ES2978123T3 - Receptor quimérico de antígeno específico para CD19 y sus usos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a receptores de antígenos quiméricos (CAR). Los CAR son capaces de redirigir la especificidad y la reactividad de las células inmunitarias hacia un objetivo seleccionado aprovechando las propiedades del dominio de unión al ligando. En particular, la presente invención se refiere a un receptor de antígenos quiméricos en el que la unión al ligando extracelular es un scFV derivado de un anticuerpo monoclonal CD19, preferiblemente 4G7. La presente invención también se refiere a polinucleótidos, vectores que codifican dicho CAR y células aisladas que expresan dicho CAR en su superficie. La presente invención también se refiere a métodos para diseñar células inmunitarias que expresan 4G7-CAR en su superficie, lo que confiere un estado "activado" prolongado a la célula transducida. La presente invención es particularmente útil para el tratamiento de linfomas de células B y leucemia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Receptor quimérico de antígeno específico para CD19 y sus usos

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con una composición para su uso en terapia combinada que comprende a) una célula T modificada genéticamente que expresa un receptor quimérico de antígeno específico para CD19 que comprende al menos un dominio de unión a ligando extracelular específico para CD19, un dominio transmembrana y al menos un dominio de señalización intracelular; en donde dicho dominio extracelular comprende un fragmento FV de cadena simple derivado del anticuerpo monoclonal 4G7, específico para CD19, comprendiendo dicho fragmento FV de cadena simple el fragmento variable de la cadena pesada gamma 1 de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de la SEQ ID NO: 3 el fragmento variable de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; y b) el anticuerpo alemtuzumab. La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Antecedentes de la invención

La inmunoterapia adaptada, que involucra la transferencia de células T específicas por antígeno autólogas generadasex vivo,es una estrategia promisoria para tratar infecciones virales y cáncer. Las células T usadas para la inmunoterapia adaptativa pueden generarse por expansión de células T específicas por antígeno o redireccionar las células T por diseño genético (Park, Rosenberg y col. 2011). La transferencia de células T específicas por antígenos virales es un procedimiento bien establecido usado para el tratamiento de infecciones virales asociadas a trasplantes y malignidades raras relacionadas con virus. Similarmente, el aislamiento y transferencia de células T específicas por tumores ha mostrado ser exitoso en el tratamiento de melanoma.

Las especificidades novedosas en células T han sido generadas exitosamente por transferencia genética de receptores de células T transgénicos o receptores de antígenos quiméricos (CAR) (Jena, Dotti y col. 2010). Los CAR son receptores sintéticos que consisten en un grupo de direccionamiento que está asociado con uno o más dominios de unión en una molécula de fusión simple. En general, el grupo de unión de un CAR consiste en un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de cadena simple (scFv), que comprende los fragmentos variables liviano y pesado de un anticuerpo monoclonal unidos por un conector flexible. Los grupos de unión basados en los dominios del receptor o ligando también han sido usados exitosamente. Los dominios de señalización para los CAR de primera generación derivan de la región citoplasmática del CD3zeta o de las cadenas gamma del receptor Fc. Los CAR de primera generación han mostrado redireccionar exitosamente la citotoxicidad de células T, sin embargo, fallan en proveer expansión prolongada y actividad antitumoralin vivo.Los dominios de unión de moléculas coestimulatorias que incluyen CD28, OX-40 (CD134) y 4-1BB (CD137) han sido agregados solos (segunda generación) o en combinación (tercera generación) para potenciar la supervivencia y aumentar la proliferación de células T con CAR modificado. Los CAR han permitido exitosamente redireccionar las células T contra antígenos expresados en la superficie de las células tumorales de diferentes malignidades que incluyen linfomas y tumores sólidos (Jena, Dotti y col. 2010).

El CD19 es un blanco atractivo para la inmunoterapia ya que la gran mayoría de las leucemias linfoblásticas agudas B (B-ALL) expresan uniformemente CD19, mientras que la expresión está ausente en células no hematopoyéticas, así como células mieloides, eritroides y T, y células madre de médula ósea. Los ensayos clínicos sobre CD19 en malignidades de células B están en progreso con respuestas antitumorales alentadoras. La mayoría infunden células T modificadas genéticamente para expresar un receptor quimérico de antígeno (CAR) con especificidad derivada de la región scFv de un anticuerpo monoclonal de ratón específico para CD19 FMC63 (Nicholson, Lenton y col. 1997; Cooper, Topp y col. 2003; Cooper, Jena y col. 2012) (Solicitud internacional: WO2013/126712). Por ejemplo, Coper, Jena y col. 2012 (Blood, vol. 119, n.° 12, páginas 2700-2702) proporcionan una revisión de los datos clínicos publicados sobre células T modificadas para expresar un receptor quimérico de antígeno (CAR) con especificidad derivada de la región scFv del anticuerpo monoclonal de ratón específico para CD19 FMC63.

Sin embargo, aún hay una necesidad por mejorar la construcción de CAR que presente mejor compatibilidad con la proliferación de células T, con el objetivo de permitir que las células que expresan dichos<c>A<r>alcancen una ventaja clínica significativa.

Sumario de la invención

Los inventores han generado un CAR específico para CD19 (4G7-CAR) que comprende un scFV derivado del anticuerpo monoclonal específico para CD19, 4G7, y han encontrado sorprendentemente que la introducción del 4G7-CAR resultante en células T primarias podría conferir un estado “activado” prolongado de la célula transducida independientemente de la unión a antígeno. Luego de la activación no específicain vitro(por ejemplo con esferas recubiertas con anti-CD3/CD28 e IL2 recombinante), estas células mostraron un tamaño célula aumentado (formación de blasto) así como la expresión de marcadores de activación (CD25) durante un período de tiempo prolongado en comparación a células transducidas con un CAR similar que comprende el FMC63scFV. Esta activación a largo plazo permite la proliferación prolongada y provee un mecanismo independiente de antígeno para la expansión de células 4G7-CARin vitro.

La presente invención por lo tanto provee una composición para su uso en terapia de combinación que comprende a) una célula T modificada genéticamente que expresa un receptor quimérico de antígeno específico para CD19 que comprende al menos un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y al menos un dominio de transducción de señales, en donde dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende un scFV derivado de un anticuerpo monoclonal específico, 4G7, comprendiendo dicho fragmento FV de cadena simple el fragmento variable de la cadena pesada gamma 1 de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de SEQ ID NO: 3 y el fragmento variable de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; y b) el anticuerpo alemtuzumab. En particular, el CAR empleado de acuerdo con la presente invención una vez transducido a una célula T contribuye a la activación y proliferación de la célula independiente de antígeno.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Proliferación de células T alfa TCR inactivadas (KO) transducidas con vector lentiviral de 4G7-CAR en comparación a células T KO no transducidas (NTD). La proliferación se continuó durante 30 días luego de un paso de reactivación (IL2+CD28) o no (IL2) con anti-CD28 soluble.

Figura 2: Análisis de expresión del marcador de activación CD25 en la superficie de células T alfa TCR inactivadas transducidas con el vector lentiviral de 4G7-CAR, separadas basándose en la expresión de 4G7-CAR (CAR+, CAR ) y en comparación con la expresión de CD25 en células alfa TCR positivas no electroporadas (NEP) o alfa TCR alteradas pero no transducidas (NTD). La expresión de CD25 se analizó luego de un paso de reactivación (IL2+CD28) o no (IL2) con anti-CD28 soluble.

Figura 3: Análisis de la expresión de CAR en la superficie de células T transducidas con un vector lentiviral que codifica para 4G7-CAR o FMC63-CAR. El análisis se hizo 3, 8 y 15 días luego de la transducción por citometría de flujo. NT se refiere a células T no transducidas.

Figura 4: Análisis de la expresión de CD25 en la superficie de células T transducidas con un vector lentiviral que codifica para 4G7-CAR o FMC63-CAR. El análisis se hizo 3, 8 y 15 días luego de la transducción por citometría de flujo. NT se refiere a células T no transducidas.

