ES2982578T3 - Cuantificación de analitos polinucleotídicos de muestras secas - Google Patents

Abstract

Se presentan métodos, sistemas y productos de software útiles para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido utilizada para producir una muestra seca, donde la muestra seca sirve como fuente del analito en un procedimiento de detección y cuantificación. Se ilustra particularmente el uso de gotas de sangre seca para cuantificar un analito de polinucleótido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Cuantificación de analitos polinucleotídicos de muestras secas

Campo técnico

La presente divulgación se refiere en general al campo de la biotecnología. Más específicamente, la divulgación se refiere a métodos, sistemas y productos de soporte lógico para determinar la concentración de un analito en una muestra líquida utilizada para preparar una muestra seca, donde la muestra seca sirve como fuente del analito en un procedimiento de detección y cuantificación.

Antecedentes

El uso de muestras secas de fluidos corporales, tales como muestras de sangre seca, para la detección de analitos expande en gran medida la disponibilidad de pruebas de laboratorio sofisticadas simplificando los requisitos para la recogida, transporte y procesamiento de muestras. Una mancha de sangre seca (MSS) representa un tipo particular de muestra seca. Más específicamente, una MSS es una forma de biomuestreo donde 50-70 pl de sangre se transfieren a un círculo de papel de filtro, se secan y después se utilizan para la detección de uno o más bioanalitos en la muestra de sangre. Mediante este enfoque, se puede preparar, secar y enviar convenientemente una mancha de sangre a una ubicación de prueba remota. No es necesario que el lugar en donde se toma la muestra de sangre para la aplicación puntual tenga recursos para realizar extracciones de sangre convencionales. La ventaja aquí es que las pruebas de bioanalitos pueden estar disponibles para entornos con problemas de recursos, así como para las categorías de donación anónima y pruebas domésticas.

El uso de muestreo MSS ofrece muchas ventajas. Por ejemplo, las muestras son fáciles de recoger, almacenar y transportar sin requerir refrigeración. La adquisición de muestras es menos invasiva que extraer sangre por flebotomía, ya que solo se requieren volúmenes de sangre muy pequeños. Las muestras secas pueden ser estables a temperatura ambiente durante meses. Por lo tanto, este tipo de muestra proporciona una forma conveniente de ofrecer acceso de laboratorio a pacientes fuera del entorno clínico tradicional. La muestra seca puede incluso utilizarse como una fuente de moldes para el cebado en reacciones de amplificación de ácido nucleicoin vitro,tales como reacciones de amplificación de ácido nucleico en tiempo real.

Marconi et al. (2009.Clinical Microbiology and Infection,15(1): 93-97) divulgan la evaluación del ensayo cuantitativo de VIH-1 en tiempo real de Abbott con especímenes de manchas de sangre secos. El documento WO 2016/007709 divulga un procedimiento automatizado de prueba de carga viral de VIH-1 para manchas secas. El documento WO 2006/052764 divulga un análisis cuantitativo de una muestra biológica de cantidad desconocida. Rouet et al. (2008.Expert Reviews in Molecular Diagnostics,8(5): 635-650) divulgan ensayos de RT-PCR en tiempo real de ARN de VIH-1 internos.

Desafortunadamente, la conversión de un resultado de MSS cuantitativo (p. ej., medido en copias/ml utilizando una muestra MSS reconstituida) en un resultado de "muestra húmeda" exacto (p. ej., - medido en copias/ml) para una muestra líquida o fluida de un tipo diferente (p. ej., sangre completa o el plasma) pueden ser muy dificultosa. Producciones cuantitativas de analizadores de ácidos nucleicos que procesan muestras líquidas (p. ej., muestras de plasma) son típicamente muy diferentes de las producciones cuantitativas producidas utilizando muestras MSS reconstituidas. De hecho, las eficiencias de la preparación de muestras pueden diferir significativamente para el muestreo directo de un producto sanguíneo fluido y una muestra MSS reconstituida, afectando de este modo a la cantidad de diana nativa que entra en la ruta para la amplificación y detección.

Una estrecha correspondencia entre la MSS y los resultados cuantitativos de la muestra húmeda puede ser crítica si el resultado de la MSS se va a utilizar para tomar una decisión informada con respecto a un tratamiento médico, o cambio en el tratamiento. Por ejemplo, si los resultados de la prueba de MSS se van a utilizar para determinar el fracaso de un tratamiento antirretroviral para el VIH-1, en ese caso, según las directrices de la Organización Mundial de la Salud (directrices consolidadas de la OMS sobre el uso de fármacos antirretrovirales para tratar o prevenir la infección por VIH, 2016) la prueba debe ser capaz de detectar cuando la carga viral del VIH supera un nivel de 1.000 copias/ml en plasma.

La presente divulgación aborda la necesidad de convertir los resultados de las pruebas de MSS en un patrón de muestra húmeda, relacionando así los dos resultados entre sí de una manera que es tanto altamente exacta como precisa.

Compendio de la divulgación

Los aspectos y realizaciones de la presente invención se exponen en las reivindicaciones.

Un aspecto de la invención proporciona un método para cuantificar un analito polinucleotídico presente en una muestra de sangre fluida que se secó para producir una MSS, comprendiendo el método las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico utilizando la MSS como fuente de moldes para producir productos de amplificación y obtener un resultado medido, indicando el resultado medido una concentración o una cantidad del analito polinucleotídico; y (b) multiplicar el resultado medido por un factor de corrección para obtener un resultado corregido, en donde el factor de corrección es la solución a una ecuación que especifica el factor de corrección en función del resultado medido, y en donde la ecuación comprende una ecuación no lineal, cuantificando de ese modo el analito polinucleotídico presente en la muestra de sangre fluida.

Un aspecto de la invención proporciona un método para cuantificar un analito polinucleotídico presente en una muestra de sangre fluida que creó una MSS, comprendiendo el método las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico utilizando la MSS como fuente de moldes para producir productos de amplificación y obtener un resultado medido, indicando el resultado medido una concentración o una cantidad del analito polinucleotídico; (b) resolver una ecuación para determinar un factor de corrección, en donde la ecuación especifica el factor de corrección en función del resultado medido; y en donde la ecuación comprende una ecuación no lineal; y (c) multiplicar el resultado medido por el factor de corrección para obtener un resultado corregido, cuantificando de ese modo el analito polinucleotídico presente en la muestra de sangre fluida.

En una realización, la ecuación no lineal comprende coeficientes optimizados en un procedimiento matemático de ajuste de curvas para definir una curva ajustada.

En una realización, la ecuación no lineal comprende cuatro coeficientes.

En una realización, la etapa (a) comprende trabajar con un analizador de ácidos nucleicos automatizado que amplifica el analito polinucleotídico y detecta productos de amplificación a medida que se produce la reacción de amplificación de ácido nucleico.

En una realización, la ecuación en la etapa (b) es una ecuación no lineal preparada utilizando resultados obtenidos de un analizador de ácidos nucleicos automatizado diferente del analizador de ácidos nucleicos automatizado utilizado para llevar a cabo la reacción de amplificación de ácido nucleico en la etapa (a).

En una realización, la etapa (a) comprende trabajar con un analizador de ácidos nucleicos automatizado que aísla el analito polinucleotídico, y después amplifica el analito polinucleotídico aislado.

En una realización, el analizador de ácidos nucleicos automatizado detecta adicionalmente la síntesis de productos de amplificación a medida que se produce la reacción de amplificación de ácido nucleico.

En una realización, el resultado medido indica una concentración del analito polinucleotídico en una muestra de plasma.

En una realización, la reacción de amplificación de ácido nucleico es una reacción de amplificación de ácido nucleico isotérmica.

En una realización, la reacción de amplificación de ácido nucleico isotérmica es una reacción de amplificación de ácido nucleico asociada a la transcripción.

En una realización, la reacción de amplificación de ácido nucleico asociada a la transcripción comprende una reacción de amplificación mediada por transcripción (AMT).

En una realización, el analito polinucleotídico comprende un segmento de un genoma viral.

En una realización, el genoma viral comprende ARN.

En una realización, el analito polinucleotídico comprende un segmento de un genoma de VIH-1.

En una realización, la muestra de sangre fluida comprende sangre completa.

Un aspecto de la invención proporciona un ordenador programado con instrucciones de soporte lógico para cuantificar un analito polinucleotídico presente en una muestra de sangre fluida que se secó para producir una MSS, las instrucciones de soporte lógico, cuando son ejecutadas por el ordenador, hacen que el ordenador: (a) reciba un resultado medido; (b) resuelva una ecuación no lineal para determinar un factor de corrección, en donde la ecuación no lineal especifica el factor de corrección en función del resultado medido; (c) multiplique el resultado medido por el factor de corrección para calcular un resultado corregido; y (d) registre el resultado corregido en una forma no transitoria, cuantificando de ese modo el analito polinucleotídico.

En una realización, el resultado medido se determina a partir de resultados de una reacción de amplificación de ácido nucleico en tiempo real, en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico en tiempo real se lleva a cabo utilizando la MSS como fuente de moldes para producir productos de amplificación, y en donde el resultado medido indica una concentración o una cantidad del analito polinucleotídico.

En una realización, el resultado medido y el resultado corregido se expresan ambos en unidades de concentración.

