ES2971045T3 - Moléculas multiespecíficas de unión a antígeno y usos de las mismas - Google Patents

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antigen
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Julian Andreev
Nithya Thambi
Frank Delfino
Joel Martin
Gavin Thurston
Katherine Cygnar
Nicholas Papadopoulos
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Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Abstract

La presente divulgación proporciona moléculas de unión a antígenos multiespecíficas y usos de las mismas. Las moléculas de unión a antígeno multiespecíficas comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a una molécula diana, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a una proteína efectora de internalización. Las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno de la presente divulgación pueden ser, en algunas realizaciones, anticuerpos biespecíficos que son capaces de unirse tanto a una molécula diana como a una proteína efectora de internalización. En ciertas realizaciones de la divulgación, la unión simultánea de la molécula diana y la proteína efectora de internalización por la molécula de unión a antígeno multiespecífica de la presente divulgación da como resultado la atenuación de la actividad de la molécula diana en mayor medida que la unión de la molécula diana sola. En otras realizaciones de la divulgación, la molécula diana es un antígeno asociado a tumor, y la unión simultánea del antígeno asociado a tumor y la proteína efectora de internalización por la molécula de unión a antígeno multiespecífica de la presente divulgación provoca o facilita la destrucción dirigida de células tumorales. . (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas multiespecíficas de unión a antígeno y usos de las mismas
Campo
La presente invención se refiere al campo de las proteínas terapéuticas y, en particular, al campo de las proteínas terapéuticas que son capaces de inactivar, bloquear, atenuar, eliminar y/o reducir la concentración de una o más moléculas dianain vitrooin vivo.
Antecedentes
Los tratamientos terapéuticos a menudo requieren la inactivación o el bloqueo de una o más moléculas diana que actúan sobre una célula o en sus proximidades. Por ejemplo, los tratamientos basados en anticuerpos a menudo funcionan mediante la unión a un antígeno particular expresado en la superficie de una célula, o a un ligando soluble, interfiriendo así con la actividad biológica normal del antígeno. Se ha demostrado que los anticuerpos y otras construcciones de unión dirigidas contra diversas citocinas (por ejemplo, IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33, etc.), o sus respectivos receptores, por ejemplo, son útiles en el tratamiento de una amplia gama de dolencias y enfermedades humanas. Los agentes terapéuticos de este tipo normalmente funcionan bloqueando la interacción entre la citocina y su receptor para atenuar o inhibir la señalización celular. En determinados contextos, sin embargo, sería terapéuticamente beneficioso inactivar o inhibir la actividad de una molécula diana de una manera que no implique necesariamente bloquear su interacción física con otro componente. Una manera de lograr dicha atenuación sin bloqueo de una molécula diana sería reducir la concentración extracelular o en la superficie celular de la molécula diana. Aunque en la materia se conocen estrategias genéticas y basadas en ácidos nucleicos para reducir la cantidad o concentración de una molécula diana determinada, dichas estrategias suelen estar plagadas de importantes complicaciones técnicas y reacciones adversas no deseadas en entornos terapéuticos. Por consiguiente, se necesitan estrategias alternativas sin bloqueo para facilitar la inactivación o atenuación de diversas moléculas diana con fines terapéuticos.
Se mencionan también los siguientes documentos:
- El documento WO 2013/138400 A1 que se refiere a moléculas multiespecíficas de unión a antígenos y usos de las mismas.
- Philipset al.(2013)Clinical Cáncer Research,20(2):456-458, que se refiere al doble tratamiento del cáncer HER2 positivo con trastuzumab emtansina y pertuzumab, y el papel fundamental del bloqueo de neuregulina en la respuesta antitumoral a la terapia combinada.
- El documento WO 2014/182970 A1 que se refiere a construcciones biespecíficas de unión a antígenos Her2 y Her3.
- El documento WO 2015/026907 A1 que re refiere a anticuerpos que se unen al receptor de prolactina (PRLR) y a métodos para utilizarlos.
Breve sumario
La presente invención se basa, al menos en parte, en el concepto de atenuar o inactivar una molécula diana facilitando o provocando un enlace físico entre la molécula diana y una proteína efectora de interiorización. A través de este tipo de enlace físico intermolecular, la molécula diana se puede forzar a interiorizarse en la célula junto con la proteína efectora de interiorización y procesarse por la maquinaria degradativa intracelular, o atenuarse, secuestrarse o inactivarse de otro modo. Este mecanismo representa una estrategia novedosa e inventiva para inactivar o atenuar la actividad de una molécula diana sin bloquear necesariamente la interacción entre la molécula diana y sus compañeros de unión.
Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico anti-HER2 * PRLR y un agente citotóxico, en donde el agente citotóxico es un conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF) que comprende un fármaco, toxina o radioisótopo conjugado con un anticuerpo que se une de manera específica a HER2, en donde la porción de unión a antígeno del CAF se une a un epítopo de HER2 que no se superpone con el epítopo de HER2 reconocido por el anticuerpo biespecífico anti-HER2 * PRLR.
La presente invención también proporciona un anticuerpo biespecífico para su uso en un método de tratamiento del cáncer de mama mediante la destrucción de células de cáncer de mama, comprendiendo el método poner en contacto una molécula diana y un efector de interiorización en células de cáncer de mama con el anticuerpo biespecífico y un agente citotóxico, en donde:
(a) el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo biespecífico anti-HER2 * PRLR, la molécula diana es HER2 y el efector de interiorización es PRLR;
(b) el agente citotóxico es un conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF) que comprende un fármaco, toxina o radioisótopo conjugado con un anticuerpo que se une de manera específica a HER2, en donde la porción de unión a antígeno del CAF se une a un epítopo de HER2 que no se superpone con el epítopo de HER2 reconocido por el primer dominio de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico; y
(c) el anticuerpo biespecífico, la molécula diana, el efector de interiorización y el agente citotóxico se transportan posteriormente a los lisosomas dentro de dichas células de cáncer de mama y el agente citotóxico se libera al citoplasma de las células de cáncer de mama.
La invención proporciona además un métodoin vitropara destruir células de cáncer de mama, comprendiendo el método poner en contacto una molécula diana y un efector de interiorización en células de cáncer de mama con un anticuerpo biespecífico y un agente citotóxico, en donde:
(a) el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo biespecífico anti-HER2 * PRLR, la molécula diana es HER2 y el efector de interiorización es PRLR;
(b) el agente citotóxico es un conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF) que comprende un fármaco, toxina o radioisótopo conjugado con un anticuerpo que se une de manera específica a HER2, en donde la porción de unión a antígeno del CAF se une a un epítopo de HER2 que no se superpone con el epítopo de HER2 reconocido por el primer dominio de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico; y
(c) el anticuerpo biespecífico, la molécula diana, el efector de interiorización y el agente citotóxico se transportan posteriormente a los lisosomas dentro de dichas células de cáncer de mama y el agente citotóxico se libera al citoplasma de las células de cáncer de mama.
La información técnica que figura a continuación, especialmente cuando se la denomina "aspecto" o "divulgación", puede, en algunos aspectos, ir más allá de la definición de la invención, que se define de manera exclusiva por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la presente invención en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Dicha información técnica adicional que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la presente invención.
También se divulga una molécula multiespecífica de unión a antígeno que es capaz de unirse de manera simultánea a una molécula diana (D) y a una proteína efectora de interiorización (E). De manera más específica, la presente divulgación proporciona una molécula multiespecífica de unión a antígeno que comprende un primer dominio de unión a antígeno (D i) y un segundo dominio de unión a antígeno (D2), en donde D1 se une de manera específica a D, y D2 se une de manera específica a E, y en donde la unión simultánea de D y E mediante la molécula multiespecífica de unión a antígeno atenúa la actividad de D en mayor medida que la unión a D por D i solo. La mayor atenuación de la actividad de D puede deberse a la interiorización/degradación forzada de D a través de su enlace físico con E; sin embargo, otros mecanismos de acción son posibles y no están excluidos del alcance de la presente divulgación.
Además, la presente divulgación proporciona métodos para usar la molécula multiespecífica de unión a antígeno para inactivar o atenuar la actividad de una molécula diana (D). En particular, la presente divulgación proporciona un método para inactivar o atenuar la actividad de D mediante la puesta en contacto de D y una proteína efectora de interiorización (E) con una molécula multiespecífica de unión a antígeno, en donde la molécula multiespecífica de unión a antígeno comprende un primer dominio de unión a antígeno (D i) y un segundo dominio de unión a antígeno (D2), en donde Di se une de manera específica a D, y en donde D2 se une de manera específica a E; y en donde la unión simultánea de D y E mediante la molécula multiespecífica de unión a antígeno atenúa la actividad de D en mayor medida que la unión a D por D i solo.
En determinados aspectos de la presente divulgación, D i y/o D2 comprende(n) al menos una región variable de anticuerpo. Por ejemplo, la molécula multiespecífica de unión a antígeno puede, en algunos aspectos, ser un anticuerpo biespecífico, en donde D i comprende un par de región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpo (HCVR/LCVR) que se une de manera específica a D, y en donde D2 comprende un par HCVR/LCVR que se une de manera específica a E. De manera alternativa, D i y/o D2 pueden comprender un péptido o polipéptido que interactúa de manera específica con la molécula diana (D) y/o la proteína efectora de interiorización (E). Por ejemplo, si la molécula diana es un receptor de la superficie celular, entonces D i puede comprender una porción de un ligando que se une de manera específica a la molécula diana del receptor de la superficie celular. De manera similar, si la proteína efectora de interiorización es un receptor de interiorización de la superficie celular, entonces D2 puede comprender una porción de un ligando que se une de manera específica al receptor de interiorización de la superficie celular. En determinados aspectos, D i comprende una región variable de anticuerpo que se une de manera específica a D, y D2 comprende un péptido o polipéptido que se une de manera específica a E. En otros aspectos más, D i comprende un péptido o polipéptido que se une de manera específica a D, y D2 comprende una región variable de anticuerpo que se une de manera específica a E. En cualquier configuración, sin embargo, el resultado final es que D y E son capaces de estar unidos físicamente, directa o indirectamente, mediante la unión simultánea de D y E a una molécula multiespecífica de unión a antígeno.
Otras realizaciones serán evidentes tras la revisión de la siguiente descripción detallada.
Breve descripción de las figuras
En lafigura 1 (paneles A a D)se proporcionan representaciones esquemáticas de cuatro mecanismos de acción ilustrativos generales para las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno de la presente divulgación. En cada configuración ilustrada, D1 es un primer dominio de unión a antígeno; D2 es un segundo dominio de unión a antígeno; D es una molécula diana; E es una proteína efectora de interiorización; y R es un receptor que se interioriza al unirse a E. En elpanel Ase representa la situación en la que tanto D como E están asociados a membrana. En lapanel Bse representa la situación en la que D es soluble y E está asociada a la membrana. En elpanel Cse describe la situación en la que D está asociada a la membrana y E es una proteína soluble que interactúa con la célula y se interioriza en ella mediante la interacción de E y R. En elpanel Dse representa la situación en la que D es soluble y E es una proteína soluble que interactúa con la célula y se interioriza en ella a través de la interacción de E y R.
En lafigura 2se muestran los resultados de un experimento de inmunoprecipitación realizado en dos células diferentes (la célula 1 que expresa FcyRI solo y la célula 2 que expresa Krm2 y FcyRI) después de la incubación durante diferentes períodos de tiempo (0, 15, 30 y 60 minutos) con una molécula multiespecífica de unión a antígeno DKK1-mFc.
En lafigura 3se muestra la luminiscencia relativa inducida por IL-4 producida por células HEK293 indicadoras de Stat6-luc en presencia y ausencia de una proteína multiespecífica de unión a antígeno anti-IL-4R/anti-CD63 ("conjugado de Ac") o construcciones de control ("control 1 " y "control 2") en diversas concentraciones de IL-4.
En lafigura 4se muestran los resultados de un experimento llevado a cabo de la misma manera que el experimento que se muestra en la figura 3, excepto que la expresión de CD63 se redujo significativamente en la estirpe celular indicadora mediante un ARNip dirigido contra CD63.
En lafigura 5se muestran los resultados de un experimento llevado a cabo de manera similar a los experimentos mostrados en las figuras 3 y 4, excepto que las células indicadoras se incubaron con la proteína multiespecífica de unión a antígeno ("conjugado de Ac") o construcciones de control ("control 1" y "control 2") en el tiempo cero (paneles A y B), durante 2 horas (paneles C y D) o durante la noche (paneles E y F) antes de la adición del ligando de IL-4. La fila superior de gráficos de barras (paneles A, C y E) representa los resultados de experimentos realizados en células que expresan niveles normales de CD63 ("no transfectadas"), mientras que la fila inferior de gráficos de barras (paneles B, D y F) representa los resultados de experimentos realizados en células en las que la expresión de CD63 se redujo significativamente en la estirpe celular indicadora mediante un ARNip dirigido contra CD63.
En lafigura 6se muestran los resultados de un experimento llevado a cabo de manera similar a los experimentos mostrados en las figuras 3 y 4, excepto que las células indicadoras se incubaron con la proteína multiespecífica de unión a antígeno anti-IL-4R/anti-CD63 ("conjugado de Ac") o construcciones de control ("control 1" y "control 2") durante 15 minutos (panel A), 30 minutos (panel B), 1 hora (panel C) o 2 horas (panel D) antes de la adición del ligando de IL-4.
En lafigura 7se muestran los resultados de un experimento en el que se trataron células indicadoras Stat6-luc con IL-4 10 pM en presencia de diversas diluciones de un anticuerpo biespecífico anti-IL-4R * anti-CD63 ("biespecífico"), 0 construcciones de control (monoespecífico anti-IL-4R o biespecífico simulado que sólo se une a IL-4R).
En lafigura 8se muestran los resultados de experimentos en los que se trataron células HEK293 con una construcción SOST marcada con un marcador myc y un marcador sensible al pH (que produce una señal fluorescente a pH bajo), junto con los diversos anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos como se muestra. Los resultados se expresan en términos de número de puntos fluorescentes (es decir, vesículas marcadas) por célula. En elpanel Ase muestran los resultados después de una incubación en hielo durante 3 horas, en elpanel Bse muestran los resultados después de 1 hora de incubación a 37 °C y en elpanel Cse muestran los resultados después de 3 horas de incubación a 37 °C.
En lafigura 9se muestran los resultados de experimentos en los que se trataron células HEK293 con lipopolisacárido (LPS) marcado con fluorescencia deE. coli(Panel A)o S.minnesota(Panel B),junto con un anticuerpo biespecífico anti-CD63 * anti-LPS, anticuerpos de control o LPS solo, durante varias veces, seguido de la extinción del fluoróforo no interiorizado (es decir, unido a la superficie). Por lo tanto, la señal fluorescente refleja LPS interiorizados en las diversas condiciones mostradas. Los resultados se expresan en términos de número de puntos fluorescentes (es decir, vesículas marcadas) por célula.
En lafigura 10se muestra la fluorescencia media en unidades arbitrarias de FelD1-mycv-myc-his marcado con Alexa488. Los histogramas azules representan el marcador de la superficie celular. Los histogramas rojos representan un marcador interiorizado. El grupo 1 en el eje de abscisas representa células tratadas con el anticuerpo biespecífico anti-HLA-B * anti-FelD1; el grupo 2 representa células tratadas con el anticuerpo monoespecífico bivalente parental anti-HLA-B; el grupo 3 representa el tratamiento con controles de isotipo IgG. En elgráfico Ase muestra la unión e interiorización de FelD1-mmh-488 por células linfoblastoides B C1Rneo que no expresan MHC1. En elgráfico Bse muestra la unión e interiorización de FelD1-mmh-488 por células linfoblastoides B C1Rneo que expresan MHC1.
En lafigura 11se representa la interiorización del receptor de prolactina (PRLR) y HER2 en células T47D mediante la medición de la cantidad de PRLR o HER2 que queda en la superficie celular a los 0 y 60 minutos después de transferir las células de 4 °C a 37 °C. Se muestra el porcentaje de receptor de superficie que permanece con el tiempo. Los cuadrados representan PRLR y los triángulos representan HER2.
En lafigura 12se representa la localización conjunta del receptor de prolactina (PRLR) y HER2 con lisosomas en células T47D. Se muestra el porcentaje de receptores asociados con los lisosomas a lo largo del tiempo. Los cuadrados representan PRLR y los triángulos representan HER2.
En lafigura 13se representan esquemáticamente los truncamientos y quimeras de PRLR y HER2.
En lafigura 14se representan micrografías fluorescentes de células HEK293 que expresan diversas quimeras y construcciones de PRLr y HER2. Los subpaneles de la izquierda de cada panel representan células a 4 °C antes de la interiorización. Los subpaneles a la derecha de cada panel representan células después de una hora a 37 °C. El panel A representa células que expresan PRLR de longitud completa (PRLR FL). El panel B representa células que expresan HER2 de longitud completa (PRLR FL). El panel C representa células que expresan la construcción PRLRectoHER2citoTM. El panel D representa células que expresan la construcción HER2ectoPRLRcitoTM.
