RS65569B1 - Rekombinantni virusni vektori modifikovani tropizmom i njihove upotrebe za ciljano uvođenje genetičkog materijala u humane ćelije - Google Patents

Rekombinantni virusni vektori modifikovani tropizmom i njihove upotrebe za ciljano uvođenje genetičkog materijala u humane ćelije

Info

Publication number
RS65569B1
RS65569B1 RS20240615A RSP20240615A RS65569B1 RS 65569 B1 RS65569 B1 RS 65569B1 RS 20240615 A RS20240615 A RS 20240615A RS P20240615 A RSP20240615 A RS P20240615A RS 65569 B1 RS65569 B1 RS 65569B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cell
protein
aav capsid
human
capsid protein
Prior art date
Application number
RS20240615A
Other languages
English (en)
Inventor
Christos Kyratsous
Andrew J Murphy
Cheng Wang
Leah Sabin
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS65569B1 publication Critical patent/RS65569B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/41—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a Myc-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10042—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
[0001] Spisak sekvenci napisan u datoteci 10335WO01_ST25.txt je 88 kilobajta, napravljen je 27 juna, 2018.
OBLAST TEHNIKE
[0002] Ovo otkriće se uopšteno odnosi na vektore rekombinantnog virusa povezanog sa adenovirusom (AAV) modifikovane tropizmom, i kompozicije koje ih sadrže, koje su korisne za ciljano uvođenje genetičkog materijala u ćelije i/ili tkiva.
STANJE TEHNIKE
[0003] Isporuka gena u određene ciljne ćelije je postala jedna od najvažnijih tehnologija u modernoj medicini za dijagnostiku i gensku terapiju raznih hroničnih i genskih bolesti. Do sada je napredak u kliničkoj primeni genske terapije bio ograničen nedostatkom idealnih nosača za isporuku gena. Da bi se postigao terapijski uspeh, nosači za isporuku gena moraju biti sposobni da transdukuju ciljne ćelije dok izbegavaju transdukciju neciljnih ćelija. Specifično, kada nativni tropizam virusa ne ispunjava trenutne terapijske potrebe, postoji potreba za rekombinantnim virusnim vektorima u kojima se prirodni tropizam smanjuje ili ukida i željeni tropizam se uspešno modifikuje. (Buchholz et al.).
[0004] Poslednjih godina, najveći napredak u razvoju vektora je postignut korišćenjem golih virusa (npr., virusi koji sadrže kapsid koji je obrazovan od virusnih kapsidnih proteina bez omotača (npr., lipidni dvosloj)) kao što su adeno-asocirani virusi (AAV) i adenovirusi (Ads), kao i virusni sa omotačem (npr., virusi za koje je kapsid okružen lipidnim dvoslojem) kao što su retrovirusi, lentivirusi, i virus herpes simpleks. Vektori koji su zasnovani na AAV su bili u fokusu većine istraživanja, jer su AAV virusi bez omotača koji su samo blago imunogeni ali su sposobni da transduciraju širok opseg vrsta i tkiva in vivo bez dokaza o toksičnosti.
[0005] AAV su mali, bez omotača, jednolančani DNK virusi. AAV genom je 4.7 kb i karakterišu ga dva invertovana terminalna ponovka (ITR) i dva otvorena okvira čitanja koja kodiraju proteine Rep i protein Cap, tim redom. Dva ITRs su jedini cis elementi koji su neophodni za AAV replikaciju, pakovanje i integraciju. Otvoreni okvir čitanja Rep kodira za četiri proteina molekularne težine 78 kD, 68 kD, 52 kD i 40 kD. Ovi proteini uglavnom funkcionišu u regulisanju replikacije AAV i integracije AAV u hromozome ćelija domaćina. Otvoreni okvir čitanja Cap kodira tri strukturalna (kapsid) virusna proteina (VP) koji imaju molekulske težine 83-85 kD (VP1), 72-73 kD (VP2) i 61-62 kD (VP3). Više od 80% ukupnih proteina u AAV virionu sadrže VP3; u zrelim virionima VP1, VP2 i VP3 se nalaze u relativno velikoj zastupljenosti približno 1:1:10. In vitro, tri proteina se spontano sklapaju u strukture slične virionu, npr., virusne kapside. Čini se, stoga, da se obrazovanje virusnih kaspida u inficiranim ćelijama odvija nezavisno od sinteze virusne DNK (pregled u Kotin et al. (1994) Hum. Gene Ther.5:793).
[0006] Među svim poznatim AAV serotipovima, AAV2 je možda najbolje okarakterisani serotip, jer je njegov infektivni klon prvi dobijen. (Samulski et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2077-2081). Nakon toga, pune sekvence za AAV3A, AAV3B, AAV4 i AAV6 su takođe određene. (Rutledge et al. (1998) J. Virol. 72:309-319; Chiorini et al. (1997) J. Virol. 71:6823-6833; S. Muramatsu et al. (1996) Virol.221:208-217). Generalno, svi AAV dele više od 80% identiteta u nukleotidnoj sekvenci.
[0007] AAV je obećavajući vektor za humanu gensku terapiju jer, za razliku od drugih virusnih vektora, nije pokazano da su AAV povezani sa bilo kojom poznatom humanom bolesti i generalno se ne smatraju patogenima. (Muzyczka et al. (1992) Current Topics in Microbiology and Immunology 158:97-129). Osim toga, AAV bezbedno transdukuje postmitotična tkiva sa relativno niskom imunogenošću, i sposoban je da se integriše u hromozome domaćina na način specifičan za mesto, i u ćelije koje su kultivisane u tkivu u hromozomu 19 ukoliko se proteini Rep primenjuju in trans. (Kotin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2211-2215; Samulski et al. (1991) EMBO J.10(12):3941-3950; Balague et al. (1997) J. Virol. 71:3299-3306; Surosky et al. (1997) J. Virol. 71:7951-7959). Pokazalo se da integrisani genomi AAV omogućavaju dugotrajnu ekspresiju gena u brojnim tkivima, uključujući, mišić, jetru, i mozak (Fisher (1997) Nature Med.3(3):306-312; Snyder et al. (1997) Nature Genetics 16:270-276; Xiao et al. (1997) Experimental Neurology 144:113-124; Xiao et al. (1996) J. Virol.70(11):8098-8108).
[0008] Brojni virusni, uključujući AAV, inficiraju ćelije preko virus/ligand:ćelija/receptor interakcije što na kraju dovodi do endocitoze virusa od strane inficirane ćelije. Ova interakcija ligand: receptor je u fokusu većine istraživanja u virusnim vektorima, npr., može se preusmeriti prirodni tropizam virusa iz ćelije koja je prirodno permisivna na infekciju divljim tipom virusa u ciljnu ćeliju, npr., receptorom koji je eksprimiran od strane ciljne ćelije.
[0009] Teorijski, retargetiranje vektora prema bilo kom proteinu ćelijske površine ili markeru trebalo bi da dovede do infekcije ciljne ćelije pošto je većina markera ili receptora ćelijske površine uključena u putevima endocitoze, bilo konstitutivne (npr., za recikliranje) ili indukovane ligandom (npr., koja je posredovana receptorom). Ovi receptori se grupišu u jamicama obloženim klatrinom, ulaze u ćeliju pomoću vezikula obloženim klatrinom, prolaze kroz zakišljeni endozom u kome se receptori sortiraju, i zatim se ili recikliraju na ćelijskoj površini, postaju intracelularno skladišteni, ili se degradiraju u lizozomima. Kao takve, platforme za retargetiranje virusnih vektora često imaju za cilj da uklone prirodni tropizam virusnog vektora i da preusmere virusni vektor na receptor ili marker eksprimiran isključivo ili primarno u ciljnoj ćeliji. Mnoge od prednosti u ciljanoj genskoj terapiji korišćenjem virusnog vektora mogu se sažeti kao nerekombinatorna (negenetička) ili rekombinatorna (genetička) modifikacija virusnog vektora, što rezultira pseudotipizacijom, širenjem, i/ili retargetiranjem prirodnog tropizma virusnog vektora. (Pregled u Nicklin i Baker (2002) Curr. Gene Ther. 2:273-93; Verheiji i Rottier (2012) Advances Virol 2012:1-15).
[0010] Negenetički pristupi obično koriste adaptor, koji prepoznaje i divlji tip (nemodifikovani) virusni površinski protein i ciljnu ćeliju. Rastvorljivi pseudo-receptori (za virus divljeg tipa), polimeri kao što je polietilen glikol, i antitela ili njegovi delovi, su korišćeni kao domen vezivanja virusa adaptora, dok su prirodni peptidi ili vitaminski ligandi, i antitela i njihovi delovi su korišćeni za domen koji se koristi za vezivanje ćelija adaptora kao što je gore opisano. Sa ovim pristupom, retargetiranje virusnog vektora na ciljnoj ćeliji može se postići nakon vezivanja kompleksa vektor: adaptor za protein koji je eksprimiran na površini ciljne ćelije, npr., protein ćelijske površine.
[0011] Takav pristup je korišćen za AAV (Bartlett et al. (1999) Nat. Biotechnol. 74: 2777-2785), adenoviruse (Hemminki et al. (2001) Cancer Res. 61: 6377-81; van Beusechem et al. (2003) Gene Therapy 10:1982-1991; Einfeld, et al. (2001) J. Virol. 75:11284-91; Glasgow et al. (2009) PLOS One 4:e8355), herpesviruse (Nakano et al. (2005) Mol. Ther. 11:617-24), i paramiksoviruse (Bian et al.
(2005) Cancer Gene Ther. 12:295-303; Bian et al. (2005) Int. J. Oncol. 29:1359-69), koronaviruse (Haijema et al. (2003) J. Virol.77:4528-43]8; Wurdinger et al. (2005) Gene Therapy 12:1394-1404).
[0012] Popularniji pristup je bio rekombinatorna genska modifikacija virusnuh kapsidnih proteina, i prema tome, površine virusnog kapsida. U indirektnim rekombinatornim pristupima, virusni kapsid je modifikovan sa heterolognom "skelom", koja je nakon toga povezana sa adaptorom. Adaptor se veže za skelu i ciljnu ćeliju. (Arnold et al. (2006) Mol. Ther.5:125-132; Ponnazhagen et al. (2002) J. Virol.
76:12900-907; vidi takođe WO 97/05266). Skele kao što su (1) Fc vezujući molekuli (npr., Fc receptori, Protein A, itd.), koji se vežu za Fc adaptora antitela, (2) (strept)avidin, koji se veže za biotinilovane adaptore, (3) biotin, koji se veže za adaptore koji su spojeni sa (strept)avidinom, i (4) protein:protein vezujući parovi koji obrazuju izometrijske peptidne veze kao što su SpyCatcher, koji veže SpyTagged adaptor, su inkorporisane u Ad (Pereboeva et al. (2007) Gene Therapy 14: 627-637; Park et al. (2008) Biochemical i Biophysical Research Communications 366: 769-774; Henning et al. (2002) Human Gene Therapy 13:1427-1439; Banerjee et al. (2011) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 21:4985-4988), AAV (Gigout et al. (2005) Molecular Therapy 11:856-865; Stachler et al. (2008) Molecular Therapy 16:1467-1473), i togavirus (Quetglas et al. (2010) Virus Research 153:179-196; Ohno et al. (1997) Nature Biotechnology 15:763-767; Klimstra et al. (2005) Virology 338:9-21).
[0013] U pristupu direktnog rekombinatornog pristupa, ligand za ciljanje je direktno insertovan (umetnut) u, ili spojen sa, virusnim kapsidom, tj., proteini virusnog kapsida su modifikovani da eksprimiraju heterologni ligand za ciljanje. Ligand zatim preusmerava, npr., veže, receptor ili marker koji je preferencijalno ili isključivo eksprimiran na ciljnoj ćeliji. (Stachler et al. (2006) Gene Ther.
13:926-931; White et al. (2004) Circulation 109:513-519.). Direktni rekombinatorni pristupi su korišćeni u AAV (Park et al., (2007) Frontiers in Bioscience 13:2653-59; Girod et al. (1999) Nature Medicine 5:1052-56; Grifman et al. (2001) Molecular Therapy 3:964-75; Shi et al. (2001) Human Gene Therapy 12:1697-1711; Shi i Bartlett (2003) Molecular Therapy 7:515-525), retrovirus (Dalba et al. Current Gene Therapy 5:655-667; Tai i Kasahara (2008) Frontiers in Bioscience 13:3083-3095; Russell i Cosset (1999) Journal of Gene Medicine 1:300-311; Erlwein et al. (2002) Virology 302:333-341; Chadwick et al. (1999) Journal of Molecular Biology 285:485-494; Pizzato et al. (2001) Gene Therapy 8:1088-1096), poxvirus (Guse et al. (2011) Expert Opinion on Biological Therapy 11:595-608; Galmiche et al. (1997) Journal of General Virology 78:3019-3027; Paul et al. (2007) Viral Immunology 20:664-671), paramiksovirus (Nakamura i Russell (2004) Expert Opinion on Biological Therapy 4:1685-1692; Hammond et al. (2001) Journal of Virology 75:2087-2096; Galanis (2010) Clinical Pharmacology and Therapeutics 88:620-625; Blechacz i Russell (2008) Current Gene Therapy 8:162-175; Russell i Peng (2009) Current Topics in Microbiology and Immunology 330:213-241), i herpesvirus (Shah i Breakefield (2006) Current Gene Therapy 6:361-370; Campadelli-Fiume et al. (2011) Reviews in Medical Virology 21:213-226).
[0014] Svaki od tri pristupa ima prednosti i mane. Glavna prednost direktnog rekombinatornog pristupa je specifičnost virusnog vektora koja je inherentna virusnom genomu, i može se održati nakon replikacije. Međutim, za ove i indirektne rekombinatorne pristupe, sposobnost da se virus genetički modifikuje zahteva da se održi struktura kapsida, a ciljani ligand ili skela budu postavljeni u poziciju koja tolerisati i na odgovarajući način prikazati ciljani ligand ili skelu, čime se ograničava repertoar odgovarajućih liganada ili skela koji se mogu koristiti. Kao takvi, postupci rekombinatornog retargetiranja su ograničeni prirodno postojećim molekulima koji su korisni kao ligandi za ciljanje, što dovodi do inkorporacije drugih vezujućih liganada kao što su antitela ili njegovi delovi. I nerekombinatorne i rekombinatorne platforme adaptora imaju prednost u fleksibilnosti korišćenog adaptora. Međutim, optimalnu efikasnost transdukcije je teško postići sa ova dva komponentna sistema.
[0015] Takođe je pomenut Wickham et al. (1997) Journal of Virology, 71(10): 7663-7669 koji se tiče ciljane-adenovirusom-posredovane isporuke gena u T ćelije pomoću CD3.
[0016] Ovde je obezbeđena strategija retargetiranja AAV koja rešava probleme inherentne u prethodnim rekombinatornim strategijama retargetiranja umetanjem heterolognog epitopa u AAV kapsid. Trenutni rekombinantni AAV kapsid ispoljava smanjeni do ukinuti prirodni tropizam, koji je obnovljen i preusmeren nakon uzimanja multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula koji sadrži paratop antitela, npr., Fv, koji specifično veže heterologni epitop i ligand za retargetiranje koji specifično veže ćiljnu ćeliju, posebno u određenom odnosu virusni vektor: multispecifični vezujući molekul.
SUŠTINA PRONALASKA
[0017] Ovde su prikazani rekombinantni adeno-asocirani virusni (AAV) kapsidni proteini, AAV kapsidi koji sadrže rekombinantne AAV kapsidne proteine, AAV vektore koji sadrže nukleotid od interesa koji je inkapsuliran od strane rekombinantnog AAV kapsida; pri čemu pomenuti AAV kapsidni proteini, AAV kapsidi, i AAV vektori su genski modifikovani da sadrže (ispoljavaju) heterologni epitop, gde heterologni epitop (njegov deo ili u kombinaciji sa AAV kapsidnim proteinom) obrazuje vezujući par sa paratopom antitela, i gde rekombinantni AAV kapsidni protein/kapsid/vektor mogu dalje sadržati mutaciju, inserciju ili deleciju u aminokiselinskog poziciji koja je uključena u vezivanje receptora, npr., (prirodni) tropizam AAV kapsidnog proteina/kapsida/vektora, tako da rekombinantni AAV kapsidni protein ili AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV protein ima smanjeni do ukinut (prirodni) tropizam (npr., ima, u odsustvu multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, efikasnost transdukcije koja je manja od efikasnosti transdukcije referentnog AAV kapsidnog proteina /kapsida/vektora kome nedostaje heterologni epitop, ili nedetektabilnu efikasnost transdukcije u odsustvu multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula). Takav smanjeni do ukinuti (prirodni) tropizam rekombinantnog AAV kapsidnog proteina/kapsida/vektora može biti pojačan ili obnovljen u prisustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, ostatka vezivanja. Prema tome, takođe su opisane kompozicije koje sadrže (1) rekombinantne AAV vektore koji imaju kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein koji je ovde opisan i (2) multispecifični, opciono bispecifični, vezujući molekul koji sadrži paratop antitela i ligand za targetiranje, uključujući kompozicije koje sadrže odnose određenog virusnog vektora:multispecifičnog vezujućeg molekula; i upotrebe istog da se usmeri i/ili uvede genski materijal u ciljnu ćeliju su ovde takođe opisani. Ovde su takođe opisani postupci za retargetiranje rekombinantnog AAV vektora, npr., za ciljanu isporuku nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju, koji sadrži dovođenje u kontakt rekombinantnog AAV vektora sa multispecifičnim, opciono bispecifičnim, vezujućim molekulom, i postupke dobijanja rekombinantnog AAV vektora, koji su takođe opisani.
[0018] Prema tome, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži:
(i) rekombinantni adeno-asocirani virusni (AAV) vektor koji sadrži AAV kapsid koji inkapsulira nukleotid od interesa, pri čemu AAV kapsid sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein modifikovan da sadrži heterologni epitop, gde rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV kapsidnog gena modifikovanog da eksprimuje heterologni epitop;
(ii) multispecifični vezujući molekul koji sadrži
(a) paratop antitela koji specifično veže heterologni epitop; i
(b) ligand za retargetiranje koji specifično veže protein ili marker ćelijske površine; i opciono (iii) farmaceutski prihvatljivi nosač, gde AAV kapsid ispoljava:
-smanjeni do ukinuti tropizam u odsustvu multispecifičnog vezujućeg molekula; i -modifikovani tropizam nakon kombinacije sa multispecifičnim vezujućim molekulom u poređenju sa referentnim AAV kapsidom,
pri čemu sekvenca AAV kapsida sadrži referentni AAV kapsidni protein koji je identičan rekombinantnom AAV kapsidnom proteinu ali zbog nedostatka heterolognog epitopa.
[0019] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje kompoziciju iz predmetnog pronalaska za upotrebu u in vivo postupku terapije ili dijagnoze isporukom nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju koja eksprimira protein ćelijske površine koji obuhvata dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa kompozicijom, gde multispecifični vezujući molekul sadrži ligand za retargetiranje koji veže protein ćelijske površine.
[0020] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje in vitro ili ex vivo postupak za isporuku nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju koja eksprimira protein ćelijske površine koji obuhvata dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa kompozicijom iz predmetnog pronalaska, pri čemu multispecifični vezujući molekul sadrži ligand za retargetiranje koji veže protein ćelijske površine.
[0021] Ovde su opisani rekombinantni AAV kapsidni proteini koji sadrže epitop koji je heterologan kapsidnom proteinu, pri čemu epitop ili njegov deo specifično veže paratop antitela, i gde rekombinantni AAV kapsidni protein ili AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein ima smanjen do ukinut tropizam, npr., u odsustvu multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg ostatka.
[0022] U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan (ispoljen) od strane rekombinantnog AAV kapsidnog proteina tako da insercija i/ili prikaz heterolognog epitopa smanjuje ili ukida (prirodni) tropizam AAV kapsida u poređenju sa referentnim AAV kapsidom kome nedostaje heterologni epitop, npr., AAV kapsid sadrži mutaciju koja obuhvata inserciju epitopa u aminokiselinskoj poziciji i/ili supstituciju aminokiseline sa epitopom u poziciji aminokiseline, gde mutacija smanjuje ili ukida (prirodni) tropizam AAV kapsidnog proteina, npr., u odsustvu multispecifičnog, opciono bispecifičnog, ostatka vezivanja. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan (ispoljen od strane) AAV kapsidnog proteina tako da insercija i/ili prikaz parcijalno smanjuje (prirodni) tropizam rekombinantnog AAV kapsida u poređenju sa referentnim AAV kapsidom kome nedostaje heterologni epitop, npr., u odsustvu multispecifičnog, opciono bispecifičnog, ostatka vezivanja, i AAV kapsid dalje sadrži drugu mutaciju (npr., supstituciju, deleciju, inserciju koja nije insercija heterolognog epitopa) koja dalje smanjuje i/ili ukida (prirodni) tropizam rekombinantnog AAV kapsida ili rekombinantnih AAV vektora koji ih sadrže, nrp., u odsustvu multispecifičnog, opciono bispecifičnog, ostatka vezivanja, u poređenju sa referentnim AAV kapsidom kome nedostaje mutacija.
[0023] Generalno, rekombinantni AAV kapsidni protein koji su ovde opisani mogu se dobiti od AAV kapsidnog gena, npr., je kodiran od strane AAV kapsidnog gena koji je modifikovan da eksprimira epitop i/ili je genski modifikovani AAV. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein koji je ovde opisan je dobijen od AAV kapsidnog gena, npr., je kodiran od strane kapsidnog gena koji je modifikovan da eksprimira epitop i/ili je genski modifikovani adeno-povezani virus (AAV) kapsidnog proteina AAV serotipa koji inficira primate, opciono gde je AAV odabran iz grupe koja sadrži AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV2, AAV6, AAV8, ili AAV9 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV2 kapsidni protein, genski modifikovani AAV6 kapsidni protein, genski modifikovani AAV8 kapsidni protein, ili genski modifikovani AAV9 kapsidni protein. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV2 kapsidnog gena , npr., je kodiran od strane AAV2 kapsidnog gena koji je modifikovan da eksprimira epitop i/ili je genski modifikovani AAV2 VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnog proteina, za koji aminokiselinska sekvenca divljeg tipa AAV2 VP1 proteina je redom prikazana kao SEQ ID NO:1. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV6 kapsidnog gena, npr., je kodiran od strane AAV6 kapsidnog gena koji je modifikovan da eksprimira epitope i/ili je genski modifikovani AAV6 VP1, VP2 i/ili VP3 kapsidnog proteina, za koji je aminokiselinska sekvenca divljeg tipa AAV6 VP1 prikazana u SEQ ID NO:3. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV8 kapsidnog gena, npr., je kodiran od strane AAV8 kapsidnog gena koji je modifikovan da eksprimira epitop i/ili je genski modifikovani AAV8 VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidni protein, za koji je aminokiselinska sekvenca divljeg tipa AAV VP1 proteina prikazana redom kao SEQ ID NO:21. U nekim izvođenjima rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV9 kapsidnog gena, npr., je kodirana od strane AAV9 kapsidnog gena koji je modifikovan da eksprimira epitop i/ili je genski modifikovani AAV9 VP1, VP2 ili VP3 kapsidni protein, za koji je aminokiselinska sekvenca divljeg tipa AAV9 VP1 prikazana redom kao SEQ ID NO:5. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV2 kapsidnog gena, npr., je kodiran od strane AAV2 kapsidnog gena koji je modifikovan da eksprimira epitope i/ili je genski modifikovani VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidni protein AAV2. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV6 kapsidnog gena, npr., je kodiran od strane AAV6 kapsidnog gena koji je modifikovan da eksprimira epitop i/ili je genski modifikovani VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidni protein AAV6. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV8 kapsidnog gena, npr., je kodiran sa AAV8 kapsidnim genom koji je modifikovan da eksprimira epitop i/ili je genski modifikovani VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidni protein AAV8. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV9 kapsidnog gena, npr., je kodiran od strane AAV9 kapsidnog gena koji je modifikovan da eksprimira epitop i/ili je genski modifikovani VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidni protein AAV9.
[0024] U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od, npr., je kodiran himernim AAV kapsidnim genom koji je modifikovan da eksprimira epitop, pri čemu himerni AAV kapsidni gen sadrži mnoštvo sekvenci nukleinskih kiselina, pri čemu svaka od mnoštva sekvenci nukleinskih kiselina kodira deo AAV kapsidnog proteina različitog AAV serotipa, i pri čemu mnoštvo sekvenci nukleinskih kiselina zajedno kodira himerni AAV kapsidni protein. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od himernog AAV2 kapsidnog gena. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od himernog AAV6 kapsidnog gena. U nekim izvođenjima, AAV kapsidni protein je dobijen od himernog AAV8 kapsidnog gena. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od himernog AAV9 kapsidnog gena.
[0025] Generalno, rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan sadrži heterologni epitop insertovan u i/ili ispoljen od strane AAV kapsidnog proteina tako da sam heterologni epitop smanjuje i/ili ukida prirodni tropizam rekombinantnog AAV kapsidnog proteina ili kapsida koji sadrži isti, u poređenju sa referentnim AAV kapsidnim proteinom kome nedostaje heterologni epitop ili AAV kapsid koji sadrži referentni AAV kapsidni protein, redom. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan u (ispoljen u) regionu AAV kapsidnog proteina koji je uključen u prirodni tropizam referentnog AAV kapsidnog proteina divljeg tipa, npr., regiona AAV kapsidnog proteina koji je uključen u ciljanje ćelija. U nekim izvođenjima, heterologni epitop is insertovan u i/ili ispoljen od stane “knob” domena Ad vlakna proteina. U nekim izvođenjima, heterologni epitop is insertovan u i/ili ispoljen od strane HI petlje Ad vlakna proteina. U nekim izvođenjima, heterologni epitop is insertovan u i/ili ispoljen u mestu vezivanja heparina AAV kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan u i/ili ispoljen u mestu vezivanja heparina AAV2 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan u i/ili ispoljen u mestu vezivanja heparina AAV6 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan u i/ili ispoljen u mestu vezivanja heparina AAV8 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan u i/ili ispoljen u mestu vezivanja heparina AAV9 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, (i) AAV kapsidni protein je dobijen od AAV2 kapsidnog gena i epitop je insertovan nakon i/ili zamenjuje aminokiselinu na poziciji I-453 ili I-587 AAV2 VP1 kapsidnog proteina i/ili aminokiselina na odgovarajućim pozicijama AAV2 VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina; (ii) AAV kapsidni protein je dobijen od AAV6 kapsidnog gena i epitop je insertovan nakon i/ili zamenjuje aminokiselinu na poziciji 1-585 AAV6 VP1 kapsidnog proteina i/ili aminokiselina na odgovarajućim pozicijama AAV6 VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina; (iii) AAV kapsid je dobijen od AAV8 kapsidnog gena i epitop je insertovan nakon i/ili zamenjuje aminokiselinu na poziciji 1-590 AAV8 VP1 kapsidnog proteina i/ili aminokiseline na odgovarajućim pozicijama AAV8 VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina, ili (iv) AAV kapsidni protein je dobijen od AAV9 kapsidnog gena i epitop je insertovan nakon i/ili zamenjuje aminokiselinu na poziciji I-453 ili I-589 AAV9 VP1 kapsidni protein i/ili aminokiseline na odgovarajućim pozicijama AAV9 VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan odmah nakon (npr., je spojen sa C-krajem) aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja sadrži G-453 AAV2 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajuće pozicije VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitih AAV koji inficiraju ljude, npr., AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, i AAV9), N587 AAV2 kapsidni protein VP1 (ili odgovarajuće pozicije VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitih AAV koji inficiraju ljude, npr., AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, i AAV9), Q585 AAV6 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitih AAV koji inficiraju ljude, npr., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, i AAV9), N-590 AAV8 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitih AAV koji inficiraju ljude, npr., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, i AAV9), G453 AAV9 kapsidnog proteina VP1(ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitih AAV koji inficiraju ljude, npr., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, i AAV8), ili A-589 AAV9 kapsidni protein VP1 (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitih AAV koji inficiraju ljude, npr., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, i AAV8). U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan odmah nakon (npr., spojen je sa C-krajem) G-453 AAV2 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitih AAV koji inficiraju ljude, npr., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, i AAV9). U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan odmah nakon (npr., spojen je sa C-krajem) N587 AAV2 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV koji inficira ljude, npr., AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, i AAV9). U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan odmah nakon (npr., je spojen sa C-krajem Q-585 AAV6 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV koji inficira ljude, npr., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, i AAV9). U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan odmah nakon (npr., je spojen sa C-krajem) N-590 AAV8 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnog proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV koji inficira ljude, npr., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, i AAV9). U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan odmah nakon (npr., je spojen sa C-krajem) G453 AAV9 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnog proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV koji inficira ljude, npr., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, i AAV8). U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan odmah nakon (npr., je spojen sa C-krajem) A-589 AAV9 kapsidnog proteina VP1 (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnog proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena, ili odgovarajućih aminokiselina VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidnih proteina različitog AAV koji inficira ljude, npr., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, i AAV8). U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan i/ili ispoljen između aminokiselina N-587 i R-588 AAV2 VP1 kapsidnog proteina (ili odgovarajućih pozicija VP2 i/ili VP3 kapsidnih proteina koji su kodirani sa istog kapsidnog gena). U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:2. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid sadrže aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:4. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana sekvencom nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO:25. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana sekvencom nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO:26. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV1 vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana sekvencom nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO:27.
[0026] U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan sadrži drugu i različitu mutaciju, pored heterolognog epitopa. Na primer, u nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan može biti genski modifikovani AAV2 kapsidni protein, sadržati heterologni epitop, i dalje može sadržati mutaciju, npr., R-585-A i/ili R-588-A mutaciju. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV2 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV2 VP1 kapsidni protein, sadrži heterologni epitop koja je insertovan odmah nakon (npr., spojena sa C-krajem ) G-453 AAV2 VP1 proteina, i dalje sadrži mutaciju koja je odabrana iz grupe koja sadrži R-585A i/ili R-5889A. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV2 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV2 VP1 kapsidni protein, sadrži heterologni epitop koja je insertovan odmah nakon (npr., spojen sa C-krajem) N587 AAV2 VP1 proteina, i dalje sadrži mutaciju koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od R-585A i/ili R-588A. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV9 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV9 VP1 kapsidni protein, sadrži heterologni epitop koja je insertovan odmah nakon (npr., spojena sa C-krajem) G453 AAV9 VP1 proteina, i dalje sadrži W503A mutaciju. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV9 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV9 VP1 kapsidni protein, sadrži heterologni epitop koji je insertovan odmah nakon (npr., spojen sa C-krajem) A589 AAV9 VP1 kapsidnog proteina, i dalje sadrži W503A mutaciju.
[0027] Generalno, rekombinantni AAV kapsidni protein i/ili AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid sadrži heterologni epitop koji je dužine bar jedne aminokiseline. U nekim izvođenjima, heterologni epitop može imati između oko 5 aminokiselina i oko 35 aminokiselina u dužini, i obrazuje vezujući par sa paratopom antitela, npr., varijabilni domen imunoglobulina. U nekim izvođenjima, heterologni epitop sadrži bar 10 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop sadrži afinitetni tag. U nekim aspektima, heterologni epitop i/ili afinitetni tag ne obrazuje vezujući par sa konstantnim domenom imunoglobulina. U nekim aspektima, heterologni epitop i/ili afinitetni tag ne obrazuje vezujući par sa jonom metala, npr., Ni<2+>, Co<2+>, Cu<2+>, Zn<2+>, Fe<3+>, itd. U nekim izvođenjima, heterologni epitop nije polipeptid koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz Streptavidina, Strep II, HA, L14, 4C-RGD, LH, i Proteina A. U nekim izvođenjima, afinitetni tag je odabran iz grupe koja se sastoji iz FLAG (SEQ ID NO:7), HA (SEQ ID NO:8) i c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:6). U nekim izvođenjima, heterologni epitop sadrži c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:6).
[0028] U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je genski modifikovani AAV2 VP1 kapsidni protein i sadrži heterologni epitop koji sadrži sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) koja je insertovana odmah nakon (npr., spojena sa C-krajem) G-453 AAV2 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein (i) je dobijen od AAV2 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV2 VP1 kapsidni protein, (ii) sadrži heterologni epitop koji sadrži sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) i insertovan je odmah nakon (npr., spojen sa C-krajem) G-453 AAV2 VP1 kapsidnog proteina, i (iii) dalje sadrži mutaciju koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz R-585A i/ili R-5889-A. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je genski modifikovani AAV2 VP1 kapsidni protein i sadrži heterologni epitop koji sadrži sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) koja je insertovana odmah nakon (npr., spojena sa C-krajem) N587 AAV2 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein (i) je dobijen od AAV2 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV2 VP1 kapsidni protein, (ii) koji sadrži heterologni epitop koji sadrži sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) i insertovan je odmah nakon (npr., spojen sa C-krajem) N587 AAV2 VP1 kapsdnog proteina, i (iii) dalje sadrži mutaciju koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od R585A i/ili R588A. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein (i) je dobijen od AAV6 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV6 VP1 kapsidni protein, (ii) sadrži heterologni epitop koji sadrži sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) i insertovan je odmah nakon (npr., spojena saC-krajem ) Q-585 AAV6 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je genski modifikovani AAV8 VP1 kapsidni protein i sadrži heterologni epitop koji sadrži sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) koja je insertovana odmah nakon (npr., spojena sa C-krajem) N590 AAV8 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je genski modifikovani AAV9 VP1 kapsidni protein i sadrži heterologni epitop koji sadrži sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) koja je insertovana odmah nakon (npr., spojena sa C-krajem) G453 AAV9 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein (i) je dobijen od AAV9 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV9 VP1 kapsidni protein, (ii) sadrži heterologni epitop koji sadrži sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) i insertovan je odmah nakon (npr., spojen sa C-krajem) G453 AAV9 VP1 kapsidnog proteina, i (iii) dalje sadrži W503A mutaciju. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je genski modifikovani AAV9 VP1 kapsidni protein i sadrži heterologni epitop koji sadrži sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) koja je insertovana odmah nakon (npr., spojena sa C-krajem) A589 AAV9 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein (i) je dobijen od AAV9 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV9 VP1 kapsidni protein, (ii) sadrži heterologni epitop koji sadrži sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) i insertovan je odmah nakon (npr., spojen sa C-krajem) A589 AAV9 VP1 kapsidnog proteina, i (iii) dalje sadrži W503A mutaciju.
[0029] U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid kao što je ovde opisan sadrži aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO: 6) bočno raspoređenu i/ili operativno povezanu sa bar 5 susednih aminokiselina AAV VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid kao što je ovde opisan sadrži aminokiselisku sekvencu EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO: 6) bočno raspoređenu i/ili operativno povezanu sa bar 5 susednih aminokiselina AAV2 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid kao što je ovde opisan sadrži EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je insertovana u I587 AAV2 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid kao što je ovde opisan sadrži EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta između N587 i R588 AAV2 VP1 kapsidnog proteina, npr., sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2.
[0030] U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid kao što je ovde opisan sadrži aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO: 6) bočno raspoređenu i/ili operativno povezanu sa bar 5 susednih aminokiselina AAV6 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid kao što je ovde opisan sadrži EQKLI-SEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta u 1585 AAV6 VP1 kapsidnom proteinu. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid kao što je ovde opisan sadrži EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta između Q585 i S586 AAV6 VP1 kapsidnog proteina, npr., sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4.
