ES2978909T3 - Anticuerpos contra haptenos de aripiprazol y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Se describe un anticuerpo que se une al aripiprazol, que se puede utilizar para detectar aripiprazol en una muestra, como en un método de inmunoensayo competitivo. El anticuerpo se puede utilizar en un dispositivo de ensayo de flujo lateral para la detección en el punto de atención de aripiprazol, incluida la detección múltiple de aripiprazol, olanzapina, quetiapina y risperidona en un solo dispositivo de ensayo de flujo lateral. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos contra haptenos de aripiprazol y uso de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los inmunoensayos y, en particular, a los anticuerpos que se unen al aripiprazol y que pueden usarse en inmunoensayos para la detección del aripiprazol.

Antecedentes

La esquizofrenia es un trastorno psiquiátrico crónico y debilitante que afecta aproximadamente al 0,45-1% de la población mundial (van Os, J.; Kapur, S. "Schizophrenia"Lancet2009, 374, 635-645). Los principales objetivos del tratamiento son lograr una remisión sostenida de los síntomas psicóticos, reducir el riesgo y las consecuencias de las recaídas y mejorar el funcionamiento y la calidad de vida en general del paciente. Aunque muchos pacientes con esquizofrenia son capaces de lograr la estabilidad de los síntomas con los medicamentos antipsicóticos disponibles, la mala adherencia a la medicación es una razón común para la recaída con medicamentos orales administrados diariamente. Varios estudios (Abdel-Baki, A.; Ouellet-Plamondon, C.; Malla, A. "Pharmacotherapy Challenges in Patients with First-Episode Psychosis"Journal of Affective Disorders2012, 138, S3-S14) que investigan los resultados del incumplimiento han demostrado que los pacientes con esquizofrenia que no toman la medicación según lo prescrito tienen mayores tasas de recaída, ingreso hospitalario y suicidio, así como un aumento de la mortalidad. Se estima que entre el 40 y el 75% de los pacientes con esquizofrenia tienen dificultades para cumplir un régimen de tratamiento oral diario (Lieberman, J. A.; Stroup, T. S.; McEvoy, J. P.; Swartz, M. S.; Rosenheck, R. A.; Perkins, D. O.; Keefe, R. S. E.; Davis, S. M.; Davis, C. E.; Lebowitz, B. D.; Severe, J.; Hsiao, J. K. "Effectiveness of Antipyschotic Drugs in Patients with Chronic Schizophrenia"New England Journal of Medicine2005, 353(12), 1209-1223).

La monitorización terapéutica de fármacos (TDM) es la cuantificación de las concentraciones séricas o plasmáticas de fármacos, incluyendo los fármacos antipsicóticos, para la monitorización y optimización del tratamiento. Dicha monitorización permite, por ejemplo, la identificación de pacientes que no cumplen su régimen de medicación, que no alcanzan las dosis terapéuticas, que no responden a las dosis terapéuticas, que tienen una tolerabilidad subóptima, que presentan interacciones farmacocinéticas entre fármacos o que tienen un metabolismo anormal que da como resultado concentraciones plasmáticas inapropiadas. Existe una considerable variabilidad individual en la capacidad del paciente para absorber, distribuir, metabolizar y excretar fármacos antipsicóticos. Tales diferencias pueden estar provocadas por enfermedades concurrentes, edad, medicación concomitante o peculiaridades genéticas. Las diferentes formulaciones de los fármacos también pueden influir en el metabolismo de los fármacos antipsicóticos. La TDM permite la optimización de dosis para pacientes individuales, mejorando los resultados terapéuticos y funcionales. Además, la TDM permite al médico que prescribe garantizar el cumplimiento con las dosificaciones prescritas y la obtención de concentraciones séricas efectivas.

Hasta la fecha, los métodos para determinar los niveles de concentraciones séricas o plasmáticas de fármacos antipsicóticos implican el uso de cromatografía líquida (LC) con detección UV o espectrometría de masas, y radioinmunoensayos (consultar, por ejemplo, Woestenborghs et al., 1990 "On the selectivity of some recently developed RIA's" en Methodological Surveys in Biochemistry and Analysis 20:241-246. Analysis of Drugs and Metabolites, Including Anti-infective Agents; Heykants et al., 1994 "The Pharmacokinetics of Risperidone in Humans: A Summary", J Clin Psychiatry 55/5, suppl:13-17; Huang et al., 1993 "Pharmacokinetics of the novel anti-psychotic agent risperidone and the prolactin response in healthy subjects", Clin Pharmacol Ther 54:257-268). Los radioinmunoensayos detectan una o ambas sustancias, risperidona y paliperidona. Salamone et al. en la Patente de Estados Unidos N° 8,088,594 divulgan un inmunoensayo competitivo para risperidona usando anticuerpos que detectan tanto risperidona como paliperidona pero no metabolitos farmacológicamente inactivos. Los anticuerpos usados en el inmunoensayo competitivo se desarrollan contra un inmunógeno particular. ID Labs Inc. (Londres, Ontario, Canadá) comercializa un ELISA para la olanzapina, otro fármaco antipsicótico, que también utiliza un formato competitivo. Las instrucciones de uso indican que el ensayo está diseñado con propósitos de cribado y destinado a uso forense o de investigación, y específicamente no está destinado a uso terapéutico. Las instrucciones recomiendan que todas las muestras positivas deberían confirmarse con cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC-MS), e indican que el anticuerpo usado detecta olanzapina y clozapina (consultar ID Labs Inc., "Instructions For Use Data Sheet IDEL-F083", Fecha de revisión 8 de agosto de 2011). Algunos de estos métodos, concretamente la HPLC y la GC/MS, pueden ser caros y laboriosos, y por lo general sólo se realizan en laboratorios grandes o especializados que disponen del equipo adecuado.

Existe una necesidad de otros métodos para determinar los niveles de fármacos antipsicóticos, en particular métodos que puedan realizarse en la consulta del médico que prescribe (donde el tratamiento de un paciente individual puede ajustarse en consecuencia de manera mucho más oportuna) y en otros entornos médicos que carezcan de equipos de LC o GC/MS o que requieran resultados rápidos de las pruebas.

La WO 2011/163594 divulga profármacos para su uso en la administración de fármacos en el tratamiento de varios trastornos, incluyendo profármacos de aripiprazol. La WO 2007/035348 se dirige a composiciones y métodos que comprenden aripiprazol nanoparticulado, o una sal o derivado del mismo. La WO 2010/142974 se dirige a la determinación de la ingesta abusiva de mCPP. Benchikh et al., 2009, informa sobre la generación de anticuerpos policlonales para la detección de trazodona o mCPP. La EP 2261259 está dirigida a la generación de anticuerpos contra la mCPP y al uso de tales anticuerpos para detectar antidepresivos basados en N-(3-clorofenil)piperazina mediante inmunoensayo. La WO 2011/115733 está dirigida a la generación de anticuerpos que son selectivamente reactivos a los fármacos risperidona y paliperidona. Huang et al., 2007, se dirige a métodos para detectar aripiprazol en una muestra mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas. La WO 2005/059547 divulga un inmunoensayo competitivo para detectar analitos en una muestra.

El aripiprazol es:

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones.

La presente invención se dirige a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une específicamente al aripiprazol y al dehidroaripipiprazol, y que se genera en respuesta a un compuesto de Fórmula II (compuesto 6) en el que la proteína es un portador inmunogénico, y en donde el anticuerpo o el fragmento de unión del mismo genera las mismas curvas de respuesta a la dosis para el aripiprazol y el dehidroaripipiprazol en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) competitivo.

Fórmula II (Compuesto 6):

Las realizaciones actualmente preferidas del anticuerpo de la presente invención son los anticuerpos designados 3C1, 3D7 y 5C7, generados contra el compuesto que tiene la Fórmula II.

Fórmula II (Compuesto 6):

Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de la presente invención pueden proporcionarse en kits de ensayo y dispositivos de ensayo, siendo un dispositivo actualmente preferido un dispositivo de ensayo de flujo lateral que permite el análisis en el punto de atención.

La invención proporciona además un método de producción de un anticuerpo que se une al aripiprazol, el método comprendiendo: (i) seleccionar una célula huésped no humana para la producción de anticuerpos; y (ii) inocular el huésped no humano con un compuesto de Fórmula II (compuesto 6) en donde la proteína es un portador inmunogénico, en donde el huésped produce un anticuerpo que se une al aripiprazol. Se proporciona además un método de producción de una línea celular de hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal que se une al aripiprazol. El método comprende: (i) seleccionar un huésped no humano para la producción de anticuerpos; (ii) inocular al huésped no humano un conjugado de un compuesto de Fórmula II (compuesto 6) en donde la proteína es un portador inmunogénico; (iii) fusionar una línea celular del huésped inoculado con una célula en división continua para crear una célula fusionada capaz de producir un anticuerpo monoclonal que se une al aripiprazol; y (iv) clonar la célula fusionada para obtener una línea celular de hibridoma.

La invención proporciona además un método de detección de aripiprazol en una muestra. El método comprende: (i) poner en contacto una muestra con un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con la presente invención que se marca con un marcador detectable, en donde el anticuerpo marcado o el fragmento de unión del mismos y el aripiprazol presente en la muestra forman un complejo marcado; y (ii) detectar el complejo marcado para detectar el aripiprazol en la muestra.

Se proporciona además un método de inmunoensayo competitivo para detectar aripiprazol en una muestra. El método comprende: (i) poner en contacto una muestra con un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con la presente invención, y con el aripiprazol o un compañero de unión competitivo aripiprazol, en donde uno del anticuerpo o fragmento de unión del mismo y del aripiprazol o del compañero de unión competitivo del mismo se marcad con un marcador detectable, y en donde el aripiprazol de la muestra compite con el aripiprazol o el compañero de unión competitivo del mismo para unirse al anticuerpo o fragmento de unión del mismo; y (ii) detectar el marcador para detectar el aripiprazol de la muestra.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica tras la consideración detallada de las realizaciones preferidas que siguen.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra los resultados del ELISA competitivo generados con el hibridoma 3C1;

La Fig. 2 muestra los resultados del ELISA competitivo generados con el hibridoma 3D7;

La Fig. 3 muestra el formato de inmunoensayo competitivo usado en un dispositivo de ensayo de flujo lateral; La Fig. 4 muestra el diseño del chip de un dispositivo de ensayo de flujo lateral de acuerdo con la presente invención;

La Fig. 5 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para un control positivo de aripiprazol generado con el anticuerpo 5C7 y un compañero de unión competitivo de aripiprazol marcado;

La Fig. 6 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para un control positivo de olanzapina generado con el anticuerpo 4G9-1 y un compañero de unión competitivo de olanzapina marcado;

La Fig. 7 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para un control positivo de quetiapina generado con el anticuerpo 11 y un compañero de unión competitivo de quetiapina marcado;

La Fig. 8 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para un control positivo de risperidona generado con el anticuerpo 5-9 y un compañero de unión competitivo de risperidona marcado;

La Fig. 9 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene aripiprazol generada con el anticuerpo 5C7 de aripiprazol en presencia de un compañero de unión competitivo de aripiprazol marcado, sin curva de respuesta a la dosis para olanzapina, quetiapina o risperidona en presencia de un compañero de unión competitivo marcado para cada uno;

La Fig. 10 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene olanzapina generada con el anticuerpo 4G9-1 de olanzapina en presencia de un compañero de unión competitivo de olanzapina marcado, sin curva de respuesta a la dosis para aripiprazol, quetiapina o risperidona en presencia de un compañero de unión competitivo marcado para cada uno;

La Fig. 11 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene quetiapina generada con el anticuerpo 11 de quetiapina en presencia de un compañero de unión competitivo marcado de quetiapina, sin curva de respuesta a la dosis para aripiprazol, olanzapina o risperidona en presencia de un compañero de unión competitivo marcado para cada uno;

La Fig. 12 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene risperidona generada con el anticuerpo 5-9 de risperidona en presencia de un compañero de unión competitivo marcado de risperidona, sin curva de respuesta a la dosis para aripiprazol, olanzapina o quetiapina en presencia de un compañero de unión competitivo marcado para cada uno;

La Fig. 13 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene aripiprazol generada con el anticuerpo 5C7 de aripiprazol en presencia de un compañero de unión competitivo marcado de aripiprazol, sin curva de respuesta a la dosis para olanzapina, quetiapina o risperidona en presencia de anticuerpo y compañero de unión competitivo marcado para cada uno;

La Fig. 14 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene olanzapina generada con el anticuerpo 4G9-1 de olanzapina en presencia de un compañero de unión competitivo marcado de olanzapina, sin curva de respuesta a la dosis para aripiprazol, quetiapina o risperidona en presencia de anticuerpo y compañero de unión competitivo marcado para cada uno;

La Fig. 15 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene quetiapina generada con el anticuerpo 11 de quetiapina en presencia del compañero de unión competitivo de quetiapina marcado, sin curva de respuesta a la dosis para aripiprazol, olanzapina o risperidona en presencia del anticuerpo y el compañero de unión competitivo marcado para cada uno;

La Fig. 16 muestra una curva típica de respuesta a la dosis para una muestra que contiene risperidona generada con el anticuerpo 5-9 de risperidona en presencia de un compañero de unión competitivo marcado de risperidona, sin curva de respuesta a la dosis para aripiprazol, olanzapina o quetiapina en presencia de anticuerpo y compañero de unión competitivo marcado para cada uno;

La Fig. 17 muestra una comparación de la curva de respuesta a la dosis de aripiprazol generada como control positivo con la curva de respuesta a la dosis de aripiprazol generada en el formato multiplex;

La Fig. 18 muestra una comparación de la curva de respuesta a la dosis de olanzapina generada como control positivo con la curva de respuesta a la dosis de olanzapina generada en el formato multiplex;

La Fig. 19 muestra una comparación de la curva de respuesta a la dosis de quetiapina generada como control positivo con la curva de respuesta a la dosis de quetiapina generada en el formato multiplex; y

La Fig. 20 muestra una comparación de la curva de respuesta a la dosis de risperidona generada como control positivo con la curva de respuesta a la dosis de risperidona generada en el formato multiplex.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión del mismo que se une al aripiprazol y al dehidroaripiprazol como se define en las reivindicaciones. La invención proporciona además un kit de ensayo y un dispositivo de ensayo que comprende el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención. También se proporcionan métodos de producción del anticuerpo y de producción de una línea celular de hibridoma capaz de producir el anticuerpo como se define en las reivindicaciones. Se proporciona además un método para detectar el aripiprazol en una muestra, que incluye un método de inmunoensayo competitivo como se define en las reivindicaciones.

