3H), 7,23 (dd,J= 1,6, y 7,9 Hz, 1H), 7,11-6,93 (m, ); tiempo de retención LC-MS (Procedimiento 1): 1.669 O3S, 440.0830) encontrado 440.0811. Compuesto
4-(3-cloro-2-hidroxibencilammo)-M-(qumolm-3-il)benc
cloro-2-hidroxibenzaldehído y 3-bromoquinolina; tiempo sulfonamida, TFA (75): Procedimiento C: utilizando 3-retención LC-MS (Procedimiento 1): 2.346 min; HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para C22H19ClN3O3S, 440.083
ilustrativos.
ontrado 440.0824. Compuesto proporcionado con fines
4-(3-cloro-2-hidroxibencilammo)-N-(4-(piperidm-4-il)f
utilizando ferc-buf/M-(4-aminofenil)piperidin-1-carboxila
tras la aminación reductora con HCl 4 M en dioxano du
9,71 (s, 1H), 7,87-7,59 (m, 2H), 7,57 (dd,J= 1,64, y 7,9
2H), 4,59 (d,J= 5.77 Hz, 2H), 3,64 (s, 2H), 3,27 (t,J=
1,98 (qd,J= 4,00, y 13,16 Hz, 2H); tiempo de retenci
(Calculado para C23H2qCIN203S, 472.1456) encontrad encenosulfonamida, TFA (76): Procedimiento D: -cloro-2-hidroxibenzaldehído. El grupo Boc se eliminó 30 min. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 10,20 (s, 1H), 1H), 7,48-7,15 (m, 6H), 7,21-7,02 (m, 1H), 6,96-6,69 (m, Hz, 3H), 3,10-2,93 (m, 1H), 2,18 (d,J=13,73 Hz, 2H), y -MS (Procedimiento 1): 2.884 min; HRMS:m/z(M+H)+ 1442. Compuesto proporcionado con fines ilustrativos.
4-(4-bromo-2-hidroxibencilammo)-N-fen/7bencenosu
hidroxibenzaldehído y bencilamina; 1H RMN (400 MHz,
7,28-7,12 (m, 2H), 7,12-6,78 (m, 7H), 6,63-6,41 (m,
(Procedimiento 2): 5.501 min; Hr MS: m/z (M+H)+ (Calc
Compuesto proporcionado con fines ilustrativos.
/da, TFA (77): Procedimiento D: utilizando 4-bromo-2-O-d6) 5 10,09 (s, 1H), 9,85 (s, 1H), 7,52-7.28 (m, 2H), ,12 (d,J=2,80 Hz, 2H); Tiempo de retención LC-MS para C1gH1sBrN2o3s, 434.0246) encontrado 434.0239.
4-(4-bromo-2-hidroxibencilamino)-N-(naftalen-1-il)be
amino-naftaleno y 4-bromo-2-hidroxibenzaldehído; 1H
(s, 1H), 8,03 (dd,J= 1,23, y 8,56 Hz, 1H), 7,87-7,80 (
8,11 Hz, 1H), 7,41-7,28 (m, 4H), 7,17-7,09 (m, 1H), 7,0
2H); tiempo de retención LC-<m>S (procedimiento 2): 6.2
483.0373) encontrado 483.0367. Compuesto proporcio osulfonamida (78): Procedimiento D: utilizando 1-400 MHz, DMsO-d6) 5 10,09 (d,J= 1,50 Hz, 1H), 9,74 , 7.70 (dd,J= 8,24 Hz, 1H), 7,45 (ddd,J= 1,23, 6,81 y (m, 2H), 6,92-6,81 (m, 2H), 6,53-6,42 (m, 2H)y 4,12 (s, ; HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para C23H20BrN2o3S, on fines ilustrativos.
7V-(benzo[d]tiazol-2-il)-4-(4-bromo-2-hidroxibencila
utilizando 2-aminobenzotiazol y 4-bromo-2-hidroxibenza
(s, 1H), 8,07-7,95 (m, 1H), 7,85-7,68 (m, 2H), 7.62 (dd
(m, 5H), 6,93-6,67 (m, 2H) y 4,43 (d,J= 5,75 Hz, 2H
HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para C2üH17BrN3O3S2
con fines ilustrativos.
encenosulfonamida, TFA (79): Procedimiento D: o; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 513,15 (s, 1H), 10,38 1,22, 7,36 y 8,30 Hz, 1H), 7,54-7,40 (m, 2H), 7,37-7,04 po de retención LC-MS (procedimiento 1): 2.505 min; 9869) encontrado 491.9855. Compuesto proporcionado
4-(4-bromo-2-hidroxibencilamino)-N-(quinolin-3-il)be
amino-quinolina y 4-bromo-2-hidroxibenzaldehído; 1H R
(s, 1H), 8,59 (d,J= 2,6 Hz, 1H), 7,94-7,83 (m, 3H), 7.61
2H), 6,85 (dt,J= 2,11, y 8,10 Hz, 1H), 6,53 (dd,J= 2,2
(Procedimiento 1): 2.166 min; HRMS:m/z(M+<h>)+ (Calcu
Compuesto proporcionado con fines ilustrativos.
osulfonamida, TFA (80): Procedimiento D: utilizando 3-400 MHz, DMSO-d6) 5 10,41 (d,J= 2,1 Hz, 1H), 10,08 = 2,43, y 6,74 Hz, 1H), 7,59-7,41 (m, 3H), 7,01-6,88 (m, ,01 Hz, 2H), y 4,10 (s, 2H); tiempo de retención LC-MS para C22H19BrN3O3S, 485.0355) encontrado 485.0331.
4-(4-bromo-2-hidroxibencilammo)-M-(naftalen-2-il)be
amino-naftaleno y 4-bromo-2-hidroxibenzaldehído; 1H R
7,66 (m, 3H), 7,51-7.30 (m, 5H), 7,25 (dd,J=2,19, y 8,81
2H), y 4,09 (d,J= 2,95 Hz, 2h ); Tiempo de retención
(Calculado para C23H20BrN2O3S, 483.0373) encontrado osulfonamida, TFA (81): Procedimiento D: utilizando 2-400 MHz, DMSO-d6) 510,09 (s, 1H), 10,07 (s, 1H), 7,79 1H), 7,00-6,92 (m, 2H), 6,91-6,81 (m, 2H), 6,61-6,25 (m, MS (Procedimiento 1): 2.856 min; HRm S:m/z(M+H)+ .0372. Compuesto proporcionado con fines ilustrativos.
M-([1,1'-bifeml]-4-il)-4-((4-bromo-2-hidroxibencil)amm
utilizando 4-amino-bifenilo y 4-bromo-2-hidroxibenzalde
1H), 7,61-7,36 (m, 8H), 7.35-7,04 (m, 5H), 6,97 (t,J= 5,
J= 5,7 Hz, 2H); tiempo de retención LC-MS (procedi
C25H22BrN2O3S, 510.0560) encontrado 510.0549. Com ncenosulfonamida, TFA (82): Procedimiento D: 1H RMN (400 MHz, DMSO-CÍ6) 510,03 (s, 1H), 9,37 (s, 1H), 6,78 (t,J= 7,8 Hz, 1H), 6,62-6,52 (m, 2H), 4,26 (d, to 2): 6.592 min; HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para to proporcionado con fines ilustrativos.
4-(4-bromo-2-hidroxibencilammo)-M-(qumolm-8-il)be
amino-isoquinolina y 4-bromo-2-hidroxibenzaldehído; ti
HRMS:m/z(M+H)+ (Calculado para C22H19BrN3O3S, 48
fines ilustrativos.
Se llevaron a cabo exploraciones sistemáticas de la R
Tablas 1-3. Como se muestra en la Tabla 1, la eliminació
2-OH (10) provocó una pérdida completa de la activi
(compuestos 11-12) o su sustitución por una amina (co
de la 12-LOX. Una sustitución bioisostérica de la fracc
derivado 2,3-dicloro (18) tuvo una actividad comparable
una actividad comparable, mientras que el 3-Fluoro y el
~2,5 veces menos activos, respectivamente. Un resulta
observada para los derivados 4-bromo(22, IC50 = 2,2 ^
metoxi (28) presentaron una actividad reducida en com
actividad y la posición 3 es la más óptima para el grup
sustituirse por un grupo cloro (19) y el 4-Bromo (22)
compuesto 1.
osulfonamida, TFA (83): Procedimiento D: utilizando 8-o de retención LC-M<s>(Procedimiento 1): 2.524 min; 5) encontrado 485.0345. Compuesto proporcionado con
ón Estructura-Actividad (SAR) como se muestra en las los grupos fenólicos (8), del grupo 3-OMe (9) o del grupo La protección de la fracción 2-OH como éter metílico stos 13 y 15) también anuló toda la actividad inhibidora de catecol por un indol(17) también resultó inactiva. El el compuesto 1. Además, el 3-Cl (19, IC50 = 6,1 ^M) tuvo romo (20, IC50 = 19 ^M y 21, IC50 = 13 ^M) fueron ~4 a teresante e inesperado fue la actividad 2 veces superior 4-cloro (27). Otros derivados 4-sustituidos como el 4-ión con el compuesto 1. El 2-OH era importante para la etoxi. Este SAR preliminar sugirió que el 3-OMe podría teniendo una actividad comparable, si no mejorada, al. , -
Ċ
El siguiente perfil SAR se centró en la modificación del
introducidos en esta región de la molécula dieron lugar a
de tiazol por un 2-benzotiazol (35, ML355) dio lugar a un
la selectividad. El benzoxazol (36) y el bencimidazol (37) p
de un grupo metilo en la posición 4 del anillo benzotiazol
^M). La potencia contra la 12-LOX también mejoró más d
pero los derivados de tiazol/isoxazol sustituidos (40-43) n
caso del derivado fenílico (48),
(IC50 = 0,5 ^M). En general, los compuestos arom
heteroaromáticos [3-quinolina (46), 8-isoquinolina (47), 2-mejor potencia que el derivado de tiazol (1). En un es
solubilizante, se sintetizaron algunos derivados fenílico
posiciones alrededor del anillo arilo (53-55). Aunque esto
en comparación con los mejores activos (por ejemplo, la
Muchos de estos análogos también se probaron para act
selectividad. Estos compuestos se probaron inicialmente
determinó una IC50 sólo para los compuestos de interés.
