ES2978295T3 - Vectores víricos recombinantes modificados con tropismo y usos de los mismos para la introducción dirigida de material genético en células humanas - Google Patents

Vectores víricos recombinantes modificados con tropismo y usos de los mismos para la introducción dirigida de material genético en células humanas Download PDF

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Abstract

En el presente documento se proporcionan composiciones y métodos para reorientar proteínas/cápsides/vectores de cápside viral recombinantes, por ejemplo, in vivo, con una molécula de unión multiespecífica, tal como un anticuerpo biespecífico, que se une específicamente a un epítopo heterólogo mostrado por la proteína de la cápside y una proteína expresada en la célula de interés para la administración dirigida de un nucleótido de interés. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores víricos recombinantes modificados con tropismo y usos de los mismos para la introducción dirigida de material genético en células humanas
El listado de secuencias escrito en el archivo 10335WO01_ST25.txt que es de 88 kilobytes, fue creado el 27 de junio de 2018.
Campo técnico
La divulgación en el presente documento se refiere en general a vectores de virus asociados a adenovirus (AAV) recombinantes modificados con tropismo y a composiciones que comprenden los mismos, los cuales son útiles para la introducción dirigida de material genético en células y/o tejidos.
Antecedentes de la invención
La administración de genes a células diana particulares se ha convertido en una de las tecnologías más importantes de la medicina moderna para el diagnóstico y la terapia génica de una diversidad de enfermedades genéticas y crónicas. Hasta ahora, el progreso en la aplicación clínica de la terapia génica se ha visto limitado por la falta de vehículos ideales para la administración de genes. Para lograr el éxito terapéutico, los vehículos de administración de genes deben ser capaces de transducir células diana evitando al mismo tiempo la transducción de células no diana. Específicamente, cuando el tropismo natural del virus no satisface las necesidades terapéuticas instantáneas, existe una necesidad de vectores víricos recombinantes en donde se anule o disminuya el tropismo natural y el tropismo deseado se diseña por ingeniería genética con éxito. (Buchholzet al.).
En los últimos años, la mayor parte del progreso en el desarrollo de vectores se ha logrado utilizando virus desnudos (por ejemplo, virus que comprenden una cápside formada por proteínas de la cápside vírica sin una envoltura (por ejemplo, bicapa lipídica)) tales como virus adenoasociados (AAV) y adenovirus (Ads), así como virus con envoltura (por ejemplo, virus cuya cápside está rodeada por una bicapa lipídica) tales como retrovirus, lentivirus y virus del herpes simple. Los vectores basados en AAV han sido el foco de mucha investigación, puesto que los AAV son virus sin envoltura que son sólo ligeramente inmunogénicos pero capaces de transducir una amplia gama de especies y tejidosin vivosin evidencia de toxicidad.
Los AAV son virus de ADN monocatenarios, sin envoltura, pequeños. El genoma del AAV tiene 4,7 kb y se caracteriza por dos repeticiones terminales invertidas (ITR) y dos marcos de lectura abiertos que codifican las proteínas Rep y Cap, respectivamente. Las dos ITR son los únicos elementos cis esenciales para la replicación, empaquetado e integración del AAV. El marco de lectura de Rep codifica cuatro proteínas de peso molecular 78 kD, 68 kD, 52 kD y 40 kD. Estas proteínas funcionan principalmente en la regulación de la replicación del AAV y la integración del AAV en los cromosomas de la célula hospedadora. El marco de lectura de Cap codifica tres proteínas víricas (VP) estructurales (cápside) que tienen pesos moleculares de 83-85 kD (VP1), 72-73 kD (VP2) y 61-62 kD (VP3). Más del 80 % de las proteínas totales del virión AAV comprenden VP3; en los viriones maduros VP1, VP2 y VP3 se encuentran en una abundancia relativa de aproximadamente 1:1:10.In vitro,las tres proteínas se ensamblan espontáneamente en estructuras tipo viriones, por ejemplo, cápsides víricas. Parece, por lo tanto, que la formación de la cápside vírica en células infectadas se produce independientemente de la síntesis del ADN vírico (revisado por Kotinet al.(1994)Hum. Gene Ther.5:793).
Entre todos los serotipos de AAV conocidos, AAV2 es quizás el serotipo mejor caracterizado, debido a que su clon infeccioso fue el primero que se produjo. (Samulskiet al.(1982)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 79:2077-2081). Posteriormente, también se han determinado las secuencias completas para AAV3A, AAV3B, AAV4 y AAV6. (Rutledgeet al.(1998)J. Virol.72:309-319; Chioriniet al.(1997)J. Virol.71:6823-6833; S. Muramatsuet al.(1996)Virol.221:208-217). Generalmente, todos los AAV comparten más del 80 % de identidad en la secuencia de nucleótidos.
El AAV es un vector prometedor para la terapia génica humana ya que, a diferencia de otros vectores víricos, no se ha demostrado que los AAV estén asociados con ninguna enfermedad humana conocida y, en general, no se consideran patógenos. (Muzyczkaet al.(1992)Current Topics in Microbiology and Immunology158:97-129). Por otra parte, el AAV sirve para la transducción de forma segura de tejidos posmitóticos con una inmunogenicidad relativamente baja y es capaz de integrarse en los cromosomas del hospedador de manera específica a sitio y en células cultivadas de tejido en el cromosoma 19 si las proteínas Rep se suministran en forma trans. (Kotinet al.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87:2211-2215; Samulskiet al.(1991)EMBO J.10(12):3941-3950; Balagueet al.(1997)J. Virol.71:3299-3306; Suroskyet al.(1997)J. Virol.71:7951-7959). Se ha demostrado que los genomas integrados del AAV permiten la expresión génica de larga duración en varios tejidos, incluyendo, el músculo, el hígado y el cerebro (Fisher (1997)Nature Med.3(3):306-312; Snyderet al.(1997)Nature Genetics16:270-276; Xiaoet al.(1997)Experimental Neurology144:113-124; Xiaoet al.(1996)J. Virol.70(11):8098-8108).
Varios virus, incluyendo los AAV, infectan células a través de una interacción virus/ligando:célula/receptor, lo que finalmente da como resultado endocitosis del virus por parte de la célula infectada. Esta interacción ligando: receptor es el foco de gran parte de la investigación sobre vectores víricos, por ejemplo, puede manipularse para redirigir el tropismo natural de un virus desde una célula permisiva de forma natural a la infección por el virus de tipo silvestre a una célula diana, por ejemplo, a través de un receptor expresado por la célula diana.
En teoría, redirigir un vector hacia cualquier proteína o marcador de la superficie celular debería dar como resultado la infección de una célula diana, ya que la mayoría de los receptores o marcadores de la superficie celular están implicados en las vías de endocitosis, ya sea constitutiva (por ejemplo, para reciclaje) o inducida por ligando (por ejemplo, mediada por receptor). Estos receptores se agrupan en fosas recubiertas de clatrina, ingresan a la célula a través de vesículas recubiertas de clatrina, pasan a través de un endosoma acidificado en el que se clasifican los receptores y, a continuación, se reciclan a la superficie celular, se almacenan intracelularmente o se degradan en los lisosomas. Como tal, las plataformas para redireccionar vectores víricos a menudo tienen como objetivo anular el tropismo natural del vector vírico y redirigir el vector vírico a un receptor o marcador expresado única o principalmente por la célula diana. Muchos de los avances en la terapia génica dirigida utilizando vectores víricos pueden resumirse como modificaciones no recombinatorias (no genéticas) o recombinatorias (genéticas) del vector vírico, que dan como resultado el pseudotipado, la expansión y/o el redireccionamiento ("retargeting") del tropismo natural del vector vírico. (Revisado en Nicklin y Baker (2002)Curr. Gene Ther.2:273-93; Verheiji y Rottier (2012)Avances Virol2012:1-15).
Los enfoques no genéticos normalmente utilizan un adaptador, que reconoce tanto una proteína de superficie del virus de tipo silvestre (no modificado) como una célula diana. Se han utilizado seudorreceptores solubles (para el virus de tipo silvestre), polímeros tales como polietilenglicol y anticuerpos o porciones de los mismos, como dominio de unión al virus de los adaptadores, mientras que para el dominio de unión celular de los adaptadores descritos anteriormente se han utilizado ligandos de péptidos o vitaminas naturales, y anticuerpos y porciones de los mismos. Con este enfoque, el redireccionamiento del vector vírico hacia una célula diana se puede lograr mediante la unión del complejo vector: adaptador a una proteína expresada en la superficie de la célula diana, por ejemplo, una proteína de la superficie celular.
Este enfoque se ha utilizado para AAV (Bartlettet al.(1999)Nat. Biotechnol.74: 2777-2785), adenovirus (Hemminkiet al.(2001)Cáncer Res.61: 6377-81; van Beusechemet al.(2003)Gene Therapy10:1982-1991; Einfeld,et al(2001,J. Virol.75:11284-91; Glasgowet al.(2009)PLOS One4:e8355), herpesvirus (Nakanoet al.(2005)Mol. Ther.11:617-24), y paramixovirus (Bianet al.(2005)Cancer Gene Ther.12:295-303; Bianet al.(2005)Int. J. Oncol.29:1359-69), Coronavirus (Haijemaet al.(2003)J. Virol.77:4528-43]8; Wurdingeret al.(2005)Gene Therapy12:1394-1404).
Un enfoque más popular ha sido la modificación genética recombinatoria de las proteínas de la cápside vírica y, por tanto, la superficie de la cápside vírica. En enfoques recombinatorios indirectos, se modifica una cápside vírica con un "andamio" heterólogo, que, a continuación, se vincula a un adaptador. El adaptador se une al andamio y a la célula diana. (Arnoldet al.(2006)Mol. Ther.5:125-132; Ponnazhagenet al.(2002)J. Virol.76:12900-907; véase también el documento WO 97/05266). Andamios tales como (1) moléculas de unión a Fc (por ejemplo, receptores Fc, Proteína A, etc.), que se unen al Fc de los adaptadores del anticuerpo, (2) (estrept)avidina, que se une a adaptadores biotinilados, (3) biotina, que se une a adaptadores fusionados con (estrept)avidina, y (4) pares de unión proteína:proteína que forman enlaces peptídicos isométricos tales como SpyCatcher, que une un adaptador SpyTagged, han sido incorporados en Ad (Pereboevaet al.(2007)Gene Therapy14: 627-637; Parket al.(2008)Biochemical and Biophysical Research Communications366: 769-774; Henninget al.(2002)Human Gene Therapy13:1427-1439; Banerjeeet al.(2011)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters21:4985-4988), AAV (Gigoutet al.(2005)Molecular Therapy11:856-865; Stachleret al.(2008)Molecular Therapy16:1467-1473), y togavirus (Quetglaset al.(2010)Virus Research153:179-196; Ohnoet al.(1997)Nature Biotechnology15:763-767; Klimstraet al.(2005)Virology338:9-21).
En un enfoque de direccionamiento ("targeting") recombinatorio directo, un ligando de direccionamiento se inserta directamente, o se acopla a, una cápside vírica, es decir, cápsides víricas proteicas se modifican para expresar un ligando de direccionamiento heterólogo. El ligando, a continuación, se redirige, por ejemplo, se une a, un receptor o marcador expresado preferente o exclusivamente en una célula diana. (Stachleret al.(2006)Gene Ther.13:926-931; Whiteet al.(2004)Circulation109:513-519.). Se han utilizado enfoques recombinatorios directos en AAV (Parket al.,(2007)Frontiers in Bioscience13:2653-59; Girodet al.(1999)Nature Medicine5:1052-56; Grifmanet al.(2001)Molecular Therapy3:964-75; Shiet al.(2001)Human Gene Therapy12:1697-1711; Shi y Bartlett (2003)Molecular Therapy7:515-525), retrovirus (Dalbaet al. Current Gene Therapy5:655-667; Tai y Kasahara (2008)Frontiers in Bioscience13:3083-3095; Russell y Cosset (1999)Journal of Gene Medicine1:300-311; Erlweinet al.(2002)Virology302:333-341; Chadwicket al.(1999)Journal of Molecular Biology285:485-494; Pizzatoet al.(2001)Gene Therapy8:1088-1096), poxvirus (Guseet al.(2011)Expert Opinion on Biological Therapy11:595-608; Galmicheet al.(1997)Journal of General Virology78:3019-3027; Paulet al.(2007)Viral Immunology20:664-671), paramixovirus (Nakamura y Russell (2004)Expert Opinion on Biological Therapy4:1685-1692; Hammondet al.(2001)Journal of Virology75:2087-2096; Galanis (2010)Clinical Pharmacology and Therapeutics88:620-625; Blechacz y Russell (2008)Current Gene Therapy8:162-175; Russell y Peng (2009)Current Topics in Microbiology and Immunology330:213-241), y herpesvirus (Shah y Breakefield (2006)Current Gene Therapy6:361-370; Campadelli-Fiumeet al.(2011)Reviews in Medical Virology21:213-226).
Cada uno de los tres enfoques tiene ventajas y desventajas. Una ventaja principal de un enfoque recombinatorio directo es que la especificidad del vírico es inherente al genoma vírico y puede mantenerse tras la replicación. Sin embargo, para este y los enfoques recombinatorios indirectos, la capacidad de modificar genéticamente el virus requiere que se mantenga la estructura de la cápside, y que el ligando o andamio dirigido se coloque en una posición que tolere y muestre apropiadamente el ligando o andamio dirigido, limitando así el repertorio de ligandos o armazones apropiados que pueden usarse. Como tal, los métodos de redireccionamiento recombinatorio están limitados por moléculas existentes de forma natural útiles como ligandos dirigidos, conduciendo a la incorporación de otros ligandos de unión tales como anticuerpos o porciones de los mismos. Tanto la plataforma adaptadora no recombinatoria como la recombinatoria son ventajosas por la flexibilidad del adaptador utilizado. Sin embargo, es difícil lograr eficiencias de transducción óptimas con estos sistemas de dos componentes.
También se menciona Wickhamet al.(1997)Journal of Virology,71(10): 7663-7669 que se ocupa de la administración génica mediada por adenovirus dirigido a linfocitos T a través de CD3.
En el presente documento se proporciona una estrategia de redireccionamiento de AAV que resuelve los problemas inherentes a las anteriores estrategias de redireccionamiento recombinatorio mediante la inserción de un epítopo heterólogo en una cápside de AAV. La cápside de AAV recombinante instantánea presenta un tropismo natural reducido a anulado, que se restaura y redirige tras combinarse con una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, que comprende un paratopo de anticuerpo, por ejemplo, Fv, que se une específicamente al epítopo heterólogo y un ligando de redireccionamiento que se une específicamente a una célula diana, particularmente dentro de determinadas proporciones de vector vírico: moléculas de unión multiespecíficas.
Sumario de la invención
En el presente documento se divulgan proteínas de la cápside del virus adenoasociado (AAV) recombinantes, cápsides de AAV que comprenden las proteínas de la cápside de AAV recombinantes, vectores de AAV que comprenden el nucleótido de interés encapsulado por la cápside de AAV recombinante; en donde dichas proteínas de la cápside de AAV, cápsides de AAV y vectores AAV se modifican genéticamente para comprender (mostrar) un epítopo heterólogo, en donde el epítopo heterólogo (parte del mismo o junto con la proteína de la cápside de AAV) forma un par de unión con un paratopo de anticuerpo, y en donde la proteína de la cápside/cápside/vector de AAV recombinante puede comprender además una mutación, inserción o deleción en una posición de aminoácido implicada en la unión al receptor, por ejemplo, el tropismo (natural) de la proteína de la cápside/cápside/vector del AAV, de modo que la proteína de la cápside de AAV recombinante o una cápside de AAV que comprende la proteína de AAV recombinante tiene un tropismo (natural) reducido a anulado (por ejemplo, tiene, en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, una eficiencia de transducción que es menor que la eficiencia de transducción de una proteína de la cápside/cápside/vector de AAV de referencia que carece del epítopo heterólogo, o una eficiencia de transducción indetectable en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica). Dicho tropismo (natural) reducido a anulado de la proteína de la cápside/cápside/vector de AAV recombinante puede potenciarse o restaurarse en presencia de un resto de unión multiespecífico, opcionalmente biespecífico, apropiado. En consecuencia, también se describen composiciones que comprenden (1) los vectores AAV recombinantes que tienen una cápside que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante descrita en el presente documento y (2) una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, que comprende el paratopo del anticuerpo y un ligando de direccionamiento, incluyendo composiciones que comprenden determinadas proporciones de vector vírico:molécula de unión multiespecífica; y también se describen en el presente documento sus usos para dirigir y/o introducir material genético en una célula diana. También se describen métodos para redireccionar un vector AAV recombinante, por ejemplo, para la administración dirigida de un nucleótido de interés a una célula diana, que comprende poner en contacto el vector AAV recombinante con una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, y también se describen métodos para producir el vector AAV recombinante.
En consecuencia, la presente invención proporciona una composición que comprende:
(i) un vector de virus adenoasociado (AAV) recombinante que comprende una cápside de AAV que encapsula un nucleótido de interés,
en donde la cápside de AAV comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante modificada para comprender un epítopo heterólogo, en donde la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV modificado para expresar el epítopo heterólogo;
(ii) una molécula de unión multiespecífica que comprende
(a) un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo heterólogo; y
(b) un ligando de redireccionamiento que se une específicamente a una proteína o marcador de superficie celular; y opcionalmente
(iii) un vehículo farmacéuticamente aceptable,
en donde la cápside de AAV presenta:
- tropismo reducido a anulado en ausencia de la molécula de unión multiespecífica; y
- tropismo modificado tras la combinación con la molécula de unión multiespecífica en comparación con una cápside de AAV de referencia, en donde la cápside de AAV de referencia comprende una proteína de la cápside de AAV de referencia que es idéntica a la proteína de la cápside de AAV recombinante excepto por la falta del epítopo heterólogo.
La presente invención proporciona además una composición de la presente invención para su uso en un método de terapia o diagnósticoin vivomediante la administración del nucleótido de interés a una célula diana que expresa una proteína de superficie celular que comprende poner en contacto la célula diana con la composición, en donde la molécula de unión multiespecífica comprende un ligando de redireccionamiento que se une a la proteína de superficie celular.
La presente invención también proporciona un método para administrarin vitrooex-vivoun nucleótido de interés a una célula diana que expresa una proteína de superficie celular que comprende poner en contacto la célula diana con la composición de la presente invención, en donde la molécula de unión multiespecífica comprende un ligando de redireccionamiento que se une a la proteína de superficie celular.
En el presente documento se describen proteínas de la cápside de AAV recombinantes que comprenden un epítopo que es heterólogo a la proteína de la cápside, en donde el epítopo o porción del mismo se une específicamente a un paratopo de anticuerpo y en donde la proteína de la cápside de AAV recombinante o una cápside de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV recombinante tiene un tropismo natural reducido a anulado, por ejemplo, en ausencia de un resto de unión multiespecífico, opcionalmente biespecífico.
En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo es insertado (presentado) por la proteína de la cápside de AAV recombinante de modo que la inserción y/o presentación del epítopo heterólogo reduce o anula el tropismo (natural) de la cápside de AAV en comparación con una cápside de AAV de referencia que carece del epítopo heterólogo, por ejemplo, la cápside de AAV comprende una mutación que comprende una inserción del epítopo en la posición de aminoácido y/o una sustitución de un aminoácido por el epítopo en la posición de aminoácido, en donde la mutación reduce o anula el tropismo (natural) de la proteína de la cápside de AAV, por ejemplo, en ausencia de un resto de unión multiespecífico, opcionalmente biespecífico. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta (presenta) por la proteína de la cápside de AAV de modo que la inserción y/o presentación reduce parcialmente el tropismo (natural) de la cápside de AAV recombinante en comparación con una cápside de AAV de referencia que carece del epítopo heterólogo, por ejemplo, en ausencia de un resto de unión multiespecífico, opcionalmente biespecífico, y la cápside de AAV comprende además una mutación adicional (por ejemplo, una sustitución, deleción, inserción distinta de la inserción de un epítopo heterólogo) que reduce aún más y/o anula el tropismo (natural) de la cápside de AAV recombinante o de vectores de AAV recombinantes que comprenden la misma, por ejemplo, en ausencia de un resto de unión multiespecífico, opcionalmente biespecífico, en comparación con una cápside de AAV de referencia que carece de la mutación.
Generalmente, las proteínas de la cápside de AAV recombinantes descritas en el presente documento pueden derivarse de un gen de la cápside de AAV, por ejemplo, están codificadas por un gen de la cápside de AAV modificado para expresar el epítopo y/o es un AAV genéticamente modificado. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante descrita en el presente documento se deriva de un gen de la cápside de AAV, por ejemplo, está codificada por un gen de la cápside modificado para expresar el epítopo y/o es una proteína de la cápside del virus adenoasociado (AAV) modificada genéticamente de un serotipo de AAV que infecta a los primates, en donde opcionalmente el AAV se selecciona del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2, AAV6, AAV8 o AAV9, por ejemplo, es una proteína de la cápside de AAV2 genéticamente modificada, una proteína de la cápside de AAV6 genéticamente modificada, una proteína de la cápside de AAV8 modificada genéticamente, o una proteína de la cápside de AAV9 genéticamente modificada. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2, por ejemplo, está codificada por un gen de la cápside de AAV2 modificado para expresar el epítopo y/o es una proteína de la cápside de AAV2 VP1, VP2 y/o VP3 genéticamente modificada, para lo cual la secuencia de aminoácidos de una proteína VP1 de AAV2 de tipo silvestre se establece respectivamente como SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV6, por ejemplo, está codificada por un gen de la cápside de AAV6 modificado para expresar el epítopo y/o es una proteína de la cápside de AAV6 VP1, VP2 y/o VP3 genéticamente modificada, para lo cual las secuencias de aminoácidos de VP1 de AAV6 de tipo silvestre se establecen como SEQ ID NO:3. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV8, por ejemplo, está codificada por un gen de la cápside de AAV8 modificado para expresar el epítopo y/o es una proteína de la cápside de AAV8 VP1, VP2 y/o VP3 genéticamente modificada, para lo cual la secuencia de aminoácidos de una proteína VP1 de AAV de tipo silvestre se establece respectivamente como SEQ ID NO:21. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV9, por ejemplo, está codificada por un gen de la cápside de AAV9 modificado para expresar el epítopo y/o es una proteína de la cápside de AAV9 VP1, VP2 o VP3 genéticamente modificada, para lo cual la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de VP1 de AAV9 se establece respectivamente como SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2, por ejemplo, está codificada por un gen de la cápside de AAV2 modificado para expresar el epítopo y/o es una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 genéticamente modificada de AAV2. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV6, por ejemplo, está codificada por un gen de la cápside de AAV6 modificado para expresar el epítopo y/o es una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 genéticamente modificada de AAV6. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV8, por ejemplo, está codificada por un gen de la cápside de AAV8 modificado para expresar el epítopo y/o es una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 genéticamente modificada de AAV8. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV9, por ejemplo, está codificada por un gen de la cápside de AAV9 modificado para expresar el epítopo y/o es una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 genéticamente modificada de AAV9.
En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de, por ejemplo, está codificada por un gen quimérico de la cápside de AAV modificado para expresar el epítopo, en donde el gen quimérico de la cápside de AAV comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico, en donde cada una de la pluralidad de secuencias de ácidos nucleico codifica una porción de una proteína de la cápside de AAV de un serotipo de AAV diferente, y en donde la pluralidad de secuencias de ácido nucleico codifican juntas una proteína de la cápside de AAV quimérica. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen quimérico de la cápside de AAV2. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen quimérico de la cápside de AAV6. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV se deriva de un gen quimérico de la cápside de AAV8. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen quimérico de la cápside de AAV9.
Generalmente, una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende un epítopo heterólogo insertado en y/o presentado por la proteína de la cápside de AAV recombinante de modo que el propio epítopo heterólogo reduce y/o anula el tropismo natural de la proteína de la cápside de AAV recombinante o de la cápside que comprende la misma, en comparación con una proteína de la cápside de AAV de referencia que carece del epítopo heterólogo o una cápside de a Av que comprende la proteína de la cápside de AAV de referencia, respectivamente. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta en (se presenta en) una región de la proteína de la cápside de AAV implicada con el tropismo natural de la proteína de la cápside de AAV de tipo silvestre de referencia, por ejemplo, una región de la proteína de la cápside de AAV implicada en el direccionamiento celular. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta en y/o se presenta mediante un dominio knob de una proteína fibra de Ad. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta en y/o se presenta mediante el bucle HI de una proteína fibra de Ad. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta y/o se presenta en el sitio de unión a heparina de una proteína de la cápside de AAV. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta y/o se presenta en el sitio de unión a heparina de una proteína de la cápside de AAV2. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta y/o se presenta en el sitio de unión a heparina de una proteína de la cápside de AAV6. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta y/o se presenta en el sitio de unión a heparina de una proteína de la cápside de AAV8. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta y/o se presenta en el sitio de unión a heparina de una proteína de la cápside de AAV9. En algunas realizaciones, (i) la proteína de la cápside de AAV se deriva de un gen de la cápside de AAV2 y el epítopo se inserta después y/o reemplaza un aminoácido en la posición I-453 o I-587 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 y/o aminoácidos en las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 de AAV2; (ii) la proteína de la cápside de AAV se deriva de un gen de la cápside de AAV6 y el epítopo se inserta después y/o reemplaza un aminoácido en la posición 1-585 de la proteína de la cápside VP1 de AAV6 y/o aminoácidos en las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 de AAV6; (iii) la cápside de AAV se deriva de un gen de la cápside de AAV8 y el epítopo se inserta después y/o reemplaza un aminoácido en la posición 1-590 de la proteína de la cápside VP1 de AAV8 y/o aminoácidos en las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 de AAV8, o (iv) la proteína de la cápside de AAV se deriva de un gen de la cápside de AAV9 y el epítopo se inserta después y/o reemplaza un aminoácido en la posición I-453 o I-589 de la proteína de la cápside VP1 de AAV9 y/o los aminoácidos en las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 de AAV9. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta inmediatamente después (por ejemplo, se fusiona al extremo C de) un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G-453 de la proteína VP1 de la cápside de AAV2 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside, o de los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a los seres humanos, por ejemplo, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9), N587 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a los seres humanos, por ejemplo, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9), Q585 de la proteína de la cápside VP1 de AAV6 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a los seres humanos, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, A<a>V4, AAV5, AAV7, AAV8 y AAV9), N-590 de la proteína de la cápside VP1 de AAV8 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a los seres humanos, por ejemplo, a Av 1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV9), G453 de la proteína de la cápside VP1 de AAV9 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside, o los correspondientes aminoácidos de VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a los seres humanos, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8), o A-589 de la proteína de la cápside VP1 de AAV9 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o v P3 de un AAV diferente que infecta a los seres humanos, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, a Av 4, AAV5, Aa V6, AAV7 y AAV8). En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta inmediatamente después (por ejemplo, se fusiona al extremo C de) G-453 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a los seres humanos, por ejemplo,<a>A<v>1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9). En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta inmediatamente después (por ejemplo, se fusiona al extremo C de) N587 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o<v>P3 de un AAV diferente que infecta a los seres humanos, por ejemplo, AAV1, AAV3, AAV4,<a>A<v>5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9). En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta inmediatamente después (por ejemplo, se fusiona al extremo C de Q-585 de la proteína de la cápside VP1 de AAV6 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a los seres humanos, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8 y AAV9). En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta inmediatamente después (por ejemplo, se fusiona al extremo C de) N-590 de la proteína de la cápside VP1 de AAV8 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a los seres humanos, por ejemplo, AA<v>1, AAV2, AAV3, A<a>V4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV9). En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta inmediatamente después (por ejemplo, se fusiona al extremo C de) G453 de la proteína de la cápside VP1 de AAV9 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a los seres humanos, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8). En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta inmediatamente después (por ejemplo, se fusiona al extremo C de) A-589 de la proteína de la cápside VP1 de AAV9 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside, o los aminoácidos correspondientes de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente que infecta a los seres humanos, por ejemplo, AA<v>1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8). En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta y/o presenta entre los aminoácidos N-587 y R-588 de una proteína de la cápside VP1 de AAV2 (o las posiciones correspondientes de las proteínas de la cápside VP2 y/o VP3 codificadas a partir del mismo gen de la cápside). En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante, el vector AAV que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de AAV recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante, el vector AAV que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de AAV recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante, el vector AAV que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de AAV recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID NO:25. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante, el vector AAV que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de AAV recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID NO:26. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante, el vector AAV1 que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de AAV recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID NO:27.
