ES2979247T3 - Un método para ensayar la sensibilidad a los antimicrobianos - Google Patents

Un método para ensayar la sensibilidad a los antimicrobianos Download PDF

Info

Publication number
ES2979247T3
ES2979247T3 ES18780814T ES18780814T ES2979247T3 ES 2979247 T3 ES2979247 T3 ES 2979247T3 ES 18780814 T ES18780814 T ES 18780814T ES 18780814 T ES18780814 T ES 18780814T ES 2979247 T3 ES2979247 T3 ES 2979247T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
microorganism
cells
antimicrobial agent
sample
flow cytometry
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES18780814T
Other languages
English (en)
Inventor
Timothy John Jay Inglis
Kieran Mulroney
Jarrad Hall
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Western Australia
Original Assignee
University of Western Australia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2017901295A external-priority patent/AU2017901295A0/en
Application filed by University of Western Australia filed Critical University of Western Australia
Application granted granted Critical
Publication of ES2979247T3 publication Critical patent/ES2979247T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/06—Methods of screening libraries by measuring effects on living organisms, tissues or cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
    • C12Q2304/10—DNA staining
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1402—Data analysis by thresholding or gating operations performed on the acquired signals or stored data
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing
    • G01N2015/142—Acoustic or ultrasonic focussing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1477—Multiparameters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1488—Methods for deciding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1493—Particle size
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para la determinación cualitativa y cuantitativa de la susceptibilidad de organismos microbianos, como bacterias, a agentes antimicrobianos, como antibióticos. Por ejemplo, la presente invención proporciona un método para determinar la susceptibilidad de un microorganismo unicelular o multicelular a un agente antimicrobiano mediante citometría de flujo acústica. El método comprende exponer células del microorganismo a al menos un agente antimicrobiano, en donde dichas células del microorganismo están en y/o derivan de una muestra obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección con dicho microorganismo; medir el efecto de dicho al menos un agente antimicrobiano sobre la morfología celular de dichas células del microorganismo mediante citometría de flujo acústica; y determinar la susceptibilidad del microorganismo al menos un agente antimicrobiano a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Un método para ensayar la sensibilidad a los antimicrobianos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para la determinación cualitativa y cuantitativa de la sensibilidad de organismos microbianos tales como bacterias a agentes antimicrobianos tales como antibióticos.
Antecedentes
Una revisión de la resistencia a los antimicrobianos (RAM) estimó que 700000 personas mueren por infecciones debidas a organismos resistentes cada año, y que para 2050 la RAM superará el cáncer como causa de muerte [The Review on Antimicrobial Resistance. (2016).Tackling drug resistant infections globally: Final report and recommendations(ed. O'Neil, J.) 1-72 (HM Government 2016)]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce la RAM como una amenaza grave para la salud global [Organización Mundial de la Salud. Antimicrobial resistance. Hoja técnica n.° 194. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/HO AMR challenge], y destacó la aparición deKlebsiellaresistentes a carbapenems como su prioridad principal en el primer informe global de la OMS sobre la RAM en 2014 [Organización Mundial de la Salud. WHO's first global report on antibiotic resistance reveals serious, worldwide threat to public.World Health Organisation Media Centrehttp://www.who.int/mediacentre/news/releases/2014/amr-report/en/ (2014)].
Existen muchos tipos de agentes antimicrobianos. Los antibióticos constituyen una clase importante de agentes antimicrobianos. También existen diferentes tipos de antibióticos. Los antibióticos beta-lactámicos forman un ejemplo de clase de antibióticos. Por ejemplo, los carbapenems pertenecen a una clase de antibióticos de amplio espectro que tienen actividad antibacteriana contra muchos organismos aerobios y anaerobios Gram positivos y Gram negativos. Esta clase de antibióticos beta-lactámicos es particularmente útil en el tratamiento de infecciones bacterianas debido a su resistencia a enzimas beta-lactamasas (también conocidas como penicilinasas y cefalosporinasas) producidas por bacterias. A modo de ejemplo de aumento en la RAM, una serie de bacterias han desarrollado una forma adquirida de resistencia a los antibióticos carbapenémicos.
Por ejemplo, las especiesKlebsiellason las Enterobacteriáceas resistentes a carbapenems (CRE) más prominentes y causan un exceso de mortalidad hospitalaria de 27% en pacientes con septicemia y neumonía [Hauck, C. et al., Spectrum of excess mortality due to carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniaeinfections.Clin. Microbiol. Infecí22, 513-519 (2016)]. Por ejemplo, la región del borde del océano Índico se ha convertido en uno de los principales focos de carbapenemasas emergentes, y ha visto olas sucesivas de diversas formas deK. pneumoniaeresistentes a carbapenems [Hall, J.M. et al. Molecular mechanisms of p-lactam resistance in carbapenemase-producingKlebsiella pneumoniaefrom Sri Lanka.J. Med. Microbiol.63, 1087-92 (2014); y Hall, J. M., Ingram, P. R., O'Reilly, L. C., & Inglis, T. J. J. Temporal flux in beta-lactam resistance amongKlebsiella pneumoniaein Western Australia.J. Med. Microbiol.
65, 429-437 (2016)].
Debido a la creciente propagación de la RAM y su impacto en la seguridad del paciente, p. ej., como se ilustra por la expansión de la distribución global deKlebsiella pneumoniaemultirresistente y su impacto sobre la seguridad de pacientes infectados conKlebsiella pneumoniae,existe una necesidad creciente de un sistema de ensayo de sensibilidad a antimicrobianos más rápido para guiar el uso de compuestos antimicrobianos tales como antibióticos en el tratamiento de pacientes. Por lo tanto, se necesitan métodos de ensayo de sensibilidad a antimicrobianos (AST) más rápidos para detener el uso inapropiado de agentes antimicrobianos tales como antibióticos, y por lo tanto combatir o detener el aumento de la RAM.
A pesar de la necesidad en la técnica de un sistema de ensayo rápido de sensibilidad a antimicrobianos, las técnicas de laboratorio actuales para determinar la sensibilidad de los microorganismos a los agentes antimicrobianos requieren mucho tiempo porque dependen en gran medida de métodos dependientes del cultivo para diferenciar entre resistencia y sensibilidad después del aislamiento inicial de los microorganismos (tales como bacterias) de una muestra clínica.
Por ejemplo, la detección de bacterias multirresistentes a fármacos se basa actualmente en el aislamiento primario de las bacterias infecciosas de una muestra clínica seguido de procedimientos de AST dependientes en gran medida del cultivo. Este enfoque retrasa la selección y el comienzo del tratamiento dirigido eficaz, medidas de prevención de infecciones y control de infecciones en al menos aproximadamente 24 a 72 horas, generalmente asociado con el aislamiento y cultivo de las bacterias de la muestra clínica. Debido a dicho retraso en la selección y comienzo del tratamiento dirigido eficaz, se usan antimicrobianos de amplio espectro inapropiados en ausencia de resultados empíricos de laboratorio.
Los métodos de cribado rápidos actuales no basados en cultivo para la sensibilidad a agentes antimicrobianos tales como ensayos de PCR específicos de mecanismo y el ensayo de Carba-NP ampliamente usado, pueden ser poco fiables [Goire N. et al. The implications of endemic IMP-4 carbapenemase for clinical laboratory susceptibility testing.J. Microbiol. Methods.124, 10-2 (2016)], lo cual disminuye su valor para predecir la sensibilidad a los carbapenems y, por lo tanto, disminuye su utilidad para el médico que los prescribe. Por ejemplo, con estos ensayos, aunque los resultados positivos indican resistencia probable a carbapenems, un resultado negativo no predice de forma fiable un fenotipo sensible a carbapenems.
La determinación de la concentración mínima inhibidora (MIC) por microdilución en caldo (BMD) es el estándar reconocido internacionalmente para el AST (ISO 200776-1, 2006) (ISO 20776-1:2006.Sistemas de ensayos de laboratorios clínicos y de ensayo de diagnóstico in vitro--Prueba de sensibilidad de agentes infecciosos y evaluación del rendimiento de dispositivos de ensayos de sensibilidad a antimicrobianos- Parte 1: Método de referencia para ensayo de la actividad in vitro de agentes antimicrobianos frente a bacterias aerobias de crecimiento rápido implicadas en enfermedades infecciosas]. Se puede realizar una clasificación categórica (sensible, intermedio o resistente - SIR, o sensible/no sensible - S/NS) comparando la MIC con puntos de corte específicos de especie para el microorganismo en cuestión, usando puntos de corte emitidos por el Comité Europeo sobre Ensayos de Sensibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST) o el Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI). Todos los métodos actuales para el AST se validan frente a BMD antes de la introducción en la práctica clínica [Matuschek, E., Brown, D. F. J., Kahlmeter, G. Development of the EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine microbiology laboratories.Clin. Microbiol. Infecí20, 0255-66 (2014)].
Por ejemplo, tanto el método de difusión con disco de EUCAST como la categorización de SIR conseguida por el método BMD, requieren una etapa de cultivo secundario que añade 16-20 horas a los tiempos de finalización del ensayo. De nuevo, esto retrasa la selección y el comienzo del tratamiento dirigido eficaz y, como resultado, requiere que los médicos prescriban agentes antimicrobianos de amplio espectro tales como antibióticos antes de los resultados empíricos del laboratorio.
La citometría de flujo se ha considerado un método candidato para suministrar AST rápidos [Martínez, O. V., Gratzner, H. G., Malinin, T. I., Ingram, M. The effect of some p-lactam antibiotics onEscherichia colistudied by flow cytometry.Cytometry.3, 129-1331 (1982)]. Sin embargo, al principio los análisis de citometría de flujo de bacterias estaban limitados por su baja resolución a estudios de agregación celular. La introducción de colorantes de viabilidad bacteriana, la resolución mejorada del citómetro de flujo y el aumento de la sofisticación del análisis de múltiples parámetros impulsaron intentos renovados para establecer un método para el análisis de sensibilidad a los antimicrobianos asistido por flujo [Gant, V. A., Warnes, G., Phillips, I., Savidge, G. F. The application of flow cytometry to the study of bacterial responses to antibiotics.J. Med. Microbiol.39, 147-154 (1993); Durodie, J. et al. Rapid detection of antimicrobial activity using flow Cytometry.Cytometry21,374-377 (1995); Deere, D., Porter J., Edwards, C., Pickup, R. Evaluation of the suitability of bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimetineoxonol, (diBA-C4(3)-), for the flow cytometric assessment of bacterial viability.FEMS Microbiol. Lett.130, 165-9 (1995); Mason, D. J. et al. Antibacterial action of ciprofloxacin.Antimicrob. Agents Chemother.39, 2752-8 (1995); Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro H. M. Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts ofStaphylococcus aureusandMicrococcus luteus. Antimicrob. Agents Chemother.
44, 827-34 (2000)].
Todos los estudios anteriores empleaban citómetros de flujo hidrodinámicos convencionales. A pesar de que estos estudios produjeron un catálogo de interacciones complejas entre colorantes permeables a la membrana y bacterias durante el daño subletal, los límites de resolución de incluso el mejor de los citómetros de flujo hidrodinámicos disponibles previamente aún planteaban restricciones significativas en los intentos previos para diseñar cualquier método de ensayo de sensibilidad asistido por citómetro de flujo (FAST). Como tal, hasta la fecha ha habido poco progreso en hacer que los métodos FAST sean ampliamente accesibles para AST.
Por consiguiente, la resolución limitada de los citómetros de flujo hidrodinámicos existentes, así como las exigencias técnicas de estos procedimientos de citometría de flujo no estándar y la necesidad de validación frente a métodos estándar existentes, ha obstaculizado el desarrollo de cualquier método eficaz de ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo a los agentes antimicrobianos para microorganismos, que por ejemplo se pueda implementar rápidamente en el punto de atención p. ej., en hospitales.
Avanzando sobre esta base, sigue existiendo la necesidad en la técnica de métodos más rápidos para la determinación precisa de la sensibilidad de microorganismos unicelulares o multicelulares a agentes antimicrobianos, incluyendo aquellos métodos que proporcionan una determinación cualitativa precisa y rápida de la sensibilidad y/o determinación cuantitativa rápida de la sensibilidad, tal como la determinación rápida de la MIC de un agente antimicrobiano frente a un microorganismo específico encontrado en una muestra clínica tomada de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por el microorganismo.
Sumario de la invención
General
En el trabajo que conduce a la presente invención, los autores de la invención buscaban desarrollar un método que emplee citometría de flujo acústica (AFC) que conduzca a la determinación cualitativa rápida a partir de los datos de salida de la AFC de sensibilidad o no sensibilidad a uno o más agentes antimicrobianos de un microorganismo unicelular o multicelular tal como bacterias, hongos o levaduras, preferiblemente una bacteria, que pueda estar presente en y/o infectar a un sujeto o se sospeche que está presente en y/o que infecta al sujeto.
En el trabajo que conduce a la presente invención, los autores de la invención también buscaban utilizar el método que emplea AFC para la determinación cuantitativa rápida a partir de los datos de salida de la AFC, de la(s) concentración(es) mínima(s) inhibidora(s) del uno o más agentes antimicrobianos a los que es sensible el microorganismo que puede estar presente en y/o infectar a un sujeto o se sospeche que está presente en y/o que infecta al sujeto.
Los autores de la invención especularon que dicho método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC para determinar cualitativa y/o cuantitativamente la sensibilidad de un microorganismo (tal como una bacteria, hongo o levadura) en una muestra clínica obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por el microorganismo, podría evitar en gran medida la necesidad de basarse en el aislamiento inicial del microorganismo infeccioso de la muestra clínica y los posteriores procedimientos de AST dependientes de cultivo largos empleados por los métodos de ensayo de sensibilidad de práctica de referencia actuales que están actualmente establecidos en laboratorios clínicos y de patología, incluyendo los que están establecidos en hospitales en todas partes.
Los autores de la invención razonaron que dicho método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC para determinar cualitativa y/o cuantitativamente la sensibilidad de un microorganismo a uno o más agentes antimicrobianos, proporcionaría por tanto al médico una herramienta valiosa para la determinación cualitativa muy rápida de la sensibilidad del microorganismo a uno o más agentes antimicrobianos y/o una cuantificación muy rápida de la MIC del(de los) agente(s) antimicrobiano(s) al(a los) que es sensible el microorganismo, asegurando así la selección y el comienzo del tratamiento dirigido eficaz, medidas de prevención de infecciones y control de infecciones, en sólo muy pocas horas, tal como en el plazo de aproximadamente 1 a 6 horas e incluso en el plazo de aproximadamente 1 a 3 horas desde la recogida de la muestra clínica. Los autores de la invención razonaron que dicho método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC proporcionaría a los médicos los resultados empíricos de laboratorio relevantes en solo poco tiempo desde la recogida de muestras y evitaría la necesidad de los médicos de tratar a sujetos con agentes antimicrobianos inapropiados tales como antibióticos de amplio espectro usados actualmente en ausencia de dichos resultados empíricos. Los autores de la invención razonaron que dicho método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC contribuiría por lo tanto a reducir la aparición de cepas adicionales de AMR.
Por consiguiente, los autores de la invención razonan que dicho método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC será valioso en la determinación muy rápida de la sensibilidad de un microorganismo de una muestra clínica a agentes antimicrobianos ensayados y/o la determinación muy rápida de la MIC del(de los) agente(s) antimicrobiano(s) al(a los) que es sensible el microorganismo. Dicho método facilitará la administración rápida del tratamiento dirigido eficaz al sujeto p. ej., en el plazo de sólo unas pocas horas desde la recogida de muestras. Los autores de la invención razonaron que dicho método sería particularmente útil para el tratamiento rápido de infecciones, tal como con bacterias multirresistentes a fármacos, p. ej., en un entorno hospitalario o una sala de urgencias en la que se requiere una intervención clínica rápida para evitar la progresión de la infección o la aparición de complicaciones clínicas asociadas con la progresión de la infección.
Como se ilustra en el presente documento, los autores de la presente invención han demostrado un método de AFC capaz de determinar rápidamente cualitativamente la sensibilidad de un microorganismo (p. ej., bacterias) a un agente antimicrobiano (p. ej., antibiótico) asignando categorías de sensibilidad, tal como en el plazo de aproximadamente 1 hora desde la manipulación inicial de la muestra microbiana. Como se ilustra en el presente documento, los autores de la presente invención también han demostrado que el método de AFC es capaz además de determinar rápidamente las MIC de los agentes antimicrobianos (p. ej., antibióticos) ensayados para los que se mostraba que el microorganismo (p. ej., bacterias) era sensible, con lo que se lograba la determinación de las MIC, p. ej., en el plazo de aproximadamente 3 horas desde la manipulación inicial de la muestra microbiana, p. ej., desde la recogida inicial de la muestra del sujeto y/o la primera manipulación de la muestra para incubar las células y/o la muestra en un medio de cultivo. Por lo tanto, como se ilustra en el presente documento, los autores de la presente invención han demostrado un nuevo método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC y su utilidad en la asignación muy rápida de categorías de sensibilidad al(a los) agente(s) antimicrobiano(s) para un microorganismo en una muestra clínica y/o determinación muy rápida de la MIC del(de los) agente(s) antimicrobiano(s) al(a los) que el microorganismo es susceptible.
Como también se ilustra en el presente documento, los autores de la invención también han demostrado que el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC puede realizarse (i) cultivando en un medio de cultivo células de un microorganismo de una muestra obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, y/o (ii) cultivando directamente en un medio de cultivo una muestra obtenida del sujeto que comprende las células del microorganismo, p. ej., sin separar primero las células de la muestra del sujeto antes de cultivar la muestra en el medio de cultivo, para producir así un cultivo de las células del microorganismo que se divide activamente para usar en el método de la invención descrito en el presente documento.
Específicamente, como se ilustra en el presente documento, los autores de la presente invención demostraron un método de AFC capaz de determinar rápidamente las MIC de carbapenems y asignar categorías de sensibilidad. Además, los autores de la invención demostraron una eficacia exitosa de este método comparando los resultados de las MIC obtenidos mediante este método frente a los resultados de MIC obtenidos mediante microdilución en caldo en una validación prospectiva, con ocultación, usando una colección de aislados deK. pneumoniaeyK. oxytocasusceptibles a carbapenems y resistentes a carbapenems, incluyendo aislados productores de ESBL y carbapenemasas internacionalmente dominantes. Se entenderá que el término "ESBL", como se usa en el presente documento, se refiere a "beta lactamasa de espectro extendido", y abarca dos clases específicas de mecanismos de resistencia antimicrobiana que son ESBL y carbapenemasa. Como se demuestra en el presente documento, la colección de cepas microbianas analizadas por los autores de la presente invención comprendía representantes de las subclases de estos mecanismos de resistencia que son más prevalentes en el mundo.
Más específicamente, a diferencia de los AST de laboratorio actuales que se basan en métodos que requieren mucho tiempo y que dependen de cultivos largos para la diferenciación de resistencia y sensibilidad después del aislamiento inicial de microorganismos, p. ej., bacterias de una muestra clínica, como se ilustra en el presente documento, los autores de la presente invención demuestran un flujo de trabajo de citometría de flujo acústica para determinar rápidamente la sensibilidad a carbapenems a partir de las características de las células bacterianas en una colección de aislados deK. pneumoniaeinternacional (n = 48), que expresan una variedad representativa de carbapenemasas. El método de ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica (FAST) combina tanto (i) la clasificación cualitativa rápida de sensible/no sensible como (ii) la medición cuantitativa rápida de la MIC en un procedimiento de ensayo que puede completarse poco después de la recepción de un aislado primario o una muestra clínica (por ejemplo, 54 y 158 minutos respectivamente). Los resultados cualitativos de FAST y MIC derivada de FAST (MIC<fast>) se corresponden estrechamente con la MIC por microdilución en caldo (MIC<bmd>, coeficiente de correlación de Matthew 0.887) y se alinean con la norma internacional AST (ISO 200776-1; 2006). Por consiguiente, los resultados ilustrados en el presente documento demuestran que el método de citometría de flujo acústica de la presente invención puede aplicarse a la determinación rápida de la sensibilidad a los antimicrobianos en una variedad más amplia de microorganismos incluyendo bacterias Gram negativas y Gram positivas.
Ejemplos específicos de la invención
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
Por consiguiente, en un primer aspecto amplio de la presente invención se proporciona un método para determinar la sensibilidad de un microorganismo unicelular o multicelular a un agente antimicrobiano mediante citometría de flujo acústica. El método comprende las siguientes etapas: (i) incubar en un medio de cultivo (a) células del microorganismo de una muestra obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, y/o (b) una muestra obtenida del sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, en donde dicha muestra comprende células de dicho microorganismo, en donde dicha incubación es durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células se dividan activamente para obtener de ese modo un cultivo de dichas células de dicho microorganismo en división activa; (ii) exponer las células del microorganismo en y/o del cultivo celular en división activa obtenido en la etapa (i) a un agente antimicrobiano durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células del microorganismo se dividan activamente; (iii) marcar las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano en la etapa (ii) con un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico; (iv) medir el efecto de dicho agente antimicrobiano en la morfología celular de dichas células del microorganismo mediante citometría de flujo acústica; y (v) determinar la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica, en donde la etapa (v) comprende (A) determinar la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano cualitativamente determinando a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica que dicho microorganismo es susceptible o no susceptible a dicho agente antimicrobiano; y (B) determinar la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano cuantitativamente determinando a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica la concentración mínima inhibidora (MIC) de dicho agente antimicrobiano a la que el microorganismo es susceptible.
En un ejemplo, el método según esta realización comprende obtener una muestra que comprende células del microorganismo de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por el microorganismo.
Preferiblemente, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es permeable a la membrana celular, fluorescente de manera natural dentro de las células del microorganismo, tiene fluorescencia potenciada tras la unión a un ácido nucleico, y/o es fotoestable. Por ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico permea la membrana celular de las células del microorganismo y es fluorescente cuando se une a ácidos nucleicos dentro de dichas células de dicho microorganismo. Preferiblemente, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico permea fácilmente la membrana celular.
Preferiblemente, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico se une a ácidos nucleicos citoplasmáticos, mitocondriales y nucleares en las células del microorganismo. Por ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico se une a ácido desoxirribonucleico (ADN) y/o ácido ribonucleico (ARN) en las células del microorganismo.
En un ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico comprende un resto de unión a ácido nucleico y un resto marcador fluorescente. Sin embargo, en otro ejemplo, los compuestos fluorescentes de unión a ácido nucleico adecuados para usar en la presente invención pueden ser un compuesto fluoróforo que no tiene un resto de unión a ácido nucleico y un resto marcador fluorescente separados. Por ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico puede ser un colorante fluoróforo intercalante de ácido nucleico.
En un ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es un colorante fluoróforo seleccionado de colorantes de la gama Quant-iT™ disponible comercialmente (p. ej., ThermoFisher Scientific) y/o colorantes de la gama SYBR™ permeable a la membrana disponible comercialmente (p. ej., ThermoFisher Scientific) y/o de los colorantes de la gama Hoechst disponibles comercialmente (p. ej., ThermoFisher Scientific; o Invitrogen) incluyendo pero limitados a Hoechst 33258 (bis-bencimida pentahidrato), Hoechst 33342 [también conocido como [2-(4-etoxifenil)-6-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-bencimidazol-2-il]-1H-bencimidazol o trihidrocloruro trihidrato], Hoechst 34580 [también conocido como N,N-dimetil-4-[6-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-bencimidazol-2-il]-1H-bencimidazol-2-il]anilina], o el amarillo nuclear Hoechst S769121 y/o diaminofenilindol [también conocido como 4',6-diamidino-2-fenilindol o 2-(4-carbamimidoilfenil)-1H-indol-6-carboximidamida o DAPI] y derivados de DAPI permeables a la membrana (p. ej., Biotium o ThermoFisher Scientific) y/o yoduro de propidio (PI) (p. ej., ThermoFisher Scientific o Stemcell Technologies), y/o bromuro de etidio (EB o EtBr) (p. ej., Sigma-Aldrich, Merck) y/o yoduro de hexidio (p. ej., ThermoFisher Scientific) y/o naranja de acridina [también conocido como (3-N,3-N,6-N,6-N-tetrametilacridin-3,6-diamina o AO] (p. ej., ThermoFisher Scientific) y/o colorantes de la gama DRAQ5™ y DRAQ7™ (p. ej., Biostatus, BioLegend, o Beckman Coulter, Inc) y/o colorantes de la gama SYTOX™ (también conocidos como verde SYTO) (p. ej., ThermoFisher Scientific) y/o colorantes de la gama SYTO™ tales como sYt O 9, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO BC (p. ej., ThermoFisher Scientific).
En un ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es un colorante fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en SYTO 9, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO BC, Hoechst 33342, yoduro de propidio (PI), DAPI y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es un colorante fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en SYTO 9, Hoechst 33342 y una combinación de SYTO 9 y yoduro de propidio (PI).
Preferiblemente, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es el colorante SYTO 9.
En un ejemplo de un método según esta realización, la etapa de marcar las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano en la etapa (iii) con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico, comprende teñir las células del microorganismo con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico para discriminar entre sucesos bacterianos y residuos no bacterianos cuando se mide el efecto del agente antimicrobiano en la morfología celular de las células del microorganismo mediante citometría de flujo acústica en la etapa (iv).
En otro ejemplo, el marcado de las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano en la etapa (ii) con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico da como resultado la detención de la división celular de células intactas y/o replicantes del microorganismo. Por ejemplo, el uso de SYTO 9 y otro ADN, otros colorantes intercalantes de ADN, puede detener la división celular bloqueando la síntesis de ADN de la célula microbiana y, por lo tanto, puede detener la división celular antes del aumento en el volumen citoplasmático.
En un ejemplo de un método según esta realización de la invención, el microorganismo es sensible al agente antimicrobiano. Según este ejemplo, medir el efecto del agente antimicrobiano en la morfología celular de las células del microorganismo mediante citometría de flujo acústica puede comprender medir el efecto del agente antimicrobiano en la morfología celular de las células del microorganismo en división activa derivado del sujeto a medida que las células se ven afectadas por el agente antimicrobiano y antes de la lisis celular y/o la descomposición celular completa después de la exposición de las células del microorganismo en división activa al agente antimicrobiano.
Preferiblemente, la etapa de medir el efecto del agente antimicrobiano en la morfología celular de las células del microorganismo mediante citometría de flujo acústica comprende medir mediante citometría de flujo acústica el efecto del agente antimicrobiano en (i) la cantidad de contenido de ácido nucleico en dichas células de dicho microorganismo, y/o (ii) el volumen citoplasmático de las células del microorganismo.
También preferiblemente, la etapa de medir el efecto del agente antimicrobiano en la morfología celular de las células del microorganismo mediante citometría de flujo acústica comprende medir un cambio en la morfología celular de las células de dicho microorganismo en división activa determinado por citometría de flujo acústica después de la exposición de dichas células del microorganismo a una concentración de dicho agente antimicrobiano, respecto a la morfología celular de las células del microorganismo en división activa en y/o de la muestra obtenida del sujeto determinado por citometría de flujo acústica sin exposición de dichas células a dicho agente antimicrobiano.
Se entenderá que cualquier cambio puede medirse hasta el límite de resolución del citómetro acústico. También se entenderá que es la magnitud de este cambio la que puede considerarse cuando se realizan determinaciones para la concentración inhibidora.
Por ejemplo, medir un cambio en la morfología celular de células del microorganismo en división activa después de la exposición de las células del microorganismo a una concentración del agente antimicrobiano respecto a la morfología celular de células del microorganismo en división activa en y/o de la muestra obtenida del sujeto sin exposición de dichas células a dicho agente antimicrobiano, comprende medir un desplazamiento en la dispersión frontal y/o un cambio en la intensidad de fluorescencia en gráficos biaxiales de los resultados de la citometría de flujo acústica entre: datos de salida de la citometría de flujo acústica medidos para células del microorganismo después de exposición de esas células a una concentración del agente antimicrobiano, respecto a los datos de salida de la citometría de flujo acústica medidos para células de dicho microorganismo sin exposición de las células al agente antimicrobiano.
En un ejemplo, medir el efecto del agente antimicrobiano en la morfología celular de las células del microorganismo mediante citometría de flujo acústica comprende medir un cambio en el tamaño de las células del microorganismo en división activa después de la exposición de las células a una concentración del agente antimicrobiano. Por ejemplo, el método de la presente invención puede comprender medir un cambio en el tamaño de las células del microorganismo en división activa determinado por citometría de flujo acústica después de exposición de las células a una concentración del agente antimicrobiano, respecto al tamaño de las células en división activa del microorganismo en y/o de la muestra obtenida del sujeto determinado por citometría de flujo acústica sin exposición de las células al agente antimicrobiano.
En un ejemplo de este tipo, medir un cambio en el tamaño de las células en división activa del microorganismo comprende medir o determinar un desplazamiento en la dispersión frontal y/o un cambio en la intensidad de fluorescencia en gráficos biaxiales de la salida de la citometría de flujo acústica entre los datos de salida de la citometría de flujo acústica observados o medidos para células del microorganismo después de exposición de las células a la concentración del agente antimicrobiano, respecto a los datos de salida de la citometría de flujo acústica medidos para las células del microorganismo en ausencia de exposición de las células al agente antimicrobiano, en donde el desplazamiento en el gráfico de la dispersión frontal representa un cambio en el tamaño de las células en división activa expuestas al agente antimicrobiano respecto al tamaño de las células activas del microorganismo en ausencia de exposición al agente antimicrobiano.
En otro ejemplo, medir un cambio en el tamaño de las células en división activa comprende medir un aumento en el tamaño de las células del microorganismo en división activa en y/o de la muestra obtenida del sujeto determinado por citometría de flujo acústica después de exposición de las células del microorganismo en división activa a una concentración del agente antimicrobiano, respecto al tamaño de las células del microorganismo en división activa en y/o de la muestra obtenida del sujeto determinado por citometría de flujo acústica en ausencia de exposición de las células al agente antimicrobiano. En un ejemplo de este tipo, el método comprende medir o determinar un desplazamiento en la dispersión frontal y/o un cambio en la intensidad de fluorescencia en gráficos biaxiales de la salida de la citometría de flujo acústica entre los datos de salida de la citometría de flujo acústica observados o medidos para células del microorganismo después de exposición de las células a la concentración del agente antimicrobiano, respecto a los datos de salida de la citometría de flujo acústica medidos para células del microorganismo en ausencia de exposición de las células al agente antimicrobiano, en donde el desplazamiento en el gráfico de dispersión frontal representa un aumento en el tamaño de las células en división activa expuestas al agente antimicrobiano respecto al tamaño de las células del microorganismo en división activa en ausencia de exposición al agente antimicrobiano.
Preferiblemente, medir un aumento en el tamaño de las células del microorganismo en división activa comprende medir un aumento en (i) el contenido de ácido nucleico en dichas células de dicho microorganismo, y/o (ii) el volumen citoplasmático de las células del microorganismo es decir, después de la exposición de las células a una concentración del agente antimicrobiano respecto al tamaño de las células en división activa del microorganismo obtenido del sujeto sin exposición al agente antimicrobiano. Por ejemplo, el aumento en el volumen citoplasmático de las células del microorganismo comprende elongación celular y/o hinchamiento celular y/o expansión.
Preferiblemente, en los ejemplos y realizaciones descritos anteriormente en el presente documento, la concentración del agente antimicrobiano es una concentración inhibidora de dicho agente antimicrobiano al que son susceptibles las células del microorganismo obtenido del sujeto.
Según la presente invención, el método según este primer aspecto amplio puede comprender una etapa de validar o registrar un cambio en la morfología celular de las células del microorganismo después de la exposición de dichas células a una concentración del agente antimicrobiano respecto a la morfología celular de las células del microorganismo en y/o de la muestra obtenida del sujeto sin exposición de las células a dicho agente antimicrobiano mediante observación de la morfología celular de dichas células usando microscopía de fluorescencia tal como microscopía de fluorescencia digital.
Según la presente invención, el método según el primer aspecto amplio de la invención, que determina la sensibilidad del microorganismo obtenido del sujeto al agente antimicrobiano a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica comprende determinar la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano cualitativamente determinando a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica que dicho microorganismo es sensible o no sensible a dicho agente antimicrobiano. Además, determinar la sensibilidad del microorganismo obtenido del sujeto al agente antimicrobiano a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica comprende determinar la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano cuantitativamente determinando a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica la concentración inhibidora mínima (MIC) del agente antimicrobiano a la que es susceptible el microorganismo.
El método de la presente invención comprende (i) determinar que el microorganismo obtenido del sujeto es sensible o no sensible al agente antimicrobiano, y (ii) cuando se determina que el microorganismo en (i) es sensible al agente antimicrobiano, el método comprende además determinar la MIC del agente antimicrobiano a la que es sensible el microorganismo.
Por ejemplo, determinar a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica que el microorganismo es sensible o no sensible al agente antimicrobiano comprende medir a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica el efecto que tiene el agente antimicrobiano en la morfología celular de las células en división activa de dicho microorganismo a diferentes concentraciones del agente antimicrobiano. En un ejemplo de este tipo, el método de la presente invención comprende además determinar que el microorganismo es sensible al agente antimicrobiano cuando los datos de salida de la citometría de flujo acústica miden un cambio en la morfología celular de las células en división activa del microorganismo obtenido del sujeto después de exposición de las células del microorganismo en división activa a una concentración del agente antimicrobiano que es igual o menor que una concentración predeterminada de dicho agente antimicrobiano, respecto a la morfología celular de las células del microorganismo en división activa en y/o de la muestra obtenida del sujeto sin exposición de esas células a dicho agente antimicrobiano. En un ejemplo alternativo, el método de la presente invención comprende además determinar que el microorganismo no es sensible a dicho agente antimicrobiano cuando (i) los datos de salida de la citometría de flujo acústica no miden un cambio en la morfología celular de células del microorganismo en división activa con exposición de las células en división activa del microorganismo obtenido del sujeto a una concentración de dicho agente antimicrobiano que es igual o menor que dicha concentración predeterminada de dicho agente antimicrobiano y/o (ii) los datos de salida de la citometría de flujo acústica miden un cambio en la morfología celular de células del microorganismo en división activa después de la exposición de dichas células en división activa de dicho microorganismo obtenido del sujeto a una concentración de dicho agente antimicrobiano que es mayor que dicha concentración predeterminada de dicho agente antimicrobiano.
Por ejemplo, los datos de salida de la citometría de flujo acústica miden un cambio en la morfología celular de células del microorganismo en división activa después de la exposición de las células del microorganismo del sujeto a la concentración de dicho agente antimicrobiano, midiendo en los datos de salida de la citometría de flujo acústica un desplazamiento en la dispersión frontal y/o un cambio en la intensidad de fluorescencia en gráficos biaxiales de la salida de la citometría de flujo acústica entre (i) los datos de salida de la citometría de flujo acústica medidos para las células de dicho microorganismo en división activa después de exposición de dichas células a una concentración de dicho agente antimicrobiano, y (ii) los datos de salida de la citometría de flujo acústica medidos para dichas células de dicho microorganismo en división activa en y/o de la muestra obtenida del sujeto sin exposición de dichas células a dicho agente antimicrobiano.
Preferiblemente, un cambio en la morfología celular de células del microorganismo en división activa comprende un aumento en el tamaño de las células del microorganismo en división activa. Por ejemplo, el cambio de aumento en el tamaño de las células del microorganismo en división activa comprende (i) un aumento en la cantidad de contenido de ácido nucleico en dichas células en división activa de dicho microorganismo, y/o (ii) un aumento en el volumen citoplasmático de dichas células en división activa de dicho microorganismo opcionalmente determinado por elongación celular y/o hinchamiento celular y/o expansión.
También preferiblemente, la concentración predeterminada del agente antimicrobiano detallada en los ejemplos anteriores en el presente documento, es una concentración de punto de corte de sensibilidad clínica reconocida internacionalmente o una MIC reconocida internacionalmente de dicho agente antimicrobiano para dicho microorganismo en la muestra obtenida de la o de una especie a la que pertenece dicho microorganismo. Por consiguiente, se entenderá que el término "MIC", como se usa en el presente documento a lo largo de la presente memoria, se refiere a la concentración mínima inhibidora de un agente antimicrobiano que es la concentración de un agente antimicrobiano que se requiere para inhibir el crecimiento de células de un aislado microbiano específico. Por ejemplo, la concentración predeterminada del agente antimicrobiano es una concentración de punto de corte de sensibilidad clínica para el agente antimicrobiano determinado o proporcionado por una autoridad de ensayo de sensibilidad a los antimicrobianos reconocido internacionalmente tal como el Comité Europeo sobre Ensayos de Sensibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST) (como se puede encontrar, p. ej., en http://www.eucast.org/) o el Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI) (como se puede encontrar, p. ej., en http://clsi.org/) con respecto al microorganismo obtenido del paciente o para una especie a la que pertenece dicho microorganismo. En ausencia de un punto de corte clínico determinado o proporcionado, puede determinarse una concentración a partir de datos epidemiológicos para representar una concentración suficientemente baja como para garantizar el éxito del tratamiento clínico si la MIC determinada cae por debajo de dicha concentración.
En una realización del método según este primer aspecto amplio de la invención, el método comprende medir a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica el efecto que tiene el agente antimicrobiano en la morfología celular de las células en división activa del microorganismo obtenido del sujeto a diferentes concentraciones del agente antimicrobiano, por ejemplo, a concentraciones del agente antimicrobiano que comprenden 0 mg/l, 0.25 mg/l, 1 mg/l, 2 mg/l, 4 mg/l y 16 mg/l.
En una realización del método según el primer aspecto amplio de la presente invención, la determinación a partir de los datos de salida de citometría de flujo acústica de que el microorganismo obtenido del sujeto es sensible o no sensible al uno o más agentes antimicrobiano ensayados por este método se logra en el plazo de aproximadamente 1 a 3 horas desde el momento de obtener la muestra que comprende células del microorganismo del sujeto; y/o en el plazo de aproximadamente 1 a 3 horas desde el momento de incubar primero las células del microorganismo de dicha muestra en el medio de cultivo para obtener el cultivo en división activa de dichas células de dicho microorganismo usado para exponer las células del microorganismo en división activa al agente antimicrobiano; y/o en el plazo de aproximadamente 1 a 3 horas desde el momento de incubar primero la muestra obtenida del sujeto que comprende las células del microorganismo en el medio de cultivo para obtener el cultivo de dichas células de dicho microorganismo en división activa usado para exponer las células del microorganismo en división activa al agente antimicrobiano.
En una realización preferida del método según el primer aspecto amplio descrito en el presente documento, las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano de ensayo en un método según cualquier aspecto amplio de la invención descrito en el presente documento están presentes a una concentración en el intervalo de aproximadamente 5.0 x 101 a aproximadamente 5.0 X 109 células microbianas/ml, y más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 5.0 x 102 a aproximadamente 5.0 x 108 células microbianas/ml, y lo más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml. Por consiguiente, en un ejemplo, la etapa de exponer las células del microorganismo en y/o del cultivo celular en división activa obtenidas en la etapa (i) a un agente antimicrobiano durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células del microorganismo se dividan activamente, comprende exponer al agente antimicrobiano una cantidad de células microbianas a una concentración en el intervalo de aproximadamente 5.0 x 101 a aproximadamente 5.0 x 109 células microbianas/ml, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 5.0 x 102 a aproximadamente 5.0 x 108 células microbianas/ml, y más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml. En un ejemplo de este tipo, la concentración de las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano es de aproximadamente 5.0 x 104 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml, o de aproximadamente 5.0 x 105 a aproximadamente 5.0 x 107 células/ml, o de aproximadamente 5.0 x 106 a aproximadamente 5.0 x 107 células/ml. En otro ejemplo, la concentración de las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano es de aproximadamente 5.0 x 103 células/ml o aproximadamente 5.0 x 104 células/ml o aproximadamente 5.0 x 104 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 105 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 106 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 107 células/ml o aproximadamente 5.0 x 108 células/ml. En algunos ejemplos preferidos, la concentración de las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano es de aproximadamente 5.0 x 105 células/ml.
Se prefiere que las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano de ensayo estén presentes a las concentraciones mencionadas anteriormente cuando se determina la sensibilidad del microorganismo a un agente antimicrobiano. Alternativamente o además, se prefiere que las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano de ensayo estén presentes a las concentraciones mencionadas anteriormente cuando se determina la MIC del agente microbiano para el que se ha mostrado que el microorganismo es sensible mediante el método de este aspecto.
Por consiguiente, en algunos ejemplos según esta realización, el método según el primer aspecto amplio descrito en el presente documento, comprende una etapa de incubar en el medio de cultivo (a) células del microorganismo de una muestra obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, y/o (b) una muestra obtenida del sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, en donde dicha muestra comprende células de dicho microorganismo, en donde la incubación es durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células se dividan activamente para obtener de ese modo un cultivo en división activa de dichas células de dicho microorganismo que comprende dividir activamente células microbianas a una concentración en el intervalo de aproximadamente 5.0 x 101 a aproximadamente 5.0 x 109 células microbianas/ml, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 5.0 x 102 a aproximadamente 5.0 x 108 células microbianas/ml, y más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml. En un ejemplo de este tipo, se prefiere que el cultivo en división activa comprenda una concentración de células microbianas en división activa de aproximadamente 5.0 x 104 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml, o de aproximadamente 5.0 x 105 a aproximadamente 5.0 x 107 células/ml, o de aproximadamente 5.0 x 106 a aproximadamente 5.0 x 107 células/ml. Por ejemplo, el cultivo en división activa comprende una concentración de células microbianas en división activa de aproximadamente .0 x 103 células/ml, o 5.0 x 104 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 105 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 106 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 107 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 108 células/ml.. En algunos ejemplos preferidos, la concentración de las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano es de aproximadamente 5.0 x 105 células/ml.
En ejemplos alternativos, para adquirir las células microbianas en división activa del cultivo en división activa de dichas células de dicho microorganismo se concentra para lograr la concentración mencionada anteriormente de células microbianas en división activa antes de exponer las células del microorganismo en y/o del cultivo celular en división activa al agente antimicrobiano.
Es deseable que las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano de ensayo estén presentes en las concentraciones mencionadas anteriormente para determinar la sensibilidad de un microorganismo a un agente antimicrobiano mediante citometría de flujo acústica usando el método de cualquier aspecto amplio descrito en el presente documento. Alternativamente, o además, es deseable que las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano de ensayo estén presentes en las concentraciones mencionadas anteriormente cuando se determina la MIC del agente microbiano para el que se ha determinado que el microorganismo es sensible. En algunos de tales ejemplos, las células microbianas pueden ser bacterias.
En otra realización del método según el primer aspecto amplio de la presente invención, el método comprende además:
(a) producir una muestra de células de control no expuesta incubando en un medio de cultivo células del microorganismo de la muestra obtenida del sujeto durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células se dividan activamente para obtener un cultivo en división activa de las células del microorganismo, y marcar las células en o de dicho cultivo en división activa con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico en ausencia de una exposición previa de las células al agente antimicrobiano; y
(b) medir por citometría de flujo acústica la morfología celular y/o cantidad de las células del microorganismo en la muestra de control no expuesta.
En un ejemplo, el método según esta realización comprende además medir por citometría de flujo acústica la morfología celular y/o la cantidad de las células del microorganismo de la muestra obtenida del sujeto después de la exposición de esas células a una concentración del agente antimicrobiano, y opcionalmente comparar la morfología celular y/o la cantidad de células del microorganismo después de la exposición al agente antimicrobiano con la morfología celular y/o la cantidad de células medidas por citometría de flujo acústica para la muestra de control no expuesta.
Con referencia a las realizaciones preferidas del método de la presente invención donde la determinación de la sensibilidad del microorganismo obtenido del sujeto al agente antimicrobiano a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica comprende determinar cuantitativamente la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica midiendo o determinando la MIC del agente antimicrobiano al que es sensible el microorganismo, en un ejemplo de tales realizaciones la etapa de medir o determinar a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica la MIC del agente antimicrobiano al que es sensible el microorganismo, comprende:
(a) incubar en un medio de cultivo células del microorganismo de la muestra obtenida del sujeto y/o incubar en un medio de cultivo una muestra obtenida del sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, en donde dicha muestra comprende células del microorganismo, durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células se dividan activamente para obtener de ese modo un cultivo en división activa de las células del microorganismo, y marcar las células del microorganismo en y/o de este cultivo en división activa con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico en ausencia de cualquier exposición previa al agente antimicrobiano, para producir de ese modo una muestra de control no expuesta;
(b) medir por citometría de flujo acústica la morfología celular y la cantidad de dichas células de dicho microorganismo en la muestra de control no expuesta;
(c) llevar a cabo etapas que comprenden
(i) incubar en un medio de cultivo células del microorganismo de una muestra obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por el microorganismo, y/o incubar en el medio de cultivo una muestra obtenida del sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por el microorganismo en donde la muestra comprende células del microorganismo, en donde la incubación de las células del microorganismo en y/o de la muestra del sujeto es durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células se dividan activamente para obtener de ese modo un cultivo en división activa de las células del microorganismo;
(ii) exponer las células del microorganismo en y/o del cultivo celular en división activa obtenido en la etapa (i) al agente antimicrobiano durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células del microorganismo se dividan activamente;
(iii) marcar las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano en la etapa (ii) con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico;
(iv) medir el efecto del agente antimicrobiano en la morfología celular de las células del microorganismo mediante citometría de flujo acústica; y
(d) determinar a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica la concentración mínima del agente antimicrobiano para la que la cantidad o proporción de las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano que tienen una morfología celular de células no expuestas a agente antimicrobiano en la muestra de control no expuesta, sea igual o menor que una cantidad o proporción predeterminada de las células del microorganismo en la muestra de control no expuesta medida por citometría de flujo acústica para presentar dicha morfología celular de células no expuestas a agente antimicrobiano.
Preferiblemente, la etapa (c) (ii) de este método comprende exponer las células del microorganismo en y/o del cultivo celular en división activa obtenido en la etapa (i) a una concentración del agente antimicrobiano durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células del microorganismo se dividan activamente, en donde las células del microorganismo que están siendo expuestas al agente antimicrobiano están presentes en una concentración de aproximadamente 5.0 x 101 a aproximadamente 5.0 x 109 células microbianas/ml, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 5.0 x 102 a aproximadamente 5.0 x 108 células microbianas/ml, y más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml. Por ejemplo, el método comprende exponer las células del microorganismo en y/o del cultivo celular en división activa al agente antimicrobiano en una concentración de aproximadamente 5.0 x 104 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml, o de aproximadamente 5.0 x 105 a aproximadamente 5.0 x 107 células/ml, o de aproximadamente 5.0 x 106 a aproximadamente 5.0 x 107 células/ml. En un ejemplo de este tipo, la concentración de las células microbianas que se exponen al agente antimicrobiano es de aproximadamente 5.0 x 104 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 105 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 106 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 107 células/ml. En algunos ejemplos, la concentración de células microbianas que se exponen al agente antimicrobiano es de aproximadamente 5.0 x 105 células/ml.
El método de la etapa (c) anterior comprende preparar una muestra expuesta a agente antimicrobiano
(i) incubando en un medio de cultivo células del microorganismo de una muestra obtenida del sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, y/o incubando en un medio de cultivo una muestra obtenida del sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo en donde dicha muestra comprende células del microorganismo, en donde la incubación es durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células de dicho microorganismo se dividan activamente para obtener de ese modo un cultivo en división activa de las células de dicho microorganismo para el sujeto;
(ii) exponiendo las células del microorganismo en y/o del cultivo celular en división activa obtenido en la etapa (i) a una concentración del agente antimicrobiano durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células del microorganismo se dividan activamente; y
(iii) marcar las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano en la etapa (ii) con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico.
Preferiblemente, la etapa (c) (ii) de este método comprende exponer las células del microorganismo en y/o del cultivo celular en división activa obtenido en la etapa (i) a una concentración del agente antimicrobiano durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células del microorganismo se dividan activamente, en donde las células del microorganismo que están siendo expuestas al agente antimicrobiano están presentes en una concentración de aproximadamente 5.0 x 101 a aproximadamente 5.0 x 109 células microbianas/ml, preferiblemente en una concentración de aproximadamente 5.0 x 102 a aproximadamente 5.0 x 108 células microbianas/ml, y más preferiblemente en una concentración de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml, como se describió anteriormente.
En un ejemplo de este tipo, el método comprende además medir por citometría de flujo acústica la morfología celular y la cantidad de las células del microorganismo en la muestra expuesta al agente antimicrobiano, por ejemplo, medir la cantidad o proporción de células en dicha muestra expuesta al agente antimicrobiano que tienen la misma morfología celular de células no expuestas a agente antimicrobiano en la muestra de control no expuesta.
Preferiblemente, el método comprende además medir o determinar que la cantidad o proporción de las células en la muestra expuesta al agente antimicrobiano que tienen la misma morfología celular de las células del microorganismo no expuestas al agente antimicrobiano en la muestra de control no expuesta, es igual o menor que la cantidad o proporción predeterminada de las células en la muestra de control no expuesta medida (por citometría de flujo acústica) que presentan dicha morfología celular de las células no expuestas al agente antimicrobiano.
En un ejemplo según las realizaciones descritas anteriormente, el método puede comprender en la etapa (c), exponer las células del microorganismo en división activa en y/o del cultivo celular en división activa del microorganismo obtenido en la etapa (c) (i) a diferentes concentraciones del agente antimicrobiano. El método puede comprender además en la etapa (d) medir para cada una de las concentraciones del agente antimicrobiano la cantidad o proporción de células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano que tienen o presentan una morfología celular de células no expuestas a agente antimicrobiano de la muestra de control no expuesta. El método también puede comprender además identificar a partir de la concentración más baja del agente antimicrobiano en la que la cantidad o proporción de las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano que tiene la misma morfología celular de las células no expuestas al agente antimicrobiano, es igual o menor que la cantidad o proporción predeterminada (es decir, de las células en la muestra de control no expuesta medida por citometría de flujo acústica que presentan la morfología celular de las células no expuestas al agente antimicrobiano).
En un ejemplo de este tipo, las diferentes concentraciones del agente antimicrobiano comprenden una serie de diluciones 1:2 que varía de aproximadamente 2560 mg/ml a aproximadamente 2.5 mg/ml de dicho agente antimicrobiano.
Preferiblemente, se usa la misma densidad de inóculo normalizada de las células del microorganismo obtenido del sujeto para preparar el cultivo en división activa a partir del cual se produce la muestra de control no expuesta y el cultivo en división activa para exponer las células del microorganismo en división activa al agente antimicrobiano. Por ejemplo, se usa la misma densidad de inóculo normalizada de las células del microorganismo obtenido del sujeto para preparar el cultivo que se divide activamente a partir del cual se produce la muestra de control no expuesta y el cultivo en división activa para exponer las células en división activa del microorganismo a cada una de las diferentes concentraciones del agente antimicrobiano.
En un ejemplo, el método comprende preparar (i) una serie de al menos tres muestras de control no expuestas, y (ii) una serie de al menos tres muestras para células del microorganismo expuestas a cada concentración ensayada del agente antimicrobiano, y luego medir por citometría de flujo acústica la cantidad y morfología celular de las células en cada una de las al menos tres muestras de control no expuestas y en cada una de las tres muestras de células del microorganismo expuestas a cualquier concentración ensayada del agente antimicrobiano. Según este ejemplo, el método comprende además determinar a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica la concentración de ensayo mínima del agente antimicrobiano para la que dos o más de las al menos tres muestras expuestas al agente antimicrobiano comprenden una cantidad o proporción de células del microorganismo que tienen una morfología celular de células no expuestas a agente antimicrobiano en la muestra de control no expuesta, que es igual a o menor que una cantidad o proporción predeterminada de las células en cada una de las al menos tres muestras de control no expuestas medida por la citometría de flujo acústica, para presentar dicha morfología celular de células no expuestas a agente antimicrobiano.
