ES2979087T3 - Sistema de administración de principio activo dirigido a las células - Google Patents

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ES2979087T3
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cd11b
monocyte
cell
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English (en)
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Magdalena Krol
Irene Benni
Paola Baiocco
Tomasz Rygiel
Alberto Boffi
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Cellis AG
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Abstract

La presente invención se refiere a un sistema de administración celular dirigida aislado que comprende una célula leucocítica CD45+ que comprende dentro de dicha célula un complejo de una o más proteínas de unión a hierro y un ingrediente activo, así como a métodos para producir dicho sistema de administración celular dirigida aislado y a usos de dicho sistema para terapia, en particular para terapia del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema de administración de principio activo dirigido a las células
La presente invención se refiere a un sistema aislado de administración dirigido a las células que comprende una célula leucocitaria CD45+ que comprende dentro de dicha célula un complejo de una o más proteínas fijadoras de hierro y un ingrediente activo, así como métodos para producir dicho sistema aislado de administración dirigido a las células y usos de dicho sistema para terapia, en particular para terapia del cáncer.
Antecedentes de la invención
Las herramientas actuales de diagnóstico por imagen son capaces de detectar metástasis de gran tamaño (superiores a 0.5-1 cm). Sin embargo, rara vez detectan la propagación temprana de las células tumorales metastásicas. Las metástasis humanas menores de 0.5 cm son avasculares, por lo que carecen de un suministro adecuado de sangre y oxígeno. Esto significa que no es posible administrar agentes de contraste a través de la circulación sanguínea para marcar estas metástasis y obtener imágenes de ellas. La presencia de hipoxia es una característica común de micrometástasis donde la fracción hipóxica puede ser tan alta como 90% con poca o ninguna perfusión sanguínea (Li, et al. 2012, Journal of Solid Tumours, 2(2): 28-33). Así pues, la hipoxia grave se considera una característica general de las micrometástasis.
El direccionamiento de una o más micrometástasis ocultas en una gran población de células normales presenta un desafío único, ya que el acceso a las micrometástasis se ve obstaculizado por varias barreras biológicas, un suministro sanguíneo deficiente, y otros obstáculos adicionales se presentan por el pequeño tamaño de las micrometástasis y su dispersión en los órganos.
Por la misma razón, las micrometástasis suelen ser refractarias a la terapia. Aunque los tumores sólidos en los que se originan las micrometástasis suelen responder bien a la terapia convencional, a menudo vuelven a crecer en el lugar del tumor primario o en los lugares de la metástasis. Esto constituye un grave problema en oncología clínica (Muthana, et al. 2012, Cancer Res; 73(2); 490-495). Está relacionado con las características del microambiente de los tumores sólidos que limitan la penetración de los fármacos, exponiendo así al tumor a concentraciones de fármacos inferiores a las eficaces (Hobbs, et al. 1998, Proc Natl Acad Sci USA: 4607 4612). Esto se debe a una vasculatura inadecuada que da lugar a: alta heterogeneidad de las células cancerosas, baja tensión de oxígeno (hipoxia), bajo pH y baja concentración de glucosa dentro de la masa (Kizaka-Kondoh, et al., 2003, Cancer Sci 94(12): 1021-1028). Además, la rápida proliferación de células tumorales en algunas zonas podría superar el ritmo de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, lo que favorecería la formación de una zona hipóxica (Lewis y Murdoch, 2005, Am J Pathol 167(3):627-635). Esta arquitectura anómala de los vasos sanguíneos y, posteriormente, el deterioro de su función que da lugar a la hipoxia tumoral se asocia a un fenotipo más maligno y a una supervivencia deficiente en pacientes que padecen tumores sólidos y da lugar tanto al fracaso del tratamiento debido a la menor captación de fármacos como a cambios inducibles por la hipoxia en las células cancerosas (Sun, et al., 2012, Clin Cancer Res 18(3):758-770; Sullivan, et al., 2008 Mol Cancer Ther 7(7): 1961-1973; Kizaka-Kondoh, et al., 2003, Cancer Sci 94(12): 1021 1028). Además, la quimioterapia o la radioterapia provocan la formación adicional de grandes zonas de hipoxia tumoral, lo que dificulta aún más el tratamiento del tumor. El hecho de que la eficacia de la terapia anticancerosa se vea limitada por la presencia de células tumorales hipóxicas ha dado lugar a la introducción de diversos enfoques terapéuticos destinados a superar este problema.
Choi et al. (2015, Biomaterials 33(16): 4195-4203) divulga macrófagos utilizados como vehículos de administración dirigida de fármacos. El portador utilizado es un liposoma. Los presentes inventores han descubierto que las células leucocitarias CD45+, en particular los macrófagos activados, pueden captar principios activos complejados con una o más proteínas fijadoras de hierroin vitroy suministrar estos complejos a o dentro de las células, preferiblemente a o dentro de células tumoralesin vivo.Basándose en esta observación, los presentes inventores han superado uno o más de los problemas anteriormente mencionados de la técnica anterior. Por lo tanto, el sistema de administración dirigida de la presente invención proporciona, entre otras, una o más de las siguientes ventajas: (i) administración específica de uno o más principios activos a tejidos que atraen los leucocitos CD45+ antes mencionados, preferiblemente a células enfermas, (ii) protección de los principios activos frente a la inactivación en la circulación sanguínea o la eliminación del organismo, (iii) administración de principios activos a, preferiblemente en células de zonas de la enfermedad poco o nada vascularizadas, p. ej., metástasis, zonas hipóxicas dentro de grandes tumores, lesiones reumáticas, heridas avasculares, piel, (iv) toxicidad reducida del ingrediente activo, (v) administración de principios activos con farmacocinética pobre, (vi) efectos secundarios reducidos de los fármacos debido a su administración dirigida, (vii) mayor eficacia del tratamiento con dosis más bajas de los fármacos debido a la administración dirigida; y/o (viii) menor riesgo de lesión tisular local en el lugar de administración del fármaco debido a la administración del fármaco unido a la proteína fijadora de hierro, que se carga en el interior del leucocito CD45+ (Pérez-Herrero E, Fernández-Medarde A. 2015, Eur J Pharm Biopharm 93: 52-79).
Resumen de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un sistema aislado de administración dirigida que comprende una célula leucocitaria CD45+, que preferiblemente es capaz de internalizar una proteína fijadora de hierro que comprende dentro de dicha célula un complejo de una o más proteínas fijadoras de hierro y un fármaco seleccionado del grupo que consiste en un fármaco anticanceroso, un fármaco antiarteriosclerótico, un fármaco antiinflamatorio, un ácido nucleico, un compuesto fotosensibilizante, un virus y un isótopo radiactivo farmacéuticamente activo; en el que en el complejo (i) la proteína fijadora de hierro y el fármaco están unidos de forma covalente y/o no covalente, o (ii) el fármaco está atrapado/encapsulado por la proteína fijadora de hierro o sus multímeros en ausencia de un enlace covalente o no covalente.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método de preparación del sistema de administración dirigido aislado del primer aspecto de la invención que comprende las etapas de
a) proporcionar proteína fijadora de hierro purificada;
b) la unión covalente o no covalente de un fármaco y/o encapsulación de un fármaco en una proteína fijadora de hierro;
c) proporcionar una célula leucocitaria CD45+; y
d) incubar la célula leucocitaria CD45+ en presencia de la proteína fijadora de hierro producida en la etapa b) hasta que la célula leucocitaria CD45+ esté cargada, al menos parcialmente, con la proteína fijadora de hierro producida en la etapa b).
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un sistema aislado de administración dirigida del primer aspecto de la invención para su uso como medicamento.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un sistema aislado de administración dirigida del primer aspecto de la presente invención para su uso en la prevención/tratamiento de tumores, preferiblemente un tumor sólido, preferiblemente cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de colon, o un tumor que presente zonas hipóxicas, enfermedad inflamatoria o zonas isquémicas, en particular en heridas cutáneas o tras infarto de órgano (corazón) o retina isquémica.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Antes de que la presente invención se describa en detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que pueden variar. También debe entenderse que la terminología empleada en el presente documento tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia.
A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos descritos y las realizaciones preferidas no deben interpretarse como una limitación de la presente invención a las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción apoya y abarca las realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos divulgados y/o preferidos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud debe considerarse divulgada por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario.
A lo largo del texto de esta especificación se citan varios documentos. Cada uno de los documentos citados en el presente documento (incluyendo todas las patentes, solicitudes de patentes, publicaciones científicas, especificaciones del fabricante, instrucciones, etc.), ya sea anteriormente o más adelante, se incorporan por referencia en su totalidad. Nada de lo aquí expuesto debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a ser anterior a dicha divulgación en virtud de una invención anterior.
Definiciones
Para poner en práctica la presente invención, a menos que se indique lo contrario, se emplean métodos convencionales de química, bioquímica y técnicas de ADN recombinante que se explican en la bibliografía sobre la materia (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda Edición, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
A lo largo de esta especificación y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende", y variaciones tales como "que comprende", implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Tal como se utilizan en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes plurales, a menos que el contenido indique claramente lo contrario.
El término "administración dirigida de fármacos" se refiere a la administración de un principio activo a un paciente que produce un aumento de la concentración del principio activo en una región concreta del cuerpo en comparación con otras regiones del cuerpo de ese paciente. Preferiblemente, las concentraciones relativas se comparan entre la(s) región(es) enferma(s) del cuerpo y otras regiones del cuerpo que tienen un acceso similar a la circulación sanguínea. En las realizaciones preferidas, la concentración del principio activo en un número determinado de células o un volumen determinado de biopsia de la región enferma es al menos un 10% mayor, si se compara con el número idéntico de células o volumen de biopsia de una región no enferma tras la administración del sistema de administración dirigida de la presente invención, preferiblemente después de 2-24 horas. Más preferiblemente, la concentración del principio activo en la región enferma del cuerpo de un paciente es de al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150%, al menos 200%, al menos 250%, al menos 300%, al menos 350%, al menos 400%, al menos 450%, al menos 500%, más preferiblemente al menos 1000% más que en una región no enferma del cuerpo tras la administración del sistema de administración dirigido de la presente invención, preferiblemente después de 2-24 horas. Cuando se evalúa sobre la base de la distribución corporal total, se prefiere que al menos el 5% del principio activo administrado a un paciente llegue a la región enferma del cuerpo, preferiblemente al menos el 10%, más preferiblemente al menos el 15%. La administración dirigida del principio activo limita los posibles efectos nocivos de un principio activo en la región enferma del cuerpo.
Los términos "sistema de administración dirigida de fármacos" o "sistema de administración dirigida" se utilizan como sinónimos en la presente solicitud y se refieren a un sistema capaz de administrar un principio activo a la región dirigida, es decir, capaz de administración dirigida, preferiblemente dentro del cuerpo de un paciente.
Los términos "principio activo" o "fármaco" se utilizan como sinónimos en el contexto de la presente invención y se refieren a cualquier compuesto que modifique o module la actividad celular o que sea capaz de ser activado, es decir, un profármaco, para modificar o modular la actividad celular, preferiblemente en el cuerpo de un paciente. Ejemplos de tales principios activos son las llamadas "moléculas pequeñas" y los péptidos. El término "molécula pequeña" se utiliza en el contexto de la presente invención para referirse a un hidrocarburo con una masa molecular inferior a 1.500 g/mol o a isótopos radiactivos farmacéuticamente activos. Preferentemente, los fármacos que pueden utilizarse comprenden fármacos anticancerígenos, isótopos radiactivos farmacéuticamente activos o ferrihidrita.
El término "profármaco", tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, se refiere a cualquier ingrediente activo que, tras su administración, se metaboliza o convierte de otro modo en un ingrediente biológicamente activo o más activo (o fármaco) con respecto a al menos una propiedad. En comparación con el fármaco, un profármaco se modifica químicamente de una manera que lo hace, en relación con el fármaco, menos activo o inactivo, pero la modificación química es tal que el fármaco correspondiente se genera por procesos metabólicos u otros procesos biológicos después de que el profármaco se administra al paciente. Por ejemplo, un profármaco puede tener, en relación con el fármaco activo, una estabilidad metabólica o unas características de transporte alteradas, menos efectos secundarios o una toxicidad menor, o un sabor mejorado (por ejemplo, véase la referencia Nogrady, 1985, Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Nueva York, páginas 388-392, incorporada aquí como referencia). Un profármaco puede sintetizarse utilizando reactivos distintos del fármaco correspondiente.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se utilizan indistintamente en el presente documento y se entienden como una macromolécula polimérica u oligomérica hecha de monómeros de nucleótidos. Los monómeros nucleótidos se componen de una nucleobase, un azúcar de cinco carbonos (tal como, pero sin limitarse a la ribosa o la 2'-desoxirribosa) y de uno a tres grupos fosfato. Típicamente, un polinucleótido se forma mediante enlaces fosfodiéster entre los monómeros nucleotídicos individuales. En el contexto de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico incluyen, entre otros, el ácido ribonucleico (ARN), el ácido desoxirribonucleico (ADN) y sus mezclas, como los híbridos ARN-ADN. Los ácidos nucleicos pueden sintetizarse químicamente, por ejemplo, de acuerdo con el método del fosfotriéster (véase, por ejemplo, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584). Los "aptámeros" son ácidos nucleicos que se unen con gran afinidad a un polipéptido. Los aptámeros pueden aislarse mediante métodos de selección tales como SELEmir146-a (véase, por ejemplo, Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug y Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107;<u>S 5,582,981) a partir de un gran conjunto de diferentes moléculas de ARN monocatenario. Los aptámeros también pueden sintetizarse y seleccionarse en su forma especular, por ejemplo, como el L-ribonucleótido (Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5). Las formas así aisladas tienen la ventaja de que no son degradadas por las ribonucleasas naturales y, por lo tanto, poseen una mayor estabilidad.
El término "péptido" o "polipéptido" se utiliza indistintamente en el contexto de la presente invención para referirse a una cadena de al menos dos aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Por lo tanto, el término "péptido" en el contexto de la presente invención también se utiliza para referirse a cadenas de aminoácidos con más de 50, más de 100 o más de 150 aminoácidos.
El término "anticuerpo", tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, se refiere a una glicoproteína perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas; los términos anticuerpo e inmunoglobulina se utilizan a menudo indistintamente. Un anticuerpo es una molécula proteica producida por células plasmáticas y utilizada por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar objetos extraños, como bacterias y virus. El anticuerpo reconoce una parte única del objeto extraño, su antígeno.
El término "fragmento de anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término "fragmento de anticuerpo" incluyen un fragmento de unión a antígeno (Fab), un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un anticuerpo de cadena pesada, un anticuerpo de dominio único (Abdu), un fragmento variable de cadena única (Fvcu), un fragmento variable (Fv), un dominio V<h>, un dominio V<l>, un anticuerpo de dominio único, un nanocuerpo, un IgNAR (receptor de antígeno nuevo de inmunoglobulina), un di-Fvcu, un captador de células T biespecífico (BITE), una molécula de redireccionamiento de afinidad dual (DART), un cuerpo triple, un diacuerpo, un diacuerpo de cadena única, una proteína de andamiaje alternativa y una proteína de fusión de las mismas.
El término "diacuerpo", tal como se utiliza en esta especificación, se refiere a una proteína de fusión o a un anticuerpo bivalente que puede unirse a diferentes antígenos. Un diacuerpo se compone de dos cadenas proteicas simples que comprenden fragmentos de un anticuerpo, concretamente fragmentos variables. Los diacuerpos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V<h>) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V<l>) en la misma cadena polipeptídica (V<h>-V<l>, o V<l>-V<h>). Mediante el uso de un péptido corto que conecta los dos dominios variables, los dominios se ven obligados a emparejarse con el dominio complementario de otra cadena y, por lo tanto, crean dos sitios de unión a antígenos. Los diacuerpos pueden dirigirse al mismo antígeno (monoespecíficos) o a antígenos diferentes (biespecíficos).
Un "anticuerpo de dominio único", se refiere a fragmentos de anticuerpos que consisten en un único dominio variable monomérico de un anticuerpo. Simplemente, sólo comprenden las regiones variables monoméricas de cadena pesada de anticuerpos de cadena pesada producidos por camélidos o peces cartilaginosos. Debido a sus diferentes orígenes, también se denominan fragmentos VHH o VNAR (receptor variable de antígeno nuevo). Alternativamente, los anticuerpos de dominio único pueden obtenerse por monomerización de dominios variables de anticuerpos convencionales de ratón o humanos mediante el uso de ingeniería genética. Tienen una masa molecular de aproximadamente 12-15 kDa y, por lo tanto, son los fragmentos de anticuerpo más pequeños capaces de reconocer antígenos. Otros ejemplos son los nanocuerpos o nanoanticuerpos.
El término "mimético de anticuerpo", tal como se utiliza en el contexto de la presente especificación, se refiere a compuestos que pueden unirse específicamente a antígenos, de forma similar a un anticuerpo, pero que no están estructuralmente relacionados con los anticuerpos. Normalmente, los miméticos de anticuerpos son péptidos o proteínas artificiales con una masa molar de aproximadamente 3 a 20 kDa que comprenden uno, dos o más dominios expuestos que se unen específicamente a un antígeno. Los ejemplos incluyen, entre otros, el LACI-D1 (inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteínas); afilinas, por ejemplo, ubiquitina cristalina humana-Y B o humana; cistatina; Sac7D deSulfolobus acidocaldarius;lipocalina y anticalinas derivadas de lipocalinas; DARPins (dominios de repetición de anquirina diseñados); dominio SH3 de Fyn; dominio Kunits de inhibidores de proteasa; monocuerpos, por ejemplo el décimo dominio tipo III de la fibronectina; adnectinas: knottins (miniproteínas de nudo de cisteína); atrímeros; evicuerpos, p. ej., fijadores basados en CTLA4, aficuerpos, p. ej., haz de tres hélices del dominio Z de la proteína A deStaphylococcus aureus;trans-cuerpos, p. ej., transferrina humana; tetranectinas, p. ej., dominio de lectina de tipo C monomérica o trimérica; microcuerpos, p. ej. inhibidor de tripsina-II; afilinas; proteínas armadillo repetidas. Los ácidos nucleicos y las moléculas pequeñas también se consideran a veces miméticos de anticuerpos (aptámeros), pero no los anticuerpos artificiales, los fragmentos de anticuerpos y las proteínas de fusión compuestas a partir de éstos. Las ventajas comunes sobre los anticuerpos son una mejor solubilidad, penetración en los tejidos, estabilidad frente al calor y las enzimas, y costes de producción comparativamente bajos.