Figura 5: Análisis de tamaño de las células T transducidas con un vector lentiviral que codifica para el 4G7-CAR o el FMC63-CAR. El análisis se hizo 3, 8 y 15 días luego de la transducción por citometría de flujo. NT se refiere a células T no transducidas.

Figura 6: Proliferación de células T transducidas con 4G7-CAR en comparación a lentiviral vector de FMC63. La proliferación se continuó durante 20 días después de un paso de reactivación (CD28) o no (-) con anti-CD28 soluble. NTD se refiere a células T no transducidas.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina específicamente en la presente, todos los términos técnicos y científicos usados tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por una persona con experiencia en los campos de la terapia génica, bioquímica, genética y biología molecular.

Todos los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la en la presente pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, estando descritos en la presente los métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo definiciones, prevalecerá. Adicionalmente, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no tienen como intención ser limitantes, a menos que se especifique de otro modo.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que se encuentran dentro de la experticia del arte. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Biblioteca del Congreso, EE.UU.); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, (Sambrook y col, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis y col. Patente de los EE.UU. No. 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds.

1984); Transcription And Translation (B. D. Hames& S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); las series, Methods In ENZYMOL<o>G<y>(J. Abelson y M. Simon, editores en jefe, Academic Press, Inc., New York), específicamente, Volúmenes 154 y 155 (Wu y col. eds.) y Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

Receptor quimérico de antígeno específico para CD19

La presente invención se relaciona con una composición para su uso en terapia combinada que comprende a) una célula T modificada genéticamente que expresa un receptor quimérico de antígeno (CAR) específico para CD19 que comprende un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de transducción de señales, en donde dicho dominio extracelular comprende un fragmento FV de cadena simple derivado del anticuerpo monoclonal 4G7, específico para CD19, comprendiendo dicho fragmento FV de cadena simple el fragmento variable de la cadena pesada gamma 1 de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de SEQ ID NO: 3 y el fragmento variable de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; y b) el anticuerpo alemtuzumab.

El término “dominio de unión a antígeno extracelular” como se usa en la presente se define como un oligo o polipéptido que tiene la capacidad de unión a un ligando. Preferentemente, el dominio tendrá la capacidad de interactuar con una molécula de superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno extracelular puede seleccionarse para reconocer un ligando que actúa como un marcador de superficie celular sobre células blanco asociado con un estado de enfermedad particular.

En una forma de realización preferida, dicho dominio de unión a antígeno extracelular comprende un fragmento de anticuerpo de cadena simple (scFv) que comprende los fragmentos variables de la cadena pesada gamma1 de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra de SEQ ID NO: 3 y los fragmentos variables de la cadena ligera kappa de la inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 unidos entre sí por un conector flexible. En una forma de realización particular dicho conector flexible tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

En otras palabras, dicho CAR comprende un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento Fv de cadena simple derivado del anticuerpo monoclonal específico para CD19 4G7 (Peipp, Saul y col. 2004). En una forma de realización particular, dicho scFv comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

El dominio de transducción de señales o dominio de señalización intracelular del CAR de acuerdo con la presente invención es responsable de la señalización intracelular luego de la unión del dominio de unión a ligando extracelular al blanco dando como resultado la activación de la célula inmune y la respuesta inmune. En otras palabras, el dominio de transducción de señales es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmune en las cuales se expresa el CAR. Por ejemplo, la función efectora de una célula T puede ser una actividad citotóxica o actividad colaboradora que incluye la secreción de citoquinas. Por lo tanto, el término “dominio de transducción de señales” se refiere a la porción de una proteína que transduce la función de señal efectora y dirige la célula a realizar una función especializada.

Los ejemplos preferidos de dominio de transducción de señales para usar en un CAR pueden ser las secuencias citoplasmáticas del receptor de célula T y correceptores que actúan juntos para iniciar la transducción de señal luego de la unión del receptor al antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tiene la misma capacidad funcional. El dominio de transducción de señales comprende dos clases diferentes de secuencias de señalización citoplasmática, aquellas que inician la activación primaria dependiente de antígeno, y aquellas que actúan de un modo independiente de antígeno para proveer una señal secundaria o coestimulatoria. La secuencia de señalización citoplasmática primaria puede comprender motivos de señalización que son conocidos como motivos de activación basada en tirosina de inmunoreceptor ITAM. Los ITAM son motivos de señalización bien definidos encontrados en la cola intracitoplasmática de una variedad de receptores que sirven como sitios de unión para tirosina quinasas de clase syk/zap70. Los ejemplos de ITAM usados en la invención pueden incluir como ejemplos no limitantes aquellos derivados de TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, FcRepsilon, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En una forma de realización preferida, el dominio de transducción de señales del CAR puede comprender el dominio de señalización CD3 zeta que tiene la secuencia de aminoácidos con al menos 70%, preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 90 %, 95 % 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10.

En una forma de realización particular el dominio de transducción de señales del CAR de la presente invención comprende una molécula de señalización coestimulatoria. Una molécula coestimulatoria es una molécula de superficie celular diferente de un receptor de antígeno o sus ligandos que es requerida para una respuesta inmune eficaz. “Ligando coestimulatorio” se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimulatoria cognada en una célula T, proveyendo de esta forma una señal que, además de la señal primaria provista por, por ejemplo, unión a un complejo TCR/CD3 con una molécula de MHC cargada con el péptido, media una respuesta de células T, que incluye, a título enunciativo no taxativo, activación proliferativa, diferenciación y similares. Un ligando coestimulatorio puede incluir pero no se limita a CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulatorio inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor de ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulatorio también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimulatoria presente en una célula T, tal como a título enunciativo no taxativo, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83.

Una “molécula coestimulatoria” se refiere a un compañero de unión cognado en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulatorio, mediando de esta forma una respuesta coestimulatoria por la célula, tal como, a título enunciativo no taxativo proliferación. Las moléculas coestimulatorias incluyen, a título enunciativo no taxativo, una molécula MHC de clase I, BTLA y receptor de ligando Toll. Los ejemplos de moléculas coestimulatorias incluyen CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83 y similares.

En una forma de realización preferida, el dominio de transducción de señales del CAR de la presente invención comprende una parte de molécula señal coestimulatoria seleccionada del grupo que consiste en fragmento de 4-1BB (GenBank: AAA53133.) y CD28 (NP_006130.1). En particular el dominio de transducción de señales del CAR de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos la cual comprende al menos 70%, preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 90 %, 95 % 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.

El CAR de acuerdo con la presente invención se expresa en la membrana superficial de la célula. Por lo tanto, el CAR puede comprender un dominio transmembrana. Las características distintivas de los dominios transmembrana comprenden la capacidad de ser expresados en la superficie de una célula, preferentemente en la presente invención una célula inmune, en particular células linfocitos o células asesinas naturales (NK), y de interactuar juntos para dirigir la respuesta celular de la célula inmune contra una célula blanco predefinida. El dominio transmembrana puede derivar de una fuente natural o de una sintética. El dominio transmembrana puede derivar de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Como ejemplos no limitantes, el polipéptido transmembrana puede ser una subunidad del receptor de célula T tal como el polipéptido a, p, y o 8, que constituye el complejo CD3, receptor de IL2 p55 (cadena a), p75 (cadena p) o cadena y, cadena de subunidad de receptores de Fc, en particular receptor Fcy III o proteínas CD. Como alternativa el dominio transmembrana puede ser sintético y puede comprender residuos predominantemente hidrofóbicos tales como leucina y valina. En una forma de realización preferida dicho dominio transmembrana deriva de la cadena alfa de CD8 humano (por ejemplo NP_001139345.1) (SEQ ID NO: 196. El dominio transmembrana además puede comprender una región tallo entre dicho dominio de unión a antígeno extracelular y dicho dominio transmembrana. El término “región tallo” usado en la presente generalmente significa cualquier oligo o polipéptido que funciona para unir el dominio transmembrana al dominio de unión a antígeno extracelular. En particular, las regiones tallo se usan para proveer más flexibilidad y accesibilidad para el dominio de unión a antígeno extracelular. Una región tallo puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferentemente entre 10 y 100 aminoácidos y más preferentemente entre 25 y 50 aminoácidos. La región tallo puede derivar de todas o parte de las moléculas de origen natural, tal como toda o parte de la región extracelular de CD8, CD4 o CD28, o de toda o parte de una región constante de anticuerpo. Como alternativa la región tallo puede ser una secuencia sintética que corresponde a una secuencia tallo de origen natural, o puede ser una secuencia tallo completamente sintética. En una forma de realización preferida dicha región tallo es una parte de la cadena alfa de CD8 humano (por ejemplo NP_001139345.1) (SEQ ID NO: 196). En otra forma de realización particular, dichos dominios transmembrana y bisagra comprenden una parte de la cadena alfa de CD8 humano, preferentemente que comprende al menos 70%, preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 90 %, 95 % 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13.

