ES2974643T3 - Un éter poliglicidílico de poliglicerol hiperramificado y su uso como reticulante de polisacáridos - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un éter poliglicidílico de poliglicerol hiperramificado que tiene un peso molecular de 750 a 15.000 Da; y un peso equivalente de epoxi de 183 a 7.000 g/eq. También se refiere a un polisacárido reticulado que se puede obtener reticulando el polisacárido con el éter poliglicidílico de poliglicerol hiperramificado. La presente invención también se refiere a procesos para su preparación y sus usos en el campo terapéutico, cosmético, agrícola y alimentario. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Un éter poliglicidílico de poliglicerol hiperramificado y su uso como reticulante de polisacáridos
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente europea 19200803.5 presentada el 1 de octubre de 2019.
La presente invención se refiere a un éter poliglicidílico de poliglicerol hiperramificado. En particular, a éter poliglicidílico de poliglicerol hiperramificado que tiene un peso molecular de 750 a 15.000 Da; y un peso equivalente de epoxi de 183 a 7.000 g/eq. También se refiere a un polisacárido reticulado obtenible mediante reticulación del polisacárido con el éter poliglicidílico de poliglicerol hiperramificado, un procedimiento para su preparación y sus usos en las industrias alimentaria, farmacéutica, cosmética y agrícola.
Estado de la técnica
Los hidratos de carbono también conocidos como polisacáridos son las biomoléculas más abundantes, de fácil acceso, baratas y recursos renovables en la tierra, con una tasa de formación anual que supera la tasa de producción mundial de polímeros sintéticos en varios órdenes de magnitud. Son materiales sostenibles sintetizados por la energía del sol y totalmente biodegradables. Los polisacáridos están presentes en todos los organismos vivos y están diseñados por la naturaleza para llevar a cabo diversas funciones específicas. Además de sus usos potenciales como materias primas químicas clave y producción de energía, se ha reconocido que los polisacáridos desempeñan una función clave en una amplia variedad de procedimientos biológicos complejos. Están implicados en gran medida en la mediación de procedimientos de reconocimiento a través de sus interacciones con proteínas y otras entidades biológicas; y procedimientos de reconocimiento celular, incluyendo la regulación del crecimiento celular, la diferenciación, la adhesión, la metástasis de células cancerosas, el tráfico celular, la inflamación por bacterias y virus y la respuesta inmunitaria.
Uno de los polisacáridos más conocidos es la celulosa. La celulosa es un componente de al menos un tercio de las plantas avanzadas y, por lo tanto, es sin duda el compuesto orgánico reproducible de origen natural más abundante. En su forma más sencilla, la celulosa está compuesta por cadenas de glucano con enlaces p-1,4 que pueden disponerse de diferentes formas dando lugar a diferentes formas de celulosa. Su estructura química corresponde a la siguiente fórmula:
En la naturaleza, la celulosa se produce de manera jerárquica asociándose las cadenas de glucano entre sí para formar regiones cristalinas y no cristalinas que se ensamblan en estructuras de orden superior tales como la microfibrilla. La celulosa se obtiene en general como la forma cristalina de celulosa I en la que las cadenas de glucano están alineadas paralelas entre sí. Se ha mostrado que dos formas del polímero cristalino nativo, celulosa, la y lp, están presentes en diferentes cantidades obtenidas de diferentes fuentes.
En particular, la carboximetilcelulosa de sodio (NaCMC) se define como la sal de sodio de un éter carboximetílico de celulosa obtenida directamente de cepas naturales de material vegetal fibroso. La molécula de NaCMC es un polímero con una base de unidades de p-D-glucosa, cuyos grupos hidroxilo libres están parcialmente sustituidos por grupos carboximetilo. Su estructura química corresponde a la siguiente fórmula, en donde R es H o CH<2>CO<2>Na:
El derivado de celulosa NaCMC se utilizó por primera vez como sustituto del almidón y gomas naturales. Se utilizan grandes volúmenes de este derivado de celulosa en papel, procesamiento textil, detergentes, fluidos de perforación y revestimientos protectores. La calidad purificada, conocida como goma de celulosa, se usa ampliamente en las industrias alimentaria, farmacéutica y cosmética.
Otro polisacárido utilizado habitualmente es el almidón, que es abundante y de origen natural. Se encuentra en las hojas de todas las plantas verdes y en las semillas, los frutos, los tallos, las raíces y los tubérculos de la mayoría de las plantas. La mayoría de los almidones se componen de dos tipos de polisacáridos, un glucano con enlace a -(1^4) lineal, denominado amilosa, y un glucano con enlace a-(1^4) con 4,2 a 5,9 % de enlaces de ramificación a-(1^6), denominado amilopectina. La estructura química de las unidades de amilosa y amilopectina corresponden a las siguientes fórmulas respectivamente:
amilopectina
El almidón se produce como un producto final de la fotosíntesis y actúa como la forma de almacenamiento químico de la energía del sol en la Tierra. Se estima que el 60-70 % de la ingesta calórica de los seres humanos proviene del almidón. Todos los almidones se almacenan en las plantas como partículas o pellets insolubles en agua en los cloroplastos de las hojas y en los amiloplastos de otros tejidos vegetales. Los pellets son partículas relativamente densas de moléculas compactas, con propiedades semicristalinas.
La categoría principal de enzimas que hidrolizan los enlaces a -(1^4) del almidón son las a-amilasas. Estas enzimas son ubicuas y son producidas por bacterias, hongos, plantas y animales. En mamíferos, existen dos fuentes específicas, las glándulas salivales que secretan la enzima en la boca y el páncreas que secreta la enzima en el intestino delgado. Las a-amilasas son enzimas endoactivas que atacan las partes interiores de las cadenas de almidón polimérico, produciendo un descenso rápido de la viscosidad. Debido a estas propiedades, se denominan en ocasiones enzimas licuantes. Cuando las a-amilasas encuentran una cadena de almidón e hidrolizan un enlace a-(1^4), también producen maltodextrinas de bajo peso molecular mediante un procedimiento denominado ataque múltiple en una de las dos cadenas que se escindieron inicialmente. El almidón es un ingrediente habitual que se utiliza ampliamente en muchas aplicaciones alimentarias y no alimentarias. Sin embargo, la aplicación de almidones nativos está con frecuencia limitada debido a deficiencias en sus propiedades fisicoquímicas, tales como baja resistencia al cizallamiento y estabilidad térmica, descomposición térmica y alta tendencia a la retrogradación.
El almidón se utiliza como aditivo para el procesamiento de alimentos, los almidones alimentarios se utilizan normalmente en alimentos como espesantes, extensores, estabilizadores de emulsión y son aglutinantes excepcionales en carnes procesadas. En la industria farmacéutica, el almidón también se usa como excipiente, como disgregante de comprimidos, como aglutinante y expansor del volumen plasmático. El almidón se puede modificar químicamente para permitir que actúe correctamente en las condiciones que se encuentran con frecuencia durante el procesamiento o el almacenamiento, tales como calor alto, alto cizallamiento, pH bajo, congelación/descongelación y enfriamiento. El almidón resistente es un tipo de almidón que escapa a la digestión en el intestino delgado de individuos sanos. Se utiliza como fibra dietética insoluble en alimentos procesados y como complemento dietético por sus beneficios para la salud. El almidón resistente ayuda a mejorar la sensibilidad a la insulina, aumenta la saciedad y mejora los marcadores de la función colónica.
Asimismo, otro polisacárido ramificado es el glucógeno, que es un polisacárido de glucosa multirramificado que actúa como forma de almacenamiento de energía en animales, hongos y bacterias. La estructura del polisacárido representa la principal forma de almacenamiento de glucosa en el cuerpo, el glucógeno es el análogo del almidón, con una estructura como la amilopectina, pero más ampliamente ramificado y compacto.
Por último, el ácido hialurónico (HA), también denominado hialuronano o hialuronato de sodio es un glucosaminoglucano aniónico no sulfatado (GAG). HA es un polisacárido lineal de alto peso molecular que consiste en monómeros repetidos de ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina, unidos mediante enlaces glucosídicos alternos p-( 1 —^ 4) y p-(1 —»3). Su estructura química corresponde a la siguiente fórmula:
HA se distribuye ampliamente por todo el cuerpo humano, es un componente de tejidos conjuntivos, epiteliales y neuronales y forma un elemento principal en la matriz extracelular (MEC), incluyendo la MEC del cerebro, donde su deficiencia o ausencia puede ser la causa de trastornos epilépticos. Está presente en casi todos los líquidos biológicos, incluyendo el líquido sinovial y el humor vítreo del ojo. Actúa como lubricante y amortiguador, en particular, en las articulaciones, evitando el daño celular inducido por la tensión física a la que están constantemente sometidos los cartílagos, ayudando a mantenerlos sanos. La mayor cantidad de HA se encuentra en la piel, que contiene más del 50 % del contenido total dentro del cuerpo. En estado normal, HA está presente como polímero libre, sin embargo, en algunos tejidos, está ligado a diferentes proteínas para dar proteoglucanos o a receptores celulares específicos.
La función principal de HA es crear volumen y proporcionar lubricantes a los tejidos, manteniendo un espacio extracelular abierto, hidratado y estable en el que las células y otros componentes de la MEC, tales como fibras de colágeno y elastina se mantienen de manera firme. El HA también está implicado en la actividad celular, donde es responsable de la regulación de la adhesión celular, la migración celular y la proliferación celular. En particular, el HA de alto peso molecular presenta propiedades anti-angiogénicas y antiinflamatorias, mientras que los fragmentos de bajo peso molecular (<100 kDa) tienen la actividad biológica opuesta; son inflamatorios, inmunoestimulantes y angiogénicos. Se han descrito ampliamente las funciones de HA y fragmentos de HA en la cicatrización de heridas, así como en el crecimiento tumoral y la proliferación del cáncer, durante los cuales se sobreexpresan receptores de células CD44. Debido a las propiedades biológicas únicas de HA que son muy similares a las de los tejidos humanos, ha atraído gran atención e interés a lo largo de los años. Estas propiedades han permitido que el HA se utilice en diferentes aplicaciones biomédicas tales como la cicatrización de heridas, lubricante en osteoartritis, aumento de tejido y como vehículo para sistemas de liberación de fármacos. Sin embargo, el HA nativo tiene aplicaciones muy limitadas debido a sus malas propiedades mecánicas y rápida degradaciónin vivo.
Se ha descrito en el estado de la técnica que los polisacáridos pueden degradarse ampliamente. La degradación de polisacáridos, y en particular HA, puede verse como un procedimiento de despolimerización que está mediado por la escisión de enlaces glucosídicos; lo que implica principalmente dos mecanismos: la degradación enzimática (selectiva y muy rápida promovida por las enzimas específicas hialuronidasas); y la degradación oxidativa (no selectiva y menos rápida promovida por radicales libres (ERO) y actividades enzimáticas prooxidantes que podrían estar presentes durante la inflamación de los tejidos). Asimismo, además de los mecanismos antes mencionados, siempre existe un mecanismo de degradación hidrolítica no selectiva debido al agua y los electrolitos en los tejidos.
En particular, se supone que la degradación de HA es un procedimiento muy organizado y estrictamente controlado para generar fragmentos de HA de tamaño definido con precisión para la función biológica deseada. HYAL1 y HYAL2 son las hialuronidasas más ampliamente expresadas. HYAL2 (anclado en la membrana celular) escinde HA de alto peso molecular (>1 MDa) en fragmentos de 20 kDa y HYAL1 (que se encuentra en lisosomas) posteriormente escinde estos fragmentos adicionalmente en tetrasacáridos, que después se convierten en monosacáridos por varias enzimas de la familia de las hialuronidasas (p. ej., p-glucuronidasa, p-N-acetilglucosaminidasa). Debido a que estos productos de degradación son nativos del cuerpo humano, siguen el procedimiento de eliminación natural. Como se ha mencionado anteriormente, el HA también puede degradarse de forma natural en el organismo mediante especies reactivas de oxígeno (ERO). El mecanismo de degradación de HA difiere según las ERO implicadas. Independientemente de la magnitud, la alteración del entorno tisular puede activar el sistema inmunitario del cuerpo, lo que conduce a una reacción inflamatoria transitoria. La lesión mecánica del tejido provocada por la penetración de una aguja durante la inyección de relleno también puede conducir a una reacción de este tipo. Debido a los mecanismos de degradación mencionados anteriormente, el recambioin vivodespués de la inyección de polisacáridos nativos es muy corto, tal como el ácido hialurónico que es menor de 24 horas, dependiendo de la actividad enzimática específica del tejido en el que se implanta. Su duraciónin vivoy, en consecuencia, su efecto terapéutico, sin embargo, pueden reducirse adicionalmente después de la degradación por tensión oxidativa, debido a la presencia de ERO y enzimas proinflamatorias.
Para superar estos inconvenientes en relación con la estabilidad y biocompatibilidad de los polisacáridos, y en particular HA, se han descrito varias estrategias para modular las propiedades físicas y mecánicas de los polisacáridos para aumentar la semividain vivodel HA.
Una de estas estrategias implica la preparación de polisacáridos reticulados tales como HA reticulado que tiene una estabilidad mejorada y un tiempo de residencia más largo (es decir, una tasa de degradación menor). Se han desarrollado varios métodos en el estado de la técnica para producir polisacárido reticulado y, en particular, HA reticulado. El HA reticulado resultante es un hidrogel de<H a>reticulado que tiene una estructura de red tridimensional (3D) formada por enlaces reticulados covalentes que retiene el agua dentro de su red pero no se disuelve en agua.
Los hidrogeles químicamente reticulados son materiales estables y muestran mayor resistencia contra la degradación enzimática que el HA nativo, debido a la formación de puentes y enlaces intermoleculares entre las cadenas de HA y el reticulante. Además, esta estructura tridimensional también puede contribuir a la resistencia frente a la degradación oxidativa debido a su actividad antiinflamatoria (polioles). Los hidrogeles de HA reticulado mencionados anteriormente que tienen la modificación de los grupos hidroxilo permiten su uso para el desarrollo de rellenos dérmicos. En esta línea, se han descrito en el estado de la técnica varios reticulantes químicos como reticulantes adecuados para la preparación de polisacáridos reticulados, incluyendo metacrilamida, hidrazida, carbodiimida (EDC), divinil sulfona (DVS), epiclorhidrina y algunos compuestos diepoxi y éteres diglicidílicos tales como 1,2,7,8 diepoxioctano, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (BDDE), éter diglicidílico de poli (etilenglicol) (PEGDE) y éter diglicidílico de glicerol (GDE).
Se conoce en el estado de la técnica que se prefieren polisacáridos reticulados (tales como hidrogeles de HA reticulados) con grados mayores de reticulación debido a su mayor longevidad y resistencia mecánicain vivo.El hidrogel de HA reticulado más fuerte también puede proporcionar la fuerza adecuada para levantar los tejidos y resistir la deformación posterior. Sin embargo, desde una perspectiva de salud, la incorporación de altos contenidos de reticulantes químicos en la modificación de HA no es factible. Las cantidades excesivas de reticulantes son con frecuencia tóxicas para las células y los tejidos con los que el hidrogel está en contacto después de la implantación. Además, una cantidad excesiva de reticulante tóxico puede interferir con la diferenciación y proliferación de las células y, por otra parte, puede producir reacciones no deseadas con otros ingredientes bioactivos incorporados en la matriz de hidrogel durante su fabricación (polioles libres, antioxidantes, aminoácidos, tampones, anestésicos, fármacos, etc.).
La divinil sulfona, (DVS) era el agente reticulante utilizado para la reticulación de la mayoría de los rellenos dérmicos en el mercado antes de la introducción del BDDE y actualmente todavía se utiliza en algunos productos comerciales. Su capacidad como agente de reticulación se atribuye a la reactividad de los grupos vinilo activados presentes en los dos extremos de la molécula. La reacción tiene lugar por adición en el doble enlace vinílico del grupo hidroxilo, con carga negativa en un ambiente alcalino (nucleófilo), presente en la cadena de polisacárido con la consiguiente formación de un enlace éter. La reacción es una adición nucleófila y no se libera ninguna molécula o grupo después de la reacción química. Sin embargo, los rellenos dérmicos de ácido hialurónico reticulado DVS han mostrado algunos problemas de degradación enzimática, probablemente relacionados con la presencia de los grupos sulfónicos que actúan como inhibidores enzimáticos, por lo tanto, los rellenos son difíciles de eliminar mediante inyección de hialuronidasa en caso de reacciones adversas después de la implantación. En consecuencia, el DVS se abandonó gradualmente en favor de otros reticulantes tales como el BDDE. Asimismo, el DVS es una molécula extraña, de origen sintético y con un grado determinado de toxicidad superior incluso al BDDE, es muy volátil e irritante, y esto lo hace problemático incluso para los fabricantes de rellenos dérmicos.
El éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (BDDE) y su reacción con HA se han descrito en el estado de la técnica. En particular, la solución de HA se mezcló con BDDE en condiciones alcalinas y se formó un enlace éter. Esta reacción implica un procedimiento de apertura del anillo epoxi y se lleva a cabo en un medio alcalino, donde el anillo epoxi reacciona preferentemente con el grupo hidroxilo para formar enlaces éter. El BDDE se utiliza habitualmente para la preparación de rellenos dérmicos a base de HA disponibles actualmente en el mercado.
Su capacidad de reticulación se atribuye a la reactividad de los grupos epoxi presentes en los dos extremos de la molécula. Aunque se ha descubierto que el BDDE sin reaccionar es mutagénico en el organismo modelo Drosophila, no se ha observado un efecto cancerígeno definitivo en ratones. A pesar de esto, y debido a su potencial mutagénico, la cantidad de BDDE sin reaccionar en los rellenos dérmicos debe mantenerse en trazas (es decir, nivel residual). Se ha determinado que este nivel de trazas es seguro después de una evaluación de riesgos de seguridad de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA). Por otro lado, el BDDE hidrolizado es un diol-éter resultante de la hidrólisis de los grupos epóxido en el BDDE o de la escisión hidrolítica del BDDE reticulado. Sin embargo, el metabolismo del BDDE hidrolizado no está descrito en el estado de la técnica, se entiende que se desarrolla a través de la escisión del enlace éter por una familia de enzimas denominadas citocromos P450. Por el contrario, tanto el BDDE nativo como el butanodiol metabolizado son moléculas extrañas, de origen sintético (petróleo) y con un grado determinado de toxicidad.
Por lo tanto, debido a la toxicidad potencial del BDDE y sus moléculas derivadas metabolizadas, así como el estricto control regulador de la cantidad de BDDE, BDDE también se ha sustituido gradualmente por otros reticulantes de seguridad.
Con el fin de proporcionar reticulantes de seguridad para la preparación de polisacáridos reticulados de seguridad que tengan propiedades físicas y químicas mejoradas, varios estudios han descrito el uso de éter diglicidílico de glicerol (g De ). GDE es un éter glicidílico bis-sustituido de glicerol. En particular, la estructura química de GDE puede corresponder al 1,3-GDE y al 1,2-GDE como se muestra en las siguientes fórmulas:
Sin embargo, en el estado de la técnica, GDE ha sido denominado erróneamente "éter poliglicidílico de poliglicerol" o "éter diglicidílico de poliglicerol" (PPE) debido a la indeterminación de su estructura química, que está disponible con frecuencia en el mercado como una mezcla del éter glicidílico bis-sustituido de glicerol con el éter glicidílico mono- e incluso tri-sustituido de glicerol.
El uso de GDE es especialmente ventajoso porque el glicerol es una molécula endógena presente de forma natural en todos los tejidos humanos, tanto en forma libre en circulación como ligado en forma de triglicéridos en tejidos adiposos o fosfolípidos de la membrana celular. De hecho, el glicerol participa en los procedimientos metabólicos y catabólicos del cuerpo y es, por lo tanto, una molécula segura. Por lo tanto, a pesar de DVS y BDDE, la presencia de GDE y/o su principal producto de degradación (glicerol) no implica posibles problemas de toxicidad. Sin embargo, el principal problema del uso de GDE es que para reducir la tasa de degradación de los polisacáridos reticulados con GDE resultantes es necesario un alto contenido de reticulante.
