ES2973213T3 - Medio de cultivo celular para cultivo de organoide, método de cultivo y organoide - Google Patents

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Abstract

Un medio de cultivo celular para cultivar un organoide que comprende al menos dos miembros seleccionados del grupo que consiste en factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y epirregulina (EREG), y al menos un miembro seleccionado de componentes i) a iii): i) un agonista de Wnt; ii) un inhibidor de la proteína de la morfogénesis ósea (BMP); y iii) un inhibidor del factor de crecimiento transformante β (TGF-β). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Medio de cultivo celular para cultivo de organoide, método de cultivo y organoide
Campo técnico
La presente invención se refiere a un medio de cultivo celular para cultivar un organoide.
La presente solicitud reivindica prioridad sobre la base de Solicitud de la Patente japonesa No. 2016-099995 presentada en Japón el 18 de mayo de 2016, cuyo contenido se incorpora en este documento como referencia.
Antecedentes de la técnica
El tracto intestinal es el órgano que tiene mayor superficie en contacto con el mundo exterior del cuerpo, y tiene funciones indispensables para mantener la vida tal como la digestión y la absorción. La mayoría de las funciones del tracto intestinal las cumple el epitelio intestinal que recubre la capa interna del mismo. El epitelio intestinal está compuesto por dos componentes que consisten en cilios compuestos por tres tipos de células diferenciadas (células productoras de moco, células epiteliales absorbentes y células endocrinas) y criptas compuestas principalmente por células germinales no diferenciadas. Las células de Paneth que producen péptidos antimicrobianos están presentes en la base de las criptas del intestino delgado. Recientemente, se ha determinado mediante análisis de linaje celular basado en genética molecular que las células Lgr5 positivas (también denominadas células columnares de la base de la cripta (CBC)) son células madre epiteliales intestinales. Aunque las células madre epiteliales intestinales positivas para Lgr5 producen células progenitoras denominadas células amplificadoras de tránsito, estas células progenitoras no tienen una capacidad de autorreplicación permanente, sino que la capacidad de diferenciación se limita a una a tres líneas celulares. Las células amplificadoras de tránsito se diferencian junto con dos a cuatro ciclos de división celular en las criptas y logran una diferenciación terminal en los cilios. Estas células diferenciadas se desprenden de las puntas de los cilios y mueren por apoptosis. El epitelio intestinal es un tejido que tiene un metabolismo rápido y migra desde las células madre de las criptas hasta las puntas de los cilios en cuatro o cinco días. A diferencia de otras células diferenciadas, las células de Paneth migran al fondo de las criptas acompañando la diferenciación y tienen una larga vida celular de dos meses.
Se sabe que el mecanismo de autorreplicación de las células madre epiteliales intestinales está controlado por una señal Wnt y una señal de proteína morfogenética ósea (BMP), según los resultados obtenidos en varios ratones genéticamente modificados. Los ratones con un gen nofuncional específicos para el epitelio intestinal que expresan moléculas inhibidoras de la señal Wnt en forma de poliposis coli adenomatosa (APC) presentan hiperproliferación y formación de adenomas. Además, se ha observado la formación de criptas ectópicas en ratones que demuestran una sobreexpresión de la proteína inhibidora de BMP en forma de nogina en las células epiteliales intestinales, lo que sugiere que la señal de BMP actúa para inhibir las células madre epiteliales intestinales. En realidad, la señal Wnt es muy activa en las bases de las criptas y se ha observado un gradiente por el cual esa actividad disminuye hacia la luz. Por otro lado, se sabe que la señal BMP presenta un gradiente opuesto al de la señal Wnt.
Además, hace tiempo que resulta imposible un cultivo prolongado de células epiteliales intestinales. Se cree que esto se debe a que se desconocen los factores de crecimiento necesarios para mantener las células madre epiteliales intestinales. En los últimos años, el mantenimiento a largo plazo de las células madre epiteliales intestinales ha tenido éxito adhiriendo las células madre epiteliales intestinales a la matriz extracelular y cultivándolas en presencia de un medio de cultivo celular que contiene medio basal para células animales o humanas al que se le ha agregado inhibidor de BMP, factor de crecimiento mitogénico y agonista de Wnt (véase, por ejemplo, el documento de Patente 1).
Documentos de la técnica anterior
Documentos de Patente
Documento de Patente 1: Patente japonesa No. 5458112
Divulgación de la invención
Problemas a resolver por la invención
Los medios de cultivo celular usados en el método de cultivo descrito en el Documento de Patente 1 tenían el problema de una disminución en la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) causada por la estimulación del factor de crecimiento epidérmico (EGF). Por el contrario, la adición del inhibidor de p38 permitió mantener la expresión de EGFR. Sin embargo, los medios y métodos de cultivo que incorporan inhibidor de p38 pueden causar inhibición de la diferenciación o muerte celular, impidiendo así el cultivo de algunos tejidos humanos y tejidos tumorales.
Para resolver los problemas antes mencionados, la presente invención proporciona un medio de cultivo celular para cultivar organoides que permiten el cultivo a largo plazo de células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos uno de estas células o tejidos que no pueden cultivarse en la técnica anterior.
También se describe en este documento un organoide humano cultivado capaz de producirse en ausencia de suero. Se describe además un organoide humano cultivado producido a partir de tejido en el que su producción anteriormente no era posible.
Medios para resolver los problemas
Como resultado de realizar extensos estudios para resolver los problemas antes mencionados, los inventores de la presente invención descubrieron la composición de un medio de cultivo celular para cultivar organoides que permite el cultivo a largo plazo de células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no puede cultivarse en la técnica anterior. Además, los inventores descubrieron que se puede formar un organoide cultivando células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no se puede cultivar en la técnica anterior, en condiciones hipóxicas.
La presente invención proporciona un medio de cultivo celular para cultivar organoides que contiene al menos dos tipos de componentes seleccionados del grupo que consiste en factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y epiregulina (EREG), y al menos un tipo de componente entre los siguientes componentes i) a iii):
i) agonista de Wnt,
ii) inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP), y
iii) inhibidor del factor de crecimiento transformante p (TGF-p);
en el que el medio de cultivo celular:
- no contiene EGF en absoluto o sólo contiene EGF en una concentración en la que no se produce la inhibición de la expresión de EGFR; y
- no contiene inhibidor de p38 en absoluto o solo contiene inhibidor de p38 en una concentración en la que no se produce la inhibición de la diferenciación y la muerte celular causada por el inhibidor de p38.
El medio de cultivo celular para cultivar organoides según la invención puede contener IGF1 y FGF2.
El agonista de Wnt puede ser al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en proteína Wnt, R-espondina e inhibidor de GSK-3p.
La proteína Wnt puede formar un complejo con afamina, que es una sustancia estabilizadora de la misma.
El agonista de Wnt puede ser la proteína Wnt y la R-espondina.
La proteína Wnt puede ser al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 y Wnt16.
La R-espondina puede ser al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 y R-espondina 4.
El inhibidor de BMP puede ser al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en nogina, gremlin, cordina, proteína similar a cordina que contiene un dominio de cordina, folistatina, proteína relacionada con folistatina que contiene un dominio de folistatina, DAN, proteína tipo DAN que contiene un DAN dominio del nudo de cisteína, esclerostina/SOST y macroglobulina a-2.
El inhibidor de BMP puede ser nogina.
El inhibidor de TGF-p puede ser al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494 y SJN-2511.
El inhibidor de TGF-p puede ser A83-01.
También se describe en este documento un método para cultivar células madre epiteliales, células epiteliales, células tumorales epiteliales o tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células; provisto de: una etapa de preparación de matriz extracelular para preparar una matriz extracelular, una etapa de adhesión para adherir células madre epiteliales, células epiteliales, células tumorales epiteliales o tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células a la matriz extracelular, y una etapa de formación de organoides para formar un organoide agregando el medio de cultivo celular para cultivar organoides según la invención y cultivar las células madre epiteliales, las células epiteliales, las células tumorales epiteliales o el tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, después de la etapa de adhesión celular.
En la etapa de formación de organoides, se puede formar un organoide cultivando las células madre epiteliales, las células epiteliales, las células tumorales epiteliales o el tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células en condiciones hipóxicas a una concentración de oxígeno del 15 % al 0.1 %.
También se describe en este documento un organoide que contiene células diferenciadas obtenidas mediante el método antes mencionado.
El organoide que contiene células diferenciadas puede ser para medicina regenerativa.
En este documento se describe además un método para cultivar las células madre epiteliales, las células epiteliales, las células tumorales epiteliales o el tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células; provisto de: una etapa de preparación de matriz extracelular para preparar una matriz extracelular, una etapa de adhesión para adherir células madre epiteliales, células epiteliales, células tumorales epiteliales o tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células a la matriz extracelular, y una etapa de formación de organoides para formar un organoide agregando el medio de cultivo celular para cultivar organoides y cultivar las células madre epiteliales, las células epiteliales, las células tumorales epiteliales o el tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células en condiciones hipóxicas a una concentración de oxígeno del 15 % al 0.1 % , después de la etapa de adhesión celular; en la que el medio de cultivo celular para cultivar organoides contiene al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en agonista de Wnt, factor de crecimiento mitogénico, inhibidor de BMP, inhibidor de TGF-p e inhibidor de p38.
El agonista de Wnt puede ser al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en proteína Wnt, R-espondina e inhibidor de GSK-3p.
La proteína Wnt puede formar un complejo con afamina, que es una sustancia estabilizadora de la misma.
El agonista de Wnt puede ser la proteína Wnt y la R-espondina.
La proteína Wnt puede ser al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 y Wnt16.
La R-espondina puede ser al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 y R-espondina 4.
El inhibidor de BMP puede ser al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en nogina, gremlin, cordina, proteína similar a cordina que contiene un dominio de cordina, folistatina, proteína relacionada con folistatina que contiene un dominio de folistatina, DAN, proteína tipo DAN que contiene un DAN dominio del nudo de cisteína, esclerostina/SOST y macroglobulina a-2.
El inhibidor de BMP puede ser nogina.
El inhibidor de TGF-p puede ser al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494 y SJN-2511.
El inhibidor de TGF-p puede ser A83-01.
También se describe en este documento un organoide que contiene células diferenciadas obtenidas mediante el método de cultivo.
La materia orgánica que contiene células diferenciadas puede ser para medicina regenerativa.
Según los métodos de cultivo celular para cultivar organoides descritos en este documento, células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no puede cultivarse en la técnica anterior, Se puede cultivar durante un largo período de tiempo. Además, se puede formar un organoide con alta eficacia a partir de al menos uno cualquiera de las células y tejidos antes mencionados.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa imágenes que muestran organoides cultivados de células tumorales epiteliales humanas el día 7 desde el inicio del cultivo primario (pasaje 0) en cada uno de los medios del ejemplo 1. Aquí, W representa Wn-3A, N representa nogina, R representa R-espondina 1 y A representa A83-01.
La figura 2 es un gráfico que cuantifica el área en pocillos ocupados por organoides de células tumorales epiteliales humanas el día 7 desde el inicio del cultivo primario (pasaje 0) en cada uno de los medios del ejemplo 1. Las abreviaturas tienen el mismo significado que en la figura 1.