En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende una segunda y diferente mutación, además del epítopo heterólogo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento puede ser una proteína de la cápside de AAV2 genéticamente modificada, comprender un epítopo heterólogo, y puede comprender además una mutación, por ejemplo, una mutación R-585-A y/o R-588-A. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV2 genéticamente modificada, comprende un epítopo heterólogo insertado inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) G-453 de la proteína v P1 de AAV2, y comprende además una mutación seleccionada del grupo que consiste en R-585A y/o R-5889A. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV2 genéticamente modificada, comprende un epítopo heterólogo insertado inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) N587 de la proteína VP1 de AAV2, y comprende además una mutación seleccionada del grupo que consiste en R-585A y/o R-588A. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV9, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV9 genéticamente modificada, comprende un epítopo heterólogo insertado inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) G453 de la proteína VP1 de AAV9, y comprende además una mutación W503A. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV9, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV9 genéticamente modificada, comprende un epítopo heterólogo insertado inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) A589 de la proteína de la cápside VP1 de AAV9, y comprende además una mutación W503A.
Generalmente, una proteína de la cápside de AAV recombinante y/o un vector de AAV que comprende la cápside de AAV recombinante comprende un epítopo heterólogo que tiene al menos un aminoácido de longitud. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 aminoácidos y aproximadamente 35 aminoácidos, y forma un par de unión con un paratopo de anticuerpo, por ejemplo, un dominio variable de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo comprende al menos 10 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo comprende una etiqueta de afinidad. En algunos aspectos, el epítopo heterólogo y/o la etiqueta de afinidad no forman un par de unión con un dominio constante de inmunoglobulina. En algunos aspectos, el epítopo heterólogo y/o la etiqueta de afinidad no forma un par de unión con un ion metálico, por ejemplo, Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+, etc. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo no es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en estreptavidina, Strep II, HA, L14, 4C-RGD, LH y proteína A. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad se selecciona del grupo que consiste en FLAG (SEQ ID NO:7), HA (SEQ ID NO:8) y c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo comprende c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 6).
En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante es una proteína de la cápside VP1 de AAV2 genéticamente modificada y comprende un epítopo heterólogo que comprende la secuencia EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) insertado inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) G-453 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante (i) se deriva de un gen de la cápside de AAV2, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV2 genéticamente modificada, (ii) comprende un epítopo heterólogo que comprende la secuencia EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) y se inserta inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) G-453 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2, y (iii) además comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en R-585A y/o R-5889-A. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante es una proteína de la cápside VP1 de AAV2 genéticamente modificada y comprende un epítopo heterólogo que comprende la secuencia EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) insertado inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) N587 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante (i) se deriva de un gen de la cápside de AAV2, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV2 genéticamente modificada, (ii) comprende un epítopo heterólogo que comprende la secuencia EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) y se inserta inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) N587 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2, y (iii) comprende además un mutación seleccionada del grupo que consiste en R585A y/o R588A. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante (i) se deriva de un gen de la cápside de AAV6, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV6 genéticamente modificada, (ii) comprende un epítopo heterólogo que comprende la secuencia EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) y se inserta inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) Q-585 de la proteína de la cápside VP1 de AAV6. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante es una proteína de la cápside VP1 de AAV8 genéticamente modificada y comprende un epítopo heterólogo que comprende la secuencia EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) insertado inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) N590 de la proteína de la cápside VP1 de AAV8. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante es una proteína de la cápside VP1 de AAV9 genéticamente modificada y comprende un epítopo heterólogo que comprende la secuencia EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) insertado inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) G453 de la proteína de la cápside VP1 de AAV9. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante (i) se deriva de un gen de la cápside de AAV9, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV9 genéticamente modificada, (ii) comprende un epítopo heterólogo que comprende la secuencia EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) y se inserta inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) G453 de la proteína de la cápside VP1 de AAV9, y (iii) comprende además una mutación W503A. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante es una proteína de la cápside VP1 de AAV9 genéticamente modificada y comprende un epítopo heterólogo que comprende la secuencia EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) insertado inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) A589 de la proteína de la cápside VP1 de AAV9. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante (i) se deriva de un gen de la cápside de AAV9, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV9 genéticamente modificada, (ii) comprende un epítopo heterólogo que comprende la secuencia EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) y se inserta inmediatamente después (por ejemplo, fusionado al extremo C de) A589 de la proteína de la cápside VP1 de AAV9, y (iii) comprende además una mutación W503A.
En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por y/o unida operativamente a al menos 5 aminoácidos contiguos de una proteína de la cápside de VP1 de AAV. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por y/o unida operativamente a al menos 5 aminoácidos contiguos de una proteína de la cápside VP1 de AAV2. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada en I587 de una proteína de la cápside VP1 de AAV2. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada entre N587 y R588 de una proteína de la cápside VP1 de AAV2, por ejemplo, comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por y/o unida operativamente a al menos 5 aminoácidos contiguos de una proteína de la cápside VP1 de AAV6. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada en 1585 de una proteína de la cápside VP1 de AAV6. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada entre Q585 y S586 de una proteína de la cápside Vp 1 de AAV6, por ejemplo, comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) flanqueada por y/o unida operativamente a al menos 5 aminoácidos contiguos de una cápside VP1 de AAV8. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante comprende EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada en I590 de una proteína de la cápside VP1 de AAV8. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante comprende EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada entre N590 y T591 de una proteína de la cápside VP1 de AAV8, por ejemplo, comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 25.
En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por y/o unida operativamente a al menos 5 aminoácidos contiguos de una proteína de la cápside VP1 de AAV9. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante comprende EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada en I453 de una proteína de la cápside VP1 de AAV9. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante comprende EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada entre G-453 y S-454 de una proteína de la cápside VP1 de AAV9, por ejemplo, comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, una cápside de a Av recombinante comprende EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada en I589 de una proteína de la cápside VP1 de AAV9. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante comprende EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada entre A-589 y Q-590 de una proteína de la cápside VP1 de AAV9, por ejemplo, comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 27.
En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo comprende una etiqueta de afinidad y uno o más conectores. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo comprende una etiqueta de afinidad flanqueada por un conector, por ejemplo, el epítopo heterólogo comprende desde el extremo N al extremo C un primer conector, una etiqueta de afinidad y un segundo conector. En algunas realizaciones, el primer y el segundo conector son cada uno independientemente un polipéptido de al menos 1 aminoácido de longitud. En algunas realizaciones, un epítopo heterólogo como se describe en el presente documento, por ejemplo, una etiqueta de afinidad por sí sola o junto con uno o más conectores, tiene una longitud entre aproximadamente 5 aminoácidos y 35 aminoácidos. En algunas realizaciones, los conectores primero y segundo tienen longitudes idénticas y/o comprenden secuencias de aminoácidos idénticas.
Generalmente, en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento se ha reducido hasta anular el tropismo natural, por ejemplo, tiene una capacidad reducida o es incapaz de dirigirse y unirse a una célula de referencia de forma natural permisiva para la transducción en comparación con la de una cápside de AAV de referencia, por ejemplo, una cápside que comprende una proteína de la cápside de AAV de referencia, por ejemplo, una proteína de la cápside de a Av que sería idéntica a la proteína de la cápside de AAV recombinante excepto por la falta del epítopo heterólogo. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 10 % en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 20 % en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 30 % en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 40 % en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 50%en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 60 % en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 70 % en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 75 % en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 80 % en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 85 % en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 90 % en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 95 % en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV1 de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento muestra al menos una disminución del 99 % en la eficiencia de transducción en comparación con una cápside de AAV de referencia. En algunas realizaciones y en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, apropiada, la transducción de una célula de control mediante una cápside de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento es anulada, por ejemplo, es indetectable.
En algunas realizaciones, una cápside de AAV que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento es una cápside mosaico, por ejemplo, comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante que comprende un epítopo heterólogo y una proteína de la cápside de AAV de referencia que no comprende el epítopo heterólogo en una proporción determinada. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV de referencia es una proteína de la cápside de AAV de referencia de tipo silvestre por tanto comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de AAV de tipo silvestre que tiene el mismo serotipo que la proteína de la cápside de AAV recombinante. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV de referencia es una proteína de la cápside de AAV de referencia de control porque comprende una secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de AAV de referencia recombinante excepto que la proteína de la cápside de AAV de referencia de control carece del epítopo heterólogo. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV de referencia es una proteína de referencia de tipo silvestre mutada porque comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la de una proteína de la cápside de AAV de tipo silvestre que tiene el mismo serotipo que la proteína de la cápside de AAV recombinante excepto por una mutación, (por ejemplo, una inserción de una secuencia de aminoácidos, quimerización, etc.) que reduce el tropismo de la proteína de la cápside de AAV de tipo silvestre. En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento comprende, o un método descrito en el presente documento combina, una proteína de la cápside de AAV recombinante y una proteína de la cápside de referencia en una proporción que varía entre 1:1 y 1:15. En algunas realizaciones, la proporción es 1:2. En algunas realizaciones, la proporción es 1:3. En algunas realizaciones, la proporción es 1:4. En algunas realizaciones, la proporción es 1:5. En algunas realizaciones, la proporción es 1:6. En algunas realizaciones, la proporción es 1:7. En algunas realizaciones, la proporción es 1:8. En algunas realizaciones, la proporción es 1:9. En algunas realizaciones, la proporción es 1:10. En algunas realizaciones, la proporción es 1:11. En algunas realizaciones, la proporción es 1:12. En algunas realizaciones, la proporción es 1:13. En algunas realizaciones, la proporción es 1:14. En algunas realizaciones, la proporción es 1:15.
En el presente documento, también se divulgan ácidos nucleicos que codifican una proteína de la cápside de AAV recombinante descrita en el presente documento, composiciones que comprenden dichos ácidos nucleicos (por ejemplo, que pueden usarse en métodos para producir una cápside de AAV recombinante) y/o proteínas de la cápside de AAV recombinante (por ejemplo, composiciones que consisten prácticamente en una proteína de la cápside de AAV recombinante, composiciones que comprenden solo vectores de AAV encapsulados por una cápside que comprende una proteína de la cápside de AAV descrita en el presente documento, composiciones que comprenden dichos vectores de AAV y una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, (por ejemplo, en ciertas proporciones de vector de AAV a molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, (molécula:molécula), composiciones que comprenden dichos vectores de AAV, restos de redireccionamiento y un vehículo farmacéuticamente aceptable, etc.). En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) y una secuencia de nucleótidos que codifica al menos 5 aminoácidos contiguos de una proteína de la cápside de virus adenoasociado.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por y/o unida operativamente a al menos 5 aminoácidos contiguos de una proteína de la cápside VP1 de AAV2. En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada en I587 de una proteína de la cápside VP1 de AAV2. En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada entre N587 y R588 de una proteína de la cápside VP1 de AAV2, por ejemplo, en algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:2.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por y/o unida operativamente a al menos 5 aminoácidos contiguos de una proteína de la cápside VP1 de AAV6. En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada en I-585 de una proteína de la cápside VP1 de AAV6. En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada entre Q-585 y S-586 de una proteína de la cápside VP1 de AAV6, por ejemplo, en algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:4.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por y/o unida operativamente a al menos 5 aminoácidos contiguos de una proteína de la cápside VP1 de AAV8. En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada en I-590 de una proteína de la cápside VP1 de AAV8. En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada entre N-590 y T-591 de una proteína de la cápside VP1 de AAV8, por ejemplo, en algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:25.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por y/o unida operativamente a al menos 5 aminoácidos contiguos de una proteína de la cápside VP1 de AAV9. En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada en I453 de una proteína de la cápside VP1 de AAV9. En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada entre G453 y S454 de una proteína de la cápside VP1 de AAV9, por ejemplo, en algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:26. En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada en I589 de una proteína de la cápside VP1 de AAV9. En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada entre A589 y Q590 de una proteína de la cápside VP1 de AAV9, por ejemplo, en algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:27.
Generalmente, los vectores de AAV recombinantes como se describen en el presente documento comprenden una cápside de AAV que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento, en donde la cápside de AAV encapsula un nucleótido de interés. En algunas realizaciones, el nucleótido de interés está bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que consiste en un promotor vírico, un promotor bacteriano, un promotor de mamíferos, un promotor aviar, un promotor de pescado, un promotor de insectos y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el nucleótido de interés está bajo el control de un promotor no humano. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de citomegalovirus (CMV). En algunas realizaciones, el promotor es un promotor EF1a.
Generalmente, un nucleótido de interés puede ser uno o más genes, que pueden codificar un marcador detectable, por ejemplo, indicador, o un polipéptido terapéutico. En algunas realizaciones, el nucleótido de interés es un gen indicador. En algunas realizaciones, el nucleótido de interés es un gen indicador que codifica un marcador detectable seleccionado del grupo que consiste en proteína de fluorescencia verde, luciferasa, p-galactosidasa, etc. En algunas realizaciones, el marcador detectable es la proteína de fluorescencia verde. En otras realizaciones, el nucleótido de interés se selecciona del grupo que consiste en un gen suicida, un nucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, un nucleótido que codifica un sistema CRISPR/Cas o porción(es) del mismo, un nucleótido que codifica el ARN antisentido, un nucleótido que codifica ARNip, una enzima secretada, etc. En una realización, el nucleótido de interés codifica un compuesto terapéutico multidominio, por ejemplo, una proteína que comprende al menos dos dominios que proporcionan dos funciones distintas.
Las composiciones descritas en el presente documento generalmente comprenden un vector de AAV que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento, por ejemplo, comprende una cápside que comprende la proteína de la cápside de AAV recombinante, en donde la cápside encapsula un nucleótido de interés. En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento comprende (1) un vector de AAV que tiene una cápside que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante genéticamente modificada para comprender un epítopo heterólogo, (2) una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, que comprende (i) un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo y (ii) un ligando de redireccionamiento que se une específicamente a un receptor, y opcionalmente (3) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un paratopo de anticuerpo como se describe en el presente documento generalmente comprende como mínimo una región determinante de la complementariedad (CDR) que reconoce específicamente el epítopo heterólogo, por ejemplo, una región CDR3 de un dominio variable de cadena pesada y/o ligera. En algunas realizaciones, una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, comprende un anticuerpo (o porción del mismo) que comprende el paratopo del anticuerpo que se une específicamente al epítopo heterólogo. Por ejemplo, una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, puede comprender una región variable de cadena pesada de dominio único o una región variable de cadena ligera de dominio único, en donde la región variable de cadena pesada de dominio único o la región variable de cadena ligera de dominio único comprende un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo heterólogo. En algunas realizaciones, una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, puede comprender una región Fv, por ejemplo, una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, puede comprender un scFv, que comprende un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo heterólogo. En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, comprende un anticuerpo (o porción del mismo) que comprende un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo heterólogo, en donde el anticuerpo (o parte del mismo) comprende además uno o más dominios constantes del anticuerpo (por ejemplo, un dominio constante de cadena pesada (por ejemplo, CH1, bisagra, CH2, CH3, CH4, etc.) y/o un dominio constante de cadena ligera (por ejemplo, CL), en donde uno o más dominios constantes del anticuerpo no se unen al epítopo heterólogo.
Una molécula de unión multiespecífica, opcionalmente biespecífica, como se describe en el presente documento comprende además un ligando de redireccionamiento, además de un paratopo (por ejemplo, un anticuerpo o porción del mismo que comprende el paratopo) que se une específicamente al epítopo heterólogo insertado en/presentado por una proteína de la cápside de AAV recombinante. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une específicamente a un receptor en la superficie de una perla (por ejemplo, para el aislamiento y/o la purificación de una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento). En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une específicamente a una proteína de la superficie celular, por ejemplo, un receptor, marcador de superficie celular, etc., expresado en la superficie de una célula eucariota de mamífero (por ejemplo, humana), por ejemplo, una célula diana. En algunas realizaciones, un ligando de redireccionamiento se une a una célula hepática (humana), una célula cerebral (humana), un linfocito T (humano), una célula renal (humana), una célula intestinal (humana), una célula del páncreas (humana), una célula cancerosa (humana) y/o una célula (humana) infectada con un patógeno heterólogo. En algunas realizaciones, un ligando de redireccionamiento se une a un marcador específico de células hepáticas (humanas), un marcador específico de células cerebrales (humanas), un marcador específico de linfocitos T (humanos), un marcador específico de células renales (humanas), un marcador específico de células intestinales (humanas), un marcador específico de células del páncreas (humano), un marcador específico de células tumorales (humanas) y/o un epítopo patógeno.
En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por una célula hepática (humana), por ejemplo, un receptor de la asialoglicoproteína, por ejemplo, hASGRl. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por una célula neuronal (humana), por ejemplo, GABA, transferrina, etc. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por un linfocito T (humano), por ejemplo, CD3, por ejemplo, CD3e. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por una célula madre hematopoyética (humana), por ejemplo, CD34. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por una célula renal (humana). En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por una célula muscular (humana), por ejemplo, una integrina. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por una célula cancerosa (humana), por ejemplo, un antígeno asociado a tumor, por ejemplo, adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fetoproteína (AFP), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusión BCRABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, antígeno carcinoembrionario (CEA), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina-A1, proteína de fusión dek-can, DKK1, EFTUD2, Factor 2 de elongación, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, antígeno tumoral epitelial (ETA), proteína de fusión de ETV6-AML1, EZH2, E6, E7, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pme117, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDOl, IGF2B3, IL13Ralfa2, Carboxil esterasa intestinal, K-ras, Calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 (también conocido como CCDC110), LAGE-1, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, enzima mélica, mammaglobina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midquina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina, Miosina clase I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipéptido P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusión pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica (PEM), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerasa, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, Triosafosfato isomerasa, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinasa, tirosinasa (TYR), VEGF, WT1, XAGE-lb/GAGED2a, Kras, NY-ESO1, MAGE-A3, HPV E2, HPV E6, HPV E7, antígeno WT-1 (en linfoma y otros tumores sólidos), receptores de ErbB, Melan A [MART1], gp 100, tirosinasa, TRP-1/gp 75 y TRP-2 (en melanoma); MAGE-1 y MAGE-3 (en vejiga, cabeza y cuello, y carcinoma de células no pequeñas); proteínas HPV EG y E7 (en cáncer de cuello uterino); Mucina [MUC-1] (en cánceres de mama, páncreas, colon y próstata); antígeno prostético específico [PSA] (en cáncer de próstata); antígeno carcinoembrionario [CEA] (en cánceres de colon, mama y gastrointestinales) y antígenos específicos de tumores compartidos como MAGE-2, Ma GE-4, MAGE-6, MAGE-10, MAGE-12, BAGE-1, CAGE-1,2,8, CAGE-3 TO 7, LAGE-1, NY-ESO-1/LAGE-2, NA-88, GnTV, TRP2-INT2, etc. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a E6 y/o E7. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a Her2. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une al receptor de glucagón humano (hGCGR). En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a la ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 3 humana (hENTPD3).
En algunas realizaciones, el paratopo (por ejemplo, un anticuerpo o una porción del mismo) y el ligando de redireccionamiento se fusionan directamente entre sí. En algunas realizaciones, el paratopo (por ejemplo, un anticuerpo o porción del mismo) que se une específicamente al epítopo heterólogo y el ligando de redireccionamiento están unidos covalentemente entre sí.
En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica es una molécula de unión biespecífica, por ejemplo, un anticuerpo que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno comprende un paratopo que se une específicamente al epítopo heterólogo insertado en/presentado por una proteína de la cápside de AAV recombinante y el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a una proteína o marcador de la superficie celular expresado por una célula diana. En algunas realizaciones, la molécula de unión biespecífica es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno comprende un paratopo que se une específicamente al epítopo heterólogo insertado en/presentado por una proteína de la cápside de AAV recombinante y el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a un receptor expresado por una célula diana, en donde el primer dominio de unión a antígeno está unido operativamente a una primera región de cadena pesada que comprende un primer dominio CH3, en donde el segundo dominio de unión a antígeno está unido operativamente a una segunda región de cadena pesada que comprende un segundo dominio CH3, en donde el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio C<h>3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio C<h>3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H-95-R (según la numeración de exones IMGT; H435R según la numeración EU). El segundo dominio Ch3 puede comprender además una modificación Y-96-F (según IMGT; Y-436-F según EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo dominio C<h>3 incluyen: D-16-E, L-18-M, N-44-S, K-52-N, V-57-M y V-82-I (según IMGT; D-356-E, L-358-M, N-384-S, K-392-N, V-397-M y V-422-I según EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N-44-S, K-52-N y V-82-I (IMGT; N-384-S, K-392-N y V-422-I según EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q-15-R, N-44-S, K-52-N, V-57-M, R-6-9K, E-79-Q y V-82-I (según IMGT; Q-355-R, N-384-S, K-392-N, V-397-M, R-409-K, E-419-Q y V-422-I según EU) en el caso de anticuerpos IgG4.
En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica es una molécula de unión biespecífica, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une a una etiqueta de afinidad presentada por una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento, y en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une a un receptor expresado en la superficie de una célula diana. En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica es una molécula de unión biespecífica, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une a la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) presentada por una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento, y en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une a un receptor expresado en la superficie de una célula diana. En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica es una molécula de unión biespecífica, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une a la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) presentada por una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento, y en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une a hASGR1. En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica es una molécula de unión biespecífica, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une a la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) presentada por una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento, y en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une a una proteína CD3, por ejemplo, CD3<e>. En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica es una molécula de unión biespecífica, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une a la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) presentada por una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento, y en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une a una integrina. En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica es una molécula de unión biespecífica, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une a la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) presentada por una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento, y en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une a un receptor de glucagón humano, por ejemplo, hGCGR. En algunas realizaciones, la molécula de unión multiespecífica es una molécula de unión biespecífica, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une a la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) presentada por una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento, y en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une a ENTPD3.
También se describen en el presente documento métodos para producir y utilizar las proteínas de la cápside de AAV recombinante, vectores AAV que comprenden las mismas, composiciones, etc. En algunas realizaciones, un método para redirigir un virus adenoasociado, etc.; la administración de carga diagnóstica/terapéutica a una célula diana, etc. comprende combinar un vector de AAV recombinante que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento, por ejemplo, un vector de AAV que comprende una cápside que comprende una cápside de AAV recombinante que presenta un epítopo heterólogo, con una molécula de unión biespecífica, en donde la molécula de unión biespecífica comprende (i) un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo y (ii) un ligando de redireccionamiento que se une específicamente a un receptor. Dichos métodos pueden incluir como primera etapa producir un vector de AAV recombinante, por ejemplo, cultivar una célula empaquetadora en condiciones suficientes para la producción de vectores de AAV, en donde la célula empaquetadora comprende un plásmido que codifica la proteína de la cápside de AAV que comprende el epítopo. Al entregar carga diagnóstica/terapéutica a una célula diana, los métodos descritos en el presente documento pueden comprender poner en contacto la célula diana con la combinación de un vector de AAV que comprende una cápside de AAV que comprende una cápside de AAV recombinante que presenta un epítopo heterólogo y una molécula de unión multiespecífica, en donde la molécula de unión multiespecífica comprende (i) un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo y (ii) un ligando de redireccionamiento que se une específicamente a un receptor expresado por la célula diana. En algunas realizaciones, la célula diana estáin vitro.En otras realizaciones, la presente invención también proporciona una composición de la presente invención para su uso en un método de tratamiento o diagnósticoin vivo,comprendiendo el método administrar el nucleótido de interés a una célula diana que expresa una proteína de la superficie celular que comprende poner en contacto la célula diana con la composición, en donde la molécula de unión multiespecífica comprende un ligando de redireccionamiento que se une a la proteína de superficie celular. Por ende, en dichas realizaciones, la célula diana estáin vivoen un sujeto, por ejemplo, un ser humano.
En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento comprende, o un método descrito en el presente documento combina, un vector AAV recombinante que comprende un nucleótido de interés encapsulado con una cápside que comprende una proteína de la cápside recombinante como se describe en el presente documento y una molécula de unión multiespecífica en una proporción molécula:molécula que restaura la eficiencia de transducción del vector AAV similar a la de un vector AAV de referencia. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) varía de 1:0,5 a 1:100. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) varía de 1:4 a 1:20. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión biespecífica (molécula:molécula) varía de 1:8 a 1:15. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es de 1:4. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es de 1:8. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es de 1:15. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es de 1:20.
También se describen en el presente documento métodos para inactivar una cápside de AAV y/o producir vectores AAV, cuyos métodos comprenden generalmente (a) insertar un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga en una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside de AAV para formar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de AAV genéticamente modificada que comprende la proteína heteróloga y/o (b) cultivar una célula empaquetadora en condiciones suficientes para la producción de vectores AAV, en donde la célula empaquetadora comprende la secuencia de nucleótidos. En algunas realizaciones, la célula empaquetadora comprende además un plásmido auxiliar y/o un plásmido de transferencia que comprende un nucleótido de interés. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además aislar vectores víricos adenoasociados autocomplementarios del sobrenadante del cultivo. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además lisar la célula empaquetadora y aislar vectores víricos adenoasociados monocatenarios del lisado celular. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además (a) eliminar restos celulares, (b) tratar el sobrenadante que contiene vectores AAV con ADNasa I y MgCl2, (c) concentrar los vectores AAV, (d) purificar los vectores AAV, y (e) cualquier combinación de (a)-(d). También se proporcionan en el presente documento un vector AAV elaborado de acuerdo con el método descrito en el presente documento, y células empaquetadoras útiles para producir un vector AAV como se describe en el presente documento, por ejemplo, se describen células empaquetadoras que comprenden un plásmido que codifica una proteína de la cápside de AAV recombinante.
