EA036200B1 - Cd19-специфический химерный антигенный рецептор и его применения - Google Patents

Cd19-специфический химерный антигенный рецептор и его применения Download PDF

Info

Publication number
EA036200B1
EA036200B1 EA201501109A EA201501109A EA036200B1 EA 036200 B1 EA036200 B1 EA 036200B1 EA 201501109 A EA201501109 A EA 201501109A EA 201501109 A EA201501109 A EA 201501109A EA 036200 B1 EA036200 B1 EA 036200B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
leu
gly
ser
cell
vai
Prior art date
Application number
EA201501109A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201501109A1 (ru
Inventor
Роман Галетто
Джулианне Смит
Эндрью Шаренберг
Сесиль Шиффер-Манниуи
Original Assignee
Селлектис
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51897790&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA036200(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/US2013/040766 external-priority patent/WO2013176916A1/en
Application filed by Селлектис filed Critical Селлектис
Publication of EA201501109A1 publication Critical patent/EA201501109A1/ru
Publication of EA036200B1 publication Critical patent/EA036200B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Abstract

Описаны химерные антигенные рецепторы (CAR). CAR обладают способностью перенаправлять специфичность и реактивность иммунных клеток на выбранные мишени благодаря свойствам лигандсвязывающего домена. Описан также химерный антигенный рецептор, в котором внеклеточный лигандсвязывающий домен представляет собой scFV, выведенный из моноклонального антитела к CD19, предпочтительно 4G7. Описаны также полинуклеотиды, векторы, кодирующие указанный CAR, и выделенные клетки, экспрессирующие указанный CAR на своей поверхности. Описаны также способы конструирования иммунных клеток, экспрессирующих 4G7-CAR на своей поверхности, которые обеспечивают пролонгированное "активированное" состояние трансдуцированной клетки. Настоящее изобретение наиболее пригодно для лечения В-клеточных лимфом и лейкоза.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к химерным антигенным рецепторам (CAR). CAR обладают способностью перенаправлять специфичность и реактивность иммунных клеток на выбранные мишени благодаря свойствам лигандсвязывающего домена. В частности, настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору, в котором внеклеточный лигандсвязывающий домен представляет собой scFV, выведенный из моноклонального антитела к CD19, предпочтительно 4G7. Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, векторам, кодирующим указанный CAR, и к выделенным клеткам, экспрессирующим указанный CAR на своей поверхности. Настоящее изобретение относится также к способам создания иммунных клеток, экспрессирующих 4G7-CAR на своей поверхности, который обеспечивает пролонгированное активированное состояние трансдуцированной клетки.
Настоящее изобретение наиболее пригодно для лечения В-клеточных лимфом и лейкоза.
Предпосылки создания изобретения
Адаптивная иммунотерапия, в которой применяют перенос аутологичных антигенспецифических Т-клеток, созданных ex vivo, представляет собой перспективную стратегию для лечения вирусных инфекций и рака. Т-клетки, применяемые для адаптивной иммунотерапии, можно создавать либо путем размножения антигенспецифических Т-клеток, либо посредством перенаправления Т-клеток с помощью методов генетической инженерии (Park, Rosenberg и др., 2011). Перенос Т-клеток, специфических в отношении вирусных антигенов, является хорошо зарекомендовавшей себя процедурой, которую применяют для лечения ассоциированных с трансплантацией вирусных инфекций и редких связанных с вирусами злокачественных заболеваний. Продемонстрировано также, что выделение и перенос специфических в отношении опухоли Т-клеток приводит к успеху при лечении меланомы.
В Т-клетках были успешно созданы новые специфичности посредством генетического переноса трансгенных Т-клеточных рецепторов или химерных антигенных рецепторов (CAR) (Jena, Dotti и др., 2010). CAR представляют собой синтетические рецепторы, состоящие из нацеливающего фрагмента, ассоциированного с одним или несколькими сигнальными доменами в одной слитой молекуле. В целом, связывающий фрагмент CAR состоит из антигенсвязывающего домена одноцепочечного антитела (scFv), который содержит фрагменты моноклонального антитела, представляющие собой вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, соединенные гибким линкером. Успешно применяли также связывающие фрагменты на основе доменов рецептора или лиганда. Сигнальные домены для первого поколения CAR выводили из цитоплазматической области цепей зета CD3 или гамма Fc-рецептора. Было продемонстрировано, что первое поколение CAR позволяло успешно перенаправлять Т-клеточную цитотоксичность, однако для них не удалось обеспечить пролонгированное размножение и противоопухолевую активность in vivo. Для повышения выживаемости и усиления пролиферации модифицированных с помощью CAR Тклеток осуществляли добавление сигнальных доменов из костимуляторных молекул, включая CD28, ОХ40 (CD134) и 4-1BB (CD137), по отдельности (второе поколение) или в комбинации (третье поколение). CAR позволяли успешно перенаправлять Т-клетки на антигены, экспрессируемые на поверхности опухолевых клеток при различных злокачественных заболеваниях, включая лимфомы и солидные опухоли (Jena, Dotti и др., 2010).
CD19 представляет собой привлекательную мишень для иммунотерапии, поскольку огромное большинство клеток острого В-клеточного лимфобластного лейкоза (В-ALL) постоянно экспрессируют CD19, в то время как экспрессия отсутствует на не гематопоэтических клетках, а также на миелоидных, эритроидных и Т-клетках и стволовых клетках костного мозга. В настоящее время проводятся клинические опыты по оценке направленного воздействия на CD19 при В-клеточных злокачественных заболеваниях, в которых получены обнадеживающие противоопухолевые ответы. В большинстве случаев вводимые путем инфузии Т-клетки генетически модифицировали таким образом, чтобы они экспрессировали химерный антигенный рецептор (CAR) со специфичностью, выведенной из scFv-области CD19специфического мышиного моноклонального антитела FMC63 (Nicholson, Lenton и др., 1997; Cooper, Topp и др., 2003; Cooper, Jena и др., 2012) (международная заявка на патент: WO 2013/126712). Однако все еще существует необходимость в улучшении конструкции CAR, которая была бы в большей степени совместима с Т-клеточной пролиферацией, для того, чтобы клетки, экспрессирующие такие CAR, обладали значимым с клинической точки зрения преимуществом.
Краткое изложение сущности изобретения
При создании изобретения был создан CD19-специфичесkий CAR (4G7-CAR), который содержит scFV, выведенный из CD19-специфического моноклонального антитела, а именно 4G7, и неожиданно было установлено, что интродукция созданного 4G7-CAR в первичные Т-клетки может обеспечивать пролонгированное активированное состояние трансдуцированных клеток независимо от связывания с антигеном. После иеспецифической активации in vitro (например, с использованием покрытых антителом к CD3/CD28 гранул и рекомбинантного IL2) указанные клетки характеризовались увеличенным клеточным размером (образование бластов), а также экспрессией маркеров активации (CD25) в течение более длительного периода времени по сравнению с клетками, трансдуцированными сходным CAR, содержащим scFV FMC63. Такая продолжительная активация дает возможность осуществления более продолжительной пролиферации и обеспечивает независимый от антигена механизм размножения несущих 4G7
- 1 036200
CAR клеток in vitro.
Таким образом, в настоящем изобретении предложен химерный антигенный рецептор, содержащий по меньшей мере один внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен и по меньшей мере один домен трансдукции сигнала, в котором указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен содержит scFV, выведенный из специфического моноклонального антитела, 4G7. В частности, предлагаемый в изобретении CAR после трансдукции в иммунную клетку вносит вклад в независимую от антигена активацию и пролиферацию клетки. Настоящее изобретение относится также к нуклеиновой кислоте, векторам, кодирующим CAR, который содержит scFV, выведенный из CD19-специфического моноклонального антитела 4G7, и способам конструирования иммунных клеток, заключающимся в том, что в указанную клетку интродуцируют 4G7-CAR. Настоящее изобретение относится также к генетически модифицированным иммунным клеткам, экспрессирующим на своей поверхности 4G7, прежде всего к иммунным клеткам, пролиферация которых не зависит от опосредуемого антигеном механизма. Генетически модифицированные иммунные клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, наиболее пригодны для таких терапевтических применений, как лечение 3-клеточной лимфомы и лейкоза.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано на фиг. 1 - сравнение пролиферации Т-клеток с инактивированным TCR-α (KO), трансдуцированных несущим 4G7-CAR лентивирусным вектором, и нетрансдуцированных KO Т-клеток (NTD). Мониторинг пролиферации осуществляли в течение 30 дней после осуществления стадии реактивации растворимым антителом к CD28 (IL2+CD28) или без осуществления стадии реактивации (IL2);
на фиг. 2 - результаты анализа экспрессии маркера активации CD25 на поверхности Т-клеток с инактивированным TCR-α, трансдуцированных несущим 4G7-CAR лентивирусным вектором, где дискриминационное окно устанавливали на основе наличия экспрессии 4G7-CAR (CAR+, CAR-), результаты сравнивали с экспрессией CD25 на TCR-a-позитивных не подвергнутых электропорации (NEP) или несущих разрушенный TCR-α, но не подвергнутых трансдукции (NTD) клетках. Экспрессию CD25 анализировали после осуществления стадии реактивации растворимым антителом к CD28 (IL2+CD28) или без осуществления стадии реактивации (IL2);
на фиг. 3 - результаты анализа экспрессии CAR на поверхности Т-клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором, кодирующим либо 4G7-CAR, либо FMC63-CAR. Анализ проводили методом проточной цитометрии через 3, 8 и 15 дней после трансдукции. NT обозначает не подвергнутые трансдукции Т-клетки;
на фиг. 4 - результаты анализа экспрессии CD25 на поверхности Т-клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором, кодирующим либо 4G7-CAR, либо FMC63-CAR. Анализ проводили методом проточной цитометрии через 3, 8 и 15 дней после трансдукции. NT обозначает не подвергнутые трансдукции Т-клетки;
на фиг. 5 - результаты анализа размера Т-клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором, кодирующим либо 4G7-CAR, либо FMC63-CAR. Анализ проводили методом проточной цитометрии через 3, 8 и 15 дней после трансдукции. NT обозначает не подвергнутые трансдукции Т-клетки;
на фиг. 6 - сравнение пролиферации Т-клеток, трансдуцированных несущим 4G7-CAR и несущим FMC63 лентивирусным вектором. Мониторинг пролиферации осуществляли в течение 20 дней после осуществления стадии реактивации растворимым антителом к CD28 (CD28) или без осуществления стадии реактивации (-). NTD обозначает не подвергнутые трансдукции Т-клетки.
Подробное описание изобретения
Если специально не указано иное, то все технические и научные понятия, использованные в настоящем описании, имеют значение, которое является общепринятым для специалистов в области генной терапии, биохимии, генетики и молекулярной биологии.
Для осуществления на практике или тестирования настоящего изобретения можно применять все методы и материалы, сходные или эквивалентные тем, которые указаны в настоящем описании, при этом в настоящей заявке описаны пригодные методы и материалы. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. В случае разночтения следует руководствоваться настоящим описанием, включая определения. Кроме того, материалы, методы и примеры представлены только для иллюстрации и не направлены на ограничение объема изобретения, если не указано иное. При осуществлении на практике настоящего изобретения следует применять, если не указано иное, общепринятые методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, известные специалисту в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, изд-во Wiley and son Inc, Library of Congress, USA, 2000); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3-е изд. (Sambrook и др., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001); Oligonucleotide Synthesis, под ред. M.J. Gait, 1984; Mullis и др., U.S. № 4683195; Nucleic Acid Hybridization (под ред. B.D. Harries и S.J. Higgins, 1984); Transcription And Translation (под ред. B.D. Hames и S.J. Higgins, 1984);
- 2 036200
Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, изд-во Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (изд-во IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); серия: Methods In ENZYMOLOGY (под. ред J. Abelson и М. Simon, изд-во Academic Press, Inc., New York), прежде всего т. 154 и 155 (под ред. Wu и др.) и т. 185, Gene Expression Technology (под ред. D. Goeddel); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (под ред. J.H. Miller и M.P. Calos, 1987, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (под ред. Mayer и Walker, изд-во Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, тт. I-IV (под ред. D.M. Weir и С.С. Blackwell. 1986); и Manipulating the Mouse Embryo, (изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
CD19-специфический химерный антигенный рецептор
Настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору (CAR), содержащему внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен трансдукции сигнала.
Понятие внеклеточный лигандсвязывающий домен в контексте настоящего описания обозначает олиго- или полипептид, обладающий способностью связываться с лигандом. Предпочтительно домен должен обладать способностью взаимодействовать с молекулой клеточной поверхности. Например, можно выбирать внеклеточный лигандсвязывающий домен, позволяющий распознавать лиганд, который функционирует в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированных с конкретным болезненным состоянием.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен содержит фрагмент одноцепочечного антитела (scFv), содержащий вариабельный фрагмент легкой (VL) и тяжелой (VH) цепи специфического в отношении антигена-мишени моноклонального антитела, соединенные гибким линкером. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный scFV выводят из моноклонального антитела к CD19 4G7 (Peipp, Saul и др., 2004), предпочтительно указанный scFv, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит часть иммуноглобулиновой тяжелой γ-1-цепи моноклонального антитела к CD19 4G7 (GenBank: CAD88275.1; SEQ ID NO: 1) и часть иммуноглобулиновой легкой κ-цепи моноклонального антитела к CD19 4G7 (GenBank: CAD88204.1; SEQ ID NO: 2), предпочтительно сцепленные друг с другом с помощью гибкого линкера. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный scFV, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит вариабельные фрагменты иммуноглобулиновой тяжелой γ-1-цепи моноклонального антитела к CD19 4G7 (SEQ ID NO: 3) и вариабельные фрагменты иммуноглобулиновой легкой κ-цепи моноклонального антитела к CD19 4G7 (SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5), сцепленные друг с другом с помощью гибкого линкера. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный гибкий линкер имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 6).
Иными словами, указанный CAR содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит одноцепочечный Fv-фрагмент, выведенный из CD19-специфического моноклонального антитела 4G7. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный scFv содержит часть аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-5. В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность указанного scFv идентична по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 97 или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8.
Домен трансдукции сигнала или внутриклеточный сигнальный домен CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, ответствен за внутриклеточную передачу сигнала после связывания внеклеточного лигандсвязывающего домена с мишенью, приводящую к активации иммунной клетки и иммунному ответу. Иными словами, домен трансдукции сигнала ответствен за активацию по меньшей мере одной из обычных эффекторных функций иммунной клетки, в которой имеет место экспрессия CAR. Например, эффекторная функция Т-клетки может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов. Таким образом, понятие домен трансдукции сигнала относится к части белка, которая осуществляет трансдукцию сигнала эффекторной сигнальной функции и направляет клетку на выполнение специализированной функции.
Предпочтительными примерами домена трансдукции сигнала, которые можно использовать в CAR, могут служить цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора и корецепторов, которые функционируют согласованно, инициируя трансдукцию сигнала после привлечения антигенного рецептора, а также любые производные или варианты указанных последовательностей и любая синтетическая последовательность, обладающая такой же функциональной способностью. Домен трансдукции сигнала содержит два различных класса цитоплазматических сигнальных последовательностей, а именно те, которые инициируют антигензависимую первичную активацию, и те, которые функционируют независимым от антигена образом, обеспечивая вторичный или костимулирующий сигнал. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность может содержать сигнальные мотивы, известные как мотивы активации иммунных рецепторов на основе тирозина, ITAM. ITAM представляют собой хорошо известные сигнальные мотивы, присутствующие во внутрицитоплазматическом хвосте различных ре
- 3 036200 цепторов, которые служат в качестве сайтов связывания для класса syk/zap70 тирозинкиназ. Примерами ITAM, применяемых согласно изобретению, могут служить (но не ограничиваясь только ими) ITAM, выведенные из TCR-зета, FcR-гамма, FcR-бета, FcR-эпсилон, CD3-гαмма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В предпочтительном варианте осуществления изобретения домен трансдукции сигнала CAR может содержать выведенный из CD3-зета сигнальный домен, который имеет аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 97 или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (SEQ ID NO: 10).
В конкретном варианте осуществления изобретения домен трансдукции сигнала CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит костимуляторную сигнальную молекулу. Костимуляторная молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от антигенного рецептора или его лигандов, которая требуется для эффективного иммунного ответа. Понятие костимуляторный лиганд относится к молекуле на антигенпрезентирующей клетке, которая специфически связывается с когнатной костимуляторной молекулой на Т-клетке, создавая тем самым сигнал, который в дополнение к первичному сигналу, создаваемому, например, при связывании комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, загруженной пептидом, опосредует Т-клеточный ответ, включая (но не ограничиваясь только этим) активацию пролиферации, дифференцировку и т.п. Костимуляторный лиганд может включать (но не ограничиваясь только ими) CD7, B7-1 (CD80), В7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцибельный костимуляторный лиганд (ICOS-L), молекулу межклеточной адгезии (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, рецептор лимфотоксина бета, 3/TR6, ILT3, ILT4, агонист или антитело, который/которое связывается с лигандом Толл-рецептора, и лиганд, который специфически связывается с В7-И3. Под понятие костимуляторный лиганд подпадает, среди прочего, антитело, которое специфически связывается с костимуляторной молекулой, присутствующей на Т-клетке, такой как (но не ограничиваясь только ими) CD27, CD28, 4-1ВВ, ОХ40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, антиген-1, ассоциированный с функцией лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, специфически связывающийся с CD83.
Понятие костимуляторная молекула относится к когнатному (родственному) связывающему партнеру, присутствующему на Т-клетке, который специфически связывается с костимуляторным лигандом, опосредуя тем самым костимулирующий ответ клетки, такой как (но не ограничиваясь только им) пролиферация. Костимуляторные молекулы включают (но не ограничиваясь только ими) молекулу ГКГС класса I, BTLA и лиганд Толл-рецептора. Примерами костимуляторных молекул являются CD27, CD28, CD8, 4-1ВВ (CD137), ОХ40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, антиген-1, ассоциированный с функцией лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-НЗ и лиганд, специфически связывающийся с CD83, и т.п.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения домен трансдукции сигнала CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит часть костимуляторной сигнальной молекулы, выбранной из группы, состоящей из фрагмента 4-1ВВ (GenBank: AAA53133.) и CD28 (NP_006130.1). В частности, домен трансдукции сигнала CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 97 или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12.
CAR, предлагаемый в настоящем изобретении, экспрессируется на поверхности клеточной мембраны. Таким образом, CAR может содержать трансмембранный домен. Отличительными особенностями соответствующих трансмембранных доменов являются способность экспрессироваться на поверхности клетки, согласно настоящему изобретению предпочтительно на поверхности иммунной клетки, прежде всего лимфоцитов или естественных клеток-киллеров (NK), и взаимодействовать друг с другом, направляя клеточный ответ иммунной клетки на заранее определенную клетку-мишень. Трансмембранный домен можно выводить как из встречающегося в естественных условиях, так и синтетического источника. Трансмембранный домен можно выводить из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка. Примерами трансмембранных полипептидов могут служить (но не ограничиваясь только ими) субъединица Т-клеточного рецептора, такая как α-, β-, γ- или δ-субъединица, полипептид, образующий комплекс CD3, р55 (α-цепь), р75 (β-цепь) или γ-цепь рецептора IL2, цепь субъединиц Fc-рецепторов, в частности FcY-рецептора III или CD-белки. Альтернативно этому трансмембранный домен может быть синтетическим, и он может содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный трансмембранный домен выводят из α-цепи человеческого CD8 (например, NP_001139345.1). Трансмембранный домен может содержать также стеблевую область между указанным внеклеточным лигандсвязывающим доменом и указанным трансмембранным доменом. В контексте настоящего описания понятие стеблевая область, как правило, обозначает олиго- или полипептид, функция которого заключается в сцеплении трансмембранного домена с внеклеточным лигандсвязывающим доменом. В частности, стеблевую область используют для обеспечения большей гибкости и доступности внеклеточного лигандсвязывающего домена. Стеблевая область может содержать вплоть до 300 аминокислот, предпочтительно от 10 до 100
- 4 036200 аминокислот и наиболее предпочтительно от 25 до 50 аминокислот. Стеблевую область можно выводить из полных встречающихся в естественных условиях молекул или их частей, таких как полная внеклеточная область CD8, CD4 или CD28, или ее часть, или полная константная область антитела или ее часть. Альтернативно этому стеблевая область может представлять собой синтетическую последовательность, которая соответствует встречающейся в естественных условиях стеблевой последовательности, или может представлять собой полностью синтетическую стеблевую последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная стеблевая область представляет собой часть α-цепи человеческого CD8 (например, NP_001139345.1). В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанный трансмембранный домен и шарнирный домен содержат часть α-цепи человеческого CD8, последовательность которой идентична предпочтительно по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 97 или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13.