[0031] U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid kao što je ovde opisan sadrži aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) bočno raspoređenu i/ili operativno povezanu sa bar 5 susednih aminokiselina AAV8 VP1 kapsida. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid sadrži EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta u I590 AAV8 VP1 kapsidnom proteinu. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid sadrži EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta između N590 i T591 AAV8 VP1 kapsidnog proteina, npr., sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:25.
[0032] U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid kao što je ovde opisan sadrži aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO: 6) bočno raspoređenu i/ili operativno povezanu sa bar 5 susednih aminokiselina AAV9 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid sadrži EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnut u I453 AAV9 VP1 kapsidnom proteinu. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid sadrži EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta između G-453 i S-454 AAV9 VP1 kapsidnog proteina, npr., sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:26. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid sadrži EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta u I589 AAV9 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid sadrži EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta između A-589 i Q-590 AAV9 VP1 kapsidnog proteina, npr., sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:27.
[0033] U nekim izvođenjima, heterologni epitop sadrži afinitetni tag i jedan ili više linkera. U nekim izvođenjima, heterologni epitop sadrži afinitetni tag bočno u odnosu na linker, npr., heterologni epitop sadrži od N-kraja prema C-kraju prvi linker, afinitetni tag, i drugi linker. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linkeri su svaki nezavisno polipeptid od bar 1 aminokiseline u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop kao što je ovde opisan, npr., afinitetni tag sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera, je između oko 5 aminokiselina do oko 35 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linkeri su identičnih dužina i/ili sadrže identične aminokiselinske sekvence.
[0034] Generalno, u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan redukovao se na ukinuti prirodni tropizam, npr., ima smanjen kapacitet ili nije sposoban da cilja i veže referentnu ćeliju koja prirodno dovoljava transdukciju u poređenju sa onim referentnog AAV kapsida, npr., kapsid koji sadrži referentni AAV kapsidni protein, npr., AAV kapsidni protein koji bi bio identičan sa rekombinantnim AAV kapsidnim proteinom ali zbog nedostatka heterolognog epitopa. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 10% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 20% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 30% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 40% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 50% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsidom koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 60% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 70% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 75% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 80% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 85% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 90% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 95% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV 1 kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, rekombinantni AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan ispoljava bar 99% smanjenje u efikasnosti transdukcije u poređenju sa referentnim AAV kapsidom. U nekim izvođenjima i u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog, opciono bispecifičnog, vezujućeg molekula, transdukcija kontrolne ćelije rekombinantnim AAV kapsidom koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan je ukinuta, npr., ne otkriva se.
[0035] U nekim izvođenjima AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan je mozaični kapsid, npr., sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein koji sadrži heterologni epitop i referentni AAV kapsidni protein koji ne sadrži heterologni epitop u određenom odnosu. U nekim izvođenjima, referentni AAV kapsidni protein je referentni AAV kapsidni protein divljeg tipa koji sadrži aminokiselinsku sekvencu AAV kapsidnog proteina divljeg tipa koji je istog serotipa kao rekombinantni AAV kapsidni protein. U nekim izvođenjima, referentni kapsidni protein je kontrolni referentni AAV kapsidni protein u tome što sadrži aminokiselinsku sekvencu rekombinantnog AAV kapsidnog proteina osim što kontrolnoj referenci AAV kapsidnog proteina nedostaje heterologni epitop. U nekim izvođenjima, referentni AAV kapsidni protein je mutirani referentni protein divljeg tipa u tome što sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski identičnu onoj kod AAV kapsidnog proteina divljeg tipa sa istim serotipom kao rekombinantnim AAV kapsidnim proteinom ali za mutaciju, (npr., insercija aminokiselinske sekvence, himerizacija, itd.) koji smanjuje tropizam AAV kapsidnog proteina divljeg tipa. U nekim izvođenjima, ovde opisana kompozicija sadrži, ili ovde opisani postupak kombinuje, rekombinantni AAV kapsidni protein i referentni kapsidni protein u odnosu koji je opsega od 1:1 do 1:15. U nekim izvođenjima, odnos je 1:2. U nekim izvođenjima, odnos je 1:3. U nekim izvođenjima, odnos je 1:4. U nekim izvođenjima, odnos je 1:5. U nekim izvođenjima, odnos je 1:6.U nekim izvođenjima, odnos je 1:7. U nekim izvođenjima, odnos je 1:8. U nekim izvođenjima, odnos je 1:9. U nekim izvođenjima, odnos je 1:10. U nekim izvođenjima, odnos je 1:11. U nekim izvođenjima, odnos je 1:12. U nekim izvođenjima, odnos je 1:13. U nekim izvođenjima, odnos je 1:14. U nekim izvođenjima, odnos je 1:15.
[0036] Takođe su prikazane nukleinske kiseline koje kodiraju ovde opisani rekombinantni AAV kapsidni protein, kompozicije koje sadrže takve nukleinske kiseline (npr., koji se mogu koristiti u postupcima dobijanja rekombinantnog AAV kapsida) i/ili rekombinantnih AAV kapsidnih proteina (npr., kompozicije koje se u suštini sastoje iz rekombinantnog AAV kapsidnog proteina, kompozicije koje sadrže samo AAV vektore inkapsulirane kapsidom koji sadrži ovde opisani AAV kapsidni protein, kompozicije koje sadrže AAV vektore i multispecifični, opciono bispecifični, vezujući molekul (npr., u određenom AAV vektoru u multispecifični, opciono bispecifični, vezujući molekul (molekul:molekul) odnosi), kompozicije koje sadrže takve AAV vektore, ostatke za retargetiranje, i farmaceutski prihvatljiv nosač, itd.). U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) i nukleotidnu sekvencu koja kodira bar 5 susednih aminokiselina adeno-asociranog virusnog kapsidnog proteina.
[0037] U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO: 6) bočno raspoređenu i/ili operativno povezanu sa bar 5 susednih aminokiselina AAV2 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je insertovana u I587 AAV2 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta između N587 i R588 AAV2 VP1 kapsidnog proteina, npr., u nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:2.
[0038] U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO: 6) bočno raspoređenu i/ili operativno povezanu sa bar 5 susednih aminokiselina AAV6 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je insertovana u I-585 AAV6 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta između Q-585 i S-586 AAV6 VP1 kapsidnog proteina, npr., u nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:4.
[0039] U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO: 6) bočno raspoređenu i/ili operativno povezanu sa bar 5 susednih aminokiselina AAV8 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je insertovana u I-590 AAV8 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta između N-590 i T-591 AAV8 VP1 kapsidnog proteina, npr., u nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:25.
[0040] U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO: 6) bočno raspoređenu i/ili operativno povezanu sa bar 5 susednih aminokiselina AAV9 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je insertovana u I453 AAV9 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta između G453 i S454 AAV9 VP1 kapsidnog proteina, npr., u nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kako je opisana kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:26. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja ja umetnuta u I589 AAV9 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, nukeinska kiselina kao što je ovde opisana sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta između A589 i Q590 AAV9 VP1 kapsidnog proteina, npr., u nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kao što je opisana kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:27.
[0041] Generalno, rekombinantni AAV vektori kao što su ovde opisani sadrže AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan, gde AAV kapsid inkapsulira nukleotid od interesa. U nekim izvođenjima, nukleotid od interesa je pod kontrolom promotora odabranog iz grupe koja se sastoji od virusnog promotora, bakterijskog promotora, sisarskog promotora, ptičjeg promotora, ribljeg promotora, promotora insekata, i bilo koja njihova kombinacija. U nekim izvođenjima, nukleotid od interesa je pod kontrolom nehumanog promotora. U nekim izvođenjima, promotor je citomegalovirusni (CMV) promotor. U nekim izvođenjima, promotor je EF1α promotor.
[0042] Generalno, nukleotid od interesa može biti jedan ili više gena, koji mogu kodirati detektabilni marker, npr., reporter, ili terapeutski polipeptid. U nekim izvođenjima, nukleotid od interesa je reporterski gen. U nekim izvođenjima, nukleotid od interesa je reporterski gen koji kodira detektabilni marker odabran iz grupe koja se sastoji iz zelenog fluorescentnog proteina, luciferaze, β-galaktozidaze, itd. U nekim izvođenjima, detektabilni marker je zeleni fluorescentni protein. U drugim izvođenjima, nukleotid od interesa je izabran iz grupe koja se sastoji iz suicidalnog gena, nukleotida koji kodira antitelo ili njegov fragment, nukleotid koji kodira CRISPR/Cas sistem ili njegov de(o)love, nukleotid koji kodira antisens RNK, nukleotid koji kodira siRNK, izlučeni enzim, itd. U jednom izvođenju, nukleotid od interesa kodira multidomenski terapeutski, npr., protein koji sadrži bar dva domena koji obezbeđuju dve različite funkcije.
[0043] Ovde opisane kompozicije generalno sadrže AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan, npr., sadrži kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein, gde kapsid inkapsulira nukleotid od interesa. U nekim izvođenjima, ovde opisana kompozicija sadrži (1) AAV vektor koji sadrži kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein genski modifikovan da sadrži heterologni epitop, (2) multispecifični, opciono bispecifični, vezujući molekul koji sadrži (i) paratop antitela koji specifično veže epitop i (ii) ligand za retargetiranje koji specifično veže receptor, i opciono (3) farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0044] Paratop antitela kao što se ovde opisuje generalno sadrži najmanje region koji određuje komplementarnost (CDR) koji specifično prepoznaje heterologni epitop, npr., CDR3 region varijabilnog domena teškog i/ili lakog lanca. U nekim izvođenjima, multispecifični, opciono bispecifični, vezujući molekul sadrži antitela (ili njegovog dela) koji sadrži paratop antitela koji specifično veže heterologni epitop. Na primer, multispecifični, opciono bispecifični, vezujući molekul može sadržati jedan domen varijabilnog regiona teškog lanca ili jedan domen varijabilnog domena lakog lanca, gde jedan domen varijabilnog regiona teškog lanca ili jedan domen varijabilnog regiona lakog lanca sadrži paratop antitela koji specifično veže heterologni epitop. U nekim izvođenjima, multispecifični, opciono bispecifični, vezujući molekul može sadržati Fv region, npr., multispecifični, opciono bispecifični, vezujući molekul može sadržati scFv, koji sadrži paratop antitela koji specifično veže heterologni epitop. U nekim izvođenjima, multispecifični, opciono bispecifični, vezujući molekul sadrži antitelo (ili njegov deo) koji sadrži paratop antitela koji specifično veže heterologni epitop, pri čemu antitelo (ili njegov deo) dalje sadrži jedan ili više konstantnih domena antitela (npr., konstantni domen teškog lanca (npr., CH1, zglob, CH2, CH3, CH4, itd.) i/ili konstantni domen lakog lanca (npr., CL), pri čemu jedan ili više konstantnih domena antitela ne veže heterologni epitop.
[0045] Multispecifični, opciono bispecifični, vezujući molekul kao što je ovde opisan dalje sadrži ligand za retargetiranje, pored paratopa (npr., antitelo ili njegov deo koji sadrži paratop) koji specifično veže heterologni epitop koji je umetnut u / prikazan rekombinantni AAV kapsidni protein. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje specifično veže receptor na površini čestice (npr., za izolaciju i/ili prečišćavanje rekombinantnog AAV kapsidnog proteina kao što je ovde opisano). U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje specifično veže protein ćelijske površine, npr., receptor, marker ćelijske površine, itd., eksprimiran na površini sisarske (npr., humane) eukariotske ćelije, npr., ciljne ćelije. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje veže (humanu) ćeliju jetre, (humanu) ćeliju mozga, (humanu) T ćeliju, (humanu) ćeliju bubrega, (humanu) ćeliju creva, (humanu) ćeliju pankreasa, (humanu) kanceroznu ćeliju, i/ili (humanu) ćeliju koja je inficirana heterolognim patogenom. U nekim izvođenjima, ligandi za retargetiranje vežu (humane) specifične markere ćelije jetre, (humani) marker specifičan za ćelije mozga, (humani) marker specifičan za T ćelije, (humani) marker specifičan za ćeliju bubrega, (humani) marker specifičan za ćelije creva, (humani) marker specifičan za ćelije pankreasa, (humani) marker specifičan za ćeliju tumora, i/ili patogeni epitop.
[0046] U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje veže receptor koji je eksprimiran od strane (humane) ćelije jetre, npr., asijaloglikoproteinski receptor, npr., hASGR1. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje veže receptor koji je eksprimiran od strane (humanih) neuronskih ćelija, npr., GABA, transferin, itd. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje veže receptor koji je eksprimiran od strane (humanih) T ćelija, npr., CD3, npr., CD3ε. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje veže receptor koji je eksprimiran od strane (humanih) hematopojetskih matičnih ćelija, npr., CD34. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje veže receptor koji je eksprimiran od strane (humanih) bubrežnih ćelija. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje veže receptor koji je eksprimiran od strane (humanih) mišićnih ćelija, npr., integrin. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje veže receptor koji je eksprimiran od strane (humanih) ćelija kancera, npr., antigen povezan sa tumorom, npr., adipofilin, AIM-2, ALDH1A1, alfa-aktinin-4, alfa-fetoprotein ("AFP"), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), BCR-ABL spojeni protein b3a2, beta-katenin, BING-4, CA-125, CALCA, karcinoembrionalni antigen ("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciklin D1, Ciklin-A1, dek-can spojeni protein, DKK1, EFTUD2, faktor 2 elongacije, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, epitelijalni tumorski antigen ("ETA"), ETV6-AML1 spojeni protein, EZH2, E6, E7, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipikan-3, GnTV, gp100/Pme117, GPNMB, HAUS3, Hepsin, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDOl, IGF2B3, IL13Ralpha2, intestinalna karboksil esteraza, K-ras, Kalikrein 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 (takođe poznat kao CCDC110), LAGE-1, LDLR-fukoziltransferazaAS spojeni protein, Lengsin, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, malatna dehidrogenaza, mamaglobin-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midkine, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucin, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miozin, Miozin klasa I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, P polipeptid, p53, PAP, PAX5, PBF, pml-RARalfa spojeni protein, polimorfni epitelni mucin ("PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernin 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivin, SYT-SSX1 ili -SSX2 spojeni protein, TAG-1, TAG-2, Telomeraza, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, Triosefosfatna izomeraza, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirozinaza, tirozinaza ("TYR"), VEGF, WT1, XAGE-lb/GAGED2a, Kras, NY-ESO1, MAGE-A3, HPV E2, HPV E6, HPV E7, WT-1 antigen (u limfomu i drugim solidnim tumorima), ErbB receptori, Melan A [MART1], gp 100, tirozinaza, TRP-1/gp 75, i TRP-2 (u melanomu); MAGE-1 i MAGE-3 (u bešici, glavi i vratu, i karcinom nemalih ćelija); HPV EG i E7 proteini (u kanceru grlića materice); Mucin [MUC-1] (u dojci, pankreasu, debelom crevu, i kancerima prostate); antigen specifičan za prostatu [PSA] (u kanceru prostate); karcinoembrionalni antigen [CEA] (u debelom crevu, dojci, i gastrointestinalnim kancerima), i takvi zajednički tumor-specifični antigeni poput MAGE-2, MAGE-4, MAGE-6, MAGE-10, MAGE-12, BAGE-1, CAGE-1,2,8, CAGE-3 TO 7, LAGE-1, NY-ESO-1/LAGE-2, NA-88, GnTV, TRP2-INT2, etc. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje veže E6 i/ili E7. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje veže Her2. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje veže receptor humanog glukagona (hGCGR). U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje veže humanu ektonukleozid trifosfat difosfohidrolazu 3 (hENTPD3).
[0047] U nekim izvođenjima, paratop (npr., antitelo ili njegov deo) i ligand za retargetiraje su direktno spojeni jedan sa drugim. U nekim izvođenjima, paratop (npr., antitelo ili njegov deo) koji specifično veže heterologni epitop i ligand za retargetiranje su kovalentno vezani jedan za drugi.
[0048] U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul je bispecifični vezujući molekul, npr., antitelo koje sadrži prvi i drugi domen za vezivanje antigena, gde prvi domen za vezivanje antigena sadrži paratop koji specifično veže heterologni epitop koji je insertovan u /ispoljen od strane rekombinantnog AAV kapsidnog proteina i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično veže protein ćelijske površine ili marker koji je eksprimiran od strane ciljne ćelije. U nekim izvođenjima, bispecifični vezujući molekul je bispecifično antitelo koje sadrži prvi i drugi domen za vezivanje antigena, pri čemu prvi domen za vezivanje antigena sadrži paratop koji specifično veže heterologni epitop koji je insertovan u/ispoljen od strane rekombinantnog AAV kapsidnog proteina i drugi domen za vezivanje antigena specifično veže receptor koji je eksprimiran od strane ciljne ćelije, gde prvi antigen vezujući domen je operativno povezan sa prvim regionom teškog lanca koji sadrži prvi CH3 domen, pri čemu drugi antigen vezujući domen je operativno povezan sa drugim regionom teškog lanca koji sadrži drugi CH3 domen, pri čemu prvi i drugi Ig CH3 domeni se razlikuju jedan od drugog u bar jednoj aminokiselini, i gde razlika u bar jednoj aminokiselini smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A u poređenju sa bispecifičnim antitelom kome nedostaje razlika u aminokiselini. U jednom izvođenu, prvi Ig CH3 domen veže Protein A i drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje Proteina A kao što je modifikacija H-95-R (sa IMGT numeracijom egzona; H435R sa EU numeracijom). Drugi CH3 domen dalje može da sadrži Y-96-F modifikaciju (sa IMGT; Y-436-F sa EU). Dalje modifikacije koje se mogu pronaći u drugom CH3 domenu uključuju: D-16-E, L-18-M, N-44-S, K-52-N, V-57-M, i V-82-I (sa IMGT; D-356-E, L-358-M, N-384¬S, K-392-N, V-397-M, i V-422-I sa EU) u slučaju IgG1 antitela; N-44-S, K-52-N, i V-82-I (IMGT; N-384-S, K-392-N, i V-422-I sa EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q-15-R, N-44-S, K-52-N, V-57-M, R-6-9K, E-79-Q, i V-82-I (sa IMGT; Q-355-R, N-384-S, K-392-N, V-397-M, R-409-K, E-419-Q, i V-422-I sa EU) u slučaju IgG4 antitela.
[0049] U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul je bispecifični vezujući molekul, npr., bispecifično antitelo koje sadrži prvi i drugi domen za vezivanje antigena, gde prvi domen za vezivanje antigena veže afinitetni tag ispoljen od strane rekombinantnog AAV kapsidnog proteina kao što je ovde opisano, i gde drugi domen za vezivanje antigena veže receptor koji je eksprimiran na površini ciljne ćelije. U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul je bispecifični vezujući molekul, npr., bispecifično antitelo koje sadrži prvi i drugi domen za vezivanje antigena, pri čemu prvi domen za vezivanje antigena veže aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) koja je ispoljena od strane rekombinantnog AAV kapsidnog proteina kao što je ovde opisano, i gde drugi domen za vezivanje antigena veže receptor koji je eksprimiran na površini ciljne ćelije. U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul je bispecifični vezujući molekul, npr., bispecifično antitelo koje sadrži prvi i drugi domen za vezivanje antigena, pri čemu prvi domen za vezivanje antigena veže aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) koja je ispoljena od strane rekombinantnog AAV kapsidnog proteina kao što je ovde opisan, i gde drugi domen za vezivanje antigena veže hASGR1. U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul je bispecifični vezujući molekul, npr., bispecifično antitelo koje sadrži prvi i drugi domen za vezivanje antigena, pri čemu prvi domen za vezivanje antigena veže aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) koja je ispoljena od strane rekombinantnog AAV kapsidnog proteina kao što je ovde opisan, i gde drugi domen za vezivanje antigena veže CD3 protein, npr., CD3ε. U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul je bispecifični vezujući molekul, npr., bispecifično antitelo koje sadrži prvi i drugi domen za vezivanje antigena, pri čemu prvi domen za vezivanje antigena veže aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) koja je ispoljena od strane rekombinantnog AAV kapsidnog proteina kao što je ovde opisan, i gde drugi domen za vezivanje antigena veže integrin. U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul je bispecifični vezujući molekul, npr., bispecifično antitelo koje sadrži prvi i drugi domen za vezivanje antigena, pri čemu prvi domen za vezivanje antigena veže aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) koja je ispoljena od strane rekombinantnog AAV kapsidnog proteina kao što je ovde opisano, i gde drugi domen za vezivanje antigena veže receptor humanog glukagona, npr., hGCGR. U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul je bispecifični vezujući molekul, npr., bispecifično antitelo koje sadrži prvi i drugi domen za vezivanje antigena, pri čemu prvi domen za vezivanje antigena veže aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) koja je ispoljena od strane rekombinantnog AAV kapsidnog proteina kao što je ovde opisan, i gde drugi domen za vezivanje antigena veže ENTPD3. Ovde se takođe opisuju postupci dobijanja i korišćenja rekombinantnih AAV kapsidnih proteina, AAV vektora koji ih sadrže, kompozicija, itd. U nekim izvođenjima, postupak za preusmereavanje adeno-asociranog virusa, itd.; isporučivanje diagnostičkog/terapeutskog tereta u ciljnu ćeliju, itd. sadrži kombinovanje rekombinantnog AAV vektora koji sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisano, npr., AAV vektor koji sadrži kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsid koji ispoljava heterologni epitop, sa bispecifičnim vezujućim molekulom, pri čemu bispecifični vezujući molekul sadrži (i) paratop antitela koji specifično veže epitop i (ii) ligand za retargetiranje koji specifično veže receptor. Takvi postupci mogu obuhvatiti prvi korak proizvodnje rekombinantnog AAV vektora, npr., gajenje pakovanja ćelija u uslovima koji su dovoljni za proizvodnju AAV vektora, gde pakovanje ćelija sadrži plazmid koji kodira AAV kapsidni protein koji sadrži epitop. Kada se isporučuje diagnostički/terapeutski teret u ciljnoj ćeliji, ovde opisani postupci mogu obuhvatiti dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa kombinacijom AAV vektora koji sadrži AAV kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsid koji ispoljava heterologni epitop i multispecifični vezujući molekul, pri čemu multispecifični vezujući molekul sadrži (i) paratop antitela koji specifično veže epitop i (ii) i ligand za retargetiranje koji specifično veže receptor koji je ekprimiran od strane ciljne ćelije. U nekim izvođenjima, ciljna ćelija je in vitro. U drugim izvođenjima, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju iz predmetnog pronalaska za upotrebu u in vivo postupku lečenja ili dijagnostikovanja, postupak sadrži isporuku nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju koja eksprimira protein ćelijske površine koja obuhvata dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa kompozicijom, pri čemu multispecifični vezujući molekul sadrži ligand za retargetiranje koji veže protein ćelijske površine. Prema tome, u takvim izvođenjima, ciljna ćelija je in vivo u subjektu, npr., čoveku.
[0050] U nekim izvođenjima, ovde opisana kompozicija sadrži, ili ovde opisani postupak kombinuje, rekombinantni AAV vektor koji sadrži nukleotid od interesa inkapsuliran u kapsid koji sadrži rekombinantni kapsidni protein kao što je ovde opisano i multispecifični vezujući molekul u odnosu molekul:molekul koji ponovo uspostavlja efikasnost transdukcije AAV vektora slično onoj kod referentnog AAV vektora. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je u opsegu od 1:0.5 do 1:100. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je u opsegu od 1:4 do 1:20. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je u opsegu od 1:8 do 1:15. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je 1:4. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je 1:8. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je 1:15. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je 1:20.
[0051] Ovde su takođe opisani postupci inaktivacije AAV kapsida i/ili koji proizvode AAV vektore, koji postupci generalno obuhvataju (a) umetanje nukleinske kiseline koja kodira heterologni protein u sekvencu nukleinske kiseline koja kodira AAV kapsidni protein da bi se formirala nukleotidna sekvenca koja kodira genetički modifikovani AAV kapsidni protein koji sadrži heterologni protein i/ili (b) kultivisanje ćelije za pakovanje u uslovima dovoljnim za proizvodnju AAV vektora, pri čemu ćelija za pakovanje sadrži nukleotidnu sekvencu. U nekim izvođenjima, ćelija za pakovanje dalje sadrži pomoćni plazmid i/ili transferni plazmid koji sadrži nukleotid od interesa. U nekim izvođenjima, postupci dalje obuhvataju izolovanje samokomplementarnih adeno-asociranih virusnih vektora iz supernatanta kulture. U nekim izvođenjima, metode dalje obuhvataju liziranje ćelije za pakovanje i izolovanje jednolančanih adeno-asociranih virusnih vektora iz ćelijskog lizata. U nekim izvođenjima, postupci dalje obuhvataju (a) čišćenje ćelijskih ostataka, (b) tretiranje supernatanta koji sadrži AAV vektore sa DNazom I i MgCl2, (c) koncentriranje AAV vektora, (d) prečišćavanje AAV vektora i (e) bilo koje kombinacija (a)-(d). Ovde su takođe obezbeđeni AAV vektor napravljen u skladu sa metodom opisanim ovde, i ćelija za pakovanje korisna za proizvodnju AAV vektora kao što je ovde opisano, npr. ćelije za pakovanje koje sadrže plazmid koji kodira opisani rekombinantni AAV kapsidni protein.
KRATAK OPIS SLIKA
[0052] Datoteka patenta ili prijave sadrži bar jedan crtež izveden u boji. Zavod će obezbediti kopije ovog patenta ili publikacije prijave patenta sa crtežom(ima) u boji na zahtev i plaćanje neophodne naknade.
Slika 1 daje slike imunofluorescentne mikroskopije (gornji panel) ili histograme dobijene fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) (donji panel) za procenu ekspresije zelene fluorescencije (GFP) od strane HepG2 ćelija inkubiranih samo sa (A) divljim tipom scAAV2-CMV-eGFP virusnim vektorima; (B) samo virusni vektori scAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP; scAAV2-N587Myc virusni vektori pomešani sa bispecifičnim anti-Myc-ASGR1 antitelima u sledećim odnosima: (C) 1:0,5, (D) 1:1, (E) 1:2, (F) 1:4, (G) 1:8, (H) 1:15, (I) 1:20, (J) 1:50 ili (K) 1:100; (L) ili scAAV-N587Myc virusni vektori pomešani sa monospecifičnim anti-Myc antitelom u odnosu 1:8. Slika 2A prikazuje tačke dobijene sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) za procenu ekspresije zelene fluorescencije (GFP) od strane 29T3-hASGR1 ćelija inkubiranih samo sa scAAV2 viralnim vektorima divljeg tipa (i), scAAV2-N587Myc-CMV-eGFPi samo virusnim vektorima (ii), scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusni vektori pomešani sa bispecifičnim anti-Myc-ASGR1 antitelima u sledećim odnosima: 1:0,5 (iii), 1:1 (iv), 1:2 (v), 1:4 (vi), 1:8 (vii), 1:15 (viii), 1:20 (ix), ili 1:100 (x), ili scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusni vektori pomešani sa irelevantnim bispecifičnim anti-Myc-GCGR antitelom u odnosu 1:8 (xii). Takođe je prikazana ekspresija GFP pomoću 29T3 ćelija inkubiranih sa scAAV-N587Myc virusnim vektorima pomešanim sa bispecifičnim anti-Myc-ASGR1 antitelima u odnosu 1:8 (xi). Za svaki eksperiment korišćeni su 2X10<5>ćelije i 5X10<9>virusni vektori. Slika 2B prikazuje histograme dobijene fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) koji procenjuju ekspresiju zelene fluorescencije (GFP) od strane 29T3-hASGR1 ćelija inkubiranih samo sa nemodifikovanim AAV9-CAGG-GFP virusnim vektorima (i) Samo AAV9-A589Myc-CAGG-eG virusni vektori (ii), AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP virusni vektori pomešani sa bispecifičnim anti-Myc-ASGR1 antitelima u sledećim odnosima: 1:1 (iii), 1:2 (iv), 1:4 (v), 1:8 (vi), 1:20 (vii), 1:50 (viii) ili 1:100 (ix). Za svaki eksperiment korišćeni su 2X10<5>ćelije i 1X10<10>virusni vektori (titrirani qPCR).
Slika 3 prikazuje tačke dobijene sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) za procenu ekspresije zelene fluorescencije (GFP) od strane 29T3-hASGR1 ćelija prethodno inkubiranih sa bivalentnim anti-ASGR1 antitelom u koncentraciji od 0 nM (C), 50 nM (D), 10 nM (E), 2 nM (F), 0,4 nM (G), 0,08 nM (H), 0,016 nM (I) ili 0,0032 nM (J) i naknadno inficirani virusnim vektorima scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP pomešan sa bispecifičnim anti-Myc-ASGR1 antitelima u odnosu 1:8 (L).
293T3-hASGR1 ćelije inkubirane samo sa scAAV virusnim vektorima divljeg tipa (A) ili samo scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusnim vektorima (B) služe kao kontrole. Za svaki eksperiment, korišćeno je 2X10<5>ćelija i 5X10<9>virusnih vektora (kako je titrirano pomoću qPCR).
Slika 4 daje slike imunofluorescentne mikroskopije koje procenjuju ekspresiju zelene fluorescencije (GFP) od strane 293T-hASGR1 ćelija inkubiranih samo sa scAAV virusnim vektorima divljeg tipa (A), scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP samo virusnim vektorima (B) ili inkubiranih uzastopno sa 1X10<9>u (C), 2X10<9>(D), 4X10<9>(E), 8X10<9>(F), 2X10<10>(G), 1 X10<11>(H), 1X10<12>(I) bispecifična anti-Myc-ASGR1 antitela praćena 1X10<9>scAAV2-N587Mie virusni vektori. Takođe su prikazane imunofluorescentne mikroskopske slike 293T ćelija koje su sekvencijalno inkubirane sa molekulima antitela 1X10<11>antimyc-ASGR1 praćenih 1X10<9>scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusnim vektorima (J) i 293T-hASGR1 ćelijama sekvencijalno inkubiranim sa 1x10<11>irelevantnim bispecifičnim molekulima anti-Myc-GCGR antitela zatim sa 1X10<9>scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusnim vektorima (K).
Slika 5 prikazuje tačke dobijene sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) za procenu ekspresije zelene fluorescencije (GFP) od strane 29T3-hASGR1 ćelija inkubiranih samo sa ssAAV virusnim vektorima divljeg tipa (A), ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP virusnim vektorima samo (B), ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP virusni vektori pomešani sa bispecifičnim anti-Myc-ASGR1 antitelima u sledećim odnosima: 1:1 (C), 1:2 (D), 1:4 (E), 1:8 (F), 1:20 (G), 1:100 (H), 1:1000 (I) ili ssAAV-N587Myc virusni vektori pomešani sa irelevantnim bispecifičnim anti-Myc-GCGR antitelom u odnosu 1:8 (K) . Takođe je prikazana ekspresija GFP pomoću 29T3 ćelija inkubiranih sa ssAAV-N587Myc virusnim vektorima pomešanim sa bispecifičnim anti-Myc-ASGR1 antitelima u odnosu 1:8 (J). Za svaki eksperiment korišćeni su 2X10<5>ćelije i 5X10<9>virusni vektori.
Slika 6 prikazuje tačke dobijene sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) za procenu ekspresije zelene fluorescencije (GFP) od strane 29T3-hGCGR ćelija inkubiranih samo sa scAAV virusnim vektorima divljeg tipa (A), scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP samo virusnim vektorima (B), scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusni vektori pomešani sa bispecifičnim anti-Myc-GCGR antitelima u sledećim odnosima: 1:0,5 (C), 1:1 (D), 1:2 (E), 1:4 (F), 1:8 (G), 1:15 (H), 1:20 (I), 1:50 (J) ili 1:100 (K), ili scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusni vektori pomešani sa irelevantnim monospecifičnim anti-Myc antitelom (Regeneron Pharmaceuticals, Tarrytown, NY) u odnosu 1:8 (L). Za svaki eksperiment korišćeno je 2X10<5>ćelija i 5X10<9>virusnih vektora.
Slika 7 prikazuje tačke dobijene sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) za procenu ekspresije zelene fluorescencije (GFP) samo u Jurkat ćelijama (A) ili Jurkat ćelijama inkubiranim samo sa scAAV6-EF1-eGFP virusnim vektorima divljeg tipa (B), AAV6-Q585Myc-EFla-eGFP samo virusni vektori (C), AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP virusni vektori pomešani sa bispecifičnim anti-Myc-CD3 antitelima u sledećim odnosima: 1:1 (D), 1:5 (E), 1: 10 (F), 1:100 ili (G), 1:1000 (H). Za svaki eksperiment korišćeni su 2X10<5>ćelije i 1X10<9>virusni vektori.
Slika 8A daje slike jetre sa imunofluorescentne mikroskopije. Slika 8B daje imunofluorescentne mikroskopske slike slezine. Slika 8C daje imunofluorescentnu mikroskopsku sliku bubrega. Svi uzorci su uzeti od C57BL/6 miševa koji su transgenski modifikovani da eksprimiraju humani ASGR1 ćelijama jetre (i-iv) ili divlji tip C57BL/6 miševa (v-viii) deset dana nakon intravenske injekcije sa 1X10<11>divljeg tipa scAAV2-CMV-eGFP (i, v), fiziološki rastvor (ii, vi), 1X10<11>scAAV2-N587myc-CMV-eGFP virusni vektori sami (iii, vii) ili scAAV2-N587myc-CMV-eGFP virusni vektori sa bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelom (iv, viii).
Slika 9 daje slike imunofluorescentne mikroskopije uzoraka jetre uzetih od miševa C57BL/6 transgenski modifikovanih da eksprimiraju humani ASGR1 na ćelijama jetre (D-F, J-L, P-R) ili divljeg tipa C57BL/6 miševa (A-C, G-I, M-O) četiri nedelje nakon intravenske injekcije sa 2.18X10<11>divlji tip ssAAV2-CAGG-eGFP (B, C, E, F), fiziološki rastvor (A, D), 2.18X10<11>ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP samo virusni vektori (G-I, J-L) ili ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP vektori sa bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelom (M-O, P-R). Svaka slika predstavlja jednog miša.
Slika 10 daje slike imunofluorescentne mikroskopije uzoraka jetre uzetih od miševa C57BL/6 transgenski modifikovanih da ekspresuju humani ASGR1 ćelijama jetre deset dana nakon intravenske injekcije sa (A) divljim tipom AAV9, (B) 250 nM NaCl (C) AAV9-A589myc-CAGG-eGFP virusne čestice u kombinaciji sa bispecifičnim anti-myc-hCD3 antitelom, ili (D) AAV9-A589myc-CAGG-eGFP virusne čestice u kombinaciji sa bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelom.
Slika 11 daje ilustrativne formate multispecifičnih vezujućih molekula koji su korisni u nekim izvođenjima pronalaska, a ne u razmeri i neograničavajući.
