WO2021020953A2 - Wnt 단백질 활성 증진용 배지 조성물 - Google Patents

Wnt 단백질 활성 증진용 배지 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a medium composition for enhancing the activity of Wnt protein and culturing organoids, and a method for culturing organoids using the same.
  • Organoids may be more effective in testing the safety and efficacy of new drugs than tissues made in two dimensions, and it is believed that organoids can be transplanted into damaged or poorly developed organs to improve the condition. Accordingly, research related to organoids is becoming more active from the viewpoint of regenerative medicine in recent years, and it is expected that organoids can be widely used in various fields.
  • Wnt protein which is one of the essential factors in organoid production, generally exists in the form of covalently bonded lipids to conserved Ser residues. Wnt protein has a strong hydrophobic property due to the bound lipid, so it has been difficult to separate and use pure protein due to aggregation. Accordingly, it has been found that stable Wnt protein can be obtained when a medium containing fetal brovine serum (FBS) is used, so Wnt protein including fetal bovine serum has been used in organoid production.
  • FBS fetal brovine serum
  • fetal bovine serum contains a substance that inhibits organoid growth, so there is still a problem that is not suitable for culturing organoids for a long time. Accordingly, development of a medium that enables continuous growth while maintaining the activity of the Wnt protein is required. In addition, if Wnt is purified from a Wnt production medium containing fetal bovine serum, contamination of animal impurities is inevitable, and it is a major limitation in making Wnt therapeutic materials for human use. Development is needed.
  • An object of the present invention is for the culture of cells, cell aggregates, tissue fragments or organ analogs, comprising a basal medium, Wnt protein or cells expressing it, apamine or cells expressing it, and albumin as active ingredients It is to provide a medium composition.
  • Another object of the present invention is to provide a method for obtaining organoids using the medium composition.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for enhancing or stabilizing the activity of Wnt protein in a biological sample.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object is a basal medium, a Wnt protein or a cell expressing it, apamine or a cell expressing it, and an albumin (albumin) as an active ingredient, cells, cell aggregates, tissues It relates to a medium composition for culturing fragments or organ analogs.
  • culture media refers to a medium capable of supporting cell growth and survival, and includes all conventional media used as suitable for culturing cells.
  • the culture medium of the present invention may be a serum-free medium.
  • serum-free medium refers to a medium that does not contain serum or contains only less than an effective amount so that the biological and physiological functions of serum in the culture environment can be exhibited.
  • Serum refers to serum commonly included in cell culture, such as fetal bovine serum (FBS), fetal calf serum (FCS), dialyzed fetal bovine serum, and newborn calf serum (NCS). .
  • FBS fetal bovine serum
  • FCS fetal calf serum
  • NCS newborn calf serum
  • Serum contains a wide range of high molecular proteins, low molecular nutrients, carriers for insoluble substances, hormones, etc., and is usually added to the basic medium, but the medium composition in the present invention does not contain serum or contains only less than an effective amount.
  • Wnt proteins essential for cultivation of organoids can be maintained in an active form.
  • the "Wnt protein” affects the balance between proliferation and differentiation in many cell types, and is a cysteine-rich secreted polypeptide family protein that is involved in bone formation, immune regulation, cancer, and stem cell regeneration.
  • the Wnt protein-dependent Wnt signaling pathway is important for regulating tissue and organ formation in animal cells.
  • the Wnt protein is one of the essential growth factors for organoid production. Wnt11 and Wnt16. Specifically, the Wnt protein may be a Wnt3a protein.
  • Afamin is a glycoprotein that functions as a carrier of hydrophobic molecules in body fluids, and Wnt1, Wnt2B, Wnt3, Wnt3A, Wnt5A, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8, Wnt9A, Wnt9B, Wnt10A and/or Wnt10B It is a protein essential for the activity and lysis of the lipidated Wnt family, including.
  • the lipoprotein system may be involved in transporting vitamin E under insufficient conditions or in transporting vitamin E across the blood-brain barrier (BBB).
  • AFM gene is a gene encoding human apamine (e.g., NCBI Accession No. NP_001124) or mouse apamine (NP_660128), such as NCBI Accession No. It may be a gene represented by NM_001133 and NM_145146, but is not limited thereto.
  • the present inventors first identified the fact that the combination of albumin and apamine plays a key role in maintaining the stability and activity of Wnt protein in the culture medium.
  • the Wnt protein and the apamine may be added to the medium in the form of a peptide, or may be supplied by co-culturing the cells expressing the Wnt protein and/or the apamine protein.
  • cells expressing Wnt protein refer to cells that endogenously express Wnt protein (apamine) and transfection in which the encoding nucleic acid molecule of each protein is introduced through a gene delivery system. It encompasses all cells.
  • nucleic acid molecule refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides present in a single-stranded or double-stranded form, and includes analogs of natural nucleotides unless otherwise specifically stated (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley , New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90:543-584 (1990)).
  • the term “gene delivery system” refers to a medium for introducing and expressing a desired target gene into a target cell.
  • the ideal gene delivery system should be harmless to the human body, easy to mass-produce, and be able to efficiently deliver genes.
  • gene transfer means that a gene is transported into a cell, and has the same meaning as the intracellular transduction of a gene. At the cellular and tissue level, gene transfer has the same meaning as the spread of a gene.
  • the gene delivery system of the present invention can be described as a gene penetration system and a gene diffusion system.
  • the Wnt protein and apamine When the Wnt protein and apamine are supplied in a recombinant form using their expressing cells, the two proteins may be expressed through different host cells or co-expressed in one host cell.
  • albumin is a protein contained in serum, plasma, etc., and accounts for about 55-60% of the total serum protein. Albumin is known to maintain the moisture content in the blood by attracting moisture.
  • serums include FBS and FCS, but safety issues have been pointed out as they have been reported as the cause of human mad cow disease.
  • FBS FBS
  • FCS FCS
  • Wnt protein required for organoid cultivation without serum There was a demand for the development of technology that could lead to the activity of
  • the albumin used in the present invention is serum albumin.
