ES2976464T3 - Dispositivo y método para la detección de células en microgotas - Google Patents

Dispositivo y método para la detección de células en microgotas Download PDF

Info

Publication number
ES2976464T3
ES2976464T3 ES19801405T ES19801405T ES2976464T3 ES 2976464 T3 ES2976464 T3 ES 2976464T3 ES 19801405 T ES19801405 T ES 19801405T ES 19801405 T ES19801405 T ES 19801405T ES 2976464 T3 ES2976464 T3 ES 2976464T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
microdroplets
cell
microdroplet
cells
electrowetting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19801405T
Other languages
English (en)
Inventor
Tom Isaac
Cameron Frayling
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lightcast Discovery Ltd
Original Assignee
Lightcast Discovery Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP18207379.1A external-priority patent/EP3656473A1/en
Priority claimed from EP18207377.5A external-priority patent/EP3656472A1/en
Application filed by Lightcast Discovery Ltd filed Critical Lightcast Discovery Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2976464T3 publication Critical patent/ES2976464T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads or physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/50273—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means or forces applied to move the fluids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/01—Drops
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1484—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry microstructural devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
    • G01N15/1492—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties within droplets
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0673—Handling of plugs of fluid surrounded by immiscible fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0645—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0654—Lenses; Optical fibres
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0663—Whole sensors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0867—Multiple inlets and one sample wells, e.g. mixing, dilution
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/10—Means to control humidity and/or other gases
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0427—Electrowetting
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/103—Particle shape
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1481—Optical analysis of particles within droplets

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

Se proporcionan dispositivos, sistemas y métodos asociados para manipular y/o determinar una o más características de las células contenidas dentro de una muestra biológica. En particular, se proporciona un dispositivo y métodos de uso del mismo, comprendiendo el dispositivo un componente de clasificación configurado para separar las microgotas que contienen células de las vacías en una población de primeras microgotas que contienen células; un componente de manipulación de microgotas configurado para manipular las primeras microgotas usando electrodos de electrohumectación reales o virtuales, y un sistema de detección óptica configurado para detectar una señal óptica de las microgotas a través de una o más ventanas de detección. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivo y método para la detección de células en microgotas
Descripción
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un dispositivo y métodos relacionados para la rápida identificación, manipulación y selección de células. Este es especialmente útil para la manipulación de células de mamíferos, ya sea a partir de muestras de cultivos celulares inmortalizados o directamente de muestras de tejido. También es especialmente útil para la detección rápida y paralela de muestras de pacientes que se cree que contienen evidencia de infecciones.
Se han descrito previamente en la técnica dispositivos para manipular gotitas o perlas magnéticas; ver por ejemplo US6565727, US20130233425 y US20150027889. En el caso de gotitas, este resultado normalmente se puede lograr haciendo que las gotitas, por ejemplo, en presencia de un fluido portador inmiscible, viajen a través de un espacio de microfluidos definido por dos paredes opuestas de un cartucho o tubo de microfluidos. Incrustados dentro de una o ambas paredes hay microelectrodos cubiertos con una capa dieléctrica, cada uno de los cuales está conectado a un circuito de polarización de A/C capaz de encenderse y apagarse rápidamente a intervalos para modificar las características del campo eléctrico de la capa. Esto da lugar a fuerzas capilares direccionales localizadas en las proximidades de los microelectrodos que pueden usarse para dirigir la gotita a lo largo de una o más vías predeterminadas. Dichos dispositivos, que emplean lo que en lo sucesivo y en conexión con la presente invención se denominarán electrodos de electrohumectación "reales", se conocen en la técnica con el acrónimo de dispositivos EWOD (Electrowetting on Dielectric).
Una variante de este enfoque, en la que las fuerzas de electrohumectación están mediadas ópticamente, conocida en la técnica como optoelectrohumectación y en lo sucesivo el acrónimo correspondiente OEWO<d>, se ha divulgado, por ejemplo, en US20030224528, US20150298125, US20160158748, US20160160259 y Cartas de Física Aplicada 93 221110 (2008). En particular, la primera de estas tres solicitudes de patente divulga diversos dispositivos microfluídicos que incluyen una cavidad microfluídica definida por una primera y una segunda pared y en la que la primera pared tiene un diseño compuesto y está comprendida por capas de sustrato, fotoconductoras y aislantes (dieléctricas). En esta realización de un solo lado, entre las capas fotoconductora y aislante se dispone una serie de células conductoras que están eléctricamente aisladas entre sí y acopladas a la capa fotoactiva y cuyas funciones son generar ubicaciones de electrodos electrohumectantes correspondientes en la capa aislante. En estos lugares, las propiedades de tensión superficial de las gotitas se pueden modificar por medio de un campo de electrohumectación como se describió anteriormente. Las células conductoras pueden entonces encenderse temporalmente mediante la luz que incide sobre la capa fotoconductora. Este enfoque tiene la ventaja de que la conmutación se hace mucho más fácil y rápida, aunque su utilidad está todavía limitada hasta cierto punto por la disposición de los electrodos. Además, existe una limitación en cuanto a la velocidad a la que se pueden mover las gotas y en qué medida se puede variar la ruta real de las gotitas.
Se han divulgado realizaciones de doble cara de este último enfoque en la tesis UCB/EECS-2015-119 de la Universidad de California en Berkeley de Pei. En un ejemplo, se describe una celda que permite la manipulación de gotas relativamente grandes en el intervalo de tamaño de 100 a 500 pm usando optoelectrohumectación a través de una superficie de Teflón AF depositado sobre una capa dieléctrica usando un patrón de luz sobre silicio amorfo polarizado eléctricamente. Sin embargo, en los dispositivos ejemplificados la capa dieléctrica es delgada (100 nm) y sólo está dispuesta en la pared que lleva la capa fotoactiva.
El documento US 2013/143312 A1 describe un nuevo método para implementar ensayos basados en células y cultivos celulares a largo plazo. El método se basa en microfluidos digitales (DMF) que se utilizan para activar gotitas de nanolitros de reactivos y células de en una matriz plana de electrodos.
El documento US 2018/133715 A1 divulga instrumentos y cartuchos para procesar gotitas en emulsiones que contienen entidades biológicas tales como células. Un método de tal procesamiento comprende proporcionar una pluralidad de entidades en un fluido; preparar una gotita del fluido; determinar si la gotita contiene una o más entidades de dicha pluralidad de entidades, o si dicha gotita no contiene dicha entidad; clasificar dicha gotita en función del resultado de la determinación; y dispensar la gotita clasificada en un depósito.
En nuestra solicitud WO 2018/234445, hemos descrito un dispositivo para manipular microgotas que utiliza optoelectrohumectación para proporcionar la fuerza motriz. En este dispositivo de electrohumectación mediado ópticamente (OEWOD), las microgotas se trasladan a través de un espacio de microfluidos definido por paredes de contención; por ejemplo, un par de placas paralelas que tienen el espacio microfluídico intercalado entre ellas. Al menos una de las paredes de contención incluye lo que en lo sucesivo se denominará ubicaciones de electrodos de electrohumectación "virtuales" que se generan iluminando selectivamente un área de una capa semiconductora enterrada en su interior. Mediante la iluminación selectiva de la capa con luz procedente de una fuente de luz separada, se puede generar transitoriamente una ruta virtual de ubicaciones virtuales de electrodos de electrohumectación a lo largo de la cual se puede hacer que se muevan las microgotas.
En nuestra correspondiente patente publicada WO 2018/234448, se describe el uso de este dispositivo como parte operativa de un secuenciador de ácido nucleico.
Ahora hemos desarrollado un dispositivo para aplicar métodos de microgotas similares a los que sustentan nuestro secuenciador descrito anteriormente para la detección y manipulación rápida de muestras biológicas que contienen células.
Así, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un dispositivo para manipular y/o determinar una o más características de las células contenidas dentro de una muestra biológica, el dispositivo comprende:
un componente de clasificación configurado para separar microgotas que contienen células de las vacías en una población de primeras microgotas que contienen células;
un componente de manipulación de microgotas configurado para manipular las primeras microgotas usando electrodos de electrohumectación reales o virtuales, incluyendo el componente de manipulación de microgotas:
una primera zona configurada para disponer las primeras microgotas en una matriz para inspección óptica y para introducir un sistema reportero en cada primera microgota mediante fusión de microgotas;
una segunda zona ubicada dentro o adyacente a la primera zona y configurada para detectar microgotas en una o más ventanas de detección; y
opcionalmente una tercera zona en la que las microgotas pueden subdividirse y aislarse para su posterior recuperación del dispositivo; y
un sistema de detección óptica configurado para detectar una señal óptica de las microgotas a través de una o más ventanas de detección, en el que, para microgotas fusionadas, la señal surge de una interacción entre el sistema reportero y las células o un producto expresado de las mismas.