El término "identidad de secuencia" se utiliza en toda la especificación con respecto a las comparaciones de secuencias polipeptídicas y nucleotídicas. En caso de que se comparen dos secuencias y no se especifique la secuencia de referencia en comparación con la cual debe calcularse el porcentaje de identidad de secuencia, la identidad de secuencia se calculará con referencia a la más larga de las dos secuencias que se comparen, si no se indica específicamente otra cosa. Si se indica la secuencia de referencia, la identidad de secuencia se determina sobre la base de la longitud completa de la secuencia de referencia indicada por la SEQ ID, si no se indica específicamente lo contrario. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica que consta de 200 aminoácidos comparada con una secuencia polipeptídica de referencia de 300 aminoácidos de longitud puede presentar un porcentaje máximo de identidad de secuencia del 66.6% (200/300), mientras que una secuencia con una longitud de 150 aminoácidos puede presentar un porcentaje máximo de identidad de secuencia del 50% (150/300). Si 15 de esos 150 aminoácidos son diferentes de los aminoácidos respectivos de la secuencia de referencia de 300 aminoácidos de longitud, el nivel de identidad de secuencia disminuye al 45%. La similitud de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos, es decir, el porcentaje de identidad de secuencia, puede determinarse mediante alineaciones de secuencias. Dichos alineamientos pueden llevarse a cabo con varios algoritmos conocidos, preferiblemente con el algoritmo matemático de Karlin y Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), con hmmalign (paquete HMMER, http://hmmer.wustl.edu/) o con el algoritmo CLUSTAL (Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80) disponible, por ejemplo, en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ o en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmLo en http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/ npsa_clustalw.html. Los parámetros utilizados preferiblemente son los parámetros por defecto tal y como están configurados en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ o http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. El grado de identidad de secuencia (coincidencia de secuencia) puede calcularse utilizando, por ejemplo, BLAST, BLAT o BlastZ (o BlastX). Las búsquedas de proteínas por BLAST se realizan con el programa BLASTP, puntuación = 50, longitud de palabra = 3. Para obtener alineaciones separadas con fines comparativos, se utiliza Gapped BLAST tal y como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan los parámetros por defecto de los respectivos programas. El análisis de coincidencia de secuencias puede complementarse con técnicas establecidas de mapeo homológico como Shuffle-LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1: I54-I62) o campos aleatorios de Markov. También pueden utilizarse alineaciones basadas en estructuras para múltiples secuencias y/o estructuras de proteínas utilizando información de búsquedas en bases de datos de secuencias, homólogos disponibles con estructuras 3D y restricciones definidas por el usuario (Pei J, Grishin NV: PROMALS: towards accurate multiple sequence alignments of distantly related proteins. Bioinformatics 2007, 23:802-808; 3DCoffee@igs: un servidor web para combinar secuencias y estructuras en una alineación múltiple de secuencias. Poirot O, Suhre K, Abergel C, O'Toole E, Notredame C. Nucleic Acids Res. 2004 1 de julio de 2004; 32:W37-40.). Cuando en la presente solicitud se hace referencia a porcentajes de identidad de secuencias, estos porcentajes se calculan en relación con la longitud completa de la secuencia más larga, si no se indica específicamente lo contrario.
El término "leucocito" se utiliza en el contexto de la presente invención para referirse a las células del sistema inmunitario que intervienen en la protección del organismo tanto contra las enfermedades infecciosas como contra los invasores extraños. Todos los leucocitos se producen y derivan de células multipotentes de la médula ósea conocidas como células madre hematopoyéticas. Los leucocitos se encuentran en todo el organismo, incluidos la sangre y el sistema linfático. Todos los leucocitos tienen núcleo, lo que los distingue de las demás células sanguíneas, los glóbulos rojos (RBC) anucleados y las plaquetas. Los tipos de leucocitos pueden clasificarse de forma estándar. Dos pares de las categorías más amplias los clasifican por estructura (granulocitos o agranulocitos) o por linaje de división celular (células mieloides o células linfoides). Estas categorías más amplias pueden dividirse a su vez en los cinco tipos principales: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos. Estos tipos se distinguen por sus características físicas y funcionales. Los monocitos y los neutrófilos son fagocíticos. Pueden clasificarse otros subtipos; por ejemplo, entre los linfocitos, hay células B, células T y células NK. Los granulocitos se distinguen de los agranulocitos por la forma de su núcleo (lobulado frente a redondo, es decir, polimorfonuclear frente a mononuclear) y por sus gránulos de citoplasma (presentes o ausentes, o más exactamente, visibles en la microscopía óptica o por lo tanto no visibles). La otra dicotomía es por linaje: las células mieloides (neutrófilos, monocitos, eosinófilos y basófilos) se distinguen de las células linfoides (linfocitos) por el linaje hematopoyético (linaje de diferenciación celular).
Los presentes inventores han observado que la expresión de CD45+ es característica de las células leucocitarias que son adecuadas para ser utilizadas en el contexto del sistema de administración dirigida de la presente invención, en particular porque las células leucocitarias CD45+ son atraídas a tejidos y células particulares dentro del cuerpo y son capaces de administrar complejos de una o más proteínas fijadoras de hierro y uno o más principios activos a o dentro de las células. El experto entiende que las células leucocitarias CD45+, a menos que sean de origen clonal, son una población mixta de leucocitos diferentes que comparten la propiedad común de expresar el antígeno de superficie CD45+. En consecuencia, las subpoblaciones de células dentro del grupo diverso de leucocitos CD45+ se caracterizan a lo largo de la especificación por otras características funcionales y/o estructurales. El término "CD45+" indica que la mayoría de las células dentro de una población de células o esencialmente todas las células expresan el antígeno de superficie CD45+. En este contexto y también con referencia a otros antígenos de superficie celular, el término "expresa" indica que el antígeno de superficie se produce dentro de la célula y se expone de forma detectable en la superficie de una célula. El nivel de expresión y, por tanto, el número de antígenos de superficie expuestos de forma detectable en la superficie de una célula puede variar enormemente entre diferentes leucocitos. En general, se considera que una célula es positiva, es decir, se indica que es "+", para un antígeno de superficie celular, si al menos 5, preferiblemente al menos 10 copias del antígeno de superficie están expuestas de forma detectable en la superficie de la célula. El experto sabe muy bien cómo detectar, cuantificar y seleccionar las células que son positivas (o negativas) para un antígeno de superficie celular determinado. Entre los métodos preferidos se encuentra la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). En esta tecnología se utilizan anticuerpos marcados con fluorescencia para unirse a antígenos de la superficie celular de una población de células, las células se aíslan posteriormente en células individuales y, basándose en la intensidad de fluorescencia medida para la célula individual, se caracterizan como positivas o negativas para el antígeno de superficie celular dado. En algunas realizaciones de la presente invención se indica que la expresión de una proteína dada es alta o baja. Esto significa que la proteína se expresa de forma detectable en ambos casos, es decir, es "+", sin embargo, a diferentes niveles. La expresión alta y baja, respectivamente, significará diferentes números absolutos de proteínas por célula para diferentes proteínas. Por lo tanto, puede considerarse que una proteína dada se expresa a niveles altos si hay más de 500
expresa a niveles bajos si hay entre 1 y 50
proteína puede considerarse expresada a niveles altos, si hay más de 5000
niveles bajos, si hay entre 1 a 500
el número de proteínas expresadas o producidas en una célula mediante citometría de flujo y el método de perlas Quantibrite™ de Becton Dickinson (véase, por ejemplo, Pannu, K.K., 2001, Cytometry. 1 de diciembre de 2001; 45(4): 250-8) o espectrometría de masas (véase, por ejemplo, Milo, R., 2013, Bioessays, 35(12): 1050-1055). A efectos de la presente invención, el término "alta expresión" de una proteína dada se refiere a la expresión detectable de esa proteína que es al menos el 70% del nivel de expresión más alto encontrado, es decir, número de copias por célula, en una población de leucocitos CD45+ sanos. El término "baja expresión" de una proteína dada se refiere a la expresión detectable de esa proteína que es el 30% o menos del nivel de expresión más alto encontrado, es decir, el número de copias de esa proteína por célula, en una población de leucocitos CD45+ sanos. Preferiblemente, el "nivel de expresión más alto" se determina como la media de los niveles de expresión más altos encontrados en leucocitos CD45+ sanos de diferentes sujetos. En algunas realizaciones, las subpoblaciones preferidas de células se caracterizan por "producir" una proteína determinada. Esto se entiende como que la proteína no es necesariamente detectable en la superficie de la célula, sino que puede estar presente sólo en el interior de la célula. El experto sabe muy bien cómo detectar y/o cuantificar la producción de una proteína en el interior de una célula y/o seleccionar las células que producen dichas proteínas.
El término "monocito diferenciado" se utiliza en el contexto de la presente invención para referirse a un monocito diferenciado del precursor comprometido denominado precursor de macrófago-DC (MDP) que reside principalmente en la médula ósea (pero también podría estar en el bazo) y se diferencia en células dendríticas o macrófagos. En ratones están formados por dos subpoblaciones principales: (i) célula CD11b+ con alta expresión de CX3CR1, baja expresión de CCR2 y Ly6C' y (ii) célula CD11b+ con baja expresión de CX3CR1, alta expresión de CCR2 y Ly6C+. Tras abandonar la médula ósea, los monocitos Ly6C+ de ratón se diferencian en monocitos Ly6C' en circulación. Del mismo modo, en la diferenciación de monocitos humanos, se acepta que los monocitos CD14++ clásicos abandonan la médula ósea y se diferencian en monocitos CD14++ CD16+ intermedios y secuencialmente en monocitos CD14+ CD16++ no clásicos en la circulación sanguínea periférica (Yang et al., 2014; Biomark Res 2(1) doi. 10.1186/2050-7771-2-1).
Los macrófagos son fagocitos profesionales residentes en los tejidos y células presentadoras de antígenos (APC), que se diferencian de los monocitos circulantes de sangre periférica (PBM). El término "macrófago activado" se utiliza en el contexto de la presente invención para referirse a cualquier macrófago que esté polarizado. La activación de macrófagos se consigue en general por incubación con interleuquinas, citocinas y/o factores de crecimiento. En particular, la IL-4 y el M-CSF pueden utilizarse como agentes activadores. Los macrófagos activados de diferentes fenotipos se clasifican en macrófagos M1, macrófagos activados clásicamente (CAM) y macrófagos M2, macrófagos activados alternativamente (AAM). Los macrófagos M1 clásicamente activados son células efectoras inmunitarias con un fenotipo inflamatorio agudo. Son muy agresivos contra las bacterias y producen grandes cantidades de linfoquinas (Murray, y Wynn, 2011, J Leukoc Biol, 89(4): 557-63). Los macrófagos M2 antiinflamatorios activados alternativamente pueden dividirse en al menos tres subgrupos. Estos subtipos tienen varias funciones diferentes, como la regulación de la inmunidad, el mantenimiento de la tolerancia y la reparación de tejidos/curación de heridas. El término "inductor M1" se utiliza en el contexto de la presente invención para referirse a un compuesto que dirige la diferenciación de los PBM a macrófagos del tipo M1. El término "inductor M2" se utiliza en el contexto de la presente invención para referirse a un compuesto que dirige la diferenciación de PBM a macrófagos de tipo M2. El experto conoce un gran número de formas de promover la diferenciación en macrófagos M1 o M2.
El término "fagocitosis por macrófagos" es el proceso por el cual un macrófago engulle una partícula sólida para formar una vesícula interna conocida como fagosoma.
El término "proteína fijadora de hierro" se refiere a una proteína que fija de forma no covalente un ion hierro. Ejemplos de tales proteínas son la ferritina, la hemoglobina, la transferrina y la lactoferrina. Las proteínas fijadoras de hierro se unen a receptores de la superficie celular que facilitan la internalización de estas proteínas en las células.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un sistema aislado de administración dirigida que comprende una célula leucocitaria CD45+, preferiblemente capaz de internalizar una proteína fijadora de hierro, que comprende dentro de dicha célula un complejo de una o más proteínas fijadoras de hierro y un fármaco seleccionado del grupo que consiste en un fármaco anticanceroso, un fármaco antiarteriosclerótico, un fármaco antiinflamatorio, un ácido nucleico, un compuesto fotosensibilizante, un virus y un isótopo radiactivo farmacéuticamente activo; en el que en el complejo (i) la proteína fijadora de hierro y el fármaco están unidos de forma covalente y/o no covalente, o (ii) el fármaco está atrapado/encapsulado por la proteína fijadora de hierro o sus multímeros en ausencia de un enlace covalente o no covalente.
La capacidad de una determinada célula leucocitaria CD45+ o población celular para internalizar proteínas fijadoras de hierro depende de la expresión de receptores implicados en este proceso de internalización. Los receptores que conducen a la intemalización de ferritina comprenden, por ejemplo, TfR, CXCR4, CD163 y TIM-2. El experto sabe muy bien cómo medir la cantidad de captación de una proteína fijadora de hierro y el método preferido para medir la captación se describe en la Sección de Ejemplos más adelante. Los presentes inventores también observaron que las subpoblaciones de células leucocitarias CD45+ tienen una cierta propensión a internalizar una proteína fijadora de hierro sobre otra proteína fijadora de hierro y, por lo tanto, pueden alcanzar concentraciones de complejo más altas y/o mostrar menos fugas del complejo de las células. Dichas subpoblaciones de leucocitos CD45+ se describen con más detalle a continuación.
La frase "complejo de una o más proteínas fijadoras de hierro y un ingrediente activo", tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, se refiere a una composición en la que una o más moléculas del ingrediente activo están unidas de forma covalente o no covalente a una o más proteínas fijadoras de hierro. La unión covalente o no covalente entre una o más proteínas fijadoras de hierro y el principio activo puede ser directa o indirecta. En este último caso, el principio activo se une a la proteína fijadora de hierro mediante un enlazador o espaciador. Los enlazadores o espaciadores son conocidos por el experto, como polialanina, poliglicina, hidratos de carbono, grupos (CH2)n o enlazadores polipeptídicos. Así pues, el experto podrá seleccionar el(los) enlazador(es) o espaciador(es) adecuados en función de la aplicación correspondiente. Si las proteínas fijadoras de hierro forman jaulas como, por ejemplo, la ferritina, el término "complejo" también engloba el encierro de principios activos dentro de la jaula, incluso en ausencia de un enlace covalente o no covalente entre la(s) proteína(s) y el(los) compuesto(s) activo(s). La formación del complejo permite el transporte del principio activo al interior de la célula cuando ésta está internalizando la proteína fijadora de hierro. Por lo tanto, se prefiere que los principios activos estén unidos a la proteína fijadora de hierro de forma que no interfieran con el mecanismo de transporte. Esto puede comprobarse fácilmente por el experto utilizando ensayos de absorción conocidos en la técnica y descritos en la Sección de Ejemplos más adelante. Se prefiere que el complejo sea suficientemente estable para sobrevivir al transporte dentro de la célula hasta la región diana dentro del cuerpo. Por lo tanto, se prefiere que sea el complejo y no el principio activo solo el que se administre a las células o dentro de las células en la región diana. Esta propiedad también reduce posibles efectos deletéreos, por ejemplo, citotoxicidad, del ingrediente activo al leucocito CD45+. Si los principios activos se acoplan covalentemente a las proteínas fijadoras de hierro, tal acoplamiento se realiza preferiblemente a través de residuos de aminoácidos que se sabe están localizados en áreas superficiales que no están implicadas en la unión a los receptores celulares requeridos para la captación celular de las proteínas fijadoras de hierro. Las proteínas fijadoras de hierro utilizadas en el contexto de la presente invención pueden formar complejos estables unidos de forma no covalente con una amplia variedad de principios activos.
El leucocito CD45+ procede del paciente que se va a tratar, en cuyo caso la célula cargada con el complejo sería autóloga del paciente. También se prevé que los pacientes se clasifiquen de acuerdo con el MHC antes del tratamiento con la administración dirigida de la presente invención y que el tipo de célula leucocitaria utilizada para un paciente dado sea compatible con el MHC del paciente. En estas dos realizaciones preferidas, el leucocito CD45+ es una célula primaria o derivada mediante un número bajo de etapas de diferenciación a partir de una célula primaria. Alternativamente, el leucocito CD45+ puede proceder de una línea celular de leucocitos CD45+ inmortalizada pero preferiblemente no transformada. Por lo tanto, la sangre utilizada para el aislamiento de leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos, se obtiene preferiblemente del paciente que se va a tratar o de un donante sano. Alternativamente, la sangre puede obtenerse del banco de sangre. También se considera aquí el uso de sangre de cordón umbilical.
Los presentes inventores observaron que una subpoblación de leucocitos CD45+, que son producibles a partir de una célula precursora hematopoyética CD34+ son especialmente adecuados para la administración específica diana del principio activo. En consecuencia, se prefiere que los leucocitos utilizados para producir el sistema de administración diana se deriven de células precursoras hematopoyéticas CD34+. El experto sabe muy bien cómo seleccionar células precursoras hematopoyéticas CD34+ y cómo diferenciar dichas células en leucocitos.
Preferiblemente, el leucocito CD45+ se selecciona del grupo formado por un monocito, un monocito diferenciado, un linfocito y un granulocito. Las subpoblaciones preferidas en estas categorías generales de leucocitos se definen a continuación por parámetros estructurales, por ejemplo, presencia o ausencia de una proteína determinada, propiedades funcionales y/o método de su producción/diferenciación. Como se ha indicado anteriormente, el sistema de administración dirigido de la presente invención sigue proporcionando las ventajas indicadas anteriormente, si en una población de células no todas las células tienen una propiedad particular, siempre que la mayoría de las células dentro de esa población tengan esa propiedad. Así pues, a continuación, se describe la propiedad de una célula preferida del sistema de administración dirigida de la presente invención. El experto entiende que una composición farmacéutica de la presente invención comprenderá millones de células y que no todas las células de la población tendrán las propiedades funcionales y/o estructurales descritas en el presente documento, pero que la composición farmacéutica puede utilizarse para tratar una enfermedad si la mayoría de las células comparten las propiedades funcionales y/o estructurales respectivas.