Slika 12 prikazuje tačke dobijene sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) za procenu ekspresije zelene fluorescencije (GFP) od strane 29T3-hASGR1 ćelija inkubiranih samo sa (A) divljim tipom AAV8 virusnih vektora, (C) samo virusnim vektorima AA8-N590-myc, ili pAAV RC8 N590myc virusni vektori pomešani sa bispecifičnim anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc bispecifičnim molekulima u sledećim odnosima (D) 1:1, (E) 1:2, (F) 1:4, (G) 1:8, (H) 1:12, (I) 1:15, (J) 1:50 ili (K) 1:100. Takođe je prikazana ekspresija GFP pomoću lažno transfektovanih 29T3-hASGR1 ćelija (B). Za svaki eksperiment korišćeni su 2X105 ćelije i 1X10<9>virusni vektori.
Slika 13 daje slike imunofluorescentne mikroskopije uzoraka jetre uzetih od miševa C57BL/6 transgenski modifikovanih da ekspresuju humani ASGR1 ćelijama jetre deset dana nakon intravenske injekcije sa (A)-(C) divljim tipom AAV8, (D)-(F) AA8-N590 -myc virusni vektori i kontrolni bispecifični vezujući molekul, ili (G)-(I) AAV8 N590myc-CAGG-eGFP virusne čestice u kombinaciji sa anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc bispecifičnim vezujućim molekulima.
Slika 14 prikazuje tačke dobijene sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) za procenu ekspresije zelene fluorescencije (GFP) od strane 29T3-h ENTPD3 ćelija inkubiranih samo sa (A) divljim tipom AAV2 virusnih vektora, (B) virusnim AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP samo vektori ili AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP virusni vektori pomešani sa bispecifičnim anti-hENTPD3-IgG4-Fc/antimyc bispecifičnim molekulima u sledećim odnosima (C) 1:1, (D) 1:2, (E) 1:4, (F) 1:8, (G) 1:20, (V) 1:50, (I) 1:100 ili (K) 1:200. Za svaki eksperiment korišćeni su 2X10<5>ćelije i 1X10<9>virusni vektori Slika 15A daje imunofluorescentne mikroskopske slike uzoraka jetre, Slika 15B daje imunofluorescentne mikroskopske slike uzoraka creva, i
Slika 15C daje imunofluorescentne mikroskopske slike uzoraka pankreasa. Svi uzorci su uzeti od miševa divljeg tipa C57BL/6 deset dana nakon intravenske injekcije PBS (15A(i), 15B(i) i 15C(i)), 5X10<11>divljeg tipa AAV9 (15A(ii), 15B(ii) i 15C (ii)), 5X10<11>AAV2-N587myc-CAGG-eGFP virusnih vektora sa 1X10<3>irelevantnim bispecifičnim IgG4-Fc/anti-myc vezujućim proteinima (15A(iii), 15B(iii) i 15C(iiii)), ili N587myc-CAGG-eGFP virusni vektori sa 1X10<13>bispecifičnim hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc vezujućim proteinima (15A(iv), 15B(iv) i 15C(iv)).
DETALJNI OPIS
[0053] Uobičajeni problem sa pristupima adaptera koji koriste nemodifikovane virusne kapside ili skele modifikovane virusne kapside je suboptimalna efikasnost transdukcije modifikovanih kapsida. (Grifman et al. (2001) Mol. Ther.3:964-75). Na primer, Curiel et al. opisuju stvaranje i karakterizaciju rekombinantnog adenovirusnog vektora koji sadrži vlakna sa RGD-4C sekvencom genetski ugrađenom u HI petlju domena karboksi terminalnog “knob” i pokazuju korisnost HI petlje “knob” vlakna kao optimalnog mesta za ugradnju liganada kratkog peptida. Vidi, npr., Patent SAD br. 7,297,542; vidi takođe Beatti i Curiel (2012) Adv. Rak. Res.115:39-67. Slično tome, umetanje ligandnih peptida u AAV kapsidnog proteina rezultiralo je kapsidima koji su bili u stanju da prikažu ligand na površini kapsida i posreduju u transdukciji kroz interakciju liganda sa njegovim receptorom i na taj način preusmeravaju virusni tropizam genskim modifikacijama kapsida (Girod i dr. (1999) Nat.5(9): 1438 (1999) Mol (2001) Mol 74(18):8635-47). Konkretno, pokazano je da je umetanje motiva Arg-Gly-Asp (RGD) koji vezuje integrin na mestu insercije I-587 AAV kapsidnog proteina VP1 omogućilo AAV virusnim vektorima da transduciraju ćelije preko αvb1integrina (Girod et al. (1999) supra). Nasuprot tome, iako je umetanje 14-aminokiselinskog peptida L14 posle aminokiseline R447 (I-447) dovelo do kapsida koje još uvek prepoznaje antitelo A20 osetljivo na konformaciju, takvi rekombinantni virusni vektori nisu bili u stanju da transduciraju ćelije koje eksprimiraju L-14 receptor, (Girod et al., 1999; cf Wu et al. (2000) (izveštavanje o ubacivanju peptida hemaglutinina (HA) na poziciju I-447 i uspešnoj transdukciji ćelija koje eksprimiraju HA peptid). Ubacivanje Myc epitopa između T448 i N449 je prepoznato anti-Myc antitelom i stoga je bilo prisutno na površini kapsida, ali je dovelo do inaktiviranih virusnih vektora (Grifman et al., 2001.), ponovo je prijavljeno uspešno retargetiranje NGR motiva posle N587, ali ne i umetanje c-myc posle N587 (Grifman et al., 2001. U.S. patent br.9,624,274 opisuje I-453 AAV kapsidni protein kao pogodno mesto za umetanje heterolognog epitopa). Iako ove studije demonstriraju uspešno umetanje i prikazivanje heterolognog peptida, npr. epitopa, od strane AAV kapsidnog proteina, nijedna od ovih studija ne pruža nikakva očekivanja da multispecifični vezujući molekul, npr.
koji specifično vezuje heterologni peptid i protein ćelijske površine, može preusmeriti modifikovane virusne vektore ka ćelijama koje eksprimiraju protein ćelijske površine i povratiti njihovu efikasnost transdukcije.
[0054] Ovde su prikazani rekombinantni AAV kapsidni proteini koji su modifikovani heterolognim epitopom, koji se mogu koristiti u vezi sa multispecifičnim vezujućim molekulom koji sadrži paratop, npr. Fv domen, koji specifično vezuje epitop i ligand koji vezuje receptor eksprimiran na površini ciljne ćelije. Kao što je ovde prikazano, kontaktiranje AAV vektora koji imaju kapside formirane sa AAV kapsidnim proteinima opisanim ovde sa multispecifičnim vezujućim molekulima u određenim odnosima vraća efikasnost transdukcije AAV kapsida na nivoe koji se mogu uporediti sa virusom divljeg tipa, videti, npr., Primer 2. Kapsidni proteini modifikovani heterolognim epitopima kao što je ovde opisano su izvedeni iz adenovirusa (Ad) i adeno-asociranog virusa (AAV).
[0055] Iako je pronalazak posebno prikazan i opisan u vezi sa brojnim izvođenjima, stručnjacima bi bilo jasno da različita izvođenja koja su ovde otkrivena nemaju nameru da deluju kao ograničenja obima zahteva.
[0056] Iako bilo koji od postupaka i materijala koji su slični ili ekvivalentni sa onima koji se ovde opisuju mogu se koristiti i praksi ili ispitivanju predmetnog pronalaska, određeni poželjni postupci i materijali su sada opisani. Osim ukoliko nije definisano drugačije, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kao što to uobičajeno razume osoba koja je verzirana u stanje tehnike kojoj ovaj pronalazak pripada.
Definicije
[0057] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje koje obično razume stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada.
[0058] Oblici jednine " uključuju reference u množini osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca na "postupak" uključuje jedan ili više postupaka, i/ili koraka tipa opisanog ovde i/ili koji će postati očigledni onim stručnjacima u ovoj oblasti nakon čitanja ovog prikaza.
[0059] Termin "antitelo" obuhvata molekule imunoglobulina koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i konstantni region teškog lanca (CH). Konstantni region teškog lanca obuhvata tri domena, CL1, CH2, CH3 i opciono CH4. Svaki laki lanac sadrži varijabilni domen lakog lanca (CH) i konstantni region lakog lanca (CL). Varijabilni domeni teškog i lakog lanca mogu se dalje podeliti na regione hiper-varijabilnosti, nazvane regionima koji određuju komplementarnost (CDR), ispresecane regionima koji su više konzervirani, nazvanim okvirni regioni (FR). Svaki varijabilni domen teškog i lakog lanca sadrži tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređene od amino-kraja do karboksi-kraja u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDR-ovi teškog lanca mogu biti skraćeni kao HCDR1, HCDR2 i HCDR3 CDR-ovi lakog lanca mogu biti skraćeni kao LCDR1, LCDR2 i LCDR3. CHi CLdomeni formiraju Fv region antitela sa jednim domenom koji se vezuje za antigen, npr., VHili VLantitela, himerna antitela, jednolančana Fvs (scFv), jednolančana antitela, Fab fragmenti, F(ab') fragmenti, disulfidno povezana Fvs (sdFv), intratela, minitela, dijatela i anti-idiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr., anti-Id antitela na antigen-specifičan TCR), i fragmente koji se vezuju za epitop bilo kog od gore navedenih. Termini "antitela" i "antitela" takođe se odnose na kovalentna dijatela kao što su ona otkrivena u U.S. Appl. Pub.2007/0004909 i Ig-DARTS kao što su oni otkriveni u U.S. objavi br.
2009/0060910. Antitela obuhvataju molekule imunoglobulina i imunološki aktivne fragmente molekula imunoglobulina, tj. molekule koji sadrže mesto vezivanja antigena. Molekuli imunoglobulina mogu biti bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgI), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase.
[0060] Domen antitela koji se vezuje za antigen, na primer, deo antitela koji prepoznaje i vezuje se za epitop antigena, takođe se naziva "paratop". To je mali region (od 5 do 10 aminokiselina) Fv regiona antitela, deo fragmenta koji se vezuje za antigen (Fab region) i može da sadrži delove teških i/ili lakih lanaca antitela. Paratop specifično vezuje epitop kada paratop vezuje epitop sa visokim afinitetom. Termin "antitelo visokog afiniteta" odnosi se na antitelo koje ima KDu odnosu na ciljni epitop od oko 10<-9>M ili niže (npr., oko 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, ili oko 1 x 10<-12>M). U jednom izvođenju, KDse meri površinskom plazmonskom rezonancom, npr., BIACORE™; u drugom izvođenju, KDse meri pomoću ELISA.
[0061] Izraz "region koji određuje komplementarnost" ili termin "CDR" uključuje aminokiselinsku sekvencu kodiranu sekvencom nukleinske kiseline imunoglobulinskih gena organizma koja se normalno (tj., kod životinja divljeg tipa) pojavljuje između dva okvira regioni u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca molekula imunoglobulina (npr. antitelo ili receptor T ćelije). CDR može biti kodiran, na primer, sekvencom zametne linije ili preuređenom ili neuređenom sekvencom, i, na primer, naivnom ili zrelom B ćelijom ili T ćelijom. CDR može biti somatski mutiran (npr. varira od sekvence kodirane u germinativnog liniji životinje), humanizovan, i/ili modifikovan supstitucijama aminokiselina, adicijama ili brisanjem. U nekim okolnostima (npr. za CDR3), CDR-ovi mogu biti kodirani sa dve ili više sekvenci (npr. sekvence germinativne linije) koje nisu susedne (npr. u neuređenoj sekvenci nukleinske kiseline), ali su susedne u nukleinskoj kiselini B ćelije sekvence, npr., kao rezultat spajanja ili povezivanja sekvenci (npr. V-D-J rekombinacija da se formira CDR3 teškog lanca).
[0062] "Epitop" je deo makromolekula koji prepoznaje imuni sistem, posebno antitela, B ćelije ili citotoksične T ćelije. Iako se obično smatra da epitopi potiču od nesopstvenih proteina, sekvence izvedene od domaćina koje se mogu prepoznati takođe su klasifikovane kao epitopi. Epitopi imaju dužinu od 4 aminokiseline, poželjno 4 do 30 aminokiselina, poželjnije 5 do 20 aminokiselina, posebno 5 do 15 aminokiselina. Epitopi mogu biti linearni ili trodimenzionalni formirani uobičajeno od aminokiselina koje su udaljene jedna od druge u primarnoj strukturi proteina, ali postaju blisko povezane u sekundarnoj i/ili tercijarnoj strukturi. Epitopi koje B ćelije specifično prepoznaju nazivaju se epitopima B-ćelija.
[0063] Temrin "invertovani terminalni ponovak" ili "ITR" uključuje simetrične sekvence nukleinske kiseline u genomu adeno-asociranih virusa potrebne za efikasnu replikaciju. ITR sekvence se nalaze na svakom kraju genoma AAV DNK. ITR služe kao izvori replikacije za sintezu virusne DNK i suštinske su cis komponente za generisanje vektora koji integrišu AAV.
[0064] Izraz "laki lanac" uključuje sekvencu lakog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, i osim ako nije drugačije naznačeno uključuje humane κ i λ lake lance i VpreB, kao i surogate lake lance. Varijabilni domeni lakog lanca obično uključuju tri CDR-a lakog lanca i četiri okvira (FR) regiona, osim ako nije drugačije naznačeno. Generalno, laki lanac pune dužine uključuje, od amino kraja do karboksilnog kraja, varijabilni domen koji uključuje FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 i konstantni region lakog lanca. Varijabilni domen lakog lanca je kodiran sekvencom gena varijabilnog regiona lakog lanca, koja generalno obuhvata VLi JLsegmente, izvedene iz repertoara V i J segmenata prisutnih u germinativnoj liniji. Sekvence, lokacije i nomenklatura za V i J segmente lakih lanaca za različite organizme mogu se naći u IMGT bazi podataka, www.imgt.org. Laki lanci obuhvataju one, na primer, koji ne vezuju selektivno ni prvi ni drugi epitop selektivno vezan za epitop-vezujući protein u kome se pojavljuju. Laki lanci takođe uključuju one koji vezuju i prepoznaju, ili pomažu teškom lancu ili drugom lakom lancu u vezivanju i prepoznavanju, jednog ili više epitopa selektivno vezanih za epitop-vezujući protein u kome se pojavljuju. Uobičajeni ili univerzalni laki lanci uključuju one izvedene iz humanog Vκ1-39Jκ gena ili humanog Vκ3-20Jκ gena, i uključuju somatski mutirane (npr. sazrele afinitetne) verzije istih. Primeri humanih VL segmenata obuhvataju humani segment gena Vκ1-39, segment humanog gena Vκ3-20, segment humanog Vλ1-40 gena, humani segment gena Vλ1-44, segment humanog gena Vλ2-8, humani Vλ2-14 segment gena i segment humanog Vλ3-21 gena, i uključuju somatski mutirane (npr. afinitetno sazrele) verzije istih. Mogu se napraviti laki lanci koji se sastoje od varijabilnog domena jednog organizma (npr. čoveka ili glodara, npr. pacova ili miša; ili ptica, na primer, piletina) i konstantnog regiona iz istog ili različitog organizma (npr. čoveka ili glodara), na primer, pacov ili miš ili ptica, na primer, pile);
[0065] Termin "oko" ili "približno" uključuje postojanje unutar statistički značajnog opsega vrednosti. Takav opseg može biti unutar reda veličine, poželjno unutar 50%, poželjnije unutar 20%, još poželjnije unutar 10%, a još poželjnije unutar 5% date vrednosti ili opsega. Dozvoljene varijacije obuhvaćene terminom "oko" ili "približno" zavise od određenog sistema koji se proučava, i može lako da se proceni od strane osobe koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike.
[0066] Termin "tag afiniteta" uključuje polipeptidnu sekvencu koja je član specifičnog vezujućeg para, npr., koja se specifično vezuje za drugu polipeptidnu sekvencu, npr., paratop antitela, sa visokim afinitetom. Primeri i neograničavajući oznake afiniteta uključuju heksahistidinski tag, FLAG tag, tag Strep II, tag peptida koji vezuje streptavidin (SBP), peptid koji vezuje kalmodulin (CBP), glutation S-transferazu (GST), protein koji vezuje maltozu (MBP), S-tag, HA tag i c-Myc tag. (Pregled u Zhao et al. (2013) J. Analytical Meth. Chem.1-8).
[0067] Termin "kapsidni protein" uključuje protein koji je deo kapsida virusa. Za viruse povezane sa adeno, kapsidnog proteina se generalno naziva VP1, VP2 i/ili VP3, i svaki je kodiran jednim cap genom. Za AAV, tri AAV kapsidna proteina se proizvode na način koji se preklapa iz okvira za čitanje otvorenog okvira (ORF) preko alternativnog spajanja iRNK i/ili alternativnog translacionog startnog kodona, iako sva tri proteina koriste zajednički stop kodon. Warrington et al. (2004) J. Virol.78:6595. VP1 AAV2 se generalno prevodi iz ATG startnog kodona (aminokiselina M1) na iRNK od 2,4 kb, dok VP2 i VP3 AAV2 nastaju iz manje iRNK od 2,3 kb, koristeći slabiji početni kodon ACG za proizvodnju VP2 (aminokiselina T138) i prevođenje na sledeći raspoloživi ATG kodon (aminokiselina M203) za proizvodnju najzastupljenijeg kapsidnog proteina, VP3. Warrington, supra; Rutledge i dr. (1998) J. Virol.72:309-19. Aminokiselinske sekvence kapsidnog proteina adeno-asociranih virusa su dobro poznate u tehnici i generalno su očuvane, posebno kod zavisnih parvovirusa. Videti, Rutledge et al., supra. Na primer, Rutledge et al. (1998), supra, daje na Slici 4B poravnanja aminokiselinskih sekvenci za VP1, VP2 i VP3 kapsidnog proteina AAV2, AAV3, AAV4 i AAV6, pri čemu početna mesta za svaki od VP1, VP2 i VP3 kapsidnog proteina su označeni strelicama, a promenljivi domeni su u okvirima. Shodno tome, iako se ovde date pozicije aminokiselina mogu obezbediti u odnosu na VP1 kapsidni protein AAV-a, i ovde date pozicije aminokiselina koje nisu dalje specificirane odnose se na AAV2 sekvencu glavnog proteina omotača VP1 prikazanu u SEQ ID NO: 1, kvalifikovani stručnjak bi bio u stanju da respektivno i lako odredi položaj te iste aminokiseline unutar VP2 i/ili VP3 kapsidnog proteina AAV-a, i odgovarajući položaj aminokiselina među različitim serotipovima. Dodatno, kvalifikovani stručnjak bi mogao da zameni domene između kapsidnih proteina različitih AAV serotipova za formiranje "himernog kapsidnog proteina".
[0068] Zamena domena između dva AAV kapsidna proteinska konstrukta za generisanje "himernog AAV kapsidnog proteina" je opisana, videti, npr., Shen et al. (2007) Mol. Therapy 15(11):1955-1962. "himerni AAV kapsidni protein " uključuje AAV kapsidni protein koji sadrži aminokiselinske sekvence, npr., domene, iz dva ili više različitih AAV serotipova i koji je sposoban da formira i/ili formira virusnu kapsidu/virusnu česticu nalik AAV-u. Himerni AAV kapsidni protein je kodiran himernim AAV kapsidnim genom, npr., nukleotidom koji se sastoji od mnoštva sekvenci nukleinskih kiselina, na primer, dva niza, od kojih je svaki množina identična delu kapsidnog gena koji kodira različiti kapsidni protein AAV serotipova, a čiji množina zajedno kodira funkcionalnu himernu AAV kapsidnog proteina. Pozivanje na himerni kapsidni protein u odnosu na specifični AAV serotip ukazuje da kapsidni protein obuhvata jedan ili više domena kapsidni proteina tog serotipa i jedan ili više domena kapsidni proteina različitog serotipa. Na primer, AAV2 himerni kapsidni protein uključuje kapsidni protein koji sadrži jedan ili više domena AAV2 VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidni proteina i jedan ili više domena VP1, VP2, i/ili VP3 kapsidni proteina različitog AAV.
[0069] "Mozaični kapsid" sadrži bar dva seta VP1, VP2, i/ili VP3 proteina, svaki set je kodiran različitim cap genom.
[0070] U nekim izvođenjima, mozaični kapsid koji je ovde opisan sadrži rekombinantne VP1, VP2, i/ili VP3 proteine kodirane cap genom genski modifikovanim umetanjem sekvence nukleinske kiseline koja kodira heterologni epitop, i dalje sadrži VP1, VP2, i/ili VP3 proteini kodirani referentnim cap genom, npr. divlji tip referentnog cap gena koji kodira divlji tip VP1, VP2, i/ili VP3 proteina istog AAV serotipa kao rekombinantni VP1, VP2, i/ili VP3 proteini, kontrola referentni cap gen koji kodira VP1, VP2, i/ili VP3 proteine identične rekombinantnim VP1, VP2 i VP3 proteinima, ali zbog odsustva heterolognog epitopa, mutiranog divljeg tipa referentnog cap gena koji kodira uglavnom divlje tipove VP1, VP2, i/ili VP3 proteina istog AAV serotipa kao rekombinantni VP1, VP2, i/ili VP3 proteini, ali za mutaciju (npr. umetanje, supstitucija, delecija), koja mutacija poželjno smanjuje tropizam divljeg tipa VP1, VP2 i VP3 proteina. U nekim izvođenjima, referentni kapsidni protein je himerni referentni protein koji sadrži bar jedan domen VP1, VP2, i/ili VP3 proteina istog AAV serotipa kao rekombinantni VP1, VP2, i/ili VP3 proteini. U nekim izvođenjima, referentni cap gen kodira himerni VP1, VP2, i/ili VP3 protein.
[0071] Termin "teški lanac" ili "teški lanac imunoglobulina" uključuje sekvencu teškog lanca imunoglobulina, uključujući sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, iz bilo kog organizma. Varijabilni domeni teškog lanca uključuju tri CDR-a teškog lanca i četiri FR regiona, osim ako nije drugačije naznačeno. Fragmenti teških lanaca uključuju CDR, CDR i FR, i njihove kombinacije. Tipičan teški lanac ima, posle varijabilnog domena (od N-terminala do C-terminala), CH1 domen, zglob, CH2 domen i CH3 domen. Funkcionalni fragment teškog lanca uključuje fragment koji je sposoban da specifično prepozna epitop (npr. da prepozna epitop sa KDu mikromolarnom, nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu), koji je sposoban da eksprimuje i luči iz ćelije, i koji obuhvata bar jedan CDR. Varijabilni domeni teškog lanca su kodirani nukleotidnom sekvencom varijabilnog regiona, koja generalno obuhvata VH, DHi JHsegmente izvedene iz repertoara VH, DHi JHsegmenata prisutnih u zametnoj liniji. Sekvence, lokacije i nomenklatura za V, D i J segmente teških lanaca za različite organizme mogu se naći u IMGT bazi podataka, koja je dostupna putem interneta na svetskoj mreži (www) na URL-u „imgt.org“.
[0072] Termin "samo antitelo teškog lanca", "protein koji vezuje antigen samo za težak lanac", "protein koji vezuje antigen sa jednim domenom", "protein koji vezuje jedan domen" ili slično odnosi se na monomerni ili homodimerni molekul imunoglobulina koji sadrži imunoglobulin sličan lancu. koji sadrži varijabilni domen koji je operativno vezan za konstantni region teškog lanca, koji nije u stanju da se poveže sa lakim lancem jer konstantnom regionu teškog lanca tipično nedostaje funkcionalni CH1 domen. Shodno tome, termin "samo antitelo teškog lanca", "protein koji vezuje samo antigen za težak lanac", "protein koji vezuje antigen sa jednim domenom", "protein koji se vezuje za jedan domen" ili slično uključuje oba (i) monomerni vezujući protein i jednodomen antigen koji sadrži jedan od lanaca sličnih imunoglobulinu koji sadrži varijabilni domen koji je operativno vezan za konstantni region teškog lanca kome nedostaje funkcionalni CH1 domen, ili (ii) homodimerni jednodomenski antigen-vezujući protein koji sadrži dva lanca slična imunoglobulinu, od kojih svaki sadrži varijabilni domen koji je operativno vezan za konstantni region teškog lanca kome nedostaje funkcionalni CH1 domen. U različitim aspektima, homodimerni jednodomenski vezujući antigen protein sadrži dva identična lanca slična imunoglobulinu, od kojih svaki sadrži identičan varijabilni domen koji je operativno vezan za identičan konstantni region teškog lanca kome nedostaje funkcionalni CH1 domen. Pored toga, svaki lanac sličan imunoglobulinu proteina koji se vezuje za antigen sa jednim domenom sadrži varijabilni domen, koji može biti izveden iz segmenata gena varijabilnog regiona teškog lanca (npr. VH, DH, JH), segmenata gena lakog lanca (npr. VL, JL) ili njihova kombinacija, povezana sa sekvencom gena konstantnog regiona teškog lanca (CH) koja sadrži delecijsku ili inaktivirajuću mutaciju u sekvenci koja kodira CH1 (i, opciono, zglobni region) gena konstantnog regiona teškog lanca, na primer, IgG, IgA, IgE, IgD ili njihova kombinacija. Protein koji se vezuje za antigen sa jednim domenom koji sadrži varijabilni domen izveden iz genskih segmenata teškog lanca može se nazvati "antitelom sa jednim domenom VH" ili "proteinom koji vezuje antigen sa jednim domenom", videti, npr., U.S. Patent br. 8,754,287; Objava američkog patenta br. 20140289876; 20150197553; 20150197554; 20150197555; 20150196015; 20150197556 i 20150197557. Protein koji se vezuje za antigen sa jednim domenom koji sadrži varijabilni domen izveden iz segmenata gena lakog lanca može se nazvati ili kao "protein koji vezuje antigen sa jednim domenom" videti, npr., US Obj.204850.
[0073] Termin "laki lanac" uključuje sekvencu lakog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, i osim ako nije drugačije naznačeno uključuje humane kapa (κ) i lambda (λ) lake lance i VpreB, kao i surogat lake lance. Varijabilni domeni lakog lanca tipično uključuju tri CDR lakog lanca i četiri regiona okvira (FR), osim ako nije drugačije naznačeno. Generalno, laki lanac pune dužine uključuje, od amino kraja do karboksilnog kraja, varijabilni domen koji uključuje FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 i aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca. Varijabilni domeni lakog lanca su kodirani nukleotidnom sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca, koja generalno uključuje VLlaki lanac i JLsegmente gena lakog lanca, izvedene iz repertoara V i J segmenata gena lakog lanca prisutnih u germinativnoj liniji. Sekvence, lokacije i nomenklatura za V i J gen segmente lakog lanca za različite organizme mogu se naći u bazi podataka IMGT, koja je dostupna na svetskoj mreži (www) na URL-u „imgt.org“. Laki lanci uključuju one, na primer, koji se ne vezuju selektivno ni za prvi ni za drugi epitop selektivno vezan za epitop-vezujući protein u kome se pojavljuju. Laki lanci takođe uključuju one koji vezuju i prepoznaju, ili pomažu teškom lancu u vezivanju i prepoznavanju, jednog ili više epitopa selektivno vezanih za epitop-vezujući protein u kome se pojavljuju. Laki lanci takođe uključuju one koji vezuju i prepoznaju, ili pomažu teškom lancu u vezivanju i prepoznavanju, jednog ili više epitopa selektivno vezanih za epitop-vezujući protein u kome se pojavljuju. Uobičajeni ili univerzalni laki lanci uključuju one izvedene iz humanog Vκ1-39Jk5 gena ili humanog Vκ3-20Jk1 gena, i uključuju somatski mutirane (npr. sazrele afinitetne) verzije.
[0074] Izraz "operativno povezan", kako se ovde koristi, uključuje fizičku jukstapoziciju (npr., u trodimenzionalnom prostoru) komponenti ili elemenata koji su u interakciji, direktno ili indirektno jedni sa drugima, ili na drugi način koordiniraju jedni sa drugima kako bi učestvovali u biološkom događaju, koja jukstapozicija postiže ili dozvoljava takvu interakciju i/ili koordinaciju. Da damo samo jedan primer, kaže se da je kontrolna sekvenca (npr. sekvenca za kontrolu ekspresije) u nukleinskoj kiselini „operativno povezana“ sa kodirajućom sekvencom kada se nalazi u odnosu na kodirajuću sekvencu tako da njeno prisustvo ili odsustvo utiče na ekspresiju i/ili aktivnost kodirajuće sekvence. U mnogim izvođenjima, "operabilna veza" uključuje kovalentno povezivanje relevantnih komponenti ili elemenata jedan sa drugim. Stručnjaci u ovoj oblasti lako će razumeti, međutim, da U nekim izvođenjima, kovalentna veza nije potrebna da bi se postigla efektivna operativna veza. Na primer, u nekim izvođenjima, kontrolne sekvence nukleinske kiseline koje su operativno povezane sa kodirajućim sekvencama koje one kontrolišu susedne sa nukleotidom od interesa. Alternativno, ili dodatno, u nekim izvođenjima, jedna ili više takvih kontrolnih sekvenci deluje u trans ili na udaljenosti prema da kontroliše sekvencu kodiranja od interesa. U nekim izvođenjima, izraz "sekvenca za kontrolu ekspresije" kako se ovde koristi odnosi se na polinukleotidne sekvence koje su neophodne i/ili dovoljne da utiču na ekspresiju i obradu kodirajućih sekvenci za koje su vezane. U nekim izvođenjima, sekvence za kontrolu ekspresije mogu biti ili sadržati odgovarajuće sekvence inicijacije, terminacije, promotora i/ili pojačivača transkripcije; efikasne signale za obradu RNK kao što su signali spajanja i poliadenilacije; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku iRNK; sekvence koje poboljšavaju efikasnost prevođenja (npr. Kozak konsenzusna sekvenca); sekvence koje poboljšavaju stabilnost proteina; i/ili, u nekim izvođenjima, sekvence koje pojačavaju lučenje proteina. U nekim izvođenjima, jedna ili više kontrolnih sekvenci su preferencijalno ili ekskluzivno aktivne u određenoj ćeliji domaćinu ili organizmu, ili njegovom tipu. Da damo samo jedan primer, u prokariotima, kontrolne sekvence obično obuhvataju promotor, mesto za vezivanje ribozoma, i sekvencu za terminaciju transkripcije; u eukariotima, u mnogim izvođenjima, kontrolne sekvence obično obuhvataju promotore, pojačivače, i/ili sekvence za terminaciju transkripcije. Osobe koje su uobičajeno verzirane u stanje tehnike će iz konteksta razumeti da, u mnogim izvođenjima, termin "kontrolne sekvence" se odnosi na komponente čije je prisustvo suštinski za ekspresiju i obradu, i u nekim izvođenjima, uključuje komponente čije je prisustvo prednost za ekspresiju (uključujući, na primer, vodeće sekvence, sekvence za ciljanje, i/ili sekvence spojenog partnera).
[0075] Termin "rekombinantni kapsidni protein" uključuje kapsidni protein koji ima mutaciju bar jednu u poređenju sa odgovarajućim kapsidni proteinom divljeg tipa virusa, koji može biti referentni i/ili kontrolni virus za uporedno proučavanje. Rekombinantni kapsidni protein uključuje kapsidni protein koji sadrži heterologni epitop, koji može biti inserovan u i/ili prikazan kapsidnim proteinom. "Heterologan" u ovom kontekstu znači heterologan u poređenju sa virusom iz kojeg je izveden kapsidni protein. Umetnute aminokiseline jednostavno mogu biti koja je umetnuta između dve date aminokiseline kapsidnog proteina. Insercija aminokiselina takođe može da ide zajedno sa delecijom datih aminokiselina kapsidni proteina na mestu umetanja, npr.1 ili više kapsidni protein aminokiselina su supstituisane sa 5 ili više heterolognih aminokiselina).
[0076] Termini "multispecifični vezujući molekul" i "bispecifični vezujući molekul" i slično se generalno i respektivno odnose na vezujući molekul koji sadrži dve i samo dve neidentične vezujuće komponente, gde svaka komponenta vezivanja specifično vezuje različit epitop - bilo na dva različita molekule (npr. različiti epitopi na dva različita imunogena) ili na isti molekul (npr. različiti epitopi na istom imunogenu). Generalno, jedna od komponenti vezivanja bispecifičnog vezujućeg molekula ovde specifično vezuje heterologni epitop koji prikazuje AAV kapsid protein, a druga vezujuća komponenta je specifična za protein, npr. ciljna ćelija, npr. marker T ćelije (npr. CD3, CD28, itd.). Bispecifični vezujući molekuli se mogu napraviti, na primer, kombinovanjem vezujućih komponenti koje prepoznaju različite epitope istog imunogena. Na primer, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju komponente vezivanja (npr. varijabilne sekvence lakog ili teškog lanca) koje prepoznaju različite epitope mogu biti spojene sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju iste ili različite konstantne regione teškog lanca, iste ili različite konstantne regione lakog lanca, ili npr., konstantni region teškog lanca i konstantni region lakog lanca, a takve sekvence mogu biti eksprimirane u ćeliji kao multispecifični protein koji vezuje antigen u formatu sličnom Fab strukturi, scFab strukturi, strukturi dijatela, scFv strukturi, scFv -Fc struktura, scFv-zipper struktura, tetramerna struktura slična tipičnom antitelu koje uključuje srodni univerzalni laki lanac, tetramerna struktura koja sadrži tipično bivalentno antitelo koje uključuje srodni univerzalni laki lanac i/ili dodatnu vezujuću komponentu (npr., scFv, scFv-zatvarač (eng.zipper) , scFab, itd.) vezan za jedan ili oba teška lanca (npr. na N- i/ili C-kraju) i/ili za jedan ili oba laka lanca (npr. na N- i/ili C-kraju). Različiti formati multispecifičnih, posebno bispecifičnih, vezujućih molekula su dobro poznati, vidi npr. Brinkmann i Konterman (2017) mAbs 9:182-212.