En algunas realizaciones, se proporciona un dispositivo para manipular y/o determinar una o más características de análisis de células contenidas dentro de una muestra biológica, el dispositivo comprende:
un componente de clasificación configurado para separar microgotas que contienen células de las vacías en una población de primeras microgotas que contienen células;
un componente de manipulación de microgotas configurado para manipular las primeras microgotas usando electrodos de electrohumectación reales o virtuales, el componente de manipulación de microgotas incluye:
una primera zona configurada para disponer las primeras microgotas en una matriz para inspección óptica y, opcionalmente, para introducir un sistema reportero en cada primera microgota mediante fusión de microgotas;
una segunda zona ubicada dentro o adyacente a la primera zona y configurada para detectar microgotas fusionadas en una o más ventanas de detección; y
opcionalmente una tercera zona en la que las microgotas pueden subdividirse y aislarse para su posterior recuperación del instrumento; y
un sistema de detección óptica configurado para detectar una señal óptica de las microgotas fusionadas a través de una o más ventanas de detección, en el que, para las microgotas fusionadas, la señal surge de una interacción entre el sistema reportero y las células o un producto expresado de las mismas.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para usar el dispositivo de cualquier reivindicación anterior para manipular y/o determinar una o más características de tipos de células en una muestra biológica, el método comprende las etapas de: crear a partir de las primeras microgotas acuosas de muestra biológica en un fluido portador inmiscible, de las cuales se cree que al menos algunas contienen células de un tipo celular particular; mover las primeras microgotas a lo largo de una ruta usando los electrodos de electrohumectación reales o virtuales hasta al menos una ubicación de fusión de microgotas; mover segundas microgotas acuosas que contienen un sistema reportero característico del tipo de célula cuyas características se están investigando a lo largo de una ruta usando electrodos de electrohumectación reales o virtuales hasta la ubicación de fusión de las microgotas; fusionar la primera y la segunda microgotas en el lugar de fusión para producir microgotas fusionadas; y analizar el contenido de cada microgota fusionada con el sistema de detección óptica y detectar una señal óptica característica de una interacción entre la célula y el sistema reportero; en el que la interacción entre la célula y el sistema reportero que es característica del tipo de célula identifica la naturaleza de las células en la muestra biológica.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para usar un dispositivo de acuerdo con la presente invención para manipular y/o determinar una o más características de tipos de células en una muestra biológica, el método comprende las etapas de: crear a partir de la muestra biológica primeras microgotas acuosas en un fluido portador inmiscible, de las cuales se cree que al menos algunas contienen células de un tipo celular particular; mover las primeras microgotas a lo largo de un recorrido usando electrodos de electrohumectación reales o virtuales hasta al menos una ubicación de inspección de microgotas; y analizar el contenido de cada microgota con un sistema de detección óptica para determinar una o más características de una célula contenida en esa microgota, la una o más características comprenden al menos una de: morfología celular, motilidad celular o integridad de la membrana celular.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para usar el dispositivo de la presente invención para manipular y/o determinar una o más características de tipos de células en una muestra biológica, el método comprende las etapas de: crear a partir de la muestra biológica primeras microgotas acuosas en un fluido portador inmiscible, de las cuales se cree que al menos algunas contienen células del tipo celular; mover las primeras microgotas a lo largo de una ruta usando electrodos electrohumectantes virtuales hasta al menos una ubicación de fusión de microgotas; mover segundas microgotas acuosas que contienen un sistema reportero característico del tipo de célula cuyas características se están investigando a lo largo de una ruta utilizando electrodos electrohumectantes virtuales hasta el lugar de fusión de las microgotas; fusionar la primera y la segunda microgotas en el lugar de fusión para producir microgotas fusionadas; y analizar el contenido de cada microgota fusionada con un sistema de detección óptica y detectar una señal óptica característica de una interacción entre la célula y el sistema reportero.
Inicialmente, el método también puede comprender una o más etapas iniciales de clasificación, cultivo y preparación de gotitas. Estas etapas iniciales pueden comprender uno o más de: (a) separar las primeras microgotas que contienen células de una población de microgotas que incluyen tanto microgotas que contienen células como vacías; (b) cultivar la población de microgotas en condiciones que provoquen el crecimiento y la división celular antes o después de llevarse a cabo la etapa inicial (a); (c) generar la población de microgotas cortando microgotas de la muestra biológica mediante la aplicación de una fuerza de estiramiento electrohumectante.
En algunas realizaciones de la etapa inicial (c), las microgotas contienen componentes del medio de crecimiento separado en un fluido portador inmiscible que comprende un aceite, creando así una emulsión que puede cultivarse posteriormente en la etapa inicial (b). En otro caso, las microgotas se separan en aire u otra mezcla de gases, por ejemplo, una mezcla de dióxido de carbono y nitrógeno, y a continuación se cultivan por separado unas de otras. En algunas realizaciones, puede resultar ventajoso purgar periódicamente el fluido portador de gases perjudiciales para el cultivo de las células.
En una realización de la etapa inicial (b), el cultivo de la población de microgotas se lleva a cabo en una emulsión y en presencia de una corriente fluida de fluido portador inmiscible tal como un hidrocarburo o un aceite fluorado, especialmente un aceite fluorado. Opcionalmente, este aceite puede comprender además tensioactivos y otros aditivos para mantener la estabilidad de las microgotas. El aceite también contiene niveles bajos de nutrientes y gases necesarios para mantener el crecimiento celular durante la fase de cultivo y la aplicación de esta realización hace que el contenido de nutrientes de las microgotas se reponga periódica o continuamente mediante difusión interfacial. Alternativamente, la reposición de nutrientes y gases se puede lograr directamente fusionando microgotas acuosas secundarias que contienen estos componentes; por ejemplo, cuando el fluido portador es aire o gas inerte. En algunas realizaciones, cultivar la población de microgotas comprende poner en contacto la población de microgotas en el fluido portador inmiscible con un flujo de fluido portador que contiene nutrientes para cultivo celular y/o gas disuelto que consiste en uno o más de oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono. En otra realización, el aceite se purga de ciertos gases disueltos para proporcionar un ambiente hipóxico a las células.
En una realización de la etapa inicial (b), hemos encontrado que para mantener el crecimiento celular es necesario mantener niveles óptimos de ciertos gases atmosféricos en las microgotas. No hacerlo puede provocar, por ejemplo, cambios adversos en el pH del medio de microgotas. Así, en una realización de la etapa inicial (b), la corriente que fluye de fluido portador inmiscible contiene uno o más niveles de saturación de nitrógeno, oxígeno o, en particular, dióxido de carbono.
En otra realización de la etapa inicial (b), el contenido de las microgotas se revuelve o agita mediante la aplicación de una fuerza de electrohumectación en los lugares donde se mantienen las microgotas. Adecuadamente, esto se logra usando una fuerza electrohumectante mediada ópticamente suministrada, por ejemplo, por una estructura OEWOD del tipo descrito a continuación. Creemos que este enfoque también es de utilidad más amplia y, por lo tanto, en otro segundo aspecto de la invención generalmente aplicable, se proporciona un método para revolver o agitar de otra manera el contenido de una microgota que comprende las etapas de: ubicar la microgota en una ubicación virtual del electrodo de electrohumectación; y aplicar una fuente de radiación electromagnética a la ubicación activando de este modo el correspondiente electrodo de electrohumectación virtual y generando una fuerza de electrohumectación asociada caracterizada porque la fuente de radiación electromagnética se mueve alrededor de la ubicación para causar un movimiento correspondiente de la microgota y un movimiento o agitación correspondiente de su contenido.
En algunas realizaciones, la muestra biológica puede comprender uno o más gametos masculinos y/o femeninos, y el método puede comprender además la manipulación e inspección de los gametos masculinos y/o femeninos como parte de los flujos de trabajo de fertilización in vitro.
Por ejemplo, utilizando el instrumento es posible realizar etapas de inspección, selección y ensayo en células de gametos masculinos, tales como espermatozoides humanos o animales. En un procedimiento de ejemplo, se prepara una muestra de espermatozoides a partir de semen diluido y se encapsula en gotitas. Las gotitas se cargan en el chip y luego se inspeccionan mediante microscopía de campo claro. A continuación, se descartan las gotitas que no contienen gametos y las que contienen espermatozoides se conservan para su inspección. Una vez que se selecciona una muestra de gametos para su análisis, se toman vídeos de los gametos junto con imágenes fijas. Los algoritmos de reconocimiento de patrones aplicados a la salida del sistema de detección óptica permiten la caracterización de los gametos en cuanto a motilidad, morfología corporal y morfología del núcleo. Los resultados de esta caracterización se pueden asignar a una gotita particular que luego se recupera para su posterior procesamiento. Este procesamiento incluye etapas de ensayo en el chip, como la adición de reactivos reporteros.
En otro ejemplo, encapsulando un gameto femenino tal como un óvulo humano o animal, es posible realizar la fertilización del óvulo. De manera similar al gameto masculino, es posible encapsular el gameto femenino en una gotita y cargarlo en el chip. Una vez en el dispositivo, la célula se puede inspeccionar en busca de defectos de morfología y analizarse con reactivos reporteros. Después de la inspección o el ensayo, la célula del gameto femenino podría someterse a etapas de procesamiento opcionales, como la eliminación de las células del epitelio germinal mediante cizalla mecánica aplicada mediante el movimiento de las gotitas o mediante la adición de reactivos adicionales.
En otro ejemplo más, al cargar gametos masculinos y femeninos en un único dispositivo de microfluidos, es posible fusionar gotitas que contienen los dos gametos y hacer que se combinen. En una aplicación de ejemplo, un gran número de gotitas de gametos masculinos se fusionan con un único óvulo; Las interacciones convencionales entre los gametos conducen a la fertilización y la generación de un blastocisto en el chip. En otro ejemplo, un único gameto masculino seleccionado y un único gameto femenino seleccionado y procesado se combinan en un chip y se hacen que interactúen.
En otra aplicación de ejemplo, se recuperan gametos de ambos sexos del chip de microfluidos y se combinan usando técnicas de manipulación convencionales conocidas en la técnica, como ICSI o IVF.
En algunas realizaciones, los blastocistos, que pueden formarse mediante los métodos detallados anteriormente, o mediante los medios convencionales conocidos en la técnica, también pueden encapsularse en gotitas y cultivarse en un chip. El cultivo en chip permite la inspección del blastocisto durante la formación, utilizando los sistemas de detección e imágenes que se describen a continuación. Mediante operaciones de fusión de gotitas, el entorno del blastocisto se puede controlar mediante la adición de materiales adicionales, como soluciones tampón, sales, nutrientes, proteínas y materiales de matriz extracelular. Durante la formación del blastocisto, a menudo es deseable utilizar técnicas como la microdisección con láser para extraer una muestra de células del blastocisto y recuperarlas para su posterior análisis. En algunas realizaciones, el blastocisto se transporta a una zona de manipulación de gotitas. Esta zona de manipulación puede comprender una característica física en el chip de microfluidos, tal como un pilar, un poste, una restricción física entre las placas de electrohumectación o una variación en forma de cuña en el espacio entre las placas de electrohumectación tal como se describe en la solicitud WO 2019/219905 (PCT/EP2019/062791).
Una vez que se carga un blastocisto en la zona de manipulación, se mantiene efectivamente inmóvil. A continuación, se puede proceder a la microdisección con láser, cuyo proceso está bien descrito en la literatura, para eliminar una porción del blastocisto. Una vez que se escinde una porción de la gotita, se pueden usar operaciones de división de gotitas como se describe en el presente documento para separar la porción de muestra del blastocisto. Mediante repetidas operaciones de división y refusión y una inspección con visión artificial de la distribución del material entre las dos gotitas después de la división, es posible verificar que el blastocisto y la porción de muestra se han separado correctamente. Después de la separación, la porción de muestra del blastocisto se puede recuperar para análisis posteriores, por ejemplo, mediante una prueba genética que incluya la reacción en cadena de la polimerasa o la secuenciación del ADN.
