ES2969882T3 - Ensayos y reactivos de electroforesis capilar en microchip - Google Patents

Ensayos y reactivos de electroforesis capilar en microchip Download PDF

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Gabriel Carreau
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Abstract

Se proporcionan ensayos y reactivos MCE para evaluar la pureza e identificar impurezas en muestras de productos farmacéuticos proteicos. Se proporcionan métodos para analizar analitos en una muestra de fármaco proteico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayos y reactivos de electroforesis capilar en microchip
Campo técnico de la invención
Los aspectos de la invención están, en general, dirigidos al campo de la electroforesis capilar, en particular a la electroforesis capilar en microchip.
Antecedentes de la invención
La implementación de una tecnología sólida, reproducible y fácil de usar es fundamental para satisfacer las demandas de pruebas de productos biológicos que se imponen en los laboratorios de control de calidad (CC) actuales. Es necesario mejorar la tecnología para facilitar una mayor producción, sin dejar de generar datos analíticos de calidad e intentar minimizar el número de resultados de pruebas e investigaciones relacionadas con instrumentos no válidos. Si bien la electroforesis se ha utilizado históricamente en el control de calidad para el análisis de pureza y fragmentación de productos, la metodología ha pasado de estar basada en gel, a estar basada en capilares y, más recientemente, en microchip. La electroforesis capilar en microchip (ECM) permite reducir drásticamente los tiempos de análisis de muestras, manteniendo los patrones de rendimiento y reproducibilidad necesarios para el análisis de control de calidad (Ouimet, C.,et al.,Expert Opin Drug Discov., 12(2): 213-224 (2017)).
Aunque la ECM ha surgido como una técnica prometedora con un uso creciente en la industria farmacéutica para la caracterización de productos biofarmacéuticos, el control de calidad y el descubrimiento de fármacos, puede ser propensa a sufrir interferencias en el ensayo.
Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar ensayos y composiciones de ECM mejorados que reduzcan las interferencias de los ensayos.
Otro objeto de la invención es proporcionar ensayos y composiciones de ECM para mejorar la detección de impurezas en un medicamento proteico.
Sumario de la invención
Se proporcionan ensayos y reactivos de ECM para evaluar la pureza e identificar impurezas en muestras de medicamentos proteicos. Se proporcionan métodos para analizar analitos en una muestra de fármaco proteico. Los fármacos proteicos preferidos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, proteínas de fusión y proteínas recombinantes. Los ensayos emplean técnicas de ECM para separar, identificar y cuantificar el producto proteico y las impurezas en el producto proteico. Las impurezas incluyen, pero no se limitan a, agregados de proteínas, fragmentos de proteínas, multímeros de proteínas y contaminantes del ensayo. También se proporcionan tampones reductores y no reductores. En particular, la presente invención proporciona tampones acuosos para muestras de electroforesis.
En consecuencia, la presente invención proporciona un tampón acuoso para muestras de electroforesis que comprende:
2-yodoacetamida de 155 a 175 mM;
dodecilsulfato de litio del 0,50 al 1,5 %; y
fosfato de sodio de 75 a 95 mM,
en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH inferior a 7.
En una realización preferida, el pH del tampón es 6. En otra realización, el tampón acuoso contiene 2-yodoacetamida 166 mM, dodecilsulfato de litio al 0,81 % y fosfato de sodio 81 mM.
La presente invención también proporciona un tampón acuoso para muestras de electroforesis que consiste en:
2-yodoacetamida 166 mM,
dodecilsulfato de litio al 0,81 % y
fosfato de sodio 81 mM,
en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH de 6,0.
También se describe un tampón reductor. En un caso, el tampón reductor es un tampón acuoso para muestras de electroforesis que contiene dodecilsulfato de litio del 0,5 al 1,5 %, fosfato de sodio de 55 a 85 mM y un agente reductor, en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH superior a 8. En un caso preferido, el pH del tampón es 9. En un caso, el tampón reductor contiene ditiotreitol de 135 a 155 mM. Otro ejemplo más proporciona un tampón reductor que contiene dodecilsulfato de litio al 0,69 %, fosfato de sodio 69 mM y ditiotreitol 142 mM.
También se pueden utilizar tampones basados en HEPES con los métodos divulgados. La presente invención también proporciona un tampón acuoso para muestras de electroforesis que comprende:
2-yodoacetamida de 55 a 75 mM;
dodecilsulfato de litio del 0,1 al 1,0 %;
cloruro de sodio de 5 a 115 mM y
HEPES de 5 a 85 mM,
en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH inferior a 9. En otra realización, el pH del tampón es 8. En aún otra realización, el tampón acuoso contiene 2-yodoacetamida 66,4 mM, dodecilsulfato de litio al 0,32 %, HEPES 16,2 mM y cloruro sódico 48,6 mM.
La presente invención proporciona además un tampón acuoso para muestras de electroforesis que comprende:
2-yodoacetamida 66,4 mM;
dodecilsulfato de litio al 0,32 %;
NaCl 48,6 mM y
HEPES 16,2 mM,
en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH inferior a 9.
También se describe un tampón acuoso para muestras de electroforesis a base de HEPES reductor que contiene dodecilsulfato de litio del 0,05 al 0,75 %, cloruro de sodio de 5 mM a 115 mM, HEPES de 5 mM a 115 mM y un agente reductor, en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH superior a 7. En un caso preferido, el pH del tampón es 8. En un caso, el tampón reductor contiene ditiotreitol de 35 a 50 mM. Otro ejemplo más proporciona un tampón reductor que contiene dodecilsulfato de litio al 0,28 %, cloruro de sodio 41,5 mM, HEPES 13,8 mM y ditiotreitol 42,5 mM.