La figura 3 representa imágenes que indican organoides cultivados de células tumorales epiteliales humanas el día 7 desde el inicio del cultivo primario (pasaje 0) en cada concentración de oxígeno en el ejemplo 2.
La figura 4 es un diagrama que indica las condiciones de cultivo óptimas para organoides establecidos a partir de 55 tipos de tumores de colon.
La figura 5A representa imágenes de organoides cultivados de células madre intestinales humanas el día 7 desde el inicio del cultivo primario (pasaje 0) en cada uno de los medios del ejemplo 3.
La figura 5B es un gráfico que cuantifica el área en pocillos ocupados por organoides de células madre intestinales humanas el día 7 desde el inicio del cultivo primario (pasaje 0) en cada uno de los medios del ejemplo 1.
La figura 6 representa imágenes que indican organoides de células tumorales epiteliales humanas seis días después de una tercera ronda de subcultivo (pasaje 3) (número total de días de cultivo: 26), seis días después del inicio de una cuarta ronda de subcultivo (pasaje 4) (número total de días de cultivo: 33), y seis días después del inicio de una sexta ronda de subcultivo (pasaje 6) (número total de días de cultivo; 47).
La figura 7 es una tabla que indica los resultados de haber evaluado la eficiencia de formación de organoides en un medio de cultivo celular para cultivar organoides que tienen diferentes composiciones.
Mejor modo para realizar la divulgación
«Medio de cultivo celular para cultivo de organoides»
El medio de cultivo celular para cultivar organoides según la presente invención contiene al menos dos tipos de componentes seleccionados del grupo que consiste en IGF1, FGF2 y EREG, y al menos un tipo de componente entre los siguientes componentes i) a iii):
i) agonista de Wnt,
ii) inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP), y
iii) inhibidor del factor de crecimiento transformante p (TGF-p);
en el que el medio de cultivo celular:
- no contiene EGF en absoluto o sólo contiene EGF en una concentración en la que no se produce la inhibición de la expresión de EGFR; y
- no contiene inhibidor de p38 en absoluto o solo contiene inhibidor de p38 en una concentración en la que no se produce la inhibición de la diferenciación y la muerte celular causada por el inhibidor de p38.
Según el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la invención, se puede cultivar tejido durante un largo período de tiempo que no contiene sustancialmente EGF o inhibidor de p38 pero que contiene células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, o tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no puede cultivarse en la técnica anterior.
Además, según el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la invención, se puede formar un organoide con alta eficacia a partir de células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células o tejidos que no pueden cultivarse en la técnica anterior.
Además, la capacidad de diferenciación de las células madre epiteliales cultivadas usando el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la invención se puede mantener durante un largo período de tiempo y la incidencia de tumores de las mismas es extremadamente baja.
En la presente descripción, las células epiteliales incluyen células epiteliales diferenciadas y células madre epiteliales adquiridas del tejido epitelial. "Células madre epiteliales" se refiere a células madre derivadas de tejido epitelial que tienen la capacidad de autorreplicarse y diferenciarse en células epiteliales diferenciadas durante un largo período de tiempo. Ejemplos de tejido epitelial incluyen la córnea, la mucosa oral, la piel, la conjuntiva, la vejiga, los túbulos uriníferos, los riñones, los órganos digestivos (esófago, estómago, duodeno, intestino delgado (incluido el yeyuno y el íleon) e intestino grueso (incluido el colon)), hígado, páncreas, glándulas mamarias, glándulas salivales, glándulas lagrimales, glándula prostática, raíces pilosas, tráquea y pulmones. Entre estos, el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la invención se usa de manera particularmente preferida para cultivar células epiteliales derivadas de órganos digestivos (esófago, estómago, duodeno, intestino delgado (incluidos el yeyuno y el íleon) e intestino grueso (incluido el colon)), hígado y páncreas.
Además, en la presente descripción, "células tumorales epiteliales" se refieren a las células antes mencionadas derivadas de tejido epitelial que se han vuelto tumorigénicas.
En la presente descripción, un "organoide" se refiere a un órgano celular tridimensional que se autoorganiza acumulando células a alta densidad en un espacio controlado.
En la presente descripción, "que no contiene sustancialmente" se refiere a no contener ningún componente específico o solo contener un componente específico en una concentración en la que no se demuestra su función.
De acuerdo con lo anterior, "que no contiene sustancialmente EGF o inhibidor de p38" se refiere a no contener EGF o inhibidor de p38 en absoluto o que sólo contiene EGF e inhibidor de p38 en una concentración en la que no ocurre la inhibición de la expresión de EGFR por EGF y la inhibición de la diferenciación y muerte celular causada por el inhibidor de p38.
El medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención contiene al menos dos tipos de factores seleccionados del grupo que consiste en IGF1, FGF2 y epiregulina, y si cualquiera de los tres tipos de factores antes mencionados está contenido puede seleccionarse adecuadamente correspondiente a la tipo de células o tejido cultivado. Entre estos, el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención contiene preferiblemente IGF1 y epiregulina, FGF2 y epiregulina o IGF1 y FGF2 y más preferiblemente contiene IGF 1 y FGF2. Como resultado de contener los factores antes mencionados, se pueden cultivar durante un largo tiempo células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos estas células, o tejido que no puede cultivarse en la técnica anterior durante un período de tiempo sin contener sustancialmente EGF e inhibidor de p38. Además, se puede formar un organoide con alta eficacia a partir de células madre epiteliales, células epiteliales o tumores epiteliales derivados de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no se puede cultivar en la técnica anterior.
A continuación se proporciona una explicación detallada de los constituyentes del medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención.
<Medio basal de cultivo celular>
Todos los tipos de medios basales de cultivo celular sin suero están incluidos en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención. El medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención es preferiblemente para células animales o células humanas.
Ejemplos de estos medios basales de cultivo celular sin suero incluyen medios sintéticos prescritos regulados con una solución reguladora a base de ácido carbónico a pH de 7.2 a pH 7.6. Más específicamente, los ejemplos incluyen glutamina, insulina, suplemento de B27 (Thermo Fisher), N-acetil-L-cisteína (Wako Pure Chemical Industries), penicilina o estreptomicina y medio Eagle modificado de Dulbecco/medio mixto F-12 de Ham suplementado con transferrina (medio Eagle modificado de Dulbecco: Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12)).
Además, otros ejemplos incluyen el medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, DMEM/F12 y el medio RPMI avanzado en lugar del medio Eagle modificado por Dulbecco avanzado/medio mixto F-12 de Ham.
El medio de cultivo celular antes mencionado para cultivar organoides de la presente invención no contiene sustancialmente componentes indeterminados tales como suero fetal bovino (FBS) o suero fetal de ternera.
Además, el medio de cultivo celular antes mencionado para el cultivo de organoides puede contener un 5 % de suero.
<Agonista Wnt>
En la presente descripción, un "agonista de Wnt" se refiere a un agente químico que activa la transcripción mediada por el factor de células T (TCF)/factor potenciador linfoide (LEF) en las células. De acuerdo con lo anterior, los agonistas de Wnt no se limitan a las proteínas de la familia Wnt, sino que también incluyen agonistas de Wnt que se activan uniéndose a miembros de la familia de receptores frizzled, inhibidores de la destrucción de p-catenina intracelular y sustancias activadoras de TCF/LEF. El agonista de Wnt es preferiblemente al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en proteína Wnt, R-espondina e inhibidor de GSK-3p.
El agonista de Wnt estimula la actividad de Wnt en las células en al menos un 10 %, preferiblemente al menos un 20 %, más preferiblemente al menos un 30 %, incluso más preferiblemente al menos un 50 % y de manera particularmente preferida al menos un 90 % en comparación con el nivel de actividad de Wnt en la ausencia del agonista Wnt. La actividad de Wnt se puede investigar usando un método conocido por los expertos en la técnica, tal como midiendo la actividad de transcripción de Wnt con constructos indicadores de luciferasa pTOPFLASH y pFOPFLASH Tcf (documento de referencia: Korinek, et al., 1997, Science 275: 1784-1787).
El agonista de Wnt está contenido preferiblemente cuando se cultivan células madre epiteliales, células epiteliales, células tumorales epiteliales o tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células. El agonista de Wnt contenido en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención incluye más preferiblemente un complejo de proteína Wnt y afamina e incluso más preferiblemente contiene tanto un complejo de proteína Wnt y afamina como R-espondina. Las células madre epiteliales o células epiteliales son capaces de formar organoides con alta eficiencia como resultado del medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención que contiene un complejo de proteína Wnt y afamina, y R-espondina.
[Proteína Wnt]
No existen limitaciones particulares sobre el origen de la proteína Wnt que sirve como un tipo de agonista de Wnt y se puede usar proteína Wnt derivada de diversos organismos. Entre éstas, es preferible la proteína Wnt derivada de mamíferos. Ejemplos de mamíferos incluyen seres humanos, ratones, ratas, vacas, cerdos y conejos. Los ejemplos de proteína Wnt de mamífero incluyen Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 y Wnt16. Se puede usar una pluralidad de tipos de proteína Wnt en combinación en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención.
Un ejemplo de un método para producir proteína Wnt consiste en producir proteína Wnt usando células que expresan proteína Wnt. No existen limitaciones particulares sobre el origen de las células que expresan la proteína Wnt (tales como especie o forma de cultivo) y solo se requiere que sean células que expresen la proteína Wnt de manera estable y pueden ser células que expresen la proteína Wnt de manera transitoria. Los ejemplos de células que expresan proteína Wnt incluyen L dells que expresan de manera estable Wnt3a de ratón (ATCC CRL-2647) y células L que expresan de manera estable Wnt5a de ratón (ATCC CRL-2814). Además, también se pueden producir células que expresan la proteína Wnt usando una tecnología de recombinación de genes conocida. Es decir, se pueden producir células que expresan la proteína Wnt insertando ADN que codifica una proteína Wnt deseada en un vector de expresión conocido e introduciendo el vector de expresión resultante en células hospedadoras adecuadas. La secuencia de bases del gen que codifica la proteína Wnt deseada se puede adquirir de una base de datos conocida como GenBank.
La proteína Wnt expresada por células que expresan la proteína Wnt puede ser un fragmento de la proteína Wnt y puede contener una secuencia de aminoácidos distinta de la secuencia de aminoácidos de la proteína Wnt siempre que tenga actividad Wnt. No existen limitaciones particulares de la secuencia de aminoácidos distintas de la secuencia de aminoácidos de la proteína Wnt, y un ejemplo de la misma es la secuencia de aminoácidos de una etiqueta de afinidad. Además, no es necesario que la secuencia de aminoácidos de la proteína Wnt coincida completamente con una secuencia de aminoácidos adquirida de una base de datos conocida tal como GenBank, sino que puede ser más bien una secuencia de aminoácidos que sea sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos capaz de adquirirse de una base de datos conocida siempre que tenga actividad Wnt.
Ejemplos de secuencias de aminoácidos que son sustancialmente idénticas a una secuencia de aminoácidos de la proteína Wnt que se puede adquirir de una base de datos conocida tal como GenBank incluyen secuencias de aminoácidos en las que se han suprimido, sustituido o agregado de uno a una pluralidad de aminoácidos.
