JP7315565B2 - マイクロチップキャピラリー電気泳動アッセイおよび試薬 - Google Patents

マイクロチップキャピラリー電気泳動アッセイおよび試薬 Download PDF

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Description

発明の技術分野
本発明の態様は概して、キャピラリー電気泳動、特にマイクロチップキャピラリー電気泳動の分野を対象とする。
発明の背景
今日の品質管理（ＱＣ）ラボに課せられた生物学的製品の検査要求を満たすためには、堅牢で再現性が高く、使用者の使いやすい技術の導入が欠かせない。高品質の分析データを生成し続け、無効な試験結果の数や機器関連の調査を最小限に抑えるようにしつつ、出力結果の増加を促進するには、技術の格上げが必要である。電気泳動は、歴史的に製品の純度のＱＣと断片化分析に使用されてきたが、その方法は、ゲルを用いたものからキャピラリーを用いたもの、そして最近ではマイクロチップへと移行している。マイクロチップキャピラリー電気泳動（Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＭＣＥ））により、ＱＣ分析に必要な性能と再現性の基準を維持しつつ、サンプル分析時間を劇的に削減することができる（Ｏｕｉｍｅｔ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．,１２（２）：２１３－２２４（２０１７）（非特許文献１））。
ＭＣＥは、バイオ医薬品の特性評価、品質管理、および創薬のために製薬業界での使用が増加している有望な技術として登場したが、アッセイ干渉を起こしやすい傾向がある。
したがって、アッセイ干渉を低減する改良されたＭＣＥアッセイおよび組成物を提供することが本発明の目的である。
本発明の別の目的は、タンパク質薬物製造物中の不純物の検出を改善するＭＣＥアッセイおよび組成物を提供することである。
Ｏｕｉｍｅｔ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．,１２（２）：２１３－２２４（２０１７）
タンパク質薬物製造物サンプル中の純度を評価し不純物を同定するためのＭＣＥアッセイおよび試薬が提供される。タンパク質薬物サンプル中の分析物を分析する方法が提供される。好ましいタンパク質薬物には、抗体およびその抗原結合断片、融合タンパク質、ならびに組換えタンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。アッセイは、タンパク質製造物およびタンパク質製造物中の不純物を分離、同定、および定量するためにＭＣＥ技術を採用する。不純物には、タンパク質凝集体、タンパク質断片、タンパク質マルチマー、およびアッセイ汚染物質などが挙げられるが、これらには限定されない。還元性緩衝液および非還元性緩衝液も提供される。
一実施形態では、アルキル化剤、例えば１５５～１７５ｍＭの２－ヨードアセトアミド；０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウム；および６５～９５ｍＭのリン酸ナトリウムを含む非還元性の水性電気泳動サンプル緩衝液が提供され、ここで水性電気泳動サンプル緩衝液は７未満のｐＨを有する。好ましい実施形態では、緩衝液のｐＨは６である。別の実施形態では、水性緩衝液は、１６６ｍＭの２－ヨードアセトアミド、０．８１％のドデシル硫酸リチウム、および８１ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。
還元性緩衝液も提供される。一実施形態では、還元性緩衝液は、０．５～１．５％のドデシル硫酸リチウム、５５～８５ｍＭのリン酸ナトリウム、および還元剤を含む水性電気泳動サンプル緩衝液であり、ここで、水性電気泳動サンプル緩衝液は８より大きいｐＨを有する。好ましい実施形態では、緩衝液のｐＨは９である。一実施形態では、還元性緩衝液は、１３５～１５５ｍＭのジチオスレイトールを含む。さらに別の実施形態では、０．６９％のドデシル硫酸リチウム、６９ｍＭのリン酸ナトリウム、および１４２ｍＭのジチオスレイトールを含む還元性緩衝液が提供される。
ＨＥＰＥＳを用いた緩衝液もまた、本開示の方法と共に使用することができる。一実施形態では、アルキル化剤、例えば、５５～７５ｍＭの２－ヨードアセトアミド；０．１～１．０％のドデシル硫酸リチウム；５～８５ｍＭのＨＥＰＥＳ、および５～１１５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、非還元性のＨＥＰＥＳを用いた水性電気泳動サンプル緩衝液が提供され、ここで水性電気泳動サンプル緩衝液は９未満のｐＨを有する。別の実施形態では、緩衝液のｐＨは８である。さらに別の実施形態では、水性緩衝液は、６６．４ｍＭの２－ヨードアセトアミド、０．３２％のドデシル硫酸リチウム、１６．２ｍＭのＨＥＰＥＳ、および４８．６ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
別の実施形態では、０．０５～０．７５％のドデシル硫酸リチウム、５ｍＭ～１１５ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭ～１１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、および還元剤を含む、還元性のＨＥＰＥＳを用いた水性電気泳動サンプル緩衝液が提供され、ここで水性電気泳動サンプル緩衝液は７より大きいｐＨを有する。好ましい実施形態では、緩衝液のｐＨは８である。一実施形態では、還元性緩衝液は、３５～５０ｍＭのジチオスレイトールを含む。さらに別の実施形態では、０．２８％のドデシル硫酸リチウム、４１．５ｍＭの塩化ナトリウム、１３．８ｍＭのＨＥＰＥＳ、および４２．５ｍＭのジチオスレイトールを含む還元性緩衝液が提供される。
一実施形態では、タンパク質サンプルを上述の非還元性緩衝液に添加して緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップを含む、タンパク質薬物サンプル中の汚染物質または不純物を同定する非還元性ＭＣＥ法が提供される。緩衝化されたタンパク質薬物サンプルは、６５℃～８５℃の間に５分～１５分間加熱されて、変性した緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成する。好ましい実施形態では、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルは、７０℃に１０分間加熱される。
タンパク質薬物サンプルを、検出可能な標識と混合し３０～４０℃で２０～４０分間、加熱して、変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを形成する。好ましい検出可能な標識には、ダイノミクス社（Ｄｙｏｍｉｃｓ）製ＤＹ－６３１ ＮＨＳエステルなどが挙げられるが、これには限定されない。使用し得る他の検出可能な標識には、他の染料、フルオロフォア、クロモフォア、マスタグ、量子ドットなど、および参照によりその全体が援用される米国特許第６，９２４，３７２号に開示のものなどが挙げられる。好ましい実施形態では、標識を添加したタンパク質薬物サンプルは、３５℃に３０分間、加熱される。過剰な標識は任意で、例えばスピンフィルターを使用することによって、サンプルから除去される。