La presente divulgación está dirigida a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula I y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i).

Fórmula I:

en donde:

R1 es H,

NH<2>, NHC(O)(CH<2>)<m>CO<2>H, o Z-(Y)<p>-G;

R<3>es H, o W-(Y)<p>-G; siempre que dos de R<1>, R<2>, R<3>sean H, y además siempre que R<1>, R<2>y R<3>no sean todos H simultáneamente;

en donde:

Z se selecciona del grupo que consiste en:

-N(R4)-, -O-, -S-, -alquilo-, -alcoxialquilo-, -aminoalquilo-, -tioalquilo-, -heteroalquilo-, -alquilcarbonilo-,

en donde:

W se selecciona del grupo que consiste en:

-C(O)-, -alquilo-, -alcoxialquilo-, -aminoalquilo-, -tioalquilo-, -heteroalquilo-, -alquilcarbonilo-;

R4 es H, un grupo alquilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo o un grupo arilo sustituido o no sustituido; Y es un grupo espaciador orgánico;

G es un grupo de enlace funcional capaz de unirse a un portador;

p es 0 o 1;

m es 1, 2, 3, 4, o 5; y

n es 1, 2, 3, 4, o 5.

La presente divulgación también se dirige a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula I y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i); en donde:

R1 es H,

CH<2>NH<2>, CH<2>NHC(O)(CH<2>)<m>CO<2>H, o Z-(Y)<p>-G;

R<2>es H,

NH<2>, NHC(O)(CH<2>)<m>CO<2>H, o Z-(Y)<p>-G;

R<3>es H, siempre que cualquiera de R<1>o R<2>sea H, y además siempre que tanto R<1>como R<2>no sean H simultáneamente;

en donde:

Z se selecciona del grupo que consiste en:

-N(R<4>)-, -O-, -S-, -alquilo-, -alcoxialquilo-, -aminoalquilo-, -tioalquilo-, -heteroalquilo-, -alquilcarbonilo-,

R4 es H, un grupo alquilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo o un grupo arilo sustituido o no sustituido; Y es un grupo espaciador orgánico;

G es un grupo de enlace funcional capaz de unirse a un portador;

p es 0 o 1;

m es 1, 2, 3, 4, o 5; y

n es 1, 2, 3, 4, o 5.

La presente divulgación también se dirige a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula I y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i); en donde:

R<1>es H, o CH<2>NH-(Y)<p>-G;

R<2>es H, o NH-(Y)<p>-G;

R<3>es H, siempre que cualquiera de R<1>o R<2>sea H, y siempre que tanto R<1>como R<2>no sean H simultáneamente; en donde:

Y es un grupo espaciador orgánico;

G es un grupo funcional de enlace capaz de unirse a un portador; y

p es 1.

La presente divulgación también se dirige a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula I y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i); en donde:

R<1>es H,

CH2NH2, CH2NHC(O)(CH2)mCO2H;

R2es H,

NH<2>, o NHC(O)(CH<2>)<m>CO<2>H; siempre que cualquiera de R<1>o R<2>sean H, y siempre que tanto R<1>como R<2>no sean H simultáneamente;

R<3>es H;

m es 1, 2, 3, 4 o 5;

n es 1, 2, 3, 4 o 5.

La presente divulgación también se dirige a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula I y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i); en donde:

R<1>es H, CH<2>NH<2>, o CH<2>NHC(O)(CH<2>)<m>CO<2>H; R<2>es H, NH<2>, o NHC(O)(CH<2>)<n>CO<2>H; siempre que cualquiera de R<1>o R<2>sea H, y siempre que tanto R<1>como R<2>no sean H simultáneamente;

R<3>es H;

m es 1, 2 o 3;

n es 1, 2 o 3.

La presente divulgación también se dirige a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula I y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i); en donde:

R<1>es H, CH<2>NH<2>, o CH<2>NHC(O)(CH<2>)<m>CO<2>H;

R<2>es H, NH<2>, o NHC(O)(CH<2>)<n>CO<2>H; siempre que cualquiera de R<1>o R<2>sea H, y siempre que tanto R<1>como R<2>no sean H simultáneamente;

R<3>es H;

m es 2;

n es 2.

La presente divulgación también se dirige a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula III y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i).

Fórmula III:

La presente divulgación también se dirige a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula IV y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i).

Fórmula IV:

La presente divulgación también se dirige a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula V y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i).

Fórmula V:

La presente divulgación también se dirige a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula VI y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i).

Fórmula VI:

La presente divulgación también se dirige a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula VII y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i).

Fórmula VII:

La presente divulgación también se dirige a un anticuerpo aislado o un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula VIII y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i).

Fórmula VIII:

El anticuerpo de la divulgación se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto seleccionado entre los compuestos de: Fórmula I, Fórmula III, Fórmula IV, Fórmula V, Fórmula VI, Fórmula VII y Fórmula VIII; y un portador inmunogénico.

En la sección siguiente titulada "Compuestos, conjugados e inmunógenos" se proporcionan detalles adicionales de los compuestos descritos mediante las fórmulas anteriores y los conjugados formados por los compuestos y un portador inmunogénico.

En la sección siguiente titulada "Anticuerpos" se proporcionan detalles adicionales sobre los anticuerpos de la presente invención.

La presente invención proporciona además un kit de ensayo que comprende el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención, así como un dispositivo de ensayo que comprende el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención. Preferiblemente, el dispositivo de ensayo es un dispositivo de ensayo de flujo lateral. En la sección siguiente titulada "Kits y dispositivos de ensayo" se proporcionan detalles adicionales sobre los kits y dispositivos de ensayo.

En la presente se divulga un método para producir un anticuerpo que se une al aripiprazol, el método comprende: (i) seleccionar una célula huésped no humana para la producción de anticuerpos; e (ii) inocular al huésped no humano un conjugado de un compuesto de Fórmula I y un portador inmunogénico, en donde el huésped produce un anticuerpo que se une al aripiprazol. El conjugado usado en el método puede ser un conjugado de un compuesto seleccionado entre los compuestos de: Fórmula III, Fórmula IV, Fórmula V, Fórmula VI, Fórmula VII y Fórmula VIII; y un portador inmunogénico. En la sección siguiente titulada "Anticuerpos" se proporcionan detalles adicionales sobre la producción de los anticuerpos de la presente invención.

Se divulga además un método para producir una línea celular de hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal que se une al aripiprazol. El método comprende: (i) seleccionar un huésped no humano para la producción de anticuerpos; (ii) inocular al huésped un conjugado de un compuesto de Fórmula I y un portador inmunogénico; (iii) fusionar una línea celular del huésped inoculado con una célula en división continua para crear una célula fusionada capaz de producir un anticuerpo monoclonal que se une al aripiprazol; y (iv) clonar la célula fusionada para obtener una línea celular de hibridoma. El conjugado usado en el método puede ser un conjugado de un compuesto seleccionado entre los compuestos de: Fórmula III, Fórmula IV, Fórmula V, Fórmula VI, Fórmula VII y Fórmula VIII; y un portador inmunogénico. En la sección siguiente titulada "Anticuerpos" se proporcionan detalles adicionales sobre la producción de hibridomas de acuerdo con la presente invención.

La invención proporciona además un método de detección de aripiprazol en una muestra. El método comprende: (i) poner en contacto una muestra con un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con la presente invención que está marcado con un marcador detectable, en donde el anticuerpo marcado o el fragmento de unión del mismo y el aripiprazol presentes en la muestra forman un complejo marcado; y (ii) detectar el complejo marcado para detectar aripiprazol en la muestra. En la sección siguiente titulada "Inmunoensayos" se proporcionan detalles adicionales sobre el método de detección de aripiprazol de acuerdo con la presente invención.

Se proporciona además un método de inmunoensayo competitivo para detectar aripiprazol en una muestra. El método comprende: (i) poner en contacto una muestra con un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de acuerdo con la presente invención, y con aripiprazol o un compañero de unión competitivo de aripiprazol, en donde uno del anticuerpo o fragmento de unión del mismo y el aripiprazol o el compañero de unión competitivo del mismo se marca con un marcador detectable, y en donde el aripiprazol de la muestra compite con el aripiprazol o el compañero de unión competitivo del mismo para unirse al anticuerpo o fragmento de unión del mismo; y (ii) detectar el marcador para detectar el aripiprazol de la muestra. En la sección siguiente titulada "Inmunoensayos" se proporcionan detalles adicionales del método de inmunoensayo competitivo para detectar aripiprazol de acuerdo con la presente invención.

En una realización preferida de la presente invención, la detección de aripiprazol se acompaña de la detección de uno o más analitos además de aripiprazol. Preferiblemente, el uno o más analitos son fármacos antipsicóticos distintos del aripiprazol, y más preferiblemente los fármacos antipsicóticos distintos del aripiprazol se seleccionan del grupo que consiste en: risperidona, paliperidona, quetiapina, olanzapina y metabolitos de los mismos.

Como se ha analizado anteriormente, los anticuerpos de la invención pueden usarse en ensayos para detectar la presencia y/o cantidad del fármaco antipsicótico en muestras de pacientes. Dicha detección permite la monitorización de fármacos terapéutica con todas las ventajas de la misma. La detección de los niveles de fármacos antipsicóticos puede ser útil para muchos propósitos, cada uno de los cuales representa otra realización de la presente invención, incluyendo: determinación de la adherencia o cumplimiento del paciente con la terapia prescrita; uso como herramienta de decisión para determinar si un paciente debe pasarse de un régimen antipsicótico oral a un régimen antipsicótico inyectable de acción prolongada; uso como herramienta de decisión para determinar si debe aumentarse o disminuirse el nivel de dosis o el intervalo de dosificación de antipsicóticos orales o inyectables para asegurar el logro o mantenimiento de niveles eficaces o seguros del fármaco; uso como ayuda en el inicio de la terapia con fármacos antipsicóticos al proporcionar pruebas de la consecución de niveles de pK mínimos; uso para determinar la bioequivalencia de fármacos antipsicóticos en múltiples formulaciones o de múltiples fuentes; uso para evaluar el impacto de la polifarmacia y las posibles interacciones entre fármacos; y uso como indicación de que debe excluirse o incluirse un paciente en un ensayo clínico y como ayuda en la monitorización posterior de la adherencia a los requisitos de medicación del ensayo clínico.

COMPUESTOS, CONJUGADOS E INMUNÓGENOS

En relación con los compuestos y conjugados e inmunógenos, se usan las siguientes abreviaturas: AIBN es azobisisobutironitrilo; AMAS es éster de N-(a-maleimidoacetoxi)succinimida; BTG es tiroglobulina bovina; Bu3N es tributilamina; DMF es N,N-dimetilformamida; EDTA es ácido etilendiaminotetraacético; EtOH es alcohol etílico; KLH es hemocianina de lapa californiana; NBS es N-bromo succinimida; SATA es N-succinimidil S-acetiltioacetato; THF es tetrahidrofurano; TFA es ácido trifluoroacético; DCC es diciclohexilcarbodiimida; DIC es diisopropilcarbodiimida; DMAP es N,N-dimetil-4-aminopiridina; EDC es 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimidahidrocloruro; NHS es N-hidroxisuccinimida; TFP es tetrafluorofenilo; PNP es p-nitrofenilo; TBTU es tetrafluoroborato de O-(Benzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio; HOBT es N-hidroxibenzotriazol; DEPBT es 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotrazin-4(3H)-ona; BOP-Cl es cloruro Bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfónico; DTT es ditioperitritol.

El término "conjugado" se refiere a cualquier sustancia formada por la unión de partes separadas. Los conjugados representativos incluyen los formados por la unión de una molécula pequeña, como los compuestos de Fórmula I, y una molécula grande, como un portador o un polímero de poliamina, en particular una proteína. En el conjugado, la molécula pequeña puede unirse a uno o más sitios activos de la molécula grande.

El término "hapteno" hace referencia a un antígeno parcial o incompleto. Un hapteno es una sustancia libre de proteínas, que no es capaz de estimular la formación de anticuerpos, pero que sí reacciona con los anticuerpos. Los anticuerpos se forman acoplando un hapteno a un portador inmunógeno de alto peso molecular, y luego inyectando este producto acoplado, es decir, un inmunógeno, en un sujeto humano o animal.

El término "inmunógeno" se refiere a una sustancia capaz de provocar, producir o generar una respuesta inmunitaria en un organismo.

Un "portador inmunogénico", como se usa en la presente, es una sustancia inmunogénica, normalmente una proteína, que puede unirse en una o más posiciones con haptenos, permitiendo de este modo la producción de anticuerpos que pueden unirse a estos haptenos. Ejemplos de sustancias portadoras inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a, proteínas, glicoproteínas, poliamino-polisacáridos complejos, partículas y ácidos nucleicos que se reconocen como extraños y, por lo tanto, provocan una respuesta inmunológica del huésped no humano. Los poliamino-polisacáridos pueden prepararse a partir de polisacáridos usando cualquiera de los medios convencionales conocidos para esta preparación.

Como portadores inmunogénicos pueden emplearse varios tipos de proteínas incluyendo, sin limitación, albúminas, proteínas séricas, lipoproteínas, etc. Entre las proteínas ilustrativas se incluyen la albúmina sérica bovina, la hemocianina de lapa californiana, la ovoalbúmina de huevo, la tiroglobulina bovina, la fracción V de la albúmina sérica humana, la albúmina de conejo, la globulina de semilla de calabaza, el toxoide diftérico, el toxoide tetánico, la toxina botulínica, las proteínas succiniladas y los poli(aminoácidos) sintéticos como la polilisina.

Los portadores inmunogénicos también pueden incluir poli amino-polisacáridos, que son polímeros de alto peso molecular formados por condensaciones repetidas de monosacáridos. Ejemplos de polisacáridos son los almidones, el glucógeno, la celulosa, las gomas de carbohidratos como la goma arábiga, el agar, y demás. El polisacárido también contiene residuos de poli(aminoácidos) y/o residuos de lípidos.

El portador inmunogénico también puede ser un poli(ácido nucleico) solo o conjugado con uno de los poli(aminoácidos) o polisacáridos mencionados anteriormente.

El portador inmunogénico también puede incluir partículas sólidas. Por lo general, las partículas tienen un diámetro de por lo menos aproximadamente 0,02 micras (|jm) y no más de aproximadamente 100 |jm, y habitualmente de aproximadamente 0,05 jm a 10 jm . La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, óptimamente de una densidad aproximada a la del agua, generalmente de aproximadamente 0,7 a 1,5 g/ml, y compuesta de material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partículas pueden ser materiales biológicos como células y microorganismos, incluyendo ejemplos no limitativos como eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli y virus. Las partículas también pueden estar compuestas de polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas, látex, vesículas de fosfolípidos o lipoproteínas.