Una "secuencia de aminoácidos en la que se han suprimido, sustituido o agregado de uno a una pluralidad de aminoácidos" se refiere a una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos en aproximadamente un número de los mismos que se pueden suprimir, sustituir o agregar (preferiblemente 10 o menos , más preferiblemente 7 o menos e incluso más preferiblemente 6 o menos) se han suprimido, sustituido o agregado mediante un método de producción de proteínas mutantes conocido tal como mutagénesis específica de sitio.
Además, los ejemplos de secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas incluyen secuencias de aminoácidos en las que la identidad con una secuencia de aminoácidos que puede adquirirse de una base de datos conocida es al menos el 80 % o más, preferiblemente al menos el 85 % o más, más preferiblemente al menos 90 % o más, incluso más preferiblemente al menos 92 % o más, en particular preferiblemente al menos 95 % o más, y lo más preferiblemente al menos 99 % o más.
La actividad de la proteína Wnt puede confirmarse, por ejemplo, mediante el ensayo indicador TCF. En general, un ensayo indicador TCF se refiere a un método que consiste en introducir un gen de luciferasa que tiene una secuencia de unión para el factor de células T (TCF), que es un factor de transcripción que se activa específicamente cuando una señal Wnt ingresa a una célula y simplemente evaluar la intensidad de la actividad de la proteína Wnt basada en la luminiscencia de la luciferasa (documento de referencia: Molenaar, et al., Cell, 86, 391, 1996). Un ejemplo de un método distinto al ensayo indicador TCF consiste en usar la estabilización de p-catenina en una célula cuando una señal Wnt ingresa a esa célula y luego evaluar cuantitativamente la cantidad de p-catenina mediante transferencia Western (documento de referencia: Shibamoto, et al., Gene to cells, 3, 659, 1998). Además, un ejemplo de método que puede utilizarse para evaluar la actividad de la proteína Wnt que imparte una señal a las células mediante una vía no canónica a la manera de Wnt5a consiste en evaluar la fosforilación de una proteína adaptadora intracelular en forma de Dvl2 (documento de referencia: Kikuchi, et al., EMBO J., 29, 3470, 2010).
[R-Espondina]
Ejemplos de un tipo de agonista de Wnt en forma de R-espondina incluyen miembros de la familia R-espondina compuesta por R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 y R-espondina 4. La familia R-espondina consiste en proteínas secretoras que se sabe que participan en la activación y el control de la vía de transducción de señales Wnt. Se puede usar una pluralidad de tipos de R-espondina en combinación en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención.
La R-espondina puede ser un fragmento de R-espondina o contener una secuencia de aminoácidos distinta de la secuencia de aminoácidos de R-espondina siempre que tenga actividad de R-espondina.
[Contenido]
La concentración de proteína Wnt contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención es preferiblemente de 50 ng/mL o más, más preferiblemente de 10 ng/mL a 10 pg/mL, incluso más preferiblemente de 200 ng/mL a 1 pg/mL y en particular preferiblemente de 300 ng/mL a 1 pg/mL. El agonista Wnt se agrega preferiblemente al medio de cultivo cada dos días cuando se cultivan células madre epiteliales, y el medio de cultivo celular para cultivar organoides se reemplaza preferiblemente con medio nuevo cada cuatro días.
[Inhibidor de GSK-3p]
Los inhibidores de GSK-3p conocidos incluyen CHIR-99021, CHIR-98014 (Sigma-Aldrich), litio (Sigma), kenpaullona (Biomol. International, Leost, M., et al. (2000), Eur. J. Biochem. 287, 5983-5994), 6-bromoindirrubina-30-acetoxima (Meyer, L., et al. (2003) Chem. Biol. 10, 1255-1266), SB 218763 y SB 415286 (Sigma-Aldrich), así como miembros de la familia FRAT y péptidos derivados de FRAT que inhiben la interacción entre GSK-3 y la axina. Una descripción general de los mismos se indica en Meijer, et al. (2004) Trends in Pharmacological Sciences 25, 471-480, que se incorpora en la presente descripción como referencia. Los métodos y ensayos para determinar el nivel de inhibidor de GSK-3p son conocidos entre los expertos en la técnica y los ejemplos de los mismos incluyen el método y ensayo descritos en Liao, et al. (2004), Endocrinology, 145(6), 2941-2949.
<Afamina>
En la presente descripción, "afamina" se refiere a una glicoproteína que pertenece a la familia de las albúminas que se sabe que está presente en la sangre o en los fluidos corporales. La afamina derivada de animales de los cuales se toma muestra del suero está contenida en el suero que normalmente se agrega al medio usado para el cultivo celular. Dado que el suero contiene impurezas y similares distintas a la afamina, la afamina se usa preferiblemente sin usar suero en el medio de cultivo celular para cultivar el organoide de la presente invención.
No existen limitaciones particulares sobre la fuente de afamina contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención, y se puede usar afamina derivada de diversos organismos. Entre estos, es preferible la afamina derivada de mamíferos. Los ejemplos de mamíferos incluyen los mismos que los de la sección descrita anteriormente titulada "Proteína Wnt". Las principales secuencias de aminoácidos de la afamina de mamíferos junto con las secuencias de bases de los genes que codifican esas secuencias de aminoácidos se pueden adquirir en una base de datos conocida tal como GenBank. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la afamina humana está registrada en GenBank con el número de acceso AAA21612 y la secuencia de bases del gen que codifica esa secuencia está registrada con el número de acceso L32140, la secuencia de aminoácidos de la afamina bovina está registrada con el número de acceso número DAA28569, y la secuencia de bases del gen que codifica esa secuencia está registrada con el número de acceso GF060968.
La afamina contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención se puede purificar según un método conocido en el caso de afamina natural contenida en suero y similares o puede estar en forma de afamina recombinante. La afamina recombinante se puede producir usando adecuadamente una tecnología de recombinación de genes conocida. Un ejemplo de un método para producir afamina recombinante consiste en insertar ADN que codifica afamina en un vector de expresión conocido, introducir el vector de expresión resultante en una célula hospedadora adecuada para expresar afamina recombinante y luego purificar la afamina recombinante usando un método de purificación conocido. La afamina recombinante puede ser una afamina a la que se le ha agregado una etiqueta de afinidad. No existen limitaciones particulares sobre la etiqueta de afinidad agregada y se puede seleccionar adecuadamente para su uso entre etiquetas de afinidad conocidas. La etiqueta de afinidad es preferiblemente una etiqueta de afinidad reconocida por un anticuerpo específico, y ejemplos de la misma incluyen la etiqueta FLAG, la etiqueta MYC, la etiqueta HA y la etiqueta V5.
La proteína Wnt antes mencionada tiene una fuerte hidrofobicidad como resultado de la modificación de un residuo de serina específico con un ácido graso (ácido palmitoleico). En consecuencia, se sabe ampliamente que la proteína Wnt es extremadamente difícil de purificar y almacenar como resultado de ser susceptible a la aglutinación y degeneración cuando está en una solución acuosa.
Por otro lado, esta modificación de un residuo de serina específico por un ácido graso es esencial para la actividad fisiológica de la proteína Wnt y se ha informado que está involucrada en la unión con miembros de la familia de receptores frizzled.
Además, en una solución acuosa, también hay hallazgos que indican que la proteína Wnt se une con afamina en una proporción de 1:1 para formar un complejo y volverse soluble mientras se mantiene un alto nivel de actividad fisiológica (Active and water-soluble form of lipidated Wnt protein is maintained by a serum glycoprotein in afamin/a-albumin, Mihara, E., Hirai, H., Yamamoto, H., Tamura- Kawakami, K., Matano, M., Kikuchi, A., Sato, T, Takagi, J., Elife, 2016 Feb. 23; 5).
Sobre la base de estos hallazgos, se puede producir el complejo Wnt-proteína-afamina según un método que consiste en cultivar células que expresan tanto proteína Wnt como afamina, o se puede producir el complejo Wnt-proteínaafamina según un método que consiste en cocultivar células que expresan proteínas Wnt y células que expresan afamina. La actividad de la proteína Wnt en el complejo proteína Wnt-afamina se puede evaluar usando métodos similares a los usados para la "proteína Wnt" antes mencionada.
Aunque no existen limitaciones particulares al respecto, la concentración de afamina en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención es preferiblemente de 50 ng/mL a 10 pg/mL, más preferiblemente de 100 ng/mL a 1 pg/mL, e incluso más preferiblemente de 300 pg/mL a 1 pg/mL.
<Factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1)>
En general, el "factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1)" también se conoce como somatomedina C y es un factor que se secreta mediante la estimulación de la hormona del crecimiento (GH) principalmente en el hígado. Se sabe que casi todas las células del cuerpo (y particularmente las células musculares, óseas, hepáticas, renales, nerviosas, cutáneas y pulmonares) se ven afectadas por el IGF1. Además de demostrar un efecto similar al de la insulina, el IGF1 tiene funciones que regulan el crecimiento celular (y particularmente, las células nerviosas) y el desarrollo, así como la síntesis de ADN celular.
Aunque no existen limitaciones particulares al respecto, la concentración de IGF 1 contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención es preferiblemente de 5 ng/mL a 1 pg/mL, más preferiblemente de 10 ng/mL a 1 pg/mL, e incluso más preferiblemente de 50 ng/mL a 500 ng/mL. Como resultado de hacer que la concentración de IGF 1 contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención esté dentro de los intervalos antes mencionados, las células madre epiteliales, las células epiteliales o las células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no se puede cultivar en la técnica anterior, se puede cultivar durante un largo período de tiempo sin contener sustancialmente EGF e inhibidor de p38.
Además, se puede formar un organoide con alta eficacia a partir de células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no se puede cultivar en la técnica anterior.
Además, durante el cultivo de células madre, preferiblemente se agrega IFG1 al medio de cultivo cada dos días, y el medio de cultivo se reemplaza preferiblemente con medio nuevo cada cuatro días.
<Factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2)>
En general, el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) se refiere a un factor de crecimiento de fibroblastos básico que tiene las funciones de promover el crecimiento de las células endoteliales vasculares y organizarlas en una estructura tubular, o en otras palabras, promover la vascularización mediante la unión con el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR). Además, se sabe que el FGF2 humano tiene dos isoformas que consisten en una forma de bajo peso molecular (LWL) y una forma de alto peso molecular (HWL). LWL está presente principalmente en el citoplasma y actúa de forma autocrina, mientras que, por otro lado, HWL está presente en el núcleo celular y demuestra actividad mediante un mecanismo intracrino que actúa dentro de las células.
Aunque no existen limitaciones particulares al respecto, la concentración de FGF2 contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención es preferiblemente de 5 ng/mL a 1 pg/mL, más preferiblemente de 10 ng/mL a 1 pg/mL, e incluso más preferiblemente de 50 ng/mL a 500 ng/mL. Como resultado de hacer que la concentración de FGF2 contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención esté dentro de los intervalos antes mencionados, las células madre epiteliales, las células epiteliales o las células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no se puede cultivar en la técnica anterior, se puede cultivar durante un largo período de tiempo sin contener sustancialmente EGF e inhibidor de p38.
Además, se puede formar un organoide con alta eficacia a partir de células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no se puede cultivar en la técnica anterior.