En algunas realizaciones preferidas, el método comprende normalizar las mediciones de citometría de flujo acústica definiendo una selección de poblaciones racional de morfología celular no expuesta de las células del microorganismo en dispersión frontal de citometría de flujo acústica (FSC) y diagramas biaxiales de fluorescencia que delimitan los sucesos de citometría de flujo acústica correspondientes a todas las células en una muestra de control no expuesta que tienen una morfología celular de células de dicho microorganismo no expuestas a agente antimicrobiano, excluyendo sucesos agregados y coincidentes a un umbral de 10%. En algunos ejemplos preferidos, los datos recogidos del citómetro de flujo acústico de una muestra de control no expuesta a antimicrobianos se usan para definir la distribución de parámetros registrados para células antimicrobianas no afectadas. Por ejemplo, esto puede realizarse usando cualquier algoritmo de contorneado o agrupamiento para identificar la distribución de parámetros de la población no expuesta observada. Un umbral ideal para un algoritmo de contorneado o agrupamiento es una similitud de 10%.
Por ejemplo, el método puede comprender determinar a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica la concentración mínima del agente antimicrobiano para la que la cantidad o proporción de sucesos correspondientes a células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano que caen dentro de la selección de poblaciones racional de la morfología celular no expuesta, es igual o menor que una cantidad o proporción predeterminada de los sucesos correspondientes a todas las células en la muestra de control no expuesta que tienen una morfología celular de células de dicho microorganismo no expuestas a agente antimicrobiano, excluyendo sucesos agregados y coincidentes a un umbral del 10%.
Preferiblemente, la cantidad o proporción predeterminada de las células en la muestra de control no expuesta medida por citometría de flujo acústica para presentar la morfología celular de células no expuestas a agente antimicrobiano, se determina por referencia a concentraciones mínimas inhibidoras (MIC) conocidas del agente antimicrobiano para un panel de aislados conocidos del microorganismo. Por ejemplo, la cantidad predeterminada es la cantidad o proporción conocida de células en división activa del panel de aislados del microorganismo conocido que presentan la morfología celular de células del microorganismo no expuestas a agentes antimicrobianos a la MIC del agente antimicrobiano respecto al panel de los aislados conocidos.
En un ejemplo de este tipo, la cantidad predeterminada se ha determinado previamente realizando análisis de microscopía electrónica y/o citometría de flujo de la morfología celular de células en división activa del panel conocido de aislados a las concentraciones mínimas inhibidoras conocidas de dicho agente antimicrobiano respecto a dicho panel de los aislados conocidos.
Alternativamente, o además, el método puede comprender además medir o determinar la cantidad o proporción de células en división activa del panel de aislados conocidos del microorganismo que presentan la morfología celular de células del microorganismo no expuestas a agentes antimicrobianos a la MIC de dicho agente antimicrobiano respecto a dicho panel de los aislados conocidos. Opcionalmente, en donde la medición o determinación se realiza mediante análisis por microscopía electrónica y/o de citometría de flujo.
Preferiblemente, el panel de los aislados conocidos del microorganismo comprende al menos tres aislados conocidos diferentes, en donde se sabe que al menos uno de dichos aislados es sensible a dicho fármaco antimicrobiano, y en donde se sabe que uno de dichos aislados no es sensible (p. ej., resistente) al agente antimicrobiano, y en donde las concentraciones mínimas inhibitorias de los aislados en dicho panel que se sabe que son sensibles al agente antimicrobiano a lo largo del intervalo de concentraciones del agente antimicrobiano ensayadas con respecto a las células en división activa de dicho microorganismo obtenido del paciente. Preferiblemente, los al menos tres aislados conocidos representan aislados conocidos obtenidos de diferentes lugares geográficos.
En un ejemplo, el panel de los aislados conocidos comprende al menos aproximadamente 10 aislados diferentes del microorganismo conocidos, opcionalmente en donde esos aislados conocidos proceden de diferentes lugares geográficos. En un ejemplo de este tipo, el panel comprende al menos de aproximadamente 10 a aproximadamente al menos aproximadamente 50 aislados diferentes conocidos de dicho microorganismo obtenidos opcionalmente de diferentes lugares geográficos. En un ejemplo particular, el microorganismo obtenido del paciente es la bacteriaKlebsiella pneumoniae,y el panel de aislados conocidos de dicho microorganismo comprende los 48 aislados deKlebsiella pneumoniaeconocidos enumerados en la Tabla 1 y/o Tabla 2.
Todos los aislados bacterianos enumerados en las Tablas 1 y 2 se conocen en la técnica. Por ejemplo, el aislado ATCC 700603 es una cepa depositada previamente (en ATCC) deK. pneumoniaeESBL y puede emplearse en el método según cualquier aspecto de la invención descrita en el presente documento como control positivo. El aislado bacteriano ATCC bAa 1706 también era una cepa depositada previamente (en ATCC) deK. pneumoniaey se puede usar en el método según cualquier aspecto de la presente invención como una cepa de control de tipo natural deK. pneumoniae.El aislado ATCC BAA1705 también era una cepa depositada previamente (en ATCC) deK. pneumoniaeKPC y se sabe que produce carbapenemasa. Así pues, la tinción de ATCC BAA1705 puede usarse en el método de la presente invención como un aislado de control que produce carbapenemasas. El resto de las cepas deKlebsiellaenumeradas en las Tablas 1 y 2 se han descrito previamente p. ej., en Hall, J.M. et al. Molecular mechanisms of plactam resistance in carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae from Sri Lanka.J. Med. Microbiol.63, 1087-92 (2014) y Hall, J. M., Ingram, P. R., O'Reilly, L. C., e Inglis, T. J. J. Temporal flux in beta-lactam resistance among Klebsiella pneumoniae in Western Australia.J. Med. Microbiol.65, 429-437 (2016).
En un ejemplo, las MIC conocidas del agente antimicrobiano para el panel de aislados conocidos son concentraciones de punto de corte de sensibilidad clínica o MIC conocidas para el agente antimicrobiano determinadas o proporcionadas por una autoridad de ensayo de sensibilidad a los antimicrobianos reconocida internacionalmente tal como EUCAST o CLSI para dicho microorganismo. Alternativamente, o además, las MIC conocidas del agente antimicrobiano para el panel de los aislados conocidos del microorganismo, se han determinado previamente p. ej., mediante un ensayo de microdilución en caldo (BMD) y/o mediante un método de citometría de flujo. Alternativamente, o además, el método según cualquier aspecto amplio de la invención descrito en la presente memoria comprende medir las MIC del agente antimicrobiano respecto al panel de los aislados conocidos p. ej., realizando un ensayo de BMD y/o mediante un método de citometría de flujo.
Preferiblemente, la cantidad o proporción predeterminada de las células en la muestra de control no expuesta medida por citometría de flujo acústica para presentar dicha morfología celular de células no expuestas a agentes antimicrobianos, es de aproximadamente 1% a aproximadamente 50% de las células totales en la muestra de control no expuesta, más preferiblemente, aproximadamente 1% o aproximadamente 5% o aproximadamente 10% o aproximadamente 15% o aproximadamente 20% o aproximadamente 25% o aproximadamente 30% o aproximadamente 35% o aproximadamente 40% o aproximadamente 45% o aproximadamente 50% del total de las células en dicha muestra de control no expuesta.
En un ejemplo, la determinación cuantitativa de la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano midiendo a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica la concentración mínima inhibidora de dicho agente antimicrobiano al que es sensible el microorganismo, se logra en el plazo de aproximadamente 3 a 6 horas, preferiblemente en el plazo de aproximadamente 3 horas, desde el momento de obtener la muestra que comprende células del microorganismo del sujeto; y/o en el plazo de aproximadamente 3 a 6 horas, preferiblemente en el plazo de aproximadamente 3 horas, desde el momento de incubar primero las células del microorganismo de dicha muestra en el medio de cultivo para obtener el cultivo en división activa de dichas células de dicho microorganismo; y/o en el plazo de aproximadamente 1 a 6 horas, preferiblemente en el plazo de aproximadamente 3 horas, o en el plazo de aproximadamente 2 horas, o en el plazo de aproximadamente 1 hora, desde el momento de incubar primero la muestra obtenida del sujeto que comprende células del microorganismo en el medio de cultivo para obtener el cultivo en división activa de dichas células de dicho microorganismo.
En otro ejemplo, el método puede comprender además determinar la aparición de la firma asociada a la sensibilidad para uno o más de los aislados en el panel de los aislados conocidos, y medir por citometría de flujo acústica la cantidad o proporción de las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano que tienen una morfología celular de células no expuestas al agente antimicrobiano que no se parecen a las características morfológicas de la aparición de la firma asociada a la sensibilidad del uno o más aislados conocidos.
En algunos ejemplos preferidos, la etapa de medir por citometría de flujo acústica la morfología celular y la cantidad de células del microorganismo en la muestra de control no expuesta, puede comprender medir el tamaño celular (determinado por el volumen citoplasmático celular) y la cantidad de ácido nucleico celular en las células del microorganismo en la muestra de control no expuesta. En tales ejemplos preferidos, el método de la presente invención puede comprender además determinar a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica la concentración mínima del agente antimicrobiano para la que la cantidad o proporción de las células del microorganismo expuestas a dicho agente antimicrobiano tienen una morfología celular de células no expuestas a agente antimicrobiano en la muestra de control no expuesta, determinando o midiendo la cantidad o proporción de las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano que tienen la misma cantidad de ácido nucleico celular que en las células de la muestra de control no expuesta y/o no muestran un aumento en el tamaño celular determinado por el volumen citoplasmático celular con respecto a las células de la muestra de control no expuesta.
El método según la presente invención comprende además incubar en un medio de cultivo células del microorganismo de la muestra obtenida del sujeto y/o incubar en el medio de cultivo la muestra obtenida del sujeto en donde la muestra comprende las células del microorganismo, durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células se dividan activamente para obtener un cultivo en división activa de dichas células de dicho microorganismo. En estos ejemplos preferidos, el método comprende además marcar dichas células de dicho microorganismo en o de dicho cultivo en división activa con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico ausente antes de la exposición al agente antimicrobiano, para producir de ese modo una muestra de control no expuesta; y medir por citometría de flujo acústica la morfología celular y la cantidad de dichas células de dicho microorganismo en la muestra de control no expuesta.
Debe entenderse que en el método según el primer aspecto amplio de la presente invención, la muestra obtenida del sujeto es una muestra biológica que comprende células del microorganismo que infecta al sujeto o que se sospecha que infecta al sujeto.
En un ejemplo, la muestra es una muestra biológica seleccionada de una muestra de hisopo de garganta, una muestra de esputo, muestra de orina, muestra de sangre, una muestra de fluido articular, una muestra de fluido de diálisis peritoneal ambulatoria continua (CAPD), una muestra de hisopo bucal, una biopsia de tejido, una muestra de fluido de drenaje quirúrgico, una muestra de heces, una muestra de líquido cefalorraquídeo, muestra de líquido ascítico, muestra de líquido pleural, una muestra de sangre tal como muestra de plasma sanguíneo y/o suero sanguíneo, un hisopo de herida o muestra de moco de herida, una muestra de hisopo nasal, una muestra de hisopo rectal, una muestra de hisopo uretral, una muestra de piel o muestra de hisopo de piel, una muestra de hisopo genital, muestra de pus, muestra de saliva, muestra de legaña, muestra de fluido seroso, muestra de secreción vaginal, muestra de vómito, sudor, lágrimas, muestra de moco, muestra de fluido pericárdico, muestra de líquido peritoneal, muestra de sebo, muestra de unto sebáceo, muestra de jugo gástrico, una muestra de bilis, muestra de quilo, muestra de quimo, muestra de fluido endolinfa y/o perilinfa, muestra de fluido linfático, muestra de fluido intersticial, leche materna, muestra de hisopo de campo quirúrgico perioperatorio, cualquier muestra o hisopo tomado para determinar la presencia de un organismo multirresistente a fármacos y cualquier combinación de los mismos. Alternativamente o además, la muestra es una muestra de alimento tal como la que permite el seguimiento de la resistencia a antimicrobianos en alimentos tanto sin cocinar como cocinados o listos para comer con los que el sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo, puede haber estado en contacto.
En realizaciones preferidas del método según el primer aspecto amplio de la presente invención, el medio de cultivo es un medio de cultivo que soporta el crecimiento y replicación del microorganismo para producir de ese modo el cultivo celular en división activa de dichos microorganismos. Preferiblemente, el medio de cultivo es estéril y/o exento de contaminantes microbianos antes de la inoculación en el medio de cultivo de las células del microorganismo obtenido del sujeto. También preferiblemente, el medio de cultivo es capaz de soportar el crecimiento y replicación de bacterias Gram positivas y Gram negativas.
En un ejemplo, el medio de cultivo es un medio estéril y/o de cultivo seleccionado de caldo Mueller-Hinton (MHB), caldo de infusión de cerebro corazón (BHIB), caldo de lisogenia, caldo nutriente, medio Oxoid Iso-Sensitest y caldo con tripticasa de soja.
Un medio de cultivo de MBH adecuado puede comprender aproximadamente 300.0 g de extracto de carne bovina (a partir de infusión deshidratada), aproximadamente 17.5 g de hidrolizado de caseína y aproximadamente 1.5 g de almidón, p. ej., reconstituido en aproximadamente 1 l de agua, p. ej., y el pH puede ajustarse a aproximadamente pH 7.3 ± 0.1 medido a aproximadamente 25°C.
Un medio de cultivo BHIB adecuado puede comprender aproximadamente 12.5 g de sólidos de infusión de cerebro, aproximadamente 5.0 g de sólidos de infusión de corazón bovino, aproximadamente 10.0 g de proteosa peptona, aproximadamente 2.0 g de glucosa, aproximadamente 5.0 g de cloruro de sodio, aproximadamente 2.5 g de fosfato disódico, p. ej., reconstituido en aproximadamente 1 l de agua, y el pH puede ajustarse a aproximadamente pH 7.4 ± 0.2 medido a aproximadamente 25°C.
Un medio de cultivo de caldo de lisogenia adecuado puede comprender aproximadamente 10 g de peptona tal como peptona 140, aproximadamente 5 g de extracto de levadura, aproximadamente 5 g de cloruro sódico, y reconstituido en aproximadamente 1 l de agua.
Un medio de cultivo de caldo nutriente adecuado puede comprender aproximadamente 1.0 g de polvo de extracto de carne “Lab-Lemco” (p. ej., Thermo Scientific; Oxoid Limited), aproximadamente 2.0 g de extracto de levadura, aproximadamente 5.0 g de peptona, aproximadamente 5.0 g de cloruro sódico, y puede reconstituirse en aproximadamente 1 l de agua, y el pH puede ajustarse a aproximadamente pH 7.4 ± 0.2 medido, p. ej., a aproximadamente 25°C.
Un medio de cultivo de medio Oxoid Iso-Sensitest adecuado puede comprender aproximadamente 11 g de caseína hidrolizada, aproximadamente 3.0 g de peptonas, aproximadamente 2.0 g de glucosa, aproximadamente 3.0 g de cloruro sódico, aproximadamente 1.0 g de almidón soluble, aproximadamente 2.0 g de hidrogenofosfato disódico, aproximadamente 1.0 g de acetato sódico, aproximadamente 0.2 g de glicerofosfato de magnesio, aproximadamente 0.1 g de gluconato cálcico, aproximadamente 0.001 de sulfato cobaltoso, aproximadamente 0.001 de sulfato cúprico, aproximadamente 0.001 de sulfato de cinc, aproximadamente 0.001 g de sulfato ferroso, aproximadamente 0.002 de cloruro manganoso, aproximadamente 0.001 g de menadiona, aproximadamente 0.001 g de cianocobalamina, aproximadamente 0.02 g de hidrocloruro de L-cisteína, aproximadamente 0.02 g de L-triptófano, aproximadamente 0.003 g de piridoxina, aproximadamente 0.003 g de pantotenato, aproximadamente 0.003 g de nicotinamida, aproximadamente 0.0003 g de biotina, aproximadamente 0.00004 g de tiamina, aproximadamente 0.01 g de adenina, aproximadamente 0.01 g de guanina, aproximadamente 0.01 g de xantina, aproximadamente 0.01 g de uracilo, y se puede reconstituir, p. ej., en aproximadamente 1 l de agua, y el pH se puede ajustar a, p. ej., aproximadamente pH 7.4 ± 0.2 medido a aproximadamente 25°C.
Un medio de cultivo de caldo de tripticasa de soja adecuado puede comprender aproximadamente 17 g de triptona (p. ej., de digerido pancreático de caseína), aproximadamente 3.0 g de Soytone (p. ej., de digerido péptico de soja), aproximadamente 2.5 g de glucosa (p. ej., dextrosa), aproximadamente 5.0 g de cloruro de sodio, aproximadamente 2.5 g de fosfato dipotásico, p. ej., reconstituido en aproximadamente 1 l de agua.
En un ejemplo preferido, el método según este primer aspecto amplio, comprende incubar en el medio de cultivo las células del microorganismo en y/o de la muestra del sujeto durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células se dividan activamente, preferiblemente, durante un tiempo y en condiciones suficientes para que ocurran de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 divisiones celulares, y más preferiblemente durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células experimenten de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 divisiones celulares. Por ejemplo, el microorganismo puede ser una bacteria y el método puede comprender incubar células del microorganismo en y/o de la muestra del sujeto en un medio de cultivo durante un período de al menos aproximadamente 20 minutos a al menos aproximadamente 3 horas, preferiblemente durante aproximadamente 20 minutos o aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 40 minutos o aproximadamente 50 minutos o aproximadamente 60 minutos o aproximadamente 70 minutos o aproximadamente 80 minutos o aproximadamente 90 minutos o aproximadamente 100 minutos o aproximadamente 110 minutos o aproximadamente 120 minutos o aproximadamente 130 minutos, o aproximadamente 140 minutos, o aproximadamente 150 minutos, o aproximadamente 160 minutos, o aproximadamente 170 minutos, o aproximadamente 180 minutos, o aproximadamente 190 minutos, o aproximadamente 200 minutos, o aproximadamente 210 minutos, o aproximadamente 220 minutos, o aproximadamente 230 minutos, o aproximadamente 240 minutos, y más preferiblemente, aproximadamente 30 minutos, o aproximadamente 1 hora o aproximadamente 1.5 horas. Alternativamente o además, el método comprende incubar las células del microorganismo en y/o de la muestra del sujeto en el medio de cultivo en condiciones de temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 42°C, preferiblemente aproximadamente 37°C y con o sin aireación.
En otro ejemplo, el método de acuerdo con este primer aspecto amplio comprende incubar células del microorganismo en presencia del agente antimicrobiano durante aproximadamente 20 min a aproximadamente 3 horas. Por ejemplo, el microorganismo puede ser una bacteria y el método puede comprender incubar células del microorganismo en presencia del agente antimicrobiano durante un período de al menos aproximadamente 20 minutos a al menos aproximadamente 3 horas, preferiblemente durante aproximadamente 20 minutos o aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 40 minutos o aproximadamente 50 minutos o aproximadamente 60 minutos o aproximadamente 70 minutos o aproximadamente 80 minutos o aproximadamente 90 minutos o aproximadamente 100 minutos o aproximadamente 110 minutos o aproximadamente 120 minutos o aproximadamente 130 minutos, o aproximadamente 140 minutos, o aproximadamente 150 minutos, o aproximadamente 160 minutos, o aproximadamente 170 minutos, o aproximadamente 180 minutos, o aproximadamente 190 minutos, o aproximadamente 200 minutos, o aproximadamente 210 minutos, o aproximadamente 220 minutos, o aproximadamente 230 minutos, o aproximadamente 240 minutos, y más preferiblemente, preferiblemente aproximadamente 30 minutos, o aproximadamente 1 hora o aproximadamente 1.5 horas. Alternativamente o además, el método puede comprender incubar las células del microorganismo en presencia del agente antimicrobiano en condiciones de temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 42°C, preferiblemente aproximadamente 37°C y con o sin aireación.
En un ejemplo, el método comprende exponer las células en división activa del microorganismo a un intervalo de diferentes concentraciones del agente antimicrobiano tales como 0 mg/l, 0.25 mg/l, 1 mg/l, 2 mg/l, 4 mg/l y 16 mg/l. Alternativamente, o además, el intervalo de diferentes concentraciones del agente antimicrobiano puede comprender una serie de diluciones 1:2 que van de aproximadamente 2560 mg/ml a aproximadamente 2.5 mg/ml de dicho agente antimicrobiano.
En otro ejemplo, el método comprende exponer las células del microorganismo en división activa a una variedad de diferentes agentes antimicrobianos.
En otro ejemplo, el método comprende exponer las células del microorganismo en división activa a una variedad de diferentes agentes antimicrobianos.
Preferiblemente, en el método según el primer aspecto amplio de la presente invención descrito anteriormente y según cualquier aspecto posterior de la invención descrita en el presente documento, el microorganismo unicelular o multicelular se selecciona de una bacteria, un hongo o una levadura.
En un ejemplo preferido, el microorganismo es un microorganismo unicelular tal como una bacteria. Por ejemplo, las bacterias pueden ser bacterias Gram negativas o Gram positivas. Las bacterias pueden ser anaerobias o anaerobias o anaerobias facultativas o aerobias facultativas o aerobias obligadas o anaerobias obligadas y/o pueden ser cualquier bacteria patógena o no patógena.
En un ejemplo, la bacteria se selecciona de bacterias que pertenecen a uno o más de los siguientes grupos, géneros y/o especies bacterianas:Enterobacter,Enterobacteriaceae,Campylobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Acinetobacter, Burkholderia, Clostridium, Stenotrophomonas, Serratia, Haemophilus, Neisseria, Burkholderia, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Bacillus, Bacteroides, Listeria, Mycobacterium, Salmonella, Brucella, Bordetella, Borrelia, Nocardia, Francisella, Legionella, Yersinia, Leptospira, Borrelia, Shigella, Shewanella, Campylobacter, Chlamydia, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Haemophilus, Helicobacter, Leptospira, Mycoplasma, Rickettsia, TreponemayVibrio.
Por ejemplo, las bacterias se seleccionan de una cualquiera o más de las siguientes: Acinetobacter baumanii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia cepacia, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia thailandesis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena, E. coli (O157:H7), Francisella tularensis, Haemophilus influenza, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Legionella longbeachae, Leptospira interrogans, Leptospira Santarosai, Listeria monocytogenes, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsiae, Salmonella enterica var. Typhi, Salmonella enterica var. Typhimurium, Serratia marcescens, Shewanella oneidensis, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Shigella boydii, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus, Stenotrophomonas maltophila, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus anginosus-constellatus intermedius, Streptococcus mitis, Vibrio cholera, Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia pestis.
En un ejemplo, las bacterias pertenecen a especies incluidas en lasEnterobacteriaceae,tales como especiesKlebsiella,o a otros grupos de bacterias incluyendo las especiesPseudomonaso las especiesAcinetobacter
Por ejemplo, las bacterias son una cepa deKlebsiella pneumoniaeoPseudomonas aeruginosa.
En otro ejemplo preferido, el microorganismo es una levadura. Por ejemplo, la levadura se selecciona de una levadura que pertenece a una o más de las siguientes especies de levadura:Candida, SaccharomycesyCryptococcus.
Por ejemplo, la levadura se selecciona de uno cualquiera o más de los siguientes: Candida albicans, Candida krusei, Candida tropica, Torulopsis glabrata, Cryptococcus neoformans.
En otro ejemplo preferido, el microorganismo es un hongo. Por ejemplo, el hongo se selecciona de uno o más de los siguientes géneros o especies:Aspergillus, Candida, Histoplasma, Pneumocystis,yStachybotrys.
Por ejemplo, el hongo se selecciona de uno cualquiera o más de los siguientes: Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum, Pneumocystis jirovecii (también conocido como Pneumocystis carinii) y Stachybotrys chartarum.
Preferiblemente, en el método según el primer aspecto amplio de la presente invención descrito anteriormente y según cualquier aspecto posterior de la invención descrita en el presente documento, el agente antimicrobiano es o comprende un agente antibacteriano y/o agente antifúngico y/o agente antilevadura. El agente antimicrobiano puede tener efecto biostático y/o microbicida sobre los microorganismos unicelulares y/o multicelulares de la presente invención. Por consiguiente, el agente antimicrobiano según cualquier aspecto, realización y ejemplo descrito en el presente documento puede inhibir el crecimiento y/o matar células del microorganismo en división activa ensayado en el método de la presente invención. En un ejemplo, el agente antimicrobiano puede ser cualquier compuesto tal como un compuesto químico o una composición farmacéutica tal como un fármaco. En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es una composición que comprende un compuesto tal como un compuesto químico o un producto farmacéutico o un fármaco. En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano puede ser una composición que comprende dos o más compuestos tales como compuestos químicos, productos farmacéuticos y/o fármacos. De manera similar, el agente antimicrobiano puede ser sintético y/o químicamente producido y/o natural y/o derivado, ya sea directa o indirectamente de un organismo o una planta o un animal. En otro ejemplo, el agente antimicrobiano puede comprender o consistir en un fenómeno físico y/o químico o estrés aplicado a las células de los microorganismos descritos según un aspecto amplio, de realización de ejemplo del presente documento. Según este ejemplo, el agente antimicrobiano puede comprender o consistir en uno o más fenómenos físicos y/o químicos o estrés aplicado a células de un microorganismo en división activa seleccionados de estrés térmico, luz ultravioleta, luz azul, radiación tal como radiación electromagnética, radiación de microondas, radiación con rayos X o rayos gamma, radiación de partículas tal como radiación de partículas alfa, beta o de neuronas y/o estrés oxidativo. Preferiblemente, el agente antimicrobiano es o comprende un agente antibacteriano tal como un agente bactericida y/o un agente bacteriostático.
Por ejemplo, el agente antimicrobiano puede ser o comprender uno cualquiera de más de los siguientes: aminoácidos o derivados de aminoácidos, ácidos grasos o derivados de ácidos grasos, péptidos o derivados de péptidos antimicrobianos, aminoglucósidos, ácidos aureólicos, aziridinas, bencenoides, bencimidazoles, cumarina-glicósidos, derivados de éter difenílico, epipolitiodioxopiperazinas, glucosaminas, glicopéptidos, imidazoles, derivados de indol, macrolactama, macrólidos, nucleósidos, beta-lactamas tales como penicilinas, cefalosporinas, monobactámicos y/o carbapenems, peptidil nucleósidos, fenicoles, polienos, piridinas y pirimidinas, quinolonas y fluoroquinolonas, estatinas, esteroides, sulfonamidas, taxoides, tetraciclinas, aleaciones metálicas tales como aleaciones de cobre.
En un ejemplo particularmente preferido, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico. Por ejemplo, el antibiótico es un antibiótico antibacteriano y/o antifúngico y/o antilevadura.
En un ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico betalactámico tal como penicilinas, cefalosporinas, monobactámicos y/o carbapenems.
Por ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico de penicilina seleccionado de uno o más de penicilina G tal como sal de potasio de penicilina G o sal de sodio de penicilina G, ampicilina tal como ampicilina anhidra, ampicilina trihidrato y/o sal de sodio de ampicilina, amoxicilina, ticarcilina piperacilina, ácido (+)-6-aminopenicilánico (6-APA), azlocilina tal como sal de sodio de azlocilina, carbenicilina tal como sal disódica de carbenicilina, cloxacilina tal como sal de sodio de cloxacilina (p. ej., monohidrato de sal de sodio de cloxacilina), dicloxacilina tal como sal de sodio de dicloxacilina monohidrato, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina tal como sal de sodio de nafcilina monohidrato, oxacilina tal como sal de sodio de oxacilina, D-penicilamina, penicilina V tal como sal de potasio de penicilina V, ácido fenoximetilpenicilínico tal como sal potásica de ácido fenoximetilpenicilínico, piperacilina tal como sal sódica de piperacilina, temocilina y ticarcilina tal como sal disódica de ticarcilina. Cada una de estas penicilinas está disponible comercialmente p. ej., de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano que es o comprende un antibiótico de penicilina proporciona un efecto antimicrobiano tal como un efecto antibacteriano en las células del microorganismo en división activa (p. ej., bacterias) alterando la síntesis de la capa de peptidoglicano de las paredes celulares del microorganismo.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico seleccionado de uno o más de cefalotina, cefalexina, cefaclor, cefixima tal como cefixima trihidrato, cefmetazol tal como sal sódica de cefmetazol, cefoperazona tal como sal sódica de cefoperazona, sal sódica, cefotaxima tal como sal sódica de cefotaxima, cefuroxima, cefprozil, cefoxitina, ceftriaxona, ceftazidima, cefpodoxima, cefepima, ácido 7-aminocefalosporánico (7-ACA), ácido 7-aminodesacetoxicefalosporánico (7-ADCA), cefotiam tal como dihidrocloruro de cefotiam hidrato, ceftazidima tal como ceftazidima hidrato, cefsulodina tal como sal sódica de cefsulodina hidrato, ceftibuten tal como ceftibuten hidrato, ceftriaxona tal como sal disódica de ceftriaxona hemi(heptahidrato), cefexina tal como cefexina hidrato, cefalomanina, cefalotina tal como cefalotina como sal sódica, cefradina, imipenem, p. ej., imipenem monohidrato, moxalactama tal como sal sódica de moxalactama, y sal sódica de tazobactam. Cada una de estas cefalosporinas está disponible comercialmente p. ej., de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico de primera generación seleccionado de: cefadroxilo, cefazolina, cefalotina o cefalotín y cefalexina.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico de segunda generación seleccionado de: cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil y cefuroxima.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico de tercera generación seleccionado de: cefixima, cefdinir, cefditoren, cefotaxima, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftibuten, ceftizoxima y ceftriaxona.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico de cuarta generación tal como cefepima.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico de quinta generación tal como ceftarolina fosamil y/o ceftobiprolel.
En un ejemplo, según cualquier ejemplo o realización o aspecto descrito en el presente documento que implica un agente antimicrobiano que es o comprende una o más cefalosporinas (ya sea antibiótico cefalosporínico de primera, segunda, tercera, cuarta y/o quinta generación), el agente antimicrobiano proporciona un efecto antimicrobiano tal como un efecto antibacteriano en células del microorganismo en división activa (p. ej., bacterias) alterando la síntesis de la capa de peptidoglicano de las paredes celulares del microorganismo.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico monobactámico tal como aztreonam, que está disponible comercialmente p. ej., de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano que comprende un antibiótico monobactámico tal como aztreonam proporciona un efecto antimicrobiano tal como un efecto antibacteriano en células del microorganismo en división activa (p. ej., bacterias) alterando la síntesis de la capa de peptidoglicano de las paredes celulares del microorganismo.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico carbapenémico seleccionado de uno o más de imipenem o cilastatina, meropenem, ertapenem y doripenem. Cada uno de estos antibióticos carbapenémicos de ejemplo está disponible comercialmente p. ej., de Sigma-Aldrich. En un ejemplo, el agente antimicrobiano que es o comprende un antibiótico carbapenémico proporciona efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano por inhibición de la síntesis celular en células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un aminoácido o derivado de aminoácido. Por ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un derivado de aminoácido seleccionado de uno o más de: ácido L-alanil-L-1-aminoetilfosfónico, azaserina (O-diazoacetil-L-serina), hidrocloruro de bestatina (hidrocloruro de N-[(2S,3R)-3-amino-2-hidroxi-4-fenilbutiril]-L-leucina), D-cicloserina [(R)-4-amino-3-isoxazolidona, 4-amino-3-isoxazolidina], y 6-diazo-5-oxo-L-norleucina [ácido (S)-2-Amino-6-diazo-5-oxocaproico, o DON]. Cada uno de estos aminoácidos o derivados está disponible comercialmente p. ej., de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un aminoglucósido. Por ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un aminoglucósido seleccionado de uno o más de: gentamicina, tobramicina, amikacina, daunorubicina tal como hidrocloruro, sesquisulfato de dihidroestreptomicina, antibiótico G418 tal como sal de disulfato<de antibiótico G418 (C20H40N4O10 ■>2<H2SO4) (p. ej., Sigma-Aldrich), gentamicina, higromicina B (p. ej., de polvo>liofilizado deStreptomyces hygroscopicus)(p. ej., Sigma-Aldrich), kanamicina, neomicina tal como hidrato de sal de trisulfato de neomicina, netilmicina tal como sal de sulfato de netilmicina, paromomicina tal como sal de sulfato de paromomicina, ribostamicina tal como sal de sulfato de ribostamicina, sisomicina tal como sal de sulfato de sisomicina, espectinomicina tal como dihidrocloruro de espectinomicina pentahidrato, estreptomicina tal como sal de sulfato de estreptomicina, y antibiótico aminoglucósido de tobramicina tal como sal de sulfato de tobramicina (antibiótico aminoglucósido), paromomicina, cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej., de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico aminoglucósido seleccionado de: amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, tobramicina, estreptomicina y espectinomicina.
En un ejemplo, el agente antimicrobiano que es o comprende un aminoglucósido proporciona efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano por unión a la subunidad ribosómica 30S microbiana (p. ej., bacteriana) y/o la subunidad 50S, inhibiendo de ese modo la translocación del peptidil-ARNt desde el sitio A al sitio P y/o provocando una lectura errónea del ARNm, dejando las células de microorganismos (p. ej., células bacterianas) incapaces de sintetizar proteínas vitales para su crecimiento.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico de ansamicina seleccionado de: geldanamicina, herbimicina y rifaximina.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un macrólido. Por ejemplo, el macrólido es o comprende un compuesto seleccionado de: anhidroeritromicina A (también conocida como anhídrido de eritromicina), apoptolidina A, azitromicina, dafilomicina A1 p. ej. deStreptomyces griseus,bafilomicina B1 p. ej. deStreptomyces sp.,borrelidina p. ej. deStreptomyces sp.(tal comoStreptomyces parvulus),claritromicina, clindamicina tal como el antibiótico lincosamida hidrocloruro de clindamicina o el antibiótico aminoglucósido clindamicina 2-fosfato, concanamicina A p. ej. deStreptomyces sp.,diritromicina, diritromicina, eritromicina tal como estolato de eritromicina o succinato de etilo y eritromicina o estearato de eritromicina, complejo de filipina, p. ej. deStreptomyces filipinensis,Josamicina, lincomicina tal como hidrocloruro de lincomicina, mepartricina, nonactina p. ej. deStreptomyces sp.,(tal comoStreptomyces griseus),oligomicina p. ej. deStreptomyces diastatochromogenes,oligomicina A, pimaricina p. ej. deStreptomyces chattanoogenis,rapamicina p. ej. deStreptomyces hygroscopicustal como sal sódica de rapamicina, rifapentina, rifaximina, roxitromicina, espiramicina p. ej. deStreptomycessp. tales como adipato de espiramicina, tiamulina, telitromicina, troleandomicina, tilosina tal como tartrato de tilosina, virginiamicina S1 (también conocida como antibiótico 899 o estafilomicina S), y virginiamicina M1 (también conocida como mikamicina A o estafilomicina). Cada uno de estos macrólidos está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
Por ejemplo, el macrólido es o comprende un compuesto seleccionado de: azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, teitromicina, espiramicina.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano que es o comprende uno o más macrólidos, proporciona efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano por inhibición de la biosíntesis de proteínas microbianas (p. ej., bacterianas) uniéndose reversiblemente a la subunidad 50S del ribosoma microbiano, inhibiendo de ese modo la translocación de peptil-ARNt.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico de tetraciclina tal como una tetraciclina seleccionada de uno cualquiera o más de: clortetraciclina tal como hidrocloruro de clortetraciclina, demeclociclina tal como hidrocloruro de demeclociclina, doxorubicina tal como hidrocloruro de doxorubicina, doxiciclina tal como hiclato de doxiciclina, duramicina p. ej. deStreptoverticilium cinnamoneus,meclociclina tal como sal de sulfosalicilato de meclociclina, minociclina tal como hidrocloruro de minociclina, oxitetraciclina tal como oxitetraciclina deshidrato o hidrocloruro de oxitetraciclina, y tetraciclina tal como hidrocloruro de tetraciclina. Cada una de estas tetraciclinas está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano que es o comprende un antibiótico de tetraciclina proporciona efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano por inhibición de la unión de aminoacil-ARNt microbiano al complejo de ARNm-ribosoma p. ej. en las células del microorganismo en división activa, por ejemplo, mediante la unión a la subunidad ribosómica 30S en el complejo de traducción del ARNm de las células microbianas.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico polimixina tal como polimixina B y/o colistina, cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende una lincosamida tal como clindamicina y/o lincomicina, cada una de las cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich. Por ejemplo, el agente antimicrobiano que es o comprende la(s) lincosamida(s) proporciona un efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano por unión a la subunidad 50S microbiana (p. ej., bacteriana) del ARN ribosómico, inhibiendo de este modo la síntesis de proteínas en las células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un nitrofurano tal como furazolidona y/o nitrofurantoína, cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende una oxazolidinona tal como linezolid (p. ej., Sigma-Aldrich) y/o posizolid (p. ej., Sigma-Aldrich) y/o radezolid y/o torezolid.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano que es o comprende una oxazolidinona proporciona efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano por inhibición de la iniciación proteica de la síntesis de proteínas, p. ej. en células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un péptido o polipéptido o derivado peptídico o derivado polipeptídico. Por ejemplo, el péptido o derivado peptídico se selecciona de uno o más de: actinomicina (actinomicina C1), actinonina, hidrocloruro de amastatina hidrato, 7-aminoactinomicina D (7-AAD), antimicina A (p. ej., deStreptomyces<sp.), antimicina A>2<, antipaína tal como dihidrocloruro de antipaína, bacitracina tal como sal de cinc de>bacitracina (p. ej., deBacillus licheniformis),bactenecina, BD-3 recombinante humana (p. ej., Sigma-Aldrich), Beta D-4 recombinante humana (p. ej., Sigma-Aldrich), carbenicilina tal como sal disódica de carbenicilina, cecropina A, cecropina B, cecropina P1 porcina, cinamicina p. ej. deStreptomyces cinnamoneus,colistina tal como sal de sulfato o metanosulfonato de colistina de sodio, ciclosporina A, p. ej. detolypocladium inflatum,p-defensina 1 humana (p. ej., Sigma-Aldrich), p-defensina 2 humana recombinante (p. ej., Sigma-Aldrich), defensina HNP-1 humana (p. ej., Sigma-Aldrich), defensina HNP-2 humana (p. ej., Sigma-Aldrich), elafina humana (p. ej., recombinante, expresada enSaccharomyces cerevisiae)(p. ej., Sigma-Aldrich), fengicina (p. ej., Sigma-Aldrich), polipéptido de gramicidina, p. ej. deBacillus aneurinolyticustal como polipéptido de gramicidina A o polipéptido de gramicidina C, kendomicina p. ej. deStreptomyces violaceoruber,lactoferricina B (sal de trifluoroacetato del fragmento 4-14) (p. ej., Sigma-Aldrich), sal de trifluoroacetato de LL-37 (humano) (p. ej., Sigma-Aldrich), lisostafina p. ej. deStaphylococcus staphylolyticus,magainina I, magainina II, melitina p. ej. de veneno de abeja melífera, micosubtilina, nisina, p. ej. deLactococcus lactis,NP-1 humano recombinante (p. ej., Sigma-Aldrich), pediocina p. ej. dePediococcus acidilactici,PGLa, polimixina B, surfactina p. ej. de Bacillus subtilis, tiostreptona p. ej.Streptomyces azureus,y valinomicina. Todos los péptidos o derivados peptídicos mencionados anteriormente están disponibles comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano es o comprende el polipéptido bacitracina. Por ejemplo, dicho agente antimicrobiano proporciona actividad antimicrobiana tal como actividad antibacteriana por inhibición del pirofosfato de isoprenilo microbiano (una molécula que porta las unidades estructurales del peptidoglicano microbiano p. ej. pared celular bacteriana fuera de la membrana interna de las células) tal como en células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano es o comprende el polipéptido colistina o el polipéptido polimixina B. Por ejemplo, dicho agente antimicrobiano proporciona actividad antimicrobiana tal como actividad antibacteriana por interacción con una membrana externa bacteriana Gram negativa y membrana citoplasmática, y desplazando contraiones bacterianos, desestabilizando de este modo la membrana externa bacteriana. Alternativamente, o además, dicho agente antimicrobiano puede funcionar como un detergente contra la membrana citoplasmática p. ej. de la célula del microorganismo en división activa alterando de este modo su permeabilidad celular.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un glicopéptido. Por ejemplo, el glicopéptido se selecciona de uno o más de: vancomicina, teicoplanina, bleomicina tal como sulfato de bleomicina p. ej. deStreptomyces verticillus,fleomicina p. ej. deStreptomyces verticillus,ramoplanina, ristomicina p. ej. monosulfato de ristomicina, vancomicina tal como hidrocloruro de vancomicina p. ej. deStreptomyces orientalis,telavancina, dalbavancina y oritavancina. Todos los glicopéptidos mencionados anteriormente están disponibles comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich. En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano es o comprende un glicopéptido seleccionado de teicoplanina, vancomicina, telavancina, dalbavancina y/u oritavancina. Por ejemplo, el agente antimicrobiano que es o comprende un glicopéptido proporciona efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano por unión al microbio (p. ej., bacteriano) inhibe la síntesis de peptidoglicanos p. ej. de células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un nucleósido. Por ejemplo, el nucleósido se selecciona de: adenina 9-p-D-arabinofuranósido, 5-azacitidina, hidrocloruro de blasticidina S, cordicepina p. ej. deCordyceps militaris,análogo de nucleósido de 5-fluorocitosina, formicina A p. ej. deStreptomyces kaniharaensis,ganciclovir, ribavirina [1 -p-D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-3-carboxamida], sangivamicina tal como hidrato de sangivamicina p. ej. deStreptomyces rimosus,sinefungina [5'-desoxi-5'-(1,4-diamino-4-carboxibutil)adenosina], tubercidina p. ej. deStreptomyces tuberculidicus,<tunicamicina, p. ej. de Streptomyces sp., y homólogo de tunicamicina C>2<. Cada uno de>los nucleósidos mencionados anteriormente está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de fenicol. Por ejemplo, el compuesto de fenicol se selecciona de: cloranfenicol tal como sal sódica del succinato de cloranfenicol y/o tianfenicol [D-treo-2,2-dicloro-N-(p-hidroxi-a-[hidroximetil]-4-[metilsulfonil]fenetil)acetamida], cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de polieno. Por ejemplo, el compuesto de polieno se selecciona de: anfotericina B p. ej. deStreptomycessp., kirromicina (también conocida como antibiótico Myc-8003 o mocimicina) p. ej. deStreptomyces collinus,y nistatina (también conocida como fungicidina o micostatina), cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de poliéter. Por ejemplo, el compuesto de poliéter se selecciona de: monensina (también conocida como monensina A) tal como sal sódica de monensina o hidrato de sal sódica de monensina, nigericina (también conocida como antibiótico K178, antibiótico X464, azalomicina M, helexina C, polieterina A) tal como sal sódica de nigericina y salinomicina p. ej. deStreptomyces albus,cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de piridinas y/o pirimidinas. Por ejemplo, el compuesto de piridinas y/o pirimidina se selecciona de: ácido fusárico [ácido 5-butilpiridin-2-carboxílico] p. ej. deGiberella fujikuroi,isoniacida [hidrazida del ácido 4-piridincarboxílico], protionamida [2-propil-4-piridincarbotioamida], tioconazol [1 -[2-[(2-cloro-3-tienil)metoxi]-2-(2,4-diclorofenil)etil]-1 H-imidazol], trimetoprim [2,4-diamino-5-(3,4,5-trimetoxibencil)pirimidina], tal como la sal de lactato de trimetoprim. Cada uno de estos compuestos de piridinas y/o pirimidina ejemplificados está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de quinolona y/o un compuesto de fluoroquinolona. Por ejemplo, el compuesto de quinolona y/o un compuesto de fluoroquinolona se selecciona/seleccionan de: cinoxacina [ácido 1-etil-1,4-dihidro-4-oxo-[1,3]dioxolo[4,5-g]cinolina-3-carboxílico], ciprofloxacina [ácido 1-ciclopropil-6-fluoro-4-oxo-7-(piperazin-1-il)-1,4-dihidroquinolina-3-carboxílico], hidrocloruro de difloxacina [hidrocloruro del ácido 6-fluoro-1-(4-fluorofenil)-1,4-dihidro-7-(4-metilpiperazino)-4-oxo-3-quinolincarboxílico], enoxacina, enrofloxacina (también conocida como baytril), flumequina, 8-hidroxiquinolina, nadifloxacina [ácido 9-fluoro-6,7-dihidro-8-(4-hidroxi-1 -piperidinil)-5-metil-1 -oxo-1 H,5H-benzo[ij]quinolizina-2-carboxílico], ácido nalidíxico [ácido 4-dihidro-1-etil-7-metil-1,8-naftiridin-4-ona-3-carboxílico] tal como sal sódica del ácido nalidíxico, antibiótico de fluoroquinolona ofloxacino (también conocido como antibiótico de fluoroquinolona), antibiótico de quinolona ácido oxolínico (también conocido como antibiótico de quinolona) [ácido 5,8-dihidro-5-etil-8-oxo-1,3-dioxolo[4,5-g]quinolina-7-carboxílico], mesilato de pefloxacino deshidrato [ácido 3-quinolinacarboxílico, 1-etil-6-fluoro-1,4-dihidro-7-(4-metil-1-piperazinil)-4-oxo-, monometanosulfonato], ácido pipemídico [ácido 8-etil-5,8-dihidro-5-oxo-2-(1-piperazinil)pirido(2,3-d)pirimidina-6-carboxílico], 8-quinolinol [8-hidroxiquinolina] tal como sal de hemisulfato de 8-quinolinol, levofloxacino, gatifloxacino, gemifloxacino, lomefloxacino, moxifloxacino, ácido nalidíxico y norfloxacina. Cada una de estas quinolonas y fluoroquinolonas ilustradas está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano que es o comprende un compuesto de quinolona y/o un compuesto de fluoroquinolona proporciona efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano por inhibición de la enzima ADN girasa y/o topoisomerasa IV microbianas (p. ej., bacterianas), inhibiendo de este modo la replicación y transcripción del ADN p. ej. en células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de sulfonamida. Por ejemplo, el compuesto de sulfonamida se selecciona de: succinilsulfatiazol, sulfabenzamida [N-(4-aminobencenosulfonil)benzamida], sulfacetamida [N-(4-aminobencenosulfonil)acetamida] tal como sal sódica de sulfacetamida monohidrato, sulfadiazina [4-amino-N-(2-pirimidinil)bencenosulfonamida], sulfadimetoxina [4-amino-N-(2,6-dimetoxi-4-pirimidinil)bencenosulfonamida], sulfadoxina [4-amino-N-(5,6-dimetoxi-4-pirimidinil)bencenosulfonamida], sulfadiazina de plata, sulfaguanidina [-amino-N-(aminoiminometil)bencenosulfonamida], sulfameter [5-metoxisulfadiazina], sulfametazina [4,6-dimetilsulfadiazina], sulfamonometoxina [4-metoxi-6-sulfanilamidopirimidina], sulfanilamida [paminobencenosulfonamida], sulfaquinoxalina p. ej. como sal sódica, sulfasalazina [ácido 2-hidroxi-5-{{4-[(2-piridinilamino)sulfonil]fenil}azo}benzoico], sulfatiazol, p. ej. como sal sódica [sal sódica de 4-amino-N-(2-tiazolil)bencenosulfonamida], sulfametoxazol, mafenida, sulfametizol, sulfanilamida, trimetoprim, trimetoprimsulfametoxazol (cotrimoxazol; también conocido como TMP-SMX) y sulfonamidocrisoidina. Cada una de estas sulfonamidas ilustradas está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano que es o comprende un compuesto de sulfonamida proporciona efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano por inhibición de la síntesis de folato p. ej. en células del microorganismo en división activa. Según este ejemplo, el compuesto de sulfonamida puede ser un inhibidor competitivo de la enzima microbiana dihidropteroato sintetasa (DHPS). Según este ejemplo, en ausencia del agente antimicrobiano, la DHPS microbiana puede catalizar generalmente la conversión de PABA (para-aminobenzoato) en dihidropteroato, una etapa en la síntesis de folato.
Sin estar ligados por ninguna teoría particular o modo de acción específico, los autores de la invención razonan que el folato puede ser necesario para que las células microbianas sinteticen ácidos nucleicos (tales como ADN y/o ARN microbiano). Por consiguiente, los autores de la invención especulan que los agentes antimicrobianos que comprenden un compuesto de sulfonamida evitan la síntesis de ácidos nucleares microbianos p. ej. en células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende una estatina tal como mevastatina (también conocida como compactina o ML-236B), que está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un esteroide tal como sal sódica del ácido fusídico (también conocida como fucidina) que está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto taxoide tal como paclitaxel p. ej. deTaxus brevifoliaque está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
Otros agentes antimicrobianos de ejemplo incluyen agentes antimicrobianos que comprenden uno cualquiera o más de los siguientes: anisomicina [(2R,3S,4S)-2-(4-metoxibencil)-3,4-pirrolidinadiol-3-acetato] p. ej. deStreptomyces griseolus,cicloheximida [3-[2- (3,5-dimetil-2-oxociclohexil)-2-hidroxietil]glutarimida (también conocida como actidiona o naramicina A), citocalasina D (también conocida como zigosporina A) p. ej. deZygosporium mansonii,citocalasina B (también conocida como fomina) p. ej. deDrechslera dematioidea,hidrato de dihidrocloruro de emetina, ionomicina tal como ionomicina como sal de calcio p. ej. deStreptomyces conglobatus,y piericidina A (también conocida como Shaoguanmicina B) p. ej. deStreptomyces mobaraensis,cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un peptidil nucleósido. Por ejemplo, el peptidil nucleósido es uno cualquiera o más de: nicomicina Z p. ej. deStreptomyces tendae,sulfato de nourseotricina y dihidrocloruro de puromicina, p. ej. deStreptomyces alboniger.Todos los peptidil nucleósidos mencionados anteriormente están disponibles comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es un ácido aureólico tal como cromomicina A3 p. ej. deStreptomyces griseusy/o mitramicina A p. ej. deStreptomyces plicatus,cada uno de las cuales está disponible comercialmente fácilmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de aziridina tal como mitomicina p. ej. deStreptomyces caespitosusy/o tio-TEPA [N,N',N"-Trietilenetiofosforamida también conocido como sulfuro de Tris(aziridinil)fosfina], cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto bencenoide tal como 17-(alilamino)-17-demetoxigeldanamicina, 17-dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina, geldanamicina p. ej. deStreptomyces hygroscopicus,y/o herbimicina A p. ej. deStreptomyces hygroscopicus,cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de bencimidazol tal como albendazol [también conocido como 5-(propiltio)-2-bencimidazolcarbamato de metilo] y/o ricobendazol [también conocido como óxido de albendazol, o [5-(propano-1 -sulfinil)-1 H-benzoimidazol-2-il]-carbamato de metilo], cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de cumarina-glicósido tal como cumermicina A1 y/o novobiocina p. ej. sal sódica de novobiocina, cada una de las cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un derivado de éter difenílico tal como irgasán [también conocido como 5-cloro-2-(2,4-diclorofenoxi)fenol] que está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende una epipolitiodioxopiperazina tal como gliotoxina deGliocladium fimbriatumque está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un ácido graso o un derivado de ácido graso tal como cerulenina [(2R,3S,E,E)-2,3-epoxi-4-oxo-7,10-dodecadienamida] p. ej. deCephalosporium caerulensque está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende una glucosamina tal como hidrocloruro de 1-desoximanojirimicina [hidrocloruro de 1,5-didesoxi-1,5-imino-D-manitol] y/o N-metil-1-desoxinojirimicina [1,5-didesoxi-1,5-imino-1 -metil-D-sorbitol], cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de imidazol. Por ejemplo, el compuesto de imidazol se selecciona de: clotrimazol, econazol tal como sal de nitrato de econazol, ketoconazol, metronidazol, miconazol, tal como sal de nitrato de (±)-miconazol, sulconazol tal como sal de nitrato de sulconazol, y tiabendazol, cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un derivado de indol tal como fumitremorgina C p. ej. deNeosartorya fischeriy/o estaurosporina p. ej. deStreptomyces sp., cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende una macrolactama tal como ascomicina p. ej. deStreptomyces hygroscopicusvar.ascomyceticusque está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo particularmente preferido, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico. Por ejemplo, el antibiótico puede ser un antibiótico beta-lactámico tal como un antibiótico de penicilina, un antibiótico de cefalosporina, un antibiótico monobactámico y/o un antibiótico carbapenémico. Por ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico y/o un antibiótico carbapenémico. El agente antimicrobiano puede ser o comprende un antibiótico cefalosporínico. Alternativamente, el agente antimicrobiano puede ser o comprender un antibiótico carbapenémico
En un ejemplo, el antibiótico beta-lactámico es un antibiótico carbapenémico seleccionado de meropenem, imipenem y ertapenem.