[0077] Primer multispecifičnog vezujućeg molekula ima dva teška lanca, od kojih svaki ima CDR-ove teškog lanca, praćene (N-kraj do C-kraja) CH1 domenom, zglobom, CH2 domenom i CH3 domenom, i lakim lancem imunoglobulina koji ima ne daje specifičnost vezivanja epitopa, ali može da se poveže sa svakim teškim lancem (npr., zajednički laki lanac), ili koji može da se poveže sa svakim teškim lancem i koji može da veže jedan ili više epitopa vezanih regionima koji se vezuju za epitop teškog lanca, ili koji se mogu povezati sa svakim teškim lancem i omogućiti vezivanje jednog ili oba teška lanca za jedan ili oba epitopa. U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul sadrži: (1) varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina koji je operativno povezan sa prvim konstantnim regionom teškog lanca koji sadrži prvu CH3 aminokiselinsku sekvencu humanog IgG izabranog između IgG1, IgG2, IgG4 i njihove kombinacije; i (2) varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, pri čemu je drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina operativno vezan za drugi konstantni region teškog lanca koji sadrži drugu CH3 aminokiselinsku sekvencu humanog IgG izabranu između IgG1, IgG2, IgG4 i njihova kombinacija, pri čemu se prvi ili drugi varijabilni domen teškog lanca (sa ili bez srodnog lakog lanca) vezuje za heterologni epitop kao što je ovde opisano, a drugi varijabilni domen teškog lanca (sa ili bez srodnog lakog lanca) vezuje receptor na ciljnu ćeliju, i pri čemu se prvi konstantni region teškog lanca povezuje sa drugim regionom konstantnog lanca na način koji omogućava lakšu izolaciju multispecifičnog vezujućeg proteina, na primer, pri čemu prvi i drugi konstantni region teškog lanca formiraju “knobs into holes” (KIH) format ili gde druga CH3 aminokiselinska sekvenca sadrži modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše vezivanje druge CH3 aminokiselinske sekvence za protein A (videti, na primer, US br. br.8,586,713). U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul sadrži: (1) varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina koji je operativno povezan sa prvim konstantnim regionom teškog lanca koji sadrži prvu CH3 aminokiselinsku sekvencu humanog IgG izabranog između IgG1, IgG2, IgG4 i kombinacije od toga; i (2) varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, pri čemu je drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina operativno vezan za drugi konstantni region teškog lanca koji sadrži drugu CH3 aminokiselinsku sekvencu humanog IgG izabranu između IgG1, IgG2, IgG4 i njihova kombinacija, pri čemu se prvi i drugi varijabilni domen teškog lanca (sa ili bez srodnog lakog lanca) vezuju za iste ili različite antigene, pri čemu su prvi ili drugi konstantni regioni teškog lanca modifikovani da dalje sadrže dodatni vezujući domen (npr., scFv ili Fv koji se vezuje za heterologni epitop kao što je ovde opisano, na primer, pri čemu je dodatni domen vezivanja vezan za C-kraj ili N-kraj jednog ili oba teška lanca), i gde se prvi konstantni region teškog lanca povezuje sa drugim regionom konstantnog lanca na način koji obezbeđuje lakšu izolaciju multispecifičnog vezujućeg proteina, na primer, gde prvi i drugi konstantni region teškog lanca formiraju “knobes into holes” (KIH) format ili gde druga CH3 aminokiselinska sekvenca sadrži modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše vezivanje druge CH3 aminokiselinske sekvence za protein A. U nekim izvođenjima u kojima druga CH3 aminokiselinska sekvenca sadrži smanjeno ili eliminisano vezivanje za protein A, druga CH3 aminokiselinska sekvenca sadrži H95R modifikaciju (IMGT numerisanjem egzona; H435R prema EU numeraciji). U jednom izvođenju, druga CH3 aminokiselinska sekvenca dalje sadrži Y96F modifikaciju (po IMGT numerisanju egzona; H436F prema EU). U drugom aspektu, druga CH3 aminokiselinska sekvenca sadrži i H95R modifikaciju (po IMGT numerisanju egzona; H435R prema EU numerisanju) i Y96F modifikaciju (po IMGT numerisanju egzona; H436F prema EU). U nekim izvođenjima, druga CH3 aminokiselinska sekvenca je iz modifikovanog humanog IgG1 i dalje sadrži mutaciju izabranu iz grupe koju čine D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (IMGT; D356E, L38M, N384S, K392N, V397M i V422I od EU). U nekim izvođenjima, druga CH3 aminokiselinska sekvenca je iz modifikovanog humanog IgG2 i dalje sadrži mutaciju izabranu iz grupe koju čine N44S, K52N i V82I (IMGT: N384S, K392N i V422I prema EU). U nekim izvođenjima, druga CH3 aminokiselinska sekvenca je iz modifikovanog humanog IgG4 i dalje sadrži mutaciju izabranu iz grupe koju čine Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (IMGT: Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I od EU). U nekim izvođenjima, sekvenca aminokiselina konstantnog regiona teškog lanca je sekvenca aminokiselina konstantnog regiona koji nije humani, a sekvenca aminokiselina konstantnog regiona teškog lanca obuhvata jednu ili više od bilo koje od gore opisanih tipova modifikacija.
[0078] U raznim izvođenjima, Fc domeni su modifikovani da imaju izmenjeno vezivanje Fc receptora što zauzvrat utiče na efektorsku funkciju. U nekim izvođenjima, modifikovani konstantni region teškog lanca (CH), koji uključuje Fc domen, je himerni. Kao takav, himerni CH region kombinuje CH domene koji su dobijeni iz više od jednog izotipa imunoglobulina. Na primer, himerni CH region sadrži deo ili sve od CH2 domena koji je dobijen od humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 molekula, koji je kombinovan sa delom ili celim domenom CH3 koji je dobijen iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 molekula. U nekim izvođenjima, himerni CH region sadrži himerni region zgloba. Na primer, himerni zglob može da sadrži aminokiselinsku sekvencu "gornjeg zgloba" (aminokiselinski ostaci iz pozicija 216 do 227 u skladu sa EU numerisanjem; aminokiselinski ostaci iz pozicija 226 do 240 prema Kabat numerisanju) koji su dobijeni iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 zglobnog regiona, kombinovano sa sekvencom "donjeg zgloba" (aminokiselinski ostaci iz pozicija 228 do 236 u skladu sa EU numerisanjem; aminokiselinski ostaci iz pozicija 241 do 249 u skladu sa Kabat numerisanjem) koji su dobijeni iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog regiona zgloba IgG4. U nekim izvođenjima, himerni region zgloba sadrži aminokiselinske ostatke koji su dobijeni iz humanog IgG1 ili humanog IgG4 gornjeg zgloba i aminokiselinske ostatke koji su dobijeni iz humanog IgG2 donjeg zgloba.
[0079] U nekim izvođenjima, domen Fc može se modifikovati da aktivira sve, neke od, ili nijednu od normalnih efektorskih funkcija Fc, bez uticaja na željena farmaceutska svojstva proteina koji sadrže Fc (npr. antitela). Za primere proteina koji sadrže himerne CH regione i imaju izmenjene efektorske funkcije, vidi WO2014022540.
[0080] Termin "ciljne ćelije" uključuje bilo koje ćelije u kojima je poželjna ekspresija nukleotida od interesa. Poželjno, ciljne ćelije ispoljavaju protein, npr., receptor, na njihovoj površini koje omogućava ćelijama da budu ciljane sa ligandom za retargetiranje, kao što je ispod opisano. Poželjno, ciljani protein, npr., receptor je specifičan za ciljnu ćeliju, npr., je "marker specifičan za ćeliju," "antigen specifičan za ćeliju," ili slično. Termin "marker specifičan za ćeliju," "ćelijski specifičan antigen," "marker specifičan za organ," "marker specifičan za tkivo," ili slično se odnosi na i uključuje one proteine za koje je ekspresija obogaćena u ćeliji, tkivu i/ili organu za koje je marker specifičan. "Obogaćen" u kontekstu proteinske ekspresije se odnosi na i uključuje ekspresiju ili prekomernu ekspresiju ćelijskog/tkiva/organ specifičnog proteina primarno, preferencijalno, ili isključivo od strane ćelije/tkiva/organa za koje je protein specifični marker, iako takav marker može takođe da bude eksprimiran od strane drugih ćelija/tkiva/ili organa na minimalnim nivoima. Humani Proteinski Atlas može se koristiti da se odredi da li je protein ćelijski/tkivni/organ specifični marker, i takođe obezbeđuje skladište proteina specifičnih za ćeliju/tkivo/organ. Vidi, www.proteinatlas.org; vidi takođe Uhlen et al. (2010) Nat. Biotech.28:1248-50.
[0081] Termin "transdukcija" ili "infekcija" ili slično se odnosi na uvođenje nukleinske kiseline u ciljnu ćeliju pomoću virusnog vektora. Termin efikasnost u odnosu na transdukciju ili slično, npr., "efikasnost transdukcije" se odnosi na deo (npr., procenat) ćelija koje eksprimiraju nukleotid od interesa nakon inkubacije sa određenim brojem virusnih vektora koji sadrže nukleotid od interesa. Dobro poznati postupci za određivanje efikasnosti transdukcije uključuju fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija koje su transdukovane sa fluorescentnim reporterskim genom, PCR za ekspresiju nukleotida od interesa, itd.
[0082] Termin "divlji tip", kao što se ovde koristi, obuhvata entitet koji ima strukturu i/ili aktivnost koja se u prirodi nalazi u "normalnom" (suprotno sa mutantnim, obolelim, izmenjenim, itd.) stanjem ili kontekstom. Osobe koje su uobičajeno verzirane u stanje tehnike će razumeti da virusni vektori divljeg tipa, npr., kapsidni proteini divljeg tipa, mogu da se koriste kao referentni virusni vektor u uporednim studijama. Generalno, referentni virusni kapsidni protein/kapsid/vektor su identični sa ispitivanim kapsidnim proteinom/kapsidom/vektorom ali za promenu za koju je efekat koji treba da se testira. Na primer, da se odredi efekat, npr., na efikasnost transdukcije, insercije heterolognog epitopa u ispitivani virusni vektor, efikasnosti transdukcije ispitivanog virusnog vektora (u odsustvu ili prisustvu odgovarajućeg multispecifičnog vezujućeg molekula) se mogu uporediti sa efikasnostima transdukcije referentnog virusnog vektora (u odsustvu ili prisustvu odgovarajućeg multispecifičnog vezujućeg molekula po potrebi) koji je identičan sa ispitivanim virusnim vektorom u svakom slučaju (npr., dodatne mutacije, nukleotid od interesa, brojni virusni vektori i ciljne ćelije, itd.) osim prisustva heterolognog epitopa.
Rekombinantni virusni kapsidni proteini i AAV vektori i nukleinske kiseline
[0083] U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan je Ad kapsidni protein, npr., kapsidni protein Ad serotipa koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz Ad1, Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, i Ad7. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od Ad2 kapsidnog gena. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od Ad5 kapsidnog gena. U nekim izvođenjima, rekombinantni Ad AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan sadrži heterologni epitop u domenu vlakna proteina, npr., na karboksi kraju vlakna proteina, “knob” vlakna, i/ili HI petlje “knob” vlakna.
[0084] U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein izveden iz adeno-povezanog virusnog (AAV) kapsidnog gena je genski modifikovani kapsidni protein AAV serotipa koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV2 kapsidnog gena, AAV6 kapsidnog gena, AAV8 kapsidnog gena, ili AAV9 kapsidnog gena. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV2 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV2 VP1 kapsidni protein, aminokiselinska sekvenca divljeg tipa koja je redom prikazana kao SEQ ID NO:1. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV8 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV8 VP1 kapsidni protein, aminokiselinska sekvenca divljeg tipa koja je prikazana u SEQ ID NO:21. U nekim izvođenjima rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV9 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani AAV9 VP1 kapsidni protein, aminokiselinska sekvenca divljeg tipa koja je redom prikazana kao SEQ ID NO:5. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein je dobijen od AAV6 kapsidnog gena, npr., je genski modifikovani VP1 kapsidni protein AAV6. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan u I-453 AAV9 kapsidnog proteina.
[0085] Generalno, rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan sadrži heterologni epitop insertovan u i/ili prikazan od strane AAV kapsidnog proteina tako da heterologni epitop smanjuje i/ili ukida prirodni tropizam AAV kapsidnog proteina ili kapsida koji ga sadrži. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan u region AAV kapsidnog proteina koji je uključen u prirodni tropizam divljeg tipa referentnog kapsidnog proteina, npr., region kapsidnog proteina koji je uključen u ćelijski receptor. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan u i/ili prikazan od strane “knob” domena Ad vlakna proteina. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan u i/ili prikazan od strane HI petlje Ad vlakna proteina. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je insertovan nakon aminokiselinske pozicije koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od G-453 of AAV2 kapsidnog proteina VP1, N-587 AAV2 kapsidnog proteina VP1, Q-585 AAV6 kapsidnog proteina VP1, G-453 AAV9 kapsidnog proteina VP1, i A-589 AAV9 kapsidnog proteina VP1. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je inserted i/ili je ispoljen između aminokiselina N-587 i R-588 AAV2 VP1 kapsida. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:2. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid sadrže aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:4. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana od strane sekvence nukleinske kiseline prikazane u SEQ ID NO:25. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana sekvencom nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO:26. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana sekvencom nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO:27. Dodatna pogodna mesta insercije koja su identifikovana korišćenjem AAV2 su dobro poznata u oblasti tehnike (Wu et al. (2000) J. Virol.74:8635-8647) i uključuju I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713 i I-716. Rekombinantni virusni kapsidni protein kao što je ovde opisan može biti AAV2 kapsidni protein koji sadrži heterologni epitop insertovan u poziciju koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I¬713, I-716, i njihovih kombinacija. Dodatna pogodna mesta insercije su identifikovana korišćenjem dodatnih AAV serotipova su dobro poznata i uključuju I-587 (AAV1), I-589 (AAV1), I-585 (AAV3), I-585 (AAV4), i I-585 (AAV5). U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan može biti AAV2 kapsidni protein koji sadrži heterologni epitop insertovan u poziciju koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz I-587 (AAV1), I-589 (AAV1), I-585 (AAV3), I-585 (AAV4), I-585 (AAV5), i njihove kombinacije.
[0086] Ovde korišćena nomenklatura I-### se odnosi na mesto insercije ### imenovanjem broja aminokiseline u odnosu na VP1 protein AAV kapsidnog proteina, međutim takva insercija može biti locirana direktno N-ili C-kraju, poželjni C-kraju jedne aminokiseline u sekvenci od 5 aminokiselina N-ili C-kraja date aminokiseline, poželjno 3, poželjnije 2, naročiti 1 aminokiselina(e) N-ili C-kraju date aminokiseline. Dodatno, pozicije koje su ovde naznačene se odnose na VP1 protein kodiran AAV kapsidnim genom, i odgovarajuće pozicije (i njihove mutacije) mogu se jednostavno identifikovati za VP2 i VP3 kapsidne protein koji su kodirani od strane kapsidnog gena izvođenjem poravnanja u sekvenci VP1, VP2 i VP3 proteina kodiranih referentnim AAV kapsidnim genom.
[0087] Prema tome, insercija u odgovarajuću poziciju kodirajuće nukleinske kiseline jednog od ovih mesta gena cap dovodi do insercije u VP1, VP2 i/ili VP3, kako su kapsidni proteini kodirani preklapajućim okvirima čitanja istog gena sa raspoređenim preklapajućim start kodonima. Prema tome, za AAV2, na primer, prema ovoj nomenklaturi insercije između aminokiselina 1 i 138 su insertovane samo u VP1, insercije između 138 i 203 su insertovane u VP1 i VP2, i insercije između 203 i C-kraja su insertovane u VP1, VP2 i VP3, što je naravno slučaj za mesto insercije I-587. Prema tome, predmetni pronalazak sadrži strukturalne gene AAV sa odgovarajućim insercijama u VP1, VP2 i/ili VP3 proteinima.
[0088] Dodatno, zbog visoke očuvanosti bar velikih rastegnutih delova i velikog broja blisko povezanih članova familije, odgovarajuća mesta za inserciju za AAV osim nabrojanog AAV mogu se identifikovati izvođenjem poravnanja aminokiselina ili poređenjem struktura kapsida. Vidi, npr., Rutledge et al. (1998) J. Virol. 72:309-19 i U.S. Patent Br. 9,624,274 za primere poravnanja različitih proteina AAV kapsida.
[0089] U nekim ovde prikazanim kompozicijama koje sadrže rekombinantni AAV kapsid (npr., u odsustvu multispecifičnog vezujućeg molekula), rekombinantni AAV kapsidni protein je AAV2 kapsidni protein VP1 sa heterolognim epitopom koji je insertovan u 1587 mestu, gde heterologni epitop ne sadrži Arg-Gly-Asp (RGD) motiv, NGR motiv, ili c-myc. U nekim ovde prikazanim kompozicijama koje sadrže rekombinantni AAV kapsid (npr., u odsustvu multispecifičnog vezujućeg molekula), rekombinantni AAV kapsidni protein je VP1 kapsidni protein sa heterolognim epitopom koji je umetnut između T-448 i N-449, pri čemu heterologni epitop ne sadrži c-myc. U nekim ovde prikazanim kompozicijama koje sadrže rekombinantni AAV kapsid (npr., u odsustvu multispecifičnog vezujućeg molekula), rekombinantni AAV kapsidni protein je VP1 kapsidni protein sa heterolognim epitopom koji je insertovan u I-447 mestu, gde heterologni epitop ne sadrži L14 ili HA.
[0090] U nekim kompozicijama koje sadrže rekombinantni AAV kapsid (npr., dalje sadrži multispecifični vezujući molekul), rekombinantni AAV kapsidni protein je VP1 kapsidni protein sa heterolognim epitopom koji je insertovan na I-587 mestu, pri čemu heterologni epitop sadrži Arg-GlyAsp (RGD) motiv, NGR motiv, ili c-myc. U nekim ovde prikazanim kompozicijama koji sadrže rekombinantni AAV kapsid (npr., dalje sadrži multispecifični vezujući molekul), AAV kapsid je VP1 kapsid, heterologni epitop sadrži c-myc, i heterologni epitop je umetnut između T-448 i N-449, ili između N-587 i R-588. U nekim ovde prikazanim kompozicijama koje sadrže rekombinantni AAV kapsid (npr., dalje sadrži multispecifični vezujući molekul), rekombinantni AAV kapsidni protein je VP1 kapsidni protein sa heterolognim epitopom je insertovan u I-447 mestu, pri čemu heterologni epitop sadrži L14 ili HA. U nekim ovde prikazanim kompozicijama koje sadrže rekombinantni AAV kapsid (npr., u prisustvu multispecifičnog vezujućeg molekula), rekombinantni AAV kapsidni protein je VP1 kapsidni protein sa heterolognim epitopom koji je umetnut između T-448 i N-449, pri čemu heterologni epitop sadrži c-myc. U.S. Patent Br. 9,624,274 opisuje I-453 AAV kapsidnog proteina kao pogodno mesto insercija za heterologni epitop.
[0091] U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa ukida prirodni tropizam AAV vektora, npr., transdukcija ćelija koje su prirodno propustljive za infekciju referentnim AAV vektorima divljeg tipa i/ili ciljna ćelija nije detektabilna u odsustvu odgovarajućeg multispecifičnog vezujućeg molekula. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora, npr., u poređenju sa transdukcijom ćelija koje su prirodno permisivne za infekciju referentnim AAV vektorima divljeg tipa. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 5%. U nekim izvođenjima, insercije (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 5%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 10%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterologni epitop smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 20%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 30%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 40%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 50%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 60%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 70%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 80%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 90%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 95%. U nekim izvođenjima, insercija (prikaz) heterolognog epitopa smanjuje prirodni tropizam AAV vektora za bar 90%. U ovim izvođenjima, gde insercija (prikaz) heterolognog epitopa ne ukida prirodni tropizam rekombinantnih AAV kapsida, prirodni tropizam takvih rekombinantnih AAV kapsida se može ukinuti drugom i različitom mutacijom. Na primer, u jednom izvođenju, rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisano može se dobiti od AAV9 kapsidnog gena, sadrže heterologni epitop, i može dalje sadržati mutaciju, npr., W503A mutaciju.
[0092] Ovo detargeriranje virusa od njegove prirodne ćelije domaćina je važno naročito ukoliko je namenjena sistemska u odnosu na lokalnu ili lokalno-regionalnu primenu AAV vektora, jer uzimanje AAV vektora od strane prirodnih ćelija domaćina ograničava efikasnu dozu AAV vektora. U slučaju AAV2 i AAV6, prijavljeno je da je HSPG primarni receptor za unos virusa u veliki broj ćelija, posebno ćelija jetre. Za AAV2, aktivnost vezivanja HSPG zavisi od grupe od 5 baznih aminokiselina, R484, R487, R585, R588 i K532 (Kern et al., (2003) J Virol. 77(20):11072-81). Nedavno je prijavljeno da lizin-uglutamat aminokiselinska supstitucija K531E dovodi do supresije sposobnosti AAV6 da veže heparin ili HSPG ((Wu et al., 2006) J. of Virology 80(22):11393-11397). Prema tome, poželjne tačkaste mutacije su one koje smanjuju aktivnost transdukcije vektora AAV za datu ciljnu ćeliju koja je posredovana prirodnim receptorom za bar 50%, poželjno bar 80%, naročito bar 95%, u slučaju HSPG kao primarnog receptora vezivanja vektora AAV za HSPG.
[0093] Prema tome, dalje mutacije koje su poželjne za AAV vektori koji se vezuju za HSPG su one mutacije koje iscrpljuju ili zamenjuju baznu aminokiselinu kao što je R, K ili H, poželjno R ili K koja je uključena u vezivanje HSPG odgovarajućeg virusa, nebaznom aminokiselinom kao što je A, D, G, Q, S i T, poželjno A ili aminokiselina koja se nalazi na odgovarajućem položaju različitog ali visoko konzervisanog AAV serotipa kome nedostaje takva bazna aminokiselina na ovoj poziciji. Prema tome, poželjne supstitucije aminokiselina su R-484-A, R-487-A, R-487-G, K-532-A, K-532-D, R-585-A, R-585-S, R-585-Q, R-585-A ili R-588-T, posebno R-585-A i/ili R-588-A za AAV2, i K-531-A ili K-531-E za AAV6. Jedno naročito poželjno izvođenje iz pronalaska su takvi mutanti proteina kapsida AAV2 koji dodatno sadrže dve tačkaste mutacije R-585-A i R-588-A i ove dve tačkaste mutacije su dovoljne da u velikoj meri uklone aktivnost vezivanja HSPG. Ove tačkaste mutacije omogućavaju efikasno detargetiranje iz ćelija koje eksprimiraju HSPG koje—za svrhe ciljanja--povećava specifičnost odgovarajućeg mutiranog virusa za njegovu novu ciljnu ćeliju.
[0094] Jedno izvođenje iz predmetnog pronalaska je multimerna struktura koja sadrži rekombinantni AAV protein kapsida iz predmetnog pronalaska. Multimerna struktura sadrži bar 5, poželjno bar 10, požljenije bar 30, najpoželjnije bar 60 rekombinantnih AAV kapsidnih proteina koji sadrži heterologni epitop kao što je ovde opisan. Mogu formirati regularne AAV kapside (prazne čestice AAV) ili AAV vektori (kapsidi inkapsuliraju nukleotid od interesa). Obrazovanje AAV vektora koji su sposobni da pakuju genom virusa je visoko poželjna osobina za upotrebu rekombinantnih AAV kapsida koji se ovde opisuju kao AAV vektori.
[0095] Jedno izvođenje iz predmetnog pronalaska je nukleinska kiselina koja kodira protein kapsida kao što je gore opisano. Nukleinska kiselina je poželjno vektor koji sadrži zahtevanu sekvencu nukleinske kiseline. Nukleinske kiseline, naročito vektori su neophodni za rekombinantnu ekspresiju proteina kapsida ovog pronalaska.
[0096] Dalje izvođenje predmetnog pronalaska je upotreba bar jednog rekombinantnog AAV kapsidnog proteina i/ili nukleinske kiseline koja kodira, poželjno bar jednu multimernu strukturu (npr., AAV vektor) za pravljenje i upotrebu kao vektora genskog transfera.
Heterologni epitopi
[0097] Generalno, rekombinantni AAV protein i/ili AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid sadrži heterologni epitop, koji omogućava retargetiranje AAV vektora, npr., preko multispecifičnog vezujućeg molekula. U nekim izvođenjima, heterologni epitop je epitop B ćelije, npr., je između oko 1 aminokiseline i oko 35 aminokiselina u dužini, i obrazuje vezujući par sa paratopom antitela, npr., varijabilnim domenom imunoglobulina. U nekim izvođenjima, heterologni epitop sadrži afinitetni tag.
[0098] U oblasti tehnike je poznat veliki broj tagova. (Videti, npr.: Nilsson et al. (1997) "Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of recombinant proteins" Protein Expression and Purification 11: 1-16, Terpe et al. (2003) "Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems" Applied Microbiology and Biotechnology 60:523-533, and references therein). Afinitetni tagovi uključuju, ali nisu ograničeni na, polihistidinski tag (npr., His-6, His-8, ili His-10 tag) koji veže immobilizovane divalentne katjone (npr., Ni<2+>), ostatak biotina (npr., na in vivo biotinilovanoj polipeptidnoj sekvenci) koja veže imobilizovani avidin, GST (glutation S-transferaza) sekvencu koja veže immobilizovani glutation, S tag koji veže imobilizovani S protein, antigen koji je imobilizovano antitelo ili domen ili njegov fragment (uključujući, npr., T7, myc, FLAG, i B tagove koji vežu odgovarajuća antitela), FLASH Tag (visokoafinitetni tag koji se spaja sa specifičnim ostacima na bazi arsena), receptor ili domen receptora koji veže imobilizovani ligand (ili obrnuto), protein A ili njegov derivate (npr., Z) koji veže imobilizovani IgG, protein koji vezuje maltozu (MBP) koji vezuje imobilizovanu amilozu, albumin vezujući protein koji veže imobilizovani albumin, domen za vezivanje hitina koji veže imobilizovani hitin, kalmodulin vezujući peptid koji veže imobilizovani kalmodulin, i celuloza vezujući domen koji veže imobilizovanu celulozu. Drugi primer taga je SNAP-tag, komercijalno dostupan od Covalys (www.covalvs.com). U nekim izvođenjima, heterologni epitop koji je ovde prikazan sadrži afinitetni tag prepoznat samo od strane paratopa antitela. U nekim izvođenjima, ovde prikazani heterologni epitop sadrži afinitetni tag koji je prepoznat od strane paratopa antitela i drugi specifični vezujući parovi.
[0099] U nekim aspektima, heterologni epitop i/ili afinitetni tag ne obrazuje vezujući par sa konstantnim domenom imunoglobulna. U nekim aspektima, heterologni epitop i/ili afinitetni tag ne obrazuje vezujući par sa jonom metala, npr., Ni<2+>, Co<2+>, Cu<2+>, Zn<2+>, Fe<3+>, itd. U nekim izvođenjima, heterologni epitop nije polipeptid koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz Streptavidina, Strep II, HA, L14, 4C-RGD, LH, i Proteina A.
[0100] U nekim izvođenjima, afiniteni tag je odabran iz grupe koja se sastoji iz FLAG (SEQ ID NO:7), HA (SEQ ID NO:8) i c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:6). U nekim izvođenjima, heterologni epitop je c-myc.
[0101] U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid kao što je ovde opisan sadrži aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO: 6) bočno raspoređenu i/ili operativno u vezi sa bar 5 susednih aminokiselina AAV VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid kao što je ovde opisan adrži aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO: 6) bočno raspoređenu /ili operativno u vezi sa bar 5 susednih aminokiselina AAV2 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid kao što je ovde opisan sadrži EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO:6) koja je umetnuta između N587 i R588 AAV2 VP1 kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:2. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsidni protein kao što je ovde opisan sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:4. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana sekvencom nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO:25. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana sekvencom nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO:26. U nekim izvođenjima, rekombinantni AAV kapsid, AAV vektor koji sadrži rekombinantni AAV kapsid, i/ili kompozicije koje sadrže rekombinantni AAV kapsid sadrži aminokiselinsku sekvncu koja je kodirana sekvencom nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO:27.
[0102] U nekim izvođenjima, heterologni epitop sadrži afinitetni tag i jedan ili više linkera. U nekim izvođenjima, heterologni epitop sadrži afinitetni tag bočno raspoređen u odnosu na linker, npr., heterologni epitop sadrži od N-kraja ka C-kraju prvi linker, afinitetni tag, i drugi linker. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linkeri su svaki nezavisno dužine bar jedne aminokiseline. U nekim izvođenjima, prvi i drugi linkeri su identični.
[0103] Uopšteno, heterologni epitop kao što je ovde opisan, npr., afinitetni tag sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera, je između oko 5 aminokiselina do oko 35 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je bar 5 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 6 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 7 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 8 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 9 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 10 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 11 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 12 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 13 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 14 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 15 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 16 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 17 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 18 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 19 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 20 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 21 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 22 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 23 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 24 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 25 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 26 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 27 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 28 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 29 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 30 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 31 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 32 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 33 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 34 aminokiselina u dužini. U nekim izvođenjima, heterologni epitop (sam ili u kombinaciji sa jednim ili više linkera) je 35 aminokiselina u dužini.
Ostaci retargetiranja
[0104] AAV vektor kao što je ovde opisano ima smanjene do ukinute sposobnosti transdukcije u odsustvu multispecifičnog vezujućeg molekula, naročito multispecifičnog vezujućeg molekula koji sadrži (i) paratop antitela koji specifično veže epitop i (ii) retargetirajući ligand koji specifično veže receptor, koji može biti konjugovan za površinu čestice (npr., za prečišćavanje) ili eksprimovan od strane ciljne ćelije. Prema tome, multispecifični vezujući molekul sadrži (i) paratop antitela koji specifično veže epitop i (ii) retargetirajući ligand koji specifično veže receptor retargetira AAV vektor. Takvo "retargetiranje" ili "preusmeravanje" može obuhvatiti scenario u kom AAV vektor divljeg tipa cilja nekoliko ćelija u tkivu i/ili nekoliko organa u organizmu, gde je široko ciljanje ćelija tkiva ili organa smanjeno do ukinuto umetanjem heterolognog epitopa, i gde je retargetiranje na specifičnije ćelije u tkivu ili specifičniji organ u organizmu postignuto multispecifičnim vezujuim molekulom. Takvo retargetiranje ili preusmeravanje može takođe da obuvati scenario u kome AAV vektor divljeg tipa cilja tkivo, gde je ciljanje tkiva smanjeno do ukinuto umetanjem heterolognog epitopa, i gde retargetiranje na potpuno različito tkivo je postignuto sa multispecifičnim vezujućim molekulom. Paratop antitela kao što je ovde opisan generalno sadrži minimum regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) koji specifično prepoznaje heterologni epitop, npr., CDR3 region varijabilnog domena teškog i/ili lakog lanca. U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul sadrži antitelo (ili njegov deo) koji sadrži paratop antitela koji specifično veže heterologni epitop. Na primer, multispecifični vezujući molekul može sadržati jedan domen varijabilnog regiona teškog lanca ili jedan domen varijabilnog regiona lakog lanca, pri čemu jedan domen varijabilnog regiona teškog lanca ili jedan domen varijabilnog regiona lakog lanca sadrži paratop antitela koje specifično veže heterologni epitop. U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul može da sadrži Fv region, npr., multispecifični vezujući molekul može sadržati scFv, koji sadrži paratop antitela koji specifično veže heterologni epitop. U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul kao što je ovde opisano sadrži paratop antitela koji specifično veže c-myc.
[0105] U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul kao što je ovde opisan sadrži paratop antitela koji specifično veže c-myc, gde paratop sadrži scFv, varijabilne domene teškog i lakog lanca scFv, i/ili niz HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 aminokiselinske sekvence, koje su kodirane sekvencom nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO:28, npr., scFv sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:37. U nekim izvođenjima, multispecifični vezujući molekul kao što je ovde opisan sadrži Fv ili scFv koji je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO:28.
[0106] Prema tome, ovaj pronalazak sadrži antitela, antigen-vezujuće fragmente antitela, i multispecifične vezujuće proteine koji specifično vežu c-myc, pri čemu antitela, fragmenti antitela, i multispecifični vezujući proteini sadrže paratop koji sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji se sastoji iz SEQ ID NO:29 i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji se sastoji iz SEQ ID NO:30. Ovaj pronalazak takođe sadrži antitela, antigen-vezujuće fragmente antitela, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji specifično veže c-Myc, pri čemu paratop sadrži region 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR1) koji se sastoji iz SEQ ID NO:31, HCDR2 koji se sastoji iz SEQ ID NO:32, HCDR3 koji se sastoji iz SEQ ID NO:33, region 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR1) koji se sastoji iz SEQ ID NO:34, LCDR2 koji se sastoji iz SEQ ID NO:35, i LCDR3 koji se sastoji iz SEQ ID NO:36.
[0107] Ovaj pronalazak može koristiti antitela, njihove antigen vezujuće fragmente, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji sadrži HCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO:29, ili njene suštinski slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.
[0108] Ovaj pronalazak može da koristi antitela, njihove antigen-vezujuće fragmente, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji sadrži LCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO:30, ili suštinski slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.
[0109] Ovaj pronalazak može da koristi antitela, njihove antigen-vezujuće fragmente, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji sadrži HCVR i LCVR aminokiselinski par sekvenci (HCVR/LCVR) koji sadrži HCVR aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:29 uparenu sa LCVR aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:30. U nekim izvođenjima, HCVR/LCVR aminokiselinski par sekvenci je izabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 29/30.
[0110] Ovaj pronalazak može da koristi antitela, njihove antigen-vezujuće fragmente, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji sadrži CDR1 teškog lanca (HCDR1) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO:31 ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.
[0111] Ovaj pronalazak može da koristi antitela, njihove antigen-vezujuće fragmente, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji sadrži CDR2 teškog lanca (HCDR2) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO:32, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.
[0112] Ovaj pronalazak može da koristi antitela, njihove antigen-vezujuće fragmente, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji sadrži CDR3 teškog lanca (HCDR3) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:33, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.
[0113] Ovaj pronalazak može da koristi antitela, njihove antigen-vezujuće fragmente, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji sadrži CDR1 lakog lanca (LCDR1) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:34, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.
[0114] Ovaj pronalazak može da koristi antitela, njihove antigen-vezujuće fragmente, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji sadrži CDR2 lakog lanca (LCDR2) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:35, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekveci.
[0115] Ovaj pronalazak može da koristi antitela, njihove antigen-vezujuće fragmente, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji sadrži CDR3 lakog lanca (LCDR3) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:36, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.
[0116] Ovaj pronalazak može da koristi antitela, njihove antigen-vezujuće fragmente, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji sadrži HCDR3 i LCDR3 aminokiselinski par sekvenci (HCDR3/LCDR3) koji sadrži HCDR3 aminokiselinu koja je prikazana u SEQ ID NO:33 uparena sa LCDR3 aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:36. U nekim izvođenjima, HCDR3/LCDR3 aminokiselinski par sekvenci je prikazan u SEQ ID NOs: 33/36.
[0117] Ovaj pronalazak može da koristi antitela, njihove antigen-vezujuće fragmente, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji sadrži niz od šest CDR-a (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) koji su kodirani sekvencom nukleotida koja je prikazana u SEQ ID NO:28. U određenim izvođenjima, niz HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 aminokiselinskih sekvenci je prikazan u SEQ ID NOs: 31-32-33-34-35-36.
[0118] U srodnom izvođenju, ovaj pronalazak može da koristi antitela, njihove antigen-vezujuće fragmente, i/ili multispecifične vezujuće proteine koji sadrže paratop koji sadrži niz od šest CDR-a (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) koji se nalaze u HCVR/LCVR aminokiselinskom paru sekvenci koji je prikazan u SEQ ID NOs:29/30. Postupci i tehnike za identifikovanje CDRa unutar HCVR i LCVR aminokiselinskih sekvenci su dobro poznati u oblasti tehnike i mogu da se koriste za identifikovanje CDRs unutar određenih HCVR i/ili LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde prikazane. Primeri konvencija koje se mogu koristiti za identifikovanje granica CDR uključuju, npr., definiciju po Kabatu, Chothia definiciju, i AbM definiciju. U opštem smislu, definicija po Kabatu je zasnovana na varijabilnosti u sekvenci, Chothia definicija je zasnovana na lokaciji regiona strukturalne petlje, i AbM definicija je kompromis između pristupa Kabat i Chothia. Vidi, npr., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol.273:927-948 (1997); i Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Javne baze podataka su takođe dostupne za identifikovanje sekvenci CDR u antitelu.
[0119] Ovaj pronalazak može koristiti molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju anti-myc antitela ili njihove delove.