Adecuadamente, la fuente de radiación electromagnética utilizada en este método corresponde a la segunda radiación electromagnética descrita a continuación y comprende una fuente de luz rotacional que parpadea rápidamente y que describe una ruta circular dentro o alrededor de la periferia de la ubicación. En otra realización, el movimiento de la fuente de luz puede comprender una ruta de uno o más movimientos laterales. En una manifestación, las ubicaciones están definidas por áreas de al menos 0.5 micrones de diámetro y el movimiento es circular, radial o una mezcla de ambos. El movimiento es radial para generar la correspondiente mezcla centrífuga del contenido de la microgota.
Los sistemas reporteros que pueden introducirse en las primeras microgotas en la etapa (4) pueden ser, en principio, cualquier sistema que sea característico o que pueda usarse para analizar la presencia de un tipo celular o comportamiento celular determinado en una muestra biológica. Dichos sistemas reporteros incluyen, por ejemplo, un gen reportero, un biomarcador de la superficie celular o una molécula reportera selectiva para una enzima, proteína o anticuerpo expresado por células del tipo de célula que se busca. Una clase relacionada de sistema reportero puede ser una segunda célula reportera que responde a la presencia de material relevante expresado por la célula que se busca. Se conocen muchos de estos ensayos y, en muchos casos, los candidatos adecuados para su uso resultarán evidentes para un experto en la técnica. Además, se apreciará que al introducir una pluralidad de sistemas reporteros diferentes en las primeras microgotas mediante la fusión de uno o más segundos tipos de microgotas, el método puede multiplexarse para llevar a cabo búsquedas paralelas y simultáneas para una variedad de tipos de células diferentes asociados con una gama de diferentes características y comportamientos. En algunas realizaciones, el sistema reportero es un gen reportero, un biomarcador de la superficie celular o una molécula reportera selectiva para una enzima o anticuerpo expresado por células del tipo de célula que se busca, o es una célula reportera luminiscente que reacciona selectivamente ante la presencia de un enzima o anticuerpo expresado por células del tipo celular que se busca.
El método de la presente invención y sus diversas etapas y subetapas iniciales se pueden llevar a cabo convenientemente usando un dispositivo analítico del tipo que se describe a continuación. A continuación, también se describen ejemplos del sistema de detección óptica aplicable al método. En algunas realizaciones, este dispositivo comprende:
un componente de clasificación para separar microgotas que contienen células de las vacías en una población de primeras microgotas que contienen células;
un componente de manipulación de microgotas para manipular posteriormente las primeras microgotas usando electrodos de electrohumectación reales o virtuales y que incluye:
una primera zona que incluye un medio para introducir un sistema reportero en cada primera microgota mediante fusión de microgotas;
una segunda zona ubicada dentro o adyacente a la primera zona en la que las microgotas fusionadas se detectan posteriormente en una o más ventanas de detección y
un sistema de detección óptica para detectar una señal óptica de las microgotas fusionadas que surgen de una interacción entre el sistema reportero y las células o un producto expresado de las mismas seleccionado de un microscopio de campo claro, un microscopio de campo oscuro, un medio para detectar quimioluminiscencia, un medio para detectar transferencia de energía por resonancia Forster o un medio para detectar fluorescencia.
El componente de clasificación empleado en tales realizaciones es un medio para separar microgotas que contienen una o más células (en adelante, "microgotas llenas") de una población más grande, algunas de las cuales están vacías. Dependiendo del tipo de componente de clasificación elegido, las microgotas se dirigen hacia abajo o hacia una de dos vías de microfluidos diferentes o ubicaciones receptoras, dependiendo de si están llenas o vacías. En algunas realizaciones, el acceso a uno u otro de estos se controla mediante un divisor o el accionamiento de una compuerta electromecánica que actúa en respuesta al análisis de cada microgota en una ventana analítica. En otra realización, la clasificación se logra aplicando una fuerza electrohumectante mediada ópticamente en la ventana analítica a una corriente de microgotas de modo que las elegidas sean arrastradas hacia un área o conjunto de retención. Las microgotas rechazadas permanecen entonces en la corriente y posteriormente pueden desecharse. En otra realización, la decisión de clasificación se basa en un fenómeno óptico; por ejemplo, microscopía de campo claro o detectando una propiedad óptica asociada con las células, por ejemplo, la presencia de una etiqueta o marcador fluorescente. En otra realización, la clasificación se puede lograr mediante un método dielectroforético en el que se aplica un campo eléctrico temporal en la ventana analítica para desviar cada microgota hacia uno de dos caminos diferentes a cada lado de un divisor. En una realización, el componente de clasificación comprende un primer canal de microfluidos que termina en una cámara analítica; al menos dos segundos canales de microfluidos conectados a la cámara analítica en el lado aguas abajo, al menos uno de los cuales transporta las primeras microgotas, una fuente de luz para iluminar la cámara analítica; un microscopio de campo claro o detector de fluorescencia para obtener datos de cada microgota iluminada en la cámara analítica; al menos una estructura OEWOD operable para dirigir las microgotas por uno de los dos segundos canales y un microprocesador adaptado para operar la(s) estructura(s) en respuesta a un resultado de un algoritmo de identificación aplicado a los datos recibidos del microscopio o analizador de fluorescencia.
En una realización, el dispositivo comprende además un componente de cultivo que es un componente integral del propio dispositivo o está ubicado por separado antes o después del componente de clasificación; preferiblemente después del componente de clasificación. Aquí, las microgotas se retienen mientras las células contenidas en ellas se cultivan para estimular la división y el crecimiento celular. De manera adecuada, el componente de cultivo comprende un recipiente en el que las microgotas se mantienen en condiciones de cultivo óptimas; típicamente entre una hora y una semana a una temperatura en el intervalo superior a 25 °C (por ejemplo, 25 a 40° C) y un puerto de entrada para introducir las microgotas en el mismo. En una realización, el componente de cultivo comprende además un calentador controlado termostáticamente y opcionalmente un temporizador que controla los ciclos de llenado y descarga del dispositivo. En una realización, el contenido del dispositivo comprende una emulsión de microgotas en un fluido portador inmiscible y el dispositivo comprende además una entrada y una salida a través de las cuales se puede pasar el fluido portador permitiendo su reemplazo con el tiempo. En una realización, el fluido portador es un aceite de hidrocarburo, silicona o fluorocarbono que se ha hidratado opcionalmente con micelas acuosas o microgotas secundarias. En algunas realizaciones, el fluido portador inmiscible es un aceite de fluorocarbono tal como HFE7500, HFE7700 o FC-40. Dichos aceites contienen además adecuadamente tensioactivos y otros aditivos para mantener la estabilidad de las microgotas y niveles bajos de nutrientes y gases necesarios para mantener el crecimiento.
En una realización, de particular utilidad donde la relación en peso de microgotas acuosas a aceite es baja, existe una tendencia a que las microgotas se encojan con el tiempo; un fenómeno que puede provocar una pérdida de reactividad en su interior. Una forma de contrarrestar este efecto es utilizar un aceite que ha sido hidratado. Dado que generalmente, los aceites descritos anteriormente no tienen una alta capacidad para disolver agua, la hidratación se logra adecuadamente creando micelas o microgotas secundarias de agua o tampón acuoso dentro de la fase oleosa. Este tampón puede tener una composición igual o diferente a la de las propias microgotas. En algunas realizaciones, estas micelas o microgotas secundarias pueden contener hasta cinco veces el contenido de sal de las propias microgotas y, opcionalmente, contener glicerol. Normalmente, estas micelas y microgotas secundarias son un orden de magnitud más pequeñas.
En una realización, el recipiente comprende además una superficie provista de una pluralidad de ubicaciones en las que las microgotas pueden ubicarse y agitarse para agitar su contenido usando fuerzas electrohumectantes mediadas ópticamente; también como se describe arriba.
El dispositivo comprende además un componente de preparación de muestras integral con el propio dispositivo o ubicado por separado aguas arriba del componente de cultivo que comprende un medio para crear una emulsión de las microgotas en un fluido portador inmiscible a partir de una alícuota de la muestra biológica.
Este componente de preparación de muestras incluye un medio de separación para separar microgotas de la muestra biológica en el fluido portador que comprende al menos una ubicación donde se aplica una fuerza de estiramiento electrohumectante a la muestra biológica. En una realización, los medios de separación comprenden:
una primera ubicación de electrohumectación adaptada para recibir la muestra biológica;
al menos una segunda ubicación de electrohumectación dispuesta de manera que la primera y segunda ubicaciones de electrodos de electrohumectación definan una ruta a lo largo de la cual las microgotas separadas de la muestra pueden transportarse usando fuerzas de electrohumectación direccionales;
un circuito de accionamiento de CA dispuesto en la primera ubicación de electrohumectación y comprendido por un electrodo y un circuito eléctrico de CA asociado o una zona semiconductora activada por el impacto de luz electromagnética sobre el mismo y
un circuito de carga de CC dispuesto en la primera ubicación de electrohumectación y adaptado para cargar electrostáticamente la superficie de la muestra biológica.
En una realización, los medios de separación comprenden además un circuito de control para conmutar entre los circuitos de accionamiento y de carga que son adecuadamente circuitos de CA y CC respectivamente. En otra realización, los medios de separación comprenden además un analizador para analizar el contenido de cada microgota producida a partir de la muestra biológica. A este respecto, la muestra biológica puede estar en forma de cualquier material acuoso como sangre, plasma, esputo, orina o material derivado de biopsias de tejido. Puede encontrar más información sobre los medios de separación adecuados en nuestra solicitud pendiente EP 3 639 925 A1 (EP18201162.7) al que se dirige el lector. Se apreciará fácilmente que el método de separación de microgotas asociado con este medio de separación puede formar la base para llevar a cabo la etapa inicial (c) anterior.