変性した標識されたタンパク質薬物製造物を希釈してＭＣＥにかけ、マイクロチップキャピラリー電気泳動システム上で、希釈されたタンパク質薬物サンプルを分離して、電気泳動図を作成する。一実施形態では、初めに０．５ｍｇ／ｍｌでマイクロチップ上に注入されたサンプルの最終濃度は、ＭＣＥへは９μｇ／ｍｌとなる。電気泳動図は、タンパク質薬物製造物および不純物に対応するピークを含む。この方法は、汚染物質または不純物に対応する、電気泳動図中のピークを特定することによって、完結する。
別の実施形態では、タンパク質薬物サンプル中の汚染物質または不純物を同定する還元性ＭＣＥ法が提供される。この方法は、タンパク質サンプルを上記のいずれかの還元性緩衝液に添加して、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成することから始まる。緩衝化されたタンパク質薬物サンプルは、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを６５～８５℃、好ましくは７０℃に１０分間、加熱することにより変性させ、変性したタンパク質薬物サンプルを形成する。タンパク質薬物サンプルを、検出可能な標識と混合し３０～４０℃で２０～４０分間加熱して、変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを形成する。好ましい実施形態では、標識を添加したタンパク質薬物サンプルは、３５℃に３０分間、加熱される。過剰な標識は任意で、例えばスピンフィルターを使用することによって、サンプルから除去される。好ましい検出可能な標識には、ダイノミクス社製ＤＹ－６３１ ＮＨＳエステルなどが挙げられるが、これには限定されない。使用され得る他の検出可能な標識には、他の染料、フルオロフォア、クロモフォア、マスタグ、量子ドットなど、および参照によりその全体が援用される米国特許第６，９２４，３７２号に開示のものなどが挙げられる。
一実施形態では、サンプル濃度について確立されたアッセイ範囲は０．４ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌであり、分析されている約７μｇ／ｍｌ～１１μｇ／ｍｌの最終濃度に対応しており、この最終濃度がマイクロチップキャピラリー電気泳動システム上でＭＣＥ分析にかけられて、電気泳動図が作成される。この方法は、汚染物質または不純物に対応する、電気泳動図中のピークを特定することによって、完結する。
[本発明1001]
155～175ｍＭの2－ヨードアセトアミドと、
0．50～1．5％のドデシル硫酸リチウムと、
75～95ｍＭのリン酸ナトリウムと
を含み、
7未満のｐＨを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。
[本発明1002]
ｐＨが6である、本発明1001の水性緩衝液。
[本発明1003]
166ｍＭの2－ヨードアセトアミドと、0．81％のドデシル硫酸リチウムと、81ｍＭのリン酸ナトリウムとを含む、本発明1001または1002の水性緩衝液。
[本発明1004]
166ｍＭの2－ヨードアセトアミドと、
0．81％のドデシル硫酸リチウムと、
81ｍＭのリン酸ナトリウムと
から成り、
6．0のｐＨを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。
[本発明1005]
0．50～1．5％のドデシル硫酸リチウムと、
45～75ｍＭのリン酸ナトリウムと、
還元剤と
を含み、
8より大きいｐＨを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。
[本発明1006]
ｐＨが9である、本発明1005の水性緩衝液。
[本発明1007]
135～155ｍＭのジチオスレイトールを含む、本発明1005または1006の水性緩衝液。
[本発明1008]
0．69％のドデシル硫酸リチウムと、69ｍＭのリン酸ナトリウムと、142ｍＭのジチオスレイトールとを含む、本発明1005～1007のいずれかの水性緩衝液。
[本発明1009]
0．69％のドデシル硫酸リチウムと、
69ｍＭのリン酸ナトリウムと、
142ｍＭのジチオスレイトールと
から成り、
9．0のｐＨを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。
[本発明1010]
タンパク質薬物サンプル中の汚染物質または不純物を同定する方法であって、
前記タンパク質薬物サンプルを本発明1001～1004のいずれかの緩衝液に添加して、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
前記緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを、65～85℃に5～15分間、加熱して、変性した緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
前記変性した緩衝化されたタンパク質薬物サンプルに検出可能な標識を添加し、30～40℃で20～40分間、加熱して、変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
前記変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを希釈し、ＭＣＥにかけて、マイクロチップキャピラリー電気泳動システム上で、希釈されたタンパク質薬物サンプルを分離し、電気泳動図を作成するステップと、
汚染物質または不純物に対応する、前記電気泳動図におけるピークを同定するステップと
を含む、方法。
[本発明1011]
前記緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを、70℃で10分間、加熱する、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記標識されたタンパク質薬物サンプルを、35℃で30分間、加熱する、本発明1010または1011の方法。
[本発明1013]
前記希釈されたタンパク質薬物サンプルが9ｍｇ／ｍｌである、本発明1010～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
タンパク質薬物サンプル中の汚染物質または不純物を同定する方法であって、
前記タンパク質サンプルを本発明1005～1009のいずれかの緩衝液に添加して、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
前記緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを65～85℃に5～15分間、加熱して、変性したタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
前記変性したタンパク質薬物サンプルに、検出可能な標識を添加し、30～40℃で20～40分間、加熱して、変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
前記変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを希釈し、マイクロチップキャピラリー電気泳動システム上でＭＣＥ分析にかけて、電気泳動図を作成するステップと、
汚染物質または不純物に対応する、前記電気泳動図におけるピークを同定するステップと
を含む、方法。
[本発明1015]
前記緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを、70℃で10分間、加熱する、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記サンプルを、35℃で30分間、加熱する、本発明1014または1015の方法。
[本発明1017]