un benzotiazol y sus derivados mantenían la selectividad
(62) y 20-(68). La relación de selectividad 15-LOX/12-LO
un benzoxazol (36), un bencimidazol (37) y un fenilo sustit
relación de selectividad de 15. Se observó una amplia g
estructuras comparables, que iban desde la inhibición casi
mínima (por ejemplo, 55, 58 y 66). El dramático efecto so
de la molécula, sugiere que la parte inferior del sitio a
demostrado anteriormente que controla la especificidad d po tiazol como se muestra en la Tabla 2. Los cambios álogos de mayor potencia. La sustitución de la molécula ejora de 18 veces en la actividad 12-LOX, manteniendo eían una actividad de buena a excelente, y la introducción ), mantenía una excelente actividad 12-LOX (IC50 = 0,24 0 veces cuando el tiazol se sustituyó por un tiofeno (38), ostraron este aumento de potencia. Este fue también el io, que tuvo una potente actividad contra la 12-LOX cos mayores [1-naftaleno (49) y 2-naftaleno (50)] y dina (58) y 3-piridina (59)] fueron bien tolerados y tuvieron rzo por mejorar la solubilidad añadiendo funcionalidad ustituidos con una fracción de piperazina en diferentes ambios fueron tolerados, tuvieron una actividad reducida rada 35, ML355).
ad contra 15-LOX-1 para asegurar que se mantuviera la nte a 15-LOX-1 a una única concentración (25 ^M) y se tos estudios demostraron que la sustitución del tiazol por n proporciones 15/12-LOX de 29 veces (35), 18-(39), 19-ejoró a más de 100 con la conversión del benzotiazol en o porm-iPr(67). La sustitución fenílica (48) sólo tuvo una a de selectividad a pesar de que los compuestos tenían mpleta de 15-LOX-1 (por ejemplo, 38 y 62) a la inhibición la selectividad entre 12-LOX y 15-LOX-1 en esta porción o de la LOX está implicada en la unión, ya que se ha sustrato.
Tabla 2. inhibición de 12 de los análogos 35,68a
35 2 -b e n z o t ia z o l
36 2 -b e n z o x a z o l
37 2 -b e n z im id a z o l
38 2 -tio fen o
39 4 - M e - 2 - b e n z o t ia z o l
40 4 -M e -2 - t ia z o l
41 5 -M e -2 - t ia z o l
42 5 -P h - 2 - t ia z o l
43 4 ,5 -M e -2 - t ia z o l
44 5 -M e -3 - is o x a z o l
45 3 -O M e -P h
46 3 - q u in o l in a
47 8 - i s o q u in o l in a
48 P h
49 1 -n a f ta len o
50 2 -n a f ta le n o
51 1 ,4 -b i-P h
52 1 ,3 -b i-P h
53 3 - p ip e ra z in -P h
544 - p ip e r a z in - P h
554 - p ip e r id in - P h
564 - p ip e r a z in - 3 - p i r
576 - m e th y l - 3 - p i r
582- p i r
593 -p i r
602- p i r im id i n a
613 - ‘B u - P h
626 - O M e - 2 - b e n z o t i a z o l
634 - P h - 2 - t i a z o l
643 -m o rfo lin -P h
6547 V -b o c -p ip e r id in -3 -P h
663 -p ip e r id in - P h
673 - /P r - P h
686 - F - 2 - b e n z o t i a z o l
aLos valores de IC50 representan la concentración inhibit
UV-vis por triplicado.
bRepresenta la inhibición a 25 pM.
[0.04 ] 9.7 [0.1 ]
[0.1 ] >100
[0.04 ] > 70
[0.02 ] 100
[0.01 ] 0.69 [0.1 )
[0.2 ] 14
[0 ,4 ] 75
% b 77
[0.3 ] 3 7
[1.2 ]
% b 73
[0 ,1 ] 77
[0.2 ] 70
[0.05 ] 7.6 [1.0 ]
[0.06 ] 73
[0.05 ] 54
[0.2 ] 6 0
% b 70
[0.5 ] 31
[2.7 ]
[0 .6 ] 8
[0 .6 ] 12
[0 .5 ] 18
[0 .5 ] 3
[0 .5 ]
[1.0 ]
9 [0 .8 ] 66
6 [0 .3 ] 5.1 [0.6 ]
[0 .03 ] 87
[0 .3 ] 50
[0 .05 ] 34
[0 .3 ] 4 .7
[0 .02 ] >100
[0 .05 ) 4.5 [0.4 )
emimáxima (50 %) determinada en el ensayo con cubetaComo se ha indicado anteriormente (Tabla 1), la sustitu
fenol (19) o un 4-bromo-2-fenol (22) dio lugar a una pot
respectivamente. Estos grupos se combinaron con algu
de los esfuerzos iniciales de SAR (véase la Tabla 3, co
la potencia y, en casi todos los casos, habían redu
proporcionó la mejor actividad tanto con el 3-cloro-2-fen
1,7 pM), aunque el derivado de 1-naftaleno 78 tuvo una
Tabla 3. inhibición de 1 n de la porción "derecha" de la molécula por un 3-cloro-2-ia comparable a la de 1 con valores deIC50 de 6,2 y 2,2 pM de los derivados de sulfonamida descubiertos como parte estos 69-83). Ninguno de los compuestos había mejorado la actividad. En general, la molécula de 2-benzotiazol (71; IC50 = 1,6 pM) como con el 4-bromo-2-fenol (79;IC50 = tencia comparable (IC50 = 1,3 pM).
OX de los análogos 69-83a
75 3jquinolina 5
76 4-piperidin-Ph 6
77 Ph 2
78 1-naftaleno
79 2-benzotiazole
80 3jquinolina 2
81 2-naftaleno 2
82 4-bi-Ph 2
83 8-quinolina 5
aLos valores de IC50 representan la concentración inhibit
UV-vis por triplicado.
bRepresenta la inhibición a 25 pM.
Se realizaron estudios adicionales centrados en la select
humanas (5-LOXy 15-LOX-2). Además, los compuesto
2. Como se muestra en la Tabla 4, no hubo una inhibició
con excepción del ML355 que tiene una potencia m
compuestos descritos en la bibliografía han alcanzado
frente a otras isozimas.
Tabla 4. Selectividad y actividad redox deanálogosrepr
[0.7] 58
[3.0] 4
[0.4] 82
[0.3] 83
[0.8] 100
[0.5] 74
[0.3] 78
[0.4] 80
[2.0] 55
semimáxima (50 %) determinada en el ensayo con cubeta
ad de los análogos(35,36 y 37) contra otras isozimas LOX probaron contra la ciclooxigenasa-1 (COX-1) y/o la COX-ignificativa contra ninguna de estas enzimas relacionadas, sta (29 veces menos activo) hacia la 15-LOX-1. Pocos to la potencia nM frente a la 12-LOX como la selectividad
ntativosa
Se sabe que los inhibidores de LOX exhiben una vari
pseudoperoxidasa UV se utiliza para investigar si la inhi
y 36 con 12-LOX y no se observó degradación del pr
inhibitorio no reductor (Tabla 4). Para investigar más a
estado estacionario utilizando 35 y 36 mediante la mo
concentración de sustrato e inhibidor en presencia de
i/Vmaxfrente a la concentración de inhibidor produjero
igual a 0,35 ± 0,08 pM para 35 y 0,53 ± 0,2 pM para 36,
a 0,72 ±0,1 pM para 35 y 0,62 ±0,1 pM para 36, a part
35 como para 36 se correlacionan con sus valores IC
mixtos, que es una propiedad común de los inhibidores
Se exploró la actividad de ML355 en sistemas celulare
se ha relacionado con la activación plaquetaria, que de
primaria y la trombosis arterial. En consecuencia, si no
formación excesiva de coágulos que conduce a aco
miocardio y el ictus. Estudios anteriores han demostrad
medida tras la estimulación del receptor activado por pro
Además, el metabolito bioactivo de la 12-LOX (12-HE
araquidónico (AA) y la reducción por las peroxidasas,
Por lo tanto, el tratamiento de las plaquetas humanas i
de 12-LOX atenúa la agregación plaquetaria de form
plaquetas humanas lavadas (1 * 106 plaquetas/ml)
concentraciones crecientes de ML355 (Figura 2A). La
de ML355 . El calcio se midió en tiempo real utilizando u
por triplicado. Además, la agregación plaquetaria de pla
utilizando un Chronolog Lumi-Aggregometer (modelo 7
pM de ML355 no inhibieron la agregación plaquetari
plaquetaria en plaquetas humanas lavadas. Los resulta
significativamente la agregación plaquetaria inducida
desempeña un papel en la movilización del calcio en la
una reducción de la concentración de calcio libre en la pl
con 200 pM de PAR4-AP y se midió el calcio libre en la
concentraciones de ML355 (Figura 2A). Estos datos d
ML355 la movilización de calcio se reduce significativa
completa de la movilización de calcio que ocurre a ~5
superior (compuesto 36) mostrado en la Figura 8.