Volviendo al componente de manipulación de microgotas que se utiliza para manipular posteriormente las primeras microgotas producidas por el componente de clasificación, este es adecuadamente un chip microfluídico comprendido por una primera zona, una segunda zona y un sistema de detección óptica comprendido por electrodos electrohumectantes reales o virtuales, unidos juntos por una o más rutas de microfluidos a lo largo de las cuales las primeras microgotas son impulsadas por fuerzas neumáticas y/o electrohumectantes. De manera adecuada, los electrodos electrohumectantes son virtuales y están establecidos en ubicaciones en una o más estructuras OEWOD. Generalmente, esta es la forma de manipular las microgotas en el método y en una realización estas estructuras OEWOD están comprendidas por:
una primera pared compuesta comprendida por:
un primer sustrato
una primera capa conductora transparente sobre el sustrato, teniendo la primera capa conductora transparente un espesor en el intervalo de 70 a 250 nm;
una capa fotoactiva activada por radiación electromagnética en el intervalo de longitud de onda de 400-850 nm sobre la capa conductora, teniendo la capa fotoactiva un espesor en el intervalo de 300-1500 nm y
una primera capa dieléctrica sobre la capa fotoactiva, la primera capa dieléctrica
que tiene un espesor en el intervalo de 30 a 160 nm;
una segunda pared compuesta comprendida por:
un segundo sustrato;
una segunda capa conductora sobre el sustrato, teniendo la segunda capa conductora un espesor en el intervalo de 70 a 250 nm y
opcionalmente una segunda capa dieléctrica sobre la segunda capa conductora, teniendo la segunda capa dieléctrica un espesor en el intervalo de 30 a 160 nm.
en el que las superficies expuestas de la primera y segunda capas dieléctricas están dispuestas a una distancia de 20-180 |jm para definir un espacio de microfluidos adaptado para contener microgotas;
una fuente de A/C para proporcionar un voltaje a través de las paredes compuestas primera y segunda que conectan las capas conductoras primera y segunda;
al menos una fuente de radiación electromagnética que tiene una energía superior a la banda prohibida de la capa fotoactiva adaptada para incidir en la capa fotoactiva para inducir ubicaciones de electrohumectación virtuales correspondientes en la superficie de la primera capa dieléctrica; y
medios para manipular los puntos de incidencia de la radiación electromagnética sobre la capa fotoactiva para variar la disposición de las ubicaciones de electrohumectación virtuales, creando así al menos una ruta de electrohumectación a lo largo de la cual se puede hacer que se muevan las microgotas.
En una realización, la primera y segunda paredes de estas estructuras son transparentes con el espacio de microfluidos intercalado entre ellas. En otro, el primer sustrato y la primera capa conductora son transparentes, lo que permite que la luz procedente de la fuente de radiación electromagnética (por ejemplo, múltiples haces láser, una lámpara o un LED) incida sobre la capa fotoactiva. En otro, el segundo sustrato, la segunda capa conductora y la segunda capa dieléctrica son transparentes para que pueda obtenerse el mismo objetivo. En otra realización más, todas estas capas son transparentes.
De manera adecuada, el primer y segundo sustratos están hechos de un material que sea mecánicamente resistente, por ejemplo, vidrio metálico o un plástico técnico. En una realización, los sustratos pueden tener cierto grado de flexibilidad. En otra realización más, el primer y segundo sustrato tienen un espesor en el intervalo de 100-1000 jm . En algunas realizaciones, el primer sustrato está compuesto por silicio, sílice fundida y vidrio. En algunas realizaciones, el segundo sustrato está comprendida por sílice fundida y vidrio.
La primera y segunda capas conductoras están situadas sobre una superficie del primer y segundo sustrato y normalmente tienen un espesor en el intervalo de 70 a 250 nm, preferiblemente de 70 a 150 nm. En una realización, al menos una de estas capas está hecha de un material conductor transparente como óxido de indio y estaño (ITO), una película muy delgada de metal conductor como plata o un polímero conductor como PEDOT o similar. Estas capas pueden formarse como una lámina continua o una serie de estructuras discretas tales como alambres. Alternativamente, la capa conductora puede ser una malla de material conductor, dirigiéndose la radiación electromagnética entre los intersticios de la malla.
La capa fotoactiva está compuesta adecuadamente de un material semiconductor que puede generar áreas de carga localizadas en respuesta a la estimulación por la fuente de la segunda radiación electromagnética. Los ejemplos incluyen capas de silicio amorfo hidrogenado que tienen un espesor en el intervalo de 300 a 1500 nm. En una realización, la capa fotoactiva se activa mediante el uso de luz visible.
La capa fotoactiva en el caso de la primera pared y opcionalmente la capa conductora en el caso de la segunda pared están recubiertas con una capa dieléctrica que normalmente tiene un espesor de 30 a 160 nm. Las propiedades dieléctricas de esta capa incluyen preferiblemente una alta resistencia dieléctrica de >107 V/m y una constante dieléctrica de >3. Preferiblemente, es lo más delgado posible para evitar la ruptura dieléctrica. En una realización, la capa dieléctrica se selecciona entre alúmina, sílice, hafnia o una película delgada de polímero no conductor.
En otra realización de estas estructuras, al menos la primera capa dieléctrica, preferiblemente ambas, están recubiertas con una capa antiincrustante para ayudar a establecer el ángulo de contacto microgota/fluido portador/superficie deseada en las diversas ubicaciones virtuales de los electrodos de electrohumectación, y además para evitar que el contenido de las microgotas se adhiera a la superficie y disminuya a medida que la microgota se mueve a través del chip. Si la segunda pared no comprende una segunda capa dieléctrica, entonces la segunda capa antiincrustante se puede aplicar directamente sobre la segunda capa conductora. Para un rendimiento óptimo, la capa antiincrustante debe ayudar a establecer un ángulo de contacto microgota/fluido portador/superficie que debe estar en el intervalo de 50-170° cuando se mide como una interfaz de tres puntos aire-líquido-superficie a 25 °C. En una realización, estas capas tienen un espesor inferior a 10 nm y normalmente son una capa monomolecular. En otro, estas capas están comprendidas por un polímero de un éster de acrilato tal como metacrilato de metilo o un derivado del mismo sustituido con grupos hidrófilos; por ejemplo, alcoxisililo. Una o ambas capas antiincrustantes son hidrófobas para garantizar un rendimiento óptimo. En algunas realizaciones, se puede interponer una capa intersticial de sílice de espesor inferior a 20 nm entre el revestimiento antiincrustante y la capa dieléctrica para proporcionar un puente químicamente compatible.
La primera y segunda capas dieléctricas, y por lo tanto la primera y segunda paredes, definen un espacio microfluídico que tiene al menos 10 jm , y preferiblemente en el intervalo de 20-180 jm , de ancho y en el que están contenidas las microgotas. Preferiblemente, antes de ser contenidas, las propias microgotas tienen un diámetro intrínseco que es más de un 10 % mayor, adecuadamente más de un 20 % mayor, que la anchura del espacio de microgotas. De este modo, al entrar en el chip, las microgotas se someten a compresión, lo que conduce a un rendimiento de electrohumectación mejorado a través, por ejemplo, de una mejor capacidad de fusión de microgotas.
En una realización, la primera y segunda capas dieléctricas están recubiertas con un recubrimiento hidrófobo tal como fluorosilano.
En otra realización, el espacio microfluídico incluye uno o más espaciadores para mantener separadas las paredes primera y segunda en una cantidad predeterminada. Las opciones para espaciadores incluyen cuentas o pilares, crestas creadas a partir de una capa de resistencia intermedia que se ha producido mediante fotopatrón. Alternativamente, se puede utilizar material depositado tal como óxido de silicio o nitruro de silicio para crear los espaciadores. Alternativamente, se pueden usar capas de película, incluidas películas de plástico flexible con o sin un revestimiento adhesivo, para formar una capa espaciadora. Se pueden utilizar diversas geometrías de espaciador para formar canales estrechos, canales ahusados o canales parcialmente cerrados que están definidos por líneas de pilares. Mediante un diseño cuidadoso, es posible utilizar estos espaciadores para ayudar en la deformación de las microgotas, realizar posteriormente la división de las microgotas y efectuar operaciones en las microgotas deformadas. De manera similar, estos espaciadores se pueden usar para separar físicamente zonas del chip para evitar la contaminación cruzada entre poblaciones de gotas y para promover el flujo de gotas en la dirección correcta cuando se carga el chip bajo presión hidráulica.
Las paredes primera y segunda están polarizadas usando una fuente de energía A/C unida a las capas conductoras para proporcionar una diferencia de potencial de voltaje entre ellas; adecuadamente en el intervalo de 10 a 50 voltios.
Estas estructuras OEWOD se emplean normalmente en asociación con una fuente de segunda radiación electromagnética que tiene una longitud de onda en el intervalo de 400 a 850 nm, preferiblemente 660 nm, y una energía superior a la banda prohibida de la capa fotoactiva. De manera adecuada, la capa fotoactiva se activará en las ubicaciones virtuales de los electrodos electrohumectantes donde la intensidad incidente de la radiación empleada está en el intervalo de 0.01 a 0.2 W.cm-2.
La fuente de radiación electromagnética está, en una realización, pixelada para producir regiones fotoexcitadas correspondientes en la capa fotoactiva que también están pixeladas. De este modo, se inducen ubicaciones de electrodos electrohumectantes virtuales pixelados en la primera capa dieléctrica.
Cuando la fuente de radiación electromagnética está pixelada, se suministra adecuadamente directa o indirectamente utilizando una pantalla reflectante tal como un dispositivo de microespejo digital (DMD) iluminado por luz de LED u otras lámparas. Esto permite crear y destruir rápidamente patrones altamente complejos de ubicaciones de electrodos de electrohumectación virtuales en la primera capa dieléctrica, lo que permite que las microgotas se dirijan con precisión a lo largo de esencialmente cualquier ruta virtual utilizando fuerzas de electrohumectación estrechamente controladas. Esto también es especialmente ventajoso cuando es necesario que el chip manipule muchos miles de microgotas de este tipo simultáneamente a lo largo de múltiples vías. Se puede considerar que dichas vías de electrohumectación están construidas a partir de una serie continua de ubicaciones virtuales de electrodos de electrohumectación en la primera capa dieléctrica.
Los puntos de incidencia de las fuentes de radiación electromagnética sobre la capa fotoactiva pueden tener cualquier forma conveniente, incluida la circular o anular convencional. En una realización, las morfologías de estos puntos están determinadas por las morfologías de las correspondientes pixelaciones y en otra corresponden total o parcialmente a las morfologías de las microgotas una vez han entrado en el espacio microfluídico. En una realización, los puntos de impacto y, por lo tanto, las ubicaciones de los electrodos electrohumectantes pueden tener forma de media luna y estar orientados en la dirección de desplazamiento prevista de la microgota. Adecuadamente, las propias ubicaciones de los electrodos de electrohumectación son más pequeñas que la superficie de las microgotas que se adhieren a la primera pared y dan un gradiente de intensidad de campo máximo a través de la línea de contacto formada entre la gotita y el dieléctrico de superficie.