  • the albumin may be contained in a concentration of 0.1 mg/mL to 20 mg/mL. More specifically, the albumin may be included at a concentration of 0.3 mg/mL to 20 mg/mL, and most specifically, may be included at a concentration of 5 mg/mL to 20 mg/mL.
  • the activity of the Wnt protein increased in a concentration-dependent manner as the amount of albumin increased in the conditional medium containing Wnt3, Wnt3a, and the conditional medium containing apamine (FIGS. 1 and 2 ).
  • the activity of the Wnt protein was increased in a concentration-dependent manner (FIG. 3).
  • composition of the present invention does not contain serum such as FBS, which is an obstacle to long-term culture of organoids, the activity of Wnt protein required for organoid culture can be exhibited.
  • the medium composition of the present invention may be for enhancing the activity of Wnt protein.
  • the medium composition of the present invention shows the activity of the Wnt protein required for organoid cultivation even if the medium composition of the present invention does not contain serum, and the medium composition of the present invention may be for organoid cultivation.
  • organoid refers to a cell aggregate made by aggregation and recombination of cells isolated from stem cells or cells of organ origin through re-culture, and may include organoids or cell clusters formed from suspension cell cultures. have. For example, it may be a gastric organoid, a small intestine organoid, a colon organoid, a liver organoid, a thyroid organoid, a lung organoid, or a brain organoid, and may be applied differently depending on the tissue site.
  • obtaining organoids includes all actions capable of generating or maintaining organoids.
  • the organoid may survive, grow, or proliferate, and stem cells or cells isolated from a specific tissue may be differentiated into tissue or organ cells having a specific function.
  • basic medium is a known medium commonly used for culturing animal cells, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A medium, AmnioMax, AminoMaxII It may be one or more selected from the group consisting of complete Medium and Chang's Medium MesemCult-XF Medium, but is not limited thereto. In addition, if necessary, antibiotics such as penicillin-streptomycin, or supplements may be further added.
  • the medium composition may further include one or more selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts of epidermal growth factor (EGF), Noggin, thiazovivin, CHIR99021 and CHIR99021, and are limited thereto. It does not become.
  • EGF epidermal growth factor
  • Noggin Noggin
  • thiazovivin CHIR99021 and CHIR99021
  • CHIR99021 is a compound of the following formula 1, 6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidi Nyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile (CAS No. 252917-06-9).
  • Another aspect of the present invention relates to a method for obtaining organoids comprising culturing stem cells, a population of stem cells, cells differentiated from stem cells, or isolated tissue fragments in the medium composition of the present invention.
  • organoids may be cultured by culturing and differentiating multidifferentiated stem cells and adult stem cells, and the multidifferentiated stem cells may be embryonic stem cells or dedifferentiated stem cells.
  • the medium composition used for the organoid culture may further include one or more selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts of epidermal growth factor (EGF), Noggin, thiazovivin, CHIR99021, and CHIR99021, It is not limited to this.
  • EGF epidermal growth factor
  • Noggin Noggin
  • thiazovivin CHIR99021
  • CHIR99021 CHIR99021
  • the present invention provides a composition for enhancing the activity of Wnt protein in a biological sample comprising apamine or its expressing cells and albumin as an active ingredient.
  • biological sample is any sample including a Wnt protein or cells expressing the same, obtained from mammals including humans, and includes, but is not limited to, tissues, organs, organ analogs, cells, or a culture solution thereof. Does not.
  • enhancing the activity of Wnt protein refers to a significant increase in the amount of Wnt protein or a unique function in vivo so as to be measurable compared to the control.
  • An increase in activity includes not only an increase in function, but also an increase in ultimate activity due to an increase in stability.
  • the composition of the present invention containing apamine and albumin maintains and increases the activity as well as the amount of Wnt protein in the sample, and maintains the Wnt protein in a soluble form of the active form. It increases structural stability by blocking aggregation.
  • the term "activity enhancing composition" of the present invention may be expressed as “stability enhancing composition” or "stabilizing composition”.
  • the medium composition of the present invention can significantly increase the activity of Wnt protein without serum, and thus can be used for long-term organoid culture.
  • 1 shows the results of measuring the activity of the Wnt protein according to the concentration of bovine serum albumin (BSA) in a conditioned medium containing Wnt3a.
  • BSA bovine serum albumin
  • Figure 2 shows the results of measuring the activity of the Wnt protein according to the concentration of bovine serum albumin (BSA) in a conditioned medium containing Wnt3a and apamine.
  • BSA bovine serum albumin
  • Figure 3 is a graph showing the results of measuring the activity of the Wnt protein according to the concentration of human albumin (rhALB) in each condition medium, Wnt3a-containing condition medium ( Figure 3a) and Wnt3a and a condition medium containing apamine ( Figure 3b) shows the results respectively.
  • rhALB human albumin
  • Figures 4a and 4c are apamine and Wnt3a-expressing cells (L3a-Afa) 5mg / mL of bovine serum albumin (BSA) (-) and (+) conditions of 5 days after culturing the resulting conditional medium This is a result showing stability.
  • Figure 4a is a Western blot result showing the amount of Wnt3a protein measured after culturing the produced medium at 37 °C for 0, 24 or 48 hours
  • Figure 4c is the resulting medium cultured at 37 °C for 0, 24 or 48 hours This is a result showing the time-dependent activity change of the Wnt protein measured after the test.
  • Figure 4b is a result showing the stability of the medium produced after adding 10% fetal bovine serum (FBS) to the cells (L3a) expressing only Wnt3a and culturing for 5 days, the resulting medium was 0, 24 or 48 at 37°C. After incubation for a period of time, the amount of Wnt3a protein was measured by Western blot (left, right black line) and the time-dependent activity change of Wnt protein (right red line), respectively.
  • Figure 4d shows a total of 13 fractions obtained by culturing L3a-Afa cells for 5 days under BSA (-) and (+) conditions by sucrose gradient centrifugation, and then Wnt3a glycoproteins in each fraction This is the result of seeing sheep through Western blot.