[0120] Multispecifični vezujući molekul kao što je ovde opisan dalje sadrži ligand za retargetiranje, dodatno (npr., antitelo ili njegov deo) koji specifično vezuje heterologni epitop umetnut u/ispoljen od strane rekombinantnog AAV kapsidnog proteina. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje protein koji je eksprimiran na površini ćelije, npr., protein ćelijske površine (humane) eurkariotske ćelije, npr., ciljna ćelija. Postoji veliki broj proteina ćelijske površine, npr. receptora ćelijske površine, pogodnih koji mogu biti ciljani ligandom za retargetiranje, i za koje su ligand za retargetiranje, npr., antitela ili njihovi delovi, već dostupni. Takve strukture uključuju, ali nisu ograničene na: glavne antigene histokompatibilnosti klase I i klase II; receptore za razne citokine (npr. receptore za IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33, itd.), hormone rasta specifične za ćelijski tip, neurotrofni faktor koji potiče iz mozga (BDNF), cilijarni neurotrofični faktor (CTNF), faktori rasta koji stimulišu kolonije, faktori rasta endotela, epidermalni faktori rasta, faktori rasta fibroblasta, neurotrofični faktor koji potiče od glija, faktori rasta glija, gro-beta/mip 2, rast hepatocita faktori, faktor rasta sličan insulinu, interferoni (a-IFN, b-IFN, gIFN, konsenzus IFN), interleukini (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL¬5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14), faktor rasta keratinocita, inhibitorni faktori leukemije, hemotaktički aktivirajući faktor makrofaga/monocita, faktor rasta nerva, protein koji aktivira neutrofile 2, faktor rasta izveden iz trombocita, faktor matičnih ćelija, transformišući faktor rasta, faktori nekroze tumora, faktor rasta vaskularnog endotela, lipoproteini, uključujući dodatne ili druge transmembranske receptore tipa 1 kao što je PRLR, receptore spojenih sa G-proteinom kao što je GCGR, jonske kanale kao što su Nav1.7, ASIC1 ili ASIC2; molekuli ćelijske adhezije; transportne molekule za metabolite kao što su aminokiseline; receptori antigena B- i T-limfocita (npr. receptori B ćelija i povezani proteini (npr. CD19, CD20, itd.) i T ćelijski receptori i povezani proteini (npr. CD3, CD4, CD8, itd.); a tetraspanin protein (npr., CD63 Rekombinantni AAV kapsid koji je ovde opisan omogućava specifičnu infekciju tipa ćelije korišćenjem multispecifičnog vezujući molekul koji sadrži ligand za retargetiranje koji vezuje diferencijacione ćelijske antigene kao mete za kompleks AAV vektora).
[0121] U nekim izvođenjima ligand za retargetiranje vezuje protein koji se primarno (npr., isključivo) eksprimira u (ljudskim) ćelijama jetre, tj., marker specifičan za jetru. U nekim izvođenjima ligand ponovnog ciljanja vezuje protein koji se prvenstveno (npr. isključivo) eksprimuje (humanim) moždanim ćelijama, markerom specifičnom za moždane ćelije. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje protein koji se prvenstveno (npr. isključivo) eksprimuje pomoću (humanih) hematopoetskih ćelija, tj., marker specifičan za hematopoetsku ćeliju. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje protein koji se primarno (npr., isključivo) eksprimira preko (humanih) T ćelija, odnosno, za T-ćelijski specifičan marker. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje protein koji se primarno (npr., isključivo) eksprimira u (humanim) B ćelijama, npr., za B-ćelijski specifičan marker. U nekim izvođenjima, retargeting ligand vezuje protein koji se primarno (npr., isključivo) eksprimira pomoću (humanih) dendritičnih ćelija, tj., marker specifičan za dendritične ćelije. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje protein koji se prvenstveno (npr., isključivo) eksprimuje pomoću (humanih) makrofaga, odnosno, markera specifičnog za makrofage. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje protein koji se primarno (npr., isključivo) eksprimuje preko (humanih) NK ćelija, tj., marker specifičan za NK ćelije. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje protein koji se primarno (npr. isključivo) eksprimira putem (humanih) ćelija bubrega, odnosno, za bubreg specifični marker. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje receptor koji se primarno (npr., isključivo) eksprimira u (humanim) ćelijama pankreasa, tj., marker specifičan za pankreas. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje receptor koji se primarno (npr., isključivo) eksprimira u (humanim) crevnim ćelijama, tj., marker specifičan za crevo. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje protein koji se primarno (npr., isključivo) eksprimira u (humanoj) ćeliji kancera, tj., antigen koji je povezan sa tumorom. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje protein koji se primarno (npr. isključivo) eksprimira u (humanoj) ćeliji inficiranoj heterolognim patogenom. Proteini koji su (1) specifično eksprimirani ili za koje je ekspresija obogaćena, ćelijom/tkivom/organom, i (2) prepoznati od strane proteina koji vezuje antigen koristan kao ligand za retargetiranje kao što je ovde opisano, dobro su poznati i mogu takođe možete naći na www.proteinatlas.org; vidi takođe Uhlen et al. (2010) Nat. Biotech.28:1248-50. Tabela 1 u nastavku daje primere i neograničavajući markere specifične za organ za koje su dostupni proteini koji vezuju antigen, koji mogu biti korisni kao ligandi za retargetiranje, i ćelije/tkivo/organ koji eksprimiraju takve markere.
Tabela 1: Primeri tkivo s ecifičnih markera
[0122] U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje receptor eksprimiran u (humanoj) ćeliji jetre, npr., asijaloglikoproteinski receptor, npr. hASGR1. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje receptor eksprimiran u (humanoj) moždanoj ćeliji. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje receptor eksprimiran od (humane) T ćelije, npr., CD3, npr., CD3ε. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje receptor eksprimiran u (ljudskoj) ćeliji bubrega. U nekim izvođenjima, ligand za retrargetiranje vezuje receptor eksprimiran u (humanoj) mišićnoj ćeliji, na primer, integrin. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje receptor eksprimiran u (humanoj) kancerogenoj ćeliji, npr., antigen koji je povezan sa tumorom, npr. E6 i E7. U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje humani glukagonski receptor (hGCGR). U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje humani ENTPD3.
[0123] U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje vezuje antigen povezan sa tumorom eksprimiran u tumorskoj ćeliji. Neograničavajući primeri specifičnih antigena povezanih sa tumorom uključuju, na primer, adipofilin, AIM-2, ALDH1A1, alfa-aktinin-4, alfa-fetoprotein ("AFP"), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), BCR-ABL fuzioni protein b3a2, beta-katenin, BING-4, CA-125, CALCA, karcinoembrionalni antigen („CEA“), CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A , CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciklin D1, Ciklin-A1, dek-kan fuzioni protein, DKK1, EFTUD2, faktor elongacije 2, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3 , antigen epitelnog tumora ("ETA"), ETV6-AML1 fuzioni protein, EZH2, E6, E7, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIKS, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4, 5,6,7, GAS7, glipikan-3, GnTV, gp100/Pme117, GPNMB, HAUS3, Hepsin, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, crevna karboksil esteraza, K-ras, kalikrein 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 takođe poznat kao CCDC110, LAGE-1, LDLR-ASfukoziltransferaza proteina, Lengsin, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A 10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, malatna dehidrogenaza, mamaglobin-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midkine, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucin, MUM-1 , MUM-2, MUM-3, miozin, miozin klase I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFIC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, P polipeptid, p53, PAP, PAX5, PBF, pml-RARalfa fuzioni protein, polimorfni epitelni mucin („PEM“), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernin 1, SIRT2, SNRPD1, SOKS10, Sp17, SPA17, SSKS-2, SSKS-4, STEAP1, survivin, SIT-SSX1 ili -SSX2 fuzioni protein, TAG-2, telomeraza, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, triosefosfat izomeraza, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirozinaza, tirozinaza ("TYR"), VEGF, WT1, XAGE-lb/GAGED2a, Kras, NI-ESO1, MAGE-A3, HPV E2, HPV E6, HPV E7, WT-1 antigen (kod limfoma i drugih solidnih tumora), ErbB receptori, Melan A [MART1], gp 100, tirozinaza , TRP-1/gp 75 i TRP-2 (kod melanoma); MAGE-1 i MAGE-3 (kod bešike, glave i vrata i karcinoma ne-malih ćelija); HPV EG i E7 proteini (kod raka grlića materice); Mucin [MUC-1] (kod kancera dojke, pankreasa, debelog creva i prostate); prostata-specifični antigen [PSA] (kod kancera prostate); karcinoembrionalni antigen [CEA] (kod kancera debelog creva, dojke i gastrointestinalnog trakta) i zajednički antigeni specifični za tumor kao što su MAGE-2, MAGE-4, MAGE-6, MAGE-10, MAGE-12, BAGE-1, CAGE- 1,2,8, CAGE-3 DO 7, LAGE-1, NY-ESO-1/LAGE-2, NA-88, GnTV, TRP2-INT2. U nekim izvođenjima, antigen povezan sa tumorom je ErbB2/Her2. U nekim izvođenjima, tumorpovezani antigen je E6 i/ili E7.
[0124] U nekim izvođenjima, ligand za retargetiranje se vezuje za CD markere povezane sa imunološkim odgovorom, npr. CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, itd. U nekim izvođenjima, CD marker je CD3.
[0125] U određenim primerima izvođenja, multispecifični vezujući molekul je bispecifično antitelo. Svaki domen bispecifičnog antitela koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni domen teškog lanca (HCVR) i varijabilni domen lakog lanca (LCVR). U kontekstu bispecifičnog molekula koji se vezuje za antigen koji sadrži prvi i drugi domen koji se vezuje za antigen (npr., bispecifično antitelo), CDR-ovi prvog domena za vezivanje antigena mogu biti označeni prefiksom „A1“ i CDR-ovima drugi domen za vezivanje antigena može biti označen prefiksom "A2". Prema tome, CDR-ovi prvog domena za vezivanje antigena mogu se ovde označiti kao A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3; i CDR-ovi drugog domena za vezivanje antigena mogu se ovde nazvati A2-HCDR1, A2-HCDR2 i A2-HCDR3.
[0126] Prvi domen za vezivanje antigena i drugi domen za vezivanje antigena mogu biti direktno ili indirektno povezani jedan sa drugim da bi formirali bispecifični molekul koji vezuje antigen prema ovom pronalasku. Alternativno, prvi domen za vezivanje antigena i drugi domen za vezivanje antigena mogu biti povezani sa zasebnim multimerizujućim domenom. Povezivanje jednog multimerizujućeg domena sa drugim multimerizujućim domenom olakšava asocijaciju između dva domena za vezivanje antigena, čime se formira bispecifičan molekul koji vezuje antigen. Kako se ovde koristi, "multimerizujući domen" je bilo koji makromolekul, protein, polipeptid, peptid ili aminokiselina koji ima sposobnost da se poveže sa drugim multimerizujućim domenom iste ili slične strukture ili konstitucije. Na primer, multimerizujući domen može biti polipeptid koji sadrži CH3 domen imunoglobulina. Neograničavajući primer multimerizirajuće komponente je Fc deo imunoglobulina (koji sadrži CH2-CH3 domen), na primer, Fc domen IgG izabran od izotipova IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, kao i bilo koji alotip unutar svake grupe izotipova.
[0127] Bispecifični molekuli za vezivanje antigena korišćeni u ovom pronalasku će tipično sadržati dva multimerizujuća domena, npr. dva Fc domena koji su svaki pojedinačno deo posebnog teškog lanca antitela. Prvi i drugi multimerizujući domen mogu biti istog IgG izotipa, kao što su, na primer, IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Alternativno, prvi i drugi multimerizujući domen mogu biti različitih IgG izotipova kao što su, na primer, IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, itd.
[0128] U određenim izvođenjima, multimerizujući domen je Fc fragment ili aminokiselinska sekvenca od 1 do oko 200 aminokiselina u dužini koja sadrži bar one cisteinske ostatke. U drugim izvođenjima, multimerizujući domen je cisteinski ostatak, ili kratak peptid koji sadrži cistein. Drugi multimerizujući domeni obuhvataju peptide ili polipeptide koji sadrže ili se sastoje od leucinskog patent zatvarača, motiva spiralne petlje ili motiva namotanog namotaja.
[0129] Bilo koji format ili tehnologija bispecifičnog antitela može se koristiti za pravljenje bispecifičnih molekula koji vezuju antigen koji se koriste u ovom pronalasku. Na primer, antitelo ili njegov fragment koji ima prvu specifičnost vezivanja antigena može biti funkcionalno povezan (npr. hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na neki drugi način) sa jednim ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela koji ima druga specifičnost vezivanja antigena za proizvodnju bispecifičnog molekula koji vezuje antigen. Specifični primeri bispecifičnih formata koji se mogu koristiti u kontekstu ovog pronalaska uključuju, bez ograničenja, npr. formate zasnovane na scFv ili bispecifične formate diatela, fuzije IgG-scFv, dualni varijabilni domen (DVD)-Ig, Quadroma, “knobs-into-holes”, zajednički laki lanac (npr., zajednički laki lanac sa “knobs-into-holes”, itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED)telo, leucinski zatvarač, Duotelo, IgG1/IgG2, Fab (DAF)-IgG dvostrukog dejstva i Mab2 bispecifični formati (videti, npr., Klein et al.2012, mAbs 4:6, 1-11, i reference koje su tamo citirane, za pregled prethodno navedenih formata; videti takođe Brinkmann i Konterman (2017) mAbs 9:182-212 ).
[0130] Ovaj pronalazak takođe može da koristi bispecifične molekule za vezivanje antigena koji sadrže prvi CH3 domen i drugi Ig CH3 domen, pri čemu se prvi i drugi Ig CH3 domen razlikuju jedan od drugog za jednu amino kiselinu, i gde bar jednu aminokiselinu razlika smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za protein A u poređenju sa bispecifičnim antitelom kome nedostaje razlika u aminokiselinama. U jednom aspektu, prvi Ig CH3 domen vezuje protein A, a drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje proteina A kao što je H95R modifikacija (preko IMGT egzona numerisanja; H-435-R prema EU numerisanju). Drugi CH3 može dalje da sadrži modifikaciju I96F (od IMGT; Y436F od EU). Dalje modifikacije koje se mogu naći u okviru drugog CH3 uključuju: D-16-E, L-18-M, N-44-S, K-52-N, V-57-M i V-82-I (od IMGT D-356-E, L-358-M, N-384-S, K-392-N, V-397-M i V-422-I od strane EU) u slučaju IgG1 antitela; N-44-S, K-52-N i V-82-I (IMGT; N-384-S, K-392-N i V-422-I prema EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q-15-R, N-44-S, K-52-N, V-57-M, R-69-K, E-79-K i V-82-I (od IMGT; Q-355 -R, N-384-S, K-392-N, V-397-M, R-409-K, E-419-Q i V-422-I od EU) u slučaju IgG4 antitela; videti, npr., WO 2010/151792.
[0131] U određenim izvođenjima, Fc domen može biti himerni, kombinujući Fc sekvence izvedene iz više od jednog izotipa imunoglobulina. Na primer, himerni Fc domen može da sadrži deo ili celu CH2 sekvencu izvedenu iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 CH2 regiona, i deo ili celu CH3 sekvencu izvedenu iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Himerni Fc domen takođe može da sadrži himerni zglobni region. Na primer, himerna šarka može da sadrži sekvencu „gornjeg zgloba“, izvedenu iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 zglobnog regiona, kombinovanu sa sekvencom „donjeg zgloba“, izvedenom iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humani IgG4 zglobni region. Poseban primer himernog Fc domena koji može biti uključen u bilo koji od molekula koji se vezuju za antigen koji su ovde navedeni, obuhvata, od N- do C-kraja: [IgG4 CH1] -[IgG4 gornji zglob] -[IgG2 donji zglon] - [IgG4 CH2] - [IgG4 CH3]. Drugi primer himernog Fc domena koji može biti uključen u bilo koji od molekula koji se vezuju za antigen koji su ovde navedeni, obuhvata, od N- do C-terminusa:
[IgG1 CH1]-[IgG1 gornji zglob]-[IgG2 donji zglob]-[ IgG4 CH2]-[IgG1 CH3]. Ovi i drugi primeri himernih Fc domena koji mogu biti uključeni u bilo koji od molekula koji se vezuju za antigen ovog pronalaska su opisani u PCT prijavi br. WO2014/022540. Himerni Fc domeni koji imaju ove opšte strukturne aranžmane i njihove varijante mogu imati izmenjeno vezivanje Fc receptora, što zauzvrat utiče na funkciju Fc efektora.
Postupci za upotrebu i dobijanje
[0132] Dalje izvođenje rekombinantnog AAV kapsidnog proteina opisanog ovde je njihova upotreba za isporuku nukleotida od interesa, npr. reporter gena ili terapeutskog gena, u ciljnu ćeliju. Dakle, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u in vivo postupku lečenja ili dijagnoze, postupak koji obuhvata isporuku nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju koja eksprimuje protein ćelijske površine koja obuhvata dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa kompozicijom, pri čemu multispecifični vezujući molekul sadrži ligand za retargetiranje koji vezuje protein površine ćelije. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje in vitro ili ex vivo postupak za isporuku nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju koja eksprimira protein na površini ćelije koji se sastoji u dovođenju u kontakt ciljne ćelije sa kompozicijom ovog pronalaska, pri čemu multispecifični vezujući molekul sadrži ligand za retargetiranje koji se vezuje za protein ćelijske površine.
[0133] Generalno, nukleotid od interesa može biti transfer plazmid, koji generalno može da sadrži 5' i 3' sekvence invertovanih terminalnih ponovaka (ITR) koje su bočno raspoređene u odnosu na reporterski gen(e) ili terapeutski(e) gen(e) (koji mogu biti ispod kontrola virusnog ili nevirusnog promotera, kada je obuhvaćen AAV vektorom). U jednom aspektu, nukleotid od interesa je transfer plazmid koji sadrži od 5’ do 3’: 5’ ITR, promotor, gen (npr. reporter i/ili terapeutski gen) i 3’ ITR.
[0134] Neograničavajući primeri korisnih promotora uključuju, npr., promotor citomegalovirusa (CMV), promotor virusa koji formira fokus slezine (SFFV), promotor faktora elongacije 1 alfa (EF1a) (1,2 kb EFla-promotor ili 0,2 kb EFla-promotor), himerni EF 1 a/IF4-promotor i fosfo-glicerat kinaza (PGK)-promotor. Unutrašnji pojačivač takođe može biti prisutan u virusnom konstruktu da poveća ekspresiju gena od interesa. Na primer, može se koristiti CMV pojačivač (Karasuyama et al. 1989. J. Ekp. Med.169:13). U nekim izvođenjima, CMV pojačivač se može koristiti u kombinaciji sa pilećim 13-aktinskim promoterom.
[0135] Različiti reporterski geni (ili ostaci koji se mogu detektovati) mogu biti inkapsulirani u multimernu strukturu koja sadrži rekombinantni AAV kapsidnog proteina koji je ovde opisan. Primeri reporterskih gena uključuju, na primer, β-galaktozidazu (kodirani lacZ genom), zeleni fluorescentni protein (GFP), poboljšani zeleni fluorescentni protein (eGFP), MmGFP, plavi fluorescentni protein (BFP), poboljšani plavi fluorescentni protein (eBFP), mPlum , mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, žuti fluorescentni protein (YFP), poboljšani žuti fluorescentni protein (eIFP), Emerald, CzPet, cijan fluorescentni protein (CFP), T-safir, luciferaza, alkalna fosfataza ili njihova kombinacija. Postupci koji su opisani ovde demonstriraju konstrukciju ciljanih vektora koji koriste upotrebu reporterskog gena koji kodira zeleni fluorescentni protein, međutim, stručne osobe nakon čitanja ovog otkrića će razumeti da životinje koje nisu ljudi ovde opisane mogu biti generisane u odsustvu reporterskog gena ili sa bilo kojim reporterskim genom poznatim u oblasti tehnike.
[0136] Različiti terapeutski geni takođe mogu biti inkapsulirani u mogu biti inkapsulirani u multimernu strukturu koja sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein koji je ovde opisan, npr., kao deo vektora za prenos. Neograničavajući primeri terapeutskog gena uključuju one koji kodiraju toksin (npr. samoubilački gen), terapeutsko antitelo ili njegov fragment, CRISPR/Cas sistem ili njegov(e) deo(e), antisens RNK, siRNK, shRNK, itd.
[0137] Dalje izvođenje prikazanog pronalaska je postupak za dobijanje rekombinantnog AAV kapsidnog proteina, postupak sadrži korake:
a) ekspresije nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni AAV kapsidni protein u pogodnim uslovima, i
b) izolovanja kapsidnog proteina iz koraka a).
[0138] Dalja izvođenja iz prikazanog pronalazaka je postupak za izmenu virusnog tropizma, postupak sadrži korake: (a) insercije nukleinske kiseline koja kodira heterologni epitop u sekvencu nukleinske kiseline koja kodira AAV kapsidni protein da se obrazuje nukelotidna sekvenca koja kodira genski modifikovni AAV kapsidni protein koji sadrži heterologni epitop i/ili (b) kultivisanje pakovanja ćelija u uslovima koji su dovoljni za proizvodnju vektora AAV, pri čemu pakovanje ćelija sadrži nukleotidnu sekvencu. Dalje izvođenje iz predmetnog pronalaska je postupak za ispoljavanje heterolognog epitopa na površini AAV kapsidnog proteina, postupak sadrži korake: a) ekspresije nukleinske kiseline prema ovom pronalasku pod pogodnim uslovima, i b) izolovanje eksprimiranog AAV kapsidnog proteina iz koraka a).
[0139] U nekim izvođenjima, pakovanje ćelija dalje sadrži pomoćnički plazmid i/ili plazmid za transfer koji sadrži nukleotid od interesa. U nekim izvođenjima, postupci dalje sadrže izolovanje samokomplementarnih adeno-povezanih virusnih vektora iz supernatanta kulture. U nekim izvođenjima, postupci dalje sadrže liziranje pakovanja ćelija i izolaciju jednolančanih adeno-povezanih virusnih vektora iz ćelijskog lizata. U nekim izvođenjima, postupci dalje sadrže (a) čišćenje ćelijskog debrisa, (b) tretiranje supernatanta koji sadrži AAV vektore sa DNazom I i MgCl2, (c) koncentrovanje virusnih vektora, (d) prečišćavanje virusnih vektora, i (e) bilo koja kombinacija (a)-(d).
[0140] Pakovanja ćelija koja su korisna za proizvodnju ovde opisanih AAV vektora uključuju, npr., ćelije životinja koje su permisivne za virus, ili ćelije modifikovane da budu permisivne za virus; ili konstrukt ćelije za pakovanje, na primer, sa upotrebom agensa za transformaciju kao što je kalcijum fosfat. Neograničavajući primeri ćelijskih linija za pakovanje koje su korisne za proizvodnju vektora AAV koji su ovde opisani uključuju, npr., ćelije humanog embrionalnog bubrega 293 (HEK-293) (npr., American Type Culture Collection [ATCC] Br. CRL-1573), HEK-293 ćelije koje sadrže SV40 veliki T-antigen (HEK-293T ili 293T), HEK293T/17 ćelije, ćelijsku liniju humanog sarkoma HT-1080 (CCL-121), ćelijsku liniju sličnu limfoblastu Raj i (CCL-86), epitelna ćelijska linija glioblastom-astrocitoma U87-MG (HTB-14), ćelijska linija T-limfoma HuT78 (TIB-161), NIH/3T3 ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) (npr., ATCC Br-i. CRL9618, CCL61, CRL9096), HeLa ćelije (npr., ATCC Br. CCL-2), Vero ćelije, NIH 3T3 ćelije (npr., ATCC Br. CRL-1658), Huh-7 ćelije, BHK ćelije (npr., ATCC Br. CCL10), PC12 ćelije (ATCC Br. CRL1721), COS ćelije, COS-7 ćelije (ATCC Br. CRL1651), RATI ćelije, mišje L ćelije (ATCC Br. CCLI.3), HLHepG2 ćelije, CAP ćelije, CAP-T ćelije, i slično.
[0141] L929 ćelije, FLY virusni sistem za pakovanje ćelija opisan u Cosset et al (1995) J Virol 69,7430-7436, NS0 ćelije (mišjeg mijeloma), humane amniocitne ćelije (npr., CAP, CAP-T), ćelije kvasca (uključujući, ali bez ograničenja na, S. cerevisiae, Pichia pastoris), biljne ćelije (uključujući, ali bez ograničenja na, Tobacco NT1, BY-2), ćelije insekata (uključujući ali bez ograničenja na SF9, S2, SF21, Tni (npr. High 5)) ili bakterijske ćelije (uključujući, ali bez ograničenja na, E. coli).
[0142] Za dodatne ćelije i sisteme za pakovanje, tehnike pakovanja i vektori za pakovanje genoma nukleinske kiseline u pseudotipovani virusni vektor vidi, na primer, Polo, et al, Proc Natl Acad Sci USA, (1999) 96:4598-4603. Postupci za pakovanje uključuju korišćenje ćelija za pakovanje koje trajno eksprimiraju virusne komponente, ili prolaznu transfekciju ćelija sa plazmidima.
[0143] Dalja izvođenja uključuju postupke za preusmeravanje AAV virusa i/ili isporuku reporterskog ili terapijskog gena u ciljnu ćeliju, postupak obuhvata postupak za transdukciju ćelija in vitro, postupak se sastoji iz koraka: dovođenja u kontakt ciljne ćelije sa kombinacijom vektora AAV koji sadrži kapsid koji sadrži rekombinantni AAV kapsid koji ispoljava heterologni epitop i multispecifični vezujući molekul, pri čemu multispecifični vezujući molekul sadrži (i) paratop antitela koji specifično veže epitope i (ii) ligand za retargetiranje koji specifično veže receptor koji je eksprimiran od strane ciljne ćelije. U nekim izvođenjima, ovde opisana kompozicija sadrži, ili ovde opisani postupak kombinuje, rekombinantni AAV vektor i multispecifični vezujući molekul u odnosu molekula koji uspostavlja efikasnost transdukcije AAV vektora sličnu kod divljeg tipa kontrolnog AAV vektora. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je u opsegu od 1:0.5 do 1:100. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je u opsegu od 1:4 do 1:20. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je u opsegu od 1:8 do 1:15. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je 1:4. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je 1:8. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je 1:15. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema mulitispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je 1:20. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je manji od 1:100. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je manji od 1:50. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je manji od 1:20. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je manji od 1:15. U nekim izvođenjima, odnos rekombinantnog AAV vektora prema multispecifičnom vezujućem molekulu (molekul:molekul) je manji od 1:10.
[0144] U nekim izvođenjima, ciljna ćelija je in vitro. U drugim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u in vivo postupku za lečenje ili dijagnozu, postupak sadrži isporuku nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju koja eksprimira protein ćelijske površine koji obuhvata dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa kompozicijom. Stoga, u takvim izvođenjima ciljna ćelija je in vivo u subjektu, npr., čoveku.
Ciljane ćelije
[0145] Širok spektar ćelija može biti ciljan da bi se isporučio nukleotid od interesa korišćenjem rekombinantnog AAV vektora kao što je ovde prikazano. Ciljne ćelije će se generalno birati na osnovu nukleotida od interesa i željenog efekta.
[0146] U nekim izvođenjima, nukleotid od interesa se može isporučiti da se omogući ciljnoj ćeliji da proizvede protein koji nadoknađuje nedostatak u organizmu, kao što je enzimski nedostatak, ili imunološka deficijencija, kao što je teška kombinovana imunodeficijencija povezana sa X. Prema tome, u nekim izvođenjima, ciljane su ćelije koje bi normalno proizvodile protein u životinjama. U drugim izvođenjima, ćelije u oblasti u kojoj bi protein bio najkorisniji su ciljane.
[0147] U drugim izvođenjima, nukleotid od interesa, kao što je gen koji kodira siRNK, može inhibirati ekspresiju određenog gena u ciljnoj ćeliji. Nukleotid od interesa može, na primer, inhibirati ekspresiju gena koji je uključen u životni ciklus patogena. Prema tome, ćelije podložne infekciji patogenom ili inficirani patogenom mogu biti ciljane. U drugim izvođenjima, nukleotid od interesa mogu inhibirati ekspresiju gena koji je odgovoran za proizvodnju toksina u ciljnoj ćeliji.
[0148] U drugim izvođenjima nukleotid od interesa može kodirati toksični protein koji ubija ćelije u kojima je eksprimiran. U tom slučaju, tumorske ćelije ili druge neželjene ćelije mogu biti ciljane.
[0149] U još drugim izvođenjima nukleotid od interesa koji kodira protein koji treba da se prikupi, kao što je terapeutski protein može se koristiti i ciljaju se ćelije koje su u stanju da proizvode i luče protein.
[0150] Kada se identifikuje određena populacija ciljnih ćelija u kojoj je poželjna ekspresija nukleotida od interesa, bira se ciljni receptor koji je specifično eksprimiran na toj populaciji ciljnih ćelija. Ciljni receptor može biti eksprimiran isključivo na toj populaciji ćelija ili u većoj meri na toj populaciji ćelija nego na drugim populacijama ćelijam. Što je ekspresija specifičnija, specifičnija isporuka može biti usmerena na ciljne ćelije. U zavisnosti od konteksta, željena količina specifičnosti markera (i prema tome genske isporuke) se može razlikovati. Na primer, za uvođenje toksičnog gena, visoka specifičnost je najpoželjnija da bi se izbeglo ubijanje neciljanih ćelija. Za ekspresiju proteina za sakupljanje, ili ekspresiju izlučenog proizvoda gde je poželjan globalni uticaj, može biti potrebna manja specifičnost markera.
[0151] Kao što je gore razmotreno, ciljni receptor može biti bilo koji receptor za koji se ligand za retargetiranje može identifikovati ili kreirati. Poželjno ciljni receptor je peptid ili polipeptid, kao što je receptor. Međutim, u drugim izvođenjima ciljni receptor može biti ugljeni hidrat ili drugi molekul koji može prepoznati vezujući partner. Ukoliko je vezujući partner, npr., ligand, ciljnog receptora već poznat, može se koristiti kao afinitetni molekul. Međutim, ukoliko vezujući molekul nije poznat, antitela na ciljni receptor se mogu generisati korišćenjem standardnih postupaka. Antitela se nakon togа mogu koristiti kao ligandi za retargetiranje kao deo multispecifičnog vezujućeg molekula.
[0152] Prema tome, ciljne ćelije mogu da se izaberu na osnovu različitih faktora, uključujući, na primer, (1) određenu primenu (npr., terapiju, ekspresiju proteina koji se skuplja, i pružanje otpornosti na bolest) i (2) ekspresiju markera sa željenom količinom specifičnosti.
[0153] Ciljne ćelije nisu ograničene na bilo koji način i sadrže i germinativne ćelije i ćelijske linije i somatske ćelije i ćelijske linije. Ciljne ćelije mogu biti matične ćelije izvedene iz bilo kojeg porekla. Gde su ciljne ćelije germinative ćelije, ciljne ćelije su poželjno odabrane iz grupe koja se sastoji iz jednoćelijskih embriona i embrionalnih matičnih ćelija (ES).
Farmaceutske kompozicije, dozni oblici i primena
[0154] Dalje izvođenje obezbeđuje lek koji sadrži bar jedan rekombinantni AAV kapsidni protein i odgovarajući multispecifični vezujući molekul prema ovom pronalasku i/ili nukelinsku kiselinu prema ovom pronalasku, poželjno bar jednu strukturu multimera prema ovom pronalasku. Poželjno takav lek je koristan kao vektor genskog transfera.
[0155] Ovde su takođe prikazane farmaceutske kompozicije koje sadrže ovde opisane AAV vektore i farmaceutski prihvatljivi nosač i/ili ekscipijens. Dodatno, ovde su prokazani farmaceutski dozni oblici koji sadrže ovde opisani AAV vektor.
[0156] Kao što se ovde razmatra, ovde opisani AAV vektori se mogu koristiti za različite terapijske primene (in vivo i ex vivo) i kao istraživački alati.
[0157] Farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu biti formulisane na bilo koji konvencionalni način korišćenjem jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača i/ili ekscipijenasa. AAV vektor može se formulisati za primenu, na primer, injekcijom, inhalacijom ili izolacijom (ili kroz usta ili nos) ili oralnom, bukalnom, parentalnom ili rektalnom primenom, ili direktnom primenom u tumor.
[0158] Farmaceutske kompozicije se mogu formulisati za različite načine primene, uključujući sistemsku, lokalnu ili lokalizovanu primenu. Tehnike i formulacije se mogu pronaći u, na primer, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. Za sistemsku primenu, poželjna je injekcija, koja obuhvata intramuskularnu, intravenznu, intraperitonealnu, i subkutanoznu. Za svrhe injekcije, farmaceutske kompozicije se mogu formulisati u tečnim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima, kao što je Henkov rastvor ili Ringerov rastvor. Dodatno, farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane u čvrstom obliku i ponovo rastvorene ili suspendovane neposredno pre upotrebe. Takođe su pogodni liofilizovani oblici farmaceutske kompozicije.
[0159] Za oralnu primenu, farmaceutske kompozicije mogu biti oblika, na primer, tableta ili kapsula koje su pripremljene konvencionalnim načinima sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima kao što su sredstva za vezivanje (npr. preželatinizovani kukuruzni skrob, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilceluloza); sredstva za punjenje (npr. laktoza, mikrokristalna celuloza ili kalcijum hidrogen fosfat); sredstva za vlaženje (npr. magnezijum stearat, talk ili silicijum dioksid); dezintegranti (npr. krompirov skrob ili natrijum skrob glikolat); ili sredstva za vlaženje (npr. natrijum lauril sulfat). Tablete mogu takođe biti obložene postupcima koji su poznati u oblasti tehnike. Tečni preparati za oralnu primenu mogu imati oblik, na primer, rastvora, sirupa ili suspenzija, ili mogu biti predstavljeni kao suvi proizvod za konstituciju sa vodom ili drugim pogodnim nosačem pre upotrebe. Takvi tečni preparati se mogu pripremiti na konvencionalne načine sa farmaceutski prihvatljivim aditivima kao što su agensi za suspendovanje (npr. sorbitol sirup, derivati celuloze ili hidrogenizovane jestive masti); sredstva za emulgovanje (npr. lecitin ili akacija); nevodeni nosači (npr. bademovo ulje, uljni estri, etilalkohol ili frakcionisana biljna ulja); i konzervansi (npr. metil ili propil-p-hidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparati mogu takođe da sadrže puferske soli, arome, boje i zaslađivače po potrebi.
[0160] Farmaceutske kompozicije mogu se formulisati za parenteralnu primenu injekcijom, npr. bolus injekcijom ili kontinuirana infuzija. Formulacije za injekciju može biti predstavljen u obliku jedinične doze, npr. u ampulama ili multi-doznim kontejnerima, sa opciono dodatim konzervansima. Farmaceutske kompozicije mogu dalje biti formulisane kao suspenzije, rastvore ili emulzija u uljanim ili vodenim nosačima, i može sadržati druga sredstva uključujući sredstva za suspenziju, stabilizaciju i/ili dispergovanje.