Los presentes inventores han reconocido que las subpoblaciones de leucocitos CD45+ tienen propiedades ventajosas particulares que incluyen, entre otras, la eficiencia y/cantidad de captación del complejo en general, la capacidad para retener el complejo dentro de la célula, es decir, para evitar la fuga y la liberación selectiva del principio activo, la eficiencia de captación de una proteína fijadora de hierro particular y/o el direccionamiento a tejidos o células particulares y, por lo tanto, la idoneidad para tratar o mejorar una enfermedad particular. Los presentes inventores han observado, por ejemplo, que los leucocitos CD45+, que expresan uno o más de los siguientes antígenos: CD204, CD206, CD200R, CCR2 tienen preferencia por la captación de ferritina frente a la captación de otras proteínas fijadoras de hierro. Así pues, si la proteína fijadora de hierro del complejo es la ferritina, es preferible seleccionar leucocitos CD45+ que expresen uno o más de los siguientes antígenos: CD204, CD206, CD200R, CCR2. Por consiguiente, en una realización preferida de la presente invención
(i) el monocito es un monocito CD11b+, seleccionado preferiblemente del grupo formado por un monocito CD11b+ CD14+, un monocito CD11b+ CD16+, un monocito CD11b+ CD14+ CD16+, un monocito CD11b+ CD14+ MHCII+, un monocito CD11b+ CD14+ CD115+, un monocito CD11b+ CD114+, un monocito CD11b+ CD116+, un monocito CD11b+ CCR1+, un monocito CD11b+ CCR2+, un monocito CD11b+ CX3CR+, un monocito CD11b+ CXR4+, un monocito CD11b+ CXR6+ y un monocito CD11b+ CD14+ CD33+;
(ii) el monocito diferenciado se selecciona del grupo que consiste en un macrófago, un macrófago activado, preferiblemente un macrófago CD11b+, más preferiblemente un macrófago CD11b+ CD16+, macrófago CD11b+ CD32+, macrófago CD11b+ CD64+, macrófago CD11b+ CD68+, preferiblemente un macrófago M1 CD11b+ CD86+, preferiblemente productor de óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) y/o secretor de interleucina 12 (IL-12) o preferiblemente un macrófago M2 CD11b+ CCR2+, macrófago M2 CD11b+ CD204+, macrófago M2 CD11b+ CD206+, macrófago M2 CD11b+ CD204+ CD206+, macrófago M2 CD11b+ del complejo principal de histocompatibilidad II+ (MHCII+) (baja o alta expresión), macrófago M2 CD11b+ CD200R+, macrófago M2, CD11b+ CD163+ o macrófago activado productor y/o secretor de arginasa-1 y/o interleucina 10 (IL-10); o una célula dendrítica, preferiblemente con expresión de CD11b CD11c, CD11b<c>D80, CD11c CD80, CD11c CD86, CD11c MHCII y CD11c CD123, preferiblemente, el monocito diferenciado no es una célula espumosa que exprese el receptor de lipoproteínas de baja densidad oxidadas tipo lectina-1 (Lox1+), el receptor de quimiocinas C-X-C tipo 7 (CXCR7+) y el factor nuclear (derivado de eritroides 2) similar a 2 (NRF2+). Una célula espumosa es un tipo de macrófago que se localiza en los depósitos grasos de las paredes de los vasos sanguíneos, donde ingiere lipoproteínas de baja densidad y se carga de lípidos dándoles un aspecto espumoso. Estas células secretan diversas sustancias implicadas en el crecimiento de la placa y su muerte favorece la inflamación, contribuyendo así a la enfermedad cardiovascular;
(iii) monocitos o monocitos activados que expresan al menos un receptor de quimiocinas, preferiblemente seleccionado del grupo formado por CCR1, CCR2, CXR4 y CXR6, o al menos un receptor de factor de crecimiento, preferiblemente seleccionado del grupo formado por el receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos (CD 115), el receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos (CD114) y el receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (formado por CD116 y CD131); los monocitos de estas características son especialmente adecuados para tratar afecciones inflamatorias y cáncer;
(iv) el linfocito se selecciona del grupo formado por un linfocito T CD3+ y CD4+ o CD8+, o un linfocito B CD19+, CD20+, CD21+, CD19+ CD20+, CD19+ CD21+, CD20+ CD21+, o CD19+ CD20+ CD21+; o
(v) el granulocito se selecciona del grupo formado por un neutrófilo, preferiblemente un neutrófilo CD66b+, un eosinófilo y un basófilo, preferiblemente un eosinófilo CD193+.
En una realización preferida del sistema de suministro dirigido de la presente invención, el macrófago activado:
(i) es producible por incubaciónin vitrode un monocito o macrófago o sus precursores con un factor capaz de alterar los marcadores de expresión en los macrófagos, preferiblemente
(a) con al menos un inductor M1,
(b) con al menos un inductor M2,
(c) o con un factor capaz de alterar la capacidad de los macrófagos para secretar citocinas, preferiblemente IL-10 e IL-12, quimiocinas y/o para producir iNOS, arginasa u otras enzimas inmunomoduladoras; ejemplos de tales factores son: plaquetas activadas, IL-4, IL-10, IL-13, inmunocomplejo de un antígeno y un anticuerpo, IgG, gammaglobulina activada por calor, glucocorticosteroide, factor de crecimiento tumoral-p (TGF-p), IL-1R, ligando de quimiocina CC 2 (CCL-2), IL-6, factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), agonista del receptor y activado por el proliferador de peroxisomas (PPARy), factor inhibidor de leucocitos (LIF), adenosina, infección por helmintos y hongos, lipopolisacárido (LPS), interferón<y>(INF-<y>), factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF) e infección viral y bacteriana; a este respecto, se observó que la activación de un monocito con un inductor M1, en particular LpS, hará que la célula exprese iNOS, que la activación de un monocito con un inductor M1, en particular LPS, hará que la célula no exprese arginasa-1, que la activación de un monocito con un inductor M2, en particular IL-4, hará que la célula exprese arginasa-1, y que la activación de un monocito con un inductor M2, en particular IL-4, hará que la célula no exprese iNOS,
(ii) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los antígenos siguientes CD64, CD86, CD16, CD32, alta expresión de MHCII, y/o producción de iNOS y/o IL-12;
(iii) es producible por incubaciónin vitrode un monocito o macrófago con un factor capaz de inducir la capacidad del macrófago para fagocitar, por ejemplo, IL-18, opsoninas (por ejemplo, proteínas derivadas del complemento tales como iC3b, inmunoglobulina G), péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), lipopolisacárido (LPS), interferón y (INF-y), factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), infección viral y/o infección bacteriana;
(iv) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los antígenos siguientes: CD204, CD206, CD200R; CCR2, receptor de transferrina (TfR), receptor 4 de quimiocina motriz CXC (CXCR4), CD163, y/o dominio de inmunoglobulina de células T y dominio 2 de mucina (TIM-2), y/o muestran baja expresión de MHCII; los macrófagos activados que tienen estas propiedades son particularmente adecuados para complejos que comprenden ferritina como proteína fijadora de hierro;
(v) tiene la capacidad de fagocitar; y/o
(vi) es capaz de secretar citocinas, preferiblemente IL-12, o IL-10, o de producir óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) (u otros compuestos proinflamatorios), arginasa u otros compuestos inmunosupresores/antiinflamatorios.
En una realización preferida del sistema de administración dirigido de la presente invención, el inductor M1 para diferenciar macrófagos en macrófagos M1 se selecciona del grupo que consiste en lipopolisacárido (LPS), interferón<y>(INF-<y>), factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF) e infección viral y bacteriana, y el inductor M2 para diferenciar macrófagos en macrófagos M2 se selecciona del grupo que consiste en IL-4, IL-10, IL-13, inmunocomplejo de antígeno y anticuerpo, IgG, gammaglobulina activada por calor, glucocorticosteroide, factor de crecimiento tumoral-p (TGF-p), IL-1R, ligando de quimiocina CC 2 (CCL-2), IL-6, factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), agonista del receptor<y>activado por proliferadores de peroxisomas (PPAR<y>), factor inhibidor de leucocitos (LIF), adenosina, infección por helmintos y hongos.
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que tanto los macrófagos M1 cargados con complejos como los macrófagos M2 son adecuados para la administración dirigida de agentes activos en tejidos hipóxicos, preferiblemente un tumor o su metástasis. En general, observamos que entre el 3 y el 5% de los macrófagos M1 administrados se localizaban en el tumor, mientras que alrededor del 35% de los macrófagos M2 mostraban un direccionamiento específico hacia el tumor. Sin embargo, esta ventaja general de los macrófagos M2 se vio contrarrestada cuando se utilizó un complejo compuesto por hemoglobina y fármaco, ya que se pudieron cargar cantidades significativamente mayores de este complejo en los macrófagos M1 que en los M2. En general, este tropismo específico hace que los macrófagos M2 sean más adecuados para el tratamiento de tumores y enfermedades caracterizadas por tejidos hipóxicos.
En una realización preferida del sistema de administración dirigida de la presente invención, el monocito:
(i) es producible a partir de una célula precursora hematopoyética CD34+;
(ii) es producible por incubaciónin vitrode monocitos con al menos un inductor, preferiblemente inductor M1 o M2, más preferiblemente al menos un inductor M2;
(iii) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los siguientes antígenos: TfR, CD163, TIM-2, CD14, CD16, CD33, y/o CD115;
(iv) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los siguientes antígenos: TfR, CD163, TIM-2, CXCR4, CD14, y/o CD16; y/o
(v) tiene la capacidad de fagocitar.
En esta realización del sistema de administración dirigida de la presente invención, el inductor M1 para la diferenciación de monocitos se selecciona del grupo que consiste en LPS, INF-y, GM-CSF o infección viral o bacteriana, o el inductor M2 para la diferenciación de monocitos se selecciona del grupo que consiste en IL-4, IL-10, IL-13, inmunocomplejo de antígeno y anticuerpo, IgG, gammaglobulinas activadas por calor, glucocorticosteroides, TGF-p, IL-1R, CCL-2, IL-6, M-CSF, agonista de PPARy, factor inhibidor de leucocitos (LIF), medio acondicionado para el cáncer, células cancerosas, adenosina e infección por helmintos u hongos.
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que los monocitos son adecuados para la administración selectiva de agentes activos en tejidos hipóxicos, preferiblemente el tumor o su metástasis, mientras que los monocitos tratados con activadores M2 son más adecuados para la administración selectiva de agentes activos en tejidos hipóxicos, preferiblemente el tumor o su metástasis. Estos tropismos específicos hacen que los monocitos tratados con activadores M2 sean más adecuados para tratar tumores y zonas hipóxicas.
En una realización preferida del sistema de administración dirigida de la presente invención, el linfocito:
(i) puede obtenerse de la sangre, el bazo o la médula ósea o es producible a partir de una célula precursora CD34+ como es conocido por el experto y también se describe en, por ejemplo, Lefort y Kim, 2010, J Vis Exp 40: 2017; Tassone y Fidler, 2012, Methods in Molecular Biology 882: 351-357; Kouro et al., 2005, Current Protocols in Immunology, 66:F22F.1:22F.1.1-22F.1.9.;
(ii) es un linfocito inmunológicamente competente;
(iii) expresa receptores de células T específicos de antígenos; y/o
(iv) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los siguientes antígenos: (a) antígeno CD3 y CD4 o CD8 o (b): CD19, CD20, CD21, CD19 CD20, CD19 CD21, CD20 CD21, o CD19 CD20 CD21, y preferiblemente es capaz de producir inmunoglobulinas.
En una realización preferida del sistema de administración dirigida de la presente invención, el granulocito:
(i) puede obtenerse a partir de sangre, bazo o médula ósea o producirse a partir de una célula precursora CD34+ como se describe, por ejemplo, en Kuhs et al. 2015, Curr Protoc Immunol 111: 7.23-1-7.23.16; Coquery et al., 2012, Cytometry A 81(9): 806-814; Swemydas y Lionakis 2013, J Vis Exp 77: 50586.;
(ii) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los siguientes CD66b y/o CD 193;
(iii) es un leucocito polimorfonuclear caracterizado por la presencia de gránulos en su citoplasma; y/o (iii) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los siguientes: TfR, CD163, TIM-2, y/o CXCR4.
En una realización preferida del sistema de administración dirigido de la presente invención, la proteína fijadora de hierro se selecciona del grupo que consiste en ferritina, preferiblemente ferritina pesada (H), ferritina ligera (L) y/o ferritina mitocondrial; hemoglobina, preferiblemente hemoglobina A, hemoglobina AS, hemoglobina SC, hemoglobina C, hemoglobina D, hemoglobina E, hemoglobina F, hemoglobina H; complejo hemoglobinahaptoglobina, hemopexina, transferrina; y lactoferrina. Los términos ferritina; hemoglobina, preferiblemente hemoglobina A, hemoglobina AS, hemoglobina SC, hemoglobina C, hemoglobina D, hemoglobina E, hemoglobina F, hemoglobina H; complejo hemoglobina-haptoglobina, hemopexina, transferrina; y lactoferrina engloban variantes estructurales de las proteínas naturales y, por lo tanto, se refieren a proteínas que tienen al menos el 70%, preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% y más preferiblemente al menos el 100% de la capacidad de la proteína de tipo silvestre respectiva para fijar ion(es) de hierro. Las proteínas de fijación de hierro utilizadas en el contexto de la presente invención son preferiblemente de mamífero, más preferiblemente de ratón, rata, perro, simio, en particular, chimpancé, o humano, más preferiblemente de origen humano. Las secuencias de consenso de las proteínas fijadoras de hierro preferidas utilizadas en el contexto de la presente invención se muestran en la Fig. 1 a continuación. Las variantes estructurales preferidas se basan en las secuencias indicadas en la Fig. 1. Los residuos marcados con una X varían entre las diferentes ferritinas, transferrinas y hemoglobinas de mamíferos. La alteración de estos residuos no es crucial para la capacidad de las proteínas de unirse a los iones de hierro. En consecuencia, se prefiere que las mutaciones o deleciones de aminoácidos afecten a uno o más de los residuos marcados con una X.
Las proteínas plasmáticas siempre han sido portadores privilegiados para la administración de principios activos farmacéuticos en la terapia del cáncer. Por lo tanto, la albúmina, la proteína plasmática más abundante, se utiliza actualmente en protocolos terapéuticos para la administración de moléculas de taxano y derivados de la doxorrubicina (Larsen MT et al., 2016, Mol Cell Ther 27; 4: 3).
Las proteínas transferrina y ferritina humanas se han considerado portadores eficaces para la administración de pequeñas moléculas o conjugados de toxinas dirigidos específicamente a células cancerosas. Hasta la fecha, a pesar de los considerables esfuerzos realizados, ningún complejo farmacológico de transferrina o ferritina ha llegado a la clínica (Luck AN et al., 2013, Adv Drug Deliv Rev 65(8): 1012-9).
La ferritina tiene una arquitectura en jaula y capacidad de unión al hierro que podría utilizarse para encapsular fármacos en el interior de su cavidad. Las ferritinas no son abundantes en el plasma, pero pueden producirse fácilmente en alto rendimiento como proteínas recombinantes en vectores comunes de expresión de proteínas como las células deEscherichia coli.Las cadenas H o L de las ferritinas están codificadas como pequeños monómeros proteicos (21 kDa y 19 KDa para las cadenas H y L, respectivamente) capaces de ensamblarse con 24 mer en una estructura similar a una jaula, delimitando una cavidad de 8 nm de diámetro. Los presentes inventores observaron en el contexto del trabajo sobre la presente invención que los homopolímeros de H-ferritina representan una construcción proteica preferida para administrar específicamente fármacos encapsulados a las células leucocitarias CD45+ que expresan TfR. Además, la H-ferritina dirige principios activos complejos al núcleo de la célula (y, por lo tanto, administra directamente proteínas de unión al ADN en el núcleo.
La transferrina purificada puede conjugarse eficientemente con algunos fármacos contra el cáncer mediante enlazadores covalentes que se liberan adecuadamente dentro de las células (Beyer U et al., 1998, J Med Chem 41(15): 2701-2708). En el caso de la transferrina, sólo los grupos de lisina de la superficie de la proteína están disponibles para la unión covalente.
La hemoglobina ha sido considerada en el pasado como un posible portador de fármacos, debido a su versatilidad en la conjugación química con fármacos, su abundancia y relativa estabilidad en la sangre (Somatogen, 1993, WO1993008842 A1). Sin embargo, la falta de propiedades de direccionamiento a receptores no fomentó aplicaciones biomédicas distintas de los sustitutos sanguíneos o los agentes antiescaras. De hecho, la Hb sólo puede ser reconocida por epítopos CD163 (receptor de haptoglobina/hemoglobina) en los leucocitos, especialmente de origen monocito-macrófago. El leucocito CD45+, en particular la administración de proteínas basada en macrófagos, que se describe en esta solicitud, desplazó a la hemoglobina al centro de la escena como portador de fármacos específico de un objetivo. La hemoglobina puede unirse covalentemente con facilidad a conjugados farmacológicos apropiados, albergar moléculas farmacológicas hidrófobas dentro del bolsillo de unión hemo o incluso transportar pequeñas moléculas citotóxicas unidas al hierro hemo. La Hb puede modificarse fácilmente mediante la unión selectiva del conjugado farmacológico apropiado al residuo de cisteína beta93, la única cisteína titulable de la superficie de la proteína. Los fármacos con la función maleimida, tal como el inhibidor de la tubulina MonometilAuristatina (MMAE) o el fármaco entrecruzante del dímero ADN pirrolobenzodiazepina (PBD) son ejemplos notables de citotóxicos extremadamente potentes que pueden unirse fácil y específicamente al residuo cys beta93 correspondiente.
Alternativamente, los residuos de lisina en la superficie de la Hb (al menos 10 residuos de lisina valorables por tetrámero de Hb) pueden ser fácilmente susceptibles de conjugación con fármacos a través de enlaces succinimida escindibles. La hemoglobina también ofrece una capacidad única de liberar el grupo hemo unido de forma no covalente a valores de pH ácido. La apo-hemoglobina así obtenida es capaz de albergar varias moléculas hidrófobas dentro del bolsillo hemo vacío, como se muestra en el caso del paclitaxel (Meng Z et al., 2015 J Pharm Sci 104(3): 1045-55).
Cualquiera que sea el método de conjugación/adsorción/unión, la hemoglobina (Hb), la transferrina (Tf) y las ferritinas demostraron en las presentes invenciones ser portadores privilegiados de fármacos, una vez cargados en sistemas celulares apropiados con propiedades de orientación tumoral, por ejemplo, macrófagos activados. El procedimiento de purificación fácil, rápido, económico y seguro de estas proteínas también aporta un enorme valor añadido.