En una realización, la ecuación no lineal comprende coeficientes optimizados en un procedimiento matemático de ajuste de curvas para definir una curva ajustada.

En una realización, la ecuación no lineal comprende cuatro coeficientes.

En una realización, la forma no transitoria comprende almacenamiento en un dispositivo de memoria legible por ordenador.

En una realización, la muestra de sangre fluida comprende sangre completa.

Un aspecto de la invención proporciona un medio de almacenamiento legible por ordenador que comprende instrucciones que, cuando son ejecutadas por un ordenador, hacen que el ordenador lleve a cabo el método descrito en el presente documento.

Un aspecto de la invención proporciona un sistema configurado para cuantificar un analito polinucleotídico que puede estar presente en una muestra de sangre fluida que se secó para producir una MSS, que comprende: un analizador de ácidos nucleicos que comprende una incubadora de temperatura controlada; un fluorómetro en comunicación óptica con la incubadora de temperatura controlada, en donde el fluorómetro está configurado para medir la producción de productos de amplificación de ácido nucleico contenidos dentro de la incubadora de temperatura controlada en función del tiempo o del número de ciclo; y un ordenador en comunicación con el fluorómetro, en donde el ordenador está programado con instrucciones de soporte lógico que hacen que el ordenador: (a) calcule un resultado medido utilizando mediciones realizadas por el fluorómetro, (b) resuelva una ecuación para determinar un factor de corrección, en donde la ecuación comprende una ecuación no lineal, y en donde la ecuación no lineal especifica el factor de corrección en función del resultado medido; (c) multiplique el resultado medido por el factor de corrección para calcular un resultado corregido, y (d) registre el resultado corregido en una forma no transitoria, cuantificando de ese modo el lito polinucleotídico diana presente en la muestra de sangre fluida que se secó para producir una MSS.

En una realización, la incubadora de temperatura controlada está configurada para mantener una temperatura constante.

En una realización, la incubadora de temperatura controlada está configurada para el ciclo de temperatura.

En una realización, el fluorómetro está configurado para detectar una pluralidad de diferentes longitudes de onda de luz.

En una realización, la incubadora de temperatura controlada, el fluorómetro y el ordenador son todos componentes integrales del analizador de ácidos nucleicos.

En una realización, el resultado medido comprende un valor de concentración para el analito polinucleotídico.

Un aspecto de la invención proporciona un método para cuantificar un analito polinucleotídico presente en una muestra de fluido corporal que se secó para producir una muestra seca, comprendiendo el método las etapas de: (a) realizar una reacción utilizando la muestra seca como fuente del analito polinucleotídico para obtener un resultado medido, indicando el resultado medido una concentración o una cantidad del analito polinucleotídico, en donde la reacción se realiza con un analizador de ácidos nucleicos automatizado que amplifica el analito polinucleotídico y detecta productos de amplificación cuando está teniendo lugar la reacción de amplificación de ácido nucleico; y (b) multiplicar el resultado medido por un factor de corrección para obtener un resultado corregido, en donde el factor de corrección es la solución a una ecuación que especifica el factor de corrección en función del resultado medido, y en donde la ecuación comprende una ecuación no lineal, cuantificando de ese modo el analito polinucleotídico presente en la muestra de fluido corporal.

En una realización, la ecuación no lineal comprende coeficientes optimizados en un procedimiento matemático de ajuste de curvas para definir una curva ajustada.

En una realización, la ecuación no lineal comprende cuatro coeficientes.

En una realización, la ecuación que comprende la ecuación no lineal en la etapa (b) comprende coeficientes optimizados en un procedimiento matemático de ajuste de curvas para definir una curva ajustada, y en donde la ecuación no lineal se prepara utilizando resultados obtenidos de un analizador de ácidos nucleicos automatizado diferente del analizador de ácidos nucleicos automatizado utilizado para llevar a cabo la reacción de amplificación de ácido nucleico en la etapa (a).

En una realización, la etapa (a) comprende trabajar con un analizador de ácidos nucleicos automatizado que aísla el analito polinucleotídico, y después amplifica el analito polinucleotídico aislado.

En una realización, el analizador de ácidos nucleicos automatizado detecta adicionalmente la síntesis de productos de amplificación a medida que se produce la reacción de amplificación de ácido nucleico.

En una realización, el resultado medido indica una concentración del analito polinucleotídico en una muestra de plasma.

En una realización, la reacción de amplificación de ácido nucleico es una reacción de amplificación de ácido nucleico isotérmica.

En una realización, la reacción de amplificación de ácido nucleico isotérmica es una reacción de amplificación de ácido nucleico asociada a la transcripción. En una realización, la reacción de amplificación de ácido nucleico asociada a la transcripción comprende una reacción de amplificación mediada por la transcripción (AMT).

En una realización, el analito polinucleotídico comprende un segmento de un genoma viral.

En una realización, el genoma viral comprende ADN. En una realización, el analito polinucleotídico comprende un segmento de un genoma de VIH-1.

En una realización, la muestra de fluido corporal se selecciona del grupo que consiste en una muestra de sangre completa, una muestra de plasma, una muestra de orina y una muestra de saliva.

Descripción detallada

Introducción y visión general

En el presente documento se divulga un enfoque para convertir con exactitud un resultado cuantitativo obtenido utilizando una muestra de fluido corporal seca en un resultado correspondiente, medido en unidades de concentración, para una muestra líquida que se utilizó para crear la muestra seca. Los ácidos nucleicos de VIH sirvieron como analito modelo en los procedimientos ilustrativos. No hay necesidad de modificar las químicas utilizadas para la amplificación y detección de ácidos nucleicos para conseguir resultados sobresalientes. Esto significa que se puede utilizar una sola química de ensayo para cuantificar un analito polinucleotídico utilizando o bien muestras líquidas o bien muestras secas reconstituidas en un amplio intervalo dinámico. Se utilizó muestreo de machas de sangre seca para ilustrar la técnica.

En lugar de modificar la química del ensayo, se utiliza un multiplicador numérico de "factor de corrección" (en lo sucesivo FC) para lograr los resultados deseados. El FC puede multiplicarse por el resultado emitido o "medido" de un ensayo cuantitativo utilizando una MSS reconstituida como fuente de analito. Esto convierte el resultado medido en una concentración correspondiente (p. ej., copias/ml) de un tipo de muestra diferente. Por ejemplo, un resultado obtenido utilizando una muestra MSS reconstituida puede convertirse o ajustarse a una concentración correspondiente en una muestra de sangre completa. Por tanto, se puede utilizar ahora una única química de ensayo (p. ej., un solo tipo de mezcla de reacción de amplificación y detección, o un solo tipo de kit de ensayo) para amplificar y cuantificar el analito polinucleotídico, independientemente del tipo de muestra (p. ej., sangre completa, plasma, MSS reconstituida, etc.).

Una característica clave de la presente técnica implica la manera en la que se determina el FC. Se descubrió durante el desarrollo de la técnica que el FC requerido no es constante en el intervalo dinámico cuantitativo del ensayo. En su lugar, el FC varía en función de la salida de un analizador de ácidos nucleicos calibrado utilizando una muestra líquida (p. ej., donde la salida puede medirse en unidades de concentración). A medida que disminuye la cantidad de analito presente en una muestra seca (p. ej., una MSS), que experimenta reconstitución y prueba, aumenta el FC requerido para una cuantificación exacta.

El FC que se va a utilizar como un multiplicador numérico se calcula utilizando una ecuación ajustada a una colección de datos. Según la invención, la ecuación es una ecuación no lineal. Según la divulgación, la ecuación puede incluir una o más ecuaciones lineales. Los datos utilizados para obtener una ecuación ajustada representan factores de corrección calculados en función del valor de salida cuantitativo suministrado desde un analizador de ácidos nucleicos calibrado para procesar muestras líquidas (p. ej., plasma). En algunas realizaciones, la ecuación ajustada utilizada para determinar el FC que se va a utilizar en un aparato se puede determinar en ese mismo aparato. Sin embargo, es más conveniente, y por tanto preferible, determinar la ecuación ajustada utilizando uno o más aparatos, y después utilizar esa ecuación ajustada en un aparato diferente (es decir, un aparato que no se utilizó para determinar la ecuación ajustada). Por ejemplo, la ecuación ajustada puede ser preparada por el fabricante de un kit de ensayo, y después ser transferida a, y utilizada por, un cliente o usuario final en un aparato diferente (a veces denominado aparato "local").

En algunas realizaciones, el FC se calcula a partir de una pluralidad de curvas o líneas ajustadas, donde la curva o línea apropiada para la determinación de FC depende de la salida del analizador antes de aplicar el multiplicador de FC. De nuevo, el FC se elige en función de la concentración o cantidad medidas de analito que se indica que deben estar presentes cuando se prueba la muestra seca (p. ej., una muestra MSS) después de la reconstitución. El FC elegido se multiplica después por esa concentración medida para producir un resultado cuantitativo ajustado que cuantifica el analito.

Definiciones

Los siguientes términos tienen los significados indicados en la memoria descriptiva a menos que se indique expresamente que tienen un significado diferente.

Los términos "un", "uno", "una", "el", y "la", incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, se entiende que "un polinucleótido" como se emplea en el presente documento representa uno o más polinucleótidos. Como tales, los términos "un", "uno", (o "una"), "uno o más", "una o más”, “al menos uno", y "al menos una" se pueden utilizar indistintamente en el presente documento.