  • FBS fetal bovine serum
  • FIG. 5 shows the results of measuring organoid formation efficiency by culturing human colon organoids using a conditional medium produced by culturing L3a-Afa cells under BSA (-) and (+) conditions for 5 days.
  • a plasmid for constructing cells expressing hAfamin was constructed.
  • pLVX-EF1a-IRES-Puro (Clontech)'s puromycin acetyltransferase gene was replaced with a blasticidin S deaminase gene to produce pLVX-EIBla.
  • the human apamine coding sequence human Afamine CDS was PCR and inserted into the plasmid.
  • a 1% agarose gel was prepared, and the samples after the reaction were dropped onto a 1% agarose gel to separate the size, and hAfamin was obtained through a gel extraction process.
  • the hAfamin fragment was digested with Xba1 restriction enzyme, and then inserted into the Xba1 restriction enzyme site of the pLVXEIBla plasmid to produce pLVX-EIBla-hAfamin plasmid.
  • the hAfamin polynucleotide is represented by SEQ ID NO: 1, and the primer pairs used in PCR are as described in Table 1 below.
  • Example 2 Construction of a lentivirus for production of hAfamin-expressing cells
  • L3a L-Wnt3a (hereinafter L3a) cells were transferred to Dr. Used by Hans Clevers (Utrecht Institute, Netherlands).
  • the L3a cells are cells designed to express Wnt3a. After culturing L3a cells to be 30% confluency in a 24-well plate, 200 ⁇ L of fresh medium and 200 ⁇ L of pLVX-EIBla-hAfamin virus were mixed and infected. After 12 hours of infection, the medium was changed, and after 72 hours, apamine-expressing cells (L3a-Afa) were selected for 1 week by treatment with 10 ug/mL of blasticidin while being transferred to a 60 mm dish. Got it.
  • Human albumin was purchased and used from Sigma (Catalog Number A9731).
  • a conditional medium containing Wnt3a by L3a cell culture and a conditional medium containing Wnt3a and apamine by L3a-Afa cell culture were obtained, respectively, and bovine serum albumin or human albumin were added at different concentrations to each conditional medium. .
  • Each of the L3a cells and L3a-Afa cells was cultured in 100 mm dishes until reaching 90%. Including DMEM/F12 medium and 10% FBS in which bovine serum albumin (BSA) was added at 0, 0.3, 1, 2, 5, 10 and 20 mg/mL after washing twice with 12 mL PBS. Each was replaced with DMEM. Thereafter, the conditional medium cultured for 5 days was rolled up, centrifuged at 1,000 rpm for 3 minutes to remove cells, and then filtered through a 0.45 ⁇ m filter.
  • BSA bovine serum albumin
  • a conditioned medium using human albumin prepared in Example 4 was prepared. Specifically, each of the L3a cells and L3a-Afa cells was cultured in a 100 mm dish until reaching 90%. After washing twice with 12 mL PBS, it was replaced with DMEM/F12 medium to which human albumin was added at 0 and 5 mg/mL. Thereafter, the conditioned medium cultured for 5 days was rolled up, centrifuged at 1,000 rpm for 3 minutes to remove cells, and then filtered through a 0.45 ⁇ m filter.
  • the activity of the Wnt protein during culture in the conditional medium prepared in Example 5-1 was measured. Specifically, a reporter assay was performed using 293-STF (ATCC) cells. 293-STF cells were plated to a 70% confluency in a 96 well plate coated with 0.05% poly-L-lysine, and the medium was replaced with 100 ⁇ L of fresh medium the next day. After that, 50 ⁇ L of conditioned medium was added. After 10-14 hours, a conventional luciferase assay was performed, and the measured Wnt protein activity was expressed as% of the activity when FBS (fetal bovine serum) was added.
  • FBS fetal bovine serum
  • the activity of the Wnt protein increased as the amount of bovine serum albumin increased.
  • bovine serum albumin was added at least 5 mg/mL, it was confirmed that the activity of the Wnt protein was markedly increased compared to the case where bovine serum albumin was not added (0 mg/mL) conditioned medium (Fig. One).
  • the activity of the Wnt protein during cultivation in the conditioned medium prepared in Example 5-2 was measured.
  • the measurement method is the same as that of Experimental Example 1-1.
  • L3a-Afa cells were cultured for 5 days under BSA (-) and (+) conditions to prepare a conditioned medium in which Wnt3a and apamine were accumulated. After incubating the prepared Wnt3a and apamine accumulation condition medium at 37° C. for 0, 24 or 48 hours, the amount of Wnt3a protein was measured through Western blot using human or mouse anti-Wnt3a or anti-Wnt3 antibody (Fig. 4a, left), the change in the amount of Wnt3a protein over time was plotted as a graph (FIG. 4a, right).
  • Human colon organoids were cultured using a conditioned medium prepared by culturing L3a-Afa cells under BSA (-) and (+) conditions for 5 days.
  • human colon organoids include N-acetylcysteine (1mM), B-27 supplement (2%), R-spondin-1 conditioned medium (10%), EGF (50ng/ml), Noggin (100ng/ml). ), nicotinamide (10mM), TGF ⁇ inhibitor (A83-01, 500nM), p38 inhibitor (10uM).
  • Adult stem cells of the large intestine were placed in a matrigel dome, and the above medium was added thereto to culture organoids.

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Abstract

본 발명은 Wnt 단백질의 활성 증진 및 오가노이드 배양을 위한 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법에 관한 것이다.

Description

Wnt 단백질 활성 증진용 배지 조성물
본 발명은 Wnt 단백질의 활성 증진 및 오가노이드 배양을 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법에 관한 것이다.