Sin embargo, los polisacáridos reticulados que tienen un alto grado de reticulación presentan unas propiedades de flujo deficientes inadecuadas, debido al aporte de elasticidad además de la viscosidad y, por lo tanto, son difíciles de extruir a través de agujas finas, especialmente cuando se utilizan en aplicaciones inyectables (rellenos para estética, tratamiento de la osteoartritis, etc.). De hecho, se ha informado en el estado de la técnica de diversas complicaciones y efectos secundarios relacionados con los reticulantes químicos utilizados en la estabilización de HA, en particular para los rellenos de HA tratados con cantidades excesivas de reticulantes, tales como dolor indeseable en pacientes después de la aplicación y manejo deficiente para los médicos. Se cree que todos los efectos secundarios o reacciones alérgicas producidos por los rellenos a base de HA están provocados por los reticulantes, tanto sin retirar durante la fabricación como liberados posteriormentein vivodespués de la hidrolización de hidrogel.
Por tanto, este campo de estudio está recibiendo en la actualidad una atención considerable y se ha convertido en uno de los principales desafíos en la fabricación de hidrogeles (es decir, polisacáridos reticulantes). Sin embargo, cuando se reduce una cantidad de reticulante y, en consecuencia, se reduce el grado de reticulación, las propiedades mecánicas y/o la resistencia a la degradación se han visto comprometidas. Asimismo, debido a problemas relacionados con la cinética de las reacciones químicas, el bajo nivel de reticulante puede no completar cuantitativamente la reacción química en un tiempo razonable, lo que conduce a un injerto solo sin reticulación efectiva del polímero o, lo que es peor, dejando grandes cantidades de reticulante libre sin reaccionar en el hidrogel, que es difícil de eliminar y conduce a material de alta toxicidad, reduciendo la seguridad del producto para el paciente.
Por lo tanto, a partir de lo que se conoce en la técnica, todavía existe la necesidad de proporcionar polisacáridos reticulados de seguridad que tengan tanto una baja cantidad de reticulante como un bajo grado de reticulación con adecuada resistencia a la degradación mecánica y enzimática/oxidativa.
Resumen de la invención
Los inventores de la presente invención han proporcionado sorprendentemente un polisacárido reticulado seguro que tiene propiedades mecánicas adecuadas, baja tasa de degradación enzimática/oxidativa y biocompatibilidad adecuada para su uso en aplicacionesin vivo.
En particular, los inventores han encontrado que el éter diglicidílico de poliglicerol hiperramificado (PPE) de la invención que tiene un peso molecular de 750 a 15.000 Da; y un peso equivalente de epoxi de 183 a 7.500 g/eq es útil como agente de reticulación capaz de reaccionar con los grupos hidroxilo del polisacárido y permitir la preparación del polisacárido reticulado de la invención que tiene un bajo grado de reticulación; propiedades mecánicas y tasa de degradación adecuadas y siendo al mismo tiempo seguro para su aplicación en la piel.
Sin quedar ligados a teoría alguna, los inventores atribuyen las propiedades mecánicas y la resistencia a la degradación de los polisacáridos reticulados del PPE de la presente invención a un efecto de combinación de la estructura y cantidad del PPE hiperramificado de la presente invención, junto con sus propiedades cohesivas derivadas de interacciones covalentes y no covalentes entre el polisacárido y el PPE hiperramificado de la invención. La interacción del PPE hiperramificado de la invención con el polisacárido crea una densa red de HA tridimensional que mantiene intacta la matriz de hidrogel y limita la capacidad de la enzima para infiltrarse en el implante y degradar la red de HA tridimensional incluso con un bajo grado de reticulación.
El PPE hiperramificado de la invención se prepara mediante un procedimiento que comprende una etapa de autopolimerización del material de partida (es decir, GDE o PPE no hiperramificado). La etapa de autopolimerización implica someter el GDE o PPE no hiperramificado en tales condiciones de reacción de temperatura y tiempo que permitan tener el peso molecular y el peso equivalente de epoxi adecuados como se define en la presente invención.
Por último, los polisacáridos reticulados con PPE de la presente invención presentan buenas propiedades de flujo y, por lo tanto, son fáciles de manipular y extruir a través de agujas finas, especialmente cuando se usan en aplicaciones inyectables. Además, la inyección de los polisacáridos reticulados con PPE de la presente invención hace que los pacientes tengan una percepción de dolor baja o nula durante y después de su aplicación.
Entonces, la presente invención proporciona un hidrogel a base de polisacárido con un grado bajo de reticulación, con baja modificación química y, por lo tanto, molecular y estructuralmente muy similar al polisacárido nativo con las ventajas de un alto perfil de biocompatibilidad y seguridad. Sorprendentemente, incluso con baja reticulación, el hidrogel a base de polisacárido presenta propiedades mecánicas adecuadas y resistencia a la degradación enzimática y oxidativa con un alto grado de reticulación, con la ventaja de una alta longevidadin vivo.
Por tanto, el primer aspecto de la invención se refiere a un compuesto PPE hiperramificado de fórmula (I),
o, como alternativa,
<un compuesto de fórmula (II)>
en donde
cada R<1>se selecciona de manera independiente del grupo que consiste en R<2>y R<3>; R<2>es
R<3>es
b es un número entero seleccionado del grupo que consiste en 1 a 70; c es un número entero seleccionado del grupo que consiste en 1 a 70; d es un número entero seleccionado del grupo que consiste en 1 a 70; que tiene<un peso molecular (Pm) de 750 a 15.000 Da medido por el método de cromatografía líquida; y un peso>equivalente de epoxi de 183 a 7.000 g/eq medido por titulación rápida asistida por ultrasonidos con HCl.
El segundo aspecto de la invención se refiere a un polisacárido reticulado de fórmula (III)
o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV)
En donde: cada R<1>se selecciona de manera independiente del grupo que consiste en R<2>, R<3>, R<4>y R<5>;
R<2>es
R3 es
R<5>es
PS es un polisacárido; y el polisacárido reticulado tiene un porcentaje de reticulación de 0,077 a 0,450 %; en particular del 0,077 al 0,269 %.
El tercer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un compuesto (I) o, como alternativa, de un compuesto de fórmula (II) del primer aspecto de la invención; en donde: cuando el compuesto es un compuesto de fórmula (I), entonces el procedimiento comprende: a) proporcionar una solución alcalina que contiene éter diglicidílico de 1,3-glicerol; y b) mantener la solución obtenida en la etapa a) a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días; o, como alternativa, cuando el compuesto es un compuesto de fórmula (II), entonces el procedimiento comprende: c) proporcionar una solución alcalina que contiene éter diglicidílico de 1,2-glicerol; y d) mantener la solución obtenida en la etapa c) a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días.
El cuarto aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la preparación del polisacárido reticulado del segundo aspecto de la invención, que comprende reticular el polisacárido con un compuesto de fórmula (I); o, como alternativa, con un compuesto de fórmula (II) como se define en el primer aspecto de la invención.
El quinto aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende uno o más de los polisacáridos reticulados del segundo aspecto de la invención.
El sexto aspecto de la invención se refiere al uso del PPE hiperramificado del primer aspecto de la invención como agente de reticulación.
Y, por último, el uso del polisacárido reticulado del segundo aspecto de la invención en el campo de la farmacia, cosmética, alimentación y agricultura.
En particular, es parte de la invención un polisacárido reticulado como se define en el segundo aspecto de la invención en donde el polisacárido es ácido hialurónico para su uso en terapia. Y, el uso de un polisacárido reticulado como se define en el segundo aspecto de la invención en donde el polisacárido es ácido hialurónico como relleno dérmico.
Descripción detallada de la invención
Todos los términos y expresiones como se usan en la presente solicitud, a menos que se indique lo contrario, se entenderán en su significado habitual, como es conocido en la técnica. Otras definiciones más específicas de términos y expresiones como se usan en la presente solicitud son como se exponen a continuación y tienen por objeto aplicarse de manera uniforme a lo largo de la descripción y las reivindicaciones a menos que una definición expresamente establecida de otro modo proporcione una definición más amplia.
Para los fines de la presente invención, cualquier intervalo dado incluye los puntos finales tanto inferior como superior del intervalo. Los intervalos dados, tales como temperaturas, tiempos, pesos y similares, deben considerarse aproximados, a menos que se indique específicamente.
La expresión "porcentaje (%) en peso" se refiere al porcentaje de cada grupo o cada ingrediente en relación con el peso total.
Como se ha descrito anteriormente, el primer aspecto de la presente invención es un compuesto de fórmula (I); o, como alternativa, un compuesto de fórmula (II).
El compuesto de fórmula (I) se obtiene sometiendo el 1,3-GDE o un PPE no hiperramificado obtenido a partir de 1,3-GDE a la etapa de autopolimerización como se define en el procedimiento de la invención. Como alternativa, el compuesto de fórmula (II) se obtiene sometiendo el 1,2-GDE o un PPE no hiperramificado obtenido a partir de 1,2-GDE a la etapa de autopolimerización como se define en el procedimiento de la invención.
Para el fin de la invención, el PPE descrito en el estado de la técnica es un PPE ramificado pero no un PPE hiperramificado. El PPE ramificado del estado de la técnica se prepara mediante reacción de glicerol y epiclorhidrina, cuyo peso molecular se puede ajustar aumentando la cantidad de epiclorhidrina. Sin embargo, esos procedimientos no comprenden una etapa de autopolimerización como el procedimiento de la presente invención. Como resultado, el PPE ramificado del estado de la técnica (disponible en el mercado con el nombre comercial Denacol®) es estructuralmente diferente del PPE hiperramificado de la presente invención. En particular, las estructuras del PPE ramificado descrito en el estado de la técnica, que quedan fuera del alcance de la presente invención son las siguientes:
El compuesto de fórmula (I) o, como alternativa, el compuesto de fórmula (II) tiene un peso molecular de 750 a 15.000 Da medido por cromatografía líquida; y un peso equivalente de epoxi de 183 a 7.500 g/eq medido por titulación rápida asistida por ultrasonidos con HCl.
La expresión "peso equivalente de epoxi", "PEE promedio" y la abreviatura "PEE" tienen el mismo significado y se usan indistintamente. El PEE es el peso del agente reticulante, en gramos, que contiene el equivalente a un gramo de epoxi. PEE se refiere al contenido de grupos epoxi presentes en un gramo de los agentes reticulantes descritos en la presente invención y expresado en g/eq. El PEE se midió experimentalmente utilizando la titulación cuantitativa asistida por ultrasonidos con HCl para la determinación rápida de epóxidos descritos en el estado de la técnica (He, Z.,et al.,"Ultrasonication-assisted rapid determination of epoxide values in polymer mixtures containing epoxy resin". Analytical Methods, 2014, vol. 6 (12), págs. 4257-4261).
La medición del peso molecular y del índice de polidispersidad se realizó mediante cromatografía líquida, en particular utilizando un instrumento GPC equipado con detector de dispersión de luz.
En una realización, el compuesto de fórmula (I) o, como alternativa, el compuesto de fórmula (II) tiene un peso molecular de 800 a 7.000 Da por cromatografía líquida; y un peso equivalente de epoxi de 195 a 700 g/eq medido por titulación rápida asistida por ultrasonidos con HCl. En una realización, el compuesto de fórmula (I) o, como alternativa, el compuesto de fórmula (II) tiene un peso molecular de 900 a 4.500 Da por cromatografía líquida; y un peso equivalente de epoxi de 200 a 600 g/eq medido, mediante titulación rápida asistida por ultrasonidos con HCl.
En una realización, el compuesto de fórmula (I) o, como alternativa, el compuesto de fórmula (II) tiene un índice de polidispersidad igual a o menor de 1,8 medido por cromatografía líquida. En una realización, el compuesto de fórmula (I) o, como alternativa, el compuesto de fórmula (II) tiene un índice de polidispersidad igual a o menor de 1,6 medido por cromatografía líquida, en particular utilizando un instrumento GPC equipado con detector de dispersión de luz.
La expresión "índice de polidispersidad", "índice de heterogeneidad" y "dispersión" tienen el mismo significado y se utilizan indistintamente. Se refieren a una medida de la heterogeneidad de tamaños de moléculas o partículas en una mezcla, en particular la distribución de la masa molecular en una muestra polimérica dada. Está representado por el símboloD.Para el fin de la presente invención, el índice de polidispersidad se refiere a la masa molecular, que se puede calcular usando la siguiente ecuación
D<m>= P<m>/M<n>
donde P<m>es la masa molar promedio en peso y M<n>es la masa molar promedio en número.
Las expresiones "peso molecular", "peso molecular promedio", "masa molar promedio en peso", "masa molar promedio en masa", "Pm promedio" y la abreviatura "P<m>" tienen el mismo significado y se utilizan indistintamente. La masa molar promedio en masa se calcula mediante la siguiente ecuación:
dondeN¡es el número de moléculas con masa molecularM¡.La masa molecular promedio en masa se puede determinar mediante dispersión de luz estática, dispersión de neutrones en ángulo pequeño, dispersión por rayos X y velocidad de sedimentación.
Las expresiones "masa molar promedio en número" y la abreviatura "Mn" tienen el mismo significado y se usan indistintamente. Mn es una manera de determinar la masa molecular de un polímero. Las moléculas poliméricas, tales como polisacáridos, incluso los del mismo tipo, tienen diferentes tamaños (longitudes de cadena, para polímeros lineales), por lo que la masa molecular promedio dependerá del método de promediación. La masa molecular promedio en número es la media aritmética habitual o promedio de las masas moleculares de las macromoléculas individuales. Se determina midiendo la masa molecular de n moléculas poliméricas, sumando las masas y dividiendo por n. Mn se calcula mediante la siguiente ecuación:
dondeNies el número de moléculas con masa molecularMi. La masa molecular promedio en número de un polímero puede determinarse mediante cromatografía de permeación en gel, viscosimetría mediante la (Ecuación de Mark-Houwink), métodos coligativos tales como osmometría de presión de vapor, determinación de grupos terminales o RMN de protones.
Los fragmentos del polímero con diferente peso molecular pueden separarse previamente mediante cromatografía líquida utilizando un instrumento GPC y revelarse o detectarse por medio del detector de dispersión de luz equipado, antes de la evaluación de la masa molar promedio en peso "Pm" y la masa molar promedio en número "Mn" de cada fragmento, realizada por el propio instrumento y utilizando patrones con Pm certificado.
En una realización, el PPE hiperramificado de la presente invención es el compuesto de fórmula (I)-16:
en donde el Pm promedio es 3530 g/mol; el PEE promedio es 589 g/eq y el Pm/Mn es 1,53.
En una realización, el PPE hiperramificado de la presente invención es el compuesto de fórmula (I)-22:
en donde el Pm promedio es 910 g/mol; el PEE promedio es 229 g/eq y el Pm/Mn es 1,36.
En una realización, el PPE hiperramificado de la presente invención es el compuesto de fórmula (I)-23:
en donde el Pm promedio es 2400 g/mol; el PEE promedio es 404 g/eq y el Pm/Mn es 1,54.
En una realización, el PPE hiperramificado de la presente invención es el compuesto de fórmula (I)-14:
En una realización, el PPE hiperramificado de la presente invención es el compuesto de fórmula (I)-28:
en donde el Pm promedio es 990 g/mol; el PEE promedio es 247 g/eq y el Pm/Mn es 1,37.
En una realización, el PPE hiperramificado de la presente invención es el compuesto de fórmula (I)-26:
en donde el Pm promedio es 2200 g/mol; el PEE promedio es 365 g/eq y el Pm/Mn es 1,47.
En una realización, el PPE hiperramificado de la presente invención es el compuesto de fórmula (I)-21:
en donde el Pm promedio es 4200 g/mol; el PEE promedio es 585 g/eq y el Pm/Mn es 1,55.
Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para la preparación del compuesto de fórmula (I) o, como alternativa, un compuesto de fórmula (II).
El procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (I) de la presente invención comprende: a) proporcionar una solución alcalina que contiene éter diglicidílico de 1,3-glicerol (1,3-DGE); y
b) mantener la solución obtenida en la etapa a) a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días;
El procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (II) de la presente invención comprende: c) proporcionar una solución alcalina que contiene éter diglicidílico de 1,2-glicerol (1,2-DGE); y
d) mantener la solución obtenida en la etapa c) a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días.
El 1,3-GDE y el 1,2-GDE se han descrito previamente en el estado de la técnica y están disponibles en el mercado (consúltese la sección experimental).
En una realización, la solución alcalina de la etapa a) o, como alternativa, de la etapa c) comprende una base seleccionada del grupo que consiste en hidróxidos de amonio o metales alcalinos fisiológicamente aceptables (Na, K), hidróxidos de metales alcalinotérreos (Mg, Ca, Sr), hidróxidos de metales pesados fisiológicamente aceptables (Fe, Al, Co, Cu, Se, Zn, Cr, Ni), hidróxidos de cationes de amonio cuaternario fisiológicamente aceptables, hidrogenocarbonato de amonio o metales pesados fisiológicamente aceptable (NH<4>, Fe, Al, Co, Cu, Se, Zn, Cr, Ni) y mezclas de los mismos.
La expresión "fisiológicamente aceptable" se refiere a un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, un cultivo celular, un tejido o un organismo. Preferentemente, el sistema biológico es un organismo vivo, tal como un mamífero, en particular, un ser humano.
En una realización, la solución alcalina de la etapa a) o, como alternativa, de la etapa c) comprende un metal alcalino o hidróxido de amonio seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de potasio (KOH), hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de amonio y una mezcla de los mismos; en particular, hidróxido de sodio.
En una realización, la solución alcalina de la etapa a) o, como alternativa, de la etapa c) comprende un hidróxido de metal alcalinotérreo seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de magnesio, hidróxido de calcio, hidróxido de estroncio y una mezcla de los mismos.
En una realización, la solución alcalina de la etapa a) o, como alternativa, de la etapa c) comprende un hidróxido de metal pesado seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de hierro, hidróxido de aluminio, hidróxido de cobalto, hidróxido de selenio, hidróxido de estaño, hidróxido de cromo, hidróxido de níquel y una mezcla de los mismos.
En una realización, la solución alcalina de la etapa a) o, como alternativa, de la etapa c) comprende un hidróxido de amonio cuaternario de fórmula HONR<6>R<7>R<8>R<9>en donde cada uno de R<6>, R<7>, R<s>y R<9>se selecciona de manera independiente del grupo que consiste en alquilo (C<i>-C<s>), o, como alternativa, dos de R<5>, R<6>, R<7>y R<9>forman un anillo de cicloalquilo (C<5>-C<6>).
En una realización, la solución alcalina de la etapa a) o, como alternativa, de la etapa c) comprende hidrogenocarbonato de metal pesado o amonio seleccionado del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de hierro, hidrogenocarbonato de aluminio, hidrogenocarbonato de cobalto, hidrogenocarbonato de cobre, hidrogenocarbonato de selenio, hidrogenocarbonato de cinc, hidrogenocarbonato de cromo, hidrogenocarbonato de níquel, hidrogenocarbonato de amonio y una mezcla de los mismos; en particular, hidrogenocarbonato de sodio.
En una realización, la solución alcalina de la etapa a) o, como alternativa, de la etapa c) comprende de 1 a 50 por ciento en peso de 1,3-GDE o, como alternativa, de 1,2-GDE. En una realización, la solución alcalina de la etapa a) o, como alternativa, de la etapa c) comprende un hidróxido alcalino y comprende de 1 a 50 por ciento en peso de 1,3-GDE o, como alternativa, de 1,2-GDE. En una realización, la solución alcalina de la etapa a) o, como alternativa, de la etapa c) comprende un hidróxido alcalino seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de potasio (KOH), hidróxido de sodio (NaOH) y una mezcla de los mismos y comprende de 1 a 50 por ciento en peso de 1,3-GDE o, como alternativa, de 1,2-GDE. En una realización, la solución alcalina de la etapa a) o, como alternativa, de la etapa c) comprende hidróxido de sodio (NaOH) y comprende de 1 a 50 por ciento en peso de 1,3-GDE o, como alternativa, de 1,2-GDE.