Como se emplea en el presente documento, una "muestra de fluido corporal seca" es una muestra de un fluido corporal, tal como una muestra de sangre completa u otro producto sanguíneo, donde el componente acuoso del fluido se ha retirado sustancialmente. Típicamente, el fluido corporal se aplicará a una matriz sólida (p. ej., un papel de filtro, un filtro de fibra de vidrio, un tejido, un hisopo flocado, un material esponjoso, etc.) antes de la eliminación del componente acuoso.

Como se emplea en el presente documento, una "mancha de sangre seca" (a veces "MSS") se refiere a una muestra de sangre o producto sanguíneo que se seca antes del análisis para determinar la presencia o cantidad de un analito. Preferiblemente, la muestra de sangre se aplica a una matriz sólida y después se deja secar para crear o producir la MSS. En algunas realizaciones, la matriz sólida es un filtro, tal como un filtro de papel o un filtro de fibra de vidrio, un tejido, un hisopo flocado o un material esponjoso. Preferiblemente, la MSS incluye una muestra de sangre completa seca. Los analitos preferidos para someter a prueba utilizando muestras MSS incluyen analitos polinucleotídicos.

Como se emplea en el presente documento, una muestra "reconstituida" es una muestra líquida o fluida resultante de combinar una muestra biológica seca (p. ej., una MSS) con un líquido (p. ej., una solución de extracción) que disuelve, licua o resuspende la muestra biológica seca. En algunas realizaciones, la muestra reconstituida resulta de combinar o poner en contacto una mancha de sangre seca sobre una matriz de soporte sólido (p. ej., una "tarjeta" de papel de filtro) con un tampón de extracción, que puede incluir un tampón de pH y un detergente. Por lo tanto, la mancha de sangre seca puede servir como fuente de analito (p. ej., analito polinucleotídico) que se va a detectar cuando el analito de la muestra reconstituida se utilice para la detección. En algunas realizaciones, los procedimientos para detectar analitos polinucleotídicos de una muestra reconstituida pueden implicar procedimientos de amplificación de ácido nucleicoin vitro.

Como se emplea en el presente documento, "polinucleótido" significa ARN, ADN o una molécula quimérica que contiene tanto ARN como ADN. El término también abarca moléculas que contienen análogos nucleotídicos de ARN o ADN.

Como se emplea en el presente documento, una "muestra de prueba" es cualquier muestra que se va a investigar para determinar la presencia de una secuencia polinucleotídica particular. Las muestras de prueba incluyen cualquier material que contenga polinucleótidos obtenido de una muestra humana, animal, ambiental o derivada de laboratorio o sintética. Las muestras de prueba preferidas incluyen muestras de fluidos corporales. La sangre completa, el plasma y el suero son ejemplos particularmente preferidos de muestras de prueba. Otras muestras de prueba incluyen saliva, orina, etc.

Como se emplea en el presente documento, un "analito" es una especie química o bioquímica que se va a detectar y/o cuantificar. Por ejemplo, un "analito polinucleotídico" se refiere a un polinucleótido (p. ej., un segmento de un polinucleótido de VIH-1) que se va a detectar o cuantificar en un procedimiento de prueba.

Como se emplea en el presente documento, un "analizador de ácidos nucleicos" (o "analizador de polinucleótidos") es un aparato que amplifica, detecta y cuantifica analitos polinucleotídicos. Ciertos analizadores de ácidos nucleicos preferidos incluyen una incubadora de temperatura controlada (p. ej., un bloque, placa o cámara), un fluorómetro en comunicación óptica con el contenido de la incubadora de temperatura controlada, y uno o más ordenadores o procesadores que procesan datos recogidos por el fluorómetro para cuantificar un analito polinucleotídico de interés.

Por "patrón de analito polinucleotídico" se entiende una composición que comprende una cantidad conocida de un analito polinucleotídico, o fragmento del mismo. Por ejemplo, un patrón de analito polinucleotídico de VIH-1 puede contener un número conocido de copias de un genoma de VIH-1, transcrito de VIH-1 o transcrito sintetizadoin vitroque representa una parte del genoma viral. Un patrón de "OMS" (p. ej., el patrón de la OMS del VIH-1) es un patrón de analito polinucleotídico de concentración establecida que es proporcionado por la Organización Mundial de la Salud.

Por "patrón de calibración" se entiende una composición que incluye una cantidad conocida o predeterminada de patrón de analito polinucleotídico combinada con una cantidad constante conocida de un polinucleótido calibrador interno. Dos patrones de calibración diferentes pueden contener cantidades diferentes de analito polinucleotídico o un fragmento del mismo, pero contendrán la misma cantidad de polinucleótido calibrador interno. El analito polinucleotídico del patrón de analito polinucleotídico, y el polinucleótido calibrador interno, serán distinguibles entre sí, por ejemplo, por tener secuencias de bases nucleotídicas que son diferentes. Se dice que un aparato de prueba (p. ej., un analizador de ácidos nucleicos) está "calibrado" cuando se ha utilizado un patrón de calibración para asegurar que el aparato proporciona resultados exactos. Por ejemplo, un aparato puede calibrarse para suministrar resultados exactos cuando se procesan muestras de plasma.

Un "amplicón" (a veces "producto de amplificación") es un producto polinucleotídico de una reacción de amplificación, en donde una secuencia polinucleotídica diana de un analito polinucleotídico sirvió como molde para la síntesis de copias de polinucleótidos o productos de amplificación.

Por "amplificación" o "amplificación de ácido nucleico" o "amplificación de polinucleótidos" y similares se entiende cualquier procedimiento conocido para obtener múltiples copias, permitiendo equivalentes de ARN y ADN, de una secuencia polinucleotídica diana o su complemento o fragmentos de los mismos. La amplificación de "fragmentos de los mismos" se refiere a la producción de un ácido nucleico amplificado (es decir, polinucleótido) que contiene menos de la secuencia de ácido nucleico de la región diana completa o su complemento. Tales fragmentos pueden producirse amplificando una porción del ácido nucleico diana, por ejemplo, utilizando un oligonucleótido de amplificación que hibrida con, e inicia la polimerización desde, una posición interna del polinucleótido diana.

Como se emplean en el presente documento, los términos "coamplificar" y "coamplificando" y variantes de los mismos se refieren a un procedimiento en donde diferentes secuencias de polinucleótidos diana se amplifican en una única (es decir, la misma) reacción de amplificación. Por ejemplo, un analito polinucleotídico y un polinucleótido calibrador interno no relacionado se "coamplifican" cuando ambos polinucleótidos se amplifican en reacciones que tienen lugar en un solo tubo, y cuando ambas reacciones de amplificación comparten al menos un reactivo (p. ej., desoxirribonucleótidos trifosfato, enzima, cebador o cebadores, etc.) en común.

Como se emplea en el presente documento, "ciclo térmico" se refiere a cambios repetidos de temperatura, (es decir, aumentos o disminuciones de temperatura) en una mezcla de reacción. Las muestras que experimentan ciclo térmico pueden cambiar de una temperatura a otra, estabilizarse a esa temperatura, pasar a una segunda temperatura o volver a la temperatura de partida. El ciclo de temperatura puede repetirse tantas veces como se requiera para estudiar o completar la reacción química particular de interés.

Por "diana" o "ácido nucleico diana" o "polinucleótido diana" se entiende un polinucleótido que contiene una secuencia que se va a amplificar, detectar y cuantificar. Una secuencia polinucleotídica diana que se va a amplificar preferiblemente se colocará entre dos oligonucleótidos dispuestos de manera opuesta, e incluirá la porción del polinucleótido diana que sea complementaria a cada uno de los oligonucleótidos.

Por "secuencia polinucleotídica diana" o "secuencia diana" o "región diana" se entiende una secuencia específica de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que comprende toda o parte de la secuencia de nucleótidos de una molécula de polinucleótido de hebra sencilla, y la secuencia de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos complementaria a la misma.

Por "amplificación asociada a la transcripción" se entiende cualquier tipo de amplificación de polinucleótidos que utiliza una ARN polimerasa para producir múltiples transcritos de ARN a partir de un molde de polinucleótidos. Convencionalmente, estas reacciones de amplificación emplean al menos un cebador que tiene un extremo 3' que puede extenderse por la actividad de una ADN polimerasa. Un ejemplo de un método de amplificación asociado a la transcripción, denominado "Amplificación Mediada por Transcripción" (AMT), emplea generalmente una ARN polimerasa, una ADN polimerasa, desoxirribonucleósidos trifosfato, ribonucleósidos trifosfato, y un oligonucleótido que contiene un promotor complementario al polinucleótido diana. Las variaciones de AMT son bien conocidas en la técnica como divulgan en detalle Burg et al., Patente de Estados Unidos Núm. 5,437,990; Kacian et al., Patentes de Estados Unidos Núm. 5,399,491 y 5,554,516; Kacian et al., documento PCT Núm. w O 93/22461; Gingeras et al., documento PCT Núm. WO 88/01302; Gingeras et al., documento PCT Núm. WO 88/10315; Malek et al., Patente de Estados Unidos Núm. 5,130,238; Urdea et al., Patentes de Estados Unidos Núm. 4,868,105 y 5,124,246; McDonough et al., documento PCT Núm. WO 94/03472; y Ryder et al., documento PCT Núm. WO 95/03430. Otros métodos de amplificación asociados a la transcripción que emplean sólo un único cebador que puede ser extendido por una ADN polimerasa, como se divulga la Patente de Estados Unidos Núm. 7,374,885 están particularmente englobados por la definición y son muy preferidos para su uso en relación con el método desvelado en el presente documento.