En otro ejemplo, el antibiótico beta-lactámico es un antibiótico cefalosporínico seleccionado de ceftazidima, cefepima y ceftriaxona.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano puede comprender o consistir en un fenómeno físico y/o químico o estrés aplicado a las células de los microorganismos descritos según una realización de aspecto amplio, de ejemplo de la misma. Por ejemplo, el agente antimicrobiano puede comprender o consistir en uno o más fenómenos físicos y/o químicos o estrés aplicado a células de un microorganismo en división activa seleccionados de estrés térmico, luz ultravioleta, luz azul, radiación tal como radiación electromagnética, radiación de microondas, radiación con rayos X o rayos gamma, radiación de partículas tal como radiación de partículas alfa, beta o neutrones y/o estrés oxidativo.
En un ejemplo preferido, el microorganismo presente en la muestra obtenida del sujeto es una bacteria que pertenece a la especieKlebsiellay/o las células del microorganismo presente en la muestra obtenida del sujeto son células de bacterias pertenecientes a la especieKlebsiella,y el agente antimicrobiano ensayado en el método según cualquier aspecto amplio de la invención descrita en el presente documento comprende un antibiótico beta-lactámico. En un ejemplo de este tipo preferido, el microorganismo es una cepa deK. pneumoniaeoK. oxytocay/o las células del microorganismo son células de una cepa deK. pneumoniaeoK. oxytoca,y el agente antimicrobiano comprende un antibiótico carbapenémico tal como meropenem y/o imipenem y/o ertapenem. En un ejemplo preferido alternativo, el microorganismo es una cepa deK pneumoniaey/o las células del microorganismo son células de una cepa deK. pneumoniae,y el agente antimicrobiano comprende un antibiótico cefalosporínico tal como ceftriaxona.
En un ejemplo preferido alternativo, el microorganismo presente en la muestra obtenida del sujeto es una bacteria que pertenece a la especiesStaphylococcusy/o las células del microorganismo presente en la muestra obtenida del sujeto son células de bacterias pertenecientes a la especieStaphylococcus,y el agente antimicrobiano ensayado en el método según cualquier aspecto amplio de la invención descrita en el presente documento comprende un antibiótico beta-lactámico. En un ejemplo de este tipo preferido, el microorganismo es una cepa deStaphylococcus aureusy/o las células del microorganismo son células de una cepa deStaphylococcus aureus,y el agente antimicrobiano comprende un antibiótico cefalosporina tal como cefoxitina. En un ejemplo preferido alternativo, el microorganismo es una cepa deStaphylococcus aureusy/o las células del microorganismo son células de una cepa deStaphylococcus aureus,y el agente antimicrobiano comprende un antibiótico penicilínico tal como oxacilina.
En un ejemplo, el método según el primer aspecto amplio de la invención comprende además recuperar, aislar y/o purificar el microorganismo de la muestra obtenida del sujeto.
En otro ejemplo más, el método según el primer aspecto amplio de la invención comprende además, comprende cultivar las células del microorganismo en y/o de la muestra obtenida del sujeto con el propósito de identificar (p. ej., identificar la especie o género de) el microorganismo obtenido del sujeto.
Por supuesto, en un ejemplo preferido alternativo, el método no comprende identificar el microorganismo o cultivar las células de los microorganismos en y/o de la muestra obtenida del sujeto para identificar el microorganismo (p. ej., para identificar la especie o género del microorganismo).
Preferiblemente, el sujeto es un animal o un sujeto humano. En un ejemplo, el sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo puede presentar uno o más síntomas indicativos o que sugieren a un clínico, tal como un médico o una enfermera una infección por uno o más microorganismos. A modo de ejemplo no limitante, un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo puede sufrir o presentar uno o más síntomas seleccionados de temperatura corporal elevada tal como mayor de 38°C (o 100.4°F), debilidad muscular, dolor específico de órganos o sitios, necrosis o putrefacción de tejidos, adormecimiento o somnolencia excesiva, debilidad muscular, producción de modo pre-nasal o post-nasal excesiva, diarrea, dolor abdominal, tos y/o estornudos, dolor muscular y de articulaciones no específico, y/o una inflamación específica de órganos tal como celulitis, foliculitis, impétigo, otitis u otitis media, inflamación del tracto urinario, gastroenteritis y/o meningitis. Alternativamente, o además, el sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo puede presentar uno o más síntomas indicativos o que sugieren a un clínico tal como un médico o una enfermera, y/o uno o más síntomas indicativos o que sugieren sepsis tales como uno o más síntomas seleccionados de temperatura corporal elevada mayor de 38°C (100,4°F) o una temperatura corporal inferior de menos de 36°C (96.8°F), frecuencia cardíaca aumentada (p. ej., de aproximadamente más de 90 latidos por minuto), ritmo cardíaco irregular o cambiante, dificultad respiratoria o frecuencia respiratoria aumentada (p. ej., frecuencia respiratoria mayor de 20 respiraciones por minuto), dificultad o dolor asociado con la respiración, estado mental alterado tal como desorientación, confusión, agresión no provocada, producción de orina disminuida, coagulación sanguínea anormal, evidencia de infección microbiana que se presenta en múltiples sitios corporales, una caída en la presión sanguínea (p. ej., con respecto a la norma del paciente individual), debilidad o debilidad extrema, inconsciencia y/o muerte.
En un segundo aspecto amplio, la presente invención proporciona un método para determinar la sensibilidad de un microorganismo unicelular o multicelular a una pluralidad de agentes antimicrobianos. El método comprende realizar el método según el primer aspecto amplio en donde el método comprende exponer las células del microorganismo en división activa en y/o de la muestra obtenida del sujeto a uno o más agentes antimicrobianos representativos de una primera familia o panel de una pluralidad de agentes antimicrobianos, para determinar de este modo la sensibilidad de las células del microorganismo a agentes antimicrobianos pertenecientes a esta primera familia o panel de agentes antimicrobianos.
En un ejemplo, cuando se determina que las células del microorganismo son sensibles al uno o más agentes antimicrobianos representativos de la primera familia o panel de la pluralidad de agentes antimicrobianos, el método comprende además realizar el método según el primer aspecto amplio exponiendo las células del microorganismo en división activa en y/o de la muestra obtenida del sujeto a uno o más agentes antimicrobianos adicionales que pertenecen a la primera familia o panel de agentes antimicrobianos, para determinar de este modo la sensibilidad de las células del microorganismo para el sujeto a dichos agentes antimicrobianos adicionales.
En otro ejemplo, el método según este segundo aspecto puede comprender además realizar el método según el primer aspecto, en donde el método comprende exponer las células del microorganismo en división activa en y/o de la muestra obtenida del sujeto a
(i) uno o más agentes antimicrobianos representativos de una segunda familia o panel de una pluralidad de agentes antimicrobianos, y/o
(ii) uno o más agentes antimicrobianos representativos de una tercera familia o panel de una pluralidad de agentes antimicrobianos, y/o
(iii) uno o más agentes antimicrobianos representativos de una cuarta familia o panel de una pluralidad de agentes antimicrobianos, y/o
(iv) a uno o más agentes antimicrobianos representativos de cualquier otra familia o panel adicional de una pluralidad de agentes antimicrobianos,
determinar así la sensibilidad de las células del microorganismo a agentes antimicrobianos pertenecientes a dicha segunda y/o tercera y/o cuarta y/o cualquier otra familia o panel adicional de una pluralidad de agentes antimicrobianos.
En un ejemplo de este tipo, cuando se determina que las células del microorganismo son sensibles al uno o más agentes antimicrobianos representativos de la segunda y/o tercera y/o cuarta y/u otra familia o panel adicional de la pluralidad de agentes antimicrobianos, entonces dicho método comprende además realizar el método según el primer aspecto amplio exponiendo las células activas del microorganismo de la muestra obtenida en y/o del sujeto a uno o más agentes antimicrobianos adicionales que pertenecen al segundo y/o tercer y/o cuarto y/o cualquier otra familia o panel adicional de la pluralidad de agentes antimicrobianos, para determinar de ese modo la sensibilidad de dichas células de dicho microorganismo a los agentes antimicrobianos adicionales.
En un tercer aspecto amplio, descrito pero no reivindicado, la presente invención proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo unicelular o multicelular. El método comprende determinar la sensibilidad del microorganismo en dicho sujeto a uno cualquiera o más agentes antimicrobianos realizando el método según el primer o segundo aspectos amplios de la invención. El método comprende además identificar uno o más agentes antimicrobianos para los que se ha determinado que el microorganismo es sensible, y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del uno o más agentes antimicrobianos.
En un cuarto aspecto amplio, descrito pero no reivindicado, la presente invención proporciona el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno cualquiera o más agentes antimicrobianos en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo unicelular o multicelular, en donde se ha determinado que el microorganismo es sensible al uno o más agentes antimicrobianos llevando a cabo el método según el primer o segundo aspectos amplios.
En un quinto aspecto amplio, descrito pero no reivindicado, la presente invención proporciona el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno cualquiera o más agentes antimicrobianos en el tratamiento de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo unicelular o multicelular, en donde se ha determinado que el microorganismo es sensible al uno o más agentes antimicrobianos llevando a cabo el método según el primer o segundo aspectos amplios.
En un ejemplo según cualquier aspecto amplio, realización y/o ejemplo descrito en el presente documento, el método de sensibilidad de un microorganismo unicelular o multicelular a un agente antimicrobiano mediante citometría de flujo acústica se llevando a cabo usando un citómetro de flujo acústico. En un ejemplo preferido, el citómetro de flujo acústico está optimizado para la resolución de partículas pequeñas, y/o comprende un láser y detector instalados capaces de medir el colorante fluorescente que se usa en el método, y/o que es capaz de resolver partículas de aproximadamente 800 nm y mayores, y/o capaz de suministro volumétrico preciso o, en otras palabras, es capaz de medir con precisión el volumen dispensado de una muestra p. ej., una muestra celular que se está analizando. En un ejemplo de este tipo, cuando el método emplea un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico tal como SYTO 9, el citómetro comprende una combinación de láser y detector que comprende un láser azul de 488 nm con un filtro de 530/30 nm en el tubo fotomultiplicador, para medir el compuesto fluorescente que se está usando.
Por ejemplo, el citómetro de flujo acústico empleado en el método según cualquier aspecto, realización o ejemplo descrito en el presente documento, puede ser el citómetro de flujo acústico Attune (p. ej., citómetro de flujo acústico Thermo Fisher Scientific) o Attune NxT (p. ej., Thermo Fisher Scientific).
En un ejemplo del método según cualquier aspecto, realización o ejemplo descrito a lo largo del presente documento, la muestra obtenida del sujeto es una muestra de sangre que comprende las células del microorganismo.
En un ejemplo del método según cualquier aspecto, según cualquier aspecto, realización o ejemplo descrito a lo largo del presente documento, la muestra obtenida del sujeto es una muestra de sangre.
En un ejemplo del método según cualquier aspecto, según cualquier aspecto, realización o ejemplo descrito a lo largo del presente documento, la determinación de la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano llevando a cabo dicho método se logra en el plazo de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 horas o en el plazo de aproximadamente 1 hora o en el plazo de aproximadamente 2 horas o en el plazo de aproximadamente 3 horas desde el momento de obtener la muestra del sujeto y/o desde el momento de incubar primero la muestra obtenida del sujeto en el medio de cultivo.
En algunos ejemplos del método según cualquier aspecto, realización o ejemplo descrito a lo largo del presente documento, la muestra obtenida del sujeto es una muestra de sangre que comprende las células del microorganismo.
En algunos ejemplos del método según cualquier aspecto, realización o ejemplo descrito a lo largo del presente documento, el método comprende incubar en el medio de cultivo una muestra obtenida del sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, en donde la muestra comprende células del microorganismo, y en donde la muestra se obtiene del sujeto, se incuba directamente en dicho medio de cultivo sin aislar y/o retirar primero dichas células de dicho microorganismo de dicha muestra antes de dicha incubación de dicha muestra en dicho medio de cultivo. Por ejemplo, la muestra obtenida del sujeto es una muestra de sangre. Además, por ejemplo, la determinación de la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano llevando a cabo dicho método se logra en el plazo de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 horas o en el plazo de aproximadamente 1 hora o en el plazo de aproximadamente 2 horas o en el plazo de aproximadamente 3 horas desde el momento de obtener la muestra del sujeto y/o desde el momento de incubar primero la muestra obtenida del sujeto en el medio de cultivo.
En algunos ejemplos del método según cualquier aspecto, realización o ejemplo descrito a lo largo del presente documento, el microorganismo esBurkholdria thailandesisoBurkholderia pseudomallei,y opcionalmente el agente antimicrobiano es un antibiótico carbapenémico tal como meropenem.
En otros ejemplos del método según cualquier aspecto, realización o ejemplo descrito a lo largo del presente documento, el microorganismo esStaphylococcus aureus,y opcionalmente el agente antimicrobiano es un antibiótico carbapenémico. Por ejemplo, los antibióticos carbapenémicos pueden ser oxacilina y/o cefoxitina. En un ejemplo preferido, elStaphylococcus aureuses resistente a meticilina. Alternativamente, elStaphylococcus aureuses meticilina sensible a meticilina.
El método como se describe en el presente documento está adaptado para el cribado cualitativo y/o cuantitativo de alto rendimiento de la sensibilidad de microorganismos en o de una muestra clínica a uno o más agentes antimicrobianos simultáneamente. En un ejemplo, el método está adaptado para el cribado simultáneo de alto rendimiento de la sensibilidad de múltiples muestras de microorganismos obtenidos de diferentes muestras clínicas y/o para múltiples agentes antimicrobianos. El método de cribado de alto rendimiento puede emplearse para predecir rápidamente cualitativamente la sensibilidad de uno o una pluralidad de microorganismos a uno o una pluralidad de agentes antimicrobianos en el plazo de aproximadamente 1 a 3, preferiblemente con aproximadamente 2 horas y más preferiblemente en el plazo de aproximadamente 1 hora desde el momento de obtener la muestra que comprende células del microorganismo del sujeto y/o desde el momento de incubar primero las células del microorganismo en un medio de cultivo para obtener un cultivo del microorganismo en división activa. Alternativamente, o además, el método de alto rendimiento rápido según esta realización puede emplearse para predecir rápidamente cuantitativamente la sensibilidad de uno o una pluralidad de microorganismos a uno o una pluralidad de agentes antimicrobianos determinando los valores de MIC FAST en el plazo de aproximadamente 2 a 6 horas, preferiblemente en el plazo de aproximadamente 2 a 5 horas, o en el plazo de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 horas o de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 horas o de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 horas, y más preferiblemente aproximadamente 3 horas desde el momento de obtener la muestra que comprende células del microorganismo del sujeto, y/o desde el momento de incubar primero células del microorganismo en un medio de cultivo para obtener un cultivo del microorganismo en división activa.
En un ejemplo de este tipo, el método de alto rendimiento utilizaba al menos una placa de 96 pocillos para el cribado selectivo para determinar cualitativa y/o cuantitativamente uno o más microorganismos frente a uno o más agentes antimicrobianos. En un ejemplo, el método de alto rendimiento se usaba para determinar cualitativa y/o cuantitativamente la sensibilidad de al menos 13 microorganismos diferentes obtenidos de diferentes muestras clínicas a uno o más agentes antimicrobianos, en una única placa de 96 pocillos.
En otro ejemplo, usando una única placa de 96 pocillos, el método de alto rendimiento puede usarse para determinar simultáneamente cualitativa y/o cuantitativamente (determinando los valores de MIC FAST) la sensibilidad de un único microorganismo (obtenido de una muestra clínica tal como una muestra de sangre) a al menos 13 agentes antimicrobianos diferentes.
En otro ejemplo, usando una única placa de 96 pocillos, el método de alto rendimiento puede usarse para determinar simultáneamente cualitativa y/o cuantitativamente (determinando los valores de MIC FAST) la sensibilidad de dos o más microorganismos (obtenidos de dos o más muestras clínicas a al menos cuatro agentes antimicrobianos diferentes, por ejemplo ensayados en diferentes concentraciones de cada agente antimicrobiano. Por ejemplo, las diferentes concentraciones del agente antimicrobiano ensayado pueden ser una dilución seriada que comprende una o más de las siguientes concentraciones 0.25 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l, 32.0 mg/l, 64.0 mg/l, 128.0 mg/l y 256.0 mg/l.
En otro ejemplo de este tipo, usando una única placa de 96 pocillos, el método de alto rendimiento puede usarse para determinar simultáneamente cualitativa y/o cuantitativamente (determinando los valores de MIC FAST) la sensibilidad de dos o más microorganismos (obtenidos de dos o más muestras clínicas) a al menos ocho agentes antimicrobianos diferentes, por ejemplo ensayados en diferentes concentraciones de cada agente antimicrobiano, p. ej., seleccionadas de 0.25 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l, 32.0 mg/l, 64.0 mg/l, 128.0 mg/l y/o 256.0 mg/l.
En otro ejemplo más de este tipo, usando una única placa de 96 pocillos, el método de alto rendimiento puede usarse para determinar simultáneamente cualitativa y/o cuantitativamente (determinando los valores de MIC FAST) la sensibilidad de al menos un microorganismo (obtenido de una única muestra clínica) a al menos 13 agentes antimicrobianos diferentes, por ejemplo, ensayados en diferentes concentraciones, p. ej., seleccionadas de 0.25 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l y 32.0 mg/l.
El experto en la técnica reconocería que se pueden ensayar otras permutaciones del número de microorganismos y agentes antimicrobianos distintos de los descritos en el presente documento en el método de alto rendimiento de la invención sin afectar a la eficacia del método para lograr la determinación rápida de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos ensayados.
En otros ejemplos del método, el microorganismo esKlebsiella pneumoniae,y opcionalmente el agente antimicrobiano es piperacilina y/o tazobactam. Por ejemplo, el agente antimicrobiano comprende una combinación de antibióticos tanto de piperacilina como de tazobactam. Por ejemplo, los antibióticos carbapenémicos pueden ser oxacilina y/o cefoxitina. En un ejemplo preferido, elStaphylococcus aureuses resistente a meticilina. Alternativamente, elStaphylococcus aureuses sensible a meticilina.
Breve descripción de los dibujos
Características adicionales de la presente invención se describen más completamente en la siguiente descripción de varias realizaciones no limitantes de la misma. Esta descripción se incluye únicamente con el propósito de ilustrar la presente invención. No debe entenderse como una restricción del amplio sumario, divulgación o descripción de la invención tal como se ha expuesto anteriormente. La descripción se hará con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1 es una representación ilustrativa que muestra una colección internacional de un panel de aislados deKlebsiellaspp. reunidos en el trabajo que conduce a la presente invención. "ATCC" indica aislados obtenidos de la Colección Americana de Cultivos Tipo; "AMRHAI" indica aislados obtenidos del laboratorio de Resistencia a los Antimicrobianos e Infecciones Asociadas al Hospital; "NPHI" indica aislados obtenidos del Instituto Público de Salud Noruego; "EDL" indica aislados obtenidos del Laboratorio de Desarrollo EUCAST; "DMUC" indica aislados obtenidos del Departamento de Microbiología, Universidad de Colombo; y "PWLM" indica aislados obtenidos de la Medicina de Laboratorio PathWest.
La Figura 2 es un diagrama esquemático de la validación del método de ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica.
La Figura 3 es una representación gráfica (gráfico biaxial de AFC) que demuestra que la sensibilidad al meropenem puede identificarse mediante AFC observando una firma asociada a la sensibilidad (SAS, por sus siglas en inglésSusceptibility-Associated Signature).El panel (A) muestra que la exposición de la cepa de tipo sensible deK. pneumoniae(ATCC 700603) produjo un aumento en la dispersión frontal, fluorescencia de SYTO 9, número reducido de sucesos globales, y formó un nuevo foco de contorneado en la MIC del aislado (0.25 mg/l). A 32 veces la MIC, se observaron un total de cuatro focos de contorneado, con un desplazamiento global hacia dispersión frontal baja, residuos fluorescentes bajos. La progresión de estas características, cuando se observan en combinación, constituye la firma asociada a la sensibilidad. La coloración en gráficos biaxiales indica focos de agrupamiento separados. Acompañando a los gráficos biaxiales de AFC están micrografías de fluorescencia (adquiridas a 60 aumentos) que muestran menores números totales de células y más morfotipos celulares aberrantes a medida que aumenta la concentración de meropenem. El panel (B) demuestra que la exposición de la cepa clínica K8 deK. pneumoniaealtamente resistente a meropenem muestra una ausencia de firma asociada a sensibilidad a lo largo de concentraciones de meropenem clínicamente relevantes mediante el gráfico biaxial de AFC, y una ausencia de morfotipos celulares aberrantes por microscopía de fluorescencia.
La Figura 4 es una representación gráfica (gráfico biaxial de AFC) que demuestra una estrategia de selección de poblaciones normalizada aplicada a datos en bruto de sucesos bacterianos para producir, entre otros, un resultado consistente de mediciones de sensibilidad cualitativas y/o cuantitativas por el método de la presente invención. La estrategia define una selección de poblaciones racional de morfotipo de células no expuestas (UCM) del microorganismo de ensayo que delimita todos los sucesos bacterianos contorneados en un gráfico de contorno bivariable de FSC-H frente a BL1 -H en el umbral de 10%. La selección de poblaciones de UCM definida en el gráfico bivariable después se puede aplicar de manera consistente a todas las muestras en toda las series de diluciones del agente antimicrobiano que ayudan en la medición o determinación de MIC FAST. El panel (A) muestra que los sucesos recogidos se seleccionaron para incluir sólo aquellos sucesos con una fluorescencia de SYTO 9 (BL1 - 530/30 nm) de 104 unidades arbitrarias de fluorescencia o superior. Se eliminaron los dobletes mediante un gráfico de FSC-A frente a FSC-H, y se eliminó el fondo representando la fluorescencia específica de SYTO 9 (BL1 - 530/30) frente a un canal no usado (BL3 - 640 LP). El panel (B) muestra que en la muestra no expuesta a antibiótico, se aplicó un contorneado del vecino más cercano al 10%, y se estableció una selección de poblaciones (denominada morfotipo de células no expuestas) para incluir todos los sucesos agrupados. Esta selección de poblaciones se aplicó entonces a todas las muestras en todas las series de diluciones de antibióticos.
La Figura 5 es una representación gráfica que muestra que el método de ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica de la invención predecía con precisión la MIC<bmd>en toda la colección de aislados deK. pneumoniae.Las regiones coloreadas (sombreadas de manera diferente) representan la determinación cualitativa de sensible (sombreada de color verde o claro)/no sensible (sombreada de color rojo u oscuro). El panel (A) muestra una determinación cualitativa de sensible/no sensible a través de los 10 aislados iniciales ensayados (mostrados como barras de media y error representan SEM de repeticiones biológicas), se observó una fuerte correlación positiva (r = 0.899, p < 0.0001), ▲ representa cuatro aislados, todos con coordenadas de MIC<bmd>y MIC<fast>perfectamente concordantes. El panel (B) muestra determinación cualitativa de sensible/no sensible en toda la colección completa de 48 aislados. Las cifras indican los números de aislados que ocupan las mismas coordenadas de MIC<bmd>, MIC<fast>. En toda la colección completa de aislados, se observó una fuerte correlación positiva (coeficiente de correlación de Matthew = 0.918).
La Figura 6 es una representación gráfica (gráfico biaxial de AFC) que muestra diferencias en las MIC<fast>que se observaron entre variantes de colonias de aislados deK. pneumoniaeK16. Cuando se subcultiva el aislado deK. pneumoniaeK16 productor de IMP-4 se observó una variante de colonia rugosa y lisa. Cada una se subcultivó en agar de sangre de caballo al 5% y se sometió a ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica de forma independiente. La variante de la colonia lisa produjo una MIC<fast>de 2 mg/l. La colonia rugosa produjo una MIC<fast>de 64 mg/l y, a 2 mg/l, por AFC se observó que contenía una población consistente con un fenotipo no sensible. Ambos resultados de MIC<fast>eran concordantes (es decir, dentro de la resolución del ensayo de BMD) con los resultados de MIC<bmd>.
La Figura 7 es una representación gráfica (biaxial, gráfico biaxial de AFC FSC/BL1) que demuestra que se observaron subpoblaciones resistentes en el aislado deK. pneumoniaeK16 a lo largo de dos días de pase selectivo y ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica. Día uno - Se encontró que el aislado deK. pneumoniaeK16 productor de IMP-4, con 2 mg/l de meropenem, contenía una población minoritaria de células con un fenotipo consistente con células no expuestas (que permanecían dentro de la selección de poblaciones del morfotipo de células no expuestas - indicada por flecha). Esta subpoblación persistía, a una menor frecuencia, con 16 mg/l de meropenem, mientras que la mayoría de las células presentaban un fenotipo afectado (desplazado fuera de la selección de poblaciones). Día 2 - El cultivo de 2 mg/l de K16 del día 1 se subcultivó y se sometió a ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica al día siguiente. El aislado que presenta una MIC aumentada (4 mg/l) retrasó la progresión a la firma asociada con la sensibilidad que aparece, con la mayoría de los sucesos consistentes con un fenotipo de no sensibilidad a 2 mg/l. La mayoría de los sucesos a 16 mg/l eran consistentes con un fenotipo sensible, sin embargo, una pequeña subpoblación permanecía dentro de la selección de poblaciones del morfotipo de células no expuestas.
La Figura 8 es una representación gráfica que muestra la correlación de los resultados de sensibilidad y valores de MIC determinados usando el método asistido por citometría de flujo acústica de la presente invención (MIC<fast>) y MIC<bmd>para el antibiótico ceftriaxona (CRO) en toda la colección de 14 aislados deK. pneumoniae.El método de ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica de la invención predijo con precisión la MIC<bmd>en toda la colección de 14 aislados deK. pneumoniaepara la ceftriaxona. Catorce aislados deK. pneumoniaede la Tabla 2 (incluyendo los 10 aislados mostrados en la Tabla 1) se expusieron a ceftriaxona en diferentes concentraciones (según el método asistido por citometría de flujo acústica de la presente invención) y los correspondientes resultados de MIC<bmd>y MIC<fast>se correlacionaron como se muestra. Recta de regresión y = 0.9997 ± 0.0001488 x 0.06866 ± 0.03223, R2 = 1. El punto de dato en 256 representa 10 aislados.
La Figura 9 es una representación gráfica (gráfico biaxial de AFC) que demuestra que la sensibilidad a la cefoxitina deStaphylococcus aureusWACC 98 con tinción puede identificarse mediante AFC observando una firma asociada a la sensibilidad a una dilución de MIC 128 (Panel A), y la correspondiente morfología celular mediante microscopía de fluorescencia (Panel B).
La Figura 10 es una representación gráfica (gráfico biaxial de AFC) que demuestra que la sensibilidad a la cefoxitina deStaphylococcus aureusATCC 29213 con tinción puede identificarse mediante AFC observando una firma asociada a la sensibilidad a la dilución de MIC 4 (Panel A), y la correspondiente morfología celular mediante microscopía de fluorescencia (Panel B).
La Figura 11 es una representación gráfica (gráfico de AFC biaxial) que demuestra que la sensibilidad a la oxacilina deStaphylococcus aureusWACC 98 con tinción puede identificarse mediante AFC observando una firma asociada a la sensibilidad a la dilución de MIC 256 (Panel A), y la correspondiente morfología celular mediante microscopía de fluorescencia (Panel B).
La Figura 12 es una representación gráfica (gráfico de AFC biaxial) que demuestra que la sensibilidad a la oxacilina deStaphylococcus aureusATCC 29213 con tinción puede identificarse mediante AFC observando una firma asociada a la sensibilidad a la dilución de MIC de 0.25 (Panel A), y la correspondiente morfología celular mediante microscopía de fluorescencia (Panel B).
La Figura 13 es una representación gráfica que muestra la inducción de resistencia por oxacilina en el aislado clínico de S.aureusresistente a meticilina (MRSA) WACC 98 comparado con el aislado de control de S.aureussensible a meticilina (MSSA) ATCC 25912; gráficos de citometría de flujo biaxial de dispersión frontal frente a fluorescencia de SYTO 9 con 0 mg/l de oxacilina (izquierda) y 8 mg/l de oxacilina (centro). Usando gráficos de contorno de vecino más cercano al 10%, los dos aislados se comparan en el gráfico final (derecha) - la población azul es ATCC 25912, la población dorada es WACC 98.
La Figura 14 proporciona representaciones gráficas que muestran resultados de MIC<fast>obtenidos por el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención para el aislado de control de S.aureussensible a meticilina (MSSA) ATCC 25912 (panel A) y aislado clínico de S.aureusresistente a meticilina (MRSA) WACC 98 (panel B) después de la exposición a concentraciones variables de oxacilina. En resumen, esta figura muestra comparaciones de sucesos que permanecen en la selección de población de morfotipo de células no expuestas a lo largo de un intervalo de concentraciones de oxacilina. A) S. aureus sensible a meticilina de control (ATCC 25912) muestra una reducción casi completa de sucesos con oxacilina 0.25 mg/l, y permanece por debajo del umbral de 10% de la MIC<fast>. Los puntos de datos azules representan los no corregidos para la inducción de resistencia con oxacilina, los dorados representan después de corrección. B) S. aureus resistente a meticilina clínico (WACC 98) muestra una reducción inmediata de sucesos con oxacilina 0.25 mg/l, pero permanece alta en toda la serie de diluciones y por encima del umbral del 10% para MIC<fast>en el punto de corte de EUCAST para la no sensibilidad (8 mg/l - indicado por la línea roja). Los puntos de datos azules representan los no corregidos para la inducción de resistencia con oxacilina, los dorados representan después de corrección. En particular, obsérvese los puntos de datos de 128 mg/l - sin corrección, el número de sucesos cae por debajo del umbral de MIC<fast>, sin que permanezcan por encima (representación precisa de la biología).
La Figura 15 proporciona representaciones ilustrativas (panel A) y gráficas (panel B) que demuestran la aplicabilidad del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de esta invención para estudiar un mutante del sistema de eflujo (RND) deB. thailandensisconstruido como modelo sustituto paraB. pseudomallei.La bomba de eflujo RND se eliminó por intercambio alélico para generar un mutanteÚRND de B. thailandensis.Los gráficos de AFC biaxial de FSC/BL1 del panel B muestran la exposición deB. thailandensis ameropenem ensayado por FAST: se ensayaron aislados de tipo natural de referencia de B.thailandensispara determinar la MIC<fast>. Las muestras en toda la serie de diluciones presentaban una firma asociada a sensibilidad consistente con las observadas enKlebsiella pneumoniaeexpuesta a meropenem, con un aumento de la dispersión frontal y fluorescencia de SYTO® 9, y una disminución en el número de células globales a medida que el aislado se acercaba a la MIC<bmd>. MIC<fast>paraB. thailandensisusaba los mismos los algoritmos de posprocesamiento que paraK. pneumoniae.
La Figura 16 proporciona una representación ilustrativa del flujo de trabajo de FAST de TZP. Los cultivos de una noche (a) se ajustaron a la densidad celular de 106 células/ml (c) y se incubaron. A continuación se expusieron a TZP (d). Las células se centrifugaron y se resuspendieron en HBSS (e). Las muestras se diluyeron (f) y se tiñeron con SYTO®9 (g) antes del análisis de flujo. Cada experimento se controló internamente por microdilución en caldo (b).
La Figura 17 proporciona una representación gráfica (paneles superiores) e ilustrativa (paneles inferiores) de comparación de cambios inducidos por TZP por dispersión frontal (paneles superiores) e intensidad de fluorescencia a 540/40 nm (paneles inferiores) entre un aislado deKlebsiella pneumoniaesensible a TZP (43558) y un aislado resistente aislado deKlebsiella pneumoniae(K2). Se podía observar un cambio morfológico grande con microscopía epifluorescente en los aislados sensibles expuestos a TZP (compuesto de color falso).
La Figura 18 proporciona una representación gráfica que muestra una regresión de dispersión para los resultados de MIC<fast>y MIC<bmd>. La línea vertical (roja) indica el punto de corte de EUCAST paraEnterobacteriaceae.
La Figura 19 proporciona representaciones gráficas e ilustrativas que muestran la determinación rápida de la sensibilidad de bacterias a agentes antimicrobianos usando el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención. El panel A demuestra que la sensibilidad a la ceftriaxona puede identificarse por AFC observando una firma asociada a la sensibilidad. La exposición de la cepa deK. pneumoniaede tipo sensible (SSCC 43558) aumentó la dispersión frontal, fluorescencia de SYTO 9, redujo el número de sucesos globales, y formó un nuevo foco de contorneado en la MIC del aislado (0.25 mg/l) que aumentó más con 2 mg/l de ceftriaxona. Estos cambios estaban acompañados, puesto de manifiesto con micrografías electrónicas de transmisión demostrativas, de alargamiento de las células, distensión de las estructuras de membrana y pared celular, y probable lisis celular. El panel B demuestra que la sensibilidad a la gentamicina puede identificarse por AFC observando una firma asociada a la sensibilidad. La exposición de la cepa deK. pneumoniaede tipo sensible (aislado 244606) aumentó la fluorescencia de SYTO 9 y formó un nuevo foco de contorneado por encima de la MIC del aislado (1 mg/l). Estos cambios estaban acompañados, puesto de manifiesto con micrografías electrónicas de transmisión demostrativas, de un mayor desorden citoplasmático y vacuolización dentro del citoplasma de las células.
La Figura 20 proporciona una comparación de los resultados de categorías de sensibilidad de laboratorio de referencia y FAST para 10 aislados frente a 3 antibióticos (ceftriaxona, gentamicina, meropenem; 30 ensayos AST) que muestran concordancia perfecta de los resultados de sensibilidad MIC<fast>y MIC<bmd>obtenidos.
La Figura 21 proporciona una representación ilustrativa del flujo de trabajo de FAST para ensayar la sensibilidad de microorganismos no identificados directamente de hemocultivos, y comparar con el flujo de trabajo de ensayar la sensibilidad de microorganismos no identificados directamente de hemocultivos usando métodos convencionales tales como microdilución en caldo. Como se indica, los resultados de sensibilidad positiva pueden obtenerse usando el método FAST muy rápidamente en el plazo de 125 minutos en comparación con más de 48 horas usando técnicas convencionales conocidas. Proporcionando un ahorro de tiempo tan alto como 46 horas. En resumen, se recogieron frascos de hemocultivo positivos una vez que los servicios de patología indicaban un resultado positivo, y se tomó una parte alícuota. Las muestras se procesaron en un protocolo de depuración y se inocularon en caldo Mueller-Hinton (MHB) y se incubaron a 37°C para garantizar que las bacterias se estaban dividiendo activamente. Una vez confirmada la división activa, una parte alícuota se sometió a microdilución en caldo tradicional para determinar la MIC<bmd>. Otra parte alícuota se expuso a meropenem, ceftriaxona o gentamicina durante 30 minutos, se recogió, se tiñó con SYTO 9 y después se ensayó por AFC para determinar la MIC<fast>.
La Figura 22 proporciona una representación esquemática e ilustrativa del método FAST de la invención realizado de una manera de alto rendimiento. El panel A) proporciona una representación esquemática de un procedimiento de ejemplo de alto rendimiento que analiza simultáneamente 96 muestras de ensayo en una placa/bandeja de 96 pocillos. Se tomaron muestras de dos hemocultivos positivos separados, recogidos en un frasco de un sujeto separado que tenía o que se sospechaba que tenía infección microbiana, se diluyeron con una solución de detergente no iónico (Tritón-X al 0.001 %) y se inocularon en una bandeja de 96 pocillos que contenía cuatro antibióticos (CRO - ceftriaxona, GEN - gentamicina, MEM - meropenem y PTZ - piperacilinatazobactam) que se diluyeron en serie a concentraciones de 0.25 mg/l, 0,5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l, 32.0 mg/l, 64.0 mg/l, 128.0 mg/l, 256.0 mg/l. Las suspensiones que contenían las células microbianas (en este caso bacterianas) de cada muestra de sangre y los antibióticos se incubaron durante 30 120 minutos, se diluyeron con solución salina equilibrada de Hank preteñida con SYTO 9 y se analizaron con un citómetro de flujo acústico equipado con un lector de placas. El panel B) muestra una placa de 96 pocillos de ejemplo que comprende las células bacterianas que se incubaron en las diluciones seriadas anteriores de los 4 antibióticos. Las muestras que contenían células bacterianas obtenidas de un hemocultivo positivo se muestran en círculos sombreados oscuros, y las muestras que contienen células bacterianas obtenidas del otro hemocultivo positivo se muestran en círculos sombreados claros. Usando intervalos completos de diluciones para los 4 antibióticos (CRO, GEN, MEM y PTZ), se obtuvieron cuatro resultados de MIC FAST (un resultado de MIC para cada antibiótico) para los 2 aislados clínicos bacterianos ensayados simultáneamente. Todos los resultados de MIC FAST se obtuvieron en un promedio de aproximadamente 2 a 3 horas desde el indicador positivo de hemocultivo inicial.
La Figura 23 proporciona una representación gráfica que muestra que después de los ensayos de hemocultivos por FAST de alto rendimiento, p. ej., con 4 agentes antimicrobianos (CRO - ceftriaxona, GEN - gentamicina, MEM - meropenem y PTZ - piperacilina-tazobactam), el número de células por microlitro que caen dentro de la región de la selección de poblaciones de UCM en cada serie se puede representar gráficamente como un porcentaje de las encontradas en el control no expuesto. El panel A) muestra una representación de un aislado microbiano que se ha demostrado previamente que es sensible a todos los antimicrobianos ensayados - demuestra una disminución rápida en los números a las concentraciones más bajas, con todos los agentes antimicrobianos que caen por debajo de los umbrales de sensibilidad (sombreado coincidente, líneas discontinuas) antes de alcanzar una concentración asociada con un fenotipo resistente (la línea vertical). En un aislado multirresistente a fármacos (panel B) esta caída no se produce hasta que las concentraciones de agentes antimicrobianos están por encima de la concentración asociada con un fenotipo resistente (línea vertical).
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
General
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
La invención descrita en el presente documento puede incluir uno o más intervalos de valores (p. ej., tamaño, desplazamiento e intensidad de campo). Se entenderá que un intervalo de valores incluye todos los valores dentro del intervalo, incluyendo los valores que definen el intervalo, y valores adyacentes al intervalo que conducen al mismo o sustancialmente el mismo resultado que los valores inmediatamente adyacentes a ese valor que define el límite al intervalo.
Las definiciones para los términos seleccionados usados en el presente documento pueden encontrarse dentro de la descripción detallada de la invención y aplicarse a lo largo de la misma. A menos que se defina lo contrario, todos los demás términos científicos y técnicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención.
Cada ejemplo, realización y aspecto descritos en el presente documento se aplica cambiando lo que se deba cambiar a todos y cada uno de los otros ejemplos, realizaciones y aspectos, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Definiciones
A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende" o variaciones tales como "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de una etapa o elemento o número entero o grupo de etapas o elementos o números enteros indicados pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o número entero o grupo de etapas o elementos o números enteros.
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario o el contexto requiera lo contrario, se debe considerar que la referencia a una sola etapa, composición o materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia se considerará que abarca una y una pluralidad (es decir, una o más) o esas etapas, composiciones o materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia. Debe observarse que, tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", “la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "agente antimicrobiano" o "microorganismo" incluye una pluralidad de tales agentes antimicrobianos o microorganismos, y así sucesivamente.
Como se usa en el presente documento a lo largo de esta memoria descriptiva, el término "derivado" o "derivado de" se tomará para indicar que un número entero especificado puede obtenerse de una fuente particular aunque no necesariamente de esa fuente.
La expresión "citometría de flujo acústica", como se usa en el presente documento, pretende abarcar cualquier método o técnica de citometría de flujo para el análisis de células de microorganismos tales como células bacterianas, células de levadura y/o células fúngicas p. ej. células individuales del microorganismo, en una suspensión que fluye enfocada acústicamente pasada una fuente de luz con tubos fotomultiplicadores, con tubos fotomultiplicadores que aceptan luz transmitida y emitida desde cada célula a medida que pasa por la fuente de luz. El método o técnica de citometría de flujo acústica que abarca la presente invención emplea preferiblemente un dispositivo de enfoque (p. ej., pero no limitado a, un dispositivo de enfoque piezoeléctrico) para generar una onda estacionaria acústica que dirige y alinea las células que siguen pasada la fuente de luz. Se entenderá que los métodos o técnicas de citometría de flujo acústica abarcados por la presente invención son diferentes y distintos de los métodos o técnicas de citometría de flujo hidrodinámica conocidos, entre otras en la forma en que una suspensión que fluye de las células que fluyen pasa por la fuente de luz en el citómetro de flujo se comprime en una corriente para análisis en la fuente de luz. Por ejemplo, los métodos o técnicas convencionales de citometría de flujo hidrodinámica emplean generalmente un vórtice presurizado de fluido para alinear las células en una única corriente. Los expertos en la materia entenderán que generar un vórtice de fluido presurizado hidrodinámicamente para dirigir y alinear las células es conceptualmente completamente diferente a una onda estacionaria acústica que dirige y alinea las células que siguen pasada la fuente de luz. Por consiguiente, se entenderá que los métodos o técnicas de citometría de flujo acústica de la presente invención y los dispositivos de citómetro de flujo acústico abarcados por la presente invención excluyen técnicas y dispositivos de citometría de flujo hidrodinámica convencionales que emplean enfoque presurizado hidrodinámicamente de las células de microorganismos. Se entenderá que los métodos o técnicas de citometría de flujo acústica de la presente invención y los dispositivos de citometría de flujo acústica abarcados por la presente invención son aquellos métodos y dispositivos de citometría de flujo que, entre otras cosas, implican el análisis de células de microorganismos en una suspensión que fluye enfocada acústicamente pasada una fuente de luz generando (p. ej., usando un dispositivo de enfoque piezoeléctrico) una onda estacionaria acústica para dirigir y alinear las células.
Preferiblemente, el citómetro de flujo acústico empleado en los métodos de la presente invención está optimizado para la resolución de partículas pequeñas, y/o comprende un láser y detector instalados capaces de medir el colorante fluorescente que se usa en el método, y/o capaces de resolver partículas de aproximadamente 800 nm y mayores, y/o capaces de suministro volumétrico preciso o, en otras palabras, son capaces de medir con precisión el volumen dispensado de una muestra celular que se analiza. Por ejemplo, el citómetro de flujo acústico empleado puede ser un citómetro de flujo acústico Attune (p. ej., Thermo Fisher Scientific) o un citómetro de flujo acústico Attune NxT (p. ej., Thermo Fisher Scientific). En los ejemplos, cuando el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico usado es colorante SYTO 9, el citómetro de flujo acústico puede comprender preferiblemente un láser azul de 488 nm con un filtro de 530/30 nm en el tubo fotomultiplicador para medir la fluorescencia de las células ensayadas.
Como se usa en el presente documento, la expresión "muestra que comprende células de un microorganismo" en el contexto de la presente invención siempre que se refiera a una muestra que comprende células de un microorganismo obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo, pretende abarcar cualquier muestra clínica o biológica obtenida directa o indirectamente de un sujeto tal como un ser humano que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo. También se entenderá que el término "muestra", como se usa en el presente documento, también abarca suspensiones preparadas a partir de aislados primarios que incluyen cultivos tanto puros como/o mixtos obtenidos directa o indirectamente de una muestra biológica o clínica del sujeto. La muestra puede ser estéril o no estéril y puede obtenerse o derivarse de un sitio estéril o no estéril en el sujeto. Por ejemplo, una muestra que comprende células de un microorganismo obtenida de un sujeto puede ser cualquier muestra clínica o biológica que comprende células de un microorganismo, puede seleccionarse de una muestra de hisopo de garganta, una muestra de esputo muestra de orina, muestra de sangre, una muestra de fluido articular, una muestra de fluido de diálisis peritoneal ambulatoria continua (CAPD), una muestra de hisopo bucal, una biopsia de tejido, una muestra de fluido de drenaje quirúrgico, una muestra de heces, una muestra de líquido cefalorraquídeo, muestra de líquido ascítico, muestra de líquido pleural, una muestra de sangre tal como muestra de plasma sanguíneo y/o suero sanguíneo, un hisopo de herida o muestra de moco de herida, una muestra de hisopo nasal, una muestra de hisopo rectal, una muestra de hisopo uretral, una muestra de piel o muestra de hisopo de piel, una muestra de hisopo genital, muestra de pus, muestra de saliva, muestra de legaña, muestra de fluido seroso, muestra de secreción vaginal, muestra de vómito, sudor, lágrimas, muestra de moco, muestra de líquido pericárdico, muestra de fluido peritoneal, muestra de sebo, muestra de unto sebáceo, muestra de jugo gástrico, una muestra de bilis, muestra de quilo, muestra de quimo, muestra de fluido endolinfa y/o perilinfa, muestra de fluido linfático, muestra de fluido intersticial, leche materna, muestra de hisopo de campo quirúrgico perioperatorio, cualquier muestra o hisopo tomado para determinar la presencia de un organismo multirresistente a fármacos, y cualquier combinación de los mismos. Alternativamente o además, "muestra que comprende células de un microorganismo" en el contexto de la presente invención también abarca muestras de alimentos para rastrear la resistencia a antimicrobianos en alimentos tanto sin cocinar como cocinados o listos para comer con los que el sujeto que se sospecha que tiene o se supone que tiene una infección por un microorganismo, puede haber entrado en contacto.
Como se usa en el presente documento, la expresión "agente antimicrobiano" o "agentes antimicrobianos" pretende abarcar cualquier agente, sustancia, compuesto o composición de materia que tenga o capaz de tener un efecto (ya sea directa o indirectamente) en el crecimiento y/o replicación de un microorganismo unicelular y/o multicelular tal como bacterias, levaduras y/u hongos. Por ejemplo, el agente antimicrobiano (o agentes) incluido dentro del alcance de la presente invención puede actuar para inhibir el crecimiento y/o matar el microorganismo preferiblemente por cualquier modo o mecanismo de acción. Por consiguiente, el(los) agente(s) antimicrobiano(s) abarcado(s) dentro de la presente invención pueden tener efecto biostático y/o microbicida en los microorganismos unicelulares y/o multicelulares de la presente invención. Por ejemplo, el(los) agente(s) antimicrobiano(s) de la presente invención incluyen agentes bactericidas y/o agentes bacteriostáticos, tales como antibiótico(s). Se entenderá que el(los) agente(s) antimicrobiano(s) de la presente invención pueden no estar limitados por su manera de producción o fabricación, e incluye agentes, sustancias, compuestos o composición de materias que son sintéticas, producidas químicamente, de origen natural y/o derivadas tanto directa como indirectamente de un organismo o animal preferiblemente, organismo vivo incluyendo microorganismos, plantas y animales. Por ejemplo, el agente antimicrobiano puede ser uno o compuesto(s) sintéticos o naturales derivados directa o indirectamente de una bacteria, hongo, levadura, planta, insecto, reptil o mamífero. En un ejemplo, el agente antimicrobiano puede ser cualquier compuesto tal como un compuesto químico o una composición farmacéutica tal como un fármaco. En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es una composición que comprende un compuesto tal como un compuesto químico o un producto farmacéutico o un fármaco. En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano puede ser una composición que comprende dos o más compuestos tales como compuestos químicos, productos farmacéuticos y/o fármacos. En otro ejemplo, el agente antimicrobiano puede comprender o consistir en un fenómeno físico y/o químico o estrés aplicado a las células de los microorganismos descritos según un ejemplo de realización de aspecto amplio del presente documento. Según este ejemplo, el agente antimicrobiano puede comprender o consistir en uno o más fenómenos físicos y/o químicos o estrés aplicado a células de un microorganismo en división activa seleccionados de estrés térmico, luz ultravioleta, luz azul, radiación tal como radiación electromagnética, radiación de microondas, radiación con rayos X o rayos gamma, radiación de partículas tal como radiación de partículas alfa, beta o neutrones y/o estrés oxidativo.
Los ejemplos no limitantes de agente(s) antimicrobiano(s) abarcado(s) dentro del alcance de la presente invención incluyen aminoácidos y derivados de aminoácidos, ácidos grasos y derivados de ácidos grasos, péptidos antimicrobianos y derivados peptídicos, aminoglucósidos, ácidos aureólicos, aziridinas, bencenoides, bencimidazoles, cumarina-glicósidos, derivados de éter difenílico, epipolitiodioxopiperazinas, glucosaminas, glucopéptidos, imidazoles, derivados de indol, macrolactama, macrólidos, nucleósidos, beta-lactamas tales como penicilinas y cefalosporinas, peptidil nucleósidos, fenicoles, polienos, piridinas y pirimidinas, quinolonas y fluoroquinolonas, estatinas, esteroides, sulfonamidas, taxoides, tetraciclinas y aleaciones metálicas tales como aleaciones de cobre.
También se entenderá que el(los) agente(s) antimicrobiano(s) de la presente invención pueden formularse para la administración a un sujeto en cualquier forma de administración, incluyendo pero no limitado a auricular, conjuntival, bucal, cutánea, dental, electro-ósmosis, endocervical, endosinusal, endotraqueal, enteral, epidural, extraamniótico, extracorpóreo, hemodiálisis, infiltración, intersticial, intraabdominal, intraamniótica, intraarterial, intraarticular, intratrabiliar, intrabronquial, intrabursal, intracardiaca, intracartilaginosa, intracaudal, intracavernosa, intracavitaria, intracerebral, intracisternal, intracisternal, intracisternal, intracorneal, intradérmica, intradiscal, intraductal, intraduodenal, intradural, intraepidérmica, epidérmica, intraesofágica, intragástrica, intragingival, intraileal, intralesional, Intraluminal, intralinfática, intramedular, intrameníngea, intramuscular, intraocular, intraovárica, intrapericárdica, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrasinal, intraespinal, intrasinovial, intratendinosa, intratesticular, intratecal, intratorácica, intratubular, intratumoral, intratimpánica, intrauterina, intravascular, intravenosa, bolo intravenoso, por goteo intravenoso, intraventricular, intravesical, intravítrea, por iontoforesis, laríngea, nasal, nasogástrica, oftálmica, oral, orofaríngea, parenteral, percutánea, periarticular, peridural, periodontal, rectal, inhalación, retrobulbar, subconjuntival subcutánea, sublingual, submucosa, tópica, transdérmica, transmucosa, transplacentaria, transtraqueal, transtimpánica, ureteral, uretral y vaginal.
Como se usa en el presente documento, las frases "sensibilidad de las células del microorganismo a agente(s) antimicrobiano(s)" o "susceptibilidad del microorganismo a agente(s) antimicrobiano(s)" o "sensibilidad de un microorganismo a agente(s) antimicrobiano(s)" o "sensibilidad de un microorganismo a agente(s) antimicrobiano(s)" se entenderá que reflejan el uno o más agentes antimicrobianos para promover el daño a, o comprometer la integridad de, la morfología celular de las células del microorganismo en división activa cuando las células en división activa se exponen a, o se cultivan con una cantidad del agente antimicrobiano en comparación con la morfología celular de las células del microorganismo en división activa obtenidas del sujeto cuando se cultivan o incuban en ausencia del agente antimicrobiano. Por ejemplo, el agente antimicrobiano promueve el daño a, o compromete la integridad de la pared celular del microorganismo que finalmente puede conducir a que células del microorganismo experimenten lisis celular y/o descomposición celular completa después de la exposición de células del microorganismo en división activa en o derivadas de una muestra obtenida del sujeto, al agente antimicrobiano. La "susceptibilidad de células del microorganismo al agente antimicrobiano" o la "sensibilidad de células del microorganismo al agente antimicrobiano" se puede evaluar midiendo, p. ej., por citometría de flujo acústica, el efecto o grado del efecto del agente antimicrobiano en (i) la cantidad de contenido de ácido nucleico en, y/o (ii) volumen citoplasmático de, células del microorganismo en o derivadas de la muestra del sujeto después del cocultivo de células del microorganismo en división activa en y/o de la muestra del sujeto con una cantidad del agente antimicrobiano preferiblemente antes de que tenga lugar cualquier lisis celular y/o rotura celular completa. El efecto o grado del efecto del agente antimicrobiano en (i) la cantidad de contenido de ácido nucleico en, y/o (ii) volumen citoplasmático de células del microorganismo después de la exposición a la cantidad del agente antimicrobiano, se puede determinar por comparación con (i) la cantidad de contenido de ácido nucleico en, y/o (ii) el volumen citoplasmático de células del microorganismo en división activa cuando se cultivan en ausencia del agente antimicrobiano.