También se evaluó la capacidad del ML355 para inhibir l
diabética. Como se ha comentado anteriormente, la 12
metabólico, el 12-HETE, está implicado en la muerte c
que el 12('S)-HETE reduce la actividad metabólica, inh
muerte celular en los islotes humanos. El ML355 se pr
como en islotes donantes primarios humanos para det
inducida por AA/ionóforo de calcio. El ML355 fue capaz
IC50 aproximado de 1 pM, medido por ELISA (Figura 3 de mecanismos inhibitorios; por lo tanto, el ensayo de es de naturaleza reductora. El ensayo se realizó en 35 hidroperóxido a 234 nm, lo que indica un mecanismo el mecanismo de inhibición, se realizó una cinética en zación de la formación de 12-HPETE en función de la de Triton X-100. Las representaciones deKm/Vmaxy dencias lineales tanto para 35 como para 36. LaKifue ir de los gráficosKm/Vmax(Figuras 4 y 6). ElKi'fue igual los gráficosi/Vmax(Figuras 5 y 7). Los datos tanto para bla 2) e indican que ambas moléculas son inhibidores -LOX y 15-LOX-1 en general.
vantes. Como se ha señalado anteriormente, la 12-LOX eña un papel central en la regulación de la hemostasia sigue atenuar la activación plaquetaria, se produce una ientos cardiovasculares adversos como el infarto de la 12-LOX en las plaquetas humanas se activa en gran -4 (PAR4) por el péptido activador del PAR4 (PAR4-AP). resultante de la oxidación estereoespecífica del ácido stra efectos protrombóticos en las plaquetas humanas. das por PAR4-AP con una pequeña molécula inhibidora endiente de la dosis. Para confirmarlo, se estimularon 200 pM de PAR4-AP en ausencia o presencia de zación de calcio disminuyó al aumentar la concentración metro de flujo C6 Accuri. Los experimentos se realizaron s humanas (3 * 108 plaquetas/ml) se midió en tiempo real ras la adición de PAR4-AP (Figura 2B). Mientras que 10 pM de ML355 inhibieron en un 80 % la agregación la Figura 2B muestran que, de hecho, el ML355 reduce AR4-AP Además, se ha demostrado que la 12-LOX quetas humanas y la inhibición de la 12-LOX conduce a a. Para estudiar esto, se estimularon plaquetas humanas eta, utilizando un citómetro de flujo C6 Accuri con varias tran que a concentraciones tan bajas como 250 nM de (medido como cambio de pliegue), con una inhibición Se obtuvieron resultados comparables con otro activo
OX en modelos celulares relevantes para la enfermedad se expresa en las células p pancreáticas y su producto inducida por citocinas. En concreto, se ha demostrado secreción de insulina y, en última instancia, induce la nto en una línea de células p derivada de ratón (BTC3) ar su capacidad de inhibir la estimulación de 12-HETE hibir potentemente la 12-HETE en células BTC3 con un da la dificultad de obtener islotes humanos primarios apartir de tejidos donados, la actividad en islotes humanos
en la Figura 3B demuestran una inhibición significativa d
de ML355. Se obtuvieron resultados comparables con ot
Células beta de ratón (BTC3) fueron tratadas con ácid
presencia de ML355 (Figura 3A). En el gráfico se muest
los detectados en las células estimuladas únicamente co
(por encima del control/no estimulado) de 12-HETE en is
araquidónico e ionóforo de calcio (AA/IONO) solos o en p
ELISA. En la Figura 3C, el gráfico representa los niveles d
se trataron con ácido araquidónico e ionóforo de calcio (
del compuesto 35 o 36. Los datos graficados en la figur
datos graficado realizado por triplicado. Estos datos s
distintas, cada una de ellas realizada con preparacio
graficados son la media ± SEM, n=3. Las barras de error
Las Figuras 3D y 3E muestran resultados de la secreci
islotes de donantes humanos en respuesta a 3 mM de gl
(no tratados). Los islotes se incubaron con citoquinas (T
y los compuestos 35 o 36. Las figuras 3D y 3E represen
islotes de donantes humanos. Los compuestos 35 o
estimulada por glucosa mediante citocinas .
Aunque los datos anteriores demuestran actividad en m
el uso potencial de ML355 en modelos animales de pru
vitroy PKin vivo. Estos datos se resumen en las Tabla
estabilidad microsomal tanto en rata (T1/2 >30 minutos)
plasma de ratón durante un periodo de 2 horas (100 % r
tampones acuosos (pH 2-9) y fue estable a 5 mM de
suplementaria S5). Se observa una mejor solubilidad en e
de benzoxazol (36) tiene una solubilidad mucho mejor e
menor frente a la 12-LOX.
ealizó a una concentración única. Los datos presentados producción de 12-HETE inducida por AA/ION<o>, a 10 pM ctivo superior (compuesto 36) mostrado en la Figura 9.
aquidónico e ionóforo de calcio (AA/IONO) solos o en los niveles de 12-HETE expresados como porcentaje de /IONO. En la Figura 3B, el gráfico representa el aumento humanos de donantes primarios estimulados con ácido ncia de 10 pM de ML355. el 12-HETE se midió mediante -HETE detectados cuando los islotes donantes humanos NO) solos o en presencia de diferentes concentraciones son un experimento representativo con cada punto de epresentativos de tres determinaciones experimentales distintas de islotes de donantes humanos. Los datos algunos puntos están enmascaradas por el símbolo.
e insulina estimulada por glucosa en preparaciones de a (Baja) o 18 mM de glucosa (Alta) para islotes de control IL-1p, IFNy ) y los islotes se coincubaron con citoquinas los resultados obtenidos en diferentes preparaciones de hiben el desacoplamiento de la secreción de insulina
s celulares relevantes para la enfermedad, para validar e concepto, se determinaron sus propiedades ADMEin6, respectivamente. El ML355 demostró una excelente o en ratón (T1/2 >300 minutos) y resultó ser estable en te). Además, el ML355 no mostró degradación en varios atión, lo que sugiere una excelente estabilidad (Figura pón de ensayo (análisis cualitativo). Además, el derivado pón (>10 veces), aunque con una potencia ligeramente
El ML355 mostró una permeabilidad celular moderada en
para la Pgp dada la relación de eflujo de <2. También se
(Tabla 6). Los estudios exploratorios de f (DMSO:Solutol:PEG400:agua; 5/10/20/65 v/v/v/v) en el
y PO (30 mpk). Estos estudios demuestran que el ML35
moderada (T1/2 = 2,9 horas). Con una dosis de 30 mpk,
vitroy se mantiene por encima del valor IC50 durante má
ml/min/kg) y una buena exposición global (AUCinf) de 3
bajo pero sugiere una distribución razonable entre el te
(metabolismo de fase I) y, sin embargo, la modesta T1/2in
(metabolismo de fase II), lo que daría lugar a un aclara
cofactor UDPGAen lugar de NADPH condujo a unT1/2
además que el entorno estéricamente obstaculizado
glucuronidación, pero estos datos sugieren lo contr
glucuronidación consiste en introducir grupos que retire
esta estrategia se sintetizó el análogo 71 (2-OH, 3-Cl), s
Además de introducir en el anillo otros grupos que retir
fenólico mediante un enfoque pro-fármaco. Lo ideal
convertirse en fenol libre, después de haber superado
con éxito en varios medicamentos comercializados, qu
Clement B.; Testa, B. Lecciones aprendidas de profárma
47, 2393-2404.)
Como se ha indicado anteriormente, los inhibidores de la
nor-dihidroguairetico (NDGA), los "bromo-fenoles" o lo
potentes y selectivos, sino que tampoco son fácilmente
de la 12-LOX descrito anteriormente(ML127) muestra u
pero se observó que presentaba un SAR plano estrec
posterior. Se descubrió un nuevo quimiotipo estructuralm
y que posee un andamiaje similar a un fármaco. ML355,
(<500 nM) inhibición hacia 12-LOXy una excelente selec
LOX-2, COX 1/2). Esta serie se adapta fácilmente a modi
El ML355 presenta un perfil ADMEin vitroy PKin vivof
enfermedades, como la trombosis (agregación plaqueta
HETE en las células p).
Reactivos biológicos: Todos los ácidos grasos comer
nuevo utilizando una columna C-18 Higgins HAIsil Semi
de MeOH y 0,1 % de ácido acético; la solución B era 99,
de 85 % A: se utilizó 15 % B para purificar todos los ácid
de 6 meses.