В конкретном варианте осуществления изобретения указанный химерный антигенный рецептор, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит scFv, выведенный из моноклонального антитела к CD19 4G7, шарнирного и трансмембранного домена α-цепи человеческого CD8, сигнального домена ОЭ3-зета и сигнального домена 4-1ВВ. Предпочтительно последовательность 4G7-CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, идентична по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 97 или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14 и 15.
В раковых клетках часто имеет место понижающая регуляция или мутация антигенов-мишеней, что приводит к появлению так называемых вариантов потерянных антигенов, т.е. антигенов, ускользающих от иммунологического надзора. Таким образом, для того, чтобы противостоять ускользанию опухоли от иммунологического надзора и придавать иммунной клетке большую специфичность в отношении мишени, ОО19-специфический CAR может содержать другие внеклеточные лигандсвязывающие домены, предназначенные для одновременного связывания с другими элементами на мишени и усиления тем самым активации и функции иммунной клетки. В одном из вариантов осуществления изобретения внеклеточные лигандсвязывающие домены можно размещать тандемно на одном и том же трансмембранном полипептиде и их необязательно можно отделять друг от друга с помощью линкера. В другом варианте осуществления изобретения указанные другие внеклеточные лигандсвязывающие домены можно размещать на различных трансмембранных полипептидах, из которых состоит CAR. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к популяции CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. В частности, настоящее изобретение относится к способу создания иммунных клеток, заключающемуся в том, что получают иммунную клетку и экспрессируют на поверхности указанной клетки популяцию, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу создания иммунной клетки, заключающемуся в том, что получают иммунную клетку и интродуцируют в указанную клетку полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, из которых состоит популяция CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Под популяцией CAR подразумевают по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть или большее количество CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Согласно настоящему изобретению различные внеклеточные лигандсвязывающие домены, предлагаемые в настоящем изобретении, предпочтительно могут связываться одновременно с различными элементами на мишени, усиливая тем самым активацию и функцию иммунной клетки. Настоящее изобретение относится также к выделенной иммунной клетке, которая содержит популяцию CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены.
Полинуклеотиды, векторы.
Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, векторам, кодирующим описанный выше CAR, предлагаемый в изобретении. Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17. В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность полинуклеотида идентична по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 97 или 99% нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17.
Полинуклеотид может содержаться в кассете экспрессии или экспрессионном векторе (например, в плазмиде, предназначенной для интродукции в бактериальную клетку-хозяин, или вирусном векторе, таком как бакуловирусный вектор, предназначенный для трансфекции клетки насекомого-хозяина, или плазмидном или вирусном векторе, таком как лентивирус, предназначенном для трансфекции клетки млекопитающего-хозяина.
В конкретном варианте осуществления изобретения можно включать различные нуклеотидные последовательности в один полинуклеотид или вектор, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую рибосомальную skip-последовательность, такую как последовательность, кодирую
- 5 036200 щую пептид 2А. Пептиды 2А, которые были идентифицированы в подгруппе афтовирусов группы пикорнавирусов, приводят к рибосомальному перескоку (skip) от одного кодона к следующему без образования пептидной связи между двумя аминокислотами, кодируемыми кодонами (см. Donnelly и Elliott, 2001; Atkins, Wills и др., 2007; Doronina, Wu и др., 2008). Под кодоном понимают три нуклеотида на мРНК (или на смысловой цепи молекулы ДНК), которые транслируются рибосомой в один аминокислотный остаток. Таким образом, можно синтезировать два полипептида из одной непрерывной рамки считывания в мРНК, если полипептиды разделены последовательностью олигопептида 2А, присутствующей в рамке считывания. Такие рибосомальные skip-механизмы хорошо известны в данной области и известно их применение в нескольких векторах для экспрессии нескольких белков, кодируемых одной матричной РНК.
Для направления трансмембранного полипептида в секреторный путь клетки-хозяина, в последовательность полинуклеотида или в последовательность вектора помещают секреторную сигнальную последовательность (известную также как лидерная последовательность, пре-пропоследовательность или препоследовательность). Секреторную сигнальную последовательность функционально связывают с трансмембранной нуклеотидной последовательностью, т.е. две последовательности соединяют в правильной рамке считывания и размещают так, чтобы направлять новый синтезированный полипептид в секреторный путь клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности, как правило, размещают в 5'-направлении относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые секреторные сигнальные последовательности можно размещать и в другом месте представляющей интерес нуклеотидной последовательности (см., например, Welch и др., US № 5037743; Holland и др., US № 5143830). В предпочтительном варианте осуществления изобретения сигнальный пептид содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 18 и 19.
Специалистам в данной области должно быть очевидно, что с учетом вырожденности генетического кода могут иметь место значительные вариации последовательности указанных полинуклеотидных молекул. Предпочтительно нуклеотидные последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют оптимизированные кодоны для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно для экспрессии в человеческих клетках. Оптимизация кодонов относится к замене в представляющей интерес последовательности кодонов, встречающихся относительно редко в генах с высоким уровнем экспрессии, на кодоны, которые, как правило, часто встречаются в генах с высоким уровнем экспрессии в указанных видах, такие кодоны кодируют те же аминокислоты, что и подлежащие замене кодоны.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17. Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, содержащим нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 97 или 99% нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17.
Способы создания иммунной клетки.
Конкретные варианты осуществления, подпадающие под объем настоящего изобретения, относятся к способу получения иммунных клеток для иммунотерапии, заключающемуся в том, что интродуцируют в указанные иммунные клетки CAR, предлагаемый в настоящем изобретении, и размножают указанные клетки. Конкретный вариант осуществления изобретения относится к способу создания иммунной клетки, заключающемуся в том, что получают клетку и экспрессируют на поверхности указанной клетки по меньшей мере один CAR, описанный выше. В конкретном варианте осуществления изобретения способ заключается в том, что трансформируют клетку по меньшей мере одним полинуклеотидом, кодирующим CAR, описанный выше, и экспрессируют указанные полинуклеотиды в указанной клетке.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные полинуклеотиды включают в лентивирусные векторы, принимая во внимание, что они стабильно экспрессируются в клетках.
В другом варианте осуществления изобретения указанный способ дополнительно включает стадию, на которой генетически модифицируют указанную клетку путем инактивации по меньшей мере одного гена, экспрессирующего один компонент TCR, мишень иммуносупрессорното агента, ген HLA и/или ген иммунных чекпойнтов, такой как PDCD1 или CTLA-4. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный ген выбирают из группы, состоящей из TCR-a, TCR-β, CD52, GR, PD1 и CTLA4. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный способ дополнительно заключается в том, что интродуцируют в указанные Т-клетки редко расщепляющую эндонуклеазу, обладающую способностью осуществлять избирательную инактивацию путем расщепления ДНК указанных генов. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная редко расщепляющая эндонуклеаза представляет собой TALE-нуклеазу или эндонуклеазу Cas9.
Методы доставки.
Различные методы, описанные выше, предполагают интродукцию CAR в клетку. Например (но не ограничиваясь только этим), указанный CAR можно интродуцировать в виде трансгенов, кодируемых одним плазмидным вектором. Указанный плазмидный вектор может содержать также селектируемый маркер, обеспечивающий идентификацию и/или отбор клеток, в которые встроен указанный вектор.
- 6 036200
Полипептиды можно синтезировать in situ в клетке в результате интродукции в клетку полинуклеотидов, кодирующих указанные полипептиды. Альтернативно этому указанные полипептиды можно получать вне клетки и затем интродуцировать в нее. Методы интродукции полинуклеотидных конструкций в клетки известны в данной области и их примерами являются (но не ограничиваясь только ими) методы стабильной трансформации, в которых полинуклеотидную конструкцию интегрируют в геном клетки, методы кратковременной трансформации, в которых полинуклеотидную конструкцию не интегрируют в геном клетки, и методы, основанные на использовании вирусов. Указанные полинуклеотиды можно интродуцировать в клетку, например, с использованием рекомбинантных вирусных векторов (например, ретровирусов, аденовирусов), липосом и т.п. Например, методы кратковременной трансформации включают микроинъекцию, электропорацию или бомбардировку частицами. Указанные полинуклеотиды можно включать в векторы, более конкретно в плазмиды или вирусы, с целью экспрессии в клетках.
Сконструированные иммунные клетки.
Настоящее изобретение относится также к выделенным клеткам или клеточным линиям, которые можно получать указанным способом создания клеток. В частности, указанная выделенная клетка содержит по меньшей мере один описанный выше CAR. В другом варианте осуществления изобретения указанная выделенная клетка содержит популяцию CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. В частности, указанная выделенная клетка содержит экзогенную полинуклеотидную последовательность, кодирующую CAR. Активация и пролиферация генетически модифицированных иммунных клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, происходит независимо от механизмов связывания с антигеном.
Под объем настоящего изобретения подпадает также выделенная иммунная клетка, предпочтительно Т-клетка, полученная с помощью одного из описанных ранее способов. Указанная иммунная клетка представляет собой клетку, происходящую из гематопоэтической клетки, функционально участвующую в инициации и/или реализации врожденного или адаптивного иммунного ответа. Указанную иммунную клетку, предлагаемую в настоящем изобретении, можно выводить из стволовой клетки. Стволовые клетки могут представлять собой зрелые стволовые клетки, нечеловеческие эмбриональные стволовые клетки из организма кроме человека, более предпочтительно нечеловеческие стволовые клетки, стволовые клетки из пуповинной крови, клетки-предшественники, стволовые клетки костного мозга, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, тотипотентные стволовые клетки или гематопоэтические стволовые клетки. Репрезентативными человеческими клетками являются CD34+-клетки. Указанная выделенная клетка может представлять собой также дендритную клетку, дендритную клетку-киллер, тучную клетку, NK-клетку, В-клетку или Т-клетку, выбранную из группы, состоящей из воспалительных Тлимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или хэлперных Тлимфоцитов. В другом варианте осуществления изобретения указанную клетку можно выводить из группы, состоящей из CD4+-Т-лимфоцитов и CD8+-Т-лимфоцитов. Перед осуществлением размножения и генетической модификации клеток, предлагаемых в изобретении, из организма индивидуума можно получать источник клеток с помощью различных методов, не ограничивающих объем изобретения. Клетки можно получать из многочисленных источников, включая (но не ограничиваясь только ими) мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из инфицированной области, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно применять любое количество Т-клеточных линий, доступных и известных специалистам в данной области. В другом варианте осуществления изобретения указанную клетку можно получать из организма здорового донора, пациента, у которого диагностирован рак или пациента, у которого диагностирована инфекция. В другом варианте осуществления изобретения указанная клетка представляет собой часть смешанной популяции клеток, обладающих различными фенотипическими характеристиками. Под объем настоящего изобретения подпадает также клеточная линия, полученная из трансформированной Т-клетки согласно ранее описанному способу. Под объем настоящего изобретения подпадают модифицированные клетки, полученные с помощью ранее описанного способа, которые являются устойчивыми или чувствительными к иммуносупрессорной обработке.
В другом варианте осуществления изобретения указанная выделенная клетка, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит полинуклеотид, кодирующий CAR.
Активация и размножение Т-клеток.
Как до, так и после осуществления генетической модификации Т-клеток, даже в том случае, если активация и пролиферация генетически модифицированных иммунных клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, не зависит от механизмов связывания с антигеном, иммунные клетки, прежде всего Тклетки, предлагаемые в настоящем изобретении, можно подвергать дополнительной активации и размножать с помощью методов, описанных, например, в US №№ 6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041 и публикации заявки на патент США № 2006/0121005. Т-клетки можно размножать in vitro или in vivo.
Как правило, Т-клетки, предлагаемые в изобретении, размножают путем приведения в контакт с
- 7 036200 агентом, который стимулирует комплекс CD3 TCR, и костимуляторной молекулой на поверхности Тклеток с целью создания сигнала активации для Т-клетки.
Например, для создания сигнала активации для Т-клетки можно применять химические соединения, такие как ионофор кальция А23187, форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА), или митогенные лектины, такие как фитогемагглютинин (ФГА).
Например (но не ограничиваясь только этим), популяции Т-клеток можно стимулировать in vitro путем приведения в контакт с антителом к CD3 или его антигенсвязывающим фрагментом, или антителом к CD2, иммобилизованным на поверхности, или путем приведения в контакт с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) в сочетании с ионофором кальция. Для костимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клеток можно использовать лиганд, который связывается с вспомогательной молекулой. Например, популяцию Т-клеток можно приводить в контакт с антителом к CD3 и антителом к CD28 в условиях, обеспечивающих стимуляцию пролиферации Т-клеток. Условия, пригодные для культивирования Т-клеток, включают соответствующие среды (например, минимальную поддерживающую среду или среду RPMI 1640, или X-vivo 5 (фирма Lonza)), которые могут содержать факторы, необходимые для обеспечения пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку (например, фетальную бычью сыворотку или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-γ , 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, -2, 1L-15, TGFp и TNF- или любые другие добавки для роста клеток, известные специалисту в данной области. Другие добавки для роста клеток включают (но не ограничиваясь только ими) сурфактант, плазманат и восстановители, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут представлять собой RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 и X-Vivo 20, Optimizer, содержащие в качестве добавок аминокислоты, пируват натрия и витамины, они могут быть бессывороточными или могут содержать в качестве добавок в определенном количестве сыворотку (или плазму) или определенный набор гормонов, и/или цитокин(ы) в количестве, достаточном для роста и размножения Т-клеток. Антибиотики, например пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, но не в культуры клеток, которые предназначены для введения путем инфузии индивидууму. Клетки-мишени поддерживают в условиях, необходимых для поддержания роста, например при соответствующей температуре (например, при 37°C) и атмосфере (например, в воздухе плюс 5% CO2). Клетки, которые подвергали стимуляции в течение различных промежутков времени, могут обладать различными характеристиками.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные клетки можно размножать путем совместного культивирования с тканью или клетками. Указанные клетки можно размножать также in vivo, например, в крови индивидуума после введения указанной клетки индивидууму.
Терапевтические применения.
В другом варианте осуществления изобретения выделенные клетки, полученные различными методами, или клеточную линию, выведенную из указанной выделенной клетки, согласно описанному ранее методу, можно применять в качестве лекарственного средства. В другом варианте осуществления изобретения указанное лекарственное средство можно применять для лечения рака, прежде всего для лечения В-клеточных лимфом и лейкозов у пациента, нуждающегося в этом. В другом варианте осуществления изобретения указанную выделенную клетку, предлагаемую в изобретении, или клеточную линию, выведенную из указанной выделенной клетки, можно применять для изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака у пациента, нуждающегося в этом.
Другой объект настоящего изобретения относится к способам лечения пациентов, нуждающихся в этом, где указанный способ заключается в том, что осуществляют по меньшей мере одну из следующих стадий, на которых:
(а) получают иммунную клетку, которую можно создавать с помощью одного из ранее описанных методов;
(б) вводят указанные трансформированные иммунные клетки указанному пациенту.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанные Т-клетки, предлагаемые в изобретении, можно подвергать интенсивному Т-клеточному размножению in vivo и их можно сохранять в течение продолжительного периода времени.
Указанное лечение может быть облегчающим, терапевтическим или профилактическим. Оно может представлять собой либо составную часть аутологичного иммунотерапевтического лечения, либо составную часть аллогенного иммунотерапевтического лечения. Понятие аутологичный означает, что клетки, клеточная линия или популяция клеток, применяемые для лечения пациентов, происходят из организма указанного пациента или из организма совместимого по человеческому лейкоцитарному антигену (HLA) донора. Понятие аллогенный означает, что клетки или популяция клеток, применяемые для лечения пациентов, не происходят из организма указанного пациента, но происходят из организма донора.
Клетки, которые можно применять в заявляемых способах, описаны в предыдущем разделе. Указанное лечение можно применять для лечения пациентов, у которых диагностирован рак. Типы рака, которые можно лечить, включают несолидные опухоли (такие как гематологические опухоли, включая (но не ограничиваясь только ими) пре-В ALL (при педиатрических показаниях), ALL взрослых, лимфому из клеток мантии, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому и т.п. Типы рака, которые можно
- 8 036200 лечить с помощью CAR, предлагаемых в изобретении, включают (но не ограничиваясь только ими) некоторые типы лейкозов или лимфоидных злокачественных заболеваний. Они включают также опухоли/типы рака взрослых и детские опухоли/типы рака.
Лечение можно осуществлять в сочетании с применением одного или нескольких типов противораковой терапии, выбранных из группы, включающей терапию на основе антител, химиотерапию, цитокиновую терапию, терапию с использованием дендритных клеток, генную терапию, гормональную терапию, свето-лазерную терапию и лучевую терапию.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения указанное лечение можно применять для пациентов, подвергающихся иммуносупрессорной терапии. Фактически, настоящее изобретение основано предпочтительно на применении клеток или популяции клеток, которые приобрели устойчивость по меньшей мере к одному иммунодепрессанту в результате инактивации гена, кодирующего рецептор для такого иммунодепрессанта. С этой точки зрения иммуносупрессорная терапия должна способствовать отбору и размножению Т-клеток, предлагаемых в изобретении, в организме пациента.
Введение клеток или популяции клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, можно осуществлять любым пригодным методом, включая ингаляцию аэрозоля, инъекцию, прием внутрь, трансфузию, имплантацию или трансплантацию. Композиции, представленные в настоящем описании, можно вводить пациенту подкожно, внутрикожно, внутрь опухоли, интранодально, интрамедуллярно, внутримышечно, путем внутривенной или внутрилимфатической инъекции, или внутрибрюшинно. В одном из вариантов осуществления изобретения клеточные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, предпочтительно вводят путем внутривенной инъекции.
Введение клеток или популяции клеток может заключаться во введении 104-109 клеток/кг веса тела, предпочтительно от 105 до 106 клеток/кг веса тела, включая все целочисленные количества клеток в указанных диапазонах. Клетки или популяцию клеток можно вводить в виде одной или нескольких доз. В другом варианте осуществления изобретения указанное эффективное количество клеток вводят в виде однократной дозы. В другом варианте осуществления изобретения указанное эффективное количество клеток вводят в виде более чем одной дозы в течение некоторого периода времени. График введения находится в компетенции лечащего врача и зависит от клинического состояния пациента. Клетки или популяцию клеток можно получать из любого источника, такого как банк крови или донор. Поскольку индивидуальные потребности варьируются, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств рассматриваемого типа клеток для конкретного заболевания или состояний, находится в компетенции специалиста в данной области. Эффективное количество представляет собой количество, которое обеспечивает терапевтическое или профилактическое полезное действие. Вводимая доза должна зависеть от возраста, состояния здоровья и веса реципиента, вида одновременно применяемого лечения, если это имеет место, частоты обработки и природы требуемого действия.