El término "derivado" se refiere a un compuesto químico o molécula elaborado a partir de un compuesto original mediante una o más reacciones químicas.

El término "análogo" de un compuesto químico se refiere a un compuesto químico que contiene una cadena de átomos de carbono y los mismos grupos funcionales particulares que un compuesto de referencia, pero la cadena de carbono del análogo es más larga o más corta que la del compuesto de referencia.

Un "marcador", "molécula detectora", "informador" o "marcador detectable" es cualquier molécula que produzca, o que puede inducirse para que produzca, una señal detectable. El marcador puede conjugarse con un analito, un inmunógeno, un anticuerpo o con otra molécula, como un receptor o una molécula que pueda unirse a un receptor, como un ligando, en particular un hapteno o un anticuerpo. Un marcador puede unirse directa o indirectamente mediante una fracción de enlace o puente. Ejemplos no limitativos de marcadores incluyen isótopos radiactivos (por ejemplo,125I), enzimas (por ejemplo, p-galactosidasa, peroxidasa), fragmentos de enzimas, sustratos de enzimas, inhibidores de enzimas, coenzimas, catalizadores, fluoróforos (por ejemplo, rodamina, isotiocianato de fluoresceína o FITC, o Dylight 649), colorantes, quimioluminiscentes y luminiscentes (por ejemplo, dioxetanos, luciferina), o sensibilizadores.

Como se usa en la presente, un "espaciador" se refiere a una parte de una estructura química que conecta dos o más subestructuras como haptenos, portadores, inmunógenos, marcadores o compañeros de unión a través de un grupo de enlace funcional. Estos grupos espaciadores están formados por los átomos típicamente presentes y ensamblados en las formas que se encuentran típicamente en los compuestos orgánicos, por lo que pueden denominarse "grupos espaciadores orgánicos". Las unidades estructurales químicas usadas para ensamblar los espaciadores se describirán más adelante en esta solicitud. Entre los espaciadores preferidos se encuentran las cadenas de carbono lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas. Estas cadenas de carbono también pueden incluir uno o más heteroátomos dentro de la cadena, uno o más heteroátomos que sustituyen uno o más hidrógenos de cualquier átomo de carbono de la cadena, o en los extremos terminales de las cadenas. Por "heteroátomos" se entienden átomos distintos del carbono que se eligen del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre, en donde los átomos de nitrógeno, fósforo y azufre pueden existir en cualquier estado de oxidación y pueden tener carbono u otros heteroátomos unidos a ellos. El espaciador también puede incluir grupos cíclicos o aromáticos como parte de la cadena o como sustitución en uno de los átomos de la cadena.

El número de átomos del grupo espaciador se determina contando los átomos distintos del hidrógeno. El número de átomos de una cadena dentro de un grupo espaciador se determina contando el número de átomos distintos del hidrógeno a lo largo de la ruta más corta entre las subestructuras que se conectan. Las longitudes de cadena preferidas están comprendidas entre 1 y 20 átomos.

Un "grupo de enlace funcional" se refiere a un grupo reactivo presente en un hapteno y que puede usarse para proporcionar un sitio reactivo disponible a través del cual puede acoplarse la porción de hapteno a otra fracción mediante la formación de un enlace químico covalente para producir un conjugado de un hapteno con otra fracción (como un marcador o un portador). El hapteno puede enlazarse de este modo a una fracción como la biotina para formar un compañero de unión competitivo.

Pueden usarse grupos espaciadores para enlazar el hapteno al portador. Los espaciadores de distintas longitudes permiten unir el hapteno a diferentes distancias del portador para presentarlo al sistema inmunitario del animal o el humano que se esté inmunizado para la optimización del proceso de formación de anticuerpos. La unión a diferentes posiciones en la molécula de hapteno permite la oportunidad de presentar sitios específicos en el hapteno al sistema inmunitario para influir en el reconocimiento de anticuerpos. El espaciador puede contener grupos solubilizantes hidrófilos para hacer que el derivado del hapteno sea más soluble en medios acuosos. Los ejemplos de grupos solubilizantes hidrófilos incluyen, entre otros, grupos polioxialquiloxi, por ejemplo, cadenas de polietilenglicol; grupos hidroxilo, carboxilato y sulfonato.

El término "grupo nucleofílico" o "nucleófilo" se refiere a una especie que dona un par de electrones para formar un enlace químico en una reacción. El término "grupo electrofílico" o "electrófilo" se refiere a una especie que acepta un par de electrones de un nucleófilo para formar un enlace químico en una reacción.

El término "sustituido" se refiere a la sustitución de un átomo o grupo de átomos en lugar de un átomo de hidrógeno en un átomo de carbono en cualquier posición de la molécula original. Ejemplos no limitativos de sustituyentes incluyen átomos de halógeno, grupos amino, hidroxi, carboxi, alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo, ciano, alcoxi, nitro, aldehído y cetona.

El término "alquilo" se refiere a radicales de cadena lineal y ramificada, saturados o insaturados, de hasta 12 átomos de carbono, a menos que se indique lo contrario, y se pretende que incluya específicamente radicales que tengan cualquier grado o nivel de saturación. El alquilo incluye, entre otros, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, isohexilo, heptilo, octilo, 2,2,4-trimetilpentilo, nonilo, decilo, undecilo y dodecilo.

El término "cicloalquilo" se refiere a un radical de anillo de hidrocarburo monocíclico o bicíclico saturado o parcialmente insaturado compuesto de 3 a 10 átomos de carbono. En el anillo puede haber opcionalmente sustituyentes alquilo. Algunos ejemplos son el ciclopropilo, el 1,1 -dimetilciclobutilo, el 1,2,3-trimetilciclopentilo, el ciclohexilo y el ciclohexenilo.

El término "heteroalquilo" se refiere a un grupo alquilo que incluye uno o más heteroátomos dentro de la cadena, uno o más heteroátomos que sustituyen a uno o más hidrógenos de cualquier átomo de carbono de la cadena, o en los extremos terminales de las cadenas.

El término "aminoalquilo" se refiere a por lo menos un grupo amino primario o secundario unido a cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena alquílica.

El término "alcoxi" se refiere a radicales de cadena lineal o ramificada de hasta 12 átomos de carbono, a menos que se indique lo contrario, unidos a un átomo de oxígeno. Los ejemplos incluyen, entre otros, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi y butoxi.

El término "alcoxialquilo" se refiere a por lo menos un grupo alcoxi unido a cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena alquílica.

El término "tioalquilo" se refiere a por lo menos un grupo de azufre unido a cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena alquílica. El grupo azufre puede estar en cualquier estado de oxidación e incluye sulfóxidos, sulfonas y sulfatos.

El término "grupo carboxilato" incluye los ácidos carboxílicos y los ésteres de carboxilato de alquilo, cicloalquilo, arilo o aralquilo.

El término "alquilcarbonilo" se refiere a un grupo que tiene un grupo carbonilo unido a cualquier átomo de carbono a lo largo de una cadena alquílica.

El término "heteroarilo" se refiere a radicales de anillos aromáticos monocíclicos de 5 a 7 miembros o bicíclicos de 8 a 10 miembros, cualquier anillo de los cuales puede consistir en uno a cuatro heteroátomos seleccionados de N, O o S, donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden existir en cualquier estado de oxidación permitido. Los ejemplos incluyen bencimidazolilo, benzotiazolilo, benzotienilo, benzoxazolilo, furilo, imidazolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, oxazolilo, pirazinilo, pirazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolilo, quinolinilo, tiazolilo y tienilo.

El término "arilo" se refiere a radicales de anillos aromáticos monocíclicos o bicíclicos que contienen de 6 a 12 carbonos en el anillo. Los sustituyentes alquilo pueden estar presentes opcionalmente en el anillo. Los ejemplos incluyen el fenilo, el bifenilo y el naftaleno.

El término "aralquilo" se refiere a un grupo alquilo C<1-6>que contiene un sustituyente arilo. Los ejemplos incluyen el bencilo, el feniletilo o el 2-naftilmetilo.

El término "acilo" se refiere al grupo -C(O)R<a>, donde R<a>es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, arilo, aralquilo y heteroarilo. Un "agente acilante" añade el grupo -C(O)R<a>a una molécula.

El término "sulfonilo" se refiere al grupo -S(O)R<2b>, donde R<b>es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, haloalquilo, arilo, aralquilo y heteroarilo. Un "agente sulfonilante" añade el grupo -S(O)R<2a>a una molécula.

Los espaciadores que llevan grupos de enlace funcionales reactivos para la unión de haptenos a fracciones portadoras pueden prepararse mediante una amplia variedad de métodos. El espaciador puede formarse usando una molécula funcionalizada o activada diferencialmente con grupos en cualquier extremo para permitir la reacción secuencial selectiva con el hapteno y el portador, pero también puede usarse la misma fracción reactiva en ambos extremos. Los grupos seleccionados para reaccionar con el hapteno y el grupo de enlace funcional que se va a unir al portador vienen determinados por el tipo de funcionalidad del hapteno y del portador al que se va a unir el hapteno.

Los espaciadores y métodos de unión a haptenos y portadores incluyen, entre otros, los descritos por Brinkley, M., A.,Bioconjugate Chem.1992, 3:2-13, Hermanson, Greg T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press, Londres, Amsterdam, Burlington, Mass., USA, 2008 yThermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook;disponible para descarga o solicitud de copia impresa en Thermo Scientific 3747 N Meridian Rd, Rockford, Ill. USA 61101, ph 800-874-3723 o en: http://www.piercenet.com/ y las referencias en el mismo. Muchas moléculas activadas diferencialmente para la formación de grupos espaciadores están disponibles comercialmente a través de proveedores, por ejemplo Thermo Scientific.

Para los haptenos que llevan un grupo amino, los modos de unión del espaciador al hapteno incluyen la reacción de la amina del hapteno con una unidad estructural del espaciador que lleva un haluro de acilo o un éster activo. Los "ésteres activos" se definen como ésteres que reaccionan con un grupo nucleofílico, por ejemplo un grupo amino, en condiciones suaves para formar un enlace estable. Un enlace estable se define como aquel que permanece intacto en condiciones de uso posterior, por ejemplo, en pasos sintéticos posteriores, como inmunógeno o en un ensayo bioquímico. Un ejemplo preferido de enlace estable es un enlace amida. Los ésteres activos y los métodos de formación se describen en Benoiton, N. L., en Houben-Weyl,Methods ofOrganic Chemistry,Thieme Stuttgart, Nueva York, vol E22 sección 3.2:443 y Benoiton, N. L.,Chemistry of Peptide Synthesis,Taylor and Francis, NY, 2006. Los ésteres activos preferidos incluyen el éster de p-nitrofenilo (PNP), el éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) y el éster de tetrafluorofenilo (TFP). Los haluros de acilo pueden prepararse por muchos métodos conocidos por un experto en la materia, por ejemplo, reacción del ácido carboxílico con cloruro detionilo o cloruro de oxalilo, consultar: Fieser, L. F. y Fieser, M.Reagents for Organic Synthesis,John Wiley y Sons, NY, 1967 y las referencias en el mismo. Éstos pueden convertirse en otros ésteres activos, como los ésteres de p-nitrofenilo (PNP), que también pueden usarse en espaciadores bifuncionales activos, como se describe en Wu et. al,Organic Letters,2004, 6 (24):4407. Los ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) pueden prepararse por reacción de N,N-disuccinimidilcarbonato (CAS 74124-79-1) con el ácido carboxílico de un compuesto en presencia de una base orgánica como trietilamina o diisopropiletilamina en un solvente aprótico en condiciones anhidras como se describe en el Ejemplo 35 de la WO2012012595 o usando N-hidroxisuccinimida y diciclohexilcarbodiimida (DCC) u otro agente deshidratante, en condiciones anhidras. Los ésteres de tetrafluorofenilo (TFP) pueden prepararse por reacción de ácidos carboxílicos con 2,3,5,6-tetrafluorofeniltrifluoroacetato en presencia de una base orgánica como trietilamina o diisopropiletilamina en un solvente aprótico en condiciones anhidras, como informa Wilbur, et. al,Bioconjugate Chem.,2004, 15(1):203. Un experto en la técnica reconocerá que los espaciadores mostrados en la Tabla 1, entre otros, pueden obtenerse usando métodos conocidos y unirse a haptenos portadores de amino utilizando la optimización rutinaria de las condiciones de reacción. Estos espaciadores permiten la unión del hapteno a un grupo tiol de un portador.

Tabla 1

También puede usarse como modo de unión el acoplamiento directo de la amina en el hapteno y una funcionalidad de ácido carboxílico en la unidad estructural en presencia de un agente de acoplamiento. Los reactivos preferidos son los usados habitualmente en la síntesis de péptidos. Los reactivos de acoplamiento de péptidos incluyen, entre otros, O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU, CAS N° 125700-67-6), consultar: Pruhs, S.,Org. Process. Res. Dev.2006, 10:441; N-hidroxibenzotriazol (H<o>B<t>, CAS N° 2592-95-2) con un agente deshidratante de carbodiimida, por ejemplo N-N-diclohexilcarbodiimida (DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC) o 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimidahidrocloruro (EDC), consultar: Konig W., Geiger, R.Chem. Ber.,1970, 103 (3):788; 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotrazin-4(3H)-ona (DEPBT, CAS N° 165534-43-0), consultar: Liu, H. et. al.,chínese Chemical Letters,2002, 13(7):601; cloruro fosfónico de bis(2-oxo-3-oxazolidinilo); (BOP-Cl, CAS N° 68641 49-6), consultar: Diago-Meseguer, J et. al.Synthesis,1980, 7:547-51 y otros descritos en detalle en Benoiton enChemistry of Peptide Synthesis,CRC Press, Boca Ratón, FL, 2005, Capítulo 2, y el boletín técnico proporcionado por Advanced Automated Peptide Protein Technologies (aapptec), 6309 Shepardsville Rd., Louisville Ky .40228, ph 888 692 9111; www.aapptec.com, y las referencias del mismos. Estos métodos crean un enlace amida estable que une el hapteno al espaciador. Se muestran ejemplos de espaciadores que pueden obtenerse usando métodos conocidos y unirse a haptenos portadores de amino usando la optimización rutinaria de las condiciones de reacción empleando los métodos descritos y citados anteriormente, pero sin limitarse a los de la Tabla 2. Estos espaciadores permiten la unión del hapteno a un grupo tiol de un portador.