오가노이드 제작기술은 이론적으로 거의 모든 종류의 장기를 줄기세포만으로 제작할 수 있기 때문에 다양한 질병에 이용 가능할 것으로 기대되고 있다. 오가노이드는 2차원에서 만든 세포 조직보다 신약의 안전성과 효능을 시험하는데 더 효과적일 수 있으며, 훼손되거나 제대로 발달하지 못한 장기에 오가노이드를 이식해 상태를 개선하는데 활용할 수 있을 것으로 여겨진다. 이에 따라 최근 재생의학 관점에서도 오가노이드 관련 연구가 더욱 활발해지는 추세에 있으며, 여러 분야에 오가노이드를 널리 이용할 수 있을 것으로 전망되고 있다.
한편, 오가노이드 제작에 있어 필수 인자 중 하나인 Wnt 단백질은 일반적으로 보존된 Ser 잔기에 지질이 공유결합된 형태로 존재한다. Wnt 단백질은 결합되어 있는 지질로 인해 강한 소수성(hydrophobic)의 성질을 띠기 때문에 응집되어 순수한 단백질을 분리하여 사용하는데 어려움이 있어왔다. 이에 태아 소혈청(Fetal brovine serum, FBS)을 넣은 배지를 이용할 경우 안정적인 Wnt 단백질을 얻을 수 있음이 밝혀짐에 따라 오가노이드 제작에 있어 태아 소혈청을 포함하는 Wnt 단백질 을 이용해왔다.
그러나 태아 소혈청은 오가노이드 성장을 억제하는 물질을 포함하고 있어, 장기간 오가노이드를 배양할 경우에는 여전히 적합하지 않은 문제점이 있다. 이에 따라, Wnt 단백질의 활성을 유지하면서도 지속적인 성장이 가능하도록 하는 배지의 개발이 요구되고 있다. 또한, 태아 소혈청을 포함한 Wnt 생산 배지로부터 Wnt를 정제하게 되면 동물성 불순물의 오염의 피할 수 없어, 사람에게 사용할 Wnt 치료제재를 만드는데 큰 제한점이 되기 때문에, 태아 소혈청을 포함하지 않는 Wnt 생산 배지의 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 기본 배지, Wnt 단백질 또는 이의 발현 세포, 아파민(Afamin) 또는 이의 발현 세포, 및 알부민(albumin)을 유효성분으로 포함하는, 세포, 세포 응집체, 조직 단편 또는 장기 유사체의 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 배지 조성물을 이용한 오가노이드 수득 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생물학적 시료 내 Wnt 단백질의 활성 증진용 또는 안정화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 기본 배지, Wnt 단백질 또는 이의 발현 세포, 아파민(Afamin) 또는 이의 발현 세포, 및 알부민(albumin)을 유효성분으로 포함하는, 세포, 세포 응집체, 조직 단편 또는 장기 유사체의 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 “배지(culture media)”는 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있도록 하는 배지를 의미하며, 세포의 배양에 적절한 것으로 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 배양 배지는 무혈청 배지일 수 있다.
본 발명에서, “무혈청 배지”는 혈청이 포함되지 않거나 배양환경 내에서의 혈청의 생물학적 및 생리학적 기능이 발휘될 수 있을 만큼의 유효량 미만으로만 포함된 배지를 말한다. 혈청은 FBS(fetal bovine serum), FCS(fetal calf serum), 투석우태혈청(dialyzed fetal bovine serum), 신생우아혈청(newborn calf serum, NCS) 등 통상 세포 배양에 포함되는 혈청(serum)을 통칭한다. 혈청은 광범위한 고분자 단백질, 저분자 영양분, 불용성 물질들에 대한 운반체, 호르몬 등을 포함하고 있으며 통상 기본 배지에 첨가되는 경우가 많으나, 본 발명에서의 배지 조성물은 혈청을 포함하지 않거나 유효량 미만으로만 포함하고도 오가노이드 등의 배양에 필수적인 Wnt 단백질을 활성 형태로 유지할 수 있다.
본 발명에서 “Wnt 단백질”은 많은 세포 유형에서 증식 및 분화 사이의 균형에 영향을 미치며, 뼈 형성, 면역 조절, 암, 줄기 세포 재생 등에 관계있는 시스테인이 풍부한 분비되는 폴리펩타이드 계열의 단백질이다. 특히, 동물 세포에서 조직과 장기의 형성을 조정하는데 Wnt 단백질 의존적인 Wnt 신호전달 경로가 중요하다.
상기 Wnt 단백질은 오가노이드 제작에 있어 필수적인 성장인자 중 하나로서, Wnt1, Wnt2, Wnt2B, Wnt3, Wnt3A, Wnt4, Wnt5A, Wnt5B, Wnt6, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8A, Wnt8B, Wnt9A, Wnt9B, Wnt10A, Wnt10B, Wnt11 및 Wnt16을 포함한다. 구체적으로, 상기 Wnt 단백질은 Wnt3a 단백질일 수 있다.
본 발명에서 “아파민(Afamin)”은 체액 중의 소수성 분자의 운반체로서 기능하는 당단백질로, Wnt1, Wnt2B, Wnt3, Wnt3A, Wnt5A, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8, Wnt9A, Wnt9B, Wnt10A 및/또는 Wnt10B를 포함한 지질화된 Wnt 패밀리의 활성 및 용해에 필수적인 단백질이다. 그 외에도 비타민 E와 결합하여, 지질단백질 시스템이 충분하지 않은 조건에서 비타민 E를 운반하거나, 혈액-뇌 장벽(Blood-brain barrier, BBB)를 가로질러 비타민 E를 운반하는데 관여할 수 있다.
아파민을 암호화하는 유전자, AFM 유전자는 인간 아파민(e.g., NCBI Accession No. NP_001124) 또는 마우스 아파민(NP_660128) 을 암호화하는 유전자, 예컨대, NCBI Accession No. NM_001133, NM_145146 로 표현되는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 본 발명자들은 배양액 내 Wnt 단백질의 안정성과 활성 유지에 알부민과 아파민의 조합이 핵심적인 역할을 한다는 사실을 최초로 규명하였다. 본 발명의 배지에서 Wnt 단백질과 아파민은 펩타이드 형태로 배지에 첨가될 수도 있고, Wnt 단백질 및/또는 아파민 단백질을 발현하는 세포를 공배양함으로써 공급될 수도 있다.