Plaquetas humanas: Se obtuvieron plaquetas human
Thomas Jefferson y del área de Filadelfia. Estos estudio
la Universidad Thomas Jefferson, y se obtuvo el consenti
de sangre. La sangre se centrifugó a 200 g durante 13
transfirió a un tubo cónico que contenía una solución de
mM de citrato sódico y 135 mM de glucosa, pH 7,4) y se
Las plaquetas se resuspendieron en tampón Tyrode (12
mM MgCl2, 5 mM glucosa y 10 mM HEPE<s>), y la concent
el recuento con un contador de partículas ZI Coulter (B nsayo Caco-2 (1,5 * 10'6 cm/s) y no parece ser un sustrato loraron las propiedades PKin vivo(ratón) de la molécula ulación condujeron a un vehículo apropiado el ML355 se administró como solución por vía IV (3 mpk) biodisponible por vía oral (%F = ~20), con una semivida L355 alcanza una Cmax de más de 135 veces el IC50in12 horas. El compuesto tiene un aclaramiento bajo (3,4 . El volumen de distribución (Vd) es de 0,55 L/kg, que es y la sangre. Dada la estabilidad microsómica favorableo, se pensó que la fracción fenólica podría glucuronidarse nto superior al previsto. De hecho, la incubación con el 8 minutos (frente a >30 minutos con NADPH). Se creía l 2-OH posiblemente impediría que se produjera la Otra estrategia que se ha utilizado para evitar la ctrones junto a la fracción fenólica de interés. Utilizando mbargo, esto no cambió la velocidad de glucuronidación. lectrones, otro enfoque consiste en modificar el hidroxilo a que el profármaco se hidrolizara lentamente hasta etabolismo de primer paso. Este enfoque se ha utilizado ntienen grupos fenólicos. (Ettmayer, P.; Amidon, G. L.; comercializados y en investigación. J. Med. Chem. 2004,
LOX previamente descritos, como la baicaleína y el ácido erivados de pirazol" (ver Figura 1) no sólo son menos ificables para una mayor optimización. Nuestro inhibidor otente inhibición (<500 nM) y una excelente selectividad, por lo que ofrecía pocas posibilidades de modificación distinto de todos los inhibidores descritos anteriormente álogos superiores relacionados demuestran una potente ad frente a enzimas relacionadas (15-LOX-1, 5-LOX, 15-iones estructurales y muestra un SAR claro y manejable. able con actividad en sistemas celulares relevantes para movilización de calcio) y la diabetes (reducción de 12-
s (Sigma-Aldrich Chemical Company) se purificaron de parative (5 pm, 250 * 10mm). La solución Aera 99,9 % de H2Oy 0,1 % de ácido acético. Una elución isocrática rasos, que se almacenaron a -80 °C durante un máximo
e voluntarios sanos de la comunidad de la Universidad eron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de to informado de todos los donantes antes de la extracción a temperatura ambiente. El plasma rico en plaquetas se ato ácido y dextrosa al 10 % (39 mM de ácido cítrico, 75 trifugó a 2000 g durante 15 min a temperatura ambiente. NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 ón final de plaquetas se ajustó a 3 * 108 plaquetas/mLtras an Coulter, Fullerton, CA). Los resultados comunicadosson los datos obtenidos utilizando plaquetas de al meno
a las concentraciones indicadas en las figuras y en las l
Sobreexpresión y purificación de la 12-lipoxigenasa
de ratón y las 15-lipoxigenasas humanas: La 12-lipo
reticulocitaria humana (15-LOX-1) y la 15-lipoxigenasamarcadas N-terminalmente con His6 y se purificaron c
SDS-PAGE. La 5-lipoxigenasa humana se expresó como
cruda de sulfato de amonio, tal y como se publicó anteri
un espectrómetro de masas de plasma acoplado induc
patrón interno. Las concentraciones de hierro se comp
para normalizar las concentraciones de enzimas.
Materiales de cribado de alto rendimiento: El dimetils
que el sulfato amónico ferroso, el naranja de xilenol (XO
Aldrich.
Ensayo qHTS de 12-lipoxigenasa (AID: 1452): Todas l
totalmente integrado (Kalypsys Inc, San Diego, CA). (Ing
11478.) Se dispensaron 3 pl de enzima (aproximadament
Greiner negras de fondo transparente de 1536 pocillo
mediante Kalypsys PinTool equipado con una matriz
temperatura ambiente y, a continuación, se añadió una al
final de ácido araquidónico) para iniciar la reacción. La
FeXO (concentraciones finales de 200 pM de naranja d
sulfúrico 50 mM). Tras un centrifugado corto (1000 rpm,
durante 30 minutos. Las absorbancias a 405 y 573 nm
rendimiento ViewLux (Perkin-Elmer, Waltham, MA) util
Durante la dispensación, los frascos de enzima y sustr
recirculación a 4 °C para minimizar la degradación. S
soluciones de compuestos) aproximadamente cada 5
tendencia sistemática en la señal del ensayo asociada c
de la actividad específica de la enzima. Los datos se
correcciones de datos basadas en placas para filtrar el
detalles sobre el análisis de los datos.
Ensayo UV-Vis de lipoxigenasa: Los compuestos in
concentración a 25 pM en un espectrofotómetro Perki
determinó comparando las velocidades enzimáticas d
siguiendo la formación del producto dieno conjugado
añadiendo 30 nM de 12-L<o>X, 40 nM de 15-LOX-1, 200
cubeta con 2 mL de tampón de reacción agitada con
temperatura ambiente (22 °C). Los tampones de rea
siguientes: 25 mM HEPES (pH 7,3), 0,3 mM CaCh, 0,1
la 5-LOX cruda precipitada con sulfato de amonio; y 25
LOX, 15-LOX-1 y 15-LOX-2. La concentración de sustr
enzimática se completara en presencia de 15-LOX-2. P
en las pruebas de un punto, los valoresIC50 se obtuviero
disolvente solo, a varias concentraciones de inhibido
concentración de inhibidor y se realizó un ajuste h
concentración total de enzima [E] << Kiapp, por lo que I
mostraron una inhibición máxima superior al 80 %, salv
almacenaron a -20 °C en DMSO
Cinética de inhibición en estado estacionario: Se r
ML355 para determinar el modo de inhibición. Se utilizar
reacciones se iniciaron añadiendo sustrato (intervalo 1 -de 2 mL en agitación constante que contenía tampón H
%. Las tasas de lipoxigenasa se determinaron monitoriz
nm (£ = 25 000 M-1 cirr1) con un espectrofotómetro Pe
muestra un mayor error en los valores de KM a bajas c
espectrofotómetro. Para minimizar este error inherente, l
la reacción con la adición de la cantidad adecuada de
reproducibles. La concentración de sustrato se determi
procediera hasta su finalización, utilizando 15-LOX-2. L
enzimáticas iniciales, a distintas concentraciones de su
de Henri-Michaelis-Menten, utilizando KaleidaGraph sujetos diferentes. Se utilizaron agonistas e inhibidores das de las figuras.
ana, la 5-lipoxigenasa humana, la 12/15-lipoxigenasa asa plaquetaria humana (12-LOX), la 15-lipoxigenasa-1 telial humana (15-LOX-2) se expresaron como proteínas a pureza superior al 90 %, evaluada mediante análisis proteína no etiquetada y se utilizó como fracción proteica nte. El contenido en hierro de 12-LOX se determinó con ente (ICP-MS) Finnigan, utilizando cobalto-EDTA como n con soluciones de hierro normalizadas y se utilizaron
ido (DMSO) de grado ACS procedía de Fisher, mientras ácido sulfúrico y el Tritón X-100 se obtuvieron de Sigma-
eraciones de cribado se realizaron en un sistema robótico J. etal. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 2006, 103, 11473 nM de 12-LOX, concentración final) en placas de ensayo os compuestos y los controles (23 nL) se transfirieron 536 pines. La placa se incubó durante 15 minutos a a de 1 pl de solución de sustrato (50 pM de concentración ción se detuvo tras 6,5 min añadiendo 4 pL de solución nol (XO) y 300 pM de sulfato amónico ferroso en ácido ), la placa de ensayo se incubó a temperatura ambiente registraron con el generador de imágenes CCD de alto do los ajustes estándar del protocolo de absorbancia. se mantuvieron sumergidos en un baño refrigerante de luyeron placas que contenían sólo DMSO (en lugar de cas a lo largo de la pantalla para controlar cualquier variación del dispensador de reactivos o la disminución malizaron con respecto a los controles y se aplicaron o de fondo. En el presente documento se ofrecen más
ores se analizaron inicialmente utilizando un punto de mer Lambda 40 UV/Vis. El porcentaje de inhibición se ntrol (disolvente DMSO) y de la muestra de inhibidor nm (£ = 25.000 M-1cirr1). Las reacciones se iniciaron e 15-LOX-2 o 5-10 pL de extracto crudo de 5-LOX a una emente mediante una barra de agitación magnética a utilizados para las distintas lipoxigenasas fueron los EDTA, 0,2 mM ATP, 0,01 % Triton X-100, 10 pM AA para EPES (pH 7,5), 0,01 % Triton X-100, 10 pM AA para 12-e determinó cuantitativamente dejando que la reacción s inhibidores que mostraron más del 50 % de inhibición erminando el % de inhibición, en relación con el vehículo continuación, se trazaron los datos en función de la ólico de la curva de saturación (suponiendo que la Kiapp). Cabe señalar que todos los inhibidores potentes se indique lo contrario en las tablas. Los inhibidores se
ron experimentos cinéticos en estado estacionario con oncentraciones de inhibidor de 0, 0,1, 0,2 y 0,35 pM. Las AA) a aproximadamente 30 nM 12-LOX en una cubeta S 25 mM (pH 7,5), en presencia de Triton X-100 al 0,01 la formación del producto conjugado, 12-HPETE, a 234 Elmer Lambda 45 UV/Vis. Cabe señalar que la 12-LOX ntraciones de sustrato (< 1 pM) debido a los límites del jor es añadir primero 12-LOX y luego iniciar rápidamente trato, lo que produjo resultados significativamente más antitativamente permitiendo que la reacción enzimática atos cinéticos se obtuvieron registrando las velocidades e inhibidor, y posteriormente se ajustaron a la ecuación ergy) para determinar las constantes de velocidadmicroscópica, Vmax (|jmol/min/mg) y Vmax/KM (jmo
replantearon posteriormente con 1/Vmax, KM/Vmax y 1/K
Ensayo de pseudoperoxidasa: Los índices de actividad
control positivo, 13-(S)-HPODE como producto oxidante
Lambda 40 UV/Vis, tal como se ha descrito anteriorment
234 nm (degradación del producto) en tampón (50 mM d
0,01 % de Triton X100 y 20 jiM de 13-(<s>)-HPODE). S
contenía 20 jiM de 13-(S)-HPODE, agitando constantem
inició con la adición de 20 jM de inhibidor (en propor
consumo de 13-(S)-HPODE y la pérdida de producto inf
realizaron controles individuales consistentes en enzima
negativos constituyeron la línea de base del ensayo, r
dependiente de la pseudoperoxidasa. Para descarta pseudoperoxidasa, se midió la actividad residual de 12-a la mezcla de reacción y se determinó la actividad res
HPODE frente al inhibidor solo, ya que el inhibidor por sí
actividad se caracteriza por la medición directa de la for
nm.