En una forma de realización particular, dicho receptor quimérico de antígeno comprende un scFV que comprende el fragmento variable de la cadena pesada gamma 1 de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de SEQ ID NO: 3 y el fragmento variable de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, un dominio bisagra humano alfa CD8 y transmembrana, el dominio de señalización CD3 zeta y el dominio de señalización 4-1BB. Preferentemente, el CAR 4G7 de la presente invención comprende al menos 70%, preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 90 %, 95 % 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 y 15.

La disminución en la expresión o mutación de antígenos blanco se observa comúnmente en células cancerígenas, creando variantes de escape por pérdida de antígeno. Por lo tanto, para ajustar el escape tumoral y obtener una célula inmune más específica por un blanco, el CAR específico para CD19 puede comprender otro dominio de unión a antígenos extracelulares, para unirse simultáneamente a diferentes elementos en el blanco aumentando de esta forma la activación y función de la célula inmune. En una forma de realización, el dominio de unión a antígenos extracelulares puede colocarse en tándem en el mismo polipéptido transmembrana, y opcionalmente puede estar separado por un conector. En otra forma de realización, dicho dominio de unión a antígenos extracelulares diferente puede ser colocado en diferentes polipéptidos transmembrana que componen el CAR. En otra forma de realización, la presente invención se relaciona con una población de CAR que comprende cada uno de los diferentes dominios de unión a ligandos extracelulares. Por población de CAR, se entiende que al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más CAR cada uno de los cuales comprende diferentes dominios de unión a ligandos extracelulares. Los diferentes dominios de unión a ligandos extracelulares preferentemente pueden unirse simultáneamente a diferentes elementos en el blanco aumentando de esta forma la activación y función de la célula inmune.

Polinucleótidos, vectores:

Se describen polinucleótidos, vectores que codifican para los CAR descritos anteriormente. En una instancia preferida, el polinucleótido comprende la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 17. En una instancia preferida, el polinucleótido tiene al menos 70%, preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 90 %, 95 % 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17.

El polinucleótido puede consistir de un casete de expresión o vector de expresión (por ejemplo un plásmido para la introducción en una célula huésped bacteriana, o un vector viral tal como un vector baculovirus para la transfección de una célula huésped de insecto, o un vector plasmídico o viral tal como un lentivirus para la transfección a una célula huésped de mamífero).

En una instancia particular, las diferentes secuencias de ácidos nucleicos puede incluirse en un polinucleótido o vector el cual comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la secuencia de omisión ribosomal tal como una secuencia que codifica para un péptido 2A. Los péptidos 2A, que se identificaron en el subgrupoAphthovirusde los picornavirus, provocan una "omisión" ribosomal de un codón con el siguiente sin la formación de un enlace peptídico entre los dos aminoácidos codificados por los codones (véase (Donnelly y Elliott 2001; Atkins, Wills y col.

2007; Doronina, Wu y col. 2008)). Por "codón" se entiende tres nucleótidos en un ARNm (o en la cadena sentido de una molécula de<a>D<n>) que son traducidos por un ribosoma a un residuo de aminoácido. Por lo tanto, pueden sintetizarse dos polipéptidos a partir de un marco de lectura abierto simple, contiguo en un ARN, cuando los polipéptidos están separados por una secuencia de oligopéptido 2A que están en marco. Dichos mecanismos de omisión ribosomal son bien conocidos en el arte y se sabe que son usados por diferentes vectores para la expresión de varias proteínas codificadas por un ARM mensajero único.

Para dirigir el polipéptido transmembrana en la vía secretoria de una célula huésped, se provee una secuencia señal de secreción (también conocida como secuencia líder, prepro secuencia o presecuencia) en la secuencia de polinucleótido o secuencia de vector. La secuencia señal de secreción está operativamente ligada a la secuencia de ácido nucleico transmembrana, es decir, las dos secuencias están unidas en el marco de lectura correcto y posicionado para dirigir el polipéptido recientemente sintetizado a la vía secretoria de la célula huésped. Las secuencias señales de secreción están comúnmente posicionadas 5' respecto a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para el polipéptido de interés, a pesar de que las secuencias de señales de secreción pueden ser posicionadas en cualquier lugar en la secuencia de ácidos nucleicos de interés (véase, por ejemplo, Welch y col., Patente de los EE.UU. No.

5.037.743; Holland y col., Patente de los EE.UU. No. 5.143.830). En una instancia preferida el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y 19.

Aquellos con experiencia en el arte reconocerán que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación considerable de secuencia entre estas moléculas de polinucleótido. Preferentemente, las secuencias de ácido nucleico divulgadas en el presente documento tienen optimización de codones para la expresión en células de mamífero, preferentemente para la en células de humano. La optimización de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interés de codones que generalmente son raros en genes muy expresados de una dada especie por codones que generalmente son frecuentes en genes muy expresados de dicha especie, tal que los codones codifican para los mismos aminoácidos que los codones que están siendo intercambiados.

En una instancia preferida, el polinucleótido comprende la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 17. También se describen polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 70%, preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 90 %, 95 % 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17.

Métodos para modificar una célula inmune:

Se describe un método para preparar células T para inmunoterapia que comprende introducir en dichas células T el CAR como se ha descrito anteriormente y expandir dichas células. En particular, se describe un método para modificar una célula T que comprende proveer una célula T y que expresa en la superficie de dicha célula al menos un CAR como se describe anteriormente. En una instancia particular, el método comprende la transformación de la célula con al menos un polinucleótido que codifica para CAR como se describió anteriormente, y que expresa dichos polinucleótidos en dicha célula.

En una instancia preferida, dichos polinucleótidos son incluidos en vectores lentivirales debido que se expresan establemente en las células.

En otra instancia, dicho método además comprende un paso para modificar genéticamente dicha célula por inactivación de al menos un gen que expresa un componente del TCR, un blanco de un agente inmunosupresor, gen HLA y/o un gen de punto de control inmune tal como PDCD1 o CTLA-4. En una instancia preferida, dicho gen se selecciona del grupo que consiste en TCRalfa, TCRbeta, CD52, GR, PD1 y CTLA-4. En una instancia preferida dicho método además comprende la introducción en dichas células T de una endonucleasa de corte raro con capacidad de inactivar selectivamente por clivaje de ADN de dichos genes. En una instancia preferida dicha nucleasa de corte raro es TALE-nucleasa o Cas9 endonucleasa.

Métodos de administración

Los diferentes métodos descritos anteriormente involucran la introducción de CAR en una célula. Como ejemplo no limitante, dicho CAR puede ser introducido como transgén codificado por un vector plasmídico. Dicho vector plasmídico también puede contener un marcador de selección que provee la identificación y/o selección de células que recibieron dicho vector.