En lafigura 15se representan micrografías fluorescentes de células HEK293 que expresan diversas construcciones y truncamientos de PRLR. El panel A representa células que expresan PRLR de longitud completa, teñidas para PRLR, después de 1 hora a 4 °C. El panel B representa células que expresan PRLR de longitud completa, teñidas para PRLR, después de una hora a 37 °C. El panel C representa células que expresan PRLR truncado con 42 restos del dominio citoplasmático, teñidas para PRLR, después de 1 hora a 4 °C. El panel D representa células que expresan PRLR truncado con 42 restos del dominio citoplasmático, teñidas para PRLR, después de una hora a 37 °C. El panel E representa células que expresan PRLR truncado con sólo 21 restos del dominio citoplasmático, teñidas para PRLR, después de 1 hora a 4 °C. El panel F representa células que expresan PRLR truncado con sólo 21 restos del dominio citoplasmático, teñidas para PRLR, después de una hora a 37 °C.
En lafigura 16se representan transferencias Western de lisados celulares de células que expresan PRLR de longitud completa (panel A), células que expresan PRLR truncado con 42 restos del dominio citoplasmático restantes (panel B) y células que expresan PRLR truncado con 21 restos del dominio citoplasmático restantes (panel C). Los subpaneles superiores están teñidos con anticuerpo anti-PRLR. Los subpaneles inferiores están teñidos con p-actina para controlar la carga.
En lafigura 17se representa el porcentaje de células en mitosis temprana frente a los niveles de expresión superficial de PRLR o HER2 o PRLRectoHER2citoTM (Panel A), PRLR o HER2ectoPRLRcitoTM (Panel B) después del tratamiento con PRLR-DM1 o HER2-DM1.
En lafigura 18se representa una transferencia Western de lisados de células completas que expresan varias construcciones, truncamientos y sustituciones de PRLR a las 0 horas y 4 horas después del tratamiento con CHX. El panel superior se tiñe para PRLR y el panel inferior se tiñe para p-actina para controlar la carga.
En lafigura 19se representa una transferencia Western de lisados de células completas de células HEK 293 inducidas a expresar PRLR de longitud completa a las 0 horas, 1 hora, 2 horas y 4 horas después del tratamiento con CHX. El panel superior está teñido para<h>ER2 y el panel inferior está teñido para PRLR.
En lafigura 20se representa una transferencia Western de lisados de células completas de células HEK 293 inducidas a expresar la forma de truncamiento citoplasmático de PRLR a las 0 horas, 2 horas y 4 horas después del tratamiento con CHX. El panel superior está teñido para HER2 y el panel inferior está teñido para PRLR.
En lafigura 21se representa la localización conjunta de HER2 con lisosomas en células T47D tratadas con el anticuerpo biespecífico HER2 * PRLR. El porcentaje de lisosomas asociados con el receptor HER2 se muestra a lo largo del tiempo. Los cuadrados representan células tratadas con el anticuerpo biespecífico HER2 * PRLR y los triángulos representan células tratadas con anticuerpos de control sin unión.
Lafigura 22es un histograma que representa el porcentaje de células T47D/HER2 detenidas en el ciclo celular (eje de ordenadas) tratadas con 1 nM, 10 nM o 30 nM de Ca F PRLR (A), CAF HER2 más anticuerpo biespecífico HER2 * PRLR (B), CAF HER2 solo (C), CAF de control no unido (D) o ningún tratamiento (E).
Lafigura 23es una inmunotransferencia por puntos que representa el porcentaje de células T47D viables que expresan HER2 frente a la cantidad creciente de fármaco: c A f PRLR(A; cuadrados), CAF HER2 más anticuerpo biespecífico HER2 * PRLR (B; rombos), CAF HER2 solo (C; triángulos hacia arriba), CAF de control no unido (D; círculos) o CAF de control no unido más anticuerpo biespecífico HER2 * PRLR (E; triángulos hacia abajo).
En lafigura 24se muestra un panel de transferencia Western de suero de ratón sondado con anticuerpo anti-FelD1 en varios momentos (15 minutos, 6 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días y 6 días) después del tratamiento con un anticuerpo biespecífico anti-HLAB * anti-FelD1, solución salina tamponada con fosfato, anticuerpo monoespecífico bivalente anti-FelD1 y anticuerpo monoespecífico bivalente anti-HLAB.
En lafigura 25se muestra un histograma que representa la proporción de FelD1-Fc eliminado del suero de ratón por encima de los niveles de referencia y normalizado al valor inicial (eje de ordenadas). El elemento 1 representa el tratamiento con el anticuerpo biespecífico anti-HLAB xanti-FelD1; el elemento 2 representa el tratamiento con el anticuerpo monoespecífico bivalente anti-FelD1; y el elemento 3 representa el tratamiento con el anticuerpo monoespecífico bivalente anti-HLAB (eje de abscisas).
Lafigura 26es un histograma que representa la absorción de pHrodo®-hHJV-mmh en células HEK293. El eje de ordenadas representa la intensidad integrada (unidades arbitrarias) de la señal de pHrodo®. En el eje de abscisas, Anti-Myc::PCSK9 muestra el efecto en la absorción de HJV debido a la ausencia de anticuerpos (barra abierta), a-Myc::PCSK9FL (barra rellena sólida), a-Myc::PCSK9LC (barra rellena de línea horizontal) y a-Myc::PCSK9SC (barra rellena de punteado); Anti-HJV::PCSK9 representa el efecto en la absorción de HJV debido a la ausencia de anticuerpos (barra abierta), a-HJV-N::PCSK9FL (barra rellena sólida), a-HJV-N::PCSK9LC (barra rellena con línea horizontal) y a-HJV-N::PCSK9SC (barra rellena de punteado); y controles sin anticuerpos para la absorción de fondo.
Lafigura 27es una inmunotransferencia por puntos que muestra los niveles de hierro en suero en microgramos por decilitro de suero (eje de ordenadas) una semana después del tratamiento de ratones transgénicos hHLAB con anticuerpo monoespecífico bivalente anti-HJV bloqueador(1);proteína de fusión de longitud completa anti-Myc::PCSK9(2);anticuerpo monoespecífico bivalente no bloqueador anti-HJV(3);y proteína de fusión de longitud completa anti-HJV-no bloqueador::PCSK9(4).
Descripción detallada
Antes de describir la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a métodos ni a condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, dado que el alcance de la presente invención estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se utiliza en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se utiliza en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101, y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
Aunque pueden utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente invención cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.
MOLÉCULAS MULTIESPECÍFICAS DE UNIÓN A ANTÍGENO
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la actividad de una molécula diana se puede atenuar mediante la unión de la molécula diana a una proteína efectora de interiorización a través de una molécula multiespecífica de unión a antígeno. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico anti-HER2 x PRLR y un agente citotóxico, en donde el agente citotóxico es un conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF) que comprende un fármaco, toxina o radioisótopo conjugado con un anticuerpo que se une de manera específica a HER2, en donde la porción de unión a antígeno del CAF se une a un epítopo de h ER2 que no se superpone con el epítopo de HER2 reconocido por el anticuerpo biespecífico anti-HER2 x PRLR.
La presente divulgación proporciona moléculas multiespecíficas de unión a antígeno que comprenden un primer dominio de unión a antígeno (también denominado en el presente documento "D1") y un segundo dominio de unión a antígeno (también denominado en el presente documento "D2"). D1 y D2 se unen cada uno a moléculas diferentes. D1 se une de manera específica a una "molécula diana". La molécula diana también se denomina en el presente documento "D". D2 se une de manera específica a una "proteína efectora de interiorización". La proteína efectora de interiorización también se denomina en el presente documento "E". De acuerdo con la presente divulgación, la unión simultánea de D y E mediante la molécula multiespecífica de unión a antígeno atenúa la actividad de D en mayor medida que la unión a D por D1 solo. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "unión simultánea", en el contexto de una molécula multiespecífica de unión a antígeno, significa que la molécula multiespecífica de unión a antígeno es capaz de ponerse en contacto tanto con una molécula diana (D) como con una proteína efectora de interiorización (E) durante al menos algún período de tiempo en condiciones fisiológicamente oportunas para facilitar el enlace físico entre D y E. La unión de la molécula multiespecífica de unión a antígeno a los componentes D y E puede ser secuencial; por ejemplo, la molécula multiespecífica de unión a antígeno puede unirse primero a D y después a E, o puede unirse primero a E y después a D. En cualquier caso, siempre que D y E estén unidas mediante la molécula multiespecífica de unión a antígeno durante algún período de tiempo (independientemente del orden secuencia! de unión), se considerará que la molécula multiespecífica de unión a antígeno "se une simultáneamente" a D y E para los fines de la presente divulgación. Sin pretender quedar ligado a teoría alguna, se cree que la inactivación mejorada de D está provocada por la interiorización y el redireccionamiento degradativo de D dentro de una célula debido a su enlace físico con E. Las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno de la presente divulgación son, por lo tanto, útiles para inactivar y/o reducir la actividad y/o concentración extracelular de una molécula diana sin bloquear o antagonizar directamente la función de la molécula diana.
De acuerdo con la presente divulgación, una molécula multiespecífica de unión a antígeno puede ser un solo polipéptido multifuncional o puede ser un complejo multimérico de dos o más polipéptidos que se asocian de manera covalente o no covalente entre sí. Como se hará evidente por la presente divulgación, cualquier construcción de unión a antígeno que tenga la capacidad de unirse de manera simultánea a una molécula D y E se considera una molécula multiespecífica de unión a antígeno. Cualquiera de las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno de la divulgación, o variantes de las mismas, puede construirse usando técnicas de biología molecular convencionales (por ejemplo, tecnología de ADN recombinante y expresión de proteínas), como sabrá un experto habitual en la materia.
DOMINIOS DE UNIÓN A ANTÍGENO
Las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno de la presente divulgación comprenden al menos dos dominios de unión a antígeno separados (D1 y D2). Como se utiliza en el presente documento, la expresión "dominio de unión a antígeno" significa cualquier péptido, polipéptido, molécula de ácido nucleico, molécula de tipo armazón, molécula de presentación peptídica o construcción que contiene polipéptidos que es capaz de unirse de manera específica a un antígeno de interés particular. La expresión "que se une de manera específica", como se utiliza en el presente documento, significa que el dominio de unión a antígeno forma un complejo con un antígeno particular caracterizado por una constante de disociación (KD) de 500 pM o inferior, y no se une a otros antígenos no relacionados en condiciones de ensayo normales. Los "antígenos no relacionados" son proteínas, péptidos o polipéptidos que tienen menos de un 95 % de identidad de aminoácidos entre sí.
Las categorías ilustrativas de dominios de unión a antígeno que se pueden utilizar en el contexto de la presente divulgación incluyen anticuerpos, porciones de unión a antígeno de los anticuerpos, péptidos que interactúan de manera específica con un antígeno particular (por ejemplo, pepticuerpos), moléculas receptoras que interactúan de manera específica con un antígeno particular, proteínas que comprenden una porción de unión a ligando de un receptor que se une de manera específica a un antígeno particular, armazones de unión a antígeno (por ejemplo, DARPin, proteínas de repetición HEAt , proteínas de repetición ARM, proteínas de repetición tetratri copéptidos y otros armazones basados en proteínas de repetición de origen natural, etc., [véase, por ejemplo, Boersma y Pluckthun, 2011,Curr. Opin. Biotechnol.22:849-857 y las referencias citadas en el mismo]), y aptámeros o porciones de los mismos.
En determinados aspectos en los que la molécula diana o la proteína efectora de interiorización es una molécula receptora, un "dominio de unión a antígeno", a efectos de la presente divulgación, puede comprender o consistir en un ligando o porción de un ligando que es específico para el receptor. Por ejemplo, si la molécula diana (D) es IL-4R, el componente D1 de la molécula multiespecífica de unión a antígeno puede comprender el ligando de IL-4 o una porción del ligando de IL-4 que es capaz de interactuar de manera específica con IL-4R; o si la proteína efectora de interiorización (E) es el receptor de transferrina, el componente D2 de la molécula multiespecífica de unión a antígeno puede comprender transferrina o una porción de transferrina que es capaz de interactuar de manera específica con el receptor de transferrina.
En determinados aspectos en los que la molécula diana o la proteína efectora de interiorización es un ligando que es reconocido de manera específica por un receptor particular (por ejemplo, una molécula diana soluble), un "dominio de unión a antígeno", a efectos de la presente divulgación, puede comprender o consistir en el receptor o una porción del receptor que se une al ligando. Por ejemplo, si la molécula diana (D) es IL-6, el componente D1 de la molécula multiespecífica de unión a antígeno puede comprender el dominio de unión a ligando del receptor de IL-6; o si la proteína efectora de interiorización (E) es una proteína interiorizada indirectamente (como se define ese término en otra parte del presente documento), el componente D2 de la molécula multiespecífica de unión a antígeno puede comprender un dominio de unión a ligando de un receptor específico para E.
En la materia se conocen bien métodos para determinar si dos moléculas se unen de manera específica entre sí e incluyen, por ejemplo, diálisis de equilibrio y resonancia de plasmón superficial. Por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, como se usa en el contexto de la presente invención, incluye polipéptidos que se unen a un antígeno particular (por ejemplo, una molécula diana [D] o una proteína efectora de interiorización [E]) o una porción de los mismos con una K<d>inferior a aproximadamente 500 pM, inferior a aproximadamente 400 pM, inferior a aproximadamente 300 pM, inferior a aproximadamente 200 pM, inferior a aproximadamente 100 pM, inferior a aproximadamente 90 pM, inferior a aproximadamente 80 pM, inferior a aproximadamente 70 pM, inferior a aproximadamente 60 pM, inferior a aproximadamente 50 pM, inferior a aproximadamente 40 pM, inferior a aproximadamente 30 pM, inferior a aproximadamente 20 pM, inferior a aproximadamente 10 pM, inferior a aproximadamente 5 pM, inferior a aproximadamente 4 pM, inferior a aproximadamente 2 pM, inferior a aproximadamente 1 pM, inferior a aproximadamente 0,5 pM, inferior a aproximadamente 0,2 pM, inferior a aproximadamente 0,1 pM o inferior a aproximadamente 0,05 pM, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial.
La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones en tiempo real por detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biodetectora, por ejemplo, usando el sistema BIAcore™ (Biacore Life Sciences división de GE Healthcare, Piscataway, Nueva Jersey).
El término "K<d>", como se utiliza en el presente documento, significa la constante de disociación en equilibrio de una interacción proteína-proteína particular (por ejemplo, una interacción anticuerpo-antígeno). A menos que se indique de otro modo, los valores de K<d>divulgados en el presente documento se refieren a valores de K<d>determinados por ensayo de resonancia de plasmón superficial a 25 °C.
ANTICUERPOS Y FRAGMENTOS DE UNIÓN A ANTÍGENO DE ANTICUERPOS
Como se indica anteriormente, un "dominio de unión a antígeno" (D1 y/o D2) puede comprender o consistir en un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une de manera específica a un antígeno particular o interacciona con él (por ejemplo, D o E). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o V<h>) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, C<h>1, C<h>2 y C<h>3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (C<l>1). Las regiones V<h>y V<l>pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En distintas realizaciones de la invención, las FR de los anticuerpos (o porciones de unión a antígeno de los mismos) para su uso en la invención pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse de manera natural o artificial. Una secuencia de aminoácidos consenso puede definirse basándose en un análisis en paralelo de dos o más CDR.
Los componentes D1 y/o D2 de las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno de la presente invención pueden comprender o consistir en fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se utiliza en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible de manera enzimática, sintético o modificado por ingeniería genética que se une de manera específica a un antígeno para formar un complejo. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas, mediante cualquier técnica convencional adecuada, tal como digestión proteolítica o técnicas recombinantes de ingeniería genética que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica los dominios variables y, opcionalmente, los constantes, de un anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluidas, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", tal como se utiliza en el presente documento.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a una o más secuencias marco o en el marco con ellas. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio V<h>asociado con un dominio V<l>, los dominios V<h>y V<l>pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros V<h>-V<h>, V<h>-V<l>o V<l>-V<l>. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio V<h>o V<l>monomérico.