Una realización proporciona un método de ECM no reductora para identificar contaminantes o impurezas en una muestra de fármaco proteico que incluye las etapas de añadir la muestra proteica a un tampón no reductor mencionado anteriormente para formar una muestra de fármaco proteico tamponada. La muestra de fármaco proteico tamponada se calienta entre 65 y 85 °C durante 5 a 15 minutos para formar una muestra de fármaco proteico tamponada desnaturalizada.
En una realización preferida, la muestra de fármaco proteico tamponada se calienta a 70 °C durante 10 min.
La muestra de fármaco proteico se mezcla con un marcador detectable y se calienta de 30 a 40 °C durante 20 a 40 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcada desnaturalizada. Un marcador detectable preferido incluye, pero sin limitación, éster de NHS DY-631 de Dyomics. Se pueden utilizar otros marcadores detectables que incluyen otros colorantes, fluoróforos, cromóforos, marcadores de masa, puntos cuánticos y similares y los divulgados en la patente de Estados Unidos n.° 6.924.372. En una realización preferida, la muestra de fármaco proteico con el marcador añadido se calienta a 35 °C durante 30 minutos. Opcionalmente se elimina el exceso de marcador de la muestra, por ejemplo mediante el uso de un filtro giratorio.
El medicamento proteico desnaturalizado marcado se diluye y se somete a ECM para separar la muestra del fármaco proteico diluido en un sistema de electroforesis capilar en microchip para producir un electroforetograma. En una realización, la concentración final de una muestra que comienza en 0,5 mg/ml y que luego se inyecta sobre el microchip es de 9 pg/ml para la ECM. El electroforetograma contiene picos correspondientes al medicamento proteico y a las impurezas. El método concluye mediante la identificación de picos en el electroforetograma correspondientes a contaminantes o impurezas.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para identificar contaminantes o impurezas en una muestra de fármaco proteico, comprendiendo el método las etapas de:
añadir la muestra de fármaco proteico al tampón de la presente invención para formar una muestra de fármaco proteico tamponada;
calentar la muestra de fármaco proteico tamponada a una temperatura de 65 a 85 °C durante 5 a 15 minutos para formar una muestra de fármaco proteico tamponada desnaturalizada;
añadir un marcador detectable a la muestra de fármaco proteico tamponada desnaturalizada y calentarla a una temperatura de 30 a 40 °C durante 20 a 40 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcada desnaturalizada;
diluir la muestra de fármaco proteico marcada desnaturalizada y someterla a electroforesis capilar en microchip (ECM) para separar la muestra de fármaco proteico marcada desnaturalizada diluida en un sistema de electroforesis capilar en microchip para producir un electroforetograma; e identificar los picos en el electroforetograma correspondientes a contaminantes o impurezas.
Otra realización proporciona un método de ECM reductora para identificar contaminantes o impurezas en una muestra de fármaco proteico. El método comienza mediante la adición de la muestra proteica a uno cualquiera de los tampones reductores descritos anteriormente para formar una muestra de fármaco proteico tamponada. La muestra de fármaco proteico tamponada se desnaturaliza calentando la muestra de fármaco proteico tamponada a una temperatura de 65 a 85 °C, preferiblemente a 70 °C durante 10 minutos para formar una muestra de fármaco proteico desnaturalizada. La muestra de fármaco proteico se mezcla con un marcador detectable y se calienta de 30 a 40 °C durante 20 a 40 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcada desnaturalizada. En una realización preferida, la muestra de fármaco proteico con el marcador añadido se calienta a 35 °C durante 30 minutos. Opcionalmente se elimina el exceso de marcador de la muestra, por ejemplo mediante el uso de un filtro giratorio. Un marcador detectable preferido incluye, pero sin limitación, éster de NHS DY-631 de Dyomics. Otros marcadores detectables que se pueden utilizar incluyen otros colorantes, fluoróforos, cromóforos, marcadores de masa, puntos cuánticos y similares y los divulgados en la patente de Estados Unidos n.° 6.924.372.
En una realización, el intervalo de ensayo establecido para la concentración de la muestra es de 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml, correspondiente a una concentración final que se analiza de aproximadamente 7 pg/ml a 11 pg/ml que se somete a análisis de ECM en un sistema de electroforesis capilar en microchip para producir un electroforetograma. El método concluye mediante la identificación de picos en el electroforetograma correspondientes a contaminantes o impurezas.
Breve descripción de los dibujos
En la figura 1A se muestra un electroforetograma de un análisis típico de una muestra no reducida. En la figura 1B se muestra un electroforetograma de un análisis atípico de una muestra reducida. El eje de abscisas representa el tiempo en minutos y el eje de ordenadas representa las unidades de fluorescencia relativas (UFR). Un mayor tiempo de migración corresponde a un mayor tamaño de proteína.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
El uso de los términos "un", "uno/a" "el", "la", y referentes similares en el contexto de la descripción de la presente invención reivindicada (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) debe interpretarse que incluyen tanto el singular como el plural, a menos que se indique otra cosa en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente.
La enumeración de intervalos de valores en el presente documento meramente pretende servir como método abreviado de hacer referencia de manera individual a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, salvo que se indique lo contrario en el presente documento y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerara de manera individual en el presente documento.