Breve descripción de los dibujos
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LaFigura 1proporciona imágenes de microscopía de inmunofluorescencia(panel superior)o histogramas obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)(panel inferior)evaluando la expresión de fluorescencia verde (GFP) por células HepG2 incubadas con (A) únicamente vectores víricos scAAV2-CMV-eGFP de tipo silvestre; (B) únicamente vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP; vectores víricos scAAV2-N587Myc mezclados con anticuerpos biespecíficos anti-Myc-ASGR1 en las siguientes proporciones: (C) 1:0,5, (D) 1:1, (E) 1:2, (F) 1:4, (G) 1:8, (H) 1:15, (I) 1:20, (J) 1:50, o (K) 1:100; (L) o vectores víricos scAAV-N587Myc mezclados con anticuerpo monoespecífico anti-Myc en una proporción de 1:8.
La Figura 2A proporciona diagramas de puntos obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúan la expresión de fluorescencia verde (GFP) mediante células 29T3-hASGR1 incubadas únicamente con vectores víricos scAAV2 de tipo silvestre (i), únicamente vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (ii), vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP mezclados con anticuerpos biespecíficos anti-Myc-ASGR1 en las siguientes proporciones: 1:0,5 (iii), 1:1 (iv), 1:2 (v), 1:4 (vi), 1:8 (vii), 1:15 (viii), 1:20 (ix), o 1:100 (x), o vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP mezclados con anticuerpo anti-Myc-GCGR biespecífico irrelevante en una proporción de 1:8 (xii). También se muestra la expresión de GFP por células 29T3 incubadas con vectores víricos scAAV-N587Myc mezclados con anticuerpos biespecíficos anti-Myc-ASGR1 en una proporción de 1:8 (xi). Para cada experimento, se utilizaron 2x105 células y 5x109 vectores víricos.
La Figura 2B proporciona histogramas obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúan la expresión de fluorescencia verde (GFP) mediante células 29T3-hASGR1 incubadas únicamente con vectores víricos AAV9-CAGG-GFP no modificados (i) únicamente vectores víricos AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP (ii), vectores víricos AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP mezclados con anticuerpos biespecíficos anti-Myc-ASGR1 en las siguientes proporciones: 1:1 (iii), 1:2 (iv), 1:4 (v), 1:8 (vi), 1:20 (vii), 1:50 (viii), o 1:100 (ix). Para cada experimento, se utilizaron 2x105 células y 1x1010 vectores víricos (titulados por qPCR).
LaFigura 3proporciona gráficos de puntos obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúan la expresión de fluorescencia verde (GFP) por células 29T3-hASGR1 preincubadas con anticuerpo bivalente anti-ASGR1 a una concentración de 0 nM (C), 50 nM (D), 10 nM (E), 2 nM (F), 0,4 nM (G), 0,08 nM (H), 0,016 nM (I) o 0,0032 nM (J) y posteriormente infectado con vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP mezclados con anticuerpos biespecíficos anti-Myc-ASGR1 en una proporción de 1:8 (L). Células 293T3-hASGR1 incubadas únicamente con vectores víricos de scAAV de tipo silvestre (A) o únicamente vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (B) sirven como controles. Para cada experimento, se utilizaron 2x105 células y 5x109 vectores víricos (titulados por qPCR).
LaFigura 4proporciona imágenes de microscopía de inmunofluorescencia que evalúan la expresión de fluorescencia verde (GFP) mediante células 293T-hASGR1 incubadas únicamente con vectores víricos scAAV de tipo silvestre (A), únicamente vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (B), o incubados secuencialmente con 1x109 (C), 2x109 (D), 4x109(E), 8x109 (F), 2x1010 (G), 1x1011 (H), 1x1012 (I) anticuerpos biespecíficos anti-Myc-ASGR1 seguidos de 1x109 vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP. También se muestran imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de células 293T incubadas secuencialmente con 1x1011 moléculas de anticuerpo anti-myc-ASGR1 seguidas de 1x109 vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (J), y células 293T-hASGR1 incubadas secuencialmente con 1x1011 moléculas de anticuerpo anti-Myc-GCGR biespecíficas irrelevantes seguidas de 1x109 vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (K).
LaFigura 5proporciona gráficos de puntos obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúan la expresión de fluorescencia verde (GFP) por células 29T3-hASGR1 incubadas únicamente con vectores víricos ssAAV de tipo silvestre (A), únicamente vectores víricos ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP (B), vectores víricos ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP mezclados con anticuerpos biespecíficos anti-Myc-ASGR1 en las siguientes proporciones: 1:1 (C), 1:2 (D), 1:4 (E), 1:8 (F), 1:20 (G), 1:100 (H), 1:1000 (I), o vectores víricos ssAAV-N587Myc mezclados con anticuerpo anti-Myc-GCGR biespecífico irrelevante en una proporción de 1:8 (K). También se muestra la expresión de GFP por células 29T3 incubadas con vectores víricos ssAAV-N587Myc mezclados con anticuerpos biespecíficos anti-Myc-ASGR1 en una proporción de 1:8 (J). Para cada experimento, se utilizaron 2x105 células y 5x109 vectores víricos.
LaFigura 6proporciona gráficos de puntos obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúan la expresión de fluorescencia verde (GFP) por células 29T3-hGCGR incubadas únicamente con vectores víricos scAAV de tipo silvestre (A), únicamente vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (B), vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP mezclados con anticuerpos anti-Myc-GCGR biespecíficos en las siguientes proporciones: 1:0,5 (C), 1:1 (D), 1:2 (E), 1:4 (F), 1:8 (G), 1:15 (H), 1:20 (I), 1:50 (J) o 1:100 (K), o vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP mezclados con un anticuerpo anti-Myc monoespecífico irrelevante (Regeneron Pharmaceuticals, Tarrytown, Nueva York) en una proporción de 1:8 (L). Para cada experimento, se utilizaron 2x105 células y 5x109 vectores víricos.
LaFigura 7proporciona diagramas de puntos obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúan la expresión de fluorescencia verde (GFP) mediante células Jurkat solas (A) o células Jurkat incubadas únicamente con vectores víricos scAAV6-EF1-eGFP de tipo silvestre (B), únicamente vectores víricos AAV6-Q585Myc-EFla-eGFP (C), vectores víricos AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP mezclados con anticuerpos biespecíficos anti-Myc-CD3 en las siguientes proporciones: 1:1 (D), 1:5 (E), 1:10 (F), 1:100 o (G), 1:1000 (H). Para cada experimento, se utilizaron 2x105 células y 1x109 vectores víricos.
La Figura 8A proporciona imágenes de microscopía de inmunofluorescencia del hígado. La Figura 8B proporciona imágenes de microscopía de inmunofluorescencia del bazo. La Figura 8C proporciona imágenes de microscopía de inmunofluorescencia del riñón. Todas las muestras se toman de ratones C57BL/6 modificados transgénicamente para expresar ASGR1 humano mediante células hepáticas (i-iv) o ratones C57BL/6 de tipo silvestre (v-viii) diez días después de la inyección intravenosa con 1x1011 scAAV2-CMV-eGFP de tipo silvestre (i, v), solución salina (ii, vi), 1x1011 vectores víricos scAAV2-N587myc-CMV-eGFP solos (iii, vii), o vectores víricos scAAV2-N587myc-CMV-eGFP con anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 (iv, viii).
LaFigura 9proporciona imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de muestras de hígado tomadas de ratones C57BL/6 modificados transgénicamente para expresar ASGR1 humano en células hepáticas (D-F, J-L, P-R) o ratones C57BL/6 de tipo silvestre (A-C, G-I, M-O) cuatro semanas después de la inyección intravenosa con 2,18x1011 ssAAV2-CAGG-eGFP de tipo silvestre (B, C, E, F), solución salina (A, D), 2,18x1011 vectores víricos ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP solos (G-I, J-L), o vectores víricos ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP con anticuerpo anti-myc-ASGR1 biespecífico (M-O, P-R). Cada imagen representa un ratón.
LaFigura 10proporciona imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de muestras de hígado tomadas de ratones C57BL/6 modificados transgénicamente para expresar ASGR1 humano mediante células hepáticas diez días después de la inyección intravenosa con (A) AAV9 de tipo silvestre, (B) NaCl 250 nM (C) partículas víricas AAV9-A589myc-CAGG-eGFP junto con anticuerpo biespecífico anti-myc-hCD3, o (D) partículas víricas AAV9-A589myc-CAGG-eGFP junto con anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1.
LaFigura 11proporciona formatos de moléculas de unión multiespecíficas ilustrativos, no a escala y como ejemplo no limitante útiles en algunas realizaciones de la invención.
LaFigura 12proporciona gráficos de puntos obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúan la expresión de fluorescencia verde (GFP) por células 29T3-hASGR1 incubadas con (A) únicamente vectores víricos AAV8 de tipo silvestre, (C) únicamente vectores víricos AA8-N590-myc, o vectores víricos pAAV RC8 N590myc mezclados con moléculas biespecíficas anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc biespecíficas en las siguientes proporciones (D) 1:1, (E) 1:2, (F) 1:4, (G) 1:8, (H) 1:12, (I) 1:15, (J) 1:50, o (K) 1:100. También se muestra la expresión de GFP por células 29T3-hASGR1 transfectadas simuladas (B). Para cada experimento, se utilizaron 2x105 células y 1x109 vectores víricos.
LaFigura 13proporciona imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de muestras de hígado tomadas de ratones C57BL/6 modificados transgénicamente para expresar ASGR1 humano mediante células hepáticas diez días después de la inyección intravenosa con(A)-(C)AAV8 de tipo silvestre,(D)-(F)vectores víricos AA8-N590-myc y molécula de unión biespecífica de control, o(G)-(I)partículas víricas AAV8 N590myc-CAGG-eGFP junto con las moléculas de unión biespecíficas anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc.
LaFigura 14proporciona diagramas de puntos obtenidos de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) que evalúan la expresión de fluorescencia verde (GFP) por células 29T3-h ENTPD3 incubadas con (A) únicamente vectores víricos AAV2 de tipo silvestre, (B) únicamente vectores víricos AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP, o vectores víricos AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP mezclados con moléculas biespecíficas anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc biespecíficas en las siguientes proporciones (C) 1:1, (D) 1:2, (E) 1:4, (F) 1:8, (G) 1:20, (H) 1:50, (I) 1:100, o (K) 1:200. Para cada experimento, se utilizaron 2x105 células y 1x109 vectores víricos
La Figura 15A proporciona imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de muestras de hígado, la Figura 15B proporciona imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de muestras de intestino y la Figura 15C proporciona imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de muestras de páncreas. Todas las muestras se toman de ratones C57BL/6 de tipo silvestre diez días después de la inyección intravenosa con PBS(15A(i), 15B(i) y 15C(i)), 5x1011 AAV9 de tipo silvestre(15A(ii), 15B(ii), y15C(ii)),5x1011 vectores víricos AAV2-N587myc-CAGG-eGFP con 1x103 proteínas de unión IgG4-Fc/anti-myc biespecíficas irrelevantes(15A(iii), 15B(iii), y15C(iii)),o 5x1011 vectores víricos AAV2-N587myc-CAGG-eGFP con 1x1013 proteínas de unión hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc biespecíficas(15A(iv), 15B(iv)y15C(iv)).
Descripción detallada
Un problema común con los enfoques de adaptador que utilizan cápsides víricas no modificadas o cápsides víricas modificadas con armazón han sido las eficiencias de transducción subóptimas de las cápsides modificadas. (Grifmanet al.(2001)Mol. Ther.3:964-75). Por ejemplo, Curielet al.describen la generación y caracterización de un vector adenoviral recombinante que contiene fibras con una secuencia RGD-4C incorporada genéticamente dentro del bucle HI del dominio knob carboxi terminal y demuestran la utilidad del bucle HI del knob de la fibra como un sitio óptimo para la incorporación de ligandos de péptido corto. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 7.297.542; véase también Beatty y Curiel (2012)Av. Cáncer. Res.115:39-67. De forma similar, la inserción de péptidos ligandos en las proteínas de la cápside de AAV dio como resultado cápsides que eran capaces de presentar el ligando en la superficie de la cápside y mediar en la transducción a través de la interacción del ligando con su receptor, redirigiendo de este modo el tropismo vírico mediante modificaciones genéticas de la cápside (Girodet al.(1999)Nat. Medicina.5(9):1052-6, 1438 (erratas incluidas) (1999); Grifmanet al.(2001)Mol. Ther.3(6):964-75; Nicklinet al.(2001)Mol. Ther.4(3):174-81; Shiet al.(2001)Hum Gene Ther.17(3):353-61 (2006); Wuet al.(2000)J. Virol.74(18):8635-47). En particular, se ha demostrado que la inserción de un motivo Arg-Gly-Asp (RGD) de unión a integrina en el sitio de inserción I-587 de la proteína VP1 de la cápside de AAV permitió a los vectores víricos de AAV transducir células a través de avp<1>integrinas (Girodet al.(1999) citado anteriormente). Por el contrario, aunque la inserción del péptido L14 de 14 aminoácidos después del aminoácido R447 (I-447) condujo a que las cápsides todavía fueran reconocidas por el anticuerpo A20 sensible a la conformación, dichos vectores víricos recombinantes no pudieron transducir células que expresaban el receptor L-14, (Girodet al.,1999; cf. Wuet al.(2000) (informando de la inserción de un péptido de hemaglutinina (HA) en la posición I-447 y de la transducción exitosa de células que expresan el péptido de HA). La inserción de un epítopo Myc entre T448 y N449 fue reconocida por un anticuerpo anti-Myc y, por lo tanto, estaba presente en la superficie de la cápside, pero condujo a vectores víricos inactivados. (Grifmanet al.,2001). Por el contrario, se informó nuevamente de un redireccionamiento exitoso para la inserción de un motivo NGR después de N587, pero no la inserción de c-myc después de N587. (Grifmanet al.,2001). La patente de EE. UU. N.° 9.624.274 describe el I-453 de una proteína de la cápside de AAV como un sitio de inserción adecuado para un epítopo heterólogo. Aunque estos estudios demuestran la inserción y presentación exitosa de un péptido heterólogo, por ejemplo, epítopo, por las proteínas de la cápside del AAV, ninguno de estos estudios proporciona ninguna expectativa de que una molécula de unión multiespecífica, por ejemplo, una molécula de unión biespecífica tal como un anticuerpo biespecífico, que se une específicamente al péptido heterólogo y una proteína de la superficie celular, pueda redirigir los vectores víricos modificados hacia células que expresan la proteína de superficie celular y restaurar sus eficiencias de transducción.
En el presente documento se divulgan proteínas de la cápside de AAV recombinantes que se modifican con un epítopo heterólogo, que pueden usarse en conexión con una molécula de unión multiespecífica que comprende un paratopo, por ejemplo, un dominio Fv, que se une específicamente al epítopo y un ligando que se une a un receptor expresado en la superficie de una célula diana. Como se muestra en el presente documento, poner en contacto vectores de AAV que tienen cápsides formadas con las proteínas de la cápside de AAV descritas en el presente documento con una molécula de unión multiespecífica en determinadas proporciones restaura la eficiencia de transducción de la cápside de AAV a niveles comparables a los del virus de tipo silvestre, véase, por ejemplo, el Ejemplo 2. Las proteínas de la cápside modificadas con epítopos heterólogos como se describe en el presente documento se derivan de adenovirus (Ad) y virus adenoasociados (AAV).
Aunque la invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencia a un número de realizaciones, los expertos en la materia entenderán que las diversas realizaciones divulgadas en el presente documento no pretenden actuar como limitaciones en el alcance de las reivindicaciones.
Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención puede utilizarse cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento, a continuación, se describen algunos métodos y materiales preferidos. A menos que se definan de otra manera, todas las expresiones/términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento, tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.
Definiciones
A menos que se definan de otra manera, todas las expresiones/términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento, tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.
Las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "un método" incluye uno o más métodos, y/o etapas del tipo descrito en el presente documento y/o que llegará a ser evidente para los expertos en la materia tras leer esta divulgación.
El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende un dominio variable de cadena pesada (V<h>) y una región constante de cadena pesada (C<h>). La región constante de la cadena pesada comprende al menos tres dominios, Cl1, Ch2, Ch3 y opcionalmente CH<4>. Cada cadena ligera comprende un dominio variable de cadena ligera (C<h>) y una región constante de cadena ligera (C<l>). Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada dominio variable de cadena pesada y cadena ligera comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDr 3, FR4 (las CDR de cadena pesada pueden abreviarse como HCDR1, HCDR2 y HCDR3; las CDR de cadena ligera pueden abreviarse como LCDR1, LCDR2 y LCDR3. Las estructuras típicas de anticuerpos tetraméricos comprenden dos dominios de unión a antígeno idénticos, cada uno de los cuales formado por asociación de los dominios Vh y Vl, y cada uno de los cuales junto con sus respectivos dominios Ch y Cl forman la región Fv del anticuerpo. Los anticuerpos de dominio único comprenden un único dominio de unión a antígeno, por ejemplo, una V<h>o una V<l>. El término "anticuerpo" abarca anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, Fv monocatenario (scFv), anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), intracuerpos, minicuerpos, diacuerpos y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra TCR específico de antígeno) y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. Los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" también se refieren a diacuerpos covalentes tales como los divulgados en la publicación de solicitud de patente EE. UU. 2007/0004909 e Ig-DARTS tales como los divulgados en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2009/0060910. Los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunitariamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.
El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, la parte de un anticuerpo que reconoce y se une al epítopo de un antígeno, también se denomina "paratopo". Es una región pequeña (de 5 a 10 aminoácidos) de la región Fv de un anticuerpo, parte del fragmento de unión a antígeno (región Fab), y puede contener partes de las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo. Un paratopo se une específicamente a un epítopo cuando el paratopo se une al epítopo con una alta afinidad. La expresión anticuerpo de "alta afinidad" se refiere a un anticuerpo que tiene una K<d>con respecto a su epítopo diana de aproximadamente 10'9 M o inferior (por ejemplo, aproximadamente 1 x 10'9 M, 1 x 10'10 M, 1 x 10'11 M, o aproximadamente 1 x 10'12 M). En una realización, K<d>se mide por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™; en otra realización, la Kd se mide por ELISA.
La expresión "región determinante de la complementariedad", o el término "CDR", incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia del ácido nucleico de los genes de la inmunoglobulina de un organismo que normalmente (es decir, en un animal de tipo silvestre) aparecen entre dos regiones marco en una región variable de una cadena ligera o una cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de linfocitos T). Una CDR puede estar codificada por, por ejemplo, una secuencia de la línea germinal o una secuencia reorganizada o no reorganizada, y, por ejemplo, por un linfocito B o un linfocito T virgen o maduro. Una CDR puede estar mutada somáticamente (por ejemplo, variar a partir de una secuencia codificada en una línea germinal del animal), humanizada, y/ modificada con sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDR pueden estar codificadas por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de la línea germinal) que no son contiguas (por ejemplo, en una secuencia del ácido nucleico no reorganizada) pero son contiguas en una secuencia del ácido nucleico de un linfocito B, por ejemplo, como resultado del corte y empalme o de la conexión de las secuencias (por ejemplo, recombinación V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).
Un "epítopo" es la parte de una macromolécula que es reconocida por el sistema inmunitario, específicamente por los anticuerpos, los linfocitos B o linfocitos T citotóxicos. Aunque generalmente se piensa que los epítopos derivan de proteínas no propias, las secuencias derivadas del hospedador que pueden reconocerse también se clasifican como epítopos. Los epítopos tienen una longitud de al menos 4 aminoácidos, preferentemente de 4 a 30 aminoácidos, más preferentemente de 5 a 20 aminoácidos, especialmente de 5 a 15 aminoácidos. Los epítopos pueden ser lineales o tridimensionales, formados normalmente por aminoácidos que están distantes entre sí en la estructura proteica primaria pero que se vuelven estrechamente relacionados en una estructura secundaria y/o terciaria. Los epítopos que son reconocidos específicamente por los linfocitos B se denominan epítopos de linfocitos B.
La expresión "repetición terminal invertida" o "ITR" incluye secuencias de ácido nucleico simétricas en el genoma de virus adenoasociados necesarios para una replicación eficaz. Las secuencias de ITR se encuentran en cada extremo del genoma de ADN del AAV. Las ITR sirven como los orígenes de replicación para la síntesis de ADN vírico y son componentes en cis esenciales para generar vectores de AAV de integración.
La expresión "cadena ligera" incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo, y a menos que se especifique lo contrario incluye las cadenas ligeras k y A y VpreB, así como cadenas ligeras subrogadas. Los dominios variables de cadena ligera incluyen normalmente tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones marco (FR), a menos que se especifique lo contrario. Generalmente, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino al extremo carboxilo, un dominio variable que incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, y una región constante de cadena ligera. Un dominio variable de cadena ligera está codificado por una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera, que comprende generalmente segmentos de V<l>y J<l>, derivados de un repertorio de segmentos V y J presentes en la línea germinal. Las secuencias, ubicaciones y la nomenclatura de los segmentos de cadenas ligeras V y J para diferentes organismos se pueden encontrar en la base de datos IMGT, www.imgt.org.
Las cadenas ligeras incluyen aquellas, por ejemplo, que no se unen selectivamente a un primer o un segundo epítopo unido selectivamente por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras incluyen también aquellas que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada o a otra cadena ligera con la unión y el reconocimiento, uno o más epítopos unidos selectivamente por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras comunes o universales incluyen aquellas derivadas de un gen V<k>1-39J<k>humano o un gen V<k>3-20J<k>humano, e incluyen versiones somáticamente mutadas (por ejemplo, maduradas por afinidad) de las mismas. Los segmentos V i humanos ilustrativos incluyen un segmento génico Vk1-39 humano, un segmento génico Vk3-20 humano, un segmento génico VA1-40 humano, un segmento génico VA1-44 humano, un segmento génico VA2-8 humano, un segmento génico VA2-14 humano y un segmento génico VA3-21 humano, e incluyen versiones somáticamente mutadas (por ejemplo, maduradas por afinidad) de los mismos. Se pueden producir cadenas ligeras que comprendan un dominio variable de un organismo (por ejemplo, ser humano o roedor, por ejemplo, rata o ratón; o pájaro, por ejemplo, pollo) y una región constante del mismo organismo o de uno diferente (por ejemplo, ser humano o roedor, por ejemplo, rata o ratón; o pájaro, por ejemplo, pollo).
El término "alrededor de" o "aproximadamente" incluye estar dentro de un intervalo estadísticamente significativo de un valor. Dicho intervalo puede estar dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro del 50 %, más preferentemente dentro del 20 %, aún más preferentemente dentro del 10%, e incluso más preferentemente dentro del 5% de un valor o intervalo dado. La variación permisible abarcada por el término "aproximadamente" o "alrededor de" depende del sistema particular que se esté estudiando, y puede apreciarse fácilmente por un experto en la materia.
El término "etiqueta de afinidad" incluye una secuencia polipeptídica que es miembro de un par de unión específico, por ejemplo, que se une específicamente con otra secuencia polipeptídica, por ejemplo, un paratopo de anticuerpo, con alta afinidad. Las etiquetas de afinidad ilustrativas y no limitantes incluyen la etiqueta de hexahistidina, la etiqueta FLAG, etiqueta Strep II, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SBP), péptido de unión a calmodulina (CBP), glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP), etiqueta S, etiqueta HA y etiqueta c-Myc. (Revisado en Zhaoet al.(2013)J. Analytical Meth. Chem.1-8).
La expresión "proteína de la cápside" incluye una proteína que forma parte de la cápside del virus. Para los virus adenoasociados, las proteínas de la cápside generalmente se denominan VP1, VP2 y/o VP3, y cada una está codificada por un único gencap.Para el AAV, las tres proteínas de la cápside del a Av se producen de forma superpuesta a partir del marco de lectura abierto (ORF) decapmediante corte y empalme de ARNm alternativo y/o uso alternativo de codones de inicio de traducción, aunque las tres proteínas utilizan un codón de parada común. Warringtonet al.(2004)J. Virol.78:6595. VP1 de AAV2 generalmente se traduce a partir de un codón de inicio ATG (aminoácido M1) en un ARNm de 2,4 kb, mientras que VP2 y VP3 de AAV2 surgen de un ARNm más pequeño de 2,3 kb, usando un codón de inicio ACG más débil para la producción de VP2 (aminoácido T138) y traducción completa al siguiente codón ATG disponible (aminoácido M203) para la producción de la proteína de la cápside más abundante, VP3.Warrington,citado anteriormente; Rutledgeet al.(1998)J. Virol.72:309-19. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la cápside de virus adenoasociados son bien conocidas en la técnica y generalmente están conservadas, particularmente sobre los dependoparvovirus. Véase, Rutledgeet al,citado anteriormente. Por ejemplo, Rutledgeet al.(1998), citado anteriormente, proporciona en la Figura 4B alineamientos de secuencias de aminoácidos para proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 de AAV2, AAV3, AAV4 y AAV6, en donde los sitios de inicio para cada una de las proteínas de la cápside Vp1, VP2 y VP3 están indicadas por flechas y los dominios variables están encuadrados. En consecuencia, aunque las posiciones de aminoácidos proporcionadas en el presente documento pueden proporcionarse en relación con la proteína de la cápside VP1 del AAV, y las posiciones de aminoácidos proporcionadas en el presente documento que no se especifican adicionalmente se refieren a la secuencia de AAV2 de la proteína de cubierta principal VP1 establecida como SEQ ID NO:1, un experto en la materia sería capaz de determinar respectivamente y fácilmente la posición de ese mismo aminoácido dentro de la proteína de la cápside VP2 y/o VP3 del AAV, y la posición correspondiente de los aminoácidos entre diferentes serotipos. Adicionalmente, un experto en la materia podría intercambiar dominios entre proteínas de la cápside de diferentes serotipos del AAV para la formación de una "proteína de la cápside quimérica".
Se ha descrito el intercambio de dominio entre dos construcciones de proteína de la cápside de AAV para la generación de una "proteína de la cápside de AAV quimérica", véase, por ejemplo, Shenet al.(2007)Mol. Gene Therapy15(11):1955-1962. Una "proteína quimérica de la cápside de AAV" incluye una proteína de la cápside de AAV que comprende secuencias de aminoácidos, por ejemplo, dominios, de dos o más serotipos de AAV diferentes y que es capaz de formar y/o forma una cápside vírica/partícula vírica similar a AAV. Una proteína de la cápside de AAV quimérica está codificada por un gen de la cápside de AAV quimérica, por ejemplo, un nucleótido que comprende una pluralidad, por ejemplo, al menos dos, secuencias de ácido nucleico, cada una de dicha pluralidad es idéntica a una porción de un gen de la cápside que codifica una proteína de la cápside de distintos serotipos de AAV, y dicha pluralidad en conjunto codifica una proteína de la cápside de AAV quimérica funcional. La referencia a una proteína de la cápside quimérica en relación con un serotipo de AAV específico indica que la proteína de la cápside comprende uno o más dominios de una proteína de la cápside de ese serotipo y uno o más dominios de una proteína de la cápside de un serotipo diferente. Por ejemplo, una proteína de la cápside quimérica de AAV2 incluye una proteína de la cápside que comprende uno o más dominios de una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de AAV2 y uno o más dominios de una proteína de la cápside VP1, VP2 y/o VP3 de un AAV diferente.