En determinadas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Las configuraciones ilustrativas no limitantes de dominios variables y constantes que se pueden encontrar en un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo para su uso en la presente invención incluyen: (i) V<h>-C<h>1; (ii) V<h>-C<h>2; (iii) V<h>-C<h>3; (iv) V<h>-C<h>1-C<h>2; (v) V<h>-C<h>1-C<h>2-C<h>3; (vi) V<h>-C<h>2-C<h>3; (vii) V<h>-C<l>; (viii) V<l>-C<h>1; (ix) V<l>-C<h>2; (x) V<l>-C<h>3; (xi) V<l>-C<h>1-C<h>2; (xii) V<l>-C<h>1-C<h>2-C<h>3; (xiii) V<l>-CH2-CH3; y (xiv) VL-CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluidas cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan lugar a una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Asimismo, un fragmento de unión a antígeno puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominios variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios V<h>o V<l>monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).
Las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno para su uso en la presente invención pueden comprender o consistir en anticuerpos humanos y/o anticuerpos humanos recombinantes, o fragmentos de los mismos. La expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. No obstante, los anticuerpos humanos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitioin vitroo por mutación somáticain vivo),por ejemplo, en las CDR y, en particular, en CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR procedentes de la estirpe germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.
Las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno para su uso en la presente invención pueden comprender o consistir en anticuerpos humanos recombinantes o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula hospedadora (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Tayloret al.(1992)Nucl.Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes están sujetos a mutagénesisin vitro(o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somáticain vivo)y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de secuencias de V<h>y V<l>de la línea germinal humana, y están relacionadas con ellas, no pueden existir de forma natural en del repertorio de la estirpe germinal de anticuerpos humanosin vivo.
ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS
Las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno para su uso en la invención son anticuerpos biespecíficos; es decir, anticuerpos biespecíficos que comprenden un brazo de unión a antígeno que se une de manera específica a la molécula diana (D) HER2 y un brazo de unión a antígeno que se une de manera específica a la proteína efectora de interiorización (E) PRLR. En particular, una composición farmacéutica de la presente invención comprende un anticuerpo biespecífico anti-HER2 * PRLR. Los métodos para producir anticuerpos biespecíficos se conocen en la materia y pueden utilizarse para construir moléculas multiespecíficas de unión a antígeno de la presente divulgación. Los formatos biespecíficos ilustrativos que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-lg, cuadroma, "botón en ojal", cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con "botón en ojal", etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, lgG1/lgG2, Fab de acción doble (DAF,dual acting Fab)-IgGy formatos biespecíficos de Mab2 (véase, por ejemplo, Kleinet al.2012, mAbs 4:6, 1-11, y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores).
COMPONENTES DE MULTIMERIZACIÓN
Las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno de la presente divulgación, en determinados aspectos, también pueden comprender uno o más componentes de multimerización. Los componentes de multimerización pueden funcionar para mantener la asociación entre los dominios de unión a antígeno (D1 y D2). Como se utiliza en el presente documento, un "componente de multimerización" es cualquier macromolécula, proteína, polipéptido, péptido o aminoácido que tiene la capacidad de asociarse con un segundo componente de multimerización de la misma estructura o constitución o similar. Por ejemplo, un componente de multimerización puede ser un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina C<h>3. Un ejemplo no limitante de un componente de multimerización es una porción Fc de una inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio Fc de una IgG seleccionada de los isotipos lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4, así como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipo. En determinados aspectos, el componente de multimerización es un fragmento Fc o una secuencia de aminoácidos de 1 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud que contiene al menos un resto de cisteína. En otros aspectos, el componente de multimerización es un resto de cisteína o un péptido corto que contiene cisteína. Otros dominios de multimerización incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden o consisten en una cremallera de leucina, un motivo de bucle de hélice o un motivo de hélice superenrollada.
En determinadas realizaciones, las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno de la presente invención comprenden dos dominios de multimerización, M1 y M2, en donde D1 está unido a M1 y D2 está unido a M2, y en donde la asociación de M1 con M2 facilita el enlace físico de D1 y D2 entre sí en una única molécula multiespecífica de unión a antígeno. En determinadas realizaciones, M1 y M2 son idénticos entre sí. Por ejemplo, M1 puede ser un dominio Fc que tiene una secuencia de aminoácidos particular y M2 es un dominio Fc con la misma secuencia de aminoácidos que M1. Como alternativa, M1 y M2 pueden diferir entre sí en una o más posiciones de aminoácidos. Por ejemplo, M1 puede comprender un primer dominio C<h>3 de inmunoglobulina (Ig) y M2 pueden comprender un segundo dominio C<h>3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio C<h>3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde la diferencia de al menos un aminoácido reduce la unión de la construcción diana a la proteína A en comparación con una construcción de referencia que tiene las secuencias M1 y M2 idénticas. En una realización, el dominio C<h>3 de Ig de M1 está unido a la proteína A y el dominio C<h>3 de Ig de M2 contiene una mutación que reduce o anula la unión a la proteína A, tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El C<h>3 de M2 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones que se pueden encontrar en el C<h>3 de M2 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y v 82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de un dominio Fc de IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de un dominio Fc de lgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de un dominio Fc de lgG4.
PROTEÍNAS EFECTORAS DE INTERIORIZACIÓN (E)
En el contexto de la presente divulgación, el componente D2 de la molécula multiespecífica de unión a antígeno se une de manera específica a una proteína efectora de interiorización ("E"). Una proteína efectora de interiorización es una proteína que puede interiorizarse en una célula o que participa o contribuye de otro modo al tráfico retrógrado de la membrana. En algunos casos, la proteína efectora de interiorización es una proteína que experimenta transcitosis; es decir, la proteína se interioriza en un lado de una célula y se transporta al otro lado de la célula (por ejemplo, de apical a basal). En muchos aspectos, la proteína efectora de interiorización es una proteína expresada en la superficie celular o una proteína extracelular soluble. Sin embargo, la presente divulgación también contempla aspectos en que la proteína efectora de interiorización se expresa en un compartimiento intracelular, tal como el endosoma, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, lisosoma, etc. Por ejemplo, las proteínas implicadas en el tráfico retrógrado de la membrana (por ejemplo, vías desde los endosomas tempranos/de reciclaje hasta la red trans-Golgi) pueden servir como proteínas efectoras de interiorización en diversos aspectos de la presente divulgación. En cualquier caso, la unión de D2 a una proteína efectora de interiorización hace que toda la molécula multiespecífica de unión a antígeno, y cualquier molécula asociada con ella (por ejemplo, una molécula diana unida por D1), también se interioricen en la célula. Tal como se explica a continuación, las proteínas efectoras de interiorización incluyen proteínas que se interiorizan directamente en una célula, así como proteínas que se interiorizan indirectamente en una célula.
Las proteínas efectoras de interiorización que se interiorizan directamente en una célula incluyen moléculas asociadas a la membrana con al menos un dominio extracelular (por ejemplo, proteínas transmembranarias, proteínas ancladas a GPI, etc.), que experimentan interiorización celular, y se procesan preferentemente mediante una ruta intracelular de degradación y/o reciclado. Ejemplos no limitantes específicos de proteínas efectoras de interiorización que se interiorizan directamente en una célula incluyen, por ejemplo, CD63, MHC-I (por ejemplo, HLA-B27), Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, receptor de transferrina, receptor de LDL, receptor de proteína 1 relacionada con LDL, ASGR1, ASGR2, proteína 2 similar a proteína precursora de amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), MAL, del inglésMyelin And Lymphocyte(proteína de mielina y linfocitos, también conocida como VIP17), IGF2R, ATPasa H+ de tipo vacuolar, receptor de toxina diftérica, receptor de folato, receptores de glutamato, receptor de glutatión, receptores de leptina, receptores secuestradores (por ejemplo, SCARA1-5, SCARB1-3, CD36), etc.
En la presente invención, la proteína efectora de interiorización es el receptor de prolactina (PRLR). Se descubrió que el PRLR es, no sólo una diana para ciertas aplicaciones terapéuticas, sino también una proteína efectora de interiorización eficaz basándose en su elevada tasa de interiorización y recambio. El potencial de PRLR como proteína efectora de interiorización, por ejemplo, se ilustra en el documento WO2015/026907, donde se demuestra, entre otras, que los anticuerpos anti-PRLR se interiorizan de manera eficaz por células que expresan PRLRin vitro.
En aspectos en los que E es una proteína efectora directamente interiorizada, el componente D2 de la molécula multiespecífica de unión a antígeno puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une de manera específica a E, o un ligando o porción de un ligando que interactúa de manera específica con la proteína efectora. Por ejemplo, si E es Kremen-1 o Kremen-2, el componente D2 puede comprender o consistir en un ligando de Kremen (por ejemplo, DKK1) o porción de unión a Kremen de la misma. Como otro ejemplo, si E es una molécula receptora, tal como ASGR1, el componente D2 puede comprender o consistir en un ligando específico para el receptor (por ejemplo, asialoorosomucoide [ASOR] o p-GalNAc) o una porción de unión al receptor del mismo.
Las proteínas efectoras de interiorización que se interiorizan indirectamente en una célula incluyen proteínas y polipéptidos que no se interiorizan por sí mismas, pero que quedan interiorizadas en una célula después de su unión a, o asociación de otro modo con, una segunda proteína o polipéptido que se interioriza directamente en la célula. Las proteínas que se interiorizan indirectamente en una célula incluyen, por ejemplo, ligandos solubles que pueden unirse a una molécula receptora expresada en la superficie celular de interiorización. Un ejemplo no limitante de un ligando soluble que se interioriza (indirectamente) en una célula mediante su interacción con una molécula receptora expresada en la superficie celular de interiorización es transferrina. En aspectos de la divulgación en donde E es transferrina (u otra proteína interiorizada indirectamente), la unión de D2 a E, y la interacción de E con el receptor de transferrina (u otra molécula receptora expresada en la superficie celular de interiorización), hace que toda la molécula multiespecífica de unión a antígeno, y cualquier molécula asociada con ella (por ejemplo, una molécula diana unida por D1), se interiorice en la célula al mismo tiempo que la interiorización de E y su compañero de unión.
En aspectos de la divulgación en los que E es una proteína efectora interiorizada indirectamente, tal como un ligando soluble, el componente D2 de la molécula multiespecífica de unión a antígeno puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une de manera específica a E, o un receptor o porción de un receptor que interactúa de manera específica con la proteína efectora soluble. Por ejemplo, si E es una citocina, el componente D2 puede comprender o consistir en el receptor de citocinas correspondiente o porción de unión a ligando del mismo.
MOLÉCULAS DIANA (D)
En el contexto de la presente divulgación, el componente D1 de la molécula multiespecífica de unión a antígeno se une de manera específica a una molécula diana ("D"). Una molécula diana es cualquier proteína, polipéptido u otra macromolécula cuya actividad o concentración extracelular se desea atenuar, reducir o eliminar. En muchas ocasiones, la molécula diana a la que se une D1 es una proteína o polipéptido [es decir, una "proteína diana"]; sin embargo, la presente divulgación también incluye aspectos en donde la molécula diana ("D") es un hidrato de carbono, glucoproteína, lípido, lipoproteína, lipopolisacárido u otro polímero o molécula no proteico al que se une D1. De acuerdo con la presente divulgación, D puede ser una proteína diana expresada en la superficie celular o una proteína diana soluble. La unión a la diana mediante la molécula multiespecífica de unión a antígeno puede tener lugar en un contexto extracelular o de la superficie celular. En determinados aspectos, sin embargo, la molécula multiespecífica de unión a antígeno se une a una molécula diana dentro de la célula, por ejemplo, dentro de un componente intracelular, tal como el retículo endoplásmico, aparato de Golgi, endosoma, lisosoma, etc.
Ejemplos de moléculas diana expresadas en la superficie celular incluyen receptores expresados en la superficie celular, ligandos unidos a la membrana, canales iónicos y cualquier otro componente polipeptídico monomérico o multimérico con una porción extracelular que esté unida o asociada con una membrana celular. Las moléculas diana expresadas en la superficie celular ilustrativas no limitantes que pueden ser diana de la molécula multiespecífica de unión a antígeno de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, receptores de citocinas (por ejemplo, receptores para IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33, etc.), así como dianas de la superficie celular incluidos otros receptores transmembrana de tipo 1, tal como PRLR, receptores acoplados a proteína G, tales como GCGR, canales de iones, tales como Nav1.7, ASIC1 o ASIC2, proteínas de la superficie no receptoras, tales como MHC-I (por ejemplo, HLA-B*27), etc.
En aspectos de la divulgación en los que D es una proteína diana expresada en la superficie celular, el componente D1 de la molécula multiespecífica de unión a antígeno puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une de manera específica a D, o un ligando o porción de un ligando que interactúa de manera específica con la proteína diana expresada en la superficie celular. Por ejemplo, si D es IL-4R, el componente D1 puede comprender o consistir en IL-4 o una porción de unión al receptor de la misma.
Ejemplos de moléculas diana solubles incluyen citocinas, factores de crecimiento y otros ligandos y proteínas de señalización. La proteína diana soluble ilustrativa no limitante que puede ser diana de la molécula multiespecífica de unión a antígeno de la presente divulgación incluye, por ejemplo, IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33, SOST, DKK1, etc. Las moléculas diana solubles también incluyen, por ejemplo, moléculas diana no humanas, tales como alérgenos (por ejemplo, Fel D1, Betv1, CryJ1), patógenos (por ejemplo,Candida albicans, S. aureus,etc.) y moléculas patógenas (por ejemplo, lipopolisacárido [LPS], ácido lipotecoico [LTA], proteína A, toxinas, etc.). En aspectos de la divulgación en los que D es una molécula diana soluble, el componente D1 de la molécula multiespecífica de unión a antígeno puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une de manera específica a D, o un receptor o porción de un receptor que interactúa de manera específica con la molécula diana soluble. Por ejemplo, si D es IL-4, el componente D1 puede comprender o consistir en IL-4R o una porción de unión a ligando de la misma.
Las moléculas diana también incluyen antígenos asociados a tumores, como se describe en cualquier otra parte del presente documento.
UNIÓN DEPENDIENTE DEL pH
La presente divulgación proporciona moléculas multiespecíficas de unión a antígeno que comprenden un primer dominio de unión a antígeno (D1) y un segundo dominio de unión a antígeno (D2), en donde uno o ambos dominios de unión a antígeno (D1 y/o D2) se unen a su antígeno (D o E) de manera dependiente del pH. Por ejemplo, un dominio de unión a antígeno (D1 y/o D2) puede presentar una unión reducida a su antígeno a pH ácido en comparación con un pH neutro. Como alternativa, un dominio de unión a antígeno (D1 y/o D2) puede presentar una unión mejorada a su antígeno a pH ácido en comparación con un pH neutro. Se pueden obtener dominios de unión a antígeno con características de unión dependientes del pH, por ejemplo, mediante la selección de una población de anticuerpos para la unión reducida (o mejorada) a un antígeno particular a pH ácido en comparación con pH neutro. De manera adicional, las modificaciones del dominio de unión a antígeno a nivel de aminoácidos pueden producir dominios de unión a antígeno con características dependientes del pH. Por ejemplo, mediante la sustitución de uno o más aminoácidos de un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, en una CDR) con un resto de histidina, puede obtenerse un dominio de unión a antígeno con unión a antígeno reducida a pH ácido en relación con el pH neutro.
En determinados aspectos, la presente divulgación incluye moléculas multiespecíficas de unión a antígeno que comprenden un componente D1 y/o D2 que se une a su antígeno respectivo (D o E) a pH ácido con una K<d>que es al menos aproximadamente 3, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más veces mayor que la K<d>del componente D1 y/o D2 para unirse a su antígeno respectivo a pH neutro. La unión dependiente del pH también se puede expresar en términos de t1^ del dominio de unión a antígeno para su antígeno a pH ácido en comparación con un pH neutro. Por ejemplo, la presente divulgación incluye moléculas multiespecíficas de unión a antígeno que comprenden un componente D1 y/o D2 que se une a su antígeno respectivo (D o E) a pH ácido con una t1^ que es al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más veces más corta que la t1^ del componente D1 y/o D2 para unirse a su antígeno respectivo a pH neutro.
Las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno de la presente divulgación que comprenden un componente D1 y/o D2 con unión a antígeno reducida a pH ácido en comparación con pH neutro, cuando se administran a sujetos animales, en determinados aspectos puede presentar una eliminación de la circulación más lenta en comparación con moléculas comparables que no presentan características de unión dependientes del pH. De acuerdo con este aspecto de la divulgación, se proporcionan moléculas multiespecíficas de unión a antígeno con unión a antígeno reducida a D y/o E a pH ácido en comparación con pH neutro que presentan una eliminación de la circulación al menos 2 veces más lenta en relación con moléculas de unión a antígeno comparables que no poseen unión a antígeno reducida a pH ácido en comparación con pH neutro. La tasa de eliminación se puede expresar en términos de la semivida del anticuerpo, en donde una eliminación más lenta se correlaciona con una semivida más larga.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "pH ácido" significa un pH de 6,0 o inferior. La expresión "pH ácido" incluye valores de pH de aproximadamente 6,0, 5,95, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1,5,05, 5,0 o inferiores. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "pH neutro" significa un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4. La expresión "pH neutro" incluye valores de pH de aproximadamente 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 y 7,4.
ATENUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA MOLÉCULA DIANA
Como se indica en otra parte del presente documento, y como lo demuestran los ejemplos de trabajo que aparecen a continuación, los presentes inventores han descubierto que la unión simultánea de una molécula diana (D) y una proteína efectora de interiorización (E) mediante una molécula multiespecífica de unión a antígeno atenúa la actividad de D en mayor medida que la unión de D por el primer componente del dominio de unión a antígeno (D1) de la molécula multiespecífica de unión a antígeno sola. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "atenúa la actividad de D en mayor medida que la unión de D por D1 solo" significa que, en un ensayo en el que se puede medir la actividad de D mediante células que expresan E, el nivel de actividad de D medido en presencia de una molécula multiespecífica de unión a antígeno es al menos un 10 % menor que el nivel de actividad de D medido en presencia de una construcción de control que contiene D1 solo (es decir, no unido físicamente al segundo dominio de unión a antígeno (D2)). Por ejemplo, el nivel de actividad de D medido en presencia de la molécula multiespecífica de unión a antígeno puede ser aproximadamente un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o el 100 % menor que el nivel de actividad de D medido en presencia de una construcción de control que contiene D1 solo.
En el presente documento, a continuación, en los ejemplos de trabajo 1 y 2 se muestra un formato de ensayo ilustrativo no limitante para determinar si una molécula multiespecífica de unión a antígeno atenúa la actividad de una molécula diana en mayor medida que la unión de la molécula diana mediante el dominio D1 solo. En el ejemplo 1, por ejemplo, "D" es el receptor de interleucina-4 (IL-4R) y "E" es CD63. La molécula multiespecífica de unión a antígeno del ejemplo 1 es un conjugado de 2 anticuerpos que comprende un AcM anti-IL-4R unido a un AcM anti-CD63 mediante un enlazador de estreptavidina/biotina. Por lo tanto, "D1" en esta construcción ilustrativa es el dominio de unión a antígeno (par HCVR/LCVR) del anticuerpo anti-IL-4R, y "D2" es el dominio de unión a antígeno (par HCVR/LCVR) del anticuerpo anti-CD63. En los experimentos de los ejemplos 1 y 2, se utilizó un formato de ensayo basado en células que produce una señal indicadora cuando la actividad de IL-4R se estimula mediante la adición de un ligando de IL-4 exógeno. La cantidad de actividad indicadora inducida por IL-4 detectada en presencia de la molécula multiespecífica de unión a antígeno se comparó con la cantidad de actividad indicadora inducida por IL-4 detectada en presencia de construcciones de control que contenían el anticuerpo anti-IL-4R conectado a una inmunoglobulina de control irrelevante (control 1), o combinado con, pero no conectado físicamente a, el anticuerpo anti-CD63 (control 2). Las construcciones de control producen así la condición en la que D está unida solo por D1 (es decir, en donde D1 no es parte de la molécula multiespecífica de unión a antígenoper se).Si el grado de actividad de la molécula diana (representada por la señal indicadora) observado en presencia de la molécula multiespecífica de unión a antígeno es al menos un 10 % menor que la cantidad de actividad de la molécula diana observada en presencia de una construcción de control que comprende el componente D1 no unido físicamente al componente D2 (por ejemplo, control 1 o control 2), entonces, para los fines de la presente divulgación, se concluye que "la unión simultánea de D y E mediante la molécula multiespecífica de unión a antígeno atenúa la actividad de D en mayor medida que la unión de D por D1 solo".
La unión de D por D1 solo puede, en algunos aspectos, dar como resultado una atenuación parcial de la actividad de D (como en el caso del ejemplo 1 donde el tratamiento de células indicadoras con un anticuerpo anti-IL-4R solo [es decir, controles 1 y 2] provocó un pequeño nivel de atenuación de la señalización de IL-4 en relación con las células no tratadas). En otros aspectos, la unión de D por D1 solo no dará como resultado una atenuación detectable de la actividad de D; es decir, la actividad biológica de D puede no verse afectada por la unión de D por D1 solo. En cualquier caso, sin embargo, la unión simultánea de D y E por una molécula multiespecífica de unión a antígeno de la divulgación atenuará la actividad de D en mayor medida que la unión de D por D1 solo.
Los formatos de ensayo alternativos y las variaciones de los formatos de ensayo ejemplificados en el presente documento serán evidentes para las personas con conocimientos habituales en la materia, teniendo en cuenta la naturaleza de la molécula diana específica y las proteínas efectoras a las que puede dirigirse cualquier molécula multiespecífica de unión a antígeno dada. Cualquier formato de este tipo se puede utilizar en el contexto de la presente divulgación para determinar si la unión simultánea de D y E por una molécula multiespecífica de unión a antígeno atenúa la actividad de D en mayor medida que la unión de D por D1 solo.
DIRECCIONAMIENTO A TUMORES
En otro aspecto de la divulgación, las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno son útiles para dirigirse a células tumorales. De acuerdo con este aspecto de la divulgación, la molécula diana "D" a la que se une D1 es un antígeno asociado a tumores. En determinados casos, el antígeno asociado a tumores es un antígeno que normalmente no se interioriza. La proteína efectora de interiorización "E" a la que se une D2 puede ser específica de un tumor o puede expresarse tanto en células tumorales como no tumorales de un individuo. Cualquiera de las proteínas efectoras de interiorización mencionadas en otra parte del presente documento puede ser la diana de las aplicaciones antitumorales de la divulgación.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "antígeno asociado a tumor" incluye proteínas o polipéptidos que se expresan preferentemente en la superficie de una célula tumoral. La expresión "expresada preferentemente", como se usa en este contexto, significa que el antígeno se expresa en una célula tumoral a un nivel que es al menos un 10 % mayor (por ejemplo, un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 100 %, un 110 %, un 150 %, un 200 %, un 400 % o más) que el nivel de expresión del antígeno en células no tumorales. En determinados aspectos, la molécula diana es un antígeno que se expresa preferentemente en la superficie de una célula tumoral seleccionada del grupo que consiste en una célula tumoral renal, una célula tumoral de colon, una célula tumoral de mama, una célula tumoral de ovario, una célula tumoral de la piel, una célula tumoral de pulmón, una célula tumoral de próstata, una célula tumoral pancreática, una célula de glioblastoma, una célula tumoral de cáncer de cabeza y cuello, y una célula de melanoma. Los ejemplos no limitantes de antígenos asociados a tumores específicos incluyen, por ejemplo, AFP, ALK, proteínas BAGE, p-catenina, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, anhidrasa carbónica IX, caspasa-8, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciclina-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvlll, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EphA2, Fra-1, FOLR1, proteínas GAGE (por ejemplo, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipicano-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, proteínas MAGE (por ejemplo, MAGE-1, -2, -3, -4, -6 y -12), MART-1, mesotelina, ML-IAP, Muc1, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, survivina, TAG-72, TGF-p, TMPRSS2, Tn, TRP-1, TRP-2, tirosinasa y uroplaquina-3. El antígeno asociado a tumores al que se dirige la presente invención es Her2.
La molécula multiespecífica de unión a antígeno, de acuerdo con este aspecto de la divulgación, puede conjugarse con un fármaco, toxina, radioisótopo u otra sustancia que sea perjudicial para la viabilidad de una célula. Como alternativa, el fármaco o toxina puede ser una sustancia que no destruye directamente una célula, pero hace que la célula sea más susceptible a ser destruida por otros agentes externos. En otros aspectos más relacionados con el direccionamiento a tumores, la molécula multiespecífica de unión a antígeno de la divulgación no está conjugada en sí misma con un fármaco, toxina o radioisótopo, sino que en lugar de ello se administra junto con una segunda molécula de unión a antígeno específica para la diana (D) (denominada en el presente documento "molécula cómplice"), en donde la molécula cómplice está conjugada con un fármaco, toxina o radioisótopo. En dichos aspectos, la molécula multiespecífica de unión a antígeno se unirá preferentemente a un epítopo en la molécula diana (D) que es distinto y/o no se superpone con el epítopo reconocido por la molécula cómplice (es decir, para permitir la unión simultánea de la molécula multiespecífica de unión a antígeno y la molécula cómplice a la diana).
En un aspecto relacionado, la presente divulgación también incluye combinaciones antitumorales y métodos terapéuticos que comprenden: (a) una molécula de unión a antígeno conjugada con una toxina o fármaco que se une de manera específica a un antígeno asociado a tumor; y (b) una molécula multiespecífica de unión a antígeno que comprende (i) un primer dominio de unión que se une de manera específica a una proteína efectora de interiorización (por ejemplo, con baja afinidad) y (ii) un segundo dominio de unión que se une de manera específica a la molécula de unión a antígeno conjugada con toxina o fármaco. En este aspecto, la molécula multiespecífica de unión a antígeno sirve para unir la molécula de unión a antígeno conjugada con toxina o fármaco a la proteína efectora de interiorización, que de este modo sirve para unir físicamente el antígeno asociado al tumor con la proteína efectora de interiorización. La interiorización del anticuerpo antiantígeno asociado al tumor marcado con toxina a través de su conexión con la proteína efectora de interiorización daría como resultado, en consecuencia, la destrucción específica de las células tumorales.
De acuerdo con determinados aspectos de los aspectos de la divulgación dirigidos a tumores, la molécula multiespecífica de unión a antígeno (o anticuerpo cómplice) puede conjugarse con uno o más fármacos citotóxicos seleccionados del grupo que consiste en: calicheamicina, esperamicina, metotrexato, doxorrubicina, melfalán, clorambucilo, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cis-platino, etopósido, bleomicina, 5-fluorouracilo, estramustina, vincristina, etopósido, doxorrubicina, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, orataxel, docetaxel, dolastatina 10, auristatina E, auristatina PHE y compuestos a base de maitansina (por ejemplo, DM1, DM4, etc.). La molécula multiespecífica de unión a antígeno (o anticuerpo cómplice) también puede, o como alternativa, conjugarse con una toxina, tal como la toxina diftérica, exotoxina A dePseudomonas aeruginosa,cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, a-sarcina, proteínas deAleurites fordii,proteínas de diantina, proteínas dePhytolaca americana,etc. La molécula multiespecífica de unión a antígeno (o anticuerpo cómplice) también puede, o como alternativa, estar conjugada con uno o más radioisótopos seleccionados del grupo que consiste en 225Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 186Rh, 188Rh, 177Lu, 90Y, 131I, 67Cu, 125l, 123l, 77Br, 153Sm, 166Ho, 64Cu, 121Pb, 224Ra y 223Ra. Por lo tanto, este aspecto de la divulgación incluye moléculas multiespecíficas de unión a antígeno que son conjugados de anticuerpo y fármaco (CAF) o conjugados de anticuerpo y radioisótopo (CAR).
En el contexto de las aplicaciones para destruir tumores, el componente D2 puede, en determinadas circunstancias, unirse con baja afinidad a la proteína efectora de interiorización "E". Por lo tanto, la molécula multiespecífica de unión a antígeno se dirigirá preferentemente a las células tumorales que expresan el antígeno asociado al tumor. Como se utiliza en el presente documento, unión de "baja afinidad" significa que la afinidad de unión del componente D2 por la proteína efectora de interiorización (E) es al menos un 10 % más débil (por ejemplo, un 15 % más débil, un 25 % más débil, un 50 % más débil, un 75 % más débil, un 90 % más débil, etc.) que la afinidad de unión del componente D1 por la molécula diana (D). En determinadas realizaciones, la unión de "baja afinidad" significa que el componente D2 interactúa con la proteína efectora de interiorización (E) con una K<d>de más de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 1 pM, según se mide en un ensayo de resonancia de plasmón superficial a aproximadamente 25 °C.
La unión simultánea de una molécula multiespecífica de unión a antígeno a una proteína efectora de interiorización y a un antígeno asociado a tumor dará como resultado la interiorización preferente de la molécula multiespecífica de unión a antígeno en células tumorales. Si, por ejemplo, la molécula multiespecífica de unión a antígeno se conjuga con un fármaco, toxina o radioisótopo (o si la molécula multiespecífica de unión a antígeno se administra junto con un anticuerpo cómplice que se conjuga con un fármaco, toxina o radioisótopo), la interiorización dirigida del antígeno asociado al tumor en la célula tumoral a través de su unión a la molécula multiespecífica de unión a antígeno dará como resultado la destrucción extremadamente específica de células tumorales.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN
La presente divulgación incluye composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula multiespecífica de unión a antígeno. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una mejor transferencia, administración y tolerancia.
La presente divulgación también incluye métodos para inactivar o atenuar la actividad de una molécula diana (D). Los métodos de la presente divulgación comprenden poner en contacto una molécula diana con una molécula multiespecífica de unión a antígeno como se describe en el presente documento. En determinados aspectos, los métodos de acuerdo con este aspecto de la divulgación comprenden administrar una composición farmacéutica que comprende una molécula multiespecífica de unión a antígeno a un paciente para quien es deseable y/o beneficioso inactivar, atenuar o disminuir de otro modo la concentración extracelular de una molécula diana.
Se conocen diversos en la materia diferentes sistemas de administración y se pueden utilizar para administrar las composiciones farmacéuticas de la presente invención a un paciente. Los métodos de administración que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención incluyen las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por cualquier vía, por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto a la administración subcutánea, se puede utilizar un dispositivo de administración en bolígrafo para administrar una composición farmacéutica de la presente invención a un paciente.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar a los expertos familiarizados con la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y utilizar los métodos y las composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.
Ejemplo 1. Uso de una molécula multiespecífica de unión a antígeno para inducir la degradación de un receptor de la superficie celular mediante la unión con una proteína efectora de interiorización
Como experimento inicial demostrativo preliminar, se creó una molécula multiespecífica de unión a antígeno que es capaz de unirse a (a) una molécula efectora de interiorización y (b) una molécula diana receptora en la superficie celular. En este ejemplo, la proteína efectora de interiorización es Kremen-2 (Krm2) y la molécula diana receptora en la superficie celular es un receptor Fc (FcyRI [Fc-gamma-R1]).
Las moléculas de Kremen (Krm1 y Krm2) son proteínas de la superficie celular que median la señalización de WNT mediante el direccionamiento de la interiorización y degradación de las moléculas de señalización de la vía WNT LRP5 y LRP6. La interiorización de LRP5/6 se logra mediante la proteína soluble interactuante DKK1. En particular, DKK1 une Kremen con LRP5/6 en la superficie celular y, debida a esta unión, la interiorización de Kremen impulsa la interiorización y degradación de LRP5 y LRP6. (Véase Liet al.,PLoS One 5(6):e11014).
Los presentes inventores intentaron explotar las propiedades de unión a Kremen de DKK1 y las propiedades de interiorización de Kremen para inducir la interiorización de FcyRI. Para facilitar la interiorización/degradación de FcyRI mediada por Kremen, se construyó una molécula multiespecífica de unión a antígeno que consiste en DKK1 fusionada a un Fc de ratón (DKK1-mFc, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1). Como se explica en otra parte en el presente documento, una molécula multiespecífica de unión a antígeno se define como una molécula que comprende un primer dominio de unión a antígeno (D1) que se une de manera específica a una molécula diana, y un segundo dominio de unión a antígeno (D2) que se une de manera específica a una proteína efectora de interiorización. En este ejemplo demostrativo preliminar, el "primer dominio de unión a antígeno" es el componente mFc que se une de manera específica a la molécula diana FcyRI, y el "segundo dominio de unión a antígeno" es el componente DKK1 que se une de manera específica a la proteína efectora de interiorización Kremen.
En primer lugar, se realizó un experimento para determinar si DKK1-mFc se puede endocitar en células de forma dependiente de Kremen. Para este experimento, se utilizaron dos estirpes celulares: Célula 1, una estirpe celular HEK293 genomanipulada para expresar FcyRI, pero no Kremen-2, y célula 2, una estirpe celular HEK293 genomanipulada para expresar tanto FcyRI como Kremen-2. Se añadió una dilución 1:10 de medio acondicionado DKK1-mFc a las estirpes celulares respectivas y se dejó incubar a 37 °C durante 90 minutos. Después de la incubación de 90 minutos, las células se tiñeron con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con Alexa-488 para detectar la molécula DKK1-mFc. Mediante microscopía de fluorescencia, se observó que prácticamente no se localizó DKK1-mFc en la célula 1 (que carece de Kremen); sin embargo, se detectaron cantidades sustanciales de DKK1-mFc en la célula 2 que expresa Kremen-2. Por lo tanto, estos resultados muestran que la molécula multiespecífica de unión a antígeno DKK1-mFc puede interiorizarse en las células de una manera dependiente de Kremen.