본 명세서에서“Wnt 단백질(아파민)을 발현하는 세포”는 Wnt 단백질(아파민)을 내재적(endogenously)으로 발현하는 세포와 유전자 전달체를 통해 각 단백질의 코딩 핵산 분자가 도입된 형질 도입(transfection) 세포를 모두 포괄한다.
본 명세서에서, 용어“핵산 분자”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 명세서에서 용어 “유전자 전달체”는 원하는 타겟 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다.
본 명세서에서, 용어“유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 세포 및 조직 수준에서, 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
Wnt 단백질과 아파민이 이의 발현 세포를 이용한 재조합적 형태로 공급될 경우, 두 가지 단백질이 각각의 상이한 숙주 세포를 통해 발현될 수도 있고 하나의 숙주 세포에서 공발현(co-expression)될 수도 있다.
본 발명에서, “알부민(albumin)”은 혈청, 혈장 등에 포함되어 있는 단백질로서, 전체 혈청 단백질의 약 55-60%를 차지한다. 알부민은 수분을 끌어들이는 작용을 하여 혈액 속의 수분함량을 유지하는 것으로 알려져 있다. 현재 널리 사용되는 혈청으로는 FBS, FCS 등이 있으나, 인간 광우병 발병의 원인으로 보고된 바 있어 안전성 문제가 지적된 바 있다. 특히, 오가노이드 배양에 있어 혈청을 이용하는 경우 알부민 외 다른 성분 및 불순물에 의하여 오가노이드의 성장이 억제되어 오가노이드의 장기 배양이 불가능한 문제가 있어, 혈청을 포함하지 않으면서도 오가노이드 배양에 필요한 Wnt 단백질의 활성을 이끌어낼 수 있는 기술의 개발이 요구되었다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 알부민은 혈청 알부민(serum albumin)이다.
구체적으로, 상기 알부민은 0.1 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도로 포함되는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로 상기 알부민은 0.3 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도로 포함될 수 있으며, 가장 구체적으로 5 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도로 포함될 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 Wnt3가 포함된 조건배지, Wnt3a 및 아파민이 포함된 조건배지에서 알부민의 첨가량이 증가할수록 농도 의존적으로 Wnt 단백질의 활성이 증가하는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2). 또한, 소혈청 알부민 뿐 아니라 인간 알부민을 포함한 경우에도 농도 의존적으로 Wnt 단백질의 활성이 증가하였다(도 3).
이는 오가노이드의 장기 배양에 장애가 되는 FBS 등의 혈청을 포함하지 않더라도 본 발명의 조성물을 이용하여 오가노이드 배양에 필요한 Wnt 단백질의 활성을 나타낼 수 있음을 나타내는 것이다.
이에 따라, 상기 본 발명의 배지 조성물은 Wnt 단백질의 활성 증진용인 것일 수 있다.
또한 구체적으로, 본 발명의 배지 조성물은 혈청을 포함하지 않더라도 오가노이드 배양에 필요한 Wnt 단백질의 활성을 나타냄을 확인하였는 바, 본 발명의 배지 조성물은 오가노이드 배양용인 것일 수 있다.
본 발명에서 “오가노이드”는 줄기세포나 장기 기원 세포로부터 분리한 세포를 다시 배양을 통해 응집, 재조합하여 만들어진 세포집합체를 의미하는 것으로, 서스펜션 세포 배양물로부터 형성된 오가노이드 또는 세포 클러스터를 포함할 수 있다. 예를 들면, 위 오가노이드, 소장 오가노이드, 결장 오가노이드, 간 오가노이드, 갑상선 오가노이드, 폐 오가노이드, 또는 뇌 오가노이드 일 수 있으며, 조직 부위에 따라 달리 적용될 수 있다.
본 발명에서 “오가노이드 수득”은 오가노이드를 생성하거나 유지시킬 수 있는 모든 행위를 포함한다. 예를 들어 오가노이드를 생존, 성장 또는 증식시키는 것일 수 있으며, 줄기세포 또는 특정 조직으로부터 분리된 세포가 특정 기능을 갖는 조직이나 기관 세포로 분화시키는 것일 수 있다.
또한 구체적으로, 본 발명에서, “기본 배지”는 동물 세포의 배양에 통상적으로 사용되는 공지의 배지들로서, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium 및 Chang's Medium MesemCult-XF Medium으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 페니실린-스트렙토마이신과 같은 항생제, 또는 보충제 등이 더 첨가된 것일 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 배지 조성물은 상피 성장 인자(EGF), 노긴(Noggin), 티아조비빈, CHIR99021 및 CHIR99021의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 CHIR99021은 하기 화학식 1의 화합물로서, 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴(CAS 번호 252917-06-9)을 말한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2020010229-appb-I000001
본 발명의 다른 측면은, 상기 본 발명의 배지 조성물에서 줄기세포, 줄기세포의 집단, 줄기세포로부터 분화된 세포 또는 단리된 조직단편을 배양하는 단계를 포함하는, 오가노이드 수득 방법에 관한 것이다.
예를 들면, 다분화성 줄기세포, 성체 줄기세포를 배양 및 분화되도록 하여 오가노이드를 배양할 수 있으며, 상기 다분화성 줄기세포는 배아줄기세포 또는 역분화줄기세포일 수 있다.