Como se emplea en el presente documento, un "oligonucleótido" u "oligómero" es una cadena polimérica de al menos dos, generalmente entre aproximadamente cinco y aproximadamente 100, subunidades químicas, comprendiendo cada subunidad un radical de base nucleotídica, un radical de azúcar y un radical de conexión que une las subunidades en una configuración espacial lineal. Los radicales de bases nucleotídicas comunes son guanina (G), adenina (A), citosina (C), timina (T) y uracilo (U), aunque son bien conocidas por los expertos en la técnica otras bases de nucleótidos raras o modificadas capaces de formar enlaces de hidrógeno. Los oligonucleótidos pueden incluir opcionalmente análogos de cualquiera de los radicales de azúcar, los radicales de base y los constituyentes de la cadena principal. Los oligonucleótidos preferidos están comprendidos en un rango de tamaño de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 restos. Los oligonucleótidos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, pero preferiblemente se sintetizan utilizando cualquiera de una variedad de métodos enzimáticos o químicos bien conocidos.

Por "oligonucleótido de amplificación" u "oligómero de amplificación" se entiende un oligómero que híbrida con un polinucleótido diana, o su complemento, y participa en una reacción de amplificación de polinucleótidos. Los ejemplos de oligómeros de amplificación incluyen cebadores que contienen un extremo 3' que se extiende como parte del procedimiento de amplificación, pero también incluyen oligómeros que no son extendidos por una polimerasa (p. ej., un oligómero bloqueado en 3') pero pueden participar en, o facilitar la amplificación eficaz a partir de un cebador. Los rangos de tamaño preferidos para los oligómeros de amplificación incluyen aquellos que tienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nucleótidos de longitud y contienen al menos aproximadamente 10 bases contiguas, y más preferiblemente al menos 12 bases contiguas que son complementarias a una región de la secuencia polinucleotídica diana (o una hebra complementaria de la misma). Las bases contiguas son preferiblemente al menos aproximadamente 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% y lo más preferiblemente aproximadamente 100% complementarias a la secuencia diana a la que se une el oligómero de amplificación. Un oligómero de amplificación puede incluir opcionalmente nucleótidos modificados o análogos, o nucleótidos adicionales que participan en una reacción de amplificación, pero no son complementarios a, ni están contenidos en, el polinucleótido diana. Un oligómero de amplificación que está bloqueado en 3' pero es capaz de hibridar con un polinucleótido diana y proporcionar una secuencia promotora aguas arriba que sirve para iniciar la transcripción se denomina oligómero "proveedor de promotor".

Un "cebador" es un oligómero de amplificación que hibrida con un polinucleótido molde y tiene un extremo 3'-OH que puede extenderse por una ADN polimerasa. La región 5' del cebador puede ser no complementaria al polinucleótido diana (p. ej., una secuencia promotora), dando como resultado un oligómero denominado "promotor-cebador". Aquellos en la técnica apreciarán que cualquier oligómero que pueda funcionar como cebador puede ser modificado para incluir una secuencia promotora 5', y por tanto podría funcionar como promotor-cebador. De manera similar, cualquier promotor-cebador puede ser modificado mediante la eliminación de, o la síntesis sin, una secuencia promotora y aún funcionar como cebador.

Como se emplea en el presente documento, una "sonda" es un oligonucleótido que hibrida específicamente con una secuencia diana en un polinucleótido, preferiblemente en un polinucleótido amplificado, en condiciones que promueven la hibridación, para formar un híbrido detectable. Ciertas sondas preferidas incluyen una marca detectable (p. ej., una marca fluorescente o una marca quimioluminiscente).

Como se emplea en el presente documento, el seguimiento "dependiente del tiempo" de la amplificación de polinucleótidos, o el seguimiento de la amplificación de polinucleótidos en "tiempo real" se refieren a un procedimiento en donde la cantidad de amplicón presente en una reacción de amplificación de polinucleótidos se mide en función del tiempo de reacción o el número de ciclos, y después se utiliza para determinar una cantidad de partida de molde que estaba presente en la mezcla de reacción en el momento en que se inició la reacción de amplificación. Por ejemplo, la cantidad de amplicón se puede medir antes de comenzar cada ciclo completo de una reacción de amplificación que comprende ciclos térmicos, tal como PCR. Alternativamente, se puede realizar un seguimiento de las reacciones de amplificación isotérmicas que no requieren intervención física para iniciar las transiciones entre ciclos de amplificación de manera continua, o a intervalos de tiempo regulares para obtener información con respecto a la cantidad de amplicón presente en función del tiempo.

Como se emplea en el presente documento, una "curva de crecimiento" se refiere al patrón característico de aparición de un producto sintético, tal como un amplicón, en una reacción en función del tiempo o número de ciclos. Una curva de crecimiento se representa convenientemente como un gráfico bidimensional del tiempo o número de ciclos (eje x) frente a algún indicador de cantidad de producto, tal como una medición de fluorescencia (eje y). Algunas, pero no todas, las curvas de crecimiento tienen una forma sigmoidea.

Como se emplea en el presente documento, la "fase de referencia" de una curva de crecimiento se refiere a la fase inicial de la curva en donde la cantidad de producto (tal como un amplicón) aumenta a una velocidad sustancialmente constante, siendo esta velocidad menor que la velocidad de aumento característica de la fase de crecimiento (que puede tener un perfil logarítmico lineal) de la curva de crecimiento. La fase de referencia de una curva de crecimiento tiene típicamente una pendiente muy poco profunda, que frecuentemente se aproxima a cero.

Como se emplea en el presente documento, la "fase de crecimiento" de una curva de crecimiento se refiere a la porción de la curva en donde el producto medible aumenta sustancialmente con el tiempo. La transición desde la fase de referencia a la fase de crecimiento en una reacción de amplificación de polinucleótidos típica se caracteriza por la aparición de amplicones a una velocidad que aumenta con el tiempo. La transición de la fase de crecimiento a la fase de meseta de la curva de crecimiento comienza en un punto de inflexión donde la velocidad de aparición del amplicón comienza a disminuir.

Como se emplea en el presente documento, la "fase de meseta" de una curva de crecimiento trifásico se refiere a la fase final de la curva. En la fase de meseta, la velocidad de formación de producto medible generalmente es sustancialmente menor que la velocidad de producción de amplicones en la fase log-lineal, e incluso puede acercarse a cero.

Como se emplea en el presente documento, la frase "indicios de amplificación" se refiere a características de curvas de ejecución en tiempo real que indican un nivel predeterminado de progreso en reacciones de amplificación de polinucleótidos. Tales indicios se determinan comúnmente mediante análisis matemático de curvas de ejecución, a veces denominadas "curvas de crecimiento", que muestran una señal medible (tal como una lectura de fluorescencia) cuya intensidad está relacionada con la cantidad de un amplicón presente en una mezcla de reacción en función del tiempo, número de ciclos, etc.

Como se emplea en el presente documento, la frase "indicios de amplificación basados en umbrales" se refiere a indicios de amplificación que miden el tiempo o número de ciclo cuando una señal de curva de crecimiento cruza un valor o umbral arbitrario. Las determinaciones de TTime son ejemplos de indicios de amplificación basados en umbrales, mientras que las determinaciones de TArc y OTArc son ejemplos de indicios de amplificación no basados en umbrales.

Como se emplea en el presente documento, la frase indicios de amplificación "dependientes del tiempo" se refiere generalmente a indicios de amplificación (p. ej., un parámetro de progreso de la reacción) que se miden en unidades de tiempo (p. ej., minutos). Los indicios de amplificación dependientes del tiempo se utilizan comúnmente para realizar un seguimiento del progreso en reacciones isotérmicas de amplificación de polinucleótidos que no se caracterizan por "ciclos" distintos. TTime, TArc y OTArc son todos ejemplos de indicios de amplificación dependientes del tiempo.

Como se emplea en el presente documento, un "calibrador interno" (a veces "CI" en el presente documento) es un polinucleótido que puede amplificarse en una reacción de amplificación de polinucleótidosin vitro,y que es distinguible de un analito polinucleotídico que se amplifica conjuntamente en la misma reacción. "Interno" significa que el polinucleótido calibrador se amplifica, detecta y cuantifica dentro de la misma mezcla de reacción que el analito polinucleotídico, o fragmento del mismo. En términos generales, la cantidad o concentración del calibrador interno será constante en diferentes reacciones utilizadas para preparar curvas de calibración y para cuantificar el analito polinucleotídico. Preferiblemente, la cantidad o concentración constantes de calibrador interno serán una cantidad conocida de calibrador interno, o una concentración conocida de calibrador interno. En ciertas realizaciones preferidas, el calibrador interno y el analito polinucleotídico se amplifican conjuntamente en una reacción de amplificación de polinucleótidosin vitroutilizando uno o más oligómeros o cebadores de amplificación diferentes. Por ejemplo, el analito y los polinucleótidos calibradores internos empleados en los Ejemplos de trabajo detallados a continuación se amplificaron utilizando oligonucleótidos de amplificación que no fueron compartidos. En otras realizaciones preferidas, el calibrador interno y el analito polinucleotídico se amplifican conjuntamente en una reacción de amplificación de polinucleótidosin vitroutilizando uno o más oligómeros o cebadores de amplificación idénticos.