Basándose en las secuencias de ferritinas tipo H, ferritinas tipo L, cadenas alfa de hemoglobina, cadenas beta de hemoglobina y transferrinas de mamíferos, se determinó una secuencia consenso para cada una de estas proteínas. Éstas se muestran en la Fig. 1 en la SEQ ID NO: 2, 7, 9, 14, 16, 20 y 25, respectivamente). Sobre esta base, pero también sobre la base de la supresión y el análisis estructural divulgados en el estado de la técnica, se determinó un fragmento mínimo para las ferritinas de tipo H, las ferritinas de tipo L, las cadenas alfa de hemoglobina y las cadenas beta de hemoglobina suficiente para su captación por los leucocitos CD45+. Se muestran en la SEQ ID NO: 1, 3, 5 (ferritina tipo H); 8, 10 12 (ferritina tipo L), 15 y 17 (cadena alfa de hemoglobina) y 19 y 21 (cadena beta de hemoglobina). La transferrina comprende un dominio situado en el extremo terminal N y un dominio situado en el extremo terminal C que son necesarios para la fijación del hierro y su captación por los leucocitos CD45+, si están comprendidos en un polipéptido y situados entre 100 y 450 aminoácidos de separación, preferiblemente entre 150 y 400, más preferiblemente entre 200 y 350 aminoácidos y más preferiblemente entre 250 y 320 aminoácidos de separación. El dominio del extremo terminal N comprende los aminoácidos 1 a 82 de la transferrina de consenso de longitud completa (SEQ ID NO: 25) o de la transferrina humana de longitud completa (SEQ ID NO: 28). El dominio del extremo terminal C comprende los aminoácidos 396 a 510 de la transferrina consenso de longitud completa (SEQ ID NO: 25) o transferrina humana de longitud completa (SEQ ID NO: 28). En cada caso en que se indica una X en la secuencia consenso, ésta representa independientemente cualquier aminoácido y caracteriza un aminoácido no conservado o sólo escasamente conservado entre las ferritinas tipo H de mamíferos, que puede mutarse sin detrimento o con poco detrimento de las propiedades de fijación del hierro de la proteína fijadora de hierro respectiva. Se prefiere que X tenga en cada caso el significado del aminoácido de la respectiva proteína humana fijadora de hierro que se alinea con X. Esta información puede tomarse, por ejemplo, de la Fig. 1, que muestra los alineamientos de las secuencias consenso con proteínas humanas y, en algunos casos, de ratón.
Las ferritinas de tipo H preferidas comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 1 y variantes de la misma que tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una ferritina de tipo H que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente leucocitos M2. En la SEQ ID NO: 1 X en la posición 5 puede estar presente o ausente, si está presente significa cualquier aminoácido, preferiblemente Ile, X en la posición 6 significa cualquier aminoácido, preferiblemente Asn, X en la posición 14 significa cualquier aminoácido, preferiblemente Tyr, X en la posición 24 significa cualquier aminoácido, preferiblemente Tyr o Cys, X en la posición 66 significa cualquier aminoácido, preferiblemente Phe, X en la posición 68 significa cualquier aminoácido, preferiblemente Gln, X en la posición 75 significa cualquier aminoácido, preferiblemente Arg o Cys, X en la posición 90 significa cualquier aminoácido, preferiblemente His, X en la posición 94 significa cualquier aminoácido, preferiblemente Ser o Asn, X en la posición 120 puede estar presente o ausente, si está presente significa cualquier aminoácido, preferiblemente His o Tyr, más preferiblemente His, X en la posición 123 significa cualquier aminoácido, preferiblemente Asn o Ser, más preferiblemente Asn, X en la posición 128 significa cualquier aminoácido, preferiblemente Ala o Ser, más preferiblemente Ala.
En una realización preferida, la ferritina de tipo H comprende o consiste en ferritina murina de acuerdo con la SEQ ID NO: 3. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una ferritina de tipo H consistente en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2.
En una realización preferida, la ferritina de tipo H comprende o consiste en ferritina humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 5. La ferritina de tipo H es una variante estructural preferida. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una ferritina de tipo H que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2.
En una realización preferida, la ferritina de tipo H comprende o consiste en una secuencia consenso de mamífero derivada de alinear ferritinas de tipo H de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o 7, siendo preferida la 2. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una ferritina de tipo H que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o 7, siendo preferida la 2 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2. En la SEQ ID NO: 2 X en la posición 6 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Pro, X en la posición 14 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente His, X en la posición 16 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asp, X en la posición 21 puede estar presente o ausente, si está presente significa cualquier aminoácido, preferiblemente Ile, X en la posición 22 significa cualquier aminoácido, preferiblemente Asn, X en la posición 30 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Tyr, X en la posición 40 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Tyr o Cys, más preferiblemente Tyr, X en la posición 82 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Phe, X en la posición 84 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Gln, X en la posición 91 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Arg o Cys, más preferiblemente Cys, X en la posición 106 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente His, X en la posición 110 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asn o Ser, más preferiblemente Asn, X en la posición 137 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente His o Tyr, más preferiblemente His, X en la posición 140 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asn o Ser, más preferiblemente Asn, X en la posición 145 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ala o Ser, más preferiblemente Ala, X en la posición 164 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ala o Ser, más preferiblemente Ser, X en la posición 166 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Met o Leu, preferiblemente Leu, X en la posición 178 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asp o His, más preferiblemente Asp, X en la posición 181 está ausente o cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asn, X en la posición 182 está ausente o cualquier aminoácido natural, preferiblemente Glu, X en la posición 183 está ausente o cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ser. En la SEQ ID NO: 7 X en la posición 6 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Pro, X en la posición 14 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente His, X en la posición 16 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asp, X en la posición 21 puede estar presente o ausente, si está presente significa cualquier aminoácido, preferiblemente Ile, X en la posición 29 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Tyr, X en la posición 81 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Phe, X en la posición 83 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Gln, X en la posición 105 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente His, X en la posición 144 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ala o Ser, más preferiblemente Ala, X en la posición 180 está ausente o cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asn, X en la posición 181 está ausente o cualquier aminoácido natural, preferiblemente Glu, X en la posición 182 está ausente o cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ser.
En una realización preferida, la ferritina de tipo H comprende o consiste en ferritina murina de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 siendo la preferida. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una ferritina murina de tipo H consistente en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2.
En una realización preferida, la ferritina de tipo H comprende o consiste en ferritina humana de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 siendo la preferida. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una ferritina humana de tipo H que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2.
Las ferritinas de tipo L preferidas comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 8 y variantes de la misma que tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una ferritina de tipo L que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 8 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente leucocitos M2. En la SEQ ID NO: 8 X en la posición 5 puede ser cualquier aminoácido de origen natural, preferiblemente Asp o Glu, más preferiblemente Asp, X en la posición 12 puede ser cualquier aminoácido de origen natural, preferiblemente Arg o Ser, más preferiblemente Ser, X en la posición 17 puede ser cualquier aminoácido de origen natural, preferiblemente Ser o Arg, más preferiblemente Ser, X en la posición 19 puede ser cualquier aminoácido de origen natural, preferiblemente Arg o Gln, más preferiblemente Gln, X en la posición 29 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Phe, X en la posición 30 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Tyr o Phe, más preferiblemente Tyr, X en la posición 42 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ser o Gly, más preferiblemente Ser, X en la posición 56 puede ser cualquier aminoácido natural, X en la posición 61 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Glu o Lys, más preferiblemente Lys, X en la posición 62 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Met o Phe, más preferiblemente Met, X en la posición 65 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asp o Gln, más preferiblemente Gln, X en la posición 75 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ile o Val, más preferiblemente Ile, X en la posición 76 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Lys o Gln, más preferiblemente Lys, X en la posición 79 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ala o Ser, más preferiblemente Ala, X en la posición 80 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Glu o Gln, más preferiblemente Gln, X en la posición 87 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Pro o Gln, más preferiblemente Pro, X en la posición 88 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Glu o Asp, más preferiblemente Asp, X en la posición 91 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Glu o Lys, más preferiblemente Lys, X en la posición 94 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Met o Leu, más preferiblemente Leu, X en la posición 96 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Met o Leu, más preferiblemente Met, X en la posición 99 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Lys o Asn, preferiblemente Lys, X en la posición 115 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Thr o Ala, más preferiblemente Thr, X en la posición 119 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Leu, X en la posición 125 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ser o Thr, más preferiblemente Thr, X en la posición 127 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Tyr o Phe, más preferiblemente Phe, X en la posición 130 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Lys o Glu, más preferiblemente Glu, X en la posición 140 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asp o Asn, más preferiblemente Asp, X en la posición 146 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Arg o His, más preferiblemente His, y X en la posición 148 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Leu o Val, más preferiblemente Leu.
En una realización preferida, la ferritina de tipo L comprende o consiste en ferritina de tipo L murina de acuerdo con la SEQ ID NO: 10. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una ferritina de tipo L consistente en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 10 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2.
En una realización preferida, la ferritina de tipo L comprende o consiste en ferritina humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 12. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una ferritina de tipo L consistente en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2.
En una realización preferida, la ferritina de tipo L comprende o consiste en una secuencia consenso de mamífero derivada de la alineación de ferritinas de tipo H de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 9 o 14, siendo preferida la 9. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una ferritina de tipo L que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 9 o 14, siendo preferida la 9 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2. En la SEQ ID NO: 9 X en la posición 12 X en la posición 12 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asp o Glu, más preferiblemente Asp, X en la posición 19 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ser o Arg, más preferiblemente Ser, X en la posición 24 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ser o Arg, más preferiblemente Ser, X en la posición 26 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Arg o Gln, más preferiblemente Gln, X en la posición 36 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Phe, X en la posición 37 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Tyr o Phe, más preferiblemente Tyr, X en la posición 47 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ser o Gly, más preferiblemente Ser, X en la posición 63 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ala o Tyr, más preferiblemente Tyr, X en la posición 68 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Glu o Lys, más preferiblemente Lys, X en la posición 69 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Met o Phe, más preferiblemente Met, X en la posición 72 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asp o Gln, más preferiblemente Gln, X en la posición 82 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ile o Val, más preferiblemente Ile, X en la posición 83 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Lys o Gln, más preferiblemente Lys, X en la posición 86 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ala o Ser, más preferiblemente Ala, X en la posición 87 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Glu o Gln, más preferiblemente Gln, X en la posición 94 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Pro o Gln, más preferiblemente Pro, X en la posición 95 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Glu o Asp, más preferiblemente Asp, X en la posición 98 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Glu o Lys, más preferiblemente Lys, X en la posición 101 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Met o Leu, más preferiblemente Leu, X en la posición 103 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Met o Leu, más preferiblemente Met, X en la posición 106 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Lys o Asn, preferiblemente Lys, X puede ser cualquier aminoácido natural, X en la posición 126 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Leu, X en la posición 132 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ser o Thr, más preferiblemente Thr, X en la posición 134 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Tyr o Phe, más preferiblemente Phe, X en la posición 137 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Lys o Glu, más preferiblemente Glu, X en la posición 147 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asp o Asn, más preferiblemente Asp, X en la posición 153 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Arg o His, más preferiblemente His, X en la posición 155 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Leu o Val, más preferiblemente Leu, X en la posición 161 puede estar ausente o ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Ala, X en la posición 163 puede estar ausente o ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Thr, X en la posición 166 puede estar ausente o ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Pro, y X en la posición 168 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Gly o Ala, más preferiblemente Ala. En la SEQ ID NO: 14 X en la posición 36 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Phe, X en la posición 37 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Tyr o Phe, más preferiblemente Tyr, X en la posición 94 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Pro o Gln, más preferiblemente Pro, X en la posición 126 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Leu, X en la posición 137 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Lys o Glu, más preferiblemente Glu, X en la posición 147 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Asp o Asn, más preferiblemente Asp, X puede ser cualquier aminoácido natural, X en la posición 163 puede estar ausente o ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Thr, X en la posición 166 puede estar ausente o ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Pro, X en la posición 168 puede ser cualquier aminoácido natural, preferiblemente Gly o Ala, más preferiblemente Ala.
En una realización preferida, la ferritina de tipo L comprende o consiste en ferritina murina de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 11 siendo la preferida. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una ferritina murina de tipo L consistente en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2.
En una realización preferida, la ferritina de tipo L comprende o consiste en ferritina humana de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 13 siendo preferida. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una ferritina de tipo L humana que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 13 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2.
En una realización preferida, la hemoglobina alfa comprende o consiste en una secuencia consenso mínima de mamífero derivada de alinear hemoglobinas alfa de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 15. Preferiblemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 15 y variantes de la misma que tengan al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una hemoglobina alfa consistente en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 15 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M1.
En una realización preferida, la hemoglobina alfa comprende o consiste en una secuencia mínima de aminoácidos humanos derivada de la hemoglobina alfa humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 17. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una hemoglobina alfa consistente en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 17 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M1.
En una realización preferida, la hemoglobina alfa comprende o consiste en una secuencia consenso de mamífero derivada de la alineación de hemoglobinas alfa de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 16. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una hemoglobina alfa consistente en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 16 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2.
En una realización preferida, la hemoglobina alfa comprende o consiste en hemoglobina alfa humana de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 18. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una hemoglobina alfa humana de longitud completa que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 18 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2.
En una realización preferida, la hemoglobina alfa comprende o consiste en una secuencia consenso mínima de mamífero derivada de alinear hemoglobinas beta de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 19 y sus variantes que tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una hemoglobina beta consistente en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 19 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M1.
En una realización preferida, la hemoglobina alfa comprende o consiste en una secuencia mínima de aminoácidos humanos derivada de la hemoglobina beta humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 21. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una hemoglobina beta consistente en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 21 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M1.
En una realización preferida, la hemoglobina beta comprende o consiste en una secuencia consenso de mamífero derivada de la alineación de hemoglobinas beta de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 20. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una beta hemoglobina que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2.
En una realización preferida, la beta-hemoglobina comprende o consiste en beta-hemoglobina humana de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 22. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y, en cada caso, al menos un 70% de la capacidad de una beta hemoglobina humana de longitud completa consistente en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M2.
En una realización preferida, la transferrina comprende o consiste en una secuencia consenso de mamífero derivada de la alineación de hemoglobinas alfa de longitud completa de acuerdo con la SEQ ID NO: 25. Por lo tanto, en particular, las transferrinas preferidas comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 25 y de variantes de la misma que tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una transferrina que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 25 para ser captada por leucocitos CD45+ preferiblemente macrófagos M1.
En una realización preferida la transferrina comprende o consiste en transferrina humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 28. En consecuencia, las variantes estructurales preferidas tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una transferrina que consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 28 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M1.
Las propiedades de fijación de hierro de las transferrinas dependen de un dominio localizado del extremo terminal N y del extremo terminal C. Por lo tanto, en una realización preferida la transferrina utilizada en la presente invención comprende al menos el dominio del extremo terminal N de acuerdo con la SEQ ID NO: 23 y el dominio del extremo terminal C de acuerdo con la SEQ ID NO: 24. La transferrina preferida comprende proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 23 y 24 así como variantes de la misma que tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una transferrina que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 23 y 24 para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M1. La SEQ ID NO: 23 o 24 indica una secuencia consenso de transferrinas de mamíferos.
Por lo tanto, en una realización preferida, la transferrina utilizada en la presente invención comprende al menos el dominio del extremo terminal N de acuerdo con la SEQ ID NO: 26 y el dominio del extremo terminal C de acuerdo con la SEQ ID NO: 27. La transferrina preferida comprende proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 26 y 27, así como variantes de la misma que tienen al menos un 70% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 75% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 80% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de aminoácidos, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de aminoácidos y en cada caso al menos un 70% de la capacidad de una transferrina que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 26 y 27, respectivamente, para ser captada por leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos M1.
Las ferritinas preferidas también comprenden proteínas que, independientemente de la secuencia de aminoácidos dada, se ajustan al ensamblaje de 24 subunidades mer de un módulo de proteína de haz de cuatro hélices, que caen dentro de alineaciones de secuencia dadas de proteínas distantemente relacionadas de acuerdo con lo definido por alineaciones basadas en estructuras 3D.
Es una observación sorprendente de los presentes inventores que los linfocitos y los macrófagos M2 son mejores en la captación de complejos que comprenden una o más ferritina y uno o más principio activo, que los macrófagos M1 son mejores en la captación de complejos que comprenden una o más hemoglobina y uno o más principio activo y que los macrófagos son mejores en la captación de complejos que comprenden una o más transferrina y uno o más principio activo. Por consiguiente, basándose en el tropismo tisular y celular de los leucocitos CD45+: monocitos, macrófagos M1 y M2, granulocitos y linfocitos, descritos anteriormente los complejos que comprenden una o más ferritina y uno o más principio activo se utilizan para cargar macrófagos M2, linfocitos o monocitos si se desea el tropismo de macrófagos M2, linfocitos o monocitos y los complejos que comprenden una o más hemoglobina y uno o más principio activo se utilizan para cargar macrófagos M1, si se desea el tropismo de macrófagos M1.
En el sistema de administración dirigida de la presente invención, el fármaco se selecciona del grupo que consiste en un fármaco anticanceroso, en particular un fármaco citostático, un fármaco citotóxico y profármacos del mismo; un fármaco anti arteriosclerótico, un fármaco antiinflamatorio, un ácido nucleico, un compuesto fotosensibilizante; un virus, en particular un virus oncolítico; y un isótopo radiactivo farmacéuticamente activo, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en lutecio-177, iterbio-90, yodo-131, samario-153, fósforo-32, cesio-131, paladio-103, radio-233, yodo-125 y boro-10 o una cantidad de radiación a dañina para las células, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en actinio-225, bismuto-213, plomo-212 y polonio-212.
Los fármacos anticancerígenos preferidos se seleccionan entre los fármacos inductores de apoptosis/autofagia o necrosis. Un fármaco inductor de apoptosis/autofagia o necrosis puede ser cualquier fármaco capaz de inducir apoptosis/autofagia o necrosis eficazmente incluso en células que presentan una anormalidad en la proliferación celular. Estos fármacos se utilizan preferiblemente en complejos con una o más ferritinas.