Ensayo de ciclooxigenasa: Se añadieron aproximada
0,1 M de tampón Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM de EDTA, 2
seleccionados se añadieron a la cubeta de reacción, se
enzimas COX. A continuación, se inició la reacción aña
recogieron utilizando un electrodo de oxígeno Hansatec
y el disolvente DMSO se utilizaron como controles positi
de la enzima se calculó comparando los índices de las
Agregación plaquetaria: Las plaquetas lavadas se ajust
se indica, las plaquetas se pretrataron con ML355 duran
respuesta de agregación a PAR4-AP se midió utilizando
Movilización de calcio: Las plaquetas se recalcifica
preincubación con Fluo-4 AM durante 10 min. A continu
las concentraciones indicadas antes de la estimulación
utilizando el citómetro de flujo Accuri C6.
Ensayo en células beta de ratón (inhibición de 12-HE
en placas de 24 pocillos en DMEM (Cat# 11885092, Life
pretrataron con ML355 y se estimularon como en el caso
el medio y se centrifugó a 1000 RPM durante 5 minutos
análisis. Para el análisis, los sobrenadantes se extrajeron
Corporation, Milford, MA) y se secaron bajo gas nitróg
HETe y analizarlos siguiendo las recomendaciones d
Meeting, PA).
Ensayo en islotes humanos (inhibición de 12-HETE)
integrado de distribución de islotes (www.iidp.coh.org) s
CV MediaTech, Inc. Manassas, VA) que contenía un
estreptomicina (pen/strep). Los islotes se equilibraron
albúmina de suero humano libre de ácidos grasos (C
pretratamiento con 10jM ML355 durante 30 minutos. P
100 jM de ácido araquidónico (Cat# BMI,-FA003-0100,
(Cat# C7522, Sigma, St. Louis, MO), durante 4 horas a
RPM durante 5 minutos. Los islotes fueron cosechad
sobrenadante limpio y el pellet de islotes almacenados a
se acidificaron a pH 3 con HCl 1N durante 30 minutos
muestras se añadieron a una columna preparada (prela
con 3 mL de H2O, seguidos de 3 mL de EtOH al 15 %,
acetato de etilo y se secaron bajo gas nitrógeno antes d
12-HETE (Enzo Life Sciences, Plymouth Meeting, PA).
y las muestras se secaron bajo gas nitrógeno antes de
niveles de 12-HETE en las muestras se determinaron
Sciences, Plymouth Meeting, PA).
Ejemplos relacionados con el uso de inhibidores
tratam iento de la trom bosis
/mg/jM). Las constantes cinéticas de velocidad se te a la concentración de inhibidor, obteniéndose Ki.
pseudoperoxidasa se determinaron con BWb70c como -LOXo 15-LOX-1 en un espectrofotómetro Perkin-Elmer a actividad se determinó monitorizando la disminución a ato sódico (pH 7,4), 0,3 mM deCaCh, 0,1 mM de EDTA, dieron unos 60 nM de 12-LOX a 2 mL de tampón que con una barra agitadora giratoria (22 °C). La reacción se 1:1 respecto al producto). Se registró el porcentaje de l 20 % no se consideró como actividad redox viable. Se con producto y ML355 solo con enzima. Estos controles ndo la descomposición del producto hidroperóxido no autoinactivación de la enzima por el ciclado de la na vez finalizado el ensayo. se añadieron 20 jM de AA comparando las tasas iniciales con inhibidor y 13-(S)-o disminuye intrínsecamente la tasa de oxigenación. La n de producto con el aumento de la absorbancia a 234
2-5 jg de COX-1 o COX-2 a un tampón que contenía de fenol y 1 jM de hematina a 37 °C. Los inhibidores de una incubación de 5 minutos con cualquiera de las o 100 jM de AAen la célula de reacción. Los datos se y se registró el consumo de oxígeno. La indometazina negativo, respectivamente, y el porcentaje de inhibición ras y los controles
a una concentración final de 3 * 108 plaquetas/mL. Donde min a las concentraciones indicadas durante 1 min. La regómetro con agitación a 1100 RPM a 37 °C.
una concentración final de 1 mM seguida de una las plaquetas se trataron con ML355 durante 10 min a l agonista indicado. La movilización de calcio se midió
Las células se sembraron hasta un 90 % de confluencia nologies Grand Island, NY) 10 % FBS. Las células se s islotes humanos. Transcurridas cuatro horas, se retiró obrenadante aclarado se almacenó a -80 °C antes del na columna SPE SepPakc18 (Cat# WAT054945, Waters ntes de reconstituirlos en 500 j l de tampón ELISA 12-ricante (Cat# 901-050, Enzo Life Sciences, Plymouth
islotes de donantes humanos obtenidos del programa baron durante la noche en medio CMRL (Cat# 15-110-de suero bovino fetal, 1U de penicilina y 1 jg de medio libre de suero (CMRL con pen/Strep y 1 % de 887 Sigma, St. Louis, MO)) durante 1 hora antes del inducción de 12-HETE, los islotes fueron tratados con Life Sciences Plymouth Meeting, PA), y 5 jM de A23187 . Los islotes fueron cosechados y centrifugados a 1000 entrifugados a 1000 RPM durante 5 minutos con el . Para la extracción de los sobrenadantes, las muestras centrifugaron a 1000 RPM durante zinco minutos. Las con 3 mL de EtOH, seguidos de 3 mL de H2O) y lavada mL de Hexano. Las muestras se eluyeron con 3 mL de reconstitución en 500 mL de tampón de muestra ELISA ánulos celulares se extrajeron utilizando CHCh/ MeOH nstituirlas en 250 j l de tampón de muestra ELISA. los ando un kit ELISA 12-HETE (Cat# 901-050, Enzo Life
12-lipoxigenasa en la activación plaquetaria y elEjem plo: La 12-LO X plaquetaria es esencial p ara la a
La inhibición farmacológica de 12-LOX en plaquetas hum
mediada por FcyRIIa. se demostró que la 12-LOX es
conduce a la activación de la movilización del calcio, l
integrina aIIbp3. Además, las plaquetas de ratones trans
en 12-LOX plaquetaria no formaron agregados plaquet
Rap1 y aIIbp3 tras la estimulación del receptor FcyRIIa.
la regulación de la función plaquetaria mediada por FcYR
la trombosis inmunomediada.
La 12(S)-lipoxigenasa plaquetaria (12-LOX), una oxige
potenciar la activación de vías de señalización selectas,
complejo receptor que contiene ITAM (GPVI-FcRy). L
oxilipinas, siendo la más notable la conversión de ácido
HETE) tras la estimulación agonista de las plaquetas a tr
el 12-HETE es una oxilipina que ha demostrado ser pr
endarterectomía carotídea, la heparina intraoperatoria a
con la reactividad plaquetaria del paciente al ADP ex
actividad plaquetaria aún no se ha dilucidado completam
de la actividad de la 12-LOX para aumentar los comp
incluidos Rap1, la movilización de Ca2+ , la activación
recientemente se ha demostrado que la actividad 12-LO
por GPVI y que FcyRIIa comparte componentes de s
identificar si 12-LOX es un componente vital de la vía de
En este estudio las plaquetas humanas fueron tratadas
antes de la estimulación de FcyRIIa para determinar si
La inhibición farmacológica de la actividad 12-LOX en pl
por FcYRIIa. En consonancia con los estudios en huma
hFcR deficientes en 12-LOX presentaron una agregaci
comparación con los ratones transgénicos hFcR de tipo
esencial para la activación temprana de PLCy2, así co
calcio, Rap1, PKC, activación de aIIbp3 y secreción de
fosforilación de la propia FcyRIIa. Este estudio es el pri
esencial de la señalización normal de FcyRIIa en las pla
primera vez que la 12-LOX puede representar una
inmunomediada y la trombosis.