Una "cápside mosaico" comprende al menos dos conjuntos de proteínas VP1, VP2 y/o VP3, cada conjunto de los cuales está codificado por un gencapdiferente.
En algunas realizaciones, una cápside mosaico descrita en el presente documento comprende proteínas VP1, VP2 y/o VP3 recombinantes codificadas por un gencapmodificado genéticamente con una inserción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un epítopo heterólogo, y comprende además proteínas VP1, VP2 y/o VP3 codificadas por un gencapde referencia, por ejemplo, un gencapde referencia de tipo silvestre que codifica las proteínas VP1, VP2 y/o VP3 de tipo salvaje del mismo serotipo de AAV que las proteínas VP1, VP2 y/o VP3 recombinantes, un gencapde referencia de control que codifica las proteínas VP1, VP2 y/o VP3 idénticas a las proteínas VP1, VP2 y VP3 recombinantes, excepto por la ausencia del epítopo heterólogo, un gencapde referencia de tipo silvestre mutado que codifica sustancialmente las proteínas VP1, VP2 y/o VP3 de tipo salvaje del mismo serotipo de AAV que las proteínas VP1, VP2 y/o VP3 recombinantes, excepto por una mutación (por ejemplo, inserción, sustitución, deleción), cuya mutación reduce preferentemente el tropismo de las proteínas VP1, VP2, y VP3 de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de referencia es una proteína de referencia quimérica que comprende al menos un dominio de las proteínas VP1, VP2 y/o VP3 del mismo serotipo de AAV que las proteínas VP1, VP2 y/o VP3 recombinantes. En algunas realizaciones, el gencapde referencia codifica una proteína VP1, VP2 y/o VP3 quimérica.
La expresión "cadena pesada", o "cadena pesada de inmunoglobulina" incluye una secuencia de cadena pesada de la inmunoglobulina, incluida la secuencia de región constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, procedente de cualquier organismo. Los dominios variables de cadena pesada incluyen tres CDR de cadena pesada y cuatro regiones FR, a menos que se especifique lo contrario. Los fragmentos de las cadenas pesadas incluyen CDR, CDR y FR, y combinaciones de las mismas. Una cadena pesada típica tiene, después del dominio variable (desde el extremo N al extremo C), un dominio C<h>1, una bisagra, un dominio C<h>2 y un dominio C<h>3. Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que puede reconocer específicamente un epítopo (por ejemplo, reconociendo el epítopo con una Kd en el rango micromolar, nanomolar o picomolar), que es capaz de expresarse y secretarse a partir de una célula, y que comprende al menos una CDR. Los dominios variables de cadena pesada están codificados por una secuencia de nucleótidos de región variable, que comprende generalmente segmentos Vh, Dh, y Jh derivados de un repertorio de segmentos Vh, Dh, y Jh presentes en la línea germinal. Las secuencias, las localizaciones y la nomenclatura para los segmentos V, D y J de cadena pesada para diferentes organismos se pueden encontrar en la base de datos IMGT, a la que se puede acceder a través de Internet en la red mundial (www) en la URL "imgt.org".
La expresión "anticuerpo de cadena pesada únicamente", "proteína de unión a antígeno únicamente de cadena pesada", "proteína de unión a antígeno de dominio único", "proteína de unión de dominio único" o similar se refiere a una molécula de inmunoglobulina monomérica u homodimérica que comprende una cadena tipo inmunoglobulina que comprende un dominio variable unido operativamente a una región constante de cadena pesada, que es incapaz de asociarse a una cadena ligera debido a que la región constante de cadena pesada carece de un dominio C<h>1 funcional. En consecuencia, la expresión "anticuerpo de cadena pesada únicamente", "proteína de unión a antígeno únicamente de cadena pesada", "proteína de unión a antígeno de dominio único", "proteína de unión de dominio único" o similar abarca tanto (i) una proteína de unión a antígeno de dominio único monomérica que comprende una de las cadenas tipo inmunoglobulina que comprende un dominio variable unido operativamente a una región constante de cadena pesada que carece de un dominio C<h>1 funcional, o (ii) una proteína de unión a antígeno de dominio único homodimérica que comprende dos cadenas tipo inmunoglobulina, comprendiendo cada una de las cuales un dominio variable unido operativamente a una región constante de cadena pesada que carece de un dominio Ch1 funcional. En diversos aspectos, una proteína de unión a antígeno de dominio único homodimérica comprende dos cadenas tipo inmunoglobulina idénticas, comprendiendo cada una de las cuales un dominio variable idéntico unido operativamente a una región constante de cadena pesada idéntica que carece de un dominio C<h>1 funcional. Adicionalmente, cada cadena tipo inmunoglobulina de una proteína de unión a antígeno de dominio único comprende un dominio variable, el cual puede ser derivado de segmentos génicos de la región variable de cadena pesada (por ejemplo, V<h>, D<h>, J<h>), segmentos génicos de cadena ligera (por ejemplo, Vl, Jl), o una combinación de los mismos, unidos a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada (Ch) que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia codificante de Ch1 (y, opcionalmente, una región bisagra) de un gen de la región constante de cadena pesada de, por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgD o una combinación de las mismas. Una proteína de unión a antígeno de dominio único que comprende un dominio variable derivado de segmentos génicos de cadena pesada puede denominarse "anticuerpo de dominio único Vh" o "proteína de unión a antígeno de dominio único Vh", véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 8.754.287; las publicaciones de patente de EE. UU N.° 20140289876, 20150197553, 20150197554, 20150197555, 20150196015; 20150197556 y 20150197557. Una proteína de unión a antígeno de dominio único que comprende un dominio variable derivado de segmentos génicos de cadena ligera puede denominarse "proteína de unión a antígeno de dominio único Vl", véase, por ejemplo, publicación de EE. UU. N.° 20150289489.
La expresión "cadena ligera" incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo, y a menos que se especifique lo contrario incluye las cadenas ligeras kappa (k) y lambda (A) y VpreB, así como cadenas ligeras subrogadas. Los dominios variables de cadena ligera incluyen normalmente tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones marco (FR), a menos que se especifique lo contrario. Generalmente, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino al extremo carboxilo, un dominio variable que incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, y una secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera. Los dominios variables de cadena ligera están codificados por la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera, que generalmente comprende los segmentos génicos V<l>de cadena ligera y J<l>de cadena ligera, derivados de un repertorio de segmentos génicos V y J de cadena ligera presentes en la línea germinal. Las secuencias, las ubicaciones y la nomenclatura de los segmentos génicos V y J de cadena ligera para diferentes organismos se pueden encontrar en la base de datos IMGT, a la que se puede acceder a través de Internet en la red mundial (www) en la URL "imgt.org". Las cadenas ligeras incluyen aquellas, por ejemplo, que no se unen selectivamente a un primer o un segundo epítopo unido selectivamente por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras incluyen también aquellas que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada con la unión y el reconocimiento, uno o más epítopos unidos selectivamente por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras incluyen también aquellas que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada con la unión y el reconocimiento, uno o más epítopos unidos selectivamente por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras comunes o universales incluyen aquellas derivadas de un gen humano Vk1-39Jk5 o un gen humano Vk3-20Jk1, e incluyen versiones somáticamente mutadas (por ejemplo, afinidad madurada) del mismo.
La expresión "unido/a operativamente", como se usa en el presente documento, incluye una yuxtaposición física (por ejemplo, en un espacio tridimensional) de componentes o elementos que interactúan, directa o indirectamente entre sí, o coordinarse entre sí para participar en un evento biológico, cuya yuxtaposición logra o permite dicha interacción y/o coordinación. Por poner solo un ejemplo, se dice que una secuencia de control (por ejemplo, una secuencia de control de la expresión) en un ácido nucleico está "unida operativamente" a una secuencia codificante cuando está ubicada con respecto a la secuencia codificante de modo que su presencia o ausencia afecta a la expresión y/o la actividad de la secuencia codificante. En muchas realizaciones, un "enlace operable" implica un enlace covalente de componentes o elementos relevantes entre sí. Los expertos en la materia lo apreciarán fácilmente, sin embargo, que en algunas realizaciones, no se requiere un enlace covalente para lograr un enlace operable efectivo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las secuencias de control de ácidos nucleicos que están unidas operativamente con secuencias codificantes que controlan son contiguas al nucleótido de interés. Como alternativa o adicionalmente, en algunas realizaciones, una o más de dichas secuencias de control actúan en trans o a una distancia para controlar una secuencia codificante de interés. En algunas realizaciones, la expresión "secuencia de control de la expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias y/o suficientes para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que están unidas. En algunas realizaciones, las secuencias de control de expresión pueden ser o comprender secuencias apropiadas de iniciación de transcripción, de terminación, del promotor y/o del potenciador; señales de procesamiento del ARN eficaces, tales como las señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (por ejemplo, secuencia de consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y/o, en algunas realizaciones, secuencias que potencian la secreción de proteínas. En algunas realizaciones, una o más secuencias de control son preferente o exclusivamente activas en una célula u organismo hospedador particular, o un tipo del mismo. Por poner solo un ejemplo, en procariotas, las secuencias de control normalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, en muchas realizaciones, las secuencias de control normalmente incluyen promotores, potenciadores y/o secuencias de terminación de la transcripción. Los expertos en la materia apreciarán a partir del contexto que, en muchas realizaciones, la expresión "secuencias de control" se refiere a componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y en algunas realizaciones, incluye componentes cuya presencia es ventajosa para la expresión (incluyendo, por ejemplo, secuencias líderes, secuencias de direccionamiento y/o secuencias asociadas a la fusión).
La expresión "proteína de la cápside recombinante" incluye una proteína de la cápside que tiene al menos una mutación en comparación con la proteína de la cápside correspondiente del virus de tipo silvestre, el cual puede ser un virus de referencia y/o control para estudio comparativo. Una proteína de la cápside recombinante incluye una proteína de la cápside que comprende un epítopo heterólogo, que puede insertarse en y/o presentarse mediante la proteína de la cápside. "Heterólogo" en este contexto significa heterólogo en comparación con el virus, del cual se deriva la proteína de la cápside. Los aminoácidos insertados pueden estar insertados simplemente entre dos aminoácidos dados de la proteína de la cápside. Una inserción de aminoácidos también puede ir acompañada de una deleción de determinados aminoácidos de la proteína de la cápside en el sitio de inserción, por ejemplo, 1 o más aminoácidos de la proteína de la cápside se sustituyen por 5 o más aminoácidos heterólogos).
Las expresiones "molécula de unión multiespecífica" y "molécula de unión biespecífica", y similares se refieren en general y respectivamente a una molécula de unión que comprende al menos dos y sólo dos componentes de unión no idénticos, uniéndose cada componente de unión específicamente a un epítopo diferente, ya sea en dos moléculas diferentes (por ejemplo, epítopos diferentes en dos inmunógenos diferentes) o en la misma molécula (por ejemplo, epítopos diferentes en el mismo inmunógeno). Generalmente, uno de los componentes de unión de una molécula de unión biespecífica en el presente documento se une específicamente a un epítopo heterólogo presentado por una proteína de la cápside de AAV y el segundo componente de unión es específico para una proteína, por ejemplo, un marcador de superficie celular, expresado principal y/o preferentemente por una célula diana, por ejemplo, un marcador de linfocito T (por ejemplo, CD3, CD28, etc.). Se pueden producir moléculas de unión biespecíficas, por ejemplo, combinando componentes de unión que reconocen diferentes epítopos del mismo inmunógeno. Por ejemplo, secuencias de ácido nucleico que codifican componentes de unión (por ejemplo, secuencias variables de cadena ligera o pesada) que reconocen diferentes epítopos pueden fusionarse con secuencias de ácido nucleico que codifican la misma o diferentes regiones constantes de cadena pesada, las mismas o diferentes regiones constantes de cadena ligera, o respectivamente una región constante de cadena pesada y una región constante de cadena ligera, y dichas secuencias pueden expresarse en una célula como una proteína de unión a antígeno multiespecífica en un formato que es similar a una estructura Fab, estructura scFab, una estructura de diacuerpo, una estructura scFv, una estructura scFv-Fc, una estructura de cremallera de scFv, una estructura tetramérica similar a un anticuerpo típico que incluye la cadena ligera universal afín, una estructura tetramérica que comprende un anticuerpo bivalente típico que incluye la cadena ligera universal afín y/o un componente de unión adicional (por ejemplo, scFv, scFv-cremallera, scFab, etc.) unidas a una o ambas cadenas pesadas (por ejemplo, en el extremo N y/o C) y/o a una o ambas cadenas ligeras (por ejemplo, en el extremo N y/o C). Los diferentes formatos de moléculas de unión multiespecíficas, particularmente biespecífica, son bien conocidas, véase, por ejemplo, Brinkmann y Konterman (2017)mAbs9:182-212.
Una molécula de unión multiespecífica ilustrativa tiene dos cadenas pesadas, cada una de las cuales tiene CDR de cadena pesada, seguido por un dominio Ch1 (extremo N a extremo C), una bisagra, un dominio Ch2, y un dominio Ch3, y una cadena ligera de inmunoglobulina que no confiere especificidad de unión a epítopo pero que puede asociarse con cada cadena pesada (por ejemplo, una cadena ligera común), o que puede asociarse con cada cadena pesada y que puede unirse a uno o más epítopos, por las regiones de unión a epítopo de la cadena pesada, o que pueden asociarse con cada cadena pesada y permitir la unión de uno o ambas de las cadenas pesadas a uno o ambos epítopos. En algunas realizaciones, una molécula de unión multiespecífica comprende: (1) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina unido operativamente a una primera región constante de cadena pesada que comprende una primera secuencia de aminoácidos CH3 de una IgG humana seleccionada de IgG1, IgG2, IgG4 y una combinación de las mismas; y (2) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el segundo dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina está operativamente unido a una segunda región constante de cadena pesada que comprende una segunda secuencia de aminoácidos CH3 de la IgG humana seleccionada de IgG1, IgG2, IgG4 y una combinación de las mismas, en donde el primer o segundo dominio variable de cadena pesada (con o sin una cadena ligera afín) se une a un epítopo heterólogo como se describe en el presente documento y el otro dominio variable de cadena pesada (con o sin una cadena ligera afín) se une a un receptor en una célula diana, y en donde la primera región constante de la cadena pesada se asocia con la segunda región de la cadena constante de una manera que proporciona un aislamiento más fácil de la proteína de unión multiespecífica, por ejemplo, en donde la primera y la segunda región constante de cadena pesada forman un formato de "botón en ojal" (KIH) o en donde la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende una modificación que reduce o elimina la unión de la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 a la proteína A (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 8.586.713). En algunas realizaciones, una molécula de unión multiespecífica comprende: (1) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina unido operativamente a una primera región constante de cadena pesada que comprende una primera secuencia de aminoácidos CH3 de una IgG humana seleccionada de IgG1, IgG2, IgG4 y una combinación de las mismas; y (2) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el segundo dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina está operativamente unido a una segunda región constante de cadena pesada que comprende una segunda secuencia de aminoácidos CH3 de la IgG humana seleccionada de IgG1, IgG2, IgG4 y una combinación de las mismas, en donde el primer y el segundo dominio variable de cadena pesada (con o sin una cadena ligera afín) se une a antígenos iguales o diferentes, en donde la primera o la segunda región constante de la cadena pesada se modifica para comprender además un dominio de unión adicional (por ejemplo, un scFv o Fv que se une a un epítopo heterólogo como se describe en el presente documento, por ejemplo, en donde el dominio de unión adicional está unido al extremo C o N de una o ambas cadenas pesadas), y en donde la primera región constante de la cadena pesada se asocia a la segunda región de la cadena constante de una manera que proporciona un aislamiento más fácil de la proteína de unión multiespecífica, por ejemplo, en donde la primera y la segunda región constante de cadena pesada forman un formato de "botón en ojal" (KIH) o en donde la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende una modificación que reduce o elimina la unión de la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 a la proteína A. En algunas realizaciones en las que la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende la unión reducida o eliminada a la proteína A, la segunda secuencia de aminoácidos CH3 comprende una modificación H95R (según la numeración de exones IMGT; H435R según la numeración EU). En una realización, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende además una modificación Y96F (según la numeración de exones IMGT; H436F según EU). En otra realización, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende tanto una modificación H95R (según la numeración de exones IMGT; H435R según la numeración UE) y una modificación Y96F (según la numeración de exones IMGT; H436F según EU). En algunas realizaciones, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 es de una IgG1 humana modificada y comprende además una mutación seleccionada del grupo que consiste en D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (IMGT; D356E, L38M, N384S, K392N, V397M y V422I según EU). En algunas realizaciones, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 es de una IgG2 humana modificada y comprende además una mutación seleccionada del grupo que consiste en N44S, K52N y V82I (IMGT: N384S, K392<n>y V422I según EU). En algunas realizaciones, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 es de una IgG4 humana modificada y comprende además una mutación seleccionada del grupo que consiste en Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (IMGT: Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I según EU). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada es una secuencia de aminoácidos de la región constante no humana, y la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada comprende uno o más de cualquiera de los tipos de modificaciones descritos anteriormente.
En diferentes realizaciones, los dominios Fc se modifican para alterar la unión al receptor Fc, que a su vez afecta la función efectora. En algunas realizaciones, una región constante de cadena pesada (CH) modificada por ingeniería genética, que incluye el dominio Fc, es quimérica. Como tal, una región CH quimérica combina dominios CH derivados de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, una región CH quimérica comprende parte o la totalidad de un dominio CH2 derivado de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, en combinación con parte o la totalidad de un dominio CH3 derivado de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. En algunas realizaciones, una región CH quimérica contiene una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de aminoácidos de "bisagra superior" (residuos de aminoácidos de las posiciones 216 a 227 de acuerdo con la numeración EU; residuos de aminoácidos de las posiciones 226 a 240 de acuerdo con la numeración Kabat) derivados de una región de bisagra de una IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana, en combinación con una secuencia o "bisagra inferior" (aminoácido de las posiciones 228 a 236 de acuerdo con la numeración EU; posiciones de aminoácidos de las posiciones 241 a 249 de acuerdo con la numeración Kabat) derivadas de una región bisagra de una IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana. En algunas realizaciones, la región bisagra quimérica comprende residuos de aminoácidos procedentes de una bisagra superior de IgG1 humana o IgG4 humana y restos de aminoácidos procedentes de una bisagra inferior de IgG2 humana.
En algunas realizaciones, el dominio Fc puede modificarse por ingeniería genética para activar todas, algunas o ninguna de las funciones efectoras normales de Fc, sin afectar a las propiedades farmacocinéticas deseadas de la proteína que contiene Fc (por ejemplo, anticuerpo). Para ejemplos de proteínas que comprenden regiones CH quiméricas y que tienen funciones efectoras alteradas, véase el documento WO2014022540.
La expresión "células diana" incluye cualquier célula en la que se desea la expresión de un nucleótido de interés. Preferentemente, las células diana presentan una proteína, por ejemplo, un receptor, en su superficie que permite que la célula sea marcada como objetivo con un ligando de redireccionamiento, como se describe a continuación. Preferentemente, la proteína objetivo, por ejemplo, el receptor es específica para la célula diana, por ejemplo, es un "marcador específico de célula", "antígeno específico de célula", o similares. La expresión "marcador específico de célula", "antígeno específico de célula", "marcador específico de órgano", "marcador específico de tejido", o similares se refiere e incluye aquellas proteínas cuya expresión está enriquecida por la célula, el tejido y/u el órgano para el cual es un marcador específico. "Enriquecida" en el contexto de la expresión de proteínas se refiere e incluye la expresión o sobreexpresión de la proteína específica de célula/tejido/órgano principal, preferente, o únicamente, por la célula/tejido/órgano para el cual la proteína es un marcador específico, aunque dicho marcador también puede ser expresado por otras células/tejidos/u órganos en niveles mínimos. Se puede utilizar el Atlas de Proteínas Humanas para determinar si una proteína es un marcador específico de célula/tejido/órgano y también proporciona un depósito de proteínas específicas de célula/tejido/órgano. Véase, www.proteinatlas.org; véase también Uhlenet al.(2010)Nat. Biotech.28:1248-50.
El término "transducción" o "infección" o similares se refiere a la introducción de un ácido nucleico en una célula diana mediante un vector vírico. El término eficiencia en relación con la transducción o similares, por ejemplo, "eficiencia de transducción" se refiere a la fracción (por ejemplo, porcentaje) de células que expresan un nucleótido de interés después de la incubación con un número determinado de vectores víricos que comprenden el nucleótido de interés. Los métodos bien conocidos para determinar la eficiencia de la transducción incluyen la clasificación de células activadas por fluorescencia de células transducidas con un gen indicador fluorescente, PCR para la expresión del nucleótido de interés, etc.
La expresión "tipo silvestre", como se usa en el presente documento, incluye una entidad que tiene una estructura y/o actividad como se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto "normal" (en contraste con mutante, patológico, alterado, etc.). Los expertos en la materia apreciarán que los vectores víricos de tipo silvestre, por ejemplo, proteínas de la cápside de tipo silvestre, puede utilizarse como vector vírico de referencia en estudios comparativos. Generalmente, una proteína de la cápside vírica/cápside/vector de referencia son idénticos a la proteína de la cápside vírica/cápside/vector de prueba, excepto por el cambio para el cual se va a probar el efecto. Por ejemplo, para determinar el efecto, por ejemplo, sobre la eficacia de transducción, de insertar un epítopo heterólogo en un vector vírico de prueba, las eficiencias de transducción del vector vírico de prueba (en ausencia o presencia de una molécula de unión multiespecífica apropiada) se pueden comparar con las eficiencias de transducción de un vector vírico de referencia (en ausencia o presencia de una molécula de unión multiespecífica apropiada si es necesario) que es idéntico al vector vírico de prueba en todos los casos (por ejemplo, mutaciones adicionales, nucleótido de interés, número de vectores víricos y células diana, etc.) excepto por la presencia de un epítopo heterólogo.
Proteínas de la cápside de virus recombinantes y vectores y ácidos nucleicos de AAV
En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento es una proteína de la cápside de Ad, por ejemplo, una proteína de la cápside de un serotipo Ad seleccionado del grupo que consiste en Ad1, Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6 y Ad7. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de Ad2. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de Ad5. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV de Ad recombinante como se describe en el presente documento comprende un epítopo heterólogo en un dominio de proteína de fibra, por ejemplo, en el extremo carboxilo de la proteína de fibra, knob de fibra y/o bucle HI del knob de fibra.
En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante derivada de un gen de la cápside de un virus adenoasociado (AAV) es una proteína de la cápside modificada genéticamente de un serotipo de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2, un gen de la cápside de AAV6, un gen de la cápside de AAV8, o un gen de la cápside de AAV9. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV2, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV2 genéticamente modificada, cuya secuencia de aminoácidos para el tipo silvestre se establece respectivamente como SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV8, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV8 genéticamente modificada, cuya secuencia de aminoácidos para el tipo silvestre se establece como SEQ ID NO:21. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV9, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV9 genéticamente modificada, cuya secuencia de aminoácidos para el tipo silvestre se establece respectivamente como SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV6, por ejemplo, es una proteína de la cápside VP1 de AAV6 genéticamente modificada. En algunas realizaciones, se inserta un epítopo heterólogo en I-453 de una proteína de la cápside de AAV9.
Generalmente, una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende un epítopo heterólogo insertado en y/o presentado por la proteína de la cápside de AAV de modo que el epítopo heterólogo reduce y/o anula el tropismo natural de la proteína de la cápside de AAV o de la cápside que la comprende. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta en una región de la proteína de la cápside de AAV implicada con el tropismo natural de la proteína de la cápside de referencia de tipo silvestre, por ejemplo, una región de la proteína de la cápside involucrada con un receptor celular. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta en y/o se presenta mediante un dominio knob de una proteína fibra de Ad. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta en y/o se presenta mediante el bucle HI de una proteína fibra de Ad. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta después de una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en G-453 de la proteína VP1 de la cápside de AAV2, N-587 de la proteína VP1 de la cápside de AAV2, Q-585 de la proteína VP1 de la cápside de AAV6, G-453 de la proteína VP1 de la cápside de AAV9 y A-589 de la proteína VP1 de la cápside de AAV9. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo se inserta y/o presenta entre los aminoácidos N-587 y R-588 de una cápside VP1 de AAV2. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante, el vector AAV que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de AAV recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, una cápside de<a>A<v>recombinante, el vector AAV que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de AAV recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante, el vector AAV que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de AAV recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID NO:25. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante, el vector AAV que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de AAV recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID NO:26. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante, el vector AAV que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de a Av recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID NO:27. Los sitios de inserción adecuados adicionales identificados mediante el uso de AAV2 son bien conocidos en la técnica (Wuet al.(2000)J. Virol.74:8635-8647) e incluyen I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713 y I-716. Una proteína de la cápside de virus recombinante como se describe en el presente documento puede ser una proteína de la cápside de AAV2 que comprende un epítopo heterólogo insertado en una posición seleccionada del grupo que consiste en I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713, I-716 y una combinación de las mismas. Los sitios de inserción adecuados adicionales identificados mediante el uso de serotipos de AAV adicionales son bien conocidos e incluyen I-587 (AAV1), I-589 (AAV1), I-585 (AAV3), I-585 (AAV4) y I-585 (AAV5). En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento puede ser una proteína de la cápside de AAV2 que comprende un epítopo heterólogo insertado en una posición seleccionada del grupo que consiste en I-587 (AAV1), I-589 (AAV1), I-585 (AAV3), I-585 (AAV4), I-585(AAV5) y una combinación de las mismas.
La nomenclatura utilizada I-n.°n.°n.° en el presente documento se refiere al sitio de inserción con n.°n.°n.° que nombra el número de aminoácidos en relación con la proteína VP1 de una proteína de la cápside de AAV, sin embargo, dicha inserción puede ubicarse directamente en el extremo N o C, preferentemente el extremo C de un aminoácido en la secuencia de 5 aminoácidos N- o C-terminal del aminoácido dado, preferentemente 3, más preferentemente 2, especialmente 1 aminoácido N- o C-terminal del aminoácido dado. Adicionalmente, las posiciones a las que se hace referencia en el presente documento son relativas a la proteína VP1 codificada por un gen de la cápside de AAV, y las posiciones correspondientes (y sus mutaciones) pueden identificarse fácilmente para las proteínas de la cápside VP2 y VP3 que codifican el gen de la cápside realizando un alineamiento de secuencia de las proteínas VP1, VP2 y VP3 codificadas por el gen de la cápside de AAV de referencia.
En consecuencia, una inserción en la posición correspondiente del ácido nucleico codificante de uno de estos sitios del gencapconduce a una inserción en VP1, VP2 y/o VP3, ya que las proteínas de la cápside están codificadas mediante marcos de lectura superpuestos del mismo gen con codones de inicio escalonados. Por lo tanto, para AAV2, por ejemplo, de acuerdo con esta nomenclatura, las inserciones entre los aminoácidos 1 y 138 solo se insertan en VP1, las inserciones entre 138 y 203 se insertan en VP1 y VP2, y las inserciones entre 203 y el extremo C se insertan en VP1, VP2 y VP3, lo que, por supuesto, también es el caso del sitio de inserción I-587. Por lo tanto, la presente invención abarca genes estructurales de AAV con inserciones correspondientes en las proteínas VP1, VP2 y/o VP3.