Los fármacos anticancerosos preferidos se seleccionan del grupo formado por un fármaco inductor de apoptosis, una sustancia alquilante, antimetabolitos, antibióticos, epotilonas, agonistas y antagonistas de receptores nucleares, un antiandrógeno, un antiestrógeno, un compuesto de platino, una hormona, una antihormona, un interferón, un inhibidor de las proteínas quinasas dependientes del ciclo celular (CDK), un inhibidor de las ciclooxigenasas y/o lipoxigenasas, un ácido graso biogénico, un derivado de ácido graso biogénico, incluidos prostanoides y leucotrienos, un inhibidor de las proteínas quinasas, un inhibidor de proteína fosfatasas, un inhibidor de lípido quinasas, un complejo de coordinación de platino, una etilenimina, una metilmelamina, una triazina, un alcaloide de la vinca, un análogo de pirimidina, un análogo de purina, un alquilsulfonato, un análogo de ácido fólico, una antracendiona, una urea sustituida, y un derivado de la metilhidrazina, un antibiótico de ene-diina, un inhibidor de la polimerización de la tubulina tal como un maitansinoide o un derivado de la auristatina, un inhibidor del punto de control inmunitario y un inhibidor de la proteína o marcador específico del tumor, preferiblemente un inhibidor de la disociación Rho-GDP, más preferiblemente Grp94.
Otros fármacos anticancerosos preferidos se seleccionan del grupo que consiste en acediasulfona, aclarrubicina, ambazona, aminoglutetimida, L-asparaginasa, azatioprina, banoxantrona, bendamustina, bleomicina, busulfano, folinato cálcico, carboplatino, carpecitabina, carmustina, celecoxib, clorambucilo, cisplatino, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina dapsona, daunorrubicina, dibromopropamidina, dietilestilbestrol, docetaxel, doxorrubicina, enediinas, epirrubicina, epotilona B, epotilona D, fosfato de estramucina, estrógeno, etinilestradiol, etopósido, flavopiridol, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, fluoximesterona, flutamida fosfestrol, furazolidona, gemcitabina, análogo de la hormona liberadora de gonadotropina, hexametilmelamina, hidroxicarbamida, hidroximetilnitrofurantoína, hidroxiprogesteronacaproato, hidroxiurea, idarrubicina, idoxuridina, ifosfamida, interferón a, irinotecano, leuprolida, lomustina, lurtotecano, mafenida sulfato olamida, mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, megastrolacetato, melfalán, mepacrina, mercaptopurina, metotrexato, metronidazol, mitomicina C, mitopodozida, mitotano, mitoxantrona, mitramicina, ácido nalidíxico, nifuratel, nifuroxazida, nifuralazina, nifurtimox, nimustina, ninorazol, nitrofurantoína, mostazas nitrogenadas, oleomucina, ácido oxolínico, pentamidina, pentostatina, fenazopiridina, ftalilsulfatiazol, pipobromano, prednimustina, prednisona, preussina, procarbazina, pirimetamina, raltitrexed, rapamicina, rofecoxib, rosiglitazona, salazosulfapiridina, cloruro de scriflavinio, semustina, estreptozocina, sulfacarbamida, sulfacetamida, sulfaclopiridazina, sulfadiazina, sulfadicramida, sulfadimetoxina, sulfaetidol, sulfafurazol, sulfaguanidina, sulfaguanol, sulfametozol, sulfametoxazol, cotrimoxazol, sulfametoxidiazina, sulfametoxipiridazina, sulfamoxol, sulfanilamida, sulfaperina, sulfafenazol, sulfatiazol, sulfisomidina, estaurosporina, tamoxifeno, taxol, tenipósido, tertiposido, testolactona, testosterona propionato, tioguanina, tiotepa, tinidazol, topotecano, triaziquona, treosulfano, trimetoprim, trofosfamida, UCN-01, vinblastina, vincristina, vindesina, vinblastina, vinorelbina y zorubicina, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en auristatina, banoxantrona, bendamustina, clorambucilo, caliceamicina, ciclofosfamida dinemicina A, maitansina, melfalán, mertansina y neocazinostatina, lo más preferiblemente banoxantrona, bendamustina, clorambucilo, ciclofosfamida, pirrolobenzodiazepina y melfalán.
Se prefiere especialmente que el fármaco anticanceroso sea una proteína inhibidora de la proliferación, preferiblemente un inhibidor del ciclo celular o un anticuerpo o mimético de anticuerpo que se une específicamente a una diana sobre o dentro de una célula en el tejido diana que modula el estado de enfermedad de la célula, preferiblemente una proteína promotora de la proliferación, o un ácido nucleico, preferiblemente que codifica una proteína inhibidora de la proliferación o un anticuerpo o mimético de anticuerpo que se une específicamente a una diana en o dentro de una célula del tejido diana que modula el estado de enfermedad de la célula, preferiblemente una proteína promotora de la proliferación o un ARNip o ADNzima.
Ejemplos preferidos de anticuerpos a utilizar en el contexto de la presente invención son anticuerpos de cadena simple, fragmentos de anticuerpos, nanocuerpos, cadenas ligeras o pesadas, cadenas ligeras variables o cadenas pesadas variables, o diacuerpos. Los fragmentos de anticuerpo preferidos comprenden un fragmento de unión a antígeno (Fab), un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un anticuerpo de cadena pesada, un anticuerpo de dominio único (Abdu), un fragmento variable de cadena única (Fvcu), un fragmento variable (Fv), un dominio VH, un dominio VL, un anticuerpo de dominio único, un nanocuerpo, un IgNAR (receptor de antígeno nuevo de inmunoglobulina), un di-Fvcu, un captador de células T biespecífico (BITE), una molécula de redireccionamiento de afinidad dual (DART), un cuerpo triple, un diacuerpo, un diacuerpo de cadena única y una proteína de fusión de los mismos.
Si el principio activo es un ácido nucleico, se prefiere que sea un miARN, un ARNip, una ADNzima o un ácido nucleico que codifique una proteína farmacéuticamente activa, por ejemplo, un anticuerpo, un mimético de anticuerpo, una citoquina, una enzima convertidora de profármaco o similar.
Como se ha indicado anteriormente, el sistema de administración selectiva de la presente invención es especialmente adecuado para administrar principios activos en zonas hipóxicas. El uso de principios activos que se activan bajo condiciones hipóxicas añade una especificidad adicional al direccionamiento y/o reduce aún más los efectos adversos de los principios activos. Por lo tanto, en las realizaciones particularmente preferidas, el principio activo es un profármaco activado por hipoxia. La cadena principal de todos los profármacos activados por hipoxia es la presencia de una de cinco fracciones químicas diferentes (grupos nitro, quininas, N-óxidos aromáticos y alifáticos y metales de transición) que se reducen enzimáticamente en condiciones de hipoxia tisular. Los profármacos activados por hipoxia son cualquier profármaco que sea menos activo o inactivo, en relación con el fármaco correspondiente, y que comprenda el fármaco y uno o más grupos biorreductores. Tales profármacos activados por hipoxia incluyen todos los profármacos activados por una variedad de agentes reductores y enzimas reductoras, incluyendo sin limitación las enzimas de transferencia de un solo electrón (como las reductasas del citocromo P450) y las enzimas de transferencia de dos electrones (o de transferencia de hidruros). Según una realización preferida de la invención, el profármaco activado por hipoxia es el TH-302. Los métodos para sintetizar TH-302 se describen en la solicitud PCT WO 07/002931 y WO 08/083101. Preferiblemente, los ejemplos de tales profármacos se seleccionan del grupo de clase I que consiste en N-óxidos de benzotriazina, apaziquona (EO9), tirapazamina (TPN) y SN30000; o del grupo de clase II que consiste en: nitrocompuestos PR-104A, TH-302, TH-4000 y AQ4N.
En el sistema aislado de administración dirigida de la presente invención, el enlace o enlaces entre la proteína o proteínas fijadoras de hierro y el fármaco contenido en el complejo son covalentes y/o no covalentes; o el fármaco contenido en el complejo es atrapado/encapsulado por la proteína fijadora de hierro, preferiblemente ferritina o multímeros de la misma en ausencia de un enlace covalente o no covalente. En una realización, el acoplamiento covalente y/o no covalente es indirecto a través de un enlazador o espaciador. Si se desea la formación de enlaces covalentes, se utilizan grupos tiol, amino o carboxilo relevantes de las proteínas fijadoras de hierro para acoplar covalentemente principios activos directa o indirectamente a la una o más proteínas fijadoras de hierro. También se prevé que el complejo contenga distintos principios activos. Por ejemplo, un tipo de principio activo puede estar unido a una proteína fijadora de hierro (unido de forma no covalente), mientras que otro tipo está encapsulado. Este enfoque utiliza diferentes velocidades de liberación de los principios activos de la proteína fijadora de hierro una vez que se suministran al tejido y/o células objetivo. Por ejemplo, los derivados de fármacos que actúan como principio activo pueden unirse covalentemente a la molécula de ferritina, ya sea en la superficie del 24-mer o dentro de la cavidad interna, aprovechando la reactividad de los grupos tiol, amino o carboxilo pertinentes. Los tipos de tales reacciones útiles son bien conocidos en la técnica y pueden ser adoptados por el experto en la materia al principio activo concreto sin ningún trabajo adicional. Ejemplos de tales reacciones se describen en Behrens CR, Liu B. Methods for sitespecific drug conjugation to antibodies. MAbs. Enero-febrero de 2014; 6(1): 46-53.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de preparación del sistema aislado de administración dirigida de la presente invención que comprende las etapas de
a) proporcionar la proteína fijadora de hierro purificada definida anteriormente;
b) vinculación covalente o no covalente de un principio activo y/o encapsulación de un principio activo en una proteína fijadora de hierro;
c) proporcionar una célula leucocitaria CD45+ como la definida anteriormente; y
d) incubar la célula leucocitaria CD45+ en presencia del complejo de la proteína fijadora de hierro y el principio activo producido en la etapa b) hasta que la célula leucocitaria CD45+ esté cargada al menos parcialmente, preferiblemente totalmente, con el complejo de la proteína fijadora de hierro y el principio activo producido en la etapa b).
La formación del aducto entre la proteína y la fracción del fármaco puede ser una unión no covalente de la molécula del fármaco a la proteína diana y puede describirse como sigue: en el caso de la ferritina, los fármacos pueden encapsularse típicamente dentro de la cavidad interna (confinamiento físico) aprovechando las propiedades de asociación disociación de la propia macromolécula de ferritina. Las moléculas de fármaco se mantienen en su lugar mediante interacciones no covalentes con residuos de aminoácidos dentro de la superficie interna de la cavidad. Las macromoléculas de hemoglobina también ofrecen la posibilidad de la unión no covalente de moléculas de fármacos seleccionadas que pueden alojarse dentro del bolsillo de unión al hemo de la propia hemoglobina. El hemo puede desplazarse del bolsillo y ser sustituido por fármacos con un perfil de hidrofobicidad adecuado. En otro aspecto, todas las proteínas consideradas en la presente invención pueden unirse covalentemente a moléculas de fármacos modificadas por fracciones enlazadoras activas específicas reactivas frente a grupos tiol o amino de la propia proteína. Como tal, las ferritinas o la hemoglobina pueden unirse a fármacos reactivos al tiol de la cisteína con un enlazador escindible basado en un péptido (por ejemplo, una secuencia de valina-citrulina sensible a la catepsina y un espaciador de paraaminobencilcarbamato). Como ejemplo notable, se ha utilizado el agente antimitótico monometil auristatina E (MMAE). El enlazador a base de péptidos une la proteína al compuesto citotóxico de forma estable, de modo que el fármaco no se libera fácilmente de la proteína en condiciones fisiológicas y ayuda a prevenir la toxicidad para las células sanas y a garantizar la eficacia de la dosificación. El aducto proteico-farmacológico así generado es capaz de unirse a los tipos de receptores seleccionados, es decir, CD163 para la hemoglobina y TfR para la ferritina o la transferrina, respectivamente. Una vez unido, el aducto proteínico del fármaco se internaliza por endocitosis y es captado selectivamente por las células diana. La vesícula que contiene el fármaco se fusiona con los lisosomas y las cisteína proteasas lisosomales, en particular la catepsina B, empiezan a romper el enlace valina-citrulina y el m Ma E deja de estar unido al anticuerpo y se libera directamente en el entorno tumoral.
Alternativamente, DM1-SMCC es un derivado eficiente de mertansina con un enlazador que se une específicamente a residuos de lisina generando un complejo covalente con ferritina, hemoglobina o transferrina en una reacción que se ha descrito con éxito para anticuerpos. En particular, la hemoglobina, la ferritina o la transferrina pueden reaccionar con el DM1-SMCC, creando así un aducto covalente proteína-fármaco que puede escindirse en el interior de las células y liberar el fármaco activo en función del tiempo. La supresión de la dinámica microtubular por DM1 induce la detención mitótica y la muerte celular.
El término "carga completa" se utiliza en el contexto de la presente invención para referirse a la cantidad máxima de proteína fijadora de hierro, preferiblemente ferritina, complejada con un principio activo que puede ser captada por la célula leucocitaria CD45+, preferiblemente macrófago más preferiblemente macrófago activado.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al sistema aislado de administración dirigida de la presente invención para su uso como medicamento.
Se describe además una composición farmacéutica que comprende el sistema de administración dirigido aislado de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable y/o excipiente(s) adecuado(s). Dado que el sistema de administración dirigido aislado comprende células vivas, se prefiere que los portadores y excipientes se elijan de tal manera que mantengan las células vivas.
"Farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o incluido en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en humanos.
El término "portador", tal como se utiliza aquí, se refiere a una sustancia farmacológicamente inactiva como, por ejemplo, un diluyente, excipiente, tensioactivos, estabilizadores, soluciones tampón fisiológicas o vehículos con los que se administra el ingrediente terapéuticamente activo. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos o sólidos. Los vehículos líquidos incluyen, entre otros, líquidos estériles, como soluciones salinas en agua y aceites, incluidos, entre otros, los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como el aceite de cacahuete, de soja, mineral, de sésamo y similares. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden emplearse como portadores líquidos, en particular para soluciones inyectables. Una solución salina es el vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. En "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados.
Los "excipientes" farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares.
Los "tensioactivos" incluyen tensioactivos aniónicos, catiónicos y no iónicos tales como, pero no limitados a, desoxicolato sódico, dodecilsulfato sódico, Triton X-100 y polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65 y polisorbato 80.
Los "estabilizantes" incluyen, entre otros, manitol, sacarosa, trehalosa, albúmina, así como antagonistas de proteasas y/o nucleasas.
Las "soluciones tampón fisiológicas" incluyen, entre otras, la solución de cloruro sódico, el agua desmineralizada, así como soluciones tampón orgánicas o inorgánicas adecuadas, como, entre otras, tampón de fosfato, tampón de citrato, tampón tris (tris(hidroximetil)aminometano), tampón HEPES ([ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin]etanosulfónico) o tampón MOPS (ácido 3-morfolino-1-propanosulfónico). La elección del tampón respectivo depende en general de la molaridad deseada del tampón. Los tampones de fosfato son adecuados, por ejemplo, para soluciones inyectables y de infusión.
El término "adyuvante" se refiere a agentes que aumentan, estimulan, activan, potencian o modulan la respuesta inmunitaria al ingrediente activo de la composición a nivel celular o humoral, por ejemplo, los adyuvantes inmunológicos estimulan la respuesta del sistema inmunitario al antígeno real, pero no tienen efecto inmunológico en sí mismos. Ejemplos de tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes inorgánicos (por ejemplo, sales metálicas inorgánicas como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), adyuvantes orgánicos (por ejemplo, saponinas o escualeno), adyuvantes a base de aceite (por ejemplo, adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund), citocinas (por ejemplo, IL-1p, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS e INF-<y>), adyuvantes particulados (por ejemplo, complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), liposomas o microesferas biodegradables), virosomas, adyuvantes bacterianos (p. ej., lípido monofosforil A o péptidos muramilo), adyuvantes sintéticos (p. ej., copolímeros en bloque no iónicos, análogos del péptido muramilo o lípido sintético A) o adyuvantes polinucleótidos sintéticos (p. ej., poliarginina o polilisina).
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al sistema aislado de administración dirigida de la presente invención para su uso en la prevención/tratamiento de tumores, preferiblemente un tumor sólido, preferiblemente cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de colon, o un tumor que presente zonas hipóxicas, enfermedad inflamatoria o zonas isquémicas en heridas cutáneas, otras heridas, o tras infarto de órgano (corazón) o retina isquémica.
El término "tratamiento", tal como se utiliza aquí, incluye todos los tipos de intervenciones preventivas y/o terapéuticas permitidas médicamente con fines de curación, remisión temporal, prevención, etc. para diferentes propósitos, incluyendo retrasar o detener el progreso de una enfermedad, hacer que una lesión retroceda o desaparezca, prevenir la aparición o inhibir la recurrencia.
El sistema de administración dirigida de acuerdo con la presente invención permite la administración al tumor de los principios activos, que normalmente no podrían alcanzar el tumor (por ejemplo, debido a problemas de solubilidad). También permite la administración de principios activos a los tumores hipóxicos o a las zonas hipóxicas del tumor. Este sistema también permite suministrar un principio activo a cualquier zona de un organismo sometida a condiciones de hipoxia, por ejemplo, durante incidentes isquémicos, o sometida a un proceso inflamatorio.
Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención proporciona también el método para la administración dirigida de fármacos en la masa tumoral. Este método comprende la preparación de leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos activados que permiten una captación altamente eficiente de proteínas de fijación de hierro (ferritina, hemoglobina y/o transferrina) por los macrófagos, en los que dicha ferritina, hemoglobina y/o transferrina transportan un principio activo (por ejemplo un fármaco/profármaco), el direccionamiento al tumor y la transferencia de proteínas de fijación de hierro a la célula cancerosa, donde se libera el principio activo.
La presente invención explota los leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos activados cargados con proteínas de fijación de hierro enlazadas a un fármaco/profármaco como sistema de administración para dirigirse al tumor. La respuesta insatisfactoria de los tumores a la quimioterapia o las dificultades en su detección mediante métodos de imágenes están relacionadas principalmente con una penetración alterada de los fármacos anticancerígenos en las zonas hipóxicas debido a una vasculatura deficiente. Sin embargo, estas regiones avasculares atraen a los leucocitos CD45+, preferiblemente macrófagos activados, para que migren incluso a zonas alejadas de los vasos sanguíneos. Por lo tanto, constituyen un sistema de administración de partículas a la masa tumoral. Un ejemplo prometedor de este tipo de partículas es la proteína fijadora de hierro. Sin embargo, cuando se utilizan como agentes únicos no alcanzan las regiones hipóxicas, al igual que otros compuestos, y se acumulan en otros órganos.