En una realización, se realiza la etapa a) o, como alternativa, la etapa c) del procedimiento de la invención a temperatura ambiente. La expresión "temperatura ambiente" se refiere a una temperatura de aproximadamente 25 a 35 °C. En una realización, la etapa a) o, como alternativa, la etapa c) del procedimiento de la invención se realiza en presencia de un disolvente. En una realización, la etapa a) o, como alternativa, la etapa c) del procedimiento de la invención se realiza en presencia de un disolvente seleccionado del grupo que consiste en agua, alquilo (C<1>-C<4>)-OH, alquilo (C<1>-C<4>)-CO-alquilo (C<1>-C<4>), alquilo (C<1>-C<4>)-CO-O-alquilo (C<1>-C<4>), alquilo (C<1>-C<4>)-CN y mezclas de los mismos. En una realización, la etapa a) o, como alternativa, la etapa c) del procedimiento de la invención se realiza en presencia de un disolvente seleccionado del grupo que consiste en metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, acetona, acetonitrilo, acetato de etilo y mezcla de los mismos; en particular, el disolvente es agua.
El término "alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo ramificada o lineal saturada que contiene el número de átomos de carbono especificado en la descripción o en las reivindicaciones. Los ejemplos incluyen, entre otros, el grupo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo y tere-butilo.
En una realización, la etapa b) o, como alternativa, la etapa d) se realiza sometiendo el 1,3-GDE o, como alternativa, el 1,2-GDE a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días durante el que tiene lugar la autopolimerización de GDE.
En una realización, la etapa b) o, como alternativa, la etapa d) se realiza sometiendo el 1,3-GDE o, como alternativa, el 1,2-GDE a una temperatura en el intervalo de 50 a 80 °C durante un periodo de 1 minuto a 500 minutos. En una realización, la etapa b) o, como alternativa, la etapa d) se realiza sometiendo el 1,3-GDE o, como alternativa, el 1,2-GDE a una temperatura en el intervalo de 50 a 80 °C durante un periodo de 5 a 60 minutos.
En una realización, la etapa b) o, como alternativa, la etapa d) se realiza sometiendo el 1,3-GDE o, como alternativa, el 1,2-GDE a una temperatura en el intervalo de 10 a 40 °C durante un periodo de 1 día a 30 días. En una realización, la etapa b) o, como alternativa, la etapa d) se realiza sometiendo el 1,3-GDE o, como alternativa, el 1,2-GDE a una temperatura de 10 a 40 °C durante un periodo de 2 días a 7 días.
También es parte de la presente invención un compuesto de fórmula (I) o, como alternativa, un compuesto de fórmula (II) obtenible mediante el procedimiento tal y como se ha definido anteriormente, que comprende la etapa b) de autopolimerización o, como alternativa, la etapa d) como se ha definido anteriormente.
Para los fines de la invención, las expresiones "obtenible", "obtenido" y expresiones equivalentes se usan indistintamente y, en cualquier caso, la expresión "obtenible" abarca la expresión "obtenido".
Todas las realizaciones descritas anteriormente para el procedimiento para la preparación del compuesto de fórmula (I) o, como alternativa, el compuesto de fórmula (II) también se aplican al compuesto de fórmula (I) o, como alternativa, el compuesto de fórmula (II) obtenible mediante el procedimiento de la invención.
También es parte de la invención el uso del PPE hiperramificado de la invención como agente de reticulación.
El segundo aspecto de la invención se refiere a un polisacárido reticulado de fórmula (III)
o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) que tiene un porcentaje de reticulación de 0,077 a 0,450 %. En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) que tiene un porcentaje de reticulación de 0,077 a 0,360 %. En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) que tiene un porcentaje de reticulación de 0,077 a 0,269 %.
En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) es uno en donde el polisacárido es ácido hialurónico como se define a continuación y el porcentaje de reticulación es de 0,077 a 0,450 %. En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) es uno en donde el polisacárido es ácido hialurónico como se define a continuación y el porcentaje de reticulación es de 0,077 a 0,360 %. En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) es uno en donde el polisacárido es ácido hialurónico como se define a continuación y el porcentaje de reticulación es de 0,077 a 0,269 %. En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) es uno en donde el polisacárido es ácido hialurónico como se define a continuación y el porcentaje de reticulación es de 0,077 a 0,140 %. En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) es uno en donde el polisacárido es ácido hialurónico como se define a continuación y el porcentaje de reticulación es de 0,140 a 0,450 %. En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) es uno en donde el polisacárido es ácido hialurónico como se define a continuación y el porcentaje de reticulación es de 0,140 a 0,360 %. En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) es uno en donde el polisacárido es ácido hialurónico como se define a continuación y el porcentaje de reticulación es de 0,140 a 0,269 %. En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) es uno en donde el polisacárido es ácido hialurónico como se define a continuación y el porcentaje de reticulación es de 0,270 a 0,450 %. En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) es uno en donde el polisacárido es ácido hialurónico como se define a continuación y el porcentaje de reticulación es de 0,270 a 0,360 %.
En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) es uno en donde el polisacárido es almidón de amilosa como se define a continuación y el porcentaje de reticulación es de 0,124 a 0,204%. En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) es uno en donde el polisacárido es amilosa como se define a continuación y el porcentaje de reticulación es de 0,155 a 0,182%. En una realización, el polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV) es uno en donde el polisacárido es carboximetilcelulosa de sodio como se define a continuación y el porcentaje de reticulación es de 0,140 a 0,204%.
En una realización, en los polisacáridos reticulados de fórmula (III) y (IV), la cantidad de R<2>es menor que R<5>sobre el peso total de los polisacáridos reticulados de fórmula (III) y (IV). En una realización, en los polisacáridos reticulados de fórmula (III) y (IV), la cantidad de R<2>es menor de 2 ppm sobre el peso total de los polisacáridos reticulados de fórmula (III) y (IV). La cantidad de R<2>se mide experimentalmente utilizando la titulación cuantitativa asistida por ultrasonidos con HCl para la determinación rápida de epóxidos descrita en He, Z.,et al.,"Ultrasonication-assisted rapid determination of epoxide values in polymer mixtures containing epoxy resin". Analytical Methods, 2014, vol. 6 (12), págs. 4257-4261.
El polisacárido de la presente invención es un polisacárido "reticulado". El término "reticulado" se refiere a un polisacárido que tiene una red de reticulación tridimensional en donde la red está formada por un polisacárido de partida que ha sido colapsado por uno o más agentes de reticulación. El término "reticulación" se refiere en el campo de la ciencia de los polímeros al uso de reticulaciones para promover una diferencia en las propiedades físicas de los polímeros (polisacárido). El término "reticulación" se refiere a enlaces que se forman mediante la apertura del anillo de epóxido del agente de reticulación PPE hiperramificado de la presente invención por el grupo hidroxilo del polímero (polisacárido). La expresión "reticulante" o "agente reticulante" que se usan en el presente documento indistintamente se refiere a un compuesto que tiene la capacidad de reticular una o más cadenas poliméricas.
Las expresiones "porcentaje de reticulación", "porcentaje (%) de reticulación", “grado de reticulación” y la abreviatura “G.R.” tienen el mismo significado y se usan indistintamente. Se refieren a la relación de unidades monoméricas de polisacárido modificado con PPE con respecto a unidades monoméricas de polisacárido no modificado expresada en porcentaje. Habitualmente, la medición del grado de reticulación (G.R.) de los materiales podría evaluarse utilizando diferentes métodos bien conocidos en el estado de la técnica. Algunos métodos son directos, tales como análisis de RMN 1H o GPC cuantitativa de fragmentos del polímero después de digestión enzimática. Otros métodos son indirectos, por medidas reológicas, por compresión o por pruebas oscilatorias. Normalmente todos estos métodos son comparativos y permiten distinguir diferentes grados de reticulación dentro de la misma familia de polímeros. En la presente invención, el valor del grado de reticulación se calcula matemáticamente a partir del valor de G' obtenido mediante medidas reológicas utilizando la siguiente ecuación 1:
100 *PMunidad rep.
G.R.(%)
en donde:
PM<unidad rep.>es el peso molecular de la unidad de repetición monomérica de polisacárido,
PM<unidad rep.>= 401 Da para ácido hialurónico;
PM<unidad rep.>= 162 Da para amilosa/glucógeno;
PM<unidad rep.>= 242 Da para carboximetilcelulosa de sodio.
Me se calcula matemáticamente usando la fórmula inversa de la siguiente ecuación 2:
(Ec. 2)
En donde:
G' se obtiene experimentalmente mediante mediciones reológicas utilizando reómetro rotacional,
R T es la energía térmica,
c es la concentración de polisacárido,
M<n>es la masa molecular promedio en número del polisacárido.
En la presente invención, la tasa absoluta de degradación enzimática y oxidativa para cada hidrogel de polisacárido reticulado, se calcula matemáticamente. Dependiendo del sustrato polisacarídico, se utilizan tres métodos para monitorizar la tasa absoluta de degradación enzimática y oxidativa de los hidrogeles de polisacáridos reticulados.
El primer método se basa en el seguimiento de parámetros reológicos como el módulo de almacenamiento G' durante la degradación, la tasa de degradación<reo>se calcula a partir de la ec. 3.
tasa de degradaciónreo = —G,‘_°o'to (Ec. 3)
Se observa una disminución del módulo de almacenamiento G' durante la degradación de los hidrogeles de polisacáridos reticulados, producida por la interrupción de la red de hidrogel, G'<t>< G'<t0>y es necesario que el signo negativo tenga una tasa de degradación positiva. Este primer método es adecuado para determinar la tasa absoluta de degradación enzimática y oxidativa del hidrogel de polisacárido reticulado que contiene ácido hialurónico, almidón y derivados del mismo, glucógeno, celulosa y derivados del mismo, pectina, lignina, inulina, goma guar, goma xantana, ácidos algínicos (alginatos), glucomanano, galactomanano y carragenina.
El segundo método se basa en la monitorización de parámetros viscosos, como la viscosidad dinámica n durante la degradación, la tasa de degradación<visc>se calcula a partir de la ec. 4.
Se observa una disminución de la viscosidad dinámica n durante la degradación de los hidrogeles de polisacáridos reticulados, provocada por la reducción de la longitud de las cadenas poliméricas, n<t>< n<t0>y es necesario que el signo negativo tenga una tasa de degradación positiva. Este segundo método es adecuado para determinar la tasa absoluta de degradación enzimática y oxidativa del hidrogel de polisacárido reticulado que contiene ácido hialurónico, almidón y derivados del mismo, glucógeno, celulosa y derivados del mismo, pectina, lignina, inulina, goma guar, goma xantana, ácidos algínicos (alginatos), glucomanano, galactomanano y carragenina.
El tercer método se basa en el seguimiento colorimétrico de la concentración de ácido urónico con el ensayo de carbazol utilizando un instrumento espectrofotométrico durante la degradación, la tasa de degradación<color>se calcula a partir de la ec. 5.
tasa de degradacwnC0i0r=[ácido u rónico] t - [ácido u rónico]tn■ (Ec. 5)
Se observa un aumento de la concentración de ácido urónico durante la degradación de los hidrogeles de polisacáridos reticulados, provocado por la reducción de la longitud de las cadenas poliméricas y la formación de unidades monoméricas de ácido urónico, [ácido urónicoj<t>> [ácido urónico]<t0>en este caso, es necesario cualquier signo negativo para tener una tasa de degradación positiva. Este tercer método es adecuado para determinar la tasa absoluta de degradación enzimática y oxidativa del hidrogel de polisacárido reticulado que contiene ácido hialurónico, pectina, heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, xantano, glucuronano, ácidos algínicos (alginatos).
En la presente invención, también se hace una comparación entre la tasa absoluta de degradación enzimática y oxidativa de los hidrogeles de polisacáridos reticulados. En un periodo de tiempo fijo, la tasa de degradación enzimática y oxidativa relativa para cada hidrogel de polisacárido reticulado se calcula como porcentaje del valor de la tasa de degradación oxidativa y enzimática absoluta del hidrogel de polisacárido reticulado sobre el valor de la tasa de degradación oxidativa y enzimática absoluta del hidrogel de polisacárido reticulado con GDE conocido en el estado de la técnica utilizado como referencia. Por tanto, se calcula a partir de la ec. 6.
%tasa de degradación re la tiva = tasa de de3radaclonxi• igg (Ec. 6)
tasa de degradac ionGDE
en donde:
la tasa de degradación<xl>es la tasa de degradación absoluta del hidrogel de polisacárido reticulado con BDDE, PEGDE y PPE
la tasa de degradación<GDE>es la tasa de degradación absoluta del hidrogel de polisacárido reticulado con GDE conocido en el estado de la técnica.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención tiene una tasa de degradación enzimática relativa de 100 % a 37 % de la tasa de degradación enzimática de los polisacáridos reticulados con GDE comparativos (que se usa como valor de referencia y referencia interna). El polisacárido reticulado con GDE utilizado como valor interno es obtenible mediante reacción del polisacárido con el GDE comercial (como se muestra en la sección experimental). En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención tiene una tasa de degradación enzimática relativa de 85 a 40 %. En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención tiene un porcentaje de reticulación de 0,1528 a 0,1877 % y una tasa de degradación enzimática relativa de 84 a 37 %.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención tiene una tasa de degradación oxidativa relativa de 100 % a 76 % de la tasa de degradación oxidativa de los polisacáridos reticulados con GDE comparativos (que se usa como valor de referencia y referencia interna). El polisacárido reticulado con GDE utilizado como valor interno es obtenible mediante reacción del polisacárido con el GDE comercial (como se muestra en la sección experimental). En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención tiene una tasa de degradación oxidativa relativa de 90 a 75 %. En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención tiene un porcentaje de reticulación de 0,1528 a 0,1877 % y una tasa de degradación oxidativa de 76 a 87 %.
Como se ha mencionado anteriormente, las tasas absolutas de degradación enzimática y oxidativa de los polisacáridos reticulados de la presente invención son iguales o inferiores a la tasa absoluta de degradación enzimática y oxidativa del polisacárido reticulado con GDE comparativo usado como referencia interna, y que tiene un grado de reticulación menor. Es ventajoso porque aumentan tanto la estabilidad del hidrogel como la seguridad y comodidad del paciente.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención tiene una tasa de degradación enzimática absoluta de 0,8 a 3,5 mmol/h; y una tasa de degradación oxidativa absoluta de 3,0 a 4,3 mmol/h. En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención tiene una tasa de degradación enzimática absoluta de 0,8 a 2,6 mmol/h; y una tasa de degradación oxidativa absoluta de 3,0 a 3,4 mmol/h. En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención tiene un porcentaje de reticulación de 0,1528 a 0,1877 %, una tasa de degradación enzimática de 0,8 a 2,7 mmol/h, y una tasa de degradación oxidativa de 3,0 a 3,4 mmol/h.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde la distancia promedio (D<n>) entre dos grupos reticulantes es de 21 nm a 42 nm. En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde la distancia promedio (D<n>) entre dos grupos reticulantes es de 21 nm a menos de 27 nm. En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde la distancia promedio (D<n>) entre dos grupos reticulantes es de igual o mayor que 27 nm a 42 nm.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde la concentración del polisacárido es de 1 a 50 mg/ml. La concentración del polisacárido puede medirse mediante cualquier método adecuado descrito en el estado de la técnica. En la presente invención, la concentración del polisacárido se mide mediante medición gravimétrica del residuo seco obtenido después de la deshidratación del hidrogel en un horno ventilado a 105 °C durante un tiempo adecuado.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde la viscosidad es de 1 a 200 Pas medida por viscosímetro. En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde la viscosidad es de 10 a 100 Pas medida por viscosímetro.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde el polisacárido se selecciona del grupo que consiste en ácido hialurónico, almidón y un derivado del mismo, glucógeno, celulosa y un derivado del mismo, pectina, lignina, inulina, goma guar, goma xantana, ácidos algínicos (alginatos), heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, glucuronano, glucomanano, galactomanano y carrageninas.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde el polisacárido es ácido hialurónico. Para el fin de la presente invención, la expresión "ácido hialurónico", "hialuronano" y la abreviatura "HA" tienen el mismo significado y se usan indistintamente. Se refieren a la forma aniónica no sulfatada, natural, de glucosaminoglucano que tiene el número CAS 9004-61-9, que está compuesta por varias unidades de disacárido repetidas de N-acetil-D-glucosamina y ácido D-glucurónico; y también, a su sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de ácido hialurónico.
Para el fin de la presente invención, la expresión "ácido hialurónico" también abarca su sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de ácido hialurónico. En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde el polisacárido es una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable de ácido hialurónico. No hay limitación sobre el tipo de sal de ácido hialurónico que se puede usar, siempre que sea farmacéutica o cosméticamente aceptable cuando se use con fines terapéuticos. El ácido hialurónico y una sal del mismo pueden diferir en algunas propiedades físicas, pero son equivalentes para los fines de la presente invención y las propiedades del ácido hialurónico respetuoso con la piel son extensibles a una sal farmacéutica o cosméticamente aceptable, en particular a su sal de sodio (o hialuronato de sodio) y sal de potasio (hialuronato de potasio). La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a la sal adecuada para su uso en tecnología farmacéutica para la preparación de composiciones para uso médico y, la expresión "sal cosméticamente aceptable" o "sal dermatológicamente aceptable" usada indistintamente en este documento se refiere a la sal adecuada para su uso en contacto con la piel humana sin toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alérgica inadecuada, entre otros. En particular, la expresión "sal farmacéutica o cosméticamente aceptable" abarca sales usadas habitualmente tales como, por ejemplo, sales de metales alcalinos. La preparación de sales farmacéuticamente aceptables de ácido hialurónico se puede llevar a cabo mediante métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de sales farmacéutica o cosméticamente aceptables de ácido hialurónico adecuadas para la presente invención incluyen sales inorgánicas tales como hialuronato de sodio, hialuronato de magnesio, hialuronato de potasio, hialuronato de cinc y hialuronato de cobalto, así como sales orgánicas tales como hialuronato de tetrabutilamonio. En una realización, la sal farmacéutica o cosméticamente aceptable del ácido hialurónico es una sal de un metal alcalino seleccionado de la sal de sodio (n.° de CAS: 9067-32-7) o sal de potasio (n.° de CAS: 31799-91-4).
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde el polisacárido es un ácido hialurónico de alto peso molecular. La expresión "ácido hialurónico de alto peso molecular" se refiere a un ácido hialurónico con un peso molecular de 300 kDa o más. En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde el polisacárido es un ácido hialurónico de alto peso molecular que tiene un peso molecular de 300 kDa a 5000 kDa; en particular de 500 kDa a 2000 kDa. En una realización particular, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde el polisacárido es un ácido hialurónico de alto peso molecular que tiene un peso molecular de 1000 kDa a 2000 kDa.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es el polisacárido reticulado (III)-4 que tiene:
un grado de reticulación de 0,2688 %
una tasa de degradación enzimática de 2,8 mmol/h; y
una tasa de degradación oxidativa de 3,3 mmol/h;
en donde:
el polisacárido es ácido hialurónico, y
el PPE hiperramificado utilizado como material de partida es el compuesto (I)-22.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es el polisacárido reticulado (III)-9 que tiene:
un grado de reticulación de 0,1127 %
una tasa de degradación enzimática de 3,6 mmol/h; y
una tasa de degradación oxidativa de 4,3 mmol/h;
en donde:
el polisacárido es ácido hialurónico, y
el PPE hiperramificado utilizado como material de partida es el compuesto (I)-16.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es el polisacárido reticulado (III)-8 que tiene:
un grado de reticulación de 0,1358 %
una tasa de degradación enzimática de 3,5 mmol/h; y
una tasa de degradación oxidativa de 4,3 mmol/h;
en donde:
el polisacárido es ácido hialurónico, y
el PPE hiperramificado utilizado como material de partida es el compuesto (I)-22.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es el polisacárido reticulado (III)-5 que tiene:
un grado de reticulación de 0,1877 %
una tasa de degradación enzimática de 0,8 mmol/h; y
una tasa de degradación oxidativa de 3,0 mmol/h;
en donde:
el polisacárido es ácido hialurónico, y
el PPE hiperramificado utilizado como material de partida es el compuesto (I)-23.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es el polisacárido reticulado (III)-6 que tiene:
un grado de reticulación de 0,1528 %
una tasa de degradación enzimática de 2,7 mmol/h; y
una tasa de degradación oxidativa de 3,4 mmol/h;
en donde:
el polisacárido es ácido hialurónico, y
el PPE hiperramificado utilizado como material de partida es el compuesto (I)-16.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es el polisacárido reticulado (III)-14 que tiene:
un grado de reticulación de 0,3911 %
una tasa de degradación enzimática de 2,8 mmol/h; y
una tasa de degradación oxidativa de 2,6 mmol/h;
en donde:
el polisacárido es ácido hialurónico, y
el PPE hiperramificado utilizado como material de partida es el compuesto (I)-22.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es el polisacárido reticulado (III)-15 que tiene:
un grado de reticulación de 0,3049 %
una tasa de degradación enzimática de 1,1 mmol/h; y
una tasa de degradación oxidativa de 2,3 mmol/h;
en donde:
el polisacárido es ácido hialurónico, y
el PPE hiperramificado utilizado como material de partida es el compuesto (I)-23.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es el polisacárido reticulado (III)-16 que tiene:
un grado de reticulación de 0,2723 %
una tasa de degradación enzimática de 2,9 mmol/h; y
una tasa de degradación oxidativa de 2,6 mmol/h;
en donde:
el polisacárido es ácido hialurónico, y
el PPE hiperramificado utilizado como material de partida es el compuesto (I)-16.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde el polisacárido es almidón o un derivado del mismo. Para el fin de la presente invención, el término "almidón" se refiere a un carbohidrato polisacárido que consiste en un gran número de unidades de glucosa unidas por enlaces glucosídicos. El almidón es producido por todas las plantas verdes como reserva de energía y es una fuente importante de alimento para los seres humanos. Para el fin de la invención, las expresiones "derivado de almidón" o "almidón modificado" tienen el mismo significado y se usan indistintamente. Se refieren a almidón que se ha hecho reaccionar para modificar sus propiedades. Son ejemplos de derivados de almidón almidones de hidroxialquilo, carboxialquilados, alquilcarbonilados, fosfatados, sulfatados, derivados de injerto y alquilados. En una realización, el derivado de almidón se selecciona del grupo que consiste en almidón de hidroxipropilo, glucolato de almidón de sodio y almidón de carboximetilo.