В другом варианте осуществления изобретения клетки или композицию, содержащую эти клетки, вводят в указанном эффективном количестве парентерально. Указанное введение может представлять собой внутривенное введение. Указанное введение можно осуществлять непосредственно путем инъекции в опухоль.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки вводят пациенту в сочетании с осуществлением (например, до, одновременно или после) любого количества соответствующих форм лечения, включая (но не ограничиваясь только ими) лечение с помощью средств противовирусной терапии, таких как цидофовир и интерлейкин-2, цитарабин (известный также под названием ARA-C), или лечение натализумабом пациентов с MS (рассеянный склероз), или лечение эфализумабом пациентов с псориазом, или другие виды лечения пациентов с PML (прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия). В других вариантах осуществления изобретения Т-клетки, предлагаемые в изобретении, можно применять в сочетании с химиотерапией, лучевой терапией, иммунодепрессантами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолят и FK506, антителами или другими иммунодеструктивными агентами, такими как САМРАТН, антитела к CD3, или с другими видами терапии на основе антител, цитоксином, флударибином, циклоспорином, FK506, рапамицином, микофеноловой кислотой, стероидами, FR901228, цитокинами и облучением. Эти лекарственные средства ингибируют или кальцийзависимую фосфатазу, кальцинеурин (циклоспорин и FK506), или ингибируют киназу p70S6, которая важна для индуцируемой фактором роста передачи сигнала (рапамицин) (Henderson, Naya и др., 1991; Liu, Albers и др., 1992; Bierer, Hollander и др., 1993). В другом варианте осуществления изобретения клеточные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, вводят пациенту в сочетании с (например, до, одновременно или после) трансплантацией костного мозга, Т-клеточной абляционной терапией с использованием либо химиотерапевтических средств, таких как флударабин, либо внешней лучевой терапии (XRT), циклофосфамида, либо антител, таких как OKT3 или САМРАТН. В другом варианте осуществления изобретения клеточные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, вводят после осуществления В-клеточной абляционной терапии с использованием агентов, которые взаимодействуют с CD20, таких, например, как ритуксан. Например, в одном из вариантов осуществления изобретения индивидуумов можно подвергать стандартной обработке химиотерапевтическими средствами в высокой дозе с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В некоторых вариантах
- 9 036200 осуществления изобретения после трансплантации индивидуумам вводят путем инфузии размноженные иммунные клетки, предлагаемые в настоящем изобретении. В еще одном варианте осуществления изобретения размноженные клетки вводят до или после хирургического вмешательства.
Другие определения.
Если специально не указано иное, то множественное число и единственное число и понятие по меньшей мере один используются взаимозаменяемо и означают один или более чем один.
Аминокислотные остатки в полипептидной последовательности обозначают в настоящем описании с помощью однобуквенного кода, согласно которому, например, Q обозначает Gln или остаток глутамина, R обозначает Arg или остаток аргинина и D обозначает Asp или остаток аспарагиновой кислоты.
Аминокислотная замена обозначает замену одного аминокислотного остатка на другой, например замена остатка аргинина на остаток глутамина в пептидной последовательности представляет собой аминокислотную замену.
Нуклеотиды обозначают следующим образом.
Однобуквенный код используют для обозначения основания нуклеозида: a обозначает аденин, t обозначает тимин, c обозначает цитозин и g обозначает гуанин. Для вырожденных нуклеотидов r обозначает g или a (пуриновые нуклеотиды), k обозначает g или t, s обозначает g или с, w обозначает a или t, m обозначает a или с, y обозначает t или c (пиримидиновые нуклеотиды), d обозначает g, a или t, v обозначает g, a или c, b обозначает g, t или c, h обозначает a, t или c и n обозначает g, a, t или c.
В контексте настоящего описания понятия нуклеиновая кислота или полинуклеотиды относятся к нуклеотидам и/или полинуклеотидам, таким как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), олигонуклеотидам, фрагментам, созданным с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и фрагментам, созданным путем лигирования, расщепления, обработки эндонуклеазами и обработки экзонуклеазами. Молекулы нуклеиновой кислоты могут состоять из мономеров, которые являются встречающимися в естественных условиях нуклеотидами (такими как ДНК или РНК) или аналогами встречающихся в естественных условиях нуклеотидов (например, энантиомерными формами встречающихся в естественных условиях нуклеотидов), или представляют собой их комбинацию. Модифицированные нуклеотиды могут иметь изменения в сахарных фрагментах и/или во фрагментах, содержащих пиримидиновые или пуриновые основания. Модификации сахаров включают, например, замену одной или нескольких гидроксильных групп на галогены, алкильные группы, амины и азидогруппы, или сахара могут быть функционализированы до простых или сложных эфиров. Кроме того, весь сахарный фрагмент может быть заменен стерически и электронно сходными структурами, такими как аза-сахара и карбоциклические аналоги сахаров. Примерами модификаций во фрагменте, представляющем собой основание, могут служить алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины или другие хорошо известные гетероциклические заместители. Мономеры нуклеиновой кислоты могут быть сшиты фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными.
Под химерным антигенным рецептором (CAR) подразумевают молекулы, в которых объединен связывающий домен, направленный против компонента, присутствующего на клетке-мишени, например, присущую антителу специфичность в отношении требуемого антигена (например, опухолевого антигена), с активирующим Т-клеточный рецептор внутриклеточным доменом, в результате чего образуется химерный белок, обладающий специфической клеточной иммунной активностью в отношении мишени. Как правило, CAR состоит из внеклеточного одноцепочечного антитела (scFvFc), слитого с внутриклеточным сигнальным доменом зета-цепи комплекса Т-клеточный антиген-рецептор (scFvFc:Z, и при экспрессии в Т-клетках он обладает способностью перенаправлять распознавание антигена благодаря специфичности моноклонального антитела. Одним из примеров CAR, применяемого в настоящем изобретении, является CAR, направленный против антигена CD19, и он может, например, содержать (но не ограничиваясь только ей) аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 14.
Понятие эндонуклеаза относится к ферменту дикого типа или его варианту, обладающему способностью катализировать гидролиз (расщепление) связей между нуклеиновыми кислотами в молекуле ДНК или РНК, предпочтительно в молекуле ДНК. Эндонуклеазы не расщепляют молекулу ДНК или РНК независимо от ее последовательности, но они распознают и расщепляют молекулу ДНК или РНК в специфических полинуклеотидных последовательностях, в дальнейшем обозначенных как последовательности-мишени или сайты-мишени. Эндонуклеазы можно классифицировать как редко расщепляющие эндонуклеазы, для которых, как правило, полинуклеотидный сайт распознавания имеет длину более 12 пар оснований (bp), более предпочтительно 14-55 пар оснований. Редко расщепляющие эндонуклеазы значительно повышают гомологичную рекомбинацию (HR), индуцируя двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) в определенном локусе (Perrin, Buckle и др., 1993; Rouet, Smih и др., 1994; Choulika, Perrin и др., 1995; Pingoud и Silva, 2007). Редко расщепляющие эндонуклеазы могут представлять собой, например, хоминг-эндонуклеазу (Paques и Duchateau, 2007), химерную нуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN), образованную слиянием сконструированных доменов цинковых пальцев с каталитическим доменом рестриктазы, такой как FokI (Porteus и Carroll, 2005), эндонуклеазу Cas9 из системы CRISPR (Gasiunas, Barrangou и др., 2012; Jinek, Chylinski и др., 2012; Cong, Ran и др., 2013; Mali, Yang и др., 2013) или хи- 10 036200 мическую эндонуклеазу (Eisenschmidt, Lanio и др., 2005; Arimondo, Thomas и др., 2006). В химических эндонуклеазах химический или пептидный расщепляющий компонент конъюгируют либо с полимером нуклеиновой кислоты, либо с другой ДНК, распознающей специфическую последовательность-мишень, тем самым обеспечивая направление расщепляющей активности на специфическую последовательность. Химические эндонуклеазы включают также синтетические нуклеазы типа конъюгатов ортофенантролина, ДНК-расщепляющей молекулы и триплекс-образующих олигонуклеотидов (TFO), которые, как известно, связываются со специфическими последовательностями ДНК (Kalish и Glazer, 2005). Такие химические эндонуклеазы подпадают под понятие эндонуклеазы в контексте настоящего изобретения.
Под TALE-нуклеазой (TALEN) понимают слитый белок, который состоит из связывающего нуклеиновую кислоту домена, как правило, выведенного из подобного активатору транскрипции эффектора (TALE), и одного нуклеазного каталитического домена для расщепления последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Каталитический домен предпочтительно представляет собой нуклеазный домен и более предпочтительно домен, обладающий эндонуклеазной активностью, например, типа I-TevI, ColE7, NucA и Fok-I. В конкретном варианте осуществления изобретения домен TALE может быть слит с мегануклеазой, например, типа I-CreI и I-OnuI, или ее функциональным вариантом. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная нуклеаза представляет собой мономерную TALEнуклеазу. Мономерная TALE-нуклеаза представляет собой TALE-нуклеазу, которая не требует димеризации для специфического распознавания и расщепления, например, в виде слияний сконструированных повторов TAL с каталитическим доменом I-TevI, описанным в WO 2012/138927. Подобные активатору транскрипции эффекторы: (TALE) представляют собой белки из видов бактерий рода Xanthomonas, содержащие несколько повторяющихся последовательностей, где каждый повтор содержит di-остатки (двойные остатки) в положениях 12 и 13 (RVD), обладающие специфичностью в отношении каждого нуклеотидного основания последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Связывающие домены, обладающие сходными модульными свойствами связывания нуклеиновых кислот по типу основание-соснованием (base-per-base) (MBBBD) могут быть выведены также из новых модульных белков, недавно обнаруженных заявителями в различных видах бактерий. Преимущество новых модульных белков заключается в том, что они характеризуются большей вариабельностью последовательности, чем TALповторы. Предпочтительно RVD, ассоциированные с распознаванием различных нуклеотидов, представляют собой HD для распознавания С, NG для распознавания Т, NI для распознавания А, NN для распознавания G или A, NS для распознавания А, С, G или Т, HG для распознавания Т, IG для распознавания Т, NK для распознавания G, НА для распознавания С, ND для распознавания С, HI для распознавания С, HN для распознавания G, NA для распознавания G, SN для распознавания G или А и YG для распознавания Т, TL для распознавания А, VT для распознавания А или G и SW для распознавания А. В другом варианте осуществления изобретения имеющие решающее значение аминокислоты 12 и 13 можно изменять путем мутации на другие аминокислотные остатки для модуляции их специфичности в отношении нуклеотидов А, Т, С и G и, прежде всего, для повышения их специфичности. Ранее уже была описана TALE-нуклеаза, и ее применяют для стимуляции генного нацеливания и генных модификаций (Boch, Scholze и др., 2009; Moscou и Bogdanove, 2009; Christian, Cermak и др., 2010; Li, Huang и др., 2011). Сконструированные TAL-нуклеазы поступают в продажу под товарным знаком TALEN® (фирма Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013, Париж, Франция).
Редко расщепляющая эндонуклеаза, предлагаемая в настоящем изобретении, может представлять собой также эндонуклеазу Cas9. В последние годы был разработан новый инструмент для генетической инженерии на основе РНК-направляемой нуклеазы Cas9 (Gasiunas, Barrangou и др., 2012; Jinek, Chylinski и др., 2012; Cong, Ran и др., 2013; Mali, Yang и др., 2013) из адаптивной иммунной системы CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats)) типа II прокариот (см. обзор Sorek, Lawrence и др., 2013). CRISPRассоциированная (Cas) система впервые была обнаружена в бактериях, и ее функция состоит в защите от чужой вирусной или плазмидной ДНК. При осуществлении опосредуемой CRISPR генетической инженерии сначала проводят отбор последовательности-мишени, часто фланкированной короткой последовательностью мотива, который обозначают как примыкающий к протоспейсеру мотив (РАМ). После отбора последовательности-мишени конструируют специфическую сгРНК (CRISPR-РНК), комплементарную указанной последовательности-мишени. Для систем CRISPR типа II требуется трансактивирующая сгРНК (РисгРНК), спаренная с crRNA и связанная с внесенным белком Cas9. Cas9 функционирует в качестве молекулярного якоря, облегчающего спаривание оснований (гасРНК с сРНК (Deltcheva, Chylinski и др., 2011). В этом тройном комплексе двойная структура 1гасгРНК:сгРНК функционирует в качестве направляющей РНК, которая направляет эндонуклеазу Cas9 к когнатной последовательности-мишени. Распознавание мишени комплексом Cas9-tracrРНК:crРНК инициируется путем сканирования последовательности-мишени для обнаружения гомологии между последовательностью-мишенью и сгРНК. Помимо комплементарности последовательности-мишени и сгРНК, нацеливание ДНК требует присутствия короткого мотива, примыкающего к протоспейсеру (примыкающий к протоспейсеру мотив - РАМ). После спаривания двойной РНК и последовательности-мишени Cas9 интродуцирует тупой двухцепочечный разрыв на расстоянии 3 пар оснований в обратном направлении относительно мотива РАМ (Garneau, Du
- 11 036200 puis и др., 2010).
Редко расщепляющая эндонуклеаза может представлять собой хоминг-эндонуклеазу, также известную под названием мегануклеаза. Такие хоминг-эндонуклеазы хорошо известны в данной области (Stoddard, 2005). Хоминг-эндонуклеазы распознают последовательность ДНК-мишени и создают одноцепочечный или двухцепочечный разрыв. Хоминг-эндонуклеазы обладают высокой специфичностью, распознавая сайты ДНК-мишени длиной от 12 до 45 пар оснований (bp), как правило, длиной от 14 до 40 пар оснований. Хоминг-эндонуклеаза, предлагаемая в изобретении, может соответствовать, например, эндонуклеазе LAGLIDADG, эндонуклеазе HNH или эндонуклеазе GIY-YIG. Предпочтительно хомингэндонуклеаза, предлагаемая в настоящем изобретении, может представлять собой вариант I-CreI.
Под вектором для доставки или векторами для доставки понимают любой доставляющий вектор, который можно применять согласно настоящему изобретению для приведения в контакт с клеткой (т.е. для контактирования) или доставки внутрь клетки или в субклеточные компартменты (т.е. для интродукции) агентов/химических веществ и молекул (белков или нуклеиновых кислот), требующихся для осуществления настоящего изобретения. К ним относятся (но не ограничиваясь только ими) липосомальные векторы для доставки, вирусные векторы для доставки, векторы для доставки лекарственного средства, химические носители, полимерные носители, липоплексы, полиплексы, дендримеры, микропузырьки (ультразвуковые контрастные агенты), наночастицы, эмульсии или другие пригодные векторы для переноса. Такие векторы для доставки позволяют доставлять молекулы, химические вещества, макромолекулы (гены, белки) или другие векторы, такие как плазмиды, пептиды, разработанные фирмой Diatos. В этих случаях векторы для доставки представляют собой молекулы-носители. Под вектором для доставки или векторами для доставки понимают также методы доставки, предназначенные для осуществления трансфекции.
Понятия вектор или векторы относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, обладающей способностью транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она сцеплена. К векторам, применяемым согласно настоящему изобретению, относятся (но не ограничиваясь только ими) вирусный вектор, плазмида, РНКовый вектор или молекула линейной или кольцевой ДНК или РНК, которые могут состоять из хромосомальных, нехромосомальных, полусинтетических или синтетических нуклеиновых кислот. Предпочтительными векторами являются векторы, которые способны автономно реплицировать (эписомальный вектор) и/или экспрессировать нуклеиновые кислоты, с которыми они сцеплены (экспрессионные векторы). Специалистам в данной области известно большое количество пригодных векторов, которые поступают в продажу.
К вирусным векторам относятся ретровирус, аденовирус, парвовирус (например, аденоассоциированный вирусы), коронавирус, РНК-вирусы с негативной цепью, такие как ортомиксовирус (например, вирус гриппа), рабдовирус (например, вирус бешенства и вирус везикулярного стоматита), парамиксовирус (например, вирус кори и вирус Сендай), РНК-вирусы с позитивной цепью, такие как пикорнавирус и альфавирус, и вирусы с двухцепочечной ДНК, включая аденовирус, вирус герпеса (например, вирус герпеса простого типов 1 и 2, вирус Эпшейна-Барра, цитомегаловирус) и вирус оспы (например, вирус коровьей оспы, вирус оспы птиц и вирус оспы канарейки). Другие вирусы включают, например, вирус Норвалк, тогавирус, флавивирус, реовирусы, паповирус, гепаднавирус и вирус гепатита. Примерами ретровирусов являются вирус птичьего лейкоза-саркомы, вирусы млекопитающих С-типа, В-типа, вирусы Dтипа, группа HTLV-BLV, лентивирус, спумавирус (Coffin J. ML, Retroviridae: The viruses and their replication, в Fundamental Virology, 3-е изд., под ред. B.N. Fields и др., изд-во Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
Под лентивирусным вектором подразумевают лентивирусные векторы на основе ВИЧ, которые являются очень перспективными с точки зрения доставки гена благодаря их относительно большой способности к упаковке, пониженной иммуногенности и их способности стабильно трансдуцировать с высокой эффективностью большой спектр различных типов клеток. Лентивирусные векторы, как правило, создают посредством кратковременной трансфекции клеток-продуцентов тремя (упаковывающая плазмида, оболочечная плазмида и плазмида переноса) или большим количеством плазмид. Подобно ВИЧ, лентивирусные векторы проникают в клетку-мишень посредством взаимодействия гликопротеинов вирусной поверхности с рецепторами на клеточной поверхности. После проникновения вирусная РНК подвергается обратной транскрипции, опосредуемой комплексом вирусной обратной транскриптазы. Продуктом обратной транскрипции является двухцепочечная линейная вирусная ДНК, которая служит субстратом для вирусной интеграции в ДНК инфицированных клеток. Понятие интегрирующие лентивирусные векторы (или LV) обозначает, например (но не ограничиваясь только ими), такие векторы, которые способны интегрироваться в геном клетки-мишени. В противоположность этому понятие неинтегрирующие лентивирусные векторы (или NILV) обозначает эффективные векторы для доставки генов, которые не интегрируются в геном клетки-мишени под действием вирусной интегразы.
Векторы для доставки и векторы можно объединять или комбинировать с любыми методами клеточной пермеабилизации, такими как сонопорация или электропорация, или вариантами этих методов.
Под клеткой или клетками подразумевают любые эукариотические живые клетки, первичные клетки и клеточные линии, выведенные из указанных организмов для получения культур in vitro.
- 12 036200
Под первичной клеткой или первичными клетками подразумевают клетки, взятые непосредственно из живой ткани (т.е. материал, полученный путем биопсии) и подготовленные для выращивания in vitro, в популяции которых имело место лишь небольшое количество удвоений и следовательно они являются более репрезентативными с точки зрения основных функциональных компонентов и характеристик тканей, из которых они выведены, по сравнению с непрерывно поддерживаемыми или искусственно иммортализованными онкогенными клеточными линиями.
Примерами таких клеточных линий могут являться (но не ограничиваясь только ими) клеточные линии, выбранные из группы, состоящей из клеток линии CHO-K1; клеток линии HEK293; клеток линии Caco2; клеток линии U2-OS; клеток линии NIH 3T3; клеток линии NSO; клеток линии SP2; клеток линии CHO-S; клеток линии DG44; клеток линии K-562, клеток линии U-937; клеток линии MRC5; клеток линии IMR90; клеток линии Jurkat; клеток линии HepG2; клеток линии HeLa; клеток линии НТ-1080; клеток линии НСТ-116; клеток линии Hu-h7; клеток линии Huvec; клеток линии Molt 4.
Все эти клеточные линии можно модифицировать с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении, создавая модели клеточных линий для получения, экспрессии, количественной оценки, обнаружения, изучения представляющего интерес гена или белка; эти модели можно применять также скрининга представляющих интерес биологически активных молекул для исследовательских и промышленных целей в различных областях, например, таких как (но не ограничиваясь только ими) химия, биотопливо, терапевтические средства и агрономия.
Под мутацией подразумевают замену, делецию или инсерцию одного/одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати, пятнадцати, двадцати, двадцати пяти, тридцати, сорока, пятидесяти или большего количества нуклеотидов/аминокислот в полинуклеотидной (кДНК, ген) или полипептидной последовательности. Мутация может влиять на кодирующую последовательность гена или его регуляторную последовательность. Она может влиять также на структуру геномной последовательности или структуру/стабильность кодируемой мРНК.
Под вариантом(ами) подразумевают вариант повтора, вариант, ДНК-связывающий вариант, вариант TALE-нуклеазы, вариант полипептида, полученный в результате мутации или замены по меньшей мере одного остатка в аминокислотной последовательности родительской молекулы.
Под функциональным вариантом подразумевают обладающий каталитической активностью мутант белка или домена белка; такой мутант может обладать такой же активностью, что и родительский белок или домен белка, или дополнительными свойствами, или более высокой или более низкой активностью.
Понятие идентичность относится к идентичности последовательностей двух молекул нуклеиновых кислот или полипептидов. Идентичность можно оценивать путем сравнения положений в каждой из последовательностей, которые можно выравнивать для целей сравнения. Если положение в сравниваемой последовательности занято тем же самым основанием, то молекулы являются идентичными в этом положении. Степень сходства или идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями является функцией количества идентичных или совпадающих нуклеотидов в положениях нуклеотидных последовательностей. Для расчета идентичности двух последовательностей можно использовать различные алгоритмы и/или программы сравнительного анализа первичной структуры последовательностей, включая FASTA или BLAST, которые доступны в виде компонента пакета программ анализа последовательностей GCG (Университет Висконсина, Мэдисон, шт. Висконсин), и их можно применять, например, с использованием задаваемых по умолчанию параметров. Например, можно рассматривать полипептиды, обладающие идентичностью, составляющей по меньшей мере 70, 85, 90, 95, 98 или 99%, с конкретными полипептидами, представленными в настоящем описании, и предпочтительно обладающие практически такими же функциями, а также полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды.
Понятие сходство характеризует степень родства между аминокислотными последовательностями двух или большего количества полипептидов. BLASTP можно применять также для идентификации аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 87,5, 90, 92,5, 95, 97,5, 98, 99% аминокислотной референс-последовательности, с использованием матриц сходства, таких как BLOSUM45, BLOSUM62 или BLOSUM80. Если специально не указано иное, то указанные в описании баллы сходства получены с использованием BLOSUM62. При использовании BLASTP процент сходства основан на рассчитанном программой BLASTP балле положительных оценок, а процент идентичности последовательностей основан на рассчитанном BLASTP балле идентичности. Рассчитанные с помощью BLASTP идентичности представляют собой количество и пропорцию идентичных остатков относительно общего количества остатков в парах последовательностей с высокими баллами; а рассчитанные с помощью BLASTP положительные оценки представляют собой количество и пропорцию остатков, для которых полученные при сравнительном анализе первичной структуры последовательностей баллы, являются положительными, и которые сходны друг с другом. В настоящей заявке предложены и подпадают под объем изобретения аминокислотные последовательности, имеющие указанные степени идентичности или сходства или любую промежуточную степень идентичности или сходства с представ- 13 036200 ленными в настоящем описании аминокислотными последовательностями. Полинуклеотидные последовательности сходных полипептидов выводят с использованием генетического кода и их можно получать с помощью общепринятых методов. Полинуклеотид, кодирующий такой функциональный вариант, можно получать путем обратной трансляции его аминокислотной последовательности с использованием генетического кода.