El uso del término "aproximadamente" pretende describir valores por encima o por debajo del valor indicado en un intervalo de aprox. /-10 %; en otras realizaciones, los valores pueden variar en valor por encima o por debajo del valor indicado en un intervalo de aprox. /-5 %; en otras realizaciones, los valores pueden variar en valor por encima o por debajo del valor indicado en un intervalo de aprox. /-2 %; en otras realizaciones, los valores pueden variar en valor por encima o por debajo del valor indicado en un intervalo de aprox. /-1 %. Los intervalos anteriores pretenden quedar claros por contexto y no implican ninguna limitación adicional. Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o del lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, tiene por objeto simplemente ilustrar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención, a menos que se reivindique de otro modo. Ninguna expresión de la memoria descriptiva debe interpretarse en el sentido de que indica algún elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención.
"Proteína" se refiere a una molécula que comprende dos o más restos de aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace peptídico. La proteína incluye polipéptidos y péptidos y también puede incluir modificaciones, tales como glucosilación, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, alquilación, hidroxilación y ribosilación de ADP. Las proteínas pueden ser de interés científico o comercial, incluidos los medicamentos a base de proteínas, y las proteínas incluyen, entre otras cosas, enzimas, ligandos, receptores, anticuerpos y proteínas quiméricas o de fusión. Las proteínas se producen mediante diversos tipos de células recombinantes utilizando métodos de cultivo celular bien conocidos y generalmente se introducen en la célula mediante técnicas de ingeniería genética (por ejemplo, tal como una secuencia que codifica una proteína quimérica o una secuencia optimizada con codones, una secuencia sin intrones, etc.) donde puede residir como un episoma o integrarse en el genoma de la célula.
"Anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que consiste en cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada tiene una región variable de cadena pesada (HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada contiene tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera tiene una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera consiste en un dominio (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. El término "anticuerpo" incluye la referencia a inmunoglobulinas tanto glucosiladas como no glucosiladas de cualquier isotipo o subclase. El término "anticuerpo" incluye moléculas de anticuerpo preparadas, expresadas, creadas o aisladas por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una célula hospedadora transfectada para expresar el anticuerpo. El término anticuerpo también incluye un anticuerpo biespecífico, que incluye una inmunoglobulina heterotetramérica que se puede unir a más de un epítopo diferente. Los anticuerpos biespecíficos se describen en general en la patente de Estados Unidos n.° 8.586.713.
Las "proteínas de fusión de Fc" comprenden parte o la totalidad de dos o más proteínas, una de las cuales es una porción Fc de una molécula de inmunoglobulina, que de otro modo no se encuentran juntas en la naturaleza. La preparación de proteínas de fusión que comprenden determinados polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (que incluyen el dominio Fc) se ha descrito, por ejemplo, por Ashkenaziet al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 10535 (1991); Byrnet al.,Nature 344:677 (1990); y Hollenbaughet al.,"Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, Supl. 4, páginas 10.19.1 -10.19.11 (1992). "Las proteínas de fusión de receptor de Fc" comprenden uno o más dominios extracelulares de un receptor acoplado a una fracción Fc, que, en algunas realizaciones, comprende una región bisagra seguida de un dominio CH2 y CH3 de una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de Fc comprende dos o más cadenas de receptor distintas que se unen a uno o más ligandos. Por ejemplo, una proteína de fusión de Fc es una Trap, tal como, por ejemplo, una IL-1 Trap o una VEGF Trap.
El término "ECM" o la expresión "electroforesis capilar en microchip" se refiere a la separación de analitos por electroforesis capilar (EC) basada en microchip.
II. Ensayos de ECM y tampones
Se proporcionan métodos para analizar analitos en una muestra de fármaco proteico. Los fármacos proteicos preferidos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, proteínas de fusión y proteínas recombinantes. Los ensayos emplean técnicas de ECM para separar, identificar y cuantificar el producto proteico y las impurezas en el producto proteico. Las impurezas incluyen, pero no se limitan a, agregados de proteínas, fragmentos de proteínas, multímeros de proteínas y contaminantes del ensayo.
A. Tampones
1. Tampones no reductores
Una realización proporciona un tampón acuoso para muestras de electroforesis no reductor que contiene de 155 a 175 mM de un agente alquilante, por ejemplo, 2-yodoacetamida; dodecilsulfato de litio del 0,50 al 1,5 %; y fosfato de sodio de 75 a 95 mM, en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH inferior a 7. En una realización preferida, el pH del tampón es 6. En otra realización, el tampón acuoso contiene 2-yodoacetamida 166 mM, dodecilsulfato de litio al 0,81 % y fosfato de sodio 81 mM.
2. Tampones reductores
También se describe un tampón reductor. En un caso, el tampón reductor es un tampón acuoso para muestras de electroforesis que contiene dodecilsulfato de litio del 0,5 al 1,5 %, fosfato de sodio de 65 a 95 mM y un agente reductor, en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH superior a 8. En un caso preferido, el pH del tampón es 9.