12-LO X regula la agregación p laquetaria m ediada p o
Anteriormente se demostró que la 12-LOX regula la a
FcyRIIa utiliza muchos de los mismos efectores de señ
desempeña un papel en la agregación plaquetaria medi
ML355, un inhibidor selectivo de la 12-LOX o DMSO (cont
La inhibición de la actividad 12-LOX plaquetaria atenuó l
estimulación anti-CD9 (Fig. 11A) o la reticulación con a
disminución de la agregación plaquetaria mediada por F
a un efecto no diana del ML355, se midió la agregación
transgénicos humanizados de FcyRIIa (hFcR) que expre
/_). Las plaquetas de ratones deficientes en 12-LOX (hFc
atenuada (Fig. 12C) en respuesta a la estimulación antiratones que expresan 12-LOX funcional (hFcR/ALOX12
actividad 12-LOX por ablación farmacológica o genétic
atenuada a la activación de FcyRIIa.
12-LO X regula la activ idad de a IIb p3 y Rap1 en p laqu
Las Figs. 11 y 12 sugieren que 12-LOX es esencial par
embargo, el componente o componentes de la vía de Fc
la activación de la integrina aIIbp3 es necesaria para la
LOX en la mediación de la activación de aIIbp3 en plaq
aIIbp3 mediante citometría de flujo en plaquetas estimul
GTPasa cuya activación es esencial para la activación d
estimulación de FcyRIIa en plaquetas después del trata
mientras que la estimulación de las plaquetas en ausencivación p laquetaria m ediada p o r FcYRIIa
as resultó en una atenuación significativa de la agregación ncial para la actividad PLCy2 inducida por FcyRIIa que ctivación de Rap1 y PKC, y la posterior activación de la nicos que expresan FcyRIIa humano pero son deficientes s normales y mostraron deficiencias en la activación de os resultados respaldan el papel esencial de la 12-LOX en e identifican la 12-LOX como diana terapéutica para limitar
a altamente expresada en las plaquetas, ha demostrado cluyendo el receptor activado por proteasa 4 (PAR4) y un nción más conocida de la 12-LOX es la producción de quidónico (AA) en ácido 12-hidroxieicosatretraenoico (12-és de vías mediadas tanto por GPCR como por no GPCR. ombótica en las plaquetas. En los pacientes sometidos a enta el nivel de 12-HETE plasmático, que se correlaciona . Aunque el mecanismo por el que la 12-LOX regula la te, publicaciones anteriores han demostrado la capacidad ntes clave de señalización de la activación plaquetaria, e aIIbp3 y la secreción de gránulos densos. Dado que s necesaria para la activación plaquetaria normal mediada lización comunes con GPVI, los inventores trataron de ñalización de FcyRIIa.
n un inhibidor de 12-LOX, ML355, o control de vehículo LOX juega un papel en la vía de señalización de FcyRIIa. uetas humanas atenuó la agregación plaquetaria mediada , las plaquetas murinas aisladas de ratones transgénicos atenuada en respuesta a la estimulación con FcyRIIa en vaje. Se demostró además que la actividad de 12-LOX es para otros efectores posteriores, como la movilización de ánulos densos, mientras que no afecta directamente a la o en identificar la actividad 12-LOX como un componente etas. Además, los resultados de este estudio sugieren por ueva diana terapéutica para tratar la trombocitopenia
cYRIIa
gación plaquetaria mediada por GPVI. En las plaquetas, ación que GPVI-FcRy (4). Para determinar si la 12-LOX por FcyRIIa, se trataron plaquetas humanas lavadas con del vehículo) seguido de agregación inducida por FcyRIIa. gregación plaquetaria mediada por FcyRIIa a través de la cuerpos contra FcyRIIa (Fig. 11B). Para confirmar que la IIa se debía a la inhibición farmacológica de 12-LOX y no quetaria ex vivo tras la estimulación anti-CD9 en ratones an 12-LOX (ALOX12+;+) o deficientes en 12-LOX (ALOX12 LOX12'7') mostraron una agregación retardada (Fig. 12B) y 9 (.125 y .25 pg/mL) en comparación con las plaquetas de Estos datos sugieren que las plaquetas que carecen de resentan una respuesta de agregación significativamente
s estim uladas con FcYRIIa
agregación plaquetaria normal mediada por FcyRIIa; sin Ia regulados por 12-LOX siguen sin estar claros. Dado que egación plaquetaria, se investigó el papel potencial de 12-tas estimuladas con FcyRIIa, midiéndose la activación de s con FcyRIIa tratadas con ML355. Rap1 es una pequeña IIbp3. Por lo tanto, se midió la activación de Rap1 tras la ento con o sin ML355. Como se muestra en la Fig. 13B, e pretratamiento (control) produjo un aumento significativode Rap1-GTP, las plaquetas tratadas con ML355 no consi
mostraron atenuación en la Rap1 activa en comparación
12-LO X regula la secreción de gránulos densos p ero
La liberación de gránulos alfa y densos de las plaquetas
expresión superficial de la P-selectina se utilizó como mar
las plaquetas estimuladas con FcyRIIa. El tratamiento c
inducida por el agonista en comparación con las condi
estimuladas con FcyRIIa tratadas con ML355 mostraro
comparación con las plaquetas tratadas con DMSO (Fig. de la secreción densa corriente abajo de la estimulación
12-LO X m odula los com ponentes de señalización p ro
Como se muestra en la Fig. 13, la actividad 12-LOX e
señalización distal (Rap1, aIIbp3, y agregación plaqueta
inmunoglobulinas también inicia la activación de los
conducen a la agregación plaquetaria. FcyRIIa inicia la f
activación de Syk conduce a la activación de la fosfolipas
y a la activación de la PKC, ambas críticas para la acti
complejo entorno de señalización la 12-LOX desempe
plaqueta, se evaluaron los componentes individuales de
FcyRIIa en presencia o ausencia de ML355.
Para investigar si 12-LOX regulaba directamente la fosfori
estimuladas con IV.3+GAM tratadas con ML355 o DM
FcyRIIa. No se detectaron diferencias en la fosforilación
condiciones de control o tratadas con ML355 (Fig. 15A). E
para la fosforilación de la propia FcyRIIa.
La fosforilación de FcyRIIa resulta en el reclutamiento y
formación del signalosoma LAT La fosforilación de Syk s
presencia o ausencia de ML355. El grado de fosforilación
de ML355 varió en los sujetos analizados y puede debe
atenuación observada de la fosforilación de Syk en prese
fue demasiado pequeño para identificar definitivamente
Para evaluar si 12-LOX regula la activación de PLCy2 ag
plaquetas humanas lavadas en presencia o ausencia de
con el anticuerpo FcyRIIa se fosforilaron en los 15 segun
tratadas con ML355 mostraron una fosforilación atenuad
condiciones de control (Fig. 16A).
Dado que 12-LOX atenuó la activación de PLCy2 mediad
calcio intracelular. Se estimularon plaquetas humanas la
FcyRIIa en presencia de ML355 o de un vehículo de cont
con ML355 mostraron una disminución del Ca2+ intracelu
plaquetas tratadas con DMSO (Fig. 16B). Dado que la a
plaquetas en parte a través de la movilización de calcio,
PKC mediada por FcyRIIa por 12-LOX. Se observó una
plaquetas tratadas con ML355 a los 30 y 60 segundos
vehicular (Fig. 16C). Se determinó que esta regulación
PMA, un activador directo de la PKC, no mostró diferenci
control ni en las tratadas con ML355.
Debate
Recientemente se ha demostrado que 12-LOX es un reg
GPVI. Como se supone que FcyRIIa y GPVI señalan a tr
papel esencial en la regulación de la señalización de Fc
en demostrar que la 12-LOX es un componente esencial
FcyRIIa. Las plaquetas humanas tratadas con un inhibid
FcyRIIa deficientes en 12-LOX, mostraron una agregació
mediada por FcyRIIa. Para investigar el mecanismo sub
mediada por FcyRIIa, se evaluó la actividad de múltipl
presencia del inhibidor de 12-LOX ML355. Tras la esti ron activar Rap1. Las plaquetas tratadas con DMSO no el control.
e gránulos alfa en p laquetas activadas p o r FcYRIIa
adas sirve para amplificar la agregación plaquetaria. La or sustitutivo para medir la secreción de gránulos alfa en L355 no atenuó la expresión superficial de P-selectina es de control (Fig. 14A). Sin embargo, las plaquetas a disminución significativa en la liberación de<a>T<p>en ). Estos datos sugieren que la 12-LOX es un regulador IIa en las plaquetas.