[0161] Dodatno, farmaceutske kompozicije se mogu takođe formulisati kao depo preparati. Ove formulacije dugog dejstva se mogu primeniti implantacijom (npr. subkutanozno ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Prema tome, na primer, jedinjenja se mogu formulisati sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim materijalima (npr. kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili jonoizmenjivačkim smolama, ili kao slabo rastvorljivi derivati, na primer, kao slabo rastvorljiva so. Drugi pogodni sistemi za isporuku obuhvataju mikrosfere, koje nude mogućnost lokalne neinvazivne isporuke lekova tokom produženih vremenskih perioda. Ova tehnologija može obuhvatiti mikrosfere koje imaju prekapilarnu veličinu, koje se mogu ubrizgati preko koronarnog katetera u bilo koji odabrani deo organa bez izazivanja inflamacije ili ishemije. Primenjeni terapeutik se nakon toga sporo oslobađa iz mikrosfera i apsorbuje u okolnim ćelijama koje se nalaze u odabranom tkivu.
[0162] Sistemska primena može takođe biti transmukoznim ili transdermalnim putem. Za transmukoznu ili transdermalnu primenu, u formulaciji se koriste penetranti koji su odgovarajući za barijeru koja se prožima. Takvi penetranti su generalno poznati u oblasti tehnike, i uključuju, na primer, za transmukoznu primenu, žučne soli, i derivate fuzidinske kiseline. Dodatno, deterdženti se mogu koristiti za olakšavanje prodiranja. Transmukozna primena se može desiti korišćenjem nazalnih sprejeva ili supozitorija. Za lokalnu primenu, ovde opisan AAV vektor može biti formulisan u masti, meleme, gelove ili kreme kao što je opšte poznato u tehnici. Rastvor za pranje se takođe može koristiti lokalno za lečenje povrede ili inflamacije kako bi se ubrzalo zarastanje.
[0163] Farmaceutski oblici pogodni za injekcionu upotrebu mogu uključivati sterilne vodene rastvore ili disperzije; formulacije uključujući susamovo ulje, ulje od kikirikija ili vodeni rastvor propilen glikola; i sterilni praškovi za ekstempornu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija za injekcije. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i mora biti tečan. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i određenim parametrima skladištenja (npr. hlađenje i zamrzavanje) i mora biti zaštićen od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice.
[0164] Ako se formulacije koje su ovde otkrivene koriste kao terapeutici za jačanje imunološkog odgovora kod subjekta, terapeutski agens se može formulisati u kompoziciju u neutralnom obliku ili obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kisele adicione soli (formirane sa slobodnim amino grupama proteina) i koje se formiraju sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonične ili fosforne kiseline, ili organskim kiselinama kao što su sirćetna, oksalna, vinska, bademova kiselina, i slično. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu takođe biti izvedene iz neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe (II) hidroksidi, i takvih organskih baza kao što su izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slično.
[0165] Nosač takođe može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično), njihove pogodne smeše i biljna ulja. Odgovarajuća tečnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine virusnog vektora u slučaju disperzije i upotrebom površinskih aktivnih sredstava. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može biti izazvano raznim antibakterijskim i antifungalnim agensima poznatim u tehnici. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicija za injektiranje može se postići upotrebom u kompozicijama sredstava koja odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearat i želatin.
[0166] Sterilni rastvori za injekcije se mogu pripremiti ugrađivanjem aktivnih jedinjenja ili konstrukata u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa raznim drugim sastojcima koji su gore nabrojani, prema potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija.
[0167] Nakon formulacije, rastvori se mogu davati na način koji je kompatibilan sa formulacijom doze i u količini koja je terapeutski efikasna. Formulacije se lako primenjuju u različitim doznim oblicima, kao što je tip rastvora za injektiranje opisan gore, ali se takođe mogu koristiti kapsule sa sporim oslobađanjem ili mikročestice i mikrosfere i slično.
[0168] Za parenteralnu primenu u vodenom rastvoru, na primer, rastvor treba da bude odgovarajuće puferovan ako je potrebno, a tečni razblaživač prvo treba da se učini izotoničnim sa dovoljno fiziološkog rastvora ili glukoze. Ovi posebni vodeni rastvori su posebno pogodni za intravensku, intratumoralnu, intramuskularnu, subkutanu i intraperitonealnu primenu. U ovom kontekstu, sterilni vodeni medijumi koji se mogu koristiti biće poznati stručnjacima u ovoj oblasti u svetlu ovog otkrića. Na primer, jedna doza se može rastvoriti u 1 ml izotoničnog rastvora NaCl i dodati u 1000 ml tečnosti za hipodermoklizu ili ubrizgati na predloženo mesto infuzije.
[0169] Osoba odgovorna za primenu će, u svakom slučaju, odrediti odgovarajuću dozu za pojedinačnog subjekta. Na primer, subjektu se mogu davati AAV vektori koji su ovde opisani na dnevnoj ili nedeljnoj bazi tokom vremenskog perioda ili na mesečnoj, dvogodišnjoj ili godišnjoj osnovi u zavisnosti od potrebe ili izloženosti patogenom organizmu ili stanju kod subjekta (npr. kancer).
[0170] Pored jedinjenja koja su formulisana za parenteralno davanje, kao što je intravenoznim, intratumoralnim, intradermalnim ili intramuskularnim ubrizgavanjem, drugi farmaceutski prihvatljivi oblici uključuju, npr., tablete ili druge čvrste supstance za oralno davanje; lipozomalne formulacije; capsule sa vremenom oslobađanja; biodegradabilni i bilo koji drugi oblik koji se trenutno koristi.
[0171] Takođe se mogu koristiti intranazalni ili inhalacioni rastvori ili sprejevi, aerosoli ili inhalanti. Nazalni rastvori mogu biti vodeni rastvori dizajnirani da se daju u nazalne prolaze u kapima ili sprejevima. Nazalni rastvori se mogu pripremiti tako da su po mnogo čemu slični nazalnim sekretima. Prema tome, vodeni nazalni rastvori su obično izotonični i malo puferovani da bi se pH održala od 5.5 do 7.5. Dodatno, antimikrobni konzervansi, slični onlima koji se koriste u oftamološkim preparatima, i odgovarajući stabilizatori leka, ako je potrebno, mogu biti uključeni u formulaciju. Poznati su različiti komercijalni nazalni preparati i mogu uključiti, na primer, antibiotike i antihistaminike i koriste se za profilaksu astme.
[0172] Oralne formulacije mogu uključivati ekscipijense kao što su, na primer, manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat i slično. Ove kompozicije imaju oblik rastvora, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, formulacija sa produženim oslobađanjem ili prahova. U određenim definisanim izvođenjijma, oralne farmaceutske kompozicije će uključivati inertni razblaživač ili jestivi nosač koji se može asimilirati, ili mogu biti zatvorene u želatinske kapsule sa tvrdim ili mekim omotačem, ili mogu biti komprimovane u tablete, ili mogu biti ugrađene direktno u dijetetsku ishranu. Za oralnu terapijsku primenu, aktivna jedinjenja mogu biti ugrađena sa ekscipijentima i korišćena u obliku tableta za gutanje, bukalnih tableta, pastila, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, disk i slično.
[0173] Tablete, pastile, pilule, kapsule i slično mogu takođe da sadrže sledeće: vezivo, kao tragakant gume, bagrem, kukuruzni skrob ili želatin; ekscipijenti, kao što je dikalcijum fosfat; sredstvo za dezintegraciju, kao što je kukuruzni skrob, krompirov skrob, alginska kiselina i slično; lubrikant, kao što je magnezijum stearat; i može se dodati zaslađivač, kao što je saharoza, laktoza ili saharin ili aroma, kao što je pepermint, ulje zimzelena ili aroma trešnje. Kada je jedinični oblik doze kapsula, ona može sadržati, pored materijala gore navedenog tipa, tečni nosač. Različiti drugi materijali mogu biti prisutni kao obloge ili na drugi način modifikovati fizički oblik jedinice doze. Na primer, tablete, pilule ili kapsule mogu biti obložene šelakom, šećerom ili oboje. Sirup eliksira može da sadrži aktivna jedinjenja saharozu kao zaslađivač metil i propilparabene kao konzervanse, boju i aromu, kao što je aroma trešnje ili pomorandže.
[0174] Dalja izvođenja koje su ovde otkrivena mogu se odnositi na kitove za upotrebu sa postupcima i kompozicijama. Kitovi takođe mogu uključivati odgovarajući kontejner, na primer, bočice, epruvete, mini ili mikrofuge epruvete, epruvete, bocu, flašu, špric ili drugu posudu. Kada je obezbeđena dodatna komponenta ili agens, komplet može da sadrži jedan ili više dodatnih kontejnera u koje se ovaj agens ili komponenta mogu staviti. Kitovi će ovde takođe tipično uključivati sredstva za držanje AAV vektora i bilo kojih drugih kontejnera reagensa u zatvorenom prostoru za komercijalnu prodaju. Takvi kontejneri mogu uključivati plastične posude za injekcije ili duvanjem u koje se zadržavaju željene bočice. Opciono, jedan ili više dodatnih aktivnih agenasa kao što su, na primer, antiinflamatorni agensi, antivirusni agensi, antifungalni ili antibakterijski agensi ili antitumorski agensi mogu biti potrebni za opisane kompozicije.
[0175] Opseg doza i učestalost primene mogu da se razlikuju u zavisnosti od prirode AAV vektora i zdravstvenog stanja, kao i parametara specifičnog pacijenta i korišćenog puta primene. U nekim izvođenjima, AAV vektorske kompozicije se mogu davati subjektu u dozi koja se kreće od oko 1X10<5>jedinica koje formiraju plak (pfu) do oko 1X10<15>pfu, u zavisnosti od načina primene, načina primene, prirode bolesti i stanja predmet. U nekim slučajevima, kompozicije vektora AAV mogu se davati u dozi u rasponu od oko 1X10<8>pfu do oko 1X10<15>pfu, ili od oko 1X10<10>pfu do oko 1X10<15>pfu, ili od oko 1X10<8>pfu do oko 1X10<12>pfu. Preciznija doza takođe može zavisiti od subjekta kome se primenjuje. Na primer, može biti potrebna niža doza ako je subjekat maloletnik, a veća doza može biti potrebna ako je subjekt odrasli čovek. U određenim izvođenjima, tačnija doza može zavisiti od težine subjekta. U određenim izvođenjima, na primer, maloletni čovek može da primi od oko 1X10<8>pfu do oko 1X10<10>pfu, dok odrasli humani subjekt može da primi dozu od oko 1X10<10>pfu do oko 1X10<12>pfu.
[0176] Kompozicije koje su ovde otkrivene mogu se davati na bilo koji način poznat u tehnici. Na primer, kompozicije mogu uključivati davanje subjektu intravenozno, intratumoralno, intradermalno, intraarterijsko, intraperitonealno, intralesionalno, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatično, intratrahealno, intranazalno, intramušalno, intravaginalno, intramuskularno hrabro, subkutano, subkonjunktivalno, intra-vezikularno, mukozno, intraperikardijalno, intraumbilikalno, intraokularno, oralno, lokalno, inhalacijom, injekcijom, infuzijom, kontinuiranom infuzijom, lokalizovanom perfuzijom, putem katetera, ispiranjem, u kremi, ili u lipidnoj kompoziciji.
[0177] Bilo koji postupak poznat stručnjaku može se koristiti za proizvodnju AAV vektora, ćelija za pakovanje i konstrukta vektora koji su ovde opisani u velikim razmerama. Na primer, glavne i radne zalihe semena mogu biti pripremljene pod uslovima GMP u kvalifikovanim primarnim CEF-ovima ili drugim metodama. Ćelije za pakovanje mogu biti postavljene na boce velike površine, uzgajane do skoro konfluencije i AAV vektori prečišćeni. Ćelije mogu biti sakupljene i AAV vektori pušteni u medijum kulture izolovani i prečišćeni, ili intracelularni AAV vektori oslobođeni mehaničkim poremećajem (ćelijski ostaci mogu biti uklonjeni filtracijom u velikim porama i DNK ćelija domaćina digestirana endonukleazom). Virusni AAV vektori se mogu naknadno prečistiti i koncentrisati filtracijom tangencijalnog protoka, nakon čega sledi dijafiltracija. Dobijena koncentrovana masa se može formulisati razblaženjem puferom koji sadrži stabilizatore, napuniti u bočice i liofilizovati. Kompozicije i formulacije mogu se čuvati za kasniju upotrebu. Za upotrebu, liofilizovani AAV vektori se mogu rekonstituisati dodavanjem razblaživača.
[0178] Određena dodatna sredstva korišćena u kombinovanim terapijama mogu se formulisati i primeniti na bilo koji način poznat u oblasti tehnike.
[0179] Kompozicije kao što su ovde prikazane mogu takođe sadržati adjuvanse kao što su soli aluminijuma i drugi mineralni adjuvansi, tenzoaktivna sredstva, bakterijski derivativi, nosači i citokini. Adjuvansi takođe mogu imati antagonizirajuća imunomodulaciona svojstva. Na primer, adjuvansi mogu stimulisati imunitet Th1 ili Th2 imunitet. Kompozicije i postupci kao što su ovde prikazani mogu takođe uključiti adjuvansnu terapiju.
PRIMER
[0180] Sledeći primeri su dati samo u illustrative svrhe i nisu namenjeni da ograniče obim pronalaska. Primer 1: Proizvodnja Adeno-povezanih virusnih vektora sa heterolognim epitopom
[0181] AAV kapsidni proteini su modifikovani da sadrže jedan od nekoliko heterolognih epitopa: FLAG, c-myc, heksahistidin, itd. korišćenjem PCR-a za generisanje plazmida koji kodira rekombinantni kapsidni protein. Ukratko, sekvenca koja kodira FLAG, c-myc ili heksahistidin je umetnuta u okvir posle kodona koji kodira N587 AAV2 kapsidnog proteina, Q585 AAV6 VP1 kapsidnog proteina, N590 AAV8 VP1 kapsidnog proteina, A589 AAV9 VP1 kapsidnog proteina ili G453 kapsidnog proteina AAV9 VP1.
[0182] Proizvodnja virusa povezana sa adeno se vrši postupkom trostruke transfekcije sa ćelijama HEK293 (videti, na primer, Erik Arden i Joseph M. Metzger, J Biol Methods. 2016; 3(2)). Ćelije su zasejane jedan dan pre PEFpro (Poliplus transfekcija, Njujork, NY) posredovane transfekcije odgovarajućim vektorima:
pomoćnički plazmid, pHelper (Agilent, Kat #240074);
Plazmid koji kodira divlji tip ili modifikovani AAV rep/kap gen (pAAV RC2 (Cell biolabs, Kat# VPK-422), npr., pAAV RC2/6/9 (Cell Biolabs, Kat# VPK-426), pAAV RC8, pAAV RC2-N587myc, pAAV RC2/6-Q585myc, pAAVRC8-N590myc, pAAV RC9-A589myc, itd.; i
plazmid koji kodira nukleotid od interesa i AAV ITR sekvence, npr., pscAAV-CMV-eGFP, pAAV-CMVGFP (Agilent Kat# 240074), pAA V-EF1a-eGFP ili pAAV-CAGG-eGFP, itd.
[0183] Sedamdeset dva sata nakon transfekcije, sakupi se medijum i ćelije se liziraju u puferu [50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl i 0,5% natrijum deoksiholata (Sigma, Kat# D6750-100G)]. Zatim, benzonaza (Sigma, St. Louis, MO) se dodaje medijumu i ćelijskom lizatu do konačne koncentracije od 0,5 U/µl pre inkubacije na 37 °C tokom 60 minuta. Ćelijski lizat se centrifugira na 4000 obrtaja u minuti tokom 30 minuta. Ćelijski lizat i medijum se kombinuju zajedno i precipitiraju sa PEG 8000 (Teknova Kat# P4340) u konačnoj koncentraciji od 8%. Pelet je resuspendovan u 400 mM NaCl i centrifugiran na 10000 g tokom 10 minuta. Virusi u supernatantu se peletiraju ultracentrifugiranjem na 149.000 g tokom 3 sata i titriraju pomoću qPCR.
[0184] Za qPCR titiranje AAV genoma, AAV uzorci se tretiraju sa DNazomI (Thermofisher Scientific, Kat #EN0525) na 37°C tokom jednog sata i liziraju se korišćenjem svih reagenasa DNK ekstrakta (Thermofisher Scientific Kat# 4403319). Inkapsulirani virusni genomi su kvantifikovani korišćenjem QuantStudio 3 Real-Time PCR Sistema (Thermofisher Scientific) korišćenjem prajmera usmerenih na AAV2 ITRs. Sekvence AAV2 ITRs prajmera su 5’-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3’ (fwd ITR; SEQ ID NO:9) i 5’-CGGCCTCAGTGAGCGA-3’ (rev ITR; SEQ ID NO:10) (Aurnhammer et al., 2012), izvodi sekvencu levog unutrašnjeg invertovanog ponavljanja (ITR) iz AAV i desnu sekvencu unutrašnjeg invertovanog ponavljanja (ITR) iz AAV, redom. Sekvenca AAV2 ITRs sonde je 5’-6-FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG¬TAMRA-3’ (SEQ ID NO:11) (Aurnhammer C., Haase M., Muether N., et al., 2012, Hum. Gene Ther. Methods 23, 18-28). Posle koraka aktivacije na 95°C od 10 min, PCR ciklus u dva koraka se izvodi na 95°C tokom 15 sekundi i 60°C tokom 30 sekundi za 40 ciklusa. TaqMan Universal PCR Master Miks (Thermofisher Scientific, Kat #4304437) je korišćen u qPCR. DNK plazmid (Agilent, Kat #240074) se koristi kao standard da bi se odredili apsolutni titri.
[0185] Adeno-asocirani virusni vektori koji sadrže kapsid u kome je proizveden c-myc epitop. U ovom primeru, c-myc epitop (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:6) je bio umetnut između aminokiselina N587 i R588 kapsidnog proteina AAV2 VP1 ili između aminokiselina A589 i K590 kapsidnog proteina AAV9 VP1, tj. nukleotidna sekvenca koja kodira c-myc epitop (GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG; SEQ ID NO:12) je umetnuta u plazmid pAAV RC2 (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA) ili plazmid pAAV RC2/ 9, i svaki od odgovarajućih modifikovanih pAAV RC2-N587Myc pAAV RC9-A589Myc plazmida je korišćen da kodira modifikovani kapsidni protein za AAV virusne vektore sa smanjenim ili ukinutim tropizmom.
[0186] Da bi se stvorio pAAV RC2-N587Myc, prvi proizvod lančane reakcije polimeraze (PCR) koji sadrži (od 5' do 3') restrikciono mesto BsiW1, nukleotidnu sekvencu između pozicija 3050 i 3773 pAAV RC2, i nukleotidne sekvence lepljivih krajeva c-myc epitopa, i drugi PCR proizvod koji sadrži (od 5' do 3') nukleotidne sekvence lepljivih krajeva c-myc epitopa, nukleotidnu sekvencu između pozicija 3774 do 4370 pAAV RC2 i Pme1 restrikciono mesto stvoreni su korišćenjem prajmera navedenih u Tabeli 2. plazmid pAAV RC2-N587Myc (tj. plazmid pAAV RC2 modifikovan da kodira c-myc epitop između aminokiselina N587 i R588 kapsidnog proteina VP1) dobijen je digestijom pAAV RC2 sa BsiW3lab5, New England Biolabs) i Pme1 (New England Biolabs, R0560L), i umetanje dva PCR proizvoda putem kloniranja nezavisnog od ligacije kao što je opisano u (2012) Methods Mol. Biol.52:51-9.
[0187] Za kreiranje pAAV RC2/6-Q585Myc, gblock DNK fragment koji sadrži pozicije 3700 i 3940 pAAV RC2/6 sa sekvencom c-myc-epitopa umetnutom između 3757 i 3758 naručen je od Integrated DNK Technologies (Coralville, Io). plazmid pAAV RC2/6-Q585Myc je kreiran umetanjem gblock fragmenta u pAAV RC2/6 digestiran sa MscI (Nev England Biolabs, Kat# R0534L) i AflII (Nev England Biolabs, Cat #R0520L) putem kloniranja nezavisnog od ligacije kao što je opisano u (2012) Methods Mol. Biol.
52:51-9.
[0188] Da bi se stvorio pAAV RC9-A589Myc, prvi proizvod lančane reakcije polimeraze (PCR) koji sadrži (od 5' do 3') restrikciono mesto BsiW1, nukleotidnu sekvencu između pozicija 3052 i 3779 pAAV RC9, i nukleotidnu sekvencu lepljivih krajeva c-myc epitopa, i drugi PCR proizvod koji sadrži (od 5' do 3') nukleotidnu sekvencu lepljivih krajeva c-myc epitopa, nukleotidnu sekvencu između pozicija 3779 do 4404 pAAV RC9 i Pme1 restrikciono mesto du dobijeni korišćenjem prajmera navedenih u Tabeli 2.
[0189] Plazmid pAAV RC9-A589Myc (tj. plazmid pAAV RC2/9 modifikovan da kodira c-myc epitop između aminokiselina A589 i K590 kapsidnog proteina VP1) dobijen je digestijom pAAV RC9 sa BsiW1 (Nova Engleska Biolabs, R0555) i Pme1 (Nova Engleska Biolabs, R0560L), i umetanjem dva PCR proizvoda putem kloniranja nezavisnog od ligacije kao što je opisano u (2012) Methods Mol. Biol.
52:51-9.
Tabela 2
(nastavak)
[0190] pscAAV-CMV-eGFP je proizveden uvođenjem GFP fragmenta u pscAAV MCS vektor (Cell Biolabs, Kat# VPK-430) korišćenjem BamHI i NotI restrikcionog mesta. plazmid pAAV-EF1a-eGFP i pAAV-CAGG-eGFP napravljen je de novo sintezom od Thermofisher Scientific (Waltham, MA).
Primer 2: Retargetiranje AAV virusnih vektora in vitro posredovano antitelom
[0191] HepG2 je ćelijska linija humanog karcinoma jetre, koja eksprimira marker specifičan za jetru asijaloglikoproteinski receptor 1 (ASGR1). Da bi se testiralo da li scAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP virusni vektori mogu da inficiraju HepG2 ćelije, na primer, preko bispecifičnog antitela koje prepoznaje i cmyc i ASGR1 (anti-myc-ASGR1 antitelo), mešavine koje sadrže različite odnose broja virusnih genoma (5e9 virusni genomi) na broj molekula antitela (1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20, 1:50 ili 1:100) scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP i bispecifično anti-myc-ASGR1 antitelo su inkubirani na sobnoj temperaturi pola sata, a zatim dodati u HepG2 ćelije. HepG2 ćelije su takođe inkubirane samo sa samo virusnim vektorima divljeg tipa scAAV2-CMV-eGFP, samo scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusnim vektorima ili scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusnim vektorima sa monospecifičnim anti-myc antitelom, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) u odnosu 1:8 kao kontrole. Tri dana nakon infekcije, ekspresija GFP-a u inficiranim HepG2 ćelijama je potvrđena sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) (Slika 1). Ekspresija GFP je takođe otkrivena u uporedivom procentu HepG2 ćelija kada su inkubirane sa divljim tipom scAAV2-CMV-eGFP i kada su inkubirane sa scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusnim vektorima i bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelom u odnosu 1:8 (44,6% i 44,1%, redom, Slike 1A i 1G, gornji i donji paneli). Niža ekspresija GFP je otkrivena pomoću FACS u HepG2 ćelijama inkubiranim sa mešavinom scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusnih vektora i višeg ili nižeg bispecifičnog anti-myc-ASGR1 antitela (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) (Slika 1C, donji panel). Pored toga, GFP nije otkriven u HepG2 ćelijama inficiranim scAAV-N587Myc-CMV-eGFP u odsustvu anti-myc-ASGR1 antitela, ili u HepG2 ćelijama inkubiranim sa scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP i monospecifičnim anti-myc antitelom.
[0192] Slično, 293T-hASGR1 ćelije, koje su 29T3 ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju humani (h) ASGR1 na površini ćelije, inkubirane su sa mešavinama koje sadrže različite odnose virusnih genoma prema broju molekula antitela (1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20 ili 1:100) scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP i bispecifičnog anti-myc-ASGR1 antitela. Ćelije divljeg tipa 293T (koje ne eksprimiraju hASGR1) inkubirane sa mešavinom scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP i bispecifičnog anti-myc-ASGR1 antitela u odnosu 1:8, i ćelije 293T-hASGR1 inkubirane sa (a) divljim tipom scAAV samo virusni vektori, (b) samo virusni vektori scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP, ili (c) scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusni vektori sa irelevantnim bispecifičnim anti-myc-GCGR antitelom koje prepoznaje c-myc i glukagonski receptor (GCGR) (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) nije eksprimiran u 293T ćelijama u odnosu 1:8, služio je kao kontrola. Tri dana nakon infekcije, 293T-hASGR1 ili 293T ćelije su obojene humanim anti-hASGR1 antitelom (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY), a zatim APC konjugovanim kozjim anti-humanim antitelom (Jackson ImmunoResearch laboratories Inc, Kat# 609 098, West Grove, PA) i ekspresije GFP analizirane od strane FACS. Ekspresija hASGR1 je otkrivena na površini ćelija 293T-hASGR1 (Slike 2Ai-2Ax i 2Axii), ali ne i 293T ćelije (Slika 2Axi). GFP pozitivne 293T-hASGR1 ćelije su otkrivene nakon inkubacije sa scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP i mešavinama bispecifičnih anti-myc-ASGR1 antitela u odnosu 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20 i 1:50 na nivoima (56,9% do 68,3%) uporedivim sa 293T-hASGR1 ćelijama inkubiranim sa divljim tipom scAAV (56,7%) (Slike 2Ai i 2Aiii-2Aix). Odnos scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP i bispecifičnog anti-myc-ASGR1 antitela od 1:100 smanjio je infektivnost (Slika 2Ax). Inkubacija samo sa scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP ili scAAV-N587Myc sa irelevantnim bispecifičnim anti-myc-GCGR antitelom nije rezultirala ekspresijom GFP-a od strane 293T-hASGR1 ćelija (Slike 2Aii i 2Axii).
[0193] U sličnom eksperimentu, 293T-hASGR1 ćelije su inkubirane sa ćelijama inkubiranim samo sa nemodifikovanim AAV9-CAGG-GFP virusnim vektorima, samo AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP virusnim vektorima ili AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP virusnim vektorima pomešanim sa bispecifičnim anti-Myc-ASGR1 antitelima u različitim odnosima. Tri dana nakon infekcije, ekspresija GFP je analizirana pomoću FACS. GFP pozitivne 293T-hASGR1 ćelije su otkrivene nakon inkubacije sa AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP i mešavinama bispecifičnih anti-myc-ASGR1 antitela u odnosu 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:20, 1:50 i 1:100 na nivoima (41,1% do 91%) uporedivim sa 293T-hASGR1 ćelijama inkubiranim sa divljim tipom AAV9-CAGG-eGFP (9,72%) (z i Slike 2B(iii)-(ix). Inkubacija samo sa AAV9-A589Myc-CAGG-eGFP nije rezultirala ekspresijom GFP-a od strane 293T-hASGR1 ćelija (Slika 2B(ii)).
[0194] Testirana je sposobnost bivalentnog anti-hASGR1 antitela (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY) da blokira infekciju 293T-hASGR1 ćelija. 293T-hASGR1 ćelije su inkubirane sa bivalentnim anti-hASGR1 antitelom u različitim koncentracijama tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, a zatim su inkubirane sa smešom koja se sastojala od 1:8 odnosa scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP i bispecifičnog anti-myc-ASGR1 antitela. Tri dana nakon infekcije, ćelije su fiksirane i analizirane pomoću FACS-a kao što je gore opisano. Slika 3 daje podatke koji pokazuju da ulaz scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP može biti blokiran na dozno zavisan način bivalentnim anti-hASGR1 antitelom.
[0195] Da bi se utvrdilo da li sekvencijalna primena bispecifičnog antitela i modifikovanog AAV-a može da dovede do retargetiranja modifikovanog AAV-a posredovanog antitelom, različiti brojevi bispecifičnih molekula anti-myc-ASGR1 antitela (u rasponu od 1x10<9>do 1x10<12>molekula) dodaje se u ćelije 2x10<5>ASGR1 tokom jednog sata, nakon čega je dodato 1x10<9>scAAV-N587Myc virusnih vektora. Kontrole su uključivale (1) 293T-hASGR1 ćelije inkubirane samo sa divljim tipom scAAV, tj., u odsustvu bilo kakvog antitela, (2) 293T-hASGR1 ćelije koje su sekvencijalno inkubirane sa 1x10<11>irelevantnih bispecifičnih anti-myc-GCGR scAAV-1172 antitela CMV-eGFP virusni vektori i (3) 293T ćelije, koje ne eksprimiraju hASGR1, sekvencijalno su inkubirane sa 1x10<11>bispecifičnim molekulima anti-myc-ASGR1 antitela i 1x10<9>scAAV-N587Myc virusnim vektorima. Dva dana nakon infekcije, ekspresija GFP-a od strane inficiranih 293T-hASGR1 ćelija je vizuelizovana mikroskopski (Slika 4). Ekspresija GFP-a od strane 293T-hASGR1 ćelija primećena je nakon inkubacije samo sa divljim tipom scAAV i nakon sekvencijalne inkubacije sa molekulima anti-myc-ASGR1 antitela u svim koncentracijama i scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (Slike 4A, 4C-4I). GFP nije otkriven u 29T3-hASGR1 ćelijama nakon inkubacije samo sa scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP (Slika 4B), u 293T ćelijama koje ne eksprimiraju ASGR1 nakon sekvencijalne inkubacije sa anti-myc-hASGR1 antitelom i scAAV2-cV58 eGFP virusni vektori (Slika 4J), ili u 29T3-hASGR1 ćelijama nakon sekvencijalne inkubacije sa irelevantnim bispecifičnim anti-myc-GCGR antitelom i scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusnim vektorima (Slika 4K).
[0196] Kao što je ovde opisano, tropizam samokomplementarnog AAV (scAAV) može biti (1) inaktiviran, npr. modifikacijom kapsidnog proteina, npr. umetanjem c-myc epitopa, i opciono, (2) retargetiran korišćenjem bispecifičnih antitela, na primer, sa bispecifičnim antitelom koje prepoznaje c-myc epitop i ligand koji je eksprimovan u ciljnoj ćeliji. Da bi se utvrdilo da li tropizam jednolančanog AAV (ssAAV) može biti na sličan način (1) smanjen ili ukinut, i opciono, (2) preusmeren, 293T-hASGR1 ćelije su inkubirane sa ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP virusnim vektorima proizvedenim kako je opisano u Primeru 1 u odsustvu ili prisustvu bispecifičnog anti-myc-hASGR1 antitela u različitim odnosima virusni vektor:antitelo (1:0, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:20, 1: 100 ili 1:1000). Kontrole su uključivale 293T-hASGR1 ćelije inkubirane sa divljim tipom ssAAV, 293T-hASGR1 ćelije inkubirane sa ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP virusnim vektorima i irelevantna bispecifična anti-myc-GCGR antitela u odnosu virusni vektor antitelo 1:8293T ćelije (koji ne eksprimiraju hASGR1) inkubirane sa ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP virusnim vektorima i bispecifičnim anti-myc-hASGR1 antitelom u odnosu virusni vektor:antitelo od 1:8.
Tri dana nakon infekcije, ćelije su fiksirane i ekspresija GFP je otkrivena pomoću FACS (Slika 5). Ekspresija GFP je otkrivena u 293T-hASGR1 ćelijama inkubiranih sa divljim tipom ssAAV, i sa mešavinama ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP virusnih vektora i bispecifičnih anti-myc-ASGR1 antitela u svim odnosima (Slike 5A, 5C-5I). GFP ekspresija nije uočena u 29T3 ćelijama inkubiranim sa ssAAV2-N587Myc-CMV-hrGFP virusnim vektorima i bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelima (Slika 5J), ili sa 293T-hASGR1 ćelijama inkubiranih samo sa ssAAV2-N587-Myc-GFP vektorima, ili sa ssAAV-N587Myc virusnim vektorima i irelevantnim bispecifičnim anti-myc-GCGR bispecifičnim antitelom (Slike 5B, 5K).
[0197] Humani (h) glukagon receptor (GCGR) se normalno ne eksprimira u 293T ćelijama. Međutim, 293T-hGCGR je stabilna 293T ćelijska linija genetički modifikovana da ekspresuje hGCGR na površini ćelije. Da bi se testiralo da li retargetiranje scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusnih vektora može biti posredovano bispecifičnim anti-myc-GCGR antitelom preko hGCGR receptora, 293T-hGCGR ćelije su inkubirane sa različitim smešama koje sadrže različite odnose scAAV2-cGF7-N58:bispecifično antimyc-GCGR antitelo. Virusni vektori scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP su pomešani sa bispecifičnim antimyc-GCGR antitelom u odnosu 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:15, 1:20, 1:50 ili 1:100 na sobnoj temperaturi pola sata pre dodavanja ćelijama 293T-hGCGR. Tri dana nakon infekcije, ekspresija GFP-a u inficiranim 293T-hCGCR ćelijama je potvrđena sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) (Slika 6). Značajan procenat GFP pozitivnih ćelija je otkriven nakon inkubacije sa divljim tipom scAAV (Slika 6A) ili scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP /bispecifičnim anti-myc-GCGR antitelom u odnosu 1:0,5, 1:1, 1:2, 1 :4, 1:8, 1:15, 1:20, 1:50 i 1:100 (Slike 6C-6K). GFP nije detektovan u 293T-hGCGR ćelijama inkubiranim samo sa scAAV2-N587myc-CMV-eGFP virusnim vektorima ili scAAV2-N587Myc-CMV-eGFP virusnim vektorima sa monospecifičnim anti-myc antitelom (Slike 6B i 6L, redom).
[0198] Jurkat je ćelijska linija humane akutne T ćelijske leukemije, koja eksprimira humani (h) CD3. Da bi se testiralo da li retargetiranje AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP virusnih vektora može biti posredovano bispecifičnim anti-myc-CD3 antitelom preko hCD3 receptora, Jurkat ćelije su inkubirane sa različitim smešama koje sadrže različite odnose AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP: anti-myc-CD3 antitelo. AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP virusni vektori su pomešani sa bispecifičnim anti-myc-CD3 antitelom u odnosu 1:1, 1:5, 1:10, 1:100, 1:1000 na sobnoj temperaturi pola sata pre dodavanja Jurkat ćelijama. Tri dana nakon infekcije, ekspresija GFP-a u inficiranim Jurkat ćelijama je potvrđena sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) (Slika 7). Značajan procenat GFP pozitivnih ćelija je otkriven nakon inkubacije sa divljim tipom AAV6-EF1a-eGFP (Slika 7B) ili AAV6-Q585Myc-EFla-eGFP/bispecifičnim anti-myc-CD3 antitelom u odnosu 1:1, 1:5, 1 :10 i 1:100 (Slike 7D-7G). GFP nije otkriven u Jurkat ćelijama inkubiranim sa AAV6-Q585Myc-EF1a-eGFP virusnim vektorima (Slike 7C).