A continuación, se realizó un experimento en el tiempo para determinar si DKK1 -mFc puede inducir la degradación de FcyRI de una manera dependiente de Kremen. Una breve descripción del protocolo experimental es la siguiente: La célula 1 (que expresa solo F<cy>R I) y la célula 2 (que expresa Kremen-2 y F<cy>RI) se trataron con 2 mg/ml de NHS-sulfo-biotina durante 15 minutos en hielo para marcar todas las proteínas expresadas en la superficie celular. A continuación, las células se lavaron y resuspendieron en 400 pl de medio y se dividieron en cuatro alícuotas de 100 pl que se trataron con DKK1-mFc durante períodos de tiempo variables (0 min, 15 min, 30 min y 60 min) a 37 °C.
Después de la incubación con DKK1-mFc, las células se sedimentaron y se trataron con inhibidores de proteasa. Los lisados de las células de los diferentes momentos de incubación se sometieron a inmunoprecipitación con F<cy>RI. Para la inmunoprecipitación con FcyRI, se añadió anticuerpo de ratón anti-FcYR1 a los lisados celulares y se incubó durante 1 hora a 4 °C. Después se añadieron perlas de proteína G y la mezcla se incubó durante 1 hora a 4 °C. A continuación, se lavaron las perlas y las proteínas se eluyeron y se sometieron a SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a la membrana y se sondaron con estreptavidina marcada con HRP para revelar cantidades relativas de proteína F<cy>RI restante expuesta en la superficie en cada muestra. Los resultados se muestran en la figura 2.
Como se ilustra en la figura 2, la cantidad de proteína F<cy>RI expuesta en la superficie en muestras de célula 1 (que expresan FcyRI pero no Kremen-2) permaneció relativamente constante independientemente de la cantidad de tiempo que las células estuvieron expuestas a DKK1-mFc. Por el contrario, la cantidad de proteína FcyRI expuesta en la superficie en muestras de célula 2 (que expresan tanto Kremen-2 como FcyR I) disminuyó sustancialmente al aumentar los tiempos de incubación con DKK1-mFc. Por lo tanto, este experimento demuestra que DKK1-mFc induce la degradación de FcyRI expresada en superficie celular de una manera dependiente de Kremen-2.
Considerados en conjunto, los resultados anteriores muestran que una molécula multiespecífica de unión a antígeno que se une simultáneamente a una molécula diana de la superficie celular (FcyR I) y una proteína efectora de interiorización (Kremen-2) puede inducir la degradación de la molécula diana de una manera dependiente de la proteína efectora.
Ejemplo 2. La actividad de IL-4R se atenúa con una molécula multiespecífica de unión a antígeno con especificidad para IL-4R y CD63
En una serie adicional de experimentos demostrativos preliminares, se construyó una molécula multiespecífica de unión a antígeno que es capaz de unirse simultáneamente a una molécula diana expresada en la superficie celular (es decir, IL-4R) y a una proteína efectora de interiorización expresada en la superficie celular (es decir, CD63). El propósito de estos experimentos fue determinar si la actividad de IL-4R en una célula se puede atenuar en mayor medida mediante la unión física de IL-4R a una molécula efectora que se interioriza y se dirige a la degradación dentro del lisosoma (en este caso, CD63). Dicho de otro modo, este ejemplo se diseñó para probar si la interiorización y degradación normal de CD63 podrían utilizarse para forzar la interiorización y el redireccionamiento degradativo de IL-4R en una célula.
En primer lugar, se construyó una molécula multiespecífica de unión a antígeno que es capaz de unirse tanto a IL-4R como a CD63. De manera específica, se combinaron un anticuerpo anti-IL-4R conjugado con estreptavidina y un anticuerpo anti-CD63 biotinilado en una proporción de 1:1 para producir un conjugado anti-IL-4R:anti-CD63 (es decir, una molécula multiespecífica de unión a antígeno que se une de manera específica tanto a IL-4R como a CD63). El anticuerpo anti-IL-4R usado en este ejemplo es un AcM completamente humano generado contra el dominio extracelular de IL-4R. (El anticuerpo anti-IL-4R comprendía una región variable de cadena pesada que tiene la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 4). El anticuerpo anti-CD63 utilizado en este ejemplo es el clon MEM-259 del AcM de ratón anti-CD63 humano, obtenido de Biolegend (San Diego, CA), n.° de catálogo 312002.
También se crearon dos construcciones de control: Control 1 = anticuerpo anti-IL-4R conjugado con estreptavidina combinado en una proporción de 1:1 con anticuerpo de ratón lgG1 kappa de control biotinilado; y control 2 = anticuerpo anti-IL-4R conjugado con estreptavidina combinado en una proporción de 1:1 con anticuerpo anti-CD63 no biotinilado. El anticuerpo anti-IL-4R utilizado en las construcciones experimentales y de control para este ejemplo es un anticuerpo que se sabe que se une de manera específica a IL-4R y bloquea sólo parcialmente la señalización mediada por IL-4.
La estirpe celular experimental utilizada en este ejemplo es una estirpe celular HEK293 que contiene una construcción indicadora de luciferasa STAT6 y STAT6 adicional ("células HEK293/STAT6-luc"). Las células utilizadas en este experimento expresan tanto IL-4R como CD63 en su superficie. Cuando se trata con IL-4 en ausencia de inhibidores, esta estirpe celular produce una señal de quimioluminiscencia detectable dependiente de la dosis que refleja el grado de señalización mediada por IL-4.
En un experimento inicial, la molécula multiespecífica experimental anti-IL-4R/anti-CD63, o las construcciones de control, se añadieron a las células HEK293/STAT6-luc de modo que la concentración final de anticuerpo anti-IL-4R en el medio fuera de 12,5 nM. La señal indicadora se midió a concentraciones crecientes de IL-4 en presencia y ausencia de las construcciones experimentales y de control (Figura 3). Como se observa en la figura 3, la molécula multiespecífica anti-IL-4R/anti-CD63 ("conjugado de Ac") inhibió la señalización mediada por IL-4 en un grado significativamente mayor que cualquiera de las construcciones de control.
Para confirmar que el efecto observado en la figura 3 dependía de CD63, se llevó a cabo el mismo experimento descrito anteriormente, excepto que la expresión de CD63 se redujo significativamente en la estirpe celular indicadora mediante el uso de un ARNip dirigido contra CD63. Con la expresión de CD63 significativamente reducida, ya no se observó la actividad inhibidora mejorada de la molécula multiespecífica anti-IL-4R/anti-CD63 (Figura 4). Este resultado sugiere que la capacidad de la molécula multiespecífica anti-IL-4R/anti-CD63 para atenuar la señalización mediada por IL-4 se debe a la unión simultánea de la molécula multiespecífica a IL-4R y CD63 y la consiguiente interiorización y degradación de todo el complejo anticuerpo-IL-4R-CD63.
A continuación, se llevaron a cabo experimentos similares en los que la molécula multiespecífica anti-IL-4R/anti-CD63, o las construcciones de control, se incubó con la estirpe celular indicadora HEK293/STAT6-luc durante varios periodos de tiempo antes de la adición de IL-4. En un primer conjunto de dichos experimentos, se dejó que las moléculas se incubaran con la estirpe celular indicadora durante 0 horas (es decir, se añadió simultáneamente IL-4), 2 horas o durante toda la noche antes de la adición de IL-4 50 pM. La actividad luciferasa se midió seis horas después de la adición de IL-4. Los resultados se muestran en la figura 5, panel superior ("no transfectado"). En un conjunto de experimentos adicionales, se llevó a cabo un protocolo similar, excepto que las moléculas experimentales o de control se incubaron con la estirpe celular indicadora durante 15 minutos, 30 minutos, 1 hora o 2 horas antes de la adición de IL-450 pM. Los resultados se muestran en la figura 6.
Los resultados resumidos en las figuras 5 y 6 muestran que la molécula multiespecífica anti-IL-4R/anti-CD63 es capaz de inhibir la señalización mediada por IL-4, y que este efecto inhibidor se potencia con tiempos de incubación más prolongados. Al igual que con el conjunto inicial de experimentos, se confirmó mediante ARNip de CD63 que el efecto inhibidor de la molécula multiespecífica anti-IL-4R/anti-CD63 dependía de la expresión de CD63 (panel inferior de la figura 5 ["ARNip de CD63"]).
Resumiendo, este ejemplo proporciona un experimento demostrativo preliminar adicional para la inhibición de la actividad de una molécula diana mediante el uso de una molécula multiespecífica de unión a antígeno que es capaz de unirse simultáneamente tanto a la molécula diana (en este caso IL-4R) como a una proteína efectora de interiorización (en este caso CD63) para provocar así la interiorización y el redireccionamiento degradativo de la molécula diana en una célula. Dicho de otra manera, la unión simultánea de IL-4R y CD63 mediante la molécula multiespecífica de unión a antígeno ilustrativa atenuó la actividad de IL-4R en un grado sustancialmente mayor (es decir, >10 %) que la unión de IL-4R por las construcciones de control solas.
Ejemplo 3. Un anticuerpo biespecífico anti-IL-4R x anti-CD63 atenúa la actividad de IL-4R de una manera dependiente de CD63
Los experimentos del ejemplo 2, en el presente documento, muestran que una molécula multiespecífica anti-IL-4R/anti-CD63 inhibe la señalización mediada por IL-4 de una manera dependiente de CD63. En esos experimentos, la molécula multiespecífica de unión a antígeno consistía en dos anticuerpos monoclonales separados (anti-IL-4R y anti-CD63) que estaban conectados mediante un enlace biotina-estreptavidina. Para confirmar que los resultados observados con esa molécula multiespecífica de unión a antígeno demostrativa preliminar son generalizables a otros formatos de moléculas multiespecíficas de unión a antígeno, se construyó un verdadero anticuerpo biespecífico.
Se utilizó tecnología de anticuerpos biespecíficos convencional para construir un anticuerpo biespecífico que consistía en un primer brazo específico para IL-4R y un segundo brazo específico para CD63. El brazo específico para IL-4R contenía una cadena pesada anti-IL-4R emparejada con una cadena ligera específica de CD63. La cadena ligera específica de CD63 se emparejó con la cadena pesada específica de IL-4R únicamente por motivos de conveniencia de construcción; no obstante, el emparejamiento de la cadena pesada anti-IL-4R con la cadena ligera anti-CD63 mantuvo la especificidad completa por IL-4R y no presentó unión a CD63. El brazo específico de CD63 contenía una cadena pesada anti-CD63 emparejada con una cadena ligera anti-CD63 (la misma cadena ligera que se utiliza en el brazo de IL-4R). La cadena pesada anti-IL-4R (que comprende la SEQ ID NO: 3) procedía del anticuerpo anti-IL-4R completo como se utilizó en el ejemplo 2; Sin embargo, las cadenas pesada y ligera anti-CD63 procedieron del anticuerpo anti-CD63 denominado H5C6, obtenido del Developmental Studies Hybridoma Bank (Departamento de Biología de la Universidad de Iowa, Iowa City, IA). Al igual que con el anticuerpo anti-IL-4R completo utilizado en el ejemplo 2, el componente anti-IL-4R del anticuerpo biespecífico utilizado en este ejemplo presentó sólo una actividad bloqueadora moderada de IL-4R por sí solo.
Se llevó a cabo un ensayo con luciferasa para IL-4 para evaluar la actividad bloqueante del anticuerpo biespecífico anti-IL-4R x anti-CD63. En síntesis, se añadieron diluciones en serie de anticuerpo biespecífico anti-IL-4R x anti-CD63 o moléculas de control a células indicadoras HEK293/STAT6-luc (véase el ejemplo 2). En condiciones normales, estas células producen una señal de luciferasa detectable cuando se tratan con IL-4. Para este experimento, después se añadió IL-4 10 pM a las células y se cuantificó la actividad luciferasa para cada dilución de anticuerpo utilizada. Los controles utilizados en este ensayo fueron: (a) anticuerpo biespecífico simulado que se une a IL-4R con un brazo y tiene un brazo anti-CD63 no funcional (es decir, que contiene una cadena pesada anti-IL-4R y una cadena pesada anti-CD63, ambas emparejadas con la cadena ligera anti-IL-4R); (b) anticuerpo monoespecífico anti-IL-4R; y (c) tampón (PBS) solo (sin anticuerpo). Los resultados se muestran en la figura 7. Como se muestra en la figura 7, para las muestras de control utilizadas, la actividad de la luciferasa se mantuvo relativamente elevada incluso con las concentraciones más elevadas de anticuerpos, mientras que para el anticuerpo biespecífico, la actividad de la luciferasa disminuyó significativamente a medida que aumentaba la concentración de anticuerpos. Estos resultados confirman que la unión simultánea de IL-4R y CD63 mediante un anticuerpo biespecífico provoca una inhibición sustancial de la actividad de IL-4R.
Ejemplo 4. interiorización de SOST mediante una molécula multiespecífica de unión a antígeno que se une simultáneamente a SOST y CD63
En este ejemplo, se evaluó la capacidad de moléculas multiespecíficas de unión a antígenos para promover la interiorización de la molécula diana soluble SOST (esclerostina). Para estos experimentos, la molécula diana era una proteína de fusión que consistía en una proteína SOST humana marcada con una fracción pHrodo™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) y un marcador myc. La fracción pHrodo™ es un colorante sensible al pH que prácticamente no es fluorescente a pH neutro y que emite una fluorescencia muy brillante en un ambiente ácido, tal como el del endosoma. La señal fluorescente, por tanto, se puede utilizar como indicador de la interiorización celular de la proteína de fusión SOST. Las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno para estos experimentos fueron anticuerpos biespecíficos con especificidad de unión tanto para CD63 (una proteína efectora de interiorización) como para la proteína de fusión SOST (una molécula diana soluble), como se describe con más detalle a continuación.
Los experimentos se llevaron a cabo de la siguiente manera: En síntesis, se sembraron células HEK293 a razón de 10.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina (Greiner Bio-One, Monroe, NC). Después de dejar que las células se asienten durante la noche, el medio se reemplazó con medio que contenía anticuerpo (5 pg/ml, como se describe a continuación), SOST marcada con pHrodo™ y myc (5 pg/ml), heparina (10 pg/ml) y Hoechst 33342. A continuación, las células se incubaron durante 3 horas en hielo o 3 horas a 37 °C. Todas las células se lavaron dos veces antes de la obtención de imágenes en PBS, y se contó el número de puntos fluorescentes por célula, así como la correspondiente intensidad de fluorescencia, para establecer el grado de interiorización celular de SOST marcada con pHrodo y myc en presencia de las diversas construcciones de anticuerpos.
Los anticuerpos utilizados en este ejemplo fueron los siguientes: (1) anticuerpo monoespecífico anti-CD63 (clon H5C6, Developmental Studies Hybridoma Bank, Departamento de Biología de la Universidad de lowa, Ciudad de lowa, IA); (2) anticuerpo anti-myc (clon 9E10, Schiwecket al.,1997,FEBS Lett.414(1):33-38); (3) anticuerpo anti-SOST (un anticuerpo que tiene las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo denominado "Ac B" en la patente de EE. Uu . n.° 7.592.429); (4) anticuerpo biespecífico anti-CD63 * anti-myc (es decir, una molécula multiespecífica de unión a antígeno que comprende un brazo anti-CD63 procedente del anticuerpo H5C6 y un brazo anti-myc procedente de 9E10); (5) anticuerpo biespecífico n.° 1 anti-CD63 * anti-SOST (es decir, una molécula multiespecífica de unión a antígeno que comprende un brazo anti-CD63 procedente del anticuerpo H5C6 y un brazo anti-SOST procedente del "Ac B"); y (6) anticuerpo biespecífico n.° 2 anti-CD63 * anti-SOST (es decir, una molécula multiespecífica de unión a antígeno que comprende un brazo anti-CD63 procedente del anticuerpo H5C6 y un brazo anti-SOST procedente del anticuerpo denominado "Ac 20 " en la patente de EE. UU. n.° 7.592.429). Los anticuerpos biespecíficos utilizados en estos experimentos se ensamblaron utilizando la metodología denominada "botón en ojal" (véase, por ejemplo, Ridgwayet al.,1996, Protein Eng. 9(7):617-621).
Los resultados de los experimentos de interiorización se muestran en la figura 8. En la figura 8 se muestra el número de puntos (vesículas marcadas) por célula, en las diversas condiciones de tratamiento probadas. Considerados en conjunto, los resultados de estos experimentos demuestran que las construcciones biespecíficas, que se unen simultáneamente a CD63 y SOST (ya sea directamente o mediante el marcador myc), provocaron la mayor cantidad de interiorización de SOST como lo refleja la intensidad de la fluorescencia y la cantidad de puntos fluorescentes por célula a lo largo del tiempo a 37 °C. Por lo tanto, las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno utilizadas en este ejemplo son capaces de dirigir de manera eficaz la interiorización de una molécula diana soluble.