Tabla 2

Los espaciadores también pueden construirse por pasos mediante la unión secuencial de grupos químicos apropiados al hapteno, incluyendo el paso de formación del grupo de enlace funcional que es capaz de unirse al portador. Ver ejemplos ilustrativos en Esquemas generales de reacción.

Además, cuando el hapteno tiene un grupo nucleofílico, por ejemplo un grupo tiol, un grupo amino o un grupo hidroxilo que se convertirá en el punto de unión del espaciador, el espaciadortambién puede construirse por alquilación del grupo tiol, amino o hidroxilo. Para unir el espaciador puede usarse cualquier grupo alquilo que esté adecuadamente sustituido con una fracción capaz de experimentar una reacción de sustitución, por ejemplo, un haluro de alquilo o un éster de ácido sulfónico como el p-toluenosulfonato. Los expertos en la técnica conocen muchos ejemplos de reacciones de alquilación y ejemplos específicos pueden encontrarse en la bibliografía química general y optimizarse mediante experimentación rutinaria. En el capítulo 10 deMarch's Advanced Organic Chemistry,Smith, M. B., y March, J., John Wiley & sons, Inc. NY, 2001 puede encontrarse un análisis de las reacciones de alquilación con muchas referencias. También pueden emplearse otros enlaces como la reacción de la fracción nucleofílica, por ejemplo una amina, en el hapteno con un isocianato para formar una urea o la reacción con un isotiocianato para formar un enlace tiourea, consultar: Li, Z., et. al.,Phosphorus, Sulfur and Silicon and the Related Elements,2003, 178(2):293-297. Los espaciadores pueden unirse a haptenos que llevan grupos hidroxilo mediante reacción con grupos isocianato para formar enlaces carbamato o uretano. El espaciador puede activarse diferencialmente con el grupo funcional isocianato en un extremo y un grupo funcional de enlace capaz de reaccionar con el portador, consultar: Annunziato, M. E., Patel, U. S., Ranade, M. y Palumbo, P. S.,Bioconjugate Chem.,1993, 4:212-218.

Para los haptenos que llevan un grupo ácido carboxílico, los modos de unión de una porción espaciadora al hapteno incluyen la activación del grupo de ácido carboxílico como un haluro de acilo o éster activo, ejemplos de los cuales se muestran en la Tabla 3, cuya preparación se ha descrito anteriormente, seguido de reacción con un grupo amino (-NH<2>-), hidrazino (-NH-NH<2>-), hidrazido (-C(O)-NH-NH<2>-) o hidroxilo (-OH) en la porción espaciadora para formar un enlace amida, hidrazida, diacilhidrazina o éster, o acoplamiento directo del grupo ácido carboxílico con un grupo amino en la porción espaciadora o directamente en el portador con un reactivo de acoplamiento peptídico y/o un reactivo deshidratante de carbodiimida, descritos anteriormente, ejemplos de los cuales se muestran en las Tablas 4 y 5. Los procedimientos encontrados en las referencias citadas anteriormente para la formación de ésteres activados y el uso de agentes de acoplamiento de péptidos pueden emplearse para la unión de haptenos portadores de ácido carboxílico a unidades estructurales de espaciadores y portadores proteicos con grupos amino disponibles utilizando la optimización rutinaria de las condiciones de reacción.

Tabla 3

En el hapteno puede haber otros grupos electrofílicos para unir el espaciador, por ejemplo, un haluro de sulfonilo

o grupo fosforoso electrófilo, por ejemplo:

o

j!-p -c i

ÓRC

Consultar: Malachowski, William P., Coward, James K.,Journal of Organic Chemistry,1994, 59 (25):7616 o:

Rc es alquilo, cicloalquilo, arilo, arilo sustituido, aralquilo.

Consultar: Aliouane, L., et. al,Tetrahedron Letters,2011, 52(28):8681.

Los haptenos que llevan grupos aldehído o cetona pueden unirse a espaciadores usando métodos que incluyen, entre otros, la reacción con un grupo hidrazida H2N-NH-C(O)- en el espaciador para formar una acilhidrazona, consutlar: Chamow, S. M., Kogan, T. P., Peers, D. H., Hastings, R. C., Byrn, R. A. y Askenaszi, A.,J. Biol. Chem.,1992, 267(22): 15916. En la Tabla 6 se muestran ejemplos de grupos espaciadores de hidrazida bifuncionales que permiten la unión a un grupo tiol en el portador.

Tabla 6

Los haptenos también pueden contener grupos tiol que pueden reaccionar con el portador, siempre que el portador se haya modificado para que proporcione un grupo que pueda reaccionar con el tiol. Los grupos portadores pueden modificarse por métodos que incluyen, entre otros, la unión de un grupo que contenga un grupo funcional maleimida por reacción de un grupo amino en el portador con N-succinimidil maleimidoacetato, (AMAS, CAS N° 55750 61-3), Succinimidil yodoacetato (CAS N° 151199-81-4), o cualquiera de los grupos espaciadores bifuncionales mostrados en la Tabla 1 para introducir un grupo que pueda experimentar una reacción que resulte en la unión del hapteno al portador.

El grupo de enlace funcional capaz de formar un enlace con el portador puede ser cualquier grupo capaz de formar un enlace estable y puede ser reactivo a una serie de grupos diferentes del portador. El grupo de enlace funcional puede reaccionar preferentemente con un grupo amino, un grupo de ácido carboxílico o un grupo tiol en el portador, o un derivado de los mismos. Ejemplos no limitativos del grupo de enlace funcional son un grupo de ácido carboxílico, un haluro de acilo, un éster activo (como se ha definido anteriormente), un isocianato, un isotiocianato, un haluro de alquilo, un grupo amino, un grupo tiol, un grupo maleimida, un grupo acrilato (H2C=CH-C(O)-) o un grupo vinil sulfona H2C=CH-SO2-) Consultar: Park, J. W., et. al.,Bioconjugate Chem.,2012, 23(3): 350. El grupo de enlace funcional puede estar presente como parte de una unidad estructural del espaciador diferencialmente activada que puede reaccionar por pasos con el hapteno y el derivado de hapteno resultante puede reaccionar a continuación con el portador. Alternativamente, el hapteno puede derivatizarse con un espaciador que contenga un grupo precursor que pueda transformarse en el grupo de enlace funcional mediante una reacción posterior. Cuando el grupo de enlace funcional en el espaciador es una amina o un grupo de ácido carboxílico, la reacción de acoplamiento con el grupo de ácido carboxílico o la amina en el soporte puede llevarse a cabo directamente mediante el uso de reactivos de acoplamiento peptídico de acuerdo con los procedimientos en las referencias citadas anteriormente para estos reactivos.

Como grupo funcional de enlace en el espaciador pueden usarse grupos disulfuro particulares, por ejemplo, piridildisulfuros, que puede experimentar intercambio con un grupo tiol en el portador a partir de un enlace disulfuro mixto, consultar: Ghetie, V., et al.,Bioconjugate Chem.,1990, 1:24-31. Estos espaciadores pueden unirse por reacción del hapteno que lleva amina con un éster activo que se une a un espaciador que lleva el grupo piridildisulfuro, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, los que se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7

Lo más frecuente es que el portador sea una proteína y que puedan usarse los grupos £-amino de los residuos de lisina para la unión, bien directamente por reacción con un grupo de enlace funcional reactivo a la amina, bien tras derivitización con un grupo que contenga tiol, incluido el N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA, CAS 76931-93-6), o un análogo del mismo, seguido de la escisión del grupo acetato con hidroxilamina para exponer el grupo tiol a la reacción con el grupo de enlace funcional del hapteno. Los grupos tiol también pueden introducirse en el portador mediante la reducción de los enlaces disulfuro dentro de los portadores proteicos con reactivos reductores suaves, incluyendo, entre otros, 2-mercaptoetilamina, consultar: Bilah, M., et. al.,Bioelectrochemistry,2010, 80(1):49, reactivos de fosfina, consultar: Kirley, T. L.,Analytical Biochemistry, 1989,180(2):231 o ditioeritritol (DTT, C<a s>3483-12-3) Cleland, W.,Biochemistry, 1964,3:480-482.

ESQUEMAS GENERALES DE REACCIÓN

Los compuestos útiles para producir los anticuerpos divulgados en la presente pueden sintetizarse de acuerdo con los métodos sintéticos generales descritos a continuación. Los compuestos de Fórmula I pueden prepararse pormétodos conocidos por los expertos en la técnica. Los siguientes esquemas de reacción sólo pretenden representar ejemplos de la invención y de ninguna manera se pretende que sean un límite de la invención.

El hapteno del Ejemplo 1 puede elaborarse con espaciadores mediante reacción con un compuesto anhídrido cíclico, como el anhídrido succínico o el anhídrido glutárico, como se muestra en el Esquema 1. La reacción puede llevarse a cabo en un solvente como THF, a temperatura ambiente, durante la noche.

El hapteno del Ejemplo 2 puede elaborarse con espaciadores mediante reacción con un compuesto de anhídrido cíclico, como el anhídrido succínico o el anhídrido glutárico, como se muestra en el Esquema 2. La reacción puede llevarse a cabo en un solvente tal como piridina, y calentarse a aproximadamente 110° C en un horno microondas durante 3-6 horas.

Esquema 3

Los haptenos que terminan en un grupo alquilamina, como el del Ejemplo 1, pueden funcionalizarse adicionalmente con un grupo maleimida. Los expertos en la técnica reconocerán que la misma metodología será aplicable a otros derivados de alquilamino del aripiprazol. La reacción de la amina derivada de aripiprazol con el grupo de funcionalización alquil-maleimida, como 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1 -ilo, en un solvente como DMF, en presencia de una base, como tributil amina, a 20° C, durante una hora, genera haptenos de aripiprazol con un espaciador de maleimida.

Los espaciadores de los haptenos pueden extenderse como se muestra en el Esquema 4. Los haptenos con espaciadores que llevan una funcionalidad de ácido carboxílico pueden disolverse en un solvente adecuado, como diclorometano, en atmósfera inerte, y tratarse con N-t-butoxicarbonilpiperazina y una base adecuada, como diisopropiletilamina. A continuación, la solución puede tratarse con cianofosfonato de dietilo para instalar una fracción de piperazina en el espaciador. La desprotección de la piperazina puede lograrse con ácido trifluoroacético u otros métodos conocidos en la técnica. La reacción con un anhídrido cíclico da compuestos de Fórmula I donde R1 es

Los espaciadores de los haptenos también pueden extenderse como se muestra en el Esquema 5. Los haptenos con espaciadores que llevan funcionalidad de ácido carboxílico pueden disolverse en un solvente adecuado, como diclorometano, en atmósfera inerte, y tratarse con N-t-butoxicarbonilpiperazina y una base apropiada, como diisopropiletilamina. A continuación, la solución puede tratarse con cianofosfonato de dietilo para instalar una fracción de piperazina en el espaciador. La desprotección de la piperazina puede realizarse con ácido trifluoroacético u otros métodos conocidos en la técnica. La reacción con un anhídrido cíclico da compuestos de Fórmula I donde R2 es

Los haptenos también pueden generarse directamente a partir del aripiprazol de la molécula original mediante acilación o alquilación del nitrógeno de quinolinona. El esquema 6 representa una ruta sintética en la que puede añadirse un grupo acilo al aripiprazol por reacción con el cloruro de ácido del ácido 4-clorobutírico usando N,N-dimetil-4-aminopiridina (DMAP) como catalizador en presencia de una base como la piridina en un solvente aprótico, por ejemplo N,N-dimetilformamida, consultar: Ejemplo 5, US20110230520. La sustitución nucleofílica del cloruro por el éster metílico de N-metil-p-alanina puede llevarse a cabo en presencia de yoduro de sodio y una base, por ejemplo carbonato de potasio en un solvente aprótico dipolartal como N,N-dimetilformamida, consultar: Penning, T., D., et. al.,J. Med Chem,2002, 45:3482. La hidrólisis del grupo éster usando métodos estándar conocidos por un experto en la técnica, como la exposición a una base acuosa, proporciona un hapteno carboxi-funcionalizado que puede seguir elaborándose usando los métodos descritos anteriormente, un ejemplo de los cuales se representa en el Esquema 9 a continuación, para proporcionar un compuesto adecuadamente funcionalizado para su unión a un portador inmunogénico.

El esquema 7 ilustra un modo de unión de un grupo alquilo al nitrógeno del grupo quinolinona del aripiprazol usando la química de alquilación estándar. Puede hacerse reaccionar un compuesto yodado, por ejemplo metil-4yodobutirato, con aripiprazol en presencia de una base, como carbonato de cesio, en un solvente aprótico dipolar, como N,N-dimetilformamida, usando el método del Ejemplo 6 de la US20120004165. La hidrólisis del grupo éster usando métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica, como la exposición a una base acuosa, proporciona un hapteno carboxi-funcionalizado que puede seguir elaborándose usando los métodos descritos anteriormente, un ejemplo de los cuales se representa en el Esquema 9 a continuación, para proporcionar un compuesto adecuadamente funcionalizado para su unión a un portador inmunogénico.

Esquema 7

Los haptenos funcionalizados con maleimida pueden conjugarse con proteínas de acuerdo con el método mostrado en el Esquema 8. La activación de los residuos de lisina de la proteína mediante la acilación del nitrógeno épsilon con N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA), seguido de la posterior hidrólisis del grupo S-acetilo con hidroxilamina produce un grupo sulfhidrilo nucleófilo. La conjugación de la proteína activada por el sulfhidrilo con el hapteno derivatizado con maleimida (preparado como se describe en el Esquema general 3) se realiza mediante una reacción de adición de Michael. Las proteínas adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen hemocianina de lapa californiana, tiroglobulina bovina y ovoalbúmina. Mientras que el Esquema 8 ilustra la conjugación proteína-hapteno en la que R1 es

la misma química puede usarse para conjugar cualquier hapteno funcionalizado con maleimida con una proteina.

Esquema 9:

donde x e s m o n , según se define en la Fórmula I.