[0199] U ovom primeru se opisuje inaktivacija prirodnog tropizma nekoliko samo-komplementarnih (sc) ili jednolančanih (ss) AAV serotipa demostrirano nesposobnošću scAAV2 ili ssAAV2 genetični modifikovanog sa c-myc epitopom koji je umetnut između aminokiseline N587 i R588 VP1 kapsidnog proteina (scAAV-N587myc ili ssAAV-N587myc), AAV6 sa c-myc epitopom koji je umetnut između Q585 i S586, i AAV9 da inficira ćelije koje su normalno inficirane divljim tipom AAVs (Slika 1A-1B, 2A-2B, 3A-3B, 4A-4B, 5A-5B, 6A-6B, i 7). Dodatno je u ovom primeru pokazana sposobnost bispecifičnog antitela koje prepoznaje c-myc epitop i drugi ligand koji je eksprimiran od strane ciljne ćelije (npr., hASGR1, hGCGR ili hCD3) da se retargetira tropizam modifikovanog AAV i posreduju infekciji ciljne ćelije pseudotipovanom AAV na način koji je specifičan za ligand (Slika 1-7). Međutim, ovaj primer pokazuje da istovremena primena genski modifikovanog sc-ili ss-AAV i bispecifičnog antitela nije potrebna za infekciju, tj., sekvencijalna primena je dovoljna za retargetiranje genetički modifikovanog sc-ili ss-AAV in vitro (Slika 4).
Primer 3: Antitelom-posredovana redirekcija modifikovanih virusnih vektora In Vivo Retargetiranje virusnih vektora na jetru sa različitim formatima multispecifičnog vezujućeg molekula [0200] Da bi se odredilo da li bispecifično anti-myc-ASGR1 antitelo može retargetirati scAAV2-N587myc-CMV-eGFP virusne vektore na ćelije jetre koje in vivo eksprimiraju hASGR1, miševima genski modifikovanim tako da njihove ćelije jetre eksprimiraju hASGR1 na pozadini C57BL/6, i kontrolnim C57BL/6 miševima divljeg tipa je ubrizgano 1x10<11>(titrirano qPCR) divljim tipom scAAV2-CMV-eGFP zasebno ili scAAV2-N587myc-CMV-eGFP virusnim vektorima u kombinaciji sa bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelom u odnosu 1:8 virusnog genoma na molekule antitela intravaskularno. Kontrole su uključivale miševe kojima je ubrizgan slani rastvor [250mM NaCl] ili samo scAAV2-N587myc-CMVeGFP virusni vektor zasebno. Deset dana posle ubrizgavanja, miševi su žrtvovani i transkardijalno perfuzirani sa 4% PFA. Organi jetre, bubrega i srca su sakupljeni i dehidrirani u 15% saharozi zatim sa 30% saharozom. Zatim su organi podvrgnuti krio sekcijama na pločicama i bojeni sa kokošjim anti-EGFP antitelom (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA) i Alexa-488 konjugovanim antikokošjim sekundarnim antitelom (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA). (Slika 8A-8C). GFP pozitivne ćelije su detektovane u organima jetre iz onih transgenih životinja modifikovanih da ekspirmiraju ASGR1 u jetri i ubrizgani sa divljim tipom scAAV2-CMV-eGFP ili scAAV2-N587myc-CMV-eGFP u kombinaciji sa bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelom (Slike 8A(i) i 8A(iv)), i u organima jetre divljeg tipa C57BL/6 miševa kojima je ubrizgan divlji tip scAAV2-CMV-eGFP (Slika 8A(v)). GFP nije detektovan ni u jednom od uzoraka slezine i bubrega (Slika 8B i 8C), niti u jetri, slezini ili uzorcima bubrega iz bilo koje životinje kojoj je ubrizgan slani rastvor ili samo scAAV2-N587myc-CMV-eGFP virusne vektore (Slike 8A(ii, iii, vi, vii)), niti u uzorcima jetre uzetim iz divljeg tipa C57BL/6 životinja kojima je ubrizgan scAAV2-N587myc-CMV-eGFP u kombinaciji sa bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelom (Slika 8A(viii)). Ukratko, kombinacija scAAV2-N587myc-CMV-eGFP virusnih vektora i bispecifičnog anti-myc-ASGR1 antitela inficirala je samo one ćelije (jetre) koji eksprimiraju hASGR1, snažno sugerišući da je scAAV2-CMV-eGFP virusni vektor inaktiviran modifikacijom kapsidnog proteina, npr., prirodni tropizam scAAV virusnog vektora mogao bi se redukovati do ukinuti, npr., sa c-myc epitopom, i takvi virusni vektori mogu biti specifično reaktivirani, npr., specifično retargetirani, npr., na ćelije jetre in vivo, npr., bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelima.
[0201] Slično, da se odredi da li bispecifično anti-myc-ASGR1 antitelo moglo bi retargetirati ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP virusne vektore na ćelije jetre koje in vivo eksprimiraju hASGR1, miševima genski modifikovanim tako da njihove ćelije jetre eksprimiraju hASGR1 na C57BL/6 pozadini, i kontrolnim C57BL/6 miševima divljeg tipa je ubrizgano 2.18x10<11>(titrirano qPCR) ili divlji tip ssAAV2-CAGG-eGFP zasebno ili ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP virusnim vektorima u kombinaciji sa bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelom i u 1:4 odnosu virusnog genoma na molekule antitela intravaskularno. Kontrole su uključivale miševe kojima je ubrizgano PBS ili samo ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP virusni vektor. Četiri nedelje posle ubrizgavanja, miševi su žrtvovani i transkardijalno perfuzirani sa 4% PFA. Organi jetre, bubrega i srca su sakupljeni i dehidrirani u 15% saharozi zatim sa 30% saharozom. Zatim su organi podvrgnuti krio sekcijama na pločicama i bojeni sa kokošjim anti-EGFP antitelom (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA) i Alexa-488 konjugovanim antikokošjim sekundarnim antitelom (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA). GFP pozitivne ćelije su detektovane u organima jetre iz onih transgenih životinja modifikovanih da ekspirmiraju ASGR1 u jetri i ubrizgani sa divljim tipom ssAAV2-CAGG-eGFP ili ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP u kombinaciji sa bispecifičnim anti-myc-ASGR1antitelom (Slike 9E-9F, 9P-9R), i u organima jetre iz divljeg tipa C57BL/6 miševa kojima je ubrizgan divlji tip ssAAV2-CAGG-eGFP (Slika 9B-9C). Iznenađujuće, efikasnost infekcije ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP u kombinaciji sa bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelom je mnogo veća od DT ssAAV2-CAGG-GFP (Slika 9E-9F, 9P-9R). GFP nije detektovan ili se jedva detektuje u uzorcima jetre iz bilo koje životinje kojoj je ubrizgan slani rastvor ili samo ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP virusnim vektorima (Slike 9A, 9D, 9G-9L)), niti u uzorcima jetre uzetim iz C57BL/6 životinja divljeg tipa kojima je ubrizgan ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP u kombinaciji sa bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelom (Slika 9M-9O). Ukratko, kombinacija ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP virusnih vektora i bispecifičnog anti-myc-ASGR1 antitela inficirala je samo one (jetra) ćelije koje eksprimiraju hASGR1, snažno sugerišući da je ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP virusni vektor inaktiviran modifikovanjem proteina kapsida, npr., prirodni tropizam scAAV virusnog vektora mogao bi se redukovati do ukinuti, npr., sa c-myc epitopom, i takvi virusni vektori mogu biti specifično reaktivirani, npr., specifično retargetirani, npr., na ćelije jetre in vivo, npr., bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelima.
[0202] Dalji eksperimenti sa pseudotipovanim AAV9 virusnim vektorom su izvedeni sa miševima koji su genski modifikovani tako da njihove ćelije jetre eksprimiraju hASGR1 na C57BL/6 pozadini. Ovim miševima je ubrizgano 1x10<11>(titrirani qPCR) divljim tipom AAV9-CAGG-eGFP ili AAV9-A589myc-CAGG-eGFP virusnim česticama u kombinaciji sa bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelom u 1:100 odnosu virusnog genoma na molekule antitela intravaskularno. Kontrole su uključivale miševe kojima je ubrizgan PBS ili AAV9-N587myc-CAGG-eGFP virusne čestice u kombinaciji sa irelevantnim bispecifičnim anti-myc-hCD3 antitelom. Četiri nedelje posle ubrizgavanja, miševi su žrtvovani. Jetre su fiksirane sa 10% formalinom i poslate u HistoWiz. Inc (New York, NY) za GFP bojenje. GFP pozitivne ćelije su detektovane u organima jetre iz onih životinja kojima je ubrizgano divlji tip AAV9-CAGG-eGFP ili AAV9-N587myc-CAGG-eGFP virusne čestice u kombinaciji sa bispecifičnim anti-myc-ASGR1 antitelom (Slike 10A i 10D). GFP nije detektovan ili se jedva detektuje u uzorcima jetre iz bilo koje životinje kojoj je ubrizgan slani rastvor ili AAV9-N587myc-CAGG-eGFP virusne čestice u kombinaciji sa bispecifičnim anti-myc-hCD3 antitelom, redom (Slike 10B i 10C). U suštini, slično AAV2, prirodni tropizam AAV9 mogao bi se redukovati do ukinuti modifikovanjem kapsidnog proteina, npr., insercijom c-myc epitopa, i da takav modifikovani virusni vektor, npr., AAV9-A589myc, može biti retargetiran na specifične ćelijske tipove korišćenjem odgovarajućeg bispecifičnog anti-epitop-ćelijski specifičnog marker vezujućeg proteina, npr, bispecifično anti-myc-ASGR1 antitelo na ćelije jetre. Anti-myc scFc-dodat na anti-hASGR1 IgG4 “knobs-into-hole” Fc formatu
[0203] DA bi se odredilo da li razni formati multispecifičnog vezujućeg molekula mogu da posreduju infekciji AAV, anti-myc scFv je spojen sa C-krajem jednog lanca “knobs-into-holes” anti-hASGR1 IgG4 antitela (vidi Slika 11A). Specifično, gblock koji kodira anti-myc scFv (SEQ ID NO:28) bočno raspoređen homolognim kracima sa 1459-1478 i 1479-1498 pRG7078 koji kodira anti-hASGR1 “stealth knob” IgG4 teškog lanca je obezbeđen tehnologijama integrisane DNK (Skokie, Illinois). Nukleotidne sekvence (NA) koje kodiraju i aminokiselinske (AA) sekvence HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, i LCDR3 scFv (SEQ ID NO:37) koje su kodirane sa SEQ ID NO:28 su obezbeđene u Tabeli 3.
Tabela 3: SEQ ID NOs u povezane sa scFv navedenim kao SEQ ID NO:37
[0204] gblock je kloniran u pRG7078 koji kodira anti-hASGR1 “stealth knob” IgG4 težak lanac da se dobije pRG7078 koji kodira anti-hASGR1 “stealth knob” IgG4 anti-myc scFv spojeni polipeptid "antihASGR1-IgG4-Fc/anti-myc bispecifični." Plazmid pRG7078 modifikovan sa c-myc, nemodifikovan pRG7078 antihASGR1 IgG4 “stealth hole star” i plazmid koji sadrži laki lanac antitela, su transfektovani u 293T ćelije, kultivisani sa OPTI-MEM (Kat#31985070, Thermo Fisher). Četiri dana nakon transfekcije, medijum je sakupljen i anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc bispecifični vezujući molekul je prečišćen korišćenjem kolone proteina A (kat # 89948, Thermo Fisher).
[0205] Za kreiranje pseudotipovanog virusnog vektora AAV8, pAAV RC8 N590myc, gblock sa c-myc epitopom (SEQ ID NO:22) koji je umetnuta između N590 i T591 VP1 kapsidnog proteina AAV8 naručen je od Integrated DNK Technology (Skokie), Ilinois). pAAV RC8 plazmid (SEQ ID NO:23) je digestiran sa Mlu1 i Sbf1 enzimima i gblock je kloniran u vektor korišćenjem SLIC-a da bi se napravio pAAV RC8 N590myc (SEQ ID NO:24).
[0206] 293T-hASGR1 ćelije, koje su 293T ćelije genetički modifikovane da eksprimuju humani (h) ASGR1 na površini ćelije, inkubirane su sa bilo kojom mešavinom koja sadrži različite odnose AAV8-N590Myc-CAGG-eGFP prema anti-hASGR1-IgG4-Fc /anti-myc bispecifični vezujući molekuli (1:0, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:12, 1:15, 1:50 ili 1:100) ili AAV8-CAGG-eGFP virusni genomi. Tri dana nakon infekcije, ekspresija GFP je analizirana pomoću FACS. GFP pozitivne 293T-hASGR1 ćelije su otkrivene nakon inkubacije sa mešavinama AAV8-N590Myc-CAGG-eGFP i anti-hASGRI-IgG4-Fc/anti-myc bispecifičnih molekula u odnosu 1:1, 1:2, 1:4, 1 :8, 1:12, 1:15, 1:50 ili 1:100 (2,12% do 22,2%; Slike 12D-12K) uporedivo sa 293T-hASGR1 ćelijama inkubiranim sa divljim tipom AAV8-CAGG-eGFP (46,1%) (Slika 12A). Ni lažno inficirane ćelije (Slika 12B) niti inkubacija samo sa AAV8-N590Myc-CAGG-eGFP nisu rezultirale ekspresijom GFP-a od strane 293T hASGR1 ćelija (Slika 12C).
[0207] Da bi se utvrdilo da li anti-hASGRI-IgG4-Fc/anti-myc bispecifični vezujući proteini mogu da retargetiraju AAV8 N590myc-CAGG-eGFP virusne čestice na ćelije jetre koje eksprimiraju hASGR1 in vivo, miševi genetički modifikovani tako da njihove ćelije jetre eksprimiraju hASGR1 na pozadini C57BL/6 su injektirani intravaskularno sa 1X10<11>(titrirano qPCR) virusnih čestica divljeg tipa AAV8-CAGG-eGFP ili AAV8 N590myc-CAGG-eGFP u kombinaciji sa anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc bispecifičnim vezujućim molekulom u odnosu 1:12 virusnog genoma za vezivanje proteinskih molekula. Kontrolnim životinjama su ubrizgane AAV8 N590myc-CAGG-eGFP virusne čestice u kombinaciji sa irelevantnim anti-hCD3xanti-myc bispecifičnim vezujućim molekulom koji ima sličan format kao anti-hASGR1-IgG4-Fc/anti-myc bispecifično vezujući molekul. Tri nedelje nakon injekcije, miševi su žrtvovani i transkardijalno perfuzirani sa 4% PFA. Organi jetre, bubrega i srca su sakupljeni i dehidrirani u 15% saharoze, a zatim sa 30% saharoze. Zatim su organi podvrgnuti krio sekcijama na pločicama i obojeni pilećim anti-EGFP antitelom (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA) i Alexa 488 konjugovanim anti-pilećim sekundarnim antitelom (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. West Grove, PA). GFP pozitivne ćelije su otkrivene u jetri onih životinja kojima je ubrizgan divlji tip AAV8-CAGG-eGFP (Slike 13A-13C) ili AAV8 N590myc-CAGG¬eGFP virusne čestice u kombinaciji sa antihASGRI-IgG4-Fc/anti-myc bispecifičnim vezivanjem molekula (Slike 13G-13I). GFP nije detektovan ili jedva detektovan u uzorcima jetre bilo koje životinje kojoj su ubrizgane AAV8 N590myc-CAGG-eGFP virusne čestice u kombinaciji sa irelevantnim anti-hCD3/myc vezujućim proteinom (Slike 13D-13F). Ukratko, epitopom obeležen AAV8, npr., AAV8-N590myc, može se retargetirati na specifični tip ćelije korišćenjem bispecifičnog vezujućeg molekula koji specifično vezuje epitop i ćelijski specifični marker eksprimiran ciljanim tipom ćelije.
Preusmeravanje virusnih vektora na creva i/ili pankreasa
[0208] Ćelije 293T genetički modifikovane da eksprimiraju humanu ektonukleozid trifosfat difosfohidrolazu 3 (hENTPD3) na površini ćelije („293T-ENTPD3“) su inkubirane sa smešama koje sadrže različite odnose AAV2-N587Myc-FFPGal ili AAGGG2-CAGGAV virusnih genoma i bispecifični vezujući molekul formiran spajanjem anti-myc scFv sa C-krajem jednim lancem “knobs-into-holes” anti-hENTPD3 IgG4 antitela (anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc) u različitim odnosima (1: 0, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:20, 1:50, 1:100 ili 1:200). Tri dana nakon infekcije, ekspresija GFP je analizirana pomoću FACS. GFP pozitivne 293T-ENTPD3 ćelije su otkrivene nakon inkubacije sa mešavinama AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP i anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc na nivoima (1,48% do 16%; Slike 14C-14J) uporedivim sa 293T-ENTPD3 ćelije inkubirane sa divljim tipom AAV2-CAGG-eGFP (66%) (Slika 14A). Inkubacija samo sa AAV2-N587Myc-CAGG-eGFP dovodi do veoma niskog nivoa ekspresije GFP-a od strane 293T-ENTPD3 ćelija (Slika 14B).
[0209] Utvrđeno je da se ENTPD3 eksprimuje u sluzokoži creva (podaci nisu prikazani). Da bi se utvrdilo da li anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc vezujući protein može ponovo da cilja AAV2-N587myc-CAGG-eGFP virusne čestice na crevne ćelije koje eksprimiraju ENTPD3 in vivo, miševima C57BL/6 je intravaskularno ubrizgan 5X10<11>od strane 5X10<11>(titrirano qPCR) AAV2-N587myc-CAGG-eGFP virusne čestice u kombinaciji sa anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc vezujućim proteinima u odnosu 1:20 virusnog genoma i vezujućih proteinskih molekula. Kontrolnim miševima je ubrizgan PBS, divlji tip AAV9 ili virusne čestice AAV2-N587myc-CAGG-eGFP u kombinaciji sa irelevantnim vezujućim proteinskim molekulom. Tri nedelje nakon injekcije, miševi su žrtvovani. Jetra, creva i pankreas su fiksirani sa 10% formalina i poslati u HistoWiz. Inc (Njujork, Njujork) za GFP bojenje. GFP pozitivne ćelije su otkrivene kod miševa kojima je ubrizgan divlji tip AAV9 (Slika 15B(ii)), ali ne i u jetri miševa kojima je ubrizgan PBS ili AAV2-N587myc-CAGG-eGFP virusne čestice u kombinaciji sa irelevantnim vezujućim molekulima ili anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc vezujući proteini (Slika 15A(iii)-15A(iv), redom), što ukazuje da AAV2-N587myc virusni vektori ne inficiraju ENTPD3-negativne ćelije jetre čak i kada se istovremeno ubrizgavaju sa hENTPD3-IgG4-Fc/ anti-myc vezujući proteini. GFP je otkriven u crevima samo miševa kojima su ubrizgane virusne čestice divljeg tipa AAV9 ili AAV2-N587myc-CAGG-eGFP u kombinaciji sa hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc vezujućim proteinima (Slike 15B(i)-15B(iv)). GFP se detektuje u ostrvcima pankreasa kod miša kome su ubrizgane AAV2-N587myc-CAGG-eGFP virusne čestice u kombinaciji sa anti-hENTPD3-IgG4-Fc/anti-myc vezujućim proteinima. (Slika 15C(iv)). WT AAV9 je inficirao i ćelije ostrvaca i ćelije pankreasa bez ostrva (Slika 15C(ii)). GFP nije otkriven u uzorcima pankreasa kod miševa kojima je ubrizgan fiziološki rastvor ili AAV2-N587myc-CAGG-eGFP virusne čestice u kombinaciji sa irelevantnim vezujućim proteinima. (Slike 7C(i) i 7C(iii)). Ukratko, prirodni tropizam AAV-a se može svesti na ukidanje umetanjem heterolognog epitopa i ponovnog ciljanja na iste ili druge ćelije korišćenjem multispecifičnog vezujućeg proteina koji vezuje epitopski tag i marker eksprimiran od strane ponovo ciljanih ćelija ili tkiva.
[0210] Ovaj primer pokazuje da nekoliko različitih serotipova adeno-asociranog virusnog vektora može biti genetički modifikovano heterolognim epitopom (npr. c-myc) kako je ovde opisano da bi se inaktivirala infektivnost, i bispecifičnim antitelom (bez obzira na bispecifične formate) koje prepoznaje i heterologni epitop (npr. c-myc) i marker eksprimiran u ciljanoj ćeliji mogu se koristiti za retargetiranje virusnog vektora za isporuku nukleotida od interesa.
Primer 4: Upotreba genetički modifikovanih AAV-N587Myc virusnih vektora za isporuku terapeutskog tereta određenim ćelijama
[0211] Ovaj primer pokazuje sposobnost AAV-N587Myc virusnih vektora da specifično isporuče terapeutski teret, kao što su jedan ili više gena samoubistva, biološki terapeutik (npr., antitelo), sistem za uređivanje gena CRISPR/Cas, shRNK, itd., na ciljani tip ćelije. Konkretno, ovaj primer opisuje isporuku gena za samoubistvo, sekvence koja kodira antitela ili sistema za uređivanje gena CRISPR/Cas ćelijama koje eksprimiraju ciljani ligand.
Isporuka samoubilačkog gena ćelijama koje eksprimiraju ciljani ligand
[0212] Da bi se testirala sposobnost scAAV2-N587Myc virusnih vektora da isporuče samoubilački gen u određenu ćeliju, model ksenografta golog miša HER2<+>kancera dojke kako su opisali Vang et al. ((2010) Cancer Gene Therapy 17:559-570).
[0213] Virusni vektori: scAAV2-N587Myc ili ssAAV2-N587Myc virusni vektori koji nose reporterski EGFP gen (scAAV2-N587Myc-EGFP ili ssAAV2-N587MycEGFP) se generišu kao što je opisano u Primeru 1. scAAV2-N587Myc ili ssAAV2-N587Myc virusni vektori koji nose samoubilački gen (SG) se generišu na sličan način. Ukratko, ćelije 293T17 su transfektovane sa (1) pAd Helper i (2) pAAV RC2 (kodira kapsid divljeg tipa) ili pAAV RC2-N587Myc vektorima (kodiraju kapsid modifikovan sa c-myc epitopom) kao što je gore opisano, i sa (3) pAAV vektorom koji nosi samoubilački gen, npr. gen za citozin deaminazu, gen timidin kinaze virusa herpes simpleksa, pod kontrolom promotora, npr. CMV. Virusni vektori ssAAV-N587MycSG ili scAAV-N587SG su izolovani i titrirani kao što je opisano u Primeru 1.
[0214] Ćelijske linije: BT474 kancer dojke, SK-BR-3 kancer dojke i ćelijske linije kancera pluća Calu-3 su HER2 pozitivne ćelijske linije humanog tumora (Bunn P.A. et al., (2001) Clin Cancer Res.7:3239- 3250; Pegram M, et al. (1999) Oncogene 18:2241-2251, Clin Cancer Res. A-673 rabdomiosarkom i HeLa karcinom grlića materice su HER2 negativne humane tumorske ćelijske linije, a BEAS-2b je besmrtna HER2 negativna ćelijska linija bronhijalnog epitela (Jia LT et al. (2003) Cancer Res.63:3257-3262; Kern JA, et al. al., (1993) Am J Respir Cell Biol 9:448-454, (2003) Cancer Genet Citogenet 141:138-142; Sve ove ćelijske linije su dobijene iz American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, WA) i održavane u medijumu preporučenom od ATCC.
[0215] Miševi: Ženke golih miševa, starosti od 6 do 8 nedelja, dobijaju se i smeštaju u specifične uslove bez patogena. Dana 0, miševima se istovremeno (1) ubrizgava subkutano u desni bok sa 10<7>BT474, SK-BR-3, Calu-3, A673 ili HeLa tumorskih ćelija i (2) se leči intravenozno sa bispecifičnim anti-myc-HER2 antitela i ss-ili scAAV-N587Myc virusnih vektora koji nose reporter (npr. EGFP) ili samoubilački gen. Kao kontrole služe netretirane životinje (životinje kojima su ubrizgane samo tumorske ćelije), životinje kojima je ubrizgan divlji tip ss- ili scAAV virusnih vektora koji nose reporterski ili samoubilački gen, životinje kojima je ubrizgana samo bispecifična anti-myc-HER2 antitela, ili životinje kojima je ubrizgan ss- ili scAAV-N587Myc virusni vektori koji nose samo reporter ili samoubilački gen. Sve životinje su tretirane odgovarajućim prolekom 1 dan nakon injekcije i tretmana. Veličina svakog tumora se meri pomoću čeljusti 2 puta nedeljno, a zapremina tumora se izračunava kao dužina 3 širina 230,52. Nakon morbiditeta, ulceracije tumora, prečnika tumora od 15 mm ili zapremine tumora od 1000 mm<3>, miševi su žrtvovani, a datum žrtvovanja je zabeležen kao datum smrti. Jetra, slezina, bubrezi i tumori životinja kojima je ubrizgan divlji tip ss-ili scAAV ili ss-ili scAAV-N587Myc virusni vektori koji nose reporterski gen su fiksirani i ekspresija reporterskog gena je vizuelizovana. Iako je opisana ciljana isporuka gena koji izazivaju samoubistvo (Zarogoulidis P., et al. (2013) J. Genet. Sindr. Gene Ther. 4:16849), ovaj primer opisuje isporuku gena za samoubistvo u ćeliju koja eksprimira ciljani HER2 ligand koristeći ovde opisane virusne vektore koji sadrže heterologni epitop, npr. c-myc, i bispecifično antitelo koje specifično vezuje ciljani ligand i heterologni epitop. U dodatnim eksperimentima, samoubilački gen se isporučuje drugom tipu ćelije koji eksprimira jedan ili više drugih ciljnih liganda pomoću virusnog vektora koji sadrži heterologni epitop kao što je ovde opisan i bispecifično antitelo koje specifično vezuje heterologni epitop (npr. c-myc) i ciljni receptor. Primeri i neograničavajući primeri receptora pogodnih za ciljanje uključuju one receptore koji posreduju u endocitozi virusnog vektora, na primer, karcino-embrionalni antigen (CEA) (Qiu Y, et al. (2012) Cancer Lett.316:31-38) i receptor faktora rasta vaskularnog endotela (VEGFR) (Leng A, et al. (2013) Tumor Biol.32:1103-1111; Liu T, et al. (2011) Ekp Mol Pathol. 91:745-752). Dodatni receptori koji mogu biti ciljani uključuju: receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) (Heimberger AB, et al. (2009) Expert Opin Biol Ther. 9:1087-1098), klaster diferencijacije 44s (CD44s) (Heider KH, et al. (2004) Cancer Immunol Immunother 53:567-579), klaster diferencijacije 133 (CD133 aka AC133) (Zhang SS, et al. (2012) BMC Med. ;10:85), receptor folata (FR) (Duarte). S, et al., (2011) J Control Release 149(3):264-72), receptor transferina (TfR) ili diferencijacija klastera 71 (CD71) (Habashy HO, et al., Breast Cancer Res Treat.119(2)):283-93), mucini (Torres MP, et al., (2012) Curr Pharm Des.2012; 18(17):2472-81), stadijum specifični embrionalni antigen 4 (SSEA-4) (Malecki M., et al., (2012) J Stem Cell Res Ther 2(5)), antigen otpornosti na tumor 1-60 (TRA-1-60) (Malecki M., et al., (2013) J Stem Cell Res Ther.3:134).