La expresión "compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico" como se usa en el presente documento pretende abarcar cualquier compuesto o composición de materia fluorescente que sea permeable a la membrana celular fácilmente de manera natural o que pueda hacerse que antes de su uso en la presente invención sea permeable a la membrana, y sea capaz de unirse ya sea de forma reversible como no reversible a ácidos nucleicos (tales como ARN y ADN) en células de microorganismos analizados en el método de la presente invención, incluyendo el ácido nucleico citoplasmático y/o nuclear y/o mitocondrial en células del microorganismo y que sea fluorescente dentro de las células del microorganismo cuando se une a ácidos nucleicos celulares dentro de las células del microorganismo para permitir la detección de señal o intensidad de fluorescencia por citometría de flujo acústica.
Los compuestos fluorescentes de unión a ácido nucleico adecuados para usar en la presente invención serán conocidos por el experto en la técnica e incluyen colorantes fluorescentes de unión a ácido nucleico tales como SYTO 9. Además, los colorantes fluorescentes de unión a ácidos nucleicos se han descrito ampliamente en la técnica, por ejemplo en Deere, D., Porter J., Edwards, C., Pickup, R. Evaluation of the suitability of bis-(1,3-dibutylbarbitturic acid) trimetineoxonol, (diBA-C4(3)-), for the flow cytometric assessment of bacterial viability.FEMS Microbio!. Lett.130, 165-9 (1995).
La expresión "fácilmente permeable" cuando se usa en el presente documento en relación con un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico de la presente invención pretende significar cualquier compuesto fluorescente de ácido nucleico que sea capaz de atravesar fácilmente la membrana celular de las células del microorganismo y entrar en las células para unirse a ácidos nucleicos celulares, sustancialmente sin tratamiento de células del microorganismo con el fin de hacer que el microorganismo sea sensible a la permeabilidad del compuesto fluorescente de ácido nucleico a través de su membrana celular.
La expresión "suceso microbiano", como se usa en el presente documento en el contexto de la presente invención, se entenderá que significa un paquete de datos medidos por citometría de flujo acústica que ha sido generado por una célula microbiana (p. ej., bacteriana). Específicamente, se entenderá que cuando una partícula tal como una célula microbiana pasa a través de los láseres del citómetro, los fotones recogidos de ese suceso cruzan un tubo fotomultiplicador, que convierte la señal física en una señal eléctrica, cuyo software unido al citómetro convierte en datos digitales, que se registran como un "suceso". Se hace una distinción basándose en parámetros de tamaño y la presencia de parámetros de fluorescencia consistentes con ácidos nucleicos microbianos unidos a un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico. Estos parámetros pueden establecerse midiendo la suspensión de células microbianas antes, y después tras añadir el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico. Se entenderá que habrá un mínimo de aumento en unidades arbitrarias de fluorescencia igual al aumento de fluorescencia del colorante usado unido a ácido nucleico, en aquellos sucesos que contienen ácidos nucleicos tales como ADN. Por ejemplo, cuando se usa SYTO 9, los sucesos que contienen ácido nucleico tal como ADN no serán menos de 10 veces más brillantes (en el canal de 515-545 nm) cuando está presente SYTO 9 en comparación con cuando no lo está.
De manera similar, la expresión "residuos no microbianos" como se usa en el presente documento con referencia a la medición de sucesos por citometría de flujo acústica, se entenderá que significa un paquete de datos medidos por citometría de flujo acústica que ha sido generado por una célula microbiana (p. ej., bacteriana).
Otras definiciones para los términos seleccionados usados en el presente documento pueden encontrarse dentro de la descripción detallada de la invención y se aplican a lo largo de la misma. A menos que se defina lo contrario, todos los demás términos científicos y técnicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención. La expresión "agente activo" puede significar un agente activo, o puede abarcar dos o más agentes activos.
Específico
Los autores de la invención han desarrollado un método para determinar la sensibilidad de los organismos microbianos a agentes antimicrobianos. En particular, el método es útil para determinar la sensibilidad deKlebsiellay otras bacterias Gram negativas a un agente antibacteriano. Además, el método también es útil para determinar la concentración mínima inhibidora (MIC) de bacterias para agentes antimicrobianos.
En la presente invención, los autores de la invención han desarrollado un flujo de trabajo de citometría de flujo acústica para caracterizar la dinámica de poblaciones y medir la sensibilidad cualitativa a antibióticos carbapenémicos y a un antibiótico cefalosporínico, y también medir la concentración mínima inhibidora (MIC), en una colección de aislados deK. pneumoniaeinternacionalmente representativa. Además, los autores de la invención emplearon el flujo de trabajo de citometría de flujo acústica para caracterizar y medir la sensibilidad cualitativa a un antibiótico penicilínico y a un antibiótico cefalosporínico, y también para medir la sensibilidad cuantitativamente midiendo la MIC, en una colección de aislados representativa en la colección de aislados deStaphylococcus aureusrepresentativa. El método de ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica (FAST) de la presente invención combina la categorización cualitativa rápida de S/NS y la medición cuantitativa de la MIC en un procedimiento de ensayo que puede completarse poco después de la recepción de un aislado primario. Los resultados de sensibilidad cualitativa de FAST y la MIC derivada de FAST se corresponden estrechamente con la MIC de microdilución en caldo, están alineados con la norma ISO para AST (ISO 200776-1; 2006) y tienen aplicaciones potenciales para la determinación rápida de sensibilidad a antimicrobianos en una variedad más amplia de microorganismos que incluyen una variedad más amplia de bacterias Gram negativas y/o bacterias Gram positivas.
Por consiguiente, en un aspecto amplio de la presente invención, se proporciona un método para determinar la sensibilidad de un microorganismo unicelular o multicelular a un agente antimicrobiano por citometría de flujo acústica. El método comprende las siguientes etapas: (i) incubar en un medio de cultivo (a) células del microorganismo de una muestra obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, y/o (b) una muestra obtenida del sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, en donde dicha muestra comprende células de dicho microorganismo, en donde dicha incubación es durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células se dividan activamente para obtener de ese modo un cultivo en división activa de dichas células de dicho microorganismo; (ii) exponer las células del microorganismo en y/o del cultivo celular en división activa obtenido en la etapa (i) a un agente antimicrobiano durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células del microorganismo se dividan activamente; (iii) marcar las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano en la etapa (ii) con un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico; (iv) medir el efecto de dicho agente antimicrobiano en la morfología celular de dichas células del microorganismo mediante citometría de flujo acústica; y (v) determinar la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica, en donde la etapa (v) comprende (A) determinar la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano cualitativamente determinando a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica que dicho microorganismo es sensible o no sensible a dicho agente antimicrobiano; y (B) determinar la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano cuantitativamente determinando a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica la concentración mínima inhibidora (MIC) de dicho agente antimicrobiano al que el microorganismo es sensible.
Por ejemplo, el método comprende obtener una muestra que comprende células del microorganismo de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por el microorganismo.
En un segundo aspecto amplio de la presente invención, se proporciona un método para determinar la sensibilidad de un microorganismo unicelular o multicelular a una pluralidad de agentes antimicrobianos. El método comprende llevar a cabo el método según el primer aspecto amplio en donde el método comprende exponer las células del microorganismo en división activa de la muestra obtenida del sujeto a uno o más agentes antimicrobianos representativos de una primera familia o panel de una pluralidad de agentes antimicrobianos, para determinar de este modo la sensibilidad de las células del microorganismo a agentes antimicrobianos que pertenecen a esta primera familia o panel de agentes antimicrobianos.
En una realización de este segundo aspecto, cuando se determina que las células del microorganismo son sensibles al uno o más agentes antimicrobianos representativos de la primera familia o panel de la pluralidad de agentes antimicrobianos, el método puede comprender además llevar a cabo el método según el primer aspecto amplio exponiendo las células del microorganismo en división activa a uno o más agentes antimicrobianos adicionales que pertenecen a la primera familia o panel de agentes antimicrobianos, para determinar de este modo la sensibilidad de las células del microorganismo para el sujeto a dichos agentes antimicrobianos adicionales.
En una realización adicional, el método según este segundo aspecto puede comprender además llevar a cabo el método según el primer aspecto, en donde el método comprende exponer las células del microorganismo en división activa a
(i) uno o más agentes antimicrobianos representativos de una segunda familia o panel de una pluralidad de agentes antimicrobianos, y/o
(ii) uno o más agentes antimicrobianos representativos de una tercera familia o panel de una pluralidad de agentes antimicrobianos, y/o
(iii) uno o más agentes antimicrobianos representativos de una cuarta familia o panel de una pluralidad de agentes antimicrobianos, y/o
(iv) a uno o más agentes antimicrobianos representativos de cualquier otra familia o panel adicional de una pluralidad de agentes antimicrobianos,
para determinar así la sensibilidad de las células del microorganismo a agentes antimicrobianos pertenecientes a dicha segunda y/o tercera y/o cuarta y/o cualquier otra familia o panel adicional de una pluralidad de agentes antimicrobianos.
En un ejemplo, cuando se determina que las células del microorganismo son sensibles al uno o más agentes antimicrobianos representativos de la segunda y/o tercera y/o cuarta y/u otra familia o panel adicional de la pluralidad de agentes antimicrobianos, entonces dicho método comprende además llevar a cabo el método según el primer aspecto amplio exponiendo las células del microorganismo en división activa a uno o más agentes antimicrobianos adicionales que pertenecen a la segunda y/o tercera y/o cuarta y/o cualquier otra familia o panel adicional de la pluralidad de agentes antimicrobianos, para determinar de ese modo la sensibilidad de dichas células de dicho microorganismo a los agentes antimicrobianos adicionales.
Un ejemplo de un método según el segundo aspecto, comprende cribar la sensibilidad a agentes antimicrobianos de bacterias Gram negativas o Gram positivas.
Por ejemplo, el cribado selectivo de sensibilidad de bacterias a agentes antimicrobianos puede realizarse como se describe ampliamente en el ejemplo proporcionado a continuación, p. ej., con respecto al cribado de sensibilidad de bacterias Gram negativas.
Por ejemplo, la quimioterapia antimicrobiana implica idealmente la selección del antibiótico más eficaz, de espectro estrecho, activo contra el microbio. Estos criterios pueden formar la base de pautas que clasifican los agentes antimicrobianos como de primera, segunda, tercera y cuarta línea. Por ejemplo, los agentes de primera línea son los de espectro más estrecho, reservándose preferiblemente los agentes de última línea para aislados difíciles de tratar. Los autores de la invención han especulado que la aparición de resistencia a los antimicrobianos ha hecho difícil seleccionar tratamientos antimicrobianos. Como resultado, el tratamiento a menudo comienza con agentes de segunda o tercera línea. Esto puede promover una mayor resistencia a los agentes de segunda y tercera línea, que a su vez pueden promover el uso de agentes de cuarta línea, promoviendo por lo tanto a su vez la resistencia a estos. Por lo tanto, se sugiere un panel rápido que indique la eficacia de líneas tempranas de agentes antimicrobianos.
Por ejemplo, la mayor parte de los agentes antimicrobianos de segunda y tercera línea activos contra bacterias Gram negativas pueden pertenecer a la familia de beta-lactámicos de espectro extendido (p. ej., ceftriaxona, ceftazidima y cefepima). La ceftriaxona puede usarse en el laboratorio como un agente de cribado para indicar la presencia de mecanismos de resistencia que hacen que todas las beta-lactamas de espectro extendido sean ineficaces (p. ej., como puede ser para enterobacteriáceas). La no sensibilidad a la ceftriaxona p. ej., en enterobacteriáceas puede determinarse cuando los aislados pueden crecer en medios que contienen p. ej., 2 mg/l de ceftriaxona. Este crecimiento puede indicar el uso de un carbapenem.
Por ejemplo, la sensibilidad a carbapenems se puede ensayar exponiendo aislados a meropenem en el punto de corte sugerido (p. ej., 2 mg/l mencionados anteriormente o cualquier otro punto de corte actual de enterobacteriáceas de EUCAST). Cuando los aislados eran resistentes a un carbapenem, puede ser necesario considerar la adición de agentes antimicrobianos adicionales (p. ej., colistina). El panel también puede analizar la resistencia a la colistina p. ej., para permitir una selección rápida de los agentes de última línea.
En un ejemplo de este tipo, se pueden usar puntos de corte específicos de especie, temporales y de ubicación dependiendo de la referencia antimicrobiana (EUCAST, CLSI u otra), posterior a la revisión de los puntos de corte u organismo detectado.
Por ejemplo, el método de cribado de sensibilidad de Gram negativas anterior puede no ser aplicable para cribar la sensibilidad de especiesde Pseudomonas, Acinetobacter.En esos casos, el panel de antibióticos puede necesitar incorporar un indicador equivalente de beta-lactama como cefepima.
Concentración preferida de células de un microorganismo en división activa que se expone a un agente antimicrobiano
En un ejemplo, la cantidad y/o tipo del agente antimicrobiano usado para determinar la sensibilidad de un microorganismo puede depender del "efecto de inóculo'' para ese agente antimicrobiano. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "efecto de inóculo" se entenderá que se refiere al fenómeno de laboratorio mediante el cual puede observarse un aumento en la concentración mínima inhibidora de un agente antimicrobiano tal como un antibiótico cuando aumenta el número de microorganismos expuestos al agente antimicrobiano. Por ejemplo, en un entorno de laboratorio, la eficacia del agente antimicrobiano puede depender de su concentración final en el cultivo o suspensión de ensayo en función del número total o concentración de las células microbianas presentes en el cultivo o suspensión de ensayo.
El método para determinar la sensibilidad de un microorganismo a un agente antimicrobiano y/o determinar la MIC del agente microbiano al que el microorganismo es sensible, mediante citometría de flujo acústica según cualquier aspecto amplio descrito en el presente documento puede llevarse a cabo usando cualquier concentración o cantidad de las células de un microorganismo en división activa que se están exponiendo a un agente antimicrobiano. A pesar de esto, los autores de la presente invención han mostrado que, para explicar el efecto de inóculo del agente antimicrobiano ensayado, se prefiere que las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano de ensayo en un método según cualquier aspecto amplio de la invención descrita en el presente documento estén presentes en una concentración en el intervalo de aproximadamente 5.0 x 101 a aproximadamente 5.0 x 109 células microbianas/ml, y más preferiblemente en una concentración de aproximadamente 5.0 x 102 a aproximadamente 5.0 x 108 células microbianas/ml, y lo más preferiblemente en una concentración de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml. Por ejemplo, el método según cualquier aspecto amplio de la invención descrito en el presente documento comprende exponer las células del microorganismo en y/o del cultivo celular en división activa al agente antimicrobiano, en donde las células microbianas que se exponen al agente antimicrobiano están presentes en una concentración de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml. En un ejemplo, la concentración de las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano es de aproximadamente 5.0 x 104 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml, o de aproximadamente 5.0 x 105 a aproximadamente 5.0 x 107 células/ml, o de aproximadamente 5.0 x 106 a aproximadamente 5.0 x 107 células/ml. En un ejemplo de este tipo, la concentración de las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano es de aproximadamente 5.0 x 103 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 104 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 105 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 106 células/ml, o aproximadamente 5.0 x 107 células/ml. En algunas realizaciones de ejemplo, la concentración de las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano es de aproximadamente 5.0 x 105 células/ml. Es deseable que las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano de ensayo estén presentes en las concentraciones mencionadas anteriormente para determinar la sensibilidad de un microorganismo a un agente antimicrobiano mediante citometría de flujo acústica usando el método de cualquier aspecto amplio descrito en el presente documento. Alternativamente, o además, es deseable que las células microbianas en división activa que se exponen al agente antimicrobiano de ensayo estén presentes en las concentraciones mencionadas anteriormente cuando se determina la MIC del agente microbiano al que se ha determinado que el microorganismo es sensible. En algunos de tales ejemplos, las células microbianas pueden ser bacterias. En otros ejemplos, las células microbianas pueden ser células fúngicas. En otros ejemplos más, las células microbianas pueden ser células de levadura.
Por consiguiente, el método según la presente invención, comprende una etapa de incubar en un medio de cultivo células del microorganismo en o más de una muestra obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células se dividan activamente, para obtener así un cultivo en división activa de las células de dicho microorganismo que comprende las concentraciones mencionadas anteriormente de las células microbianas en división activa. Según este ejemplo, es deseable que se alcancen las concentraciones mencionadas anteriormente antes de la exposición de las células en el cultivo celular en división activa al agente antimicrobiano. Alternativamente, o además, las concentraciones mencionadas anteriormente de células en división activa en el cultivo celular pueden lograrse combinando y/o concentrando células microbianas en división activa de dos o más cultivos para obtener un único cultivo de células microbianas en división activa antes de la exposición de las células al agente antimicrobiano.
Los métodos para determinar la concentración de células microbianas en un cultivo o suspensión celular son conocidos por el experto e incluyen, por ejemplo, mediciones bien documentadas de densidad óptica (OD) en un espectrofotómetro adecuado (p. ej., Thermo Fisher Scientific) y/oin situusando el integrador de flujo de bomba Lambda según las instrucciones del fabricante (p. ej., Lambda Laboratory Instruments, Ruessenstrase 6, CH-6340Baar, Suiza - Europa). Por ejemplo, la densidad celular de células microbianas en división activa, tales como células bacterianas o de levadura, se puede determinar midiendo la OD a 600-650 nm en un espectrofotómetro, o midiendo la densidad celular total mediante el recuento en una cámara de recuento de células Neubauer bajo un microscopio óptico, o usando un nefelómetro. Alternativamente, o además, la concentración de células puede determinarse mediante un contador de células automatizado tal como un sistema de recuento de células o partículas "contador Coulter'' o un contador de células automatizado Countess II FL (p. ej., Thermos Fisher Scientific). Alternativamente, o además, la concentración de células microbianas puede determinarse combinando opcionalmente la suspensión con cualquier marcador fluorescente apropiado (en presencia o ausencia de patrones de microesferas marcadas fluorescentemente), y analizando la suspensión para contar con precisión el número de células microbianas usando cualquier citómetro de flujo.
Los métodos para concentrar células en un cultivo celular también están bien documentados y son conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, las células en división activa de dos o más cultivos celulares separados se pueden combinar en un único cultivo transfiriendo suspensiones celulares de dos o más cultivos a un tubo de centrífuga estéril de tamaño apropiado seguido de centrifugación durante un período de tiempo, p. ej., durante 5 a 10 minutos, p. ej., a 800 x g. Después el líquido sobrenadante se puede separar preferiblemente sin alterar el sedimento celular. El sedimento que contiene el sedimento celular restante puede resuspenderse en el volumen deseado de un medio de cultivo adecuado tal como los descritos en el presente documento y/o transferirse a un cultivo existente de células microbianas en división activa para aumentar así el número de células microbianas en división activa en ese cultivo.
Compuestos fluorescentes de unión a ácido nucleico adecuados
En un ejemplo de un método según cualquier aspecto amplio de la invención descrita en el presente documento, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico puede comprender una cualquiera o más de las siguientes características: permeable a la pared celular y a la membrana, se une a ácidos nucleicos (tales como ADN y/o ARN), tiene algún grado de fluorescencia nativa, es fotoestable.
Preferiblemente, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico se une a ácidos nucleicos citoplasmáticos, mitocondriales y nucleares en las células del microorganismo. Por ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico se une a ácido desoxirribonucleico (ADN) y/o ácido ribonucleico (ARN) en las células del microorganismo.
En un ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico comprende un resto de unión a ácido nucleico y un resto de marcador fluorescente. Sin embargo, en otro ejemplo, los compuestos fluorescentes de unión a ácido nucleico adecuados para usar en la presente invención pueden ser un compuesto fluoróforo que no tiene un resto de unión a ácido nucleico y un resto de marcador fluorescente separados. Por ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico puede ser un colorante fluoróforo intercalante de ácido nucleico.
En un ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es un colorante fluoróforo seleccionado de colorantes de la gama Quant-iT™ disponible comercialmente (p. ej., Thermo Fisher Scientific) y/o colorantes de la gama SYBR™ permeables a la membrana disponibles comercialmente (p. ej., Thermo Fisher Scientific) y/o colorantes de la gama Hoechst disponibles comercialmente (p. ej., Thermo Fisher Scientific; o Invitrogen) incluyendo pero sin limitación Hoechst 33258 (bis-bencimida pentahidrato), Hoechst 33342 [también conocido como [2-(4-etoxifenil)-6-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-bencimidazol-2-il]-1H-bencimidazol o trihidrocloruro trihidrato], Hoechst 34580 [también conocido como N,N-dimetil-4-[6-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-bencimidazol-2-il]-1 H-bencimidazol-2-il]anilina], o amarillo nuclear Hoechst S769121 y/o diaminofenilindol [también conocido como 4',6-diamidino-2-fenilindol o 2-(4-carbamimidoilfenil)-1H-indol-6-carboximidamida o DAPI] y derivados de DAPI permeables a la membrana (p. ej., Biotium o Thermo Fisher Scientific) y/o yoduro de propidio (PI) (p. ej., Thermo Fisher Scientific o Stemcell Technologies), y/o bromuro de etidio (EB o EtBr) (p. ej., Sigma-Aldrich, Merck) y/o yoduro de hexidio (p. ej., Thermo Fisher Scientific) y/o naranja de acridina [también conocido como (3-N,3-N,6-N,6-N-tetrametilacridina-3,6-diamina o AO] (p. ej., Thermo Fisher Scientific) y/o colorantes de gama DRAQ5™ y DRAQ7™ (p. ej., Biostatus, BioLegend, o Beckman Coulter, Inc) y/o colorantes de la gama SYTOX™ (también conocido como verde SYTO) (p. ej., Thermo Fisher Scientific) y/o colorantes de la gama SYTO™ tales como SYTO 9, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO BC (p. ej., Thermo Fisher Scientific).
En un ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es un colorante fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en SYTO 9, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO BC, Hoechst 33342, yoduro de propidio (PI), DAPI y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es un colorante fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en SYTO 9, Hoechst 33342 y una combinación de SYTO 9 y yoduro de propidio (PI).
Preferiblemente, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es el colorante SYTO 9.
En un ejemplo de un método según esta realización, la etapa de marcar células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico, comprende teñir las células del microorganismo con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico para discriminar entre sucesos microbianos (tales como sucesos bacterianos) y residuos no microbianos (tales como residuos no bacterianos) cuando se mide el efecto del agente antimicrobiano en la morfología celular de las células del microorganismo mediante citometría de flujo acústica.
Un experto en la técnica podrá determinar fácilmente la capacidad de un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico para ser permeable a la membrana, por ejemplo, mediante la polaridad relativa de los compuestos, y específicamente la naturaleza lipófila de los restos expuestos en el compuesto usando métodos rutinarios conocidos en la técnica. En otro ejemplo, se puede emplear el siguiente método para determinar que un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es permeable a la membrana. En primer lugar, una suspensión de microorganismos tales como bacterias puede normalizarse respecto a una concentración de trabajo apropiada tal como aproximadamente de 5.0 x 103 a 5.0 x 107 células microbianas/ml. La suspensión normalizada puede dividirse entonces en un intervalo de tubos (típicamente pueden usarse 10, pero puede usarse cualquier número mayor que o incluyendo 1 tubo). Después se añade el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico a cada uno de los tubos que se están ensayando, a lo largo de un intervalo de concentraciones controladas. Típicamente, los compuestos pueden ensayarse en diluciones dobles descendentes desde su solubilidad máxima. A modo de ejemplo solamente, si un compuesto es soluble a 10 mM/ml, es deseable ensayar 10 mM, 5 mM, 2.5 mM, etc. El compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico se deja incubar durante un período de tiempo - típicamente los tiempos de tinción son de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos, pero se puede ensayar cualquier período de tiempo. Las células después pueden lavarse, por ejemplo, por centrifugación (preferiblemente 9800 x g durante 5 minutos, pero también puede aplicarse menos tiempo (1 minuto - 30 minutos) y velocidades variables, p. ej., de 4000 x g a 30000 x g. Alternativamente, o además, las células pueden someterse a una filtración, donde la suspensión de compuesto fluorescente de unión a células/ácido nucleico puede hacerse pasar a través de un filtro con una malla lo suficientemente pequeña para capturar bacterias (tamaño de poros 1 pM o menor) pero eliminar el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico. Las células pueden analizarse después de lavado/filtrado usando cualquier dispositivo de fluorescencia capaz de excitar el compuesto fluorescente y medir la emisión. Un microscopio de fluorescencia, un citómetro de flujo o espectrofotómetro son todos ejemplos de equipos comúnmente usados. En este momento, se puede usar un control negativo (una parte alícuota de la suspensión bacteriana que no se ha expuesto al colorante) para determinar la presencia del colorante que queda en la célula.
De manera similar, está dentro del conocimiento del experto en la técnica determinar que un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es fluorescente de manera nativa dentro de las células. Por ejemplo, la determinación puede llevarse a cabo mediante el mismo método descrito anteriormente con respecto a la determinación de que el compuesto es permeable a la membrana celular. Por ejemplo, con el propósito de determinar que un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es fluorescente de forma nativa dentro de las células, se puede usar una condición de control, usando una vesícula derivada de membrana que no contiene ácidos nucleicos, para ensayar que existe fluorescencia en las células en ausencia de ácidos nucleicos.
De manera similar, está dentro del conocimiento del experto en la técnica determinar que un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es fotoestable dentro de las células. Por ejemplo, las mediciones pueden realizarse mediante el mismo método descrito anteriormente con respecto a la determinación de que el compuesto es permeable a la membrana celular y/o fluorescente de manera nativa dentro de las células, con comparación directa entre una vesícula derivada de membrana y una estructura que contiene un ácido nucleico tal como un ADN (puede ser una vesícula derivada de membrana, o una célula/organismo). Por ejemplo, la medición de una relación de unidades arbitrarias de fluorescencia entre la muestra sin un ácido nucleico presente, y con un ácido nucleico presente, produce una unidad de medición conocida como potenciación de la fluorescencia. Las instrucciones del fabricante y las documentaciones de información que contienen esta información, también pueden consultarse para determinar que un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico es fotoestable dentro de las células.
Preferiblemente, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico se une a ácidos nucleicos citoplasmáticos, mitocondriales y nucleares en las células del microorganismo. Por ejemplo, el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico se une a ácido desoxirribonucleico (ADN) y/o ácido ribonucleico (ARN) en las células del microorganismo. Las mediciones se pueden realizar como se detalla anteriormente, con comparación directa entre una vesícula derivada de membrana y una estructura que contiene ADN (puede ser una vesícula derivada de membrana, o una célula/organismo). La medición de una relación de unidades arbitrarias de fluorescencia entre la muestra sin ADN o ARN presente y con ADN o ARN presente, produce mediciones de potenciación de la fluorescencia. De nuevo, se pueden consultar las instrucciones del fabricante para determinar si un compuesto disponible comercialmente se une a ácidos nucleicos citoplasmáticos, mitocondriales y nucleares en las células del microorganismo y/o se une a ADN y/o ARN.
Condiciones para cultivar microorganismos
i) Medios de cultivo
En otro ejemplo de un método según cualquier aspecto amplio de la invención descrito en el presente documento, el medio de cultivo para incubar células de la forma de una muestra obtenida del sujeto, puede ser nutricionalmente completo y/o exento de componentes microbianos y/o contener macroproteínas mínimas. Preferiblemente, el medio de cultivo usado nutrirá las células durante la incubación con el antibiótico. En un ejemplo, el medio de cultivo es uno cualquiera o más de los siguientes: caldo de infusión de cerebro y corazón, caldo de lisogenia, caldo de nutrientes, medio Oxoid Iso-Sensitest™, caldo Mueller-Hinton.
El cultivo de células de un microorganismo que está presente en una muestra biológica obtenida de un sujeto en el contexto de la presente invención, puede lograrse añadiendo la muestra clínica obtenida del sujeto o una parte alícuota de la misma, y/o células microbianas purificadas y/o aisladas de la muestra clínica obtenida del sujeto, a un medio de cultivo o crecimiento que contiene nutrientes adecuados tales como una fuente de carbono (preferiblemente como mínimo un azúcar simple), una fuente de nitrógeno (preferiblemente como mínimo aminoácidos), y tener un pH compatible con el pH encontrado en el cuerpo (preferiblemente un pH en el intervalo de pH 6.2 - pH 8.2).
Los medios usados para cultivar células de un microorganismo para crecimiento y/o mantenimiento microbiano se preparan mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en BD Diagnostics(Manualof Microbiological Culture Media,Sparks, Maryland, Segunda Edición, 2009); Versalovic et al. (enManual of Clinical Microbiology,American Society for Micobiology, Washington D.C., 10a Edición, 2011); Garrity et al. (enBergey's Manual of Systemic Bacteriology,Springer, Nueva York, Segunda edición 2001). Como será evidente para el experto en la técnica, la morfología microbiana, tal como una morfología de una bacteria, se puede realizar llevando a cabo una tinción, tal como una tinción Gram (véase p. ej., Cioco 2005Curr. Protoc. Microbiol.Apéndice 3) y la viabilidad se pueden evaluar como se describe, por ejemplo, por Murray et al. (En:Manual of Clinical Microbiology, American Society of Microbiology,Washington D.C, Novena edición 2007). A continuación se describen medios de cultivo adecuados de ejemplo para cultivar células de un microorganismo para el crecimiento y/o mantenimiento microbiano y/o con el fin de incubar células de microorganismos durante un tiempo y en condiciones para que dichas células se dividan activamente para obtener de ese modo un cultivo de dichas células en división activa.
Un medio de cultivo MHB adecuado puede comprender aproximadamente 300.0 g de extracto de carne bovina (a partir de infusión deshidratada), aproximadamente 17.5 g de hidrolizado de caseína y aproximadamente 1.5 g de almidón, p. ej., reconstituido en aproximadamente 1 l de agua, p. ej., y el pH puede ajustarse a aproximadamente pH 7.3 ± 0.1 medido a aproximadamente 25°C. Preferiblemente, el medio de cultivo MHB comprende aproximadamente 300.0 g de extracto de carne bovina (a partir de infusión deshidratada), aproximadamente 17.5 g de hidrolizado de caseína y aproximadamente 1.5 g de almidón, reconstituido en aproximadamente 1 l de agua y el pH puede ajustarse a aproximadamente pH 7.3 ± 0.1 medido a aproximadamente 25 °C.
Un medio de cultivo BHIB adecuado puede comprender aproximadamente 12.5 g de sólidos de infusión de cerebro, aproximadamente 5.0 g de sólidos de infusión de corazón bovino, aproximadamente 10.0 g de proteosa peptona, aproximadamente 2.0 g de glucosa, aproximadamente 5.0 g de cloruro de sodio, aproximadamente 2.5 g de fosfato disódico, p. ej., reconstituido en aproximadamente 1 l de agua, y el pH puede ajustarse a aproximadamente pH 7.4 ± 0.2 medido a aproximadamente 25°C. Preferiblemente, el medio de cultivo BHIB comprende aproximadamente 12.5 g de sólidos de infusión de cerebro, aproximadamente 5.0 g de sólidos de infusión de corazón bovino, aproximadamente 10.0 g de proteosa peptona, aproximadamente 2.0 g de glucosa, aproximadamente 5.0 g de cloruro de sodio, aproximadamente 2.5 g de fosfato disódico, reconstituido en aproximadamente 1 l de agua, y el pH ajustado a aproximadamente pH 7.4 ± 0.2 medido a aproximadamente 25°C.
Un medio de cultivo de caldo de lisogenia adecuado puede comprender aproximadamente 10 g de peptona tal como peptona 140, aproximadamente 5 g de extracto de levadura, aproximadamente 5 g de cloruro de sodio, y puede reconstituirse en, p. ej., aproximadamente 1 l de agua. Preferiblemente, el medio de cultivo de caldo de lisogenia comprende aproximadamente 10 g de peptona tal como peptona 140, aproximadamente 5 g de extracto de levadura, aproximadamente 5 g de cloruro de sodio, reconstituido en aproximadamente 1 l de agua.
Un medio de cultivo de caldo nutriente adecuado puede comprender aproximadamente 1.0 g de polvo de extracto de carne “Lab-Lemco” (p. ej., Thermo Scientific), aproximadamente 2.0 g de extracto de levadura, aproximadamente 5.0 g de peptona, aproximadamente 5.0 g de cloruro de sodio, y puede reconstituirse en aproximadamente 1 l de agua, y el pH puede ajustarse a aproximadamente pH 7.4 ± 0.2 medido, p. ej., a aproximadamente 25°C. Preferiblemente, el medio de cultivo de caldo nutriente comprende aproximadamente 1.0 g de polvo de extracto de carne “Lab-Lemco” (p. ej., Thermo Scientific), aproximadamente 2.0 g de extracto de levadura, aproximadamente 5.0 g de peptona, aproximadamente 5.0 g de cloruro de sodio, y reconstituirse en aproximadamente 1 l de agua, y el pH ajustado a aproximadamente pH 7.4 ± 0.2 medido, p. ej., a aproximadamente 25°C.
Un medio de cultivo Medio Oxoid Iso-Sensitest adecuado puede comprender aproximadamente 11 g de caseína hidrolizada, aproximadamente 3.0 g de peptonas, aproximadamente 2.0 g de glucosa, aproximadamente 3.0 g de cloruro sódico, aproximadamente 1.0 g de almidón soluble, aproximadamente 2.0 g de hidrogenofosfato disódico, aproximadamente 1.0 g de acetato sódico, aproximadamente 0.2 g de glicerofosfato de magnesio, aproximadamente 0.1 g de gluconato cálcico, aproximadamente 0.001 de sulfato cobaltoso, aproximadamente 0.001 de sulfato cúprico, aproximadamente 0.001 de sulfato de cinc, aproximadamente 0.001 g de sulfato ferroso, aproximadamente 0.002 cloruro manganoso, aproximadamente 0.001 g de menadiona, aproximadamente 0.001 g de cianocobalamina, aproximadamente 0.02 g de hidrocloruro de L-cisteína, aproximadamente 0.02 g de L-triptófano, aproximadamente 0.003 g de piridoxina, aproximadamente 0.003 g de pantotenato, aproximadamente 0.003 g de nicotinamida, aproximadamente 0.0003 g de biotina, aproximadamente 0.00004 g de tiamina, aproximadamente 0.01 g de adenina, aproximadamente 0.01 g de guanina, aproximadamente 0.01 g de xantina, aproximadamente 0.01 g de uracilo, y se puede reconstituir, p. ej., en aproximadamente 1 l de agua, y el pH se puede ajustar a, p. ej., aproximadamente pH 7.4 ± 0.2 medido a aproximadamente 25°C.
Preferiblemente, el medio de cultivo Medio Oxoid Iso-Sensitest comprende aproximadamente 11 g de caseína hidrolizada, aproximadamente 3.0 g de peptonas, aproximadamente 2.0 g de glucosa, aproximadamente 3.0 g de cloruro sódico, aproximadamente 1.0 g de almidón soluble, aproximadamente 2.0 g de hidrogenofosfato disódico, aproximadamente 1.0 g de acetato sódico, aproximadamente 0.2 g de glicerofosfato de magnesio, aproximadamente 0.1 g de gluconato cálcico, aproximadamente 0.001 de sulfato cobaltoso, aproximadamente 0.001 de sulfato cúprico, aproximadamente 0.001 de sulfato de cinc, aproximadamente 0.001 g de sulfato ferroso, aproximadamente 0.002 cloruro manganoso, aproximadamente 0.001 g de menadiona, aproximadamente 0.001 g de cianocobalamina, aproximadamente 0.02 g de hidrocloruro de L-cisteína, aproximadamente 0.02 g de L-triptófano, aproximadamente 0.003 g de piridoxina, aproximadamente 0.003 g de pantotenato, aproximadamente 0.003 g de nicotinamida, aproximadamente 0.0003 g de biotina, aproximadamente 0.00004 g de tiamina, aproximadamente 0.01 g de adenina, aproximadamente 0.01 g de guanina, aproximadamente 0.01 g de xantina, aproximadamente 0.01 g de uracilo, reconstituido en aproximadamente 1 l de agua, y el pH se puede ajustar a, p. ej., aproximadamente pH 7.4 ± 0.2 medido a aproximadamente 25°C.
Un medio de cultivo de caldo de tripticasa de soja adecuado puede comprender aproximadamente 17 g de triptona (p. ej., de digerido pancreático de caseína), aproximadamente 3.0 g de Soytone (p. ej., de digerido péptico de soja), aproximadamente 2.5 g de glucosa (p. ej., dextrosa), aproximadamente 5.0 g de cloruro de sodio, aproximadamente 2.5 g de fosfato dipotásico, y puede reconstituirse, p. ej., en aproximadamente 1 l de agua. Preferiblemente, el medio de cultivo de caldo de tripticasa de soja comprende aproximadamente 17 g de triptona (p. ej., de digerido pancreático de caseína), aproximadamente 3.0 g de Soytone (p. ej., de digerido péptico de soja), aproximadamente 2.5 g de glucosa (p. ej., dextrosa), aproximadamente 5.0 g de cloruro sódico, aproximadamente 2.5 g de fosfato dipotásico, y reconstituido en aproximadamente 1 l de agua.
Alternativamente, o además, p. ej., para microorganismos raros e inusuales, los requisitos de medios específicos se pueden seleccionar de repositorios de información tales como: https://www.dsmz.de/catalogues/cataloguemicroorganisms/culture-technology/list-of-media-for-microorganisms.html. Preferiblemente, el medio de cultivo usado es caldo Mueller-Hinton, p. ej., porque abarca todas las características deseables mencionadas anteriormente de un medio de cultivo, y es el medio estándar con el que se alinean todas las prácticas de sensibilidad a antibióticos actualmente establecidas.
ii) Tiempos y condiciones suficientes para que las células microbianas se dividan activamente para obtener de este modo un cultivo en división activa
Para obtener células en división activa es deseable lograr condiciones del entorno adecuadas para que las células de un microorganismo crezcan y se dividan, tales como temperatura, humedad y atmosféricas, condiciones atmosféricas.
Un cultivo de células microbianas en división activa puede prepararse incubando una muestra biológica que comprende células viables de un microorganismo que se ha obtenido de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por el microorganismo, o incubando células microbianas viables aisladas de la muestra biológica en un medio de cultivo adecuado tal como el descrito anteriormente.
En un ejemplo, el método comprende incubar una parte alícuota de la muestra biológica o una parte alícuota de las células de la muestra biológica en un cultivo adecuado durante un período de tiempo para que se produzcan de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 divisiones celulares, y más preferiblemente durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células experimenten de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 divisiones celulares. Se entenderá que el periodo de tiempo requerido para que las células de un microorganismo experimenten una división celular variaría dependiendo del tipo o especie del microorganismo encontrado en la muestra biológica. Algunos microorganismos pueden experimentar división celular en aproximadamente 20-30 minutos, otros pueden ser más lentos para experimentar una división celular y pueden tardar hasta 3 horas para experimentar una división celular única.
Por ejemplo, el microorganismo puede ser una bacteria y el método puede comprender incubar células del microorganismo en y/o de la muestra del sujeto en un medio de cultivo durante un período de al menos aproximadamente 20 minutos a al menos aproximadamente 3 horas. En un ejemplo de este tipo, el método puede comprender incubar células del microorganismo en y/o de la muestra del sujeto en un medio de cultivo durante un período de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 180 minutos, o de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 180 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 170 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 160 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 150 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 140 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 130 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 120 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 110 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 100 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 90 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 80 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 70 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 60 minutos o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 50 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 40 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 30 minutos. En un ejemplo, el método puede comprender incubar células del microorganismo en y/o de la muestra del sujeto en un medio de cultivo durante un período de aproximadamente 20 minutos o aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 40 minutos o aproximadamente 50 minutos o aproximadamente 60 minutos o aproximadamente 70 minutos o aproximadamente 80 minutos o aproximadamente 90 minutos o aproximadamente 100 minutos o aproximadamente 110 minutos o aproximadamente 120 minutos o aproximadamente 130 minutos, o aproximadamente 140 minutos, o aproximadamente 150 minutos, o aproximadamente 160 minutos, o aproximadamente 170 minutos, o aproximadamente 180 minutos, o aproximadamente 190 minutos, o aproximadamente 200 minutos, o aproximadamente 210 minutos, o aproximadamente 220 minutos, o aproximadamente 230 minutos, o aproximadamente 240 minutos. Más preferiblemente, el tiempo de incubación es de aproximadamente 30 minutos, o de aproximadamente 1 hora o de aproximadamente 1.5 horas. Los autores de la invención han especulado que se puede usar un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 180 minutos para capturar la mayoría de los posibles microorganismos clínicamente relevantes. La utilidad en el presente método de un tiempo mínimo que se requiere para lograr 1-3 divisiones celulares contribuye a la capacidad del método para determinar la sensibilidad en un tiempo muy corto.
El método puede comprender incubar las células del microorganismo en y/o de la muestra del sujeto en el medio de cultivo en condiciones de temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 42°C, preferiblemente de aproximadamente 33°C a 42°C, y más preferiblemente de aproximadamente 37°C y con aireación o sin aireación.
Por ejemplo, el método de la presente invención según cualquier aspecto o realización o ejemplo descrito en el presente documento puede lograr cultivos celulares en división activa obteniendo primero una muestra clínica que contiene el microorganismo, añadiendo células viables de los organismos microorganismos a un medio de cultivo/crecimiento adecuado tal como los descritos anteriormente e incubando las células en el medio de cultivo/crecimiento durante un tiempo suficiente para que se produzcan de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 divisiones celulares.
Opcionalmente, la presencia de células en división activa en un cultivo celular puede confirmarse mediante cualquier<método conocido en la técnica que incluyen, por ejemplo, pero no limitados a, mediciones de producción de CO>2<y/o>uso de reactivos fluorescentes. Por ejemplo, la densidad del microorganismo en un cultivo celular puede ensayarse por citometría de flujo para contar una suspensión teñida durante 5 minutos con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico como se describe según cualquier ejemplo o realización del presente documento, tal como usando SYTO 95 pM para contar el número de organismos. Sin embargo, puede usarse cualquier técnica y/o instrumento capaz de contar números de organismos, incluyendo un citómetro de flujo (de cualquier tipo), un microscopio (óptico o de fluorescencia), un espectrofotómetro que mide la densidad óptica, p. ej., a 600 nm, o un nefelómetro. La medición de la densidad de células en división activa después de aproximadamente 1 -3 divisiones celulares ayuda a establecer la densidad base, donde el número total de células en división activa en el cultivo celular puede ser preferiblemente no menor de 1000 células.
La suspensión resultante puede ponerse después en una incubadora para proporcionar calor, humedad y/o gases atmosféricos apropiados. Por ejemplo, para muestras clínicas, este intervalo es de 33°C a 42°C, con condiciones de gases atmosféricos, condiciones de gases atmosféricos enriquecidos con 5% de CO2, o condiciones de crecimiento<anaeróbicas (tales como aquellas menores o iguales a 5% de H>2<siendo el resto N>2<).>
Opcionalmente, se puede realizar una medición adicional de la densidad celular como se ha descrito anteriormente para confirmar que el cultivo celular "en división activa" puede tener como mínimo un aumento de 60% en el número total de células (o se puede observar una medición representativa, tal como con un nefelómetro, igual a un aumento en el número de células de 60%). Dicho aumento de 60% en el número de células puede ayudar a determinar que un número suficiente de células en el cultivo se está dividiendo activamente. El momento en el que se puede realizar esta medición puede variar. En un ejemplo, el muestreo puede tener lugar a aproximadamente 180 minutos desde la inoculación en el medio de cultivo de las células microbianas. Alternativamente, el muestreo puede tener lugar a cualquier número de intervalos para determinar el punto en el que se alcanza el 60% de aumento en el número de células. Para capturar la mayoría de los posibles microorganismos clínicamente relevantes, es deseable que las células se incuben durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 180 minutos.
iii) Exposición de células microbianas en y/o de un cultivo celular en división activa a un agente antimicrobiano durante un tiempo y en condiciones suficientes para que las células se dividan activamente
En realizaciones preferidas de los métodos según cualquier aspecto amplio o ejemplo o realización descrito en el presente documento, las condiciones de incubación para la división activa durante la exposición a antimicrobianos son similares a o reflejan las usadas para obtener un cultivo en división activa como se describió anteriormente, es decir, antes de la exposición al agente antimicrobiano. Por ejemplo, se prefiere que la exposición de células microbianas en división activa a un agente antimicrobiano se realice en el mismo medio y/o durante el mismo o similar período de tiempo y/o la misma o similar temperatura y/o las mismas o similares condiciones atmosféricas usadas para obtener un cultivo que se divide activamente de dichas células del microorganismo antes de la exposición al agente antimicrobiano.
En un ejemplo, la exposición de células microbianas en división activa a un agente antimicrobiano se realiza en el mismo medio que el utilizado para obtener un cultivo en división activa de dichas células del microorganismo antes de la exposición al agente antimicrobiano.
En otro ejemplo, la exposición de células microbianas en división activa a un agente antimicrobiano se realiza durante un período de al menos aproximadamente 20 minutos a al menos aproximadamente 3 horas. En un ejemplo de este tipo, el método puede comprender exponer células microbianas en división activa a un agente antimicrobiano durante un período de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 180 minutos, o de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 180 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 170 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 160 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 150 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 140 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 130 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 120 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 110 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 100 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 90 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 80 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 70 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 60 minutos o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 50 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 40 minutos, o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 30 minutos. En un ejemplo, el método puede comprender exponer células microbianas en división activa a un agente antimicrobiano durante un período de aproximadamente 20 minutos o aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 40 minutos o aproximadamente 50 minutos o aproximadamente 60 minutos o aproximadamente 70 minutos o aproximadamente 80 minutos o aproximadamente 90 minutos o aproximadamente 100 minutos o aproximadamente 110 minutos o aproximadamente 120 minutos o aproximadamente 130 minutos, o aproximadamente 140 minutos, o aproximadamente 150 minutos, o aproximadamente 160 minutos, o aproximadamente 170 minutos, o aproximadamente 180 minutos, o aproximadamente 190 minutos, o aproximadamente 200 minutos, o aproximadamente 210 minutos, o aproximadamente 220 minutos, o aproximadamente 230 minutos, o aproximadamente 240 minutos. Más preferiblemente, el tiempo de incubación es de aproximadamente 30 minutos, o de aproximadamente 1 hora o de aproximadamente 1.5 horas. Los autores de la invención han especulado que se puede usar el tiempo de incubación en presencia de un agente antimicrobiano de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 180 minutos para capturar la mayoría de los posibles microorganismos clínicamente relevantes.
Alternativamente o además, exponer las células microbianas en división activa a un agente antimicrobiano a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 42°C, preferiblemente de aproximadamente 33°C a 42°C, y más preferiblemente de aproximadamente 37°C y con aireación o sin aireación. Por ejemplo, durante la exposición al agente antimicrobiano, la suspensión de células se puede poner en una incubadora para proporcionar calor, humedad y/o gases atmosféricos apropiados. Por ejemplo, para muestras clínicas, este intervalo es de 33°C a 42°C,<con condiciones de gases atmosféricos, condiciones de gases atmosféricos enriquecidos con 5% de CO>2<o condiciones de crecimiento anaeróbico (tales como las menores o iguales a 5% de H>2<siendo el resto N>2<).>
En una realización preferida, el tiempo de exposición al agente antimicrobiano puede adaptarse a un aislado clínico/microorganismo específico midiendo, directamente como se describe en el presente documento anteriormente, el tiempo mínimo para obtener "células en división activa" para ese aislado/microorganismo específico, y ajustando la provocación de exposición a antimicrobianos a ese período de tiempo medido.
En un ejemplo, el método comprende exponer las células del microorganismo en división activa a un intervalo de diferentes concentraciones del agente antimicrobiano tal como una o más concentraciones seleccionadas de 0.25 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l, 32.0 mg/l, 64.0 mg/l, 128.0 mg/l y 256.0 mg/l. Alternativamente, o además, el intervalo de diferentes concentraciones del agente antimicrobiano puede comprender una serie de diluciones 1:2 en el intervalo de aproximadamente 2560 mg/ml a aproximadamente 2.5 mg/ml de dicho agente antimicrobiano.
iv) Marcado de las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano con un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico
Se entenderá que el marcado de células del microorganismo expuesto al agente antimicrobiano con un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico puede realizarse en cualquier fluido o suspensión en el que el marcador que se usa permanezca químicamente estable. Es deseable que se consulten las instrucciones del fabricante para cualquier marcador de compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico específico que se emplee.
En un ejemplo preferido, las células microbianas, tales como las células bacterianas, pueden marcarse con un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico que está presente en una solución salina equilibrada de Hank o en solución salina al 0.85%.
Sujetos y usos terapéuticos
Se entenderá que el término "sujeto", como se refiere en el contexto de la presente invención a cualquier sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo, pretende abarcar como sujeto la inclusión de un sujeto humano o animal. En un ejemplo, el sujeto es un sujeto humano.
En dicho ejemplo, el sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo puede presentar uno o más síntomas indicativos o que sugieren a un clínico, tal como un médico o una enfermera una infección por uno o más microorganismos. A modo de ejemplo no limitante, un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo puede sufrir o presentar uno o más síntomas seleccionados de temperatura corporal elevada tal como mayor de 38°C (o 100.4°F), debilidad muscular, dolor específico de órganos o sitios, necrosis o putrefacción de tejidos, adormecimiento o somnolencia excesiva, debilidad muscular, producción de moco pre-nasal o post-nasal excesiva, diarrea, dolor abdominal, tos y/o estornudos, dolor muscular y de articulaciones no específico, y/o una inflamación específica de órgano tal como celulitis, foliculitis, impétigo, otitis u otitis media, inflamación del tracto urinario, gastroenteritis y/o meningitis. Alternativamente, o además, el sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo puede presentar uno o más síntomas indicativos o que sugieren a un clínico, tal como un médico o una enfermera, y/o uno o más síntomas indicativos o que sugieren sepsis tales como uno o más síntomas seleccionados de temperatura corporal elevada mayor de 38°C (100.4°F) o una temperatura corporal inferior de menos de 36°C (96.8°F), frecuencia cardíaca aumentada (p. ej., de aproximadamente más de 90 latidos por minuto), ritmo cardíaco irregular o cambiante, dificultad respiratoria o frecuencia respiratoria aumentada (p. ej., frecuencia respiratoria mayor de 20 respiraciones por minuto), dificultad o dolor asociado con la respiración, estado mental alterado tal como desorientación, confusión, agresión no provocada, producción de orina disminuida, coagulación sanguínea anormal, evidencia de infección microbiana que se presenta en múltiples sitios corporales, una caída en la presión sanguínea (p. ej., con respecto a la norma del paciente individual), debilidad o debilidad extrema, inconsciencia y/o muerte.
En un tercer aspecto amplio, descrito pero no reivindicado, la presente invención proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo unicelular o multicelular. El método comprende determinar la sensibilidad del microorganismo en dicho sujeto a uno cualquiera o más agentes antimicrobianos llevando a cabo el método según el primer o segundo aspectos amplios de la invención. El método comprende además identificar uno o más agentes antimicrobianos para los que se ha determinado que el microorganismo es sensible, y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del uno o más agentes antimicrobianos.
Las composiciones que comprenden uno o más agentes antimicrobianos que se administran al sujeto, pueden formularse para administración diaria o periódica. Por ejemplo, la composición puede administrarse al sujeto diariamente durante un periodo de al menos aproximadamente una semana, o al menos aproximadamente dos semanas o al menos aproximadamente tres semanas o al menos aproximadamente cuatro semanas o más de cuatro semanas. En otro ejemplo, la composición puede administrarse periódicamente tal como, por ejemplo, cada día, o cada dos días o cada tres días o cada cuatro días o cada seis días, o una vez a la semana o más de una vez a la semana. En otro ejemplo, la composición que comprende el agente antimicrobiano puede formularse o administrarse en una forma farmacéutica. Los medios y modos de administración de agentes antimicrobianos son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles para el experto en la técnica.