Los polipéptidos pueden ser sintetizadosin situen la célula como resultado de la introducción de polinucleótidos que codifican para dichos polipéptidos en la célula. Como alternativa, dichos polipéptidos podrían producirse fuera de la célula y luego ser introducidos a la misma. Los métodos para introducir una construcción de polinucleótido en células son conocidos en el arte e incluyen ejemplos no limitantes de métodos de transformación estable en donde la construcción de polinucleótido es integrada al genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en donde la construcción de polinucleótido no es integrada al genoma de la célula y métodos mediados por virus. Dichos polinucleótidos pueden ser introducidos en una célula por ejemplo por, vectores virales recombinantes (por ejemplo retrovirus, adenovirus), liposoma y similares. Por ejemplo, los métodos de transformación transitoria incluyen por ejemplo microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. Dichos polinucleótidos pueden incluirse en vectores, más particularmente plásmidos o virus, en vista de ser expresados en células.

Células inmunes modificadas

La presente invención emplea una célula T que comprende al menos un CAR como se describió anteriormente. En particular, dicha célula T aislada comprende una secuencia de polinucleótido exógena que codifica para CAR. Las células T genéticamente modificadas empleadas de acuerdo con la presente invención se activan y proliferan independientemente de mecanismos de unión a antígeno.

Dicha célula T se refiere a una célula de origen hematopoyético involucrada funcionalmente en la iniciación y/o ejecución de la respuesta inmune innata y/o adaptativa. Dicha célula T puede derivar de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embriónicas no humanas, más particularmente células madre no humanas, células madre de sangre de cordón, células progenitoras, células madre de médula ósea, células madre pluripotentes inducidas o células madre hematopoyéticas. Las células humanas representativas son células CD34+. Dicha célula T puede ser una célula T seleccionada del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T regulatorios o linfocitos T colaboradores. En otra forma de realización, dicha célula puede derivar del grupo que consiste en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Antes de la expansión y modificación genética de las células de la invención, puede obtenerse una fuente de células a partir de un sujeto por medio de una variedad de métodos no limitantes. Las células pueden obtenerse a partir de un número de fuentes no limitantes, que incluyen células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de nódulo linfático, sangre de cordón, tejido de timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, efusión pleural, tejido esplénico, y tumores. En ciertas formas de realización de la presente invención, puede usarse cualquier número de líneas de células T disponibles y conocidas para aquellos con experiencia en el arte. En otra forma de realización, dicha célula T puede derivar de un donante sano, de un paciente diagnosticado con cáncer o de un paciente diagnosticado con una infección. En otra forma de realización, dicha célula T es parte de una población mezclada de células que presentan diferentes características fenotípicas. Las células T modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor y susceptibles de ser obtenidas por el método previo están abarcadas en el alcance de la presente invención.

En otra forma de realización, dicha célula T empleada de acuerdo con la presente invención comprende un polinucleótido que codifica para el CAR de la presente invención.

Activación y expansión de células T

Ya sea antes o después de la modificación genética de las células T, incluso si las células inmunes genéticamente modificadas de la presente invención son activadas y proliferan independientemente de los mecanismos de unión a antígeno, las células inmunes, particularmente las células T de la presente invención pueden activarse y expandirse adicionalmente generalmente usando métodos como los descritos, por ejemplo, en las Patentes de los EE.UU.

6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. 20060121005. Las células T pueden expandirsein vitro.

Generalmente, las células T empleadas de acuerdo con la invención se expanden por contacto con un agente que estimula un complejo CD3 TCR y una molécula coestimulatoria en la superficie de las células T para crear una señal de activación para la célula T.

Por ejemplo, pueden usarse los químicos tales como el ionóforo de calcio A23187, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), o mitogeniclectinas como fitohemaglutinina (PHA) para crear una señal de activación para la célula T.

Como ejemplos no limitantes, las poblaciones de células T pueden estimularsein vitrotal como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado sobre una superficie, o por contacto con un activador de proteína quinasa C (por ejemplo, briostatina) en conjunto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria sobre la superficie de las células T, se usa un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, bajo condiciones que son apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, medio mínimo esencial o medio RPMI 1640 o, X-vivo 5, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleuquina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, IL-4, IL-7, GM-CSF, -10, - 2, IL-15, TGF-p, y TNF-a o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células que sea conocido para la persona con experiencia en el arte. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen a, a título enunciativo no taxativo, tensioactivo, plasmanato, y agentes reductores tales como N-acetil-cisteína y 2-mercaptoetanol. El medio puede incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos agregados, piruvato de sodio, y vitaminas, ya sean libres de suero o suplementados con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un grupo definido de hormonas, y/o una cantidad de citoquina(s) suficiente para el crecimiento y expansión de las células T. Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solamente en cultivos experimentales, no en los cultivos de células que son para infundir a un sujeto. Las células blanco se mantienen bajo condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (por ejemplo, 37°C) y una atmósfera (por ejemplo, aire más 5% de CO2) apropiada. Las células T que se han expuesto a tiempos de estimulación variados pueden exhibir diferentes características

Como alternativa, dichas células pueden expandirse mediante cocultivo con tejido o células.

Aplicaciones terapéuticas

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula T modificada genéticamente que expresa un receptor quimérico de antígeno específico para CD19 (CAR) que comprende al menos un dominio de unión a ligando extracelular específico para CD19, un dominio transmembrana y al menos un dominio de señalización intracelular; en donde dicho dominio extracelular comprende un fragmento FV de cadena simple derivado del anticuerpo monoclonal 4G7, específico para CD19, comprendiendo dicho fragmento FV de cadena simple el fragmento variable de la cadena pesada gamma 1 de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de la SEQ ID NO: 3 el fragmento variable de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, para su uso en combinación con el anticuerpo alemtuzumab en métodos para el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:

(a) administrar al sujeto el anticuerpo alemtuzumab;

(b) administrar a dicho sujeto la célula T modificada genéticamente.

Dicho tratamiento puede ser una mejora, puede ser curativo o profiláctico. El mismo puede ser parte de una inmunoterapia autóloga o parte de un tratamiento inmunoterapéutico alogénico. Por autólogo, significa que esas células, línea celular o población de células que se usa para tratar a los pacientes se originan de dicho paciente o de un donante con compatibilidad de Antígenos Humanos Leucocitarios (HLA). Por alogénico se entiende que las células o población de células que se usan para tratar a los pacientes no tienen origen en dicho paciente sino que tienen origen en un donante.

Los tipos de cáncer que se pueden tratar pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, incluyendo a, a título enunciativo no taxativo, ALL pre-B (indicación pediátrica), ALL de adultos, linfoma de células de manto, linfoma difuso de células B grande y similares. Los tipos de cáncer que se pueden tratar con los CAR de la invención incluyen a, a título enunciativo no taxativo ciertas leucemias o malignidades linfoides. También se incluyen tumores/cáncer en adultos y tumores/cáncer pediátricos.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, dicho tratamiento puede administrarse a pacientes que se someten a un tratamiento inmunosupresor. De hecho, la presente invención preferentemente se vale de células o población de células, que se han hecho resistentes a al menos un agente inmunosupresor debido a la inactivación de un gen que codifica para un receptor para dicho agente inmunosupresor. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor debería ayudar a la selección y expansión de las células T de acuerdo a la invención dentro del paciente.

La administración de las células o población de células de acuerdo a la presente invención puede llevarse a cabo de cualquier forma conveniente, incluyendo por inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implante o trasplante. Las composiciones que se describen en la presente pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, por vía intradérmica, por vía intratumoral, por vía intranodal, por vía intramedular, por vía intramuscular, por inyección intravenosa o intralinfática, o por vía intraperitoneal. En una forma de realización, las composiciones de células de la presente invención se administran preferentemente por inyección intravenosa.