Понятия домен трансдукции сигнала или костимуляторный лиганд относятся к молекуле на антигенпрезентирующей клетке, которая специфически связывается с когнатной костимуляторной молекулой на Т-клетке, обеспечивая тем самым сигнал, который в дополнение к первичному сигналу, обеспечиваемому, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, загруженной пептидом, опосредует Т-клеточный ответ, включая (но не ограничиваясь только ими) активацию пролиферации, дифференцировку и т.п. Костимуляторным лигандом могут служить (но не ограничиваясь только ими) CD7, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцибельный костимуляторный лиганд (ICOS-L), молекула межклеточной адгезии (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, рецептор лимфотоксина бета, 3/TR6, ILT3, ILT4, агонист или антитело, который/которое связывается с лигандом Толл-рецептора, и лиганд, который специфически связывается с В7-И3. Костимуляторный лиганд включает также, среди прочего, антитело, которое специфически связывается с костимуляторной молекулой, присутствующей на Т-клетке, такой как (но не ограничиваясь только ими) CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, ассоциированный с функцией лимфоцитов антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, В7-И3, лиганд, который специфически связывается с CD83.
Понятие костимуляторная молекула относится к когнатному связывающему партнеру на Тклетке, который специфически связывается с костимуляторным лигандом, опосредуя тем самым костимуляторный ответ клетки, такой как (но не ограничиваясь только им) пролиферация. Костимуляторные молекулы включают (но не ограничиваясь только ими) молекулу ГКГС класса I, BTLA и лиганд Толлрецептора.
В контексте настоящего описания понятие костимуляторный сигнал относится к сигналу, который в сочетании с первичным сигналом, таким как сигнал, обусловленный сцеплением TCR/CD3, приводит к пролиферации Т-клеток и/или повышающей или понижающей регуляции имеющих решающее значение молекул.
В контексте настоящего описания понятие внеклеточный лигандсвязывающий домен обозначает олиго- или полипептид, который обладает способностью связываться с лигандом. Предпочтительно домен должен обладать способностью взаимодействовать с молекулой клеточной поверхности. Например, можно выбирать внеклеточный лигандсвязывающий домен для распознавания лиганда, который функционирует в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированных с конкретным болезненным состоянием. Так, примерами маркеров клеточной поверхности, которые могут функционировать в качестве лигандов, являются маркеры, ассоциированные с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, аутоиммунным заболеванием и раковыми клетками.
В контексте настоящего описания понятие индивидуум или пациент включает всех представителей царства животных, в том числе приматов кроме человека и человека.
В представленном выше описании изобретения изложены подход и способ его осуществления и применения, так что любой специалист в данной области способен осуществлять и применять его, эта возможность относится, прежде всего, к сущности изобретения, изложенной в прилагаемой формуле изобретения, которая представляет собой составную часть исходного описания.
Если в настоящем описании указаны численные пределы или численный диапазон, то они включают их границы. Кроме того, считается, что включены все значения и поддиапазоны, находящиеся в указанных пределах или указанном численном диапазоне, как если бы они были специально указаны.
Приведенное выше описание представлено для того, чтобы дать возможность специалисту в данной области осуществлять и применять изобретение, и оно изложено в контексте конкретного применения и требуемых для этого условий. Специалистам в данной области должны быть очевидны различные модификации предпочтительных вариантов осуществления изобретения, и общие принципы, указанные в нем могут быть применены для других вариантов осуществления изобретения и применений без отклонения от сущности и объема изобретения. Таким образом, не следует считать, что настоящее изобретение ограничено представленными вариантами осуществления изобретения, напротив, оно соответствует наиболее широкому объему, согласующемуся с принципами и отличительными признаками, указанными в настоящем описании.
Имея общее описание настоящего изобретения, можно достичь более полного понимания после ознакомления с некоторыми конкретными примерами, которые представлены в настоящем описании только для целей иллюстрации и не направлены на ограничение объема, если специально не указано иное.
Примеры
Пример 1. Пролиферация клеток с инактивированным TCR-α экспрессирующих 4G7-CAR.
Конструировали и создавали гетеродимерную TALE-нуклеазу, нацеленную на две последовательности длиной 17 пар оснований (которые обозначали как полумишени), разделенные состоящим из 15
- 14 036200 пар оснований спейсером в гене константной области α-цепи Т-клеточного рецептора (TRAC). Каждая из полумишеней распознавалась повторами половин TALE-нуклеаз, представленными в таблице. .
Мишень Последовательностьмишень Последовательность повторов Половина TALEнуклеазы
TRACT01 TTGTCCCACAGATATCC Agaaccctgaccctg CCGTGTACCAGCTGAGA (SEQ ID NO: 20) повтор TRAC T01-L (SEQ ID NO: 21) TRAC T01-L TALEN (SEQ ID NO: 23)
повтор TRAC T01-R (SEQ ID NO: 22) TRAC T01-R TALEN (SEQ ID NO: 24)
Каждую конструкцию TALE-нуклеазы субклонировали с использованием расщепления рестриктазами в экспрессионном зекторе млекопитающих под контролем промотора Т7. мРНК, кодирующую TALE-нуклеазу, которая расщепляла геномную последовательность TRAC, синтезировали с использованием плазмиды, несущей кодирующую последовательность, расположенную в прямом направлении относительно промотора Т7.
Очищенные Т-клетки, предварительно активированные в течение 72 ч покрытыми антителом к CD3/CD28 гранулами, трансфектировали каждой из 2 мРНК, кодирующих обе половины TRAC T01 TALE-нуклеаз. Через 48 ч после трансфекции Т-клетки трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим 4G7-CAR (SEQ ID NO: 14). Через 2 для после трансдукции CD3NEG-клетки очищали с использованием покрытых антителом к CD3 магнитных гранул и через 5 дней после трансдукции клетки реактивировали растворимым антителом к CD28 (5 мкг/мл).
Мониторинг клеточной пролиферации осуществляли в течение периода времени вплоть до 30 дней после реактивации, подсчитывая количество клеток 2 раза в неделю. На фиг. 1 представлена кратность индукции в виде отношения количества клеток к количеству клеток, присутствовавших в день 2 после реактивации, для двух различных доноров. Обнаружено увеличение пролиферации клеток с инактивированным TCR-α, экспрессирующих 4G7-CAR, прежде всего в том случае, когда их реактивировали антителом к CD28, по сравнению с нетрансдуцированными клетками.
Для изучения вопроса о том, находятся ли человеческие Т-клетки, экспрессирующие 4G7-CAR, в активированном состоянии, анализировали экспрессию маркера активации CD25 с помощью FACS через 7 дней после трансдукции. Как проиллюстрировано на фиг. 2, очищенные клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, кодирующим 4G7-CAR, экспрессировали значительно в большем количестве CD25 на своей поверхности, чем нетрансдуцированные клетки. Повышенный уровень экспрессии CD25 обнаружен как в условиях после реактивации антителом к CD28, так и в условиях без реактивации.
Пример 2. Сравнение исходной активации первичных человеческих Т-клеток, экспрессирующих 4G7-CAR и классический FMC63-CAR.
Для определения того, обеспечивает ли scFv 4G7 пролонгированное активированное состояние трансдуцированной клетки, сравнивали исходную активацию Т-клетки, трансдуцированной CAR, который нес scFv 4G7 (SEQ ID NO: 17, кодируемая SEQ ID NO: 15) или классический scFv FMC63 (SEQ ID NO: 16).
Очищенные человеческие Т-клетки трансдуцировали согласно представленному ниже протоколу: в целом он состоял в следующем: 1 х 106 CD3+-клеток, предварительно активированных в течение 3 дней с использованием покрытых антителом к CD3/CD28 гранул и рекомбинантным IL2, трансдуцировали лентивирусными векторами, кодирующими 4G7-CAR (SEQ ID NO: 15) и FMC63-CAR (SEQ ID NO: 16), с величиной MOI, равной 5, в 12-луночных не предназначенных для культур ткани планшетах, сенсибилизированных 30 мкг/мл ретронектина. Через 24 ч после трансдукции среду удаляли и заменяли свежей средой. После этого клетки поддерживали в концентрации 1х106 клеток/мл в течение периода культивирования, осуществляя подсчет клеток каждые 2-3 дня.
Через 3, 8 и 15 дней после трансдукции лентивирусным вектором, кодирующим либо 4G7-CAR, либо FMC63-CAR, оценивали процент экспрессирующих CAR клеток с помощью проточной цитометрии. Установлено, что эффективность трансдукции была примерно эквивалентна эффективности трансдукции двумя лентивирусными векторами, что продемонстрировано на фиг. 3.
Затем проводили изучение того, характеризуются ли человеческие Т-клетки, экспрессирующие 4G7-CAR, более активированным состоянием, чем человеческие Т-клетки, экспрессирующие FMC63CAR. Для этого сравнивали экспрессию маркера активации CD25 на поверхности Т-клеток, трансдуцированных 2 лентивирусными векторами, в различные моменты времени. Как продемонстрировано на фиг. 4, через 3 и 8 дней после трансдукции уровень экспрессии CD25 на поверхности клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором, кодирующим 4G7-CAR, был значительно выше, чем на поверхности клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором, кодирующим FMC63-CAR.
Размер клеток, трансдуцированных 4G7-CAR или FMC63-CAR, оценивали также с помощью проточной цитометрии в различные моменты времени. Установлено, что через 3, 8 и 15 дней после трансдукции клетки, экспрессирующие 4G7-CAR, имели больший размер, чем клетки, экспрессирующие FMC63-CAR, см. фиг. 5.
После неспецифической активации in vitro трансдуцированные 4G7-CAR клетки имели больший размер (образование бластов), а также уровень экспрессии маркеров активации (CD25) в течение более
- 15 036200 продолжительного периода времени. Такая более продолжительная активация позволяет обеспечивать более продолжительную пролиферацию по сравнению с клетками, трансдуцированными сходным CAR, содержащим FMC63 ScFv.
Пример 3. Сравнение пролиферации первичных человеческих Т-клеток, экспрессирующих 4G7CAR и классический FMC63-CAR.
Для определения того, обеспечивает ли scFv 4G7 более высокую пролиферирующую активность, оценивали пролиферацию Т-клеток, трансдуцированных CAR, несущим scFv 4G7 (SEQ ID NO: 17 кодируемая SEQ ID NO: 15) или классический scFv FMC63 (SEQ ID NO: 16), в течение периода времени вплоть до 20 дней, осуществляя подсчет количества клеток два раза в неделю. Очищенные человеческие Т-клетки трансдуцировали согласно представленному ниже протоколу, в целом он состоял в следующем: 1x106 CD3+-клеток, предварительно активированных в течение 3 дней с использованием покрытых антителом к CD3/CD28 гранул и рекомбинантным IL2, трансдуцировали лентивирусными векторами, кодирующими 4G7-CAR (SEQ ID NO: 15) и FMC63-CAR (SEQ ID NO: 16). После этого клетки поддерживали в классических условиях и реактивировали в день 12. Клетки высевали с одинаковой плотностью и подсчитывали их количество два раза в неделю в течение 20 дней. Как проиллюстрировано на фиг. 6, пролиферирующая активность Т-клеток, экспрессирующих 4G7-CAR, была в два раза выше, чем активность клеток, экспрессирующих классический FMC63-CAR.
Ссылки.
Arimondo Р. В., С. J. Thomas и др., Exploring the cellular activity of camptothecin-triple-helix-forming oligonucleotide conjugates, Mol Cell Biol 26(1),
2006, cc. 324-333;
Atkins J. F., Ν. M. Wills и др., A case for StopGo: reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go), Rna 13(6), 2007, cc. 803-810;
Bierer В. E., G. Hollander и др., Cyclosporin A and FK506: molecular mechanisms of immunosuppression and probes for transplantation biology, Curr
Opin Immunol 5(5), 1993), cc. 763-773%;
Boch J., H. Scholze и др., Breaking the code of DNA binding specificity of
TAL-type III effectors, Science 326(5959), 2009, cc. 1509-1512;
Choulika A., A. Perrin и др., Induction of homologous recombination in mammalian chromosomes by using the I-Scel system of Saccharomyces cerevisiae, Mol Cell Biol 15(4), 1995, cc. 1968-1973;
Christian Μ., T. Cermak и др., Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases, Genetics 186(2), 2010, cc. 757-761;
Cong L., F. A. Ran и др., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems, Science 339(6121), 2013, cc. 819-823;
Deltcheva E., K. Chylinski и др., CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RN A and host factor RNase III, Nature 471(7340), 2011, cc. 602-607;
Donnelly M. и G. Elliott, Nuclear localization and shuttling of herpes simplex virus tegument protein VP13/14, J Virol 75(6), 2001, cc. 2566-2574;
Doronina V. A., C. Wu и др., Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon, Mol Cell Biol 28(13), 2008, cc. 4227-4239;
Eisenschmidt К., T. Lanio и др., Developing a programmed restriction endonuclease for highly specific DNA cleavage, Nucleic Acids Res 33(22), 2005, cc.
7039-7047;
Garneau J. E., Μ. E. Dupuis и др., The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA, Nature 468(7320), 2010, cc. 67-71;
- 16 036200
Gasiunas G., R. Barrangou и др., Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria, Proc Natl Acad Sci U S A 109(39), 2012, cc. E2579-2586;
Henderson D. J., I. Naya и др., Comparison of the effects of FK-506, cyclosporin A and rapamycin on IL-2 production, Immunology 73(3), 1991, cc. 316321;
Jena B., G. Dotti и др., Redirecting T-cell specificity by introducing a tumorspecific chimeric antigen receptor , Blood 116(7), 2010), cc. 1035-1044;
Jinek Μ., K. Chylinski и др., A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity, Science 337(6096), 2012, cc. 816-821;
Kalish J. M. и P. M. Glazer, Targeted genome modification via triple helix formation, Ann Ν Y Acad Sci 1058, 2005, cc. 151-161;
Li T., S. Huang и др., TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain, Nucleic Acids Res 39(1), 2011, cc. 359-372;
Liu J., M. W. Albers и др., Inhibition of T cell signaling by immunophilinligand complexes correlates with loss of calcineurin phosphatase activity, Biochemistry 31(16), 1992, cc. 3896-3901.
Mali P., L. Yang и др., RNA-guided human genome engineering via Cas9, Science 339(6121), 2013, cc. 823-826;
Moscou M. J. и A. J. Bogdanove, A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors, Science 326(5959), 2009, c. 1501;
Paques F. и P. Duchateau, Meganucleases and DNA double-strand breakinduced recombination: perspectives for gene therapy, Curr Gene Ther 7(1), 2007, cc. 49-66;
Park T. S., S. A. Rosenberg и др., Treating cancer with genetically engineered T cells, Trends Biotechnol 29(11), 2011, cc. 550-557;
Peipp M., D. Saul и др., Efficient eukaryotic expression of fluorescent scFv fusion proteins directed against CD antigens for FACS applications, J Immunol Methods 285(2), 2004, cc. 265-280;
Perrin A., M. Buckle и др., Asymmetrical recognition and activity of the I-Scel endonuclease on its site and on intron-exon junctions, Embo J 12(7), 1993, cc. 29392947;
Pingoud А. и G. H. Silva, Precision genome surgery, Nat Biotechnol 25(7), 2007, cc. 743-744;
Porteus Μ. H. и D. Carroll, Gene targeting using zinc finger nucleases, Nat Biotechnol 23(8), 2005, cc. 967-973;
Rouet P., F. Smih и др., Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease, Mol Cell Biol 14(12), 1994, cc 8096-8106;
Soiek R., С. M. Lawrence и др., CRISPR-mediated Adaptive Immune Systems in Bacteria and Archaea, Annu Rei/ Biochem. 2013;
Stoddard B. L., Homing endonuclease structure and function, Q Rev Biophys 38(1), 2005, cc. 49-95.
- 17 036200
Перечень последовательностей <110> СЕЛЛЕКТИС <120> CD19-СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ <130> Р81403460РСТО0 <150> PCT/US2013/040755 <151> 2С13-05-13 <150> PCT/US2013/040766 <151> 2013-05-13 <150> US 13/892,805 <151> 2С13-05-13 <150> USP 61/888,259 <151> 2013-10-08 <160> 24 <170> Patentin, версия 3.5 <210> 1 <211> 464 <212> PRT <213> mus musculus <220>
<223> иммуноглобулиновая тяжелая цепь гамма 1 античеловеческого моноклонального антитела к CD19 4G7 <400>1
Met Glu Trp Ser Trp lie Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 1015
Vai His Ser Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu lie Lys
2530
Pro Gly Ala Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
4045
Thr Ser Tyr Vai Met His Trp Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu
5560
Glu Trp He Gly Tyr He Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn
- 18 036200
70 7580
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Азр Lys Ser Ser Ser
9095
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser GLu Asp Ser Ala Vai
100 105110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Aref Vai Phe Asp
115 120125
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser Ala Lys Thr Thr
130 135140
Pro Pro Ser Vai Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn
145 150 155160
Ser Met Vai Thr Leu Gly Cys Leu Vai Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170175
Vai Thr Vai Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Vai His Thr
180 185190
Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Vai
195 200205
Thr Vai Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Vai Thr Cys Asn Vai
210 215220
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Vai Asp Lys Lys lie Vai Pro Arg
225 230 235240
Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys lie Cys Thr Vai Pro Glu Vai Ser Ser
245 250255
Vai Phe lie Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Vai Leu Thr lie Thr Leu
260 265270
Thr Pro Lys Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp lie Ser Lys Asp Asp Pro
- 19 036200
275 280285
Glu Vai Gin Phe Ser Trp Phe Vai Asp Asp Vai Glu Vai His Thr Ala
290 295300
Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Vai
305 310 315320
Ser Glu Leu Pro lie Met His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe
325 330335
Lys Cys Arg Vai Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr
340 345350 lie Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gin Vai Tyr Thr He
355 360365
Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Ala Lys Asp Lys Vai Ser Leu Thr Cys
370 375380
Met He Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp He Thr Vai Glu Trp Gin Trp
385 390 395400
Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gin Pro He Met Asp
405 410415
Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Vai Tyr Ser Lys Leu Asn Vai Gin Lys Ser
420 425430
Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Vai Leu His Glu Gly
435 440445
Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455460 <210> 2 <211>239 <212> PRT <213> mus musculus <220>
<223> иммуноглобулиновая легкая цепь каппа античеловеческого моноклонального антитела к CD19 4G7 <400>2
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Vai Leu Trp lie Pro
1015
Gly Ala lie Gly Asp lie Vai Met Thr Gin Ala Ala Pro Ser He Pro 20 2530
Vai Thr Pro Gly Glu Ser Vai Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 4045
Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg 50 5560
Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu He Tyr Arg Met Ser Asn LeuAla
70 7580
Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr AlaPhe
9095
Thr Leu Arg He Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai GLy Vai Tyr Tyr 100 105110
Cys Met Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 115 120125
Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Vai Ser He Phe Pro 130 135140
Pro Ser Ser Glu Gin Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Vai Vai CysPhe
145 150 155160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp He Asn Vai Lys Trp Lys HeAsp
165 170175
Gly Ser Glu Arg Gin Asn Gly Vai Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gin Asp
180 185190
- 21 036200
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys
195 200205
Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys
210 215220
Thr Ser Thr Ser Pro lie Vai Lys Ser Phe Asn Atxf Asn Glu Cys
225 230235 <210>3 <211>121 <212> PRT <213> mus musculus <220>
<223> фрагмент иммуноглобулиновой тяжелой цепи гамма 1 античеловеческого моноклонального антитела к CD19 4G7 (остатки 20-140) <400> 3
Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu He Lys Pro Gly Ala
1015
Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
2530
Vai Met His Trp Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He
4045
Gly Tyr He Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
5560
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Veil Tyr Tyr Cys
9095
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105110
- 22 036200
Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser
115 120 <210> 4 <211> 115 <212:> PRT <213> mus musculus <220>
<223> фрагмент иммуноглобулиновой легкой цепи каппа античеловеческого моноклонального антитела к CD19 4G7 (остатки 21-130) <400>4
Asp Не Vai Met Thr Gin Ala Ala Pro Ser He Pro Vai Thr Pro Gly
1015
Glu Ser Vai Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 2530
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 4045
Pro Gin Leu Leu He Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 5560
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu ArgHe
70 7580
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met GinHis
9095
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105110
Arg Ala Asp 115 <210>5 <211> 116 <212> PRT
- 23 036200 <213> искусственная последовательность <220>
<223> фрагмент иммуноглобулиновой легкой цепи каппа античеловеческого моноклонального антитела к CD19 4G7 <400>5
Asp Не Vai Met Thr Gin Ala Ala Pro Ser He Pro Vai Thr Pro Gly 15 1015
Glu Ser Vai Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 2530
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 4045
Pro Gin Leu Leu He Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 5560
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu ArgHe
70 7580
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met GinHis
9095
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105110
Arg Ser Asp Pro 115 <210>6 <211>15 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственная последовательнссть: синтетический олигопептид <220>
<223> линкер <400> б
- 24 036200
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 1015 <210>7 <211>252 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<223> scFV 4G7, версия 1 <400> 7
Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu lie Lys Pro Gly Ala 15 1015
Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 2530
Vai Met His Trp Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 4045
Gly Tyr He Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 5560
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr AlaTyr
70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr TyrCys
9095
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105110
Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Vai Met Thr Gin Ala Ala 130 135140
Pro Ser He Pro Vai Thr Pro Gly Glu Ser Vai Ser He Ser Cys Arg
145 150 155160
Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp
165 170175
Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu He Tyr Arg Met
180 185190
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200205
Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg He Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai
210 215220
Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly
225 230 235240
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro
245250 <210>8 <211>251 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<223> scFV 4G7, версия 2 <400> 8
Glu 1 Vai Gin Leu Gin 5 Gin Ser Gly Pro Glu 10 Leu He Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Vai Met His Trp Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He
- 26 036200
Gly Туг lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
5560
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys
9095
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105110
Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Vai Met Thr Gin Ala Ala
130 135KO
Pro Ser lie Pro Vai Thr Pro Gly Glu Ser Vai Ser lie Ser Cys Arg
145 150 155160
Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser
165
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp
170 175
Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser
180
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Arg Met
185 190
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro
195 200
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
205
Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg lie
210 215
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai
220
Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His
225 230
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly
235 240
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
Arg Ala Asp
- 27 036200
245250 <210>9 <211>250 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<223> SCFV FMC63 <400>9
Asp Не Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Alai Ser Leu Gly 15 1015
Asp Arg Vai Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp He Ser Lys Tyr 20 2530
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Vai Lys Leu Leu He 35 4045
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 5560
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr He Ser Asn Leu GluGin
70 7580
Glu Asp He Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn Thi: Leu ProTyr
9095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Thr Lys Ala Gly Gly Gly 100 105110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120125
Ser Glu Vai Lys Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Ala Pro Ser 130 135140
- 28 036200
Gin Ser Leu Ser Vai Thr Cys Thr Vai Ser Gly Vai Ser Leu Pro Asp
145 150 155160
Tyr Gly Vai Ser Trp He Arg Gin Pro Pro Arg Lys Gly Leu GluTrp
165 170175
Leu Gly Vai He Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu 180 185190
Lys Ser Arg Leu Thr He He Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Vai Phe 195 200205
Leu Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys 210 215220
Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 225 230 235240
Gin Gly Thr Ser Vai Thr Vai Ser Ser Asp 245250 <210>10 <211>112 <212> PRT <213> homo sapiens <220>
<223> фрагмент зета-цепи гликопротеина CD3 Т-клеточной поверхности <400>10
Arg Vai Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gin Gin Gly 15 1015
Gin Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 2530
Asp Vai Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 4045
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gin Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gin Lys 50 5560
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu lie Gly Met Lys Gly Glu Arg
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin Gly Leu Ser Thr Ala
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gin Ala Leu Pro Pro Arg
100
105
110 <210> 11 <211> 42 <212> PRT <213> homo sapiens <220>
<223> фрагмент 4-1BB (остатки 214-255) <400>11
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr lie Phe Lys Gin Pro Phe Met 15 1015
Arg Pro Vai Gin Thr Thr Gin Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu <210>12 <211>41 <212> PRT <213> homo sapiens <220>
<223> фрагмент специфического в отношении Т-клетки поверхностного гликопротеина CD28 <400> 12
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
- 30 036200
1015
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gin Pro Tyr Ala Pro 20 2530
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 3540 <210>13 <211>69 <212> PRT <213> homo sapiens <220>
<223> фрагмент предшественника изоформы 1 альфа-цепи поверхностного гликопротеина CD8, специфического в отношении Т-клетки (остатки 138-206) <400>13
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pre Thr He Ala 15 1015
Ser Gin Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 2530
Gly Ala Vai His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp He Tyr He 35 4045
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Vai Leu Leu Leu Ser Leu Vai 50 5560
He Thr Leu Tyr Cys 65 <210>14 <211> 495 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
- 31 036200 <223> 4G7-CAR, версия 1 <400>14
Met Ala Leu Pro Vai Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1015
His Ala Ala Arg Pro Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu
2530 lie Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 4045
Thr Phe Thr Ser Tyr Vai Met His Trp Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin
5560
Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys 65 70 7580
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser
9095
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105110
Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai
115 120125
Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser Gly Gly
130 135140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Vai
145 150 155160
Met Thr Gin Ala Ala Pro Ser He Pro Vai Thr Pro Gly Glu Ser Vai
165 170175
Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn
180 185190
Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu
- 32 036200
195 200
205
Leu He Туг Arg Met Ser Asn Leu
210 215
Ala Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe
2 0
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala
225 230
Phe Thr Leu Arg He Ser Arg Vai
235 240
Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr
245
Tyr Cys Met Gin His Leu Glu Tyr
250 255
Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr
260
Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp
265 270
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
275 280
Pro Thr Pro Ala Pre Thr He Ala
285
Ser Gin Pro Leu Ser Leu Arg Pro
290 295
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
300
Gly Ala Vai His Thr Arg Gly Leu
305 310
Asp Phe Ala Cys Asp He Tyr He
315 320
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
325
Gly Vai Leu Leu Leu Ser Leu Vai
330 335
He Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
340
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr He Phe
345 350
Lys Gin Pro Phe Met Arg Pro Vai
355 360
Gin Thr Thr Gin Glu Glu Asp Gly
65
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
370 375
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
380
Vai Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
385 390
Ala Pro Ala Tyr Gin Gin Gly Gin
395 400
Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
- 33 036200
Thr
Thr
275
Pro
Ala
Pro
Arg
Pro
280
Pro
Thr
Pro
Ai. a
Pro
285
Thr
He
Ala
Ser Gin Pro Leu Ser Leu Arg Pro
290 295
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
300
Gly Ala Vai His Thr Ατς( Gly Leu
305 310
Asp Phe Ala Cys Asp He Tyr He
315 320
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
325
Gly Vai Leu Leu Leu Ser Leu Vai
330 335
He Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
340
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr He Phe
345 350
Lys Gin Pro Phe Met Aref Pro Vai
355 360
Gin Thr Thr Gin Glu Glu Asp Gly
65
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
370 375
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
8 0
Vai Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
385 390
Ala Pro Ala Tyr Gin Gin Gly Gin
395 400
Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
405
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
410 415
Vai Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
420
Asp Pro Glu Met. Gly Gly Lys Pro
425 430
Arg Arg Lys Asn Pro Gin Glu Gly
435 440
Leu Tyr Asn Glu Leu Gin Lys Asp
445
- 36 036200
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gin Ala Leu Pro Pro Arg 485 490495 <210>16 <211>494 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<223> FMC63-CAR <400>16
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Vai Pro 15 1015
Gly Ser Thr Gly Asp He Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 2530
Ala Ser Leu Gly Asp Arc; Vai Thr He Ser Cys Arg Alai Ser Gin Asp 35 4045
He Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Vai 50 5560
Lys Leu Leu He Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Vai ProSer
70 7580
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr HeSer
9095
Asn Leu Glu Gin Glu Asp He Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn 100 105HO
Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Thr Lys 115 120125
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135140
- 37 036200
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Vai Lys
145 150
Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu
155 160
Vai Ala Pro Ser Gin Ser Leu Ser
165
Vai Thr Cys Thr Vai Ser Gly Vai
170 175
Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Vai Ser
180
Trp He Arg Gin Pro Pro Arg Lys
185 190
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Vai He
195 200
Trp Gly Ser Glu Thr- Thr Tyr Tyr
205
Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
210 215
Thr He He Lys Asp Asn Ser Lys
20
Ser Gin Vai Phe Leu Lys Met Asn
225 230
Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala
235 240
He Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
245
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met
250 255
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser
260
Vai Thr Vai Ser Ser Asp Pro Thr
265 270
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
275 280
Thr Pro Ala Pro Thr He Ala Ser
285
Gin Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
290 295
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
300
Ala Vai His Thr Arg Gly Leu Asp
305 310
Phe Ala Cys Asp He Tyr He Trp
315 320
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
325
Vai Leu Leu Leu Ser Leu Vai He
330 335
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
340
Lys Lys Leu Leu Tyr He Phe Lys
345 350
Gin Pro Phe Met Arg Pro Vai Gin Thr Thr Gin Glu Glu Asp Gly Cys
355 360365
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Vai
370 375380
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gin Gin Gly Gin Asn
385 390 395400
Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Vai
405 410415
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
420 425430
Arg Lys Asn Pro Gin Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gin Lys Asp Lys
435 440445
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu He Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
450 455460
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
465 470 475480
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gin Ala Leu Pro Pro Arg
485490 <210>17 <211>1488 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220>
<223> 4G7-CAR, версия 2 <400> L7 atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt cggtgccagg cagcaccggc 60
- 39 036200 gaggtgcagc tgcagcagag cggacccgag ctgatcaagc ca.ggcgccag cgtgaagatg120 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacgtga tcrcactgggt gaagcagaag180 ccaggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccct acaacgacgg caccaagtac240 aacgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accagcgaca agagcagcag caccgcctac300 atggagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagaggcacc360 tactactacg gcagccgggt gttcgactac tggggccagg gcaccaccct gaccgtgagc420 tctggcggag gcggctctgg cggaggcggc tctggcggag gcggcagcga catcgtgatg480 acccaggctg cccccagcat ccccgtgacc ccaggcgaga gcgtgagcat cagctgccgg540 agcagcaaga gcctgctgaa cagcaacggc aacacctacc tcjtactggtt cctgcagcgg600 ccaggccaga gcccccagct gctgatctac cggatgagca acctggccag cggcgtgccc660 gaccggttca gcggcagcgg cagcggcacc gccttcaccc tgcggatcag ccgggtggag720 gccgaggacg tgggcgtgta ctactgcatg cagcacctgg agtacccctt caccttcgga780 gccggcacca agctggagct gaagcggtcg gatcccacca ccaccccagc cccacggcca840 cctacccctg ccccaaccat cgccagccag cccctgagcc tgcggcctga agcctgcagg900 cctgccgccg gaggagccgt gcacacaagg ggcctggact tcgcctgcga catctatatc960 tgggcccccc tggccgggac atgcggggtg ctgctgctgt ccctggtgat tacactgtat1020 tgcaaacggg gccggaagaa gctgctgtac atcttcaagc agcccttcat gcggcccgtg1080 cagaccaccc aggaggagga cggctgcagc tgccggttcc ccgaggaaga ggaaggcggc1140 tgcgagctgc gggtgaagtt cagccggagc gccgacgccc cagcctacca gcagggccag1200 aaccagctgt acaacgagct gaacctggga cggcgggagg agtacgacgt gctggacaag1260 cggcggggac gggaccccga gatgggcggc aagcctcgcc ggaagaatcc ccaggagggc1320 ctgtacaacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag1380 ggcgagcggc gccggggcaa gggccacgac ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc1440 aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgccac cccggtga1488 <210>18 <211>20 <212> PRT <213> искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигопептид <220>
<223> сигнальный пептид <400>18
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Vai Pro 15 1015
Gly Ser Thr Gly 20 <210>19 <211>21 <212.> PRT
- 40 036200 <213> искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический олигопептид <220>
<223> сигнальный пептид <400> 19
Met Ala Leu Pro Vai Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 15 1015
His Ala Ala Arg Pro 20 <210>20 <211>49 <212> DNA <213> Homo sapiens <400>1 ttgtcccaca gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgaga49 <210>21 <211>530 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <220>
<223> повтор TRAC_T01-L <400>21
Leu Thr Pro Gin Gin Vai Vai Ala He Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys
1015
Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Arg Leu Leu Pro Vai Leu Cys Gin Ala
2530
His Gly Leu Thr Pro Gin Gin Vai Vai Ala He Ala Ser Asn Asn Gly
4045
Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Arg Leu Leu Pro Vai Leu Cys
5560
Gin Ala His Gly Leu Thr Pro Gin Gin Vai Vai Ala lie Ala Ser Asn 65 70 7580
Gly Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Arg Leu Leu Pro Vai
9095
Leu Cys Gin Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gin Vai Vai Ala lie Ala
100 105110
Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Arg Leu Leu
115 120125
Pro Vai Leu Cys Gin Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gin Vai Vai Ala
130 135140
He Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Arg
145 150 155160
Leu Leu Pro Vai Leu Cys Gin Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gin Vai
165 170175
Vai Ala He Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Vai
180 185190
Gin Arg Leu Leu Pro Vai Leu Cys Gin Ala His Gly Leu Thr Pro Glu
195 200205
Gin Vai Vai Ala He Ala Ser Asn He Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu
210 215220
Thr Vai Gin Ala Leu Leu Pro Vai Leu Cys Gin Ala His Gly Leu Thr
225 230 235240
Pro Glu Gin Vai Vai Ala He Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala
245 250255
- 42 036200
Leu Glu Thr Vai Gin Arg Leu Leu
260
Pro Vai Leu Cys Gin Ala His Gly
265 270
Leu Thr Pro Glu Gin Vai Vai Ala
275 280
He Ala Ser Asn He Gly Gly Lys
285
Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Ala
290 295
Leu Leu Pro Vai Leu Cys Gin Ala
ЗЭ0
His Gly Leu Thr Pro Gin Gin Vai
305 310
Vai Ala He Ala Ser Asn Asn Gly
315 320
Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Vai
325
Gin Arg Leu Leu Pro Vai Leu Cys
330 335
Gin Ala His Gly Leu Thr Pro Glu
340
Gin Vai Vai Ala He Ala Ser Asn
345 350
He Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu
355 360
Thr Vai Gin Ala Leu Leu Pro Vai
65
Leu Cys Gin Ala His Gly Leu Thr
370 375
Pro Gin Gin Vai Vai Ala He Ala
380
Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gin Ala
385 390
Leu Glu Thr Vai Gin Arg Leu Leu
395 400
Pro Vai Leu Cys Gin Ala His Gly
405
Leu Thr Pro Glu Gin Vai Vai Ala
410 415
He Ala Ser Asn He Gly Gly Lys
420
Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Ala
425 430
Leu Leu Pro Vai Leu Cys Gin Ala
435 440
His Gly Leu Thr Pro Gin Gin Vai
445
Vai Ala He Ala Ser Asn Gly Gly
450 455
Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Vai
460
Gin Arg Leu Leu Pro Vai Leu Cys Gin Ala His Gly Leu Thr Pro Glu
465 470 475480
Gin Vai Vai Ala lie Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu
485 490495
Thr Vai Gin Arg Leu Leu Pro Vai Leu Cys Gin Ala His Gly Leu Thr
500 505510
Pro Gin Gin Vai Vai Ala He Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala
515 520525
Leu Glu
530 <210>22 <211>530 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <220>
<223> повтор TRAC__T01-R <400>22
Leu Thr Pro Glu Gin Vai Vai Ala He Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 15 1015
Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Arg Leu Leu Pro Vai Leu Cys Gin Ala 20 2530
His Gly Leu Thr Pro Gin Gin Vai Vai Ala He Ala Ser Asn Gly Gly 35 4045
Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Arg Leu Leu Pro Vai Leu Cys
5560
Gin Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gin Vai Vai Ala He Ala Ser His 65 70 7580
- 45 036200
Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Arg Leu Leu Pro Vai Leu Cys Gin Ala
290 295300
His Gly Leu Thr Pro Gin Gin Vai Vai Ala He Ala Ser Asn Gly Gly
305 310 315320
Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Arg Leu Leu Pro Vai Leu Cys
325 330335
Gin Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gin Vai Vai Ala He Ala Ser Asn
340 345350
He Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Ala Leu Leu Pro Vai
355 360365
Leu Cys Gin Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gin Vai Vai Ala He Ala
370 375380
Ser His Asp Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Arg Leu Leu
385 390 395400
Pro Vai Leu Cys Gin Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gin Vai Vai Ala
405 410415
He Ala Ser Asn He Gly Gly Lys
420
Gin Ala Leu Glu Thr Vai Gin Ala
425 430
Leu Leu Pro Vai Leu Cys Gin Ala
435 440
His Gly Leu Thr Pro Glu Gin Vai
45
Vai Ala He Ala Ser His Asp Gly
450 455
Gly Lys Gin Ala Leu Glu Thr Vai
60
Gin Arg Leu Leu Pro Vai Leu Cys
465 470
Gin Ala His Gly Leu Thr Pro Gin
475 480
Gin Vai Vai Ala He Ala Ser Asn
485
Asn Gly Gly Lys Gin Ala Leu Glu
490 495
- 46 036200
Thr Vai Gin Arg Leu Leu Pro Vai Leu Cys Gin Aha His Gly Leu Thr 500 505510
Pro Gin Gin Vai Vai Ala He Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala 515 520525
Leu Glu 530 <210>23 <2H>2814 <212> DNA <213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220>
< 223> TRAC_T01-R TALEN < 4 00>23 atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac60 gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc120 aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt180 acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc240 aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc3C0 ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg360 agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc420 gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac480 ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag540 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg6C0 gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg660 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat720 ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc780 cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg840 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag900 caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg960 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc102.0 agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc1080 caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag1140 caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc1200 ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc1260 cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc1320 atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg138^0 ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt1440
- 47 036200 ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc1500 ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag1560 acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg1620 gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg1660 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat1740 attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc18C0 cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca acggcggtgg caagcaggcgI860 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag1920 caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg1980 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc2040 agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat2100 ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt2160 cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg2220 aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac228:0 gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg2340 aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc2400 aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg24650 gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gzcaggccga cgaaatgcag2520 aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca azcccaacga gtggtggaag2580 gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc2640 aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg2700 tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag2760 gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa283.4 <210>24 <211>2832 <212> DNA <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400>24 atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc60 gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag120 cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca180 ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg240 ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac300 gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc350 acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag420 attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtc, gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg430 acgggtgccc cgctcaactt gaccccggag, caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc540 ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg, ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc600 ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag650 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg720 gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg730 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat840 attggtggca agcaggcgct ggagacggtc, caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc900 cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg960 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag1020
- 48 036200 caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaeigcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tzgcccggaa cagcacccag gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg gccgactgat aa
1080
1140
1200
1260
1320 1380
1440 1500
1560 1620
1680 1740
I860 18 60 1920 19E0 204 0 2100 2160 2220 2280 234 0 2400 2460 2520 2580 2 64 0 2700 2760 2820 2832