En una realización, el polisacárido reticulado de la presente invención es uno en donde el polisacárido es celulosa o un derivado del mismo. Para el fin de la presente invención, el término "celulosa" se refiere a un polisacárido que tiene una cadena principal formada por unidades de D-glucopiranosa conectadas por enlaces p-1,4-glucosídicos. Las expresiones "celulosa modificada" o "derivado de celulosa" tienen el mismo significado y se usan indistintamente. Se refieren a cualquier compuesto que tenga una cadena principal de celulosa, es decir, una estructura de unidades de D-glucopiranosa conectadas por enlaces p-1,4-glucosídicos, que se ha modificado químicamente mediante la introducción de restos colgantes no comprendidos en celulosa pura. Los ejemplos no limitantes de derivados de celulosa incluyen metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxietilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, L-hidroxipropilcelulosa (poco sustituida), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), carboximetilcelulosa de sodio o carboximetilhidroxietilcelulosa.
Todas las realizaciones mencionadas anteriormente descritas para el polisacárido reticulado de la presente invención, también se aplican individualmente para cada uno de los polisacáridos enumerados anteriormente de manera específica, que son ácido hialurónico, almidón y un derivado del mismo, glucógeno, celulosa y un derivado del mismo, pectina, lignina, inulina, goma guar, goma xantana, ácidos algínicos (alginatos), heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, glucuronano, glucomanano, galactomanano y carrageninas.
También es un aspecto de la invención un procedimiento para la preparación de un polisacárido reticulado de fórmula (III) o, como alternativa de fórmula (IV) de la presente invención.
En una realización, el procedimiento para la preparación de un polisacárido reticulado (III) de la presente invención comprende reticular el polisacárido con un compuesto de fórmula (I) como se define en el primer aspecto de la invención.
En una realización, el procedimiento para la preparación de un polisacárido reticulado de fórmula (III) de la presente invención comprende reticular el polisacárido con un compuesto de fórmula (I) como se define en el primer aspecto de la invención; en donde el compuesto de fórmula (I) es obtenible mediante el procedimiento que comprende realizar las etapas a) y b) como se han definido anteriormente. Por tanto, el procedimiento para la preparación del polisacárido reticulado de fórmula (III) la presente invención comprende reticular el polisacárido con un compuesto de fórmula (I), en donde el compuesto de fórmula (I) es obtenido mediante un procedimiento que comprende: a) proporcionar una solución alcalina que contiene éter diglicidílico de 1,3-glicerol; y b) mantener la solución obtenida en la etapa a) a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días.
En una realización, el procedimiento para la preparación de un polisacárido reticulado (III) de la presente invención comprende reticular el polisacárido con un compuesto de fórmula (II) como se define en el primer aspecto de la invención.
En una realización, el procedimiento para la preparación de un polisacárido reticulado de fórmula (IV) la presente invención comprende reticular el polisacárido con un compuesto de fórmula (II); en donde el compuesto de fórmula (II) es obtenible mediante el procedimiento que comprende realizar las etapas c) y d) como se han definido anteriormente. Por tanto, el procedimiento para la preparación del polisacárido reticulado de la presente invención comprende reticular el polisacárido con un compuesto de fórmula (II), en donde el compuesto de fórmula (II) es obtenido mediante un procedimiento que comprende: c) proporcionar una solución alcalina que contiene éter diglicidílico de 1,2-glicerol; y d) mantener la solución obtenida en la etapa c) a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días.
Todas las realizaciones descritas anteriormente para el polisacárido, el compuesto de fórmula (I), el compuesto de fórmula (II) y el polisacárido reticulante; así como las condiciones de reacción de las etapas a)-d) del procedimiento para la preparación del polisacárido reticulado de la presente invención, también se aplican al polisacárido reticulado obtenible por este procedimiento.
En una realización, el procedimiento para la preparación del polisacárido reticulado de fórmula (III) que comprende:
e) reticular el polisacárido con un compuesto de fórmula (I) como se define en el primer aspecto de la invención; y, opcionalmente,
g) aislar el polisacárido reticulado de fórmula (III) de la invención.
En una realización, la etapa e) del procedimiento para la preparación del polisacárido reticulado de fórmula (III) comprende:
e1) proporcionar una solución alcalina del 5 al 15 por ciento en peso de polisacárido;
e2) proporcionar una solución alcalina que comprende el compuesto de fórmula (I); y
e3) mezclar la solución obtenida en la etapa e1) y la solución obtenida en la etapa e2) para obtener una solución alcalina que comprende el polisacárido y el compuesto de fórmula (I); y
e4) mantener la solución alcalina obtenida en la etapa e3) a una temperatura comprendida entre 20 °C y 50 °C durante un periodo de 1 a 48 horas.
En una realización, el procedimiento para la preparación del polisacárido reticulado de fórmula (IV) que comprende:
f) reticular el polisacárido con un compuesto de fórmula (II) como se define en el primer aspecto de la invención y, opcionalmente,
g) aislar el polisacárido reticulado de fórmula (IV) de la invención.
En una realización, la etapa f) del procedimiento para la preparación del polisacárido reticulado de fórmula (IV) comprende:
f1) proporcionar una solución alcalina del 5 al 15 por ciento en peso de polisacárido;
f2) proporcionar una solución alcalina que comprende el compuesto de fórmula (II); y
f3) mezclar la solución obtenida en la etapa f1) y la solución obtenida en la etapa f2) para obtener una solución alcalina que comprende el polisacárido y el compuesto de fórmula (II); y
f4) mantener la solución alcalina obtenida en la etapa f3) a una temperatura comprendida entre 20 C y 50°C durante un periodo de 1 a 48 horas.
En una realización, la solución alcalina de la etapa e3) o, como alternativa la etapa f3) comprende una concentración del polisacárido de 5 a 15 % en peso.
En una realización, la solución alcalina obtenida en la etapa e3) o, como alternativa, en la etapa f3) comprende de 0,25 a 0,75 M de base alcalina; en particular, de 0,40 a 0,60 M de base alcalina.
En una realización, la solución alcalina obtenida en la etapa e3) o, como alternativa, en la etapa f3) comprende de 5 a 15 % en peso de polisacárido; en particular, de 8 a 10 % en peso de polisacárido.
En una realización, la solución alcalina obtenida en la etapa e3) o, como alternativa, en la etapa f3) comprende de 0,2 a 1 % en peso de compuesto de fórmula (I) o, como alternativa, del compuesto de fórmula (II); en particular de 0,3 a 0,5 % en peso.
En una realización, la solución alcalina obtenida en la etapa e3) o, como alternativa, en la etapa f3) comprende una relación en peso entre el compuesto de fórmula (I) y el polisacárido o, como alternativa, una relación en peso entre el compuesto de fórmula (II) y el polisacárido de 2 a 40 % p/p; en particular de 2 a 12,5 % p/p expresado como relación en peso de PPE con respecto a polisacárido seco. El término "relación en peso" se refiere a la relación de pesos de dos ingredientes necesarios para aumentar la estabilidad y aumentar la biodisponibilidad del polisacárido reticulado de la presente invención después de su aplicación. En particular, la relación de polisacárido y PPE hiperramificado de la presente invención necesitaba disminuir la tasa de degradación enzimática/oxidativa y reducir el grado de reticulación.
En una realización, la solución alcalina obtenida en la etapa e4) o, como alternativa, en la etapa f4) comprende de 1 a 50 mg/ml de polisacárido.
Las etapas de aislamiento g) pueden realizarse según los métodos bien conocidos por un experto en la materia descritos en el estado de la técnica para el aislamiento de compuestos químicos. En una realización, la etapa de aislamiento puede incluir eliminarlos mediante una o más de las siguientes operaciones: evaporación, liofilización, filtración, decantación y centrifugación, u otras técnicas adecuadas conocidas por un experto en la materia. En una realización, la etapa de aislamiento g) comprende ajustar el pH de la solución alcalina obtenida en las etapas e3) o, como alternativa, f3) entre 6,5 y 7,4. El ajuste del pH se puede realizar mediante la adición de un ácido, tal como, por ejemplo, HCl, H<3>PO<3>o una mezcla de los mismos. La determinación del pH puede realizarse mediante cualquier método conocido en el estado de la técnica. En el caso de la presente solicitud, el pH se determina mediante la lectura directa del valor de pH utilizando un pHmetro con su electrodo sumergido en el hidrogel.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende:
uno o más de los polisacáridos reticulados de la presente invención, y
uno o más excipientes o vehículos adecuados. El polisacárido reticulado adecuado, así como los excipientes y/o vehículos adecuados, y sus cantidades, pueden ser determinados fácilmente por los expertos en la materia según el campo y el tipo de formulación que se esté preparando.
En una realización, la composición es una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más polisacáridos reticulados farmacéuticamente aceptables y uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
La expresión "composición farmacéutica" se refiere a una composición adecuada para su uso en la tecnología farmacéutica con uso médico. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva de un polisacárido reticulado farmacéuticamente aceptable" como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un polisacárido reticulado de la presente invención que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar en cierta medida, uno o más de los síntomas de la enfermedad que se aborda. La dosis del polisacárido reticulado farmacéuticamente aceptable administrada según la presente invención, por supuesto, estará determinada por las circunstancias particulares en torno al caso, incluyendo el compuesto administrado, la vía de administración, la afección particular que se trate y las consideraciones similares. Para el fin de la invención, la expresión "polisacárido reticulado farmacéuticamente aceptable" se refiere al ingrediente activo o central en la composición que provoca el efecto (terapéuticamente) directo en el diagnóstico, la prevención, el tratamiento, la cura o el alivio de una enfermedad o afección.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. La expresión "excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables" se refiere a los excipientes o vehículos adecuados para su uso en la tecnología farmacéutica para preparar composiciones con uso médico. En una realización, las composiciones de la presente invención comprenden uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables seleccionados del grupo que consiste en diluyente, aglutinante, emoliente, disgregante, lubricante y mezclas de los mismos. Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener otros ingredientes, tales como fragancias, colorantes y otros componentes conocidos en el estado de la técnica.
En una realización, la composición farmacéutica comprende uno o más polisacáridos reticulados farmacéuticamente aceptables seleccionados del grupo que consiste en ácido hialurónico, almidón y un derivado del mismo, glucógeno, celulosa y un derivado del mismo, pectina, lignina, inulina, goma guar, goma xantana, ácidos algínicos (alginatos), heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, glucuronano, glucomanano, galactomanano y carrageninas.
En una realización, la composición es una composición cosmética que comprende una cantidad cosméticamente efectiva de uno o más polisacáridos reticulados cosméticamente aceptables y uno o más excipientes o vehículos cosméticamente aceptables.
La composición cosmética de la presente invención está diseñada para aplicar al cuerpo la cantidad adecuada ("cantidad cosméticamente efectiva") para mejorar su apariencia o para embellecer, conservar, acondicionar, limpiar, colorear o proteger la piel, las uñas o el cabello (consúltese Academic Press Dictionary of Science and Technology, 1992, págs. 531; A terminological Dictionary of the Pharmaceutical Sciences. 2007, págs. 190). Por lo tanto, las composiciones cosméticas anteriores se utilizan adjetivamente para una aplicación no médica.
La expresión "cosméticamente aceptable" o "dermatológicamente aceptable" que se usa en el presente documento indistintamente se refiere a excipientes o vehículos adecuados para su uso en contacto con la piel humana sin toxicidad excesiva, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alérgica, entre otros.
En una realización, la composición farmacéutica o cosmética de la presente invención es una composición tópica, que se puede formular en varias formas que incluyen, pero sin limitación, soluciones, aerosoles y pulverizaciones sin aerosol, cremas de afeitar, polvos, espumas, lociones, geles, barras, pomadas, pastas, cremas, champús, gel de ducha, geles de baño o geles faciales.
En una realización, la composición farmacéutica o cosmética es una composición oral. Por ejemplo, la composición sólida es un comprimido, gránulo y cápsula.
En una realización, la composición farmacéutica o cosmética es una composición inyectable. En una realización, la composición farmacéutica o cosmética es una composición inyectable seleccionada del grupo que consiste en aplicación intramuscular, subcutánea o intravenosa. En una realización, las composiciones farmacéuticas o cosméticas de la presente invención están en forma de composiciones parenterales adecuadas para su inyección, infusión o implantación en el cuerpo. Las composiciones parenterales definidas anteriormente deben ser estériles y sin pirógenos, y pueden estar en forma líquida, tal como soluciones, emulsiones o suspensiones, o en forma sólida envasada en recipientes de dosis única o multidosis adecuadamente diluidos antes de su uso. Las composiciones parenterales pueden comprender excipientes o vehículos adecuados para administración parenteral que pueden ser excipientes farmacéuticos o cosméticos, incluyendo, pero sin limitación, disolventes, agentes de suspensión, agentes tamponantes, sustancias para hacer la preparación isotónica con sangre, estabilizadores o conservantes antimicrobianos. La adición de excipientes debe mantenerse al mínimo. Cuando se utilizan excipientes, no deben afectar negativamente a la estabilidad, la biodisponibilidad, la seguridad o la eficacia de los polímeros y/o los agentes activos, o provocar toxicidad o irritación local excesiva. No debe haber ninguna incompatibilidad entre ninguno de los componentes de la forma farmacéutica.
Las composiciones tópicas definidas anteriormente comprenden excipientes o vehículos adecuados para la administración tópica que pueden ser excipientes farmacéuticos o cosméticos, incluyendo, pero sin limitación, agente reparador de la función de barrera cutánea, un agente hidratante, un emoliente, un emulsionante, un espesante, un humectante, un agente regulador del pH, un antioxidante, un agente conservante, un vehículo o sus mezclas. Los excipientes o vehículos utilizados tienen afinidad por la piel, se toleran bien, son estables y se usan en una cantidad adecuada para proporcionar la consistencia deseada y facilidad de aplicación. Adicionalmente, las composiciones de la presente invención pueden contener otros ingredientes, tales como fragancias, colorantes y otros componentes conocidos en el estado de la técnica para su uso en formulaciones tópicas. Las composiciones tópicas de la invención se pueden formular en varias formas que incluyen, pero sin limitación, soluciones, aerosoles y pulverizaciones sin aerosol, cremas, polvos, espumas, lociones, geles, barras, pomadas, pastas y emulsiones.
En una realización, la composición cosmética comprende uno o más polisacáridos reticulados farmacéuticamente aceptables seleccionados del grupo que consiste en ácido hialurónico, almidón y un derivado del mismo, glucógeno, celulosa y un derivado del mismo, pectina, lignina, inulina, goma guar, goma xantana, ácidos algínicos (alginatos), heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, glucuronano, glucomanano, galactomanano y carrageninas.
En una realización, la composición es una composición comestible que comprende uno o más polisacáridos reticulados comestibles aceptables y uno o más excipientes o vehículos comestibles aceptables.
El término "comestible" se refiere a composiciones, polisacáridos reticulados, excipientes y vehículos que puedan ser consumidos por seres humanos o animales sin consecuencias perjudiciales significativas para la salud.
La expresión "excipientes o vehículos comestibles aceptables" se refiere a excipientes o vehículos que son sustancialmente neutros desde punto de vista del sabor, en la medida en que no altere significativamente las propiedades organolépticas. Además, son adecuados para su uso en la preparación de composiciones que pueden ser consumidas por seres humanos sin consecuencias perjudiciales para la salud significativas.
En una realización, la composición comestible comprende uno o más polisacáridos reticulados comestibles aceptables seleccionados del grupo que consiste en ácido hialurónico, almidón y un derivado del mismo, glucógeno, celulosa y un derivado del mismo, pectina, lignina, inulina, goma guar, goma xantana, ácidos algínicos (alginatos), heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, glucuronano, glucomanano, galactomanano y carrageninas.
Las composiciones comestibles de la invención se pueden formular en varias formas que incluyen, pero sin limitación, formas sólidas o líquidas. Adicionalmente, las composiciones comestibles de la presente invención pueden contener otros ingredientes, tales como colorantes y agentes de resistencia a la luz, y otros componentes conocidos en el estado de la técnica para su uso en composiciones comestibles.
En una realización, la composición comestible es un alimento para seres humanos o un alimento para animales (pienso).
En una realización, la composición es una composición agrícola que comprende una cantidad biológicamente efectiva de uno o más polisacáridos reticulados agrícolas aceptables y uno o más excipientes o vehículos agrícolas aceptables.
El término "agrícola" se refiere a composiciones, polisacáridos reticulados, excipientes y vehículos que se pueden aplicar a las partes basales y/o foliares de las plantas para tratarlas sin consecuencias perjudiciales significativas para la salud.
En una realización, la composición agrícola se selecciona del grupo que consiste en fertilizantes, macronutrientes, micronutrientes, plaguicidas, reguladores del crecimiento de la planta, hormonas vegetales y factor Nod.
Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad biológicamente efectiva" se refiere a la cantidad del polisacárido reticulado de la presente invención necesaria para producir un efecto deseado en una planta, en un insecto o en una plaga vegetal. Las cantidades efectivas de la sustancia dependerán de varios factores, incluyendo el método de tratamiento, la especie de planta, la especie de plaga, el tipo de material de propagación y las condiciones ambientales. Por ejemplo, una cantidad biológicamente efectiva de un insecticida sería la cantidad de insecticida que protege a una planta del daño. Esto no significa que la planta protegida no sufra daños por la plaga, sino que el daño es a un nivel tal que permite que la planta dé un rendimiento aceptable de un cultivo.
La composición agrícola se puede formular en una forma seleccionada de un grupo que comprende polvos humectables, polvos finos, gránulos dispersables en agua, concentrados en suspensión, concentrados emulsionables, comprimidos, pellets, líquidos y suspensiones oleosas.
En una realización, la composición agrícola comprende uno o más polisacáridos reticulados agrícolas aceptables seleccionados del grupo que consiste en ácido hialurónico, almidón y un derivado del mismo, glucógeno, celulosa y un derivado del mismo, pectina, lignina, inulina, goma guar, goma xantana, ácidos algínicos (alginatos), heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, glucuronano, glucomanano, galactomanano y carrageninas.
También es parte de la invención el uso de los polisacáridos reticulados de la presente invención. El polisacárido reticulado adecuado, así como los excipientes y/o vehículos adecuados, y sus cantidades, pueden ser determinados fácilmente por los expertos en la materia según el campo y el tipo de formulación que se esté preparando.