Los haptenos funcionalizados con ácidos carboxílicos pueden conjugarse con proteínas de acuerdo con el método mostrado en el Esquema 9. La reacción con N-hidroxisuccinimida y un agente de acoplamiento adecuado, como la diciclohexilcarbodiimida (DCC) y una base como la tributilamina (Bu<3>N), en un solvente como DMF a una temperatura de aproximadamente 20° C, durante aproximadamente 18 horas, activa el ácido carboxílico con el grupo saliente hidroxipirrolidina-2,5-diona. A continuación, el espaciador activado y el hapteno pueden conjugarse con una proteína en un solvente, como un tampón de fosfato de pH 7,5, a aproximadamente 20° C durante aproximadamente 2,5 horas. Los expertos en la técnica conocen las proteínas adecuadas e incluyen hemocianina de lapa californiana, tiroglobulina bovina y ovoalbúmina. Aunque el Esquema 9 ilustra la conjugación proteína-hapteno en la que R<2>es NHC(O)(CH<2>)<n>CO<2>H, la misma química puede usarse para conjugar cualquier hapteno funcionalizado con CO<2>H con una proteína.

ANTICUERPOS

La presente divulgación se dirige a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión del mismo, que se une al aripiprazol y que: (i) se genera en respuesta a un conjugado de un compuesto de Fórmula I y un portador inmunogénico; o (ii) compite por un epítopo que es el mismo que un epítopo al que se une el anticuerpo de (i). El término "anticuerpo" se refiere a una proteína específica capaz de unirse a un antígeno o a una porción del mismo (de acuerdo con esta invención, capaz de unirse al aripiprazol y al dehidroaripiprazol). Un anticuerpo se produce en respuesta a un inmunógeno que puede haberse introducido en un huésped no humano, por ejemplo, un animal, mediante inyección. El término genérico "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos.

"Anticuerpo" o "fragmento de anticuerpo de unión a antígeno" se refiere a un anticuerpo intacto, o a un fragmento del mismo, que compite con el anticuerpo intacto por la unión. En términos generales, se dice que un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es menor o igual a 1 pM, preferiblemente menor o igual a 100 nM y lo más preferible menor o igual a 10 nM. La unión puede medirse por métodos conocidos por los expertos en la ténica, un ejemplo siendo el uso de un instrumento BIAcore™.

Los fragmentos de anticuerpo comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región variable o de unión al antígeno del anticuerpo intacto. Los fragmentos de unión incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')<2>, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Se entiende que un anticuerpo que no sea "biespecífico" o "bifuncional" tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos.

Como se usa en la presente, "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a un receptor de inmunoglobulina o de células T. Los determinantes epitópicos consisten habitualmente de agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que dos anticuerpos "se unen al mismo epítopo" si se demuestra que un anticuerpo compite con el segundo anticuerpo en un ensayo de unión competitiva, por cualquiera de los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (como el método BIAcore™ mencionado anteriormente). En referencia a un hapteno (como el aripiprazol u otro fármaco antipsicótico), puede generarse un anticuerpo contra la molécula de hapteno no antigénica conjugando el hapteno con un portador inmunogénico. Se genera entonces un anticuerpo que reconoce un "epítopo" definido por el hapteno.

"Aislado" cuando se usa en el contexto de un anticuerpo significa alterado "por la mano del hombre" de cualquier estado natural; es decir, que, si se presenta en la naturaleza, ha sido cambiado o retirado de su entorno original, o ambas cosas. Por ejemplo, un anticuerpo de origen natural presente de manera natural en un animal vivo en su estado natural no está "aislado", pero el mismo anticuerpo separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", tal como se emplea el término en la presente. Los anticuerpos pueden aparecer en una composición, como un reactivo de inmunoensayo, que no son composiciones de origen natural, y en ese caso siguen siendo anticuerpos aislados en el sentido de dicho término, tal como se emplea en la presente.

La "reactividad cruzada" se refiere a la reacción de un anticuerpo con un antígeno que no se usó para inducir ese anticuerpo.

Preferiblemente, el anticuerpo se unirá al fármaco y a cualquier metabolito farmacológicamente activo deseado. Alterando la ubicación de la unión del portador inmunogénico al compuesto, puede manipularse en los anticuerpos la selectividad y la reactividad cruzada con los metabolitos. En el caso del aripiprazol, puede ser deseable la reactividad cruzada con el dehidroaripipiprazol. Pueden generarse anticuerpos que detecten tanto el aripiprazol como el dehidroaripipiprazol, o pueden generarse anticuerpos que detecten cada uno por separado (definiendo por tanto las propiedades de "unión específica" del anticuerpo). Un anticuerpo se une específicamente a uno o más compuestos cuando su unión a uno o más compuestos es equimolar o sustancialmente equimolar.

Los métodos de producción de dichos anticuerpos comprenden inocular a un huésped no humano el conjugado descrito en la presente. Los huéspedes no humanos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, conejos, pollos, burros, caballos, monos, chimpancés, orangutanes, gorilas, y cualquier especie capaz de montar una respuesta inmunitaria madura. Los procedimientos de inmunización están bien establecidos en la técnica y se exponen en numerosos tratados y publicaciones, incluyendo"The Immunoassay Handbook",2a edición, editado por David Wild (Nature Publishing Group, 2000). Preferiblemente, se administra un inmunógeno que incorpora características como se enumera en las reivindicaciones a un sujeto huésped no humano, por ejemplo, un animal, en combinación con un adyuvante. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund, hidróxido de aluminio en polvo (alumbre), hidróxido de aluminio junto conBordetella pertussis,y monofosforil lípido A-sintético trehalosa dicorynomycolate (MPL-TDM).

Típicamente, se inyecta un inmunógeno o una combinación de un inmunógeno y un adyuvante en un huésped mamífero no humano mediante una o múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. Preferiblemente, el programa de inmunización se lleva a cabo durante por lo menos una semana, y más preferiblemente, durante dos o más semanas. Los anticuerpos policlonales producidos de esta manera pueden aislarse y purificarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante los métodos de hibridoma bien establecidos de Kohlery Milstein, por ejemplo,Nature256:495-497 (1975). Los métodos de hibridoma típicamente implican inmunizar un huésped no humano o linfocitos de un huésped no humano, recoger el anticuerpo monoclonal que secreta o tiene el potencial de secretar linfocitos, fusionar los linfocitos con células inmortalizadas y seleccionar las células que secretan el anticuerpo monoclonal deseado.

Puede inmunizarse a un huésped no humano para proporcionar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos específicos para un inmunógeno. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Si se desean células humanas, pueden usarse linfocitos de sangre periférica, aunque se prefieren células de bazo o linfocitos de otras fuentes de mamíferos.

Los linfocitos pueden fusionarse con una línea celular inmortalizada para formar células de hibridoma, proceso que puede facilitarse mediante el uso de un agente de fusión, por ejemplo, polietilenglicol. A título ilustrativo, pueden usarse células mutantes de mieloma de roedor, bovino o humano inmortalizadas por transformación. Se prefieren las poblaciones sustancialmente puras de células de hibridoma, frente a las células inmortalizadas no fusionadas. Por tanto, tras la fusión, las células pueden cultivarse en un medio adecuado que inhiba el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas, por ejemplo, usando células de mieloma mutantes que carezcan de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT). En tal caso, pueden añadirse hipoxantina, aminopterina y timidina al medio (medio HAT) para impedir el crecimiento de las células deficientes en HGPRT y permitir al mismo tiempo el crecimiento de los hibridomas.

Preferiblemente, las células inmortalizadas se fusionan eficientemente, pueden aislarse de poblaciones mixtas por selección en un medio como HAT, y soportan una expresión estable y de alto nivel de anticuerpo tras la fusión. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas incluyen líneas celulares de mieloma disponibles de la American Type Culture Collection, Manassas, VA.

Como las células de hibridoma típicamente secretan anticuerpos extracelularmente, pueden ensayarse los medios de cultivo para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales específicos para el fármaco antipsicótico. La inmunoprecipitación de los ensayos de unión in vitro, por ejemplo, puede usarse el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabosrbente ligado a enzimas (ELISA), para medir la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales.

Las células de hibridoma secretoras de anticuerpos monoclonales pueden aislarse como clones únicos mediante procedimientos de dilución limitante y subcultivarse. Los medios de cultivo adecuados incluyen, entre otros, el medio Eagle modificado por Dulbecco, RPMI-1640, y medios libres de polipéptidos, reducidos en polipéptidos o libres de suero, por ejemplo, Ultra DOMA PF o HL-1, disponibles de Biowhittaker, Walkersville, Md. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis.

Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y/o purificarse a partir de un medio de cultivo o líquido de ascitis mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas (Ig) que incluyen, entre otros, polipéptido A-SEFAROSA, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden producirse por métodos recombinantes como los descritos en la Patente de Estados Unidos N° 4.166.452. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que se unen específicamente a genes de cadenas de anticuerpos pesadas y ligeras murinas, preferiblemente para sondear ADN aislado de líneas celulares de hibridoma de anticuerpos monoclonales que secretan anticuerpos específicos para fármacos antipsicóticos.

También pueden generarse fragmentos de anticuerpos que contengan sitios de unión específicos para el fármaco antipsicótico. Tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos F(ab')<2>que pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')<2.>Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse et al.,Science256:1270-1281 (1989)). Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fvy ScFv pueden expresarse y secretarse todos a partir deEscherichia coli,lo que permite la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E.coliy acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')<2>(Carter et al.,BioTechnology10:163-167 (1992)). Los expertos en la técnica conocen otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. También se contemplan los fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) (consultar las Patentes de Estados Unidos N° 5.761.894 y N° 5.587.458). Los fragmentos Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes; por tanto, es probable que muestren una unión no específica reducida. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.642.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

KITS Y DISPOSITIVOS DE ENSAYO

También puede proporcionarse un kit de ensayo (también denominado kit de reactivos) que comprenda un anticuerpo como se ha descrito anteriormente. Un kit de reactivos representativo puede comprender un anticuerpo que se une al fármaco antipsicótico, aripiprazol, un complejo que comprende un análogo de un fármaco antipsicótico o un derivado del mismo acoplado a una fracción de marcado, y opcionalmente también puede comprender uno o más calibradores que comprenden una cantidad conocida de un fármaco antipsicótico o un estándar relacionado.

La frase "kit de ensayo" se refiere a un conjunto de materiales y reactivos que se usa para realizar un ensayo. Los reactivos pueden suministrarse en combinación envasada dos en el mismo envase o en envases separados, dependiendo de sus reactividades cruzadas y estabilidades, y en forma líquida o liofilizada. Las cantidades y proporciones de los reactivos proporcionados en el kit pueden seleccionarse de tal manera que proporcionen resultados óptimos para una aplicación particular. Un kit de ensayo que incorpora características de la presente invención comprende anticuerpos que se unen al aripiprazol y al dehidroaripiprazol. El kit puede comprender, además, compañeros de unión competitivos del aripiprazol y materiales de calibración y control.

La frase "material de calibración y control" se refiere a cualquier material estándar o de referencia que contenga una cantidad conocida de un analito. Una muestra sospechosa de contener un analito y el material de calibración correspondiente se analizan en condiciones similares. La concentración de analito se calcula comparando los resultados obtenidos para el espécimen desconocido con los resultados obtenidos para el estándar. Esto se realiza comúnmente construyendo una curva de calibración.

Los anticuerpos que incorporan las características de la presente invención pueden incluirse en un kit, recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para su utilización. Cuando los anticuerpos se suministran en un kit, los diferentes componentes del inmunoensayo pueden envasarse en recipientes separados y mezclarse antes de su uso. Dicho envasado de los componentes por separado puede permitir el almacenamiento a largo plazo sin disminuir sustancialmente el funcionamiento de los componentes activos. Además, los reactivos pueden envasarse en entornos inertes, por ejemplo, bajo una presión positiva de gas nitrógeno, gas argón o similares, lo que es especialmente preferible para reactivos sensibles al aire y/o a la humedad.

Los reactivos incluidos en los kits que incorporan las características de la presente invención pueden suministrarse en todo tipo de recipientes, de tal manera que las actividades de los diferentes componentes se conserven sustancialmente, mientras que los propios componentes no sean adsorbidos o alterados sustancialmente por los materiales del recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, entre otros, ampollas, botellas, tubos de ensayo, viales, frascos, jeringuillas, sobres, por ejemplo, forrados de papel de aluminio, y similares. Los recipientes pueden estar hechos de cualquier material adecuado incluyendo, entre otros, vidrio, polímeros orgánicos, por ejemplo, policarbonato, poliestireno, polietileno, etc., cerámica, metal, por ejemplo, aluminio, aleaciones metálicas, por ejemplo, acero, corcho y similares. Además, los recipientes pueden comprender uno o más puertos de acceso estériles, por ejemplo, para el acceso a través de una aguja, como puede ser proporcionado por un tabique. Los materiales preferidos para los tabiques incluyen caucho y politetrafluoroetileno del tipo vendido con el nombre comercial TEFLON por DuPont (Wilmington, DE). Además, los recipientes pueden comprender dos o más compartimentos separados por separaciones o membranas que pueden retirarse para permitir el mezclado de los componentes.

Los kits de reactivos que incorporan características de la presente invención también pueden suministrarse con materiales de instrucción. Las instrucciones pueden imprimirse, por ejemplo, en papel y/o suministrarse en un medio legible electrónicamente. Alternativamente, las instrucciones pueden proporcionarse dirigiendo al usuario a un sitio web de Internet, por ejemplo, especificado por el fabricante o distribuidor del kit y/o por correo electrónico.

El anticuerpo también puede formar parte de un dispositivo de ensayo. Tales dispositivos de ensayo incluyen dispositivos de ensayo de flujo lateral. Un tipo común de dispositivo de ensayo de flujo lateral desechable incluye una zona o área para recibir la muestra líquida, una zona de conjugado y una zona de reacción. Estos dispositivos de ensayo se conocen comúnmente como tiras de ensayo de flujo lateral. Emplean un material poroso, por ejemplo, nitrocelulosa, que define una trayectoria para el flujo de fluido capaz de soportar el flujo capilar. Los ejemplos incluyen los mostrados en las Patentes de Estados Unidos N° 5,559,041, 5,714,389, 5,120,643, y 6,228,660.

Otro tipo de dispositivo de ensayo es un dispositivo de ensayo no poroso que tiene proyecciones para inducir el flujo capilar. Los ejemplos de tales dispositivos de ensayo se incluye el dispositivo de flujo lateral abierto divulgado en la Publicación Internacional de PCT N° WO 2003/103835, WO 2005/089082, WO 2005/118139 y WO 2006/137785.