Los agentes reductores son conocidos en la materia. Los agentes reductores ilustrativos incluyen, pero sin limitación, ditiotreitol (DTT, CAS 3483-12-3), beta-mercaptoetanol (BME, 2BME, 2-ME, b-mer, CAS 60-24-2), 2-aminoetanotiol (2-MEA-HCl, también llamado cisteamina-HCl, CAS 156-57-0), clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina, (TCEP, CAS 5961-85-3), clorhidrato de cisteína (Cys-HCl, CAS 52-89-1) o sal sódica del ácido 2-mercaptoetanosulfónico (MESNA). Se conocen en la materia otros métodos para reducir los enlaces de proteínas, tales como una columna reductora inmovilizada que contiene resina a la que se le ha inmovilizado un agente reductor basado en tiol para permitir la reducción en fase sólida de enlaces disulfuro peptídicos y proteicos. También se prevén agentes reductores, incluidos agentes oxidantes, que son adecuados para reducir la interacción química entre polipéptidos.
En un caso, el tampón reductor contiene ditiotreitol de 135 a 155 mM.
También se divulga un tampón reductor que contiene dodecilsulfato de litio al 0,69 %, fosfato de sodio 69 mM y ditiotreitol 142 mM.
3. Tampones no reductores basados en HEPES
También se pueden utilizar tampones basados en HEPES con los métodos divulgados. Una realización proporciona un tampón acuoso para muestras de electroforesis basado en HEPES no reductor que contiene 2-yodoacetamida de 55 a 75 mM como agente alquilante; dodecilsulfato de litio del 0,1 al 1,0 %; HEPES de 5 a 85 mM y cloruro de sodio de 5 a 115 mM, en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH inferior a 9. En una realización preferida, el pH del tampón es 8. En otra realización, el tampón acuoso contiene 2-yodoacetamida 66,4 mM, dodecilsulfato de litio al 0,32 %, HEPES 16,2 mM y cloruro sódico 48,6 mM.
4. Tampones reductores basados en HEPES
También se describe un tampón acuoso para muestras de electroforesis a base de HEPES reductor que contiene dodecilsulfato de litio del 0,05 al 0,75 %, cloruro de sodio de 5 mM a 115 mM, HEPES de 5 mM a 115 mM y un agente reductor, en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH superior a 7. En un caso preferido, el pH del tampón es 8. En un caso, el tampón reductor contiene ditiotreitol de 35 a 50 mM. Otro ejemplo más proporciona un tampón reductor que contiene dodecilsulfato de litio al 0,28 %, cloruro de sodio 41,5 mM, HEPES 13,8 mM y ditiotreitol 42,5 mM.
B. Ensayos
1. Ensayos no reductores
Una realización proporciona un método de ECM no reductora para identificar contaminantes o impurezas en una muestra de fármaco proteico, incluyendo el método las etapas de añadir la muestra proteica a un tampón no reductor mencionado anteriormente para formar una muestra de fármaco proteico tamponada. La muestra de fármaco proteico tamponada se calienta entre 65 y 85 °C durante 5 a 15 minutos para formar una muestra de fármaco proteico tamponada desnaturalizada. En una realización preferida, la muestra de fármaco proteico tamponada se calienta a 70 °C durante 10 min. Luego se añade un marcador detectable a la muestra de fármaco proteico tamponada desnaturalizada y se calienta a una temperatura de 30 a 40 °C durante 20 a 40 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcada desnaturalizada. En una realización preferida, la muestra de fármaco proteico desnaturalizada con el marcador añadido se calienta a 35 °C durante 30 minutos. Opcionalmente se elimina el exceso de marcador de la muestra, por ejemplo mediante el uso de un filtro giratorio.
Un marcador detectable preferido incluye, pero sin limitación, éster de NHS DY-631 de Dyomics. Se pueden utilizar otros marcadores detectables que incluyen otros colorantes, fluoróforos, cromóforos, marcadores de masa, puntos cuánticos y similares y los divulgados en la patente de Estados Unidos n.° 6.924.372.
El medicamento proteico desnaturalizado marcado se diluye y se somete a ECM para separar la muestra del fármaco proteico diluido en un sistema de electroforesis capilar en microchip para producir un electroforetograma. En una realización, la concentración final de una muestra que comienza en 0,5 mg/ml y que luego se inyecta sobre el microchip es de 9 pg/ml para la ECM. En otra realización, la concentración inicial de la muestra es 0,2 mg/ml. El electroforetograma contiene picos correspondientes al medicamento proteico y a las impurezas. El método concluye mediante la identificación de picos en el electroforetograma correspondientes a contaminantes o impurezas.
2. Ensayos reductores
También se describe un método de ECM reductora para identificar contaminantes o impurezas en una muestra de fármaco proteico. El método comienza mediante la adición de la muestra de fármaco proteico a uno cualquiera de los tampones reductores descritos anteriormente para formar una muestra de fármaco proteico tamponada. La muestra de fármaco proteico tamponada se desnaturaliza calentando la muestra de fármaco proteico tamponada a una temperatura de 65 a 85 °C, preferiblemente a 70 °C durante 10 minutos para formar una muestra de fármaco proteico desnaturalizada. Después, la muestra de fármaco proteico con marcador añadido se calienta a una temperatura de 30 a 40 °C durante 20 a 40 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcada desnaturalizada. En un caso preferido, la muestra del medicamento proteico con el marcador añadido se calienta a 35 °C durante 30 minutos. Opcionalmente se elimina el exceso de marcador de la muestra, por ejemplo mediante el uso de un filtro giratorio. Un marcador detectable preferido incluye, pero sin limitación, éster de NHS DY-631 de Dyomics. Otros marcadores detectables que se pueden utilizar incluyen otros colorantes, fluoróforos, cromóforos, marcadores de masa, puntos cuánticos y similares y los divulgados en la patente de Estados Unidos n.° 6.924.372.