前記希釈されたタンパク質薬物サンプルが9μｇ／ｍｌである、本発明1014～1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記検出可能な標識がＤＹ－631 Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、本発明1010～1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
本発明1001～1009のいずれかの緩衝液と、前記緩衝液中での電気泳動のためにサンプルを調製するための書面による指示書とを含む、キット。
[本発明1020]
55～75ｍＭの2－ヨードアセトアミドと、
0．1～1．0％のドデシル硫酸リチウムと、
5～115ｍＭの塩化ナトリウムと、
5～85ｍＭのＨＥＰＥＳと
を含み、
9未満のｐＨを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。
[本発明1021]
66．4ｍＭの2－ヨードアセトアミドと、
0．32％のドデシル硫酸リチウムと、
48．6ｍＭのＮａＣｌと、
16．2ｍＭのＨＥＰＥＳと
を含み、
9未満のｐＨを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。
[本発明1022]
ｐＨが8である、本発明1020または1021の水性緩衝液。
[本発明1023]
0．05～0．75％のドデシル硫酸リチウムと、
5ｍＭ～115ｍＭのＮａＣｌと、
5ｍＭ～85ｍＭのＨＥＰＥＳと、
35～50ｍＭのジチオスレイトールと
を含み、
7より大きいｐＨを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。
[本発明1024]
0．28％のドデシル硫酸リチウムと、
41．5ｍＭのＮａＣｌと、
13．8ｍＭのＨＥＰＥＳと、
42．5ｍＭのジチオスレイトールと
を含み、
7より大きいｐＨを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。
[本発明1025]
ｐＨが8である、本発明1023または1024の水性緩衝液。
図１Ａは、典型的な還元されていないサンプルの分析の電気泳動図を示す。図１Ｂは、典型的な還元されたサンプルの分析の電気泳動図を示す。Ｘ軸は分単位の時間を表し、Ｙ軸は相対蛍光単位（ＲＦＵ）を表す。移動時間の増加は、タンパク質サイズの増加に対応する。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書中に別段の指示がない限り、または文脈に矛盾することが明らかでない限り、請求されている本発明について記載する文脈において（とりわけ、特許請求の範囲との関連において）、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および同様な指示対象の使用は、単数形および複数形の両方を対象とするものと解釈すべきである。
本明細書において別段の指示がない限り、本明細書中の値の範囲の列挙は、該範囲内に含まれる各個別の値を個々に参照する簡略法として機能することのみを意図したものにすぎず、各個別の値は、あたかも本明細書中に個々に列挙されているかのように本明細書に援用されている。
「約」という用語が使用されている場合、値は、提示された値を約＋／－１０％の範囲で上回るかまたは下回るかのいずれかの値を記述することを意図したものである。他の実施形態において値は、提示された値を約＋／－５％の範囲で上回るかまたは下回るかのいずれかの値の範囲であり得る。他の実施形態において値は、提示された値を約＋／－２％の範囲で上回るかまたは下回るかのいずれかの値の範囲であり得る。他の実施形態において値は、提示された値を約＋／－１％の範囲で上回るかまたは下回るかのいずれかの値の範囲であり得る。先行する範囲は、状況によって明確になることを意図しており、これ以上の制限は示唆されていない。本明細書中に別段の指示がない限り、または文脈に矛盾することが明らかでない限り、本明細書において記載される全ての方法は、任意の適切な順序で実行できる。本明細書中に提供されているありとあらゆる例、または例示的な言い回し（例えば、「のような（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、あくまで発明を分かりやすく例証することを意図したものであり、別途請求されていない限り、本発明の範囲を限定するものではない。非請求要素が本発明の実施に必須であることを示唆する言い回しは、本明細書中に一切含まれていないものと解釈すべきである。
「タンパク質」とは、ペプチド結合を介して互いに結合された２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。タンパク質にはポリペプチドとペプチドが含まれ、さらに例えばグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ－リボシル化などの改変も含まれ得る。タンパク質は、タンパク質を主成分とする薬物をはじめとする科学的または商業的関心の対象となり得る。それらのタンパク質の代表としては、酵素、リガンド、受容体、抗体、およびキメラもしくは融合タンパク質が挙げられる。タンパク質は、周知の細胞培養方法を使用して、様々なタイプの組換え細胞によって生産され、一般的には遺伝子工学技術（例えば、キメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、イントロンを含まない配列など）によって細胞内に導入され、エピソームとして存在する場合もあれば、または細胞のゲノムに組み込まれる場合もある。
「抗体」とは、ジスルフィド結合を介して互いに結合された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、および２つの軽（Ｌ）鎖からなる、免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）と、重鎖定常領域とを有する。重鎖定常領域には、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３という３つのドメインが含まれている。各軽鎖は、軽鎖可変領域と、軽鎖定常領域とを有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に更に細分化されており、これらＣＤＲには、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、これらは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端にかけて配置されている。「抗体」という用語には、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方に対する言及が包含される。「抗体」という用語には、抗体発現用にトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体のように、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体分子も包含される。また、抗体という用語には、二重特異性抗体も含まれ、この二重特異性抗体には、複数のそれぞれ異なるエピトープに結合できるヘテロ四量体免疫グロブリンが含まれる。二重特異性抗体は、米国特許第８，５８６，７１３号に概説されており、本特許は、参照により本出願に援用されている。