Claims (23)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. ООоюцифичный химерный антигенный рецептор, содержащий внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, в котором указанный внеклеточный домен содержит одноцепочечный FV-фрагмент, происходящий из моноклонального антитела 4G7, специфичного к CD19, при этом указанный одноцепочечный FV-фрагмент содержит вариабельный фрагмент иммуноглобулиновой тяжелой γ-1 цепи моноклонального антитела 4G7 к CD19 SEQ ID NO: 3 и вариабельный фрагмент иммуноглобулиновой легкой κ-цепи моноклонального антитела 4G7 к CD19 SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
  2. 2. О19-специфичный химерный антигенный рецептор по п.1, в котором указанный одноцепочечный FV-фрагмент содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или 8.
  3. 3. ООоюцифичный химерный антигенный рецептор по п.1 или 2, в котором указанный внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен ОЗ-зета.
  4. 4. ООоюцифичный химерный антигенный рецептор по одному из пп.1-3, в котором указанный внутриклеточный сигнальный домен содержит домен 4-1ВВ.
  5. 5. О19-специфичный химерный антигенный рецептор по одному из пп.1-4, содержащий трансмембранный и стеблевой домен α-цепи человеческого CD8.
  6. 6. О19-специфичный химерный антигенный рецептор по одному из пп.1-5, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 75%, предпочтительно 80, 85, 90, 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14 или 15.
  7. 7. О19-специфичный химерный антигенный рецептор по одному из пп.1-6, дополнительно содержащий другой внеклеточный лигандсвязывающий домен, не обладающий специфичностью в отношении CD19.
  8. 8. Полинуклеотид, кодирующий указанный химерный антигенный рецептор по одному из пп.1-7.
  9. 9. Полинуклеотид по п.8, содержащий нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 75%, предпочтительно 80, 85, 90, 95% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17.
  10. 10. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.8 или 9.
  11. 11. Иммунная клетка-хозяин, экспрессирующая на мембране клеточной поверхности CD19специфичный химерный антигенный рецептор, который содержит по меньшей мере один внеклеточный лигандсвязывающий домен и по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен, где указанный внеклеточный домен содержит одноцепочечный FV-фрагмент, выведенный из моноклонального антитела 4G7, специфичного в отношении CD19, причем указанный одноцепочечный FV-фрагмент содержит вариабельные фрагменты иммуноглобулиновой тяжелой γ-1 цепи моноклонального антитела 4G7 к CD19
    - 49 036200
    SEQ ID NO: 3 и вариабельные фрагменты иммуноглобулиновой легкой κ-цепи моноклонального антитела 4G7 к CD19 SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
  12. 12. Иммунная клетка-хозяин по п.11, где указанный одноцепочечный FV-фрагмент содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или 8.
  13. 13. Иммунная клетка-хозяин, экспрессирующая на мембране клеточной поверхности CD19специфичный химерный антигенный рецептор по одному из пп.1-7.
  14. 14. Иммунная клетка-хозяин по любому из пп.11-13, дополнительно содержащая другой химерный антигенный рецептор, который не обладает специфичностью в отношении CD19.
  15. 15. Иммунная клетка-хозяин по одному из пп.11-14, выведенная из воспалительных Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов или хелперных Т-лимфоцитов.
  16. 16. Иммунная клетка-хозяин по любому из пп.11-15, где указанная клетка получена от здорового донора.
  17. 17. Иммунная клетка-хозяин по любому из пп.11-15, где указанная клетка получена от пациента, у которого диагностирован рак.
  18. 18. Применение клетки по любому из пп.11-17 для терапии.
  19. 19. Применение клетки по любому из пп.11-17 для лечения В-клеточной лимфомы или лейкоза.
  20. 20. Способ создания иммунной клетки, включающий:
    (а) получение иммунной клетки, (б) экспрессию на поверхности указанной клетки по меньшей мере одного CD19-специфичного химерного антигенного рецептора по одному из пп.1-7.
  21. 21. Способ создания иммунной клетки по п.20, включающий:
    (а) получение иммунной клетки, (б) трансфекцию или трансдукцию в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего указанный CD19-специфичный химерный антигенный рецептор, (в) экспрессию указанного полинуклеотида в указанной клетке.
  22. 22. Способ создания иммунной клетки по п.20, включающий:
    (а) получение иммунной клетки, (б) трансфекцию или трансдукцию в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего указанный CD19-специфичный химерный антигенный рецептор, (в) интродукцию по меньшей мере одного другого химерного антигенного рецептора, не обладающего специфичностью в отношении CD19.
  23. 23. Способ лечения В-клеточной лимфомы или лейкоза у индивидуума, который нуждается в этом, включающий:
    (а) получение иммунной клетки, экспрессирующей на поверхности CD19-специфичного химерного антигенного рецептора по одному из пп. 1 -7;
    (б) введение указанной иммунной клетки указанному пациенту.
EA201501109A 2013-05-13 2014-05-12 Cd19-специфический химерный антигенный рецептор и его применения EA036200B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2013/040766 WO2013176916A1 (en) 2012-05-25 2013-05-13 Use of pre t alpha or functional variant thereof for expanding tcr alpha deficient t cells
US13/892,805 US11603539B2 (en) 2012-05-25 2013-05-13 Methods for engineering allogeneic and immunosuppressive resistant T cell for immunotherapy
PCT/US2013/040755 WO2013176915A1 (en) 2012-05-25 2013-05-13 Methods for engineering allogeneic and immunosuppressive resistant t cell for immunotherapy
US201361888259P 2013-10-08 2013-10-08
PCT/EP2014/059662 WO2014184143A1 (en) 2013-05-13 2014-05-12 Cd19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201501109A1 EA201501109A1 (ru) 2016-06-30
EA036200B1 true EA036200B1 (ru) 2020-10-14