La administración de las células o población de células pueden consistir en la administración de entre 104 y 109 células por kg de peso corporal, preferentemente entre 105 y 106 células/kg de peso corporal incluyendo todo los números enteros de números de células dentro de esos rangos. Las células o población de células pueden administrarse en una o más dosis. Dicha cantidad eficaz de células puede administrarse como una dosis individual. Dicha cantidad eficaz de células puede administrarse como más de una dosis durante un periodo de tiempo. El tiempo de administración está dentro del juicio del médico a cargo y depende de la condición clínica del paciente. Las células o población de células pueden haberse obtenido de una fuente, tal como un blanco de sangre o un donante. Mientras que las necesidades individuales varían, la determinación de los rangos óptimos de cantidades eficaces de un tipo celular dado para una enfermedad particular o condiciones está dentro de las habilidades del arte. Una cantidad eficaz significa una cantidad que provee un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosificación administrada dependerá de la edad, salud y peso del receptor, del tipo de tratamiento concurrente, si existe, de la frecuencia de tratamiento y de la naturaleza del efecto deseado.

Dicha cantidad eficaz de células o composición que comprende dichas células puede administrarse por vía parenteral. Dicha administración puede ser una administración intravenosa. Dicha administración se puede hacer directamente por inyección dentro de un tumor.

Otras definiciones

- A menos que se especifique de otra forma, "un," "uno," "el/la," y "al menos uno" se usa en forma intercambiable y significa uno o más que uno.

- Los residuos de aminoácidos en una secuencia polipeptídica se designan en la presente de acuerdo al código de una letra, en done, por ejemplo, Q significa Gln o residuo de Glutamina, R significa Arg o residuo de Arginina y D significa Asp o residuo de ácido Aspártico.

- Sustitución de aminoácidos significa el reemplazo de un residuo de aminoácidos por otro, por ejemplo el reemplazo de un residuo de Arginina por un residuo de Glutamina en una secuencia peptídica es una sustitución de aminoácidos.

- Los nucleótidos se designan como sigue: se usa el código de una letra para designar la base de un nucleósido: a es adenina, t es timina, c es citosina, y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g o a (nucleótidos de purina), k representa a g o t, s representa a g o c, w representa a a o t, m representa a a o c, y representa a t o c (nucleótidos de pirimidina), d representa a g, a o t, v representa a g, a o c, b representa a g, t o c, h representa a a, t o c, y n representa a g, a, t o c.

- Tal como se usa en la presente, “ácido nucleico” o “polinucleótidos” se refiere a nucleótidos y/o polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y fragmentos generados por cualquiera de ligación, corte, acción endonucleasa, y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden componerse de monómeros que son nucleótidos de origen natural (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos de origen natural (por ejemplo, formas enantioméricas de nucleótidos de origen natural), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en los grupos de azúcar y/o en los grupos de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones en los azúcares incluyen a, por ejemplo, reemplazo de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas, y grupos azida, o los azúcares pueden funcionalizarse como éteres o ésteres. Más aún, puede reemplazarse el grupo de azúcar completo son estructuras estéricamente y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares y análogos de azúcares carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en un grupo de una base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácidos nucleicos pueden conectarse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de dichos enlaces. Los ácidos nucleicos pueden ser de hebra simple o bien de doble hebra.

- Como receptor antigénico quimérico (CAR) se conoce a moléculas que combinan un dominio de unión contra un componente presente sobre una célula blanco, por ejemplo una especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con un dominio intracelular que activa el receptor de células T para generar una proteína quimérica que exhibe una actividad inmune específica anti-célula blanco. En general, el CAR consiste en un anticuerpo de cadena individual extracelular (scFvFc) fusionado al dominio de señalización intracelular de la cadena zeta de complejo de antígeno receptor de célula T (scFvFc:Z) y tiene la capacidad, cuando se expresa en las células T, de redirigir el reconocimiento antigénico basándose en la especificidad del anticuerpo monoclonal. Un ejemplo de CAR usando en la presente invención es un CAR que se dirige contra el antígeno CD19 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

- El término “endonucleasa” se refiere a cualquier enzima de tipo salvaje o variante capaz de catalizar la hidrólisis (clivaje) de enlaces entre ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o ARN, preferentemente una molécula de a Dn . Las endonucleasas no clivan a la molécula de ADN o ARN independientemente de su secuencia, sino que reconocen y clivan a la molécula de ADN o ARN en secuencias polinucleotídicas específicas, también denominadas como “secuencias blancos” o “sitios blancos”. Las endonucleasas pueden clasificarse como endonucleasas de corte raro cuando normalmente tienen un sitio de reconocimiento de polinucleótido mayor a 12 pares de bases (pb) de longitud, más preferentemente de entre 14 y 55 pb. Las endonucleasas de corte raro incrementan significativamente la HR induciendo cortes de doble hebra en el ADN (DSB) en un locus definido (Perrin, Buckle y col. 1993; Rouet, Smih y col. 1994; Choulika, Perrin y col. 1995; Pingoud y Silva 2007). Las endonucleasas de corte raro por ejemplo pueden ser una endonucleasa direccionada (Paques y Duchateau 2007), un nucleasa de dedos de zinc quimérica (ZFN) que resulta de la fusión de dominios de dedos de zinc modificados con el dominio catalítico de una enzima de restricción tal como FokI (Porteus y Carroll 2005), una endonucleasa de Cas9 del sistema CRISPR (Gasiunas, Barrangou y col. 2012; Jinek, Chylinski y col. 2012; Cong, Ran y col.

2013; Mali, Yang y col. 2013) o una endonucleasa química (Eisenschmidt, Lanio y col. 2005; Arimondo, Thomas y col. 2006). En las endonucleasas químicas, se conjuga un clivador químico o peptídico con un polímero de ácidos nucleicos o bien con otro ADN que reconoce una secuencia blanco específica, dirigiendo de esa forma la actividad de clivaje a una secuencia específica. Las endonucleasas químicas también abarcan a las nucleasas sintéticas como conjugados de ortofenantrolina, una molécula de clivaje de ADN, y oligonucleótidos que forman estructuras triples (TFO), que se sabe que se unen a secuencias específicas de ADN (Kalish y Glazer 2005). Dichas endonucleasas químicas están comprendidas por el término “endonucleasa” de acuerdo a la presente invención.

- Como “TALE-nucleasa” (TALEN) se designa a una proteína de fusión que consiste en un dominio de unión a ácidos nucleicos que deriva normalmente de un Efector Similar a Activador de Transcripción (TALE) y un dominio catalítico de nucleasa para clivar una secuencia blanco de ácido nucleico. El dominio catalítico preferentemente es un dominio de nucleasa y más preferentemente un dominio que tiene actividad endonucleasa, como por ejemplo I-TevI, ColE7, NucA y Fok-I. En una forma de realización particular, el dominio TALE puede fusionarse con una meganucleasa como por ejemplo I-CreI y I-OnuI o variante funcional de los mismos. En una forma de realización más preferida, dicha nucleasa es una TALE-Nucleasa monomérica. Una TALE-Nucleasa monomérica es una TALE-Nucleasa que no requiere su dimerización para el reconocimiento y clivaje específico, tales como las fusiones de repeticiones TAL modificadas con el dominio catalítico de I-TevI que se describe en WO2012138927. Los Efectores similares de Activador de Transcripción (TALE) son proteínas de la especie bacterianaXanthomonasque comprenden una pluralidad de secuencias repetidas, en donde cada repetición comprende di-residuos en posición 12 y 13 (RVD) que son específicas para cada base nucleotídica de la secuencia blanco de ácido nucleico. Los dominios de unión con propiedades de unión a ácidos nucleicos modulares similares base por base (MBBBD) también pueden derivar de nuevas proteínas modulares recientemente descubiertas por el solicitante en una especie bacteriana diferente. Las nuevas proteínas modulares tienen la ventaja de mostrar más variabilidad de secuencia que las repeticiones TAL. Preferentemente, las RVD asociadas con reconocimiento de los diferentes nucleótidos son HD para reconocimiento de C, NG para reconocimiento de T, NI para reconocimiento de A, NN para reconocimiento de G o A, NS para reconocimiento de A, C, G o T, HG para reconocimiento de T, IG para reconocimiento de T, NK para reconocimiento de G, HA para reconocimiento de C, ND para reconocimiento de C, HI para reconocimiento de C, HN para reconocimiento de G, NA para reconocimiento de G, SN para reconocimiento de G o A y YG para reconocimiento de T, TL para reconocimiento de A, VT para reconocimiento de A o G y SW para reconocimiento de A. En otra forma de realización, pueden mutarse los aminoácidos críticos 12 y 13 a otros residuos de aminoácidos con el objetivo de modular su especificidad hacia los nucleótidos A, T, C y G y en particular para aumentar esta especificidad. Las TALE-nucleasas ya se han descrito y usado para estimular el direccionamiento génico y las modificaciones génicas (Boch, Scholze y col. 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak y col. 2010; Li, Huang y col. 2011). Las TAL-nucleasas modificadas están comercialmente disponibles bajo la marca comercial TALEN™ (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, Francia).