Los polisacáridos reticulados farmacéuticos de la invención y las composiciones farmacéuticas que los contienen se pueden utilizar en el campo farmacéutico. Por lo tanto, también forman parte de la invención los polisacáridos reticulados farmacéuticos de la presente invención o, como alternativa, una composición farmacéutica que los contiene de la presente invención para su uso en terapia. En una realización, un HA reticulado de la presente invención o una composición que lo contiene para su uso en terapia.
Este aspecto también podría formularse como el uso de polisacáridos reticulados farmacéuticos para la preparación de un medicamento. También se refiere a un método para el tratamiento de un mamífero que padece una enfermedad, en donde el método comprende administrar a dicho mamífero una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de los polisacáridos reticulados farmacéuticos de la presente invención como se ha definido anteriormente. En una realización, la composición farmacéutica de la presente invención como se ha definido anteriormente es una en donde el polisacárido reticulado farmacéutico es un polisacárido reticulado para su uso en el tratamiento del aumento de tejido blando. Este aspecto también podría formularse como el uso de la composición farmacéutica de la invención que comprende un HA reticulado como se ha definido anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de heridas. También se refiere a un método para el tratamiento de un mamífero que padece osteoartritis, en donde el método comprende administrar a dicho mamífero la composición farmacéutica de la presente invención que comprende el HA reticulado como se ha definido anteriormente.
Todas las realizaciones como se han definido anteriormente para los polisacáridos reticulados farmacéuticos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención también se aplican para su uso en terapia.
Los polisacáridos reticulados cosméticos de la invención y las composiciones cosméticas que los contienen se pueden utilizar en el campo cosmético. Por lo tanto, también es parte de la invención el uso de polisacáridos reticulados cosméticos y las composiciones cosméticas de la presente invención como agentes para el cuidado de la piel, donde el cuidado de la piel comprende aliviar al menos uno de los siguientes síntomas: aspereza, descamación, deshidratación, rigidez, agrietamiento y falta de elasticidad.
En una realización, los polisacáridos reticulados cosméticos de la invención y las composiciones cosméticas que los contienen es un agente hidratante. En una realización, los polisacáridos reticulados cosméticos de la invención y las composiciones cosméticas que los contienen es un agente de cuidado de la piel. En una realización, los polisacáridos reticulados cosméticos de la invención y las composiciones cosméticas que los contienen es un agente calmante. El agente calmante es adecuado para aliviar, calmar, componer, sosegar, suavizar, asentar, serenar o tranquilizar la piel. En una realización, los polisacáridos reticulados cosméticos de la invención y las composiciones cosméticas que los contienen es un agente de recuperación de la barrera de la piel.
En una realización, los polisacáridos reticulados cosméticos de la invención y las composiciones cosméticas que los contienen es un relleno dérmico, en particular en donde el polisacárido es HA.
Los polisacáridos reticulados comestibles de la invención y las composiciones comestibles que los contienen se pueden utilizar en el campo alimentario. En una realización, los polisacáridos reticulados comestibles de la invención y las composiciones comestibles que los contienen es un aditivo alimentario. En una realización, los polisacáridos reticulados comestibles de la invención y las composiciones comestibles que los contienen es un agente modificador de la textura, tal como, por ejemplo, goma, espesante, extensor, estabilizador de la emulsión y aglutinante.
En una realización, uso de un polisacárido reticulado comestible de la invención y las composiciones comestibles que los contienen como un aditivo alimentario; en particular, un agente modificador de la textura, en donde el polisacárido es ácido hialurónico, almidón y un derivado del mismo, glucógeno, celulosa y un derivado del mismo, pectina, lignina, inulina, goma guar, goma xantana, ácidos algínicos (alginatos), heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, glucuronano, glucomanano, galactomanano y carrageninas.
También es parte de la invención, el uso de un polisacárido reticulado de la invención como vehículo, que es un sistema de administración de principios activos farmacéuticos, agentes de diagnóstico, compuestos cosméticos, péptidos, proteínas, anticuerpos, vacunas y genes.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprender" y variaciones de la palabra, no tienen por objeto excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Asimismo, la palabra "comprender" abarca el caso de "que consiste en". Objetos, ventajas y características adicionales de la invención resultarán evidentes para los expertos en la materia tras examinar la descripción o pueden aprenderse mediante la puesta en práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitantes de la presente invención. Los signos de referencia relacionados con dibujos y puestos entre paréntesis en una reivindicación, son únicamente para intentar aumentar la inteligibilidad de la reivindicación y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la reivindicación. Asimismo, la presente invención abarca todas las posibles combinaciones de realizaciones descritas en el presente documento.
Ejemplos
Lista de abreviaturas
HA: ácido hialurónico
GAG: glucosaminoglucano
G.R.: grado de reticulación
NaCMC: Carboximetilcelulosa de sodio
HES: almidón de hidroxietilo
GlcA: ácido D-glucurónico
GlcNAc: N-acetil-D-glucosamina
MEC: matriz extracelular
ERO: especies reactivas de oxígeno
HYAL: enzima hialuronidasa
AI: artritis inflamatoria
EDC: carbodiimida
DVS: divinil sulfona
BDDE: éter diglicidílico de 1,4-butanodiol
PEGDE: éter diglicidílico de poli (etilenglicol)
GDE: éter diglicidílico de 1,3-glicerol
EPI: éter diglicidílico de poliglicerol
FDA: Administración de fármacos y alimentos
PEE: Peso equivalente de epoxi
GPC: cromatografía de permeación en gel
SEC: cromatografía de exclusión por tamaño
SANS: Dispersión de neutrones en ángulo pequeño
RMN 1H: resonancia magnética nuclear de protón
PBS: solución tamponada con fosfato
IPN: redes interpenetrantes
MMP: metaloproteinasas
Pm: peso molecular promedio en peso
Mn: peso molecular promedio en número
Materiales
Hialuronato de sodio ultrapuro Shyalt (ácido hialurónico) de Altergon Italia.
Almidón con alto contenido de amilosa de Merck.
Almidón con alto contenido de amilopectina de Merck.
Carboximetilcelulosa de sodio 0,7 MDa, 0,8-0,9 D.S. AQUALON™, BLANOSE™ y BONDWELL™.
Éter diglicidílico de butanodiol (BDDE), PM = 202 Da de Merck.
Éter diglicidílico de polietilenglicol (PEGDE), PM = 526 Da de Merck.
1,3-Bis(2-oxiranilmetoxi)-2-propanol que también se conoce con los siguientes nombres, nombres comerciales, sinónimos y abreviaturas: 1,3-bis(oxiran-2-ilmetoxi)propan-2-ol; 2-propanol, 1,3-bis(oxiranilmetoxi); éter 1,3-diglicidílico de glicerol; Denacol<e X - 3 1 3 ,>PM = 204 Da, PEE = 141 g/eq de Nagase Chemtex; éter diglicidílico de 1,3-glicerol, PM = 204 Da de Merck; y 1,3-GDE tiene la siguiente estructura:
2,3-Bis(2-oxiranilmetoxi)-1-propanol que también se conoce con los siguientes nombres, nombres comerciales, sinónimos y abreviaturas: 2,3-bis(oxiran-2-ilmetoxi)propan-1-ol, 1-propanol, 1,2-bis(oxiranilmetoxi); éter 1,2-diglicidílico de glicerol; éter diglicidílico de 1,2-glicerol, PM = 204 Da de Merck; y 1,2-GDE tiene la siguiente estructura:
Las mezclas de 1,3-GDE y 1,2-GDE también están disponibles comercialmente con los siguientes nombres comerciales: Denacol EX-314, PM = 260 Da, PEE = 144 g/eq de Nagase Chemtex;
Pellets de hidróxido de sodio (NaOH) de Merck;
Ácido clorhídrico al 37 % (HCl) de Merck;
Polvo de cloruro de sodio (NaCl) de Merck;
Polvo de cloruro de potasio (KCl) de Merck;
Ácido fosfórico al 85 % (H<3>PO<4>) de Merck;
Pellets de solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Merck;
Agua destilada (H<2>O) de Merck.
Métodos
El método para la medición del Pm promedio, Mn y Pm/Mn se evaluó mediante análisis de GPC/SEC usando un instrumento cromatográfico equipado con detector de dispersión de luz.
El método para la medición del PEE se evaluó mediante titulación asistida por ultrasonidos.
El método para medir el pH se calculó mediante la lectura directa de un pHmetro equipado con un electrodo sumergido directamente en el hidrogel.
1. Éter poliglicidílico de poliglicerol hiperramificado
1.1. Uso de 1,3-GDE como material de partida
Los procedimientos de preparación mencionados a continuación también se pueden realizar utilizando el Denacol® EX-313 disponible en el mercado de Nagase como fuente de 1,3-GDE. No obstante, estos procedimientos también se pueden realizar usando el éter diglicidílico de 1,3-glicerol disponible comercialmente de Merck o con la marca registrada Denacol® EX-314 que es una mezcla de contiene 1,3-DGE en lugar de Denacol® EX-313.
1.1.1. Procedimiento 1
Se disolvieron los pellets de hidróxido de sodio (NaOH) en agua para formar una solución alcalina que contenía un 4 por ciento de NaOH (1 M) en peso basado en el peso total de la solución (solución A).
Se disolvió 1,3-GDE (Denacol® EX-313) a temperatura ambiente en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía del 1 al 50 por ciento de 1,3-GDE en peso basado en el peso total de la solución (solución C1).
Después se dejó reaccionar la solución C1 a temperatura controlada en el intervalo entre 50 y 80 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 500 minutos durante lo cual tiene lugar la autopolimerización de 1,3-GDE que da éteres poliglicidílicos de poliglicerol de la presente invención (solución C3 descrita en la tabla 1 (ejemplos 1-13).
1.1.2. Procedimiento 2
Se disolvieron pellets de hidróxido de sodio (NaOH) en agua para formar una solución alcalina que contenía un 4 por ciento de NaOH (1 M) en peso basado en el peso total de la solución (solución A).
Se disolvió 1,3-GDE (Denacol® EX-313) a temperatura ambiente en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía del 1 al 50 por ciento de 1,3-GDE en peso basado en el peso total de la solución (solución C1).
Después se dejó reaccionar la solución C1 a temperatura controlada en el intervalo entre 10 y 40 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 30 días durante lo cual tiene lugar la autopolimerización de 1,3-GDE que da éter poliglicidílico de poliglicerol de la presente invención (solución C2) descrita en la tabla 1 (ejemplos 14-31).
1.1.3. Caracterización del PPE de la presente invención
El peso molecular y el contenido de epoxi del PPE obtenido, medido como peso equivalente de epoxi expresado como porcentaje de PEE de GDE inicial, del PPE obtenidos siguiendo los procedimientos 1 y 2 se controlaron analíticamente a lo largo del tiempo utilizando respectivamente un instrumento GPC equipado con detector de dispersión de luz y titulación cuantitativa con HCl como se ha descrito anteriormente. Antes de cada análisis, la reacción de autopolimerización de GDE se detuvo añadiendo una solución de ácido clorhídrico 1 M y PBS para neutralizar el catalizador alcalino y restaurar el pH de la solución de éter poliglicidílico de poliglicerol a 7,0. Los valores del peso molecular medio (PM) y PEE del éter poliglicidílico de poliglicerol (PPE) obtenido de la presente invención para cada combinación de temperatura y tiempo se indican en la tabla 1.
Tabla 1
2. Polisacáridos reticulados
2.1. Ácido hialurónico reticulado
2.1.1. ácido hialurónico reticulado con PPE de la presente invención
2.1.1.1. Procedimiento de preparación
El ácido hialurónico reticulado con PPE de los ejemplos 1-13 (véase tabla 2) se preparó siguiendo los procedimientos que se definen a continuación. El ácido hialurónico reticulado con PPE de los ejemplos 14-16 (véase tabla 2) se prepararon siguiendo los mismos procedimientos que para los ejemplos 1-13, pero usando una concentración de reticulante aproximadamente 2,5 veces mayor que en los ejemplos 1-13, que es una concentración de 1,00.
Procedimiento 1
A. Preparación del éter poliglicidílico de poliglicerol de los ej. 1-13 siguiendo el procedimiento descrito en la sección 1.1.2. anterior.
B. Preparación de polisacáridos reticulados
Alternativa B1
El polvo seco de ácido hialurónico (HA) se disolvió suavemente a temperatura ambiente (25 °C) en una parte de la solución A (o se añadió directamente a la solución C3) para formar una solución alcalina que contenía de 5 a 15 por ciento de HA hidratado en peso basado en el peso total de la solución (solución B).
La solución C3 se añade después a la solución B para proporcionar una solución alcalina con una concentración de hidróxido en la solución final en el intervalo de 0,25 y 0,75 M y con una relación de HA y PPE de 2 a 12,5 % p/p (expresada como relación en peso de PPE con respecto a polisacárido seco).
Alternativa B2
La solución C3 se añade después a la solución B para proporcionar una solución alcalina con una concentración de hidróxido en la solución final en el intervalo de 0,25 y 0,75 M, una concentración de HA en la solución final en el intervalo de 8 a 10 % en peso en relación con el peso total y una concentración de PPE en la solución final en el intervalo de 0,2 a 1 % en peso en relación con el peso total. La relación expresada como relación en peso de PPE con respecto a polisacárido seco es de 2 a 40 % p/p expresada como relación en peso de PPE con respecto a polisacárido seco.
C. Reacción y aislamiento del polisacárido reticulado
La solución alcalina resultante que consiste en HA, PPE y NaOH se mezcla después exhaustivamente a temperatura ambiente. Después, se dejó reaccionar la solución homogénea a temperatura controlada en el intervalo entre 20 y 50 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 48 horas.
El ácido hialurónico reticulado con PPE (hidrogel) se lavó después con una solución de agua ácida (ácido clorhídrico 1 M y PBS) de 48 a 120 horas para eliminar los materiales y subproductos que no habían reaccionado, para neutralizar el catalizador alcalino y restaurar el pH del ácido hialurónico reticulado con PPE (hidrogel) a 6,5-7,4 mediante intercambio iónico y para alcanzar la concentración final deseada de HA en el hidrogel de ácido hialurónico reticulado con PPE de 1 a 50 mg/ml como se muestra en la tabla 2.
El ácido hialurónico reticulado con PPE (hidrogel) se cargó en jeringas y se esterilizó por vapor en autoclave siguiendo los procedimientos aceptados por la farmacopea descritos en la EN ISO 17665-1, Sterilization of health care products - Moist heat Part 1: requirements for the development, validation and routine control of a sterilization process for medical device (p. ej., 15 min a 121 °C).
El ácido hialurónico reticulado con PPE (hidrogel) podría deshidratarse opcionalmente al vacío a 30 °C o liofilizarse (criodesecarse) y almacenarse para su posterior uso o análisis.
Procedimiento 2
A. Preparación del éter poliglicidílico de poliglicerol de los ej. 14-31 siguiendo el procedimiento descrito en la sección 1.1.3. anterior.
B. Preparación de polisacáridos reticulados
Alternativa B1
El ácido hialurónico (HA) se disolvió suavemente a temperatura ambiente (25 °C) en una parte de la solución A (o se añadió directamente a la solución C3) para formar una solución alcalina que contenía de 5 a 15 por ciento de HA hidratado en peso basado en el peso total de la solución (solución B). La solución C3 se añade después a la solución B para proporcionar una solución alcalina con una concentración de hidróxido en la solución final en el intervalo de 0,25 y 0,75 M y con una relación de HA y PPE de 2 a 12,5 % p/p (expresada como relación en peso de PPE con respecto a polisacárido seco).
Alternativa B2
La solución C3 se añade después a la solución B para proporcionar una solución alcalina con una concentración de hidróxido en la solución final en el intervalo de 0,25 y 0,75 M, una concentración de HA en la solución final en el intervalo de 8 a 10 % en peso en relación con el peso total y una concentración de PPE en la solución final en el intervalo de 0,2 a 1 % en peso en relación con el peso total. La relación expresada como relación en peso de PPE con respecto a polisacárido seco es de 2 a 40 % p/p (expresada como relación en peso de PPE con respecto a polisacárido seco).
C. Reacción y aislamiento del polisacárido reticulado
La solución alcalina resultante que consiste en HA, PPE y NaOH se mezcla después exhaustivamente a temperatura ambiente. Después, se dejó reaccionar la solución homogénea a temperatura controlada en el intervalo entre 20 y 50 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 48 horas.
El ácido hialurónico reticulado con PPE (hidrogel) se lavó después con una solución de agua ácida (ácido clorhídrico 1 M y PBS) de 48 a 120 horas para eliminar los materiales y subproductos que no habían reaccionado, para neutralizar el catalizador alcalino y restaurar el pH del hidrogel a 6,5-7,4 mediante intercambio iónico y para alcanzar la concentración final de HA en el hidrogel de ácido hialurónico reticulado con PPE (hidrogel) de 1 a 50 mg/ml como se muestra en la tabla 2.
El ácido hialurónico reticulado con PPE (hidrogel) se cargó en jeringas y se esterilizó por vapor en autoclave siguiendo los procedimientos aceptados por la farmacopea descritos en la EN ISO 17665- 1, Sterilization of health care products - Moist heat Part 1: requirements for the development, validation and routine control of a sterilization process for medical device (p. ej., 15 min a 121 °C). El ácido hialurónico reticulado con PPE (hidrogel) podría deshidratarse opcionalmente al vacío a 30 °C o liofilizarse (criodesecarse) y almacenarse para su posterior uso o análisis.
2.1.1.2. Caracterización del ácido hialurónico reticulado con PPE de la presente invención (ej. 1-16 de ácido hialurónico reticulado con PPE)
Las propiedades mecánicas del ácido hialurónico reticulado con PPE de la presente invención obtenido a partir del PPE de la presente invención se describen en la tabla 2. El ácido hialurónico reticulado con PPE descrito en los ejemplos 1-13 en la tabla 2 tiene una concentración de 22,0 mg/ml de ácido hialurónico, mientras que los ejemplos 14-16 tienen una concentración de reticulante aproximadamente 2,5 veces mayor que la de los ejemplos 1-13.
Tabla 2
a) concentración de HA en el HA reticulado con PPE expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
(b) concentración de PPE de la presente invención en el HA reticulado con PPE expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
2.1.2. Ácido hialurónico reticulado comparativo
2.1.2.1. Ácido hialurónico reticulado con 1,3-GDE comparativo (GDE-HA comparativo)
El GDE-HA comparativo mencionado a continuación se prepara utilizando Denacol® EX-313 disponible en el mercado de Nagase como fuente de 1,3-GDE. No obstante, estos procedimientos también se pueden realizar usando el éter diglicidílico de 1,3-glicerol disponible comercialmente de Merck o con la marca registrada Denacol® EX-314 que es una mezcla que contiene 1,3-DGE en lugar de Denacol® EX-313.
El ácido hialurónico reticulado con GDE comparativo de los ejemplos comparativos 1-5 (véase tabla 4) se preparó siguiendo los procedimientos que se definen a continuación. El ácido hialurónico reticulado con GDE comparativo del ejemplo comparativo 6 (véase tabla 4) se preparó siguiendo los mismos procedimientos que para los ejemplos 1-5, pero usando una concentración de reticulante de 1,00 y con una G.R. de 0,4037 %.
Procedimiento de preparación
Se disolvieron pellets de hidróxido de sodio (NaOH) en agua para formar una solución alcalina que contenía un 4 por ciento de NaOH (1 M) en peso basado en el peso total de la solución (solución A). El hA se disolvió suavemente a temperatura ambiente (25 °C) en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía de 5 a 15 por ciento de HA hidratado en peso basado en el peso total de la solución (solución B). Se disolvió GDE a temperatura ambiente en agua destilada para formar una solución neutra que contenía del 1 al 10 por ciento de GDE en peso basado en el peso total de la solución (solución C1). Opcionalmente, Se disolvió GDE a temperatura ambiente en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía del 0,2 al 2 por ciento de GDE en peso basado en el peso total de la solución (solución C2). Después, se añade la solución C (C1/C2) a la solución B para proporcionar una solución alcalina con una concentración de hidróxido en la solución final en el intervalo de 0,25 a 0,75 M y con la relación deseada de HA y GDE. La solución alcalina resultante que consiste en HA, GDE y NaOH se mezcla después exhaustivamente a temperatura ambiente.