Family

ID=51897790

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201501109A EA036200B1 (ru) 2013-05-13 2014-05-12 Cd19-специфический химерный антигенный рецептор и его применения
EA201990575A EA201990575A3 (ru) 2013-10-08 2014-05-12 Cd19-специфический химерный антигенный рецептор и его применения

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201990575A EA201990575A3 (ru) 2013-10-08 2014-05-12 Cd19-специфический химерный антигенный рецептор и его применения

Country Status (29)

Country Link
US (2) US20210000869A9 (ru)
EP (3) EP2997141B1 (ru)
JP (2) JP6491643B2 (ru)
KR (1) KR102248157B1 (ru)
CN (2) CN105431532B (ru)
AU (2) AU2014267436B2 (ru)
BR (1) BR112015028387B1 (ru)
CA (1) CA2911292C (ru)
DK (1) DK3546572T3 (ru)
EA (2) EA036200B1 (ru)
ES (2) ES2978123T3 (ru)
FI (2) FI2997141T3 (ru)
HR (2) HRP20221393T1 (ru)
HU (2) HUE060901T2 (ru)
LT (2) LT2997141T (ru)
MA (1) MA38630B2 (ru)
MX (1) MX374681B (ru)
MY (1) MY172897A (ru)
PH (1) PH12015502479B1 (ru)
PL (2) PL3546572T3 (ru)
PT (2) PT3546572T (ru)
RS (2) RS63798B1 (ru)
RU (1) RU2727447C2 (ru)
SA (1) SA515370135B1 (ru)
SG (2) SG11201508805UA (ru)
SI (2) SI3546572T1 (ru)
TW (1) TWI636992B (ru)
UA (1) UA118106C2 (ru)
WO (1) WO2014184143A1 (ru)