La endonucleasa de corte raro de acuerdo a la presente invención también puede ser una endonucleasa Cas9. Recientemente, se ha desarrollado una nueva herramienta para la modificación de genomas basada en la nucleasa Cas9 guiada por ARN (Gasiunas, Barrangou y col. 2012; Jinek, Chylinski y col. 2012; Cong, Ran y col. 2013; Mali, Yang y col. 2013) del sistema inmune adaptativo procariote de tipo II CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats) (véase para una revisión (Sorek, Lawrence y col. 2013)). El sistema asociado a CRISPR (Cas) se descubrió primero en bacterias y funciona como una defensa contra ADN foráneo, ya sea viral o plasmídico. La modificación de genoma mediada por CRISPR procede primero mediante la selección de la secuencia blanco con frecuencia flanqueada por un motivo de secuencia corta, llamado motivo adyacente proto- espaciador (PAM). Después de la selección de la secuencia blanco, se modifica un crARN específico, complementario a esta secuencia blanco. La transactivación del crARN (tracrARN) requiere que los sistemas de tipo II CRISPR se apareen al crARN y se unan a la proteína Cas9 provista. La Cas9 actúa como un anclaje molecular que facilita el apareamiento de bases del tracARN con el cARN (Deltcheva, Chylinski y col. 2011). En este complejo ternario, la estructura dual tracrARN:crARN actúa como una guía de ARN que dirige a la endonucleasa Cas9 a la secuencia blanco afín. El reconocimiento del blanco por el complejo Cas9-tracrARN:crARN se inicia por el barrido de la secuencia blanco para homología entre la secuencia blanco y el crARN. Además de la complementariedad secuencia blanco-crARN, el direccionamiento a ADN requiere la presencia de un motivo corto adyacente al proto espaciador (motivo adyacente proto espaciador - PAM). Después del apareamiento entre el ARN dual y la secuencia blanco, la Cas9 introduce subsecuentemente un ruptura roma de doble hebra 3 bases corriente arriba del motivo PAM (Garneau, Dupuis y col. 2010).

La endonucleasa de corte raro puede ser una endonucleasa de direccionamiento, también conocida bajo el nombre de meganucleasa. Dichas endonucleasas de direccionamiento son bien conocidas en el arte (Stoddard 2005). Las endonucleasas de direccionamiento reconocen una secuencia blanco de ADN y generan una ruptura de hebra simple o doble. Las endonucleasas de direccionamiento son altamente específicas, reconocen sitios blanco de ADN en el rango entre 12 y 45 pares de bases (pb) de longitud, usualmente en el rango entre 14 y 40 pb de longitud. La endonucleasa de direccionamiento de acuerdo a la invención por ejemplo puede corresponder a una endonucleasa LAGLIDADG, a una endonucleasa HNH, o a una endonucleasa GIY-YIG. La endonucleasa de direccionamiento preferida de acuerdo a la presente invención puede ser una variante de laI-Crel.

- Como “vector de administración” o “vectores de administración” se designa a cualquier vector de administración que se puede usar en la presente invención para poner en contacto celular (o sea “contactar”) o administrar al interior de células o compartimientos subcelulares (o sea “introducción”) los agentes/químicos y moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) necesarios en la presente invención. Los mismos incluyen, a título enunciativo no taxativo vectores de administración liposomales, vectores de administración virales, vectores de administración de drogas, transportadores químicos, transportadores poliméricos, lipoplejos, poliplejos, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste para ultrasonido), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de administración permiten la administración de moléculas, químicos, macromoléculas (genes, proteínas), u otros vectores tales como plásmidos, péptidos desarrollados por Diatos. En estos casos, los vectores de administración son transportadores moleculares. Como “vector de administración” o “vectores de administración” también se denomina a los métodos de administración para llevar a cabo a transfección.

- Los términos "vector" o “vectores” se refieren a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un “vector” en la presente invención incluye, a título enunciativo no taxativo, a un vector viral, un plásmido, un vector de ARN o una molécula lineal o circular de ADN o ARN que puede consistir en un ácido nucleico cromosómico, no cromosómico, semisintético o sintético. Los vectores preferidos son aquellos capaces de una replicación autónoma (vector episomal) y/o de una expresión de ácidos nucleicos a los cuales están unidos (vectores de expresión). Las personas con experiencia en el arte conocen grandes números de vectores adecuados y los mismos están comercialmente disponibles.

Los vectores virales incluyen a retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo virus adenoasociados), coronavirus, virus a ARN de hebra negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, influenza virus), rhabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y de estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo rubeola y Sendai), virus de ARN de hebra positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN de hebra doble que incluyen a adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, Herpes Simplex virus de tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus), y poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar y viruela de canario). Otros virus incluyen a virus de Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus, y virus de hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen a: sarcoma de leucosis aviar, virus de mamíferos de tipo C, de tipo B, de tipo D, grupo de HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The virus and their replication, En Fundamental Virology, Tercera Edición, B. N. Fields, y col., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

- Como “vector lentiviral” se designa a los vectores a base de HIV que son muy promisorios para la administración de genes debido a su capacidad de empaquetamiento relativamente grande, inmunogenicidad reducida y su capacidad para transducirse establemente con alta eficacia en un amplio rango de tipos celulares diferentes. Los vectores lentivirales usualmente se generan después de una transfección transitoria de tres (empacamiento, envoltura y transferencia) o más plásmidos en células productoras. Como el HIV, los vectores lentivirales entran a la célula blanco a través de la interacción de glicoproteínas de superficie viral con receptores de la superficie celular. A su entrada, el ARN viral se somete a transcripción reversa, la cual está mediada por el complejo de transcriptasa reversa del virus. El producto de la transcripción reversa es un ADN viral lineal de doble hebra, que es el sustrato para la integración viral en el ADN de las células infectadas. Como “vectores lentivirales integrativos (o LV)”, se designa a dichos vectores como ejemplo no limitante, que son capaces de integrarse al genoma de una célula blanco. Por el contrario, el término “vectores lentivirales no integrativos (o NILV)” designa a vectores de administración génica eficaz que no se integran al genoma de una célula blanco a través de la acción de la integrasa del virus.

- Los vectores de administración y los vectores pueden asociarse o combinarse con cualquier técnica de permeabilización celular tal como sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.

- Como célula o células se designa a cualquier célula eucariota viva, célula primaria y línea celular que derive de estos organismos para cultivosin vitro.

- Como “célula primaria” o “células primarias” se designa a las células que se toman directamente de tejido vivo (o sea, material de biopsia) y que se establece para crecimiento in vitro, que se ha sometido a muy pocas duplicaciones de población y que por lo tanto son más representativas de los principales componentes funcionales y características de los tejidos de los que se han obtenido, en comparación con las líneas células tumorigénicas continuas o las líneas celulares inmortalizadas por medios artificiales.