Después, se dejó reaccionar la solución homogénea a temperatura controlada en el intervalo entre 20 y 50 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 48 horas. El ácido hialurónico reticulado con GDE comparativo (hidrogel) se lavó después con una solución de agua ácida (ácido clorhídrico 1 M y PBS) de 48 a 120 horas para eliminar los materiales y subproductos que no habían reaccionado, para neutralizar el catalizador alcalino y restaurar el pH del hidrogel a 6,5-7,4 por intercambio iónico y para alcanzar la concentración de HA en el hidrogel de 1 a 50 mg/ml como se muestra en la tabla 4 a continuación (ejemplos comparativos de GDE 1-5).
El hidrogel se cargó en jeringas y se esterilizó por vapor en autoclave siguiendo los procedimientos aceptados por la farmacopea indicados en la norma e N ISO 17665-1 (p. ej., 15 min a 121 °C). El ácido hialurónico reticulado con GDE comparativo (hidrogel) podría deshidratarse opcionalmente al vacío a 30 °C o liofilizarse (criodesecarse) y almacenarse para su posterior uso o análisis.
Caracterización del ácido hialurónico reticulado con GDE comparativo (GDE-HA comp. 1-6)
Las propiedades mecánicas del ácido hialurónico reticulado con GDE comparativo que quedan fuera del alcance de la presente invención obtenido a partir de 1,3-GDE comercial se describen en la tabla 4 con una concentración de 22,0 mg/ml de ácido hialurónico.
Tabla 4
a) concentración de HA en el HA reticulado con GDE expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
(b) concentración de GDE de la presente invención en el HA reticulado con GDE expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
2.1.2.2. Ácido hialurónico reticulado con BDDE comparativo (BDDE-HA comparativo)
Procedimiento de preparación
Se disolvieron pellets de hidróxido de sodio (NaOH) en agua para formar una solución alcalina que contenía un 4 por ciento de NaOH (1 M) en peso basado en el peso total de la solución (solución A). El ácido hialurónico se disolvió suavemente a temperatura ambiente (25 °C) en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía de 5 a 15 por ciento de HA hidratado en peso basado en el peso total de la solución (solución B).
Se disolvió BDDE a temperatura ambiente en agua destilada para formar una solución neutra que contenía del 0,2 al 2 por ciento de BDDE en peso basado en el peso total de la solución (solución C1). Opcionalmente, Se disolvió BDDE a temperatura ambiente en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía del 1 al 10 por ciento de BDDE en peso basado en el peso total de la solución (solución C2). Después, se añade la solución C (C1 neutro o C2 alcalino) a la solución B para proporcionar una solución alcalina con una concentración de hidróxido en la solución final en el intervalo de 0,25 a 0,75 M y con la relación deseada de HA y BDDE. La solución alcalina resultante que consiste en HA, BDDE y NaOH se mezcla después exhaustivamente a temperatura ambiente. Después, se dejó reaccionar la solución homogénea a temperatura controlada en el intervalo entre 20 y 50 °C durante un periodo comprendido entre 30 min y 48 horas.
El ácido hialurónico reticulado con BDDE comparativo (hidrogel) se lavó después con una solución de agua ácida (ácido clorhídrico 1 M y PBS) de 48 a 120 horas para eliminar los materiales y subproductos que no habían reaccionado, para neutralizar el catalizador alcalino y restaurar el pH del hidrogel a 6,5-7,4 mediante intercambio iónico y para alcanzar la concentración de HA en el ácido hialurónico reticulado con comparativo BDDE comparativo (hidrogel) de 1 a 50 mg/ml como se muestra en la tabla posterior (Ej. comp. 1-5 de BDDE-HA).
El ácido hialurónico reticulado con BDDE comparativo (hidrogel) se cargó en jeringas y se esterilizó por vapor en autoclave siguiendo los aceptados por la farmacopea señalados en la En ISO 17665-1 (p. ej.,15 min a 121 °C). El ácido hialurónico reticulado con BDDE comparativo (hidrogel) podría deshidratarse opcionalmente al vacío a 30 °C y almacenarse para su posterior uso o análisis.
Caracterización del ácido hialurónico reticulado con BDDE comparativo
Las propiedades mecánicas del ácido hialurónico reticulado con BDDE comparativo que quedan fuera del alcance de la presente invención obtenido a partir del BDDE comercial se describen en la tabla 5 con una concentración de 22,0 mg/ml de ácido hialurónico.
Tabla 5
a) concentración de HA en el HA reticulado con GDE expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
(b) concentración de BDDE de la presente invención en el HA reticulado con BDDE expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
2.1.2.3. Ácido hialurónico reticulado con PEGDE comparativo (PEGDE-HA comparativo)
Procedimiento de preparación
Se disolvieron pellets de hidróxido de sodio (NaOH) en agua para formar una solución alcalina que contenía un 4 por ciento de NaOH (1 M) en peso basado en el peso total de la solución (solución A). El HA se disolvió suavemente a temperatura ambiente (25 °C) en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía de 5 a 15 por ciento de HA hidratado en peso basado en el peso total de la solución (solución B). Se disolvió PEGDE a temperatura ambiente en agua destilada para formar una solución neutra que contenía del 0,4 al 4 por ciento de PEGDE en peso basado en el peso total de la solución (solución C1). Opcionalmente, Se disolvió PEGDE a temperatura ambiente en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía del 1 al 10 por ciento de PEGDE en peso basado en el peso total de la solución (solución C2). Después, se añade la solución C (C1/C2) a la solución B para proporcionar una solución alcalina con una concentración de hidróxido en la solución final en el intervalo de 0,25 a 0,75 M y con la relación deseada de HA y PEGDE. La solución alcalina resultante que consiste en HA, PEGDE y NaOH se mezcla después exhaustivamente a temperatura ambiente. Después, se dejó reaccionar la solución homogénea a temperatura controlada en el intervalo entre 20 y 50 °C durante un periodo tiempo comprendido entre 1 y 48 horas. El ácido hialurónico reticulado con PEGDE comparativo (hidrogel) se lavó después con una solución de agua ácida (ácido clorhídrico 1 M y PBS) de 48 a 120 horas para eliminar los materiales y subproductos que no habían reaccionado, para neutralizar el catalizador alcalino y restaurar el pH del ácido hialurónico reticulado con PEGDE comparativo (hidrogel) a 6,5-7,4 mediante intercambio iónico y para alcanzar la concentración final de HA en el ácido hialurónico reticulado con PEGDE comparativo (hidrogel) de 1 a 50 mg/ml como se muestra en la tabla posterior (Ej. comp. 1-5 de PEGDE-HA).
El ácido hialurónico reticulado con PEGDE comparativo (hidrogel) se cargó en jeringas y se esterilizó por vapor en autoclave siguiendo los aceptados por la farmacopea señalados en la<e>N ISO 17665-1 (p. ej., 15 min a 121 °C). El hidrogel podría deshidratarse opcionalmente al vacío a 30 °C y almacenarse para el siguiente uso o análisis.
Caracterización del ácido hialurónico reticulado con PEGDE comparativo
Las propiedades mecánicas del ácido hialurónico reticulado con PEGDE comparativo que quedan fuera del alcance de la presente invención obtenido a partir del PEGDE comercial se describen en la tabla 6 con una concentración de 22,0 mg/ml de ácido hialurónico.
Tabla 6
a) concentración de HA en el HA reticulado con GDE expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
(b) concentración de PEGDE de la presente invención en el HA reticulado con PEGDE expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
2.1.3. Ensayos
2.1.3.1. Ensayo de viabilidad
Se utilizó el ensayo MTT para evaluar la viabilidad de los fibroblastos de ratón 3T3 cultivados.
Los ensayos MTT se realizaron con:
el ácido hialurónico reticulado de BDDE comparativo (hidrogel) (Ej. comparativo 3 de BDDE-HA), ácido hialurónico reticulado con PEGDE comparativo (hidrogel) (Ej. comparativo 3 de PEGDE-HA), ácido hialurónico reticulado con PPE (hidrogel) de la presente invención (ej. 3 de PPE-HA),
BDDE,
PEGDE y
PPE (ej. 22 de PPE de la presente invención).
a) Ensayo MTT en células cultivadas en contacto directo con el hidrogel probado.
El ensayo MTT se realizó en células cultivadas en contacto directo con 100 mg de cada muestra probada. Este ensayo MTT muestra una diferencia en la viabilidad celular entre los tres hidrogeles probados con respecto al control (representado por medio de cultivo), que se atribuye a una inhibición de la proliferación celular provocada principalmente por un escaso espacio disponible debido a la presencia de hidrogel, en lugar de tejidos tóxicos o de baja biocompatibilidad. En particular, la viabilidad celular en presencia del ácido hialurónico reticulado con PPE de la presente invención es significativamente mayor en comparación con el control y con el ácido hialurónico reticulado comparativo con BDDE y PEDGE.
b) Ensayo MTT en células cultivadas en el extracto de hidrogel.
El ensayo MTT se realizó en células cultivadas en presencia del extracto de hidrogel probado obtenido por inmersión del hidrogel reticulado probado en medio de cultivo durante 24 horas.
El ensayo MTT, realizado en células cultivadas en presencia de extractos de los hidrogeles probados no muestra diferencias en la viabilidad celular entre los hidrogeles y el control, esto significa que los tres hidrogeles probados no liberaron sustancias tóxicas en el medio cuando estos hidrogeles se empaparon durante 24 horas en medio de cultivo. Se atribuye a un procedimiento de fabricación bueno y controlado, en el que todas las materias primas y subproductos sin reaccionar se eliminan de manera eficaz durante la fabricación de reticulación. c)
c) Ensayo MTT en células cultivadas en contacto directo con el reticulante
El ensayo MTT se realizó en células cultivadas en contacto directo con una solución que contenía soluciones reticulantes. La solución contiene los mismos equivalentes de epoxi, siguiendo las mismas etapas del procedimiento de fabricación de hidrogeles, tales como reacción química, lavado y esterilización, pero sin la adición del polisacárido.
El ensayo MTT muestra que la viabilidad de las células cultivadas en contacto directo con PPE no es significativamente diferente con respecto al control (medio de cultivo en NaCl a 0,9 %). Las imágenes microscópicas confirmaron que las células en contacto directo con PPE tienen buena forma y viabilidad en comparación con las células cultivadas en contacto directo con BDDE y PEGDE que, en cambio, muestran una disminución significativa de la viabilidad celular y signos de padecimiento.
2.I.3.2. Ensayo de degradación enzimática
La evaluación de la tasa de degradación enzimática se realizó con:
el ácido hialurónico reticulado con BDDE comparativo (hidrogel) Ej. comp. 3 de BDDE-HA,
ácido hialurónico reticulado con PEGDE comparativo (hidrogel) Ej. comp. 3 de PEGDE-HA,
ácido hialurónico reticulado con GDE comparativo (hidrogel) Ej. comp. 3 de GDE-HA, y
ácido hialurónico reticulado con PPE (hidrogel) de la presente invención Ej. 4 de PPE-HA, ej. 5 de PPE-HA y ej. 6 de PPE-HA.
Se trataron 0,2 ml de cada ácido hialurónico reticulado (hidrogel) probado con 10 pl de hialuronidasa 0,1 mg/ml procedente de pruebas bovinas (tipo IV-S; 1040 unidades/mg de sólido). Los hidrogeles probados se incubaron durante 16 horas a 37 °C en PBS, se evaluó el ácido urónico del ácido hialurónico degradado con ensayo de carbazol. Los hidrogeles de ácido hialurónico reticulados probados de 22 mg/ml mostraron una tasa de degradación en respuesta a la hialuronidasa de 74,4 % (BDDE reticulado como control) a 26,3 % de ácido urónico libre por degradación enzimática.
El hidrogel de BDDE comparativo (ej. comp. 3 de BDDE-HA), el hidrogel de PEGDE comparativo (ej. comp. de PEGDE-HA 3) y el hidrogel comparativo de GDE (ej. comp. 3 de GDE-HA) reticulado con ácido hialurónico mostraron un grado similar de reticulación y, por lo tanto, cantidad comparable de ácido urónico libre después de la degradación enzimática de 74,4, 70,8 y 69,5 %, respectivamente.
Los hidrogeles de PPE de la presente invención (ej. 4 y ej. 5 de PPE-HA) mostraron una disminución del grado de reticulación, por lo tanto, debe esperarse una disminución de la resistencia a la degradación enzimática, de forma inesperada y contradictoria, la cantidad de ácido urónico libre después de la degradación enzimática se reduce a 56,7 % y 26,3 % respectivamente, lo que indica un aumento estadísticamente significativo de la resistencia a la degradación enzimática.
El HA reticulado con PPE Ej. 6 de PPE-HA mostró una cantidad de ácido urónico libre después de la degradación enzimática del 58,0 %, comparable con el ácido urónico libre derivado de HA reticulado con PPE del ej. 4 de PPE-HA, lo que indica que la resistencia a la degradación enzimática es comparable (56,7 y 58,0 % respectivamente) incluso si los dos hidrogeles tienen dos grados de reticulación diferentes, en particular, el G.R. del ej. 6 de PPE-HA es significativamente menor que el G.R. del ej. 4 de PPE-HA (0,2688 y 0,1528 % respectivamente).
Por lo tanto, el efecto protector del PPE de la presente invención es significativamente mayor contra la degradación enzimática que el GDE, BDDE y PEGDE comparativos. En particular, el efecto protector de PPE con alto peso molecular (es decir, de 3000 Da a 15000 Da) es mayor que el efecto protector de PPE con bajo peso molecular contra la degradación enzimática (es decir, de 750 Da a menos de 3000 Da), incluso si el PPE de bajo peso molecular da las mejores propiedades mecánicas. El HA 22 mg/ml del hidrogel del experimento 51 mostró mayor resistencia a la degradación enzimáticain vitropor hialuronidasa que los demás.
Los resultados del ensayo de degradación enzimática del ácido hialurónico comparativo reticulado con BDDE, PEGDE, GDE y el ácido hialurónico reticulado con PPE de la presente invención se resumen en la siguiente tabla:
Tabla 7
. . , , ,<n>, ,
<b> G.R. = 0,1358; G' = 85,56 ± 2,94 y D<n>= 34,92 ± 0,19
<c> G.R. = 0,1127; G' = 54,09 ± 4,07 y D<n>= 37,17 ± 0,33
Por lo tanto, como se ha mostrado en los resultados anteriores, los polisacáridos reticulados de la presente invención preparados mediante el uso del PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante tienen una mejor resistencia a la degradación enzimática (lo que significa un porcentaje menor de tasa de degradación enzimática relativa) que los polisacáridos reticulados que quedan fuera del alcance de protección de la presente invención preparada utilizando los reticulantes comparativos descritos anteriormente pero que tienen propiedades físicas comparables. En particular, se demuestra que los polisacáridos reticulados de la presente invención (obtenidos mediante el uso del PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante), que tienen propiedades físicas comparables (expresadas numéricamente por el valor de G' y, en consecuencia, por el valor de D<n>y G.R.) a los polisacáridos reticulados comparativos que quedan fuera del alcance de protección de la presente invención (obtenidos usando GDE, BDDE y PEGDE comerciales como reticulantes) tienen una mayor resistencia enzimática (es decir, menor tasa de degradación enzimática).
Asimismo, los resultados anteriores también muestran que los polisacáridos reticulados de la presente invención (obtenidos utilizando el PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante), tienen una mayor tasa de degradación enzimática con una menor cantidad de reticulante, que se expresa numéricamente por tener la misma tasa de degradación que los polisacáridos reticulados comparativos pero un valor menor de G', D<n>y G.R. Esto es ventajoso porque la menor modificación química del polisacárido debido a la menor cantidad de reticulado utilizada mejora su biocompatibilidad y seguridad después de su inyección en la piel.
2.I.3.3. Ensayo de degradación oxidativa
Muestras:
La evaluación de la tasa de degradación oxidativa se realizó con:
el ácido hialurónico reticulado con BDDE comparativo Ej. comp. 3 de BDDE-HA,
ácido hialurónico reticulado con PEGDE comparativo Ej. comp. 3 de PEGDE-HA,
ácido hialurónico reticulado con GDE comparativo Ej. comp. 3 de GDE-HA y
ácido hialurónico reticulado con PPE de la presente invención Ej. 4 de p PE-HA, ej. 5 de PPE-HA y ej. 6 de PPE-HA.
Método:
La resistencia a la degradación oxidativa se evaluó siguiendo el método descrito en el estado de la técnica (consúltese Bitter, T. y H.M. Muir, "Amodified uronic acid carbazole reaction.Analytical Biochemistry", 1962, vol. 4 (4), págs. 330-334):
Se trataron 0,2 ml de cada ácido hialurónico reticulado probado con reactivo de Fenton (10 pl de Fe+2/H<2>Ü<2>0,1 M y 25 pl de ácido ascórbico 0,1 M en 5 ml de PBS), incubados durante 24 horas a 37 °C. Se evaluó el ácido urónico del ácido hialurónico degradado con el ensayo de carbazol. El ácido hialurónico reticulado probado de 22 mg/ml mostró una tasa de degradación en respuesta a la oxidación de 88,0 % (PEGDE reticulado) a 61,6 % de ácido urónico libre por degradación oxidativa.
El ácido hialurónico reticulado con BDDE comparativo (ej. comp. 3 de BDDE-HA), el ácido hialurónico reticulado con PEGDE comparativo (ej. comp. 3 de PEGDE-HA) y el ácido hialurónico reticulado con hidrogel de GDE comparativo (ej. comp. 3 de GDE-HA) muestran un grado de reticulación comparable y, por lo tanto, cantidad comparable de ácido urónico libre después de la degradación oxidativa de 81,2, 88,0 y 80,2, respectivamente, siendo el ácido hialurónico reticulado con PEGDE el más sensible a la degradación oxidativa.
El ácido hialurónico reticulado con PPE de la presente invención (ej. 4 de PPE-HA y ej. 5 de PPE-HA) muestra una disminución del grado de reticulación, por lo tanto, debe esperarse una disminución de la resistencia a la degradación oxidativa, de forma inesperada y contradictoria, la cantidad de ácido urónico libre después de la degradación oxidativa se reduce a 65,9 y 61,6 respectivamente, lo que indica un aumento estadísticamente significativo de la resistencia a la degradación oxidativa. El HA reticulado con PPE de la presente invención del ej. 6 de PPE-HA muestra una cantidad de ácido urónico libre después de la degradación oxidativa del 69,6 %, poco mayor que el ácido urónico libre derivado de HA reticulado con PPE del ej. 4 de PPE-HA y el ej. 5 de PPE-HA, pero menor de forma estadísticamente significativa que los experimentos 3, 8 y 13, lo que indica que la resistencia a la degradación oxidativa del ácido hialurónico reticulado con PPE de la presente invención es mayor que los polisacáridos reticulados con BDDE, PEGDE y GDE comparativos que quedan fuera del alcance de la presente invención.
Resultados:
Los resultados del ensayo de degradación oxidativa del ácido hialurónico comparativo reticulado con BDDE, PEGDE, GDE y el ácido hialurónico reticulado con PPE de la presente invención se resumen en la siguiente tabla:
Tabla 8
<a> G.R. = 0,2745; G' = 274,17 ± 9,54; y DN = 27,62 ± 0,23
<b> G.R. = 0,1358; G' = 85,56 ± 2,94; y DN = 34,92 ± 0,19
<c> G.R. = 0,1127; G' = 54,09 ± 4,07; y DN = 37,17 ± 0,33
Por lo tanto, como se muestra en los resultados anteriores y se ha mencionado anteriormente para la tasa de degradación enzimática, los polisacáridos reticulados de la presente invención preparados mediante el uso del PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante tienen una mejor resistencia a la degradación oxidativa (lo que significa un porcentaje menor de tasa de degradación oxidativa relativa) que los polisacáridos reticulados que quedan fuera del alcance de protección de la presente invención preparada utilizando los reticulantes comparativos descritos anteriormente pero que tienen propiedades físicas comparables.
Asimismo, los resultados anteriores también muestran que los polisacáridos reticulados de la presente invención (obtenidos utilizando el PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante), tienen una mayor tasa de degradación oxidativa con una menor cantidad de reticulante. Esto es ventajoso porque la menor modificación química del polisacárido debido a la menor cantidad de reticulado utilizado, mejora su biocompatibilidad y seguridad después de su inyección en la piel.