En una realización de la estructura OEWOD, la segunda pared también incluye una capa fotoactiva que permite que también se induzcan ubicaciones virtuales de electrodos de electrohumectación en la segunda capa dieléctrica por medio de la misma o diferente fuente de radiación electromagnética. La adición de una segunda capa dieléctrica permite la transición del borde humectante de una microgota desde la superficie superior a la inferior de la estructura y la aplicación de más fuerza electrohumectante a cada microgota.
En algunas realizaciones, la primera zona incluye un depósito que comprende una serie de primeros sitios de retención de microgotas y un puerto para introducir segundas microgotas que contienen el sistema reportero, estando configurada además la primera zona para impulsar las segundas microgotas a través de los primeros sitios de retención de microgotas a través de una o más rutas de electrodos electrohumectantes virtuales de modo que se provoque que la primera y la segunda microgotas se fusionen.
En algunas realizaciones, el dispositivo está configurado para introducir segundas microgotas en una primera región del dispositivo, conectada al puerto, en un flujo hidráulico continuo, y en el que una segunda región del dispositivo, superpuesta a la primera región, está configurada para canalizar microgotas desde la primera región a una tercera región del dispositivo para operaciones adicionales
La primera zona que forma parte del dispositivo es, en una realización, un depósito de retención que comprende una entrada para introducir las primeras microgotas y una salida unida por una ruta de electrohumectación a la segunda zona. La primera zona incluye además un puerto para introducir un sistema reportero que en una realización adecuada es una segunda entrada para introducir segundas microgotas acuosas que contienen un sistema reportero diseñado para identificar la naturaleza de las células contenidas en las primeras microgotas. En una realización, el depósito incluye además una serie de ubicaciones donde se pueden retener las primeras microgotas mientras las segundas microgotas se conducen sobre ellas; en el proceso que provoca un grado de fusión de la primera y segunda microgotas. La primera/segundas microgotas fusionadas (en lo sucesivo, "microgotas fusionadas") se pueden mantener en las ubicaciones hasta que el sistema reportero haya interactuado lo suficiente con las células para generar posteriormente una señal óptica óptima, momento en el cual se transportan a la segunda zona mediante electrohumectación. En algunos casos, puede ser deseable controlar el crecimiento de la señal óptica utilizando mediciones resueltas en el tiempo. En una realización, se emplea una única zona que abarca las funciones de la primera y la segunda zona; por ejemplo, detectando las microgotas fusionadas en los lugares de fusión mencionados anteriormente.
La segunda zona está comprendida adecuadamente por una o más ventanas de detección a través de las cuales se pueden analizar las microgotas fusionadas usando un sistema de detección óptica. En una realización la segunda zona es una sección transparente del chip. En otra realización, el sistema de detección óptica está diseñado para detectar una señal óptica de las microgotas que surge de una interacción entre el sistema reportero y las células o un producto expresado de las mismas. De manera adecuada, el sistema de detección óptica se selecciona entre un microscopio de campo claro, un microscopio de campo oscuro, un medio para detectar quimioluminiscencia, un medio para detectar la transferencia de energía por resonancia de Forster o un medio para detectar fluorescencia. En una realización, el sistema de detección también incluye una fuente de luz para iluminar las microgotas fusionadas y/o un microprocesador para recibir una señal de uno de los detectores y proporcionar datos a un usuario en forma de, por ejemplo, una pantalla visual o conteo. En una realización, el microprocesador está adaptado además por medio de un circuito de retroalimentación para controlar uno o más del rendimiento del componente de clasificación; la tasa de introducción de las primeras microgotas en la primera zona y la tasade fusión de las primeras microgotas que contienen el sistema reportero en respuesta a una señal detectada por el sistema de detección óptica.
Una ventaja particular de un instrumento que utiliza estructuras OEWOD para realizar las manipulaciones de gotitas es que el instrumento incorpora un sistema de direccionamiento óptico enfocado en la muestra. Al multiplexar y demultiplexar la luz de excitación y emisión requerida para la detección óptica con la iluminación requerida para el control OEWOD, es posible consolidar muchas de las funciones ópticas en un conjunto más simple y de menor coste. Por ejemplo, es posible demultiplexar la emisión de luminiscencia del conjunto utilizando un espejo dicroico de paso largo para desviar la luz de la columna de manipulación y hacia una cámara de detección de alta sensibilidad. Otra realización utiliza dos espejos dicroicos; un primer espejo para multiplexar en luz de excitación fluorescente procedente de una lámpara y un segundo para demultiplexar la emisión de fluorescencia. Para realizaciones que requieren esquemas de iluminación más sofisticados, como la transferencia de energía de resonancia de Forster resuelta en el tiempo, es favorable emplear el mismo sistema de iluminación estructurado que aborda los patrones de manipulación OEWOD para aplicar un patrón de iluminación que varía espacialmente y que depende del tiempo. Además de utilizar espejos dicroicos para estas operaciones de multiplexación, es posible utilizar elementos como filtros dispersivos, lentes dispersivas o rejillas. Para algunas aplicaciones es favorable realizar multiplexación temporal mediante la cual se utiliza el sistema de iluminación estructurada para conmutar rápidamente entre fuentes de excitación.
En algunas realizaciones, el dispositivo comprende además una tercera zona para recuperar microgotas de la primera y/o segunda zona. Aquí, las primeras microgotas se pueden subdividir y aislar para su posterior recuperación del instrumento; por ejemplo, para un análisis más detallado o confirmatorio. En una realización, la tercera zona está comprendida por uno o más puertos de salida de la segunda zona conectados a un recipiente de almacenamiento temporal. Al reponer la primera y la segunda zona utilizando el mecanismo de transporte OEWOD, es posible realizar muchas recuperaciones de microgotas en secuencia, lo que permite recuperar múltiples gotas por separado de un puerto.
Además de la manipulación de fluidos mediada ópticamente en la estructura OEWOD, el dispositivo también puede incluir una red de bombas y válvulas para manipular el flujo dentro del dispositivo mediante la aplicación selectiva de presión hidráulica a los diversos puertos de entrada y salida. Preferiblemente, esta red comprende válvulas de dos posiciones conectadas a cada salida y un conjunto de fuentes de presión (tales como bombas), recipientes de recolección y depósitos conectados a las mismas válvulas. Al cambiar la configuración de cada válvula, es posible aplicar presión positiva o negativa dentro del dispositivo a través de los depósitos y recipientes de recolección y, por lo tanto, provocar el flujo de material dentro, fuera o dentro del dispositivo.
El dispositivo y los métodos asociados de la presente invención descritos anteriormente tienen numerosas aplicaciones beneficiosas. A continuación, se describen algunas aplicaciones de ejemplo y flujos de trabajo asociados.
Una aplicación de ejemplo del dispositivo y los métodos divulgados es el desarrollo de líneas celulares modificadas genéticamente.
En esta solicitud, las células diana se encapsulan en primeras microgotas a través de los medios de separación basados en electrohumectación mediados ópticamente del componente de preparación de muestras. Los reactivos de transfección tales como, por ejemplo, un lentivirus modificado, se encapsulan en segundas microgotas separadas.
Luego, la primera y la segunda microgota se fusionan en el dispositivo OEWOD en una operación de fusión como se describió anteriormente para formar microgotas fusionadas, lo que hace que las células diana queden expuestas a los reactivos de transfección. Las células de las microgotas fusionadas se someten a ciclos de operaciones de fusión y división en los que la población celular se divide entre gotitas y el medio que rodea a las células se intercambia con medios nuevos mediante diluciones en serie, reponiendo el material agotado y eliminando cualquier excreta celular que se haya acumulado dentro de las gotitas.
El seguimiento de la ubicación de cada célula en la población de microgotas, por ejemplo, mediante inspección microscópica durante el ensayo, permite identificar células de ancestros comunes con fines de clasificación, asegurando la monoclonalidad de las poblaciones de células cultivadas.
La retención de células también aumenta en comparación con los métodos convencionales de desarrollo de líneas celulares, ya que durante el proceso descrito no hay etapas dañinas de congelación-descongelación, dispensación, manipulación manual o pases repetidos a largo plazo que se sepa que reducen la viabilidad de las células. De manera similar, mantener las células encapsuladas en gotitas elimina la posibilidad de perder clones en las superficies de los instrumentos que manipulan líquidos. Además, las células no viables pueden descubrirse en una fase temprana del proceso y sustituirse por células viables.
Una vez que se determina que las células en las microgotas fusionadas se han cultivado durante un período de tiempo suficiente, se introduce un tercer reactivo que comprende un ensayo reportero en el dispositivo OEWOD y se fusiona con las microgotas que contienen las células diana. El resultado del ensayo reportero se puede medir de acuerdo con, por ejemplo, una transferencia de energía de fluorescencia, quimioluminiscencia o resonancia de Forster detectada.
En función del resultado del ensayo reportero, se pueden descartar uno o más primeros subconjuntos de células y se puede hacer que uno o más segundos subconjuntos de células proliferen aún más. Se recupera una muestra del subconjunto de células diana cultivadas y se dispensa desde el chip a una placa de pocillos, por ejemplo, una placa estándar de 1536 pocillos, para su posterior análisis fuera del chip. Las células progenitoras restantes del subconjunto cultivado se conservan para su posterior cultivo en el chip.
Luego, la muestra recuperada se somete a uno o más análisis fuera del chip, como: Secuenciación de ADN, secuenciación de ARN, análisis de PCR, perfiles genéticos y medición de micromatrices. Se puede seleccionar, recuperar y cultivar adicionalmente un subconjunto adicional de células en el chip en función del resultado del análisis fuera del chip.
Otro ejemplo de aplicación de la presente invención es el cribado de células para determinar su funcionalidad inmunitaria.
Después de la inmunización con un antígeno tal como una toxina o un biomarcador característico de una enfermedad, se puede recolectar una muestra de células inmunes nativas tales como células B, células T o células dendríticas de un organismo como un ratón, un ser humano o un animal primate. Luego, las células se tratan y purifican para separarlas del tejido circundante, la linfa, las células sanguíneas y otros componentes del organismo huésped. Esto se puede lograr mediante una combinación de disección, centrifugación, inmunoprecipitación, filtración y diálisis.