상기 오가노이드 배양에 사용되는 배지 조성물은 상피 성장 인자(EGF), 노긴(Noggin), 티아조비빈, CHIR99021 및 CHIR99021의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것 은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아파민(Afamin) 또는 이의 발현 세포 및 알부민(albumin)을 유효성분으로 포함하는 생물학적 시료 내 Wnt 단백질의 활성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 아파민 및 알부민에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, Wnt 단백질 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 모든 시료로서, 조직, 기관, 기관 유사체, 세포 또는 이들의 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서,“Wnt 단백질의 활성 증진”은 대조군에 비하여 Wnt 단백질의 양 또는 생체 내 고유한 기능이 측정 가능할 정도로 유의하게 증가하는 것을 말한다. 활성(activity)의 증가는 단순한 기능(function)의 증가 뿐 아니라 안정성(stability)의 증가로 기인한 궁극적인 활성 증가를 포함한다. 후술하는 실시예에서 보는 바와 같이, 아파민과 알부민을 포함하는 본 발명의 조성물은 Wnt 단백질의 시료 내 양 뿐 아니라 그 활성을 유지 및 증가시키고 Wnt 단백질을 활성형의 가용성 형태(soluble form)로 유지하여 응집(aggregation)을 차단함으로써 구조적 안정성을 증가시킨다. 이에, 본 발명의 용어 “활성 증진용 조성물”은“안정성 증진용 조성물”또는“안정화용 조성물”로 표현될 수도 있다.
본 발명의 배지조성물은 Wnt 단백질의 활성을 혈청 없이도 현저히 증가시킬 수 있는 바, 장기간 오가노이드 배양하는데 활용할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 Wnt3a가 포함된 조건배지에서의 소혈청 알부민(BSA) 농도에 따른 Wnt단백질의 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Wnt3a 및 아파민이 포함된 조건배지에서의 소혈청 알부민(BSA) 농도에 따른 Wnt 단백질의 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 각 조건배지에서의 인간 알부민(rhALB) 농도에 따른 Wnt 단백질의 활성을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것으로, Wnt3a가 포함된 조건배지(도 3a) 및 Wnt3a 및 아파민이 포함된 조건배지(도 3b)에서의 결과를 각각 보여준다.
도 4a와 도 4c는 아파민 및 Wnt3a를 발현하는 세포(L3a-Afa)를 5mg/mL 농도의 소혈청 알부민(BSA)(-) 및 (+) 조건에서 5일간 배양한 후 생성한 조건배지의 안정도를 나타내는 결과이다. 도 4a는 생성된 배지를 37℃에서 0, 24 또는 48시간 동안 배양한 후 측정한 Wnt3a 단백질 양을 보여주는 웨스턴 블럿 결과이며, 도 4c는 생성된 배지를 37℃에서 0, 24 또는 48시간 동안 배양한 후 측정한 Wnt 단백질의 시간별 활성 변화를 보여주는 결과이다. 도 4b는 Wnt3a 만을 발현하는 세포(L3a)에 10%의 태아 소혈청(FBS)를 넣고 5일간 배양한 후 생성한 배지의 안정도를 나타내는 결과로서, 생성된 배지를 37℃에서 0, 24 또는 48 시간 동안 배양한 후 Wnt3a 단백질 양을 웨스턴 블럿으로 측정한 결과(왼쪽, 오른쪽 검은 선) 및 Wnt 단백질의 시간별 활성 변화(오른쪽 빨간 선)를 각각 보여준다. 도 4d는 L3a-Afa 세포를 BSA(-) 및 (+) 조건으로 5일간 배양하여 생성한 조건배지를 수크로스 구배 원심분리를 하여 총 13개의 분획을 얻은 후, 각각의 분획에서의 Wnt3a 당백질 양을 웨스턴 블롯을 통해 본 결과이다.
도 5는 L3a-Afa 세포를 BSA(-) 및 (+) 조건으로 5일간 배양하여 생산한 조건배지를 이용하여 인간 대장 오가노이드를 배양함으로써 오가노이드 형성 효율을 측정한 결과를 보여준다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Human Afamin(hAfamin) 발현 세포 제작을 위한 플라스미드 구축
hAfamin을 발현하는 세포를 제작하기 위한 플라스미드를 구축하였다.
먼저, pLVX-EF1a-IRES-Puro (Clontech)의 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라아제(puromycin acetyltransferase) 유전자를 블라스티시딘-S디아미나아제(Blasticidin S deaminase) 유전자로 교체하여 pLVX-EIBla를 제작하였다. 이후 인간 아파민 코딩 시퀀스(human Afamine CDS)를 PCR하여 플라스미드에 삽입하였다.
pCR-BluntII-TOPO-Afamin (MHS6278-211689548, Dharmacon)을 주형으로, 서열 2,3을 프라이머로 하여 pfu DNA polymerase(Solgent)로 증폭하였다. 준비된 PCR 기계에 샘플을 넣어 70℃ 정지(Pause), 95℃ 2 분 이후, 95℃ 20초, 50℃ 20초, 68℃ 2분 조건으로 5회 싸이클(cycle) 및 , 95℃ 20초, 60℃ 20초, 68℃ 2분 조건으로 20회 싸이클 반복 후, 68℃ 3분, 4℃ 정지 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR이 진행되는 동안 1% 아가로즈 겔(agarose gel)을 준비한 후 반응이 끝난 샘플들을 1% 아가로즈 겔에 내려 사이즈를 분리하였으며, 겔 추출(gel extraction)과정을 통해 hAfamin을 수득하였다. hAfamin 절편은 Xba1 제한효소로 절단하였으며 이후, pLVXEIBla 플라스미드의 Xba1 제한효소 자리에 삽입하여 pLVX-EIBla-hAfamin 플라스미드를 제작하였다.
hAfamin 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 나타내었으며, PCR에 사용된 프라이머 쌍은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
서열번호 프라이머 서열
2 XbaI-hAfamin U1 tctaga gccacc atgg TGAAACTACTAAAACTTACAGG
3 hAfamin -XbaI L1 tatat tctaga T TCAGTTGCCAATTTTTGGAC
실시예 2. hAfamin 발현 세포 제작을 위한 렌티바이러스 제작
HEK293T 세포를 6 웰(well) 플레이트에 4x105 cells/well의 농도로 플레이팅한 후, 24시간 후 pLVX-EIBla-hAfamin : pxPAX2(addgene 12260) : pMD2.G(addgene 12259) = 4 : 3 : 1의 비율로 총 2 μg DNA를 형질전환 시켰다. 다음날 배지를 교체한 후 48시간 동안 배양한 배지를 수집하였다. 렌티바이러스가 포함된 이 배지를 0.45 μm 필터를 통과시킨 후, 4℃에 보관하였다.