En un dispositivo de ensayo no poroso, el dispositivo de ensayo generalmente tiene por lo menos una zona de adición de muestra, por lo menos una zona de conjugado, por lo menos una zona de reacción y por lo menos una zona de absorción. Las zonas forman una trayectoria de flujo por la que fluye la muestra desde la zona de adición de muestra hasta la zona de absorción. También se incluyen elementos de captura, como anticuerpos, en la zona de reacción, capaces de unirse al analito, opcionalmente depositados en el dispositivo (como por recubrimiento); y un material conjugado marcado también capaz de participar en reacciones que permitirán la determinación de la concentración del analito, depositado en el dispositivo en la zona de conjugado, en la que el material conjugado marcado lleva un marcador para la detección en la zona de reacción. El material conjugado se disuelve a medida que la muestra fluye a través de la zona de conjugado formando un penacho de conjugado de material conjugado marcado disuelto y muestra que fluye aguas abajo hacia la zona de reacción. A medida que el penacho de conjugado fluye hacia la zona de reacción, el material conjugado será capturado por los elementos de captura, ya sea mediante un complejo de material conjugado y analito (como en un ensayo "sándwich") o directamente (como en un ensayo "competitivo"). El material conjugado disuelto no unido será arrastrado más allá de la zona de reacción hacia la por lo menos una zona de absorción Tales dispositivos pueden incluir salientes o micropilares en la trayectoria del flujo.

Un instrumento como el divulgado en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° US20060289787A1 y US 20070231883A1, y las Patentes de Estados Unidos N° 7,416,700 y 6,139,800, es capaz de detectar el material conjugado unido en la zona de reacción. Los marcadores comunes incluyen colorantes fluorescentes que pueden detectarse mediante instrumentos que excitan los colorantes fluorescentes e incorporan un detector capaz de detectar los colorantes fluorescentes.

INMUNOENSAYOS

Los anticuerpos producidos de este modo pueden usarse en inmunoensayos para reconocer/unirse al fármaco antipsicótico, detectando de este modo la presencia y/o cantidad del fármaco en una muestra del paciente. Preferiblemente, el formato del ensayo es un formato de inmunoensayo competitivo. Dicho formato de ensayo y otros ensayos se describen, entre otros lugares, en Hampton et al.(Serological Methods, A Laboratory Manual,a Ps Press, St. Paul, Minn. 1990) y Maddox et al.(J. Exp. Med.158:12111, 1983).

El término "analito" se refiere a cualquier sustancia o grupo de sustancias cuya presencia o cantidad debe determinarse. Algunos analitos representativos de fármacos antipsicóticos incluyen, entre otros, la risperidona, la paliperidona, la olanzapina, el aripiprazol y la quetiapina.

El término "compañero de unión competitivo" se refiere a una sustancia o grupo de sustancias, como las que pueden emplearse en un inmunoensayo competitivo, que se comportan de manera similar a un analito con respecto a la afinidad de unión a un anticuerpo. Los compañeros de unión competitivos representativos incluyen, entre otros, derivados de fármacos antipsicóticos y similares.

El término "detectar" cuando se usa con un analito se refiere a cualquier método cuantitativo, semicuantitativo o cualitativo, así como a todos los demás métodos para determinar un analito en general, y un fármaco antipsicótico en particular. Por ejemplo, un método que simplemente detecta la presencia o ausencia de un fármaco antipsicótico en una muestra se encuentra dentro del alcance de la presente invención, al igual que los métodos que proporcionan datos en cuanto a la cantidad o concentración del fármaco antipsicótico en la muestra. Los términos "detectar", "determinar", "identificar" y similares se usan en la presente como sinónimos, y todos se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

Una realización preferida de la presente invención es un inmunoensayo competitivo en el que los anticuerpos que se unen al fármaco antipsicótico, o al fármaco o al compañero de unión competitivo del mismo, se unen a un soporte sólido (como la zona de reacción en un dispositivo de ensayo de flujo lateral) y el fármaco marcado o el compañero de unión competitivo del mismo, o el anticuerpo marcado, respectivamente, y una muestra derivada del huésped no humano se pasan sobre el soporte sólido y la cantidad de marcador detectado unido al soporte sólido puede correlacionarse con una cantidad de fármaco en la muestra.

De acuerdo con los métodos de las presentes realizaciones preferidas puede analizarse cualquier muestra que se sospeche que contenga un analito, por ejemplo, un fármaco antipsicótico,. La muestra puede pretratarse si se desea y puede prepararse en cualquier medio conveniente que no interfiera con el ensayo. Preferiblemente, la muestra comprende un medio acuoso como un fluido corporal de un huésped no humano, más preferiblemente plasma o suero.

Debe entenderse que se contemplan todas las formas de inmunoensayos que emplean anticuerpos para su uso de acuerdo con las realizaciones actualmente preferidas, incluyendo ensayos en los que los anticuerpos están unidos a fases sólidas y ensayos en los que los anticuerpos están en medios líquidos. Los métodos de inmunoensayo que pueden usarse para detectar analitos usando anticuerpos que incorporan características de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, ensayos competitivos (limitados por reactivos) en los que el analito marcado (análogo de analito) y el analito en una muestra compiten por los anticuerpos y ensayos inmunométricos de sitio único en los que el anticuerpo está marcado; y similares.

La presente invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar la invención haciendo referencia a realizaciones específicas.

Todos los ejemplos se llevaron a cabo usando técnicas estándar, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, salvo que se describa con detalle lo contrario. Las técnicas rutinarias de biología molecular de los siguientes ejemplos pueden llevarse a cabo como se describe en manuales de laboratorio estándar, como Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

En la presente se hace referencia a las solicitudes en trámite tituladas "Haptens of Aripiprazol" (N° de Expediente de Apoderado PRD3265USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691.450, presentada el 21 de agosto de 2012), "Haptens of Olanzapine" (N° de Expediente de Apoderado PRD3266USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691,454, presentada el 21 de agosto de 2012), "Haptens of Paliperidone" (N° de Expediente de Apoderado PRD3267USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691,459, presentada el 21 de agosto de 2012), "Haptens of Quetiapine" (N° de Expediente de Apoderado PRD3268USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691,462, presentada el 21 de agosto de 2012), "Haptens of Risperidone and Paliperidone" (N° de Expediente de Apoderado PRD3269USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691,469, presentada en agosto 21, 2012), "Antibodies to Olanzapine Haptens and Use Thereof' (N° de Expediente de Apoderado CDS5132USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691,572, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Paliperidone Haptens and Use Thereof" (N° de Expediente de Apoderado CDS5126USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691,634, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Quetiapine Haptens and Use Thereof" (N° de Expediente de Apoderado CDS5134USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691.598, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Risperidone Haptens and Use Thereof" (N° de Expediente de Apoderado CDS5130USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691,615, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Aripiprazol and Use Thereof' (N° de Expediente de Apoderado CDS5129USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691,522, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Olanzapine and Use Thereof' (N° de Expediente de Apoderado CDS5133USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691.645, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Paliperidone and Use Thereof' (N° de Expediente de Apoderado CDS5127USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691,692, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Quetiapine and Use Thereof' (N° de Expediente de Apoderado CDS5135USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691,659, presentada el 21 de agosto de 2012), "Antibodies to Risperidone and Use Thereof' (N° de Expediente de Apoderado CDS5131 USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/691,675, presentada el 21 de agosto de 2012), y "Antibodies to Risperidone and Use Thereof' (N° de Expediente de Apoderado CDS5145USPSP, Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/790,880, presentada el 15 de marzo de 2013).

EJEMPLO 1

4-(aminometil)-7-(4-(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-3,4-dihidroquinolin-2(1H)-ona

Paso A

1-(bromometil)-4-metoxi-2-nitrobenceno

A una solución bien agitada del compuesto 4-metoxi-1-metil-2-nitrobenceno (218 g, 1,30 mol) en CCl<4>(1500 ml) se le añadió AIBN (21,7 g, 0,13 mol), y NBS (348 g, 1,96 mol). Después de calentar la mezcla de reacción a reflujo durante 16 h bajo N<2>, se añadió agua y el producto se extrajo de la fase acuosa con CH<2>CI<2>. La fase orgánica resultante se lavó con salmuera, se secó sobre Na<2>SO<4>y el solvente se evaporó para dar un sólido que se purificó por cromatografía en gel de sílice (eluyendo con éter de petróleo/acetato de etilo, 20:1) para obtener el compuesto del título como un sólido amarillo. ESI-MS (M+1) 246.<1>H NMR: (CDCI<3>, 400 MHz): 6 (ppm) 7.55 (s, 1H), 7.46-7.42 (d, 1H), 7.14-7.11 (d, 1H), 4.79 (s, 2H), 3.90 (s, 3H).

Paso B

2-(4-metoxi-2-nitrofenil)acetonitrilo

A una solución agitada de 1-(bromometil)-4-metoxi-2-nitrobenceno, preparada como se describe en el Paso A, (40 g, 0,163 mol) en THF (500 ml) y ETOH (100 ml) se le añadió una solución de KCN (26,6 g, 0,408 mol) en agua (100 ml). La mezcla de reacción se agitó a 0° C durante 1 h y después adicionalmente durante 3 h a temperatura ambiente. La mezcla de la reacción se diluyó con agua (500 ml) y la fase acuosa se extrajo con DCM (500 ml) y después se lavó con salmuera, se secó sobre Na<2>SO<4>y se evaporó al vacío. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice para dar el compuesto del título. ESI-MS (M+1) 193.<1>H NMR: (Cd CI3, 400 MHz): 6 (ppm) 7.72 (s, 1H), 7.63-7.61 (d, 1H), 7.26-7.23 (d, 1H), 4.14 (s, 2H), 3.93 (s, 3H).

Paso C

3-ciano-3-(4-metoxi-2-nitrofenil)propanoato de etilo

A una solución de 2-(4-metoxi-2-nitrofenil)acetonitrilo, preparada como se describe en el Paso B, (5,5 g, 0,0286 mol) en DMF (100 ml) se le añadió BrCH2CO2Et (5,71 g, 0,034 mol) y K2CO3 (11,86 g, 0. 086 mol) a 0° C. La mezcla de la reacción se agitó a 0° C. durante 1 h y a temperatura ambiente durante otras 2 h. Una vez se hubo completado la reacción por monitorización TLC, se añadió agua. La reacción se extrajo con acetato de etilo; la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, y se concentró al vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice para dar el compuesto del título. ESI-MS (M+1) 279. 1H NMR: (CDCh, 400 MHz): 6 (ppm) 7.70-7.68 (d, 1H), 7.57-7.56 (s, 1H), 7.24-7.21 (d, 1H), 5.13-4.98 (m, 1H), 4.20-4.18 (m, 2H), 3.89 (s, 3H), 2.99-2.97 (d, 2H), 1.28-1.24 (t, 3H).

Paso D

7-metoxi-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolina-4-carbonitrilo

A una solución de 3-ciano-3-(4-metoxi-2-nitrofenil)propanoato de etilo, preparada como se describe en el Paso C, (9,0 g, 0,032 mol) en MeOH (100 ml), se le añadió Sn (19,3 g, 0,162 mol), seguido de ácido clorhídrico/MeOH (40 ml, 1:1) todo a la vez. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El solvente se eliminó al vacío. Después se añadió acetato de etilo y se añadió solución acuosa de NaHCO3 para neutralizar la solución. La fase orgánica se concentró para obtener el producto bruto, que se usó para el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso E

4-(aminometil)-7-metoxi-3,4-dihidroquinolin-2(1H)-ona

Se suspendió 7-metoxi-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolina-4-carbonitrilo bruto, preparado como se describe en el paso D, (6 g, 0,03 mol) y Raney Ni (10 g) en una mezcla de MeOH (100 ml) y 3 ml de trietilamina. La mezcla de reacción se agitó bajo atmósfera de H2 (50 Psi) a temperatura ambiente durante 4 h. Una vez se hubo completado la reacción mediante monitorización por TLC, se filtró el catalizador y después se eliminó el solvente al vacío para proporcionar el producto bruto que se usó para el paso siguiente sin purificación adicional.

Paso F

4-(aminometil)-7-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-2(1H)-ona

A una solución de 4-(aminometil)-7-metoxi-3,4-dihidroquinolin-2(1H)-ona bruta, preparada como se describe en el Paso E, (8,8 g, 0,0427 mol) en diclorometano (100 ml), se le añadió gota a gota BBr3 (85 g, 0,342 mol) en diclorometano (1M) a -14° C, y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Una vez se hubo completado la reacción mediante monitorización a través de TLC, se añadió metanol lentamente a 0° C para inactivar la reacción, y el solvente se evaporó al vacío para obtener el producto bruto, que se usó directamente en el paso siguiente.

Paso G

((7-hidroxi-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)carbamato de terc-butilo

Se añadieron 4-(aminometil)-7-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-2(1H)-ona bruta, preparada como se describe en el Paso F, (8,2 g, 0,0427 mol) y (Boc)<2>O (4,65 g, 0,021 mol), trietilamina (10 ml) a 100 ml de metanol. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Una vez se hubo detenido la reacción, el solvente se eliminó al vacío y se añadió acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua, solución acuosa de NaHCO<3>, se secó sobre Na<2>SO<4>y se concentró al vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía para dar el compuesto del título. ESI-MS (M+1) 292.<1>H NMR: (DMSO-d<6>, 400 MHz): 6 (ppm) 9.96 (s, 1H), 9.31 (s, 1H), 6.95-6.89 (m, 2H), 6.33 (d, 2H), 3.00-2.97 (m, 2H), 2.90-2.96 (m, 1H), 2.56 (m, 1H), 2.30-2.34 (m, 1H), 1.37 (s, 9H).

Paso H

((7-(4-bromobutoxi)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)carbamato de terc-butilo

A una solución de ((7-mdroxi-2-oxo-1,2,3,4-tetramdroqumolin-4-il)metil)carbamato de terc-butilo, preparada como se describe en el paso H, (1,0 mmol, 292 mg) y 1,4-dibromobutano (1,1 mmol, 237,5 mg) en DMF (1,5 ml) se le añadió K2CO3 anhidro (1,2 mmol, 166 mg). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche hasta que HPLC y LC/MS indicaron que la reacción se había completado para dar el compuesto del título, que se sometió a la siguiente reacción sin purificación. MS m/z 428 (MH+).

Paso I

((7-(4-(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)carbamato de terc-butilo

A una solución de ((7-(4-bromobutoxi)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)carbamato terc-butilo, preparada como se describe en el paso H, en DMF se le añadió clorhidrato de 1-(2,3-dicloro-fenil)-piperazina (1,0 mmol, 268 mg) y K<2>CO<3>(1,23 mmol, 170 mg). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El solvente se evaporó al vacío y el residuo se repartió entre diclorometano y solución acuosa saturada de NaHCO<3>. La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con diclorometano adicional. Las capas orgánicas se combinaron y se concentraron. El residuo se sometió luego a cromatografía en columna sobre gel de sílice con gradiente del 0-10% de metanol en diclorometano para dar el compuesto del título como un sólido. MS m/z 578 (MH<+>).