Las células inmunes purificadas se encapsulan en microgotas y se cargan en el dispositivo OEWOD. Luego se introduce un reactivo tal como un reactivo de inmunoensayo, un reportero FRET o una línea celular reportera en las microgotas que contienen las células diana en un primer ensayo. Esto se puede realizar como se describió anteriormente creando segundas microgotas del reactivo y llevando a cabo una operación de fusión.
El resultado del primer ensayo se interroga, por ejemplo, mediante detección óptica o inspección microscópica, para determinar si las células diana excretan proteínas tales como anticuerpos en respuesta al reactivo de inmunoensayo. De acuerdo con el resultado del primer ensayo, se puede descartar del dispositivo un subconjunto de microgotas que contienen las células diana y se conserva otro subconjunto para realizar más pruebas.
Luego se puede introducir un segundo reactivo, como un reportero fuera del objetivo, de manera similar a las microgotas que contienen células restantes en un segundo ensayo en chip. El resultado del segundo ensayo se mide con una técnica óptica como la espectroscopia de fluorescencia, lo que lleva a una segunda ronda de selección y descarte de subconjuntos de microgotas. El proceso anterior se puede repetir para interrogar/cribar las células diana usando una serie de ensayos reporteros diferentes, midiendo la respuesta de las células diana a objetivos dentro, fuera del objetivo e irrelevantes.
Como se utiliza en el presente documento, el término "en el objetivo" se refiere a un tejido o antígeno de interés, y contra el cual la célula objetivo está produciendo anticuerpos de respuesta tales como, por ejemplo, un objetivo puede ser un tejido canceroso. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "fuera del objetivo" se refiere a un tejido en el que se observan o esperan efectos indeseables. Un ejemplo fuera del objetivo puede ser un tejido sano que esté cerca o asociado con un tejido canceroso. Como se usa en el presente documento, el término "diana irrelevante" se refiere a material que se espera que no tenga interacción biológica con un anticuerpo, pero que podría tener un efecto negativo en la precisión de los resultados del ensayo al, por ejemplo, unir grandes cantidades del anticuerpo sin ningún fin útil o con mediciones confusas.
En función de los resultados medidos de los ensayos de detección, se selecciona un subconjunto final de células. Las microgotas restantes que contienen células que contienen el subconjunto final se introducen luego en un reactivo de lisis seleccionado y un reactivo de síntesis de ADNc para formar una biblioteca de genes que actualmente se expresan en la célula diana. Las células de interés se recuperan fuera del chip y se someten a un ensayo genético que indica el ADN codificante responsable de los comportamientos observados en los ensayos fenotípicos en el chip.
Otro ejemplo de aplicación de la presente invención es la detección de la funcionalidad y eficacia de fármacos, incluidos fármacos de inmunomodulación y fármacos para la supresión de tumores.
En esta solicitud, se encapsula un panel de células diana del fármaco en las primeras microgotas y se cargan en el dispositivo OEWOD. También se carga un conjunto de segundas microgotas que comprenden un panel de compuestos farmacológicos para realizar pruebas.
Los paneles de dosimetría se forman mediante operaciones de fusión y división realizadas en las segundas microgotas para crear paneles de microgotas que contienen una variedad de diluciones de los respectivos compuestos farmacológicos. Los compuestos farmacológicos pueden estar en forma de microperlas, encapsulados en vesículas o expresados mediante células de producción encapsuladas en las gotitas.
Los paneles de dosimetría de fármacos se introducen en las células diana mediante operaciones de fusión; Un proceso exhaustivo de combinación por pares entre la primera célula que contiene microgotas y las microgotas de los paneles de dosimetría de fármacos garantiza que todos los paneles estén expuestos a cada tipo de célula en réplica. También se puede introducir una célula efectora, como por ejemplo una célula T asesina o un macrófago, junto con el panel de fármaco y la célula diana para probar el efecto del fármaco en la modulación de la respuesta inmunitaria y realizar una comparación de cruce detallado de la respuesta inmune en presencia de diferentes tejidos.
La respuesta de las células diana a los paneles de fármacos se puede controlar mediante, por ejemplo, inspección microscópica, tinciones reporteras fluorescentes o un ensayo reportero. El resultado del proceso de selección se puede utilizar para informar sobre la potencia de los fármacos probados en diversas condiciones de células y células efectoras.
Otro ejemplo de aplicación de la presente invención es la inducción de la diferenciación de células madre diana.
En esta solicitud, las células madre diana, como por ejemplo células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, células madre mesenquimales o células madre hematopoyéticas, se encapsulan en primeras microgotas y se cargan en el dispositivo OEWOD.
Un panel de compuestos reactivos de control, como por ejemplo factores de crecimiento, estimulantes ambientales, compuestos de señalización de célula a célula y morfógenos, se encapsulan en segundas microgotas y también se cargan en el dispositivo OEWOD.
Un subconjunto de las primeras microgotas se fusiona con las segundas microgotas que contienen los reactivos de control para exponer las células madre contenidas en las primeras microgotas a los reactivos y promover así la diferenciación de las células madre a lo largo de las rutas diana.
El proceso de diferenciación de células madre se controla mediante, por ejemplo, imágenes microscópicas, detección de compuestos reporteros fenotípicos y realización de ensayos reporteros. Las células diferenciadas en las microgotas fusionadas se pueden recuperar del dispositivo OEWOD mediante un paso de dispensación para su posterior cultivo o procesamiento.
Otro ejemplo más de aplicación de la presente invención es la formación controlada de estructuras organoides.
En esta aplicación, las células progenitoras organoides, como por ejemplo células tumorales o células madre, se encapsulan en primeras microgotas y se cargan en el dispositivo OEWOD. Un panel de reactivos de control, como por ejemplo factores de crecimiento, estimulantes ambientales, compuestos de señalización de célula a célula y morfógenos, se encapsulan en segundas microgotas y también se cargan en el dispositivo OEWOD.
Un subconjunto de la población de células progenitoras organoides contenida en las primeras microgotas se expone a los reactivos de control mediante una operación de fusión para promover la formación de organoides y estructuras tisulares. Los organoides así formados se pueden almacenar en un área dedicada en el chip del dispositivo OEWOD y se les pueden suministrar nutrientes y cualquier otro medio de crecimiento necesario mediante operaciones de fusión de gotitas. Los organoides almacenados en un chip de esta manera pueden someterse a ensayos de detección de fármacos como se describe en relación con las aplicaciones de ejemplo anteriores.
Otro ejemplo de aplicación de la presente invención es la detección de modificación genética CRISPR-Cas9.
En esta aplicación, las células diana se encapsulan en las primeras microgotas y se cargan en el dispositivo OEWOD. También se carga en el dispositivo un segundo conjunto de microgotas que comprende un panel de pares de ARNg. Cargar el panel de pares de ARNg puede implicar un paso preparatorio de detectar ARNg liofilizados en regiones diana de la superficie del dispositivo y posteriormente rehidratar las regiones que comprenden el panel haciendo que las microgotas pasen sobre ellas.
Esto puede ser en forma de un paso de preparación de perlas en el que los ARNg se unen a microperlas y estas perlas se manchan y liofilizan en la superficie del fluido.
Los ARNg se introducen en las células diana mediante operaciones de fusión, que hacen que las células diana absorban el ARNg junto con una enzima de restricción programable como Cas9 y también los reactivos necesarios para inducir una modificación genética en la célula diana.
Las células de las microgotas fusionadas se someten a ciclos de operaciones de fusión y división en los que la población celular se divide entre gotitas y el medio que rodea a las células se intercambia mediante dilución en serie.
El seguimiento de la ubicación de cada célula en la población de microgotas permite identificar células de ancestros comunes con fines de clasificación, lo que aumenta la monoclonalidad de las poblaciones de células cultivadas. La retención de células también aumenta.
Una vez que se determina que las células en las microgotas fusionadas se han cultivado durante un período de tiempo suficiente, se introduce un tercer reactivo que comprende un ensayo reportero en el dispositivo OEWOD y se fusiona con las microgotas que contienen las células diana. El resultado del ensayo reportero se puede medir de acuerdo con, por ejemplo, una transferencia de energía de fluorescencia, quimioluminiscencia o resonancia de Forster detectada.
En función del resultado del ensayo reportero, se pueden descartar uno o más primeros subconjuntos de células y se puede hacer que uno o más segundos subconjuntos de células proliferen aún más. Se recupera una muestra del subconjunto de células diana cultivadas y se dispensa desde el chip a una placa de pocillos, por ejemplo, una placa estándar de 1536 pocillos, para su posterior análisis fuera del chip. Las células progenitoras restantes del subconjunto cultivado se conservan para su posterior cultivo en el chip.
Luego, la muestra recuperada se somete a uno o más análisis fuera del chip, como: Secuenciación de ADN, secuenciación de ARN, análisis de PCR, perfiles genéticos y medición de micromatrices. Se puede seleccionar, recuperar y cultivar adicionalmente un subconjunto adicional de células en el chip en función del resultado del análisis fuera del chip.
Ahora se ilustra un dispositivo de ejemplo y un flujo de trabajo de ejemplo asociado con referencia a la Figura 1.
una entrada de fluido 1 admite una emulsión 2 de una mezcla de primeras microgotas vacías y que contienen células en un aceite de fluorocarbono. Estas primeras microgotas se transfieren luego mediante estructuras OEWOD (no mostradas) a una zona de clasificación 3 donde se clasifican, por medios ópticos o por otros medios de clasificación como los descritos anteriormente, en aquellos que están vacíos 4 y los que contienen células 5. A continuación, cada una de las microgotas que contienen células 5 son transferidas a la zona de fusión 8, también mediante estructuras OEWOD, donde se mantienen durante un período de tiempo definido en condiciones que promueven el crecimiento y la división celular dentro de cada una. Al final de este período, una segunda entrada 6 admite segundas microgotas, que contienen un sistema reportero de fluorescencia selectivo para un tipo de célula de interés 7 que luego se fusionan con las primeras microgotas que contienen células 5 en la zona de fusión 8 para formar microgotas fusionadas 9. Las microgotas 9 fusionadas se transfieren luego por medio de estructuras OEWOD a la ventana óptica 10 donde se detecta una señal de fluorescencia característica del sistema reportero usando un instrumento de detección óptica 11 comprendido por una fuente de luz LED, un fotodetector y un microprocesador. El instrumento de detección óptica 11 se combina parcialmente con un proyector de manipulación óptica 12.