실시예 3. 아파민 발현세포(L-Wnt3a-Afamin, L3a-Afa) 제작
L-Wnt3a(이하 L3a) 세포를 Dr. Hans Clevers(위트레흐트 연구소, 네덜란드)로부터 받아서 사용하였다. 상기 L3a 세포는 Wnt3a가 발현되도록 제작된 세포이다. 24 웰(well) 플레이트에 30% 컨플루언시(confluency)가 되도록 L3a 세포를 배양한 후, 깨끗한 배지(fresh medium) 200 μL 및 pLVX-EIBla-hAfamin 바이러스 200 μL를 섞어 감염시켰다. 12시간 감염시킨 후 배지를 교체하였으며, 72시간 경과 후, 60mm 디쉬(dish)로 옮기면서 블라스티시딘(blasticidin) 10 ug/mL를 처리하여 1주일 간 선별하여 아파민 발현세포(L3a-Afa)를 얻었다.
실시예 4. 인간 알부민(human albumin)의 준비
인간 알부민(human albumin)은 Sigma에서 구입하여 사용하였다(Catalog Number A9731).
실시예 5. Conditioned media(조건배지) 제조
L3a 세포 배양에 의한 Wnt3a가 포함된 조건배지 및 L3a-Afa 세포 배양에 의한 Wnt3a 및 아파민이 포함된 조건배지를 각각 수득하였으며, 각 조건배지에는 소혈청 알부민 또는 인간 알부민이 농도를 달리하여 첨가되도록 하였다.
5-1. 소혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA)이 포함된 조건배지의 제조
L3a 세포 및 L3a-Afa 세포 각각을 100 mm 디쉬(dish)에서 90%에 이를 때까지 배양시켰다. 12 mL PBS로 2회 세척시킨 후 소혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA)을 0, 0.3, 1, 2, 5, 10 및 20 mg/mL로 각각 첨가한 DMEM/F12 배지 및 10% FBS를 포함한 DMEM로 각각 교체하였다. 이후 5일 간 배양한 조건배지를 걷어서 1,000rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 제거한 후, 0.45 μm 필터로 여과하였다.
5-2. 인간 알부민(human albumin)이 포함된 조건배지의 제조
소혈청 알부민에 포함된 불순물이 Wnt 단백질 활성에 영향을 줄 수 있는 점을 고려하여, 상기 실시예 4에서 제작한 인간 알부민을 이용한 조건배지를 제조하였다. 구체적으로, L3a 세포 및 L3a-Afa 세포 각각을 100 mm 디쉬(dish)에서 90%에 이를 때까지 배양시켰다. 12 mL PBS로 2회 세척시킨 후 인간 알부민을 0, 5 mg/mL로 첨가한 DMEM/F12 배지로 교체하였다. 이후 5일간 배양한 조건 배지(conditioned medium)를 걷어서 1,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 제거한 후, 0.45 μm필터로 여과하였다.
실험예 1. Wnt 단백질 활성 확인
1-1. 소혈청 알부민 포함 조건배지 적용시의 Wnt 단백질 활성 확인
상기 실시예 5-1에서 제조한 조건배지에서의 배양시의 Wnt 단백질의 활성을 측정하였다. 구체적으로, 293-STF (ATCC) 세포를 이용한 리포터 에세이(reporter assay)를 실시하였다. 0.05% poly-L-lysine으로 코팅한 96 웰(well) 플레이트에 293-STF 세포를 70% 컨플루언시(confluency)가 되도록 플레이팅하고, 다음날 깨끗한 배지(fresh medium) 100 μL로 배지를 교체한 후, 조건배지 50 μL를 첨가하였다. 10-14 시간 경과 후, 통상적인 루시퍼레아제 에세이(luciferase assay)를 수행하였으며, 측정한 Wnt 단백질의 활성은 FBS(fetal bovine serum)를 넣었을 때의 활성에 대한 %로 나타내었다.
그 결과, Wnt3가 포함된 조건배지를 가한 경우, 소혈청 알부민의 첨가량이 증가할수록 Wnt 단백질의 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 소혈청 알부민을 5 mg/mL 이상 첨가한 경우, 소혈청 알부민 미첨가(0 mg/mL)된 조건배지를 가한 경우에 비해 눈에 띄게 Wnt 단백질의 활성이 증가되어 있음을 확인하였다(도 1).
또한, Wnt3a 및 아파민이 포함된 조건배지를 가한 경우, Wnt3만 포함된 조건 배지에 비해 Wnt 단백질의 활성이 현저히 증가됨을 확인하였다. 특히, 소혈청 알부민까지 추가된 경우 FBS가 가해진 수준까지 Wnt 단백질의 활성이 증가되었다(도 2). 이로부터 오가노이드의 장기 배양에 장애가 되는 FBS 등의 혈청을 포함하지 않더라도 본 발명의 조성물을 이용하여 오가노이드 배양에 필요한 Wnt 단백질의 활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
1-2. 인간 알부민 포함 조건배지 적용시의 Wnt 단백질 활성 확인
상기 실시예 5-2에서 제조한 조건배지에서의 배양시의 Wnt 단백질의 활성을 측정하였다. 측정 방법은 상기 실험예 1-1의 방법과 동일하다.
그 결과, 소혈청 알부민을 첨가하였을 때와 유사하게 인간 알부민을 첨가한 배지에서 Wnt3a 단백질 활성이 증가함을 확인하였다. 나아가 아파민 및 인간 알부민을 5mg/mL을 모두 포함하는 배지에서 아파민을 포함하지 않는 배지에 비해, Wnt3a 단백질 활성이 더욱 증가된 효과를 나타내었다(도 3).