Paso J

4-(aminometil)-7-(4-(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-3,4-dihidroquinolin-2(1H)-ona

A una solución de ((7-(4-(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)carbamato de terc-butilo, preparada como se describe en el Paso I, (200 mg, 0,35 mmol) en diclorometano (5 ml) se le añadió 1 ml de TFA. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas. El solvente se evaporó al vacío y el residuo se repartió entre diclorometano y solución saturada de NaHCO3. La capa orgánica se separó y la acuosa se extrajo con diclorometano adicional. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. A continuación, el residuo se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice con metanol al 10% en diclorometano, seguido de amoníaco 7N en metanol al 10% en diclorometano, para dar el compuesto del título como un sólido. Este producto se purificó adicionalmente por recristalización a partir de diclorometano y heptanos para dar el producto final como un sólido blanco. MS m/z 477 (MH+). 1H NMR: (cDch, 400 MHz): 8 (ppm) 7.40 (s, 1H), 7.25-7.05 (m, 3H), 7.00 (d, 1H), 6.60 (d, 1H), 6.30 (s, 1H), 4.00 (m, 2H), 3.10 (m, 4H), 3.00 2.60 (m, 9H), 2.50 (m, 2H), 1.90-1.40 (m, 6H). Calculated for C24HaüCl2N4O2C, 60.38; H, 6.33; N, 11.74. Found C, 60.32; H, 5.89; N, 11.26.

EJEMPLO 2

7-(4-(4-(4-amino-2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-3,4-dihidroquinolin-2(1H)-ona

Paso A

4-bromo-2,3-dicloro-N-(4-metoxibencil)anilina

A una solución de 4-bromo-2,3-dicloro-fenilamina (3,215 g, 13,3 mmol) y 1-clorometil-4-metoxi-benceno (2,297 g, 14,7 mmol) en 23 ml de DMF se le añadió yoduro potásico (2,214 g, 13,3 mmol) y 647 mg de hidruro sódico (dispersión oleosa al 60%). Después de agitar a temperatura ambiente durante toda la noche, la mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se repartió entre diclorometano y solución acuosa saturada de NaHCO3. La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con diclorometano adicional. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. A continuación, el residuo se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice con acetato de etilo al 30% en heptanos para dar el compuesto del título como un sólido amarillo; MS m/z 362 (MH+).

Paso B

2,3-dicloro-N-(4-metoxibencil)-4-(piperazin-1-il)anilina

Se agitó una mezcla de 4-bromo-2,3-didoro-N-(4-metoxibencil)anilina, preparada como se describe en el paso anterior, (3,61 g, 10 mmol), piperizina (1,034 g, 12 mmol), t-butóxido sódico (1,16 g, 12 mmol), y tris(dibencilideneacetona)dipaladio(0) (180 mg, 2 mol %) en 16 ml de tolueno en un matraz de pared gruesa sellado y calentó en un baño de aceite a 100° C durante 2,5 días. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se repartió entre diclorometano y agua. La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con diclorometano adicional. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre columna de gel de sílice con metanol al 10% en diclorometano, seguido de amoníaco 7N en metanol al 10% en diclorometano, para dar el compuesto del título como un sólido marrón claro. MS m/z 367 (MH+). 1H NMR: (CDCla, 400 MHz): 6 (ppm) 7.28 (d, 2H), 6.98 (d, 2H), 6.50 (d, 1H), 4.60 (s, 1H), 4.30 (m, 2H), 3.80 (m, 3H), 3.10-2.85 (m, 8H), 2.30 (s, 1H).

Paso C

2,3-dicloro-4-(piperazin-1-il)anilina

A una solución de 2,3-dicloro-N-(4-metoxibencil)-4-(piperazin-1-il)anilina, preparada como se describe en el paso anterior, (562 mg, 1,54 mmol) en diclorometano (5 ml) se le añadieron 5 ml de TFA. La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas y después se evaporó al vacío hasta la sequedad. El residuo se volvió a disolver en diclorometano y se evaporó hasta la sequedad. El compuesto del título se usó en la siguiente reacción sin purificación. MS m/z 245 (MH+).

Paso D

7-(4-(4-(4-amino-2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-3,4-dihidroquinolin-2(1H)-ona

A una solución de 2,3-dicloro-4-(piperazin-1-il)anilina, preparada como se describe en el paso anterior, (1,535 mmol) como sal de TFA en DMF (6 ml) se le añadió una solución de 7-(4-bromo-butoxi)-3,4-dihidro-1H-quinolin-2-ona (1,535 mmol) disponible comercialmente en DMF (1 ml), K<2>CO<3>(2,121 g) y 1 ml de DMF. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El sólido se filtró y se enjuagó con diclorometano. La solución se evaporó al vacío y el residuo se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice con gradiente del 0-10% de metanol en diclorometano, seguido de amoniaco 7N en metanol al 10% en diclorometano, para dar el compuesto del título como un sólido. MS m/z 463 (MH<+>).<1>H NMR: (DMSO-d<6>, 400 MHz): 6 (ppm) 10.0 (s, 1H), 7.05 (d, 1H), 6.95 (d, 1H), 6.75 (d, 1H), 6.50 (d, 1H), 6.45 (s, 1H), 5.3 (s, 2H), 3.90 (m, 2H), 2.90-2.70 (m, 6H), 2.50-2.30 (m, 8H), 1.80-1.50 (m, 4H). Calculado para C<23>H<2s>Cl<2>N<4>O<2>is C, 59.61; H, 6.09; N, 12.09. Encontrado C, 59.44; H, 5.87; N, 11.77.

EJEMPLO 3

Ácido 4-((2,3-dicloro-4-(4-(4-((2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-7-il)oxi)butil)piperazin-1-il)fenil)amino)-4-oxobutanoico

Se agitó una solución del Ejemplo 2 (115,5 mg, 0,25 mmol) y anhídrido succínico (50 mg, 0,5 mmol) en piridina (1,5 ml) y se calentó a 110° C en un horno microondas durante 5,5 h. La solución se evaporó al vacío hasta la sequedad. El residuo se volvió a disolver en diclorometano y se evaporó hasta la sequedad; y después se volvió a disolver en metanol y se evaporó hasta la sequedad. El producto bruto se purificó en una columna Agela hílica con gradiente del 0-20% de metanol en diclorometano para dar un sólido, que se purificó de nuevo por recristalización a partir de metanol y se secó a 40-50° C en horno de vacío para dar el compuesto del título. MS m/z 563 (MH<+>).<1>H NMR: (DMSO-d<6>, 400 MHz): 6 (ppm) 12.1 (s, 1H), 10.0 (s, 1H), 9.60 (s, 1H), 7.5 (d, 1H), 7.15 (d, 1H), 7.05 (d, 1H), 6.50 (d, 1H), 6.45 (s, 1H), 3.90 (m, 2H), 3.00 (m, 4H), 2.30 (m, 2H), 2.20-2.30 (m, 12H), 1.80-1.55 (m, 4H). Calculado para C<27>H<33>Cl<2>N<4>O<5>is C, 57.55; H, 5.72; N, 9.94. Encontrado C, 55.92; H, 5.85; N, 9.58.

EJEMPLO 4

Ácido 5-((2,3-dicloro-4-(4-(4-((2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-7-il)oxi)butil)piperazin-1-il)fenil)amino)-5-oxopentanoico

Se agitó una solución del Ejemplo 2 (83 mg, 0,18 mmol) y anhídrido glutárico (41 mg, 0,36 mmol) en piridina (1,0 ml) y se calentó a 110° C en un horno microondas durante 4,5 h. La solución se evaporó al vacío hasta la sequedad. El residuo se purificó en una columna Agela hílica (12 g) con gradiente del 0-30% de metanol y se secó a 40-50° C en horno de vacío para dar el compuesto del título. MS m/z 578 (MH+).

EJEMPLO 5

Ácido 4-(((7-(4-(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico

Se agitó una solución del Ejemplo 1 (24,1 mg, 0,05 mmol) y anhídrido succínico (10 mg, 0,10 mmol) en THF (1,0 ml) a temperatura ambiente durante una noche. La solución se evaporó al vacío hasta la sequedad. El residuo se purificó en una columna de gel de sílice (12 g) con gradiente del 0-30% de metanol en diclorometano y se secó a 40-50° C en horno de vacío para dar el compuesto del título. MS m/z 578 (MH+).

EJEMPLO 6

N-((7-(4-(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)acetamida

A una solución del Ejemplo 1 (MW 477,42,2 mg, 4,61 pmoles) en 110 pl de DMF y 2,3 pl de tributilamina se le añadieron 116 pl de una solución en DMF de éster de N-a-maleimidoacetoxi)succinimida (AMAS, MW 252,2, 10 mg/ml, 1,16 mg, 4,61 pmoles). Se permitió que la solución resultante agitase durante 90 minutos a 20° C, y luego se usó como tal en la reacción de conjugación con proteína activada por tiol.

EJEMPLO 7

Conjugado de N-((7-(4-(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetamida y hemocianina de lapa californiana

A 3,23 ml de una solución de hemocianina de lapa californiana (KLH MW 100.000 14,6 mg, 0,146 emoles) en tampón de fosfato 100 mM, cloruro sódico 0,46M, pH 7,4 se le añadieron 33,7 pl de una solución DMF de N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA MW 231,2, 25 mg/ml, 0,84 mg, 3,65 pmoles). La solución resultante se incubó a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reacción se purificó en una columna Sephadex G-25 usando tampón fosfato 100 mM, cloruro sódico 0,46M y EDTA 5 mM, a pH 6,0. A 6,46 ml de la solución de KLH-SATA (13,7 mg, 0,137 pmoles) se le añadieron 646 pl de hidroxilamina 2,5M, y 50 mM de EDTA, a pH 7,0. La solución resultante se incubó a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reacción se trató con 169,6 pl de solución de N-((7-(4-(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetamida (preparada como se describe en el ejemplo 6) (3,43 pmoles). La mezcla turbia resultante se incubó durante 2 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reacción se filtró a través de un filtro de jeringuilla de 0,2 pm y después se purificó en una columna Sephadex G-25 usando tampón fosfato 100 mM y cloruro sódico 0,46M a pH 7,4, para dar el conjugado de KLH del Ejemplo 6.

EJEMPLO 8

Conjugado de N-((7-(4-(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetamida - tiroglobulina bovina

A 2,14 ml de una solución de tiroglobulina bovina (BTG, M W 660.000, 21,8 mg, 0,033 pmoles) en un tampón de fosfato 100 mM a pH 7,5 se le añadieron 61,1 pl de una solución DMF de N-succinimidil-5-acetiltioacetato (SATA, MW 231,2, 25 mg/ml, 1,53 mg, 6,6 pmoles). La solución resultante se incubó a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reacción se purificó en una columna Sephadex G-25 usando tampón fosfato 100 mM, EDTA 5 mM, a pH 6,0.

A 5,79 ml de BTG-SATA (20,5 mg, 0,031 pmoles) se le añadieron 579 pl de hidroxilamina 2,5M, y 50 mM de EDTA, a pH 7,0. La solución resultante se incubó a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reacción se trató con 304,0 pl de solución de N-((7-(4-(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetamida (preparada como se describe en el ejemplo 6) (6,2 pmoles). La mezcla turbia resultante se incubó durante 2 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reacción se filtró a través de un filtro de jeringuilla de 0,45 pm y después se purificó en una columna Sephadex G-25 usando tampón fosfato 100 mM y cloruro sódico 0,14M a pH 7,4, para dar el conjugado de tiroglobulina bovina del Ejemplo 6.

EJEMPLO 9

Conjugado de N-((7-(4-(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetamida y ovoalbúmina

Paso A

A 1,0 ml de una solución de ovoalbúmina (MW 44,300, 10,0 mg, 0,23 pmoles) en tampón de fosfato 100 mM a pH 7,5 se le añadieron 31,3 pl de una solución en DMF de N-succinimidil-5-acetiltioacetato (SATA, MW 231,2, 25 mg/ml, 0,78 mg, 3,4 pmoles). La solución resultante se incubó a 20° C durante 1 hora en un mezclador de rodillos. La reacción se trató con 100 pl de hidroxilamina 2,5M y EDTA 50 mM a pH 7,0. La solución resultante se incubó a 20° C durante 15 minutos en un mezclador de rodillos. La reacción se purificó en una columna Sephadex G-25 usando 100 mM de tampón fosfato y 5 mM de EDTA a pH 6,0.

Paso B

A la ovoalbúmina-SH, (3,1 ml, 8,3 mg, 0.187 pmol), preparada como se describe en el paso A, se le añadió solución de N-((7-(4-(4-(2,3-diclorofenil)piperazin-1-il)butoxi)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahidroquinolin-4-il)metil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetamida (preparada como se describe en el ejemplo 6) ((185,7 pl, 3,75 pmoles). La mezcla turbia resultante se incubó durante 2,5 horas a 20° C en un mezclador de rodillos. La reacción se filtró a través de un filtro de jeringuilla de 0,45 pm, y después se purificó en una columna Sephadex G-25 usando tampón fosfato 100 mM, cloruro sódico 0,14M a pH 7,4, para dar el conjugado de ovoalbúmina del Ejemplo 6.

EJEMPLO 10

Inmunoensayo competitivo para Aripiprazol e Inmunoensayo competitivo multiplex para Aripiprazol, Olanzapina, Quetiapina y Risperidona

Después de una serie de inmunizaciones con el inmunógeno que tiene la Fórmula II (compuesto 6) descrito anteriormente, se comprobó la reactividad de las hemorragias de cola de ratón mediante un ELISA. También se probaron sobrenadantes de hibridoma, y los datos ELISA mostrados en la Tabla 8 muestran la reactividad de varios hibridomas (la pareja de fusión eran células NSO).

Tabla 8

A continuación, se probó el sobrenadante mediante ELISA de competición para determinar si la señal era específica del aripiprazol o del dehidroaripipiprazol. Las Figs. 1 y 2 muestran los resultados de dos hibridomas representativos, 3C1 y 3D7. Los datos muestran reactividad tanto al aripiprazol como al dehidroaripipiprazol.

La Fig. 3 muestra el formato de inmunoensayo competitivo usado en un dispositivo de ensayo de flujo lateral en el que el anticuerpo de captura, aripiprazol clon 5C7, se depositó en un chip junto con un conjugado de detección consistente en aripiprazol conjugado con un fluoróforo. En este formato competitivo, como se muestra en la Fig. 3, un nivel bajo de analito (aripiprazol) da como resultado una señal alta, mientras que un nivel alto de analito (aripiprazol) da como resultado una señal baja.