Los ejemplos no limitantes de líneas celulares pueden ser los que se eligen del grupo que consiste en células CHO-K1; células HEK293; células Caco2; células U2-OS; células NIH 3T3; células NSO; células SP2; células CHO-S; células DG44; células K-562, células U-937; células MRC5; células IMR90; células Jurkat; células HepG2; células HeLa; células HT-1080; células HCT-116; células Hu-h7; células Huvec; células Molt 4.

Todas estas líneas celulares pueden modificarse por el métodos de la presente invención para proveer modelos de líneas celulares para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; estos modelos también pueden usarse para cribar moléculas biológicamente activas de interés para la investigación y producción y para diversos campos tales como químicos, de biocombustibles, terapéuticos y agronómicos como ejemplos no limitantes.

- Como “mutación” se designa a la sustitución, eliminación, inserción de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta, o más nucleótidos/aminoácidos en un polinucleótido (ADNc, gen) o una secuencia polipeptídica. La mutación puede afectar la secuencia codificante de un gen o su secuencia reguladora. También puede afectar la estructura de la secuencia genómica o la estructura/estabilidad del ARNm.

- Como “variante(s)”, se designa a una variante repetida, una variante, una variante de unión a ADN, una variante de TALE-nucleasa, una variante de polipéptido obtenida por mutación o reemplazo de al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la molécula parental.

- Como “variante funcional” se designa a un mutante catalíticamente activo de una proteína o un dominio proteico; dicho mutante puede tener la misma actividad en comparación con su proteína o dominio protei propiedades adicionales, o mayor o menor actividad.

- "Identidad" se refiere una identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad se puede determinar por comparación de una posición en cada secuencia que puede estar alineada para propósitos de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos es una función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en las posiciones compartidas por las secuencias de ácidos nucleicos. Se pueden usar varios algoritmos y/o programas de alineamiento para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo a FASTA, o BLAST que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.), y que se pueden usar con, por ejemplo, una configuración por defecto. Por ejemplo, se contemplan polipéptidos que tienen al menos 70%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con polipéptidos específicos descritos en la presente y preferentemente que exhiben sustancialmente las mismas funciones, así como también polinucleótidos que codifican para dicho polipéptidos.

- “Similitud” describe la relación entre las secuencias de aminoácidos de dos o más polipéptidos. Se puede usar el BLASTP para identificar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia usando una matriz de similitud tal como BLOSUM45, BLOSUM62 o BLOSUM80. A menos que se indique de otra forma, una puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se usa el BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en las puntuaciones positivas de BLASTP y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en las puntuaciones de identidades por BLASTP. Las “identidades” por BLASTP muestran el número y fracción de residuos totales en los pares de secuencia de alta puntuación que son idénticas; y los “positivos” por BLASTP muestran el número y fracción de residuos para los que las puntuaciones de alineamiento tienen valores positivos y que son similares entre sí. Las secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad o similitud con las secuencias de aminoácidos que se divulgan en la presente están contempladas y abracadas por esta divulgación. Las secuencias de polinucleótidos de polipéptidos similares se deducen usando el código genético y pueden obtener por medios convencionales. Por ejemplo, una variante funcional de pTalfa puede tener 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% de similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107. Un polinucleótido que codifica para dicha variante funcional se produciría por traducción reversa de su secuencia de aminoácidos usando el código genético.

- Un “domino de transducción de señales” o “ligando coestimulatorio” se refiere a una molécula sobre una célula presentadora de antígenos que se une específicamente a una molécula coestimulatoria cognada sobre una célula T- , proveyendo de ese modo una señal que, además de la señal primaria provista por, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula MHC cargada con péptido, media una respuesta de células T, incluyendo a, a título enunciativo no taxativo, activación de proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulatorio puede incluir a, a título enunciativo no taxativo, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulatorio inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor de ligando Toll y un ligando que se une específicamente a B7-H3. Un ligando coestimulatorio también abarca a, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente a una molécula coestimulatoria presente sobre una célula T, tal como a título enunciativo no taxativo, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a función linfocitaria (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente a CD83.

Una “molécula coestimulatoria” se refiere al compañero de unión semejante sobre una célula T que se une específicamente al ligando coestimulatorio, mediando de ese modo una respuesta coestimulatoria por parte de la célula, tal como, a título enunciativo no taxativo, la proliferación. Las moléculas coestimulatorias incluyen a, a título enunciativo no taxativo, una molécula MHC de clase I, BTLA y un receptor de ligando Toll.

Una “señal coestimulatoria” tal como se usa en la presente se refiere a una señal, que en combinación con la señal primaria, tal como la ligación TCR/CD3, conduce a la proliferación de las células T y/o el aumento o disminución de la expresión de moléculas clave.

-El término “dominio de unión a ligando extracelular” tal como se usa en la presente se define como un oligo o polipéptido que es capaz de unirse a un ligando. Preferentemente, el dominio será capaz de interactuar con una molécula de superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede elegirse para que reconozca a un ligando que actúa como un marcador de superficie celular sobre células blanco asociadas a un estado patológico particular. Por consiguiente, los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen a los asociados con infecciones por virus, bacterias y parásitos, enfermedad autoinmune y células cancerosas.

El término "sujeto" o “paciente” tal como se usa en la presente incluye a todos los miembros del reino animal incluyendo a los primates no humanos y los humanos.

La descripción de la invención presentada previamente provee una manera y un proceso para hacerla y usarla de forma que cualquier persona con experiencia en el arte es capaz de hacerla y usarla, en donde esta habilidad de proveer en particular para la materia de interés de las reivindicaciones adjuntas, que forman una parte de la descripción original.

Cuando se menciona un límite o rango numérico en la presente, los puntos finales están incluidos. También, todos los valores y subrangos dentro de un límite o rango numérico están específicamente incluidos como si los mismos apareciesen mencionados.

Habiendo descrito en forma general esta invención, puede obtenerse una comprensión adicional en referencia a ciertos ejemplos específicos, que se proveen en la presente con propósitos solo ilustrativos, y que no pretenden ser limitantes a menos que se especifique de otra forma.

Ejemplos

Ejemplo 1: Proliferación de células con TCRalfa inactivado que expresan un 4G7-CAR.

Se modificaron y produjeron TALE-nucleasas heterodiméricas direccionadas contra dos secuencias de 17 pb de longitud (llamadas hemi blancos) separadas por un espaciador de 15 pb dentro del gen de la región constante de la cadena alfa del receptor de células T (TRAC). Cada hemi blanco es reconocido por repeticiones de las hemi TALE-nucleasas que se listan en la Tabla 1.

Se subclonó cada construcción de TALE-nucleasa usando digestión con enzimas de restricción en un vector de expresión en mamíferos bajo el control del promotor T7. Se sintetizó el ARNm que codifica para la TALE-nucleasa clivando la secuencia genómica de TRAC del plásmido que porta la secuencia codificante corriente abajo del promotor T7.

Se transfectaron las células T purificadas preactivadas durante 72 horas con esferas recubiertas con antiCD3/CD28 con cada uno de los 2 ARNm que codifican para ambas hemi TRAC_T01 TALE-nucleasas. 48 horas después de la transfección, se transdujeron las células T con un vector lentiviral que codifica para 4G7-CAR (SEQ ID NO:14). 2 días después de la transducción, se purificaron las células CD3<neg>usando esferas magnéticas anti-CD3 y 5 días después de la transducción se reactivaron las células con anti-CD28 soluble (5 pg/ml).

La proliferación celular fue seguida hasta 30 días después de la reactivación mediante conteo celular 2 veces por semana. La Figura 1 muestra las veces de inducción en el número de células respecto a la cantidad de células presentes en el día 2 después de la reactivación para dos donantes diferentes. Se observó una mayor proliferación en las células con TCR alfa inactivado que expresan el 4G7-CAR, en especial cuando se reactivan con anti-CD28, en comparación con células no transducidas.