La Figura 2 muestra una vista en sección transversal de un dispositivo de ejemplo que comprende una estructura oEWOD adecuada para la manipulación rápida de microgotas acuosas 2 emulsionado en un aceite de fluorocarbono que tiene una viscosidad de 5 * 10-6 metro2.s-1 (5 centistokes) o menos a 25 °C y que en su estado libre tienen un diámetro de 120 pm (por ejemplo, en el intervalo de 80 a 120 pm). Este comprende placas de vidrio superior e inferior (13 y 14) cada una de 500 pm de espesor recubierto con capas transparentes de óxido de indio y estaño (ITO) conductor 15 teniendo un espesor de 130 nm. Cada uno de 15 está conectado a una fuente de A/C 16 con la capa ITO en 14 siendo el suelo. 14 está recubierto con una capa de silicio amorfo 17 que tiene 800 nm de espesor. 13 y 17 Cada uno está recubierto con una capa de 160 nm de espesor de alúmina de alta pureza o Hafnia 18 que a su vez están recubiertos con una capa intersticial de dióxido de silicio que soporta una capa de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano 19 para renderizar las superficies de 18 hidrófobo. 13 y 17 están espaciados 80 pm utilizando espaciadores para que las microgotas sufran un grado de compresión cuando se introducen en el dispositivo. Una imagen de una pantalla pixelada reflectante, iluminada por una fuente de luz LED 20 se dispone generalmente debajo 14 y luz visible (longitud de onda 660 u 830 nm) a un nivel de 0.01 W.cm-2 es emitido por cada diodo 21 y causado para incidir en 17 por propagación en la dirección de las múltiples flechas hacia arriba a través de 14 y 15. En los diversos puntos de impacto, regiones de carga fotoexcitadas 22 son creadas en 17 que inducen ángulos de contacto líquido-sólido modificados en 18 en los lugares correspondientes de electrohumectación 23. Estas propiedades modificadas proporcionan la fuerza capilar necesaria para impulsar las microgotas 2 desde un punto 23 a otro. 20 está controlado por un microprocesador 24 que determina cuál de 21 en la matriz se iluminan en un momento dado mediante algoritmos preprogramados.

Claims (24)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo para manipular y/o determinar una o más características de las células contenidas dentro de una muestra biológica, el dispositivo comprende:
un componente de clasificación (3) configurado para separar microgotas que contienen células de las vacías (4) en una población de primeras microgotas (5) que contienen células;
un componente de manipulación de microgotas configurado para manipular las primeras microgotas usando electrodos de electrohumectación reales o virtuales, el componente de manipulación de microgotas incluye:
una primera zona (8) configurada para disponer las primeras microgotas en una matriz para inspección óptica y para introducir un sistema reportero (7) en cada primera microgota mediante fusión de microgotas;
una segunda zona ubicada dentro o adyacente a la primera zona y configurada para detectar microgotas en una o más ventanas de detección (10); y
opcionalmente una tercera zona en la que las microgotas pueden subdividirse y aislarse para su posterior recuperación del dispositivo ; y
un sistema de detección óptica (11) configurado para detectar una señal óptica de las microgotas a través de una o más ventanas de detección, en el que, para microgotas (9) fusionadas, la señal surge de una interacción entre el sistema reportero y
las células o un producto expresado de las mismas.
2. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sistema de detección óptica (11) se selecciona entre:
un microscopio de campo claro, un microscopio de campo oscuro, un medio para detectar quimioluminiscencia, un medio para detectar la transferencia de energía por resonancia de Forster, y un medio para detectar fluorescencia.
3. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende además un componente de cultivo celular, ya sea integral con el dispositivo o ubicado por separado antes o después del componente de clasificación (3), configurado para contener las microgotas mientras se cultivan las células contenidas en su interior.
4. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el componente de cultivo celular está configurado además para agitar los contenidos de cada microgota usando fuerzas electrohumectantes mediadas ópticamente.
5. Un dispositivo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, en el que el dispositivo comprende además un calentador y un controlador de temperatura configurado para controlar la temperatura de las microgotas en el componente de cultivo celular dentro del intervalo de 25 a 40 °C.
6. Un dispositivo como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, que comprende además un componente de preparación de muestras, ya sea integral con el dispositivo o ubicado por separado antes del componente de clasificación (3), configurado para crear una emulsión de las microgotas (2) en un fluido portador inmiscible de la muestra biológica.
7. Un dispositivo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que al menos uno del componente de clasificación (3), el componente de cultivo celular y el componente de preparación de muestras está configurado con ubicaciones de electrodos de electrohumectación para permitir que las gotitas se manipulen en su interior y/o o entre ambos.
8. Un dispositivo como se reivindica en la reivindicación 6, en el que el componente de preparación de muestras incluye al menos una ubicación donde se aplica una fuerza de estiramiento por electrohumectación a la muestra biológica, y está configurado para separar microgotas de la muestra biológica hacia el fluido portador.
9. Un dispositivo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los medios de detección óptica (11) comprenden una fuente de primera radiación electromagnética adaptada para incidir en las primeras microgotas en una o más ventanas de detección (10), y comprende además un detector para detectar la fluorescencia emitida por las microgotas.
10. Un dispositivo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente de manipulación de microgotas incluye una o más estructuras OEWOD comprendidas por:
una primera pared de compuesto comprendida por:
un primer sustrato (14)
una primera capa conductora transparente sobre el sustrato (15), la primera capa conductora transparente tiene un espesor en el intervalo de 70 a 250 nm;
una capa fotoactiva (17) activada por radiación electromagnética en el intervalo de longitud de onda de 400-850 nm sobre la capa conductora, la capa fotoactiva tiene un espesor en el intervalo de 300-1500 nm y
una primera capa dieléctrica (18) sobre la capa fotoactiva, la primera capa dieléctrica tiene un espesor en el intervalo de 30 a 160 nm;
una segunda pared de compuesto comprendida por:
un segundo sustrato (13);
una segunda capa conductora sobre el sustrato (15), la segunda capa conductora tiene un espesor en el intervalo de 70 a 250 nm y
opcionalmente una segunda capa dieléctrica (18) sobre la segunda capa conductora,
la segunda capa dieléctrica tiene un espesor en el intervalo de 30 a 160 nm
en el que las superficies expuestas de la primera y segunda capas dieléctricas están dispuestas a una distancia de 20-180 |jm para definir un espacio de microfluidos adaptado para contener microgotas;
una fuente de A/C (16) para proporcionar un voltaje a través de las paredes de compuesto primera y segunda que conectan las capas conductoras primera y segunda;
al menos una fuente de radiación electromagnética (20) que tiene una energía superior a la banda prohibida de la capa fotoactiva adaptada para incidir en la capa fotoactiva para inducir ubicaciones de electrohumectación virtuales correspondientes en la superficie de la primera capa dieléctrica; y
medios para manipular los puntos de incidencia de la radiación electromagnética sobre la capa fotoactiva para variar la disposición de las ubicaciones de electrohumectación virtuales, creando así al menos una ruta de electrohumectación a lo largo de la cual se puede hacer que se muevan las microgotas.
11. Un dispositivo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera zona (8) incluye un depósito que comprende una matriz de primeros sitios de retención de microgotas y un puerto (6) para introducir segundas microgotas que contienen el sistema reportero (7), la primera zona está configurada además para impulsar las segundas microgotas a través de los primeros sitios de retención de microgotas a través de una o más rutas de electrodos de electrohumectación virtuales de modo que se haga que la primera y la segunda microgotas se fusionen.
12. Un dispositivo como se reivindica la reivindicación 11, en el que el dispositivo está configurado para introducir segundas microgotas en una primera región (8) del dispositivo, conectada al puerto (6), en un flujo hidráulico continuo, y en el que una segunda región del dispositivo, que se superpone a la primera región, está configurada para canalizar microgotas desde la primera región (8) hacia una tercera región del dispositivo para operaciones adicionales.
13. Un dispositivo como se reivindica la reivindicación 10, en el que al menos la superficie de la primera capa dieléctrica (18) está provista de un revestimiento antiincrustante (19).
14. Un dispositivo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un microprocesador (24) adaptado por medio de un circuito de retroalimentación para controlar uno o más del rendimiento del componente de clasificación (3); la velocidad de introducción de las primeras microgotas en la primera zona (8) y la velocidad de fusión de la primera y segunda microgotas en respuesta a una señal suministrada por el sistema de detección.
15. Un método para usar el dispositivo de cualquier reivindicación anterior para manipular y/o determinar una o más características de tipos de células en una muestra biológica, el método comprende las etapas de:
crear a partir de la muestra biológica primeras microgotas acuosas (2) en un fluido portador inmiscible, de las cuales se cree que al menos algunas contienen células de un tipo celular particular;
mover las primeras microgotas a lo largo de una ruta usando los electrodos de electrohumectación reales o virtuales hasta al menos una ubicación de fusión de microgotas (8);
mover segundas microgotas acuosas que contienen un sistema reportero (7) característico del tipo de célula cuyas características se están investigando a lo largo de una ruta usando electrodos de electrohumectación reales o virtuales hasta la ubicación de fusión de las microgotas (8);
fusionar las microgotas primera y segunda en el lugar de fusión (8) para producir microgotas fusionadas (9); y analizar el contenido de cada microgota fusionada (9) con el sistema la detección
óptica (11) y detectar una señal óptica característica de una interacción entre la célula y el sistema reportero; en el que la interacción entre la célula y el sistema reportero que es característica del tipo de célula identifica la naturaleza de las células en la muestra biológica.
16. Un método como se reivindica en la reivindicación 15, en el que la etapa de crear las primeras microgotas comprende además separar las primeras microgotas (5) que contienen células de una población de microgotas (2) que incluyen tanto microgotas (4) que contienen células como vacías.
17. Un método como se reivindica la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que la etapa de crear las primeras microgotas comprende además cultivar la población de microgotas en condiciones que provocan el crecimiento y la división celular.
18. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que la etapa de crear las primeras microgotas comprende además separar las microgotas de la muestra biológica mediante la aplicación de una fuerza de estiramiento electrohumectante.
19. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que el fluido portador inmiscible es un aceite de hidrocarburo, silicona, o fluorocarbono que se ha hidratado opcionalmente con micelas acuosas o microgotas secundarias.