「Ｆｃ融合タンパク質」は、１つが免疫グロブリン分子のＦｃ部分である、２つ以上のタンパク質の一部または全部を含み、それらのタンパク質は、自然界では他の方法では一緒には見いだされない。抗体由来のポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製が、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８８：１０５３５（１９９１）；Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７（１９９０）；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１－１０．１９．１１（１９９２）に記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分に結合した受容体の１つまたは複数の細胞外ドメインを含み、Ｆｃ部分は、いくつかの実施形態では、免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインに続くヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、１つまたは複数の配位子に結合する２つ以上の異なる受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えばＩＬ－１トラップまたはＶＥＧＦトラップなどのトラップである。
用語「ＭＣＥ」または「マイクロチップキャピラリー電気泳動」は、マイクロチップを用いたキャピラリー電気泳動（ＣＥ）による分析物の分離を指す。
ＩＩ．ＭＣＥアッセイと緩衝液
タンパク質薬物サンプル中の分析物を分析する方法が提供される。好ましいタンパク質薬物には、抗体およびその抗原結合断片、融合タンパク質、および組換えタンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。アッセイは、タンパク質製造物およびタンパク質製造物中の不純物を分離、同定、および定量するためにＭＣＥ技術を採用する。不純物には、タンパク質凝集体、タンパク質断片、タンパク質マルチマー、およびアッセイ汚染物質などが挙げられるが、これらには限定されない。還元性緩衝液および非還元性緩衝液も提供される。
Ａ．緩衝液
１．非還元性緩衝液
一実施形態では、１５５～１７５ｍＭのアルキル化剤、例えば２－ヨードアセトアミドまたはＮＥＭ；０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウム；および７５～９５ｍＭのリン酸ナトリウムを含む非還元性の水性電気泳動サンプル緩衝液が提供され、ここで水性電気泳動サンプル緩衝液は７未満のｐＨを有する。好ましい実施形態では、緩衝液のｐＨは６である。別の実施形態では、水性緩衝液は、１６６ｍＭの２－ヨードアセトアミド、０．８１％のドデシル硫酸リチウム、および８１ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。
２．還元性緩衝液
還元性緩衝液も提供される。一実施形態では、還元性緩衝液は、０．５～１．５％のドデシル硫酸リチウム、６５～９５ｍＭのリン酸ナトリウム、および還元剤を含む水性電気泳動サンプル緩衝液であり、ここで、水性電気泳動サンプル緩衝液は８より大きいｐＨを有する。好ましい実施形態では、緩衝液のｐＨは９である。
還元剤は、当技術分野では公知である。例示的な還元剤には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、ＣＡＳ ３４８３－１２－３）、β－メルカプトエタノール（ＢＭＥ、２ＢＭＥ、２－ＭＥ、ｂ－ｍｅｒ、ＣＡＳ ６０－２４－２）、２－アミノエタンチオール（２－ＭＥＡ－ＨＣｌ、システアミン－ＨＣｌとも称されるもの、ＣＡＳ １５６－５７－０）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、（ＴＣＥＰ、ＣＡＳ ５９６１－８５－３）、システイン塩酸塩（Ｃｙｓ－ＨＣｌ、ＣＡＳ ５２－８９－１）、または２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳＮＡ）などが挙げられるが、これらには限定されない。タンパク質結合を還元する他の方法も当分野に公知であり、例えば固定化還元カラムが挙げられ、このカラムはチオール系還元剤が固定化された樹脂を含有しており、ペプチドおよびタンパク質のジスルフィド結合の固相還元が可能である。酸化剤を含め、還元剤がポリペプチド間の化学的相互作用を低減するのに適していることが想定される。
一実施形態では、還元性緩衝液は、１３５～１５５ｍＭのジチオスレイトールを含む。
さらに別の実施形態では、０．６９％のドデシル硫酸リチウム、６９ｍＭのリン酸ナトリウム、および１４２ｍＭのジチオスレイトールを含む還元性緩衝液が提供される。
３．ＨＥＰＥＳを用いた非還元性緩衝液
ＨＥＰＥＳを用いた緩衝液もまた、本開示の方法と共に使用することができる。一実施形態では、アルキル化剤、例えば、５５～７５ｍＭの２－ヨードアセトアミド；０．１～１．０％ドデシル硫酸リチウム；５～８５ｍＭのＨＥＰＥＳ、および５～１１５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、非還元性のＨＥＰＥＳを用いた水性電気泳動サンプル緩衝液が提供され、ここで水性電気泳動サンプル緩衝液は９未満のｐＨを有する。好ましい実施形態では、緩衝液のｐＨは８である。別の実施形態では、水性緩衝液は、６６．４ｍＭの２－ヨードアセトアミド、０．３２％のドデシル硫酸リチウム、１６．２ｍＭのＨＥＰＥＳ、および４８．６ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
４．ＨＥＰＥＳを用いた還元性緩衝液
別の実施形態では、０．０５～０．７５％のドデシル硫酸リチウム、５ｍＭ～１１５ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭ～１１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、および還元剤を含む、還元性のＨＥＰＥＳを用いた水性電気泳動サンプル緩衝液が提供され、ここで水性電気泳動サンプル緩衝液は７より大きいｐＨを有する。好ましい実施形態では、緩衝液のｐＨは８である。一実施形態では、還元性緩衝液は、３５～５０ｍＭのジチオスレイトールを含む。さらに別の実施形態では、０．２８％のドデシル硫酸リチウム、４１．５ｍＭの塩化ナトリウム、１３．８ｍＭのＨＥＰＥＳ、および４２．５ｍＭのジチオスレイトールを含む還元性緩衝液が提供される。
Ｂ．アッセイ
１．非還元性アッセイ
一実施形態では、タンパク質薬物サンプル中の汚染物質または不純物を同定する非還元性ＭＣＥ法が提供され、この方法は、タンパク質サンプルを、上に考察した非還元性緩衝液に添加して、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップを含む。緩衝化されたタンパク質薬物サンプルは、６５℃～８５℃の間に５分～１５分間加熱されて、変性した緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成する。好ましい実施形態では、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルは、７０℃に１０分間加熱される。次いで、検出可能な標識を、変性した緩衝化されたタンパク質薬物サンプルに添加し、３０～４０℃で２０～４０分間、加熱して、変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを形成する。好ましい実施形態では、標識が添加された変性したタンパク質薬物サンプルは、３５℃に３０分間、加熱される。過剰な標識は任意で、例えばスピンフィルターを使用することによって、サンプルから除去される。