En una realización, el intervalo de ensayo establecido para la concentración de la muestra es de 0,4 mg/ml a 0,6 mg/ml, correspondiente a una concentración final que se analiza de aproximadamente 7 pg/ml a 11 pg/ml que se somete a análisis de ECM en un sistema de electroforesis capilar en microchip para producir un electroforetograma. El método concluye mediante la identificación de picos en el electroforetograma correspondientes a contaminantes o impurezas.
C. Instrumental
El instrumental para realizar los ensayos de ECM divulgados está disponible comercialmente. En una realización preferida, los ensayos de ECM divulgados se realizan mediante LabChip GXII o LabChip GXII Touch HT y LabChip® HT Protein Express Chip.
III. Proteínas de interés
La proteína de interés, por ejemplo, un medicamento proteico, analizada con los ensayos y reactivos de ECM divulgados puede ser cualquier proteína de interés adecuada para la expresión en células procariotas o eucariotas y se puede utilizar en los sistemas de células hospedadoras genomanipulados proporcionados. Por ejemplo, la proteína de interés incluye, pero sin limitación, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un ScFv o fragmento del mismo, una proteína de fusión de Fc o fragmento de la misma, un factor de crecimiento o un fragmento del mismo, una citocina o un fragmento de la misma, o un dominio extracelular de un receptor de superficie celular o un fragmento del mismo. Las proteínas de interés pueden ser polipéptidos simples que consisten en una única subunidad o proteínas complejas de múltiples subunidades que comprenden dos o más subunidades. La proteína de interés puede ser un producto biofarmacéutico, aditivo o conservante alimentario, o cualquier producto proteico sujeto a normas de purificación y calidad.
En algunas realizaciones, el medicamento proteico (la proteína de interés) es un anticuerpo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, un anticuerpo monocatenario, un diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2, un anticuerpo IgD, un anticuerpo IgE, un anticuerpo IgM, un anticuerpo IgG, un anticuerpo de IgG1, un anticuerpo de IgG2, un anticuerpo IgG3 o un anticuerpo IgG4. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG4. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico IgG2/IgG4. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico IgG2/IgG1. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico IgG1/IgG2/IgG4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo antimuerte celular programada 1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD1 como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2015/0203579A1), un anticuerpo antiligando 1 de muerte celular programada (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1 como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2015/0203580A1), un anticuerpo anti-Dll4, un anticuerpo antiangiopoetina 2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-ANG2 como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 9.402.898), un anticuerpo similar a antiangiopoetina 3 (por ejemplo, un anticuerpo anti-AngPtl3 como se describe en la patente de Estados Unido n.° 9.018.356), un anticuerpo antirreceptor del factor de crecimiento procedente de plaquetas (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 9.265.827), un anticuerpo anti-Erb3, un anticuerpo antirreceptor de prolactina (por ejemplo, un anticuerpo anti-PRLR como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 9.302.015), un anticuerpo anticomplemento 5 (por ejemplo, un anticuerpo anti-C5 como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2015/0313194A1), un anticuerpo anti-TNF, un anticuerpo antirreceptor del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 9.132.192 o un anticuerpo anti-EGFRvIII como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2015/0259423A1), un anticuerpo antiproproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 9 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PCSK9 como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 8.062.640 o la patente de Estados Unidos n.° 9.540.449), un anticuerpo antifactor de crecimiento y diferenciación 8 (por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF8, también conocido como anticuerpo antimiostatina, como se describe en las patentes de Estados Unidos n.° 8.871.209 o 9.260.515), un anticuerpo antirreceptor de glucagón (por ejemplo, anticuerpo anti-GCGR como se describe en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2015/0337045A1 o US2016/0075778A1), un anticuerpo anti-VEGF, un anticuerpo anti-IL1R, un anticuerpo del receptor de interleucina 4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL4R como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2014/0271681A1 o las patentes de Estados Unidos n.° 8.735.095 u 8.945.559), un anticuerpo antirreceptor de interleucina 6 (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL6R como se describe en las patentes de Estados Unidos n.° 7.582.298, 8.043.617 o 9.173.880), un anticuerpo anti-IL1, un anticuerpo anti-IL2, un anticuerpo anti-IL3, un anticuerpo anti-IL4, un anticuerpo anti-IL5, un anticuerpo anti-IL6, un anticuerpo anti-IL7, una anticuerpo antiinterleucina 33 (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL33 como se describe en las patentes de Estados Unidos n.° 9.453.072 o 9.637.535), un anticuerpo antivirus sincitial respiratorio (por ejemplo, un anticuerpo anti-RSV como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 9.447.173), un anticuerpo antigrupo de diferenciación 3 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, como se describe en las patentes de Estados Unidos n.° 9.447.173 y 9.447.173 y en la solicitud de Estados Unidos n.° 62/222.605), un anticuerpo antigrupo de diferenciación 20 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20 como se describe en las patentes de Estados Unidos n.