20. Un método como se reivindica en la reivindicación 17, en el que cultivar la población de microgotas comprende poner en contacto la población de microgotas en el fluido portador inmiscible con un flujo de fluido portador que contiene nutrientes para cultivo celular y/o gas disuelto que consiste en uno o más de oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono.
21. Un método como se reivindica en la reivindicación 20, en el que el fluido portador inmiscible se purga periódicamente de gases perjudiciales para el cultivo de las células.
22. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que cultivar la población de microgotas comprende revolver o agitar las microgotas mediante la aplicación de una fuerza de electrohumectación mediada ópticamente en ubicaciones virtuales de electrodos de electrohumectación donde se mantienen las microgotas.
23. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, en el que el sistema reportero (7) es un gen reportero, un biomarcador de la superficie celular o una molécula reportera selectiva para una enzima o anticuerpo expresado por células del tipo de célula que se busca, o es una célula reportera luminiscente que reacciona selectivamente a la presencia de una enzima o anticuerpo expresado por células del tipo de célula que se busca.
24. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, en el que las microgotas se transportan entre ubicaciones en el dispositivo usando una estructura OEWOD adaptada para generar una ruta de electrodos electrohumectantes virtuales usando radiación electromagnética, y opcionalmente provista de un antiincrustante y/o recubrimiento biocompatible.
ES19801405T 2018-11-20 2019-11-08 Dispositivo y método para la detección de células en microgotas Active ES2976464T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18207379.1A EP3656473A1 (en) 2018-11-20 2018-11-20 Microdroplet detection of cells
EP18207377.5A EP3656472A1 (en) 2018-11-20 2018-11-20 Cell analyser
GBGB1909514.0A GB201909514D0 (en) 2018-11-20 2019-07-02 Device and method for microdroplet detection of cells
PCT/GB2019/053168 WO2020104769A1 (en) 2018-11-20 2019-11-08 Device and method for microdroplet detection of cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2976464T3 true ES2976464T3 (es) 2024-08-01

Family

ID=67540110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19801405T Active ES2976464T3 (es) 2018-11-20 2019-11-08 Dispositivo y método para la detección de células en microgotas

Country Status (14)

Country Link
US (2) US12157123B2 (es)
EP (3) EP3883689B1 (es)
JP (3) JP7500560B2 (es)
KR (2) KR102921574B1 (es)
CN (2) CN113164952B (es)
AU (2) AU2019385743B2 (es)
BR (1) BR112021009866A2 (es)
DK (1) DK3883689T3 (es)
ES (1) ES2976464T3 (es)
GB (1) GB201909514D0 (es)
IL (2) IL313503A (es)
SG (1) SG11202105140UA (es)
WO (1) WO2020104769A1 (es)
ZA (1) ZA202103400B (es)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202001051D0 (en) * 2020-01-24 2020-03-11 Lightcast Discovery Ltd Methods and apparatus for high throughput microdroplet manipulation
GB202012485D0 (en) * 2020-08-11 2020-09-23 Lightcast Discovery Ltd Improvements in or relating to a method of maintaing a microdroplet
WO2022074375A1 (en) * 2020-10-05 2022-04-14 Lightcast Discovery Ltd Improvements in or relating to a device and methods for facilitating manipulation of microdroplets
EP4288764B1 (en) * 2021-02-03 2025-07-09 Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. High-sensitivity chemiluminescence detection systems and methods
GB202103609D0 (en) 2021-03-16 2021-04-28 Lightcast Discovery Ltd Method of selecting cells
JP2024522026A (ja) * 2021-05-13 2024-06-10 アイメック・ヴェーゼットウェー 生体細胞を選別するデバイス及び方法
GB202109967D0 (en) * 2021-07-09 2021-08-25 Lightcast Discovery Ltd Improvements in or relating to imaging microdroplets in a microfluidic device
CN115015159A (zh) * 2022-06-21 2022-09-06 济南微生态生物医学省实验室 一种基于太赫兹技术检测活细胞样品的方法
TWI908328B (zh) * 2024-06-28 2025-12-11 醫華生技股份有限公司 非接觸式生物微粒處理設備及生物微粒處理裝置
CN119023519B (zh) * 2024-07-31 2025-06-27 武汉欧必诺生物科技有限公司 微粒检测设备

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6565727B1 (en) 1999-01-25 2003-05-20 Nanolytics, Inc. Actuators for microfluidics without moving parts
US6958132B2 (en) 2002-05-31 2005-10-25 The Regents Of The University Of California Systems and methods for optical actuation of microfluidics based on opto-electrowetting
US20060153745A1 (en) 2005-01-11 2006-07-13 Applera Corporation Fluid processing device for oligonucleotide synthesis and analysis
US7901947B2 (en) 2006-04-18 2011-03-08 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based particle sorting
US8716015B2 (en) 2006-04-18 2014-05-06 Advanced Liquid Logic, Inc. Manipulation of cells on a droplet actuator
US20100120130A1 (en) 2007-08-08 2010-05-13 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet Actuator with Droplet Retention Structures
US8367370B2 (en) 2008-02-11 2013-02-05 Wheeler Aaron R Droplet-based cell culture and cell assays using digital microfluidics
WO2009137415A2 (en) 2008-05-03 2009-11-12 Advanced Liquid Logic, Inc. Reagent and sample preparation, loading, and storage
AU2009262959A1 (en) * 2008-06-27 2009-12-30 Massachusetts Institute Of Technology Microfluidic droplets for metabolic engineering and other applications
FR2933713B1 (fr) 2008-07-11 2011-03-25 Commissariat Energie Atomique Procede et dispositif de manipulation et d'observation de gouttes de liquide
US8846414B2 (en) * 2009-09-29 2014-09-30 Advanced Liquid Logic, Inc. Detection of cardiac markers on a droplet actuator
US20140124037A1 (en) 2012-11-07 2014-05-08 Advanced Liquid Logic, Inc. Methods of manipulating a droplet in a droplet actuator
US9366647B2 (en) 2013-03-14 2016-06-14 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Optical detection for bio-entities
US20150306598A1 (en) * 2014-04-25 2015-10-29 Berkeley Lights, Inc. DEP Force Control And Electrowetting Control In Different Sections Of The Same Microfluidic Apparatus
WO2016018726A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Becton, Dickinson And Company Methods and systems for separating components of a biological sample with gravity sedimentation
DE102015106870B3 (de) * 2014-11-10 2016-02-25 Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie e. V. Hans-Knöll-Institut System zur Inkubation von mikrofluidischen Tropfen und Verfahren zur Bereitstellung von homogenen Inkubationsbedingungen in einer Tropfeninkubationseinheit
WO2016090295A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 The Regents Of The University Of California Single-sided light-actuated microfluidic device with integrated mesh ground
EP3230718B1 (en) 2014-12-09 2022-03-02 Berkeley Lights, Inc. Automated detection of assay-positive areas or of analyte quantities in microfluidic devices
US10267726B2 (en) * 2015-04-27 2019-04-23 Illumina France Sarl Systems and methods of identifying and/or tracking particles in a droplet, wherein the particle can be a cell
GB201509640D0 (en) * 2015-06-03 2015-07-15 Sphere Fluidics Ltd Systems and methods
CA3001616C (en) * 2015-10-27 2023-09-05 Berkeley Lights, Inc. Microfluidic apparatus having an optimized electrowetting surface and related systems and methods
WO2017117567A1 (en) * 2015-12-30 2017-07-06 Berkeley Lights, Inc. Droplet generation in a microfluidic device having an optoelectrowetting configuration
KR20180133442A (ko) 2016-04-13 2018-12-14 비비아 바이오테크 에스.엘. 생체외 bite 활성화된 t 세포
US20180313819A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 Mike Joseph Pugia High speed droplet sorter
US10544413B2 (en) 2017-05-18 2020-01-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
EP4450162A3 (en) 2017-06-21 2025-01-08 Lightcast Discovery Ltd Microdroplet manipulation device
WO2018234448A1 (en) 2017-06-21 2018-12-27 Base4 Innovation Limited Method for investigating molecules such as nucleic acids
US10940477B2 (en) * 2018-07-19 2021-03-09 Micareo Taiwan Co., Ltd. Fluid sample collection and retrieval apparatus and microfluidic chip

Also Published As

Publication number Publication date
EP3883689A1 (en) 2021-09-29
SG11202105140UA (en) 2021-06-29
WO2020104769A1 (en) 2020-05-28
US12157123B2 (en) 2024-12-03
EP4488655A2 (en) 2025-01-08
EP4488655A3 (en) 2025-04-23
JP2026053366A (ja) 2026-03-25
IL313503A (en) 2024-08-01
DK3883689T3 (da) 2024-04-08
EP4336168A2 (en) 2024-03-13
IL283266B1 (en) 2024-07-01
US20250187006A1 (en) 2025-06-12
KR20260034666A (ko) 2026-03-11
CN113164952B (zh) 2023-12-05
CN117586866A (zh) 2024-02-23
CA3120239A1 (en) 2020-05-28
BR112021009866A2 (pt) 2021-09-14
IL283266A (en) 2021-07-29
KR102921574B1 (ko) 2026-02-02
CN113164952A (zh) 2021-07-23
EP4336168A3 (en) 2024-05-29
EP3883689B1 (en) 2024-03-06
JP7785851B2 (ja) 2025-12-15
KR20210094583A (ko) 2021-07-29
US20220008927A1 (en) 2022-01-13
JP2022510140A (ja) 2022-01-26
JP2024119899A (ja) 2024-09-03
AU2019385743A1 (en) 2021-06-17
JP7500560B2 (ja) 2024-06-17
IL283266B2 (en) 2024-11-01
ZA202103400B (en) 2022-10-26
AU2019385743B2 (en) 2024-10-03
GB201909514D0 (en) 2019-08-14
AU2024278411A1 (en) 2025-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2976464T3 (es) Dispositivo y método para la detección de células en microgotas
CN113543884B (zh) 微滴操纵装置
EP3656472A1 (en) Cell analyser
CN105658781B (zh) 具有隔离围栏的微流体装置及用它测试生物微目标的方法
US20220274113A1 (en) Apparatus and methods for manipulating microdroplets
CA3120239C (en) Device and method for microdroplet detection of cells
EP3656473A1 (en) Microdroplet detection of cells
US20230256448A1 (en) Improvements to apparatus and methods for manipulating microdroplets
WO2024091949A1 (en) Methods and systems for encoded effector screening
HK1225407B (zh) 具有隔离围栏的微流体装置及用它测试生物微目标的方法