al de la vía FcYRIIa en p laquetas hum anas
querida para la activación normal de componentes de de la vía FcyRIIa. El entrecruzamiento de FcYRIIa con ponentes de señalización proximales que finalmente rilación de ITAM que resulta en la activación de Syk. La mma 2 (PLCy2), lo que da lugar a la liberación de calcio ón plaquetaria. Para determinar en qué punto de este n papel esencial en la señalización de FcyRIIa en la alización directamente aguas abajo de la iniciación de
ón de FcyRIIa, se inmunoprecipitó FcyRIIa de plaquetas y se realizó inmunotransferencia para fosforilación de FcyRIIa en las plaquetas estimuladas con FcyRIIa en datos sugieren que la actividad 12-LOX no es necesaria
vación de la tirosina quinasa Syk que es crucial para la dió tras la estimulación con FcyRIIa de las plaquetas en yk en respuesta a la reticulación de FcyRIIa en presencia a la variabilidad interindividual. Por lo tanto, aunque la de ML355 fue menor, el número de sujetos analizados k como un nodo de regulación por 12-LOX (Fig. 15B). abajo de FcyRIIa, se midió la fosforilación de PLCy2 en 55. Las plaquetas estimuladas mediante la reticulación siguientes a la estimulación. Sin embargo, las plaquetas PLCy2 a los 15 y 30 segundos en comparación con las
r FcyRIIa, se midieron sus efectos sobre la liberación de s mediante la reticulación de anticuerpos mediada por se midió la liberación de calcio. Las plaquetas tratadas ras la estimulación plaquetaria en comparación con las ción de PLCy2 conduce a la activación de PKC en las bién se evaluó la posible regulación de la actividad de inución significativa de la activación de la PKC en las comparación con las plaquetas tratadas con el control PKC era indirecta, ya que la activación de la PKC por n su capacidad para activar la PKC ni en las plaquetas
or importante de la activación plaquetaria mediada por de una vía conservada, 12-LOX puede desempeñar un en las plaquetas humanas. Este estudio es el primero activación plaquetaria mediada inmunológicamente por e 12-LOX, ML355, o las plaquetas de ratón transgénico ignificativamente atenuada en respuesta a la activación nte por el que 12-LOX regula la activación plaquetaria termediarios de señalización en la vía de FcyRIIa en ción, las plaquetas tratadas con ML355 se atenuaronsignificativamente a lo largo de múltiples pasos de s inmunológicamente, incluyendo aIIbp3, Rap1, Ca2+, PLC
La función primaria conocida de la 12-LOX es producir
graso AA, el ácido graso predominante en la plaqueta, t
demostrado que los inhibidores selectivos de la 12-LOX re
el bloqueo de la producción de 12-HETE se ha asociado
papel directo del 12-HETE en la activación plaquetaria si
COX-1, otra oxigenasa de las plaquetas, actúan general
en la superficie plaquetaria. En el caso del 12-HETE, los t
GPR31, un GPCR; sin embargo, aunque los recientes crib
las plaquetas humanas, no existen pruebas directas de
plaquetas. Además de la posible señalización autocrin
producidas en la plaqueta pueden incorporarse de nuevo
un precedente de integración de la oxilipina en la membra
en los fosfolípidos de la membrana plasmática tras la a
mecanismo por el que 12-LOX regula la señalización med
indirecto de 12-LOX dentro de la célula. la formación del
descendente se ha implicado previamente en la regulació
estos mecanismos reguladores son plausibles, la rápida v
favor la posibilidad de que 12-LOX y no una oxilipina 12-L
la vía FcyRIIa.
Aunque la actividad 12-LOX es necesaria para la activac
determinado el componente molecular directo por el cual
para la fosforilación de FcyRIIa y sólo afectó parcialmente
la 12-LOX no regula directamente la actividad de la qui
actividad 12-LOX era importante para la activación tem
regulador importante en la cinética de la activación de PL
activación de PLCy2 debido a la inhibición de 12-LOX
regulación de efectores ascendentes como LAT o BTK. L
LOX incide en la vía FcyRIIa a un punto proximal en la vía
Procedimientos
Ratones y preparación de plaquetas: Los ratones transgén
eliminación de la 12-lipoxigenasa plaquetaria (ALOX12^ )
12-lipoxigenasa plaquetaria (hFcR/ALOX12'/_). Todos los r
Universidad Thomas Jefferson (TJU). Los procedimientos
y Uso de Animales de la TJU. Se extrajo sangre de la ven
edad con una jeringa que contenía citrato de sodio. La pre
en (Yeung et al., 2012). Las plaquetas murinas se resus
|jg/mL) yCaCl2 (1 mM).
Preparación de plaquetas humanas lavadas: Antes de la
por escrito de todos los voluntarios. Las plaquetas lavada
descrito previamente (14). Las plaquetas lavadas se res
menos que se indicara lo contrario. Todos los estudios r
Junta de Revisión Institucional de la Universidad Thomas
Activación plaquetaria mediada por FcyRIIa: La activació
modelos distintos: 1) reticulación con anticuerpos FcyRIIa
reticular FcyRIIa, las plaquetas lavadas se incubaron con
minuto, seguido de la adición de un anticuerpo IgG de cab
de anticuerpos reticulantes FcyRIIa utilizada para cada
estimularon plaquetas humanas lavadas con un anticuerp
por FcyRIIa. Debido a la variabilidad interindividual en la
de anti-CD9 (,25 -1 ug/ml) para alcanzar una agregación
LOX (ML355), las plaquetas lavadas se incubaron con
minutos antes de la estimulación con FcyRIIa.
Agregación plaquetaria: La agregación plaquetaria se midi
en condiciones de agitación a 37°C.
Fosforilación de PLCy2: Las plaquetas humanas lavadas
agregómetro mediante la reticulación de anticuerpos de
reductor 5X para detener la reacción. Las muestras se lización en la vía de activación de FcyRIIa mediada PKC y secreción de gránulos densos (Fig. 17).
lipinas (como el 12(S)-HETE) a partir del sustrato ácido la activación plaquetaria. Publicaciones anteriores han en significativamente la producción de 12-HETE. Aunque na reducción de la reactividad mediada por plaquetas, el e sin estar claro. Las oxilipinas generadas a partir de la te como mediadores de señalización a través de GPCR ajos publicados han demostrado que señala a través del os genéticos han demostrado la expresión del GPR31 en expresión de la proteína GPR31 en la superficie de las paracrina a través de GPR31, las oxilipinas 12-LOX a membrana para inducir sus efectos reguladores. Existe , ya que se ha demostrado que el 12-HETE se esterifica ación plaquetaria. Una tercera explicación potencial del a por FcyRlIa puede ser a través del andamiaje directo o mplejo 12-LOX como medio para regular la señalización el crecimiento celular y la tumorogénesis. Aunque todos cidad con la que 12-LOX incide en la vía FcyRlla deja a pueda actuar como un componente regulador directo de
plaquetaria normal mediada por FcyRIIa, aún no se ha requiere la actividad 12-LOX. la 12-LO<x>no fue necesaria la fosforilación de Syk, lo que sugiere que la actividad de sa de la familia Src. Sin embargo, se demostró que la na de PLCy2, lo que indica que 12-LOX puede ser un que afecta a los efectores aguas abajo. El retraso en la ede atribuirse a la regulación directa de PLCy2 o a la datos presentados aquí reducen el alcance de donde 12-señalización entre el receptor y PLCy2.
s FcyRIIA(hFcR/ALOX12+/+) se cruzaron con ratones con a generar ratones transgénicos FcyRIIA deficientes en la nes se alojaron en las instalaciones para ratones de la perimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado cava inferior de ratones anestesiados de 12 semanas de ración de plaquetas de ratón se realizó como se describe dieron en tampón Tirodes que contenía fibrinógeno (75
acción de sangre se obtuvo el consentimiento informado e aislaron de la sangre de voluntarios sanos como se ha pendieron en tampón Tirodes a 3,0x1°8 plaquetas/mL, a izados con plaquetas humanas fueron aprobados por la fferson.
plaquetaria mediada por FcyRIIa se inició mediante dos ) estimulación con anticuerpos monoclonales CD9. Para , un anticuerpo monoclonal de ratón FcyRIIa, durante un anti-ratón (g Am ) para reticular FcyRIIa. La concentración xperimento se indica en el texto. Alternativamente, se onoclonal anti-CD9 para activar la señalización mediada puesta anti-CD9, se utilizó un intervalo de concentración EC80. En los estudios realizados con el inhibidor de 12-355 (20 jM ) o DMSO (vehículo de control) durante 15
on un lumioagregómetro (Chronolog Corp, Modelo 700D)
ajustaron a 5*108 plaquetas/mL y se estimularon en un cyRIIa y se lisaron a tiempos designados con tampón pararon en un gel SDS-PAGE al 7,5 %. Se utilizaronanticuerpos contra PLCy2 y fosfo-Y759 PLCy2, un m
relativos de PLCy2 total y activa, respectivamente.
Movilización del calcio: La liberación intracelular de calci
plaquetas humanas lavadas se resuspendieron a 1,0 * 1
calcio. Las plaquetas se incubaron con Fluo-4 am, un
diez minutos antes de la estimulación. Las plaquetas se
y la intensidad de fluorescencia se midió en tiempo real
cambio de pliegue en la intensidad de fluorescencia co
con la intensidad de fluorescencia antes de la estimulaci
Activación de Rap1: Las plaquetas humanas lavadas s
durante 5 minutos y se detuvo la agregación con tampón
selectivamente la conformación activa de Rap1 a partir
El lisado total de plaquetas y las muestras de Rap1 pulltransferencia Western con un anticuerpo Rap1. Los nivel
de Rap1 total contenida en cada muestra.
Ensayo de activación de PKC: Las plaquetas lavadas s
en condiciones de agitación (1100 rpm) en un agregóme
de tampón de muestra Laemmli 5X a los tiempos indica
(1 mM), un agonista directo de la PKC, durante un mi
realizaron transferencias Western utilizando anticuerpos
Secreción de gránulos densos: Se midió la liberación de
de gránulos densos. Antes de la activación, las plaqu
colorante sensible al ATP, durante un minuto. Las plaqu
en condiciones de agitación y la fluorescencia se midió
Liberación de gránulos alfa y activación de aIIbp3: Ant
con un anticuerpo de P-selectina conjugado con FITC o
la conformación activa de aIIbp3. Las plaquetas se e
reacciones se detuvieron mediante la adición de forma
fluorescencia se midió mediante citometría de flujo.
fluorescencia.