Los presentes inventores unieron fármacos anticancerígenos, profármacos activados por hipoxia (con fines terapéuticos) o isótopos a hemoglobina o transferrina mediante métodos químicos y los cargaron en leucocitos CD45+ (monocitos, macrófagos, linfocitos y/o granulocitos), preferiblemente macrófagos activados, tratando las células con solución de proteína fijadora de hierro como se describe en los ejemplos. Los inventores observaron que, tras la administración al animal, los leucocitos CD45+ cargados, preferiblemente macrófagos activados, migran a los lugares hipóxicos del tumor y liberan la proteína fijadora de hierro con principios activos encapsulados en las células cancerosas. Este método permite la administración precisa de los principios activos en el lugar del tumor (especialmente en las regiones hipóxicas), evitando su acumulación en otros órganos.
Breve descripción de las figuras
Fig.1: El panel (A) muestra un fragmento activo mínimo de una secuencia de aminoácidos consenso entre las cadenas H de ferritina de mamíferos y dos secuencias consenso de longitud completa basadas en varias cadenas H de ferritina de mamíferos (véase la SEQ ID NO: 1, 2 y 7, respectivamente), así como una secuencia de aminoácidos mínima y de longitud completa de la cadena H de ferritina de ratón (SEQ ID NO: 3 y 4) y humana (SEQ ID NO: 5 y 6). El panel (B) muestra un fragmento activo mínimo de una secuencia de aminoácidos consenso entre cadenas de ferritina L de mamíferos y dos secuencias consenso de longitud completa basadas en varias cadenas de ferritina L de mamíferos (véase la SEQ ID NO: 8, 9 y 14, respectivamente), así como una secuencia de aminoácidos mínima de longitud completa de cadena L de ferritina de ratón (SEQ ID NO: 10 y 11) y humana (SEQ ID NO: 12 y 13). El panel (C) muestra un fragmento activo mínimo de una secuencia de aminoácidos consenso entre las cadenas alfa de hemoglobina de mamíferos y una secuencia consenso de longitud completa basada en varias cadenas alfa de hemoglobina de mamíferos (véase la SEQ ID NO: 15 y 16, respectivamente), así como una secuencia de aminoácidos mínima y de longitud completa de la cadena alfa de hemoglobina humana (SEQ ID NO: 17 y 18). El panel (D) muestra un fragmento activo mínimo de una secuencia de aminoácidos consenso entre cadenas beta de hemoglobina de mamíferos y una secuencia consenso de longitud completa basada en varias cadenas beta de hemoglobina de mamíferos (véase la SEQ ID NO: 19 y 20, respectivamente), así como una secuencia de aminoácidos mínima y de longitud completa de cadena beta de hemoglobina humana (SEQ ID NO: 21 y 22). El panel (E) muestra un fragmento activo mínimo del extremo terminal N y C de una secuencia de aminoácidos consenso entre transferrinas de mamíferos (SEQ ID NO: 23 y 24) y una secuencia consenso de longitud completa basada en varias transferrinas de mamíferos (SEQ ID NO: 25), así como un fragmento activo mínimo del extremo terminal N y C de una transferrina humana (SEQ ID NO: 26 y 27) y una secuencia de aminoácidos de longitud completa de transferrina humana (SEQ ID NO: 28). En las secuencias de consenso X indica una posición que es variable y representa cualquier aminoácido natural. Preferiblemente, en cada caso X independientemente de otros X representa el aminoácido presente en la proteína humana.
Fig. 2: Muestra el macrófago dentro de la masa tumoral del ratón (teñido con TRITC antes de la inyección, cargado con ferritina decorada con FITC).
Fig. 3: Muestra una imagen de microscopía confocal de tejido tumoral de ratón inyectado con células cancerosas mamarias y al que se le administraron macrófagos iv cargados con ferritina-FITC (asterisco) - se observa claramente, no sólo en los macrófagos sino también en las células cancerosas, que la ferritina-FITC se extiende dentro de toda la masa tumoral.
Fig. 4: Muestra instantáneas del registro de un canal (en el canal verde original convertido a la imagen en escala de grises) mediante microscopía confocal de macrófagos (indicados con *; cargados con FITC-ferritina) y célula cancerosa (indicada con flecha; teñida con etiqueta roja y, por lo tanto, no observada en el canal verde antes de la captación de ferritina)in vitrotomadas en el punto de inicio (A) y después de un tiempo suficiente para llenar la célula cancerosa con ferritina (B). La ferritina-FITC fue transportada dinámicamente a la célula cancerosa (acumulándose primero en las vesículas y extendiéndose después a todo el citoplasma, como se observa en esta imagen (la célula aparece en el canal verde).
Fig. 5: Muestra la supervivencia de los ratones que recibieron placebo y macrófagos cargados con melfalán acoplado a ferritina y clorambucilo acoplado a ferritina.
Fig. 6: Muestra la apoptosis de las células tumorales provocada por el tratamiento con ciclofosfamida y ciclofosfamida encapsulada en ferritinas cargadas en macrófagos (administrados a las mismas dosis).
Fig. 7: Muestra imágenes de resonancia magnética de un tumor mamario de ratón. El ratón fue tratado (en el punto de tiempo 0 h) con macrófagos (inyección iv) cargados con ferritina Fh. Entonces observamos un aumento del diámetro de los vasos sanguíneos (flecha) llenos de macrófagos inyectados (produciendo una reducción significativa de la señal T2) y después los macrófagos se extendieron al tejido (patrón en forma de manchas; flechas). Estos cambios (en los mismos puntos temporales) se observaron en todos los ratones examinados.
Fig. 8: Muestra la captación de ferritina, hemoglobina y transferrina por los macrófagos, la captación de ferritina y hemoglobina por los monocitos y la captación de ferritina por los linfocitos y granulocitos.
Fig. 9: Muestra la estabilidad del almacenamiento de ferritina por los macrófagos.
Fig. 10: Muestra la transferencia de ferritina, hemoglobina y transferrina del macrófago a diversas células cancerosas.
Fig. 11: Muestra la transferencia de ferritina del macrófago a células cancerosas y no cancerosas.
Fig. 12: Muestra la transferencia de ferritina encapsulada con profármaco activado por hipoxia desde el macrófago a las células cancerosas.
Fig. 13: Muestra la apoptosis en células cancerosas que recibieron ferritina con varios agentes anticancerígenos encapsulados de macrófagos co-cultivados o ferritina soluble con los mismos agentes. Fig. 14: Muestra la transferencia de ferritina, hemoglobina y transferrina de monocitos a diversas células cancerosas.
Fig. 15: Muestra la transferencia de ferritina y hemoglobina de los granulocitos a diversas células cancerosas. Fig. 16: Muestra la transferencia de ferritina y hemoglobina de los linfocitos a diversas células cancerosas. Fig. 17: Muestra la imagen de microscopía de dos fotones que muestra el tumor de un ratón que recibió macrófagos previamente etiquetados (antes de la administración) que contenían Ferritina-FITC.
Fig. 18: Muestra las imágenes de cuerpo entero de ratones que recibieron por vía intravenosa macrófagos marcados, mostrando su acumulación en la zona del tumor y su distribución en otros órganos.
Fig. 19: Muestra la migración de macrófagos al tejido hipóxico, una sección transversal del tumor de un ratón al que se le administraron macrófagos previamente etiquetados por vía intravenosa, las zonas hipóxicas del tumor se visualizan con un marcador de hipoxia - pimonidazolona.
Fig. 20: Muestra la localización presente de vesículas que contienen ferritina cargada con FITC (objetos redondos) en el microambiente dentro de la masa tumoral. Los macrófagos que contenían ferritina cargada con FITC se administraron por vía intravenosa al ratón.
Fig. 21: Muestra la señal registrada por PET en un análisis de cuerpo entero de ratones con cáncer metastásico 4T1. Los ratones recibieron por vía intravenosa macrófagos cargados con 18F-FDG. La acumulación de señal aumenta en los pulmones de los ratones con micrometástasis (confirmado por examen patológico). Los ratones que recibieron 18F-FDG simple, o los ratones sin cáncer 4T1 tenían una señal PET más baja.
Sección de ejemplos
Ejemplo 1 - Activación de macrófagos
Los macrófagos para su uso de acuerdo con la presente invención se obtuvieron, diferenciaron y activaron de la siguiente manera. Para activar macrófagos, se obtienen en primer lugar a partir de precursores de médula ósea (por ejemplo, véase el artículo: Weischenfeld y Porse, 2008, CSH Protoc, doi. 10.1101/pdb.prot.5080) o de monocitos sanguíneos. Alternativamente, pueden obtenerse del peritoneo. Los métodos de aislamiento, cultivo, diferenciación y polarización/activación de macrófagos son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, han sido descritos en detalle por Murray et al., (Immunity, 2014, 41(1): 14-20).
En esta realización práctica de la invención se obtuvieron macrófagos derivados de médula ósea de ratón BALB/c o C57Bl/6, sin embargo, macrófagos derivados de monocitos de sangre canina o líneas celulares de macrófagos disponibles comercialmente (células de ratón de linaje monocito-macrófago: RAW 264.7, J744, humanas: THP-1, U937, o línea celular canina DH82).
En breve, dichos macrófagos derivados de la médula ósea se siembran en placas Petri de plástico en 5 mL de medio (3 mL de células por placa): DMEM:F12 glutamina/glutamax FBS al 10% Penicilina/Estreptomicina y 20% de medio condicionado L929 o M-CSF (50 ng/ml). En los cinco días siguientes el medio se suplementa en factor de crecimiento y uno de los compuestos activadores o sus combinaciones como un cóctel de citocinas. Alternativamente, los macrófagos se han cultivado en "Medio de Generación de Macrófagos M1/M2" (Promocell) o en un medio equivalente disponible comercialmente o de fabricación propia que contenga todas las citocinas e interleuquinas necesarias para considerarlos activados.
Para obtener macrófagos a partir de monocitos sanguíneos, se centrifuga sangre fresca (de no más de 12 horas) utilizando el sistema Histopaque 1077 o equivalente y glóbulos blancos (o alternativamente, sólo glóbulos blancos recogidos del banco de sangre) en una cantidad adecuada de medio de fijación de monocitos precalentado (o equivalente, por ejemplo, DMEM/RPMI suplementado con M-CSF), por ejemplo 15 mL de medio por matraz T-75. La densidad de siembra debe ser de 1-2 millones/cm2 para células mononucleares con un contenido de monocitos > 25 % y de 1.5-3 millones/cm2 para un contenido de monocitos < 25 %. A continuación, las células se incuban durante 1 -1.5 horas al 5 % de CO2 y 37 °C en la incubadora sin ninguna otra manipulación.
Tras la fijación de las células, se lavan al menos dos veces y, a continuación, se añade a las células una cantidad adecuada de "medio de generación de macrófagos M1- o M2 DXF" completo (por ejemplo, 20 mL por matraz T-75) y se incuban las células durante 6 días a 37 °C y 5%de CO2 sin cambio de medio. Para activar los macrófagos, debe sustituirse todo el medio por medio suplementado con compuesto activador.
Los compuestos activadores utilizados en esta invención (para células derivadas de médula ósea o para activar células de líneas celulares de monocitos-macrófagos) son los siguientes: IL-4 (20 ng/ml), IFN-<y>(al menos 20 ng/ml), LPS (al menos 10 ng/ml), IL-13 (al menos 20 ng/ml), IL-10 (al menos 20 ng/ml), dexametasona (al menos 20 pg/ml) oxLDL (al menos 20 ng/ml), TNF-a (20 ng/ml), TGF-p (20 ng/ml), cortisol (150-300 ng/ml) o sus combinaciones como un cóctel de citocinas. Para obtener macrófagos no activados, no se ha añadido el compuesto activador.
La inversión de la polarización/activación de los macrófagos (de activados clásicamente a activados alternativamente) puede alcanzarse, por ejemplo, mediante el cultivo de macrófagos en las citocinas apropiadas enumeradas anteriormente durante al menos 48 horas.
Ejemplo 2 - Aislamiento de monocitos
Para obtener monocitos en esta realización práctica de la invención se obtuvieron monocitos derivados de médula ósea o derivados de bazo de ratón BALB/c o C57Bl/6, sin embargo, se utilizaron monocitos de sangre canina o líneas celulares de monocitos disponibles comercialmente (células de ratón de linaje monocitomacrófago: RAW 264.7, J744, humanas: THp-1, U937, o línea celular canina DH82).
Para obtener monocitos sanguíneos, se centrifuga sangre fresca (no más de 12 horas) utilizando el sistema Histopaque 1077 o equivalente y se siembran los leucocitos en una cantidad adecuada de medio de fijación de monocitos precalentado (o equivalente, p. ej. DMEM/RPMI suplementado con 20 ng/mL de M-CSF), p. ej. 15 mL de medio por matraz T-75. Como alternativa, pueden utilizarse únicamente glóbulos blancos recogidos del banco de sangre (capa leucocitaria). La densidad de siembra debe ser de 1-2 millones/cm2 para células mononucleares con un contenido de monocitos >25 % y de 1.5-3 millones/cm2 para un contenido de monocitos < 25 %. A continuación, las células se incuban durante 1 - 1.5 horas al 5 % de CO2 y 37 °C en la incubadora sin ninguna otra manipulación. Tras la adhesión de las células, se lavan al menos dos veces, y las células adherentes se consideran monocitos.
Para obtener monocitos derivados de médula ósea, en esta realización práctica de la invención se obtuvieron macrófagos derivados de médula ósea de ratón BALB/c o C57Bl/6. En breve, dichos precursores derivados de médula ósea se siembran en placa Petri de plástico en 5 mL de medio (3 mL de células por placa): DMEM:F12 glutamina/glutamax FBS al 10 % penicilina/estreptomicina y 20 % de medio condicionado L929 o 20 ng/mL de M-CSF. Dos días después se añaden 5 mL de medio estándar. Después de dos días, se añaden 0.5 ml/placa de medio condicionado L929. Las células adherentes se consideran monocitos.
Para obtener monocitos derivados del bazo, en esta realización práctica de la invención, el bazo se disoció mecánicamente para obtener una suspensión de células individuales y se pasó por el colador celular de 70 pm. Las células se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. Tras la lisis eritrocitaria, los monocitos se aislaron mediante purificación con perlas magnéticas, por ejemplo, protocolo del kit de enriquecimiento de monocitos de ratón EasySep y un imán apropiado.
Para obtener mejores efectos de sus cargas proteicas y migración antes de su uso pueden ser pretratados con estímulos de activación de macrófagos: IL-4 (20 ng/ml), IFN-<y>(al menos 20 ng/ml), LPS (al menos 10 ng/ml), IL-13 (al menos 20 ng/ml), IL-10 (al menos 20 ng/ml), dexametasona (al menos 20 pg/ml), oxLDL (al menos 20 ng/ml), TNF-a (20 ng/ml), TGF-p (20 ng/ml), cortisol (150-300 ng/ml) o sus combinaciones como un cóctel de citocinas.
Ejemplo 3 - Aislamiento de granulocitos
Para obtener células granulocíticas de la sangre, 9 partes de sangre fueron diluidas con 1 parte de tampón ACD (que contenía d-glucosa 0.17 M, ácido cítrico 0.10 M, citrato trisódico 0.11 M). La sangre de este etapa se diluyó de nuevo con PBS en la proporción 1:1 y se centrifugó. Tras eliminar el plasma y la capa leucocitaria, las células restantes se mezclaron con PBS hasta alcanzar el 80 % del volumen original de la primera etapa (ACD-sangre) y, a continuación, se diluyeron con agua destilada fría en una proporción de 4:12. Luego, se añadieron 6 partes de solución de NaCl al 2.7 % y se centrifugaron. Tras eliminar el sobrenadante, las células se resuspendieron en medio RPMI-1640. Estas células se consideraron granulocitos.
Ejemplo 4 - Aislamiento de linfocitos
Para obtener linfocitos derivados del bazo, en esta realización práctica de la invención, el bazo se ha disociado mecánicamente para obtener una suspensión de células individuales y se ha pasado por el colador celular de 70 pm. Las células se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. Tras la lisis eritrocitaria, los linfocitos se aislaron mediante purificación con perlas magnéticas, por ejemplo, protocolo del kit de enriquecimiento de CD4+ de ratón EasySep y un imán apropiado.
Ejemplo 5 - Preparación de complejos de ferritina
Para incorporar ferritinas con el fármaco anticanceroso (por ejemplo, fármacos clásicos como ciclofosfamida, clorambucilo, melfalán, bendamustina, banoxantrona o profármaco activado por hipoxia como TH-302) las ferritinas deben prepararse antes del tratamiento con macrófagos. En breve, las proteínas recombinantes de ratón de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 (Fig. 1) se obtienen como sigue. El vector de expresión pET-22b que contiene un gen sintético que codifica la proteína ferritina de la SEQ ID NO: 4 se transformó enE. coliBL21 (DE3). El cultivo deE. colise cultivó a 37 °C hasta una DO600 de 0.6 en 1 L de caldo Luria-Bertani (LB) adicionado con ampicilina (100 mg/L). La expresión de la proteína se indujo añadiendo 1 mM de isopropil tiob-D-galactósido (IPTG) y el cultivo se incubó durante toda la noche. Las células se recolectaron por centrifugación (15000 g durante 15 min) y se suspendió en Hepes 20 mM (pH 7.5), NaCl 150 mM, 0.1 mg/mL de DNasa, MgCh 10 mM y se disolvió por sonicación. El lisado se centrifugó a 15000 g durante 30 min y el sobrenadante se trató 10 min a 50 °C, se centrifugó para eliminar las proteínas desnaturalizadas y después a 70 °C durante 10 min y se centrifugó de nuevo. El sobrenadante se añadió con (NH)4SO4 al 30 % a 4 °C agitando durante 1h y se centrifugó a 15000 g durante 30 min. El sobrenadante se añadió con (NH)4SO4 a 4 °C agitando durante 1 h y se centrifugó a 15000 g durante 30 min. El precipitado se resuspendió en Hepes 20 mM (pH 7.5), NaCl 150 mM y se dializó durante la noche a 4 °C con el mismo tampón. La proteína se cargó en una columna de filtración en gel HILOAD 26/600 SUPERDEX 200 (GE-Healthcare) y después se filtró en forma estéril y se almacenó a 4 °C (Fig. 9). La concentración de proteína se determinó espectrofotométricamente a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción molar de 21000 M'1 irr1 y mediante el ensayo de Bradford midiendo la absorbancia a 595 nm.
Dichas ferritinas incluyen homopolímeros H y/o L de proteínas de ferritina de mamífero recombinantes.