Ejemplo 5. Cambios en la densidad mineral ósea en ratones tratados con una molécula multiespecífica de unión a antígeno que se une a CD63 y SOST
A continuación, se prueba una molécula multiespecífica de unión a antígeno anti-CD63 * anti-SOST, como se describe en el ejemplo 4, para determinar su capacidad para aumentar la densidad mineral ósea en ratones. En estos experimentos se utilizan cinco grupos de ratones (aproximadamente 6 ratones por grupo). Los grupos de tratamiento son los siguientes: (I) ratones de control negativo no tratados; (II) ratones tratados con un anticuerpo monoespecífico anti-SOST bloqueador que se sabe que aumenta la densidad mineral ósea por sí solo (control positivo); (III) ratones tratados con un anticuerpo biespecífico que se une de manera específica a CD63 y SOST pero que no inhibe la actividad de SOST por sí solo o solo inhibe ligeramente la actividad de SOST por sí solo; (IV) ratones tratados con un anticuerpo parental anti-CD63 (es decir, un anticuerpo monoespecífico que contiene el mismo dominio de unión a antígeno anti-CD63 que el anticuerpo biespecífico); y (V) ratones tratados con un anticuerpo parental anti-SOST (es decir, un anticuerpo monoespecífico que contiene el mismo dominio de unión a antígeno anti-SOST que el anticuerpo biespecífico). La cantidad de anticuerpo administrada a los ratones de cada grupo es de aproximadamente 10 a 25 mg/kg.
Se espera que los ratones del grupo III (tratados con un anticuerpo biespecífico anti-SOST * anti-CD63) presenten un aumento en la densidad mineral ósea que sea al menos comparable al observado en los ratones del grupo II (tratados con un conocido anticuerpo anti-SOST bloqueador), a pesar de que el componente anti-SOST del anticuerpo biespecífico no inhibe la actividad SOST por sí solo (como lo confirmaron los ratones del grupo V, que se espera quenopresenten un aumento en la densidad mineral ósea). Se cree que el aumento de la densidad mineral ósea que se espera en los ratones del grupo III está impulsado por la interiorización de SOST mediada por CD63, como se observa en los experimentos celulares del ejemplo 4 anterior.
Ejemplo 6. interiorización celular de lipopolisacárido (LPS) mediada por una molécula multiespecífica de unión a antígeno que se une simultáneamente a LPS y CD63
Este ejemplo ilustra el uso de una molécula multiespecífica de unión a antígeno de la divulgación para dirigir la interiorización de una molécula diana no proteica, en concreto, lipopolisacárido (LPS). El LPS es un componente de la membrana externa de las bacterias gramnegativas y se sabe que contribuye al choque séptico. Se han investigado los anticuerpos anti-LPS como posibles agentes de tratamiento para la sepsis. Los experimentos del presente ejemplo se diseñaron para evaluar la capacidad de una molécula multiespecífica de unión a antígeno para promover la interiorización de LPS.
La molécula multiespecífica de unión a antígeno utilizada en este ejemplo fue un anticuerpo biespecífico con un brazo dirigido a LPS (diana) y el otro brazo dirigido a CD63 (proteína efectora de interiorización). El brazo anti-LPS procedía del anticuerpo conocido como WN1 222-5. (DiPadovaet al.,1993,Infection and Immunity61 (9):3863-3872; Muller-Loennieset al.,2003,J. Biol. Chem.278(28):25618-25627; Gomeryet al.,2012,Proc. Natl. Acad. Sci USA109(51):20877-20882; documento US 5.858.728). El brazo anti-CD63 procedía del anticuerpo H5C6 (véase el ejemplo 4). El anticuerpo biespecífico anti-LPS x anti-CD63 (es decir, la molécula multiespecífica de unión a antígeno) se ensambló utilizando la metodología denominada "botón en ojal" (véase, por ejemplo, Ridgwayet al.,1996, Protein Eng. 9(7):617-621).
En estos experimentos se utilizaron dos especies de LPS: LPS deE. coliy LPS deSalmonella minnesota.Ambas versiones se obtuvieron como moléculas marcadas con fluorescencia (LPS marcado con ALEXA-FLUOR®-488, Life Technologies, Carlsbad, CA).
Los experimentos se realizaron de la siguiente manera: Las células HEK293 se sembraron en placas de obtención de imágenes de 96 pocillos recubiertas con PDL. Después de descansar durante la noche, el medio se reemplazó con medio nuevo. El LPS marcado con fluorescencia (ya sea procedente deE. colio S.minnesota)se añadió en el medio regular. A continuación, el anticuerpo biespecífico anti-LPS x anti-CD63, o semianticuerpos de control emparejados con Fc ficticio, se añadieron a las muestras. Después de varios tiempos de incubación a 37 °C (1 hora y 3 horas) o en hielo (3 horas), las células de las muestras tratadas con LPS se procesaron de la siguiente manera: lavado - extinción con anticuerpo anti-ALEXA-FLUOR®-488 - lavado y fijación. El anticuerpo anti-ALEXA-FLUOR®-488 extingue la fluorescencia del fluoróforo no interiorizado (es decir, unido a la superficie). Por lo tanto, cualquier fluorescencia observada en las muestras tratadas con anticuerpos de extinción se debe al LPS interiorizado. Se midió el nivel de fluorescencia de cada muestra en los distintos puntos temporales.
En la figura 9 se expresan los resultados de estos experimentos en términos del número de vesículas marcadas por célula. Como se muestra en la figura 9, sólo las células tratadas con el anticuerpo biespecífico anti-CD63 x anti-LPS demostraron números significativos de vesículas marcadas que aumentaron con el tiempo. Las células tratadas con LPS marcado y los anticuerpos de control no presentaron un número apreciable de vesículas fluorescentes, lo que indica que el LPS no se interiorizó en esas condiciones de tratamiento.
Por tanto, este ejemplo demuestra que un anticuerpo biespecífico anti-LPS x anti-CD63 provoca la interiorización de LPS en las células de una manera que requiere la unión simultánea de LPS y CD63. Por consiguiente, estos resultados respaldan el uso de moléculas multiespecíficas de unión a antígeno de la divulgación para promover la interiorización celular de moléculas diana tales como LPS para el tratamiento de enfermedades y trastornos, tales como la sepsis.
Ejemplo 7. Interiorización celular y degradación de Her2 mediada por una molécula multiespecífica de unión a antígeno que se une simultáneamente a Her2 y PRLR
Este ejemplo incluye tres experimentos separados que ilustran el uso de una molécula multiespecífica de unión a antígeno de la invención para dirigir la interiorización y degradación de un antígeno asociado a tumor (Her2). La eliminación de Her2 de la superficie de las células tumorales sería un enfoque deseable para el tratamiento de determinados tipos de cánceres caracterizados por una expresión elevada de Her2 (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer gástrico, cánceres gastroesofágicos, etc.).
Las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno utilizadas en los experimentos de este ejemplo fueron anticuerpos biespecíficos con un brazo dirigido a Her2 (diana) y el otro brazo dirigido a PRLR (proteína efectora de interiorización).
Experimento 1
Como experimento inicial, se evaluó la capacidad de un anticuerpo biespecífico anti-Her2 x anti-PRLR (denominado en el presente documento "AcBs1 Her2 x PRLR") para degradar Her2 endógeno en células de cáncer de mama T47D. Las células de cáncer de mama T47D expresan niveles bajos de HER2 y, en general, son resistentes a la terapia anti-HER2 (véase Horwitzet al.,"Variant T47D human breast cancer cells with high progesterone-receptor levels despite estrogen and antiestrogen resistance", Cell. marzo de 1982; 28(3):633-42).
El brazo anti-Her2 procedía del anticuerpo conocido como trastuzumab. El brazo anti-PRLR procedía de un anticuerpo anti-PRLR completamente humano. El anticuerpo biespecífico anti-Her2 * anti-PRLR (es decir, la molécula multiespecífica de unión a antígeno) se ensambló utilizando la metodología denominada "botón en ojal" (véase, por ejemplo, Ridgwayet al.,1996, Protein Eng. 9(7):617-621). Otras construcciones utilizadas en este experimento fueron trastuzumab (anticuerpo monoespecífico), Ac anti-PRLR (anticuerpo monoespecífico, referido como H1H6958N2, como se establece en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. n.° 2015/0056221) y un anticuerpo de control monoespecífico (dirigido contra un antígeno no humano irrelevante).
Para este experimento, se cultivaron células T47D que expresan niveles endógenos de receptores Her2 y PRLR en RPMI (Irvine Scientific, 9160) complementado con FBS al 10 % (ATCC, 30-2020), Hepes 10 mM, piruvato de sodio 1 mM e insulina 10 pg/ml. Se utilizó cicloheximida (CHX) a 50 pg/ml para detener la síntesis de proteínas. Las células T47D se trataron con cicloheximida y trastuzumab (CHX/Trastuzumab), cicloheximida y AcBs1 Her2 * PRLR (CHX/AcBs1), cicloheximida y Ac PRLR (CHX/Ac PRLR), cicloheximida y Ac de control (CHX/Ac de Control) o con cicloheximida, Ac PRLR y trastuzumab durante 0, 1,2 o 4 horas.
Las células se lisaron en hielo en tampón RIPA (Tris-HCI 100 mM, NaCl 300 mM, NP-40 al 2 %, desoxicolato de sodio al 1 % y SDS al 0,2 %) (Boston BioProducts BP-116X) complementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa (Thermo Fisher, 1861280), seguido de una exposición a ultrasonidos (Qsonica Modelo Q55, tres pulsos). Los lisados expuestos a ultrasonidos se diluyeron con tampón de muestra SDS 2* 1:1, calentado a 95 °C durante 10 min, seguido de centrifugación a 13.000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se resolvieron en geles Novex Tris-Glicina al 4-20 % y se transfirieron a membranas de PVDF.
Se utilizaron anticuerpos Her2 (Dako, A0485) a 1:300 o anticuerpos PRLR (Life Technologies, 35-9200) a 1:250 para el marcaje primario de membranas, seguido de un anticuerpo secundario conjugado con HRP a 1:5000 y detección por quimioluminiscencia con ECL (Amersham, RPN2106). La cuantificación de las transferencias Western se realizó mediante el cálculo de la intensidad neta de las bandas con el programa informático CareStream (Kodak). Los resultados se muestran en la tabla 1. Los valores se expresan en términos de unidades relativas en comparación con una referencia.
Como se muestra en la tabla 1, tras la inhibición de la síntesis de proteínas con cicloheximida, se demostró que PRLR sufre una degradación rápida y completa con todos los tratamientos utilizados; el proceso no se vio afectado por ninguno de los anticuerpos probados. Por el contrario, en presencia de cicloheximida, Her2 se degradó en células tratadas con AcBs1 Her2 * PRLR, pero no con la mezcla de trastuzumab y Ac anti-PRLR, Ac PRLR individuales, trastuzumab o anticuerpos de control. Este resultado sugiere que el AcBs1 Her2 * PRLR sirve para unir Her2 a PRLR en la superficie celular, a lo que sigue la degradación del complejo Her2-AcBs1-PRLR.
Tabla 1
Experimento 2
En un segundo experimento, se investigaron los efectos dependientes de la dosis de las proteínas multiespecíficas de unión a antígeno Her2 * PRLR en la degradación de Her2in vitro,así como los posibles efectos en los niveles de PRLR. En este experimento se utilizaron dos anticuerpos biespecíficos Her2 * PRLR diferentes ("AcBs1 Her2 * PRLR" y "AcBs2 Her2 * PRLR"). Ambos anticuerpos biespecíficos se construyeron utilizando la metodología de "botón en ojal". El brazo anti-Her2 era idéntico para ambos anticuerpos biespecíficos y procedía del anticuerpo conocido como trastuzumab. Los brazos anti-PRLR del AcBsl Her2 * PRLR y del AcBs2 Her2 * PRLR procedían de dos anticuerpos anti-PRLR completamente humanos diferentes.
Para este experimento, se cultivaron células T47D que expresan niveles endógenos de receptores Her2 y PRLR en RPMI (Irvine Scientific, 9160) complementado con FBS al 10 % (ATCC, 30-2020), Hepes 10 mM, piruvato de sodio 1 mM e insulina 10 pg/ml. Las células T47D se trataron durante 6 horas con AcBs1 o AcBs2 a 10 pg/ml, 3 pg/ml, 1 pg/ml, 0,3 pg/ml, 0,03 pg/ml o 0 pg/ml.
Las células se lisaron en hielo en tampón RIPA (Tris-HCI 100 mM, NaCl 300 mM, NP-40 al 2 %, desoxicolato de sodio al 1 % y SDS al 0,2 %) (Boston BioProducts BP-116X) complementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa (Thermo Fisher, 1861280), seguido de una exposición a ultrasonidos (Qsonica Modelo Q55, tres pulsos). Los lisados expuestos a ultrasonidos se diluyeron con tampón de muestra SDS 2* 1:1, calentado a 95 °C durante 10 min, seguido de centrifugación a 13.000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se resolvieron en geles Novex Tris-Glicina al 4-20 % y se transfirieron a membranas de PVDF.
Se utilizaron anticuerpos Her2 (Dako, A0485) a 1:300, anticuerpos PRLR (Life Technologies, 35-9200) a 1:250 o anticuerpos p-actina (Genetex, GTX100313) a 1:10.000 para el marcaje primario de membranas, seguido de un anticuerpo secundario conjugado con HRP a 1:5000 y detección quimioluminiscente con ECL (Amersham, RPN2106).
La cuantificación de las transferencias Western se realizó mediante el cálculo de la intensidad neta de las bandas con el programa informático CareStream (Kodak). Para controlar la carga, se utilizó la normalización con respecto a la actina de la siguiente manera: la muestra con mayor intensidad neta de actina se utilizó como control de normalización. La intensidad neta de actina de cada muestra se dividió por el valor de control de normalización para obtener un valor relativo de la muestra. Las intensidades netas de cada proteína diana (Her2 o PRLR) se dividieron por el valor relativo de actina calculado para la muestra para obtener un valor normalizado de Her2 o PRLR (unidades arbitrarias). Los resultados se muestran en la tabla 2.
Como se muestra en la tabla 2, tanto el AcBs1 Her2 * PRLR como el AcBs2 Her2 * PRLR indujeron la degradación de Her2 de una manera dependiente de la dosis en células T47D. Por el contrario, los niveles de PRLR no se vieron afectados por el tratamiento con anticuerpos biespecíficos. Este resultado es coherente con el hecho de que PRLR experimente un recambio superficial constitutivo en la superficie de estas células.
Tabla 2
Experimento 3
Los experimentos anteriores sugieren que la degradación de Her2 por un anticuerpo biespecífico Her2 * PRLR necesita que el anticuerpo biespecífico se una simultáneamente a PRLr (una proteína efectora de interiorización) y Her2 (una proteína diana). Para confirmar este principio, se realizó un tercer experimento para evaluar el efecto del bloqueo de los brazos de unión a PRLR o Her2 del AcBs1 Her2 * PRLR en la actividad de interiorización de Her2.
Para este experimento, se cultivaron células T47D que expresaban niveles endógenos de receptores Her2 y PRLR en RPMI (Irvine Scientific, 9160) complementadas con FBS al 10 % (ATCC, 30-2020), Hepes 10 mM, piruvato de sodio 1 mM e insulina 10 pg/ml. El AcBs1 Her2 * PRLR (10 pg/ml) se dejó sin tratar (es decir, ambos brazos desbloqueados) o se incubó con una construcción de proteína PRLR soluble ("PRLR.mmh" para bloquear el brazo de unión a PRLR) 0 una construcción de proteína Her2 soluble ("Her2.mmh" para bloquear el brazo de unión a Her2) a 37 °C durante 1 h (proporción molar 1:2) antes de añadirlo a las células t 47D durante 0, 2, 4 o 6 horas.
Al final del periodo de incubación, las células se lisaron en hielo en tampón RIPA (Tris-HCI 100 mM, NaCI 300 mM, NP-40 al 2 %, desoxicolato de sodio al 1 % y SDS al 0,2 %) (Boston BioProducts BP-116X) complementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa (Thermo Fisher, 1861280), seguido de una exposición a ultrasonidos (Qsonica Modelo Q55, tres pulsos). Los lisados expuestos a ultrasonidos se diluyeron con tampón de muestra SDS 2* 1:1 y se calentaron a 95 °C durante 10 min, seguido de centrifugación a 13.000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se resolvieron en geles Novex Tris-Glicina al 4-20 % y se transfirieron a membranas de PVDF.
Se utilizaron anticuerpos Her2 (Dako, A0485) a 1:300 o anticuerpos p-actina (Genetex, GTX100313) a 1:10.000 para el marcaje primario de membranas, seguido de un anticuerpo secundario conjugado con HRP a 1:5000 y detección de quimioluminiscencia con ECL (Amersham, RPN2106).