En un cuarto aspecto amplio, descrito pero no reivindicado, la presente invención proporciona el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno cualquiera o más agentes antimicrobianos en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo unicelular o multicelular, en donde se ha determinado que el microorganismo es sensible al uno o más agentes antimicrobianos llevando a cabo el método según el primer o segundo aspectos amplios.
En un quinto aspecto amplio, descrito pero no reivindicado, la presente invención proporciona el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno cualquiera o más agentes antimicrobianos en el tratamiento de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por un microorganismo unicelular o multicelular, en donde se ha determinado que el microorganismo es sensible al uno o más agentes antimicrobianos llevando a cabo el método según el primer o segundo aspectos amplios.
Tipos adecuados de microorganismos
En un ejemplo preferido según cualquier aspecto o realización o ejemplo de la presente invención descrito en el presente documento, el microorganismo es un microorganismo unicelular o multicelular seleccionado de una bacteria, un hongo o una levadura.
En un ejemplo de este tipo preferido, el microorganismo es una bacteria. Las bacterias pueden ser bacterias Gram negativas o bacterias Gram positivas. Las bacterias pueden ser aerobias o anaerobias o anaerobias facultativas o aerobias facultativas o aerobias obligadas o anaerobias obligadas y/o pueden ser cualquier bacteria patógena o no patógena.
En un ejemplo, las bacterias se seleccionan de bacterias que pertenecen a uno o más de los siguientes géneros o especies bacterianosEnterobacter,Enterobacteriáceas,Campylobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Acinetobacter, Burkholderia, Clostridium, Stenotrophomonas, Serratia, Haemophilus, Neisseria, Burkholderia, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Bacillus, Bacteroides, Listeria, Mycobacterium, Salmonella, Brucella, Bordetella, Borrelia, Nocardia, Francisella, Legionella, Yersinia, Leptospira, Borrelia, Shigella, Shewanella, Campylobacter, Chlamydia, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Haemophilus, Helicobacter, Leptospira, Mycoplasma, Rickettsia, TreponemayVibrio.
Por ejemplo, las bacterias se seleccionan de una cualquiera o más de las siguientes: Acinetobacter baumanii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia cepacia, Burkholderia cenocepacia, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena, E. coli (O157:H 7), Francisella tularensis, Haemophilus influenza, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Legionella longbeachae, Leptospira interrogans, Leptospira Santarosai, Listeria monocytogenes, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsiae, Salmonella enterica var. Typhi, Salmonella enterica var. Typhimurium, Serratia marcescens, Shewanella oneidensis, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Shigella boydii, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus, Stenotrophomonas maltophila, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus anginosus-constellatus-intermedius, Streptococcus mitis, Vibrio cholera, Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia pestis.
En un ejemplo, las bacterias pertenecen a las enterobacteriáceas, o las especiesKlebsiellao las especiesPseudomonaso las especiesAcinetobacter.
Por ejemplo, las bacterias son una cepa deKlebsiella pneumoniaeoPseudomonas aeruginosa.
En otro ejemplo preferido, el microorganismo es una levadura. Por ejemplo, la levadura se selecciona de una levadura que pertenece a una o más de las siguientes especies de levaduras:Candida, Saccharomyces,yCryptococcus.
Por ejemplo, la levadura se selecciona de una cualquiera o más de las siguientes:Candida albicans, Candida tropica, Cryptococcus neoformans.
En otro ejemplo preferido, el microorganismo es un hongo. Por ejemplo, el hongo se selecciona de uno o más de los siguientes géneros o especies:Aspergillus, Candida, Histoplasma, Pneumocystis,yStachybotrys.
Por ejemplo, el hongo se selecciona de uno cualquiera o más de los siguientes: Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum, Pneumocystis jirovecii (también conocido como Pneumocystis carinii) y Stachybotrys chartarum.
Agentes antimicrobianos
Preferiblemente, en el método según cualquier aspecto, realización y/o ejemplo de la presente invención descrito en el presente documento, el agente antimicrobiano es o comprende un agente antibacteriano y/o agente antifúngico y/o agente antilevadura. El agente antimicrobiano puede tener efecto biostático y/o microbicida sobre los microorganismos unicelulares y/o multicelulares de la presente invención. Por consiguiente, el agente antimicrobiano según cualquier aspecto, realización y/o ejemplo descrito en el presente documento puede inhibir el crecimiento y/o matar células del microorganismo en división activa analizado en el método de la presente invención. En un ejemplo, el agente antimicrobiano puede ser un compuesto de un producto químico. De manera similar, el agente antimicrobiano puede ser sintético y/o producido químicamente y/o natural y/o derivado, ya sea directa o indirectamente de un organismo o una planta o un animal. Preferiblemente, el agente antimicrobiano es o comprende un agente antibacteriano tal como un agente bactericida y/o un agente bacteriostático.
En un ejemplo, el agente antimicrobiano puede ser cualquier compuesto tal como un compuesto químico o una composición farmacéutica tal como un fármaco. En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es una composición que comprende un compuesto tal como un compuesto químico o un producto farmacéutico o un fármaco. En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano puede ser una composición que comprende dos o más compuestos tales como compuestos químicos, productos farmacéuticos y/o fármacos.
Por ejemplo, el agente antimicrobiano puede ser o comprender uno cualquiera de más de los siguientes: aminoácidos o derivados de aminoácidos, ácidos grasos o derivados de ácidos grasos, péptidos antimicrobianos o derivados de péptidos, aminoglucósidos, ácidos aureólicos, aziridinas, bencenoides, bencimidazoles, cumarina-glicósidos, derivados de éter difenílico, epipolitiodioxopiperazinas, glucosaminas, glucopéptidos, imidazoles, derivados de indol, macrolactama, macrólidos, nucleósidos, beta-lactamas tales como penicilinas y cefalosporinas, peptidil nucleósidos, fenicoles, polienos, piridinas y pirimidinas, quinolonas y fluoroquinolonas, estatinas, esteroides, sulfonamidas, taxoides, tetraciclinas, aleaciones metálicas tales como aleaciones de cobre.
En un ejemplo particularmente preferido, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico. Por ejemplo, el antibiótico es un antibiótico antibacteriano y/o antifúngico y/o antilevadura.
En un ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico betalactámico tal como penicilinas, cefalosporinas, monobactámicos y/o carbapenems.
Por ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico penicilínico seleccionado de uno o más de penicilina G tal como sal potásica de penicilina G o sal sódica de penicilina G, ampicilina tal como ampicilina anhidra, trihidrato de ampicilina y/o sal sódica de ampicilina, amoxicilina, ticarcilina piperacilina, ácido (+)-6-aminopenicilánico (6-APA), azlocilina tal como sal sódica de azlocilina, carbenicilina tal como sal disódica de carbenicilina, cloxacilina tal como sal sódica de cloxacilina (p. ej., monohidrato de sal sódica de cloxacilina), dicloxacilina tal como monohidrato de sal sódica de dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina tal como monohidrato de sal sódica de nafcilina, oxacilina tal como sal sódica de oxacilina, D-penicilamina, penicilina V tal como sal potásica de penicilina V, ácido fenoximetilpenicilínico tal como sal potásica del ácido fenoximetilpenicilínico, piperacilina tal como sal sódica de piperacilina, temocilina y ticarcilina tal como sal disódica de ticarcilina. Cada una de estas penicilinas está disponible comercialmente, por ejemplo, de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano que es o comprende un antibiótico penicilínico proporciona un efecto antimicrobiano tal como un efecto antibacteriano sobre las células del microorganismo en división activa (p. ej., bacterias) alterando la síntesis de la capa de peptidoglicano de las paredes celulares del microorganismo.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico seleccionado de uno o más de cefalotina, cefalexina, cefaclor, cefixima tal como trihidrato de aefixima, cefmetazol tal como sal sódica de cefmetazol, cefoperazona tal como sal sódica de cefoperazona, sal sódica, cefotaxima tal como sal sódica de cefotaxima, cefuroxima, cefprozil, cefoxitina, ceftriaxona, ceftazidima, cefpodoxima, cefepima, ácido 7-aminocefalosporánico (7-ACA), ácido 7-aminodesacetoxicefalosporánico (7-ADCA), cefotiam tal como hidrato de dihidrocloruro de cefotiam, ceftazidima tal como hidrato de ceftazidima, cefsulodina tal como hidrato de sal sódica de cefsulodina, ceftibuten tal como hidrato de ceftibuten, ceftriaxona tal como sal disódica de ceftriaxona hemi(heptahidrato), cefalexina tal como hidrato de cefalexina, cefalomanina, cefalotina tal como cefalotina como sal sódica, cefradina, imipenem, p. ej., monohidrato de imipenem, moxalactama tal como sal sódica de moxalactama, y sal sódica de tazobactam. Cada una de estas cefalosporinas está disponible comercialmente p. ej., de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico de primera generación seleccionado de: cefadroxilo, cefazolina, cefalotina o cefalotín y cefalexina.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico de segunda generación seleccionado de: cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil y cefuroxima.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico de tercera generación seleccionado de: cefixima, cefdinir, cefditoren, cefotaxima, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftibuten, ceftizoxima y ceftriaxona.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico de cuarta generación tal como cefepima.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico de quinta generación tal como ceftarolina fosamil y/o ceftobiprolel.
En un ejemplo, según cualquier ejemplo o realización o aspecto descrito en el presente documento que implica un agente antimicrobiano que es o comprende una o más cefalosporinas (ya sea antibiótico cefalosporínico de primera, segunda, tercera, cuarta y/o quinta generación), el agente antimicrobiano proporciona un efecto antimicrobiano tal como un efecto antibacteriano sobre células del microorganismo en división activa (p. ej., bacterias) alterando la síntesis de la capa de peptidoglicano de las paredes celulares del microorganismo.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico monobactámico tal como aztreonam, que está disponible comercialmente p. ej., de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano que comprende un antibiótico monobactámico tal como aztreonam proporciona un efecto antimicrobiano tal como un efecto antibacteriano sobre células del microorganismo en división activa (p. ej., bacterias) alterando la síntesis de la capa de peptidoglicano de las paredes celulares del microorganismo.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico carbapenémico seleccionado de uno o más de imipenem o cilastatina, meropenem, ertapenem y doripenem. Cada uno de estos antibióticos carbapenémicos de ejemplo está disponible comercialmente p. ej., de Sigma-Aldrich.
El agente antimicrobiano que es o comprende un antibiótico carbapenémico puede proporcionar un efecto antimicrobiano tal como un efecto antibacteriano inhibiendo la síntesis celular en células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un aminoácido o derivado de aminoácido. Por ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un derivado de aminoácido seleccionado de uno o más de: ácido L-alanil-L-1-aminoetilfosfónico, azaserina (O-diazoacetil-L-serina), hidrocloruro de bestatina (hidrocloruro de N-[(2S,3R)-3-amino-2-hidroxi-4-fenilbutiril]-L-leucina), D-cicloserina [(R)-4-amino-3-isoxazolidona, 4-amino-3-isoxazolidinona], y 6-diazo-5-oxo-L-norleucina [ácido (S)-2-amino-6-diazo-5-oxocaproico, o DON]. Cada uno de estos aminoácidos o derivados está disponible comercialmente, p. ej., de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un aminoglucósido. Por ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un aminoglucósido seleccionado de uno o más de: gentamicina, tobramicina, amikacina, daunorubicina tal como hidrocloruro, sesquisulfato de dihidroestreptomicina, antibiótico G418 tal como sal de disulfato<del antibiótico G418 (C>20<H>40<N>4<O>102<H>2<SO>4<) (p. ej., Sigma-Aldrich), gentamicina, higromicina B (p. ej., polvo liofilizado>deStreptomyces hygroscopicus)(p. ej., Sigma-Aldrich), kanamicina, neomicina tal como hidrato de sal de trisulfato de neomicina, netilmicina tal como sal de sulfato de netilmicina, paromomicina tal como sal de sulfato de paromomicina, ribostamicina tal como sal de sulfato de ribostamicina, sisomicina tal como sal de sulfato de sisomicina, espectinomicina tal como dihidrocloruro de espectinomicina pentahidrato, estreptomicina tal como sal de sulfato de estreptomicina, y antibiótico aminoglucósido de tobramicina tal como sal de sulfato de tobramicina (antibiótico aminoglucósido), paromomicina, cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej., de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico aminoglucósido seleccionado de: amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, tobramicina, estreptomicina y espectinomicina.
El agente antimicrobiano que es o comprende un aminoglucósido puede proporcionar un efecto antimicrobiano tal como un efecto antibacteriano uniéndose a la subunidad ribosómica 30S y/o la subunidad 50S microbiana (p. ej., bacteriana), inhibiendo de ese modo la translocación del peptidil-ARNt desde el sitio A hasta el sitio P y/o produciendo una lectura errónea del ARNm, dejando las células de microorganismos (p. ej., células bacterianas) incapaces de sintetizar proteínas vitales para su crecimiento.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico de ansamicina seleccionado de: geldanamicina, herbimicina y rifaximina.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un macrólido. Por ejemplo, el macrólido es o comprende un compuesto seleccionado de: anhidroeritromicina A (también conocida como anhídrido de eritromicina), apoptolidina A, azitromicina, dafilomicina A1 p. ej. deStreptomyces griseus,bafilomicina B1 p. ej. deStreptomyces sp.,borrelidina p. ej. deStreptomyces sp.(tal comoStreptomyces parvulus),claritromicina, clindamicina tal como el antibiótico de lincosamida hidrocloruro de clindamicina o antibiótico aminoglucósido clindamicina 2-fosfato, concanamicina A p. ej. deStreptomyces sp.,diritromicina, diritromicina, eritromicina tal como estolato de eritromicina o succinato de etilo y eritromicina o estearato de eritromicina, complejo de filipina p. ej. deStreptomyces filipinensis,Josamicina, lincomicina tal como hidrocloruro de lincomicina, mepartricina, nonactina p. ej. deStreptomyces sp.,(tal comoStreptomyces griseus),oligomicina p. ej. deStreptomyces diastatochromogenes,oligomicina A, pimaricina p. ej.,Streptomyces chattanoogenis,rapamicina p. ej. deStreptomyces hygroscopicustal como sal sódica de rapamicina, rifapentina, rifaximina, roxitromicina, espiramicina p. ej. deStreptomyces sp.tales como adipato de espiramicina, tiamulina, telitromicina, troleandomicina, tilosina tal como tartrato de tilosina, virginiamicina S1 (también conocida como antibiótico 899 o estafilomicina S), y virginiamicina M1 (también conocida como mikamicina A o estafilomicina). Cada uno de estos macrólidos está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
Por ejemplo, el macrólido es o comprende un compuesto seleccionado de: azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina, espiramicina.
El agente antimicrobiano que es o comprende uno o más macrólido(s) puede proporcionar efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano inhibiendo la biosíntesis de proteínas microbianas (p. ej., bacterianas) uniéndose reversiblemente a la subunidad 50S del ribosoma microbiano, inhibiendo de ese modo la translocación de peptidil-ARNt p. ej. en células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico de tetraciclina tal como una tetraciclina seleccionada de uno cualquiera o más de: clortetraciclina tal como hidrocloruro de clortetraciclina, demeclociclina tal como hidrocloruro de demeclociclina, doxorubicina tal como hidrocloruro de doxorubicina, doxiciclina tal como hiclato de doxiciclina, duramicina p. ej. deStreptoverticilium cinnamoneus,meclociclina tal como sal de sulfosalicilato de meclociclina, minociclina tal como hidrocloruro de minociclina, oxitetraciclina tal como oxitetraciclina deshidrato o hidrocloruro de oxitetraciclina, y tetraciclina tal como hidrocloruro de tetraciclina. Cada una de estas tetraciclinas está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
El agente antimicrobiano que es o comprende un antibiótico de tetraciclina puede proporcionar efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano inhibiendo la unión de aminoacil-ARNt microbiano al complejo de ARNm-ribosoma p. ej., en células del microorganismo en división activa, por ejemplo, mediante la unión a la subunidad ribosómica 30S en el complejo de traducción de ARNm de las células microbianas, tal como de células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico de polimixina tal como polimixina B y/o colistina, cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende una lincosamida tal como clindamicina y/o lincomicina, cada una de las cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich. Por ejemplo, el agente antimicrobiano que es o comprende la(s) lincosamida(s) proporciona efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano mediante la unión a la subunidad 50S microbiana (p. ej., bacteriana) del ARN ribosómico (p. ej., bacteriano), inhibiendo de este modo la síntesis de proteínas en las células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un nitrofurano tal como furazolidona y/o nitrofurantoína, cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende una oxazolidinona tal como linezolid (p. ej., Sigma-Aldrich) y/o posizolid (p. ej., Sigma-Aldrich) y/o radezolid y/o torezolid.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano que es o comprende una oxazolidinona proporciona efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano mediante la inhibición de la iniciación proteica de la síntesis de proteínas p. ej. en células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un péptido o polipéptido o derivado peptídico o derivado polipeptídico. Por ejemplo, el péptido o derivado peptídico se selecciona de uno o más de: actinomicina (actinomicina C1), actinonina, hidrato de hidrocloruro de amastatina, 7-aminoactinomicina D (7-AAD), antimicina A (p. ej., deStreptomyces<sp.), antimicina A>2<, antipaína tal como dihidrocloruro de antipaína, bacitracina tal como sal de cinc de>bacitracina (p. ej., deBacillus licheniformis),bactenecina, BD-3 recombinante humana (p. ej., Sigma-Aldrich), Beta D-4 recombinante humana (p. ej., Sigma-Aldrich), carbenicilina tal como sal disódica de carbenicilina, cecropina A, cecropina B, cecropina P1 porcina, cinamicina p. ej. deStreptomyces cinnamoneus,colistina tal como la sal de sulfato o metanosulfonato de sodio de colistina, ciclosporina A, p. ej. deTolypocladium inflatum,p-defensina 1 humana (p. ej., Sigma-Aldrich), p-defensina 2 humana recombinante (p. ej., Sigma-Aldrich), defensina HNP-1 humana (p. ej., Sigma-Aldrich), defensina HNP-2 humana (p. ej., Sigma-Aldrich), elafina humana (p. ej., recombinante, expresada enSaccharomyces cerevisiae)(p. ej., Sigma-Aldrich), fengicina (p. ej., Sigma-Aldrich), polipéptido de gramicidina, p. ej. deBacillus aneurinolyticustal como polipéptido de gramicidina A o polipéptido de gramicidina C, kendomicina p. ej. deStreptomyces violaceoruber,lactoferricina B (sal de trifluoroacetato del fragmento 4-14) (p. ej., Sigma-Aldrich), sal de trifluoroacetato de LL-37 (humano) (p. ej., Sigma-Aldrich), lisostafina p. ej. deStaphylococcus staphylolyticus,magainina I, magainina II, melitina p. ej., de veneno de abeja melífera, micosubtilina, nisina, p. ej. deLactococcus lactis,NP-1 humana recombinante (p. ej., Sigma-Aldrich), pediocina p. ej. dePediococcus acidilactici,PGLa, polimixina B, surfactina p. ej. de Bacillus subtilis, tiostreptona p. ej. deStreptomyces azureus,y valinomicina. Todos los péptidos o derivados peptídicos mencionados anteriormente están disponibles comercialmente, p. ej. de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano es o comprende el polipéptido bacitracina. Un agente antimicrobiano que puede ser o comprende el polipéptido bacitracina puede proporcionar actividad antimicrobiana tal como actividad antibacteriana inhibiendo el pirofosfato de isoprenilo microbiano p. ej. en células del microorganismo en división activa. Sin estar ligado por ninguna teoría o modo de acción específico, el pirofosfato de isoprenilo microbiano es una molécula que lleva las unidades estructurales del peptidoglicano microbiano p. ej., pared celular bacteriana fuera de la membrana interna de las células, tal como en células del microorganismo en división activa. Por consiguiente, la inhibición de la actividad del pirofosfato de isoprenilo en células microbianas en división activa por el polipéptido de bacitracina evita la replicación celular adicional del microorganismo.
En otro ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano es o comprende el polipéptido colistina o el polipéptido polimixina B. Por ejemplo, dicho agente antimicrobiano puede proporcionar actividad antimicrobiana tal como actividad antibacteriana mediante interacción con una membrana externa bacteriana Gram negativa y la membrana citoplasmática, y desplazando contraiones bacterianos, desestabilizando de este modo la membrana externa bacteriana. Alternativamente, o además, tal agente antimicrobiano puede funcionar como un detergente contra la membrana citoplasmática p. ej., de la célula del microorganismo en división activa alterando de este modo su permeabilidad celular.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un glicopéptido. Por ejemplo, el glicopéptido se selecciona de uno o más de: vancomicina, teicoplanina, bleomicina tal como sulfato de bleomicina p. ej. deStreptomyces verticillus,fleomicina p. ej. deStreptomyces verticillus,ramoplanina, ristomicina p. ej. de monosulfato de ristomicina, vancomicina tal como hidrocloruro de vancomicina p. ej. deStreptomyces orientalis,telavancina, dalbavancina y oritavancina. Todos los glicopéptidos mencionados anteriormente están disponibles comercialmente p. ej. de SigmaAldrich. En un ejemplo de este tipo, el agente antimicrobiano es o comprende un glicopéptido seleccionado de teicoplanina, vancomicina, telavancina, dalbavancina y/u oritavancina. Por ejemplo, el agente antimicrobiano que es o comprende un glicopéptido proporciona efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano uniéndose al microbio (p. ej., bacteriano), inhibe la síntesis de peptidoglicanos p. ej. de células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un nucleósido. Por ejemplo, el nucleósido se selecciona de: adenina 9-p-D-arabinofuranósido, 5-azacitidina, hidrocloruro de blasticidina S, cordicepina p. ej. deCordyceps militaris,análogo de nucleósido de 5-fluorocitosina, formicina A p. ej. deStreptomyces kaniharaensis,ganciclovir, ribavirina [1-p-D-ribofuranosil-1, 2, 4-triazol-3-carboxamida], sangivamicina tal como hidrato de sangivamicina p. ej. deStreptomyces rimosus,sinefungina [5'-desoxi-5'-(1,4-diamino-4-carboxibutil)adenosina], tuberculidina, p. ej. deStreptomyces tuberculidicus,<tunicamicina p. ej. de Streptomyces sp., y homólogo de tunicamicina C>2<. Cada uno de>los nucleósidos mencionados anteriormente está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de fenicol. Por ejemplo, el compuesto de fenicol se selecciona de: cloranfenicol tal como la sal sódica del succinato de cloranfenicol y/o tiamfenicol [D-treo-2,2-dicloro-N-(p-hidroxi-a-[hidroximetil]-4-[metilsulfonil]fenetil)acetamida], cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de polieno. Por ejemplo, el compuesto de polieno se selecciona de: anfotericina B p. ej. deStreptomycessp., kirromicina (también conocida como antibiótico Myc-8003 o mocimicina) p. ej. deStreptomyces collinus,y nistatina (también conocida como fungicidina o micostatina), cada una de las cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de poliéter. Por ejemplo, el compuesto de poliéter se selecciona de: monensina (también conocida como monensina A) tal como sal sódica de monensina o hidrato de sal sódica de monensina, nigericina (también conocida como antibiótico K178, antibiótico X464, azalomicina M, helexina C, polieterina A) tal como sal sódica de nigericina y salinomicina p. ej. deStreptomyces albus,cada uno de los cuales está disponible comercialmente, por ejemplo, de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de piridinas y/o pirimidinas. Por ejemplo, el compuesto de piridinas y/o pirimidina se selecciona de: ácido fusárico [ácido 5-butilpiridina-2-carboxílico], p. ej. deGiberella fujikuroi,isoniazida [hidrazida del ácido 4-piridinacarboxílico], protionamida [2-propil-4-piridinacarbotioamida], tioconazol [1-[2-[(2-cloro-3-tienil)metoxi]-2-(2,4-diclorofenil)etil]-1H-imidazol], trimetoprim [2,4-diamino-5-(3,4,5-trimetoxibencil)pirimidina], tal como sal de lactato de trimetoprim. Cada uno de estos compuestos de piridinas y/o pirimidina ilustrados está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de quinolona y/o un compuesto de fluoroquinolona. Por ejemplo, el compuesto de quinolona y/o un compuesto de fluoroquinolona se selecciona/seleccionan de: cinoxacina [ácido 1-etil-1,4-dihidro-4-oxo-[1,3]dioxolo[4,5-g]cinolina-3-carboxílico], ciprofloxacina [ácido 1-ciclopropil-6-fluoro-4-oxo-7-(piperazin-1-il)-1,4-dihidroquinolina-3-carboxílico], hidrocloruro de difloxacina [hidrocloruro del ácido 6-fluoro-1-(4-fluorofenil)-1,4-dihidro-7-(4-metilpiperazino)-4-oxo-3-quinolinacarboxílico], enoxacina, enrofloxacina (también conocida como baytril), flumequina, 8-hidroxiquinolina, nadifloxacina [ácido 9-fluoro-6,7-dihidro-8-(4-hidroxi-1 -piperidinil)-5-metil-1 -oxo-1 H,5H-benzo[ij]quinolizina-2-carboxílico], ácido nalidíxico [ácido 4-dihidro-1 -etil-7-metil-1,8-naftiridin-4-ona-3-carboxílico] tal como sal sódica del ácido nalidíxico, antibiótico de fluoroquinolona ofloxacino (también conocido como antibiótico de fluoroquinolona), antibiótico de quinolona del ácido oxolínico (también conocido como antibiótico de quinolona) [ácido 5,8-dihidro-5-etil-8-oxo-1,3-dioxolo[4,5-g]quinolin-7-carboxílico], mesilato de pefloxacino deshidrato [ácido 3-quinolinacarboxílico, 1-etil-6-fluoro-1,4-dihidro-7-(4-metil-1-piperazinil)-4-oxo-, monometanosulfonato], ácido pipemídico [ácido 8-etil-5,8-dihidro-5-oxo-2-(1-piperazinil)pirido(2,3-d)pirimidina-6-carboxílico], 8-quinolinol [8-hidroxiquinolina] tal como sal de hemisulfato de 8-quinolinol, levofloxacino, gatifloxacino, gemifloxacino, lomefloxacino, moxifloxacino, ácido nalidíxico y norfloxacina. Cada una de estas quinolonas y fluoroquinolonas ilustradas está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
Un agente antimicrobiano que es o comprende un compuesto de quinolona y/o un compuesto de fluoroquinolona puede proporcionar efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano inhibiendo la enzima ADN girasa y/o la topoisomerasa IV microbiana (p. ej., bacteriana), inhibiendo de este modo la replicación y transcripción del ADN p. ej. en células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de sulfonamida. Por ejemplo, el compuesto de sulfonamida se selecciona de: succinilsulfatiazol, sulfabenzamida [N-(4-aminobencenosulfonil)benzamida], sulfacetamida [N-(4-aminobencenosulfonil)acetamida] tal como monohidrato de sal sódica de sulfacetamida, sulfadiazina [4-amino-N-(2-pirimidinil)bencenosulfonamida], sulfadimetoxina [4-amino-N-(2,6-dimetoxi-4-pirimidinil)bencenosulfonamida], sulfadoxina [4-amino-N-(5,6-dimetoxi-4-pirimidinil)bencenosulfonamida], sulfadiazina de plata, sulfaguanidina [-amino-N-(aminoiminometil)bencenosulfonamida], sulfameter [5-metoxisulfadiazina], sulfametazina [4,6-dimetilsulfadiazina], sulfamonometoxina [4-metoxi-6-sulfanilamidopirimidina], sulfanilamida [p-aminobencenosulfonamida], sulfaquinoxalina p. ej., como sal sódica, sulfasalazina [ácido 2-hidroxi-5-{{4-[(2-piridinilamino)sulfonil]fenil}azo}benzoico], sulfatiazol, p. ej., como sal sódica [sal sódica de 4-amino-N-(2-tiazolil)bencenosulfonamida], sulfametoxazol, mafenida, sulfametizol, sulfanilamida, trimetoprim, trimetoprimsulfametoxazol (cotrimoxazol; también conocido como TMP-SMX) y sulfonamidocisoidina. Cada una de estas sulfonamidas ilustradas está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
El agente antimicrobiano que es o comprende un compuesto de sulfonamida puede proporcionar efecto antimicrobiano tal como efecto antibacteriano inhibiendo la síntesis de folato, p. ej., en células del microorganismo en división activa. Por ejemplo, el compuesto de sulfonamida puede ser un inhibidor competitivo de la enzima microbiana dihidropteroato sintetasa (DHPS). Por consiguiente, en ausencia del agente antimicrobiano, la DHPS microbiana puede catalizar generalmente la conversión de PABA (para-aminobenzoato) en dihidropteroato, una etapa en la síntesis de folato. El folato puede ser necesario para que las células microbianas sinteticen ácidos nucleicos (tales como ADN y/o ARN microbiano). Por consiguiente, los autores de la invención especulan que los agentes antimicrobianos que comprenden un compuesto de sulfonamida pueden actuar para prevenir la síntesis de ácidos nucleares microbianos p. ej. en células del microorganismo en división activa.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende una estatina tal como mevastatina (también conocida como compactina o ML-236B), que está disponible comercialmente p. ej., de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende esteroides tales como sal sódica de ácido fusídico (también conocida como fucidina) que está disponible comercialmente p. ej., de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto taxoide tal como paclitaxel p. ej., deTaxus brevifoliaque está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
Otros agentes antimicrobianos de ejemplo abarcados dentro del alcance de los métodos de cualquier aspecto, realización o ejemplo de la invención descrito en el presente documento, incluyen agentes antimicrobianos que comprenden uno cualquiera o más de los siguientes: anisomicina [(2R,3S,4S)-2-(4-metoxibencil)-3,4-pirrolidinadiol-3-acetato] p. ej. deStreptomyces griseolus,cicloheximida [3-[2-(3,5-dimetil-2-oxociclohexil)-2-hidroxietil]glutarimida (también conocida como actidiona o naramicina A), citocalasina D (también conocida como zigosporina A) p. ej., deZygosporium mansonii,citocalasina B (también conocida como fomina) p. ej. deDrechslera dematioidea,hidrato de dihidrocloruro de emetina, ionomicina tal como ionomicina como sal de calcio p. ej. deStreptomyces conglobosatus,y piericidina A (también conocida como Shaoguanmicina B) p. ej. deStreptomyces mobaraensis,cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un peptidil nucleósido. Por ejemplo, el peptidil nucleósido es uno cualquiera o más de: nicomicina Z p. ej. deStreptomyces tendae,sulfato de nourseotricina y dihidrocloruro de puromicina, p. ej. deStreptomyces alboniger.Todos los peptidil nucleósidos mencionados anteriormente están disponibles comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es un ácido aureólico tal como cromomicina A3 p. ej. deStreptomyces griseusy/o mitramicina A p. ej. deStreptomyces plicatus,cada una de las cuales está disponible comercialmente fácilmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de aziridina tal como mitomicina C p. ej. deStreptomyces caespitosusy/o tio-TEPA [N,N',N"-Trietilentiofosforamida también conocido como sulfuro de Tris(aziridinil)fosfina], cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto bencenoide tal como 17-(alilamino)-17-demetoxigeldanamicina, 17-dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina, geldanamicina p. ej. deStreptomyces hygroscopicus,y/o herbimicina A p. ej. deStreptomyces hygroscopicus,cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de bencimidazol tal como albendazol [también conocido como 5-(propiltio)-2-bencimidazolcarbamato de metilo] y/o ricobendazol [también conocido como óxido de albendazol, o [5-(propano-1 -sulfinil)-1 H-benzoimidazol-2-il]-carbamato de metilo], cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de cumarina-glicósido tal como cumermicina A1 y/o novobiocina, p. ej., sal sódica de novobiocina, cada una de las cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un derivado de éter difenílico tal como irgasán [también conocido como 5-cloro-2-(2,4-diclorofenoxi)fenol] que está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende una epipolitiodioxopiperazina tal como gliotoxina deGliocladium fimbriatumque está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un ácido graso o un derivado de ácido graso tal como cerulenina [(2R,3S,E,E)-2,3-epoxi-4-oxo-7,10-dodecadienamida] p. ej. deCephalosporium caerulensque está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende una glucosamina tal como hidrocloruro de 1-desoximanojirimicina [hidrocloruro de 1,5-didesoxi-1,5-imino-D-manitol] y/o N-metil-1-desoxinojirimicina [1,5-didesoxi-1,5-imino-1-metil-D-sorbitol], cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un compuesto de imidazol. Por ejemplo, el compuesto de imidazol se selecciona de: clotrimazol, econazol tal como sal de nitrato de econazol, ketoconazol, metronidazol, miconazol, tal como sal de nitrato de (±)-miconazol, sulconazol tal como sal de nitrato de sulconazol y tiabendazol, cada uno de los cuales está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un derivado de indol tal como fumitremorgina C p. ej. deNeosartorya fischeriy/o estaurosporina p. ej. deStreptomyces sp.,cada una de las cuales está disponible comercialmente, p. ej. de Sigma-Aldrich.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende una macrolactama tal como ascomicina p. ej. deStreptomyces hygroscopicusvar.ascomyceticusque está disponible comercialmente p. ej. de Sigma-Aldrich.
En un ejemplo particularmente preferido, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico. Por ejemplo, el antibiótico puede ser un antibiótico beta-lactámico tal como un antibiótico penicilínico, un antibiótico cefalosporínico, un antibiótico monobactámico y/o un antibiótico carbapenémico. Por ejemplo, el agente antimicrobiano es o comprende un antibiótico cefalosporínico y/o un antibiótico carbapenémico. El agente antimicrobiano puede ser o comprende un antibiótico cefalosporínico. Alternativamente, el agente antimicrobiano puede ser o comprender un antibiótico carbapenémico
En un ejemplo, el antibiótico beta-lactámico es un antibiótico carbapenémico seleccionado de meropenem, imipenem y ertapenem.
En otro ejemplo, el antibiótico beta-lactámico es un antibiótico cefalosporínico seleccionado de ceftazidima, cefepima y ceftriaxona. Preferiblemente, el antibiótico cefalosporínico es un antibiótico ceftriaxona. La ceftriaxona es un antibiótico cefalosporínico de tercera generación y puede usarse en el método de la presente invención según cualquier aspecto descrito en el presente documento como un indicador de la actividad de betalactamasa de espectro extendido.
En otro ejemplo, el agente antimicrobiano puede comprender o consistir en un fenómeno físico y/o químico o estrés aplicado a las células de los microorganismos descritos según un ejemplo de realización, de aspecto amplio del presente documento. Según este ejemplo, el agente antimicrobiano puede comprender o consistir en uno o más fenómenos físicos y/o químicos o estrés aplicados a células de un microorganismo en división activa seleccionados de estrés térmico, luz ultravioleta, luz azul, radiación tal como radiación electromagnética, radiación de microondas, radiación con rayos X o rayos gamma, radiación de partículas tal como radiación de partículas alfa, beta o de neutrones y/o estrés oxidativo. Según este ejemplo, la sensibilidad a los antimicrobianos dependiente de la exposición determinada por el método de citometría de flujo acústica como se describe según cualquier realización de ejemplo de aspecto amplio, del presente documento, es la determinada después de la exposición de células de un microorganismo en división activa a uno o más del fenómeno físico y/o químico o estrés descrito anteriormente. La preparación de suspensiones bacterianas del análisis de sensibilidad cuando se aplica según el método de la invención y parámetros de exposición será bien comprendida por el experto en la técnica y puede usarse como se describe en la técnica para ensayos de sensibilidad a los antimicrobianos convencionales.
Combinaciones de ejemplo de microorganismos/agentes antimicrobianos
En un ejemplo preferido de cualquier aspecto amplio de la invención como se describe en el presente documento, el microorganismo presente en la muestra obtenida del sujeto es una bacteria que pertenece a la especieKlebsiellay/o las células del microorganismo presentes en la muestra obtenida del sujeto son células de bacterias pertenecientes a la especieKlebsiella,y el agente antimicrobiano ensayado en el método según cualquier aspecto amplio de la invención descrito en el presente documento comprende un antibiótico beta-lactámico. En un ejemplo de este tipo preferidos, el microorganismo es una cepa deK. pneumoniaeoK. oxytocay/o las células del microorganismo son células de una cepa deK pneumoniaeoK. oxytoca,y el agente antimicrobiano comprende un antibiótico carbapenémico tal como meropenem y/o imipenem y/o ertapenem. En un ejemplo preferido alternativo, el microorganismo es una cepa deK. pneumoniaey/o las células del microorganismo son células de una cepa deK. pneumoniae,y el agente antimicrobiano comprende un antibiótico cefalosporínico tal como ceftriaxona.
En un ejemplo preferido alternativo de cualquier aspecto amplio de la invención como se describe en el presente documento, el microorganismo presente en la muestra obtenida del sujeto es una bacteria que pertenece a la especieStaphylococcusy/o las células del microorganismo presentes en la muestra obtenida del sujeto son células de bacterias pertenecientes a la especieStaphylococcus, y el agente antimicrobiano ensayado en el método según cualquier aspecto amplio de la invención descrita en el presente documento comprende un antibiótico beta-lactámico. En uno de dichos ejemplos preferidos, el microorganismo es una cepa deStaphylococcus aureusy/o las células del microorganismo son células de una cepa deStaphylococcus aureus,y el agente antimicrobiano comprende un antibiótico cefalosporínico tal como cefoxitina. En un ejemplo preferido alternativo, el microorganismo es una cepa deStaphylococcus aureusy/o las células del microorganismo son células de una cepa deStaphylococcus aureus,y el agente antimicrobiano comprende un antibiótico penicilínico tal como oxacilina.
Cribado cualitativo y/o cuantitativo de alto rendimiento de la sensibilidad a agentes antimicrobianos
El método según cualquier aspecto amplio, ejemplo o realización como se describe en el presente documento puede adaptarse para el cribado cualitativo y/o cuantitativo de alto rendimiento de la sensibilidad de microorganismos en o de una muestra clínica a uno o más agentes antimicrobianos simultáneamente. El método puede adaptarse para el cribado simultáneo de alto rendimiento de la sensibilidad de múltiples muestras de microorganismos obtenidos de diferentes muestras clínicas y/o a múltiples agentes antimicrobianos. Este método de alto rendimiento rápido puede emplearse para predecir rápidamente cualitativamente la sensibilidad de uno o una pluralidad de microorganismos a uno o una pluralidad de agentes antimicrobianos en el plazo de aproximadamente 1 a 3 horas desde el momento de obtener la muestra que comprende células del microorganismo del sujeto; y/o en el plazo de 1 a 3 horas desde el momento de incubar primero células del microorganismo en un medio de cultivo para obtener un cultivo del microorganismo en división activa. Alternativamente, o además, el método rápido de alto rendimiento puede emplearse para predecir rápidamente cuantitativamente la sensibilidad de uno o una pluralidad de microorganismos a uno o una pluralidad de agentes antimicrobianos determinando los valores de MIC FAST en el plazo de aproximadamente 2 a 6 horas, preferiblemente en el plazo de aproximadamente 2 a 4 horas, y lo más preferiblemente en el plazo de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 horas, o aproximadamente 3 horas desde el momento de obtener la muestra que comprende células del microorganismo del sujeto; y/o en el plazo de 1 a 3 desde el momento de obtener la muestra que comprende células del microorganismo del sujeto; y/o desde el momento de incubar primero células del microorganismo en un medio de cultivo para obtener un cultivo del microorganismo en división activa.
En un ejemplo, usando una única placa de 96 pocillos, el método de alto rendimiento puede usarse para determinar cualitativa y/o cuantitativamente (determinando los valores de MIC FAST) la sensibilidad de hasta 13 microorganismos diferentes obtenidos de diferentes muestras clínicas tales como muestras de sangre a uno o más agentes antimicrobianos.
En otro ejemplo, usando una única placa de 96 pocillos, el método de alto rendimiento puede usarse para determinar simultáneamente cualitativa y/o cuantitativamente (determinando los valores de MIC FAST) la sensibilidad de un único microorganismo (obtenido de una muestra clínica tal como una muestra de sangre) a hasta 13 agentes antimicrobianos diferentes. En un ejemplo de este tipo, usando una única placa de 96 pocillos, el método de alto rendimiento puede usarse para determinar simultáneamente cualitativa y/o cuantitativamente (determinando los valores de MIC FAST) la sensibilidad de dos o más microorganismos (obtenidos de dos o más muestras clínicas a al menos cuatro agentes antimicrobianos diferentes, por ejemplo, ensayados a diferentes concentraciones de cada agente antimicrobiano de 0.25 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l, 32.0 mg/l, 64.0 mg/l, 128.0 mg/l y 256.0 mg/l. En otro ejemplo de este tipo, usando una única placa de 96 pocillos, el método de alto rendimiento se puede usar para determinar simultáneamente cualitativa y/o cuantitativamente (determinando los valores de MIC FAST) la sensibilidad de dos o más microorganismos (obtenidos de dos o más muestras clínicas) a al menos ocho agentes antimicrobianos diferentes, por ejemplo, ensayados a diferentes concentraciones de cada agente antimicrobiano, p. ej., seleccionadas de 0.25 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l, 32.0 mg/l, 64.0 mg/l, 128.0 mg/l y/o 256.0 mg/l. En otro ejemplo más de este tipo, usando una única placa de 96 pocillos, el método de alto rendimiento se puede usar para determinar simultáneamente cualitativa y/o cuantitativamente (determinando los valores de MIC FAST) la sensibilidad de al menos un microorganismo (obtenido de una única muestra clínica) a al menos 13 agentes antimicrobianos diferentes, por ejemplo, ensayados a diferentes concentraciones, p. ej., seleccionadas de 0.25 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l y 32.0 mg/l. El experto en la materia reconocería que otras permutaciones del número de microorganismos y agentes antimicrobianos distintos de los mencionados en el presente documento se pueden ensayar en el método de alto rendimiento de la invención sin afectar a la eficacia del método para lograr la determinación rápida de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos ensayados.
Método de ejemplo 1
En un ejemplo, el método de alto rendimiento comprende obtener de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene infección por un microorganismo (p. ej., bacterias) una muestra que comprende células del microorganismo. La muestra obtenida del sujeto puede examinarse para determinar que la muestra comprende al menos aproximadamente 1.0 x 105 células microbianas en división activa. Alternativamente, las células de los microorganismos en o de la muestra se incuban durante un tiempo y en condiciones suficientes para ayudar a que las células se dividan activamente para obtener de este modo un cultivo en división activa de dichas células de dicho microorganismo. Se prefiere que el cultivo en división activa de dichas células de dicho microorganismo comprenda una concentración de células del microorganismo en división activa en el intervalo de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml, preferiblemente de 5.0 x 104 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas/ml, y lo más preferiblemente una concentración de aproximadamente 5.0 x 105 células microbianas/ml. Un experto en la técnica conocerá técnicas para medir células en división activa en una muestra o suspensión. Por ejemplo, una<concentración de células en división activa puede determinarse usando mediciones de producción de CO>2<y/o usando>reactivos fluorescentes para indicar la presencia de un número o concentración suficiente de células microbianas en división activa.
Por ejemplo, se pueden añadir 500 microlitros de una suspensión al 10% (en solución salina al 0.85%) de un detergente no iónico (tal como Triton-X100) a 500 microlitros de una muestra clínica o una muestra de cultivo que comprende células microbianas en división activa e incubar a temperatura ambiente para separar las células microbianas de células no microbianas (p. ej., células sanguíneas) que pueden estar presentes en el cultivo. Alternativamente, puede usarse filtración para aislar y separar las células microbianas del cultivo. Las células microbianas en división activa aisladas después pueden resuspenderse en un medio de cultivo adecuado descrito anteriormente en el presente documento tal como en 1 ml de solución salina equilibrada de Hank. Una dilución tal como una dilución 1:10 en un medio de cultivo adecuado como se describe anteriormente en el presente documento tal como solución salina equilibrada de Hank puede realizarse, por ejemplo, en un total de 1 ml de solución salina equilibrada de Hank que contiene una concentración de trabajo del compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico descrito en el presente documento (p. ej., SYTO 95 pM). Alternativamente, se puede preparar una dilución 1:10 de la suspensión bacteriana en solución salina equilibrada de Hank (opcionalmente precalentada a 37°C).
Esta suspensión que contiene las células en suspensión microbiana en división activa después se analiza usando un citómetro de flujo acústico. Por ejemplo, se puede usar un citómetro de flujo Attune NxT, con los siguientes ajustes: Caudal 25 microlitros/minuto, Tiempo de registro 1 minuto. Basándose en la selección de sucesos de los datos de la citometría de flujo que tienen una intensidad de señal de FSC mayor de 103 unidades arbitrarias de fluorescencia, intensidad de SSC mayor de 103 unidades arbitrarias de fluorescencia y fluorescencia de excitación a 488 nm-emisión a 515-545 nm mayor de 102 unidades arbitrarias de fluorescencia (que son positivas para la tinción con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico), se puede obtener un recuento del número de bacterias/ml de hemocultivo positivo. La suspensión de células microbianas previamente sometida a tratamiento con detergente puede centrifugarse para separar las células microbianas del resto de la suspensión, y las células después pueden resuspenderse en un medio de cultivo adecuado descrito en el presente documento tal como caldo Mueller-Hinton.
La suspensión de células microbianas se puede normalizar entonces mediante cualquier técnica o instrumento capaz de normalizar suspensiones microbianas (p. ej., usando un nefelómetro o un espectrofotómetro que mide a una OD a 600 nm) de manera que la densidad de las células microbianas en el momento de la exposición a un agente antimicrobiano esté en el intervalo de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 10707 células microbianas por mililitro, preferiblemente de 5.0 x 104 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas por mililitro, y lo más preferiblemente a una concentración de 5.0 x 105 células microbianas por mililitro.
Esta suspensión normalizada puede entonces incubarse, por ejemplo, a 37°C durante un periodo de tiempo que es uno de: 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos o 180 minutos.
El tiempo exacto de incubación puede determinarse, en cada incremento de 30 minutos, llevando a cabo las siguientes etapas: (a) separar una parte alícuota (p. ej., 100 microlitros) de la suspensión de células microbianas; (b) preparar una dilución 1:10 de la parte alícuota en un medio de cultivo adecuado descrito en el presente documento (p. ej., añadiendo una cantidad de aproximadamente 900 microlitros de solución salina equilibrada de Hank a la parte alícuota); (c) centrifugar la suspensión alícuota diluida; (d) separar el líquido sobrenadante de la suspensión centrifugada; (e) teñir la suspensión con un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico, p. ej., añadiendo 1 ml del medio de cultivo, p. ej., solución salina equilibrada de Hank que contiene una concentración de trabajo del compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico (p. ej., SYTO 95 pM); (f) analizar la suspensión teñida usando el citómetro de flujo acústico (p. ej., citómetro de flujo Attune NxT) con los siguientes ajustes: Caudal 25 microlitros/minuto, Tiempo de registro 1 minuto. Basándose en la selección de sucesos de los datos de la citometría de flujo que tenían intensidad de señal de FSC mayor de 103 unidades arbitrarias de fluorescencia, intensidad de SSC mayor de 103 unidades arbitrarias de fluorescencia y fluorescencia de excitación a 488-emisión a 515-545 nm mayor de 102 unidades arbitrarias de fluorescencia (tinción positiva de SYTO 9), un recuento del número de bacterias/ml de suspensión de crecimiento bacteriano; y (g) si este recuento alcanzaba 2.0 x 106 bacterias por mililitro, se terminaba la incubación y se avanzaba en el ensayo.
Alternativamente, en situaciones donde la muestra biológica recogida del sujeto se indica como positiva para un microorganismo y se mantiene a 37°C, se pueden omitir las etapas de preincubación (a) a (f). En cuyo caso la suspensión se normaliza (por ejemplo, usando recuentos de citometría de flujo, un nefelómetro o un espectrofotómetro que mide la OD 600) a una concentración celular aproximadamente en el intervalo de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas por mililitro, preferiblemente de aproximadamente 5.0 x 104 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas por mililitro, y lo más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 5.0 x 105 células microbianas por mililitro.
En un ejemplo donde no se omitían las etapas de preincubación (a) a (f), puede prepararse una suspensión de trabajo de microorganismos a partir de esta suspensión de incubación bacteriana. La determinación empírica del número de microorganismos por microlitro se puede usar para determinar un volumen de suspensión que se añadirá a un volumen de caldo Mueller-Hinton (precalentado a 37°C) de manera que la concentración final de células de microorganismos sea de aproximadamente 5.0 x 103 a 5.0 x 107 células microbianas/ml, preferiblemente aproximadamente 5.0 x 105 microorganismos/ml.
Se puede añadir un volumen de esta suspensión de crecimiento microbiano a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de formato estándar (p. ej., Merck) que contiene un agente antimicrobiano tal como un patrón de antibiótico para lograr una concentración final igual a las suspensiones de trabajo apropiadas de los agentes antimicrobianos tales como los antibióticos ensayados. Se entenderá que el formato de placa y el número de pocillos o muestras que pueden ensayarse no se limitan al formato de placa de 96 pocillos convencional. El intervalo de concentraciones para cada agente antimicrobiano ensayado se puede determinar a 0.25 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l, 32.0 mg/l, 64.0 mg/l, 128.0 mg/l y/o 256.0 mg/l. Sin embargo, se puede ensayar cualquier intervalo de concentraciones del agente antimicrobiano y no se limita a este intervalo de concentraciones.
Después de la inoculación del(de los) agente(s) antimicrobiano(s), la placa de 96 pocillos puede incubarse durante aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 60 minutos o aproximadamente 90 minutos o aproximadamente 120 minutos. Para bacterias Gram negativas se prefiere que la incubación sea durante aproximadamente 30 minutos. Para bacterias Gram positivas, el período de tiempo puede coincidir con el tiempo de preincubación. Como ejemplo, si el microorganismo tardó aproximadamente 90 minutos en crecer de 1.0 x 106 a 2.0 x 106 células microbianas por mililitro, la incubación con el agente antimicrobiano puede ser también de aproximadamente 90 minutos. En ausencia de un conocimiento previo de la identidad del organismo, la duración de la etapa de preincubación puede coincidir con la etapa de exposición al antibiótico, descrita en el presente documento. Después de la exposición de las células microbianas al agente antimicrobiano, la placa de 96 pocillos se somete preferiblemente a centrifugación, por ejemplo, a 2300 x g durante 5 minutos, y se aspira el líquido sobrenadante, y las células se resuspenden en una solución salina (p. ej., al 0.85%).
La suspensión de células microbianas que se ha expuesto al agente antimicrobiano que ahora está presentes en cada pocillo de la placa de 96 pocillos se somete después a marcado con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se añade una parte alícuota de 40 microlitros de las células que se han resuspendido en la solución salina a 160 microlitros de solución salina equilibrada de Hank teñida con un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico adecuado tal como SYTO 9 (por ejemplo para preparar una concentración de trabajo final de SYTO 9 5 gM). La placa puede entonces incubarse en ausencia de luz, a temperatura ambiente, durante aproximadamente 5 minutos para permitir el marcado suficiente.
La placa se carga entonces en un citómetro de flujo acústico adecuado como se describe en el presente documento tal como el citómetro de flujo Attune NxT por medio de un inyector automático del citómetro de flujo Attune NxT. De cada pocillo de la placa, se analiza una muestra mediante el citómetro de flujo acústico. Por ejemplo, cuando se usa el citómetro de flujo Attune NxT, mediante el inyector automático del citómetro de flujo Attune NxT, se pueden aplicar los siguientes ajustes: Caudal - 25 microlitros por minuto, Volumen de adquisición - 18 microlitros por pocillo, Espera antes de registro - 8 segundos, Enjuague entre pocillos - activo. Sin embargo, cuando el método de dilución sustituye la centrifugación de las placas, el ajuste anterior del inyector automático del citómetro de flujo Attune NxT puede sustituirse por los siguientes ajustes: Caudal - 100 microlitros por minuto, Volumen de adquisición - 60 microlitros por pocillo, Espera antes del registro - 8 segundos, Enjuague entre pocillos - activo.