Kyratsous, Christos
Murphy, Andrew J
Wang, Cheng
Sabin, Leah
<120> Tropism-Modified Recombinant Viral Vectors and Uses Thereof for the Targeted Introduction of Genetic Material into Human Cell <130> 009108.335WO1/10335WO01
<150> 62/525,704
<151> 2017-06-27
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 735
<212> PRT
<213> adeno-associated virus 2
<400> 1
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 60
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val 6 M1 et Ile Thr 545 550 555 560
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr 580 585 590
Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685
Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735
<210> 2
<211> 745
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV2 VP1 N587Myc
62
<400> 2
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Va 63l Gly Asn Ser 210 215 220
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430
64
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Glu Gln Lys Leu Ile 580 585 590
Ser Glu Glu Asp Leu Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln 595 600 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln 610 615 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro 625 630 635 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile 645 650 655
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val 675 680 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp 690 695 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val 705 710 715 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile 725 730 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740 745
<210> 3
<211> 736
<212> PRT
<213> adeno-associated virus 6
<400> 3
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125
Phe Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly 145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala 210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His 260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe 275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn 290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln 305 310 315 320 67
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro 340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala 355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly 370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro 385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe 405 410 415
Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp 420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg 435 440 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser 450 455 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn 485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn 500 505 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525
Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val M 68et Ile Phe Gly 530 535 540
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg 565 570 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala 580 585 590
Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700
Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu 705 710 715 720
Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 725 730 735
<210> 4
<211> 746
<212> PRT
<213> Artificial Sequence 69
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125
Phe Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly 145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser 7 G0ly Gly Gly 195 200 205
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His 260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe 275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn 290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln 305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn 325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro 340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala 355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly 370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro 385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe 405 410 415
71
Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg 435 440 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser 450 455 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn 485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn 500 505 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525
Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly 530 535 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg 565 570 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 580 585 590
Glu Asp Leu Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala Thr Gly Asp Val His Val 595 600 605
Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu 610 615 620
Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His 625 630 635 640
Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Pro Ala Glu Phe 660 665 670
Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln 675 680 685
Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg 690 695 700
Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Ala Lys Ser Ala Asn 705 710 715 720
Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu Tyr Thr Glu Pro Arg Pro 725 730 735
Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
740 745
<210> 5
<211> 736
<212> PRT
<213> adeno-associated virus 9
<400> 5
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 74
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445
Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met A 7la5 Ser His Lys 515 520 525
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575
Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590
Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620
Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655
Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700
Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735
76
<210> 6
<223> c-myc
<400> 6
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLAG
<400> 7
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA
<400> 8
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fwd ITR primer
<400> 9
ggaaccccta gtgatggagt t 21
<210> 10 77 <211> 16
<223> Rvs ITR primer
<400> 10
cggcctcagt gagcga 16
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV2 ITRs probe
<400> 11
cactccctct ctgcgcgctc g 21
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c-myc
<400> 12
gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 30
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAVRCBsiWF
<400> 13
ggagtaccag ctcccgtacg 20
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N587mycR
78
<400> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N587mycF
<400> 15
aaactcatct cagaagagga tctgagacaa gcagctaccg cag 43
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAVRCPmeR
<400> 16
tccgcccgct gtttaaac 18
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAVRC9BsiWF
<400> 17
actcagacta tcagctcccg tacg 24
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A589mycR
<400> 18
ctcttctgag atgagttttt gttctgcttg ggcactctgg t 41
<210> 19
<211> 37
<212> DNA 79
<213> Artificial Sequence
aaactcatct cagagaggat ctgcaggcgc agaccgg 37
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAVRC9PmeR
<400> 20
ctccgcccgc tgtttaaac 19
<210> 21
<211> 738
<212> PRT
<213> adeno-associated virus 8
<400> 21
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80
Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190
Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly 195 200 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 210 215 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp 260 265 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 81
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr 405 410 415
Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445
Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly 450 455 460
Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp 465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly 485 490 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His 500 505 510
Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr 515 520 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile 530 535 540
Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp T 8y2r Ser Asp Val 545 550 555 560
Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala 580 585 590
Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 595 600 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 610 615 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 625 630 635 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 645 650 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe 660 665 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700
Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 705 710 715 720
Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735
Asn Leu
<210> 22
<211> 453
<212> DNA
<213> Artificial Sequence 83 gaccctgtta ccgccaacaa cgcgtctcaa cgacaaccgg gcaaaacaac aatagcaact 60 ttgcctggac tgctgggacc aaataccatc tgaatggaag aaattcattg gctaatcctg 120 gcatcgctat ggcaacacac aaagacgacg aggagcgttt ttttcccagt aacgggatcc 180 tgatttttgg caaacaaaat gctgccagag acaatgcgga ttacagcgat gtcatgctca 240 ccagcgagga agaaatcaaa accactaacc ctgtggctac agaggaatac ggtatcgtgg 300 cagataactt gcagcagcaa aacgaacaaa aactcatctc agaagaggat ctgacggctc 360 ctcaaattgg aactgtcaac agccaggggg ccttacccgg tatggtctgg cagaaccggg 420 acgtgtacct gcagggtccc atctgggcca aga 453
<210> 23
<211> 7336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAV RC2/8
<400> 23
gcgcgccgat atcgttaacg ccccgcgccg gccgctctag aactagtgga tcccccggaa 60 gatcagaagt tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttctgatctg 120 cgcagccgcc atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga 180 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 240 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 300 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 360 tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 420 caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 480 tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 540 cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 600 gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 660 cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 720
84
gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 780 ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 900 caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 960 taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg 1020 gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct 1080 gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac 1140 taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt 1200 aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg 1260 ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag 1320 caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat 1380 cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca 1440 ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga 1500 ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt 1560 ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc 1620 cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac 1680 gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca 1740 cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc 1800 aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc 1860 tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat 1920 gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg 1980 catctttgaa caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt 2040 ggctcgagga caacctctct gagggcattc gcgagtggtg ggcgctgaaa cctggagccc 2100 cgaagcccaa agccaaccag caaaagcagg acgacggccg gggtctggtg cttcctggct 2160 acaagtacct cggacccttc aacggactcg acaaggggga gcccgtcaac gcggcggacg 2220 cagcggccct cgagcacgac aaggcctacg accagcagct gcaggcgggt gacaatccgt 2280 acctgcggta taaccacgcc gacgccgagt ttcaggagcg tctgcaagaa gatacgtctt 2340 ttgggggcaa cctcgggcga gcagtcttcc aggccaagaa gcgg 8g5ttctc gaacctctcg 2400 aaagactcaa ttttggtcag actggcgact cagagtcagt tccagaccct caacctctcg 2580 gagaacctcc agcagcgccc tctggtgtgg gacctaatac aatggctgca ggcggtggcg 2640 caccaatggc agacaataac gaaggcgccg acggagtggg tagttcctcg ggaaattggc 2700 attgcgattc cacatggctg ggcgacagag tcatcaccac cagcacccga acctgggccc 2760 tgcccaccta caacaaccac ctctacaagc aaatctccaa cgggacatcg ggaggagcca 2820 ccaacgacaa cacctacttc ggctacagca ccccctgggg gtattttgac tttaacagat 2880 tccactgcca cttttcacca cgtgactggc agcgactcat caacaacaac tggggattcc 2940 ggcccaagag actcagcttc aagctcttca acatccaggt caaggaggtc acgcagaatg 3000 aaggcaccaa gaccatcgcc aataacctca ccagcaccat ccaggtgttt acggactcgg 3060 agtaccagct gccgtacgtt ctcggctctg cccaccaggg ctgcctgcct ccgttcccgg 3120 cggacgtgtt catgattccc cagtacggct acctaacact caacaacggt agtcaggccg 3180 tgggacgctc ctccttctac tgcctggaat actttccttc gcagatgctg agaaccggca 3240 acaacttcca gtttacttac accttcgagg acgtgccttt ccacagcagc tacgcccaca 3300 gccagagctt ggaccggctg atgaatcctc tgattgacca gtacctgtac tacttgtctc 3360 ggactcaaac aacaggaggc acggcaaata cgcagactct gggcttcagc caaggtgggc 3420 ctaatacaat ggccaatcag gcaaagaact ggctgccagg accctgttac cgccaacaac 3480 gcgtctcaac gacaaccggg caaaacaaca atagcaactt tgcctggact gctgggacca 3540 aataccatct gaatggaaga aattcattgg ctaatcctgg catcgctatg gcaacacaca 3600 aagacgacga ggagcgtttt tttcccagta acgggatcct gatttttggc aaacaaaatg 3660 ctgccagaga caatgcggat tacagcgatg tcatgctcac cagcgaggaa gaaatcaaaa 3720 ccactaaccc tgtggctaca gaggaatacg gtatcgtggc agataacttg cagcagcaaa 3780 acacggctcc tcaaattgga actgtcaaca gccagggggc cttacccggt atggtctggc 3840 agaaccggga cgtgtacctg cagggtccca tctgggccaa gattcctcac acggacggca 3900 acttccaccc gtctccgctg atgggcggct ttggcctgaa acatcctccg cctcagatcc 3960 tgatcaagaa cacgcctgta cctgcggatc ctccgaccac cttcaaccag tcaaagctga 4020
86
actctttcat cacgcaatac agcaccggac aggtcagcgt ggaaattgaa tgggagctgc 4080 ctacaagtgt ggactttgct gttaatacag aaggcgtgta ctctgaaccc cgccccattg 4200 gcacccgtta cctcacccgt aatctgtaat tgcctgttaa tcaataaacc gtttaattcg 4260 tttcagttga actttggtct ctgcgtattt ctttcttatc tagtttccat ggctacgtag 4320 ataagtagca tggcgggtta atcattaact acagcccggg cgtttaaaca gcgggcggag 4380 gggtggagtc gtgacgtgaa ttacgtcata gggttaggga ggtcctgtat tagaggtcac 4440 gtgagtgttt tgcgacattt tgcgacacca tgtggtctcg ctgggggggg gggcccgagt 4500 gagcacgcag ggtctccatt ttgaagcggg aggtttgaac gagcgctggc gcgctcactg 4560 gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 4620 gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 4680 tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggaaattgt aagcgttaat attttgttaa 4740 aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttta accaataggc cgaaatcggc 4800 aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg 4860 aacaagagtc cactattaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc 4920 agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc 4980 gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc 5040 cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg 5100 caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac 5160 agggcgcgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 5220 tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 5280 aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 5340 ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 5400 ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 5460 tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 5520 tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 5580 actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 5640 gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtga 87taac actgcggcca 5700 acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 5880 gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 5940 ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 6000 gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 6060 cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 6120 agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 6180 catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 6240 tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 6300 cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 6360 gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 6420 taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 6480 ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 6540 tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 6600 ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 6660 cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 6720 agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 6780 gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 6840 atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 6900 gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 6960 gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 7020 ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 7080 cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 7140 cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 7200 acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 7260 cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 7320
88
accatgatta cgccaa 7336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> paav RC2/8 myc plasmid
<400> 24
gcgcgccgat atcgttaacg ccccgcgccg gccgctctag aactagtgga tcccccggaa 60 gatcagaagt tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttctgatctg 120 cgcagccgcc atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga 180 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 240 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 300 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 360 tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 420 caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 480 tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 540 cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 600 gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 660 cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 720 gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 780 atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 840 ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 900 caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 960 taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg 1020 gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct 1080 gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac 1140 taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt 1200 aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg 1260 ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaa 89gccattc tcggaggaag 1320 ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga 1500 ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt 1560 ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc 1620 cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac 1680 gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca 1740 cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc 1800 aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc 1860 tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat 1920 gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg 1980 catctttgaa caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt 2040 ggctcgagga caacctctct gagggcattc gcgagtggtg ggcgctgaaa cctggagccc 2100 cgaagcccaa agccaaccag caaaagcagg acgacggccg gggtctggtg cttcctggct 2160 acaagtacct cggacccttc aacggactcg acaaggggga gcccgtcaac gcggcggacg 2220 cagcggccct cgagcacgac aaggcctacg accagcagct gcaggcgggt gacaatccgt 2280 acctgcggta taaccacgcc gacgccgagt ttcaggagcg tctgcaagaa gatacgtctt 2340 ttgggggcaa cctcgggcga gcagtcttcc aggccaagaa gcgggttctc gaacctctcg 2400 gtctggttga ggaaggcgct aagacggctc ctggaaagaa gagaccggta gagccatcac 2460 cccagcgttc tccagactcc tctacgggca tcggcaagaa aggccaacag cccgccagaa 2520 aaagactcaa ttttggtcag actggcgact cagagtcagt tccagaccct caacctctcg 2580 gagaacctcc agcagcgccc tctggtgtgg gacctaatac aatggctgca ggcggtggcg 2640 caccaatggc agacaataac gaaggcgccg acggagtggg tagttcctcg ggaaattggc 2700 attgcgattc cacatggctg ggcgacagag tcatcaccac cagcacccga acctgggccc 2760 tgcccaccta caacaaccac ctctacaagc aaatctccaa cgggacatcg ggaggagcca 2820 ccaacgacaa cacctacttc ggctacagca ccccctgggg gtattttgac tttaacagat 2880 tccactgcca cttttcacca cgtgactggc agcgactcat caacaacaac tggggattcc 2940
90
ggcccaagag actcagcttc aagctcttca acatccaggt caaggaggtc acgcagaatg 3000 agtaccagct gccgtacgtt ctcggctctg cccaccaggg ctgcctgcct ccgttcccgg 3120 cggacgtgtt catgattccc cagtacggct acctaacact caacaacggt agtcaggccg 3180 tgggacgctc ctccttctac tgcctggaat actttccttc gcagatgctg agaaccggca 3240 acaacttcca gtttacttac accttcgagg acgtgccttt ccacagcagc tacgcccaca 3300 gccagagctt ggaccggctg atgaatcctc tgattgacca gtacctgtac tacttgtctc 3360 ggactcaaac aacaggaggc acggcaaata cgcagactct gggcttcagc caaggtgggc 3420 ctaatacaat ggccaatcag gcaaagaact ggctgccagg accctgttac cgccaacaac 3480 gcgtctcaac gacaaccggg caaaacaaca atagcaactt tgcctggact gctgggacca 3540 aataccatct gaatggaaga aattcattgg ctaatcctgg catcgctatg gcaacacaca 3600 aagacgacga ggagcgtttt tttcccagta acgggatcct gatttttggc aaacaaaatg 3660 ctgccagaga caatgcggat tacagcgatg tcatgctcac cagcgaggaa gaaatcaaaa 3720 ccactaaccc tgtggctaca gaggaatacg gtatcgtggc agataacttg cagcagcaaa 3780 acgaacaaaa actcatctca gaagaggatc tgacggctcc tcaaattgga actgtcaaca 3840 gccagggggc cttacccggt atggtctggc agaaccggga cgtgtacctg cagggtccca 3900 tctgggccaa gattcctcac acggacggca acttccaccc gtctccgctg atgggcggct 3960 ttggcctgaa acatcctccg cctcagatcc tgatcaagaa cacgcctgta cctgcggatc 4020 ctccgaccac cttcaaccag tcaaagctga actctttcat cacgcaatac agcaccggac 4080 aggtcagcgt ggaaattgaa tgggagctgc agaaggaaaa cagcaagcgc tggaaccccg 4140 agatccagta cacctccaac tactacaaat ctacaagtgt ggactttgct gttaatacag 4200 aaggcgtgta ctctgaaccc cgccccattg gcacccgtta cctcacccgt aatctgtaat 4260 tgcctgttaa tcaataaacc gtttaattcg tttcagttga actttggtct ctgcgtattt 4320 ctttcttatc tagtttccat ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta atcattaact 4380 acagcccggg cgtttaaaca gcgggcggag gggtggagtc gtgacgtgaa ttacgtcata 4440 gggttaggga ggtcctgtat tagaggtcac gtgagtgttt tgcgacattt tgcgacacca 4500 tgtggtctcg ctgggggggg gggcccgagt gagcacgcag ggtctccatt ttgaagcggg 4560 aggtttgaac gagcgctggc gcgctcactg gccgtcgttt tacaacg 91tcg tgactgggaa 4620 tggaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct 4800 cattttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc 4860 gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaag aacgtggact 4920 ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac 4980 cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga 5040 gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga 5100 aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca 5160 ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc aggtggcact tttcggggaa 5220 atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 5280 tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 5340 aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 5400 acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 5460 acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 5520 ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 5580 ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 5640 caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 5700 ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 5760 aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 5820 aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 5880 tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 5940 aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 6000 cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 6060 ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 6120 gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 6180 agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 6240
92
atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 6300 cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 6420 cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 6480 tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 6540 tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 6600 ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 6660 aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 6720 cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 6780 ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 6840 agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 6900 ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 6960 acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 7020 cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 7080 gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa 7140 tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 7200 ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt 7260 aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg 7320 gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaa 7366
<210> 25
<211> 748
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAV8N590myc
<400> 25
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30 93
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80
Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190
Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly 195 200 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 210 215 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr A 94sn Asn His 245 250 255
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr 405 410 415
Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445
Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly 450 455 460
95
Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly 485 490 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His 500 505 510
Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr 515 520 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile 530 535 540
Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val 545 550 555 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 565 570 575
Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Glu Gln 580 585 590
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Thr Ala Pro Gln Ile Gly Thr Val 595 600 605
Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val 610 615 620
Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn 625 630 635 640
Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro 645 650 655
Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr 660 665 670
Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr 675 680 685
Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser 705 710 715 720
Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro 725 730 735
Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740 745
<210> 26
<211> 746
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAV9A589myc
<400> 26
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110
97
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445
Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525
Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 99
Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Glu Gln Lys 580 585 590
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn 595 600 605
Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu 610 615 620
Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His 625 630 635 640
Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met Lys His Pro Pro Pro Gln 645 650 655
Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe 660 665 670
Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln 675 680 685
Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg 690 695 700
Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn 705 710 715 720
Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro 725 730 735
Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740 745
<210> 27
<211> 746
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
100
<220>
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 101
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Se 10r2 Gln Ser Leu 420 425 430
Lys Thr Ile Asn Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ser 450 455 460
Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser Val Ala Gly Pro Ser Asn 465 470 475 480
Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro Gly Pro Ser Tyr Arg Gln 485 490 495
Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn Asn Asn Ser Glu Phe Ala 500 505 510
Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Met 515 520 525
Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Glu Gly Glu Asp Arg Phe 530 535 540
Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Thr Gly Arg 545 550 555 560
Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile Thr Asn Glu Glu Glu Ile 565 570 575
Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser Tyr Gly Gln Val Ala Thr 580 585 590
Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn 595 600 605
Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu 610 615 620
Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His 625 630 635 640
103
Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe
660 665 670
Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln
675 680 685
Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg
690 695 700
Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn
705 710 715 720
Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro
725 730 735
Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740 745
<210> 28
<211> 814
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cmyc-scfv-gblock
<400> 28
tctccctgtc tctgggtaaa ggcggaggtg gatccggagg gggcggatct gacatccaga 60 tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc 120 gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca acagaaacca gggaaagccc 180 ctaagctcct gatctatgct gtttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagtg 240 gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaactc tctgcaacct gaagattttg 300 caacttactc ctgtcaacag acttacagta cccctccgat caccttcggc caagggacac 360 gactggagat taaaggaggg ggcggctcag gaggaggggg tagtggggga ggcggctccg 420 aggtgcagct ggtggagtct gggggaggct tggtacagcc tggagggtcc ctgagactct 480 cctgtgtcac ctctggattt cgttttagta gttatgaaat gaactgggtc cgccaggctc 540
104
cagggaaggg gctggaatgg atttcataca ttaacagaag tggttatacc atatactacg 600 ttcaaatgaa cagcctgaga gacgaggaca cggctatcta ttactgtgcg agagggagta 720 tcgcccctcg gggggagatt cgacacatct ttgactactg gggccaggga accctggtca 780 ccgtctcctc atgatgagcg gccgctaatc agcc 814
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> myc HCVR AA
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Arg Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Tyr Ile Asn Arg Ser Gly Tyr Thr Ile Tyr Tyr Ala Ala Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ile Ala Pro Arg Gly Glu Ile Arg His Ile Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
115 120
<210> 30
<211> 108 105
<212> PRT
<223> myc LCVR AA
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> myc HCDR1
<400> 31
Gly Phe Arg Phe Ser Ser Tyr Glu
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
106
<220>
Ile Asn Arg Ser Gly Tyr Thr Ile
1 5
<210> 33
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> myc HCDR3
<400> 33
Ala Arg
1
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> myc LCDR1 AA
<400> 34
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 35
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> myc LCDR2
<400> 35
Ala Ala Ser
1
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence 107 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
1 5
<210> 37
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-myc scFv
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Val Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly 100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 130 135 140
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser Tyr Ile Asn Arg
165 170 175
Ser Gly Tyr Thr Ile Tyr Tyr Ala Ala Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ile
210 215 220
Ala Pro Arg Gly Glu Ile Arg His Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 38
<211> 774
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-myc scFv NA
<400> 38
ggcggaggtg gatccggagg gggcggatct gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc 60 ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc 120 agctatttaa attggtatca acagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct 180 gtttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat 240 ttcactctca ccatcaactc tctgcaacct gaagattttg caacttactc ctgtcaacag 300 acttacagta cccctccgat caccttcggc caagggacac gactggagat taaaggaggg 360 ggcggctcag gaggaggggg tagtggggga ggcggctccg aggtgcagct ggtggagtct 420 gggggaggct tggtacagcc tggagggtcc ctgagactct cctgtgtcac ctctggattt 480 cgttttagta gttatgaaat gaactgggtc cgccaggctc cagggaa 10g9gg gctggaatgg 540 gacgaggaca cggctatcta ttactgtgcg agagggagta tcgcccctcg gggggagatt 720 cgacacatct ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc atga 774
<210> 39
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> myc HCVR NA
<400> 39
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgtca cctctggatt tcgttttagt agttatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg gatttcatac attaacagaa gtggttatac catatactac 180 gcagcctctc tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 cttcaaatga acagcctgag agacgaggac acggctatct attactgtgc gagagggagt 300 atcgcccctc ggggggagat tcgacacatc tttgactact ggggccaggg aaccctggtc 360 accgtctcct ca 372
<210> 40
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> myc LCVR NA
<400> 40
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324

Claims (21)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija koja sadrži
(i) vektor rekombinantnog adeno-asociranog virusa (AAV) koji sadrži
AAV kapsid koji inkapsulira nukleotid od interesa,
pri čemu AAV kapsid sadrži rekombinantni AAV kapsidni protein modifikovan da sadrži heterologni epitop, pri čemu je rekombinantni AAV kapsidni protein dobijen od AAV kapsidnog gena modifikovanog da eksprimuje heterologni epitop;
(ii) multispecifični vezujući molekul koji sadrži
(a) paratop antitela koji specifično vezuje heterologni epitop; i
(b) ligand za retargetiranje koji specifično vezuje protein ili marker ćelijske površine; i opciono (iii) farmaceutski prihvatljiv nosač,
pri čemu AAV kapsid ispoljava:
-smanjeni do ukinuti tropizam u odsustvu multispecifičnog vezujućeg molekula; i -modifikovani tropizam, po kombinaciji sa multispecifičnim vezujućim molekulom, u poređenju sa referentnim AAV kapsidom, pri čemu referentni AAV kapsid sadrži referentni AAV kapsidni protein koji je identičan rekombinantnom AAV kapsidnom proteinu ali zbog nedostatka heterolognog epitopa.
2. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, gde rekombinantni AAV kapsidni protein dalje sadrži mutaciju pored heterolognog epitopa.
3. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je heterologni epitop umetnut tako da umetanje delimično smanjuje tropizam AAV kapsida u poređenju sa referentnim AAV kapsidom kome nedostaje heterologni epitop i AAV kapsidni protein dalje sadrži mutaciju (npr. supstituciju, deleciju, umetanje različito od umetanja heterolognog epitopa), pored umetanja heterolognog epitopa, pri čemu mutacija dodatno smanjuje i/ili ukida tropizam rekombinantnog AAV kapsida u poređenju sa referentnim AAV kapsidom kome nedostaje mutacija.
4. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, gde modifikovani tropizam posle kombinacije sa multispecifičnim vezujućim molekulom znači da se tropizam AAV kapsida obnavlja i preusmerava u poređenju sa tropizmom referentnog AAV kapsida.
5. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde
(i) heterologni epitop sadrži afinitetni tag i opcioni linker, i/ili
(ii) rekombinantni AAV kapsidni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (prikazanu u SEQ ID NO: 6) bočno raspoređenu i/ili operativno povezanu sa bar 5 susednih aminokiselina AAV kapsidnog proteina.
6. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde heterologni epitop sadrži aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL (SEQ ID NO:6) ili njen deo, i gde paratop antitela specifično vezuje aminokiselinsku sekvencu EQKLISEEDL ili njen deo.
7. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je nukleotid od interesa:
(i) pod kontrolom promotora izabranog iz grupe koju čine virusni promotor, bakterijski promotor, promotor sisara, promotor ptica, promotor ribe, promotor insekata, i bilo koja njihova kombinacija; opciono pri čemu je nukleotid od interesa pod kontrolom ne-humanog promotora; ili
(ii) pod kontrolom ne-humanog promotora i uz bočno raspoređene AAV ITR sekvence; ili (iii) reporterski gen, opciono pri čemu reporterski gen kodira zeleni fluorescentni protein, ili je izabran iz grupe koju čine samoubilački gen, nukleotid koji kodira antitelo ili njegov fragment, nukleotid koji kodira CRISPR/Cas sistem ili njihov deo(delove), nukleotid koji kodira antisens RNK, nukleotid koji kodira siRNK, i njihovu kombinaciju.
8. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde multispecifični vezujući molekul je bispecifični vezujući molekul.
9. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, gde je paratop antitela Fv domen, opciono gde je Fv domen direktno spojen sa konstantnim domenom teškog lanca.
10. Kompozicija prema patentom zahtevu 1, gde je ligand za retargetiranje antitelo ili njegov deo, opciono:
pri čemu je antitelo bispecifično antitelo, pri čemu paratop antitela i ligand za retargetiranje svaki sadrže poseban Fv domen fuzionisan sa prvim i drugim konstantnim domenom teškog lanca, opciono pri čemu se prvi i drugi teški lanci vezuju za protein A sa diferencijalnim afinitetima vezivanja ili
pri čemu ligand za retargetiranje sadrži tetramernu strukturu antitela koja sadrži dva identična teška lanca imunoglobulina i dva identična laka lanca i gde je paratop antitela koji vezuje heterologni epitop vezan za C-kraj ili N-kraj jednog ili oba teška lanca i/ili na C-kraj ili N-kraj jednog ili oba teška lanca, i opciono gde je paratop antitela scFv, opciono gde scFv sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:37.
11. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je protein ćelijske površine receptor; i/ili pri čemu ligand za retargetiranje vezuje receptor eksprimiran na površini ćelije sisara ili čoveka.
12. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je AAV izabran iz grupe koju čine AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 i AAV9 i/ili pri čemu je heterologni epitop umetnut posle i/ ili zamenjuje poziciju izabranu iz grupe koju čine I-453 od AAV2, I-587 od AAV2, I-585 od AAV6, I-590 od AAV8, I-453 od AAV9, I-589 od AAV9 i bilo koje odgovarajuće aminokiseline AAV serotipa koji inficira primate.
13. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je AAV kapsid mozaični kapsid koji sadrži referentni AAV kapsidni protein istog serotipa koji ne sadrži heterologni epitop u određenom odnosu.
14. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je rekombinantni AAV kapsidni protein izveden iz himernog AAV kapsidnog gena modifikovanog da eksprimuje heterologni epitop, pri čemu himerni AAV kapsidni gen sadrži veći broj sekvenci nukleinskih kiselina, gde svaka od većg broja sekvenci nukleinske kiseline kodira deo kapsidnog proteina različitog AAV serotipa, i pri čemu veći broj sekvenci nukleinske kiseline zajedno kodira himerni AAV kapsidni protein.
15. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za upotrebu u in vivo postupku lečenja ili dijagnoze, pri čemu postupak obuhvata isporuku nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju koja eksprimuje protein ćelijske površine, što obuhvata dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa kompozicijom, pri čemu multispecifični vezujući molekul sadrži ligand za retargetiranje koji vezuje protein površine ćelije.
16. Kompozicija za upotrebu prema patentom zahtevu 15, pri čemu:
(a) isporuka je humanom subjektu; ili
(b) ciljna ćelija je humana ćelija; ili
(c) ciljna ćelija je humana neuronska ćelija; ili
(d) ciljna ćelija je humana mišićna ćelija; ili
(e) ciljna ćelija je izabrana iz grupe koja se sastoji od ćelije jetre, ćelije mozga, T ćelije, ćelije bubrega, crevne ćelije, ćelije pankreasa, ćelije kancera i ćelije inficirane heterolognim patogenom.
17. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 15 ili 16, gde:
(a) ciljna ćelija je ćelija humane jetre, opciono, pri čemu se ligand za retargetiranje vezuje za humani asijaloglikoproteinski receptor 1 (hASGR1) eksprimiran u humanoj ćeliji jetre; ili
(b) ligand za retargetiranje vezuje GABA receptor eksprimiran od strane humane neuronske ćelije; ili
(c) ligand za retargetiranje vezuje transferin receptor eksprimiran u humanoj neuronskoj ćeliji; (d) ciljna ćelija je humana T ćelija, opciono pri čemu se ligand za retargetiranje vezuje za CD3 eksprimiran od strane humane T ćelije; ili
(e) ciljna ćelija je humana T ćelija, opciono pri čemu se ligand za retargetiranje vezuje za CD3ε eksprimiran od strane humane T ćelije; ili
(f) ciljna ćelija je humana hematopoetska ćelija, opciono pri čemu se ligand za retargetiranje vezuje za CD34; ili
(g) ciljna ćelija je humana ćelija kancera, opciono pri čemu se ligand za retargetiranje vezuje za antigen povezan sa tumorom; ili
(h) ciljna ćelija je humana ćelija kancera, opciono pri čemu se ligand za retargetiranje vezuje za antigen povezan sa tumorom koji je E6, E7 ili Her2; ili
(i) protein na površini ćelije je humani glukagonski receptor (hGCGR); ili
(j) ciljna ćelija je crevna ćelija ili je ćelija pankreasa; opciono pri čemu je receptor ENTPD3.
18. Kompozicija za upotrebu u postupku prema patentnom zahtevu 15 ili 16, gde:
(i) ligand za retargetiranje vezuje CD20; ili
(ii) ligand za retargetiranje vezuje humani glukagonski receptor; ili
(iii)ligand za retargetiranje specifično vezuje CD63 ili humanu ektonukleozid trifosfat difosfohidrolazu 3 (hENTPD3).
19. Kompozicija prema patentnom zahtevu 5(i) pri čemu afinitetni tag sadrži c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:6).
20. Kompozicija prema patentnom zahtevu 6, pri čemu paratop antitela specifično vezuje c-myc, pri čemu paratop antitela sadrži HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i/ili LCDR3 sekvencu scFv kodiranu nukleinskom kiselinom koja je prikazana u SEQ ID NO:28.
21. Postupak in vitro ili ex vivo za isporuku nukleotida od interesa u ciljnu ćeliju koja eksprimira protein ćelijske površine, koji se sastoji od dovođenja u kontakt ciljne ćelije sa kompozicijom prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14, pri čemu multispecifični vezujući molekul sadrži ligand za retargetiranje koji vezuje protein ćelijske površine.
RS20240615A 2017-06-27 2018-06-27 Rekombinantni virusni vektori modifikovani tropizmom i njihove upotrebe za ciljano uvođenje genetičkog materijala u humane ćelije RS65569B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762525704P 2017-06-27 2017-06-27
PCT/US2018/039874 WO2019006043A1 (en) 2017-06-27 2018-06-27 RECOMBINANT VIRAL VECTORS WITH MODIFIED TROPISM AND USES THEREOF FOR TARGETED INTRODUCTION OF GENETIC MATERIAL INTO HUMAN CELLS
EP18749635.1A EP3645551B1 (en) 2017-06-27 2018-06-27 Tropism-modified recombinant viral vectors and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65569B1 true RS65569B1 (sr) 2024-06-28

Family

ID=63080487

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240615A RS65569B1 (sr) 2017-06-27 2018-06-27 Rekombinantni virusni vektori modifikovani tropizmom i njihove upotrebe za ciljano uvođenje genetičkog materijala u humane ćelije

Country Status (29)

Country Link
US (1) US20200140491A1 (sr)
EP (2) EP4372008A3 (sr)
JP (4) JP7372154B2 (sr)
KR (3) KR102877478B1 (sr)
CN (2) CN110799524A (sr)
AU (3) AU2018290882B2 (sr)
BR (1) BR112019027854A2 (sr)
CA (1) CA3066947A1 (sr)
CL (3) CL2019003842A1 (sr)
CO (1) CO2019014683A2 (sr)
DK (1) DK3645551T5 (sr)
ES (1) ES2978295T3 (sr)
FI (1) FI3645551T3 (sr)
HR (1) HRP20240773T1 (sr)
HU (1) HUE066398T2 (sr)
IL (2) IL271573B2 (sr)
LT (1) LT3645551T (sr)
MA (1) MA49513B1 (sr)
MD (1) MD3645551T2 (sr)
MX (2) MX2020000244A (sr)
PE (1) PE20200488A1 (sr)
PH (1) PH12019550266A1 (sr)
PL (1) PL3645551T3 (sr)
PT (1) PT3645551T (sr)
RS (1) RS65569B1 (sr)
SG (1) SG11201911610TA (sr)
SI (1) SI3645551T1 (sr)
SM (1) SMT202400189T1 (sr)
WO (1) WO2019006043A1 (sr)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018338728B2 (en) 2017-09-29 2025-01-02 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Rescue of central and peripheral neurological phenotype of Friedreich's Ataxia by intravenous delivery
EP3856762A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
CN113166208B (zh) 2018-10-02 2024-11-22 沃雅戈治疗公司 重新定向aav衣壳的嗜性
EP3736330A1 (en) * 2019-05-08 2020-11-11 European Molecular Biology Laboratory Modified adeno-associated virus (aav) particles for gene therapy
JP2022533438A (ja) 2019-05-24 2022-07-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 改変ウイルス粒子およびその使用
TWI900553B (zh) 2020-05-13 2025-10-11 美商航海家醫療公司 Aav蛋白殼之趨性重定向
AU2021378075B2 (en) 2020-11-11 2025-03-27 Borea Therapeutics S.R.L. Modified viral particles for gene therapy
CN115873987A (zh) * 2021-09-30 2023-03-31 北京五加和基因科技有限公司 检测腺相关病毒载体感染滴度的方法和试剂盒
EP4426716A1 (en) 2021-11-02 2024-09-11 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
JP2024540181A (ja) 2021-11-04 2024-10-31 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 骨格筋に再標的化されたウイルス粒子
CN114213505B (zh) * 2021-12-10 2022-09-20 和元生物技术（上海）股份有限公司 一种适用于特异感染u87-mg细胞的腺相关病毒突变体
CN119095866A (zh) * 2022-02-22 2024-12-06 北卡罗来纳大学查佩尔希尔分校 嵌合神经向性aav衣壳
CN115044615B (zh) * 2022-04-28 2025-09-05 三峡大学 一种靶向感染乳腺癌细胞的aav载体及应用
US20250302998A1 (en) 2022-05-09 2025-10-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
US20250312487A1 (en) * 2022-05-13 2025-10-09 Children's Medical Research Institute Adeno-associated virus capsids
CA3263388A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VIRAL PARTICLES RETRIBUTED TO TRANSFERRIN RECEPTOR 1
KR20250116795A (ko) 2022-11-14 2025-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 별아교세포로의 섬유아세포 성장 인자 수용체 3-매개된 전달을 위한 조성물 및 방법
EP4634220A2 (en) * 2022-12-16 2025-10-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antigen-binding molecules that bind to aav particles and uses
CN119894939A (zh) * 2022-12-23 2025-04-25 北京大学宁波海洋药物研究院 衣壳蛋白-抗体偶联物、修饰的病毒、药物组合和用途
EP4665764A1 (en) 2023-02-13 2025-12-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of muscle related disorders with anti-human cacng1 antibodies
WO2024229105A1 (en) 2023-05-02 2024-11-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-human m-cadherin (cdh15) antibodies, conjugates, and uses thereof for delivery of genetic payloads to muscle cells
CN118955652A (zh) * 2023-05-15 2024-11-15 杭州新昶基因技术有限公司 腺相关病毒衣壳蛋白、包含其的腺相关病毒及应用
EP4630457A1 (en) * 2023-08-18 2025-10-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and uses thereof
WO2025072501A2 (en) * 2023-09-26 2025-04-03 The Trustees Of Princeton University Method for converting farnesyl pyrophosphate synthase into a geranyl pyrophosphate synthase
WO2025151796A1 (en) 2024-01-11 2025-07-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Viral particles retargeted to nervous system tissues
US20250242018A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2025184603A2 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. The use of cd40 inhibitors for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2026025058A1 (en) 2024-07-25 2026-01-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aav viral particles retargeted to egfr-expressing cancer cells
WO2026039325A2 (en) 2024-08-12 2026-02-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified mtm1 genes and uses thereof
CN119039401B (zh) * 2024-08-19 2025-04-11 广州派真生物技术有限公司 腺相关病毒突变体及其应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2224907A1 (en) 1995-07-25 1997-02-13 Introgene B.V. Methods and means for targeted gene delivery
IL137681A0 (en) 1998-02-06 2001-10-31 Uab Research Foundation Adenovirus vector containing a heterologous peptide epitope in the hi loop of the fiber knob
DE19849643A1 (de) * 1998-10-29 2000-05-04 Deutsches Krebsforsch An das AAV-Kapsid bindender, den Zelltropismus verändernder Antikörper und Verfahren zum gerichteten Gentransfer
DE19933719A1 (de) * 1999-07-19 2001-01-25 Medigene Ag Strukturprotein in Adeno-assoziiertem Virus mit veränderten chromatographischen Eigenschaften, seine Herstellung und Verwendung
US20050233307A1 (en) * 2002-09-12 2005-10-20 Kyle Gee Site-specific labeling of affinity tags in fusion proteins
US7273835B2 (en) * 2004-08-04 2007-09-25 Honeywell International Inc. Azeotrope-like compositions of difluoromethane
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
ES2971647T3 (es) 2005-04-15 2024-06-06 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y usos de los mismos
EP2012122A1 (en) 2007-07-06 2009-01-07 Medigene AG Mutated parvovirus structural proteins as vaccines
ES2602610T3 (es) 2007-05-31 2017-02-21 Medigene Ag Proteína estructural mutada de un parvovirus
MY192182A (en) 2009-06-26 2022-08-04 Regeneron Pharma Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
ES2724975T3 (es) 2009-12-10 2019-09-18 Regeneron Pharma Ratones que producen anticuerpos de cadena pesada
FR2955773B1 (fr) * 2010-02-01 2017-05-26 Commissariat Energie Atomique Complexe moleculaire de ciblage des antigenes vers les cellules presentatrices d'antigene et ses applications pour la vaccination
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
EP3492597A3 (en) * 2013-05-21 2019-08-28 University of Florida Research Foundation, Inc. Capsid-modified, raav3 vector compositions and methods of use in gene therapy of human liver cancer
CA3124228C (en) 2014-03-21 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
US10370432B2 (en) * 2014-10-03 2019-08-06 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted AAVS
DE102015207516A1 (de) * 2015-04-23 2016-10-27 Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt Für Sera Und Impfstoffe Kopplung von Proteinen von Interesse (POI) mit viralen Vektoren mittels Intein-vermittelten Proteinspleißens

Also Published As

Publication number Publication date
BR112019027854A2 (pt) 2020-07-07
MX2020000244A (es) 2020-09-28
CO2019014683A2 (es) 2020-01-17
PT3645551T (pt) 2024-05-13
JP7851839B2 (ja) 2026-04-27
KR20250160215A (ko) 2025-11-11
IL317938A (en) 2025-02-01
LT3645551T (lt) 2024-05-10
EP4372008A2 (en) 2024-05-22
CN110799524A (zh) 2020-02-14
FI3645551T3 (fi) 2024-05-03
IL271573B1 (en) 2025-02-01
MX2023009050A (es) 2023-08-10
PH12019550266A1 (en) 2021-01-11
CA3066947A1 (en) 2019-01-03
MD3645551T2 (ro) 2024-08-31
JP2022183228A (ja) 2022-12-08
RU2020101279A (ru) 2021-07-27
EP3645551B1 (en) 2024-03-13
CL2020003343A1 (es) 2021-06-25
IL271573B2 (en) 2025-06-01
IL271573A (en) 2020-02-27
SMT202400189T1 (it) 2024-07-09
SI3645551T1 (sl) 2024-06-28
MA49513B1 (fr) 2024-05-31
KR102877478B1 (ko) 2025-10-29
MA49513A (fr) 2020-05-06
AU2023206143A1 (en) 2023-08-10
SG11201911610TA (en) 2020-01-30
CL2024001376A1 (es) 2024-10-25
AU2026200511A1 (en) 2026-02-12
AU2018290882B2 (en) 2023-07-27
AU2023206143B2 (en) 2025-10-30
CL2019003842A1 (es) 2020-07-24
BR122023021213A2 (pt) 2024-02-20
CN117051045A (zh) 2023-11-14
DK3645551T3 (da) 2024-05-06
KR102714347B1 (ko) 2024-10-14
AU2018290882A1 (en) 2020-01-16
DK3645551T5 (da) 2024-08-26
EP3645551A1 (en) 2020-05-06
US20200140491A1 (en) 2020-05-07
PE20200488A1 (es) 2020-03-03
RU2020101279A3 (sr) 2022-02-04
JP2026042952A (ja) 2026-03-11
ES2978295T3 (es) 2024-09-10
WO2019006043A1 (en) 2019-01-03
JP2024036644A (ja) 2024-03-15
HRP20240773T1 (hr) 2024-09-13
KR20240149451A (ko) 2024-10-14
PL3645551T3 (pl) 2024-07-01
EP4372008A3 (en) 2024-07-31
KR20200022434A (ko) 2020-03-03
JP7372154B2 (ja) 2023-10-31
HUE066398T2 (hu) 2024-07-28
JP2020529196A (ja) 2020-10-08
CN117051045B (zh) 2025-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102877478B1 (ko) 유전 물질을 인간 세포 내로 표적화하여 도입하기 위한 향성-변형 재조합 바이러스 벡터 및 이의 용도
KR102390075B1 (ko) 오르니틴 트랜스카르바밀라아제（ｏｔｃ） 결핍증의 치료에 유용한 조성물
JP2024150445A (ja) クローディン６抗体及びがんを治療するための方法
KR20180100304A (ko) 유전자 요법을 위한 아데노-관련-바이러스 벡터의 척추강 내 투여
IL262268B2 (en) Compositions and methods for making antibodies based on use of an expression-enhancing locus
CN114174340A (zh) 密封蛋白-6抗体和药物缀合物
CN114250227B (zh) 用于高水平表达外源基因的表达载体
RU2809246C2 (ru) Рекомбинантные вирусные векторы с модифицированным тропизмом и пути их применения для нацеленного введения генетического материала в клетки человека
CN115943214A (zh) 用于获得car-nk细胞的方法
CN114250226A (zh) 用于高水平表达外源基因的表达载体
HK40112774A (en) Tropism-modified recombinant viral vectors and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells
BR122024025144A2 (pt) Ácido nucleico isolado, método de produção de um vetor aav, vetor aav, molécula de ligação, e, composição
BR122023021213B1 (pt) Composição para o redirecionamento de proteínas do capsídeo viral
HK40018460B (en) Tropism-modified recombinant viral vectors and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells
HK40018460A (en) Tropism-modified recombinant viral vectors and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells
US20030166287A1 (en) Targeted delivery through a cationic amino acid transporter