Como se emplea en el presente documento, la frase "en función de" describe la relación entre una variable dependiente (es decir, una variable que depende de una o más variables diferentes) y una variable independiente (es decir, una variable que puede tener su valor libremente elegido sin considerar los valores de cualquier otra variable), en donde cada valor de entrada para la variable independiente se refiere exactamente a un valor de salida para la variable dependiente. La notación convencional para una ecuación que relaciona un valor y (es decir, - la variable dependiente) "en función de" un valor x (es decir, la variable independiente) es y = f(x).

Como se emplea en el presente documento, un "ordenador" es un dispositivo electrónico capaz de recibir y procesar información de entrada para generar una salida. El ordenador puede ser un dispositivo independiente (p. ej., un ordenador personal), o puede ser un componente integrado de un aparato (p. ej., un analizador de ácidos nucleicos que amplifica una diana polinucleotídica y verifica la síntesis de productos de amplificación en función del número o tiempo del ciclo de reacción). Particularmente, el término abarca un procesador integrado residente dentro de un aparato analizador, y que alberga instrucciones de soporte lógico integradas (a veces denominadas "soporte lógico inalterable").

Como se emplea en el presente documento, "optimizar" o "ajustar" una ecuación se refiere a un proceso, como se practica comúnmente en procedimientos matemáticos de modelado o ajuste de curvas, para obtener valores numéricos para coeficientes en una ecuación para producir una expresión que "ajusta" o se aproxima a mediciones experimentales. Típicamente, una ecuación optimizada definirá una curva de mejor ajuste.

Como se emplean en el presente documento, los términos "ecuación optimizada" y "ecuación ajustada" son referencias alternativas a una ecuación que contiene valores numéricos fijos para coeficientes como resultado de un procedimiento de optimización. Las curvas "ajustadas" resultan de la optimización de una ecuación.

Por "local" se entiende relacionado con un usuario final. Por ejemplo, un aparato local se refiere a un aparato de usuario final. Un gráfico de calibración local se refiere a un gráfico de calibración que utiliza resultados obtenidos por un usuario final, por ejemplo, realizando una reacción de amplificación en el aparato local.

Por "kit" se entiende una combinación envasada de materiales, típicamente destinados a su uso conjunto. Los kits pueden incluir instrucciones u otra información en una forma tangible (p. ej., información impresa, registrada electrónicamente en un medio legible por ordenador, o registrada de otro modo en un medio legible por máquina tal como un código de barras para almacenar valores numéricos).

Por "que consiste esencialmente en" se entiende que se pueden incluir uno o varios componentes, composiciones o etapas de métodos adicionales que no cambian materialmente las características básicas y novedosas. Componentes, composiciones o etapas cualesquiera del método que tengan un efecto material sobre las características básicas y novedosas quedarían fuera de este término.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico de valores calculados del factor de corrección (FC) (eje vertical) en función de la concentración "observada" o "medida" (medida en copias/ml) de un analito polinucleotídico de VIH-1 (eje horizontal). Los puntos de datos circulares abiertos representan valores de FC calculados a diferentes concentraciones diana medidas en un procedimiento que amplificó el analito polinucleotídico a partir de muestras MSS reconstituidas. Se ha ajustado una curva continua a los puntos de datos recogidos optimizando matemáticamente una ecuación de 4PL.

Descripciones de ciertas realizaciones

La técnica divulgada actualmente se demostró utilizando el Ensayo Quant Dx de VIH-1 Aptima™ de Hologic, Inc., (Marlborough, MA) como sistema modelo. Este ensayo de seguimiento de la carga viral es altamente sensible y específico, y se puede utilizar para evaluar respuestas al tratamiento antirretroviral verificando los cambios en la concentración de ARN de VIH-1. El ensayo es una prueba de amplificación de polinucleótidosin vitropara la detección y cuantificación de los grupos M, N y O de ARN del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) que puede realizarse en la Sistema Panther™ completamente automatizado (Hologic, Inc.). El sistema que ejecuta el ensayo de carga viral se calibra para producir una concentración de virus, medida en copias/ml utilizando una muestra de prueba de 500 pl. Por ejemplo, el ensayo modelo se puede utilizar para verificar el efecto del tratamiento antiviral midiendo cambios en la concentración de ARN de VIH-1 en plasma. Habría un beneficio para correlacionar con precisión los resultados cuantitativos obtenidos utilizando muestras MSS y muestras de plasma utilizando la misma calibración, así como reactivos, y el protocolo para la captura, amplificación y detección de dianas.

El ensayo modelo implica tres etapas principales, que tienen lugar todas en un único tubo en el sistema Panther automatizado para análisis de polinucleótidos: captura de diana, amplificación de diana mediante amplificación mediada por transcripción y detección de los productos de amplificación (amplicón) por las sondas de hibridación marcadas fluorescentemente (antorchas). Durante la captura de la diana, el espécimen se trata con un detergente para solubilizar la envoltura viral, desnaturalizar las proteínas y liberar el ARN genómico viral. Los oligonucleótidos de captura hibridan con regiones altamente conservadas del genoma del VIH-1, si están presentes, en la muestra de prueba. La diana hibridada es capturada después sobre micropartículas magnéticas que se separan del espécimen en un campo magnético. Las etapas de lavado eliminan los componentes extraños del tubo de reacción. La amplificación de la diana se produce después a través de AMT, que es un método de amplificación de polinucleótidos mediado por transcripción que utiliza dos enzimas, transcriptasa inversa de MMLV (virus de leucemia murina de Moloney) y ARN polimerasa de T7. La transcriptasa inversa se utiliza para generar una copia de ADN (que contiene una secuencia promotora para la ARN polimerasa de T7) de la secuencia diana. La ARN polimerasa de T7 produce múltiples copias de amplicón de ARN a partir del molde de copia de ADN. El ensayo modelo utiliza el método AMT para amplificar dos regiones de ARN de VIH-1 (pol y LTR). La amplificación de estas regiones específicas se logra utilizando cebadores específicos que están diseñados para amplificar los grupos M, N y O de VIH-1. El diseño del cebador y el enfoque de diana dual garantizan una detección y cuantificación exactas del VIH-1. La detección se logra utilizando antorchas polinucleotídicas de hebra sencilla que están presentes durante la amplificación de la diana y que hibridan específicamente con el amplicón en tiempo real. Cada antorcha tiene un fluoróforo y un extintor. Cuando la antorcha no hibrida con el amplicón, el extintor está en estrecha proximidad al fluoróforo y, por lo tanto, suprime la fluorescencia. Cuando la antorcha se une al amplicón, el extintor se aleja más del fluoróforo y emite una señal a una longitud de onda específica cuando se excita mediante una fuente de luz. Se genera una señal fluorescente más alta a medida que más antorchas hibridan con el amplicón. El tiempo necesario para que la señal fluorescente alcance un umbral especificado es proporcional a la concentración de VIH-1 de partida. Cada reacción tiene un calibrador interno/control interno (CI) que se amplifica conjuntamente con el analito VIH-1 y controla las variaciones en el procesamiento, amplificación y detección de especímenes. La concentración de una muestra se determina mediante el soporte lógico del sistema Panther utilizando las señales de VIH-1 y CI para cada reacción y comparándolas con información de calibración. Las concentraciones determinadas se calibran para VIH-1 en muestras de plasma, y no para muestras MSS reconstituidas. La concentración determinada puede denominarse alternativamente resultado "observado" o resultado "medido".

Existen diferentes tipos de MSS, y cada uno se puede utilizar para realizar la técnica cuantitativa descrita en el presente documento. Las muestras de sangre se pueden obtener de lactantes utilizando técnicas de punción en el talón o punción en el dedo convencionales. Aquí, la superficie de la piel del lactante se desinfecta y después se pincha con una aguja o lanceta estéril. A continuación, se pueden añadir 3-5 gotas de sangre a cada una de una pluralidad (p. ej., 5) de manchas en una "tarjeta" de MSS, asegurando que toda la superficie del círculo esté completamente llena. La técnica de punción en el dedo también se puede utilizar con adultos para obtener muestras MSS. La sangre completa se puede almacenar convenientemente durante hasta 24 horas de 2°C a 30°C antes de la aplicación a las tarjetas de MSS. En este caso, se pueden aplicar 70 pl de sangre completa almacenada al centro de un círculo de filtro en una tarjeta de MSS, por ejemplo, utilizando una pipeta calibrada de 200 pl. Las muestras de sangre aplicadas, sin embargo, obtenidas, se pueden secar a temperatura ambiente durante 4-24 horas. Las tarjetas individuales que contienen las muestras secas pueden colocarse en un sobre (p. ej., un sobre de papel cristal) para su almacenamiento o transporte. Se pueden envasar múltiples sobres de papel cristal en una bolsa de plástico resellable con uno o más envases desecantes. Se empaqueten como se empaqueten, las muestras MSS se pueden mantener o enviar a temperatura ambiente para su posterior procesamiento.