La cuantificación de las transferencias Western se realizó mediante el cálculo de la intensidad neta de las bandas con el programa informático CareStream (Kodak). Para controlar la carga, se utilizó la normalización con respecto a la actina de la siguiente manera: la muestra con mayor intensidad neta de actina se utilizó como control de normalización. La intensidad neta de actina de cada muestra se dividió por el valor de control de normalización para obtener un valor relativo de la muestra. La intensidad neta de la banda Her2 se dividió por el valor relativo de actina calculado para la muestra para obtener un valor de Her2 normalizado (unidades arbitrarias). Los resultados se muestran en la tabla 3.
Como se muestra en la tabla 3, la degradación de Her2 mediada por el AcBs1 Her2 * PRLR se evitó completamente en células T47D mediante el bloqueo de los brazos Her2 o PRLR del AcBs1 Her2 * PRLR, lo que indica que la degradación de Her2 se produjo a través de su conexión física con PRLR, que fue mediada por la unión simultánea de Her2 y PRLR mediante la proteína multiespecífica de unión a antígeno AcBs1 Her2 * PRLR.
Ejemplo 8. Aumento de la potencia de trastuzumab emtansina mediada por una molécula multiespecífica de unión a antígeno que se une simultáneamente a Her2 y PRLR
Este ejemplo ilustra el uso de moléculas multiespecíficas de unión a antígeno de la invención para aumentar la potencia de un conjugado de anticuerpo y fármaco ("CAF"). De manera más específica, este ejemplo demuestra el uso de una molécula multiespecífica de unión a antígeno que comprende un primer dominio de unión dirigido a una proteína efectora de interiorización y un segundo dominio de unión dirigido a un antígeno diana asociado a un tumor, en combinación con una segunda molécula de unión a antígeno específica para el antígeno diana asociado al tumor (también denominada en el presente documento "molécula cómplice"), en donde la molécula cómplice es un CAF. En los experimentos que se exponen a continuación, la proteína efectora de interiorización es el receptor de prolactina (PRLR), el antígeno diana asociado al tumor es Her2 y la molécula cómplice es un CAF específico para Her2 (es decir, trastuzumab emtansina (T-DM1)).
Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante que se une al dominio extracelular de Her2. Trastuzumab y su correspondiente CAF, Trastuzumab-emtansina, o T-DM1, se han utilizado con éxito en pacientes con fuerte sobreexpresión de Her2, según lo evaluado mediante inmunohistoquímica (IHC 3+). Sin embargo, actualmente no existe una terapia eficaz disponible para pacientes con tumores Her2 IHC2+ y Her2 IHC1+.
Tabla 3
En este ejemplo, se evaluó la capacidad de cuatro anticuerpos biespecíficos anti-Her2 * anti-PRLR diferentes (denominados en el presente documento "AcBs36 Her2 * PRLR", "AcBs37 Her2 * PRLR", "AcBs42 Her2 * PRLR" y "AcBs45 Her2 * PRLR" para aumentar la potencia de destrucción celular de T-DM1 en células que expresan Her2. Los anticuerpos biespecíficos utilizados en este ejemplo se construyeron a partir de cuatro brazos anti-Her2 diferentes y dos brazos anti-PRLR diferentes, como se resume en la tabla 4.
Tabla 4
Se utilizaron métodos convencionales para construir los anticuerpos biespecíficos anti-Her2 * anti-PRLR (es decir, las moléculas multiespecíficas de unión a antígeno). También se realizaron experimentos de control utilizando un CAF de control (es decir, un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo dirigido contra una proteína no humana irrelevante conjugada con DM1) o un CAF anti-PRLR-DM1 (el conjugado de anticuerpo y fármaco denominado H1H6958N2 en el documento US 2015/0056221).
Para evaluar la capacidad de los anticuerpos biespecíficos Her2 * PRLR para mejorar el efecto de destrucción celular de T-DM1, primero se cultivaron las células T47D que expresan niveles endógenos de PRLR y sobreexpresan Her2 a niveles intermedios (T47D/Her2) en RPMI (Irvine Scientific, 9160) complementadas con FBS al 10 % (ATCC, 30-2020), Hepes 10 mM, piruvato de sodio 1 mM e insulina 10 pg/ml. A continuación, se sembraron las células en placas de 96 pocillos a razón de 3000 células/pocillo. Al día siguiente, las células se dejaron sin tratar o se trataron con un intervalo de concentraciones de T-DM1, CAF de control, anti-PRLR-DM1 o una combinación de T-DM1 con 10 pg/ml de AcBs42 Her2 * PRLR, AcBs36 Her2 * PRLR, AcBs37 Her2 * PRLR o AcBs45 Her2 * PRLR durante 3 días por triplicado.
La viabilidad celular se evaluó de la siguiente manera: 3 días después del tratamiento, las células se fijaron con PFA al 0,25 %, saponina al 0,1 %, Hoechst 2 pg/ml durante 20 min, se adquirieron imágenes de pocillos completos en un microscopio automático lmageXpressMICRO a 10* y se analizaron mediante el módulo Cell ProliferationHT MetzxPress™ (recuento nuclear). Los resultados se resumen en la tabla 5.
Tabla 5
Como se muestra en la tabla 5, la potencia de destrucción celular de T-DM1 aumentó significativamente por la presencia de los anticuerpos biespecíficos Her2 * PRLR de la presente invención. Por lo tanto, este ejemplo demuestra la capacidad de las proteínas multiespecíficas de unión a antígeno de la invención para mejorar la potencia y eficacia de moléculas inmunoconjugadas dirigidas a proteínas diana que normalmente no están interiorizadas por las células de manera rápida.
Se sabe que T-DM1 es activo contra tumores que expresan niveles elevados de HER2, mientras que aquellas células que expresan niveles bajos e intermedios de HER2 siguen siendo resistentes al tratamiento con T-DM1. Por el contrario, un CAF anti-PRLR es capaz de inducir una destrucción sólida de células tumorales de mama que expresan niveles bajos de PRLR. La diferencia en la eficacia de destrucción entre el CAF anti-PRLR y T-DM1 probablemente se deba a la diferencia en las tasas de interiorización y el tráfico lisosómico de sus respectivas dianas. Se comparó el tráfico intracelular de PRLR y HER2.
En aquellas células que expresan niveles bajos en la superficie de PRLR y HER2, se observó que el PRLR experimentaba un rápido tráfico lisosómico constitutivo y una degradación que era en gran medida independiente del ligando de prolactina. HER2, sin embargo, no sufrió un rápido tráfico lisosómico constitutivo y la degradación. Por ejemplo, las células T47D, que expresan niveles bajos de PRLR y HER2, interiorizaron el 80 % del PRLR en 60 minutos, mientras que HER no fue interiorizado (Figura 11). En estos experimentos, las células T47D se incubaron en hielo con el anticuerpo primario anti-PRLR marcado con CF™594 o con el anticuerpo primario anti-HER2 marcado con CF™594. El proceso de interiorización se inició mediante la adición de medio precalentado (37 °C) a las células. En los momentos indicados, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % para detener la interiorización y se tiñeron con anticuerpo secundario de cabra anti-Fab humano conjugado con Alexa Fluor® 488 para detectar anticuerpos no interiorizados que permanecían en la superficie celular (amarillo). La localización conjunta se cuantificó punto por punto para todas las secciones de la pila confocal. Los resultados se representan en la figura 11
Del mismo modo, se observó que PRLR, pero no HER2, se interiorizaba rápidamente en el compartimento lisosómico de las células T47D. Se añadieron anticuerpos anti-PRLR marcados con CF™594 o anticuerpos anti-HER2 marcados con CF™594 a células T47D marcadas previamente con dextranos de fluoresceína de 3 kDa. Se permitió que los complejos de anticuerpo y receptor se interiorizaran a 37 °C durante los tiempos indicados (eje de abscisas de la figura 12) y después se fijaron con paraformaldehído al 4 %. Se determinó la localización conjunta de anticuerpos interiorizados con lisosomas marcados con dextranos. Los resultados se representan en la figura 12 y esencialmente concuerdan con los datos de interiorización de la figura 11.
Los motivos de secuencia que gobiernan el recambio constitutivo de PRLR se asignaron a una región de 21 aminoácidos en el dominio citoplásmico del receptor; El recambio de PRLR permitió la detención eficaz del ciclo celular mediada por CAF y la destrucción celular. En la figura 13 se representan las diversas construcciones de PRLR y HER2 utilizadas en los siguientes experimentos, incluidas: (1) PRLR de longitud completa (PRLR FL), (2) HER2 de longitud completa (HER2 FL), (3) el dominio extracelular (Ecto) de PRLR fusionado a las porciones transmembrana (TM) y citoplasmática (Cito) de HER2 (PRLRectoHER2citoTM), (4) el dominio extracelular (Ecto) de HER2 fusionado a las porciones transmembrana (TM) y citoplasmática (Cito) de PRLR (HER2ectoPRLRcitoTM), (5) PRLR con los aminoácidos 301 a 622 (medidos por la proteína no procesada con el péptido señal restante) eliminados (PRLR Cito42) y (6) PRLR con los aminoácidos 280 a 622 (medidos por la proteína no procesada con el péptido señal restante) eliminados (PRLR Cito21).
Para asignar las secuencias efectoras de interiorización de PRLR a uno de sus dominios (extracelular, transmembrana, citoplasmático) se cultivaron células HEK293 en placas ópticas de 24 pocillos y se transfectaron de manera transitoria con un vector de expresión de mamífero que codifica PRLR, HER2, HER2ectoPRLRcitoTM o PRLRectoHER2citoTM durante 24 horas. A continuación, las células transfectadas se incubaron en hielo en presencia de anticuerpo primario marcado con CF™594 y después se calentaron a 37 °C y se incubaron durante una hora más. En la figura 14 se muestran células decoradas a 4 °C, cuando no se espera que la construcción se interiorice, y después a 37 °C, cuando se interiorizarían aquellas construcciones capaces de ser rápidamente interiorizadas. El panel A muestra la construcción PRLR Fl interiorizada a 37 °C. El panel B representa la construcción HER2 FL, que esencialmente no logró interiorizarse en una hora a 37 °C. El panel C representa la construcción PRLRecto-HER2cito/TM, que tampoco logró interiorizarse en una hora a 37 °C. El panel D muestra la construcción HER2ectoPRLRcito/TM interiorizada a 37 °C. Estos resultados sugieren que el dominio citoplasmático de PRLR proporciona la secuencia efectora de interiorización.
La secuencia efectora de interiorización se asignó adicionalmente en los restos de aminoácidos de PRLR de aproximadamente 280 a aproximadamente 300 (por ejemplo, los restos 280 a 300 de SEQ ID NO: 11; los restos DAHLLEKGKSEELLSALGCQD [SEQ ID NO: 12]) (también conocido como PRLR Cito21-42). Se realizaron experimentos con anticuerpos marcados en hielo y a 37 °C en células HEK293 como se describe anteriormente. En la figura 15 se representa la captación celular de aquellas construcciones que contienen el dominio citoplasmático completo de PRLR (PRLR FL) (paneles A y B), los 42 aminoácidos proximales de la membrana (PRLR Cito42) (paneles C y D), y los 21 aminoácidos proximales de la membrana (PRLR Cito21) (paneles D y E). Si bien la construcción PRLR Cito42 se interiorizó rápidamente, la construcción PRLR Cito21 no. Esto demuestra que la región del dominio citoplasmático de PRLR entre 21 y 42 aminoácidos proximales de la membrana plasmática (Cito21-42) contiene información esencial para la interiorización y degradación de PRLR.
Para determinar si las construcciones de PRLR interiorizadas se degradaron (es decir, se dirigieron al lisosoma), las células HEK293 transfectadas se trataron con cicloheximida (CHX) en diversos momentos después del calentamiento (0 horas, 2 horas, 4 horas y 6 horas) para detener la producción de proteínas. Como lo demuestra la transferencia Western de lisados celulares totales (Figura 16), PRLR FL y PRLR cito42 se degradan rápidamente, mientras que casi no se detectó degradación de PRLR Cito21.
La eficacia del dominio citoplásmico y transmembrana de PRLR como efector de interiorización para administrar un fármaco antiproliferación celular, tal como un conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF), se probó en células HEK293 transfectadas. Las células HEK293 se genomanipularon para expresar PRLR, HER2 o PRLRectoHER2cito/TM de forma controlada con tetraciclina (por ejemplo, utilizando el sistema Lenti-X™ Tet-On®, Clontech, Mountain View, CA). Las células transfectadas se indujeron durante 24 horas con 0,01 pg/ml, o 0,003 pg/ml, o 0,7 pg/ml de doxiciclina para lograr diferentes niveles de expresión de los receptores, los cuales se determinaron mediante citometría de flujo. Se añadió PRLR conjugado con mertansina (también conocido como DM1, también conocido como emtansina) (1 pM) (panel A, figura 17) o HER2-DM1 (1 pM) (panel B, figura 17) a las células transfectadas respectivamente, los cuales se incubaron por otras 24 h. El análisis del ciclo celular se realizó utilizando el anticuerpo fosfohistona H3 (Ser10) para detectar células mitóticas tempranas. Los resultados se representan en la figura 17, lo que demuestra que el dominio transmembrana/citoplasmático de PRLR media de manera eficaz la administración del fármaco al interior de las células.
Mutagénesis de alanina del dominio citoplasmático, específicamente el dominio Cito21-24, se realizó para ayudar a asignar los restos necesarios para la interiorización. La mutagénesis dirigida al sitio de dos dileucinas contenidas en la secuencia Cito21-42 inhibió el recambio de PRLR Cito42 en células HEK293 transfectadas. Las células HEK293 T-REx™ (es decir, células estables que expresan Tet-On, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) se genomanipularon para expresar PRLR Cito42, PRLR Cito21, PRLR Cito42 L283A L284A, PRLR Cito42 L292A L293A o PRLR Cito42 L283A L284A L292A L293A (también conocido como 4LA) de forma controlada con tetraciclina (utilizando, por ejemplo, la plataforma de ingeniería celular Jump-In™, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), se indujeron mediante doxiciclina (0,7 pg/ml) durante 24 horas y se trataron con CHX (50 pg/ml) durante 0 o 4 horas. Los resultados se representan en la transferencia Western de la figura 18, que muestra una reducción en la degradación de proteínas para aquellas construcciones que carecen de Cito21-42 o las repeticiones de dileucina. Los resultados respaldan la conclusión de que estos restos son importantes para el direccionamiento lisosómico.
Experimentos adicionales demostraron que el recambio de PRLR, que está mediado por su dominio citoplasmático, es la fuerza impulsora que dirige HER2 a la degradación lisosómica, cuando ambos receptores se unen mediante anticuerpos biespecíficos HER2(D) x PRLR. (HER2(D) representa un brazo de trastuzumab). Primero se evaluaron los parámetros de unión cinética del anticuerpo biespecífico y sus anticuerpos monoespecíficos originales. El anticuerpo biespecífico mostró una cinética de unión similar a los dominios extracelulares de HER2 y PRLR que sus anticuerpos parentales (Tabla 6).
Para demostrar que el dominio citoplasmático de PRLR es necesario para la degradación de HER2 endógeno mediada por el AcBs HER2(D) x PRLR, las células HEK293 T-REx™ se genomanipularon para expresar un PRLR de longitud completa o un PRLR truncado que carece del dominio citoplasmático completo (panel inferior). Las proteínas se expresaron de forma controlada con tetraciclina utilizando la plataforma de ingeniería celular Jump-In™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Las células se indujeron durante 24 horas con doxiciclina 0,7 pg/ml seguido de incubación con CHX combinada con los anticuerpos indicados (Tabla 6) durante diferentes tiempos, se lisaron y se procesaron para transferencia Western.
Tabla 6
En la figura 19 se representa la transferencia Western de lisados de células que expresan la construcción PRLR de longitud completa. Hay que tener en cuenta que el anticuerpo biespecífico HER2(D) x PRLR dirige de manera eficaz HER2 al lisosoma, mientras que el anticuerpo anti-HER2(D) no, lo que demuestra la eficacia de PRLR como efector de interiorización para HER2 de baja expresión. En la figura 20 se representa la transferencia Western de lisados de células que expresan la construcción PRLR con truncamiento citoplásmico. En este punto, no se observó degradación de PRLR o<h>ER2 bajo ningún tratamiento, demostrando así la necesidad del dominio citoplasmático de PRLR para dirigir ese receptor y su carga molecular al lisosoma.
El anticuerpo biespecífico Her2 x PRLR indujo el tráfico lisosómico de HER2, mejoró la detención del ciclo celular inducida por el CAF HER2 y promovió la destrucción celular en células T47D. Para determinar el direccionamiento a los lisosomas, las células T47D se trataron con anticuerpos de control no unidos o con el anticuerpo biespecífico HER2 x PRLR y se sometieron al ensayo de endocitosis en hielo y a 37 °C. Se tiñeron los lisosomas y HER2 y se determinó el porcentaje de puntos marcadores lisosómicos ocupados por puntos de HER2. Los resultados se representan en la figura 21, que muestra que más del 50 % al 60 % de HER2 fue dirigido al lisosoma por el anticuerpo biespecífico HER2 x PRLR en los 60 minutos posteriores al calentamiento, en comparación con menos del 25 % en los controles.