Transferencia Western: Se utilizaron transferencias Wes
fosforilación de PLCy2, y la intensidad de las bandas s
Biosystems).
Análisis estadístico: En su caso, los datos representan
mediante el programa GraphPad Prism. Se consideró si
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stimularon mediante la reticulación del anticuerpo FcyRIIa lisis plaquetaria 2X. Se utilizó RalGDS-RBD para precipitar lisado plaquetario, tal y como se ha descrito previamente. wn se corrieron en un gel SDS-PAGE y se identificaron por de Rap1 activo se normalizaron con respecto a la cantidad
stimularon mediante la reticulación del anticuerpo FcyRIIa a 37°C. Las reacciones se detuvieron mediante la adición . Como control positivo, las plaquetas se trataron con PMA to. Las muestras se corrieron en un gel SDS-PAGE y se pecíficos para la fosforilación del sustrato PKC y pleckstrin.
P de las plaquetas lavadas como sustituto de la secreción s lavadas se incubaron con el reactivo Chronolume, un s se estimularon con la reticulación del anticuerpo FcyRII tiempo real utilizando un lumioagregómetro.
de la estimulación, las plaquetas lavadas se preincubaron PAC-1 conjugado con FITC, un anticuerpo específico para mularon con la reticulación del anticuerpo FcyRIIa y las hído al 2 % a los tiempos indicados. La intensidad de la s resultados se presentan como intensidad media de
n estándar para la activación de Rap1, sustratos de PKC y antificó con el Odyssey Infrared Imaging System (LIC-OR
media ± E.S.M. La significación estadística se determinó ificativo un valor P inferior a 0,05.
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Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula (I)
    en el que Ri es metoxi y R2 es H; y R3 se selecciona del grupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-bencimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 2-tiofeno, 4-metil-2-tiazol, 5-metil-2-tiazol, 5-fenil-2-tiazol, 4,5-dimetil-2-tiazol, fenilo, 1-naftaleno, 2-naftaleno, 1,4-bi-fenilo, 3-piperazin-fenilo, 4-piperazin-fenilo, 4-piperidin-fenilo, 4-piperazin-3-piridina, 3-quinolina, 8-isoquinolina, 2-piridina, 3-piridina, 3-tercbutil-fenilo, 6-metoxi-2-benzotiazol, 6-fluoro-2-benzotiazol, 4-fenil-2-tiazol, 3-morfolina-fenil, 4N-boc-piperidin-3-fenil, 3-piperidin-fenil, 3-isopropil-fenil, 3-metoxi-fenil, 5-metil-3-isoxazol, 2-pirimidina y 1,3-bi-fenil; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo o diastereómeros del mismo.
  2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R3 se selecciona del grupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-bencimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 3-quinolina, 8-isoquinolina, fenilo y 3-isopropil-fenilo.
  3. 3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R3 se selecciona del grupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-bencimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 2-tiofeno, fenilo, 1-naftaleno, 2-naftaleno, 3-quinolina, 8-isoquinolina, 3-terc-butil-fenilo, 6-metoxi-2-benzotiazol, 6-fluoro-2-benzotiazol, 4-fenil-2-tiazol, 4N-boc-piperidin-3-fenilo y 3-isopropil-fenilo.
  4. 4. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R3 se selecciona del grupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-bencimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 2-tiofeno, fenilo, 1-naftaleno, 2-naftaleno, 3-quinolina, 8-isoquinolina, 3-tercbutil-fenilo, 4N-boc-piperidin-3-fenilo y 3-isopropil-fenilo.
  5. 5. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R3 se selecciona del grupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-benzimidazol y 3-isopropil-fenil.
  6. 6. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R3 se selecciona del grupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-benzimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 2-tiofeno, fenilo, 6-metoxi-2-benzotiazol, 6-fluoro-2-benzotiazol y 4-fenil-2-tiazol.
  7. 7. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R3 se selecciona del grupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-bencimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 2-tiofeno y fenilo.
  8. 8. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R3 se selecciona del grupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-bencimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 2-tiofeno, fenilo, 1-naftaleno, 2-naftaleno, 3-quinolina, 8-isoquinolina, 2-piridina y 3-piridina.
  9. 9. Un compuesto de la reivindicación 1 que es
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo o diastereómeros del mismo.
  10. 10. Un compuesto de la reivindicación 1 que es
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo o diastereómeros del mismo.
  11. 11. Un compuesto de la reivindicación 1 que es
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo o diastereómeros del mismo.
  12. 12. Un compuesto de la reivindicación 1, sal del mismo, enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo, o diastereómeros del mismo, para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno mediado por 12-lipoxigenasa, en el que el compuesto, sal del mismo, enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo, o diastereómeros del mismo se administran a un mamífero en una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz, en el que la enfermedad o trastorno mediado por la 12-lipoxigenasa se selecciona del grupo que consiste en diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2, enfermedades cardiovasculares, esteatohepatitis no alcohólica, hemostasia plaquetaria, enfermedades cutáneas, trombocitopenia inducida por heparina, agregación plaquetaria inducida porPAR4-AP, trombosis, síndrome antifosfolípido; síndrome de sepsis; trombocitopenia asociada al receptor de la región Fc de la inmunoglobulina gamma (FcyRIIa); y cáncer.
  13. 13. El compuesto para uso de la reivindicación 12, en el que R3 se selecciona del grupo que consiste en 2-benzotiazol, 2-benzoxazol, 2-bencimidazol, 4-metil-2-benzotiazol, 2-tiofeno, fenilo, 1-naftaleno, 2-naftaleno, 3-quinolina, 8-isoquinolina, 3-terc-butil-fenilo, 6-metoxi-2-benzotiazol, 6-fluoro-2-benzotiazol, 4-fenil-2-tiazol, 4N-boc-piperidin-3-fenilo y 3-isopropil-fenilo.
  14. 14. El compuesto para uso de la reivindicación 12, en el que la 12-lipoxigenasa es 12-lipoxigenasa humana.
  15. 15. El compuesto para uso de la reivindicación 12, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de mama y cáncer de pulmón.
  16. 16. El compuesto para uso de la reivindicación 12, en el que la enfermedad cardiovascular se selecciona del grupo que consiste en infarto de miocardio y accidente cerebrovascular.
  17. 17. El compuesto para uso de la reivindicación 12, en el que la enfermedad o trastorno mediado por 12-lipoxigenasa se selecciona del grupo que consiste en diabetes tipo 1 y tipo 2.
  18. 18. El compuesto para uso de la reivindicación 12, en el que la enfermedad o trastorno mediado por la 12-lipoxigenasa es la trombosis.
  19. 19. El compuesto para uso de la reivindicación 12, en el que el compuesto es
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo o diastereómeros del mismo.
  20. 20. El compuesto para uso de la reivindicación 12, en el que el compuesto es
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo o diastereómeros del mismo; o en el que el compuesto es
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo o diastereómeros del mismo; o en el que el compuesto es
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo o diastereómeros del mismo.
  21. 21. Un compuesto de la reivindicación 1 que es
    para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, hemostasia plaquetaria, trombocitopenia inducida por heparina y trombosis.
  22. 22. El compuesto para uso de la reivindicación 21, en el que el trastorno es diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 y trombocitopenia inducida por heparina.
  23. 23. El compuesto para uso de la reivindicación 22, en el que el trastorno es trombocitopenia inducida por heparina.
  24. 24. Un compuesto de la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en N (benzo[d]tiazol-2-il)-4-[(2-hidroxi-3-metoxibencil)amino]bencenosulfonamida; N (benzo[d]oxazol-2-il)-4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)bencenosulfonamida; N-(1H-benzo/d]imidazol-2-il)-4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)bencenosulfonamida; 4-(2-hidroxi-3-metoxibencilamino)-N-(tiofen-2-il)bencenosulfonamida; 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(5-feniltiazol-2-il)bencenosulfonamida; 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(3-metoxifenil)bencenosulfonamida; 4-(2-hidroxi-3-metoxibencilamino)-N-(isoquinolin-8-il)bencenosulfonamida; 4-(2-hidroxi-3-metoxibencilamino)-N-/eni/bencenosu//onam/cfa; 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(naftalen-1-il)bencenosulfonamida; 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(naftalen-2-il)bencenosulfonamida; N-([1,1'-bifenil]-4-il)-4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)bencenosulfonamida; N-([1,1'-bifenil]-3-il)-4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)bencenosulfonamida; N (3-(terc-butil)fenil)-4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)bencenosulfonamida, 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(6-metoxibenzo[d]tiazol-2-il)bencenosulfonamida, 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(4-feniltiazol-2-il)bencenosulfonamida, terc-butil4-(3-(4-((2-hidroxi-3-metoxibencil) amino) fenilsulfonamido) fenil)piperidin-1 -carboxilato; 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(3-isopropilfenil)bencenosulfonamida; N-(6-fluorobenzo[d]tiazol-2-il)-4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino) bencenosulfonamida; 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(3-(piperazin-1-il)fenil)bencenosulfonamida; 4-(2-hidroxi-3-metoxibencilamino)-N-(4-(piperazin-1-il)fenil)bencenosulfonamida; y 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino)-N-(4-(piperidin-4-il)fenil)bencenosulfonamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, enantiómeros del mismo, una mezcla de enantiómeros del mismo o diastereómeros del mismo.
  25. 25. Una composición que comprende cualquiera de los compuestos de la reivindicación 24.
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