Métodos de amplificación de polinucleótidos preferidos

Los ejemplos de métodos de amplificación de polinucleótidosin vitroútiles con relación a la presente técnica incluyen: Amplificación Mediada por Transcripción (AMT), Amplificación de Ácido Nucleico de Cebador Único, Amplificación Basada en Secuencias de Ácido Nucleico (NASBA), Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), Amplificación por Desplazamiento de Cadena (SDA), Replicación de Secuencia Auto-Sostenida (3SR), Reacción en Cadena de la ADN Ligasa (LCR) y métodos de amplificación que utilizan moléculas de polinucleótidos autorreplicantes y enzimas de replicación tales como ARN de MDV-1 y enzima Q-beta. Los métodos para llevar a cabo estas diversas técnicas de amplificación se pueden encontrar respectivamente en la Patente de Estados Unidos Núm. 5,399,491, la Patente de Estados Unidos Núm. 7,374,885, la Patente Europea publicada EP 0525 882, la Patente de Estados Unidos Núm.

4,965,188, la Patente de Estados Unidos Núm. 5,455,166, Guatelli et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA87:1874-1878 (1990), la Publicación Internacional Núm. WO 89/09835, la Patente de Estados Unidos Núm. 5,472,840 y Lizardi et al.,Trends Biotechnol.9:53-58 (1991).). Las divulgaciones de estos documentos describen cómo realizar reacciones de amplificación de polinucleótidos. Por tanto, aunque el sistema modelo utilizado para demostrar la técnica de ajuste del factor de corrección empleó AMT como mecanismo de reacción de amplificación, también se pueden utilizarse mecanismos de reacción de amplificación alternativos con resultados igualmente buenos.

Ejemplos de técnicas cuantitativas en tiempo real preferidas

En términos generales, los procedimientos de amplificación y detección de polinucleótidos en tiempo real implican verificar la producción de productos de reacción de amplificación a medida que se produce la reacción de amplificación. Como se indicó anteriormente, se puede utilizar cualquier número de diferentes métodos de amplificación para crear productos de amplificación. En algunas realizaciones, la síntesis de productos de amplificación en función del tiempo o el número de ciclos se indica mediante la detección de una señal fluorescente generada en la mezcla de reacción de amplificación. Se proporcionan ejemplos de métodos útiles para calibrar aparatos que llevan a cabo reacciones de amplificación en tiempo real en las Patentes de Estados Unidos Núm. 9,932,628 y 9,976,175. El éxito de estos métodos es independiente de la manera en que se obtienen las curvas de ejecución en los procedimientos en tiempo real. Dicho de otro modo, se pueden utilizar diferentes indicios de amplificación para establecer cuándo una reacción de amplificación ha alcanzado un nivel umbral deseado de progreso de amplificación.

Se puede utilizar una variedad de indicios de amplificación para cuantificar los analitos antes de aplicar el ajuste de FC a los datos. La amplificación y detección en tiempo real para cuantificar analitos polinucleotídicos son muy preferidas para su uso con relación a la técnica de ajuste de FC divulgada, y están sujetas a procedimientos de procesamiento de datos alternativos con buenos resultados en cada caso. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas matemáticas e informáticas que serán familiares para aquellos que tienen un nivel normal de conocimiento práctico de la técnica para identificar el tiempo de aparición del máximo de la primera derivada, o el tiempo de aparición del máximo de la segunda derivada de una curva de ejecución en tiempo real. Wittwer et al., en la Patente de Estados Unidos Núm. 6,503,720 han detallado enfoques para determinar estas características de una curva de crecimiento. Otros enfoques útiles implican calcular una derivada de una curva de crecimiento, identificar una característica de la curva de crecimiento, y después determinar el umbral de tiempo o número de ciclos correspondiente a la característica de la derivada. Tales técnicas se han descrito en la Patente de Estados Unidos Núm. 6,783,934. Otros indicios útiles de amplificación adicionales incluyen "TTime" y "TArc". Los diferentes enfoques para determinar valores de TArc emplean vectores direccionalmente similares (es decir, que dan como resultado un valor identificado simplemente por "TArc"), y vectores direccionalmente opuestos (es decir, que dan como resultado un valor identificado como "OTArc"). Otras técnicas más implican identificar los valores de umbral de ciclo (p. ej., "Ct") como el tiempo o número de ciclo durante los cuales una reacción en donde una señal, preferiblemente una señal fluorescente, es igual a un umbral estático (p. ej., un valor umbral estático predeterminado).

Sistemas y aparatos preferidos

Los métodos divulgados en el presente documento se implementan convenientemente utilizando un ordenador o dispositivo de procesamiento similar ("ordenador" en lo sucesivo). En diferentes realizaciones preferidas, el soporte lógico o las instrucciones ejecutables por la máquina para realizar un algoritmo se pueden cargar o mantener de otro modo en un componente de memoria de un ordenador independiente, o en un componente de memoria de un ordenador conectado a un dispositivo utilizado para verificar, preferiblemente en función del tiempo, la cantidad de un producto que se somete a análisis. En una realización muy preferida, el soporte lógico para ejecutar el procedimiento de ajuste del factor de corrección se mantiene en un componente de memoria de un ordenador que está conectado a, o que es una parte integral de, un dispositivo capaz de verificar la cantidad de un amplicón presente en una mezcla de reacción en función del tiempo. Esto incluye un componente de dispositivo de procesamiento en una placa de circuito electrónico (p. ej., soporte lógico integrado) de un analizador de ácidos nucleicos automatizado.

En algunas realizaciones, el ordenador puede estar en comunicación, ya sea por medios cableados o inalámbricos, con un fluorómetro que detecta señales fluorescentes, donde el fluorómetro está dispuesto o configurado para verificar señales fluorescentes generadas en uno o más recipientes de reacción contenidos dentro de una incubadora de temperatura controlada. La incubadora puede ser un bloque de temperatura controlada (p. ej., un bloque metálico configurado para recibir y contener uno o más tubos, o incluso una placa de múltiples pocillos), o una cámara que expone uno o más recipientes de reacción a condiciones de temperatura controladas.

En algunas realizaciones, uno o ambos de un sistema controlador para controlar un dispositivo de amplificación en tiempo real y/o el sistema de detección del dispositivo de amplificación en tiempo real pueden acoplarse a un ordenador programado apropiadamente que funciona para dar instrucciones al funcionamiento de estos aparatos según instrucciones preprogramadas o de entrada de usuario. El ordenador también puede recibir preferiblemente datos e información de estos aparatos, e interpretar, manipular y notificar esta información al usuario.

En algunas realizaciones, el ordenador también puede incluir soporte lógico apropiado para recibir instrucciones de usuario, ya sea en forma de entrada de usuario en un conjunto de campos de parámetros, o en forma de instrucciones preprogramadas (p. ej., preprogramadas para una variedad de diferentes operaciones específicas). El soporte lógico convierte después estas instrucciones en lenguaje apropiado para ordenar al controlador de amplificación en tiempo real que lleve a cabo la operación deseada. Preferiblemente, el ordenador también es capaz de recibir datos de uno o más sensores/detectores incluidos dentro del sistema, e interpreta los datos según la programación. El sistema incluye preferiblemente soporte lógico que correlaciona una característica de una curva de crecimiento que representa la cantidad de copias amplificadas del polinucleótido de interés en función del tiempo, tal como se detecta mediante el detector, con el número de copias del polinucleótido de interés presentes en una muestra de prueba.

Preferiblemente, cuando el ordenador utilizado para ejecutar el procedimiento de determinación y ajuste del FC divulgado es un componente integral de un aparato para realizar y analizar reacciones de amplificación de polinucleótidos en tiempo real, el aparato comprende preferiblemente una incubadora de temperatura controlada, un dispositivo de detección para recoger señales (p. ej., un fluorómetro) y un dispositivo de análisis (p. ej., un ordenador o procesador) para analizar señales. El aparato puede incluir opcionalmente de manera adicional un dispositivo de salida para mostrar datos obtenidos o generados. El dispositivo de análisis puede estar conectado a la incubadora de temperatura controlada a través de un dispositivo de entrada conocido en la técnica, y/o conectado a un dispositivo de salida conocido en la técnica para la visualización de datos. En una realización, la incubadora de temperatura controlada es capaz de realizar ciclos de temperatura.