好ましい検出可能な標識には、ダイノミクス社製ＤＹ－６３１ ＮＨＳエステルなどが挙げられるが、これには限定されない。使用し得る他の検出可能な標識には、他の染料、フルオロフォア、クロモフォア、マスタグ、量子ドットなど、および参照によりその全体が援用される米国特許第６，９２４，３７２号に開示のものなどが挙げられる。
変性した標識されたタンパク質薬物製造物を希釈してＭＣＥにかけ、マイクロチップキャピラリー電気泳動システム上で、希釈されたタンパク質薬物サンプルを分離して、電気泳動図を作成する。一実施形態では、初めに０．５ｍｇ／ｍｌでマイクロチップ上に注入されたサンプルの最終濃度は、ＭＣＥへは９μｇ／ｍｌとなる。別の実施形態では、サンプル開始濃度は０．２ｍｇ／ｍｌである。電気泳動図は、タンパク質薬物製造物および不純物に対応するピークを含む。この方法は、汚染物質または不純物に対応する、電気泳動図中のピークを特定することによって、完結する。
２．還元性アッセイ
別の実施形態では、タンパク質薬物サンプル中の汚染物質または不純物を同定する還元性ＭＣＥ法が提供される。この方法は、タンパク質薬物サンプルを、上記の還元性緩衝液のうちのいずれか１つに添加して、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成することから始まる。緩衝化されたタンパク質薬物サンプルは、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを６５～８５℃、好ましくは７０℃に１０分間、加熱することにより変性させ、変性したタンパク質薬物サンプルを形成する。次いで、標識を添加されたタンパク質薬物サンプルを３０～４０℃で２０～４０分間、加熱して、変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを形成する。好ましい実施形態では、標識を付加されたタンパク質薬物製造物サンプルは、３５℃に３０分間、加熱される。過剰な標識は任意で、例えばスピンフィルターを使用することによって、サンプルから除去される。好ましい検出可能な標識には、ダイノミクス社製ＤＹ－６３１ ＮＨＳエステルなどが挙げられるが、これには限定されない。使用され得る他の検出可能な標識には、他の染料、フルオロフォア、クロモフォア、マスタグ、量子ドットなど、および参照によりその全体が援用される米国特許第６，９２４，３７２号に開示のものなどが挙げられる。
一実施形態では、サンプル濃度について確立されたアッセイ範囲は０．４ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌであり、分析されている約７μｇ／ｍｌ～１１μｇ／ｍｌの最終濃度に対応しており、この最終濃度がマイクロチップキャピラリー電気泳動システム上でＭＣＥ分析にかけられて、電気泳動図が作成される。この方法は、汚染物質または不純物に対応する、電気泳動図中のピークを特定することによって、完結する。
Ｃ．計測装置
本開示のＭＣＥアッセイを実行するための計測装置は、市販されている。好ましい実施形態では、本開示のＭＣＥアッセイは、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩまたはＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴ、およびＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐを用いて実行される。
ＩＩＩ．対象のタンパク質
本開示のＭＣＥアッセイおよび試薬を用いてアッセイされる、対象のタンパク質、例えばタンパク質薬物製造物は、原核細胞または真核細胞での発現に適した対象のタンパク質であれば、どのようなものであってもよく、提供される人工宿主細胞システムにおいて使用することができる。例えば、対象のタンパク質としては、限定されるものではないが、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ＳｃＦｖもしくはそのフラグメント、Ｆｃ融合タンパク質もしくはそのフラグメント、成長因子もしくはそのフラグメント、サイトカインもしくはそのフラグメント、または細胞表面受容体もしくはそのフラグメントの細胞外ドメインが挙げられる。対象のタンパク質は、単一のサブユニットからなる単純なポリペプチドである場合もあれば、あるいは２つ以上のサブユニットを含む複雑なマルチサブユニットタンパク質である場合もある。対象のタンパク質は、生物医薬品、食品添加物、または保存料、または精製および品質基準の対象となるいかなるタンパク質製造物であってもよい。
いくつかの実施形態では、タンパク質薬物製造物（対象のタンパク質）は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディもしくはテトラボディ、ＦａｂフラグメントもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体は、抗プログラム細胞死１抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５７９Ａ１号に記載の抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド－１（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５８０Ａ１号に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン－２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載の抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば米国特許第９，０１８，３５６号に記載の抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載の抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載の抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体５抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３１３１９４Ａ１号に記載の抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗上皮成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載の抗ＥＧＦＲ抗体、または米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２３Ａ１号に記載の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン－９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号もしくは米国特許９，５４０，４４９号に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗増殖分化因子８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号もしくは同第９，２６０，５１５号に記載の抗ＧＤＦ８抗体（別称：抗ミオスタチン抗体））、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