Para investigar si las células T humanas que expresan el 4G7-CAR muestran un estado activado, se analizó la expresión del marcador de activación CD25 mediante FACS 7 días después de la transducción. Como se indica en la Figura 2, las células purificadas transducidas con el vector lentiviral que codifica para 4G7-CAR expresaron considerablemente más CD25 en su superficie que las células no transducidas. Se observa una mayor expresión de CD25 tanto en la reactivación por CD28 como en condiciones de no reactivación.

Ejemplo 2: Comparación de activación basal de células T humanas primarias que expresan en 4G7-CAR y el FMC63-CAR clásico.

Para determinar si el scFV 4G7 confiere un estado “activado” prolongado a las células transducidas, se comparó la activación basal de las células T transducidas con el CAR que porta un scFV 4G7 (SEQ ID NO: 17 codificada por SEQ ID NO: 15) o un scFV FMC63 clásico (SEQ ID NO: 16).

Se transdujeron células T humanas purificadas de acuerdo al siguiente protocolo: brevemente, se transdujeron 1x106 células CD3+ preactivadas durante 3 días con esferas recubiertas con anti-CD3/CD28 e IL2 recombinante con vectores lentivirales que codifican para el 4G7-CAR (SEQ ID NO: 15) y el FMC63-CAR (SEQ ID NO:16) a una MOI de 5 en placas de cultivo no tisular de 12 pocillos recubiertas con 30 |jg/ml de retronectina. 24 horas después de la transducción se eliminó el medio y se reemplazó con medio fresco. Luego se mantuvieron las células a una concentración de 1x106 células/ml a lo largo del periodo de cultivo mediante conteo celular cada 2 a 3 días.

3, 8 y 15 días después de la transducción con el vector lentiviral que codifica para el 4G7-CAR o el FMC63-CAR, se evaluó el porcentaje de células que expresan el CAR mediante citometría de flujo. Se observó que la eficacia de la transducción fue relativamente equivalente con los dos vectores lentivirales (Figura 3).

Luego se investigó si las células T humanas que expresan el 4G7-CAR exhibieron un estado más activado que las células T humanas que expresan el FMC63-CAR. Con ese fin, se comparó la expresión del marcador de activación CD25 en la superficie de las células T transducidas con los 2 vectores lentivirales en diferentes puntos de tiempo. Como se indica en la Figura 4, 3 y 8 días después de la transducción, las células transducidas con el vector lentiviral que codifica para el 4G7-CAR expresaron considerablemente más CD25 en su superficie que las células transducidas con el vector lentiviral que codifica para el FMC63-CAR.

También se evaluó el tamaño de las células transducidas con 4G7-CAR o FMC63-CAR mediante citometría de flujo en diferentes puntos de tiempo. Se observó que las células que expresan el 4G7-CAR fueron más grandes que las células que expresan el FMC63-CAR 3, 8 y 15 días después de la transducción Figure5.

Después de una activación no específica in vitro, las células transducidas con 4G7-CAR muestran un mayor tamaño celular (transformación blástica) así como también la expresión de marcadores de activación (CD25) durante un periodo de tiempo extendido. Esta activación a largo plazo permite una proliferación extendida en comparación con las células transducidas con un CAR similar que contiene el ScFv FMC63.

Ejemplo 3: Comparación de la proliferación de células T humanas primarias que expresan el 4G7-CAR y el FMC63-CAR clásico.

Para determinar si el scFV 4G7 confiere una mayor actividad de proliferación, se siguió la proliferación de células T transducidas con el CAR que porta un scFV 4G7 (SEQ ID NO: 17 codificada por SEQ ID NO: 15) o un scFV FMC63 clásico (SEQ ID NO: 16) hasta 20 días mediante conteo celular dos times por semana. Se transdujeron células T humanas purificadas de acuerdo al siguiente protocolo: brevemente, se transdujeron 1x106 células CD3+ preactivadas durante 3 días con esferas recubiertas con anti-CD3/CD28 e IL2 recombinante con vectores lentivirales que codifican para el 4G7-CAR (SEQ ID NO: 15) y el FMC63-CAR (SEQ ID NO: 16). Luego se mantuvieron las células bajo condiciones clásicas y se reactivaron en el Día 12. Se sembraron las células a la misma densidad y se contaron dos veces por semana durante 20 días. Como se expresa en la Figura 6, la actividad de proliferación de las células T que expresan el 4G7-CAR es dos veces mayor en comparación con las células que expresan el FMC63-CAR clásico.

REFERENCIAS

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Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en terapia de combinación que comprende:

(a) una célula T modificada genéticamente que expresa un receptor quimérico de antígeno (CAR) específico para CD19 que comprende al menos un dominio de unión a ligando extracelular específico para CD19, un dominio transmembrana y al menos un dominio de señalización intracelular; en donde dicho dominio extracelular comprende un fragmento FV de cadena simple derivado del anticuerpo monoclonal 4G7, específico para CD19, comprendiendo dicho fragmento FV de cadena simple el fragmento variable de la cadena pesada gamma 1 de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de la SEQ ID NO: 3 y el fragmento variable de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5; y

(b) el anticuerpo alemtuzumab.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho fragmento FV de cadena simple comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7 o 8.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el al menos un dominio de señalización intracelular del CAR específico para CD19 es un dominio de señalización CD3 zeta que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.

4. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el dominio transmembrana del CAR específico para CD19 comprende una transmembrana de la cadena alfa de CD8 humano y en donde el dominio de tallo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.

5. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el CAR específico para CD19 comprende un segundo dominio de señalización intracelular.

6. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el segundo dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.

7. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el CAR específico para CD19 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o 15.

8. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la célula T modificada genéticamente se ha modificado genéticamente por inactivación de un gen que codifica TCRalpha, TCRbeta, CD52, GR, PD1 o CTLA-4.

9. Una célula T modificada genéticamente que expresa un receptor quimérico (CAR) de antígeno específico para CD19, que comprende al menos un dominio de unión a ligando extracelular específico para CD19, un dominio transmembrana y al menos un dominio de señalización intracelular; en donde dicho dominio extracelular comprende un fragmento FV de cadena simple derivado del anticuerpo monoclonal 4G7, específico para CD19, comprendiendo dicho fragmento FV de cadena simple el fragmento variable de la cadena pesada gamma 1 de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de la SEQ ID NO: 3 y el fragmento variable de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina del anticuerpo monoclonal 4G7 contra CD19 de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, para su uso en combinación con el anticuerpo alemtuzumab en un método para el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método:

administrar al sujeto el anticuerpo alemtuzumab;

administrar al sujeto la célula T modificada genéticamente.

10. La célula T modificada genéticamente para su uso de la reivindicación 9, en donde dicho fragmento FV de cadena simple comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7 o 8.

11. La célula T modificada genéticamente para su uso de la reivindicación 9 o 10, en donde el al menos un dominio de señalización intracelular del CAR específico para CD19 es un dominio de señalización CD3 zeta que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.

12. La célula T modificada genéticamente para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el dominio transmembrana del CAR específico para CD19 comprende una transmembrana de la cadena alfa de CD8 humano y en donde el dominio de tallo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.

13. La célula T modificada genéticamente para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde el CAR específico para CD19 comprende un segundo dominio de señalización intracelular.

14. La célula T modificada genéticamente para su uso de la reivindicación 13, en donde el segundo dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.

15. La célula T modificada genéticamente para su uso de la reivindicación 9, en donde el CAR específico para CD19 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o 15.

16. La célula T modificada genéticamente para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en donde la célula T modificada genéticamente se ha modificado genéticamente por inactivación de un gen que codifica TCRalpha, TCRbeta, CD52, GR, PD1 o CTLA-4.