Adicionalmente, debido a la alta conservación de al menos grandes tramos y al gran número de miembros de la familia estrechamente relacionados, los sitios de inserción correspondientes para AAV distintos del AAV enumerado se pueden identificar realizando una alineación de aminoácidos o comparando las estructuras de la cápside. Véase, por ejemplo, Rutledgeet al.(1998)J. Virol.72:309-19 y la patente de e E. UU. N.° 9.624.274 para alineaciones ilustrativas de diferentes proteínas de la cápside de AAV.
En algunas composiciones divulgadas en el presente documento que consisten en la cápside de AAV recombinante (por ejemplo, en ausencia de una molécula de unión multiespecífica), la proteína de la cápside de AAV recombinante es una proteína VP1 de la cápside de AAV2 con un epítopo heterólogo insertado en un sitio 1587, en donde el epítopo heterólogo no comprende un motivo Arg-Gly-Asp (RGD), un motivo NGR, o c-myc. En algunas composiciones divulgadas en el presente documento que consisten en la cápside de AAV recombinante (por ejemplo, en ausencia de una molécula de unión multiespecífica), la proteína de la cápside de AAV recombinante es una proteína de la cápside VP1 con un epítopo heterólogo insertado entre T-448 y N-449, en donde el epítopo heterólogo no comprende c-myc. En algunas composiciones divulgadas en el presente documento que consisten en la cápside de AAV recombinante (por ejemplo, en ausencia de una molécula de unión multiespecífica), la proteína de la cápside de AAV recombinante es una proteína de la cápside VP1 con un epítopo heterólogo insertado en un sitio I-447, en donde el epítopo heterólogo no comprende L14 o HA.
En algunas composiciones que comprenden la cápside de AAV recombinante (por ejemplo, que comprenden además una molécula de unión multiespecífica), la proteína de la cápside de AAV recombinante es una proteína de la cápside VP1 con un epítopo heterólogo insertado en un sitio I-587, en donde el epítopo heterólogo comprende un motivo Arg-Gly-Asp (RGD), un motivo NGR, o c-myc. En algunas composiciones divulgadas en el presente documento que comprenden la cápside de AAV recombinante (por ejemplo, que comprende además una molécula de unión multiespecífica), la cápside de AAV es una cápside VP1, el epítopo heterólogo comprende c-myc, y el epítopo heterólogo se inserta entre T-448 y N-449, o entre N-587 y R-588. En algunas composiciones divulgadas en el presente documento que comprenden la cápside de AAV recombinante (por ejemplo, que comprende además una molécula de unión multiespecífica), la proteína de la cápside de AAV recombinante es una proteína de la cápside VP1 con un epítopo heterólogo insertado en un sitio I-447, en donde el epítopo heterólogo comprende L14 o HA. En algunas composiciones divulgadas en el presente documento que comprenden la cápside de AAV recombinante (por ejemplo, en presencia de una molécula de unión multiespecífica), la proteína de la cápside de AAV recombinante es una proteína de la cápside VP1 con un epítopo heterólogo insertado entre T-448 y N-449, en donde el epítopo heterólogo comprende c-myc. La patente de EE. UU. N.° 9.624.274 describe el I-453 de una proteína de la cápside de AAV como un sitio de inserción adecuado para un epítopo heterólogo.
En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo anula el tropismo natural del vector AAV, por ejemplo, la transducción de una célula permisiva de forma natural a la infección mediante vectores de AAV de referencia de tipo silvestre y/o una célula diana es indetectable en ausencia de una molécula de unión multiespecífica apropiada. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector AAV, por ejemplo, en comparación con la transducción de una célula permisiva de forma natural a la infección mediante vectores de AAV de referencia de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 5 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 5 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 10 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 20 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 30 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 40 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 50 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 60 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 70 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 80 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 90 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 95 %. En algunas realizaciones, la inserción (presentación) del epítopo heterólogo reduce el tropismo natural del vector de AAV en al menos un 90 %. En estas realizaciones, en donde la inserción (presentación) del epítopo heterólogo no anula el tropismo natural de las cápsides de AAV recombinante, el tropismo natural de dichas cápsides de AAV recombinante puede ser anulado mediante una segunda mutación diferente. Por ejemplo, en una realización, una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento puede derivarse de un gen de la cápside de AAV9, comprender un epítopo heterólogo, y puede comprender además una mutación, por ejemplo, una mutación W503A.
Esta separación del virus de su célula hospedadora natural es importante, especialmente si se pretende una administración sistémica frente a local o locorregional de los vectores de AAV, ya que la absorción de los vectores de AAV por las células hospedadoras naturales limita la dosis eficaz de los vectores de AAV. En el caso de AAV2 y AAV6, se informa que HSPG es el receptor principal para la absorción vírica en una gran cantidad de células, especialmente las células hepáticas. Para AAV2, la actividad de unión de HSPG depende de un grupo de 5 aminoácidos básicos, R484, R487, R585, R588 y K532 (Kernet al.,(2003)J Virol.77(20):11072-81). Recientemente se informó que la sustitución del aminoácido K531E de lisina a glutamato conduce a la supresión de la capacidad de AAV6 para unirse a heparina o HSPG ((Wuet al.,2006)J. of Virology80(22):11393-11397). En consecuencia, las mutaciones puntuales preferidas son aquellas que reducen la actividad de transducción del vector de AAV para una célula diana dada mediada por el receptor natural en al menos el 50 %, preferentemente al menos el 80 %, especialmente al menos el 95 %, en el caso de HSPG como receptor primario, la unión de los vectores de AAV a HSPG.
Por consiguiente, otras mutaciones preferidas para los vectores de AAV de unión a HSPG son aquellas mutaciones que disminuyen o reemplazan un aminoácido básico tal como R, K o H, preferentemente R o K que está implicado en la unión de HSPG del respectivo virus, por un aminoácido no básico, tal como A, D, G, Q, S y T, preferentemente A o un aminoácido que está presente en la posición correspondiente de un serotipo de AAV diferente pero altamente conservado que carece de dicho aminoácido básico en esta posición. Por consiguiente, las sustituciones de aminoácidos preferidas son R-484-A, R-487-A, R-487-G, K-532-A, K-532-D, R-585-A, R-585-S, R-585-Q, R-585-A o R-588-T, especialmente R-585-A y/o R-588-A para AAV2, y K-531-A o K-531-E para AAV6. Una realización especialmente preferida de la invención son los mutantes de la proteína de la cápside de AAV2 que contienen adicionalmente las mutaciones de dos puntos R-585-A y R-588-A, ya que estas dos mutaciones puntuales son suficientes para anular la actividad de unión de HSPG en gran medida. Estas mutaciones puntuales permiten una separación eficaz de las células que expresan HSPG que, con fines de direccionamiento, aumenta la especificidad del respectivo virus mutante para su nueva célula diana.
Una realización de la presente invención es una estructura multimérica que comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante de la presente invención. Una estructura multimérica comprende al menos 5, preferentemente al menos 10, más preferentemente al menos 30, lo más preferentemente al menos 60 proteínas de la cápside de AAV recombinantes que comprenden un epítopo heterólogo como se describe en el presente documento. Pueden formar cápsides de AAV regulares (partículas de AAV vacías) o vectores AAV (cápsides que encapsulan un nucleótido de interés). La formación de vectores AAV capaces de empaquetar un genoma vírico es una característica muy preferida para el uso de las cápsides de AAV recombinantes descritas en el presente documento como vectores AAV.
Una realización de la presente invención es un ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside como se ha descrito anteriormente. El ácido nucleico es preferentemente un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico reivindicada. Los ácidos nucleicos, especialmente los vectores son necesarios para expresar de forma recombinante las proteínas de la cápside de esta invención.
Una realización adicional de la presente invención es el uso de al menos una proteína de la cápside de AAV recombinante y/o un ácido nucleico que codifica la misma, preferentemente al menos una estructura multimérica (por ejemplo, vector de AAV) para la fabricación y uso como vector de transferencia génica.
Epítopos heterólogos
Generalmente, una proteína de AAV recombinante y/o un vector de AAV que comprende la cápside de AAV recombinante comprende un epítopo heterólogo, que permite el redireccionamiento del vector de AAV, por ejemplo, a través de una molécula de unión multiespecífica. En algunas realizaciones, un epítopo heterólogo es un epítopo de linfocito B, por ejemplo, que tiene una longitud de entre aproximadamente 1 aminoácido y aproximadamente 35 aminoácidos, y forma un par de unión con un paratopo de anticuerpo, por ejemplo, un dominio variable de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo comprende una etiqueta de afinidad.
En la técnica se conoce un gran número de etiquetas. (Véase, por ejemplo: Nilssonet al.(1997) "Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of recombinant proteins"Protein Expression and Purification11: 1-16, Terpeet al.(2003) "Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems"Applied Microbiology and Biotechnology60:523-533, y referencias en el presente documento). Las etiquetas de afinidad incluyen, pero sin limitación, una etiqueta de polihistidina (por ejemplo, una etiqueta His-6, His-8 o His-10) que se une a cationes divalentes inmovilizados (por ejemplo,Ni2+), un resto de biotina (por ejemplo, en una secuencia polipeptídica biotiniladain vivo)que se une a la avidina inmovilizada, una secuencia de GST (glutatión S-transferasa) que se une al glutatión inmovilizado, una etiqueta S que se une a la proteína S inmovilizada, un antígeno que se une a un anticuerpo inmovilizado o dominio o fragmento del mismo (incluyendo, por ejemplo, T7, myc, FLAG y etiquetas B que se unen a los anticuerpos correspondientes), una etiqueta FLASH (una etiqueta de alta afinidad que se acopla a restos específicos basados en arsénico), un receptor o dominio receptor que se une a un ligando inmovilizado (o viceversa), proteína A o un derivado de la misma (por ejemplo, Z) que se une a IgG inmovilizada, proteína de unión a maltosa (MBP) que se une a la amilosa inmovilizada, una proteína de unión a albúmina que se une a la albúmina inmovilizada, un dominio de unión a quitina que se une a la quitina inmovilizada, un péptido de unión a calmodulina que se une a la calmodulina inmovilizada y un dominio de unión a celulosa que se une a la celulosa inmovilizada. Otra etiqueta ilustrativa es una etiqueta SNAP, comercializada por Covalys (www.covalvs.com). En algunas realizaciones, un epítopo heterólogo divulgado en el presente documento comprende una etiqueta de afinidad reconocida únicamente por un paratopo de anticuerpo. En algunas realizaciones, un epítopo heterólogo divulgado en el presente documento comprende una etiqueta de afinidad reconocida por un paratopo de anticuerpo y otros pares de unión específicos.
En algunos aspectos, el epítopo heterólogo y/o la etiqueta de afinidad no forman un par de unión con un dominio constante de inmunoglobulina. En algunos aspectos, el epítopo heterólogo y/o la etiqueta de afinidad no forma un par de unión con un ion metálico, por ejemplo, Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+, etc. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo no es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en estreptavidina, Strep II, HA, L14, 4C-RGD, L<h>y proteína A.
En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad se selecciona del grupo que consiste en FLAG (SEQ ID NO:7), HA (SEQ ID NO:8) y c-myc (EQKL<i>S<e>EDL; SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo es c-myc.
En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por y/o unida operativamente a al menos 5 aminoácidos contiguos de una proteína de la cápside de VP1 de AAV. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por y/o unida operativamente a al menos 5 aminoácidos contiguos de una proteína de la cápside VP1 de AAV2. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO:6) insertada entre N587 y R588 de una proteína de la cápside VP1 de AAV2. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside de AAV recombinante como se describe en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante, el vector AAV que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de AAV recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID n O:25. En algunas realizaciones, una cápside de<a>A<v>recombinante, el vector AAV que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de AAV recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID NO:26. En algunas realizaciones, una cápside de AAV recombinante, el vector AAV que comprende una cápside de AAV recombinante y/o las composiciones que comprenden una cápside de AAV recombinante comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID NO:27.
En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo comprende una etiqueta de afinidad y uno o más conectores. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo comprende una etiqueta de afinidad flanqueada por un conector, por ejemplo, el epítopo heterólogo comprende desde el extremo N al extremo C un primer conector, una etiqueta de afinidad y un segundo conector. En algunas realizaciones, el primer y el segundo conector tienen cada uno independientemente al menos un aminoácido de longitud. En algunas realizaciones, el primer y segundo conector son idénticos.
Generalmente, un epítopo heterólogo como se describe en el presente documento, por ejemplo, una etiqueta de afinidad por sí sola o junto con uno o más conectores, tiene una longitud entre aproximadamente 5 aminoácidos y 35 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (por sí mismo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 6 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 7 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 8 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 9 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 10 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 11 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 12 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 13 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 14 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 15 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 16 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 17 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 18 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 19 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 21 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 22 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 23 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 24 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 25 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 26 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 27 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 28 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 29 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 30 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 31 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 32 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 33 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 34 aminoácidos. En algunas realizaciones, el epítopo heterólogo (solo o junto con uno o más conectores) tiene una longitud de 35 aminoácidos.
Restos de redireccionamiento
Un vector de AAV como se describe en el presente documento tiene capacidades de transducción reducidas a anuladas en ausencia de una molécula de unión multiespecífica, específicamente una molécula de unión multiespecífica que comprende (i) un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo y (ii) un ligando de redireccionamiento que se une específicamente a un receptor, que puede conjugarse con la superficie de una perla (por ejemplo, para purificación) o expresarse mediante una célula diana. En consecuencia, una molécula de unión multiespecífica que comprende (i) un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo y (ii) un ligando de redireccionamiento que se une específicamente a un receptor que redirecciona el vector AAV. Dicho "redireccionamiento" puede incluir un escenario en el que el vector de AAV de tipo silvestre se dirige a varias células dentro de un tejido y/o a varios órganos dentro de un organismo, cuyo amplio direccionamiento al tejido u órganos se reduce a anula mediante la inserción del epítopo heterólogo, y cuyo redireccionamiento a células más específicas en el tejido u órgano más específico en el organismo se logra con la molécula de unión multiespecífica. Dicho redireccionamiento también puede incluir un escenario en el que el vector AAV de tipo silvestre se dirige a un tejido, cuyo direccionamiento al tejido se reduce a anula mediante la inserción del epítopo heterólogo, y cuyo redireccionamiento a un tejido completamente diferente se logra con la molécula de unión multiespecífica. Un paratopo de anticuerpo como se describe en el presente documento generalmente comprende como mínimo una región determinante de la complementariedad (CDR) que reconoce específicamente el epítopo heterólogo, por ejemplo, una región CDR3 de un dominio variable de cadena pesada y/o ligera. En algunas realizaciones, una molécula de unión multiespecífica comprende un anticuerpo (o porción del mismo) que comprende el paratopo del anticuerpo que se une específicamente al epítopo heterólogo. Por ejemplo, una molécula de unión multiespecífica puede comprender una región variable de cadena pesada de dominio único o una región variable de cadena ligera de dominio único, en donde la región variable de cadena pesada de dominio único o la región variable de cadena ligera de dominio único comprende un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo heterólogo. En algunas realizaciones, una molécula de unión multiespecífica puede comprender una región Fv, por ejemplo, una molécula de unión multiespecífica puede comprender un scFv, que comprende un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo heterólogo. En algunas realizaciones, una molécula de unión multiespecífica como se describe en el presente documento comprende un paratopo de anticuerpo que se une específicamente a c-myc.
En algunas realizaciones, una molécula de unión multiespecífica como se describe en el presente documento comprende un paratopo de anticuerpo que se une específicamente a c-myc, dicho paratopo comprende el scFv, los dominios variables de cadena pesada y ligera del scFv, y/o el conjunto de secuencia de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID NO:28, por ejemplo, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, una molécula de unión multiespecífica como se describe en el presente documento comprende un Fv o scFv codificado por la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID NO:28.
En consecuencia, la presente invención incluye anticuerpos, fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos y proteínas de unión multiespecíficas que se unen específicamente a c-myc, en donde los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y proteínas de unión multiespecíficas comprenden un parátopo que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende SEQ ID NO:29 y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende SEQ ID NO:30. La presente invención también incluye anticuerpos, fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que se une específicamente a c-Myc, en donde el paratopo comprende una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1) que comprende SEQ ID NO:31, una HCDR2 que comprende SEQ<i>D NO:32, una HCDR3 que comprende SEQ ID NO:33, una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende SEQ ID NO: 34, una LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 35 y una LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 36.
La presente invención puede emplear anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que comprende una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:29, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente invención puede emplear anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que comprende una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:30, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente invención puede emplear anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de HCVR establecida como SEQ ID NO:29 emparejada con la secuencia de aminoácidos de LCVR establecida como SEQ ID NO:30. En algunas realizaciones, el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/ LCVR se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29/30.
La presente invención puede emplear anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que comprende una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:31 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente invención puede emplear anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que comprende una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:32, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente invención puede emplear anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que comprende una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:33, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente invención puede emplear anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que comprende una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:34, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente invención puede emplear anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que comprende una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:35, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente invención puede emplear anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que comprende una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO:36, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
La presente invención puede emplear anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3 y LCDR3 (HCDR3/LCDR3) que comprenden la secuencia de aminoácidos de HCDR3 establecida como SEQ ID NO:33 emparejada con la secuencia de aminoácidos LCDR3 establecida como SEQ ID NO:36. En algunas realizaciones, el par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 se establece como SEQ ID NO: 33/36.
La presente invención puede emplear anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que comprende un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) codificadas por la secuencia de nucleótidos establecida como SEQ ID NO:28. En determinadas realizaciones, el conjunto de secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 se establece como SEQ ID NO: 31-32-33-34-35-36.
En una realización relacionada, la presente invención puede emplear anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y/o proteínas de unión multiespecíficas que comprenden un paratopo que comprende un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas dentro de un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR establecido como SEQ ID NO: 29/30. Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidos en la materia y pueden utilizarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas que se divulgan en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden utilizarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AcM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AcM es un término medio entre los enfoques de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikaniet al., J. Mol. Biol.273:927-948 (1997); y Martinet al., Proc. Natl. Acad. Sci.EE. UU. 86:9268-9272 (1989). También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
La presente invención puede emplear moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos anti-myc o porciones de los mismos.
Una molécula de unión multiespecífica como se describe en el presente documento comprende además un ligando de redireccionamiento, además de un paratopo (por ejemplo, un anticuerpo o una porción del mismo) que se une específicamente al epítopo heterólogo insertado/presentado por una proteína de la cápside de AAV recombinante. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a una proteína expresada en la superficie de una célula, por ejemplo, una proteína de superficie celular en una célula eucariota (humana), por ejemplo, una célula diana. Hay una gran cantidad de proteínas de superficie celular, por ejemplo, receptores de la superficie celular, adecuadas que pueden ser objetivo de un ligando de redireccionamiento, y para la cual un ligando de redireccionamiento, por ejemplo, anticuerpos o porciones de los mismos, ya están disponibles. Dichas estructuras incluyen, pero sin limitación: los antígenos mayores de histocompatibilidad clase I y clase II; receptores para una diversidad de citocinas (por ejemplo, receptores para IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33, etc.), hormonas de crecimiento específicas de tipo celular, factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), factor neurotrófico ciliar (CTNF), factores de crecimiento estimuladores de colonias, factores de crecimiento endotelial, factores de crecimiento epidérmico, factores de crecimiento de fibroblastos, factor neurotrófico derivado de las células gliales, factores de crecimiento gliales, gro-beta/mip 2, factores de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento tipo insulina, interferones (a-IFN, p-IFN, y IFN, IFN consenso), interleucinas (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14), factor de crecimiento de queratinocitos, factores inhibidores de la leucemia, factor activador quimiotáctico de macrófagos/monocitos, factor de crecimiento nervioso, proteína activadora de neutrófilos 2, factor de crecimiento procedente de plaquetas, factor de células madre, factor de crecimiento transformante, factores de necrosis tumoral, factor de crecimiento vascular endotelial, lipoproteínas, incluyendo receptores transmembrana tipo 1 adicionales u otros, tales como PRLR, receptores acoplados a proteína G, tales como GCGR, canales de iones, tales como Nav1.7, ASIC1 o ASIC2; moléculas de adhesión celular; moléculas de transporte para metabolitos tales como aminoácidos; receptores de antígenos de los linfocitos B y T (por ejemplo, receptores de linfocitos B y proteínas asociadas (por ejemplo, CD19, CD20, etc.) y receptores de los linfocitos T y proteínas asociadas (por ejemplo, CD3, CD4, CD8, etc.); una proteína tetraspanina (por ejemplo, CD63). Una cápside de AAV recombinante descrita en el presente documento permite la infección específica de un tipo de célula empleando una molécula de unión multiespecífica que comprende un ligando de redireccionamiento que se une a antígenos de superficie celular de diferenciación como dianas para el complejo de vector AAV.
En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (por ejemplo, únicamente) por células hepáticas (humanas), es decir, un marcador específico del hígado. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (por ejemplo, únicamente) por células cerebrales (humanas), un marcador específico de células cerebrales. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (por ejemplo, únicamente) por células hematopoyéticas (humanas), es decir, un marcador específico de células hematopoyéticas. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (por ejemplo, únicamente) por linfocitos T (humanos), es decir, un marcador específico de linfocitos T. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (por ejemplo, únicamente) por linfocitos B (humanos), es decir, un marcador específico de linfocitos B. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (por ejemplo, únicamente) por células dendríticas (humanas), es decir, un marcador específico de células dendríticas. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (por ejemplo, únicamente) por macrófagos (humanos), es decir, un marcador específico de macrófagos. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (por ejemplo, únicamente) por células NK (humanas), es decir, un marcador específico de células NK. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (por ejemplo, únicamente) por células renales (humanas), es decir, un marcador específico del riñón. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (por ejemplo, únicamente) por células del páncreas (humano), es decir, un marcador específico del páncreas. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado principalmente (por ejemplo, únicamente) por células intestinales (humanas), es decir, un marcador específico del intestino. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (por ejemplo, únicamente) por una célula cancerosa (humana), es decir, un antígeno asociado a tumor. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a una proteína expresada principalmente (por ejemplo, únicamente) por células (humanas) infectadas con un patógeno heterólogo. Proteínas que (1) se expresan específicamente, o cuya expresión está enriquecida en, una célula/tejido/órgano, y (2) reconocidas por una proteína de unión a antígeno útil como ligando de redireccionamiento como se describe en el presente documento son bien conocidas y también se pueden encontrar en www.proteinatlas.org; véase también Uhlenet al.(2010)Nat. Biotech.
28:1248-50. La siguiente Tabla 1 proporciona marcadores específicos de órganos ilustrativos y no limitantes para los cuales las proteínas de unión a antígeno, que pueden ser útiles como ligandos de redireccionamiento, están disponibles y las células/tejidos/órganos que expresan dichos marcadores.
T l 1: M r r ífi i il r iv
En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por una célula hepática (humana), por ejemplo, un receptor de la asialoglicoproteína, por ejemplo, hASGR1. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por una célula cerebral (humana). En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por un linfocito T (humano), por ejemplo, CD3, por ejemplo, CD3e. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por una célula renal (humana). En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por una célula muscular (humana), por ejemplo, una integrina. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado por una célula cancerosa (humana), por ejemplo, un antígeno asociado a tumor, por ejemplo, E6 y E7. En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une al receptor de glucagón humano (hGCGR). En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une al ENTPD3 humano.
En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a un antígeno asociado a un tumor expresado por una célula tumoral. Los ejemplos no limitantes de antígenos específicos asociados a tumores incluyen, por ejemplo, adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fetoproteína (A<f>P), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), proteína de fusión BCR-ABL b3a2, beta-catenina, BING-4, CA-125, CALCA, antígeno carcinoembrionario (CEA), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina-A1, proteína de fusión dek-can, DKK1, EFTUD2, Factor 2 de elongación, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, antígeno tumoral epitelial (ETA), proteína de fusión de ETV6-AML1, EZH2, E6,<e>7, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pme117, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, Carboxil esterasa intestinal, K-ras, Calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 también conocido como CCDC110, LAGE-1, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A 10, MAGE-A12, MAGE-A2, Ma Ge -A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, enzima málica, mammaglobina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midquina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina, Miosina clase I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NYESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipéptido P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusión pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica (PEM), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivina, proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerasa, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, Triosafosfato isomerasa, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinasa, tirosinasa (TYR), VEGF, WT1, XAGE-lb/GAGED2a, Kras, NY-ESO1, MAGE-A3, HPV E2, HPV E6, HPV E7, antígeno WT-1 (en linfoma y otros tumores sólidos), receptores de ErbB, Melan A [MART1], gp 100, tirosinasa, TRP-1/gp 75 y TRP-2 (en melanoma); MAGE-1 y MAGE-3 (en vejiga, cabeza y cuello, y carcinoma de células no pequeñas); proteínas HPV EG y E7 (en cáncer de cuello uterino); Mucina [MUC-1] (en cánceres de mama, páncreas, colon y próstata); antígeno prostático específico [PSA] (en cáncer de próstata); antígeno carcinoembrionario [CEA] (en cánceres de colon, mama y gastrointestinales) y antígenos específicos de tumores compartidos como MAGE-2, MAGE-4, MAGE-6, MAGE-10, MAGE-12, BAGE-1, CAGE-1,2,8, CAGE-3 TO 7, LAGE-1, NY-ESO-1/LAGE-2, NA-88, GnTV, TRP2-INT2. En algunas realizaciones, el antígeno asociado al tumor es ErbB2/Her2. En algunas realizaciones, el antígeno asociado al tumor es E6 y/o E7.
En algunas realizaciones, el ligando de redireccionamiento se une a los marcadores de CD asociados a la respuesta inmunitaria, por ejemplo, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, etc. En algunas realizaciones, el marcador de CD es CD3.
En determinadas realizaciones ilustrativas, la molécula de unión multiespecífica es un anticuerpo biespecífico. Cada dominio de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable de cadena pesada (HCVR) y un dominio variable de cadena ligera (LCVR). En el contexto de una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), las CDR del primer dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A1" y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A2". Por tanto, en el presente documento las CDR del primer dominio de unión a antígeno pueden denominarse A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3; y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno en este documento pueden denominarse A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3.
El primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar conectados directa o indirectamente entre sí para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención. Como alternativa, el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar unidos a un dominio de multimerización separado. La asociación de un dominio de multimerización con otro dominio de multimerización facilita la asociación entre los dos dominios de unión a antígeno, formando de este modo una molécula de unión a antígeno biespecífica. Como se usa en el presente documento, un "dominio de multimerización" es cualquier macromolécula, proteína, polipéptido, péptido o aminoácido que tiene la capacidad de asociarse con un segundo dominio de multimerización de la misma estructura o constitución o similar. Por ejemplo, un dominio multimerizante puede ser un polipéptido que comprende un dominio CH3 de inmunoglobulina. Un ejemplo no limitante de un componente de multimerización es una porción Fc de una inmunoglobulina (que comprende un dominio CH2-CH3), por ejemplo, un dominio Fc de una IgG seleccionada de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4, así como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipo.
Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas empleadas en la presente invención comprenderán normalmente dos dominios de multimerización, por ejemplo, dos dominios Fc que son cada uno de manera individual parte de una cadena pesada de anticuerpo separada. El primer y el segundo dominio de multimerización pueden ser del mismo isotipo de IgG tal como, por ejemplo, IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Como alternativa, el primer y el segundo dominio de multimerización pueden ser de diferentes isotipos de IgG tales como, por ejemplo, IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, etc.
En determinadas realizaciones, el dominio de multimerización es un fragmento Fc o una secuencia de aminoácidos de 1 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud que contiene al menos un residuo de cisteína. En otras realizaciones, el dominio de multimerización es un residuo de cisteína o un péptido corto que contiene cisteína. Otros dominios de multimerización incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden o consisten en una cremallera de leucina, un motivo de bucle de hélice o un motivo de hélice superenrollada.
Puede utilizarse cualquier formato o tecnología de anticuerpo biespecífico para producir las moléculas de unión a antígeno biespecíficas empleadas de la presente invención. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una primera especificidad de unión a antígeno puede unirse funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una segunda especificidad de unión a antígeno para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica. Otros formatos biespecíficos ilustrativos específicos que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, cuadroma, "botón en ojal", cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con "botón en ojal", etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, por ejemplo, Kleinet al.,2012,mAbs4:6, 1-11, y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores; véase también Brinkmann y Conterman (2017)mAbs9:182-212.
La presente invención también puede emplear moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio CH3 y un segundo dominio CH3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio CH3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio CH3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (según la numeración de exones IMGT; H-435-R según la numeración EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (según IMGT; Y436F según EU). Otras modificaciones que se pueden encontrar en el segundo CH3 incluyen: D-16-E, L-18-M, N-44-S, K-52-N, V-57-M y V-82-I (según IMGT; D-356-E, L-358-M, N-384-S, K-392-N, V-397-M y V-422-I según EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N-44-S, K-52-N y V-82-I (IMGT; N-384-S, K-392-N y V-422-I según EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q-15-R, N-44-S, K-52-N, V-57-M, R-69-K, E-79-Q y V-82-I (según IMGT; Q-355-R, N-384-S, K-392-N, V-397-M, R-409-K, E-419-Q y V-422-I según EU) en el caso de anticuerpos IgG4; véase, por ejemplo, el documento WO 2010/151792.
En determinadas realizaciones, el dominio Fc puede ser quimérico, que combina secuencias de Fc procedentes de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio Fc quimérico puede comprender parte o toda una secuencia CH2 derivada de una región CH2 de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, y parte o toda una secuencia CH3 derivada de una IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un dominio Fc quimérico también puede contener una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de "bisagra superior", derivada de una región bisagra de IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana, junto con una secuencia de "bisagra inferior", derivada de una región bisagra de IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana. Un ejemplo particular de un dominio Fc quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno establecidas en el presente documento comprende, desde el extremo N al extremo C: [CH1 de IgG4] - [bisagra superior de IgG4] - [bisagra inferior de IgG2] - [CH2 de IgG4] - [CH3 de IgG4]. Otro ejemplo de un dominio Fc quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno establecidas en el presente documento comprende, desde el extremo N al extremo C: [CH1 de IgG1] - [bisagra superior de IgG1] - [bisagra inferior de IgG2] - [CH2 de IgG4] - [CH3 de IgG1]. Estos y otros ejemplos de dominios Fc quiméricos que se pueden incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno de la presente invención se describen en solicitud PCT N. ° WO2014/022540. Los dominios Fc quiméricos que tienen estas disposiciones estructurales generales y variantes de los mismos, pueden tener alterada la unión al receptor de Fc, que a su vez afecta la función efectora de Fc.
Métodos de uso y producción
Una realización adicional de las proteínas de la cápside de AAV recombinantes descritas en el presente documento es su uso para administrar un nucleótido de interés, por ejemplo, un gen indicador o un gen terapéutico, a una célula diana. Por ende, la presente invención proporciona una composición de la presente invención para su uso en un método de tratamiento o diagnósticoin vivo,comprendiendo el método administrar el nucleótido de interés a una célula diana que expresa una proteína de la superficie celular que comprende poner en contacto la célula diana con la composición, en donde la molécula de unión multiespecífica comprende un ligando de redireccionamiento que se une a la proteína de superficie celular. La presente invención proporciona además un método para administrar un nucleótido de interésin vitrooex-vivoa una célula diana que expresa una proteína de la superficie celular que comprende poner en contacto la célula diana con la composición de la presente invención, en donde la molécula de unión multiespecífica comprende un ligando de redireccionamiento que se une a la proteína de superficie celular.
Generalmente, un nucleótido de interés puede ser un plásmido de transferencia, que generalmente puede comprender secuencias de repetición terminal invertida (ITR) 5' y 3' que flanquean el(los) gen(es) indicador(es) o el(los) gen(es) terapéutico(s) (que pueden estar bajo el control de un promotor vírico o no vírico, cuando está incluido dentro de un vector AAV). En una realización, un nucleótido de interés es un plásmido de transferencia que comprende de 5' a 3': una ITR de 5', un promotor, un gen (por ejemplo, un gen indicador y/o terapéutico) y una ITR 3'.
Ejemplos no limitativos útiles de promotores incluyen, por ejemplo, promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus formador del foco del bazo (SFFV), el promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1a) (el promotor de EF1a de 1,2 kb o el promotor de EF1a de 0,2 kb), el promotor quimérico de EF1 a/IF4 y el promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK). Un potenciador interno también puede estar presente en la construcción vírica para aumentar la expresión del gen de interés. Por ejemplo, se puede utilizar el potenciador CMV (Karasuyamaet al.1989.J. Exp. Med.169:13). En algunas realizaciones, el potenciador de CMV se puede utilizar junto con el promotor de 13 actina de pollo.
Se pueden encapsular una diversidad de genes indicadores (o restos detectables) en una estructura multimérica que comprende las proteínas de la cápside de AAV recombinantes descritas en el presente documento. Los genes indicadores ilustrativos incluyen, por ejemplo, p-galactosidasa (codificada genlacZ),Proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente verde potenciada (eGFP), MmGFP, proteína fluorescente azul (BFP), proteína fluorescente azul mejorada (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrina, Venus, YPet, proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP), Emerald, CyPet, proteína fluorescente cian (CFP), Cerulean, T-Zafiro, luciferasa, fosfatasa alcalina o una combinación de los mismos. Los métodos descritos en el presente documento demuestran la construcción de vectores de direccionamiento que emplean el uso de un gen indicador que codifica la proteína fluorescente verde, sin embargo, los expertos al leer esta divulgación comprenderán que los animales no humanos descritos en el presente documento pueden generarse en ausencia de un gen indicador o con cualquier gen indicador conocido en la técnica.
También se pueden encapsular una diversidad de genes terapéuticos en una estructura multimérica que comprende las proteínas de la cápside de AAV recombinantes descritas en el presente documento, por ejemplo, como parte de un vector de transferencia. Ejemplos no limitantes de un gen terapéutico incluyen aquellos que codifican una toxina (por ejemplo, un gen suicida), un anticuerpo terapéutico o fragmento del mismo, un sistema CRISPR/Cas o porción(es) del mismo, ARN antisentido, ARNip, ARNhc, etc.
Una realización adicional de la presente invención es un proceso para la preparación de una proteína de la cápside de AAV recombinante, comprendiendo el método las etapas de:
a) expresar un ácido nucleico que codifica la proteína de la cápside de AAV recombinante en condiciones adecuadas, y
b) aislar la proteína de la cápside expresada de la etapa a).
Otras realizaciones de la presente invención son un método para alterar el tropismo de un virus, comprendiendo el método las etapas de: (a) insertar un ácido nucleico que codifica un epítopo heterólogo en una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside de AAV para formar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de AAV modificada genéticamente que comprende el epítopo heterólogo y/o (b) cultivar una célula empaquetadora en condiciones suficientes para la producción de vectores AAV, en donde la célula empaquetadora comprende la secuencia de nucleótidos. Una realización adicional de la presente invención es un método para presentar un epítopo heterólogo en la superficie de una proteína de la cápside de AAV, comprendiendo el método las etapas de: a) expresar el ácido nucleico de acuerdo con esta invención en condiciones adecuadas, y b) aislar la proteína de la cápside de AAV expresada en la etapa a).
En algunas realizaciones, la célula empaquetadora comprende además un plásmido auxiliar y/o un plásmido de transferencia que comprende un nucleótido de interés. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además aislar vectores víricos adenoasociados autocomplementarios del sobrenadante del cultivo. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además lisar la célula empaquetadora y aislar vectores víricos adenoasociados monocatenarios del lisado celular. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además (a) eliminar restos celulares, (b) tratar el sobrenadante que contiene vectores AAV con ADNasa I y MgCl2, (c) concentrar los vectores víricos, (d) purificar los vectores víricos, y (e) cualquier combinación de (a)-(d).
Las células empaquetadoras útiles para la producción de los vectores AAV descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, células animales permisivas para el virus, o células modificadas para que sean permisivas para el virus; o la construcción de células empaquetadoras, por ejemplo, con el uso de un agente de transformación como el fosfato cálcico. Ejemplos no limitantes de líneas celulares empaquetadoras útiles para producir vectores AAV descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, células de riñón embrionario humano 293 (HEK-293) (por ejemplo, Colección Americana de Cultivos Tipo [ATCC] N.° CRL-1573), Células HEK-293 que contienen el antígeno T grande de SV40 (HEK-293T o 293T), células HEK293T/17, línea celular de sarcoma humano HT-1080 (CCL-121), línea celular tipo linfoblasto Raj i (CCL-86), línea celular tipo epitelial de glioblastoma-astrocitoma U87-MG (HTB-14), línea celular de linfoma T HuT78 (TIB-161), células NIH/3T3, Células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, ATCC N.° CRL9618, CCL61, CRL9096), células HeLa (por ejemplo, ATCC N.° CCL-2), células Vero, células NIH 3T3 (por ejemplo, ATCC N.° CRL-1658), células Huh-7, células b Hk (por ejemplo, ATCC N.° CCL10), células PC12 (ATCC N.° CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC N.° CRL1651), células RATI, células L de ratón (ATCC N.° CCLI.3), células HLHepG2, células CAP, células CAP-T y similares.
células L929, el sistema de células empaquetadoras víricas FLY descrito en Cosset et al (1995)J Virol69,7430-7436, células NS0 (mieloma murino), células amniocíticas humanas (por ejemplo, CAP, CAP-T), células de levadura (incluyendo, pero sin limitación, S.cerevisiae, Pichia shepherdis),células vegetales (incluyendo, pero sin limitación, Tabaco NT1, BY-2), células de insecto (incluyendo, pero sin limitación, SF9, S2, SF21, Tni (por ejemplo, High 5)) o células bacterianas (incluyendo, pero sin limitación,E. coli).
Para sistemas y células empaquetadoras adicionales, técnicas de empaquetado y vectores para empaquetar el genoma de ácido nucleico en el vector vírico pseudotipado véase, por ejemplo, Polo, et al,Proc Natl Acad Sci USA,(1999) 96:4598-4603. Los métodos de empaquetado incluyen el uso de células empaquetadoras que expresan permanentemente los componentes víricos o mediante la transfección transitoria de células con plásmidos.
Realizaciones adicionales incluyen métodos para redirigir un virus AAV y/o administrar un gen indicador o terapéutico a una célula diana, comprendiendo el método un método para transducir célulasin vitro,comprendiendo el método las etapas de: poner en contacto la célula diana con la combinación de un vector AAV que comprende una cápside que comprende una cápside de AAV recombinante que muestra un epítopo heterólogo y una molécula de unión multiespecífica, en donde la molécula de unión multiespecífica comprende (i) un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo y (ii) un ligando de redireccionamiento que se une específicamente a un receptor expresado por la célula diana. En algunas realizaciones, una composición descrita en el presente documento comprende, o un método descrito en el presente documento combina, un vector de AAV recombinante y una molécula de unión multiespecífica en una proporción molécula-molécula que restaura la eficiencia de transducción del vector AAV similar a la de un vector AAV de control de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) varía de 1:0,5 a 1:100. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) varía de 1:4 a 1:20. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) varía de 1:8 a 1:15. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es de 1:4. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es de 1:8. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es de 1:15. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es de 1:20. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es inferior a 1:100. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es inferior a 1:50. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es inferior a 1:20. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es inferior a 1:15. En algunas realizaciones, la proporción de vector AAV recombinante a molécula de unión multiespecífica (molécula:molécula) es inferior a 1:10.
En algunas realizaciones, la célula diana estáin vitro.En otras realizaciones, la invención proporciona una composición para su uso en un método de tratamiento o diagnósticoin vivo,comprendiendo el método administrar el nucleótido de interés a una célula diana que expresa una proteína de superficie celular, comprendiendo poner en contacto la célula diana con la composición. Por ende, en dichas realizaciones la célula diana se encuentrain vivoen un sujeto, por ejemplo, un ser humano.
Células diana
Se puede seleccionar como objetivo una amplia diversidad de células para administrar un nucleótido de interés utilizando un vector AAV recombinante como se describe en el presente documento. Las células diana generalmente se elegirán basándose en el nucleótido de interés y el efecto deseado.
En algunas realizaciones, se puede administrar un nucleótido de interés para permitir que una célula diana produzca una proteína que compense una deficiencia en un organismo, tal como una deficiencia enzimática o inmunodeficiencia, tal como la inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X. Por tanto, en algunas realizaciones, el objetivo son las células que normalmente producirían la proteína en el animal. En otras realizaciones, se dirigen a las células del área en la que una proteína sería más beneficiosa.
En otras realizaciones, un nucleótido de interés, tal como un gen que codifica un ARNip, puede inhibir la expresión de un gen particular en una célula diana. El nucleótido de interés puede, por ejemplo, inhibir la expresión de un gen implicado en el ciclo de vida de un patógeno. Por tanto, se pueden tomarse como objetivo células susceptibles a la infección por el patógeno o infectadas con el patógeno. En otras realizaciones, un nucleótido de interés puede inhibir la expresión de un gen responsable de la producción de una toxina en una célula diana.
En otras realizaciones, un nucleótido de interés puede codificar una proteína tóxica que mata las células en las que se expresa. En este caso, se pueden tomar como objetivo células tumorales u otras células no deseadas.
En otras realizaciones más, un nucleótido de interés que codifica una proteína a recolectar, tal como una proteína terapéutica se puede usar y se pueden dirigir a células que son capaces de producir y secretar la proteína.
Una vez que se identifica una población particular de células diana en las que se desea la expresión de un nucleótido de interés, se selecciona un receptor diana que se expresa específicamente en esa población de células diana. El receptor diana puede expresarse exclusivamente en esa población de células o en mayor medida en esa población de células que en otras poblaciones de células. Cuanto más específica sea la expresión, más específicamente se puede dirigir a las células diana. Dependiendo del contexto, la cantidad deseada de especificidad del marcador (y, por tanto, de la administración del gen) puede variar. Por ejemplo, para la introducción de un gen tóxico, lo más preferido es una alta especificidad para evitar matar células no objetivo. Para la expresión de una proteína para recolección, o la expresión de un producto secretado donde se desea un impacto global, puede ser necesaria una menor especificidad del marcador.
Como se ha analizado anteriormente, el receptor diana puede ser cualquier receptor para el cual se pueda identificar o crear un ligando de redireccionamiento. Preferentemente el receptor diana es un péptido o polipéptido, tal como un receptor. Sin embargo, en otras realizaciones, el receptor diana puede ser un carbohidrato u otra molécula que pueda ser reconocida por una pareja de unión. Si ya se conoce una pareja de la unión, por ejemplo, ligando, para el receptor diana, puede usarse como molécula de afinidad. Sin embargo, si no se conoce una molécula de unión, se pueden generar anticuerpos contra el receptor diana usando procedimientos convencionales. A continuación, los anticuerpos pueden usarse como ligando de redireccionamiento como parte de la molécula de unión multiespecífica.
Por tanto, las células diana se pueden elegir en función de una diversidad de factores, incluyendo, por ejemplo, (1) la aplicación particular (por ejemplo, la terapia, expresión de una proteína a recolectar y que confiere resistencia a enfermedades) y (2) expresión de un marcador con la cantidad deseada de especificidad.
Las células diana no están limitadas de ninguna manera e incluyen tanto células de la línea germinal y líneas celulares como células somáticas y líneas celulares. Las células diana pueden ser células madre derivadas de cualquier origen. Cuando las células diana son células de la línea germinal, las células diana se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en embriones unicelulares y células madre embrionarias (ES).
Composiciones farmacéuticas, formas farmacéuticas y administración
Una realización adicional proporciona un medicamento que comprende al menos una proteína de la cápside de AAV recombinante y una molécula de unión multiespecífica apropiada de acuerdo con esta invención y/o un ácido nucleico de acuerdo con esta invención, preferentemente al menos una estructura multimérica de acuerdo con esta invención. Preferentemente dicho medicamento es útil como vector de transferencia génica.
En el presente documento, también se describen composiciones farmacéuticas que comprenden los vectores AAV descritos en el presente documento y un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Además, en el presente documento se divulgan formas farmacéuticas que comprenden el vector AAV descrito en el presente documento.
Como se ha analizado en el presente documento, los vectores AAV descritos en el presente documento se pueden utilizar para diversas aplicaciones terapéuticas(in vivoyex-vivo)y como herramientas de investigación.
Las composiciones farmacéuticas basadas en los vectores AAV divulgados en el presente documento se pueden formular de cualquier manera convencional usando uno o más vehículos y/o excipientes fisiológicamente aceptables. El vector AAV puede formularse para administración mediante, por ejemplo, inyección, inhalación o aislamiento (ya sea por la boca o la nariz) o por administración oral, bucal, parenteral o rectal, o mediante administración directamente a un tumor.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para una diversidad de modos de administración, incluyendo administración sistémica, tópica o local. Las técnicas y formulaciones se pueden encontrar en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. Para administración sistémica, se prefiere la inyección, incluyendo intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Con el fin de inyección, las composiciones farmacéuticas se pueden formular en soluciones líquidas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como la solución de Hank o la solución de Ringer. Además, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en forma sólida y se vuelven a disolver o suspender inmediatamente antes de su uso. También son adecuadas las formas liofilizadas de la composición farmacéutica.
Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden adoptar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio). Los comprimidos pueden estar recubiertos por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse en forma de un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, metilo o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tampón, saborizantes, colorantes y agentes edulcorantes, según corresponda.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para su administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante en embolada o infusión continua. Las formulaciones para su inyección se pueden presentar en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con un conservante añadido opcionalmente. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular además como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleaginosos o acuosos y pueden contener otros agentes que incluyen agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas también se pueden formular como una preparación de liberación lenta ("depot"). Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implante (por ejemplo, subcutáneo o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal moderadamente soluble. Otros sistemas de administración adecuados incluyen microesferas, que ofrecen la posibilidad de administración local no invasiva de fármacos durante un período prolongado de tiempo. Esta tecnología puede incluir microesferas que tengan un tamaño precapilar, que se puede inyectar a través de un catéter coronario en cualquier parte seleccionada de un órgano sin causar inflamación o isquemia. A continuación, el agente terapéutico administrado se libera lentamente de las microesferas y es absorbido por las células circundantes presentes en el tejido seleccionado.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la materia, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, sales biliares y derivados del ácido fusídico. Además, se pueden usar detergentes para facilitar la permeación. La administración transmucosa puede realizarse mediante aerosoles nasales o supositorios. Para la administración tópica, el vector AAV descrito en el presente documento se puede formular en ungüentos, bálsamos, geles o cremas, como se conoce generalmente en la materia. También se puede usar una solución de lavado localmente para tratar una lesión o inflamación para acelerar la cicatrización.
Las formas farmacéuticas adecuadas para su uso inyectable pueden incluir soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y determinados parámetros de almacenamiento (por ejemplo, refrigeración y congelación) y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Si las formulaciones divulgadas en el presente documento se usan como terapéutico para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto, un agente terapéutico puede formularse en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico o dichos ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos, y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.
Un vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño del vector vírico requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos conocidos en la técnica. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo usando en las composiciones agentes retardadores de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando los compuestos o construcciones activos en la cantidad necesaria en el disolvente apropiado con otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración.
Tras la formulación, las soluciones se pueden administrar de una manera compatible con la formulación farmacéutica y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas farmacéuticas, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas o micropartículas y microesferas de liberación lenta y similares.
Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse de manera adecuada en caso necesario y el diluyente líquido en primer lugar tiene que volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intratumoral, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este contexto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosis podría disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y se añade a 1.000 ml de fluido de hipodermocilisis o se inyecta en el sitio de infusión propuesto.
La persona responsable de la administración, en todo caso, determinará la dosis adecuada para el sujeto individual. Por ejemplo, a un sujeto se le pueden administrar los vectores AAV descritos en el presente documento de forma diaria o semanal durante un período de tiempo o mensualmente, cada dos años o anualmente dependiendo de la necesidad o exposición a un organismo patógeno o a una condición en el sujeto (por ejemplo, cáncer).
Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tal como inyección intravenosa, intratumoral, intradérmica o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para la administración oral; formulaciones liposomales; cápsulas de liberación controlada; biodegradables y cualquier otra forma usada en la actualidad.
También se pueden utilizar soluciones o aerosoles intranasales o inhalables, aerosoles o inhalantes. Las soluciones nasales pueden ser soluciones acuosas diseñadas para administrarse a los pasos nasales en gotas o pulverizaciones. Las soluciones nasales se pueden preparar de forma que sean similares en muchos aspectos a las secreciones nasales. Por tanto, las soluciones acuosas nasales suelen ser isotónicas y levemente tamponadas para mantener un pH de 5,5 a 7,5. Además, conservantes antimicrobianos, similares a los usados en preparaciones oftálmicas y los estabilizadores de fármaco adecuados, si fuese necesario, se pueden incluir en la formulación. Se conocen diversas preparaciones nasales comerciales, y pueden incluir, por ejemplo, antibióticos y antihistamínicos y se utilizan para la profilaxis del asma.
Las formulaciones orales pueden incluir excipientes tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos. En determinadas realizaciones definidas, las composiciones farmacéuticas orales incluirán un diluyente inerte o vehículo comestible asimilable, o se puede encerrar en una cápsula de gelatina dura o blanda, o pueden comprimirse para formar comprimidos, o bien se pueden incorporar directamente a la comida de la dieta. Para la administración terapéutica oral, los compuestos activos pueden incorporarse con excipientes y usarse en la forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares.
Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: un aglutinante, como goma de tragacanto, acacia, maicena o gelatina; excipientes, tales como fosfato dicálcico; un agente disgregante, tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio; y se puede añadir un agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente aromatizante, tal como menta, aceite de gaulteria, o sabor a cereza. Cuando la forma farmacéutica unitaria es una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Puede haber otros diversos materiales como recubrimientos o de otro modo para modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con goma laca, azúcar o con ambas. Un jarabe de elixir puede contener los compuestos activos sacarosa como agente edulcorante, metilo y propilparabenos como conservantes, un colorante y un saborizante, tal como el sabor a cereza o naranja.
Otras realizaciones divulgadas en el presente documento pueden referirse a kits para su uso con métodos y composiciones. Los kits también pueden incluir un recipiente adecuado, por ejemplo, viales, tubos, tubos de minicentrífuga o microcentrífuga, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringa u otro recipiente. Cuando se proporciona un componente o agente adicional, el kit puede contener uno o más recipientes adicionales en los que se puede colocar este agente o componente. Los kits del presente documento también incluirán normalmente un medio para contener los vectores AAV y cualquier otro recipiente de reactivo en confinamiento cerrado para su venta comercial. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plástico inyectados o moldeados por soplado en los que se conserven los viales deseados. Opcionalmente, pueden ser necesarios uno o más principios activos adicionales tales como, por ejemplo, agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, agentes antifúngicos o antibacterianos o agentes antitumorales para las composiciones descritas.
Los rangos de dosis y la frecuencia de administración pueden variar según la naturaleza de los vectores AAV y la condición médica, así como los parámetros de un paciente específico y la vía de administración utilizada. En algunas realizaciones, las composiciones de vectores AAV se pueden administrar a un sujeto en una dosis que varía entre aproximadamente 1x105 unidades formadoras de placa (ufp) y aproximadamente 1x1015 ufp, dependiendo del modo de administración, la vía de administración, la naturaleza de la enfermedad y la condición del sujeto. En algunos casos, las composiciones de vectores de AAV se pueden administrar en una dosis que varía entre aproximadamente 1x108 ufp y aproximadamente 1x1015 ufp, o desde aproximadamente 1x1010 ufp y aproximadamente 1x1015 ufp, o desde aproximadamente 1x108 ufp y aproximadamente 1x1012 ufp. Una dosis más precisa también puede depender del sujeto al que se administra. Por ejemplo, puede ser necesaria una dosis más baja si el sujeto es juvenil, y puede ser necesaria una dosis más alta si el sujeto es un sujeto humano adulto. En determinadas realizaciones, una dosis más precisa puede depender del peso del sujeto. En determinadas realizaciones, por ejemplo, un sujeto humano juvenil puede recibir de aproximadamente 1x108 ufp a aproximadamente 1x1010 ufp, mientras que un sujeto humano adulto puede recibir una dosis de aproximadamente 1x1010 ufp a aproximadamente 1x1012 ufp.
Las composiciones divulgadas en el presente documento pueden administrarse por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir la administración a un sujeto por vía intravenosa, intratumoral, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intramuscular, intratecal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, local, mediante inhalación, mediante inyección, mediante infusión, mediante infusión continua, mediante perfusión localizada, mediante un catéter, mediante un lavado, en una crema, o en una composición lipídica.
Se puede utilizar cualquier método conocido por un experto en la materia para la producción a gran escala de vectores AAV, células empaquetadoras y construcciones de vectores descritas en el presente documento. Por ejemplo, las reservas de semillas maestras y de trabajo pueden prepararse bajo condiciones GMP en CEF primarios calificados o mediante otros métodos. Las células empaquetadoras se pueden sembrar en matraces de gran superficie, cultivar hasta cerca de la confluencia y los vectores AAV se purifican. Las células se pueden recolectar y los vectores AAV se pueden liberar en los medios de cultivo aislados y purificados, o los vectores AAV intracelulares se pueden liberar mediante alteración mecánica (los restos celulares se pueden eliminar mediante filtración profunda de poros grandes y el ADN de la célula hospedadora se puede digerir con endonucleasa). Los vectores de virus AAV pueden purificarse y concentrarse posteriormente mediante filtración de flujo tangencial, seguido de diafiltración. La masa concentrada resultante puede formularse mediante dilución con un tampón que contenga estabilizadores, envasado en viales y liofilizado. Las composiciones y formulaciones pueden almacenarse para su uso posterior. Para su uso, los vectores AAV liofilizados se pueden reconstituir mediante la adición de diluyente.