° 9.657.102 y US20150266966A1 y en la patente de Estados Unidos n.° 7.879.984), un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD28, un anticuerpo antigrupo de diferenciación 48 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD48 como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 9.228.014), un anticuerpo anti-Fel d1 (por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 9.079.948), un anticuerpo antivirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (por ejemplo, un anticuerpo anti-MERS como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2015/0337029A1), un anticuerpo antivirus del Ébola (por ejemplo, como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2016/0215040), un anticuerpo antivirus Zika, un anticuerpo antigen de activación de linfocitos 3 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LAG3 o un anticuerpo antiCD223), un anticuerpo antifactor de crecimiento nervioso (por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2016/0017029 y las patentes de Estados Unidos n.° 8.309.088 y 9.353.176) y un anticuerpo antiproteína Y. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo biespecífico anti-CD3 * anti-CD20 (como se describe en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2014/0088295A1 y US20150266966A1), un anticuerpo biespecífico anti-CD3 * antimucina 16 (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-CD3 * anti-Muc16) y un anticuerpo biespecífico anti-CD3 * antiantígeno de membrana específico de la próstata (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-CD3 * anti-PSMA). En algunas realizaciones, la proteína de interés se selecciona del grupo que consiste en abciximab, adalimumab, adalimumab-atto, ado-trastuzumab, alemtuzumab, alirocumab, atezolizumab, avelumab, basiliximab, belimumab, benralizumab, bevacizumab, bezlotoxumab, blinatumomab, brentuximab vedotina, brodalumab, canakinumab, capromab pendetida, certolizumab pegol, cemiplimab, cetuximab, denosumab, dinutuximab, dupilumab, durvalumab, eculizumab, elotuzumab, emicizumab-kxwh, emtansinealirocumab, evinacumab, evolocumab, fasinumab, golimumab, guselkumab, ibritumomab tiuxetán, idarucizumab, infliximab, infliximab-abda, infliximab-dyyb, ipilimumab, ixekizumab, mepolizumab, necitumumab, nesvacumab, nivolumab, obiltoxaximab, obinutuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, olaratumab, omalizumab, panitumumab, pembrolizumab, pertuzumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, reslizumab, rinucumab, rituximab, sarilumab, secukinumab, siltuximab, tocilizumab, tocilizumab, trastuzumab, trevogrumab, ustekinumab y vedolizumab.
En algunas realizaciones, la proteína de interés es una proteína recombinante que contiene una fracción Fc y otro dominio, (por ejemplo, una proteína de fusión de Fc). En algunas realizaciones, una proteína de fusión de Fc es una proteína de fusión de receptor de Fc, que contiene uno o más dominios extracelulares de un receptor acoplados a una fracción Fc. En algunas realizaciones, la fracción Fc comprende una región bisagra seguida de un dominio CH2 y CH3 de una IgG. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de receptor de Fc contiene dos o más cadenas de receptor distintas que se unen o bien a un solo ligando o bien a múltiples ligandos. Por ejemplo, una proteína de fusión de Fc es una proteína TRAP, tal como, por ejemplo, una IL-1 Trap (por ejemplo, rilonacept, que contiene la región de unión a ligando de IL-1RAcP fusionada a la región extracelular de IL-1R1 fusionada al Fc de hIgG1; véase la patente de Estados Unidos n.° 6.927.004), o una trampa de VEGF (por ejemplo, aflibercept o ziv-aflibercept, que comprende el dominio de Ig 2 del receptor Flt1 de VEGF fusionado al dominio de Ig 3 del receptor Flk1 de VEGF fusionado a Fc de hIgG1; véanse las Patentes de Estados Unidos n.° 7.087.411 y 7.279.159). En otras realizaciones, una proteína de fusión de Fc es una proteína de fusión de ScFv de Fc, que contiene uno o más de uno o más dominios de unión a antígeno, tal como un fragmento de cadena pesada variable y un fragmento de cadena ligera variable, de un anticuerpo acoplado a una fracción Fc.
IV. Cultivo celular
El medicamento proteico analizado con los ensayos y reactivos de ECM divulgados se producen en cultivos celulares. Los cultivos celulares pueden ser un "cultivo celular discontinuo alimentado" o "cultivo discontinuo alimentado" que se refiere a un cultivo discontinuo en donde las células y el medio de cultivo se suministran inicialmente al recipiente de cultivo y se alimentan lentamente nutrientes de cultivo adicionales, en incrementos discretos, al cultivo durante el cultivo, con o sin recolección periódica de células y/o producto antes de acabar el cultivo. El cultivo discontinuo alimentado incluye "cultivo discontinuo alimentado semicontinuo" en donde periódicamente se elimina el cultivo completo (que puede incluir células y medio) y se reemplaza por medio nuevo. El cultivo discontinuo alimentado se distingue del simple "cultivo discontinuo" en que todos los componentes para el cultivo celular (incluidas las células animales y todos los nutrientes del cultivo) se suministran al recipiente de cultivo al inicio del proceso de cultivo en el cultivo discontinuo. El cultivo discontinuo alimentado puede ser diferente del "cultivo de perfusión" en la medida en que el sobrenadante no se elimina del recipiente de cultivo durante un proceso discontinuo alimentado convencional, mientras que en el cultivo de perfusión, las células están restringidas en el cultivo por, por ejemplo, filtración, y el medio de cultivo se introduce y retira de forma continua o intermitente del recipiente de cultivo. Sin embargo, se contempla la extracción de muestras con fines de prueba durante el cultivo celular discontinuo alimentado. El proceso discontinuo alimentado continúa hasta que se determina que se alcanza el máximo volumen de trabajo y/o producción de proteína, y posteriormente se recoge la proteína.