Los datos para cada pocillo de la placa de 96 pocillos pueden exportarse entonces para el análisis.
A modo de ejemplo solamente, los datos para cada pocillo de la placa de 96 pocillos se exportan en formato de archivo FCS 3.1 desde el software de adquisición Attune NxT para análisis, y los datos de cada pocillo de la placa de 96 pocillos se importan entonces a FlowJo v10.4.2. Sin embargo, se entenderá que sería aceptable cualquier otro software (tal como FCS Express, R (FlowCore y FlowViz)) capaz de realizar las siguientes etapas de análisis. Alternativamente, puede usarse cualquier paquete estadístico capaz de aceptar los datos de FCS (convertidos en archivos CSV), capaz de realizar el análisis de subconjuntos de variables mencionado en este documento (donde una selección de poblaciones se considera un subconjunto de datos con los parámetros apropiados). Ejemplos de esto son: R (BioConductor, FlowStats), Orange, código estadístico a medida escrito en cualquier lenguaje de programación apropiado (p. ej., Python, Ruby, Visual Basic, C, Ansi C, C++).
Para cada archivo de datos, se pueden aplicar las siguiente etapas de análisisin silicoA a H: (A) Se añade una selección de poblaciones de histograma, seleccionando todos los sucesos de unidades arbitrarias de fluorescencia en la fluorescencia de excitación a 488 nm-emisión a 515 nm-545 nm mayor que 102. (B) En un gráfico de dispersión frontal - área y dispersión frontal - altura, todos los sucesos con una relación de altura a área por debajo de 1.5 se seleccionan para asegurar que solo se analizan células individuales. (C) Se identifican los archivos de datos correspondientes a las muestras de control no expuestas. Para ensayos en los que se analizan múltiples muestras de control, se identifica el modo o el número mediano de sucesos por microlitro (el que sea mayor). (D) En un gráfico de dispersión frontal-altura, y fluorescencia de excitación a 488 nm, emisión a 515 nm-545 nm, se aplica el contorneado del vecino más cercano al umbral de 10%, y se selecciona una región delimitada por el contorno más exterior que abarca todos los sucesos dentro de esta región. Esto designa la selección de poblaciones de UCM. (E) Se determina el número de sucesos registrados, se normaliza como sucesos por microlitro, y se identifica como que cae dentro del límite de la selección de poblaciones de UCM para cada archivo de datos muestreado de la placa de 96 pocillos. Esto representaba un recuento de células microbianas por microlitro, con los parámetros ópticos y de fluorescencia medidos consistentes con microorganismos no afectados por la exposición al agente antimicrobiano. (F) Usando el software, la selección de poblaciones de UCM se aplica a un gráfico de dispersión frontal-altura, y fluorescencia de excitación a 488 nm, emisión a 515 nm-545 nm, a todos los archivos de datos del ensayo. Esta etapa identifica el número de microbios por microlitro, en cada archivo de datos, consistente con microorganismos no afectados por la exposición al agente antimicrobiano. (G) Para cada archivo de datos en todo del ensayo, el número de sucesos en la selección de poblaciones de UCM por microlitro se divide por el número de sucesos en la selección de poblaciones de UCM por microlitro en la muestra de control no expuesta a partir de la cual se definió originalmente la selección de poblaciones de UCM. Este valor puede expresarse como un porcentaje para identificar la proporción de células de microorganismos en cada archivo de datos con parámetros ópticos y de fluorescencia consistentes con microorganismos no afectados por la exposición al agente antimicrobiano (véanse los resultados mostrados en la Figura 23). (H) Se compararon todos los archivos a lo largo del ensayo que habían recibido la misma exposición a antimicrobianos. La concentración mínima inhibidora (MIC) se define como la concentración antimicrobiana más baja a la que el porcentaje de células microbianas restantes ha caído por debajo de un umbral predeterminado específico de agente antimicrobiano.
Con respecto a la etapa (H) anterior, con el fin de definir la concentración mínima inhibidora (MIC) del agente antimicrobiano ensayado, los umbrales predeterminados pueden obtenerse, por ejemplo, exponiendo 122 aislados (con un mínimo de 34 aislados resistentes) del microorganismo de interés, al agente antimicrobiano de interés de la manera descrita anteriormente para generar un valor hipotético, por ejemplo, puede parecer que un nuevo agente antimicrobiano tiene un umbral de sensibilidad de 20% restante en comparación con el control no expuesto. Este umbral puede ser ensayado entonces por comparación con los resultados generados, para los aislados de microorganismos expuestos al mismo fármaco, por un método de referencia tradicional tal como microdilución en caldo. Si la correlación de MIC es mayor que 0.90, por ejemplo con menos de 3% de "errores muy importantes" (siendo "errores muy importantes" un microorganismo con un fenotipo resistente a fármacos que se determina como que tiene una MIC consistente con un fenotipo sensible a fármacos) se confirma entonces el umbral y se establece un nuevo umbral.
En ausencia de umbrales empíricamente obtenidos, validados estadísticamente, podrían usarse umbrales arbitrarios. Por ejemplo, para un agente antimicrobiano con un efecto bacteriostático conocido (es decir, cuando la presencia del agente antimicrobiano inhibe el crecimiento de, pero no destruye directamente células del microorganismo), el 60% de células restantes, en comparación con el control no expuesto, se consideraría suficiente para realizar una determinación de MIC. Para un agente antimicrobiano con una actividad bactericida conocida (un compuesto que destruye directamente las células microbianas), el 30% de células restantes, en comparación con el control no expuesto, puede ser suficientes para realizar una determinación de la MIC. Para agentes antimicrobianos con un mecanismo de acción desconocido, se puede lograr la certeza estadística de la inhibición aplicando un umbral al 10% de células restantes, en comparación con el control no expuesto.
Método de ejemplo 2
En otro ejemplo, el método de alto rendimiento puede ser una versión modificada y simplificada del método de ejemplo 1 descrito anteriormente. Por ejemplo, el método de alto rendimiento puede comprender obtener de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene infección por un microorganismo (p. ej., bacteria) una muestra que comprende células del microorganismo. La muestra obtenida del sujeto puede examinarse para determinar que comprende al menos aproximadamente 1.0 x 105 células microbianas en división activa.
Un experto en la técnica conocerá técnicas para medir las células en división activa en una muestra o suspensión. Por ejemplo, una concentración de células en división activa puede determinarse usando mediciones de producción de CO2 y/o usando reactivos fluorescentes para indicar la presencia de un número o concentración suficiente de células microbianas en división activa.
Por ejemplo, se pueden añadir 500 microlitros de una suspensión al 0.1% (en solución salina al 0.85%) de un detergente no iónico (tal como Triton-X100) a 500 microlitros de una muestra clínica o una muestra de cultivo que comprende células microbianas en división activa e incubar a temperatura ambiente para separar y/o aislar las células microbianas de otros componentes presentes en el cultivo, p. ej., para separar las células microbianas de células no microbianas tales como células sanguíneas. Alternativamente, puede usarse filtración para aislar y separar las células microbianas del cultivo.
Después se puede preparar una dilución 1:10 de las células microbianas en división activa aisladas resuspendiendo las células en un medio de cultivo adecuado descrito en el presente documento tal como solución salina equilibrada de Hank. Esta suspensión se analiza después preferiblemente con un nefelómetro y, mediante la adición gota a gota de medios de cultivo adecuados tales como solución salina equilibrada de Hank (p. ej., precalentada a 37°C), diluida hasta que alcanza la paridad, por ejemplo mediante la resolución de dicho nefelómetro, con un patrón 0.5 de McFarland (0.05 ml de cloruro de bario al 1.0% en 9.95 ml de ácido sulfúrico al 1.0%). Esto equivale a aproximadamente 1.5 x 108 células microbianas/ml.
Se añade una parte alícuota de esta suspensión a un volumen adicional de caldo Mueller-Hinton (precalentado a 37°C) de manera que la concentración final de microorganismos esté en el intervalo de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas por mililitro, preferiblemente de aproximadamente 5.0 x 104 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas por mililitro, y lo más preferiblemente a la concentración de 5.0 x 105 células microbianas por mililitro. Se añade un volumen de esta suspensión de crecimiento microbiano normalizada a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de formato normalizado que contiene un patrón de agente antimicrobiano (p. ej., antibiótico) para conseguir una concentración final igual a las suspensiones de trabajo apropiadas de los agentes antimicrobianos (p. ej., antibióticos) que se están ensayando. El intervalo de concentraciones para cada agente antimicrobiano que se puede ensayar se selecciona de 0.25 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l, 32.0 mg/l, 64.0 mg/l, 128.0 mg/l y/o 256.0 mg/l.
Después de la inoculación de un agente antimicrobiano en la suspensión de crecimiento microbiano, la placa de 96 pocilios puede incubarse durante aproximadamente 30 minutos o bien aproximadamente 120 minutos. Para bacterias Gram negativas, la incubación puede ser durante 30 minutos. Para microorganismos clasificados como bacterias Gram positivas, o en ausencia de un conocimiento previo de la identidad del microorganismo, la duración de la etapa de preincubación puede establecerse en aproximadamente 120 minutos.
Después de que haya pasado el tiempo de exposición con el agente antimicrobiano, el volumen dentro de cada pocillo se complementa preferiblemente con 4 volúmenes de una solución de trabajo de un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico descrito en el presente documento, por ejemplo, solución salina equilibrada de Hank teñida con SYTO 9 de manera que la concentración final de SYTO 9 sea 5 pM. La placa se incuba después en ausencia de luz, a temperatura ambiente, durante aproximadamente 5 minutos para permitir la tinción de las células microbianas. La placa puede cargarse entonces en cualquier citómetro de flujo acústico adecuado tal como el citómetro de flujo Attune NxT por medio de un inyector automático del citómetro de flujo Attune NxT.
De cada pocillo de la placa, se analiza una muestra mediante el citómetro de flujo acústico tal como el citómetro de flujo Attune NxT, por medio del inyector automático del citómetro de flujo Attune NxT, por ejemplo, usando los siguientes ajustes: Caudal - 100 microlitros por minuto, Volumen de adquisición - 60 microlitros por pocillo, Espera antes del registro - 8 segundos, Enjuague entre pocillos - activo.
Solución salina equilibrada de Hank teñida con SYTO 9 de manera que la concentración final de SYTO 9 es 5 pM. La placa se incuba después en ausencia de luz, a temperatura ambiente, durante aproximadamente 5 minutos. La placa se carga en el citómetro de flujo Attune NxT por medio de un inyector automático del citómetro de flujo Attune NxT.
Como en el método de ejemplo 1 descrito anteriormente, los datos para cada pocillo de la placa de 96 pocillos pueden exportarse entonces para el análisis. A modo de ejemplo solamente, los datos para cada pocillo de la placa de 96 pocillos pueden exportarse en formato de archivo FCS 3.1 desde el software de adquisición de Attune NxT para el análisis, y los datos de cada pocillo de la placa de 96 pocillos se importan entonces a FlowJo v10.4.2. Sin embargo, se entenderá que cualquier otro software (tal como FCS Express, R (FlowCore y FlowViz)) capaz de realizar las siguientes etapas de análisis sería aceptable o puede usarse cualquier paquete estadístico capaz de aceptar los datos de FCS (convertidos en archivos CSV) y que sea capaz de realizar un análisis de subconjuntos de variables donde una selección de poblaciones se considera un subconjunto de datos con los parámetros apropiados.
Para cada archivo de datos, las etapas de análisisin silicoA a H, como ya se han descrito en detalle anteriormente en relación con el método de ejemplo 1, también se pueden realizar para determinar los valores de MIC.
Discusión
Los resultados proporcionados en los ejemplos de trabajo que siguen demuestran que el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención era capaz de determinación cualitativa precisa y muy rápida del perfil de sensibilidad a los agentes antimicrobianos de microorganismos, p. ej., bacterias, en clasificación de sensible/no sensible. Los resultados proporcionados en los ejemplos de trabajo en el presente documento también demuestran que el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención era además muy eficaz para medir y/o predecir la sensibilidad cuantitativa (MIC) de los microorganismos a los agentes antimicrobianos.
Por ejemplo, la determinación del perfil de sensibilidad a antimicrobianos deK. pneumoniaeresistente a carbapenems por AFC, mediante el método de la presente invención, ha predicho tanto la sensibilidad cuantitativa (MIC) como cualitativa (sensible/no sensible) a los carbapenems. Aunque se puede haber usado la citometría de flujo hidrodinámica para ensayos de sensibilidad a antimicrobianos antes de la presente invención, el uso de citometría de flujo acústica para ensayos de sensibilidad a antimicrobianos como se ilustra en los ejemplos de trabajo y se detalla a 10 largo del presente documento es el primer informe de cualquier método validado capaz de generar puntos finales cuantitativos clínicamente relevantes, p. ej., utilizando cualquier citometría de flujo. Además, la predicción de la sensibilidad cualitativa y/o cuantitativa conseguida por el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de esta invención es la determinación fenotípica más rápida descrita de la sensibilidad a antimicrobianos conseguida hasta la fecha, tiene un alto grado de precisión, y representa un paso significativo hacia el alineamiento de la sensibilidad de microorganismos en laboratorio con plazos de decisión clínica. El método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la presente invención proporciona determinación fenotípica rápida de sensibilidad a antimicrobianos y predice con precisión resultados cualitativos.
El método de ensayo de sensibilidad reconocido internacionalmente por el método de microdilución en caldo es demasiado laborioso para su uso en laboratorios clínicos (p. ej., patología), lo cual favorecen otros métodos de determinación de sensibilidad.
La descripción de la invención proporcionada en el presente documento presenta, entre otros, estadísticas de rendimiento para el ensayo de sensibilidad cualitativa de sensibilidad asistido por AFC. Los ejemplos de trabajo en el presente documento son capaces de demostrar la potencia del análisis a nivel de células individuales, con vistas a la posible adaptación de este método en el laboratorio clínico. Para el médico que prescribe, un método de ensayo de sensibilidad cualitativa rápido tal como el descrito ampliamente en el presente documento representa una capacidad para alinear el proceso de toma de decisiones de agentes antimicrobianos (p. ej., antibiótico) que se prescriben con los mejores ideales de práctica de la gestión eficaz de antimicrobianos.
El método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC como se describe ampliamente en el presente documento es adecuado para su aplicación como un método rápido para determinar el fenotipo de resistencia a agentes antimicrobianos debido a una fuerte correlación entre MIC<bmd>y MIC<fast>. A modo de ejemplo, el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC como se describe ampliamente en el presente documento es adecuado para la aplicación como un método rápido para determinar el fenotipo de resistencia a carbapenems debido a una fuerte correlación entre MIC<bmd>y MIC<fast>para carbapenem.
La medida de MIC<fast>generada por el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la presente invención sigue una heurística predeterminada para generar resultados cuantitativos, en lugar de depender de puntos finales subjetivos potencialmente sesgados por el usuario. Cualquier uso opcional de plantillas de espacio de trabajo puede permitir la replicación de resultados por usuarios no especialistas después de instrucciones mínimas por un operador experto usando un paquete de software tal como el paquete de software registrado FlowJo. Sin embargo, el uso de software registrado no es estrictamente necesario - cualquier plataforma de software capaz de generar una salida de contorneado puede ser adecuada para usar con el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de esta invención.
La naturaleza robusta del ensayo de prueba de sensibilidad asistido por AFC de esta invención está respaldado, entre otros, por la modelización por citometría de flujo reproducible de una serie compleja de interacciones fisiológicas. Por ejemplo, la dispersión frontal (FSC) a menudo se usa como sustituto del tamaño de partículas, pero esto simplifica demasiado el comportamiento dinámico de las partículas no esféricas [Caron, G.N., Stephens, P., Badley, R. A. (1998). Assessment of bacterial viability status by flow cytometry and single cell sorting.J. Appl. Microbiol.84, 988-98]. Hay mucha más información en esta única medición que el tamaño y la orientación de una partícula que pasa a través del citómetro de flujo. Por ejemplo, los cambios en los perfiles de granularidad y autofluorescencia también son capaces de alterar el número absoluto de fotones que llegan al detector de FSC. De una manera similar, los fotones absorbidos y emitidos por las señales de fluorescencia también pueden alterar las mediciones de FSC [Shapiro, H. M., Nebevon-Caron G. (2004). Multi-parameter flow cytometry of bacteria.Methods Mol. Biol.263, 33-44].
La elección del uso de un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico p. ej. un colorante de unión a ácido nucleico fluorescente de forma natural (tal como SYTO 9) asegura que la medición en el canal BL1 (p. ej., 530/30 nm) también contiene información con respecto al contenido de ácido nucleico celular (p. ej., ADN), volumen citoplasmático y perfiles de autofluorescencia.
Los perfiles de intensidad de tinción observados a partir de un método experimental suponiendo que rigurosamente controlado ofrecen además comprensión adicional de propiedades fisiológicas tales como permeabilidad de membrana y flujo de salida de moléculas de compuesto fluorescente (p. ej., colorante). Aislados con la tercera mutación de inserción de agujero de osmoporinaompK36(ins AA 134-135 GD) puede mostrar una intensidad reducida de BL1, p. ej., como se muestra en Hall, J.M.et al.(2014) y Hall, J. M., Ingram, P. R., O'Reilly, L. C., y Inglis, T. J. J. (2016) mencionado anteriormente. Esta mutación de porina excluye compuestos cargados positivamente (tales como SYTO 9) [Dutzler, R. et al. (1999). Crystal structure and functional characterization of the OmpK36, the osmoporin of K. pneumoniae.Structure.7, 425-434]. La consistencia de los resultados obtenidos en una colección de aislados de tan diversos orígenes geográficos y mecanismos de resistencia respalda una fisiología microbiana (p. ej., bacteriana) conservada y por lo tanto respalda la naturaleza conservada de la biología subyacente que se está cuantificando.
La respuesta fisiológica que se detecta por el método FAST después de la exposición a antimicrobianos se asemeja a la variedad de morfotipos inducidos por carbapenems descritos anteriormente [Choi J. et al. (2014). A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis.Sci TranslMed.6, 267ra174]. La detención de la división celular después de la inhibición de proteínas de unión a penicilina [Kitano, K., y Tomasz, A. (1979). Triggering of autolytic cell wall degradation inEscherichia coliby beta-lactam antibiotics.Amicrob. Agents Cemother.
16, 838-848; y Lakaye, B. et al. (1999). When drug inactivation renders the target irrelevant to antibiotic resistance: a case story with beta-lactams.Mol. Microbiol.31, 89-101] conduce a un aumento global en el ADN celular y aumenta el colorante SYTO unido al ADN detectable en BL1. La disminución global en el número de células por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo, y el aumento correspondiente en las poblaciones de sucesos del citómetro de flujo con baja dispersión frontal y BL1 variada, es probable que refleje residuos celulares mixtos de la lisis celular bacteriana durante la exposición a antimicrobianos.
Más específicamente, la validación ortogonal de la firma asociada a la sensibilidad (SAS) mediante microscopía de fluorescencia (ejemplos de lo cual se proporcionan en la Figura 4) proporciona más evidencia de la respuesta fisiológica subyacente a la agresión antimicrobiana. Aunque la SAS describe los cambios en la prevalencia de poblaciones en los gráficos de AFC biaxiales, la alineación de estos cambios con microscopía demuestra una consistencia con la actividad conocida del meropenem en aislados deKlebsiellasensibles. La elongación e hinchamiento de las células aumenta el tamaño global del suceso (FSC aumentada) y el volumen citoplasmático (mayor contribución de SYTO 9 de fluorescencia natural a BL1). El fracaso de la división celular después de la inhibición de las proteínas de unión a penicilina [Kitano, K., y Tomasz, A. (1979); y Lakaye, B. et al. (1999)] se produce inmediatamente antes de la fisión binaria y da como resultado un aumento global en el contenido de ADN genómico por célula (aumento en el componente específico de SYTO 9 unido a ADN de BL1). La disminución global en el número de células observada tanto por microscopía como por AFC, mostró una asociación inversa con poblaciones de sucesos de FSC baja/BL1 variable. Los autores de la invención especulan que las poblaciones son una mezcla de residuos proteínicos, fragmentos celulares, carcasas celulares y micelas lipídicas que encapsulan ADN que pueden estar presentes después del colorante de lisis celular a la exposición a antimicrobianos.
Sin estar ligados por ninguna teoría o ningún mecanismo o modo de acción específico, los autores de la invención han especulado que en el contexto de la validación ortogonal de la firma asociada a la sensibilidad (SAS), aquellas subpoblaciones minoritarias que muestran un fenotipo de resistencia que difiere de la mayoría de la población en una sola muestra de una serie de diluciones (tales como los ejemplos destacados en la Figura 6) postulan la relevancia biológica que solo surge del análisis a nivel de una sola célula. La capacidad para discriminar entre aislados contaminantes de baja prevalencia ya sea que sean (en el caso de la contaminación del aislado 374 con S.aureus)de especies diferentes o de colonias morfológicamente distintas de la misma especie, demuestra la potencia del análisis a nivel de células individuales. La BMD requiere una incubación prolongada para producir una suspensión turbia a simple vista. Este periodo permite, bajo una fuerte presión selectiva (tal como después de la exposición a cualquier agente antimicrobiano), que una subpoblación altamente resistente persista cuando se inhibe la mayoría del fenotipo sensible. La importancia de la detección por el método de ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica de la presente invención de subpoblaciones es doble. En primer lugar, proporciona una resolución para medir el fenotipo de resistencia preciso de todos los sucesos dentro de la muestra proporcionada al ensayo (incluyendo información valiosa sobre múltiples fenotipos), y en segundo lugar se añade a la creciente evidencia de carga de la heterogeneidad existente naturalmente en el fenotipo de resistencia entre aislados que parecen por lo demás homogéneos.
En otras palabras, el método de MIC de microdilución en caldo se basa en un punto final subjetivo y requiere la incubación prolongada [Wiegand, I., Hilpert, K., y Hancock, R. E. W. (2008). Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.Nat. Protoc.3, 163-175], que permite la persistencia de subpoblaciones resistentes después de la inhibición de la mayoría de las bacterias sensibles. Por otra parte, el método FAST acústico de la presente invención mide, entre otros, el fenotipo de resistencia de todas las células de microorganismos (p. ej., bacterianas) en cada parte alícuota, y se suma a la evidencia de que los microorganismos que son resistentes al agente antimicrobiano (p. ej., enterobacteriáceas resistentes a carbapenems) son fenotípicamente heterogéneos.
Sin estar ligados por ninguna teoría o mecanismo específico o modo de acción, los autores de la invención han especulado que la microdilución en caldo simplifica demasiado el método de ensayo de sensibilidad y sobreestima la dosis requerida para demostrar la eficacia antimicrobiana.
Las subpoblaciones bacterianas altamente resistentes se han implicado anteriormente en el fracaso de la monoterapia con meropenem. Estas bacterias pueden responder a la terapia de combinación con meropenem con la condición de que no se haya producido un crecimiento importante [Qureshi, Z. A. et al. (2012). Treatment outcome of bacteremia due to KPC-producingKlebsiella pneumoniae:superiority of combination antimicrobial regimens.Antimicrob. Agents Chemother.56, 2108-2113.31,34; y Nabarro, L. E. B., y Veeraraghavan B. (2015). Combination therapy for carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: increasing evidence, unanswered questions, potential solutions.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.34, 2307-2311]. Por lo tanto, la identificación de estas características de sensibilidad bacteriana en un tiempo más corto podría convertirse en la base de una guía de tratamiento antimicrobiano más en su debido tiempo.
Aunque el método de los autores de la invención elimina la necesidad de la etapa de cultivo secundario requerida para la microdilución en caldo u otra determinación de sensibilidad cualitativa dependiente del crecimiento, puede ser necesario un desarrollo adicional opcional para purificar bacterias directamente de muestras de pacientes de manera que los resultados de laboratorio estén disponibles para el médico dentro de un marco de tiempo más corto, particularmente para pacientes con sepsis y otras infecciones graves.
Se observaron discrepancias en diluciones > 2 entre MIC<bmd>y MIC<fast>para aislados productores de pAmpC e IMP-4. Estos tipos de resistencia producen fenotipos inducibles de resistencia a meropenem [Espedido, B., Iredell, J., Thomas, L., Zelynski, A. (2005). Wide dissemination of a carbapenemase plasmid among Gram-negative bacteria: implications of the variable phenotype.J. Clin. Microbiol.43, 4918-4919.33; y Bartowsky, E., y Normark, S. (1993). Interactions of wild-type and mutant AmpR ofCitrobacter freundiiwith target DNA.Mol. Microbiol.10, 555-565]. La inducción deK. pneumoniaeproductora de pAmpC resistente a meropenem se ha demostrado después de la acumulación citosólica de subproductos de transpeptidación inhibida a lo largo del tiempo. La selección de subpoblaciones de baja prevalencia con AmpC expresado constitutivamente también puede conducir a desplazamientos rápidos, dependientes del tiempo en el fenotipo de resistencia general [Jacobs, C., et al. (1994). Bacterial cell wall recycling provides cytosolic muropeptides as effectors for beta-lactamase induction.EMBO J.13, 4684-4694; y Jacobs, C., Frere, J. M., y Normark, S. (1997). Cytosolic intermediates for cell wall biosynthesis and degradation control inducible beta-lactam resistance in Gram-negative bacteria.Cell.88, 823 - 832]. La inducción de la expresión no se produce en el plazo de 30 minutos desde la exposición a antimicrobianos y puede contribuir por tanto a discrepancias entre MIC<bmd>y MIC<fast>. En el caso de aislados productores de IMP-4, se cree que la resistencia a meropenem de alto nivel inducida es causada por las subpoblaciones intrínsecamente resistentes [Espedido, B., Iredell, J., Thomas, L., Zelynski, A. (2005). Wide dissemination of a carbapenemase plasmid among Gram-negative bacteria: implications of the variable phenotype.J. Clin. Microbiol.43, 4918-4919]. La presencia de poblaciones persistentes a concentraciones de meropenem más altas en la selección de poblaciones de UCM indica una subpoblación de células resistentes a meropenem mediado por IMP-4 inducibles. La identificación de la resistencia inducible es un desafío significativo con cualquier ensayo rápido de sensibilidad a antimicrobianos, pero la determinación de los resultados poco después del inicio de la exposición a antimicrobianos debe reducir el efecto complejo de la exposición prolongada y mejorar la precisión de los puntos finales del ensayo.
El método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la presente invención para la determinación de MIC<fast>tiene potencial, muchas aplicaciones clínicas y de investigación potenciales tales como la vigilancia de fenotipo resistente, la determinación del impacto de condiciones ambientales/químicas alteradas sobre el fenotipo de resistencia y la modelización de las interacciones entre poblaciones bacterianas mixtas después de una agresión por antimicrobiano. Otro uso potencial de este método es su incorporación en un conjunto de análisis ortogonales que combinan investigaciones genómicas y fenotípicas para evaluar las características fisiológicas de un fenotipo de resistencia particular (24-27, 33-38).
La precisión del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la presente invención para determinar y/o medir la sensibilidad cuantitativa y cualitativa a agentes antimicrobianos (p. ej., a meropenem en la especieKlebsiella)se comparan favorablemente con el estándar internacional actual, mientras que preferiblemente la obtención de resultados en de aproximadamente 1 (cualitativos) a aproximadamente 3 (cuantitativos) horas después de la recepción del cultivo primario, en la mayoría de los casos un total de 24 horas antes que la práctica estándar actual.
Además, el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la presente invención permite la transición de puntos finales interpretados subjetivamente a análisis de células bacterianas individuales generados objetivamente que pueden mejorar la resolución de un ensayo de sensibilidad a antimicrobianos, sin sacrificar la precisión o bien la especificidad.
Además, la fuerte correlación positiva observada entre MIC<bmd>y MIC<fast>respalda la aplicación del método FAST como una herramienta para un ensayo rápido de fenotipo de resistencia a antimicrobianos (p. ej., carbapenem). En lugar de depender de puntos finales subjetivos potencialmente sesgados por el usuario, las mediciones de MIC<fast>conseguidas por el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de esta invención siguen una heurística predeterminada para generar determinaciones cualitativas.
Para el médico que lo prescribe, las mediciones/determinación de sensibilidad cualitativa y cuantitativa rápidas conseguidas por el método de la presente invención representan una capacidad para mejorar el proceso de toma de decisiones de prescripción para los mejores ideales de práctica de la gestión eficaz de antimicrobianos. El método de la presente invención elimina la necesidad de la etapa de cultivo secundario requerida para realizar la determinación de sensibilidad cualitativa dependiente del crecimiento en BMD u otra.
Además, como se demuestra en los ejemplos de trabajo que siguen, la definición de morfotipo de células no expuestas (UCM) y su uso en la posterior determinación/análisis de sensibilidad se lleva a cabo en la presente invención con los parámetros del citómetro de flujo acústico que mejor diferencian la población de células bacterianas no expuestas de los efectos dependientes de antimicrobianos que comprenden la firma de exposición. La demostración de una firma de exposición se realiza en el menor número de canales del citómetro de flujo acústico que reflejan con precisión la varianza en el UCM, independientemente de qué canales puedan ser. Por lo tanto, en los métodos de la presente invención, la combinación óptima de canales y el umbral interpretativo pueden diferir con combinaciones de antimicrobianos/especies. Sin embargo, la determinación de la varianza del UCM y su atribución a un efecto antimicrobiano puede realizarse con cualquier herramienta de agrupamiento, contorneado, separación o clasificación que sea capaz de interpretar las mismos datos de salida del citómetro de flujo acústico que puedan correlacionarse con un patrón de referencia numérica para la sensibilidad a antimicrobianos.
Además, el patrón de referencia actual usado en la técnica para medir MIC (BMD) es una medición discontinua con determinación a simple vista del punto final. El patrón en BMD para MIC se define de manera diferente por diferentes jurisdicciones reguladoras, y no se aplica a combinaciones de antimicrobianos/especies para las que no hay patrón regulador aceptado. Un umbral más general para la significación biomédica puede ser >90%, lo que se ha usado ampliamente para procedimientos de laboratorio que producen un resultado numérico. Sin embargo, cuando se usa la MIC BMD para algunas combinaciones de antimicrobianos/especies, el punto final es gradual y NO agudo, introduciendo error antes de que haya comenzado un ensayo de comparación. Una consecuencia es que algunos mecanismos de acción antimicrobiana dependerán de la concentración y algunos dependerán del tiempo, o una combinación de ambos.
La precisión superior del método de citometría de flujo acústica de la presente invención permite a los autores de la invención demostrar estos efectos, diferenciar entre ellos y determinar los niveles de MIC de un agente antimicrobiano para un microorganismo infeccioso presente en el sujeto en tiempo real, que no puede ser alcanzado usando técnicas convencionales de MIC BMD.
La presente invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes:
Ejemplo 1: Aislados bacterianos
Este ejemplo demuestra la reunión de un panel representativo de aislados conocidos de un microorganismo para el que se conocen las MIC de agentes antimicrobianos. El panel representativo puede usarse como referencia o patrón para la determinación rápida de las MIC a partir de los datos de salida obtenidos por métodos de citometría de flujo acústica de la invención.
Este ejemplo también demuestra la reunión de un panel representativo de aislados conocidos de un microorganismo para validar la clasificación de sensibilidad y los resultados del ensayo de sensibilidad obtenidos con los métodos de citometría de flujo acústica de la invención, frente al análisis de microdilución en caldo, para demostrar la eficacia del método de la presente invención.
Se montó un panel internacionalmente representativo de 48 aislados deKlebsiellaproductores de carbapenemasas que cubrían un intervalo de sensibilidad a la carbapenemasa desde sensibles a altamente resistentes. Los aislados se recogieron de diferentes localizaciones geográficas por todo el mundo, como se ilustra en la Figura 1. En particular, el panel comprende aislados deKlebsiella pneumoniae(n = 45) yKlebsiella oxytoca(n = 3) que se recogieron de colaboradores en Inglaterra (n = 9), Suecia (n = 10), Noruega (n = 9), Sri Lanka (n = 4), Estados Unidos de América (aislados de colección de cultivos, n = 3) y Australia (n = 13) para asegurar la representación de un panel diverso de mecanismos y linajes. Los 48 aislados se muestran en la Tabla 2.
Los aislados deK. pneumoniaeproductores de carbapenemasa se obtuvieron de la Colección de Cultivos de Australia Occidental (WACC, PathWest Laboratory Medicine, Australia Occidental que incluía la Colección Americana de Cultivos Tipo ATCC deK. pneumoniae:a Tc C BAA1705, ATCC BAA1706 y ATCC 700603), Unidad de Referencia de Resistencia a los Antimicrobianos e Infecciones Asociadas con la Asistencia sanitaria de Salud Pública de Inglaterra (AMRHAI), (Londres, Reino Unido); el Instituto de Salud Pública Noruego (Oslo, Noruega), el Laboratorio de Desarrollo de EUCA<s>T (Vaxjo, Suecia) (Tabla 2).
Todos los aislados bacterianos mencionados en la Tabla 2 son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el aislado ATCC 700603 es una cepa depositada previamente (con ATCC) deK pneumoniaeESBL y se empleó en el método presente como control positivo (cepa de control positivo productora de carbapenemasa). El aislado bacteriano ATCC BAA1706 también era una cepa deK. pneumoniaedepositada previamente (con ATCC) y se empleó como cepa de control de tipo naturalK. pneumoniae.El aislado ATCC BAA1705 también era una cepa deK. pneumoniaeKPC depositada previamente (con ATCC) y se empleaba como un aislado de control productor de carbapenemasa. El resto de las cepas deKlebsiellamencionadas en la Tabla 2 eran todas conocidas y se describieron previamente, p. ej., en Hall, J.M. et al. Molecular mechanisms of p-lactam resistance in carbapenemase-producingKlebsiella pneumoniaefrom Sri Lanka.J. Med. Microbiol.63, 1087-92 (2014); y Hall, J. M., Ingram, P. R., O'Reilly, L. C., e Inglis, T. J. J. Temporal flux in beta-lactam resistance amongKlebsiella pneumoniaein Western Australia.J. Med. Microbiol.65, 429-437 (2016).
Todos los aislados referidos procedían de colecciones de cultivos curados, con identidad confirmada a nivel de especie, tenían MIC de carbapenems conocidas y un mecanismo definido de resistencia a carbapenems para la mayoría de los aislados resistentes (Tabla 2). Por consiguiente, el panel internacionalmente representativo proporcionaba una amplia cobertura de distribución geográfica y mecanismos de resistencia a antimicrobianos. La colección contenía 23 aislados con carbapenemasas (familias KPC, NDM, VIM, IMP y OXA-48), ocho con plactamasas de espectro extendido (ESBL) o p-lactamasas AmpC codificadas por plásmidos (pAMPC) y 17 sin betalactamasas adquiridas demostrables. Los fenotipos de sensibilidad a meropenem variaron desde muy sensibles (MIC < 0.006 mg/l) hasta resistencia de alto nivel (MIC > 256 mg/l).
Los aislados se enviaron a Perth, Australia occidental bajo la normativa de la Asociación Internacional del Transporte Aéreo (IATA) para productos biológicos y se importaron bajo la normativa australiana de bioseguridad a unas instalaciones de cuarentena aprobadas.
Todos los aislados importados se subcultivaron en agar con sangre de caballo al 5% v/v y su identidad de especie se volvió a confirmar por MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Alemania). Los aislados se almacenaron en caldo de infusión de cerebro y corazón-glicerol al 15% a -80°C para su posterior análisis.
Antes del ensayo de sensibilidad mediante el método FAST de la presente invención y el análisis de MIC por microdilución en caldo en paralelo, se recuperaron las bacterias del almacenamiento congelado según las directrices de la ATCC para proporcionar una densidad celular estándar en suspensión tal como se ha descrito previamente [en: American Type Culture Collection. (2015). ATCC® Bacterial culture guide tips and techniques for culturing bacteria and bacteriophages (pp. 1-36). Manassas, Virginia: American Type Culture Collection]. Esto se ilustra en la Figura 2. En resumen, los aislados bacterianos se reconstituyeron a partir de reservas en glicerol a -80°C, se sembraron por estría en placas de agar con sangre de caballo al 5% v/v para incubación a 37°C durante la noche para garantizar la pureza del crecimiento, después se inocularon en 20 ml de caldo de tripticasa de soja (TSB) [que comprende aproximadamente 17 g de triptona (digerido pancreática de caseína), aproximadamente 3.0 g de Soytone (digerido péptico de soja), aproximadamente 2.5 g de glucosa (dextrosa), aproximadamente 5.0 g de cloruro sódico, aproximadamente 2.5 g de fosfato dipotásico, reconstituido en aproximadamente 1 l de agua] durante una incubación de 10-18 horas (durante la noche) para garantizar la recuperación de la agresión inducida por la crioconservación.
La iteración experimental inicial usó 10 aislados de la Colección de cultivos de Australia occidental (WACC, PathWest Laboratory Medicine, Australia Occidental) que incluía la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) deK. pneumoniae.Se llevó a cabo un trabajo de validación adicional después de aceptar 38 aislados deKlebsiellaadicionales de una serie de centros de colaboración internacional: la Unidad de referencia de resistencia a los antimicrobianos e infecciones asociadas a la asistencia sanitaria (AMRHAI) de PHE, (Londres, Reino Unido), el Instituto de Salud Pública Noruego (Oslo, Noruega), el Laboratorio de Desarrollo de EUCAST (Vaxjo Suecia) y la Universidad de Colombo, Sri Lanka [Hall, J.M. et al. (2014) Molecular mechanisms of p-lactam resistance in carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae from Sri Lanka.J. Med. Microbiol.63, 1087-92]. Como ya se ha mencionado anteriormente, esto proporcionó una amplia cobertura de distribución geográfica y mecanismos de resistencia.
Ejemplo 2: Material y métodos
1. Agentes antimicrobianos
Se usaron los siguientes agentes antimicrobianos: meropenem de calidad farmacéutica (Ranbaxy, Haryana, India), e imipenem de calidad analítica, ertapenem, meropenem, ceftriaxona, cefoxitina y oxacilina (todos de Sigma-Aldrich, Missouri, EE. UU.).
Los antibióticos liofilizados se disolvieron en solución salina estéril al 0.85% para producir una solución madre de 5120 mg/l, se filtraron con jeringa a 0.1 pm usando unidades de filtro de jeringa de poli(fluoruro de vinilideno) hidrófilo (PVDF) (Millipore, Massachusetts) y se almacenaron por debajo de -20°C. Los antibióticos almacenados se descongelaron inmediatamente antes de su uso.
Para preparar soluciones madre de trabajo de FAST de los antibióticos (p. ej., soluciones madre de trabajo de meropenem FAST), se dispensaron suspensiones madre en diluciones seriadas 1:2 en caldo Mueller-Hinton filtrado (MHB) para dar una serie de diluciones de partes alícuotas de 1 ml a concentraciones en el intervalo de 2560 mg/l a 2.5 mg/l.
2. Manipulación de fluidos a granel
Todos los fluidos a granel requeridos para la preparación de muestras bacterianas, o para la operación de la citometría de flujo acústica, se filtraron antes de su uso con unidades de filtro de polietersulfona desechables de 0.1 pm (Sartorius, Stedim, Alemania) para minimizar la contaminación por partículas. Se filtraron disoluciones de volumen pequeño (tampones de resuspensión, soluciones de lavado, etc.) usando filtros de jeringa desechables de 0.1 pm (Merck, Darmstadt, Alemania) inmediatamente antes de su uso.
3. Preparación de bacterias y tinción de células bacterianas en división activa con un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico
Una parte alícuota de 1 ml de suspensión bacteriana se centrifugó, lavó y resuspendió en 1 ml de solución salina tamponada de Hank (HBSS; que comprende NaCl aproximadamente 0.137 M, KCl aproximadamente 5.4 mM,<Na2HPO4 aproximadamente 0.25 mM, aproximadamente 0.1 g de glucosa, KH>2<PO>4<aproximadamente 0.44 mM, CaCl>2<1.3 mM, MgSO4 1.0 mM, CaCl>2<aproximadamente 1.3 mM, MgSO4 1.0 mM y NaHCO3 aproximadamente 4.2 mM) y se>diluyó en serie (p. ej., en una dilución seriada 1:10) hasta una dilución final 1:1000.
Se añadió 1 pl (microlitro) de solución madre de trabajo con colorante SYTO 9 (p. ej., ThermoFisher Scientific) a la dilución final a una concentración final de 5 pM y se incubó durante 5 minutos antes de contar sucesos bacterianos por citómetro de flujo acústico (AFC) (Attune, ThermoFisher, Eugene, OR, EE. UU.), que se usó para preparar una densidad de inóculo normalizada para ensayo de sensibilidad.
Se añadió una parte alícuota de suspensión bacteriana a tubos de centrífuga de 50 ml (Corning, Nueva York) que contenían 9 ml de MHB filtrado precalentado (37°C) para producir una densidad final de 5 x 105 - 1 x 106 bacterias por ml. Esta suspensión se incubó a 37°C con agitación a 100 rpm durante 30 minutos para obtener un cultivo en división activa. Después, se añadió una parte alícuota de solución de trabajo de antibiótico de la serie de diluciones descrita anteriormente (apropiada para la concentración ensayada) a cada tubo antes de una incubación adicional de 30 minutos con agitación, tiempo durante el cual se preparó una placa de dilución en microcaldo (MBD) para la incubación durante la noche a 37°C como se ha descrito previamente en Clinical and Laboratory Standards Institute (2015)Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Informational Supplement.Documento CLSI M100-S25. Clinical and Laboratory Standards Institute, 950, West Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pennsylvania, 19087, EE. UU.
Se recogió un mililitro de suspensión bacteriana de cada concentración de antibiótico por centrifugación a 7800 x g durante 5 minutos, se lavó y diluyó 1:10 en HBSS filtrado en un tubo de microcentrífuga impermeable a la luz, después se tiñó con tinción SYTO 9 a una concentración final de 5 pM, y se incubó durante 5 minutos antes del muestreo de AFC. Se usaron colorante Hoechst 33342 (NucBlue, Thermo Fisher Scientific, Eugene, OR, EE. UU.) y una combinación de SYTO 9/yoduro de propidio (PI) (Thermo Fisher Scientific) en una serie de experimentos por duplicado.
4. Funcionamiento de la citometría de flujo acústica (AFC)
El citómetro de flujo acústico empleado era el citómetro de flujo acústico Attune (Thermo Fisher Scientific), que tiene instalado en el mismo un láser azul de 488 nm con un filtro de 530/30 nm en el tubo fotomultiplicador para medir la fluorescencia de las células ensayadas. Alternativamente, se puede emplear el citómetro de flujo acústico Attune NxT (Thermo Fisher Scientific). El AFC se calibró al comienzo de cada sesión de adquisición usando perlas de calibración de tamaños marcadas con fluorescencia, según las instrucciones del fabricante (ThermoFisher Scientific). Los ajustes de AFC fueron los siguientes: Voltaje de dispersión frontal (FSC) 3100, umbral de FSC 4 x 1000 AND, voltaje 1900 de láser azul 1 (BL1 - 530/30 nm), umbral de BL1 1 x 1000 a Nd , alta sensibilidad, caudal 25 gl/minuto y un volumen de adquisición de 125 gl. La adquisición se detuvo después de recoger 20000 sucesos en todas las selecciones de poblaciones, o después de 3 minutos, con cada muestra adquirida por triplicado técnico.
5. Análisis de datos de AFC
Los datos recogidos se exportaron en el formato de archivo FCS 3.0 y se analizaron en Flow v10.0 (FlowJo LLC, Ashland, OR, EE. UU.) por un solo usuario, con ocultación de los resultados de MIC por BMD (MIC<bmd>).
6. Microscopía de fluorescencia digital
Se recogió una parte alícuota de 1 ml de crecimiento de cada concentración antimicrobiana mientras se realizaban mediciones de AFC de bacterias expuestas a antimicrobianos, se centrifugó a 7800 x g durante 5 minutos y se resuspendió en 10 gl de HBSS. Se añadió una parte alícuota de 0.1 gl de tinción SYTO 9 a cada tubo (a una concentración final de 50 gM) y se incubó durante 5 minutos. Se puso una parte alícuota de 2 gl en un portaobjetos de poli-L-lisina, se selló debajo de un cubreobjetos, y se observó a un aumento de 60x por microscopía de fluorescencia digital. Las muestras se observaron en la plataforma de microscopía de fluorescencia digital EVOS-FL (Thermo Fisher, Eugene OR), con un campo de visión representativo capturado para cada muestra en toda la serie de diluciones antimicrobianas. Se adquirieron imágenes de alta resolución demostrativas usando un microscopio de fluorescencia digital invertido Nikon Ts2R Eclipse (Nikon, Tokio, Japón).
7. Reunión de subconjuntos de ensayos de sensibilidad cualitativa
Los autores de la invención buscaron determinar si se podía desarrollar un ensayo de sensibilidad cualitativa usando la plataforma FAST ilustrada en estos ejemplos. Para este efecto, se realizó una determinación posterior de los datos de MIC cuantitativos como se describe a continuación.
Posterior a la determinación cuantitativa de MIC<fast>, los datos del citómetro de flujo acústico se volvieron a analizarin silicopara producir un subconjunto limitado para la determinación cualitativa de la sensibilidad. Se usaron las seis diluciones de antibiótico (0 mg/l, 0.25 mg/l, 1 mg/l, 2 mg/l, 4 mg/l y 16 mg/l) más relevantes para la evaluación de la sensibilidad cualitativa. El análisisin silicose restringió al primer triplicado técnico de cada muestra registrada. Las estrategias de selección de poblaciones permanecieron consistentes, con la adición de un análisis de restricción de selección de poblaciones a solo aquellos sucesos registrados en los primeros 60 segundos de adquisición. Los aislados se definieron como sensibles a meropenem (S) o no sensibles (NS) usando los puntos de corte clínicos de EUCAST para enterobacteriáceas (S < 2 mg/l, NS > 8 mg/l).
8. Análisis estadístico
Se usó el software estadístico (Prism v 6.1, GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.) para analizar tanto la categorización de S/NS como los resultados cuantitativos de MIC. Los resultados de S/NS se analizaron usando un formato x2. Se usaron mediciones de rendimiento de ensayo de laboratorio clínico (sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, coeficiente de correlación de Matthews) para evaluar la capacidad del método FAST para determinar correctamente la sensibilidad a antimicrobianos, p. ej., carbapenem, mediante punto de corte cualitativo. La correlación entre MIC<bmd>y MIC<fast>se analizó calculando el coeficiente de Spearman para los datos no paramétricos. Los datos de MIC se representaron gráficamente en un gráfico biaxial log-log, usando los resultados de la microdilución como determinante (Prism, 6.1).
9. Investigación de discrepancias
Todos los aislados que demostraban categorías anómalas de S/NS (MIC<bmd>vs. MIC<fast>) o discrepancias de MIC fuera de la tolerancia del ensayo de microcaldo (+/- una etapa de dilución doble) se examinaron con más detalle.
Todos estos aislados se subcultivaron una vez al día durante tres días, para excluir la posibilidad de una baja prevalencia de contaminación de las soluciones madre crioconservadas por bacterias distintas de la especieKlebsiella.Cualquier aislado que presentase aspecto de colonia variable en medio sólido se había analizado en cada uno los morfotipos de colonias subcultivados por separado, y se verificó su identidad. La base molecular de la resistencia a carbapenem se reconfirmó usando ensayos de PCR específicos de mecanismo como se ha descrito previamente [Hall, J.M. et al. Molecular mechanisms of p-lactam resistance in carbapenemase-producingKlebsiella pneumoniaefrom Sri Lanka.J. Med. Microbiol.63, 1087-92 (2014) y Gorire N. et al., The implications of endemic IMP-4 carbapenemase for clinical laboratory susceptibility testing.J. Microbiol. Methods.124, 10-2 (2016)].
En los casos en los que se identificaron contaminantes o mecanismos de resistencia complejos, los aislados se sometieron a una ronda adicional de FAST después de la determinación de la identidad y la base molecular de la resistencia.
10. Investigación de subpoblaciones
Las poblaciones observadas en gráficos de citometría de flujo bivariable que parecían segregarse en dos poblaciones a lo largo de una serie de diluciones se observaron en muchos aislados durante la validación.
Para investigar este efecto adicionalmente, se seleccionó un ejemplo demostrativo (K16, un aislado productor de IMP-4) y se sometió al ensayo de MIC FAST detallado anteriormente el Día 1. Este se denominó "Día uno". Una vez completada la preparación de la muestra, se recogió un ml de la suspensión bacteriana expuesta a meropenem 4 mg/l (p. ej., por centrifugación), se lavó en HBSS nuevo para eliminar la presencia de meropenem, y se inoculó en 19 ml de TSB nuevo para incubación durante la noche para proporcionar entrada para una segunda ronda de FAST el "Día dos". El día 2, se repitió el FAST y se compararon los resultados finales. Se compararon MIC<fast>, las formas de las poblaciones y la progresión de la firma asociada a la sensibilidad entre ambos experimentos (es decir, experimentos del Día uno y el Día dos).
Ejemplo 3:
Desarrollo de un ensayo rápido de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica
Este ejemplo describe el desarrollo de un nuevo método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC para ensayar cualitativa y/o cuantitativamente la sensibilidad de un microorganismo (p. ej. una bacteria) en una muestra biológica a agente(s) antimicrobiano(s).
La metodología descrita en los ejemplos de trabajo 1 y 2 anteriores junto con los resultados proporcionados en los ejemplos de trabajo que siguen ilustran el desarrollo por los autores de la presente invención de un método nuevo y mejorado mediante el cual se puede ensayar rápidamente la sensibilidad a un agente antimicrobiano tal como un antibiótico (en este caso, ilustrado usando meropenem) en cualquier microorganismo unicelular o multicelular tal como una bacteria (en este caso, ilustrado enK. pneumoniae).Este método nuevo y mejorado se ilustra brevemente en el diagrama esquemático representado en la Figura 2.
El método se logró usando un citómetro de flujo acústico para obtener una resolución óptima de partículas pequeñas, y un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico tal como un colorante fluoróforo intercalante de unión a ácido nucleico (p. ej., SYTO 9) para discriminar entre sucesos bacterianos y residuos de fondo. De los colorantes o combinaciones de colorantes ensayados por los autores de la invención en el Ejemplo 2, se obtuvieron resultados óptimos con SYTO 9. En los presentes ejemplos de trabajo, se usaron cambios en el tamaño, forma, volumen citoplasmático y número de sucesos globales para predecir la sensibilidad deK. pneumoniae)a meropenem en 1 hora, y MIC en 3 horas.
La Figura 2 representa el flujo de trabajo como se ilustra en el presente documento. En resumen, se recuperó un aislado de la crioconservación, se sembró en agar sangre para asegurar la pureza, y se inoculó en caldo de tripticasa de soja (TSB, descrito anteriormente) durante la noche para simular fluidos biológicos. Una parte alícuota de 1 ml de esta suspensión durante la noche se inoculó en caldo Mueller-Hinton (MHB) [que comprende aproximadamente 300.0 g de extracto ovino (infusión deshidratada de), aproximadamente 17.5 g de hidrolizado de caseína, aproximadamente 1.5 g de almidón, reconstituido en aproximadamente 1 l de agua, pH 7.3 ± 0.1 medido y mantenido a 25 °C] y se incubó a 37°C para garantizar que las bacterias se dividieran activamente. Una parte alícuota se sometió a ensayo de sensibilidad de microdilución en caldo (MBD) tradicional. Otra parte alícuota se expuso a meropenem durante 30 minutos, se recogió, se tiñó con colorante SYTO 9, y después se ensayó con un citómetro de flujo acústico.
Ejemplo 4:
Definición de la sensibilidad a agente(s) antimicrobiano(s) por AFC
Este ejemplo demuestra el uso del método de la invención asistido por citometría de flujo acústica para definir la sensibilidad de un microorganismo, p. ej. una bacteria, a uno o más agentes antimicrobianos. Por ejemplo, este ejemplo demuestra el uso del método de la invención asistido por citometría de flujo acústica para definir la sensibilidad deKlebsiellaa meropenem.