Families Citing this family (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
EP4541818A3 (en) 2012-05-25 2025-07-23 Cellectis Methods for engineering allogeneic and immunosuppressive resistant t cell for immunotherapy
US11077144B2 (en) 2013-05-13 2021-08-03 Cellectis CD19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
US20150166984A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting alpha-antitrypsin point mutations
WO2015092024A2 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Cellectis Method of engineering multi-input signal sensitive t cell for immunotherapy
US10189908B2 (en) 2014-02-05 2019-01-29 The University Of Chicago Chimeric antigen receptors recognizing cancer-specific TN glycopeptide variants
GB201405845D0 (en) 2014-04-01 2014-05-14 Ucl Business Plc Signalling system
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
GB201415347D0 (en) 2014-08-29 2014-10-15 Ucl Business Plc Signalling system
WO2016062898A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Bcrt Holding Bv T cell-based immunotherapeutics
JP2018504104A (ja) * 2014-12-17 2018-02-15 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 非Ｔ細胞伝達ドメインを発現する阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲまたはＮ−ＣＡＲ）
IL301458A (en) 2014-12-24 2023-05-01 Autolus Ltd A cell that simultaneously expresses a chimeric antigen receptor (CAR) of 19CD and 22CD
JP7264592B2 (ja) 2015-01-26 2023-04-25 ザ ユニバーシティー オブ シカゴ ＩＬ１３Ｒα２結合剤及び癌治療におけるその使用
EP3250611B1 (en) 2015-01-26 2021-04-21 The University of Chicago Car t-cells recognizing cancer-specific il 13r-alpha2
WO2016120218A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Cellectis ANTI-CLL1 SPECIFIC SINGLE-CHAIN CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (scCARS) FOR CANCER IMMUNOTHERAPY
EP3261651B1 (en) * 2015-02-27 2022-05-04 iCell Gene Therapeutics LLC Chimeric antigen receptors (cars) targeting hematologic malignancies, compositions and methods of use thereof
GB201503742D0 (en) 2015-03-05 2015-04-22 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
TWI700298B (zh) 2015-04-13 2020-08-01 美商輝瑞股份有限公司 靶向ｂ細胞成熟抗原之嵌合型抗原受體類
GB201507115D0 (en) * 2015-04-27 2015-06-10 Ucl Business Plc Nucleic Acid Construct
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
BR112017024757A2 (pt) 2015-05-18 2018-11-13 TCR2 Therapeutics Inc. composições e métodos para reprogramação de tcr utilizando proteínas de fusão
CN104829733B (zh) * 2015-05-25 2018-06-05 广州百暨基因科技有限公司 抗原结合单元稳定的嵌合抗原受体及制备方法与应用
US11173179B2 (en) 2015-06-25 2021-11-16 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptor (CAR) targeting multiple antigens, compositions and methods of use thereof
TW202444897A (zh) 2015-06-25 2024-11-16 美商生物細胞基因治療有限公司 嵌合抗原受體(car)、組合物及其使用方法
EP3317399B1 (en) * 2015-06-30 2024-06-26 Cellectis Methods for improving functionality in nk cell by gene inactivation using specific endonuclease
MX2018001776A (es) 2015-08-11 2018-06-06 Cellectis Celulas para inmunoterapia modificadas geneticamente para dirigirse al antigeno cd38 y para la inactivacion del gen cd38.
KR102739782B1 (ko) * 2015-09-11 2024-12-09 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 생물학적으로 관련된 직교 사이토카인/수용체 쌍
PH12018500645B1 (en) 2015-09-24 2022-10-21 Abvitro Llc Hiv antibody compositions and methods of use
SG10202104041PA (en) 2015-10-23 2021-06-29 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
WO2017075537A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Aleta Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for treatment of cancer
CN108472365A (zh) 2015-10-30 2018-08-31 艾丽塔生物治疗剂公司 用于肿瘤转导的组合物和方法
GB201519900D0 (en) * 2015-11-11 2015-12-23 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
EP3405481B1 (en) 2016-01-21 2023-01-18 Pfizer Inc. Chimeric antigen receptors targeting epidermal growth factor receptor variant iii
CN107298715B (zh) 2016-04-15 2021-05-04 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 Slit2D2-嵌合抗原受体及其应用
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
CN109503721B (zh) * 2016-05-31 2023-03-07 上海恒润达生生物科技股份有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途
JP7114490B2 (ja) * 2016-06-24 2022-08-08 アイセル・ジーン・セラピューティクス・エルエルシー キメラ抗体受容体（ＣＡＲｓ）の構成およびその使用方法
CA3031289A1 (en) * 2016-07-18 2018-01-25 Helix Biopharma Corp. Car immune cells to treat cancer
WO2018026953A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
KR20250103795A (ko) 2016-08-03 2025-07-07 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
WO2018045034A1 (en) * 2016-08-30 2018-03-08 Promab Biotechnologies, Inc. Chimeric antigen receptors having gitr intracellular domain as co-stimulatory domain
MA46236A (fr) 2016-09-14 2019-07-24 Janssen Biotech Inc Récepteurs antigéniques chimériques comprenant des domaines de la fibronectine de type iii spécifiques du bcma, et utilisations correspondantes
WO2018058432A1 (zh) * 2016-09-28 2018-04-05 李华顺 一种多基因重组嵌合抗原受体分子及其应用
MX2019003899A (es) 2016-10-07 2019-08-14 Tcr2 Therapeutics Inc Composiciones y metodos para reprogramacion de receptores de linfocitos t mediante el uso de proteinas de fusion.
EP3525804A4 (en) * 2016-10-11 2020-09-09 Minerva Biotechnologies Corporation HUMANIZED ANTI-MUC1 * ANTIBODIES AND USE OF THE CLIVING ENZYME
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
AU2017363311A1 (en) 2016-11-22 2019-06-13 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
US11440958B2 (en) 2016-11-22 2022-09-13 National University Of Singapore Blockade of CD7 expression and chimeric antigen receptors for immunotherapy of T-cell malignancies
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
EP3592381A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cancer vaccine
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
WO2018176009A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
EP3592854A1 (en) 2017-04-13 2020-01-15 Cellectis New sequence specific reagents targeting ccr5 in primary hematopoietic cells
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
PE20241587A1 (es) 2017-06-02 2024-08-01 Pfizer Receptores de antigenos quimericos que se dirigen a flt3
JP2020524512A (ja) 2017-06-21 2020-08-20 アイセル・ジーン・セラピューティクス・エルエルシー キメラ抗体受容体（ＣＡＲｓ）の組成物およびその使用方法
CA3067914A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Cellectis Cellular immunotherapy for repetitive administration
JP7280238B2 (ja) 2017-07-17 2023-05-23 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド フィブロネクチンｉｉｉ型ドメインに対する抗原結合領域及びその使用方法
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
EP3676376B1 (en) 2017-08-30 2025-01-15 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
SG11202003849VA (en) * 2017-10-31 2020-05-28 Allogene Therapeutics Inc Methods and compositions for dosing of allogeneic chimeric antigen receptor t cells
CA3079096A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Allogene Therapeutics, Inc. Modified caspase-9 polypeptides and methods of use thereof
WO2019106163A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Cellectis Reprogramming of genetically engineered primary immune cells
KR102136063B1 (ko) 2017-12-06 2020-07-22 앱클론(주) 악성 b 세포를 특이적으로 인지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항체 수용체 및 이의 용도
WO2019118949A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
CN111683971A (zh) * 2017-12-23 2020-09-18 宇越生医科技股份有限公司 医药重组受体组成物及方法
TW201936633A (zh) 2018-02-01 2019-09-16 美商輝瑞大藥廠 標靶至cd70的嵌合抗原受體
TWI878213B (zh) 2018-02-01 2025-04-01 美商輝瑞大藥廠 對cd70具特異性抗體及其用途
WO2019166946A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Pfizer Inc. Il-15 variants and uses thereof
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
EP3820495A4 (en) 2018-07-09 2022-07-20 The Broad Institute Inc. RNA-PROGRAMMABLE EPIGENETIC RNA MODIFIERS AND THEIR USES
US20220177573A1 (en) * 2018-07-09 2022-06-09 Oslo Universitetssykehus Hf Two chimeric antigen receptors specifically binding cd19 and igkappa
AU2019327913A1 (en) 2018-08-29 2021-03-18 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Anti-mesothelin chimeric antigen receptor (CAR) constructs and uses thereof
EP3850088A4 (en) 2018-09-07 2023-07-19 Beam Therapeutics, Inc. Compositions and methods for improving base editing
AU2019336245B2 (en) 2018-09-07 2026-02-26 Beam Therapeutics Inc. Compositions and methods for delivering a nucleobase editing system
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
EP3873540A4 (en) 2018-10-31 2022-07-27 Mayo Foundation for Medical Education and Research METHODS AND MATERIALS FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2020092839A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
CA3116412A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Humanigen, Inc. Materials and methods for treating cancer
US20200268797A1 (en) 2018-11-30 2020-08-27 Janssen Biotech, Inc. Gamma delta t cells and uses thereof
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
CN114040977B (zh) 2019-01-31 2024-09-03 比姆医疗股份有限公司 非靶脱氨反应减低的核碱基编辑器和用于定性核碱基编辑器的测定
SG11202108346WA (en) 2019-02-13 2021-08-30 Beam Therapeutics Inc Modified immune cells having adenosine deaminase base editors for modifying a nucleobase in a target sequence
AU2020223314A1 (en) 2019-02-13 2021-08-12 Beam Therapeutics Inc. Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiency
RU2742000C2 (ru) * 2019-03-13 2021-02-01 Общество С Ограниченной Ответственностью "Анабион" Выделенный альтернативный внутриклеточный сигнальный домен химерного антигенного рецептора и включающий его химерный антигенный рецептор
EP3942043A2 (en) 2019-03-19 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
MX2021012726A (es) 2019-04-19 2021-11-17 Allogene Therapeutics Inc Anticuerpos contra receptores de antigenos quimericos derivados de 4g7.
EP3959235B1 (en) 2019-04-26 2023-07-26 Allogene Therapeutics, Inc. Rituximab-resistant chimeric antigen receptors and uses thereof
CA3152272A1 (en) 2019-08-27 2021-03-04 Janssen Biotech, Inc. Chimeric antigen receptor system and uses thereof
CN115279398B (zh) 2019-09-27 2025-07-04 比姆医疗股份有限公司 治疗液态癌症的组合物和方法
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
CN112079934B (zh) * 2019-12-17 2021-01-29 合源生物科技(天津)有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途
WO2021176373A1 (en) 2020-03-03 2021-09-10 Janssen Biotech, Inc. ꝩδ T CELLS AND USES THEREOF
AU2021357520A1 (en) 2020-03-05 2022-09-29 Neotx Therapeutics Ltd. Methods and compositions for treating cancer with immune cells
BR112022022603A2 (pt) 2020-05-08 2023-01-17 Broad Inst Inc Métodos e composições para edição simultânea de ambas as fitas de sequência alvo de nucleotídeos de fita dupla
AU2021312871A1 (en) 2020-07-21 2023-02-09 Allogene Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors with enhanced signaling and activities and uses thereof
WO2022031597A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Kyverna Therapeutics, Inc. Methods of producing t regulatory cells, methods of transducing t cells, and uses of the same
EP4196231A1 (en) 2020-08-14 2023-06-21 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Inc. Chimeric antigen receptor t cells for treating autoimmunity
CN111944850B (zh) * 2020-08-28 2023-03-31 澳门大学 表达抗cd22嵌合抗原受体和pd-l1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用
US12576151B2 (en) 2020-09-25 2026-03-17 Beam Therapeutics Inc. Fratricide resistant modified immune cells and methods of using the same
JP2024500847A (ja) 2020-12-18 2024-01-10 センチュリー セラピューティクス，インコーポレイテッド 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム
WO2022165419A1 (en) 2021-02-01 2022-08-04 Kyverna Therapeutics, Inc. Methods for increasing t-cell function
KR20230153529A (ko) * 2021-02-19 2023-11-06 프리트 엠. 쇼드하리 다양한 면역세포를 위한 단일사슬 및 다중사슬 합성 항원 수용체
WO2022234158A1 (es) * 2021-05-06 2022-11-10 Institut D'investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (Idibaps) Terapia de células t con receptor de antígeno quimérico específico de cd19
WO2022266075A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 Caribou Biosciences, Inc. Methods and materials for treating cancer using car constructs with an intracellular domain comprising a stap domain and a kinase domain or a stap domain and a phosphatase domain
CN118891374A (zh) 2022-03-24 2024-11-01 南京传奇生物科技有限公司 制备dna文库和检测逆转录病毒整合位点的方法
WO2025051339A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Tiber Biotech Srl SINGLE-CHAIN VARIABLE FRAGMENT AND MOLECULES DERIVING THEREFROM THAT BIND FRAGMENT TRVB5-1 OF THE β CHAIN OF HUMAN T-CELL RECEPTOR
EP4574838A1 (en) 2023-12-21 2025-06-25 Vilnius University Chimeric antigen receptor (car) with enhanced recruitment of signaling partners

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012129514A1 (en) * 2011-03-23 2012-09-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and compositions for cellular immunotherapy

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8611832D0 (en) 1986-05-15 1986-06-25 Holland I B Polypeptide
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
BR0108545A (pt) 2000-02-24 2004-06-29 Xcyte Therapies Inc Estimulação e concentração simultâneas das células
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
AU2001297703B2 (en) * 2000-11-07 2006-10-19 City Of Hope CD19-specific redirected immune cells
PL2383297T3 (pl) * 2006-08-14 2013-06-28 Xencor Inc Zoptymalizowane przeciwciała ukierunkowane na CD19
US20080131415A1 (en) * 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
WO2009052431A2 (en) * 2007-10-19 2009-04-23 Seattle Genetics, Inc. Cd19 binding agents and uses thereof
WO2009091826A2 (en) * 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
US8822647B2 (en) * 2008-08-26 2014-09-02 City Of Hope Method and compositions using a chimeric antigen receptor for enhanced anti-tumor effector functioning of T cells
WO2012050374A2 (en) * 2010-10-13 2012-04-19 Innocell, Inc. Immunotherapy for solid tumors
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
US9402865B2 (en) 2011-01-18 2016-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
US20120245996A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 Jonathan Mendez System and method for intent-based content matching
JP5996630B2 (ja) 2011-04-05 2016-09-21 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ コンパクトｔａｌｅ−ヌクレアーゼを作製する方法及びその使用
US20130071414A1 (en) * 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
PH12014500247A1 (en) * 2011-07-29 2014-03-24 Univ Pennsylvania Switch costimulatory receptors
US10421960B2 (en) * 2011-09-16 2019-09-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA engineered T cells for the treatment of cancer
KR20140127816A (ko) 2012-02-22 2014-11-04 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암의 치료에 유용한 t 세포의 지속성 집단을 생성시키기 위한 조성물 및 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012129514A1 (en) * 2011-03-23 2012-09-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and compositions for cellular immunotherapy

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRAZYNA LIPOWSKA-BHALLA; DAVID E. GILHAM; ROBERT E. HAWKINS; DOMINIC G. ROTHWELL: "Targeted immunotherapy of cancer with CAR T cells: achievements and challenges", CANCER IMMUNOLOGY, IMMUNOTHERAPY, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 61, no. 7, 22 April 2012 (2012-04-22), Berlin, DE, pages 953 - 962, XP035074376, ISSN: 1432-0851, DOI: 10.1007/s00262-012-1254-0 *
PARTOW KEBRIAEI, HELEN HULS, BIPULENDU JENA, MARK MUNSELL, RINEKA JACKSON, DEAN A. LEE, PERRY B. HACKETT, GABRIELA RONDON, ELIZABE: "Infusing CD19-Directed T Cells to Augment Disease Control in Patients Undergoing Autologous Hematopoietic Stem-Cell Transplantation for Advanced B-Lymphoid Malignancies", HUMAN GENE THERAPY, MARY ANN LIEBERT, vol. 23, no. 5, 1 May 2012 (2012-05-01), pages 444 - 450, XP055130799, ISSN: 10430342, DOI: 10.1089/hum.2011.167 *
PARTOW KEBRIAEI, SUSAN S KELLY, PALLAVI MANURI, BIPULENDU JENA, RINEKA JACKSON, ELIZABETH SHPALL, RICHARD CHAMPLIN, LAURENCE COOPE: "Chimeric antibody receptors (CARs): driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity", FRONTIERS IN BIOSCIENCE (SCHOLAR EDITION), UNITED STATES, 1 January 2012 (2012-01-01), United States, pages 520, XP055130773, Retrieved from the Internet <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22202074> *
PEIPP, M. SAUL, D. BARBIN, K. BRUENKE, J. ZUNINO, S.J. NIEDERWEIS, M. FEY, G.H.: "Efficient eukaryotic expression of fluorescent scFv fusion proteins directed against CD antigens for FACS applications", JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS., ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V.,AMSTERDAM., NL, vol. 285, no. 2, 15 February 2004 (2004-02-15), NL, pages 265 - 280, XP004491170, ISSN: 0022-1759, DOI: 10.1016/j.jim.2003.12.001 *

Also Published As

Publication number Publication date
HK1222678A1 (zh) 2017-07-07
CN105431532A (zh) 2016-03-23
HUE060901T2 (hu) 2023-04-28
CN109897100A (zh) 2019-06-18
HUE067258T2 (hu) 2024-10-28
EA201990575A2 (ru) 2019-07-31
KR20160030480A (ko) 2016-03-18
CN105431532B (zh) 2021-04-06
NZ714044A (en) 2021-08-27
KR102248157B1 (ko) 2021-05-03
EA201501109A1 (ru) 2016-06-30
EP3546572B9 (en) 2024-06-26
MA38630B2 (fr) 2021-08-31
BR112015028387B1 (pt) 2023-04-11
UA118106C2 (uk) 2018-11-26
RS65484B1 (sr) 2024-05-31
LT2997141T (lt) 2023-02-10
JP2016520074A (ja) 2016-07-11
AU2019201818A1 (en) 2019-04-04
MX374681B (es) 2025-03-06
FI3546572T3 (fi) 2024-05-06
SI2997141T1 (sl) 2023-04-28
EP3546572B1 (en) 2024-03-13
US20240269178A1 (en) 2024-08-15
JP6854307B2 (ja) 2021-04-07
WO2014184143A1 (en) 2014-11-20
SG10201708896WA (en) 2017-11-29
RU2727447C2 (ru) 2020-07-21
BR112015028387A2 (pt) 2017-09-19
MX2015015662A (es) 2016-09-16
PL3546572T3 (pl) 2024-07-22
PH12015502479B1 (en) 2019-11-27
SI3546572T1 (sl) 2024-06-28
SG11201508805UA (en) 2015-11-27
CA2911292A1 (en) 2014-11-20
EP4364809A3 (en) 2024-07-24
AU2019201818B2 (en) 2021-09-09
ES2978123T3 (es) 2024-09-05
HK1222679A1 (en) 2017-07-07
ES2930431T3 (es) 2022-12-12
US20210000869A9 (en) 2021-01-07
AU2014267436A1 (en) 2015-11-12
EP3546572A1 (en) 2019-10-02
HRP20240576T1 (hr) 2024-07-19
LT3546572T (lt) 2024-05-27
JP2019122382A (ja) 2019-07-25
MY172897A (en) 2019-12-13
TW201502139A (zh) 2015-01-16
RS63798B1 (sr) 2022-12-30
SA515370135B1 (ar) 2020-12-14
EA201990575A3 (ru) 2019-11-29
EP2997141B1 (en) 2022-10-12
PT2997141T (pt) 2022-11-23
RU2015153250A (ru) 2017-06-19
DK3546572T3 (da) 2024-05-06
EP4364809A2 (en) 2024-05-08
MA38630A1 (fr) 2017-07-31
AU2014267436B2 (en) 2019-07-04
EP2997141A1 (en) 2016-03-23
HRP20221393T1 (hr) 2023-01-06
JP6491643B2 (ja) 2019-04-03
CA2911292C (en) 2023-01-03
TWI636992B (zh) 2018-10-01
PH12015502479A1 (en) 2016-02-22
PT3546572T (pt) 2024-05-08
US20190209616A1 (en) 2019-07-11
FI2997141T3 (fi) 2022-12-15
PL2997141T3 (pl) 2023-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2727447C2 (ru) Cd19-специфический химерный антигенный рецептор и его применения
US11007224B2 (en) CD19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
RU2701341C2 (ru) Cd33-специфические химерные антигенные рецепторы для иммунотерапии рака
US11077144B2 (en) CD19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2015136001A1 (en) Method for generating t-cells compatible for allogenic transplantation
CA2939711A1 (en) Method for in situ inhibition of regulatory t cells
HK40109143A (en) Cd19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
RU2775453C2 (ru) Сконструированные универсальные иммунные клетки с анти-cd22 химерным антигенным рецептором
HK40010356A (en) Cd19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
HK1222679B (en) Cd19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
NZ714044B2 (en) Cd19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
HK1222678B (zh) Cd19特异性嵌合抗原受体及其用途