El cultivo celular puede ser un "cultivo celular continuo", que es una técnica utilizada para hacer crecer células de manera continua, generalmente en una fase de crecimiento particular. Por ejemplo, si se requiere un suministro constante de células, o se requiere la producción de una proteína de interés particular, el cultivo celular puede necesitar mantenimiento en una fase particular de crecimiento. Por lo tanto, las condiciones deben controlarse de manera continua y ajustarse en consecuencia para mantener las células en esa fase particular.
Las células se cultivan en medio de cultivo celular. Las expresiones "medio de cultivo celular" y "medio de cultivo" se refieren a una solución nutritiva utilizada para cultivar células de mamíferos que normalmente proporciona los nutrientes necesarios para mejorar el crecimiento de las células, tal como una fuente de energía de hidratos de carbono, aminoácidos esenciales (por ejemplo, fenilalanina, valina, treonina, triptófano, metionina, leucina, isoleucina, lisina e histidina) y no esenciales (por ejemplo, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, prolina, serina y tirosina), oligoelementos, fuentes de energía, lípidos, vitaminas, etc. El medio de cultivo celular puede contener extractos, por ejemplo, suero o peptonas (hidrolizados), que suministran materias primas que apoyan el crecimiento celular. Los medios pueden contener extractos de soja o procedentes de levadura, en lugar de extractos de origen animal. El medio químicamente definido se refiere a un medio de cultivo celular en el que todos los componentes químicos son conocidos (es decir, tiene una estructura química conocida). El medio químicamente definido está completamente libre de componentes de origen animal, tales como peptonas de origen sérico o animal. En una realización, el medio es un medio químicamente definido.
La solución también puede contener componentes que mejoran el crecimiento y/o la supervivencia por encima de la tasa mínima, incluidas hormonas y factores de crecimiento. La solución se puede formular a un pH y una concentración de sal óptimos para la supervivencia y proliferación de la célula particular que se está cultivando.
Una "estirpe celular" se refiere a una célula o células que proceden de un linaje particular mediante pases en serie o subcultivos de células. El término "células" se utiliza indistintamente con "población de células".
El término "célula" incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen las de procariotas y eucariotas, tal como células bacterianas, células de mamífero, células humanas, células animales no humanas, células aviares, células de insecto, células de levadura o fusiones de células, tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En determinadas realizaciones, la célula es una célula humana, de mono, de simio, de hámster, de rata o de ratón. En otras realizaciones, la célula se selecciona de las siguientes células: células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de la retina, Vero, CV1, de riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, linfocito, por ejemplo, Jurkat (linfocito T) o Daudi (linfocito B), A431 (epidérmica), U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, célula MMT, célula madre, célula tumoral y una estirpe celular procedente de una célula mencionada anteriormente. En algunas realizaciones, la célula comprende uno o más genes víricos, por ejemplo, una célula de la retina que expresa un gen vírico (por ejemplo, una célula PER.C6®). En algunas realizaciones, la célula es una célula CHO. En otras realizaciones, la célula es una célula CHO K1.
V. Kits
Una realización proporciona un kit que incluye el uno o más de los tampones o ingredientes divulgados para preparar los tampones divulgados. El kit puede incluir un recipiente para los tampones o los ingredientes. Los tampones pueden estar en solución o en forma liofilizada. Opcionalmente, el kit también incluye un segundo recipiente que contiene un diluyente o solución reconstituyente para la formulación liofilizada; y, opcionalmente, instrucciones para el uso de la solución o la reconstitución y/o uso de los tampones liofilizados o ingredientes en polvo. En particular, la presente invención proporciona un kit que comprende un tampón de la presente invención e instrucciones escritas para preparar una muestra para electroforesis en el tampón.
El kit puede incluir además reactivos adicionales necesarios para realizar los ensayos de ECM divulgados, incluidos uno o más de un tampón, un diluyente y un filtro. El tampón y los reactivos pueden estar en una botella, un frasco o tubo de ensayo.
Ejemplo
Ejemplo 1: Ensayo de ECM para análisis de la pureza e impurezas de proteínas terapéuticas.
Métodos y materiales:
Materiales:
Se utilizaron LabChip GXII o LabChip GXII Touch HT y LabChip® HT Protein Express Chip para la separación electroforética capilar y la recopilación de datos (Perkin Elmer). Para el ensayo de ECM se utilizaron tampones desnaturalizantes reductores y no reductores divulgados anteriormente.
Métodos:
En la tabla 1 se muestra el procedimiento de flujo de trabajo para preparar una muestra para un ensayo de ECM. En resumen, las muestras de proteínas se diluyeron a 0,5 mg/ml. Se añadieron 1 pl de tampón desnaturalizante no reductor (NR) o reductor (R) y 4 pl de la muestra diluida a una placa de 96 pocillos. La muestra se mezcló, centrifugó y calentó durante 10 minutos a la temperatura especificada para el producto, normalmente 75 °C. Después, las muestras se marcaron con colorante 5 pM disponible comercialmente (por ejemplo, éster de NHS DY-631 de Dyomics). Las muestras se mezclaron, centrifugaron y después se calentaron a 35 °C durante 30 minutos. A continuación, la muestra marcada se diluyó con 105 pl de solución de parada diluida. Las muestras se separaron utilizando LabChip GXII o LabChip GXII Touch HT.