Además, durante el cultivo de células madre, se agrega preferiblemente FGF2 al medio de cultivo cada dos días, y el medio de cultivo se sustituye preferiblemente por medio nuevo cada cuatro días.
<Epiregulina (EREG)>
En general, la epiregulina (EREG) se refiere a un factor de crecimiento similar al EGF que se une específicamente a ErbB 1 y ErbB4 entre los receptores (ErbB 1 a ErbB4) de la familia de tirosina cinasa (ErbB). Se sabe que EREG estimula el crecimiento de células productoras de queratina, células hepáticas, fibroblastos y células endoteliales vasculares. Además, EREG se expresa principalmente en carcinomas de vejiga, pulmón, riñón y colon, placenta y glóbulos blancos periféricos.
Aunque no existen limitaciones particulares al respecto la concentración de EREG contenida en el medio de cultivo celular para cultivar el organoide de la presente invención es preferiblemente de 5 ng/mL a 1 pg/mL, más preferiblemente de 10 ng/mL a 1 pg/mL, e incluso más preferiblemente de 50 ng/mL a 500 ng/mL. Como resultado de hacer que la concentración de EREG contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención esté dentro de los intervalos antes mencionados, las células madre epiteliales, las células epiteliales o las células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no se puede cultivar en la técnica anterior, se puede cultivar durante un largo período de tiempo sin contener sustancialmente EGF e inhibidor de p38.
Además, se puede formar un organoide con alta eficacia a partir de células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no se puede cultivar en la técnica anterior.
Además, durante el cultivo de células madre, preferiblemente se agrega EREG al medio de cultivo cada dos días, y el medio de cultivo se reemplaza preferiblemente con medio nuevo cada cuatro días.
<Inhibidor de BMP>
La proteína morfogenética ósea (BMP) se une como un ligando dímero a un complejo receptor que consta de dos tipos diferentes de receptores de serina/treonina cinasa, receptores tipo I y tipo II. El receptor de tipo II fosforila el receptor de tipo I, lo que provoca la activación del receptor cinasa. Posteriormente, este receptor de tipo I fosforila un sustrato de receptor específico (SMAD), lo que da como resultado la inducción de la actividad de transcripción mediante una vía de transducción de señales. En general, el inhibidor de BMP previene o inhibe la formación de complejos que neutralizan la actividad de BMP, por ejemplo, y es un agente químico que se une a las moléculas de BMP para formar un receptor que neutraliza la actividad de BMP Además, el inhibidor de BMP también se une al receptor de BMP, por ejemplo, para prevenir o inhibir la unión de moléculas de BMP a los receptores, y es un agente químico que actúa como antagonista o agonista inverso.
El inhibidor de BMP tiene una actividad inhibidora que es preferiblemente 50 % o más, más preferiblemente 70 % o más, incluso más preferiblemente 80 % o más y en particular preferiblemente 90 % o más que el nivel de actividad de BMP en ausencia de este inhibidor. La actividad inhibidora de BMP se puede evaluar midiendo la actividad de transcripción de BMP usando un método conocido entre los expertos en la técnica (documento de referencia: Zilberberg, et al., BMC Cell Biol., 41,2007).
Es preferible una proteína de unión a BMP de origen natural para el inhibidor de BMP contenido en el medio de cultivo celular para el cultivo de organoides de la presente invención, y ejemplos de la misma incluyen proteínas tipo cordina tales como nogina, gremlin, cordina o dominio de cordina, proteínas relacionadas con folistatina tales como folistatina o dominio de folistatina, proteínas tipo DAN tales como DAN o dominio de nudo de cisteína DAN, esclerostina/SOST, decorina y macroglobulina a-2.
La proteína tipo cordina o la proteína tipo DAN es preferible para el inhibidor de BMP contenido en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención y es más preferible la proteína tipo cordina. La nogina es preferible para la proteína tipo cordina. La proteína tipo cordina y la proteína tipo DAN son proteínas difusoras que pueden inhibir que las moléculas de BMP se acerquen a los receptores de transducción de señales uniéndose a moléculas de BMP con diversos grados de afinidad. En el caso del cultivo de células madre epiteliales, estos inhibidores de BMP pueden prevenir la pérdida de células madre agregándolos al medio de cultivo celular para cultivar organoides.
La concentración de inhibidor de BMP contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención es preferiblemente de 10 ng/mL a 100 ng/mL, más preferiblemente de 20 ng/mL a 100 ng/mL, e incluso más preferiblemente de 500 ng/mL a 100 ng/mL. Durante el cultivo de células madre, preferiblemente se agrega inhibidor de BMP al medio de cultivo cada dos días, y preferiblemente el medio de cultivo se reemplaza con medio nuevo cada cuatro días.
<Inhibidor de TGF-p>
El factor de crecimiento transformante p (TGF-p) es un tipo de factor de crecimiento que se produce en casi todas las células, como las de los riñones, la médula ósea y las plaquetas. Hay cinco subtipos de TGF-p (p1-p5). Además, se sabe que el TGF-p promueve el crecimiento de fibroblastos junto con la síntesis y el crecimiento de tejido conectivo a la manera del colágeno, al tiempo que actúa de forma supresora sobre el crecimiento de células epiteliales y osteoclastos. En general, el inhibidor de TGF-p es un agente químico que previene o inhibe la unión de TGF-p a los receptores de TGF-p y se une con TGF-p para formar un complejo que neutraliza la actividad de TGF-p. Además, el inhibidor de TGF-p es un agente químico que previene o inhibe la unión de TGF-p a receptores de TGF-p uniéndose con receptores de TGF-p, por ejemplo, actuando de ese modo como agonista o antagonista.
El inhibidor de TGF-p tiene una actividad inhibidora que es preferiblemente 50 % o más, más preferiblemente 70 % o más, incluso más preferiblemente 80 % o más y en particular preferiblemente 90 % o más que el nivel de actividad de TGF-p en ausencia de este inhibidor. La actividad de TGF-p se puede evaluar mediante un método conocido entre los expertos en la técnica. Un ejemplo de un sistema de evaluación consiste en un ensayo celular de células transfectadas de manera estable usando una construcción indicadora que contiene el promotor PAI-1 humano o un sitio de unión Simad que actúa sobre el gen indicador de luciferasa (documento de referencia: De Gouville, et al., Br. J. Pharmacol., 145(2): 166-177, 2005).
Los ejemplos de inhibidor de TGF-p contenidos en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención incluyen A83-01 (3-(6-metilpiridin-2-il)-1-feniltiocarbamoil-4-quinolin-ilpirazol), inhibidor de ALK5 I (3-(piridin-2-il)-4-(4-quinonil)-1H-pirazol), LDN1931189 (4-(6-(4-piperazin-1-il)fenil)pirazolo[1,5-a] pirimidin-3-il)quinolina), SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il]benzamida), SB-505124 (hidrato de clorhidrato de 2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-2-tert-butil-3H-imidazol-4-il)-6-metilpiridina), SD-208 (2-(5-cloro -2-fluorofenil)pteridin-4-il)piridin-4-il-amina), SB-525334 (6-[2-(1,1-dimetiletil)-5-(6-metil-2-piridinil)-1H -imidazol-4-il]quinoxalina), Ly-364947 (4-[3-(2-piridinil)-lH-pirazol-4-il]-quinolina), LY2157299 (amida del ácido 4-[2-(6-metil-piridin- 2-il)-5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2,-b]pirazol-3-il]-quinolin-6-carboxílico), inhibidor de la cinasa TGF-p RI II 616452 (2-(3-(6-metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina), inhibidor de la cinasa TGF-p RI III 616453 (2-(5-benzo[1,3]dioxol- 4-il-2-tert-butil-1H-imidazol-4-il)-6-metilpiridina HCl), inhibidor de la cinasa TGF-p RI IX 616463 (4-((4-((2,6-dimetilpiridin-3- il)oxi)piridin-2-il)amino)bencenosulfonamida), inhibidor de la cinasa TGF-p RI VII 616458 (1-(2-((6,7-dimetoxi-4-quinolil)oxi)-(4,5-dimetilfenil)-1-etanona), inhibidor de la cinasa TGF-p RI VIII 616459 (6-(2-tert-butil-5-(6-metil-piridin-2-il)-1H-imidazol-4-il)-quinoxalina), AP12009 (compuesto antisentido de TGF-p2 "Trabedersen"), Belagenpumatucel-L (vacuna alogénica de células tumorales modificada con gen antisentido de TGF-p2), CAT-152 (glaucoma-lerdelimumab (anticuerpo monoclonal anti-TGF-p2), CAT- 192 (Metelimumab (anticuerpo monoclonal IgG4 humano que neutraliza el TGF-p1) y GC-1008 (anticuerpo monoclonal anti-TGF-p). A83-01 es preferible entre los inhibidores de TGF-p contenidos en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención.
La concentración de TGF-p contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención es preferiblemente de 10 nM a 10 j M, más preferiblemente de 500 nM a 5 j M e incluso más preferiblemente de 500 nM a 2 j M. Durante el cultivo de células madre, preferiblemente se agrega inhibidor de TGF-p al medio de cultivo cada dos días, y preferiblemente el medio de cultivo se reemplaza con medio nuevo cada cuatro días.
<Otros componentes>
El medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención también puede contener inhibidor de Rho cinasa (Rock). Ejemplos del mismo incluyen Y-27632 (hidrato de diclorhidrato de (R)-(+)-trans-4-(1-aminoetil)-N-(4-piridil)ciclohexanocarboxamida), fasudil (HA1077) (5-(1,4-diazepan -1-ilsulfonil)isoquinolina) y H-1152 (diclorhidrato de (S)-(+)-2-metil-1-[(4-metil-5-isoquinolil)sulfonil]-hexahidro-1H-1,4-diazepina). En el caso de usar Y-27632 como inhibidor de Rock, se agrega preferiblemente Y-27632 durante los dos primeros días del cultivo de células madre dispersas en células individuales. La concentración de Y-27632 contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención es preferiblemente 10<j>M.
Se agrega además gastrina (o un sustituto adecuado tal como Leu 15-gastrina) al medio de cultivo celular para cultivar el organoide de la presente invención. La concentración de gastrina (o sustituto adecuado de la misma) contenida en el medio de cultivo celular para cultivar el organoide de la presente invención puede ser, por ejemplo, de 1 ng/mL a 10 jg/mL, de 1 ng/mL a 1 jg/mL, o de 5 ng/mL a 100 ng/mL.
El medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención también puede contener además al menos un tipo de aminoácido. Ejemplos de aminoácidos contenidos en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención incluyen L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, L-cistina, ácido L-glutámico, L- glutamina, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina y combinaciones de las mismas. En general, la concentración de L-glutamina contenida en el medio de cultivo celular es de 0.05 g/L a 1 g/L (y normalmente, de 0.1 g/L a 0.75 g/L). Además, la concentración de otros aminoácidos contenidos en el medio de cultivo celular es de 0.001 g/L a 1 g/L (y normalmente, de 0.01 g/L a 0.15 g/L). Los aminoácidos pueden ser de origen sintético.
El medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención puede contener además al menos un tipo de vitamina. Ejemplos de vitaminas contenidas en el medio de cultivo celular para el cultivo de organoides de la presente invención incluyen tiamina (vitamina B1), riboflavina (vitamina B2), niacina (vitamina B3), D-pantotenato de calcio (vitamina B5), piridoxal/piridoxamina/piridoxina (vitamina B6), ácido fólico (vitamina B9), cianocobalamina (vitamina B12), ácido ascórbico (vitamina C), calciferol (vitamina D2), DL-a-tocoferol (vitamina E), biotina (vitamina H) y menadiona (vitamina K).
El medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención también puede contener al menos un tipo de sal inorgánica. La sal inorgánica contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención sirve para ayudar a mantener el equilibrio osmótico de las células, así como para ayudar a regular el potencial de membrana de las mismas. Ejemplos específicos de sales inorgánicas incluyen sales de calcio, cobre, plomo, magnesio, potasio, sodio y zinc. Las sales normalmente se utilizan en forma de cloruros, fosfatos, sulfatos, nitratos y carbonatos. Además, ejemplos específicos del mismo incluyen CaCh, CuSO4-5H2O, Fe(NO2)-9 H2O, FeSO4-7H2O, MgCl, MgSO4, KCl, NaHCOa, NaCl, Na2HPO4, Na2HPO4-H2O y ZnSO4-7H2o.
El medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención también puede contener al menos un tipo de azúcar capaz de servir como fuente de energía de carbono. Ejemplos de azúcares contenidos en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención incluyen glucosa, galactosa, maltosa y fructosa. Entre estos, es preferible la glucosa y es particularmente preferible la D-glucosa (dextrosa) para el azúcar. La concentración de azúcar contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención es preferiblemente de 1 g/La 10 g/L.
El medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención también puede contener además al menos un tipo de oligoelemento. Ejemplos de oligoelementos contenidos en el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención incluyen bario, bromo, cobalto, yodo, manganeso, cromo, cobre, níquel, selenio, vanadio, titanio, germanio, molibdeno, silicio, hierro, flúor, plata, rubidio, estaño, circonio, cadmio, zinc, aluminio e iones de los mismos.
El medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención también puede contener además al menos un tipo de agente químico complementario. Ejemplos de dichos agentes químicos complementarios incluyen nutrientes o factores de crecimiento que, según se ha informado, mejoran el cultivo de células madre, tales como colesterol, transferrina, albúmina, insulina, progesterona, putrescina, selenito u otros factores.
«M étodo para cultivar células madre epiteliales, células
epiteliales, células tumorales epiteliales o tejidos que contienen estas
cé lu las»
<Primer ejemplo>
El método de cultivo descrito en este documento en un primer ejemplo es un método para cultivar células madre epiteliales, células epiteliales, células tumorales epiteliales o tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, provisto de: una etapa de preparación de matriz extracelular para preparar una matriz extracelular, una etapa de adhesión para adherir células madre epiteliales, células epiteliales, células tumorales epiteliales o tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células a la matriz extracelular, y una etapa de formación de organoides para formar un organoide agregando el medio de cultivo celular antes mencionado para cultivar organoides y cultivar las células madre epiteliales, las células epiteliales, las células tumorales epiteliales o el tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, después de la etapa de adhesión celular.
Según el método de cultivo del presente ejemplo, se pueden cultivar células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no pueda cultivarse en la técnica anterior, se pueden cultivar durante un largo período de tiempo. Además, se puede formar un organoide con alta eficacia a partir de células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no se puede cultivar en la técnica anterior.
A continuación se proporciona una explicación detallada de cada etapa del método de cultivo del presente ejemplo.
[Etapa de preparación de la matriz extracelular]
En general, una "matriz extracelular (ECM)" se refiere a una estructura supramolecular presente fuera de las células de un organismo vivo. Esta ECM sirve como andamio para el crecimiento de células madre epiteliales, células tumorales epiteliales o tejido que contiene estas células.
La ECM contiene diversos polisacáridos, agua, elastina y glicoproteínas. Ejemplos de glicoproteínas incluyen colágeno, entactina (nidógeno), fibronectina y laminina.
Un ejemplo de un método usado para preparar ECM es un método que usa células de tejido conectivo. Más específicamente, después de haber cultivado células productoras de ECM, tales como fibroblastos, estas células se extraen seguido de la adición de células madre epiteliales, células epiteliales, células tumorales epiteliales o tejido que contiene estas células para permitir su uso como andamio.
Ejemplos de células productoras de ECM incluyen osteoclastos que producen principalmente colágeno y proteoglicano, fibroblastos que producen principalmente colágeno tipo IV, laminina, proteoglicano intersticial y fibronectina, y miofibroblastos de colon que producen principalmente colágeno (tipo I, tipo III y tipo IV), proteoglicanos de sulfato de condroitina, ácido hialurónico, fibronectina y tenascina C. Alternativamente, también se puede usar ECM disponible comercialmente. Ejemplos de ECM disponibles comercialmente incluyen Proteína de Matriz Extracelular (Invitrogen) y preparaciones de membrana basal derivadas de células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) (tales como Matrigel® fabricado por BD Biosciences). También se puede usar ECM sintética tal como ProNectin (Sigma Z378666). Además, se pueden usar mezclas de ECM de origen natural y ECM sintética.
En el caso de usar ECM para cultivar células madre, se puede potenciar la supervivencia a largo plazo de las células madre y la supervivencia continua de las células madre no diferenciadas. En ausencia de ECM, los cultivos de células madre no se pueden cultivar durante un largo período de tiempo y no se observa una supervivencia continua de las células madre no diferenciadas. Además, cuando hay ECM presente, se pueden cultivar organoides que no pueden cultivarse en ausencia de ECM.
La ECM generalmente se hunde hasta el fondo de un plato en el que están suspendidas las células. Por ejemplo, cuando la ECM se coagula a 37 °C, el medio de cultivo celular antes mencionado para cultivar organoides se puede agregar y usar mediante difusión en la ECM. Las células presentes en el medio se adhieren a la ECM interactuando con la integrina, por ejemplo, como resultado de la interacción con la estructura superficial de la ECM.
Se puede recubrir con ECM un recipiente de cultivo y similares. En el caso de usar fibronectina, la proporción recubierta sobre el recipiente de cultivo como ECM es preferiblemente de 1 pg/cm2 a 250 pg/cm2, más preferiblemente 1 pg/cm2 a 150 pg/cm2, y aún más preferiblemente 8 pg/cm2 a 125 pg/cm2.
[Etapa de adhesión]
A continuación, se preparan células madre epiteliales, células epiteliales, células tumorales epiteliales o tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células. Ejemplos de células madre epiteliales, células epiteliales, células tumorales epiteliales y tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células usadas en el método de cultivo del presente ejemplo incluyen las mismas células y tejido que los de la sección descrita anteriormente titulada «Medio de cultivo celular para el cultivo de organoides».
Los ejemplos de métodos usados para preparar células epiteliales a partir del tejido antes mencionado incluyen métodos conocidos entre los expertos en la técnica. Por ejemplo, las criptas se pueden aislar dejando que un agente quelante y el tejido aislado permanezcan a una temperatura constante. Luego se lava este tejido y luego se separa la capa de células epiteliales de la capa submucosa en un portaobjetos de vidrio y se corta en secciones delgadas. Posteriormente, las secciones delgadas se dejan reposar a una temperatura constante en tripsina o preferiblemente en una solución que contiene al menos uno de EDTA y EGTA, seguido de la separación de los fragmentos de tejido no digeridos y las células individuales derivadas de las criptas usando, por ejemplo, al menos uno de filtración y centrifugación. En lugar de usar tripsina, se puede usar al menos un tipo de otra enzima proteolítica tal como colágeno o dispasa I. Se usa un método similar para aislar fragmentos de páncreas o estómago.
Ejemplos de métodos para aislar células madre de tejido epitelial incluyen métodos conocidos entre los expertos en la técnica. Las células madre expresan al menos uno de Lgr5 y Lgr6 en su superficie (Lgr5 y Lgr6 pertenecen a una superfamilia de receptores acoplados a proteína G grande (GPCR)). Un ejemplo de método de aislamiento consiste en preparar una suspensión celular a partir del tejido epitelial, poner en contacto esta suspensión celular con una sustancia química que se une con al menos uno de Lgr5 y Lgr6, separar la sustancia química que se une con al menos uno de Lgr5 y Lgr6, y aislar células madre de este compuesto de unión.
Ejemplos específicos de sustancias químicas que se unen con al menos uno de Lgr5 y Lgr6 incluyen anticuerpos y, más específicamente, anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente al menos uno de Lgr5 y Lgr6 y se unen al mismo (tales como anticuerpos monoclonales que contienen anticuerpos monoclonales de ratón y rata). El uso de tales anticuerpos hace posible aislar células madre que expresan al menos uno de Lgr5 y Lgr6 usando, por ejemplo, perlas magnéticas o pasándolas a través de un clasificador de células activado por fluorescencia.
Se siembran células madre epiteliales, células epiteliales, células tumorales epiteliales o tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células que han sido aisladas según el método antes mencionado y se dejan reposar sin perturbaciones sobre la matriz celular obtenida en la etapa de preparación antes mencionada. Las células sembradas pueden adherirse a la ECM interactuando con la integrina, por ejemplo, como resultado de la interacción con la estructura superficial de la ECM.
[Etapa de formación de organoides]
Continuando, después de sembrar las células, se agrega el medio de cultivo celular antes mencionado para cultivar organoides antes de que las células se sequen y luego se cultivan las células. La temperatura del cultivo es preferiblemente de 30 °C a 40 °C y más preferiblemente de aproximadamente 37 °C. El tiempo de cultivo se puede ajustar adecuadamente según las células usadas. Se puede formar un organoide aproximadamente entre 1 y 2 semanas después del inicio del cultivo. Además, las células que en la técnica anterior sólo se podían mantener y cultivar durante dos o tres meses se pueden mantener y cultivar durante un largo período de tiempo de 3 meses o más (y preferiblemente aproximadamente 10 meses) en el caso del método de cultivo del presente ejemplo. El uso del método de cultivo del presente ejemplo hace posible mantener la capacidad de diferenciación y suprimir la frecuencia de la tumorigénesis a un nivel bajo en el caso de cultivar las células madre antes mencionadas.
Además, el cultivo se puede llevar a cabo en condiciones hipóxicas durante la etapa de formación del organoide. El cultivo en condiciones hipóxicas permite que se formen organoides con alta eficacia a partir de células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contenga al menos cualquiera de estas células o tejido que no pueda cultivarse en la técnica anterior.
La condición hipóxica en el presente método se refiere preferiblemente a una concentración de oxígeno del 0.1 % al 15 %, más preferiblemente del 0.3 % al 10 %, e incluso más preferiblemente del 0.5 % al 5 %.