Determinados agentes adicionales usados en las combiterapias se pueden formular y administrar por cualquier medio conocido en la técnica.
Las composiciones como se divulgan en el presente documento también pueden incluir adyuvantes tales como sales de aluminio y otros adyuvantes minerales, agentes tensoactivos, derivados bacterianos, vehículos y citocinas. Los adyuvantes también pueden tener propiedades inmunomoduladoras antagonistas. Por ejemplo, los adyuvantes pueden estimular la inmunidad Th1 o Th2. Las composiciones y métodos divulgados en el presente documento también pueden incluir terapia adyuvante.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos únicamente y no están destinados a limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1: Producción de vectores víricos adenoasociados con un epítopo heterólogo
Las proteínas de la cápside de AAV se modifican para contener uno de varios epítopos heterólogos: FLAG, c-myc, hexahistidina, etc. usando PCR para generar un plásmido que codifica una proteína de la cápside recombinante. Resumiendo, la secuencia que codifica FLAG, c-myc o hexahistidina se inserta en el marco después del codón que codifica N587 de una proteína de la cápside de AAV2, Q585 de una proteína de la cápside VP1 de AAV6, N590 de una proteína de la cápside VP1 de AAV8, A589 de una proteína de la cápside VP1 de AAV9, o G453 de una proteína de la cápside VP1 de AAV9.
La producción de virus adenoasociados se realiza mediante un método de transfección triple con células HEK293 (véase, por ejemplo, Erik Arden y Joseph M. Metzger,J. Biol. Methods.2016; 3(2)). Las células se siembran en placas un día antes de la transfección mediada por PEFpro (transfección Polyplus, Nueva York, NY) con vectores apropiados:
Un plásmido auxiliar, pHelper (Agilent, n.° de cat. 240074);
Un plásmido que codifica el genrep/capde AAV de tipo silvestre o modificado (pAAV RC2 (Cell Biolabs, n.° de cat VPK-422), por ejemplo, pAAV RC2/6/9 (Cell Biolabs, n.° de cat VPK-426), pAAV RC8, pAAV RC2-N587myc, pAAV RC2/6-Q585myc, pAAVRC8-N590myc, pAAV RC9-A589myc, etc.; y
Un plásmido que codifica un nucleótido de interés y secuencias ITR de AAV, por ejemplo, pscAAV-CMV-eGFP, pAAV-CMVGFP (Agilent n.° de cat. 240074), pAA V-EF1a-eGFP o pAAV-CAGG-eGFP, etc.
Setenta y dos horas después de la transfección, se recoge el medio y las células se lisan en tampón [Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM y desoxicolato de sodio al 0,5 % (Sigma, n.° de cat. D6750-100G)]. A continuación, se añade benzonasa (Sigma, St. Louis, MO) tanto al medio como al lisado celular hasta una concentración final de 0,5 U/pl antes de la incubación a 37 °C durante 60 minutos. El lisado celular se centrifuga a 4.000 rpm durante 30 minutos. El lisado celular y el medio se combinan y se precipitan con PEG 8000 (Teknova n.° de cat. P4340) a una concentración final del 8 %. El sedimento se resuspende en NaCl 400 mM y se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos. Los virus en el sobrenadante se sedimentan mediante ultracentrifugación a 149.000 g durante 3 horas y se titulan mediante qPCR.
Para que qPCR titule los genomas de AAV, las muestras de AAV se tratan con ADNasal (Thermofisher Scientific, n.° de cat.EN0525) a 37 °C durante una hora y se lisan utilizando todos los reactivos de extracto de ADN (Thermofisher Scientific n.° de cat. 4403319). Los genomas víricos encapsidados se cuantifican utilizando un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 3 (Thermofisher Scientific) utilizando cebadores dirigidos a las ITR de AAV2. Las secuencias de los cebadores de ITR de AAV2 son 5-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3' (ITR directo; SEQ ID NO:9) y 5'-CGGCCTCAGTGAGCGA-3' (ITR inverso; SEQ ID NO: 10) (Aurnhammeret al.,2012), derivados de la secuencia de repetición interna invertida (ITR) izquierda del AAV y la secuencia de repetición interna invertida (ITR) derecha del<a>A<v>, respectivamente. La secuencia de la sonda de ITR de AAV2 es 5'-6-FAM-CACTCCCTCT<g>C<g>CGCTCG-TAMRA-3' (SEQ ID NO:11) (Aurnhammer C., Haase M., Muether N.,et al.,2012,Hum. Gene Ther. Methods23, 18 28). Después de una etapa de activación a 95 °C durante 10 min, se realiza un ciclo de PCR de dos etapas a 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 30 segundos durante 40 ciclos. En la qPCR se utilizó la mezcla maestra de PCR universal TaqMan (Thermofisher Scientific, n.° de cat. 4304437). El plásmido de ADN (Agilent, n.° de cat. 240074) se utiliza como estándar para determinar los títulos absolutos.
Vectores víricos adenoasociados que comprenden una cápside en la que se produjeron un epítopo c-myc. En este ejemplo, un epítopo de c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:6) se insertó entre los aminoácidos N587 y R588 de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 o entre los aminoácidos A589 y Q590 de la proteína de la cápside VP1 de AAV9, es decir, la secuencia de nucleótidos que codifica el epítopo c-myc (GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG; SEQ ID NO:12) se insertó en el plásmido pAAV RC2 (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA) o el plásmido pAAV RC2/9, y cada uno de los respectivos plásmidos pAAV RC2-N587Myc pAAV RC9-A589Myc modificados se usaron para codificar la proteína de la cápside modificada para vectores víricos de AAV con un tropismo reducido o anulado.
Para crear pAAV RC2-N587Myc, un primer producto de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que comprende (de 5' a 3') un sitio de restricción BsiW1, la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 3050 y 3773 de pAAV RC2, y una secuencia de nucleótidos saliente del epítopo c-myc, y un segundo producto de PCR que comprende (de 5' a 3') una secuencia de nucleótidos que sobresale del epítopo c-myc, la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 3774 a 4370 de pAAV RC2 y un sitio de restricción Pme1 se crearon usando los cebadores establecidos en la Tabla 2. El plásmido pAAV RC2-N587Myc (es decir, un plásmido pAAV RC2 modificado para codificar el epítopo c-myc entre los aminoácidos N587 y R588 de la proteína de la cápside VP1) se creó digiriendo pAAV RC2 con BsiW1 (New England Biolabs, R0553L) y Pme1 (New England Biolabs, R0560L), e insertando los dos productos de PCR mediante clonación independiente de ligación como se describe en (2012)Methods Mol. Biol.52:51-9.
Para crear pAAV RC2/6-Q585Myc, se encargó a Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) un fragmento de ADN gblock que comprendía las posiciones 3700 y 3940 de pAAV RC2/6 con la secuencia del epítopo c-myc insertada entre 3757 y 3758. El plásmido pAAV RC2/6-Q585Myc se creó mediante la inserción del fragmento gblock en pAAV RC2/6 digerido con MscI (New England Biolabs, n.° de cat. R0534L) y AflII (New England Biolabs, n.° de cat. R0520L) mediante clonación independiente de la ligación como se describe en (2012)Methods Mol. Biol.52:51-9.
Para crear pAAV RC9-A589Myc, un primer producto de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que comprende (de 5' a 3') un sitio de restricción BsiW1, la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 3052 y 3779 de pAAV RC9, y una secuencia de nucleótidos saliente del epítopo c-myc, y un segundo producto de PCR que comprende (de 5' a 3') una secuencia de nucleótidos que sobresale del epítopo c-myc, la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 3779 a 4404 de pAAV RC9 y un sitio de restricción Pme1 se crearon usando los cebadores establecidos en la Tabla 2.
El plásmido pAAV RC9-A589Myc (es decir, un plásmido pAAV RC2/9 modificado para codificar el epítopo c-myc entre los aminoácidos A589 y Q590 de la proteína de la cápside VP1) se creó digiriendo pAAV RC9 con BsiW1 (New England Biolabs, R0553L) y Pme1 (New England Biolabs, R0560L), e insertando los dos productos de PCR mediante clonación independiente de ligación como se describe en (2012)Methods Mol. Biol.52:51-9.
Tabla 2
pscAAV-CMV-eGFP se produjo introduciendo el fragmento de GFP en el vector pscAAV MCS (Cell Biolabs, n.° de cat. VPK-430) usando el sitio de restricción BamHI y NotI. El plásmido pAAV-EF1a-eGFP y pAAV-CAGG-eGFP se hicieron por síntesis de novo de Thermofisher Scientific (Waltham, MA).
Ejemplo 2: Redireccionamiento mediado por anticuerpo de vectores víricos de AAVin Vitro
HepG2 es una línea celular de cáncer de mama humano, que expresa el receptor 1 de asialoglicoproteína marcador específico del hígado (ASGR1). Para probar si los vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP pueden infectar células HepG2, por ejemplo, a través de un anticuerpo biespecífico que reconoce tanto c-myc como ASGR1 (anticuerpo anti-myc-ASGR1), mezclas que comprenden diferentes proporciones del número de genomas víricos (genomas víricos 5e9) al número de moléculas de anticuerpo (1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20, 1:50 o 1:100) de scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP y el anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 se incubaron a temperatura ambiente durante media hora y, a continuación, se añadió a las células HepG2. Las células HepG2 también se incubaron únicamente con vectores víricos scAAV2-CMV-eGFP de tipo silvestre, únicamente vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP, o vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP con anticuerpo anti-myc monoespecífico (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) en una proporción de 1:8 como controles. Tres días después de la infección, la expresión de GFP por células HepG2 infectadas se confirmó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Figura 1). La expresión de GFP también se detectó en un porcentaje comparable de células HepG2 cuando se incubaron con scAAV2-CMV-eGFP de tipo silvestre y cuando se incubaron con vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP y anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 en una proporción de 1:8 (44,6 % y 44,1 %, respectivamente, lasFiguras 1A y 1G, paneles superior e inferior). Se detectó una expresión más baja de GFP por FACs en células HepG2 incubadas con una mezcla de vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFp y anticuerpo anti-myc-ASGR1 biespecífico superior o inferior (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, Nueva York) (Figura 1C, panel inferior). Adicionalmente, no se detectó GFP en células HepG2 infectadas con scAAV-N587Myc-CMV-eGFP en ausencia de anticuerpo anti-myc-ASGR1, ni en células HepG2 incubadas con scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP y anticuerpo anti-myc monoespecífico.
De forma similar, células 293T-hASGR1, que son células 29T3 modificadas genéticamente para expresar ASGR1 humano (h) en la superficie celular, se incubaron con mezclas que comprendían diferentes proporciones de genomas víricos con respecto al número de moléculas de anticuerpos (1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20 o 1:100) de scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP y anticuerpo anti-myc-ASGR1 biespecífico. Células 293T de tipo silvestre (que no expresan hASGR1) incubadas con una mezcla de scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP y anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 en una proporción de 1:8, y células 293T-hASGR1 incubadas con (a) únicamente vectores víricos scAAV de tipo silvestre, (b) únicamente vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP, o (c) vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP con un anticuerpo anti-myc-GCGR biespecífico irrelevante que reconoce c-myc y el receptor de glucagón (GCGR) (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) no expresado por células 293T en una proporción de 1:8, sirvieron como controles. Tres días después de la infección, se tiñeron células 293T-hASGR1 o 293T con anticuerpo antihASGR1 humano (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) seguido de anticuerpo antihumano de cabra conjugado con APC (Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc, n.° de cat. 109-136-098, West Grove, PA) y expresión de GFP analizada por FACS. La expresión de hASGR1 se detectó en la superficie de células 293T-hASGR1 (Figuras 2Ai-2Axy2Axii) pero no las células 293T (Figura 2Axi). Se detectaron células 293T-hASGR1 positivas para GFP después de la incubación con scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP y mezclas de anticuerpos biespecíficos anti-myc-ASGR1 con proporciones de 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8. 1:15, 1:20 y 1:50 a niveles (56,9 % a 68,3 %) comparables a las células 293T-hAsGR1 incubadas con scAAV de tipo silvestre (56,7 %) (Figuras 2Aiy2Aiii-2Aix). Una proporción de 1:100 de scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP y anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 disminuyó la infectividad (Figura 2Ax). La incubación con scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP solo o scAAV-N587Myc con un anticuerpo anti-myc-GCGR biespecífico irrelevante no dio como resultado la expresión de GFP por células 293T-hASGR1 (Figuras 2Aiiy2Axii).
En un experimento similar, se incubaron células 293T-hASGR1 con células incubadas únicamente con vectores víricos AAV9-CAGG-GFP no modificados, únicamente vectores víricos AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP, o vectores víricos AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP mezclados con anticuerpos biespecíficos anti-Myc-ASGR1 en diferentes proporciones. Tres días después de la infección, la expresión de GFP se analizó mediante FACS. Se detectaron células 293T-hASGR1 positivas para GFP después de la incubación con AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP y mezclas de anticuerpos biespecíficos anti-myc-ASGR1 con proporciones de 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:20, 1:50 y 1:100 a niveles (41,1 % a 91 %) comparables a las células 293T-hASGR1 incubadas con AAV9-CAGG-eGFP de tipo silvestre (9,72 %) (z y Figuras 2B(iii)-(ix). La incubación solo con AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP no dio como resultado la expresión de GFP por parte de las células 293T-hASGR1 (Figura 2B (ii)).
Se probó la capacidad de un anticuerpo bivalente anti-hASGR1 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) para bloquear la infección de células 293T-hASGR1. Se incubaron células 293T-hASGR1 con el anticuerpo bivalente anti-hASGR1 a diferentes concentraciones durante 1 hora a temperatura ambiente y posteriormente se incubaron con una mezcla que comprendía una proporción de 1:8 de scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP y anticuerpo anti-myc-ASGR1 biespecífico. Tres días después de la infección, las células se fijaron y analizaron por FACS como se ha descrito anteriormente. LaFigura 3proporciona datos que muestran que la entrada de scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP puede bloquearse de manera dependiente de la dosis mediante un anticuerpo bivalente anti-hASGR1.
Para determinar si la administración secuencial de anticuerpos biespecíficos y AAV modificado podría dar como resultado un redireccionamiento mediado por anticuerpos del AAV modificado, diferentes números de moléculas de anticuerpos anti-myc-ASGR1 biespecíficos (que van desde 1x109 a 1x1012 moléculas) se añadieron a 2x105 células 293T-hASGR1 durante una hora, después de lo cual se añadieron 1x109 vectores víricos scAAV-N587Myc. Los controles incluyeron (1) células 293T-hASGR1 incubadas únicamente con scAAV de tipo silvestre, es decir, en ausencia de cualquier compuesto, (2) células 293T-hASGR1 incubadas secuencialmente con 1x1011 moléculas de anticuerpo anti-myc-GCGR biespecíficas irrelevantes y 1x109 vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP y (3) células 293T, que no expresan hASGR1, incubadas secuencialmente con 1x1011 moléculas de anticuerpo anti-myc-ASGR1 biespecíficas y 1x109 vectores víricos scAAV-N587Myc. Dos días después de la infección, la expresión de GFP por células 293T-hASGR1 infectadas se visualizó mediante microscopía (Figura 4). La expresión de GFP por células 293T-hASGR1 se observó después de la incubación con únicamente scAAV de tipo silvestre y después de la incubación secuencial con moléculas de anticuerpo anti-myc-ASGR1 en todas las concentraciones y scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (Figuras 4A, 4C-4I).No se detectó GFP en las células 29T3-hASGR1 después de la incubación con únicamente scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (Figura 4B), en células 293T que no expresaban ASGR1 después de una incubación secuencial con anticuerpo anti-myc-hASGR1 y vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP(Figura 4J), o en células 29T3-hASGR1 después de una incubación secuencial con anticuerpo anti-myc-GCGR biespecífico irrelevante y vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (Figura 4K).
Como se describe en el presente documento, el tropismo del AAV autocomplementario (scAAV) puede estar (1) inactivado, por ejemplo, por modificación de una proteína de la cápside, por ejemplo, mediante inserción de un epítopo c-myc, y opcionalmente, (2) redirigido usando anticuerpos biespecíficos, por ejemplo, con un anticuerpo biespecífico que reconoce el epítopo c-myc y un ligando expresado por la célula diana. Para determinar si el tropismo del AAV monocatenario (ssAAV) puede de manera similar (1) reducirse o anularse y, opcionalmente, (2) redirigirse, se incubaron células 293T-hASGR1 con vectores víricos ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP producidos como se describe en el Ejemplo 1 en ausencia o presencia de anticuerpo anti-myc-hASGR1 biespecífico en diferentes proporciones vector vírico:anticuerpo (1:0, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:20, 1:100 o 1:1000). Los controles incluyeron células 293T-hASGR1 incubadas con ssAAV de tipo silvestre, células 293T-hASGR1 incubadas con vectores víricos ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP y anticuerpo anti-myc-GCGR biespecífico irrelevante en una proporción vector vírico:anticuerpo de 1:8, y células 293T (que no expresan hASGR1) incubadas con vectores víricos ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP y anticuerpo anti-myc-hASGR1 biespecífico en una proporción vector vírico:anticuerpo de 1:8. Tres días después de la infección, las células se fijaron y la expresión de GFP se detectó mediante FACS (Figura 5). La expresión de GFP se detectó en células 293T-hASGR1 incubadas con ssAAV de tipo silvestre y con mezclas de vectores víricos ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP y anticuerpos biespecíficos anti-myc-ASGR1 en todas las proporciones (Figuras 5A, 5C-5I). La expresión de GFP no se observó en células 29T3 incubadas con vectores víricos ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP y anticuerpos biespecíficos anti-myc-ASGR1 (Figura 5J), o mediante células 293T-hASGR1 incubadas con únicamente vectores víricos ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP, o con vectores víricos ssAAV-N587Myc y anticuerpo biespecífico anti-myc-GCGR biespecífico irrelevante (Figuras 5B, 5K).
El receptor de glucagón (GCGR) humano (h) normalmente no se expresa en las células 293T. Sin embargo, 293T-hGCGR es una línea celular 293T estable modificada genéticamente para expresar hGCGR en la superficie celular. Para probar si el redireccionamiento de los vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP puede estar mediado por un anticuerpo anti-myc-GCGR biespecífico a través del receptor hGCGR, se incubaron células 293T-hGCGR con diferentes mezclas que comprendían diferentes proporciones de scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP:anticuerpo biespecífico anti-myc-GCGR. Los vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP se mezclaron con anticuerpo antimyc-GCGR biespecífico en proporciones de 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20, 1:50 o 1:100 a temperatura ambiente durante media hora antes de la adición a las células 293T-hGCGR. Tres días después de la infección, la expresión de GFP por células 293T-hCGCR infectadas se confirmó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Figura 6). Se detectó un porcentaje significativo de células positivas para GFP después de la incubación con scAAV de tipo silvestre (Figura 6A) o scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP/anticuerpo anti-myc-GCGR biespecífico en una proporción de 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20, 1:50 y 1:100 (Figuras 6C-6K). No se detectó GFP en células 293T-hGCGR incubadas con vectores víricos scAAV2-N587myc-CMV-eGFP solos o vectores víricos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP con anticuerpo anti-myc monoespecífico (Figuras 6B y 6L, respectivamente).
Jurkat es una línea celular de leucemia de linfocitos T aguda humana, que expresa CD3 humana (h). Para probar si el redireccionamiento de los vectores víricos AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP puede estar mediada por un anticuerpo antimyc-CD3 biespecífico a través del receptor hCD3, las células Jurkat se incubaron con diferentes mezclas que comprendían diferentes proporciones de AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP:anticuerpo anti-myc-CD3 biespecífico. Los vectores víricos AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP se mezclaron con anticuerpo anti-myc-CD3 biespecífico en proporciones de 1:1, 1:5, 1:10, 1:100, 1:1000 a temperatura ambiente durante media hora antes de la adición de las células Jurkat. T res días después de la infección, la expresión de GFP por células Jurkat infectadas se confirmó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Figura 7). Se detectó un porcentaje significativo de células positivas para GFP después de la incubación con AAV6-EF1a-eGFP de tipo silvestre (Figura 7B) o AAV6-Q585Myc-EFlaeGFP/anticuerpo anti-myc-CD3 biespecífico en una proporción de 1:1, 1:5, 1:10 y 1:100(Figuras 7D-7G). No se detectó GFP en células Jurkat incubadas con vectores víricos AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP(Figuras 7C).
En este ejemplo se describe la inactivación del tropismo natural de varios serotipos de AAV autocomplementarios (sc) o monocatenarios (ss) demostrada por la incapacidad de scAAV2 o ssAAV2 genéticamente modificados con un epítopo c-myc insertado entre el aminoácido N587 y R588 de la proteína de la cápside VP1 (scAAV-N587myc o ssAAV-N587myc), AAV6 con un epítopo c-myc insertado entre Q585 y S586, y AAV9 para infectar células normalmente infectadas por AAV de tipo silvestre (Figuras 1A-1B, 2A-2B, 3A-3B, 4A-4B, 5A-5B, 6A-6B y 7). Además, en este ejemplo se demuestra la capacidad de un anticuerpo biespecífico que reconoce el epítopo c-myc y un segundo ligando expresado por la célula diana (por ejemplo, hASGR1, hGCGR o hCD3) para redirigir el tropismo del AAV modificado y mediar en la infección de la célula diana por AAV pseudotipado de una manera específica del ligando (Figuras 1-7). Por otra parte, este ejemplo demuestra que la administración simultánea del sc- o ss-AAV genéticamente modificado y del anticuerpo biespecífico no es necesaria para la infección, es decir, la administración secuencial es suficiente para el redireccionamiento del sc- o ss-AAV genéticamente modificadoin vitro(Figura 4).
Ejemplo 3: Redireccionamiento mediado por anticuerpo de vectores víricos modificadosin vivo
Redireccionamiento de vectores víricos al hígado con diferentes formatos de moléculas de unión multiespecíficas
Para determinar si el anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 podría redirigir los vectores víricos scAAV2-N587myc-CMV-eGFP a células hepáticas que expresan hASGR1in vivo,a ratones modificados genéticamente de modo que sus células hepáticas expresen hASGR1 en el fondo C57BL/6, y a ratones C57BL/6 de tipo silvestre de control se les inyectó 1x1011 (titulado por qPCR) de vectores víricos scAAV2-CMV-eGFP de tipo silvestre solos o scAAV2-N587myc-CMV-eGFP junto con anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 y en una proporción de 1:8 de genoma vírico a moléculas de anticuerpo por vía intravascular. Los controles incluyeron ratones inyectados con solución salina [NaCl 250 mM] o con el vector vírico scAAV2-N587myc-CMV-eGFP solo. Diez días después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y perfundidos transcardialmente con PFA al 4 %. Se extirparon órganos como el hígado, riñón y el corazón y se deshidrataron en sacarosa al 15 % seguido de sacarosa al 30 %. A continuación, los órganos se crioseccionaron en portaobjetos y se tiñeron con anticuerpo anti-EGFP de pollo (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA) y anticuerpo secundario antipollo conjugado con Alexa-488 (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, Pensilvania). (Figuras 8A-8C). Se detectaron células positivas para GFP en hígados de aquellos animales transgénicos modificados para expresar ASGR1 en el hígado y se les inyectaron con scAAV2-CMV-eGFP de tipo silvestre o scAAV2-N587myc-CMV-eGFP junto con un anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 (Figuras 8A(i) y 8A(iv)), y en hígados de ratones C57BL/6 de tipo silvestre inyectados con scAAV2-CMV-eGFP de tipo silvestre (Figura 8A(v)). No se detectó GFP en ninguna muestra de bazo o riñón (Figuras 8B y 8C), ni en muestras de hígado, bazo o riñón de cualquier animal inyectado con solución salina o vectores víricos scAAV2-N587myc-CMV-eGFP solos (Figuras 8A (ii, iii, vi, vii)), ni en muestras de hígado tomadas de animales C57BL/6 de tipo silvestre inyectados con scAAV2-N587myc-CMV-eGFP junto con anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 (Figura 8A (viii)). Resumiendo, la combinación de vectores víricos scAAV2-N587myc-CMV-eGFP y anticuerpo anti-myc-ASGR1 biespecífico infectó solo aquellas células (del hígado) que expresaban hASGR1, lo que sugiere fuertemente que el vector vírico scAAV2-CMV-eGFP fue inactivado por la modificación de la proteína de la cápside, por ejemplo, el tropismo natural del vector vírico scAAV podría reducirse o anularse, por ejemplo, con un epítopo c-myc, y dichos vectores víricos podrían reactivarse específicamente, por ejemplo, redirigirse específicamente, por ejemplo, a las células del hígadoin vivo,por ejemplo, por anticuerpos biespecíficos anti-myc-ASGR1.
De forma similar, para determinar si el anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 podría redirigir los vectores víricos ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP a células hepáticas que expresan hASGR1in vivo,a ratones modificados genéticamente de modo que sus células hepáticas expresen hASGR1 en el fondo C57BL/6, y a ratones C57BL/6 de tipo silvestre de control se les inyectó 2.18x1011 (titulado por qPCR) de vectores víricos ssAAV2-CAGG-eGFP de tipo silvestre solos o ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP junto con anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 y en una proporción de 1:4 de genoma vírico a moléculas de anticuerpo por vía intravascular. Los controles incluyeron ratones inyectados con PBS o con el vector vírico ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP solo. Cuatro semanas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y perfundidos transcardialmente con PFA al 4 %. Se extirparon órganos como el hígado, riñón y el corazón y se deshidrataron en sacarosa al 15 % seguido de sacarosa al 30 %. A continuación, los órganos se crioseccionaron en portaobjetos y se tiñeron con anticuerpo anti-EGFP de pollo (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA) y anticuerpo secundario antipollo conjugado con Alexa-488 (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, Pensilvania). Se detectaron células positivas para GFP en hígados de animales transgénicos modificados para expresar ASGR1 en el hígado y se les inyectaron ssAAV2-CAGG-eGFP de tipo silvestre o ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP junto con un anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 (Figuras 9E-9F, 9P-9R), y en hígados de ratones C57BL/6 de tipo silvestre inyectados con ssAAV2-CAGG-eGFP de tipo silvestre (Figura 9B-9C). Sorprendentemente, la eficacia de infección de ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP junto con el anticuerpo anti-myc-ASGR1 biespecífico es mucho mayor que la de WT ssAAV2-CAGG-GFP (Figuras 9E-9F, 9P-9R). No se detectó GFP o apenas se detectó en muestras de hígado de ningún animal inyectado con solución salina o vectores víricos ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP solos (Figuras 9A, 9D, 9G-9L)), ni en muestras de hígado tomadas de animales C57BL/6 de tipo silvestre inyectados con ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP junto con anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 (Figura 9M-9O). Resumiendo, la combinación de vectores víricos ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP y anticuerpo anti-myc-ASGR1 biespecífico infectó solo aquellas células (del hígado) que expresaban hASGR1, lo que sugiere fuertemente que el vector vírico ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP fue inactivado por la modificación de la proteína de la cápside, por ejemplo, el tropismo natural del vector vírico scAAV podría reducirse o anularse, por ejemplo, con un epítopo c-myc, y dichos vectores víricos podrían reactivarse específicamente, por ejemplo, redirigirse específicamente, por ejemplo, a las células del hígadoin vivo,por ejemplo, por anticuerpos biespecíficos anti-myc-ASGR1.