2.2. Almidón de amilosa reticulado
2.2.1. Almidón de amilosa reticulado con PPE de la presente invención (PPE-AS)
El PPE-AS mencionado a continuación se prepara utilizando Denacol® EX-313 disponible en el mercado de Nagase como fuente de 1,3-GDE. No obstante, estos procedimientos también se pueden realizar usando el éter diglicidílico de 1,3-glicerol disponible comercialmente de Merck o con la marca registrada Denacol® EX-314 que es una mezcla que contiene 1,3-DGE en lugar de Denacol® EX-313.
Procedimiento de preparación
Se disolvieron pellets de hidróxido de sodio (NaOH) en agua para formar una solución alcalina que contenía un 4 por ciento de NaOH (1 M) en peso basado en el peso total de la solución (solución A). Se disolvió 1,3-GDE a temperatura ambiente en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía del 1 al 50 por ciento de GDE en peso basado en el peso total de la solución (solución C1). Después se dejó reaccionar la solución C1 a temperatura controlada en el intervalo entre 10 y 40 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 30 días o, como alternativa, a temperatura controlada en el intervalo entre 20 y 50 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 48 horas durante el cual tiene lugar la autopolimerización de 1,3-GDE que da el éter poliglicidílico de poliglicerol con el peso molecular y/o el contenido de epoxi específico descrito en la tabla 1 (solución C3).
El almidón de alto contenido de amilosa se dispersó suavemente a temperatura ambiente (25 °C) en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía de 5 a 15 por ciento de almidón hidratado de alto contenido de amilosa en peso basado en el peso total de la solución (solución B). Después, se añade la solución C3 a la solución B para proporcionar una solución alcalina con una concentración de hidróxido en la solución final en el intervalo de 0,25 a 0,75 M y con la relación de almidón y PPE de alto contenido de amilosa. La solución alcalina resultante que consiste en almidón de alto contenido de amilosa, PPE y NaOH se mezcla después exhaustivamente a temperatura ambiente. Después, se dejó reaccionar la solución homogénea a temperatura controlada en el intervalo entre 20 y 50 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 48 horas.
El almidón de alto contenido de amilosa reticulado con PPE (hidrogel) se lavó después con una solución de agua ácida (ácido clorhídrico 1 M y PBS) de 48 a 120 horas para eliminar los materiales y subproductos que no habían reaccionado, para neutralizar el catalizador alcalino y restaurar el pH del hidrogel a 6,5-7,4 mediante intercambio iónico y para alcanzar la concentración de almidón de alto contenido de amilosa en el almidón de amilosa reticulado con PPE (hidrogel) de 1 a 50 mg/ml como se muestra en la tabla posterior (ej. 1-3 de PPE-AS).
El hidrogel de almidón de amilosa reticulado con PPE se cargó en jeringas y se esterilizó por vapor en autoclave siguiendo los aceptados por la farmacopea señalados en la e N ISO 17665-1 (p. ej., 15 min a 121 °C). El hidrogel de almidón de amilosa reticulado con PPE podría deshidratarse opcionalmente mediante liofilización y almacenarse para su uso o análisis posterior.
2.2.2. Almidón de amilosa reticulado con GDE comparativo (GDE-AS comp.)
El almidón de amilosa reticulado con GDE comparativo se preparó siguiendo el procedimiento como se ha descrito anteriormente en la sección 2.1.2.1. para el ácido hialurónico reticulado con 1,3-GDE comparativo pero usando almidón de amilosa en lugar de ácido hialurónico.
2.2.3. Caracterización del almidón de amilosa reticulado
Las propiedades mecánicas del almidón de amilosa reticulado con PPE de la presente invención (PPE-AS) y el almidón de amilosa reticulado con GDE comparativo (GDE-AS comp.) obtenido anteriormente se describen en la tabla a continuación.
Tabla 9
a) concentración de amilosa en el hidrogel reticulado expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
(b) concentración del reticulante de la presente invención en la amilosa reticulada expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
2.2.4 Ensayo
2.2.4.1 Ensayo de degradación enzimática
Muestras:
La evaluación de la tasa de degradación enzimática se realizó con:
el almidón de amilosa reticulado con GDE comparativo (hidrogel) Ej. comp. 1 de GDE-AS, y
almidón de amilosa reticulado con PPE (hidrogel) de la presente invención Ej. 1 de PPE-AS, ej. 2 de PPE-AS y ej. 3 de PPE-AS.
Método:
Se trataron 0,2 ml de cada almidón de amilosa reticulado (hidrogel) probado con 10 pl de 0,1 mg/ml de aamilasas deBacillus licheniformis(polvo liofilizado, 500-1.500 unidades/mg de proteína). Los hidrogeles probados se incubaron durante 16 horas a 37 °C en PBS, los monómeros de hexosas de hidrogel de almidón de amilosa degradado se evaluaron con un ensayo de carbazol. Los hidrogeles de almidón de amilosa reticulados probados de 22 mg/ml mostraron una tasa de degradación enzimática relativa en respuesta a las a-amilasas de 80,3 % a 41,7 %.
Resultados:
El almidón de amilosa reticulado con GDE comparativo (ej. comp. 1 de GDE-AS) y el almidón de amilosa reticulado con PPE de la presente invención (ej. 1 de PPE-AS) muestran un grado de reticulación comparable, Los hidrogeles de PPE de la presente invención (ej.2 de PPE-AS y ej. 3 de PPE-AS) mostraron una disminución del grado de reticulación, por lo tanto, debe esperarse una disminución de la resistencia a la degradación enzimática, de forma inesperada y contradictoria, la cantidad de monómeros de hexosas libres después de la degradación enzimática se reduce a 41,7 % y 80,0 % respectivamente, lo que indica un aumento estadísticamente significativo de la resistencia a la degradación enzimática.
El HA reticulado con PPE Ej. 3 de PPE-AS mostró una cantidad de monómeros de hexosas libres después de la degradación enzimática comparable con la cantidad de monómeros de hexosas libres derivados del almidón reticulado con PPE del ej. 1 de PPE-AS, lo que indica que la resistencia a la degradación enzimática es comparable (80,0 % y 80,3 respectivamente) incluso si los dos hidrogeles tienen dos grados de reticulación diferentes, en particular, el G.R. del ej. 3 de PPE-AS es significativamente menor que el G.R. del ej. 1 de PPE-AS (0,1548 y 0,1981 % respectivamente).
Por lo tanto, el efecto protector del PPE de la presente invención es significativamente mayor contra la degradación enzimática que el GDE comparativo. En particular, el efecto protector de PPE con alto peso molecular (es decir, de 3000 Da a 15000 Da) es mayor que el efecto protector de PPE con bajo peso molecular contra la degradación enzimática (es decir, de 750 Da a menos de 3000 Da), incluso si el PPE de bajo peso molecular da las mejores propiedades mecánicas. El AS de 22 mg/ml del ej. 2 de PPE-AS mostró mayor resistencia a la degradación enzimáticain vitropor hialuronidasa que los demás.
Los resultados del ensayo de degradación enzimática del almidón de amilosa comparativo reticulado con GDE y el almidón de amilosa reticulado con PPE de la presente invención se resumen en la tabla a continuación: Tabla 10
Por lo tanto, como se ha mostrado en los resultados anteriores, los polisacáridos reticulados de la presente invención preparados mediante el uso del PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante tienen una mejor resistencia a la degradación enzimática (lo que significa un porcentaje menor de tasa de degradación enzimática relativa) que los polisacáridos reticulados que quedan fuera del alcance de protección de la presente invención preparada utilizando los reticulantes comparativos descritos anteriormente pero que tienen propiedades físicas comparables. En particular, se demuestra que los polisacáridos reticulados de la presente invención (obtenidos usando el PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante) tienen una mayor resistencia enzimática (es decir, menor tasa de degradación enzimática). Asimismo, los resultados anteriores también muestran que los polisacáridos reticulados de la presente invención (obtenidos utilizando el PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante), tienen una mayor tasa de degradación enzimática con una menor cantidad de reticulante.
2.2.4.2 Ensayo de degradación oxidativa
Muestras:
La evaluación de la tasa de degradación oxidativa se realizó con:
el almidón de amilosa reticulado con GDE comparativo Ej. comp. 1 de GDE-AS, y
almidón de amilosa reticulado con PPE de la presente invención Ej. 1 de PPE-AS, ej. 2 de PPE-AS y ej. 3 de PPE-AS.
Método:
La resistencia a la degradación oxidativa se evaluó siguiendo el método descrito en el estado de la técnica (consúltese Bitter, T. y H.M. Muir, "Amodified uronic acid carbazole reaction.Analytical Biochemistry", 1962, vol. 4 (4), págs. 330-334):
Se trataron 0,2 ml de cada almidón de amilosa reticulado probado con reactivo de Fenton (10 pl de Fe+2/H<2>Ü<2>0,1 M y 25 pl de ácido ascórbico 0,1 M en 5 ml de PBS), incubado durante 24 horas a 37 °C. Los monómeros de hexosas libres del hidrogel de almidón de amilosa degradado se evaluaron con un ensayo de carbazol. El almidón de amilosa reticulado probado de 22 mg/ml mostró una tasa de degradación en respuesta a la oxidación del 83,8 % al 77,4 %.
Resultados:
El almidón de amilosa reticulado con GDE comparativo (ej. comp. 1 de GDE-AS) y el almidón de amilosa reticulado con PPE de la presente invención (ej. 1 de PPE-AS) muestran un grado de reticulación comparable, el almidón de amilosa reticulado con PPE de la presente invención (ej. 2 de PPE-AS y ej. 3 de PPE-AS) muestra una disminución del grado de reticulación, por lo tanto, debe esperarse una disminución de la resistencia a la degradación oxidativa, de forma inesperada y contradictoria, la cantidad de monómeros de hexosas libres después de la degradación oxidativa se reduce a 83,8, 77,4 y 81,0 respectivamente para el ej. 1 de PPE-AS, ej. 2 de PPE-AS y ej. 3 de PPE-AS, lo que indica un aumento estadísticamente significativo de la resistencia a la degradación oxidativa.
Por lo tanto, como se muestra en los resultados anteriores y se ha mencionado anteriormente para la tasa de degradación oxidativa, los polisacáridos reticulados de la presente invención preparados mediante el uso del PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante tienen una mejor resistencia a la degradación oxidativa (lo que significa un porcentaje menor de tasa de degradación oxidativa relativa) que los polisacáridos reticulados que quedan fuera del alcance de protección de la presente invención preparada utilizando los reticulantes comparativos descritos anteriormente pero que tienen propiedades físicas comparables.
Los resultados del ensayo de degradación oxidativa del almidón de amilosa comparativo reticulado con GDE y el almidón de amilosa reticulado con PPE de la presente invención se resumen en la tabla a continuación:
Tabla 11
Por lo tanto, como se muestra en los resultados anteriores y se ha mencionado anteriormente para la tasa de degradación enzimática, los polisacáridos reticulados de la presente invención preparados mediante el uso del PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante tienen una mejor resistencia a la degradación oxidativa (lo que significa un porcentaje menor de tasa de degradación oxidativa relativa) que los polisacáridos reticulados que quedan fuera del alcance de protección de la presente invención preparada utilizando los reticulantes comparativos descritos anteriormente pero que tienen propiedades físicas comparables. Asimismo, los resultados anteriores también muestran que los polisacáridos reticulados de la presente invención (obtenidos utilizando el PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante), tienen una mayor tasa de degradación oxidativa con una menor cantidad de reticulante.
2.3. Almidón/glucógeno de amilopectina reticulado
2.3.1. Almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con PPE de la presente invención (PPE-ASG)
El PPE-ASG mencionado a continuación se prepara utilizando Denacol® EX-313 disponible en el mercado de Nagase como fuente de 1,3-GDE. No obstante, estos procedimientos también se pueden realizar usando el éter diglicidílico de 1,3-glicerol disponible comercialmente de Merck o con la marca registrada Denacol® EX-314 que es una mezcla que contiene 1,3-DGE en lugar de Denacol® EX-313.
Procedimiento de preparación
Se disolvieron pellets de hidróxido de sodio (NaOH) en agua para formar una solución alcalina que contenía un 4 por ciento de NaOH (1 M) en peso basado en el peso total de la solución (solución A). Se disolvió 1,3-GDE a temperatura ambiente en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía del 1 al 50 por ciento de GDE en peso basado en el peso total de la solución (solución C1). Después se dejó reaccionar la solución C1 a una temperatura en el intervalo entre 10 y 40 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 30 días o, como alternativa, a temperatura controlada en el intervalo entre 20 y 50 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 48 horas durante el cual tiene lugar la autopolimerización de 1,3-GDE que da el éter poliglicidílico de poliglicerol con un peso molecular y/o un contenido de epoxi específico descrito en la tabla 1 (solución C3).
El almidón/glucógeno de alto contenido de amilopectina se dispersó suavemente a temperatura ambiente (25 °C) en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía de 5 a 15 por ciento de almidón/glucógeno hidratado de alto contenido de amilopectina en peso basado en el peso total de la solución (solución B). Después, se añade la solución C3 a la solución B para proporcionar una solución alcalina con una concentración de hidróxido en la solución final en el intervalo de 0,25 a 0,75 M y con la relación de almidón/glucógeno de alto contenido de amilopectina y PPE. La solución alcalina resultante que consiste en almidón/glucógeno de alto contenido de amilopectina, PPE y NaOH se mezcla después exhaustivamente a temperatura ambiente. Después, se dejó reaccionar la solución homogénea a temperatura controlada en el intervalo entre 20 y 50 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 48 horas.
El almidón/glucógeno de alto contenido de amilopectina reticulado con PPE (hidrogel) de la presente invención (ej. 1-3 de PPE-ASG) se lavó después con una solución de agua ácida (ácido clorhídrico 1 M y PBS) de 48 a 120 horas para eliminar materiales y subproductos sin reaccionar, para neutralizar el catalizador alcalino y restaurar el pH del hidrogel a 6,5-7,4 mediante intercambio iónico y para alcanzar la concentración de almidón/glucógeno de alto contenido de amilopectina reticulado con p Pe (hidrogel) de la presente invención de 1 a 50 mg/ml como se muestra en la tabla posterior (ej. 1-3 de PPE-ASG).
El almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con PPE (hidrogel) se cargó en jeringas y se esterilizó por vapor en autoclave siguiendo los señalados por la farmacopea en la EN ISO 17665-1 (p. ej., 15 min a 121 °C). El almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con PPE (hidrogel) de la presente invención podría deshidratarse opcionalmente en un horno ventilado a 50 °C y almacenarse para su uso o análisis posterior.
2.3.2. Almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con GDE comparativo (GDE-ASG comp.)
El almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con GDE comparativo (GDE-ASG comp.) se preparó siguiendo el procedimiento como se ha descrito anteriormente en la sección 2.1.2.1. para el ácido hialurónico reticulado con GDE comparativo pero usando almidón/glucógeno de amilopectina en lugar de ácido hialurónico.
2.3.3. Caracterización del almidón/glucógeno de amilopectina reticulado
Las propiedades mecánicas del almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con PPE de la presente invención (PPE-ASG) y el almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con GDE comparativo (GDE-ASG comp.) obtenidos anteriormente se describen en la tabla a continuación, que tienen una concentración de 22,0 mg/ml:
Tabla 12
a) concentración de almidón/glucógeno de amilopectina en el hidrogel reticulado expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
b) concentración de reticulante en el almidón/glucógeno de amilopectina reticulado expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
2.3.4 Ensayo
2.3.4.1 Ensayo de degradación enzimática
Muestras:
La evaluación de la tasa de degradación enzimática se realizó con:
el almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con GDE comparativo (hidrogel) Ej. comp. 1 de GDE-ASG, y Almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con PPE (hidrogel) de la presente invención Ej. 1 de PPE-ASG, ej. 2 de PPE-ASG y ej. 3 de PPE-ASG.
Método:
La resistencia a la degradación enzimática se evaluó siguiendo el método descrito en la sección anterior 2.2.4.1 Ensayo de degradación enzimática.
Resultados:
Los hidrogeles de PPE de la presente invención (ej. 2 de PPE-ASG y ej. 3 de PPE-ASG) mostraron una disminución del grado de reticulación, por lo tanto, debe esperarse una disminución de la resistencia a la degradación enzimática, de forma inesperada y contradictoria, la cantidad de monómeros de hexosas libres después de la degradación enzimática se reduce a 76,0 % y 89,4 % respectivamente, lo que indica un aumento estadísticamente significativo de la resistencia a la degradación enzimática.
El almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con GDE comparativo (ej. comp. 1 de GDE-ASG) y el almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con PPE de la presente invención (ej. 1 de PPE-ASG) muestran un grado de reticulación comparable, el almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con PPE de la presente invención (ej. 2 de PPE-ASG y ej. 3 de PPE-ASG) muestra una disminución del grado de reticulación, por lo tanto, debe esperarse una disminución de la resistencia a la degradación oxidativa, de forma inesperada y contradictoria, el HA reticulado con PPE ej. 3 de PPE-ASG mostró una cantidad de monómeros de hexosas libres después de la degradación enzimática comparable con la cantidad de monómeros de hexosas libres derivados del almidón reticulado con PPE del ej. 1 de PPE-ASG, lo que indica que la resistencia a la degradación enzimática es comparable (89,4 % y 85,7 respectivamente) incluso si los dos hidrogeles tienen dos grados de reticulación diferentes, en particular, el G.R. del ej. de PPE-ASG 3 es significativamente menor que el G.R. del ej. 1 de PPE-ASG (0,1241 y 0,1708 % respectivamente).
Por lo tanto, el efecto protector del PPE de la presente invención es significativamente mayor contra la degradación enzimática que el GDE comparativo. En particular, el efecto protector de PPE con alto peso molecular (es decir, de 3000 Da a 15000 Da) es mayor que el efecto protector de PPE con bajo peso molecular contra la degradación enzimática (es decir, de 750 Da a menos de 3000 Da), incluso si el PPE de bajo peso molecular da las mejores propiedades mecánicas. El AS de 22 mg/ml del ej. 2 de PPE-AS mostró mayor resistencia a la degradación enzimáticain vitropor hialuronidasa que los demás.
Los resultados del ensayo de degradación enzimática del almidón/glucógeno de amilopectina comparativo reticulado con GDE y el almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con PPE de la presente invención se resumen en la tabla a continuación:
Tabla 13
Por lo tanto, como se ha mostrado en los resultados anteriores, los polisacáridos reticulados de la presente invención preparados mediante el uso del PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante tienen una mejor resistencia a la degradación enzimática (lo que significa un porcentaje menor de tasa de degradación enzimática relativa) que los polisacáridos reticulados que quedan fuera del alcance de protección de la presente invención preparada utilizando los reticulantes comparativos descritos anteriormente pero que tienen propiedades físicas comparables. En particular, se demuestra que los polisacáridos reticulados de la presente invención (obtenidos usando el PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante) tienen una mayor resistencia enzimática (es decir, menor tasa de degradación enzimática). Asimismo, los resultados anteriores también muestran que los polisacáridos reticulados de la presente invención (obtenidos utilizando el PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante), tienen una mayor tasa de degradación enzimática con una menor cantidad de reticulante.
2.3.4.2 Ensayo de degradación oxidativa
Muestras:
La evaluación de la tasa de degradación oxidativa se realizó con:
el almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con GDE comparativo Ej. comp. 1 de GDE-ASG, y Almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con PPE de la presente invención Ej. 1 de PPE-ASg , ej. 2 de PPE-ASG y ej. 3 de PPE-ASG.
Método:
La resistencia a la degradación oxidativa se evaluó siguiendo el método descrito en la sección anterior 2.2.4.2 Ensayo de degradación oxidativa.