<Segundo ejemplo>
El método de cultivo descrito en este documento en un segundo ejemplo es un método para cultivar células madre epiteliales, células epiteliales, células tumorales epiteliales o tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células; provisto de: una etapa de preparación de matriz extracelular para preparar una matriz extracelular, una etapa de adhesión para adherir células madre epiteliales, células epiteliales, células tumorales epiteliales o tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células a la matriz extracelular, y una etapa de formación de organoides para formar un organoide agregando el medio de cultivo celular para cultivar organoides y cultivar las células madre epiteliales, las células epiteliales, las células tumorales epiteliales o el tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células en condiciones hipóxicas, después de la etapa de adhesión celular; en el que, el medio de cultivo celular para cultivar organoides contiene al menos un tipo de componente seleccionado del grupo que consiste en agonista de Wnt compuesto de proteína Wnt y R-espondina, factor de crecimiento mitogénico, inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP), factor de crecimiento transformante p (inhibidor de TGF-p) e inhibidor de p38, y la concentración de oxígeno es preferiblemente de 0.1 % a 15 %, más preferiblemente de 0.3 % a 10 %, e incluso más preferiblemente de 0.5 % a 5 %.
Según el método de cultivo del presente ejemplo, se pueden cultivar células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no pueda cultivarse en la técnica anterior, se pueden cultivar durante un largo período de tiempo. Además, se puede formar un organoide con alta eficacia a partir de células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no se puede cultivar en la técnica anterior.
Cada etapa del método de cultivo del presente ejemplo es el mismo que el del primer ejemplo antes mencionado.
Además, el medio de cultivo celular para cultivar organoides usado en el método de cultivo del presente ejemplo contiene al menos un tipo de componente seleccionado del grupo que consiste en agonista de Wnt compuesto de proteína Wnt y R-espondina, factor de crecimiento mitogénico, inhibidor de BMP, inhibidor de TGF-p e inhibidor de p38. Además, en el método de cultivo del presente ejemplo, se pueden seleccionar condiciones adecuadas entre una pluralidad de condiciones correspondientes a las células cultivadas o al tipo de tejido preparando y cultivando varios tipos de medios de cultivo celular para cultivar organoides que tienen diferentes composiciones en condiciones hipóxicas. y condiciones normóxicas (concentración de oxígeno de aproximadamente el 20 %), lo que permite que se formen organoides con alta eficiencia.
Los ejemplos de agonista de Wnt, inhibidor de BMP e inhibidor de TGF-p incluyen los mismos que los ejemplificados en la sección descrita anteriormente titulada «Medio de cultivo celular para cultivar organoides». Además, el agonista de Wnt usado forma preferiblemente un complejo con afamina. En el método de cultivo del presente ejemplo, el uso de un medio de cultivo celular para cultivar organoides que contiene un agonista de Wnt compuesto por un complejo de proteína Wnt y afamina, y R-espondina hace posible formar un organoide con alta eficacia a partir de células madre epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no puede cultivarse en la técnica anterior.
Además, lo siguiente proporciona una explicación de otros constituyentes contenidos en el medio de cultivo celular para cultivar organoides usados en el método de cultivo del presente ejemplo.
(Factor de crecimiento mitogénico)
Ejemplos de factores de crecimiento mitogénicos contenidos en el medio de cultivo celular para cultivar organoides usado en el método de cultivo del presente ejemplo incluyen una familia de factores de crecimiento tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante-a (TGF-a), cerebro -factor neurotrófico derivado (BDNF) o factor de crecimiento de queratinocitos (KGF). También se puede usar en combinación una pluralidad de tipos de estos factores de crecimiento mitogénicos.
EGF es un potente factor mitogénico para diversas células ectodérmicas y mesodérmicas cultivadas que tiene un efecto notable en la diferenciación de algunos fibroblastos en células específicas. El precursor de EGF está presente como una molécula unida a una membrana que genera un péptido de 53 aminoácidos que estimula las células después de ser escindidas por proteólisis. Entre estos, es preferible EGF para el factor de crecimiento mitogénico contenido en el medio de cultivo celular antes mencionado para cultivar organoides. La concentración de EGF contenida en el medio de cultivo celular para cultivar organoides usado en el método de cultivo del presente ejemplo es preferiblemente de 5 ng/mL a 500 ng/mL, más preferiblemente de 100 g/mL a 400 ng/mL, e incluso más preferiblemente 50 ng/mL a 200 ng/mL.
Además, el contenido de EGF es el mismo que el de KGF en el caso de contener KGF en el medio de cultivo celular antes mencionado para cultivar organoide usado en el método de cultivo del presente ejemplo. En el caso de usar una pluralidad de KGF tal como KGF1 y KGF2 (también conocidos como FGF7 y FGF10), el contenido total de KGF está preferiblemente dentro de los intervalos antes mencionados. Cuando se cultivan células madre, preferiblemente se agrega factor de crecimiento mitogénico al medio de cultivo cada dos días y el medio de cultivo se reemplaza con medio nuevo cada cuatro días.
(Inhibidor de p38)
En la presente descripción, "inhibidor de p38" se refiere a un inhibidor arbitrario que directa o indirectamente regula negativamente la transducción de señales de p38. En general, el inhibidor de p38 se une, por ejemplo, a p38 y reduce su actividad. La proteína cinasa p38 constituye una parte de la familia de proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAPK). Las MAPK son proteínas cinasas específicas de serina/treonina que regulan diversas actividades celulares tales como la expresión genética, la mitosis, la diferenciación, el crecimiento o la muerte/apoptosis celular respondiendo a un estímulo extracelular tales como el estrés o las citocinas inflamatorias. p38 MAPK existe como isoformas a, p, p2, y y 6. Además, el inhibidor de p38 es un agente químico que se une a al menos una isoforma de p38, por ejemplo, y reduce la actividad de la misma.
El inhibidor de p38 tiene una actividad inhibidora que es preferiblemente del 50 % o más, más preferiblemente del 70 % o más, incluso más preferiblemente del 80 % o más y en particular preferiblemente del 90 % o más en comparación con el nivel de actividad de p38 en ausencia de este inhibidor. Los efectos inhibidores del inhibidor de p38 se pueden evaluar usando un método conocido entre los expertos en la técnica. Ejemplos de tales sistemas de evaluación incluyen un método para detectar un anticuerpo específico del sitio de fosforilación de la fosforilación de Thr180/Tyr182, un ensayo de cinasa bioquímica recombinante, un ensayo de secreción del factor de necrosis tumoral a (TNF-a) y una plataforma de cribado de alto rendimiento Discover Rx para la inhibición de p38 (tal como la fabricada por Millipore o Sigma-Aldrich).
Ejemplos de inhibidores de p38 contenidos en el medio de cultivo celular para cultivar organoides usados en el método de cultivo del presente ejemplo incluyen SB-202190 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-hidroxifenil)-5-(4-piridil) -IH-imidazol), SB-203580 (4-[4-(4-fluorofenil)-2-[4-(metilsulfinil)fenil]-1H-imidazol-5-il]piridina, VX-702 (6-(N -carbamoil-2,6-difluoroanilino)-2-(2,4-difluorofenil)piridin-3-carboxiamida), VX-745 (5-=(2,6-diclorofenil)-2-[(2,4-difluorofenil))tio]-6H-pirimido[1,6-b]piridazin-6-ona), PD-169316 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-nitrofenil)-5-(4-piridil)- IH-imidazol), RO-4402257 (6-(2,4-difluorofenoxi)-2-{[3-hidroxi-1-(2-hidroxietii)propil]amino}-8-metilpirido(2,3-D) pirimidin-7(8h)-ona) y BIRB-796 (1-[5-tert-butil-2-(4-metilfenil)pirazol-3-il]-3-[4-(2-morfolin-4-iletoxi)naftalen-1-il]urea).
La concentración de inhibidor de p38 contenida en el medio de cultivo celular antes mencionado para cultivar organoide usado en el método de cultivo del presente ejemplo es preferiblemente de 50 nM a 100 pM, más preferiblemente de 100 nM a 50 pM e incluso más preferiblemente de 100 nM a 10 pM. Cuando se cultivan células madre, preferiblemente se agrega inhibidor de p38 al medio de cultivo cada dos días y el medio de cultivo se reemplaza con medio nuevo cada cuatro días.
<<Organoide>>
El organoide descrito en este documento se obtiene mediante el método de cultivo descrito anteriormente.
El organoide se puede usar en medicina regenerativa, investigación médica básica sobre células epiteliales, cribado de respuesta a fármacos e investigación de desarrollo de fármacos usando organoides epiteliales derivados de pacientes.
<Aplicaciones>
El organoide antes mencionado se puede usar para el cribado de la respuesta a fármacos, ensayos de toxicidad o medicina regenerativa.
En el caso de usar el organoide antes mencionado en el cribado de la respuesta al fármaco, el organoide se cultiva, por ejemplo, en una placa de múltiples pocillos tal como una placa de 96 pocillos o una placa de 384 pocillos. Luego se identifican las moléculas que tienen un efecto sobre el organoide usando una biblioteca de moléculas. Ejemplos de bibliotecas de moléculas incluyen una biblioteca de fragmentos de anticuerpos, una biblioteca de presentación en fagos peptídicos, una biblioteca de péptidos (tal como LOPAP® disponible en Sigma-Aldrich, biblioteca de lípidos (disponible en BioMol), biblioteca de compuestos sintéticos (tal como LOPAP® disponible en Sigma-Aldrich) o biblioteca de compuestos naturales (especificaciones disponibles en TimTec). Además, también se puede usar una biblioteca de genes. Ejemplos de bibliotecas de genes incluyen una biblioteca de ADNc, una biblioteca antisentido y una biblioteca de ARNip u otra biblioteca de ARN no codificante. Un ejemplo de un método específico consiste en exponer las células a múltiples concentraciones de un agente químico de prueba durante un determinado período de tiempo y luego evaluar el cultivo al finalizar la exposición. Además, aunque el organoide se dirige específicamente a las células tumorales epiteliales, también se puede usar para identificar agentes químicos que no se dirigen a los organoides compuestos de células normales.
Además, el organoide también se puede usar en lugar de líneas celulares tales como las células Caco-2 en ensayos de toxicidad realizados con nuevos fármacos candidatos o suplementos dietéticos nuevos o conocidos.
Además, el organoide se puede usar para cultivar patógenos tales como el norovirus para los que actualmente no existen cultivos de tejidos ni modelos animales adecuados.
Además, el organoide es útil en el campo de la medicina regenerativa en la reparación del epitelio intestinal tras una exposición a radiación o cirugía, en la reparación del epitelio intestinal de pacientes que padecen enfermedades inflamatorias del intestino tales como la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa, o en la reparación del epitelio intestinal de pacientes que padecen síndrome del intestino corto. Además, el organoide es útil en la reparación del epitelio intestinal en pacientes con enfermedades genéticas del intestino delgado o del colon. Además, el organoide es útil en el campo de la medicina regenerativa, por ejemplo, como injerto o porción del mismo después de una pancreatectomía o para el tratamiento de diabetes tal como diabetes de tipo I o diabetes de tipo II.
Aunque lo siguiente proporciona una explicación de la presente invención mediante ejemplos de la misma, la presente invención no se limita a los siguientes ejemplos.
Ejemplos
[Ejemplo 1]
(1) Preparación de medio de cultivo celular para organoides
Cultivo
Primero, se agregó R-espondina 1 recombinante humana (R&D Systems) a un medio Advanced DMEM/F-12 disponible comercialmente (Thermo Fisher Scientific) hasta una concentración final de 1 pg/mL seguido de la adición de nogina (Peprotech) a una concentración final 100 ng/mLy A83-01 (Tocris) hasta una concentración final de 500 nM. Además, se preparó un medio en el que se agregó sobrenadante de cultivo derivado de W-Wnt3a/HEK cultivado en medio que contenía suero hasta una concentración final de Wnt3a de 300 ng/mL (denominado "medio WNRA").