Para determinar que el anticuerpo biespecífico HER2 x PRLR mejoró la detención del ciclo celular mediada por HER2-DM1, las células T47D que expresan He R2 se trataron con 1 nM, 10 nM o 30 nM de CAF PRLR (A), CAF He R2 más anticuerpo biespecífico HER2 x PRLR (B), CAF HER2 solo (C), CAF de control no unido (D) o ningún tratamiento (E). El porcentaje de células mitóticas tempranas se determinó mediante tinción con anticuerpo anti-fosfo-histona (Ser10), un indicador de detención del ciclo celular. Los resultados se representan en la figura 22, que muestra que el CAF HER2 más el anticuerpo biespecífico HER2 x PRLR (B) detienen las células de manera más eficaz que el CAF HER2 (C).
Para determinar que el anticuerpo biespecífico HER2 x PRLR mejoró la destrucción celular mediada por HER2-DM1, las células T47D que expresan HER2 se trataron con fármaco como se indica en la figura 23: CAF PRLR (A), CAF HER2 más anticuerpo biespecífico HER2 x PRLR (B), CAF HER2 solo (C), CAF de control no unido (D) o CAF de control no unido más anticuerpo biespecífico HER2 x PRLR (E). En la figura 23 se representan los resultados y se muestra que el anticuerpo biespecífico HER2 x PRLR redujo significativamente la CI50 para el CAF HER2.
Ejemplo 9. Tasa de recambio elevada y degradación de la diana mediante el interiorizador hMHC-1
Se utilizaron proteínas de elevado recambio para degradar dianas solubles y transmembrana. Se diseñaron proteínas multiespecíficas de unión a antígenos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) para unir la molécula diana con proteínas "destructoras" (i) que se sabe que se recambian rápidamente, (ii) que demuestran una eliminación elevada mediada por la diana de anticuerpos bivalentes, y (iii) que se sabe que circulan hacia o desde el lisosoma. Para facilitar el diseño y la fabricación, se fabricaron anticuerpos biespecíficos que contenían una cadena ligera común, una cadena pesada dirigida a la proteína "destructora" y una cadena pesada dirigida a la diana. Una de las cadenas pesadas contenía la modificación H95R.
En este ejemplo, la molécula destructora seleccionada fue el complejo principal de histocompatibilidad I, MHC-1, de manera más específica la clase I, isoforma B (también conocida como HLA-B). Los anticuerpos monoclonales de unión estrecha a HLA se eliminan rápidamente, que es un rasgo característico de una molécula "destructora". Como molécula diana soluble ilustrativa, se seleccionó el alérgeno FelD1 como molécula diana. FelD1 es una glucoproteína tetramérica que comprende dos heterodímeros unidos por enlaces disulfuro. Se construyeron y probaron dos formas de FelD1 soluble, una proteína de fusión FelD1-myc-myc-his (FelD1-mmh) y una proteína de fusión FelD1-Fc.
En un conjunto de experimentos, FelD1-mmh se marcó con Alexa 488 para ayudar a rastrear la interiorización de la diana. Se utilizó un anticuerpo biespecífico que comprendía un brazo específico de HLA-B (se une al destructor) y un brazo específico de FelD1 (se une a la diana) (a-HLAB27^a-FelD1) como proteína multiespecífica de unión a antígeno. Se incubaron células linfoblastoides C1Rneo B que expresaban HLA-B con FelD1-mmh-Alexa 488 10 pg/ml y a-HLAB27^a-FelD1 10 pg/ml. Las células se incubaron durante la noche para dar tiempo a la interiorización de la proteína diana FelD1. A continuación, las células se tiñeron con el anticuerpo anti-Alexa488 (Alexa-Fluor-488-Antibody-Polyclonal/A-11094, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), que desactiva la fluorescencia de Alexa488. El anticuerpo anti-Alexa488 no desactivará la diana marcada que se haya interiorizado, por lo tanto, la diana interiorizada se puede distinguir de la diana asociada con la superficie de la célula. En este punto, la fluorescencia se cuantificó mediante FAC.
En la figura 10 se representa la fluorescencia media (unidades arbitrarias cuantificadas por FACS) de la diana unida a la superficie y de la diana interiorizada, para células negativas para MHC1, que sirven como controles, y para células positivas para MHC1. El anticuerpo biespecífico utilizado fue a-HLAB27^a-FelD1. Se utilizaron como controles el anticuerpo bivalente original a-HLAB27^a-HLAB27 y el isotipo IgG no específico. Para aquellas células que expresan el MHC1 (destructor), las células puestas en contacto con a-HLAB27^a-FelD1 mostraron un aumento de aproximadamente cuatro veces en la molécula diana interiorizada en relación con la molécula diana asociada a la superficie. Básicamente no se detectó ningún efecto para los controles. Los resultados se representan en la figura 10 y en la tabla 7 a continuación.
Se evaluó la eliminación de FelD1-Fc mediada por a-HLAB27^a-FelD1 de los sueros de ratones que expresan un alelo HLA-B humano. Se administraron anticuerpos biespecíficos a-HLAB27^a-FelD1 y controles (p Bs , anticuerpo monoespecífico bivalente anti-FelD1 y anticuerpo monoespecífico bivalente anti-HLAB27) a ratones que expresaban un alelo HLA-B humano mediante inyección subcutánea (10 mg/kg). Al día siguiente, se administraron 1,6 mg/kg de FelD1-Fc mediante inyección en la vena de la cola. (Se utilizó una proporción anticuerpo:diana de 3:1). Se obtuvieron muestras de suero a partir de sangrados de la cola tomados a los 15 minutos, 6 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 6 días y 8 días. Los niveles de FelD1 se detectaron y cuantificaron mediante transferencia Western utilizando anticuerpos anti-FelD1. El tratamiento biespecífico a-HLAB27^a-FelD1 demostró una rápida eliminación de FelD1 con una t1/2 de <30 horas, similar a la tasa de eliminación de anti-HLAB27 en ausencia de FelD1 (es decir, t1/2 de 33 horas) y más del doble de la tasa de eliminación de a-HLAB27^a-FelD1 en ausencia de FelD1 (es decir, t1/2 de 65 horas). La administración de anti-FelD1 no afectó la eliminación mediada por MHC1, pero se observó cierta eliminación moderada, que se atribuye a los receptores Fc. Los resultados se representan en las figuras 11 y 12.
Tabla 7: Unidades de fluorescencia media FelD1-mmh-Alexa288
Ejemplo 10. Degradación de la diana utilizando el sistema APLP2/PCSK9
Para evaluar si la proproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9) y sus compañeros de la superficie celular (tales como LDLR y APLP2; véase DeVayet al.,"Characterization of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) trafficking reveals a novel lysosomal targeting mechanism via amyloid precursor-like protein 2 (APLP2)", 288(15) J. Biol. Chem. 10805-18 (12 de abril de 2013)) se pueden utilizar como efectores para la destrucción de dianas mediada por anticuerpos, se fabricaron proteínas de fusión antidiana-PCSK9. La proteína de fusión puede considerarse como un modelo para un anticuerpo biespecífico que incorpora un brazo de unión anti-PSCK9 o anti-APLP2 en lugar de la fusión PCSK9.
Para estos experimentos, se utilizó hemojuvelina (HJV) como diana modelo en parte porque la lectura de eficaciain vivo,es decir, la medición de un aumento en el hierro en suero una semana después del inicio del tratamiento, es fácil y fiable. HJV es un correceptor de la proteína 6 morfogénica ósea (BMP6). El bloqueo de la HJV inhibe la señalización de BMP6 y disminuye los niveles de hepcidina, que a su vez inhibe el transportador de hierro ferroporitina. En última instancia, el bloqueo de la HJV aumenta el hierro en suero. (Véase Coreet al.,"Hemojuvelin and bone morphogenetic protein (BMP) signaling in iron homeostasis", 5 Front. Pharmacol. 104 (1-9), 13 de mayo de 2014).
Se generaron seis moléculas de fusión de anticuerpo::PCSK9, cada una de las cuales comprendía un anticuerpo no bloqueante anti-HJV (a-HJV-n) o un anticuerpo anti-Myc (a-Myc) en una cadena principal de hlgG 1 fusionada a una de tres variantes diferentes de PCSK9 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 5) a través de un enlazador 3* GGGS (SEQ ID NO: 6). La primera variante es PCSK9 de longitud completa sin la secuencia de señal, pero que incluye el dominio pro (Longitud completa ["PCSK9FL"]; SEQ ID NO: 7). La segunda es únicamente el dominio carboxiterminal, que incluye alguna secuencia enlazadora interna entre los dominios catalítico y carboxiterminal de PCSK9 (carboxiterminal largo ["PCSK9LC"]; SEQ ID NO: 8). La tercera es una variante corta del dominio carboxiterminal que no incluye esta secuencia enlazadora interna (carboxiterminal corta ["PCSK9SC"]; SEQ ID NO: 9). Se espera que las variantes carboxiterminales se unan sólo a APLP2 y no al receptor de LDL.
Las fusiones de anticuerpo::PCSK9 se expresaron y secretaron en células CHO. Los plásmidos que contenían tanto la fusión de cadena pesada PCSK9 como la cadena ligera afín del anticuerpo relevante se transfectaron conjuntamente en células CHO-K1 en placas de 10 cm o 15 cm. A continuación, las células se incubaron durante 4 a 5 días para permitir la producción y secreción del anticuerpo::PCSK9, después de lo cual se recogió el sobrenadante y se esterilizó mediante filtración a través de filtros de 0,2 micrómetros. Posteriormente se analizó la capacidad de los sobrenadantes de células CHO que contenían las proteínas de fusión para interiorizar la proteína HJV solublein vitro.
Se preparó HJV soluble marcada con el fluoróforo pHrodo como sigue. El ectodominio de HJV (SEQ ID NO: 10) fusionado al marcador myc-myc-6*his (mmh) mediante un enlazador GPG se expresó en CHO sups y se purificó. Posteriormente, la proteína purificada se marcó con pHrodo® (Thermo Fisher Scientific, Waltham) utilizando la química de N-hidroxisulfosuccinimida (NHS).
Las células HepG2 se incubaron con una solución que contenía un sobrenadante de CHO que contenía anticuerpo::PCSK9 al 50 %, medio HepG2 al 50 % con suero deficiente en lipoproteínas al 5 % y 1 pg/ml de hHJV-mmh marcado con pHrodo®. Las células HepG2 son un modelo conveniente ya que expresan tanto LDLR como APLP2, proteínas clave que se sabe que interiorizan PCSK9. Sin embargo, para evaluar las proteínas multiespecíficas de unión a antígeno de fusión PCSK9, el experto en la materia apreciará que cualquier estirpe celular (natural, inducida o transformada ectópicamente) en la que se interioriza PCSK9, incluso a través de compañeros de unión distintos de LDLR y APLP2, podrían usarse potencialmente en este ensayo. Las células se sembraron en placas a 1,5 * 105 células por ml el día antes del ensayo y se incubaron a 37 °C. La interiorización se controló durante 24 horas mediante la toma de imágenes en un generador de imágenes de alto contenido ImageXpress® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), con el punto temporal de 24 horas que muestra la mayor diferencia entre las construcciones y los controles probablemente debido a la acumulación de pHrodo®-HJV-mmh en las células durante todo el ensayo. La fluorescencia interiorizada se cuantificó con el programa informático MetaXpress® (Molecular Devices).
La incubación con a-HJV-N::PCSK9FL y a-Myc::PCSK9FL aumentó la interiorización de la proteína HJV-mmh marcada con pHrodo® en relación con el control sin anticuerpos. Dado que la HJV-mmh marcada con pHrodo contiene dos marcadores myc, se esperaba que a-Myc::PCSK9FL actuara de manera similar a a-HJV-N::PCSK9FL en este ensayo. De manera interesante, las proteínas de fusión que contenían los dominios carboxiterminales de PCSK9 (es decir, a-HJV-N::PCSK9LC y a-HJV-N::PCSK9SC), no lograron interiorizar la proteína HJV marcada, posiblemente debido a la unión atenuada de LDLR. Los resultados se muestran en la figura 26.
Ejemplo 11. Degradación de la diana in vivo mediante el sistema APLP2/PCSK9
Se probó la capacidad del anticuerpo monoespecífico bivalente a-HJV-N original (que no bloquea la unión de BMP a HJV), de un anticuerpo monoespecífico bivalente a-HJV-B (que bloquea la unión de BMP a HJV), de la proteína de fusión a-HJV-N::PCSK9FL y de la proteína de fusión a-Myc::PCSK9FL para bloquear la señalización de HJVin vivo.Las moléculas se administraron a ratones mediante administración hidrodinámica (AHD). Se tomaron muestras de suero una semana después. Dado que la HJV endógena no tiene un marcador myc-myc-his, la proteína de fusión a-Myc::PCSK9FL funciona como control negativoin vivo.Como se esperaba, la AHD del anticuerpo multiespecífico bivalente a-HJV-N (el control positivo) condujo a un aumento significativo del hierro en suero con respecto a los controles negativos. La AHD de a-HJV-N::PCSK9FL (la molécula de prueba) también condujo a un aumento significativo del hierro en suero de magnitud similar al anticuerpo bloqueador, lo que sugiere que esta molécula es eficaz para interiorizar y secuestrar o destruir la HJVin vivo(Figura 27).

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico anti-HER2 * PRLR y un agente citotóxico, en donde el agente citotóxico es un conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF) que comprende un fármaco, toxina o radioisótopo conjugado con un anticuerpo que se une de manera específica a<h>ER2, en donde la porción de unión a antígeno del CAF se une a un epítopo de HER2 que no se superpone con el epítopo de HER2 reconocido por el anticuerpo biespecífico anti-HER2 * PRLR.
2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el fármaco se selecciona del grupo que consiste en una calicheamicina, auristatina o un fármaco a base de maitansina.
3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el agente citotóxico comprende un fármaco basado en maitansinoide conjugado con un anticuerpo monoespecífico bivalente anti-HER2.
4. Un anticuerpo biespecífico para su uso en un método de tratamiento del cáncer de mama mediante la destrucción de células cancerosas de mama, comprendiendo el método poner en contacto una molécula diana y un efector de interiorización en células de cáncer de mama con el anticuerpo biespecífico y un agente citotóxico, en donde:
(a) el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo biespecífico anti-HER2 * PRLR, la molécula diana es HER2 y el efector de interiorización es PRLR;
(b) el agente citotóxico es un conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF) que comprende un fármaco, toxina o radioisótopo conjugado con un anticuerpo que se une de manera específica a HER2, en donde la porción de unión a antígeno del CAF se une a un epítopo de HER2 que no se superpone con el epítopo de HER2 reconocido por el primer dominio de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico; y
(c) el anticuerpo biespecífico, la molécula diana, el efector de interiorización y el agente citotóxico se transportan posteriormente a los lisosomas dentro de dichas células de cáncer de mama y el agente citotóxico se libera al citoplasma de las células de cáncer de mama.
5. Un anticuerpo biespecífico para su uso en el método de la reivindicación 4, en donde el fármaco se selecciona del grupo que consiste en una calicheamicina, auristatina o un fármaco a base de maitansina.
6. Un anticuerpo biespecífico para su uso en el método de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde la afinidad de unión del anticuerpo biespecífico para PRLR es inferior a la afinidad de unión del anticuerpo biespecífico para HER2.
7. Un anticuerpo biespecífico para su uso en el método de la reivindicación 4, en donde el CAF comprende un fármaco a base de maitansina conjugado con un anticuerpo monoespecífico bivalente anti-HER2.
8. Un métodoin vitropara destruir células de cáncer de mama, comprendiendo el método poner en contacto una molécula diana y un efector de interiorización en células de cáncer de mama con un anticuerpo biespecífico y un agente citotóxico, en donde:
(a) el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo biespecífico anti-HER2 * PRLR, la molécula diana es HER2 y el efector de interiorización es PRLR;
(b) el agente citotóxico es un conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF) que comprende un fármaco, toxina o radioisótopo conjugado con un anticuerpo que se une de manera específica a HER2, en donde la porción de unión a antígeno del CAF se une a un epítopo de HER2 que no se superpone con el epítopo de HER2 reconocido por el primer dominio de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico; y
(c) el anticuerpo biespecífico, la molécula diana, el efector de interiorización y el agente citotóxico se transportan posteriormente a los lisosomas dentro de dichas células de cáncer de mama y el agente citotóxico se libera al citoplasma de las células de cáncer de mama.
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