La sensibilidad a meropenem se definió mediante emparejamiento cuidadoso de los desplazamientos observados en la fluorescencia de FSC y BL1 (530/30 nm - recogida ideal para SYTO 9) en gráficos de AFC biaxiales, y la observación de estructuras bacterianas consistentes con afectado por meropenem por microscopía de fluorescencia. Se ha demostrado que la exposición de aislados sensibles a meropenem en división activa a concentraciones inhibidoras del fármaco produce una variedad de morfotipos celulares; las células se alargan, hinchan, crecen rápidamente, y finalmente avanzan a la lisis celular completa a medida que quedan afectadas [Choi J. et al., (2014). A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis.Sci Transí Med.6, 267ra174].
Cuando se hizo la comparación entre microscopía y gráficos de AFC biaxiales, se encontró que una mayor prevalencia de morfotipos celulares aberrantes (consistente con afectado por meropenem) se correlacionó con un aumento en FSC, fluorescencia de BL1 aumentada y formación de poblaciones que se contornean independientemente en gráficos biaxiales. En un aislado sensible a meropenem, estos cambios se observaron a la concentración más baja ensayada (Figura 3A), mientras que en un aislado con una MIC de meropenem elevada, estos cambios no se observaron a concentraciones por debajo de la MIC<bmd>(Figura 3B). Cuando un aislado no sensible (es decir, resistente) se expuso a una concentración que se acercaba y excedía la m IC<b>, se observaron los cambios de dispersión frontal (FSC) y BL1 asociados con la sensibilidad. Por conveniencia, se hace referencia en el presente documento a este cambio progresivo en el morfotipo, que se acerca y supera, la MIC<bmd>como firma asociada a la sensibilidad (SAS).
Con más detalle, la Figura 3, en el panel (A), demuestra que la exposición de la cepa de tipo sensible deK pneumoniae(ATCC 700603) producía un aumento en la dispersión frontal, fluorescencia de SYTO 9, número reducido de sucesos globales, y formaba un nuevo foco de contorneado a la MIC del aislado (0.25 mg/l). A 32x MIC, se observaron un total de cuatro focos de contorneado, con un desplazamiento global hacia dispersión frontal baja, residuos fluorescentes bajos. La progresión de estas características, cuando se observa en combinación, constituye la firma asociada a la sensibilidad. La coloración en los gráficos biaxiales indica focos de agrupamiento separados. Las micrografías de fluorescencia (adquiridas a un aumento de 60x) muestran un número de células global reducido y aumento de los morfotipos celulares aberrantes a medida que aumenta la concentración de meropenem.
La Figura 3, en el panel (B), demuestra que la exposición de la cepa clínica altamente resistente a meropenem deK pneumoniaeK8 muestra una ausencia de firma asociada a sensibilidad a través de concentraciones de meropenem clínicamente relevantes mediante un trazado biaxial de citómetro de flujo acústico, y una ausencia de morfotipos celulares aberrantes mediante microscopía de fluorescencia.
Ejemplo 5:
Las estrategias de selección de poblaciones normalizada dan como resultado un informe cuantitativo de punto final reproducible
Este ejemplo demuestra una estrategia de selección de poblaciones normalizada para producir mediciones de MIC FAST en gráficos biaxiales de AFC. La estrategia como se ilustra en el presente documento implica, entre otros, definir una selección de poblaciones racional de morfología de células no expuestas de las células del microorganismo en la dispersión frontal de AFC (FSC) y gráficos biaxiales de fluorescencia que capturan sucesos de citometría de flujo acústica correspondientes a todas las células en la muestra de control no expuesta que tienen una morfología celular correspondiente a una morfología celular del microorganismo que no está afectada por los efectos del agente antimicrobiano.
Los sucesos bacterianos de interés se definieron por fluorescencia de SYTO 9 mayor de 104 unidades arbitrarias de fluorescencia. Los sucesos agregados y coincidentes se excluyeron mediante la selección de poblaciones racional en gráficos bivariables de FSC-A frente a FSC-H, y la fluorescencia de fondo (autofluorescencia y ruido electrónico) se minimizó mediante la selección racional en poblaciones de interés mediante el gráfico de BL1 -H frente a BL3-H (Figura 4A). Usando el triplicado técnico de las bacterias no expuestas con la mediana de la intensidad de fluorescencia media geométrica (GMFI) de BL1-H, se usó la herramienta de autoselección (FlowJo) para definir una selección de poblaciones que delimitaba todos los sucesos contorneados en un gráfico de contorno bivariable de FSC-H frente a BL1 -H al umbral de 10% (Figura 4B). Esta selección de poblaciones y los sucesos que delimitaban se denominaron el morfotipo de células no expuestas (UCM), y la selección de poblaciones después se aplicó de manera consistente a todas las muestras a lo largo de la serie de diluciones de agente antimicrobiano. El recuento absoluto de número de sucesos en esta selección de poblaciones se calculó para dar una medida comparable de UCM para cada muestra, normalizada por volumen (sucesos/gl). Los cambios en la prevalencia de morfotipos cuando las bacterias se expusieron a meropenem en concentraciones que se aproximaban o superaban la MIC<bmd>fueron evidentes como firma asociada a sensibilidad distinta. Se usaron comparaciones iterativas entre las tasas de sucesos de UCM/gl en muestras expuestas a antibióticos y muestras de control no expuestas para determinar la MIC (MIC<fast>) en el ensayo de sensibilidad asociada al flujo.
Ejemplo 6:
Predicción de MIC<bmd>por AFC
Este ejemplo demuestra la eficacia del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención para medir con precisión la MIC de un agente antimicrobiano al que es sensible un microorganismo, y demuestra que las mediciones de MIC<fast>obtenidas por el método de la invención son consistentes con el patrón internacionalmente reconocido para AST usando la determinación de MIC por microdilución en caldo (MIC<bmd>). Así pues, este ejemplo demuestra que las mediciones (MIC<fast>) de sensibilidad cuantitativas obtenidas por el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención predicen de manera precisa (y rápida) los valores de MIC<bmd>de un agente antimicrobiano al que es sensible un microorganismo.
La serie inicial de los autores de la invención de 10 aislados para encontrar el intervalo demostró una estrecha correspondencia entre la concentración de meropenem que producía la aparición de la firma asociada a la sensibilidad y los valores de MIC<bmd>. Se compararon los números de sucesos delimitados por la selección de poblaciones de UCM por gl (UCMg) en muestras expuestas a antibióticos con muestras de control no expuestas, con un enfoque particular en los números de células que están dentro y fuera de las regiones seleccionadas en aquellas muestras que presentan la firma asociada a la sensibilidad. Se observó que los resultados del citómetro de flujo predecían con precisión la MIC<bmd>de meropenem cuando se establecía un punto de corte como la primera concentración en una serie de diluciones de antimicrobiano en la que dos o más de las repeticiones técnicas tenían un UCMp igual o menor que el 30% de los sucesos que estaban dentro de la selección de poblaciones de UCM del control no expuesto (véase la Tabla 1 y la Figura 5A). Esta concentración se denomina MIC<fast>.
Los resultados de MIC<bmd>y MIC<fast>emparejados para la colección completa de aislados se muestran en la Tabla 2. Había una fuerte correlación positiva entre MIC<bmd>y MIC<fast>en toda la colección de aislados (r = 0.913, p < 0.0001, sensibilidad 1.00, especificidad 0.90, valor predictivo positivo 0.86, valor predictivo negativo 1.00 y coeficiente de correlación de Matthew de 0.878) (Figura 5B).
La determinación de MIC<fast>requería 158 minutos desde el cultivo primario en crecimiento activo (35 minutos de incubación, 12 minutos para la manipulación manual, 108 minutos para la adquisición de datos y 3 minutos de interpretación de datos a partir de la plantilla de espacio de trabajo preparada).
Ejemplo 7:
Predicción de la sensibilidad cualitativa por AFC
Este ejemplo demuestra que el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención también es eficaz para proporcionar rápidamente la determinación cualitativa de sensibilidad y asignar eficazmente categorías de sensibilidad (S/NS) al agente antimicrobiano ensayado para el microorganismo.
Se evaluó la sensibilidad cualitativa a meropenem para la colección completa de aislados del subconjunto de datos previamente descrito.
Sólo tres aislados se determinaron incorrectamente; dos aislados (KS1, OXA-181 y 500638, pAMPC) se categorizaron incorrectamente como sensibles (S) a pesar de ser no sensibles (NS) (MIC<fast>2, MIC<bmd>4), sin embargo, esta variación entre ensayos del doble está dentro de la tolerancia aceptada del ensayo de microdilución en caldo (BMD). K16 (IMP-4, MIC<bmd>16; MIC<fast>2) fue objeto de extensas investigaciones posteriores.
A pesar de estos aislados, el umbral/criterio interpretativo de sensible/no sensible por FAST era altamente concordante con la sensibilidad derivada de BMD (x2 = 37.03, df = 1, p < 0.0001, sensibilidad 1.00, especificidad 0.90, valor predictivo positivo 0.875, valor predictivo negativo, 1.00 coeficiente de correlación de Matthew 0.887).
Basándose en las condiciones seleccionadas para la reunión de conjuntos de datos, el tiempo teórico para el resultado para este ensayo cualitativo es de 54 minutos desde el cultivo primario en división activa (35 minutos de incubación, 11 minutos para la manipulación manual, 6 minutos para la adquisición de datos y 2 minutos de interpretación de datos a partir de la plantilla de espacio de trabajo preparada).
Tabla 1 - Validación del ensayo con diez aislados deKlebsiella pneumoniaeexpuestos a meropenem terapéutico. Cada aislado se expuso en triplicado biológico, adquiriéndose cada muestra en triplicado técnico mediante AFC, con la MIC dada como el modo de repeticiones. S/NS se dan según los siguientes criterios de EUCAST: (S: MIC < 2 mg/l, NS: MIC > 2 mg/l).
MICbmd MICfast BMD S/NS FAST S/NS
<0.25 <0.25 S S
ATCC 700603 <0.25 <0.25 S S
<0.25 <0.25 S S
<0.25 <0.25 S S
43292 <0.25 <0.25 S S
<0.25 <0.25 S S
<0.25 <0.25 S S
43358 <0.25 <0.25 S S
<0.25 <0.25 S S
<0.25 <0.25 S S
18397 <0.25 <0.25 S S
<0.25 <0.25 S S
0.5 0.5 S S
44271 0.5 0.5 S S
MICbmd MICfast<b m d s>/<ns>FAST S/NS
0.5 0.5 S S
4 4 NS NS
KS1 2 1 S S
2 2 S S
2 1 S S
KS11 4 1 NS S
4 2 NS S
16 8 NS NS
ATCC BAA1705 16 8 NS NS
16 8 NS NS
32 64 NS NS
K1 64 64 NS NS
32 32 NS NS
128 256 NS NS
K14 256 256 NS NS
256 128 NS NS
En la Tabla 1 anterior: MIC<fast>es MIC por el método FAST; MIC<bmd>es MIC por microdilución en caldo; S es sensible a meropenem (MIC < 2 mg/l); NS es no sensible a meropenem (MIC > 2 mg/l).
Tabla 2 - Sensibilidades a meropenem (mg/l) para 48 aislados deKlebsiellade diversos lugares y con mecanismos de resistencia diversos. Los 48 aislados se expusieron a meropenem de calidad terapéutica y se sometieron a FAST en triplicado técnico, con los valores de MIC<fast>y MIC<bmd>presentados como el modo de repeticiones. La interpretación fue según los criterios de EUCAST: (S = MIC < 2 mg/l; Ns = MIC > 2 mg/l).
Aislado País de origen Mecanismo Referido a MIC<bmd>MIC<fast m b d>FAST MIC de Lab S/NS S/NS 2440606 Inglaterra < 0.06 <0.25 <0.25 S S 2880622 Inglaterra < 0.06 <0.25 <0.25 S S 51575 Suecia ESBL 0.064 <0.25 <0.25 S S 515870 Suecia ESBL 0.125 <0.25 <0.25 S S ATCC 700603 EE. UU. < <0.25 <0.25 <0.25 S S ATCC BAA 1706 EE. UU. < <0.25 <0.25 <0.25 S S 3354 Australia < <0.25 <0.25 0.5 S S 18397 Australia < <0.25 <0.25 <0.25 S S 43288 Australia < <0.25 <0.25 <0.25 S S 43292 Australia < <0.25 <0.25 <0.25 S S 43358 Australia < <0.25 <0.25 <0.25 S S 43854 Australia < <0.25 <0.25 <0.25 S S A1 Noruega S <0.25 <0.25 S S A2 Noruega S <0.25 <0.25 S S A3 Noruega S <0.25 <0.25 S S A4 Noruega S <0.25 <0.25 S S A7 Noruega S <0.25 <0.25 S S Aislado País de origen Mecanismo Referido a MIC<bmd>MIC<fast m b d>FAST MIC de Lab S/NS S/NS A13 Noruega S <0.25 <0.25 S S A15 Noruega S <0.25 <0.25 S S A16 Noruega S <0.25 <0.25 S S 2890369 Inglaterra 1 <0.25 0.5 S S 2980639 Inglaterra 1 <0.25 0.5 S S 10924 Suecia k p c 4 <0.25 0.5 S S 3040820 Inglaterra pAmpC < 0.06 0.5 <0.25 S S 270902 Inglaterra 0.125 0.5 <0.25 S S 44271 Australia < <0.25 0.5 0.5 S S K23 Australia IMP - 4 0.5 2 0.5 S S 500638 Suecia pAmpC <0.25 4 2 NS NS KS1 Sri Lanka OXA-181 1 4 2 NS S 374 Suecia v im > 32 8 32 NS NS K16 Australia IMP - 4 2 16 2 NS S ATCC BAA 1705 EE. UU.<k p c>8 16 8 NS NS 200822 Suecia k p c 8 16 8 NS NS A20 Noruega NDM-1 R 16 16 NS NS 70708 Suecia k p c 16 32 32 NS NS 71076 Suecia<k p c>> 32 32 32 NS NS 3000770 Inglaterra NDM-1 > 32 32 8 NS NS N17 Suecia NDM-1 > 32 32 32 NS NS K2 Australia OXA-181 64 32 32 NS NS 2880654 Inglaterra k p c 4 64 32 NS NS 194 Suecia v im > 32 64 16 NS NS KS17 Sri Lanka OXA-181 > 32 64 64 NS NS K1 Australia OXA-181 64 64 32 NS NS KS2 Sri Lanka OXA-181 > 32 128 16 NS NS KS23 Sri Lanka OXA-181 > 32 128 64 NS NS 3080800 Inglaterra<k p c>> 32 256 32 NS NS K8 Australia NDM-1 > 256 >256 >256 NS NS K14 Australia k p c 256 >256 >256 NS NS MIC<fast>: MIC por método FAST; MIC<bmd>: MIC por microdilución en caldo
S: sensible a meropenem, MIC < 2 mg/l; NS: no sensible a meropenem, MIC > 2 mg/l
Ejemplo 8:
El método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC se puede aplicar a diferentes agentes antimicrobianos Este ejemplo demuestra que el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención también es eficaz para determinar rápidamente la sensibilidad de microorganismos a agentes antimicrobianos. En particular, este ejemplo demuestra que el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención puede aplicarse para determinar la sensibilidad a otros antibióticos carbapenémicos.
Para examinar la aplicabilidad del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención a otros carbapenems, se expusieron cepas sensibles a carbapenem (ATCC 700603) y resistentes (es decir, no sensibles; ATCC BAA 1705) a meropenem, imipenem, ertapenem de calidad analítica, y meropenem de calidad terapéutica. No había diferencia entre la determinación de S/NS entre MIC<b m d>y S/NS por FAST cualitativa en todas las condiciones ensayadas (véase la Tabla 3).
Tabla 3 - Las cepas de control deK. pneumoniaeexpuestas a carbapenems produjeron resultados concordantes entre la microdilución en caldo y FAST. Las cepas deK. pneumoniaesensibles a carbapenems de control de ATCC (ATCC 700603) y resistentes a carbapenems, es decir, no sensibles, de ATCC (ATCC BAA1705) se expusieron a tres carbapenems, a lo largo de la configuración de cribado clínico limitado de las concentraciones. No había diferencias (fuera de la resolución del ensayo de microdilución en caldo) en la MIC<f a s t>y MIC<b m d>observadas.
Compuesto usado ATCC 700603 ATCC BAA1705
MIC<f a s t>MIC<b m d>MIC<f a s t>MIC<b m d>Meropenem terapéutico <0.25 <0.25 > 16 > 16
Meropenem analítico <0.25 <0.25 > 16 > 16
Ertapenem analítico <0.25 <0.25 > 16 > 16 Imipenem analítico 1 2 > 16 > 16
Ejemplo 9:
Análisis de discrepancias de MIC<b m d>vs. MIC<f a s t>
Sólo cinco de los 48 (10.4%) aislados mostraron discrepancias entre MIC<b m d>y MIC<f a s t>que dio como resultado una evaluación S/NS a meropenem diferente. Se encontró que el primer aislado 374 contenía una baja prevalencia deStaphylococcus aureuscontaminante. Una sola colonia del aislado deK. pneumoniaepresente se subcultivó y se volvió a analizar por FAST. El análisis del crecimiento deK. pneumoniaepuro produjo una concordancia perfecta entre MIC<b m d>y MIC<f a s t>.
Tres de estos aislados, dos con una enzima de la familia OXA-48 y uno con un IMP-4 (3000763, KS11 y K23 respectivamente), tenían valores de MIC<b m d>y MIC<f a s t>dentro de la tolerancia de dilución doble del método de BMD, pero abarcaba el punto de corte de EUCAST. Por consiguiente, este era un error de clasificación, no una imprecisión del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención.
El aislado restante (K16, IMP-4) produjo inicialmente una MIC<b m d>de 16 mg/l y una MIC<f a s t>de 2 mg/l. Este aislado se subcultivó una vez más para comprobar la pureza, después de lo cual se observaron variantes de colonias lisas y rugosas. En particular, aunque ambos eran de 2-4 mm de tamaño, mucoide, de color marfil y circular, el tipo de colonia dominante tenía aspecto suave, con una forma de baja prevalencia que aparecía rugosa. Cada colonia se subcultivó independientemente y se sometió a FAST. El reensayo de cada tipo de colonia produjo una MIC<f a s t>de 2 y 64 mg/l, respectivamente (Figura 6). La MIC<b m d>(16 mg/l) y MIC<f a s t>de la variante de colonia rugosa (64 mg/l), estaban dentro de la resolución del ensayo de BMD, y dieron como resultado una determinación de S/NS concordante.
Ejemplo 10:
Identificación de subpoblaciones y poblaciones persistentes en aislados con resultados de MIC discrepantes
El aislado K16, clasificado como sensible por MIC<f a s t>se investigó a lo largo de dos días, como se describió anteriormente en el presente documento. El día 1, se encontró que el aislado K16 contenía una población de sucesos bacterianos consistentes con morfotipos de células no expuestas, que persistió hasta 16 mg/l el día 1 (véase la figura 7 - día 1) (es decir, esto es a pesar de una MIC<f a s t>que da como resultado una clasificación de sensible del aislado K16).
Además, el día 2, las características de la población bacteriana presentaron una progresión diferente hacia la firma asociada a la sensibilidad a lo largo del mismo intervalo de dilución de meropenem. Las células bacterianas presentaban una dispersión frontal (FSC) mucho mayor, sin aumento de BL1 asociado el Día 2, y comenzando en 4 mg/l de nuevo se hizo evidente una subpoblación de células (Figura 7 - Día 2). Dichas subpoblaciones se han observado a lo largo de aproximadamente un tercio de todos los aislados ensayados en la colección (n=17).
Ejemplo 11:
El método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC se puede aplicar a agentes antimicrobianos adicionales
Además de los resultados mostrados en los ejemplos de trabajo anteriores, este ejemplo particular proporciona una demostración adicional de que el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención es eficaz para determinar rápidamente la sensibilidad de microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos. En particular, este ejemplo demuestra que (además de los agentes antimicrobianos carbapenémicos ilustrados previamente) el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención es también aplicable para determinar la sensibilidad a otros antibióticos incluyendo cefalosporinas p. ej. como se representa por la ceftriaxona.
La ceftriaxona es una cefalosporina de tercera generación y se usa comúnmente en ensayos de sensibilidad de microorganismos como un indicador de actividad de beta-lactamasa de amplio espectro.
14 aislados deK. pneumoniaedel aislado indicado en la Tabla 2 (que incluyen los 10 aislados indicados en la Tabla 1) se expusieron a ceftriaxona como se ha descrito anteriormente para determinar la sensibilidad de estos aislados deK. pneumoniaea ceftriaxona y la MIC por el método de citometría de flujo acústica de la presente invención. Los resultados se correlacionaron con los valores de MIC<b m d>como antes y se muestran en la Figura 8.
Como se muestra en la Figura 8, no hubo diferencia entre la determinación de S/NS entre S/NS por MIC<b m d>y FAST cualitativo y MIC<b m d>en todas las diluciones ensayadas de ceftriaxona, demostrando además de este modo que los métodos de la presente invención tienen igual éxito para determinar la sensibilidad rápida y los valores de MIC con respecto a diferentes tipos de antibióticos, incluyendo antibióticos carbapenémicos y beta-lactámicos cefalosporinas.
Ejemplo 12:
El método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC se puede aplicar a microorganismos adicionales (parte I)
Además de los resultados mostrados en el trabajo anterior, este ejemplo particular proporciona una demostración adicional de que el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención es eficaz para determinar rápidamente la sensibilidad a agentes antimicrobianos de una variedad de microorganismos diferentes, tal como una variedad de especies bacterianas diferentes, y también a una variedad de agentes antimicrobianos diferentes. En particular, este ejemplo demuestra que el método de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica de la presente invención también puede aplicarse para determinar rápidamente la sensibilidad de bacteriasStaphylococcus aureustanto a antibióticos cefalosporínicos p. ej., representados por cefoxitina como a antibióticos penicilínicos, p. ej., representados por oxacilina.
El método asistido por citometría de flujo acústica de la presente invención se empleó esencialmente como se describe en los ejemplos de trabajo previos para determinar la sensibilidad deStaphylococcus aureustanto a cefoxitina como a oxacilina. La clasificación de sensibilidad en S/NS y los valores de MIC cuantitativos obtenidos usando el método asistido por citometría de flujo acústica se compararon con los resultados obtenidos usando el método de microdilución en caldo (BMD) convencional. Los resultados se muestran en la Tabla 4 (Paneles A y B) a continuación y en las Figuras 9-12. Estos resultados demuestran la utilidad del método de la presente invención para predecir correcta y rápidamente la sensibilidad (S/SN) y los valores de MIC obtenidos usando el método de BMD.
Tabla 4 - Ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica (AFC) paraStaphylococcus aureuscon respecto al antibiótico cefoxitina (Panel A) y el antibiótico oxacilina (Panel B).
El material y los métodos utilizados se describen brevemente a continuación en el presente documento. El método usado fue similar al descrito en los ejemplos anteriores aunque ajustado para permitir una incubación de 3 horas deStaphylococcus aureuspara tener en cuenta lo tiempos de duplicación más largos deStaphylococcus aureuscon respecto aK. pneumoniaeusada en los ejemplos anteriores.
1. Materiales
1 x Fluido de enfoque de Attune; 1x Fluido de lavado de Attune; 1x Fluido de parada de Attune; etanol de calidad reactivo al 100% (filtrado 0.1 pm); placas de agar con sangre de oveja al 5%; Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) (filtrada 0.1 pm); Caldo Mueller Hinton con NaCl al 2% (MHB); Caldo de tripticasa de soja, 25 ml (TSB); agua MilliQ (filtrada 0.1 pm); Blanqueador al 10% (filtrado 0.1 pm); Antibióticos de calidad analítica (Sigma) -oxacilina/cefoxitina; perlas de seguimiento (ensayo de rendimiento de Attune) Life Technologies Ref 4449754; tubo de fondo redondo de poliestireno de 50 ml Falcon Ref 352054-estéril; tubos Eppendorf, con cierre de seguridad, 1.5 ml (Amber blanco); Frascos de filtro de vacío de polietersulfona de 0.1 pm (PES) 1 l; tinción de ácido nucleico SYTO9 Life Technologies Ref S34854 Lote 1746883; Surfynol; Unidad de filtro Sterivex GP de 0.22 pm N.° de cat: SVGP01015.
2. Cultivo de microorganismos
Las soluciones madre bacterianas procedían del almacenamiento y se sembraron por estrías asépticamente para colonias individuales en una placa de agar sangre precalentada (35°C durante 10 minutos), se devolvieron a la incubadora y se incubaron en condiciones de gases atmosféricos a 35°C (durante la noche). Si las soluciones madre iniciales se recuperaban de soluciones madre en glicerol crioconservadas, se repetía el cultivo para asegurarse que no quedaba expresión fenotípica aberrante resultante de la crioconservación.
Una colonia cultivada se emulsionó en 25 ml de TSB y se incubó durante la noche a 35°C. Opcionalmente, los cultivos se colocaron en una plataforma de agitación para aumentar las tasas de crecimiento.
3. Preparación del citómetro de flujo acústico
El citómetro de flujo acústico (AFC) (citómetro de flujo acústico Attune de Thermo Fisher Scientific) usado se suministró con fluidos completamente filtrados. Cuando el dispositivo de AFC se usó previamente sin fluidos filtrados previamente, todas las soluciones madre fluidas anteriores se decantaron de todos los tanques. Se filtró el etanol de calidad reactivo al 100% usando un frasco de filtro de 0.1 pm. Todos los depósitos de fluidos se enjuagaron con etanol filtrado, el etanol se desechó y el dispositivo se dejó secar al aire seco. Opcionalmente, esto se repitió dos veces. Se filtró agua de alta pureza (desionizada o bidestilada) usando un frasco de filtro de 0.1 pm. Todos los depósitos de fluido fueron a fondo. Todos los depósitos tenían soluciones de Attune apropiadas. Usando el paquete de software Attune, se ajustó una limpieza de 60 ciclos, usando la solución de lavado de Attune filtrada de 0.1 pm. Opcionalmente, esta preparación se repitió una vez más.
4. Preparación de fluidos
Se filtraron HBSS y agua MiliQ usando frascos de filtro de 0.1 pm. Se dispensó una parte alícuota de 1 ml en un tubo de 1.5 ml (uno teñido y uno no teñido). Los ajustes de Attune descritos a continuación se usaron para la muestra teñida. Los sucesos estaban dispersos sin focos de agrupamiento obvios, siendo tasas de sucesos menores de 50 sucesos/pl tasas de sucesos aceptables. Si este no era el caso, la etapa de filtración se repetía hasta que se alcanzaba el nivel deseado. Para el conjunto de muestras no teñidas se ignoró el umbral.
5. Ensayo de rendimiento diario
Se comprobaron todos los tanques de fluidos y se aseguró que los niveles eran mayores de 50% (para fluido de enfoque, solución de lavado y solución de parada) o menores de 20% (para residuos). El fluido se decantó del tanque de residuos a un contenedor para su eliminación segura. Aproximadamente 10% del tanque de residuos se llenó con solución de blanqueo.
Se encendió el Attune. El paquete de software se lanzó y se registró. Se realizó el script de inicio de fluídica. Para asegurar un lavado por chorro eficaz del sistema fluídico, el script de inicio se repitió opcionalmente hasta un total de tres veces, u opcionalmente se lavó con chorro de agua MilliQ altamente filtrada por todo el sistema (a la velocidad de 1000 pl/minuto) durante no menos de aproximadamente 5 minutos.
Se usó un tubo de 1.5 ml y se preparó una suspensión de perlas de seguimiento Attune para el ensayo de rendimiento. Se añadió un ml de fluido de enfoque Attune filtrado, 1 gota de perlas de seguimiento y luego se agitó con vórtice durante más de 3 segundos. El tubo se cargó en el SIP y después se realizó el ensayo de rendimiento automatizado. Para el análisis de partículas pequeñas, los valores de CV se determinaron como sigue: FSC: <5%; SSC: <7.5%; Láser azul/rojo: <3%; Láser violeta: <3.5%. Cuando el ensayo de rendimiento no alcanzaba estas especificaciones, se procedió a los procedimientos de limpieza y/o descontaminación hasta que se lograron los ajustes de control de calidad.
6. Ajustes de citometría de flujo acústica Attune
Los sucesos se adquirieron por dispersión frontal y BL1 (515 nm - 545 nm) usando el Attune con voltajes y umbral establecidos de la siguiente manera: Voltaje de dispersión frontal: 3050; Umbral de dispersión frontal: 3x100 AND; Voltaje de dispersión lateral: 2950; Umbral de dispersión lateral: Ignorar; Voltaje de BL1: 1500; Umbral de BL1: 1x100 AND.
Antes de registrar los datos en Attune, se permitió dispensar no menos de 8 pl de muestra. Esto permitió que las fluctuaciones en la fluídica se estabilizaran y aseguraran un enfoque eficiente de la corriente de muestra antes de recoger los datos. En la parte alícuota teñida, se observó la densidad (sucesos/pl) de los sucesos.
7. Preparación de la suspensión bacteriana de ensayo
Se dividieron en partes alícuotas nueve ml de MHB en doce tubos Falcon de 50 ml. Cada tubo se marcó con la concentración de ensayo final requerida de antibiótico. Por ejemplo: 0, 0.25, 0.5, 1,2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 y 256. Los tubos se transfirieron a una incubadora a 35°C para precalentarlos.
Se transfirió un 1 ml de la suspensión bacteriana de una noche a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml y se centrifugó a 7800xg durante aproximadamente 5 minutos. El líquido sobrenadante se desechó, y el sedimento se resuspendió en 1 ml de HBSS filtrado por 0.1 pm. Esta etapa se repitió opcionalmente.
Se dispensaron aproximadamente 900 pl de HBSS en tres tubos de 1.5 ml - dos tubos transparentes y un tubo ámbar. Se inocularon aproximadamente 100 pl de la suspensión bacteriana en el primer tubo (transparente) y se diluyeron en serie hasta alcanzar 1:1000 en el tercer tubo (ámbar). Se añadió aproximadamente 1 pl de SYTO 9 (concentración final 5 pM) al tercer tubo. El colorante se incubó, protegido de la luz, durante al menos 5 minutos (tipos de muestras individuales opcionalmente requerían incubaciones más largas) y después se leyó el control teñido en el instrumento del citómetro de flujo acústico Attune
La densidad de sucesos (sucesos/pl) de las partes alícuotas de control teñidas se usó para calcular el volumen de inóculo requerido para producir 5.5 x 105 bacterias ml-1 en 10 ml de MHB. Por ejemplo, (400 sucesos/pl) / (10 ml x 550 000) = 7.3 pl, redondeado hasta los 10 pl más cercanos.
El volumen requerido de suspensión bacteriana se añadió del cultivo de una noche a cada tubo de 50 ml con 9 ml de MHB precalentado. Opcionalmente se incuba con agitación y protegido de la luz, a 100 RPM a 35°C durante 60 minutos.
8. Preparación de antibióticos
Se usó MHB (filtrado 0.1 pm) para diluir los antibióticos en esta preparación. Se retiró aproximadamente una parte alícuota de antibiótico del congelador a -20°C y se equilibró a temperatura ambiente por intercambio de calor ambiente, y se diluyó para alcanzar un intervalo de concentraciones de solución madre de trabajo que eran diez veces las concentraciones de ensayo deseadas. Como en el ejemplo anterior, las concentraciones de trabajo (antes de añadir a tubos Falcon de 50 ml) eran las siguientes: 0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280 y 2560.
Alternativamente, se prepararon soluciones madre grandes de concentraciones de trabajo de antibiótico, se dividieron en partes alícuotas y se almacenaron a -20°C antes de su uso. Se aseguró que los antibióticos no estuvieran expuestos a más de un suceso de congelación-descongelación.
9. Exposición de suspensiones bacterianas a antibióticos
Una vez que se completó la incubación de 60 minutos de la suspensión bacteriana, se añadió aproximadamente 1 ml de 10x soluciones madre de antibióticos a tubos que contenían suspensiones bacterianas para alcanzar las concentraciones de ensayo finales deseadas (1 ml de antibiótico y volumen total de 10 ml). Los tubos de 50 ml se devolvieron a la incubadora y se incubaron, mediante agitación a 100 RPM a 35°C, durante 3 horas más.
10. Lavado de las células expuestas
Después de 3 horas, se recogió aproximadamente 1 ml de suspensión de cada tubo y se transfirió a un tubo de microcentrífuga transparente de 1.5 ml (marcado con la concentración de antibiótico correspondiente), después se centrifugó a 7800xg durante 5 minutos. El líquido sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 1 ml de HBSS filtrado por 0.1 gm. Esta etapa de lavado se repitió opcionalmente.
11. Preparación de colorante
El vial de SYTO 9 se retiró del almacenamiento refrigerado y se envolvió inmediatamente en papel de aluminio para protegerlo de la luz. Usando la microcentrífuga, cualquier colorante que se adhiriera al tapón se hizo descender con un centrifugado de 30 segundos a plena potencia, después se dejó equilibrar a temperatura ambiente antes de su uso - esto se puede confirmar visualmente por disolución de cristal de DMSO de la solución madre de colorante a la forma líquida. Se confirmó que las roscas de los tubos estaban limpias de colorante antes de abrir el vial - la centrifugación previa se repitió opcionalmente múltiples veces para lograr esto.
12. Configuración de Attune Mkl (citómetro de flujo acústico)
Usando el ordenador conectado al Attune, se crearon nuevas muestras listas para la recogida de datos. Se ajustaron los siguientes parámetros: Sensibilidad: Alta sensibilidad; Caudal: 25 gl/minuto; Volumen de adquisición: 125 gl; Sucesos recogidos: no menos de 20000 de todas las selecciones de poblaciones, Tiempo: 1 minuto.
En este momento, los ajustes del instrumento se comprobaron doblemente para asegurar que todos los voltajes y umbrales eran correctos en todas las muestras nuevas creadas en su espacio de trabajo.
13. Tinción de células
Se dispensaron aproximadamente 899 gl de HBSS en un tubo ámbar de 1.5 ml por muestra. Se añadieron aproximadamente 100 gl de suspensión por tubo para conseguir una dilución de 1 en 10. Se añadió aproximadamente 1 gl de SYTO 9 a cada tubo y el tubo se agitó con vórtice durante no más de 2 segundos (el exceso de agitación con vórtice puede conducir a agrupamiento bacteriano y/o unión a las paredes del tubo).
Se dejaron al menos 5 minutos para asegurar que todas las muestras bacterianas se equilibraran completamente con colorante libre. Para los nuevos tipos de muestras, se investigó un intervalo de condiciones de tinción para asegurar una tinción óptima.
Las muestras se tiñeron opcionalmente de manera secuencial de modo que ninguna muestra individual se dejó incubar con colorante más tiempo que otras debido al tiempo empleado en adquirir partes alícuotas previas en el citómetro de flujo acústico.
14. Muestras de control
Aproximadamente 1 ml de HBSS filtrado se dividió en partes alícuotas en un tubo ámbar. Se tiñó en las mismas condiciones que las muestras bacterianas. Esto estableció la fluorescencia de fondo de cualquier componente dentro del HBSS y sirvió como control negativo.
Aproximadamente 899 gl de HBSS filtrado se dividieron en partes alícuotas en un tubo ámbar. Se añadieron aproximadamente 100 gl de la muestra bacteriana lavada, no expuesta y se agitaron con vórtice para mezclar. Esta muestra no teñida controla la actividad específica del colorante. Para garantizar la calidad diaria, era ideal la ausencia de una población bacteriana visible en esta muestra. Para el trabajo de validación, se retiró el umbral de BL1 antes de registrar la muestra.
15. Adquisición de datos
Las muestras se pusieron en el SIP y se adquirieron, por triplicado técnico, según los parámetros indicados anteriormente. El SIP no necesitaba ser bajado entre triplicados técnicos (debido a que S.aureuses autofluorescente por naturaleza, los SIP se bajaron entre los triplicados no teñidos a medida que se cambió el perfil de autofluorescencia entre los triplicados debido a razones desconocidas), siempre que se dejara que cada muestra avanzara hasta que hubieran pasado 8 gl a través del instrumento antes del registro. Entre las muestras, se usó una toallita absorbente para absorber cualquier líquido de la punta de la aguja, sin aplicar ninguna presión directamente a la propia aguja.
16. Limpieza del citómetro de flujo acústico Attune
Con cada ejecución del experimento, se realizaron los siguientes procedimientos de limpieza para asegurar que no quedaban organismos vivos en el instrumento, y no comenzaba a depositarse materia en partículas. Si esto no se hacía, la calidad de los datos producidos podría haber estado en riesgo de degradarse con el tiempo.
Se creó una nueva muestra titulada "Limpieza", y se establecieron los siguientes parámetros: Sensibilidad: Estándar; Caudal: 1000 pl/minuto; Volumen de adquisición: 4000 pl; Tiempo: 4 minutos.
Las siguientes soluciones se pasaron a través del citómetro de flujo acústico, en orden: 5 ml de blanqueador filtrado al 10%; 5 ml de solución de lavado Attune; 5 ml de MilliQ. Opcionalmente, las muestras se registraron sin la etapa de ejecución inicial, ya que no se requerían los datos.
17. Procedimientos de descontaminación para las muestras de citómetro de flujo acústico Attune
Si se observaban partículas de residuos en muestras por lo demás limpias, se encontró que era útil usar opcionalmente Surfynol para limpiar el sistema fluídico. Para este efecto, aproximadamente 10 pl eran para 1 ml de fluido de enfoque Attune y se hizo pasar a través del sistema con los siguientes ajustes: Sensibilidad: Estándar; Caudal: máx.; Volumen de adquisición: 850 pl; Tiempo: 1 minuto.
Una vez que esto se completó, se llevaron a cabo los procedimientos de lavado indicados anteriormente. Opcionalmente, esta etapa se repitió múltiples veces.
Si esto no resolvía ningún problema de contaminación, se prosiguió realizando la función de descontaminación del sistema en el paquete de software Attune. Las instrucciones aparecían en la pantalla, y se seguían explícitamente. Durante este procedimiento, se cambió el filtro de fluido de enfoque posterior. El citómetro Attune se movió a una posición en la que se accedía fácilmente a la ventana en el lado izquierdo. Se tuvo cuidado particular de que no cayera o se golpeara el instrumento contra otra superficie para evitar alterar las alineaciones del láser. Una vez que han terminado las etapas de lavado, se instaló un nuevo filtro entre los dos extremos de las líneas fluídicas.
Ejemplo 13:
El método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC se puede aplicar a microorganismos adicionales (parte II)
Este ejemplo demuestra además que el método de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica de la presente invención también puede aplicarse para determinar rápidamente la sensibilidad de bacteriasStaphylococcus aureustanto a antibióticos cefalosporínicos, p. ej., como los representados por cefoxitina, como a antibióticos penicilinas, p. ej., como los representados por oxacilina.
La resistencia a la meticilina enStaphylococcus aureusestá asociada con malos resultados del paciente, especialmente en países en desarrollo y poblaciones indígenas. Los métodos de detección actuales se basan en métodos moleculares y dan la resistencia potencial, o están limitados por ensayos basados en crecimiento que miden el fenotipo de resistencia a antimicrobianos a un nivel de población general.
Los métodos fenotípicos empleados de forma rutinaria de ensayo de sensibilidad a antimicrobianos en S.aureusrequiere al menos 48 horas desde la recepción de la muestra. Este ejemplo demuestra un método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de esta invención que da resultados a nivel de células individuales, de significación clínica, en el plazo de aproximadamente 4 horas desde el cultivo primario.
Usando una colección representativa de aislados de S.aureusresistentes a meticilina y sensibles a meticilina de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y de la Colección Australiana de Sitios Estériles (WACC) p. ej., como se indica en el Ejemplo 12, este ejemplo emplea el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención para determinar la resistencia a carbapenems para cribado de oxacilina (OXA) y cefoxitina (FOX) contra S.aureus.Usando un citómetro de flujo y SYTO 9 (un colorante de ácido nucleico verde, fluorescente), con microscopía de fluorescencia confirmatoria, se analizaron poblaciones de células individuales y se compararon con controles no expuestos, para dar un resultado de sensible/no sensible (S/NS), así como de la concentración mínima inhibidora (MIC) completa como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Resultados de ejemplos para el aislado de S.aureussensible a meticilina (MSSA) de control ATCC 25912 y aislado de S.aureusresistente a meticilina (SARM) clínica se muestran en las Figuras 13 y 14.
La microscopía mostró resultados consistentes a lo largo de la exposición a ambos antimicrobianos. A medida que aumentaba la concentración de fármaco, disminuía el número de células global, las células cambiaban de agrupaciones a células planctónicas individuales, y se observó un aumento en la fluorescencia. Se usaron datos de citometría de flujo para desarrollar una línea de análisis hecha a medida que compara las densidades celulares en muestras expuestas a antimicrobianos, con una muestra de control no expuesta emparejada. En toda una colección de aislados representativos (n=10), se observó concordancia perfecta para el resultado de S/NS, con todos los resultados de MIC<f a s t>concordantes dentro de la resolución del ensayo de MIC<b m d>(microdilución del caldo) (datos no mostrados).
Los resultados se dieron en el plazo de 4 horas desde el cultivo primario. Los resultados demuestran una fuerte concordancia entre el nuevo método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de esta invención y los métodos de ensayo convencionales existentes (p. ej. microdilución en caldo) en todo el panel de 10 aislados, significativamente, dando como resultado un ahorro de tiempo de aproximadamente 24-52 horas.
Ejemplo 14:
Ensayo rápido de sensibilidad a antimicrobianos deBurkholderia thailandensisy la función de los sistemas de bombeo de eflujo en la resistencia a antimicrobianos
Este ejemplo demuestra la aplicación del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención a microorganismos adicionales, incluyendo determinar rápidamente la sensibilidad de bacteriasBurkholderiaa agentes antimicrobianos p. ej., antibiótico meropenem. Este ejemplo demuestra además la aplicabilidad del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención como una herramienta para examinar la función del sistema de bomba de eflujo enBurkholderiaen la resistencia a antimicrobianos.
Se ha mostrado queBurkholderia thailandensises intrínsecamente resistente a muchos antimicrobianos, incluyendo aminoglucósidos y macrólidos, y se cree que las bombas de eflujo desempeñan un papel crítico en la resistencia. Una bacteria ambiental estrechamente relacionada, B.pseudomallei,es el agente etiológico de la melioidosis y utiliza sistemas de eflujo idénticos. En el pasado, B.thailandensisse usó para estudiar el efecto de las bombas de eflujo de resistencia-nodulación-división (RND) en la resistencia a antimicrobianos en especiesBurkholderia.
Antes de la presente invención, ha habido una falta de ensayos rápidos, cuantitativos y funcionales para la actividad de eflujo y un número limitado de mutantes de bomba de eflujo en B.thailandensis.Este ejemplo se expone para demostrar la utilidad del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención como una técnica y herramienta novedosas para examinar sistemas de eflujo enBurkholderia.
Para este efecto, la bomba de eflujo de RND se eliminó por intercambio alélico para generar un mutante deB. thailandensisARND de B.thailandensis.La mutagénesis se realizó usando un vector suicida y contraselección de sacarosa. El intervalo lineal de detección para citometría de flujo se determinó usando una serie de diluciones en cultivos en caldo de una noche de B.thailandensisteñidos con el colorante fluorescente intercalante de ADN, STYO9, después de lo cual se realizaron curvas de crecimiento como se muestra en la Figura 16 panel B. El protocolo de FAST como se describe en los ejemplos anteriores se adaptó a la cinética de crecimiento de B.thailandensis.Los resultados se muestran en la Figura 15.
Como se muestra en la Figura 15, la construcción del mutante cumplía varios objetivos de puntos de avance. El intervalo lineal de detección para la citometría de flujo era de 9 x 103 a 4.4 x 106 células/ml (R2 = 0.9924). El tiempo de duplicación para B.thailandensis seestimó en 43.8 minutos por citometría de flujo y 46.2 minutos usando recuentos viables (p < 0.0004). La concentración mínima inhibidora determinada por FAST (MIC<f a s t>) para meropenem era concordante con el método de microdilución en caldo convencional (MIC<b m d>).
Por consiguiente, en este ejemplo se construyó un mutante del sistema de eflujo (RND) en B.thailandensis,como modelo sustituto para B.pseudomallei.Ambas especies bacterianas son intrínsecamente resistentes a muchos antimicrobianos tales como aminoglucósidos y macrólidos. MIC<f a s t>para meropenem se corresponde a la MIC<b m d>convencional. Por lo tanto, el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de esta invención es aplicable enB.thailandensis,lo que implica su utilidad adicional para el ensayo de sensibilidad a antimicrobianos deB. pseudomallei.La adaptación del ensayo FAST de meropenemBurkholderiaspp. muestra la prueba de concepto de la actividad de la bomba de eflujo enB. pseudomallei.La caracterización del fenotipo de sensibilidad a antimicrobianos del mutante usando el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de esta invención ofrece comprensión sobre la contribución del eflujo a la resistencia a antimicrobianos, y demuestra que la eliminación del sistema de eflujo de RND puede dar lugar a poblaciones bacterianas sensibles a meropenem.
Ejemplo 15:
Ensayo de sensibilidad a antimicrobianos asistido por citometría de flujo de piperacilina/tazobactam paraKlebsiella pneumoniae
Este ejemplo demuestra la aplicación del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención para determinar rápidamente la sensibilidad de bacteriasKlebsiella pneumoniaea agentes antimicrobianos tales como piperacilina/tazobactam.
La piperacilina/tazobactam a menudo se usan de forma rutinaria para entornos de cuidados intensivos. Sin embargo, antes de la presente invención, se ha administrado quimioterapia antimicrobiana empírica a pacientes antes de que se hayan identificado el organismo causante y los antimicrobianos que pueden tratarlo mejor. El tratamiento definitivo que utiliza métodos convencionales conocidos se basa en los resultados de sensibilidad obtenidos después de que ha comenzado la quimioterapia antimicrobiana. Por lo tanto, los resultados del paciente dependen del tiempo de respuesta y la precisión del ensayo de sensibilidad a antimicrobianos (AST). Los métodos automatizados convencionales actuales de AST pueden reducir el tiempo para el resultado, sin embargo, estos métodos generalmente requieren el recrecimiento de las bacterias aisladas y los resultados pueden tardar hasta 20 horas o incluso hasta 72 horas. Además, la sensibilidad de estos métodos automatizados convencionales actualmente en uso es variable. En consecuencia, ha habido una creciente dependencia del uso de antibióticos de amplio espectro, incluyendo los carbapenems de última línea p. ej. piperacilina y tazobactam. El uso excesivo de dichos fármacos favoreció la aparición de organismos resistentes a antimicrobianos es decir, dicho uso excesivo se convirtió en un contribuyente significativo a la resistencia a los antimicrobianos. Se identificó la piperacilina/tazobactam (TZP) como un antimicrobiano potencial que excluye los carbapenems.
Este ejemplo demuestra el uso del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de esta invención como un ensayo fenotípico rápido FAST para TZP contraKlebsiella pneumoniaee implica el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de esta invención para proporcionar opciones terapéuticas adicionales con el fin de reducir el uso de carbapenems.
Para este fin, se seleccionó una cohorte de aisladosKlebsiella pneumoniaecon fenotipos de resistencia variables (n = 10). Los aislados se cultivaron durante la noche y se contaron usando citometría de flujo. Los cultivos de una noche se contaron usando un citómetro de flujo Attune™ (Thermo Fisher Scientific) como se ha descrito anteriormente. Las densidades celulares se ajustaron a 106 células/ml en caldo Mueller-Hinton, y se cultivaron en el caldo Mueller Hinton durante aproximadamente 30 min o hasta que se duplicó la densidad celular. Una vez que se duplicaron las densidades celulares, los cultivos se dividieron y se expusieron a concentraciones variables de piperacilina (0 mg/l a 256 mg/l) durante 30 minutos. El tazobactam estaba presente en cada parte alícuota a una concentración fija de 4 mg/l, incluyendo el control no expuesto. Los inóculos se lavaron, se resuspendieron, después se tiñeron con SYTO 9 y se analizaron por citometría de flujo. Las determinaciones de MIC se hicieron basándose en la concentración de antibiótico que reducía la concentración de células en la selección de poblaciones no expuesta en 40%. Las MIC se determinaron por el método FAST de la invención y por el método de microdilución en caldo convencional (BMD), realizado en paralelo. El flujo de trabajo experimental se muestra en la Figura 16 y los resultados se muestran en las Figuras 17 y 18.
Dos aislados no se duplicaron en el tiempo asignado y se excluyeron. Un aislado adicional se contaminó y se invalidó. Los resultados demuestran que, en los 7 aislados restantes donde se cumplieron los criterios de QC, había una excelente correlación entre<b>M<d>y FAST (Spearman R2= 0.98907 n=7), con todas los resultados de MIC<f a s t>que están dentro de una resolución de dilución ± 1 de BMD.
Los resultados obtenidos demuestran que la sensibilidad a TZP puede determinarse usando el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención, con resultados cuantitativos disponibles en menos de 3 horas tal como en el plazo 1 hora y/o en el plazo de 2 horas del cultivo primario. Por consiguiente, basándose en estos datos, el método FAST de la invención ha demostrado tener aplicación en agilizar la toma de decisiones clínicas, limitar el uso de carbapenems y, a su vez, reducir la selección de la resistencia a antimicrobianos.
Los resultados proporcionados en el presente documento también condujeron a los autores de la invención a considerar los resultados como una evidencia temprana de aplicabilidad directa del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención a muestras humanas directamente, tal como aplicabilidad directa a hemocultivo. Esto es porque, los autores de la invención razonaron basándose en estos resultados de que las bacterias Gram negativasKlebsiella pneumoniaese pueden separar del frasco de hemocultivo primario en el plazo de 1 hora desde el ensayo de sensibilidad al agente antimicrobiano usando el método FAST de la invención una vez que se obtiene el resultado positivo.
Ejemplo 16:
Ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo directamente de hemocultivos
Este ejemplo demuestra la aplicación exitosa del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención para determinar rápidamente la sensibilidad de microorganismos no identificados, p. ej., bacterias, a agentes antimicrobianos directamente de hemocultivos positivos tan rápidamente como en el plazo de 3 horas.
La resistencia a antimicrobianos se ha descrito como el experimento darwiniano más grande. Aunque los antimicrobianos han añadido 20 años a la vida media humana, su uso ha creado presiones selectivas favoreciendo la evolución de microbios resistentes. Las infecciones graves, tales como sepsis, requieren la administración rápida de los antimicrobianos correctos. Sin embargo, hasta la fecha, la selección del agente antimicrobiano correcto se ha basado en la presentación clínica y se ha respaldado por ensayos de sensibilidad a antimicrobianos convencionales que no producen resultados lo suficientemente rápidos como para tratar la sepsis. Además, los resultados de los ensayos de sensibilidad convencionales no están disponibles en el marco clínico agudo y las decisiones se toman basándose en la sospecha clínica y no basándose en la determinación de la sensibilidad real. Además, como se ha indicado anteriormente, el uso de antimicrobianos inapropiados conduce a la mortalidad de pacientes y la resistencia a los antimicrobianos.
Este ejemplo se propone investigar la utilidad del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención como un ensayo clínico y herramienta que puede informar de la elección del antimicrobiano a usar en las primeras horas de la presentación de sepsis, p. ej., aplicando el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC directamente a hemocultivos. El procedimiento y los resultados se muestran en las Figuras 19 a 21.
Los ensayos FAST de hemocultivo usando el método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención descrito anteriormente, realizados en los primeros cinco aislados dieron como resultado una determinación de sensibilidad que coincidía con el resultado de laboratorio de referencia. Tres de los fallos se produjeron en aislados que no lograron duplicar la concentración bacteriana durante las incubaciones. Se implementaron medidas de control de calidad para asegurar el crecimiento bacteriano activo (como se indica por una duplicación en la densidad celular) después de lo cual, 10 muestras de hemocultivo clínico tenían una concordancia de 100% con los resultados de laboratorio de referencia.
Estos resultados demuestran que la determinación de los datos de sensibilidad más temprano en la sepsis puede mejorar los resultados del paciente y también servir para mitigar la aparición de organismos multirresistentes. El uso del método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC de la invención desarrollado por los autores de la presente invención como se describe en el presente documento, es una herramienta adecuada para determinar la elección de antimicrobiano más apropiada para usar (contra bacterias incluso no identificadas), en un tiempo muy corto de 3 horas, directamente de un hemocultivo positivo.