Se realizaron experimentos adicionales con un vector vírico AAV9 pseudotipado con ratones modificados genéticamente de modo que sus células hepáticas expresaran hASGR1 en el fondo C57BL/6. A estos ratones se les inyectó 1x1011 (titulado por qPCR) de partículas víricas AAV9-CAGG-eGFP o AAV9-A589myc-CAGG-eGFP de tipo silvestre junto con anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGRI en una proporción de 1:100 de genoma vírico a moléculas de anticuerpo por vía intravascular. Los controles incluyeron ratones inyectados con PBS o con partículas víricas AAV9-N587myc-CAGG-eGFP junto con un anticuerpo anti-myc-hCD3 biespecífico irrelevante. Cuatro semanas después de la inyección, se sacrificaron los ratones. Los hígados se fijaron con formalina al 10 % y se enviaron a HistoWiz. Inc (Nueva York, NY) para la tinción con GFP. Se detectaron células positivas para GFP en hígados de animales inyectados con partículas víricas AAV9-CAGG-eGFP o AAV9-N587myc-CAGG-eGFP de tipo silvestre junto con un anticuerpo biespecífico anti-myc-ASGR1 (Figuras 10A y 10D). No se detectó GFP o apenas se detectó en muestras de hígado de ningún animal inyectado con solución salina o con partículas víricas AAV9-N587myc-CAGG-eGFP junto con un anticuerpo biespecífico anti-myc-hCD3, respectivamente (Figuras 10B y 10C). Resumiendo, de manera similar a AAV2, el tropismo natural de AAV9 puede reducirse o anularse mediante la modificación de la proteína de la cápside, por ejemplo, mediante la inserción de un epítopo c-myc, y que dicho vector vírico modificado, por ejemplo, AAV9-A589myc, puede redirigirse a tipos de células específicos utilizando la proteína de unión al marcador específico de células anti-epítopo biespecífico correspondiente, por ejemplo, anticuerpo anti-myc-ASGR1 biespecífico contra las células hepáticas.
Anti-myc scFc añadido al formato Fc de "botón en ojal" de IgG4 anti-hASGR1
Para determinar si diversos formatos de moléculas de unión multiespecíficas podrían mediar en la infección por AAV, se fusionó scFv anti-myc al extremo C de una cadena de un anticuerpo de IgG4 anti-hASGR1 con "botón en ojal" (véase la Figura 11A). Específicamente, Integrated DNA technologies (Skokie, Illinois) proporcionó un gblock que codificaba un scFv anti-myc (SEQ ID NO:28) flanqueado por brazos homólogos a 1459-1478 y 1479-1498 de pRG7078 que codificaba una cadena pesada de IgG4 con knob oculto anti-hASGR1. Las secuencias de nucleótidos (NA) que codifican y las secuencias de aminoácidos (AA) de HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del scFv (SEQ ID NO:37) codificado por<s>E<q>ID NO:28 se proporcionan en la Tabla 3.
Tabla 3: SEQ ID NO asociadas al scFv establecido como SEQ ID NO:37
El gblock se clonó en pRG7078 que codificaba una cadena pesada de IgG4 con knob oculto anti-hASGR1 para producir un pRG7078 que codificaba un polipéptido de fusión de scFv anti-myc de IgG4 con knob oculto anti-hASGR1 "biespecífico anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc". El plásmido pRG7078 modificado con c-myc, la estrella de orificio oculta pRG7078 antihASGR1 IgG4 no modificada y un plásmido que contiene una cadena ligera de anticuerpo, fueron transfectados en células 293T, cultivadas con OPTI-MEM (n.° de cat. 31985070, Thermo Fisher). Cuatro días después de la transfección, se recogió el medio y se purificó la molécula de unión biespecífica anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc utilizando una columna de proteína A (n.° de cat. 89948, Thermo Fisher).
Para crear un vector vírico de AAV8 pseudotipado, pAAV-RC8 N590myc, se encargó un gblock con un epítopo c-myc (SEQ ID NO:22) insertado entre N590 y T591 de una proteína de la cápside VP1 de AAV8 a Integrated DNA technologies (Skokie, Illinois). El plásmido pAAV RC8 (s Eq ID NO:23) se digirió con las enzimas Mlu1 y Sbf1 y el gblock se clonó en el vector usando SLIC para producir pAAV RC8 N590myc (SEQ ID NO:24).
células 293T-hASGR1, que son células 293T modificadas genéticamente para expresar ASGR1 humano (h) en la superficie celular, se incubaron con mezclas que comprenden diferentes proporciones de AAV8-N590Myc-CAGG-eGFP a moléculas de molécula de unión biespecífica anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc (1:0, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:12, 1:15, 1:50 o 1:100) o genomas víricos AAV8-CAGG-eGFP. Tres días después de la infección, la expresión de GFP se analizó mediante FACS. Se detectaron células 293T-hASGR1 positivas para GFP después de la incubación con mezclas de AAV8-N590Myc-CAGG-eGFP y moléculas biespecíficas anti-hASGRI-IgG4-Fc/anti-myc en proporciones de 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:12, 1:15, 1:50 o 1:100 (2,12 % a 22,2 %;Figuras 12D-12K) comparables a las células 293T-hASGR1 incubadas con AAV8-CAGG-eGFP de tipo silvestre (46,1 %)(Figura 12A). Ni las células infectadas de forma simulada (Figura 12B) ni la incubación con AAV8-N590Myc-CAGG-eGFP sola dieron como resultado la expresión de GFP por células 293T hASGR1 (Figura 12C).
Para determinar si las proteínas de unión biespecíficas anti-hASGRI-IgG4-Fc/anti-myc podrían redirigir las partículas víricas AAV8 N590myc-CAGG-eGFP a células hepáticas que expresan hASGR1in vivo,a ratones modificados genéticamente de modo que sus células hepáticas expresan hASGR1 en el fondo C57BL/6 se les inyectó por vía intravascular 1x1011 (titulado por qPCR) de partículas víricas AAV8-CAGG-eGFP o AAV8 N590myc-CAGG-eGFP de tipo silvestre junto con moléculas de unión biespecíficas anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc en una proporción de 1:12 de genoma vírico a moléculas de proteína de unión. A los animales de control se les inyectaron partículas víricas AAV8 N590myc-CAGG-eGFP junto con una molécula de unión biespecífica anti-hCD3xanti-myc irrelevante que tenía un formato similar al de la molécula de unión biespecífica anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc. Tres semanas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y perfundidos transcardialmente con PFA al 4 %. Se extirparon órganos como el hígado, riñón y el corazón y se deshidrataron en sacarosa al 15 % seguido de sacarosa al 30 %. A continuación, los órganos se crioseccionaron en portaobjetos y se tiñeron con anticuerpo anti-EGFP de pollo (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA) y el anticuerpo secundario antipollo conjugado con Alexa 488 (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, Pensilvania). Se detectaron células positivas para GFP en hígados de aquellos animales inyectados con AAV8-CAGG-eGFP de tipo silvestre (Figuras 13A-13C) o partículas víricas AAV8 N590myc-CAGG-eGFP junto con las moléculas de unión biespecíficas anti-hASGRI-IgG4-Fc/anti-myc (Figuras 13G-13I). No se detectó GFP o apenas se detectó en muestras de hígado de ningún animal inyectado con partículas víricas AAV8 N590myc-CAGG-eGFP junto con la proteína de unión anti-hCD3/myc irrelevante (Figuras 13D-13F). Resumiendo, AAV8 etiquetado con epítopo, por ejemplo, AAV8-N590myc, se puede redirigir a un tipo de célula específico usando una molécula de unión biespecífica que se une específicamente al epítopo y un marcador específico de célula expresado por el tipo de célula dirigida.
Direccionamiento de vectores víricos al intestino y/o páncreas
Se incubaron células 293T modificadas genéticamente para expresar la ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 3 humana (hENTPD3) en la superficie celular ("293T-ENTPD3") con mezclas que comprenden diferentes proporciones de genomas víricos AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP o AAV2-CAGG-GFP y molécula de unión biespecífica formada fusionando scFv anti-myc al extremo C de una cadena de un anticuerpo de IgG4 anti-hENTPD3 con "botón en ojal" (anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc) en diferentes proporciones (1:0, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:20, 1:50, 1:100 o 1:200). Tres días después de la infección, la expresión de g Fp se analizó mediante FACS. Se detectaron células 293T-ENTPD3 positivas para GFP después de la incubación con mezclas de AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP y anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc en niveles (1,48 % a 16 %;Figuras 14C-14J) comparables a las células 293T-ENTPD3 incubadas con AAV2-CAGG-eGFP de tipo silvestre (66 %) (Figura 14A). La incubación con AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP solo da como resultado un nivel muy bajo de expresión de GFP por parte de las células 293T-ENTPD3 (Figura 14B).
Se determinó que ENTPD3 se expresa en la mucosa del intestino (datos no mostrados). Para determinar si la proteína de unión anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc podría redirigir las partículas víricas AAV2-N587myc-CAGG-eGFP a células intestinales que expresan ENTPD3in vivo,a ratones C57BL/6 se les inyectó por vía intravascular 5x1011 (titulado por qPCR) partículas víricas AAV2-N587myc-CAGG-eGFP junto con proteínas de unión anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc en una proporción de 1:20 de genoma vírico a moléculas de proteína de unión. A los ratones de control se les inyectó PBS, AAV9 de tipo silvestre, o con partículas víricas AAV2-N587myc-CAGG-eGFP junto con una molécula de proteína de unión irrelevante. Tres semanas después de la inyección, se sacrificaron los ratones. Los hígados, los intestinos y los páncreas se fijaron con formalina al 10 % y se enviaron a HistoWiz. Inc (Nueva York, NY) para la tinción con GFP. Se detectaron células positivas para GFP en ratones inyectados con AAV9 de tipo silvestre (Figura 15B(ii)), pero no en hígados de ratones inyectados con PBS o partículas víricas AAV2-N587myc-CAGG-eGFP junto con moléculas de unión irrelevantes o proteínas de unión anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc (Figura 15A(iii)-15A(iv), respectivamente), lo que indica que los vectores víricos AAV2-N587myc no infectan células hepáticas negativas para ENTPD3 incluso cuando se inyectan conjuntamente con proteínas de unión hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc. Se detectó GFP en intestinos únicamente de ratones inyectados con partículas víricas AAV9 o AAV2-N587myc-CAGG-eGFP de tipo silvestre junto con proteínas de unión hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc (Figuras 15B(i)-15B(iv)). Se detecta GFP en los islotes pancreáticos de un ratón inyectado con partículas víricas AAV2-N587myc-CAGG-eGFP junto con proteínas de unión anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc. (Figura 15C(iv)). WT AAV9 infectó tanto las células islotes como las células no islotes del páncreas (Figura 15C (ii)). No se detectó GFP en las muestras de páncreas de ratones inyectados con solución salina o partículas víricas AAV2-N587myc-CAGG-eGFP junto con proteínas de unión irrelevantes. (Figuras 7C(i) y 7C(iii)). Resumiendo, el tropismo natural de AAV puede reducirse o anularse insertando un epítopo heterólogo y redireccionarse a la misma célula o a otras células usando una proteína de unión multiespecífica que se une a la etiqueta del epítopo y a un marcador expresado por las células o tejidos redireccionados.
Este ejemplo demuestra que se pueden modificar genéticamente varios serotipos diferentes de vector vírico adenoasociado con un epítopo heterólogo (por ejemplo, c-myc) como se describe en el presente documento para inactivar la infectividad, y un anticuerpo biespecífico (independientemente de los formatos biespecíficos) que reconoce tanto el vector vírico adenoasociado como el epítopo heterólogo (por ejemplo, c-myc) y un marcador expresado por una célula objetivo se pueden usar para redirigir el vector vírico para administrar un nucleótido de interés.
Ejemplo 4: Uso de vectores víricos AAV-N587Myc genéticamente modificados para administrar carga terapéutica a células específicas
Este ejemplo demuestra la capacidad de los vectores víricos AAV-N587Myc para administrar específicamente carga terapéutica, tal como uno o más genes suicidas, un compuesto terapéutico biológico (por ejemplo, anticuerpo), un sistema de edición de genes CRISPR/Cas, ARNhc, etc., a un tipo de célula objetivo. Específicamente, este ejemplo describe la administración de un gen suicida, secuencia que codifica el anticuerpo, o un sistema de edición de genes CRISPR/Cas para células que expresan un ligando objetivo.
Administración de un gen suicida a células que expresan un ligando objetivo
Para probar la capacidad de los vectores víricos scAAV2-N587Myc para administrar un gen suicida a una célula específica, se utiliza un modelo de ratón desnudo con xenoinjerto de cáncer de mama HER2+ descrito por Wanget al.((2010)Cancer Gene Therapy17:559-570).
Vectores víricos:los vectores víricos scAAV2-N587Myc o ssAAV2-N587Myc que portan un gen indicador EGFP (scAAV2-N587Myc-EGFP o ssAAV2-N587MycEGFP) se generan como se describe en el Ejemplo 1. Los vectores víricos scAAV2-N587Myc o ssAAV2-N587Myc que portan un gen suicida (SG) se generan de manera similar. Resumiendo, las células 293T17 se someten a transfección con (1) auxiliar pAd y (2) vectores pAAV RC2 (que codifican una cápside de tipo silvestre) o pAAV RC2-N587Myc (que codifican una cápside modificada con un epítopo c-myc) como se ha descrito anteriormente, y con (3) un vector pAAV que porta un gen suicida, por ejemplo, gen de la citosina desaminasa, el gen de la timidina cinasa del virus herpes simple, bajo el control de un promotor, por ejemplo, CMV. Los vectores víricos ssAAV-N587MycSG o scAAV-N587SG se aíslan y se titulan como se describe en el Ejemplo 1.
Líneas celulares:las líneas celulares de cáncer de mama BT474, de cáncer de mama SK-BR-3 y de cáncer de pulmón Calu-3 son líneas celulares de tumores humanos positivas para HER2 (Bunn P.A.et al.,(2001)Clin. Cáncer Res.
7:3239-3250; Pegram M,et al.(1999)Oncogene18:2241-2251; Spiridon CI,et al.,(2002)Clin. Cáncer Res.8:1720-1730). El rabdomiosarcoma A-673 y el cáncer de cuello uterino HeLa son líneas celulares tumorales humanas negativas para HER2 y BEAS-2b es una línea celular epitelial bronquial negativa para HER2 inmortalizada (Jia LTet al.(2003)Cancer Res.63:3257-3262; Kern JA,et al.,(1993)Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.9:448-454; Martinez-Ramirez A,et al.,(2003) Cancer Genet. Cytogenet. 2003; 141:138-142). Todas estas líneas celulares se obtienen de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se mantiene en el medio recomendado por la ATCC.
Ratones:Se obtuvieron ratones hembra desnudos, de 6 a 8 semanas de vida y se alojan en condiciones específicas libres de patógenos. El día 0, a los ratones se les inyecta simultáneamente (1) por vía subcutánea en el flanco derecho con células tumorales 107 BT474, SK-BR-3, Calu-3, A-673 o HeLa y (2) se tratan por vía intravenosa con anticuerpo biespecífico anti-myc-HER2 y vectores víricos ss- o scAAV-N587Myc que portan un gen indicador (por ejemplo, EGFP) o suicida. Como controles sirven animales no tratados (animales inyectados únicamente con células tumorales), animales inyectados con vectores víricos ss- o scAAV de tipo silvestre que portan un gen indicador o suicida, animales inyectados únicamente con anticuerpo biespecífico anti-myc-HER2, o animales inyectados con vectores víricos ss- o scAAV-N587Myc que portan únicamente un gen indicador o suicida. Todos los animales se tratan con un profármaco apropiado 1 día después de la inyección y el tratamiento. El tamaño de cada tumor se mide con calibradores 2 veces por semana y el volumen tumoral se calcula como largoxancho2x0,52. Tras la morbilidad, ulceración tumoral, un diámetro tumoral de 15 mm, o un volumen tumoral de 1000 mm3, los ratones se sacrifican y la fecha del sacrificio se registra como fecha de muerte. Los hígados, bazos, riñones y tumores de animales inyectados con vectores víricos de virus ss- o scAAV o ss o scAAV-N587Myc de tipo silvestre que portan un gen indicador se fijan y se visualiza la expresión del gen indicador.
Aunque a administración dirigida de genes que inducen el suicidio se ha descrito (Zarogoulidis P.,et al.(2013)J. Genet. Sindr. Gene Ther.4:16849), este ejemplo describe la administración de un gen suicida a una célula que expresa el ligando de HER2 objetivo utilizando los vectores víricos descritos en el presente documento que comprenden un epítopo heterólogo, por ejemplo, c-myc, y un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al ligando objetivo y al epítopo heterólogo. En experimentos adicionales, se administra un gen suicida a otro tipo de célula que expresa uno o más ligandos diana diferentes usando un vector vírico que comprende un epítopo heterólogo como se describe en el presente documento y un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al epítopo heterólogo (por ejemplo, c-myc) y al receptor diana. Los ejemplos ilustrativos y no limitantes de receptores adecuados para dirigirse incluyen aquellos receptores que median la endocitosis del vector vírico, por ejemplo, antígeno carcino-embrionario (CEA) (Qiu Y,et al.(2012)Cancer Lett.316:31-38) y el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGf R) (Leng A,et al.(2013)Tumour Biol.32:1103-1111; Liu T,et al.(2011)Exp. Mol. Pathol.91:745-752). Los receptores adicionales a los que se puede dirigir incluyen: receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (Heimberger AB,et al.(2009)Expert Opin. Biol. Ther.9:1087-1098), grupo de diferenciación 44s (CD44s) (Heider KH,et al.(2004)Cancer Immunol. Immunother.53:567-579), grupo de diferenciación 133 (CD133 también conocido como AC133) (Zhang SS,et al.(2012)BMC Med.;10:85), receptor de folato (FR) (Duarte S,et al.,(2011)J. Control Release149(3):264-72), receptor de transferrina (TfR) o diferenciación de grupos 71 (CD71) (Habashy HO,et al., Breast Cancer Res. Treat.119(2):283-93), mucinos (Torres MP,et al.,(2012)Curr. Pharm. Des.2012; 18(17):2472-81), antígeno embrionario específico de fase 4 (SSEA-4) (Malecki M.,et al.,(2012)J. Stem Cell Res. Ther.2(5), antígeno de resistencia tumoral 1-60 (TRA-1-60) (Malecki M.,et al.,(2013)J. Stem Cell Res. Ther.3:134).

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende
(i) un vector de virus adenoasociado (AAV) recombinante que comprende
una cápside de AAV que encapsula un nucleótido de interés,
en donde la cápside de AAV comprende una proteína de la cápside de AAV recombinante modificada para comprender un epítopo heterólogo, en donde la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen de la cápside de AAV modificado para expresar el epítopo heterólogo;
(ii) una molécula de unión multiespecífica que comprende
(a) un paratopo de anticuerpo que se une específicamente al epítopo heterólogo; y
(b) un ligando de redireccionamiento que se une específicamente a una proteína o marcador de superficie celular; y opcionalmente
(iii) un vehículo farmacéuticamente aceptable,
en donde la cápside de AAV presenta:
- tropismo reducido a anulado en ausencia de la molécula de unión multiespecífica; y
- tropismo modificado, tras la combinación con la molécula de unión multiespecífica, en comparación con una cápside de AAV de referencia, en donde la cápside de AAV de referencia comprende una proteína de la cápside de AAV de referencia que es idéntica a la proteína de la cápside de AAV recombinante excepto por la falta del epítopo heterólogo.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde la proteína de la cápside de AAV recombinante comprende además una mutación además del epítopo heterólogo.
3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en donde el epítopo heterólogo se inserta de modo que la inserción reduce parcialmente el tropismo de la cápside de AAV en comparación con una cápside de AAV de referencia que carece del epítopo heterólogo y la proteína de la cápside de AAV comprende además una mutación (por ejemplo, una sustitución, deleción, inserción distinta de la inserción del epítopo heterólogo), además de la inserción del epítopo heterólogo, reduciéndose la mutación aún más y/o anulando el tropismo de la cápside de AAV recombinante en comparación con una cápside de AAV de referencia que carece de la mutación.
4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el tropismo modificado tras la combinación con la molécula de unión multiespecífica significa que el tropismo de la cápside de AAV se restaura y redirige en comparación con el tropismo de la cápside de AAV de referencia.
5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde
(i) el epítopo heterólogo comprende una etiqueta de afinidad y un conector opcional, y/o
(ii) la proteína de la cápside de AAV recombinante comprende una secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (establecida como SEQ ID NO: 6) flanqueada por y/o unida operativamente a al menos 5 aminoácidos contiguos de una proteína de la cápside de AAV.
6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el epítopo heterólogo comprende una secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) o una porción de la misma, y en donde el paratopo del anticuerpo se une específicamente a la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL o una porción de la misma.
7. La composición de la reivindicación 1, en donde el nucleótido de interés está:
(i) bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que consiste en un promotor vírico, un promotor bacteriano, un promotor de mamíferos, un promotor aviar, un promotor de pescado, un promotor de insectos y cualquier combinación de los mismos; opcionalmente en donde el nucleótido de interés está bajo el control de un promotor no humano; o
(ii) bajo el control de un promotor no humano y flanqueado por secuencias ITR de AAV; o
(iii) un gen indicador, opcionalmente en donde el gen indicador codifica la proteína fluorescente verde, o se selecciona del grupo que consiste en un gen suicida, un nucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, un nucleótido que codifica un sistema CRISPR/Cas o porción(es) del mismo, un nucleótido que codifica el ARN antisentido, un nucleótido que codifica ARNip y una combinación de los mismos.
8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molécula de unión multiespecífica es una molécula de unión biespecífica.
9. La composición de la reivindicación 1, en donde el paratopo del anticuerpo es un dominio Fv, opcionalmente en donde el dominio Fv está directamente fusionado a un dominio constante de cadena pesada.
10. La composición de la reivindicación 1, en donde el ligando de redireccionamiento es un anticuerpo o una porción del mismo, opcionalmente:
en donde el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, en donde el paratopo del anticuerpo y el ligando de redireccionamiento comprenden cada uno un dominio Fv distinto fusionado a un primer y segundo dominio constante de cadena pesada, opcionalmente en donde la primera y segunda cadena pesada se unen a la proteína A con afinidades de unión diferenciales o
en donde el ligando de redireccionamiento comprende una estructura de anticuerpo tetramérica que comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina idénticas y dos cadenas ligeras idénticas y en donde el paratopo del anticuerpo que se une al epítopo heterólogo está anexado al extremo C o al extremo N de una o ambas cadenas pesadas y/o al extremo C o el extremo N de una o ambas cadenas pesadas, y opcionalmente en donde el paratopo del anticuerpo es un scFv, en donde, opcionalmente, el scFv comprende una secuencia del ácido nucleico establecida como SEQ ID NO: 37.
11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de superficie celular es un receptor; y/o en donde el ligando de redireccionamiento se une a un receptor expresado en la superficie de una célula de mamífero o humana.
12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el AAV se selecciona del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9 y/o donde el epítopo heterólogo se inserta después y/o reemplaza una posición seleccionada del grupo que consiste en I-453 de AAV2, I-587 de AAV2, I-585 de AAV6, I-590 de AAV8, I-453 de AAV9, I-589 de AAV9 y cualquier aminoácido correspondiente de un serotipo de AAV que infecta a primates.
13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cápside de AAV es una cápside mosaico que comprende una proteína de cápside de AAV de referencia del mismo serotipo que no comprende el epítopo heterólogo en una determinada proporción.
14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de la cápside de AAV recombinante se deriva de un gen quimérico de la cápside de AAV modificado para expresar el epítopo heterólogo, en donde el gen quimérico de la cápside de AAV comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico, en donde cada una de la pluralidad de secuencias de ácido nucleico codifica una porción de una proteína de la cápside de un serotipo de AAV diferente, y en donde la pluralidad de secuencias de ácido nucleico codifican juntas una proteína de la cápside de AAV quimérica.
15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método de tratamiento o diagnósticoin vivo,comprendiendo el método administrar el nucleótido de interés a una célula diana que expresa una proteína de la superficie celular que comprende poner en contacto la célula diana con la composición, en donde la molécula de unión multiespecífica comprende un ligando de redireccionamiento que se une a la proteína de superficie celular.
16. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde:
(a) la administración es a un objetivo humano; o
la célula diana es una célula humana; o
(c) la célula diana es una célula neuronal humana; o
(d) la célula diana es una célula muscular humana; o
(e) la célula diana se selecciona del grupo que consiste en una célula hepática, una célula cerebral, un linfocito T, una célula renal, una célula intestinal, una célula del páncreas, una célula cancerosa y una célula infectada con un patógeno heterólogo.
17. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16 en donde:
(a) la célula diana es una célula hepática humana opcionalmente en donde el ligando de redireccionamiento se une al receptor de asialoglicoproteína humana 1 (hASGR1) expresado por la célula hepática humana; o (b) el ligando de redireccionamiento se une al receptor GABA expresado por la célula neuronal humana; o (c) el ligando de redireccionamiento se une al receptor de transferrina expresado por la célula neuronal humana; (d) la célula diana es un linfocito T humano, opcionalmente en donde el ligando de redireccionamiento se une a CD3 expresada por el linfocito T humano; o
(e) la célula diana es un linfocito T humano, opcionalmente en donde el ligando de redireccionamiento se une a CD3<e>expresada por el linfocito T humano; o
(f) la célula diana es una célula hematopoyética humana, opcionalmente en donde el ligando de redireccionamiento se une a CD34; o
(g) la célula diana es una célula cancerosa humana, opcionalmente en donde el ligando de redireccionamiento se une a un antígeno asociado a un tumor; o
(h) la célula diana es una célula cancerosa, opcionalmente en donde el ligando de redireccionamiento se une a un antígeno asociado a tumor que es E6, E7 o Her2; o
(i) la proteína de superficie celular es el receptor de glucagón humano (hGCGR); o
(j) la célula diana es una célula intestinal o es una célula del páncreas; opcionalmente en donde el receptor es ENTPD3.
18. La composición para su uso en el método de la reivindicación 15 o 16, en donde:
(i) el ligando de redireccionamiento se une a CD20; o
(ii) el ligando de redireccionamiento se une al receptor de glucagón humano; o
(iii) el ligando de redireccionamiento se une específicamente a CD63 o a la ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 3 humana (hENTPD3).
19. La composición de la reivindicación 5, en donde la etiqueta de afinidad comprende c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 6).
20. La composición de la reivindicación 6, en donde el paratopo del anticuerpo se une específicamente a c-myc, cuyo paratopo de anticuerpo comprende una secuencia de HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, Hc DR3, LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3 del scFv codificado por la secuencia de ácido nucleico establecida como SEQ ID NO:28.
21. Un método para administrar un nucleótido de interésin vitrooex-vivoa una célula diana que expresa una proteína de superficie celular que comprende poner en contacto la célula diana con la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la molécula de unión multiespecífica comprende un ligando de redireccionamiento que se une a la proteína de superficie celular.
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