Además, al menos un tipo entre Epiregulina (Biolegend) hasta una concentración final de 500 ng/mL, IGF1 (Biolegend) hasta una concentración final de 500 ng/mL, o FGF2 (Peprotech) hasta una concentración final de 50 ng/mL, Se agregó para preparar medios en los que se combinaron los constituyentes de la manera indicada a continuación.
* Medio de WNRA epiregulina
* Medio de WNRA IGF 1
* Medio de WNRA epiregulina IGF 1
* Medio de WNRA epiregulina FGF2
* Medio de WNRA IGF 1 FGF2
Además, también se preparó un medio que sirvió como control en el que se agregó EGF (Thermo Fisher Scientific) hasta una concentración final de 50 ng/mL (que se denominará " Medio de WNRA EGF"). Además, se preparó un medio que sirvió como ejemplo de referencia en el que se agregó además SB202190 (Sigma-Aldrich) hasta una concentración final de 10 pM (que se denominará "Medio de WNRAS EGF").
(2) Cultivo de células tumorales epiteliales derivadas de
Tumor de colon
Se tomaron muestras de tejido lesionado de un tumor de colon, o de una porción de al menos 5 cm de distancia del tumor de colon tratado como mucosa normal, de pacientes con tumor de colon a los que se les proporcionó una explicación y de quienes se había obtenido el consentimiento con base en un protocolo de investigación ética aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Keio. A continuación, se dividió tejido tumoral de colon que contenía células tumorales epiteliales derivadas de tejido tumoral humano en células tumorales epiteliales y tejido residual usando Liberase TH. El tejido restante se dispersó libremente aún más con tripsina. A continuación, se sembraron las células tumorales epiteliales en una placa de 48 pocillos junto con 25 pL de Matrigel® (BD Biociencia). El medio de WNRA EGF (medio usado en métodos convencionales), el medio de WNRA epiregulina, el medio de WNRA IGF1, el medio de WNRA epiregulina IGF, el medio de WNRA epiregulina FGF2 o el medio de WNRA IGF1 FGF2 preparado en (1) anterior se agregaron en alícuotas de 250 pL cada uno a pocillos sembrados con células tumorales epiteliales seguido de cultivo a 37 °C y una concentración de oxígeno del 20 %. El medio se reemplazó cada dos días desde el inicio del cultivo. La figura 1 muestra imágenes que representan los estados de los cultivos el día 7 desde el inicio del cultivo primario (pasaje 0). La figura 2 es un gráfico que cuantifica el área en los pocillos ocupada por células madre intestinales para cada medio.
Basado en las figuras 1 y 2, se confirmó que el área de organoides aumentaba y se confirmó que los organoides podían cultivarse con alta eficiencia en comparación con el medio de WNRA<e>G<f>independientemente del medio usado. En particular, se determinó claramente que los organoides podían cultivarse con alta eficacia en el caso de usar "medio de WNRA IGF1 FGF2" que contenía IGF1 y FGF2.
[Ejemplo 2]
(1) Preparación de medio de cultivo celular para cultivo
de organoides
En primer lugar, se preparó un medio en el que EGF (Thermo Fisher Scientific) hasta una concentración final de 50 ng/mL, nogina (Peprotech) hasta una concentración final de 100 ng/mLy A83-01 (Tocris) hasta una concentración final de 500 nM, se agregaron a un medio Advanced DMEM/F-12 disponible comercialmente (Thermo Fisher Scientific) (y el medio resultante también se denomina "medio ENA").
(2) Preparación de tejido tumoral epitelial derivado de
Tumor de colon
Se obtuvieron células tumorales epiteliales usando métodos como los descritos en las secciones (1) y (2) del ejemplo 1. A continuación, se sembraron las células tumorales epiteliales en una placa de 48 pocillos junto con 25 pL de Matrigel® (BD Biociencia). Se agregaron 250 pL del medio ENA preparado en (1) anterior a los pocillos sembrados con células tumorales epiteliales seguido de cultivo a 37 °C y una concentración de oxígeno del 1 % (que se denominará "cultivo hipóxico") o una concentración de oxígeno de 20 % (denominado "cultivo normóxico"). El medio se reemplazó cada dos días desde el inicio del cultivo. La figura 3 muestra imágenes que indican organoides cultivados el día 7 desde el inicio del cultivo primario (pasaje 0).
Basado en la figura 3, se confirmó que la condición de cultivo hipóxico es esencial para la formación de organoides en el caso de las células tumorales epiteliales usadas aquí.
Además, la figura 4 es un diagrama que indica las condiciones de cultivo óptimas para organoides establecidos a partir de 55 tipos de tumores de colon. Basado en la figura 4, en el caso del cultivo de organoides epiteliales de colon normales, a diferencia de todos los constituyentes que consisten en un agonista de Wnt compuesto de proteína Wnt y R-espondina, se requieren EGF, inhibidor de p38, nogina e inhibidor de TGF-p como constituyentes contenidos en el medio de cultivo celular para el cultivo de organoides, en el caso de células tumorales, se confirmó que el cultivo era posible con menos constituyentes.
Sin embargo, hubo casos en los que una porción de los constituyentes (y especialmente el inhibidor de p38) exacerbaron la eficiencia del cultivo que acompaña a la tumorigénesis (consulte las áreas que contienen líneas diagonales en la figura 4). Además, la eficiencia del cultivo empeoró en condiciones de 20 % de oxígeno (condición normóxica), mientras que, por otro lado, hubo casos en los que el cultivo fue posible en condiciones de 1 % de oxígeno (condición hipóxica) (consulte las áreas que contienen líneas horizontales en la figura 4). Aquí, cáncer de colon IV se refiere al cáncer de colon metastásico.
En consecuencia, no se pudieron cultivar todos los tumores bajo un único conjunto de condiciones de cultivo, y se determinó claramente que la eficiencia del establecimiento mejoraría estableciendo preliminarmente las ocho condiciones de cultivo que se indican a continuación. En las siguientes condiciones de cultivo, WR(-) indica que no está contenido el agonista de Wnt compuesto de proteína Wnt y R-espondina, mientras que WR(+) indica que está contenido el agonista de Wnt compuesto de proteína Wnt y R-espondina.
* Medio ENA/WR(-), cultivo normóxico
* Medio ENA/WR(+), cultivo normóxico
* Medio ENAS/WR(-), cultivo normóxico
* Medio ENAS/WR(+), cultivo normóxico
* Medio ENA/WR(-), cultivo hipóxico
* Medio ENA/WR(+), cultivo hipóxico
* Medio ENAS/WR(-), cultivo hipóxico
* Medio ENAS/WR(+), cultivo hipóxico
[Ejemplo 3]
(1) Preparación del complejo Wnt3a-Afamina
Complejo Wnt3a-afamina (también denominado "Wafm") se preparó usando el hecho de que la afamina bovina está contenida en el suero fetal de ternera, cultivando células introducidas solo con el gen Wnt3a en un medio que contiene suero, y cultivando, usando el hecho de que el Wnt3a secretado forma automáticamente un complejo estable con la afamina. En otras palabras, se cultivaron células que expresaban Wnt3a que tenían una secuencia de etiqueta N-terminal (W-Wnt3a/HEK) durante 5 días a 7 días en una placa o matraz multicapa que contenía suero fetal de ternera 10&, seguido de la recuperación del sobrenadante del cultivo. A continuación, el sobrenadante del cultivo recuperado se sometió a separación centrífuga y se pasó a través de un filtro (0.22 |jm). Se utilizaron 220 mL del sobrenadante del cultivo recogido. Continuando, se agregaron 200 mL del sobrenadante del cultivo recuperado a 3 mL de Sefarosa del anticuerpo P20.1 y después de mezclar rotando durante 3 horas a 4 °C, el medio se pasó a través de una columna vacía para recoger la Sefarosa. Además, el anticuerpo P20.1 es un anticuerpo que reconoce específicamente la secuencia de etiqueta en el extremo N de Wnt3a. Continuando, la Sefarosa que se recogió en la columna se lavó con 3 mL de solución salina regulada con Tris (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5) y este procedimiento de lavado se repitió cinco veces. Continuando, se recuperó un eluyente eluyendo usando 3 mL de solución de péptido (0.2 mg/mL de péptido PAR4-C8/TBS) por elución. Este procedimiento de elución se repitió diez veces para obtener el complejo Wnt3a-afamina. La actividad de Wnt3a se confirmó mediante un ensayo informado por TCF usando sobrenadante de células W-Wnt3a/HEK y se confirmó que Wnt3a tenía un alto nivel de actividad en comparación con Wnt3a disponible comercialmente (R&D Systems).
(2) Preparación de medio de cultivo celular para cultivo de organoides
En primer lugar, se agregó R-espondina 1 recombinante humana (R&D Systems) a un medio Advanced DMEM/F-12 disponible comercialmente (Thermo Fisher Scientific) hasta una concentración final de 1 jg/m L seguido de la adición de nogina (Peprotech) a una concentración final 100 ng/mLy A83-01 (Tocris) hasta una concentración final de 500 nM. Además, se preparó un medio en el que se agregó sobrenadante de cultivo derivado de W-Wnt3a/HEK cultivado en medio que contenía suero hasta una concentración final de Wnt3a de 300 ng/mL, y se agregó IGF1 (Biolegend) hasta una concentración final de 100 ng/mL, y se agregó FGF2 (Peprotech) hasta una concentración final de 50 ng/mL.
Además, se agregó R-espondina 1 recombinante humana (R&D Systems) a un medio Advanced DMEM/F-12 disponible comercialmente (Thermo Fisher Scientific) hasta una concentración final de 1 jg/m L seguido de la adición de nogina (Peprotech) a una concentración final de 100 ng/mLy A83-01 (Tocris) hasta una concentración final de 500 nM. Además, se preparó un medio en el que se agregó el complejo Wnt3a-afamina preparado en (1) anterior hasta una concentración final de 300 ng/mL, se agregó IGF1 (Biolegend) hasta una concentración final de 100 ng/mLy FGF2 (Peprotech) se agregó a una concentración final de 50 ng/mL (y el medio resultante también se conoce como "Medio WafmIFNRA").
Además, se agregó R-espondina 1 recombinante humana (R&D Systems) a un medio Advanced DMEM/F-12 disponible comercialmente (Thermo Fisher Scientific) hasta una concentración final de 1 jg/m L seguido de la adición de nogina (Peprotech) a una concentración final de 100 ng/mLy A83-01 (Tocris) hasta una concentración final de 500 nM como en el ejemplo comparativo 1. Además, se preparó un medio en el que se agregó sobrenadante de cultivo derivado del cultivo de W-Wnt3a/HEK en medio que contenía suero hasta una concentración final de Wnt3a de 300 ng/mL, se agregó EGF (Thermo Fisher Scientific) hasta una concentración final de 50 ng/mL y se agregó SB202190 (Sigma-Aldrich) hasta una concentración final de 10 jM (y el medio resultante también se denomina "medio WENRAS").