３３７０４５Ａ１号もしくは同第２０１６／００７５７７８Ａ１号に記載の抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ｌＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６８１Ａ１号、または米国特許第８，７３５，０９５号もしくは同第８，９４５，５５９号に記載の抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、同第８，０４３，６１７号もしくは同第９，１７３，８８０号に記載の抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許第９，４５３，０７２号もしくは同第９，６３７，５３５号に記載の抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸系発疹ウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第９，４４７，１７３号に記載の抗ＲＳＶ抗体）、抗分化クラスター３（例えば、米国特許第９，４４７，１７３号および同第９，４４７，１７３号、ならびに米国特許第６２／２２２，６０５号に記載の抗ＣＤ３抗体）、抗分化クラスター２０（例えば、米国特許第９，６５７，１０２号および同第２０１５０２６６９６６Ａ１号、ならびに米国特許第７，８７９，９８４号に記載の抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗分化クラスター４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載の抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載の抗体）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３３７０２９Ａ１号に記載の抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２１５０４０号に記載の抗体）、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１７０２９号、ならびに米国特許第８，３０９，０８８号および同第９，３５３，１７６号に記載の抗ＮＧＦ抗体）、および抗プロテインＹ抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３ｘ抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５Ａ１号および米国特許出願公開第２０１５０２６６９６６Ａ１号に記載）、抗ＣＤ３ｘ抗ムチン１６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃ１６二重特異性抗体）、および抗ＣＤ３ｘ抗前立腺特異的膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３ｘ抗－ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アダリムマブ－アト、アド－トラスツズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブロダツマブ、カナキヌマブ、カプロマブペンデタイド、セルトリズマブペゴル、セミプリマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エロツズマブ、エミシズマブ－ｋｘｗｈ、エンタンシネリロクマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、ファシヌマブ、ゴリムマブ、グセルクマブ、イブリツモマブチウクセタン、イダルシズマブ、インフリキシマブインフリキシマブ－アブダ、インフリキシマブ－ダイブ、イピリムマブ、イキセキズマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ネスバクマブ、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルツナブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リヌクマブ、リツキシマブ、サリルマブ、セキキヌマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トレボグルマブ、ウステキヌマブ、およびベドリズマブからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、対象のタンパク質は、Ｆｃ部分と別のドメインとを含む、組換えタンパク質（Ｆｃ融合タンパク質など）である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ部分に結合した受容体の１つまたは複数の細胞外ドメインを含む、受容体Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分はヒンジ領域を含み、その後にＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインが続く。いくつかの実施形態では、受容体Ｆｃ融合タンパク質には、単一のリガンドまたは複数のリガンドのいずれかに結合する、２つ以上の別個の受容体鎖が含まれる。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＲＡＰタンパク質、例えば、ＩＬ－１トラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＩＬ－１Ｒ１細胞外領域に融合したＩＬ－１ＲａｃＰリガンド結合領域を含む、リロナセプト；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９２７，００４号を参照されたい）、またはＶＥＧＦトラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含む、アフリベルセプトまたはジブ－アフリベルセプト；米国特許第７，０８７，４１１号および第７，２７９，１５９号を参照されたい）である。他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、１つまたは複数の抗原結合ドメイン（Ｆｃ部分に結合した抗体の可変重鎖フラグメントおよび可変軽鎖フラグメントなど）を１つ以上含む、ＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質である。
ＩＶ．細胞培養
本開示のＭＣＥアッセイおよび試薬を用いてアッセイされるタンパク質薬物製造物は、細胞培養物である。細胞培養は、回分培養を指す「流加回分細胞培養」または「流加回分培養」であり得る。本回分培養では、まず細胞および培地を培養容器に供給する。追加的な培養栄養素は、培養中に離散的増分にて培養物にゆっくり供給される。この栄養素供給は、培養終了前に、細胞および／または産物を定期的に採取することの有無に関係なく為される。流加回分培養には、培養物全体（細胞および培地を含み得る）を定期的に取り除いて新鮮な培地と交換する、「半連続流加回分培養」が含まれる。流加回分培養は、単純な「回分培養」とは区別される。この回分培養において、細胞培養用の全てのコンポーネント（動物細胞および全ての培養栄養素を含む）が、回分培養の培養プロセスの開始時に培養容器に供給される。流加回分培養は、標準的な流加プロセス中に培養容器から上澄みが除去されない限り、「灌流培養」とは異なり得る。この灌流培養では、細胞は、例えば濾過によって培養物中に拘束され、培養培地が連続的または断続的に導入されて培養容器から除去される。対照的に、流加細胞培養中には、試験目的でサンプルを取り除くことが想到される。流加プロセスは、ワーキングボリューム（ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）および／またはタンパク質産生が最大限に到達したことが判別され、且つ以後にタンパク質が回収されるまで継続される。