Las ferritinas, obtenidas como se ha descrito anteriormente, se purifican mediante métodos estándar para obtener un producto de grado preclínico libre de endotoxinas (véase, por ejemplo: Ceci et al., 2011, Extremophiles 15(3):431-439; Vanucci et al., 2012, Int J Nanomed 7:1489-1509). En breve, la ferritina conservada estérilmente en una solución de almacenamiento que contiene Hepes 20 mM pH 7.5 se diluye a una concentración final de 4 pM en 24-mer en solución ácida (pH final < 3.0) o, alternativamente, a valores de pH altamente básicos (pH > 9.5) (véase, por ejemplo, Pontillo et al., 2016), permitiendo así la disociación del multímero. Los fármacos se disuelven a concentraciones muy elevadas en el disolvente adecuado y, a continuación, se añade un pequeño volumen a la solución de ferritina con un exceso molar de 200. A continuación, el pH se lleva a la neutralidad mediante la adición de cantidades apropiadas de soluciones de NaOH/HCl para permitir la reconstitución del multímero. Los métodos experimentales actuales indican que tres/cuatro lavados utilizando PBS (etapas de concentración) en concentradores de corte de 100 kDa permiten la eliminación rápida y completa tanto de los co-solventes como de los fármacos no encapsulados y la recuperación completa de las nanojaulas de ferritina cargadas de fármaco. El complejo ferritina-fármaco así obtenido se congeló en nitrógeno líquido y se liofilizó.
Dependiendo de la elección del codisolvente y de las propiedades químicas intrínsecas de la molécula de fármaco, se puede estimar que hasta 150-180 moléculas de fármaco pueden ser atrapadas/adsorbidas dentro de la jaula de ferritina de 24-mer.
Los fármacos también pueden acoplarse covalentemente a las cadenas laterales de aminoácidos de la ferritina (lisinas o cisteínas) mediante la elección adecuada de fármacos activados por fenilhidrazona, succinimida o maleimida. Por consiguiente, i) el derivado de fenilhidrazona puede romper y liberar el fármaco de la superficie de la ferritina, ii) los derivados unidos a lisina pueden activarse tras la degradación completa de la proteína en aminoácidos o iii) el derivado unido a cisteína puede liberarse dentro de la célula mediante hidrólisis reductora del enlace tioéter maleimida.
Ejemplo 6 - Preparación del complejo hemoglobina-compuesto
La hemoglobina humana se prepara a partir de glóbulos rojos frescos como se describe en Rossi-Fanelli et al. (Archives of biochemistry and biophysics 77:478-492, 1958). En breve, la sangre heparinizada, obtenida de donantes sanos, se centrifugó a 1600 rpm durante 30 minutos (4 °C) para sedimentar los glóbulos rojos. La capa leucocitaria se eliminó con precisión mediante aspiración con aguja en la superficie del precipitado. El sobrenadante de plasma se desechó y el precipitado de RBC se lavó tres veces resuspendiendo los RBC en solución salina isotónica al 0.9 % y centrifugando a 1600 rpm durante 30 minutos a 4 °C. Tras el último lavado con solución salina y la última etapa de centrifugación, el precipitado de RBC se resuspendió en agua destilada tamponada a pH 7.2 con tampón de fosfato de potasio 5 mM (PB, pH = 7.2) y se dejó lisar a 4 °C durante toda la noche con agitación suave. El lisado de RBC dializado se centrifugó posteriormente a 13.000 rpm durante 30 minutos a 4 °C y el sobrenadante se cargó directamente en un sistema ÁKTA Explorer equipado con una columna XK 26/40 empacada con resina Q-sefarosa XL (GE Healthcare) a temperatura ambiente. Las columnas se equilibraron con tampón A (Tris-HCl 20 mM, pH = 8.2) a un caudal de 12 mL/min y se lavaron tres veces con el mismo tampón. Se generó un gradiente lineal de elución cambiando del 100 % de tampón A al 75 % de tampón B (Tris-Cl 20mM, más NaCl 0.2 M pH 8.20) seguido de un gradiente escalonado del 100 % de tampón B. Tras la elución, se utilizó un colector de fracciones para recoger las fracciones de proteínas. Las proteínas así obtenidas se analizaron por SDS PAGE y se almacenaron congeladas a -80 °C.
La hemoglobina humana (SEQ ID NO: 18 o 22, véase la Fig. 1) puede unirse covalentemente con facilidad a conjugados farmacológicos apropiados, albergar moléculas farmacológicas hidrofóbicas dentro del bolsillo de unión al hemo o incluso transportar pequeñas moléculas citotóxicas unidas al hierro hemo. La Hb puede modificarse fácilmente mediante la unión selectiva del conjugado farmacológico apropiado al residuo de cisteína en la posición 93 de las cadenas beta, la única cisteína titulable en la superficie de la proteína. Los fármacos con la función maleimida, como el inhibidor de la tubulina monometil auristatina (MMAE) o el análogo de la mertansina con la función succinimida (DM1-SMCC) son los ejemplos más notables de citotóxicos extremadamente potentes que pueden unirse fácil y específicamente al residuo cys beta93 relevante (para los fármacos con la función maleimida) o a uno o más residuos de lisina (fármaco con la función succinimida), respectivamente. Estos fármacos se han conjugado convenientemente con la hemoglobina humana de acuerdo con los siguientes procedimientos:
El análogo de la auristatina E, maleimidacaproil-valina-citrulina-p-aminobenzoiloxicarbonil-monometil auristatina E (vcMMAE) se obtuvo de MedChem Express (Princeton, NJ). El aducto de hemoglobina vcMMAE se preparó de la siguiente manera. La solución de hemoglobina humana se ajustó a una concentración de 120 |jM de hemo con tampón de reacción (tampón fosfato 50 mM pH 6,8, que contenía EDTA 0,1 mM) y se conjugó con un exceso molar 10 veces mayor de vcMMAE en presencia de una solución de acetonitrilo al 20 % v/v a 4 °C durante la noche. Los grupos maleimida reaccionan eficaz y específicamente con sulfhidrilos libres (reducidos) a pH 6.5-7.5 para formar enlaces tioéter estables. El exceso de vcMMAE se purificó y se intercambió con tampón D-PBS utilizando el concentrador de ultrafiltración PM 100. El rendimiento de la conjugación fue de aproximadamente del 80% del total de cisteínas. La formación del conjugado vcMMAE se confirmó por análisis de LC-MS y por valoración del grupo tiol libre residual con p-cloromercuribenzoato. Las concentraciones de conjugados Hb-vcMMAE se determinaron mediante análisis de espectroscopia UV-vis.
El análogo de mertansina DM1 SMCC (Alb Technology Ltd, Hederson, NV, EE.UU.), con función para unión covalente de lisina, se preparó como sigue. La solución de hemoglobina humana se ajustó a una concentración de 400 jM de hemo con tampón de reacción (tampón fosfato 0.1 mM pH 7.4, que contenía EDTA 0.5 mM) y se conjugó con un exceso molar 20 veces mayor de DM1-SMCC en presencia de una solución de DMSO al 10% v/v a 4 °C durante 16 horas. El éster succinimidílico reactivo con aminas se acopla a aminas, produciendo así un aducto covalente con grupos de lisina en la superficie de la proteína. El exceso de DM1-SMCC se eliminó y se intercambió con tampón D-PBS utilizando el concentrador de ultrafiltración PM 100. El rendimiento de la conjugación fue de aproximadamente 2.4 moléculas de mertansina por tetrámero de hemoglobina. La formación del conjugado DM1-SMCC se confirmó mediante análisis de LC-MS. Las concentraciones de los conjugados Hb-DM1-SMCC se determinaron mediante análisis de espectroscopia UV-vis.
Ejemplo 7 - Preparación del complejo transferrina-compuesto
El suero se obtuvo de un donante sano y el exceso de hierro se añadió en presencia de iones citrato como quelante y bicarbonato, que facilita la unión del hierro a la transferrina. La mezcla de reacción contenía 6.5 mg de bicarbonato sódico y 153.16 de citrato férrico en pH = 8, 4 °C, 1 h por 100 mL de suero. Posteriormente, la albúmina se precipitó con Rivanol (4 %) añadiendo la solución alcohólica a la muestra de suero en una proporción de 3.5 V/V a 4 °C, y pH = 9.4 durante 2 h. A continuación, la solución se centrifugó a 3000 rpm durante 20 min y finalmente se filtró con un filtro de jeringa de 0.8 mm. El exceso de Rivanol se eliminó posteriormente por filtración en gel en una columna Sephadex G-25 en sulfato de amonio 0.025 M. A continuación, se llevó a cabo una primera precipitación con sulfato de amonio saturado al 50 % a pH = 6.5, seguida de centrifugación a 3000 rpm durante 10 min (eliminación de inmunoglobulinas). A continuación, se llevó a cabo una segunda precipitación con sulfato de amonio saturado al 80 %, lo que permitió recuperar la transferrina del precipitado. A continuación, el precipitado sólido se disolvió en una solución tampón de Tris HCl 0.06 M, pH = 8, que contenía NaCl 1 M. La solución se dializó en el mismo tampón para permitir la eliminación completa del sulfato de amonio. A continuación, la solución proteica se concentró con un concentrador centrífugo centricon PM50 hasta 10-15 mg/mL (de acuerdo con la estimación del método de Bradford) y se cargó en una columna de filtración en gel Sephadex G-100 (2.4 x 80 cm) equilibrada en NaCl 1M, con un caudal de 15 mL/hora. Se estimó que la transferrina así obtenida tenía una pureza del 88-90 % por SDS PAGE. A continuación, se utilizó cromatografía de intercambio iónico por intercambiador de aniones DEAE Sephadex A-50 como etapa final de pulido. La muestra de transferrina se cargó en la columna equilibrada con Tris HCl 0.06 M a pH = 8 y se eluyó mediante un gradiente de concentración lineal con tampón de elución, Tris HCl 0.3 M, pH = 8. La pureza de la proteína fue superior al 98% con un rendimiento de aproximadamente 150 mg por 100 mL de suero.
La Holo-transferrina humana, (SEQ ID NO: 28, Fig. 1) de manera similar a la hemoglobina puede ser fácilmente unida covalentemente a conjugados de fármacos apropiados, aunque sólo hay disponibilidad para modificaciones de lisina, debido a la ausencia de grupos de cisteína libremente titulables. Por lo tanto, el análogo de mertansina con función succinimida (DM1-SMCC) se ha utilizado para unirse covalentemente a uno o más residuos de lisina (fármaco con función de succinimida). El fármaco se ha conjugado convenientemente con la transferrina de acuerdo con el siguiente procedimiento:
El análogo de la mertansina DM1 SMCC (Alb Technology Ltd, Hederson, NV, EE.UU.), con función para la unión covalente de lisina, se preparó como sigue. La solución de transferrina se ajustó a una concentración de 100 |jM de hemo con tampón de reacción (tampón fosfato 0.1 mM pH 7.4, sin EDTA en este caso debido a posibles efectos de quelación del hierro) y se conjugó con un exceso molar 20 veces mayor de DM1-SMCC en presencia de una solución de DMSO al 8 % v/v a 4 °C durante 16 horas. El éster succinimidílico reactivo a aminas se acopla a aminas, produciendo así un aducto covalente con grupos de lisina en la superficie de la proteína. El exceso de DM1-SMCC se eliminó y se intercambió con tampón D-PBS utilizando un concentrador de ultrafiltración PM 100. El rendimiento de la conjugación fue de aproximadamente 1.5 moléculas de mertansina por dímero de transferencia. La formación del conjugado DM1-SMCC se confirmó mediante análisis de LC-MS. Las concentraciones de los conjugados transferrina-DM1-SMCC se determinaron mediante análisis de espectroscopia UV-vis.
Ejemplo 8 - Obtención de células cargadas de ferritina
Las células obtenidas se incuban en la solución de ferritina durante un tiempo y a la concentración suficiente para garantizar la proporción adecuada de ferritina/célula para su carga completa y también para garantizar el contenido de fármaco adecuado para obtener el efecto terapéutico). El tiempo y la concentración pueden variar en función del número de moléculas encapsuladas/adsorbidas en la jaula de ferritina, el estado de activación celular, la condición y el número de su administración prevista.
Por ejemplo, para garantizar una carga adecuada con ferritinas, las células se incuban durante 1-4 horas en solución de ferritina 0.2 mg/mL en condiciones de cultivo estándar. El marco de concentración de ferritina puede variar al menos entre 0.01 y 4 mg/mL, así como el tiempo de incubación (5 min - 6 horas o más). Ajustando el tiempo y la concentración de la carga de ferritina a las células, debe tenerse en cuenta la influencia de la ferritina y de las condiciones de tratamiento sobre la viabilidad celular. Las células obtenidas como se ha indicado anteriormente absorben muy fácilmente las ferritinas en un tiempo relativamente corto (en minutos; Fig. 8). Una vez que absorben las ferritinas, no las liberan al medio de cultivo (Fig. 9).
No obstante, el experto en la materia puede reajustar las condiciones anteriores y optimizar el protocolo para sus propios fines en su propio laboratorio.
Ejemplo 9 - Obtención de células cargadas de hemoglobina
Las células obtenidas se incuban en la solución de hemoglobina durante un tiempo y a la concentración suficientes para garantizar la proporción adecuada de hemoglobina/célula para su carga completa y también para garantizar el contenido de fármaco adecuado para obtener el efecto terapéutico). El tiempo y la concentración pueden variar en función del número de moléculas unidas a la molécula de hemoglobina, el estado de activación celular, la condición y el número de su administración prevista.
Por ejemplo, para garantizar una carga adecuada con hemoglobinas, las células se incuban durante 1-4 horas en solución de hemoglobina 0.1 mg/mL en condiciones de cultivo estándar. El marco de concentración de hemoglobina puede variar al menos entre 0.01 y 0.2 mg/mL, así como el tiempo de incubación (5 min - 4 horas o más). Ajustando el tiempo y la concentración de la carga de hemoglobina a las células, debe tenerse en cuenta la influencia de la ferritina y las condiciones de tratamiento sobre la viabilidad celular. Las células obtenidas como se ha indicado anteriormente captan muy fácilmente las hemoglobinas en un tiempo relativamente corto (en minutos; Fig. 8).
No obstante, el experto en la materia puede reajustar las condiciones anteriores y optimizar el protocolo para sus propios fines en su propio laboratorio.
Ejemplo 10 - Obtención de células cargadas con transferrina
Las células obtenidas se incuban en la solución de transferrina durante un tiempo y a la concentración suficientes para garantizar la proporción adecuada de transferrina/célula para su carga completa y también para garantizar el contenido de fármaco adecuado para obtener el efecto terapéutico). El tiempo y la concentración pueden variar en función del número de moléculas unidas a la molécula de transferrina, del estado de activación celular, de la condición y del número de su administración prevista.
Por ejemplo, para garantizar una carga adecuada con transferrinas, las células se incuban durante 1-4 horas en solución de transferrina 0.1 mg/mL en condiciones de cultivo estándar. El marco de concentración de transferrina puede variar al menos entre 0.01 y 0.2 mg/mL, así como el tiempo de incubación (5 min - 4 horas o más). Ajustando el tiempo y la concentración de la carga de transferrina a las células, debe tenerse en cuenta la influencia de la transferrina y las condiciones de tratamiento sobre la viabilidad celular. Las células obtenidas como se ha indicado anteriormente captan muy fácilmente la transferrina en un tiempo relativamente corto (en minutos; Fig. 8).
No obstante, el experto en la materia puede reajustar las condiciones anteriores y optimizar el protocolo para sus propios fines en su propio laboratorio.
Ejemplo 11 - Complejo de ferritina/hemoglobina/transferrina-macrófago como herramienta útil de administración a células cancerosas
Los macrófagos del Ejemplo 1 preparados como se describe en los Ejemplos 8, 9 y 10, transportan muy fácilmente ferritinas, hemoglobinas, transferrinas a las células cancerosas: cáncer mamario de ratón, cáncer de colon, cáncer mamario canino, cáncer de mama humano, pancreático y de vejiga (Figs. 4, 10). Además, esta transferencia es mucho más específica para las células cancerosas que para las no cancerosas (Fig. 11). Sin embargo, en el caso de las células cancerosas la proporción de ambos tipos celulares es crucial. Cuantos más macrófagos haya, mejor y más rápido será el transporte. La transferencia más eficaz a las células cancerosas se observó cuando la proporción entre macrófagos y células cancerosas era de 1:1 o superior. Esta transferencia se produjo no sólo cuando los portadores de proteínas se conjugaron con una etiqueta fluorescente (por ejemplo, FITC o Alexa610), sino también cuando se conjugaron/encapsularon con otros compuestos, por ejemplo, fármacos contra el cáncer (la Fig. 12 muestra esta transferencia de ferritina encapsulada con profármaco fluorescente activado por hipoxia - banoxantrona). Esta transferencia de compuestos conjugados con fármacos anticancerígenos tuvo el efecto de inducir la apoptosis en células cancerígenas (Fig. 6, 13).
Ejemplo 12 - Complejo ferritina/hemoglobina/transferrina-monocito como herramienta útil de administración a células cancerosas
Los monocitos del Ejemplo 2 preparados como se describe en los Ejemplos 8, 9 y 10, transportan muy fácilmente ferritinas, hemoglobinas, transferrinas a las células cancerosas (Fig. 14). Sin embargo, la proporción de ambos tipos de células es crucial. Cuantos más monocitos haya, mejor y más rápido será el transporte. La transferencia más eficaz a las células cancerosas se observó cuando la proporción entre monocitos y células cancerosas era de 1:1 o superior.
Ejemplo 13 - Complejo ferritina/hemoglobina/transferrina-granulocitos como herramienta útil de administración a células cancerosas
Los granulocitos del Ejemplo 3 preparados como se describe en los Ejemplos 8, 9 y 10, transportan muy fácilmente ferritinas, hemoglobinas, transferrinas a las células cancerosas (Fig. 15). Sin embargo, la proporción de ambos tipos de células es crucial. Cuantos más granulocitos, mejor y más rápido es el transporte. La transferencia más eficaz a las células cancerosas se observó cuando la proporción entre granulocitos y células cancerosas era de 1:1 o superior.
Ejemplo 14 - Complejo ferritina/hemoglobina/transferrina-linfocitos como herramienta útil de administración a células cancerosas
Los linfocitos del Ejemplo 4 preparados como se describe en los Ejemplos 8, 9 y 10, transportan muy fácilmente ferritinas, hemoglobinas, transferrinas a las células cancerosas (Fig. 16). Sin embargo, la proporción de ambos tipos de células es crucial. Cuantos más linfocitos, mejor y más rápido es el transporte. La transferencia más eficaz a las células cancerosas se observó cuando la proporción entre linfocitos y células cancerosas era de 1:1 o superior.