En términos generales, los diversos componentes de un aparato para realizar la amplificación de polinucleótidos en tiempo real útil con relación a los métodos divulgados serán componentes convencionales que serán familiares para aquellos que tienen un nivel normal de conocimiento práctico de la técnica. La incubadora de temperatura controlada utilizada para realizar y analizar la amplificación de polinucleótidos en tiempo real puede ser de un diseño convencional que puede contener una pluralidad de tubos de reacción, o muestras de reacción en un bloque de temperatura controlada en tubos de reacción de amplificación convencionales o en pocillos de una placa multipocillo. En un aspecto, el sistema de detección es adecuado para detectar señales ópticas de una o más marcas fluorescentes. La salida del sistema de detección (p. ej., señales correspondientes a las generadas durante la reacción de amplificación) se puede introducir en el ordenador para almacenamiento y manipulación de datos. En una realización, el sistema detecta múltiples tipos diferentes de señales ópticas, tales como múltiples tipos diferentes de marcas fluorescentes y tiene las capacidades de un lector de fluorescencia de microplaca. El sistema de detección es preferiblemente un fluorómetro multiplexado que contiene una fuente de luz de excitación, que puede ser un láser de luz visible o una lámpara ultravioleta o una lámpara halógena, un dispositivo multiplexor para distribuir la luz de excitación a los tubos de reacción individuales y para recibir luz fluorescente de los tubos de reacción, un medio de filtrado para separar la luz fluorescente de la luz de excitación por sus longitudes de onda, y un medio de detección para medir la intensidad de la luz fluorescente. Preferiblemente, el sistema de detección de la incubadora de temperatura controlada proporciona un amplio rango de detección que permite flexibilidad de elección del fluoróforo, alta sensibilidad y excelente razón señal-ruido. Las señales ópticas recibidas por el sistema de detección se convierten generalmente en señales que pueden ser manejadas por el procesador para proporcionar datos que pueden ser vistos por un usuario en una pantalla de un dispositivo de usuario en comunicación con el procesador. El dispositivo de usuario puede comprender una interfaz de usuario o puede ser un sistema informático convencional disponible comercialmente con un teclado y un monitor de vídeo. Los ejemplos de datos que pueden ser presentados por el dispositivo de usuario incluyen gráficos de amplificación, gráficos de dispersión, pantallas de valores de muestra para todos los tubos o recipientes de reacción en el conjunto y para todas las marcas utilizadas, una pantalla de intensidad de señal óptica (p. ej., pantalla de intensidad de señal fluorescente), resultados de análisis final, informes de texto y similares.

Productos de programa informático

Dentro del alcance de la invención se incluyen productos basados en soporte lógico (p. ej., realizaciones tangibles de soporte lógico para dar instrucciones a un ordenador para ejecutar diversas etapas de procedimiento) que se pueden utilizar para realizar el método de procesamiento de datos en un medio legible por ordenador, tal como medios magnéticos, medios ópticos, dispositivos de memoria "flash" y redes informáticas o almacenamiento en la nube. Además, la invención abarca un sistema que amplifica polinucleótidos, detecta productos de amplificación de polinucleótidos y procesa resultados para indicar un resultado cuantitativo para la diana en una muestra de sangre fluida que se secó para producir una MSS. Aunque los diversos componentes del aparato funcionan preferiblemente de una manera cooperativa, no hay requisito de que los componentes sean parte de un conjunto integrado (p. ej., sobre un chasis único). Sin embargo, en una realización preferida, los componentes del aparato están conectados entre sí. Dentro del significado de "conectado" se incluyen conexiones a través de conexiones cableadas e inalámbricas.

Particularmente, se encuentra dentro del alcance de la invención un sistema que incluye un ordenador conectado a un dispositivo que amplifica polinucleótidos y verifica la síntesis de amplicones en función del número de ciclo o tiempo, donde el ordenador está programado para ejecutar el algoritmo cuantitativo divulgado en el presente documento. Según la invención, el sistema incluirá una incubadora de temperatura controlada y un fluorómetro capaz de verifica y distinguir al menos dos longitudes de onda de emisiones fluorescentes. Estas emisiones pueden utilizarse para indicar la síntesis de amplicones diana y la síntesis de amplicones de CI.

En relación con las realizaciones de la divulgación implementadas por ordenador o implementadas por soporte lógico, un resultado se puede registrar o almacenar en un formato "no transitorio" al que se puede acceder como referencia en un momento posterior al que se llevó a cabo o se realizó el análisis de datos que se debe registrar. Por ejemplo, un resultado calculado se puede registrar en un formato no transitorio imprimiendo en papel, o almacenándolo en un dispositivo de memoria legible por ordenador (p. ej., un disco duro, un dispositivo de memoria flash, un archivo en almacenamiento en la nube, etc.).

Procedimientos de ajuste de curvas

Según el método divulgado para crear una curva, gráfico o ecuación ajustada para determinar factores de corrección, el procedimiento o etapa relacionados implican preferiblemente obtener una o más ecuaciones optimizadas para ajustar un conjunto de datos. El conjunto de datos comprende valores de FC calculados en función de un resultado producido por un analizador de ácidos nucleicos calibrado para determinar la cantidad de analito en un volumen conocido de muestra líquida. Esto se puede conseguir aplicando técnicas matemáticas de ajuste de curvas convencionales a cada uno de los conjuntos de datos para dar como resultado una ecuación ajustada que defina una curva asociada con la misma. En la divulgación, se pueden utilizar una o más ecuaciones lineales para determinar una FC apropiada a partir de la salida de un analizador de ácidos nucleicos calibrado para suministrar resultados cuantitativos para muestras de un tipo (p. ej., muestras de plasma) distintas de una muestra MSS reconstituida. Según la invención, la ecuación utilizada en el procedimiento de ajuste de curvas es una ecuación no lineal, preferiblemente una ecuación no lineal que contiene no menos de dos, más preferiblemente no menos de tres, y más preferiblemente no menos de cuatro coeficientes que se pueden optimizar o determinar durante el procedimiento de ajuste de curvas. Algunas ecuaciones altamente preferidas tienen exactamente cuatro coeficientes, mientras que otras ecuaciones altamente preferidas tienen exactamente cinco coeficientes. La optimización de una ecuación para ajustar los indicios de amplificación medidos puede lograrse fácilmente utilizando un paquete de soporte lógico disponible comercialmente, tal como el programa SOLVER que está disponible como una herramienta complementaria de EXCEL para encontrar un valor óptimo para una fórmula, y la resolución de ecuaciones de Microsoft Corporation (Redmond, WA). Ciertas curvas generadas por este procedimiento se pueden conformar de manera que niveles crecientes de la entrada de analito polinucleotídico en una reacción se correlacionen con valores de FC reducidos.

Aunque se pueden utilizar otras ecuaciones en el procedimiento de ajuste de curvas, los métodos descritos a continuación emplearon una ecuación logística de cuatro parámetros (4-PL) que tenía la siguiente forma:

En esta ecuación, la variable dependiente de FC representa el factor de corrección en función de la concentración observada o medida (x) en la escala logarítmica del analito polinucleotídico. De nuevo, la concentración "observada" o "medida" es la salida cuantitativa de un ensayo calibrado para detectar el analito polinucleotídico de VIH-1 en una muestra de prueba, pero no necesita calibrarse para cuantificar el analito en una muestra MSS reconstituida. Los cuatro coeficientes de la ecuación que se pueden optimizar mediante procedimientos convencionales se identifican como b a e. La constante “exp” es la base del logaritmo natural (es decir, aproximadamente 2,7183). Por supuesto, se debe entender que el éxito en el uso de la presente invención no requiere el uso de ninguna ecuación particular.

Ecuaciones alternativas para realizar el ajuste de curvas

Notablemente, aunque se utilizó una ecuación 4-PL para ilustrar la técnica divulgada, también se pueden utilizar otras funciones matemáticas en el procedimiento para simular la tendencia de los valores de FC frente a las salidas medidas.

Aquellos que tienen un nivel normal de conocimiento práctico de la técnica apreciarán que se pueden utilizar numerosos tipos de ecuaciones en los procedimientos divulgados en el presente documento. Los ejemplos de funciones de transición simétricas incluyen: Sigmoide, cumulativa Gausiana, cumulativa Lorentziana y Sigmoidea doble simétrica cumulativa. Los ejemplos de funciones de transición asimétricas incluyen: Respuesta a la Dosis Logística (LDR), Cumulativa Normal Logarítmica, Cumulativa de Valor Extremo, Cumulativo de Pulso, Cumulativa de Pulso con Término de Potencia, Cumulativa de Weibull, Sigmoide Asimétrica, Asimetría Inversa Sigmoide Asimétrica, Formación de Cascada, y Gaussiana Modificado Exponencialmente Cumulativa. Además, se pueden utilizar ecuaciones lineales y no lineales simples, tales como polinomios de orden múltiple, potencia, funciones exponenciales y logarítmicas para modelar datos en tiempo real con el ajuste posterior del coeficiente de referencia, como se detalla en el presente documento. Las funciones cinéticas con coeficientes de referencia también se pueden utilizar de la misma manera. Las ecuaciones cinéticas básicas ilustrativas que contienen coeficientes de referencia incluyen: Desintegración y Formación de Orden 1/2, Desintegración y Formación de Primer Orden, Desintegración y Formación de Segundo Orden, Desintegración y Formación de Segundo Orden (Formas Hiperbólicas) y Desintegración y Formación de Tercer Orden, Desintegración y Formación de Orden Variable. Las ecuaciones cinéticas complejas ilustrativas que contienen coeficientes de referencia incluyen: Desintegración y Formación Simultáneas de Primer y Segundo Orden, Formación Secuencial de Primer Orden, Desintegración de Primer Orden de Dos Componentes, Desintegración y Formación Independientes de Dos Primeros Órdenes, Desintegración y Formación Independientes de Dos Segundos Ordenes, y Desintegración y Formación Independientes de Primer y Segundo Orden. Las ecuaciones de equilibrio cinético ilustrativas que contienen coeficientes de referencia incluyen: Equilibrio Simple (Velocidad Directa e Inversa), Equilibrio Simple (Velocidad Neta y Concentración de Equilibrio), Equilibrio Complejo A=B+C y Equilibrio Complejo A+B=C+D. Las ecuaciones cinéticas intermedias ilustrativas que contienen coeficientes de referencia incluyen: Intermedio de Primer Orden e Intermedio de Primer Orden con Equilibrio. Un experto en la técnica entenderá fácilmente que el éxito del método de ajuste de FC divulgado no depende del uso de ninguna ecuación particular para realizar la etapa de ajuste de curva. De hecho, se cree que cualquier ecuación que tenga coeficientes que puedan optimizarse en un procedimiento de ajuste de curvas para los procedimientos de ajuste de FC divulgados.