細胞培養は、「連続細胞培養」とされる場合がある。この細胞培養は、通常は特定の成長段階にて、細胞を継続的に成長させる目的に用いられる技術である。例えば、細胞をコンスタントに供給することが必要とされる場合、または特定の対象のタンパク質を生産することが必要とされる場合、細胞培養物を、特定の成長段階にて、維持することが必要であると考えられる。したがって、その特定の段階にて細胞を維持するには、条件を継続的にモニターして、それに応じて調整する必要がある。
細胞は、細胞培養培地で培養される。「細胞培養培地」および「培養培地」という用語は、哺乳動物細胞の増殖に使用される栄養溶液を指す。この栄養溶液は、通常、細胞の成長を促進するために必要な栄養素を提供する。例えば、炭水化物エネルギー源とされる、必須アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、バリン、スレオニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、リジン、ヒスチジン）、非必須アミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、チロシン）、微量元素、エネルギー源、脂質、ビタミンなどである。細胞培養培地は、細胞増殖を支持する原料を供給する抽出物、例えば、血清またはペプトン（加水分解物）を含有し得る。培地は、動物由来の抽出物の代わりに、酵母由来または大豆抽出物を含有してもよい。化学的に定義された培地は、全ての化学成分が公知である（すなわち、公知の化学構造を有する）細胞培養培地を指す。化学的に定義済みの培地は、血清または動物由来のペプトンのような、動物由来の成分は全く含まれていない。一実施形態では、培地は、化学的に定義済みの培地とされる。
また、溶液は、成長率および／または生存率を最低率を超える程度に増強させる成分（ホルモンおよび成長因子など）も含有してもよい。本溶液は、培養の対象となる特定の細胞を生存させ且つ増殖させるのに最適なｐＨおよび塩濃度となるように調合してもよい。
「細胞株」とは、細胞の連続継代または継代培養を介して特定の系統から誘導される、細胞（１種または複数種）を指す。「細胞」という用語は、「細胞母集団」と同義に使用される。
「細胞」という用語には、組換え核酸配列を発現するのに好適な、任意の細胞が包含される。細胞には、細菌細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、酵母細胞などの原核生物および真核生物の細胞、または例えばハイブリドーマやクアドローマなどの細胞融合体が挙げられる。或る特定の実施形態において、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。他の実施形態では、細胞は、下記の細胞：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、リンパ球、例えばジャーカット（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（表皮）、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）が、細胞内に含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の実施形態では、細胞はＣＨＯ Ｋ１である。
Ｖ．キット
一実施形態では、１つまたは複数の本開示の緩衝液または成分を含む、本開示の緩衝液を製造するキットが提供される。キットは、緩衝液または成分のための容器を含むことができる。緩衝液は、溶液状態、または凍結乾燥された形態とすることができる。キットはまた任意で、凍結乾燥された製剤のための希釈剤すなわち再構成溶液を含む第２の容器を含み；そして任意で、溶液または再構成溶液の使用、および／または凍結乾燥された緩衝液または粉末状成分の使用についての指示書を含む。
キットは、緩衝液、希釈剤、およびフィルターのうちの１つまたは複数を含め、本開示のＭＣＥアッセイを実行するのに必要な試薬をさらに含んでいてもよい。緩衝液および試薬は、瓶、バイアル、または試験管に入っていてもよい。
実施例１：治療用タンパク質の純度および不純物分析のためのＭＣＥアッセイ
方法および材料：
材料：
キャピラリー電気泳動分離およびデータ収集には、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩまたはＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴおよびＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐを使用した（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））。上記の開示された非還元性および還元性変性緩衝液を、ＭＣＥアッセイに使用した。
方法：
表１に、ＭＣＥアッセイ用のサンプルを調製するワークフロー手順を示す。簡潔には、タンパク質サンプルを０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。１μｌの非還元性（ＮＲ）または還元性（Ｒ）変性緩衝液と４μｌの希釈サンプルを９６ウェルプレートに加えた。サンプルを混合、遠心分離し、製造物に指定された温度、通常は７５℃で１０分間、加熱した。次いで、サンプルを５μＭの市販の色素（例えば、ダイノミクス社製ＤＹ－６３１ ＮＨＳエステル）で標識した。サンプルを混合、遠心分離し、次いで３５℃で３０分間、加熱した。次いで、標識されたサンプルを１０５μｌの希釈停止溶液で希釈した。サンプルを、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩまたはＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴを用いて分離した。
緩衝液
２００ｍＭのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、２００ｍＭのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物、および１０％のドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）のストック溶液を調製した。このストック溶液とＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を使用して、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１％のＬＤＳでｐＨ６のもの、および１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１％のＬＤＳでｐＨ９のものの溶液を調製した。