상기 결과는 소혈청 알부민 뿐 아니라, 인간 알부민을 이용할 수 있으며, 소혈청 알부민의 불순물로 인한 영향까지 배제시킴으로써 Wnt 단백질 활성을 더욱 증대시킬 수 있음을 시사한다.
실험예 2. 배지 조성에 따른 Wnt 단백질의 양 및 활성 측정
L3a-Afa 세포를 BSA(-) 및 (+) 조건으로 5일간 배양함으로써 Wnt3a와 아파민이 축적된 조건배지를 제작하였다. 상기 제작된 Wnt3a 및 아파민 축적 조건배지를 37℃에서 0, 24 또는 48시간 동안 배양 후 Wnt3a 단백질 양을 사람 혹은 쥐의 항-Wnt3a 또는 항-Wnt3 항체를 이용한 웨스턴 블럿을 통해 측정을 하였고(도 4a, 왼쪽), 시간 별 Wnt3a 단백질 양의 변화를 그래프로 도식화하였다(도 4a, 오른쪽). 그 결과, BSA(+)배지에서는 Wnt3a 양이 유지되는 반면 BSA(-) 배지에서는 배양 48시간 째에 Wnt3a 양이 50% 미만으로 감소함을 확인하였다. 이를 통해 배지 내에 아파민이 존재하더라도 알부민이 함께 존재할 경우에만 Wnt 단백질의 양이 유지됨을 알 수 있었다(도 4a).
또한 동일한 조건 배지를 사용하여 37℃에서 0, 24, 또는 48시간 동안 배양을 한 후 시간 별 Wnt 단백질 활성 변화를 TOPflash 어세이를 수행하여 측정하였다 (도 4c). 요약하면, Wnt 신호전달에 반응하는 루시퍼레이즈 발현 세포인 HEK 293 STF를 5 x 105/mL로 96웰 플레이트에 씨딩하고 24시간 동안 배양한 후, 상기 제작한 조건 배지를 넣었다. 이후 12 내지 24시간 후 루시퍼레이즈 어세이를 통해 Wnt 활성을 측정하였다. 그 결과, BSA(+)배지에서는 48시간 째에도 Wnt3a의 활성이 약 70% 수준으로 유지되는 반면 BSA(-) 배지에서는 배양 대부분의 활성이 소실됨을 확인하였다. 이를 통해 Wnt 단백질의 양 뿐 아니라 활성에 있어서도 아파민과 알부민의 조합이 필수적임을 알 수 있었다(도 4c).
아울러, Wnt 단백질의 형태를 조사하기 위해 L3a-Afa 세포를 BSA(-) 및 (+) 조건으로 5일간 배양함으로써 제작된 조건배지를 수크로스 구배 원심분리를 하고 이후 각 분획물에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 4d에서 보는 바와 같이, 알부민이 결핍된 시료에서는 Wnt 단백질이 응집되어 불활성화되는 반면(분획 13), 알부민이 존재하는 시료는 가용성의 기능적 형태(functional form)가 유지됨을 관찰하여(분획 2 내지 6), Wnt 단백질의 활성 형태 유지에 있어서도 아파민과 알부민의 조합이 중요함을 알 수 있었다.
실험예 3. 배지 조성에 따른 Wnt 단백질의 인간 오가노이드 형성 효율 측정
L3a-Afa 세포를 BSA(-) 및 (+) 조건으로 5일간 배양함으로써 제작된 조건배지를 이용하여 인간 대장 오가노이드를 배양하였다. 인간 대장 오가노이드에는 조건배지 외에 N-아세틸시스테인(1mM), B-27 보충제 (2%), R-스폰딘-1 조건배지 (10%), EGF (50ng/ml), 노긴 (100ng/ml), 니코틴아마이드(10mM), TGFβ 억제제 (A83-01, 500nM), p38 억제제(10uM)를 포함시켰다. 대장의 성체 줄기세포를 매트리젤 돔(matrigel dome)안에 넣고, 여기에 상기 배지를 첨가하여 오가노이드를 배양하였다. 대장 오가노이드는 10일에 한번씩 계대배양(passage)하게 되며, 계대배양시마다 세포수를 세어 오가노이드 형성 및 성장 효율을 측정하였다. 그 결과, BSA(+) 배지에서는 계대를 거듭하며 지속적으로 오가노이드 형성이 유지되는 반면, BSA(-) 배지에서는 조기에 성장이 중지됨을 관찰하였다. 이를 통해 아파민과 알부인의 조합에 의해 Wnt 단백질의 활성이 유지되어야만 오가노이드가 효율적으로 형성됨을 알 수 있었다 (도 5).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 기본 배지, Wnt 단백질 또는 이의 발현 세포, 아파민(Afamin) 또는 이의 발현 세포, 및 알부민(albumin)을 유효성분으로 포함하는 세포, 세포 응집체, 조직 단편 또는 장기 유사체의 배양용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Wnt 단백질은 Wnt3a 단백질인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 알부민은 0.1 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 장기 유사체는 오가노이드인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배지 조성물은 무혈청 배지 조성물인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 기본 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium 및 Chang's Medium MesemCult-XF Medium으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배지 조성물은 상피 성장 인자(EGF), 노긴(Noggin), 티아조비빈, CHIR99021 및 CHIR99021의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 배지 조성물에서 줄기세포, 줄기세포의 집단, 줄기세포로부터 분화된 세포 또는 단리된 조직단편을 배양하는 단계를 포함하는, 오가노이드 수득 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 배지 조성물은 상피 성장 인자(EGF), 노긴(Noggin), 티아조비빈, CHIR99021 및 CHIR99021의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것인, 오가노이드 수득 방법.
  10. 아파민(Afamin) 또는 이의 발현 세포 및 알부민(albumin)을 유효성분으로 포함하는 생물학적 시료 내 Wnt 단백질의 활성 증진용 조성물.
  11. 아파민(Afamin) 또는 이의 발현 세포 및 알부민(albumin)을 유효성분으로 포함하는 생물학적 시료 내 Wnt 단백질의 안정화용 조성물.
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