Los hemocultivos rutinarios para infecciones graves representan el comienzo de la línea de ensayos. En este ejemplo, 10 aislados (30 ensayos AST), evaluados por comparación en paralelo con un servicio de patología local, proporcionaron una concordancia perfecta, con un ahorro de tiempo de 22-46 horas.
Ejemplo 17:
Desarrollo de un sistema rápido de alto rendimiento que emplea el ensayo de sensibilidad asistidos por citometría de flujo acústica (AFC) para uno o más agentes antimicrobianos en una o más muestras biológicas (Método I)
Este ejemplo describe el desarrollo de un método rápido de alto rendimiento basado en el nuevo método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC para ensayar cualitativa y/o cuantitativamente la sensibilidad de microorganismo(s) (p. ej., una o más bacterias diferentes) en una o más muestras biológicas a antimicrobiano(s). Este ejemplo demuestra la aplicación del nuevo método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC según cualquier aspecto amplio descrito en el presente documento simultáneamente y de una manera de alto rendimiento a múltiples muestras biológicas/cultivos microbianos de células microbianas en división activa y/o a múltiples agentes antimicrobianos. Este método rápido de alto rendimiento se usó para predecir rápidamente cualitativamente la sensibilidad de uno o una pluralidad de microorganismos a uno o una pluralidad de agentes antimicrobianos en una hora, y medir cuantitativamente la sensibilidad mediante MIC FAST en el plazo de 3 horas de la manipulación de la muestra. Como se ilustra en el presente documento, el sistema de alto rendimiento se llevó a cabo en placas o bandejas de 96 pocillos. Sin embargo, se entenderá que el método puede modificarse para usar cualquier formato de alto rendimiento no limitado a placas o bandejas de 96 pocillos. Como se ilustra, el método de alto rendimiento permitía ensayar en una única placa/bandeja de 96 pocillos de ensayo la sensibilidad de una muestra microbiana frente a 13 agentes antimicrobianos diferentes, o alternativamente ensayar 13 muestras microbianas frente a un agente antimicrobiano. Se entenderá fácilmente que son posibles diferentes permutaciones de esta combinación.
La metodología ya descrita en los ejemplos anteriores junto con los ejemplos que siguen ilustran el desarrollo de un método nuevo y mejorado mediante el cual la sensibilidad a un agente antimicrobiano tal como un antibiótico se puede ensayar rápidamente, rápidamente y con alto rendimiento para múltiples muestras biológicas de microorganismos unicelulares o multicelulares (tales como bacterias). Este nuevo y mejorado método de alto rendimiento se ilustra brevemente en la Figura 22.
El método se consiguió como sigue. Una vez que se ha determinado que una muestra biológica tal como una muestra de hemocultivo obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene infección por un microorganismo (p. ej., bacterias), mediante el sistema en el que se incubó, ha dado un resultado positivo al cultivo, se retiraron 500 microlitros<y se pusieron en un tubo. Se determinó un resultado positivo del cultivo mediante mediciones de producción de CO>2 y/o usando reactivos fluorescentes para indicar la presencia de un número suficiente p. ej. aproximadamente 1.0 x 106 a aproximadamente 9.0 x 109, de células microbianas en división activa presentes en la muestra microbiana.
Se añadieron 500 microlitros de una suspensión al 10% (en solución salina al 0.85%) de un detergente no iónico (tal como T riton-X100) a los 500 microlitros de la muestra de hemocultivo positivo y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos para separar las células microbianas de las células sanguíneas. Alternativamente, se usó filtración para separar las células sanguíneas de las células microbianas.
Después de que hubieran transcurrido los 5 minutos, la muestra se centrifugó a 4000 x g durante 5 minutos. El líquido sobrenadante de la suspensión se retiró después, con el material restante resuspendido en 1 ml de solución salina equilibrada de Hank. Esta muestra después se centrifugó a 4000 x g durante 5 minutos. El líquido sobrenadante de la suspensión se retiró después, con el material restante resuspendido en 1 ml de solución salina equilibrada de Hank. Se realizó una dilución 1:10 en solución salina equilibrada de Hank en un total de 1 ml de solución salina equilibrada de Hank que contenía una concentración de trabajo de SYTO 95 pM (se añadió 1 microlitro de SYTO 95 mM a 899 microlitros de solución salina equilibrada de Hank y 100 microlitros de muestra). Alternativamente, estas etapas se reemplazaron por una dilución 1:10 de la suspensión bacteriana en solución salina equilibrada de Hank precalentada (37 °C).
Esta suspensión se analizó a continuación usando el citómetro de flujo Attune NxT, con los siguientes ajustes: Caudal 25 microlitros/minuto, Tiempo de registro 1 minuto. Basándose en la selección de sucesos de los datos de citometría de flujo que tenían una intensidad de señal de FSC mayor de 103 unidades arbitrarias de fluorescencia, intensidad SSC mayor de 103 unidades arbitrarias de fluorescencia y fluorescencia de excitación a 488 nm, emisión a 515-545 nm mayor de 102 unidades arbitrarias de fluorescencia (tinción positiva SYTO 9), se observó un recuento del número de bacterias/ml de hemocultivo positivo. La suspensión de hemocultivo, previamente sometida a tratamiento con detergente, se centrifugó a 4000 x g durante 5 minutos. El líquido sobrenadante se desechó. La materia que había descendido que quedaba en el tubo se resuspendió en caldo Mueller-Hinton precalentado a 37°C.
Basándose en los números de microorganismos determinados empíricamente por mililitro de suspensión, se añadió una parte alícuota de la suspensión de microorganismos del frasco de hemocultivo a un volumen adicional de caldo Mueller-Hinton (precalentado a 37°C) de manera que la concentración final de microorganismos era de 1.0 x 106 microorganismos por mililitro y el volumen final era de 10 mililitros. En un ejemplo, donde la densidad de microorganismos en la suspensión se determinó por citometría de flujo que era 4.5 x 107 células de microorganismos por mililitro, después se añadieron 222.22 microlitros de suspensión de hemocultivo a 9777.78 microlitros de caldo de Mueller-Hinton precalentado.
Alternativamente, las suspensiones microbianas se normalizaron mediante cualquier técnica o instrumento capaz de normalizar suspensiones microbianas (p. ej., usando un nefelómetro o un espectrofotómetro que mide a la OD a 600 nm) de manera que la densidad inicial en el momento de la exposición a un agente antimicrobiano esté en el intervalo de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas por mililitro, preferiblemente 5.0 x 104 a 5.0 x 107 células microbianas por mililitro, y lo más preferiblemente a una concentración de 5.0 x 105 células microbianas por mililitro.
Esta suspensión se incubó luego a 37°C durante un período de tiempo que es uno de: 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos o 180 minutos. El tiempo exacto de incubación se determinó, en cada incremento de 30 minutos, realizando las siguientes etapas: (a) retirada de una parte alícuota de 100 microlitros de la suspensión ajustada de microorganismos en caldo de Mueller-Hinton; (b) adición de 900 microlitros de solución salina equilibrada de Hank a los 100 microlitros de suspensión; (c) centrifugación de la suspensión diluida a 4000 x g durante 5 minutos; (d) retirada del líquido sobrenadante de la suspensión centrifugada; (e) adición de un total de 1 ml de solución salina equilibrada de Hank que contiene una concentración de trabajo de SYTO 95 pM (se añadió 1 microlitros de SYTO 9 5 mM a 899 microlitros de solución salina equilibrada de Hank y 100 microlitros de muestra); (f) análisis de esta suspensión teñida con SYTO 9 usando el citómetro de flujo Attune NxT, con los siguientes ajustes: Caudal 25 microlitros/minuto, Tiempo de registro 1 minuto. Basándose en la selección de sucesos de los datos de citometría de flujo que tenían una intensidad de señal de FSC mayor de 103 unidades arbitrarias de fluorescencia, intensidad de SSC mayor de 103 unidades arbitrarias de fluorescencia y fluorescencia de excitación a 488 nm-emisión a 515-545 nm mayor de 102 unidades arbitrarias de fluorescencia (tinción positiva de SYTO 9), un recuento del número de bacterias/ml de suspensión de crecimiento bacteriano; y (g) si este recuento alcanzaba 2.0 x 106 bacterias por mililitro, se terminaba la incubación y el ensayo avanzaba.
Alternativamente, si la muestra biológica recogida del sujeto se marcaba con Flag como positiva al usar la máquina de hemocultivo y se mantenía a 37°C, las etapas de preincubación (a) a (f) podrían omitirse. Cuando se omitieron las etapas de preincubación (a) a (f), la suspensión se normalizó (usando recuentos de citometría de flujo, un nefelómetro o un espectrofotómetro que mide la OD600) a una concentración celular aproximadamente en el intervalo de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas por mililitro, preferiblemente de aproximadamente 5.0 x 104 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas por mililitro, y lo más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 5.0 x 105 células microbianas por mililitro.
Sin embargo, cuando no se omitieron las etapas de preincubación (a) a (f), se preparó una suspensión de trabajo de microorganismos a partir de esta suspensión de incubación bacteriana. La determinación empírica del número de microorganismos por microlitro se usó para determinar un volumen de suspensión para añadir a un volumen de caldo Mueller-Hinton (precalentado a 37°C) de manera que la concentración final de células de microorganismos fuera de aproximadamente 5.0 x 105 microorganismo por mililitro (el intervalo preferido puede ser de aproximadamente 5.0 x 103 a 5.0 x 107 células microbianas por mililitro). Por ejemplo, si el recuento de la suspensión determinó que había 2.0 x 106 microorganismos por microlitro, entonces se añadían 1333.33 microlitros de suspensión de crecimiento bacteriano a 28666.67 microlitros de caldo Mueller Hinton (precalentado a 37 °C).
Se añadió un volumen de esta suspensión de crecimiento microbiano diluida a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de formato estándar que contenía un agente antimicrobiano tal como un patrón de antibiótico para lograr una concentración final igual a las suspensiones de trabajo apropiadas de los agentes antimicrobianos tales como los antibióticos ensayados. Se entenderá que el formato de placa y el número de pocillos o muestras que pueden ensayarse no se limitan al formato de placa de 96 pocillos convencional. El intervalo de concentraciones para cada agente antimicrobiano ensayado era de 0.25 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l, 32.0 mg/l, 64.0 mg/l, 128.0 mg/l, 256.0 mg/l.
En un ejemplo, se ensayaron cuatro agentes antimicrobianos diferentes tales como cuatro antibióticos diferentes (ceftixalona (CRO), gentamicina (GEN), meropenem (MEM) y piperacilina-tazobactam (PZT)) a las concentraciones anteriores en una única placa plana de 96 pocilios, con 8 pocilios que no contenían agente antimicrobiano como control del crecimiento no expuesto, como se ha indicado en la Figura 22. En otro ejemplo, se ensayaron ocho agentes antimicrobianos diferentes tales como ocho antibióticos diferentes a las concentraciones anteriores en una sola placa, con 8 pocillos que no contenían agente antimicrobiano como control del crecimiento no expuesto. En otro ejemplo adicional, se ensayaron 13 agentes antimicrobianos diferentes (tales como 13 antibióticos diferentes) en una única placa de 96 pocillos, omitiendo las diluciones antimicrobianas de 64.0 mg/l, 128.0 mg/l y 256.0 mg/l, con uno o tres pocillos que no contenían agente antimicrobiano como controles de crecimiento no expuestos.
Después de la inoculación con la suspensión de crecimiento microbiano ajustada, la placa de 96 pocillos se devolvió a una incubadora durante 30 minutos o 60 minutos o 90 minutos o 120 minutos. Para los microorganismos clasificados como bacterias Gram negativas, fue de 30 minutos. Para microorganismos clasificados como bacterias Gram positivas, el período de tiempo se hizo coincidir con el período de tiempo de la preincubación. Como ejemplo, si el microorganismo tardó 90 minutos en crecer de 1.0 x 106 a 2.0 x 106 células microbianas por mililitro, la incubación en esta etapa fue de 90 minutos. En ausencia de un conocimiento previo de la identidad del organismo, la duración de la etapa de preincubación se hizo coincidir con la etapa de exposición a antibióticos, descrita en el presente documento. Después de que hubiera transcurrido el tiempo de exposición a antibióticos, la placa de 96 pocillos se transfirió a una centrífuga para centrifugación a 2300 x g durante 5 minutos.
El líquido sobrenadante de los pocillos se aspiró a continuación, y se añadieron 270 microlitros de solución salina al 0.85%. La placa de 96 pocillos se transfirió a una centrífuga para centrifugación a 2300 x g durante 5 minutos. El líquido sobrenadante de los pocillos se aspiró de nuevo y se añadieron 270 microlitros de solución salina al 0.85%. Para cada pocillo de la placa, se añadieron 40 microlitros de la suspensión de células microbianas expuestas a antibióticos a 160 microlitros de solución salina equilibrada de Hank teñida con SYTO 9, para una concentración de trabajo final de SYTO 95 pM. Alternativamente, estas etapas se omitieron y se reemplazaron por una adición de 4 volúmenes de solución salina equilibrada de Hank teñida con SYTO 9 para dar una concentración de trabajo final de SYTO 95 pM.
La placa se incubó en ausencia de luz, a temperatura ambiente, durante 5 minutos, antes de cargar la placa en el citómetro de flujo Attune NxT por medio de un inyector automático del citómetro de flujo Attune NxT. De cada pocillo de la placa, se analizó una muestra mediante el citómetro de flujo Attune NxT, mediante el inyector automático del citómetro de flujo Attune NxT con los siguientes ajustes: Caudal - 25 microlitros por minuto, Volumen de adquisición - 18 microlitros por pocillo, Espera antes del registro - 8 segundos, Enjuague entre pocillos - activo. Sin embargo, cuando el método de dilución reemplazaba la centrifugación de las placas, el ajuste anterior del inyector automático del citómetro de flujo Attune NxT se reemplazaba con los siguientes ajustes: Caudal - 100 microlitros por minuto, Volumen de adquisición - 60 microlitros por pocillo, Espera antes del registro - 8 segundos, Enjuague entre pocillos - activo. Los datos para cada pocillo de la placa de 96 pocillos se exportaron en formato de archivo FCS 3.1 del software de adquisición Attune NxT para análisis, y los datos de cada pocillo de la placa de 96 pocillos se importaron a FlowJo v10.4.2.
Sin embargo, se entenderá que sería aceptable cualquier otro software (tal como FCS Express, R (FlowCore y FlowViz)) capaz de realizar las siguientes etapas de análisis. Alternativamente, podría usarse cualquier paquete estadístico capaz de aceptar los datos de FCS (convertidos en archivos CSV), capaz de realizar el análisis de subconjuntos de variables enumerados en este documento (donde una selección de poblaciones se considera un subconjunto de datos con los parámetros apropiados). Ejemplos de esto son: R (BioConductor, FlowStats), Orange, código estadístico a medida escrito en cualquier lenguaje de programación apropiado (p. ej., Python, Ruby, Visual Basic, C, Ansi C, C++).
Para cada fichero de datos, se aplicaron las siguientes etapas de análisisin silicoA a H: (A) se añadió una selección de poblaciones de histograma, seleccionando todos los sucesos de unidades arbitrarias de fluorescencia en la fluorescencia de excitación a 488 nm, emisión 515 nm-545 nm mayores que 102. (B) En un gráfico de dispersión frontal - área y dispersión frontal - altura, todos los sucesos con una relación de altura a área por debajo de 1.5 se seleccionaron para asegurar que solo se analizan células individuales. (C) Se identificaron los archivos de datos correspondientes a las muestras de control no expuestas. Para ensayos en los que se analizaron múltiples muestras de control, se identificó el modo o número mediano de sucesos por microlitro (el que sea mayor). (D) En un gráfico de dispersión frontal-altura, y fluorescencia de excitación a 488 nm, emisión a 515 nm-545 nm, se aplicó el contorneado del vecino más cercano al umbral de 10%, y se seleccionó una región delimitada por el contorno más exterior que abarcaba todos los sucesos dentro de esta región. Esto se denominó selección de poblaciones de UCM. (E) Se determinó el número de sucesos registrados, se normalizó como sucesos por microlitro, y se identificó como que estaba dentro del límite de la selección de poblaciones de UCM para cada archivo de datos de muestras de la placa de 96 pocillos. Esto representaba un recuento de células microbianas por microlitro, con los parámetros ópticos y de fluorescencia medidos consistentes con microorganismos no afectados por la exposición al agente antimicrobiano. (F) Usando el software, se aplicó la selección de poblaciones de UCM a un gráfico de dispersión frontal-altura, y fluorescencia de excitación a 488 nm, emisión a 515 nm-545 nm a todos los archivos de datos del ensayo. Esta etapa identificaba el número de microbios por microlitro, en cada archivo de datos, consistente con microorganismos no afectados por la exposición al agente antimicrobiano. (G) Para cada archivo de datos a lo largo del ensayo, el número de sucesos en la selección de poblaciones de UCM por microlitro se dividió entre el número de sucesos en la selección de poblaciones de UCM por microlitro en la muestra de control no expuesta a partir de la cual se definió originalmente la selección de poblaciones de UCM. Este valor se expresó como un porcentaje para identificar el porcentaje/proporción de células de microorganismos en cada archivo de datos con parámetros ópticos y de fluorescencia consistentes con microorganismos no afectados por la exposición al agente antimicrobiano (véanse los resultados mostrados en la Figura 23). (H) Se compararon todos los archivos a lo largo del ensayo que habían recibido la misma exposición a antimicrobianos. La concentración mínima inhibidora (MIC) se definió como la concentración antimicrobiana más baja a la que el porcentaje de células microbianas restantes había caído por debajo de un umbral específico de agente antimicrobiano predeterminado.
Por consiguiente, como se ilustra en la Figura 23, siguiendo el método de AFC de alto rendimiento ilustrado, el número de células microbianas por microlitro que caen dentro de la región seleccionada por UCM para cada serie de diluciones antimicrobianas se puede representar gráficamente como un porcentaje de las encontradas en el control no expuesto. Por ejemplo, como se muestra en el panel A de la Figura 23, para un aislado microbiano que se ha mostrado previamente que es sensible a todos los antimicrobianos ensayados, la gráfica da como resultado una caída rápida en las células bacterianas a las concentraciones más bajas (diluciones) de los cuatro antibióticos ensayados (ceftixalona (CRO), gentamicina (GEN), meropenem (MEM) y piperacilina-tazobactam (PZT), con todos los agentes antimicrobianos cayendo al umbral de sensibilidad antes de alcanzar una concentración asociada con un fenotipo resistente. En contraste, como se muestra en el panel B de la Figura 23, para un aislado bacteriano multirresistente a fármacos, esta caída no ocurre hasta que la concentración de agente antimicrobiano está por encima de la concentración asociada con un fenotipo resistente.
Con respecto a la etapa (H) anterior, se tuvo en cuenta lo siguiente para definir la concentración mínima inhibidora (MIC) del agente antimicrobiano ensayado. (i) Para determinar la MIC del meropenem, el umbral específico del agente antimicrobiano predeterminado era de 30%, es decir, que es la concentración más baja de meropenem a la que hay 30% o menos sucesos dentro de la selección de poblaciones de UCM en comparación con la muestra de control no expuesta. (ii) Para determinar la MIC de gentamicina, el umbral específico del agente antimicrobiano predeterminado era de 60%, es decir, que es la concentración de gentamicina más baja a la que hay 60% o menos sucesos dentro de la selección de poblaciones de UCM en comparación con la muestra de control no expuesta. (iii) Para determinar la MIC de piperacilina-tazobactam, el umbral específico del agente antimicrobiano predeterminado era de 50%, es decir, que es la concentración de gentamicina más baja a la que hay 50% o menos sucesos dentro de la selección de poblaciones de UCM en comparación con la muestra de control no expuesta. (iv) Los umbrales predeterminados pueden obtenerse exponiendo 122 aislados (con un mínimo de 34 aislados resistentes) del microorganismo de interés, al fármaco de interés de la manera descrita anteriormente para generar un valor hipotético - por ejemplo, puede parecer que un nuevo antimicrobiano tiene un umbral de sensibilidad de 20% restante cuando se compara con el control no expuesto. Este umbral se ensaya entonces por comparación con los resultados generados, para los aislados de microorganismo expuestos al mismo fármaco, por un método de referencia tradicional tal como la microdilución en caldo. Si la correlación de la MIC es mayor que 0.90, por ejemplo con menos de 3% de "errores muy importantes" (siendo "errores muy importantes" un microorganismo con un fenotipo resistente a fármacos que se ha determinado como que tiene una MIC consistente con un fenotipo sensible a fármacos) se confirma el umbral y se establece un nuevo umbral. (v) En ausencia de umbrales estadísticamente validados obtenidos empíricamente, podrían usarse umbrales arbitrarios. Para un agente antimicrobiano con un efecto bacteriostático conocido (es decir, cuando la presencia del agente antimicrobiano inhibe el crecimiento de, pero no destruye directamente células del microorganismo), el 60% de células restantes, en comparación con el control no expuesto, se consideraría suficiente para hacer una determinación de MIC. Para un agente antimicrobiano con una actividad bactericida conocida (un compuesto que destruye directamente las células microbianas), el 30% de células restantes, en comparación con el control no expuesto, es suficiente para hacer una determinación de la MIC. Para agentes antimicrobianos con un mecanismo de acción desconocido, se puede lograr la certeza estadística de la inhibición aplicando un umbral al 10% de las células restantes, en comparación con el control no expuesto.
Usando el sistema de alto rendimiento ilustrado, pueden obtenerse resultados de sensibilidad cualitativa a antimicrobianos en el plazo de 1 hora desde la manipulación de la muestra, y pueden lograrse resultados de MIC FAST en el plazo de 3 horas desde la primera manipulación de la muestra, para una pluralidad de muestras microbianas y usando una pluralidad de agentes antimicrobianos. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 22, los resultados de MIC usando un intervalo completo de diluciones de agente antimicrobiano (de 0.25 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l, 32.0 mg/l, 64.0 mg/l, 128.0 mg/l, 256.0 mg/l), para hasta cuatro antibióticos diferentes (CRO, GEN, MEM y PZT) para 2 aislados bacterianos separados de un cultivo de muestra de sangre positivo pueden darse en un promedio de aproximadamente 3 horas desde la detección inicial del hemocultivo positivo. Específicamente, en las muestras de 96 pocillos ensayadas, el tiempo medio para el resultado de MIC AST tenía una media de 3.4 horas, y un intervalo de 3.0 horas a 4.2 horas. Esto es mucho más rápido en comparación con la determinación de MIC BMD para las mismas 96 muestras ensayadas en un tiempo de laboratorio de referencia que tiene una media de 47.9 horas, y un intervalo de 14.8-126.8 horas.
Ejemplo 18:
Desarrollo de un sistema rápido de alto rendimiento que emplea el ensayo de sensibilidad asistido por citometría de flujo acústica (AFC) a uno o más agentes antimicrobianos en una o más muestras biológicas (Método II)
Este ejemplo describe un método adicional de un método rápido de alto rendimiento basado en el nuevo método de ensayo de sensibilidad asistido por AFC para analizar cualitativa y/o cuantitativamente la sensibilidad de microorganismo(s) (p. ej., una o más bacterias diferentes) en una o más muestras biológicas a antimicrobiano(s). El método ilustrado en el presente documento comprende menos etapas que el método de alto rendimiento descrito en el Ejemplo 17, y se simplifica.
Este método más simple se realiza como sigue. Una vez que se ha determinado que una muestra biológica tal como una muestra de hemocultivo obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene infección por un microorganismo (p. ej., bacterias), por el sistema en el que se incubó, ha dado un resultado positivo de cultivo para el microorganismo, se retiran 500 microlitros y se ponen en un tubo. Un resultado positivo del cultivo puede determinarse mediante<mediciones de producción de CO>2<y/o uso de reactivos fluorescentes para indicar la presencia de un número suficiente,>p. ej., aproximadamente 1.0 x 106 a aproximadamente 9.0 x 109 células microbianas en división activa presentes en la muestra microbiana.
Se añaden 500 microlitros de una suspensión al 0.1% (en solución salina al 0.85%) de un detergente no iónico (tal como Triton-X100) a los 500 microlitros de la muestra de hemocultivo positivo y se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos para separar las células microbianas de las células sanguíneas. Alternativamente, se usó filtración para separar las células sanguíneas de las células microbianas.
Después de que hayan pasado los 5 minutos, la muestra se diluye 1:10 en solución salina equilibrada de Hank, precalentada a 37°C. Esta suspensión se analiza luego con un nefelómetro y, mediante la adición gota a gota de solución salina equilibrada de Hank (precalentada a 37°C), diluida hasta que alcanza la paridad, mediante la resolución de dicho nefelómetro, con un patrón de McFarland 0.5 (0.05 ml de cloruro de bario al 1.0% en 9.95 ml de ácido sulfúrico al 1.0%). Esto equivale a aproximadamente 1.5 x 108 células microbianas/ml.
Se añade una parte alícuota de la suspensión de microorganismos del frasco de hemocultivo a un volumen adicional de caldo Mueller-Hinton (precalentado a 37°C) de manera que la concentración final de microorganismos esté en el intervalo de aproximadamente 5.0 x 103 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas por mililitro, preferiblemente de aproximadamente 5.0 x 104 a aproximadamente 5.0 x 107 células microbianas por mililitro, y lo más preferiblemente a una concentración de 5.0 x 105 células microbianas por mililitro. En este caso, se pueden añadir 400.00 microlitros de suspensión de hemocultivo a 29600 microlitros de caldo Mueller-Hinton precalentado. Se añade un volumen de esta suspensión de crecimiento microbiano diluida a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de formato convencional que contiene un patrón de agente antimicrobiano (p. ej., antibiótico) para lograr una concentración final igual a las suspensiones de trabajo apropiadas de los agentes antimicrobianos (p. ej., antibióticos) que se están ensayando. El intervalo de concentraciones para cada agente antimicrobiano que se va a ensayar puede ser de 0.25 mg/l, 0.5 mg/l, 1.0 mg/l, 2.0 mg/l, 4.0 mg/l, 8.0 mg/l, 16.0 mg/l, 32.0 mg/l, 64.0 mg/l, 128.0 mg/l, 256.0 mg/l.
En una realización, se ensayan cuatro agentes antimicrobianos diferentes a las concentraciones anteriores en una placa de 96 pocillos, con 8 pocillos que no contienen agente antimicrobiano como un control del crecimiento no expuesto. En otro ejemplo, se ensayan ocho agentes antimicrobianos a las concentraciones anteriores en una placa de 96 pocillos, con 8 pocillos que no contienen agente antimicrobiano como control del crecimiento no expuesto. En otro ejemplo más, se ensayan 13 agentes antimicrobianos diferentes en una placa de 96 pocillos, con un número reducido de diluciones ensayadas para cada agente antimicrobiano (p. ej., omitiendo las diluciones de 64.0 mg/l, 128.0 mg/l y 256.0 mg/l), con uno o tres pocillos que no contienen agente antimicrobiano como controles de crecimiento no expuestos.
Después de la inoculación con la suspensión de crecimiento microbiano ajustada, la placa de 96 pocillos se pone en una incubadora durante aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 120 minutos. Para microorganismos clasificados como bacterias Gram negativas, la incubación puede ser durante 30 minutos. Para microorganismos clasificados como bacterias Gram positivas, o en ausencia de un conocimiento previo de la identidad del microorganismo, la duración de la etapa de preincubación es de aproximadamente 120 minutos.
Después de que haya pasado el tiempo de exposición con el agente antimicrobiano, el volumen dentro de cada pocillo se complementa con 4 volúmenes de solución salina equilibrada de Hank teñida con SYTO 9 de manera que la concentración final de SYTO 9 sea 5 pM. La placa se incuba después en ausencia de luz, a temperatura ambiente, durante aproximadamente 5 minutos. La placa se carga en el citómetro de flujo Attune NxT por medio de un inyector automático del citómetro de flujo Attune NxT.
De cada pocillo de la placa, se analiza una muestra mediante el citómetro de flujo Attune NxT, por medio del inyector automático del citómetro de flujo Attune NxT con los siguientes ajustes: Caudal - 100 microlitros por minuto, Volumen de adquisición - 60 microlitros por pocillo, Espera antes de registrar - 8 segundos, Enjuague entre pocillos - activo.
Como en el Ejemplo 17 anterior, los datos para cada pocillo de la placa de 96 pocillos se exportan en formato de archivo FCS 3.1 desde el software de adquisición Attune NxT para análisis, y los datos de cada pocillo de la placa de 96 pocillos se importaron a FlowJo v10.4.2. Se entenderá que sería aceptable cualquier otro software (tal como FCS Express, R (FlowCore y FlowViz)) capaz de realizar las siguientes etapas de análisis. Alternativamente, podría usarse cualquier paquete estadístico capaz de aceptar los datos de FCS (convertidos en archivos CSV), capaz de realizar el análisis de subconjuntos variables enumerados en este documento (donde una selección de poblaciones se considera un subconjunto de datos con los parámetros apropiados). Ejemplos de esto son: R (BioConductor, FlowStats), Orange, código estadístico a medida escrito en cualquier lenguaje de programación apropiado (p. ej., Python, Ruby, Visual Basic, C, Ansi C, C++).
Para cada archivo de datos, se aplican las siguientes etapas de análisisin silicoA a H: (A) Se añade una selección de poblaciones de histograma, seleccionando todos los sucesos de unidades arbitrarias de fluorescencia en la fluorescencia de excitación a 488 nm, de emisión a 515 nm-545 nm mayores que 102. (B) En un gráfico de dispersión frontal - área y dispersión frontal - altura, todos los sucesos con una relación de altura a área por debajo de 1.5 se seleccionan para asegurar que solo se analizan células individuales. (C) Se identifican los archivos de datos correspondientes a las muestras de control no expuestas. Para ensayos en los que se usan múltiples muestras de control, se identifica el modo o número mediano de sucesos por microlitro (el que sea mayor). (D) En un gráfico de dispersión frontal-altura, y fluorescencia de excitación a 488 nm, emisión a 515 nm-545 nm, se aplica el contorneado del vecino más cercano al umbral de 10%, y se selecciona una región delimitada por el contorno más exterior que abarca todos los sucesos dentro de esta región. Esto designa la selección de poblaciones de UCM. (E) Se determina el número de sucesos registrados, se normaliza como sucesos por microlitro, y se identifica como que cae dentro del límite de la selección de poblaciones de UCM para cada archivo de datos de muestra tomada de la placa de 96 pocillos. Esto representaba un recuento de células microbianas por microlitro, con los parámetros ópticos y de fluorescencia medidos consistentes con microorganismos no afectados por la exposición al agente antimicrobiano. (F) Usando el software, la selección de poblaciones de UCM se aplica a un gráfico de dispersión frontal-altura, y fluorescencia de excitación a 488 nm, emisión a 515 nm-545 nm a todos los archivos de datos del ensayo. Esta etapa identifica el número de microbios por microlitro, en cada archivo de datos, consistente con microorganismos no afectados por la exposición al agente antimicrobiano. (G) Para cada archivo de datos a lo largo del ensayo, el número de sucesos en la selección de poblaciones de UCM por microlitro se divide entre el número de sucesos en la selección de poblaciones de UCM por microlitro en la muestra de control no expuesta de la que se definió originalmente la selección de poblaciones de UCM. Este valor se expresa como un porcentaje para identificar la proporción de células de microorganismos en cada archivo de datos con parámetros ópticos y de fluorescencia consistentes con microorganismos no afectados por la exposición al agente antimicrobiano (véanse los resultados mostrados en la Figura 23). (H) Se compararon todos los archivos a lo largo del ensayo que habían recibido la misma exposición a antimicrobianos. La concentración mínima inhibidora (MIC) se define como la concentración antimicrobiana más baja a la que el porcentaje de células microbianas restantes había caído por debajo de un umbral específico de agente antimicrobiano predeterminado.
Con respecto a la etapa (H) anterior, se puede tener en cuenta lo siguiente para definir la concentración mínima inhibidora (MIC) del agente antimicrobiano ensayado. Los umbrales predeterminados pueden obtenerse por ejemplo exponiendo 122 aislados (con un mínimo de 34 aislados resistentes) del microorganismo de interés, al fármaco de interés de la manera descrita anteriormente para generar un valor hipotético - por ejemplo, puede parecer que un nuevo antimicrobiano tiene un umbral de sensibilidad de 20% restante cuando se compara con el control no expuesto. Este umbral se ensaya entonces por comparación con los resultados generados, para los aislados de microorganismo expuestos al mismo fármaco, por un método de referencia tradicional tal como microdilución en caldo. Si la correlación de MIC es mayor que 0.90, por ejemplo con menos de 3% de "errores muy importantes" (siendo "errores muy importantes" un microorganismo con un fenotipo resistente a fármacos que se ha determinado como que tiene una MIC consistente con un fenotipo sensible a fármacos) se confirma el umbral y se establece un nuevo umbral.
En ausencia de umbrales empíricamente obtenidos, validados estadísticamente, podrían usarse umbrales arbitrarios. Para un agente antimicrobiano con un efecto bacteriostático conocido (es decir, cuando la presencia del agente antimicrobiano inhibe el crecimiento de, pero no destruye directamente células del microorganismo), el 60% de células restantes, en comparación con el control no expuesto, se consideraría suficiente para hacer una determinación de MIC. Para un agente antimicrobiano con una actividad bactericida conocida (un compuesto que destruye directamente las células microbianas), el 30% de células restantes, en comparación con el control no expuesto, es suficiente para hacer una determinación de la MIC. Para agentes antimicrobianos con un mecanismo de acción desconocido, se puede lograr la certeza estadística de la inhibición aplicando un umbral al 10% de células restantes, en comparación con el control no expuesto.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método de determinación de la sensibilidad de un microorganismo unicelular o multicelular a un agente antimicrobiano por citometría de flujo acústica, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(i) incubar en un medio de cultivo
(a) células del microorganismo de una muestra que se ha obtenido de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, y/o
(b) una muestra que se ha obtenido del sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, en donde dicha muestra comprende células de dicho microorganismo, en donde dicha incubación es durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células se dividan activamente para obtener de este modo un cultivo en división activa de dichas células de dicho microorganismo;
(ii) exponer las células del microorganismo en y/o del cultivo celular en división activa obtenido en la etapa (i) a un agente antimicrobiano durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células del microorganismo se dividan activamente;
(iii) marcar las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano en la etapa (ii) con un compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico;
(iv) medir el efecto de dicho agente antimicrobiano en la morfología celular de dichas células del microorganismo por citometría de flujo acústica; y
(v) determinar la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica, en donde la etapa (v) comprende
(A) determinar cualitativamente la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano determinando a partir de los datos de salida de citometría de flujo acústica que dicho microorganismo es sensible o no sensible a dicho agente antimicrobiano; y
(B) determinar cuantitativamente la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano determinando a partir de los datos de citometría de flujo acústica la concentración mínima inhibidora (MIC) de dicho agente antimicrobiano al que es sensible el microorganismo.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el marcado de las células del microorganismo expuestas al agente antimicrobiano en la etapa (ii) con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico da como resultado la detención de la división celular de células intactas y/o replicantes de dicho microorganismo.
3. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el microorganismo es sensible al agente antimicrobiano, y en donde medir el efecto del agente antimicrobiano en la morfología celular de las células del microorganismo por citometría de flujo acústica comprende medir el efecto de dicho agente antimicrobiano en la morfología celular de las células de dicho microorganismo en división activa a medida que dichas células quedan afectadas por dicho agente antimicrobiano y antes de la lisis celular y/o la descomposición celular completa después de la exposición de dichas células de dicho microorganismo en división activa a dicho agente antimicrobiano.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho método comprende incubar en el medio de cultivo una muestra que se ha obtenido del sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por dicho microorganismo, en donde la muestra comprende células del microorganismo, y en donde la muestra que se ha obtenido del sujeto se incuba directamente en dicho medio de cultivo sin aislar primero y/o retirar dichas células de dicho microorganismo de dicha muestra antes de dicha incubación de dicha muestra en dicho medio de cultivo.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde medir el efecto del agente antimicrobiano en la morfología celular de las células del microorganismo por citometría de flujo acústica comprende
(a) medir por citometría de flujo acústica el efecto del agente antimicrobiano en
(i) la cantidad de contenido de ácido nucleico en dichas células de dicho microorganismo; y/o
(ii) el volumen citoplasmático de dichas células de dicho microorganismo; y/o
(b) medir un cambio en la morfología celular de células de dicho microorganismo en división activa como se determina por citometría de flujo acústica después de exposición de dichas células del microorganismo a una concentración de dicho agente antimicrobiano, respecto a la morfología celular de células de dicho microorganismo en división activa en y/o de la muestra que se ha obtenido del sujeto como se determina por citometría de flujo acústica sin exposición de dichas células a dicho agente antimicrobiano.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde medir el efecto del agente antimicrobiano en la morfología celular de las células del microorganismo por citometría de flujo acústica comprende medir un aumento en el tamaño de las células de dicho microorganismo en división activa después de la exposición de dichas células a una concentración de dicho agente antimicrobiano como se determina por citometría de flujo acústica con respecto al tamaño de las células de dicho microorganismo en división activa en y/o de la muestra obtenida del sujeto como se determina por citometría de flujo acústica sin exposición de dichas células a dicho agente antimicrobiano,
y en donde medir un aumento en el tamaño de las células de dicho microorganismo en división activa comprende medir un aumento en (i) el contenido de ácido nucleico en dichas células de dicho microorganismo y/o (ii) el volumen citoplasmático de dichas células de dicho microorganismo, y preferiblemente en donde la concentración del agente antimicrobiano es una concentración inhibidora de dicho agente antimicrobiano al que son sensibles las células del microorganismo.
7. El método de la reivindicación 1, en donde determinar a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica que el microorganismo es sensible o no sensible al agente antimicrobiano comprende medir a partir de dicha salida de datos de la citometría de flujo acústica el efecto de dicho agente antimicrobiano en la morfología celular de las células de dicho microorganismo en división activa a diferentes concentraciones de dicho agente antimicrobiano.
8. El método de la reivindicación 7, en donde dicho método comprende además determinar que dicho microorganismo es sensible a dicho agente antimicrobiano cuando:
los datos de salida de la citometría de flujo acústica miden un cambio en la morfología celular de células de dicho microorganismo en división activa después de la exposición de dichas células de dicho microorganismo en división activa a una concentración de dicho agente antimicrobiano que es igual o menor que una concentración predeterminada de dicho agente antimicrobiano, respecto a la morfología celular de células de dicho microorganismo en división activa en y/o de la muestra obtenida del sujeto sin exposición de dichas células a dicho agente antimicrobiano;
y preferiblemente en donde un cambio en la morfología celular de células de dicho microorganismo en división activa comprende un aumento en el tamaño de las células del microorganismo en división activa.
9. El método de la reivindicación 7, en donde dicho método comprende además determinar que dicho microorganismo no es sensible a dicho agente antimicrobiano cuando:
los datos de salida de la citometría de flujo acústica no miden un cambio en la morfología celular de células de dicho microorganismo en división activa después de la exposición de dichas células de dicho microorganismo en división activa a una concentración de dicho agente antimicrobiano que es igual o menor que dicha concentración predeterminada de dicho agente antimicrobiano; y/o
los datos de salida de la citometría de flujo acústica miden un cambio en la morfología celular de células de dicho microorganismo en división activa después de la exposición de dichas células de dicho microorganismo en división activa a una concentración de dicho agente antimicrobiano que es mayor que dicha concentración predeterminada de dicho agente antimicrobiano;
y preferiblemente en donde un cambio en la morfología celular de células de dicho microorganismo en división activa comprende un aumento en el tamaño de las células del microorganismo en división activa.
10. El método de la reivindicación 8 o reivindicación 9, en donde
la concentración predeterminada es una concentración de punto de corte de la sensibilidad clínica reconocida internacionalmente o una MIC reconocida internacionalmente de dicho agente antimicrobiano para dicho microorganismo en la muestra obtenida del paciente o una especie a la que pertenece dicho microorganismo; y/o
la concentración predeterminada es una concentración de punto de corte de sensibilidad clínica o una MIC reconocida internacionalmente determinada para el agente antimicrobiano por el Comité Europeo sobre Ensayos de Sensibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST) o por el Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI) con respecto a dicho microorganismo en la muestra obtenida del paciente o para una especie a la que pertenece dicho microorganismo obtenido del paciente.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde
(a) determinar a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica que dicho microorganismo es sensible o no sensible a dicho agente antimicrobiano se logra en el plazo de
aproximadamente 1 a 3 horas, preferiblemente en el plazo de aproximadamente 1 hora, desde el momento de obtener la muestra que comprende células del microorganismo del sujeto o
aproximadamente 1 a 3 horas, preferiblemente en el plazo de aproximadamente 1 hora desde el momento de incubar primero las células del microorganismo de o en dicha muestra en el medio de cultivo para obtener el cultivo de dichas células de dicho microorganismo en división activa; y/o
(b) determinar la sensibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano cuantitativamente midiendo a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica la concentración mínima inhibidora de dicho agente antimicrobiano al que es sensible el microorganismo, se logra en el plazo de
aproximadamente 3 a 6 horas, preferiblemente en el plazo de aproximadamente 3 horas, desde el momento de obtener la muestra que comprende células del microorganismo del sujeto o
aproximadamente 3 a 6 horas, preferiblemente en el plazo de aproximadamente 3 horas desde el momento de incubar primero las células del microorganismo de o en dicha muestra en el medio de cultivo para obtener el cultivo de dichas células de dicho microorganismo en división activa.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde determinar a partir de los datos de salida de la citometría de flujo acústica la MIC del agente antimicrobiano al que es sensible el microorganismo, comprende (a) incubar en un medio de cultivo
(i) células del microorganismo de la muestra que se ha obtenido del sujeto
y/o
(ii) una muestra que se ha obtenido del sujeto en donde dicha muestra comprende células del microorganismo,
durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células de dicho microorganismo se dividan activamente para obtener un cultivo de dichas células de dicho microorganismo en división activa, y marcar dichas células de dicho microorganismo en o de dicho cultivo en división activa con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico ausente antes de la exposición al agente antimicrobiano, para producir de ese modo una muestra de control no expuesta;
(b) medir por citometría de flujo acústica la morfología celular y la cantidad de dichas células de dicho microorganismo en la muestra de control no expuesta;
(c) llevar a cabo las etapas (i) a (iv) como se definen en la reivindicación 1; y
(d) determinar a partir de los datos de la citometría de flujo acústica la concentración mínima de dicho agente antimicrobiano para la que la cantidad o proporción de las células de dicho microorganismo expuestas a dicho agente antimicrobiano que tienen una morfología celular de células no expuestas a agente antimicrobiano en dicha muestra de control no expuesta, sea igual o menor que una cantidad o proporción predeterminada de las células en dicha muestra de control no expuesta medida por la citometría de flujo acústica que presentan dicha morfología celular de células no expuestas a agente antimicrobiano.
13. El método de la reivindicación 12, en donde
la cantidad o proporción predeterminada de las células en dicha muestra de control no expuesta medida por citometría de flujo acústica que presentan la morfología celular de células no expuestas a agente antimicrobiano, se determina por referencia a concentraciones mínimas inhibidoras (MIC) conocidas de dicho agente antimicrobiano para un panel de aislados conocidos del microorganismo; y/o
la cantidad o proporción predeterminada de las células en dicha muestra de control no expuesta medida por citometría de flujo acústica que presentan dicha morfología celular de células no expuestas a agentes antimicrobianos, es aproximadamente 1% a aproximadamente 50% del total de las células en dicha muestra de control no expuesta.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además
(a) incubar en un medio de cultivo células del microorganismo de la muestra que se ha obtenido del sujeto y/o incubar en el medio de cultivo la muestra que se ha obtenido del sujeto en donde la muestra comprende las células del microorganismo,
durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células se dividan activamente para obtener un cultivo de dichas células de dicho microorganismo en división activa, y
marcar dicha célula de dicho microorganismo en o de dicho cultivo en división activa con el compuesto fluorescente de unión a ácido nucleico ausente antes de la exposición al agente antimicrobiano, para producir de ese modo una muestra de control no expuesta; y
(b) medir por citometría de flujo acústica la morfología celular y la cantidad de dichas células de dicho microorganismo en la muestra de control no expuesta.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde
(a) incubar células del microorganismo en y/o de la muestra en un medio de cultivo durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células se dividan activamente comprende incubar dichas células de dicho microorganismo durante un tiempo y en condiciones suficientes para que se produzcan de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 divisiones celulares, preferiblemente para que se produzcan de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 divisiones celulares; y/o
(b) exponer las células del microorganismo al agente antimicrobiano durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células del microorganismo se dividan activamente, comprende incubar dichas células de dicho microorganismo en presencia del agente antimicrobiano durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichas células experimenten de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 divisiones celulares.
16. Un método para determinar la sensibilidad de un microorganismo unicelular o multicelular a una pluralidad de agentes antimicrobianos, comprendiendo dicho método:
llevar a cabo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde dicho método comprende exponer las células del microorganismo en división activa en y/o de la muestra que se ha obtenido del sujeto a uno o más agentes antimicrobianos representativos de una primera familia o panel de una pluralidad de agentes antimicrobianos, para determinar de este modo la sensibilidad de dichas células de dicho microorganismo a agentes antimicrobianos pertenecientes a dicha primera familia o panel de la pluralidad de agentes antimicrobianos.
17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde dicho método se usa para el cribado de alto rendimiento de la sensibilidad de uno o más microorganismos unicelulares o multicelulares a uno o más agentes antimicrobianos.
ES18780814T 2017-04-07 2018-04-06 Un método para ensayar la sensibilidad a los antimicrobianos Active ES2979247T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2017901295A AU2017901295A0 (en) 2017-04-07 A Method for Testing Antimicrobial Susceptibility
AU2017903423A AU2017903423A0 (en) 2017-08-24 A Method for Testing Antimicrobial Susceptibility
PCT/AU2018/050318 WO2018184073A1 (en) 2017-04-07 2018-04-06 A method for testing antimicrobial susceptibility

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2979247T3 true ES2979247T3 (es) 2024-09-25

Family

ID=63712036

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18780814T Active ES2979247T3 (es) 2017-04-07 2018-04-06 Un método para ensayar la sensibilidad a los antimicrobianos

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210292807A1 (es)
EP (1) EP3607084B1 (es)
AU (1) AU2018248070B2 (es)
ES (1) ES2979247T3 (es)
WO (1) WO2018184073A1 (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2567635B (en) * 2017-10-17 2022-09-28 Cellfacts Analytics Ltd A method and apparatus for monitoring microbial contaminants in an industrial process
GB201815122D0 (en) 2018-09-17 2018-10-31 Univ Southampton Impedance flow cytometry methods
CA3116447A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Cellfacts Analytics Limited A method and apparatus for monitoring microbial contaminants in an industrial process
GB201819187D0 (en) * 2018-11-26 2019-01-09 Univ Manchester Assay
CN110499353B (zh) * 2019-08-09 2023-11-07 佛山市第四人民医院(佛山市结核病防治所) 一种用于结核耐药诊断的微生物标志物及其应用
CN111458313A (zh) * 2020-04-07 2020-07-28 上海交通大学医学院附属仁济医院 基于荧光d型氨基酸代谢标记的抗菌药敏试验检测方法
CN112782137B (zh) * 2020-12-24 2022-10-25 自然资源部第一海洋研究所 10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法
CN117441025A (zh) * 2021-05-24 2024-01-23 香港浸会大学 用于少量细胞的无显微镜定量检测的微流体条形码样细胞传感器
CN113687072A (zh) * 2021-09-10 2021-11-23 佛山墨赛生物技术有限公司 大肠杆菌o157:h7活菌定量检测试纸条、试剂盒及检测方法
CN115798577B (zh) * 2023-02-06 2023-04-21 中国医学科学院北京协和医院 一种预测克雷伯氏菌属对左氧氟沙星敏感性的系统及方法
WO2025226860A1 (en) * 2024-04-24 2025-10-30 Affinity Biosensors, Llc Determination of antimicrobial susceptibility by population profiling of microbial cultures

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8266951B2 (en) * 2007-12-19 2012-09-18 Los Alamos National Security, Llc Particle analysis in an acoustic cytometer
PL2714922T3 (pl) * 2011-06-03 2018-02-28 Universidade Do Porto Sposób wykrywania mikroorganizmów opornych na środek terapeutyczny
EP2724160A2 (en) * 2011-06-27 2014-04-30 Life Technologies Corporation Acoustic cytometry methods and protocols
WO2014037883A1 (en) * 2012-09-06 2014-03-13 Aidance Skincare And Topical Solutions, Llc Topical antimicrobial formulations
CA2974179C (en) * 2014-01-27 2022-06-21 Aidance Skincare & Topical Solutions Llc Topical antibiotic formulations
EP3266878B1 (en) * 2016-07-08 2020-03-25 bioMérieux Flow cytometry data processing for antimicrobial agent sensibility prediction
GB201815122D0 (en) * 2018-09-17 2018-10-31 Univ Southampton Impedance flow cytometry methods

Also Published As

Publication number Publication date
EP3607084C0 (en) 2024-05-01
AU2018248070A1 (en) 2019-11-28
US20210292807A1 (en) 2021-09-23
EP3607084A4 (en) 2021-01-27
AU2018248070B2 (en) 2024-07-25
EP3607084A1 (en) 2020-02-12
EP3607084B1 (en) 2024-05-01
WO2018184073A1 (en) 2018-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2979247T3 (es) Un método para ensayar la sensibilidad a los antimicrobianos
Sands et al. Respiratory pathogen colonization of dental plaque, the lower airways, and endotracheal tube biofilms during mechanical ventilation
ES2652367T3 (es) Método de detección de los microorganismos resistentes a un agente terapéutico
ES2625632T3 (es) Método para la determinación rápida de la susceptibilidad o de la resistencia de las bacterias a los antibióticos
Cho et al. Rothia mucilaginosa pneumonia diagnosed by quantitative cultures and intracellular organisms of bronchoalveolar lavage in a lymphoma patient
Kuriyama et al. Antimicrobial chemotherapy: significance to healthcare
Fredborg et al. Synergistic activities of meropenem double and triple combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae
US20220175736A1 (en) Small molecule inhibitors of bacterial efflux pumps and methods of using same
Micheel et al. Identification of nasal colonization with β-lactamase-producing Enterobacteriaceae in patients, health care workers and students in Madagascar
Erdogan et al. Travel-associated Legionnaires disease: clinical features of 17 cases and a review of the literature
Naureen et al. Antimicrobial susceptibility of 41 Burkholderia mallei isolates from spontaneous outbreaks of equine glanders in Punjab, Pakistan
Cazzola et al. Interrelationship between the pharmacokinetics and pharmacodynamics of cefaclor advanced formulation in patients with acute exacerbations of chronic bronchitis
Omar et al. Inhibition of metallo-β-lactamases in carbapenem resistant Gram negative bacilli by omeprazole and pantoprazole
Vote Diagnosis of Periprosthetic Joint Infection
Lee et al. POM-1 metallo-β-lactamase–producing Pseudomonas otitidis isolate from a patient with chronic otitis media
Santelices et al. Targeting deubiquitinating enzymes (DUBs) and ubiquitin pathway modulators to enhance host defense against bacterial infections
Melter et al. The MicroBook: Clinical Microbiology for Medical Students
Sozen et al. Clinical and economic outcomes associated with urinary tract infections caused by extended spectrum beta-lactamase producing bacteria in a tertiary care hospital
Yamamoto et al. A case of Helicobacter cinaedi pleuritis and continuous ambulatory peritoneal dialysis-related peritonitis diagnosed by simultaneous-onset bacteremia
Naruse et al. Rare Capnocytophaga sputigena bacteremia in a patient with acute lymphoblastic leukemia
Higa et al. Efficacy of pazufloxacin mesilate in Legionnaires’ disease: a case report and in vitro study of the isolate
Özel et al. An Innovative Method for Determining Amphotericin B Susceptibility in Leishmania infantum Isolates: A Modified Disk Elution Approach
ES2910202T3 (es) Monitorización terapéutica de fármacos
Kan et al. treatment of severe pneumonia
Karnaker et al. An unusual case of Streptococcus cristatus infection in a patient with decompensated liver disease