Resultados:
El almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con GDE comparativo (ej. comp. 1 de GDE-ASG) y el almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con PPE de la presente invención (ej. 1 de PPE-ASG) muestran un grado de reticulación comparable, el almidón de amilosa reticulado con PPE de la presente invención (ej. 2 de PPE-ASG y ej. 3 de PPE-ASG) muestra una disminución del grado de reticulación, por lo tanto, debe esperarse una disminución de la resistencia a la degradación oxidativa, de forma inesperada y contradictoria, la cantidad de monómeros de hexosas libres después de la degradación oxidativa se reduce a 81,2, 74,5 y 87,0 respectivamente para el ej. 1 de PPE-ASG, ej. 2 de PPE-ASG y ej. 3 de PPE-ASG, lo que indica un aumento estadísticamente significativo de la resistencia a la degradación oxidativa.
Por lo tanto, como se muestra en los resultados anteriores y se ha mencionado anteriormente para la tasa de degradación oxidativa, los polisacáridos reticulados de la presente invención preparados mediante el uso del PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante tienen una mejor resistencia a la degradación oxidativa (lo que significa un porcentaje menor de tasa de degradación oxidativa relativa) que los polisacáridos reticulados que quedan fuera del alcance de protección de la presente invención preparada utilizando los reticulantes comparativos descritos anteriormente pero que tienen propiedades físicas comparables.
Los resultados del ensayo de degradación oxidativa del almidón/glucógeno de amilopectina comparativo reticulado con GDE y el almidón/glucógeno de amilopectina reticulado con PPE de la presente invención se resumen en la tabla a continuación:
Tabla 14
Por lo tanto, como se muestra en los resultados anteriores y se ha mencionado anteriormente para la tasa de degradación enzimática, los polisacáridos reticulados de la presente invención preparados mediante el uso del PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante tienen una mejor resistencia a la degradación oxidativa (lo que significa un porcentaje menor de tasa de degradación oxidativa relativa) que los polisacáridos reticulados que quedan fuera del alcance de protección de la presente invención preparada utilizando los reticulantes comparativos descritos anteriormente pero que tienen propiedades físicas comparables. Asimismo, los resultados anteriores también muestran que los polisacáridos reticulados de la presente invención (obtenidos utilizando el PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante), tienen una mayor tasa de degradación oxidativa con una menor cantidad de reticulante.
2.4. Carboximetilcelulosa sódica reticulada
2.4.1. Carboximetilcelulosa de sodio reticulada con PPE de la presente invención (PPE-CMC)
El PPE-CMC mencionado a continuación se prepara utilizando Denacol® EX-313 disponible en el mercado de Nagase como fuente de 1,3-GDE. No obstante, estos procedimientos también se pueden realizar usando el éter diglicidílico de 1,3-glicerol disponible comercialmente de Merck o con la marca registrada Denacol® EX-314 que es una mezcla que contiene 1,3-DGE en lugar de Denacol® EX-313.
Procedimiento de preparación
Se disolvieron pellets de hidróxido de sodio (NaOH) en agua para formar una solución alcalina que contenía un 4 por ciento de NaOH (1 M) en peso basado en el peso total de la solución (solución A). Se disolvió 1,3-GDE a temperatura ambiente en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía del 1 al 50 por ciento de GDE en peso basado en el peso total de la solución (solución C1). Después, se dejó que la solución C1 reaccionara a una temperatura en el intervalo entre 10 y 40 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 30 días o, como alternativa, a temperatura controlada en el intervalo entre 20 y 50 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 48 horas durante el que tiene lugar la autopolimerización de 1,3-GDE que da el éter poliglicidílico de poliglicerol de la presente invención con un peso molecular y/o contenido de epoxi específico como se describe en la tabla 1 (solución C3).
Se dispersó suavemente carboximetilcelulosa de sodio (NaCMC) a temperatura ambiente (25 °C) en una parte de la solución A para formar una solución alcalina que contenía del 5 al 15 por ciento de NaCMC hidratado en peso basado en el peso total de la solución (solución B). Después, se añade la solución C3 a la solución B para proporcionar una solución alcalina con una concentración de hidróxido en la solución final en el intervalo de 0,25 a 0,75 M y con la relación deseada de NaCMC y PPE. La solución alcalina resultante que consiste en NaCMC, PPE y NaOH se mezcla después exhaustivamente a temperatura ambiente. Después, se dejó reaccionar la solución homogénea a temperatura controlada en el intervalo entre 20 y 50 °C durante un periodo comprendido entre 1 y 48 horas. El NaCMC reticulado con PPE (hidrogel) de la presente invención (PPE-CMC) se lavó después con una solución de agua ácida (ácido clorhídrico 1 M y PBS) de 48 a 120 horas para eliminar materiales y subproductos sin reaccionar, para neutralizar el catalizador alcalino y restaurar el pH del hidrogel a 6,5-7,4 mediante intercambio iónico y para alcanzar la concentración de NaCMC en el NaCMC reticulado con PPE (hidrogel) de la presente invención de 1 a 50 mg/ml como se muestra en la tabla posterior (PPE-CMC). El NaCMC reticulado con PPE (hidrogel) de la presente invención se cargó en jeringas y se esterilizó por vapor en autoclave siguiendo los señalados por la farmacopea en la EN ISO 17665-1 (p. ej., 15 min a 121 °C). El hidrogel podría deshidratarse opcionalmente mediante liofilización y almacenarse para su uso o análisis posterior.
2.4.2. Carboximetilcelulosa de sodio reticulada con GDE comparativa (GDE-CMC comp.)
La NaCMC reticulada con GDE comparativo se preparó siguiendo el procedimiento como se ha descrito anteriormente en la sección 21.2.1. para el ácido hialurónico reticulado con GDE comparativo pero usando NaCMC en lugar de ácido hialurónico.
2.4.3. Caracterización de la NaCMC reticulada
Las propiedades mecánicas de la NaCMC reticulada con PPE de la presente invención (ej. 1-3 de PPE-CMC) y la NaCMC reticulada con GDE comparativa (ej. comp. 1 de GDE) obtenida anteriormente se describen en la tabla a continuación, que tienen una concentración de 22,0 mg/ml:
Tabla 15
(a) concentración de NaCMC en el hidrogel reticulado expresada como porcentaje en peso en relación con el peso total.
(b) concentración del reticulante de la presente invención en la NaCMC reticulada expresada como porcentaje en peso en relación al peso total.
2.4.4 Ensayo
2.4.4.1 Ensayo de degradación enzimática
Muestras:
La evaluación de la tasa de degradación enzimática se realizó con:
la carboximetilcelulosa de sodio reticulada con GDE (hidrogel) comparativa Ej. comp. 1 de GDE-CMC y carboximetilcelulosa de sodio reticulada con PPE (hidrogel) de la presente invención Ej. 1 de PPE-CMC, ej. 2 de PPE-CMC y ej. 3 de PPE-CMC.
Método:
Se trataron 0,2 ml de cada carboximetilcelulosa de sodio reticulada (hidrogel) probada con 10 pl de pectinasa 0,1 mg/ml deAspergillus niger.Los hidrogeles probados se incubaron durante 16 horas a 37 °C en PBS, los monómeros de hexosas de hidrogel de carboximetilcelulosa de sodio degradado se evaluaron con un ensayo de carbazol.
Resultados:
La carboximetilcelulosa de sodio reticulada con GDE comparativa (ej. comp. 1 de GDE-CMC) y la carboximetilcelulosa de sodio reticulada con PPE de la presente invención (ej. 1 de PPE-CMC) muestran un grado de reticulación comparable. Los hidrogeles de PPE de la presente invención (ej. 2 de PPE-CMC y ej. 3 de PPE-CMC) mostraron una disminución del grado de reticulación, por lo tanto, debe esperarse una disminución de la resistencia a la degradación enzimática, de forma inesperada y contradictoria, la cantidad de monómeros de hexosas libres después de la degradación enzimática se reduce al 64,6 % y al 85,4 % para el ej. 2 de PPE-CMC y el ej. 3 de PPE-CMC respectivamente, lo que indica un aumento estadísticamente significativo de la resistencia a la degradación enzimática.
Por lo tanto, el efecto protector del PPE de la presente invención es significativamente mayor contra la degradación enzimática que el GDE comparativo. En particular, el efecto protector de PPE con alto peso molecular (es decir, de 3000 Da a 15000 Da) es mayor que el efecto protector de PPE con bajo peso molecular contra la degradación enzimática (es decir, de 750 Da a menos de 3000 Da), incluso si el PPE de bajo peso molecular da las mejores propiedades mecánicas. El AS de 22 mg/ml del ej. 2 de PPE-AS mostró mayor resistencia a la degradación enzimáticain vitropor hialuronidasa que los demás.
Los resultados del ensayo de degradación enzimática de la carboximetilcelulosa de sodio comparativa reticulada con GDE y la carboximetilcelulosa de sodio reticulada con PPE de la presente invención se resumen en la tabla a continuación:
Tabla 16
Por lo tanto, el efecto protector del PPE de la presente invención es significativamente mayor contra la degradación enzimática que el GDE comparativo. En particular, el efecto protector de PPE con alto peso molecular (es decir, de 3000 Da a 15000 Da) es mayor que el efecto protector de PPE con bajo peso molecular contra la degradación enzimática (es decir, de 750 Da a menos de 3000 Da), incluso si el PPE de bajo peso molecular da las mejores propiedades mecánicas.
2.4.4.2 Ensayo de degradación oxidativa
Muestras:
La evaluación de la tasa de degradación oxidativa se realizó con:
la carboximetilcelulosa de sodio reticulada con GDE comparativa Ej. comp. 1 de GDE-CMC y carboximetilcelulosa de sodio reticulada con PPE de la presente invención Ej. 1 de PPE-CM<c>, ej. 2 de PPE-CMC y ej. 3 de PPE-CMC.
Método:
La resistencia a la degradación oxidativa se evaluó siguiendo el método descrito en la sección anterior 2.2.4.2 Ensayo de degradación oxidativa.
Resultados:
La carboximetilcelulosa de sodio reticulada con GDE comparativa (ej. comp. 1 de GDE-CMC) y la carboximetilcelulosa de sodio reticulada con PPE de la presente invención (ej. 1 de PPE-CMC) muestran un grado de reticulación comparable, la carboximetilcelulosa de sodio reticulada con PPE de la presente invención (ej. 2 de PPE-CMC y ej. 3 de PPE-CMC) muestra una disminución del grado de reticulación, por lo tanto, debe esperarse una disminución de la resistencia a la degradación oxidativa, de forma inesperada y contradictoria, la cantidad de monómeros de hexosas libres después de la degradación oxidativa se reduce a 92,6, 83,7 y 82,5 respectivamente para el ej. 1 de PPE-CMC, ej. 2 de PPE-CMC y ej. 3 de PPE-CMC, lo que indica un aumento estadísticamente significativo de la resistencia a la degradación oxidativa.
Por lo tanto, como se muestra en los resultados anteriores y se ha mencionado anteriormente para la tasa de degradación oxidativa, los polisacáridos reticulados de la presente invención preparados mediante el uso del PPE hiperramificado de la presente invención como reticulante tienen una mejor resistencia a la degradación oxidativa (lo que significa un porcentaje menor de tasa de degradación oxidativa relativa) que los polisacáridos reticulados que quedan fuera del alcance de protección de la presente invención preparada utilizando los reticulantes comparativos descritos anteriormente pero que tienen propiedades físicas comparables.
Los resultados del ensayo de degradación oxidativa de la carboximetilcelulosa de sodio comparativa reticulada con GDE y la carboximetilcelulosa de sodio reticulada con PPE de la presente invención se resumen en la tabla a continuación:
Tabla 17
3. Determinación de la fuerza de inyección a través de la aguja de jeringas precargadas de polisacáridos reticulados con PPE de la presente invención
Esta prueba permite determinar la fuerza de inyección a través de la aguja, En particular, la fuerza de inyección máxima se refiere a la fuerza requerida por el compuesto o la composición para superar la fricción estática. Con respecto al polisacárido reticulado, este valor depende de su homogeneidad, la calidad de la jeringa y también la lubricación del cilindro. Habitualmente, este valor es representativo de la calidad total del sistema (compuesto, jeringa y aguja). Por tanto, un valor más bajo de la fuerza de inyección produce una menor percepción del dolor sin aumentar la velocidad de inyección.
Muestras probadas:
el ácido hialurónico reticulado con BDDE comparativo (hidrogel) Ej. comp. 5 de BDDE-HA,
ácido hialurónico reticulado con PEGDE comparativo (hidrogel) Ej. comp. 5 de PEGDE-HA,
ácido hialurónico reticulado con GDE comparativo (hidrogel) Ej. 5 comp. de GDE-HA, y
ácido hialurónico reticulado con PPE (hidrogel) de la presente invención Ej. 10 de PPE-HA, ej. 11 de PPE-HA y ej. 12 de PPE-HA.
El efecto de la inyección a través de la aguja se evaluó realizando la prueba en muestras inyectadas. Las longitudes de calibre 27G y 30G y, en general, la elección de la aguja correcta se ve muy afectada por las propiedades fisicoquímicas y mecánicas de los hidrogeles. La fuerza de inyección se midió en un analizador de textura (Stable Micro Systems, TA. XT Plus) como la fuerza (en N) necesaria para inyectar el hidrogel a través de agujas de 27G y 30G a una distancia de 50 mm a una velocidad de 10 mm/min (0,2 ml/min) utilizando jeringas de 1 ml.
La comparación de la fuerza de inyección máxima y la fuerza de inyección promedio a través de una aguja de 27G de ácido hialurónico comparativo (hidrogel) reticulado con BDDE, PEGDE y GDE usando el método convencional y el ácido hialurónico (hidrogel) reticulado con el PPE de la presente invención (todos los reticulantes tienen el mismo contenido de epoxi equivalente cuando se añaden al polisacárido) se describen en la tabla a continuación:
Tabla 18
Como se muestra en los resultados mencionados anteriormente, los polisacáridos reticulados de la presente invención tienen un valor más bajo de la fuerza de inyección máxima que los polisacáridos reticulados comparativos que quedan fuera del alcance de la presente invención. Es ventajoso porque, sin comprometer (aumentar) la velocidad de inyección, los polisacáridos reticulados de la presente invención son más fáciles de inyectar reduciendo la percepción del dolor y el traumatismo cutáneo. Asimismo, también es ventajoso porque aumenta la manejabilidad de los polisacáridos reticulados de la invención para el facultativo.
Lista de citas
He, Z.,et al.,"Ultrasonication-assisted rapid determination of epoxide values in polymer mixtures containing epoxy resin". Analytical Methods, 2014, vol. 6 (12), págs. 4257-4261.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula (I),
    o, como alternativa, un compuesto de fórmula (II) en donde cada R<1>se selecciona de manera independiente del grupo que consiste en R<2>y R<3>; R2 es
    R3 es
    b es un número entero seleccionado del grupo que consiste en 1 a 70; c es un número entero seleccionado del grupo que consiste en 1 a 70; d es un número entero seleccionado del grupo que consiste en 1 a 70; que tiene un peso molecular (Pm) de 750 a 15.000 Da medido por el método de cromatografía líquida; y un peso equivalente de epoxi de 183 a 7.000 g/eq medido por titulación rápida asistida por ultrasonidos con HCl.
  2. 2. El compuesto según la reivindicación 1, en donde: el peso molecular (Pm) es de 800 a 7000 Da medido por el método de cromatografía líquida; y el peso equivalente de epoxi es de 195 a 700 g/eq medido por titulación rápida asistida por ultrasonidos con HCl.
  3. 3. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que tiene un índice de polidispersidad (PM/Mn) igual o inferior a 1,8 medido por cromatografía líquida.
  4. 4. Un polisacárido reticulado de fórmula (III)
    o, como alternativa, un polisacárido reticulado de fórmula (IV)
    cada Ri se selecciona de manera independiente del grupo que consiste en R<2>, R<3>, R<4>y R<5>; R<2>es
    R3 es
    R<4>es
    R5 es
    PS es un polisacárido; y el polisacárido reticulado tiene un porcentaje de reticulación de 0,077 a 0,450 %.
  5. 5. El polisacárido reticulado según la reivindicación 4, en donde PS es un polisacárido; y el polisacárido reticulado tiene un porcentaje de reticulación de 0,077 a 0,269 %.
  6. 6. El polisacárido reticulado según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en donde la cantidad de R<2>es menor de 2 ppm sobre el peso total de los polisacáridos reticulados de fórmula (III) y (IV).
  7. 7. El polisacárido reticulado según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde: la tasa de degradación enzimática relativa es de 100 % a 37,9 %; y la tasa de degradación oxidativa relativa es de 100 % a 76,8 %.
  8. 8. El polisacárido reticulado según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde el polisacárido se selecciona del grupo que consiste en ácido hialurónico, almidón y un derivado del mismo, glucógeno, celulosa y un derivado del mismo, pectina, lignina, inulina, goma guar, goma xantana, ácidos algínicos (alginatos), heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, glucuronano, glucomanano, galactomanano y carrageninas; preferentemente ácido hialurónico.
  9. 9. El polisacárido reticulado según cualquiera de las reivindicaciones 4-8, en donde la distancia media (D<n>) entre dos grupos de reticulación es de 27 nm a 42 nm.
  10. 10. El polisacárido reticulado según cualquiera de las reivindicaciones 4-9, en donde la concentración del polisacárido es de 1 a 50 mg/ml.
  11. 11. El polisacárido reticulado según cualquiera de las reivindicaciones 4-10, que es obtenible mediante un procedimiento que comprende: reticular el polisacárido con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un compuesto de fórmula (I), un compuesto de fórmula (II) y una mezcla de los mismos como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3; particularmente, que es obtenible mediante un procedimiento que comprende reticular el polisacárido con un compuesto de fórmula (I), en donde el compuesto de fórmula (I) es obtenido mediante un procedimiento que comprende: a) proporcionar una solución alcalina que contiene éter diglicidílico de 1,3-glicerol; y b) mantener la solución obtenida en la etapa a) a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días; o, como alternativa, obtenible mediante un procedimiento que comprende reticular el polisacárido con un compuesto de fórmula (II), en donde el compuesto de fórmula (II) se obtiene mediante un procedimiento que comprende: c) proporcionar una solución alcalina que contiene éter diglicidílico de 1,2-glicerol; y d) mantener la solución obtenida en la etapa c) a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días; o, como alternativa, obtenible mediante un procedimiento que comprende reticular el polisacárido con una mezcla de un compuesto de fórmula (I) y un compuesto de fórmula (II), en donde: el compuesto de fórmula (I) es obtenido mediante un procedimiento que comprende: a) proporcionar una solución alcalina que contiene éter diglicidílico de 1,3-glicerol; y b) mantener la solución obtenida en la etapa a) a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días; y el compuesto de fórmula (II) es obtenido mediante un procedimiento que comprende: c) proporcionar una solución alcalina que contiene éter diglicidílico de 1,2-glicerol; y d) mantener la solución obtenida en la etapa c) a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días; particularmente, en donde: en la etapa a) la solución alcalina comprende de 1 a 50 por ciento en peso de éter diglicidílico de 1,3-glicerol; y en la etapa c) la solución alcalina comprende de 1 a 50 por ciento en peso de éter diglicidílico de 1,2-glicerol.
  12. 12. Un procedimiento para la preparación de un compuesto (I) o, como alternativa, de un compuesto de fórmula (II) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3; en donde: cuando el compuesto es un compuesto de fórmula (I), entonces el procedimiento comprende: a) proporcionar una solución alcalina que contiene éter diglicidílico de 1,3-glicerol; y b) mantener la solución obtenida en la etapa a) a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días; o, como alternativa, cuando el compuesto es un compuesto de fórmula (II), entonces el procedimiento comprende: c) proporcionar una solución alcalina que contiene éter diglicidílico de 1,2-glicerol; y d) mantener la solución obtenida en la etapa c) a una temperatura de 10 a 80 °C durante un periodo de tiempo de 1 min a 30 días.
  13. 13. Una composición que comprende: uno o más de los polisacáridos reticulados como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4-11, y uno o más excipientes o vehículos adecuados.
  14. 14. La composición según la reivindicación 13, que es una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más polisacáridos reticulados farmacéuticamente aceptables como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 4-11, y uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables para su uso en terapia.
  15. 15. Uso de una composición según la reivindicación 13, que es una composición cosmética que comprende una cantidad cosméticamente efectiva de uno o más polisacáridos reticulados cosméticamente aceptables como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 4-11, y uno o más excipientes o vehículos cosméticamente aceptables como agente para el cuidado de la piel; en particular, como relleno dérmico.
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