３４μＬの１Ｍヨードアセトアミド（ＩＡＭ）（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水で調製したてのもの）＋１６６μＬの１００ｍＭリン酸ナトリウム、１％のＬＤＳでｐＨ６のもの＋５μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を添加して、非還元性緩衝液を調製した。最終濃度は、１６６ｍＭの２－ヨードアセトアミド、０．８１％のドデシル硫酸リチウム、および８１ｍＭのリン酸ナトリウムであった。
６８μＬの１０倍還元剤（５００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）＋１６６μＬの１００ｍＭリン酸ナトリウム、１％のＬＤＳでｐＨ９のもの＋６μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水）を添加して還元性緩衝液を調製した。最終濃度は、０．６９％のドデシル硫酸リチウム；６９ｍＭのリン酸ナトリウム；および１４２ｍＭのジチオスレイトールであった。
（表１）ＭＣＥアッセイのためのサンプル調製方法
Figure 0007315565000001
結果
マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）により、ＱＣ分析に必要な性能と再現性の基準を維持しつつ、サンプル分析時間を劇的に削減することが可能になる。ＭＣＥアッセイを、本明細書に開示の還元されていないおよび還元された変性緩衝液を使用して発展させた。図１Ａ～１Ｂに、還元されていないサンプルおよび還元されたサンプル中のタンパク質の分析結果を示す代表的な電気泳動図を示す。
前述の明細書では、本発明をその或る特定の実施形態との関連において説明し、例証目的に多くの詳細を記載してきたが、本発明が追加的な実施形態を受け入れる余地のあること、および本明細書に記載される特定の詳細が、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更できることは、当業者に明らかであろう。
本明細書中に引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により援用されている。本発明は、その趣旨または本質的属性から逸脱することなしに他の特定の形態で実施できる。したがって、本発明の範囲を指示するものとして参照すべきは、前述の明細書ではなく、寧ろ添付の特許請求の範囲である。

Claims (13)

  1. １５５～１７５ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、
    ０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、
    ７５～９５ｍＭのリン酸ナトリウムと
    を含み、
    ７未満のｐＨを有する、
    汚染物質または不純物を同定するためにマイクロチップキャピラリー電気泳動に供するための、水性電気泳動サンプル緩衝液。
  2. ｐＨが６である、請求項１に記載の水性電気泳動サンプル緩衝液。
  3. １６６ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、０．８１％のドデシル硫酸リチウムと、８１ｍＭのリン酸ナトリウムとを含む、請求項１に記載の水性電気泳動サンプル緩衝液。
  4. １６６ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、
    ０．８１％のドデシル硫酸リチウムと、
    ８１ｍＭのリン酸ナトリウムと
    から成り、
    ６．０のｐＨを有する、
    汚染物質または不純物を同定するためにマイクロチップキャピラリー電気泳動に供するための、水性電気泳動サンプル緩衝液。
  5. タンパク質薬物サンプル中の汚染物質または不純物を同定する方法であって、
    前記タンパク質薬物サンプルを、１５５～１７５ｍＭの２－ヨードアセトアミドと０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウムと７５～９５ｍＭのリン酸ナトリウムを含み、７未満のｐＨを有する、水性電気泳動サンプル緩衝液に添加して、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
    前記緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを、６５～８５℃に５～１５分間、加熱して、変性した緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
    前記変性した緩衝化されたタンパク質薬物サンプルに検出可能な標識を添加し、３０～４０℃で２０～４０分間、加熱して、変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
    前記変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを希釈し、マイクロチップキャピラリー電気泳動にかけて、マイクロチップキャピラリー電気泳動システム上で、希釈された変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを分離し、電気泳動図を作成するステップと、
    汚染物質または不純物に対応する、前記電気泳動図におけるピークを同定するステップと
    を含む、方法。
  6. 前記緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを、７０℃で１０分間、加熱する、請求項５に記載の方法。
  7. 前記変性した緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを、３５℃で３０分間、加熱する、請求項５に記載の方法。
  8. 前記希釈されたタンパク質薬物サンプルが９μｇ／ｍｌである、請求項５に記載の方法。
  9. 前記検出可能な標識がＤＹ－６３１ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、請求項５に記載の方法。
  10. １５５～１７５ｍＭの２－ヨードアセトアミドと０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウムと７５～９５ｍＭのリン酸ナトリウムを含み、７未満のｐＨを有する、水性電気泳動サンプル緩衝液と、前記水性電気泳動サンプル緩衝液中でのマイクロチップキャピラリー電気泳動のためにサンプルを調製して、汚染物質または不純物を同定するための書面による指示書とを含む、キット。
  11. ５５～７５ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、
    ０．１～１．０％のドデシル硫酸リチウムと、
    ５～１１５ｍＭの塩化ナトリウムと、
    ５～８５ｍＭのＨＥＰＥＳと
    を含み、
    ９未満のｐＨを有する、
    汚染物質または不純物を同定するためにマイクロチップキャピラリー電気泳動に供するための、水性電気泳動サンプル緩衝液。
  12. ６６．４ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、
    ０．３２％のドデシル硫酸リチウムと、
    ４８．６ｍＭのＮａＣｌと、
    １６．２ｍＭのＨＥＰＥＳと
    を含み、
    ９未満のｐＨを有する、
    汚染物質または不純物を同定するためにマイクロチップキャピラリー電気泳動に供するための、水性電気泳動サンプル緩衝液。
  13. ｐＨが８である、請求項１２に記載の水性電気泳動サンプル緩衝液。
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