Tampones
Se prepararon soluciones madre de fosfato sódico monobásico monohidrato 200 mM, fosfato de sodio dibásico heptahidrato 200 mM y dodecilsulfato de litio (LDS) al 10 %. Mediante las soluciones madre y agua Milli-Q®, se prepararon soluciones de fosfato de sodio 100 mM, LDS al 1 % pH 6 y fosfato de sodio 100 mM,<L d S>al 1 % pH 9.
Se preparó un tampón no reductor mediante la adición de 34 pl de yodoacetamida (IAM) 1 M (preparado fresco en agua Milli-Q®) 166 pl de fosfato de sodio 100 mM, LDS al 1 % pH 6 5 pl de agua Milli-Q®. Las concentraciones finales fueron 2-yodoacetamida 166 mM, dodecilsulfato de litio al 0,81 % y fosfato de sodio 81 mM.
Se preparó un tampón reductor mediante la adición de 68 pl de agente reductor 10* (ditiotreitol (DTT) 500 mM 166 pl de fosfato de sodio 100 mM, LDS al 1 % pH 9 6 pl de agua Milli-Q®. Las concentraciones finales fueron de dodecilsulfato de litio al 0,69 %; fosfato de sodio 69 mM y ditiotreitol 142 mM.
______Tabla 1.Método de preparación de muestras para ensayo de ECM._____________________________ Preparación de muestras_______________________
_______________ NR________________________________ R________________
4 pl de muestra 0,5 mg/ml 4 pl de muestra 0,5 mg/ml _________ 1 pl de tampón NR___________________ 1 pl de tampón R__________ Mezclar, centrifugar, calentar a la temperatura especificada durante 10 minutos________________________ Marcado de muestras_____________________________________________5 pl de muestra desnaturalizada_____________________ ______________________ 5 pl de colorante PICO 5 pM______________________ __________ Mezclar, centrifugar, calentar a 35 °C durante 30 minutos______________________________________ Dilución final____________________________ 5 pl de muestra marcada
___________________ 105 pl de muestra de parada diluida___________________Método de separación________________________________________________HT PICO Protein Express 200__________________________________________
Resultados:
La electroforesis capilar en microchip (ECM) permite reducir drásticamente los tiempos de análisis de muestras, manteniendo los patrones de rendimiento y reproducibilidad necesarios para el análisis de control de calidad. Se desarrolló un ensayo de ECM utilizando los tampones desnaturalizantes reducidos y no reducidos divulgados en el presente documento. En las figuras 1A y 1B se muestran electroforetogramas representativos que muestran el análisis de proteínas en muestras no reducidas y muestras reducidas.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un tampón acuoso para muestras de electroforesis, que comprende:
2-yodoacetamida de 155 a 175 mM;
dodecilsulfato de litio del 0,50 al 1,5 %; y
fosfato de sodio de 75 a 95 mM,
en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH inferior a 7.
2. El tampón acuoso para muestras de electroforesis de la reivindicación 1, en donde:
(a) el pH es 6; y/o
(b) el tampón acuoso para muestras de electroforesis comprende 2-yodoacetamida 166 mM, dodecilsulfato de litio al 0,81 % y fosfato de sodio 81 mM.
3. Un tampón acuoso para muestras de electroforesis, que consiste en:
2-yodoacetamida 166 mM,
dodecilsulfato de litio al 0,81 % y
fosfato de sodio 81 mM,
en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH de 6,0.
4. Un método para identificar contaminantes o impurezas en una muestra de fármaco proteico, comprendiendo el método las etapas de:
añadir la muestra de fármaco proteico al tampón de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para formar una muestra de fármaco proteico tamponada;
calentar la muestra de fármaco proteico tamponada a una temperatura de 65 a 85 °C durante 5 a 15 minutos para formar una muestra de fármaco proteico tamponada desnaturalizada;
añadir un marcador detectable a la muestra de fármaco proteico tamponada desnaturalizada y calentarla a una temperatura de 30 a 40 °C durante 20 a 40 minutos para formar una muestra de fármaco proteico marcada desnaturalizada;
diluir la muestra de fármaco proteico marcada desnaturalizada y someterla a electroforesis capilar en microchip (ECM) para separar la muestra de fármaco proteico marcada desnaturalizada diluida en un sistema de electroforesis capilar en microchip para producir un electroforetograma; e identificar los picos en el electroforetograma correspondientes a contaminantes o impurezas.
5. El método de la reivindicación 4, en donde la muestra de fármaco proteico tamponada se calienta a 70 °C durante 10 min.
6. El método de la reivindicación 4 o 5, en donde la muestra se calienta a 35 °C durante 30 minutos.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la muestra de fármaco proteico diluida es 9 pg/ml.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde el marcador detectable es éster de N-hidroxisuccinimidilo DY-631.
9. Un kit que comprende el tampón de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 e
instrucciones escritas para preparar una muestra para electroforesis en el tampón.
10. Un tampón acuoso para muestras de electroforesis que comprende:
2-yodoacetamida de 55 a 75 mM;
dodecilsulfato de litio del 0,1 al 1,0 %;
cloruro de sodio de 5 a 115 mM y
HEPES de 5 a 85 mM,
en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH inferior a 9.
11. Un tampón acuoso para muestras de electroforesis que comprende:
2-yodoacetamida 66,4 mM;
dodecilsulfato de litio al 0,32 %;
NaCl 48,6 mM y
HEPES 16,2 mM,
en donde el tampón acuoso para muestras de electroforesis tiene un pH inferior a 9.
12. El tampón acuoso de la reivindicación 11, en donde el pH es 8.
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