Ejemplo 15 - Complejo portador leucocito-proteína como agente útil de administración dirigida de fármacos en regiones hipóxicas
Los macrófagos preparados como arriba se inyectan en la vena de la cola del animal con el tumor (el número apropiado de macrófagos debe ajustarse al tamaño del tumor, etapa de desarrollo y presencia de metástasis). Como se muestra en las Figs. 2 y 17, alcanzan específicamente el tumor (después de unas pocas horas) y también se dispersan en otros órganos de todo el animal (Fig. 18). Además, como se muestra en la Fig. 19, en el modelo hipóxico también son capaces de migrar a los sitios avasculares e hipóxicos y transferir proteínas portadoras a las células cancerosas (Figs. 3 y 20).
Para la obtención de imágenes, se inyectaron 1-50 millones de macrófagos en la vena caudal de un animal portador de un tumor de cáncer de mama o de colon. Antes, los macrófagos se marcaron previamente con Cell Tracker y se cargaron con ferritina-FITC (como se muestra en el Ejemplo 8). Utilizando dos fotones de la masa tumoral 8 horas después de la administración de macrófagos se detectó la presencia de macrófagos portadores de ferritina-FITC (Fig. 17). Su direccionamiento específico al tumor, pero también su migración a otros órganos, se demostró utilizando imágenes de todo el cuerpo animal (IVIS) tras el preetiquetado de los macrófagos utilizando el colorante citoplasmático DIR (Fig. 18).
Los 1-10 millones de macrófagos cargados con ciclofosfamida encapsulada con ferritina, melfalán y clorambucilo encapsulado con ferritina se inyectaron i.v. en los ratones portadores de tumores (300000 - 500 000 de células EMT6 inyectadas en el flanco de la piel). Realizamos 3 inyecciones de macrófagos cada tercer día (los días 5, 8 y 11 tras la inyección de células cancerosas o los días 7, 10 y 13 tras la inyección de células cancerosas) o cinco inyecciones consecutivas cada día y observamos un aumento de la supervivencia de los ratones (Fig. 5).
Ejemplo 16 - Complejo portador leucocito-proteína o leucocito marcado como herramienta de imagen útil
El direccionamiento del sistema de suministro dirigido descrito en la presente invención se puede seguir acoplando la ferritina a un agente de contraste. Como se presenta en la Fig. 21, después de la inyección de 1 50 mL de macrófagos cargados con ferritina acoplada como se describe en el Ejemplo 8 con un agente de contraste (en este caso: ferrihidrita, sin embargo, se obtienen los mismos resultados con isótopo, por ejemplo, 123I) o marcado con isótopo (en este caso 18F-FDG) (Fig. 21) se pueden detectar fácilmente por IRM, PET o SPECT. En este ejemplo (Fig. 7), se tomaron imágenes de ratones portadores de tumores mamarios mediante IRM a las 3, 22 y 24 horas después de la inyección i.v. de macrófagos cargados con ferritina Fh. El ratón fue tratado (en el punto de tiempo 0 h) con macrófagos. A continuación, se observó un aumento del diámetro de los vasos sanguíneos (flecha) llenos de macrófagos inyectados (con una reducción significativa de la señal T2) y, posteriormente, los macrófagos se extendieron por el tejido (patrón en forma de mancha; flechas). Estos cambios (en los mismos puntos temporales) se observaron en todos los ratones examinados.
Los macrófagos también se marcaron con 18F-FDG (5-50 mln) y se obtuvieron imágenes mediante PET 1 h después de la administración i.v. a los ratones portadores de tumores. Estos ratones fueron inoculados con la línea celular metastásica 4T1, 3 semanas antes del experimento y se confirmaron histopatológicamente las metástasis en pulmones, hígado y bazo. En la Fig. 21 se observa que los macrófagos migraron a las regiones con tumores metastásicos permitiendo su visualización en PET.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema aislado de administración dirigida que comprende una célula leucocitaria CD45+ que contiene dentro de dicha célula un complejo de una o más proteínas fijadoras de hierro y un fármaco seleccionado del grupo formado por un fármaco anticanceroso, un fármaco antiarteriosclerótico, un fármaco antiinflamatorio, un ácido nucleico, un compuesto fotosensibilizante, un virus y un isótopo radiactivo farmacéuticamente activo; en el que en el complejo
(i) la proteína fijadora de hierro y el fármaco están unidos de forma covalente y/o no covalente, o
(ii) el fármaco es atrapado/encapsulado por la proteína fijadora de hierro o sus multímeros en ausencia de un enlace covalente o no covalente.
2. El sistema aislado de administración dirigida de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la célula leucocitaria es producible a partir de una célula precursora hematopoyética CD34+.
3. El sistema aislado de administración dirigida de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el leucocito se selecciona del grupo que consiste en un monocito, un monocito diferenciado que preferiblemente es un macrófago, un linfocito y un granulocito.
4. El sistema aislado de administración dirigida de acuerdo con la reivindicación 3, en el que
(i) el monocito es un monocito CD11b+, seleccionado preferiblemente del grupo formado por un monocito CD11b+ CD14+, un monocito CD11b+ CD16+, un monocito CD11b+ CD14+ CD16+, un monocito CD11b+ CD14+ MHCII+, un monocito CD11b+ CD14+ CD115+, un monocito CD11b+ CD114+, un monocito CD11b+ CD116+, un monocito CD11b+ CCR1+, un monocito CD11b+ CCR2+, un monocito CD11b+ CX3CR+, un monocito CD11b+ CXR4+, un monocito CD11b+ CXR6+ y un monocito CD11b+ CD14+ CD33+;
(ii) el monocito diferenciado se selecciona del grupo que consiste en un macrófago, un macrófago activado, preferiblemente un macrófago CD11b+, más preferiblemente un macrófago CD11b+ CD16+, macrófago CD11b+ CD32+, macrófago CD11b+ CD64+, macrófago CD11b+ CD68+, preferiblemente un macrófago M1 CD11b+ CD86+, preferiblemente productor de iNOS y/o secretor de interleucina 12 (IL-12) o preferiblemente un macrófago M2 CD11b+ CCR2+, macrófago M2 CD11b+ CD204+, macrófago M2 CD11b+ CD206+, macrófago M2 CD11b+ CD204+ CD206+, macrófago M2 CD11b+ del complejo principal de histocompatibilidad II+ (MHCII+) (baja o alta expresión), macrófago M2 CD11b+ CD200R+, macrófago M2, CD11b+ CD163+ o macrófago activado productor de arginasa 1 y/o secretor de interleucina 10 (IL-10); o una célula dendrítica, preferiblemente con expresión de CD11b+ CD11c+, CD11b+ CD80+, CD11c+ CD80+, CD11c+ CD86+, CD11c+ MHCII+ y CD11c+ CD123+, preferiblemente, el monocito diferenciado no es una célula espumosa Lox1+, CXCR7+ y NRF2+; (iii) monocitos o monocitos activados que expresan al menos un receptor de quimiocinas, preferiblemente seleccionado del grupo formado por<c>CR1, CCR2+, CXR4+, y CXR6+, o al menos un receptor de factor de crecimiento, preferiblemente seleccionado del grupo formado por el receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos (CD 115), el receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos (CD114), y el receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (formado por CD116 y CD131); los monocitos de estas características son especialmente adecuados para tratar afecciones inflamatorias y cáncer;
(iv) el linfocito se selecciona del grupo formado por un linfocito T CD3+ y CD4+ o CD8+, o un linfocito B CD19+, CD20+, CD21+, CD19+ CD20+, CD19+ CD21+, CD20+ CD21+, o CD19+ CD20+ CD21+; o
(v) el granulocito se selecciona del grupo formado por un neutrófilo, preferiblemente un neutrófilo CD66b+, un eosinófilo y un basófilo, preferiblemente un eosinófilo CD193+.
5. El sistema aislado de administración dirigida de la reivindicación 4, en el que:
(a) el macrófago activado
(i) es producible por incubaciónin vitrode un monocito o macrófago con al menos un inductor M1;
(ii) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los antígenos siguientes: CD64+, CD86+, CD16+, CD32+, alta expresión de MHCII, y/o secreción de iNOS y/o IL-12;
(iii) es producible por incubaciónin vitrode un monocito o macrófago con al menos un inductor M2;
(iv) es producible por incubaciónin vitrode un monocito o macrófago con un factor capaz de alterar los marcadores de expresión en los macrófagos;
(v) es producible por incubaciónin vitrode un monocito o macrófago con un factor capaz de inducir la capacidad de fagocitosis del macrófago;
(vi) es producible por incubaciónin vitrode un monocito o macrófago con un factor capaz de alterar la capacidad de los macrófagos para secretar citocinas, preferiblemente IL-10 e IL-12, quimiocinas y/o para producir iNOS, arginasa u otras enzimas inmunomoduladoras;
(vi) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los antígenos siguientes: CD204+, CD206+, CD200R+; CCR2+, baja expresión de MHCII, TfR+, CXCR4+, CD163, y/o TIM-2+;
(vii) tiene la capacidad de fagocitar; y/o
(viii) es capaz de secretar citocinas, preferiblemente IL-12, o IL-10, o producir iNOS (u otros compuestos proinflamatorios), arginasa u otros compuestos inmunosupresores/antiinflamatorios;
(b) el monocito
(i) es producible a partir de una célula precursora hematopoyética CD34+;
(ii) es producible por incubaciónin vitrode monocitos con al menos un inductor, preferiblemente inductor M1 o M2, más preferiblemente al menos un inductor M2;
(iii) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los antígenos siguientes: TfR+, CD163+, TIM-2+, CD14+, CD16+, CD33+, y/o CD115+;
(iv) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los antígenos siguientes: TfR+, CD163+, TIM-2+, CXCR4+, CD14+, y/o CD16+; y/o
(v) tiene la capacidad de fagocitar;
(c) el linfocito
(i) se puede obtener de la sangre, el bazo o la médula ósea o es producible a partir de una célula precursora CD34+;
(ii) es un linfocito inmunológicamente competente;
(iii) expresa receptores de células T específicos de antígenos; y/o
(iv) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los siguientes antígenos: (iva) antígeno CD3+ y CD4+ o CD8+ o (ivb): CD19+, CD20+, CD21+, CD19+ CD20+, CD19+ CD21+, CD20+ CD21+, o CD19+ CD20+ CD21+, y es preferiblemente capaz de producir inmunoglobulinas; y/o
(d) el granulocito
(i) se puede obtener a partir de sangre, bazo o médula ósea o producir a partir de una célula precursora CD34+; (ii) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los siguientes CD66b+ y/o CD193+;
(iii) es un leucocito polimorfonuclear caracterizado por la presencia de gránulos en su citoplasma; y/o (iv) se caracteriza por la expresión de al menos uno de los siguientes: TfR+, CD163+, TIM-2+, y/o CXCR4+.
6. El sistema de administración dirigida de acuerdo con la reivindicación 5, en el que:
(a) para el macrófago activado
(i) el inductor M1 se selecciona del grupo formado por LPS, INF-y, GM-CSF e infección viral y bacteriana; o (ii) el inductor M2 se selecciona del grupo formado por IL-4, IL-10, IL-13, complejo inmunitario de un antígeno y un anticuerpo, IgG, gammaglobulina activada por calor, glucocorticosteroide, TGF-p, IL-1R, CCL-2, IL-6, M-CSF, agonista de PPAR<y>, factor inhibidor de leucocitos, adenosina, infección por helmintos y hongos; y/o
(b) para el monocito
(i) el inductor M1 se selecciona del grupo formado por LPS, INF-<y>, GM-CSF o infección viral o bacteriana; (ii) el inductor M2 se selecciona del grupo que consiste en IL-4, lL-10, IL-13, inmunocomplejo de un antígeno y anticuerpo, IgG, gammaglobulinas activadas por calor, glucocorticosteroides, TGF-p, IL-1R, CCL-2, IL-6, M-CSF, agonista de PPARy, factor inhibidor de leucocitos, medio acondicionado para el cáncer, células cancerosas, adenosina e infección por helmintos u hongos.
7. El sistema aislado de administración dirigida de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la proteína fijadora de hierro se selecciona del grupo que consiste en ferritina, preferiblemente ferritina de tipo pesado (H), ferritina ligera (L) y/o ferritina mitocondrial; hemoglobina, preferiblemente hemoglobina A, hemoglobina AS, hemoglobina SC, hemoglobina C, hemoglobina D, hemoglobina E, hemoglobina F, hemoglobina H; complejo hemoglobina-haptoglobina, hemopexina, transferrina; y lactoferrina.
8. El sistema aislado de administración dirigida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el fármaco es un fármaco anticanceroso, en particular un fármaco citostático, un fármaco citotóxico y profármacos de los mismos; un fármaco anti arteriosclerótico; y un fármaco antiinflamatorio; y un compuesto fotosensibilizante; un virus, en particular un virus oncolítico; y un radioisótopo emisor de radiación a o p, que también emite una cantidad de radiación y que daña las células, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en lutecio-177, iterbio-90, yodo-l3 l, samario-153, fósforo-32 cesio-131, paladio-103, radio-233, yodo-125 y boro-10 o una cantidad de radiación a dañina para las células, preferiblemente seleccionada del grupo formado por actinio-225, bismuto-213, plomo-212 y polonio-212.
9. El sistema aislado de administración dirigida de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el fármaco anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en una proteína inhibidora de la proliferación, un fármaco inductor de la apoptosis, una sustancia alquilante, antimetabolitos, antibióticos, epotilonas, agonistas y antagonistas de receptores nucleares, un antiandrógeno, un antiestrógeno, un compuesto de platino, una hormona, una antihormona, un interferón, un inhibidor de las proteínas quinasas dependientes del ciclo celular (CDK), un inhibidor de las ciclooxigenasas y/o lipoxigenasas, un ácido graso biogénico, un derivado de ácido graso biogénico, incluyendo prostanoides y leucotrienos, un inhibidor de proteínas quinasas, un inhibidor de proteínas fosfatasas, un inhibidor de lípido quinasas, un complejo de coordinación de platino, una etilenimina, una metilmelamina, una triazina, un alcaloide de la vinca, un análogo de pirimidina, un análogo de purina, un alquilsulfonato, un análogo del ácido fólico, una antracendiona, una urea sustituida y un derivado de la metilhidrazina, un antibiótico ene-diina, un maitansinoide, un derivado de la auristatina, un inhibidor del punto de control inmunitario y un inhibidor de la proteína o marcador específico del tumor, preferiblemente un inhibidor de la disociación Rho-GDP, más preferiblemente Grp94.
10. El sistema aislado de administración dirigida de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el fármaco anticanceroso es una acediasulfona, aclarrubicina, ambazona, aminoglutetimida, L-asparaginasa, azatioprina, banoxantrona, bendamustina, bleomicina, busulfano, folinato cálcico, carboplatino, carpecitabina, carmustina, celecoxib, clorambucilo, cis-platino, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina dapsona, daunorrubicina, dibromopropamidina, dietilestilbestrol, docetaxel, doxorrubicina, enediinas, epirrubicina, epotilona B, epotilona D, fosfato de estramucina, estrógeno, etinilestradiol, etopósido, flavopiridol, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, fluoximesterona, flutamida fosfestrol, furazolidona, gemcitabina, análogo de la hormona liberadora de gonadotropina, hexametilmelamina, hidroxicarbamida, hidroximetilnitrofurantoína, hidroxiprogesteronacaproato, hidroxiurea, idarrubicina, idoxuridina, ifosfamida, interferón a, irinotecano, leuprolida, lomustina, lurtotecano, mafenida sulfato olamida, mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, megastrolacetato, melfalán, mepacrina, mercaptopurina, metotrexato, metronidazol, mitomicina C, mitopodozida, mitotano, mitoxantrona, mitramicina, ácido nalidíxico, nifuratel, nifuroxazida, nifuralazina, nifurtimox, nimustina, ninorazol, nitrofurantoína, mostazas nitrogenadas, oleomucina, ácido oxolínico, pentamidina, pentostatina, fenazopiridina, ftalilsulfatiazol, pipobromano, prednimustina, prednisona, preussina, procarbazina, pirimetamina, raltitrexed, rapamicina, rofecoxib, rosiglitazona, salazosulfapiridina, cloruro de scriflavinio, semustina, estreptozocina, sulfacarbamida, sulfacetamida, sulfaclopiridazina, sulfadiazina, sulfadicramida, sulfadimetoxina, sulfaetidol, sulfafurazol, sulfaguanidina, sulfaguanol, sulfametozol, sulfametoxazol, cotrimoxazol, sulfametoxidiazina, sulfametoxipiridazina, sulfamoxol, sulfanilamida, sulfaperina, sulfafenazol, sulfatiazol, sulfisomidina, estaurosporina, tamoxifeno, taxol, tenipósido, tertiposido, testolactona, testosterona propionato, tioguanina, tiotepa, tinidazol, topotecano, triaziquona, treosulfano, trimetoprim, trofosfamida, UCN-01, vinblastina, vincristina, vindesina, vinblastina, vinorelbina y zorubicina, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en auristatina, banoxantrona, bendamustina, clorambucilo, caliceamicina, ciclofosfamida dinemicina A, maitansina, melfalán, mertansina y neocazinostatina.
11. El sistema aislado de administración dirigida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el fármaco es un profármaco activado por hipoxia, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en N-óxidos de benzotriazina, apaziquona (Eo 9), tirapazamina (TPN), SN30000, PR-104A, TH-302, TH-4000, AQ4N.
12. Método de preparación del sistema aislado de administración dirigida de las reivindicaciones 1 a 11 que comprende las etapas de
a) proporcionar proteína fijadora de hierro purificada;
b) la unión covalente o no covalente de un fármaco y/o la encapsulación de un fármaco en una proteína fijadora de hierro;
c) proporcionar una célula leucocitaria CD45+; y
d) incubar la célula leucocitaria CD45+ en presencia de la proteína fijadora de hierro producida en la etapa b) hasta que la célula leucocitaria CD45+ esté cargada, al menos parcialmente, con la proteína fijadora de hierro producida en la etapa b).
13. El sistema aislado de administración dirigida de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso como medicamento.
14. El sistema aislado de administración dirigida de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en la prevención/tratamiento de tumores, preferiblemente un tumor sólido, preferiblemente cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de colon, o un tumor que presente áreas hipóxicas, enfermedad inflamatoria o áreas isquémicas en heridas cutáneas o tras infarto de órgano (corazón) o retina isquémica.
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