La Fig. 4 muestra el diseño del chip de un dispositivo de ensayo de flujo lateral de acuerdo con una realización de la presente invención. El dispositivo incluye una zona o área para recibir la muestra, una zona de conjugado (que contiene la pareja o parejas de unión competitiva marcadas deseadas), y una zona de reacción (se indican ocho áreas dentro de la zona de reacción; cada área puede contener un anticuerpo deseado separado). La muestra fluye desde la zona de muestra a través de la zona de conjugado hasta la zona de reacción.

Las Figs. 5-8 muestran curvas de respuesta a dosis típicas para un control positivo de aripiprazol (muestra que contiene aripiprazol) generado con el anticuerpo 5C7 depositado en la zona de reacción 2 y un compañero de unión competitiva de aripiprazol marcado en la zona de conjugado (Fig. 5), un control positivo de olanzapina (muestra que contiene olanzapina) generado con el anticuerpo 4G9-1 depositado en la zona de reacción 4 y un compañero de unión competitiva de olanzapina marcado en la zona de conjugado (Fig. 6), un control positivo de quetiapina (muestra que contiene quetiapina) generado con el anticuerpo 11 depositado en la zona de reacción 6 y un compañero de unión competitiva de quetiapina marcado en la zona de conjugado (Fig. 7), y un control positivo de risperidona (muestra que contiene risperidona) generado con el anticuerpo 5-9 depositado en la zona de reacción 8 y un compañero de unión competitivo de risperidona marcado en la zona de conjugado (Fig. 8). Los compañeros de unión competitivos marcados en la zona de conjugado compiten con los fármacos presentes en las muestras para unirse a los anticuerpos. Se detecta la cantidad de marcador y es una indicación de la cantidad de fármaco presente en la muestra (la cantidad de señal es inversamente proporcional a la cantidad de fármaco en la muestra; consultar la Fig. 3).

Para confirmar que los conjugados de los compañeros de unión competitivos marcados no se unen a los anticuerpos depositados en las zonas de reacción, se realizaron controles negativos usando muestras que no contenían fármacos. En referencia a la Tabla 9, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene aripiprazol y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo olanzapina marcada, quetiapina marcada y risperidona marcada, pero sin aripiprazol marcado) y a la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2. La Tabla 9 a continuación muestra los resultados, confirmando que no hay respuesta a la dosis y que los conjugados de olanzapina, quetiapina y risperidona que se mueven por acción capilar a través de la zona de reacción no se unen al anticuerpo de aripiprazol.

Tabla 9

En referencia a la Tabla 10, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene olanzapina y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo aripiprazol marcado, quetiapina marcada y risperidona marcada, pero no olanzapina marcada) y hacia la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4. La Tabla 10 a continuación muestra los resultados, confirmando que no hay respuesta a la dosis y que los conjugados de aripiprazol, quetiapina y risperidona que se mueven por capilaridad a través de la zona de reacción no se unen al anticuerpo de olanzapina.

Tabla 10

En referencia a la Tabla 11, una muestra que no contiene quetiapina se deposita en la zona de muestra y se desplaza por acción capilar a través de la zona de conjugado (que esta vez contiene aripiprazol marcado, olanzapina marcada y risperidona marcada, pero no quetiapina marcada) y a la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6. La Tabla 11 siguiente muestra los resultados, confirmando que no hay respuesta a la dosis y que los conjugados de aripiprazol, olanzapina y risperidona que se mueven por capilaridad a través de la zona de reacción no se unen al anticuerpo de quetiapina.

Tabla 11

En referencia a la Tabla 12, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene risperidona y se desplaza por acción capilar a través de la zona de conjugado (que esta vez contiene aripiprazol marcado, olanzapina marcada y quetiapina marcada, pero no risperidona marcada) y a la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. La Tabla 12 siguiente muestra los resultados, confirmando que no hay respuesta a la dosis y que los conjugados de aripiprazol, olanzapina y quetiapina que se mueven por capilaridad a través de la zona de reacción no se unen al anticuerpo de risperidona.

Tabla 12

Para confirmar que los conjugados de los compañeros de unión competitiva marcados se unen sólo a sus respectivos anticuerpos depositados en las zonas de reacción, se realizaron controles negativos adicionales usando de nuevo muestras que no contenían fármaco. En referencia a la Tabla 13, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene aripiprazol y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo aripiprazol marcado) y a la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2, así como el anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4, el anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6 y el anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. La Tabla 13 siguiente muestra los resultados, confirmando que no hay respuesta a la dosis excepto para el anticuerpo aripiprazol 5C7 (en la zona de reacción 2).

Tabla 13

En referencia a la Tabla 14, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene olanzapina y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo olanzapina marcada) y a la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2, así como el anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4, el anticuerpo quetiapina (11) en la zona de reacción 6, y el anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. La tabla 14 siguiente muestra los resultados, confirmando que no hay respuesta a la dosis excepto para el anticuerpo de olanzapina 4G9-1 (en la zona de reacción 4).

Tabla 14

En referencia a la Tabla 15, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene quetiapina y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo quetiapina marcada) y a la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2, así como el anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4, el anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6 y el anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. La tabla 15 siguiente muestra los resultados, confirmando que no hay respuesta a la dosis excepto para el anticuerpo 11 de quetiapina (en la zona de reacción 6).

Tabla 15

En referencia a la Tabla 16, se deposita en la zona de muestra una muestra que no contiene risperidona y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo risperidona marcada) y a la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2, así como el anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4, el anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6 y el anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. La Tabla 16 siguiente muestra los resultados, confirmando que no hay respuesta a la dosis excepto para el anticuerpo de risperidona 5-9 (en la zona de reacción 8).

Tabla 16

Los resultados mostrados anteriormente confirman que los conjugados de compañeros de unión competitivos marcados se unen únicamente a sus respectivos anticuerpos en la zona de reacción.

Las Figs. 9-12 muestran curvas típicas de respuesta a la dosis en zonas de reacción de anticuerpos específicas, y la prueba de respuesta de dosis de concentración baja/alta para cada ensayo específico en presencia de otros conjugados. En la Fig. 9, se deposita en la zona de muestra una muestra que contiene aripiprazol y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo aripiprazol marcado, olanzapina marcada, quetiapina marcada y risperidona marcada) y a la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2. Se generó una curva típica de respuesta a la dosis como se muestra en la Fig. 9 sólo para el aripiprazol, y no para olanzapina, quetiapina o risperidona.

En la Fig. 10, se deposita en la zona de muestra una muestra que contiene olanzapina y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (esta vez conteniendo aripiprazol marcado, olanzapina marcada, quetiapina marcada y risperidona marcada) y a la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4. Se generó una curva típica de respuesta a la dosis como se muestra en la Fig. 10 sólo para olanzapina, y no para aripiprazol, quetiapina o risperidona.

En la Fig. 11, se deposita en la zona de muestra una muestra que contiene quetiapina y se desplaza por acción capilar a través de la zona de conjugado (que esta vez contiene aripiprazol marcado, olanzapina marcada, quetiapina marcada y risperidona marcada) y a la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6. Se generó una curva típica de respuesta a la dosis como se muestra en la Fig. 10 sólo para quetiapina, y no para aripiprazol, olanzapina o risperidona.

En la Fig. 12, se deposita en la zona de muestra una muestra que contiene risperidona y se desplaza por acción capilar a través de la zona de conjugado (que esta vez contiene aripiprazol marcado, olanzapina marcada, quetiapina marcada y risperidona marcada) y a la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. Se generó una curva típica de respuesta a la dosis como se muestra en la Fig. 12 sólo para risperidona, y no para aripiprazol, olanzapina o quetiapina.

Las Figs. 13-16 muestran curvas típicas de respuesta a la dosis para cada ensayo en presencia de otros conjugados y anticuerpos. En la Fig. 13, se deposita en la zona de muestra una muestra que contiene aripiprazol y se mueve por acción capilar a través de la zona de conjugado (que también contiene aripiprazol marcado, olanzapina marcada, quetiapina marcada y risperidona marcada) y a la zona de reacción. La zona de reacción contiene de nuevo el anticuerpo de aripiprazol (5C7) en la zona de reacción 2, así como el anticuerpo de olanzapina (4G9-1) en la zona de reacción 4, el anticuerpo de quetiapina (11) en la zona de reacción 6 y el anticuerpo de risperidona (5-9) en la zona de reacción 8. Se generó una curva típica de respuesta a la dosis para el anticuerpo de olanzapina (4G9-1). Se generó una curva típica de respuesta a la dosis para el aripiprazol, como se muestra en la Fig. 13. Cuando se depositó una muestra que contenía olanzapina en la zona de muestra de este chip, se generó una curva típica de respuesta a la dosis para la olanzapina, como se muestra en la Fig. 14. Cuando se depositó una muestra que contenía quetiapina en la zona de muestra de este chip, se generó una curva típica de respuesta a la dosis para la quetiapina como se muestra en la Fig. 15. Cuando se depositó una muestra que contenía risperidona en la zona de muestra de este chip, se generó una curva típica de respuesta a la dosis para la risperidona como se muestra en la Fig. 16.

Las Figs. 17-20 muestran comparaciones de curvas de respuesta a la dosis generadas como controles positivos (Figs. 5-8) con curvas de respuesta a la dosis generadas en el formato multiplex (Figs. 13-16). La comparación para aripiprazol se muestra en la Fig. 17; para la olanzapina en la Fig. 18; para la quetiapina en la Fig. 19; y para la risperidona en la Fig. 20. Estas figuras muestran que las curvas de control positivo son similares a las curvas multiplex.

Estos datos demuestran que puede usarse un dispositivo de ensayo de flujo lateral de la presente invención para detectar múltiples fármacos antipsicóticos usando una única muestra de un paciente en un dispositivo portátil de punto de atención.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión del mismo, que se une específicamente al aripiprazol y al dehidroaripipiprazol, y que se genera en respuesta a un compuesto de Fórmula II (compuesto 6) en el que la proteína es un portador inmunogénico, y en donde el anticuerpo o el fragmento de unión del mismo genera las mismas curvas de respuesta a la dosis para el aripiprazol y el dehidroaripipiprazol en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) competitivo, Fórmula II (compuesto 6):
2. 2. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la reivindicación 1, en donde el fragmento de unión se selecciona del grupo de fragmentos que consiste en fragmentos Fv, F(ab'), F(ab')2, scFv, minicuerpo y diacuerpo.
3. 3. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
4. 4. Un kit de ensayo que comprende el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. 5. Un dispositivo de ensayo que comprende el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
6. 6. El dispositivo de ensayo de la reivindicación 5, en el que el dispositivo es un dispositivo de ensayo de flujo lateral.
7. 7. Un método para producir un anticuerpo que se une al aripiprazol, el método comprendiendo: i. seleccionar un huésped no humano para la producción del anticuerpo; y ii. inocular al huésped no humano con un compuesto de Fórmula II (compuesto 6) en el que la proteína es un portador inmunogénico, y en donde el huésped produce un anticuerpo que se une al aripiprazol, Fórmula II (compuesto 6):
8. 8. Un método para producir una línea celular de hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal que se une al aripiprazol, el método comprendiendo: i. seleccionar un huésped no humano para la producción de anticuerpos; ii. inocular al huésped no humano con un compuesto de Fórmula II (compuesto 6) en el que la proteína es un portador inmunogénico; iii. fusionar una línea celular de dicho huésped inoculado con una célula en división continua para crear una célula fusionada capaz de producir un anticuerpo monoclonal que se una al aripiprazol; y iv. clonar la célula fusionada para obtener una línea celular de hibridoma, Fórmula II (compuesto 6):
9. 9. Un método para detectar aripiprazol en una muestra, el método comprendiendo: i. poner en contacto una muestra con un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 marcado con un marcador detectable, en donde el anticuerpo marcado o fragmento de unión del mismo y el aripiprazol presente en la muestra forman un complejo marcado; y ii. detectar el complejo marcado para detectar el aripiprazol en la muestra.
10. 10. Un método de inmunoensayo competitivo para detectar aripiprazol en una muestra, el método comprendiendo: i. poner en contacto una muestra con el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y con aripiprazol o un compañero de unión competitivo del aripiprazol, en donde uno del anticuerpos o fragmento de unión del mismo y del aripiprazol o compañero de unión competitivo del mismo está marcado con un marcador detectable, y en donde el aripiprazol de la muestra compite con el aripiprazol o compañero de unión competitivo del mismo para unirse al anticuerpo o fragmento de unión del mismo; y ii. detectar el marcador para detectar el aripiprazol de muestra.
11. 11. El método de la reivindicación 10, en donde: i. el aripiprazol o el compañero de unión competitivo del mismo está marcado con el marcador detectable; ii. el anticuerpo o fragmento de unión del mismo está marcado con un marcador detectable; o iii. el inmunoensayo se realiza en un dispositivo de ensayo de flujo lateral y la muestra se aplica al dispositivo.
12. 12. El método de la reivindicación 9 o 10: i. que comprende además detectar la presencia de uno o más analitos además del aripiprazol; ii. en donde la detección de aripiprazol es una indicación de la adherencia del paciente a la terapia con aripiprazol prescrita; iii. en donde la detección de aripiprazol se usa para determinar si un paciente debe pasarse de un régimen de aripiprazol oral a un régimen antipsicótico inyectable; iv. en donde la detección de aripiprazol se usa para determinar si debe aumentarse o reducirse el nivel de dosis o el intervalo de dosificación de aripiprazol oral o inyectable para garantizar la consecución o el mantenimiento de niveles eficaces o seguros del fármaco; v. en donde la detección de aripiprazol es una ayuda para el inicio de la terapia con aripiprazol al proporcionar evidencias de la consecución de los niveles mínimos de pK; vi. en donde la detección de aripiprazol se usa para determinar la bioequivalencia del aripiprazol en múltiples formulaciones o de múltiples fuentes; vii. en donde la detección de aripiprazol se usa para evaluar el impacto de la polifarmacia y las posibles interacciones entre fármacos; o viii. en donde la detección de aripiprazol es una indicación de que un paciente debe ser excluido o incluido en un ensayo clínico y es una ayuda en la monitorización posterior de la adherencia a los requisitos de medicación del ensayo clínico.
13. 13. El método de la reivindicación 12.i. en donde el uno o más analitos son fármacos antipsicóticos distintos del aripiprazol seleccionados del grupo que consiste en: risperidona, paliperidona, quetiapina, olanzapina y metabolitos de los mismos.