Además, se agregó R-espondina 1 recombinante humana (R&D Systems) a un medio Advanced DMEM/F-12 disponible comercialmente (Thermo Fisher Scientific) hasta una concentración final de 1 jg/m L seguido de la adición de nogina (Peprotech) a una concentración final de 100 ng/mLy A83-01 (Tocris) hasta una concentración final de 500 nM como en el ejemplo comparativo 1. Además, se preparó un medio en el que se agregó el complejo Wnt3a-afamina preparado en (1) anterior hasta una concentración final de 300 ng/mL, se agregó EGF (Thermo Fisher Scientific) hasta una concentración final de 50 ng/mL y se agregó SBS02190 (Sigma-Aldrich) hasta una concentración final de 10 jM (y el medio resultante puede denominarse "Medio WafnENRAS").
(3) Cultivo de células madre intestinales
Se tomó una muestra de un sitio de lesión de un tumor de colon, o una porción de al menos 5 cm de distancia del tumor de colon tratado como mucosa normal, de pacientes con tumor de colon a quienes se les proporcionó una explicación y de quienes se había obtenido el consentimiento según un protocolo de investigación ética aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Keio. Las células epiteliales se extrajeron del tejido muestreado con EDTA o Liberase TH y luego se incluyeron en Matrigel®.
La Matrigel® que contenía las células epiteliales (que se denominarán "células madre intestinales") se sembró en una placa de 48 pocillos y se cultivó junto con el medio. Más concretamente, el procedimiento fue el que se indica a continuación.
Las células madre intestinales cultivadas se sembraron en una placa de 48 pocillos junto con 25 jL de Matrigel® (BD Biociencia). Alícuotas de 250 jL de los cuatro tipos de medios preparados en (2) ("Medio WIFNRA", "Medio WafmIFNRA", "Medio WENRAS" y "MedioWafmENRAS") a cada pocillo seguido de cultivo a 37 °C y una concentración de oxígeno del 20 %. El medio se reemplazó cada dos días desde el inicio del cultivo. La figura 5(A) muestra imágenes que representan los estados de los cultivos el día 7 desde el inicio del cultivo primario (pasaje 0), mientras que la figura 5B es un gráfico que cuantifica el área en los pocillos ocupada por organoides de células madre intestinales en el medio. En las figuras 5(A) y 5(B), "W" indica suero que contiene Wnt3a mientras que "Wafm" indica complejo Wnt3aafamina libre de suero.
Basado en las figuras 5(A) y 5(B), en el caso de usar "Medio WENRAS" que representa la condición de cultivo convencional, la eficiencia con la que se formaron organoides a partir de células madre intestinales individuales fue pobre y los organoides no crecieron hasta un tamaño adecuado. Por otro lado, en el caso del uso del medio "WIFRNA", se pudieron formar organoides a partir de células madre intestinales individuales con mayor eficiencia. Además, en el caso de sustituir Wnt3A que contiene suero convencional por un complejo Wnt3a-afamina libre de suero, la eficiencia del cultivo de células epiteliales normales individuales con IGF1 e IGF2 mejoró drásticamente.
De acuerdo con lo anterior, se determinó claramente que el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención era extremadamente eficaz para mejorar la eficiencia de la formación de organoides a partir de células individuales en aplicaciones tales como el cribado de alto rendimiento de células epiteliales normales.
[Ejemplo 4]
(1) Preparación del complejo Wnt3a-Afamina
El complejo Wnt3a-afamina se preparó usando el mismo método que en la sección (1) del ejemplo 3.
(2) Preparación de medio de cultivo celular para cultivo de organoides
Se prepararon los medios "Medio WIFNRA", "Medio W ^lFN R A" y "WENRAS" usando el mismo método que en la sección (2) del ejemplo 4. Además, se agregó R-espondina 1 humana recombinante (R&D Systems) a medio Advanced DMEM/F-12 disponible comercialmente (Thermo Fisher Scientific) hasta una concentración final de 1 pg/mL seguido de la adición de nogina (Peprotech) a una concentración final de 100 ng/mLy A83-01 (Tocris) hasta una concentración final de 500 nM. Además, se preparó un medio en el que se agregó el complejo Wnt3a-afamina preparado en (1) anterior hasta una concentración final de 300 ng/mL, se agregó IGF1 (Biolegend) hasta una concentración final de 100 ng/mL, FGF2 (Peprotech) se agregó hasta una concentración final de 50 ng/mL, y se agregó SBS02190 (Sigma-Aldrich) hasta una concentración final de 10 pM (y el medio resultante puede denominarse "Medio WafmIFNRAS").
(3) Cultivo de células tumorales epiteliales derivadas de tumor de colon
Se obtuvieron células tumorales epiteliales usando el mismo método que en la sección (2) del ejemplo 1. A continuación, se sembraron las células tumorales epiteliales en una placa de 48 pocillos junto con 25 pL de Matrigel® (BD Bioscience). Se agregaron "Medio WIFNRA", "Medio W ^ IF<n>R<a>", "Medio WEN<r>A<s>" y "Medio WAfmlFNRAS" preparados en (2) anterior en alícuotas de 250 pL a los pocillos sembrados con células tumorales epiteliales, seguido de cultivo a 37 °C y una concentración de oxígeno del 20 %. El medio se reemplazó cada dos días desde el inicio del cultivo. La figura 6 representa imágenes que indican los estados de los cultivos seis días después del inicio de la tercera ronda de subcultivo (Pasaje 3) (número total de días cultivados después del inicio del cultivo: 26), seis días después del inicio de la cuarta ronda de subcultivo (Pasaje 4) (número total de días de cultivo después del inicio del cultivo: 33), y seis días después del inicio de la sexta ronda de subcultivo (Pasaje 6) (número total de días de cultivo después del inicio del cultivo: 47). En la figura 6, "W" indica suero que contiene Wnt3a mientras que "Wafm" indica complejo Wnt3a-afamina libre de suero.
Basado en la figura 6, las células tumorales epiteliales derivadas del tumor de colon usadas en este documento mostraron toxicidad para el inhibidor de p38 en forma de SB202190 y no crecieron en presencia de SBS202190 ("Medio WENRAS" y "Medio WafmIFNRAS"). Por otra parte, se observó formación de organoides por células tumorales epiteliales como resultado del cultivo con medio que contenía IGF1 y FGF2 ("Medio WIFNRA").
Además, el agonista de Wnt que consiste en proteína Wnt y R-espondina era esencial para las células tumorales epiteliales derivadas de tumores de colon usadas aquí, y durante el cultivo con medio que contenía Wnt3a ("Medio WlFNRA"), se observó que el crecimiento era inhibido por el suero contenido en Wnt3a y el cultivo a largo plazo no fue posible. Por otra parte, el cultivo a largo plazo fue posible en el caso del cultivo con un medio que contenía el complejo Wnt3a-afamina libre de suero ("Medio WafmlFNRA").
Además, la figura 7 es una tabla que indica los resultados de la evaluación de la eficiencia de formación de organoides y la posibilidad de cultivo a largo plazo en diferentes composiciones del medio de cultivo celular para cultivar organoides. En la figura 7, ° indica que se pueden formar organoides y que es posible un cultivo a largo plazo durante aproximadamente un mes, © indica que los organoides se pueden cultivar de manera eficiente y que el cultivo a largo plazo es posible durante aproximadamente un mes, y © © indica que los organoides se pueden formar aún más eficientemente y que es posible un cultivo a largo plazo durante aproximadamente tres meses. Además, en la figura 7, "Normoxia" se refiere a una condición de cultivo normóxico a una concentración de oxígeno de aproximadamente el 20 %, mientras que "Hipoxia" se refiere a una condición de cultivo hipóxico a una concentración de oxígeno de aproximadamente el 1 %.
Basado en la figura 7, según el medio de cultivo celular para cultivar organoides o el método de cultivo de la presente invención, se demostró que los organoides podían formarse y se demostró que era posible el cultivo a largo plazo, independientemente de las células o tejido, con respecto a las células madre epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no puede cultivarse en la técnica anterior.
Aplicabilidad industrial
Según el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención, se pueden usar células madre epiteliales, células epiteliales o células tumorales epiteliales derivadas de mamíferos, incluidos seres humanos, tejido que contiene al menos una cualquiera de estas células, o tejido que no se puede cultivar en la técnica anterior, puede ser cultivado durante un largo período de tiempo.
Además, se puede formar un organoide con alta eficacia a partir de al menos uno cualquiera de las células y los tejidos antes mencionados.
Además, la capacidad de diferenciación de las células madre epiteliales cultivadas usando el medio de cultivo celular para cultivar organoides de la presente invención se puede mantener durante un largo período de tiempo y la incidencia de tumores de las mismas es extremadamente baja.
Además, un organoide obtenido mediante los métodos de cultivo descritos en este documento se puede usar en medicina regenerativa, investigación médica básica sobre células epiteliales, cribado de respuesta a fármacos e investigación de desarrollo de fármacos usando organoides epiteliales derivados de pacientes.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un medio de cultivo celular para cultivar organoides que contiene al menos dos tipos de componentes seleccionados del grupo que consiste en factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y epiregulina (EREG), y al menos un tipo de componente entre los siguientes componentes i) a iii):
i) agonista de Wnt,
ii) inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP), y
iii) inhibidor del factor de crecimiento transformante p (TGF-p);
en el que el medio de cultivo celular:
- no contiene EGF en absoluto o sólo contiene EGF en una concentración en la que no se produce la inhibición de la expresión de EGFR; y
- no contiene inhibidor de p38 en absoluto o solo contiene inhibidor de p38 en una concentración en la que no se produce la inhibición de la diferenciación y la muerte celular causada por el inhibidor de p38.
2. El medio de cultivo celular para cultivar organoides según la reivindicación 1, que contiene IGF1 y FGF2.
3. El medio de cultivo celular para cultivar organoides según la reivindicación 1 o 2, en el que el agonista de Wnt es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en proteína Wnt, R-espondina e inhibidor de GSK-3p.
4. El medio de cultivo celular para cultivar organoides según la reivindicación 3, en el que la proteína Wnt forma un complejo con afamina, que es una sustancia estabilizante de la misma.
5. El medio de cultivo celular para cultivar organoides según la reivindicación 3 o 4, en el que el agonista de Wnt es proteína Wnt y R-espondina.
6. El medio de cultivo celular para cultivar organoides según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la proteína Wnt es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 y Wnt16.
7. El medio de cultivo celular para cultivar organoides según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que la R-espondina es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 y R-espondina 4.
8. El medio de cultivo celular para cultivar organoides según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el inhibidor de BMP es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en nogina, gremlin, cordina, proteína similar a cordina que contiene un dominio de cordina, folistatina, proteína relacionada con la folistatina que contiene un dominio de folistatina, DAN, proteína tipo DAN que contiene un dominio de nudo de cisteína DAN, esclerostina/SOST y macroglobulina a-2.
9. El medio de cultivo celular para cultivar organoides según la reivindicación 8, en el que el inhibidor de BMP es nogina.
10. El medio de cultivo celular para cultivar organoides según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el inhibidor de TGF-p es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494 y SJN-2511.
11. El medio de cultivo celular para cultivar organoides según la reivindicación 10, en el que el inhibidor de TGF-p es A83-01.
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