Todos los tipos de ecuaciones enumerados anteriormente se pueden utilizar para llevar a cabo los métodos divulgados. Esto se debe a que el éxito del procedimiento no depende de la ecuación particular utilizada, sino de su capacidad para ajustar los datos óptimamente.

Ejemplos de trabajo

Como se ha indicado anteriormente, la técnica divulgada mejoró la capacidad cuantitativa de los ensayos llevados a cabo utilizando muestras de fluido corporal secas mediante el suministro de resultados fiables que se correlacionaban con concentraciones de analito polinucleotídico en la muestra de partida que se utilizó para crear la muestra seca. Se pretende que los Ejemplos presentados a continuación sean ilustrativos, y no se pretende que limiten la divulgación de ninguna manera.

Aquellos que tienen un nivel normal de conocimiento práctico de la técnica apreciarán que el límite inferior de cuantificación ("LLOQ") en un ensayo es la concentración más baja de un analito que se puede cuantificar con un cierto nivel de exactitud y precisión, y tiene al menos 95 % de reactividad. Asimismo, aquellos que tienen un nivel normal de conocimiento práctico de la técnica apreciarán que el límite de detección ("LOD") en un ensayo es la concentración más baja de analito que puede detectarse de manera constante en al menos 95% de las muestras probadas.

El LLOQ de un ensayo es la concentración mínima a la que se cumplen los dos requisitos siguientes: (1) la reactividad debe ser al menos de 95%; y (2) el error total (ET) debe cumplir las especificaciones para la exactitud del ensayo. En el caso del ensayo de carga viral modelo utilizado para ilustrar la presente técnica de ajuste de FC, la especificación ET es < 1 log de exactitud en la LLOQ. Se utilizaron dos enfoques de evaluación de "error total" diferentes para calibrar los impactos de diferentes enfoques de factor de corrección en el límite inferior de cuantificación (LLOQ). Estos enfoques fueron los modelos de la directriz CLSI EP-17-A2 recomendados por Westgard y la raíz de la media cuadrática (RMS) para el cálculo de LLOQ. El procedimiento implicó determinar la exactitud y precisión de la cuantificación a bajas concentraciones de VIH utilizando muestras MSS reconstituidas como fuente de analito. Se utilizaron reservas de un patrón de VIH de la OMS diluido que tenía un valor de concentración asignado, que sirvió como "patrón oro" para la cuantificación, para crear muestras MSS. Más particularmente, se añadieron diversas cantidades de solución de partida patrón de la OMS del VIH a diferentes alícuotas de sangre completa, y las diluciones resultantes se utilizaron para preparar muestras MSS.

Según el modelo de Westgard citado anteriormente, el ET se puede calcular utilizando la siguiente ecuación.

Sesgo (2 X Desv. Típ.) < 1 log (Ec. 2)

Según el modelo RMS anteriormente citado, el ET se puede calcular utilizando la siguiente ecuación.

En el contexto de estas ecuaciones, "sesgo" es la diferencia entre el resultado del ensayo esperado (es decir, real) y el "recuperado". Como se emplea en el presente documento, un resultado "recuperado" se ha ajustado utilizando un multiplicador de FC, y por lo tanto difiere de un resultado medido, que no se ha ajustado utilizando un multiplicador de FC. Dicho de manera sencilla, un resultado recuperado puede calcularse multiplicando un resultado medido por un FC. El ajuste del FC es capaz de mejorar la cuantificación del ensayo a bajas concentraciones de analito al reducir el sesgo (mejorar la exactitud) y mejorar la precisión (al reducir la Desv. Típ.).

Un enfoque inicial para mejorar la cuantificación de MSS implicó el uso de multiplicadores de los valores de FC estáticos (es decir, constantes). Más específicamente, las constantes preseleccionadas en el rango de 15 a 33 se multiplicaron por el valor medido de un ensayo de amplificación de polinucleótidos en tiempo real que se calibró para proporcionar resultados cuantitativos para una muestra líquida de 500 gl (p. ej., plasma). Es importante para los ensayos que miden la carga viral del VIH cumplir los objetivos de exactitud a concentraciones < 1.000 copias/ml. Esto se debe a que el punto de decisión médica recomendado por la OMS para verificar la eficacia del tratamiento antirretroviral es de 1.000 copias/ml. Por lo tanto, la sensibilidad clínica y la especificidad del ensayo se calcularon en el punto de decisión médica de 1.000 copias/ml utilizando resultados de ensayo recuperados para MSS calculados utilizando diferentes FC estáticos. No se observó diferencia significativa en la sensibilidad o especificidad del ensayo cuando se utilizaron FC que variaban de 25 a 33. Según un enfoque, el LOD determinado para muestras MSS reconstituidas (es decir, 873 copias/ml) se dividió por el LLOQ para muestras de plasma (es decir, 30 copias/ml) para la misma química de ensayo para establecer un valor constante de FC de 29,1 para uso como multiplicador. Por tanto, un ensayo realizado utilizando una alícuota de 500 gl de una muestra MSS reconstituida (p. ej., un filtro que se había aplicado con 70 gl de sangre completa y después secado, y posteriormente reconstituido con 1 ml de tampón) que produjo una salida "medida" u observada de 35 copias/ml se multiplicaría por 29,1 para proporcionar un resultado corregido (es decir, recuperado) de 1.019 copias/ml.

El Ejemplo 1 describe un ensayo de amplificación de polinucleótidos en tiempo real que cuantificó polinucleótidos de VIH-1 utilizando muestras MSS reconstituidas. El analizador de ácidos nucleicos automatizado utilizado en el procedimiento se calibró para suministrar resultados medidos en copias/ml para muestras de plasma.

Ejemplo 1

El factor de corrección estático cuantifica el analito polinucleotídico con error excesivo

Se prepararon MSS que albergaban cantidades conocidas de polinucleótidos del VIH-1 utilizando procedimientos de laboratorio que resultarán familiares a aquellos que tienen un nivel normal de conocimiento práctico de la técnica. La sangre completa se enriqueció con VIH-1 a partir del valor asignado a la reserva de virus patrón de la OMS para producir muestras con concentraciones en el rango de 50 copias/ml a 1.200 copias/ml. Las muestras de sangre completa (70 gl cada una) de las diferentes concentraciones de VIH se aplicaron por separado a tarjetas de papel de filtro convencionales y a continuación, se dejaron secar. Las manchas de sangre seca se perforaron de las tarjetas y cada MSS se combinó con 1 ml de una solución detergente tamponada (es decir, tampón de extracción de MSS). Después, se utilizó la mitad de cada muestra (500 gl) para realizar pruebas en el ensayo de carga viral en tiempo real Aptima HIV-1 Quant Dx en el analizador de ácidos nucleicos automatizado Panther (Hologic, Inc.; Marlborough, MA). Al menos 90 réplicas de muestras MSS probadas utilizando diferentes lotes de reactivos para el VIH-1 en la plataforma arrojaron resultados esencialmente equivalentes. La Tabla 1 presenta resultados ilustrativos obtenidos utilizando uno de los lotes de reactivos. En las columnas 1 y 2 se enumeran las concentraciones reales de reservas de analito en sangre completa que se utilizaron para crear las muestras MSS. La columna 3 ("Reactividad") indica el porcentaje de ensayos con resultados positivos (es decir, analito VIH-1 detectado). La columna 4 ("Recuperado Promedio") indica el producto promediado de la multiplicación de FC estático por la concentración medida de analito emitida por el analizador automático. La columna 5 ("Sesgo") indica la magnitud de la desviación del resultado de concentración recuperada promedio con respecto a la concentración real del analito. La columna 6 ("Desv. Típ. Log Copias") indica la desviación típica entre los resultados recuperados presentados en la columna 4. La columna 7 ("Error total (Westgard)") presenta los resultados calculados según un protocolo de análisis de Westgard convencional. La columna 8 ("Error total (RMS)") presenta los resultados calculados según el protocolo de análisis RMS antes citado.

Tabla 1

Los resultados presentados en la Tabla 1 indicaron que el Error Total, independientemente del método utilizado para realizar la determinación, excedía de manera no deseable el objetivo aceptable de umbral de 1,0. Aunque no se muestra, diferentes valores constantes de FC que sustituyen 29,1 también dieron resultados inaceptables.

El Ejemplo 2 presenta resultados experimentales que muestran que no se puede utilizar un único (es decir, constante) FC para cuantificar analito a lo largo del rango dinámico del ensayo, particularmente a concentraciones más bajas de analito. Como se desprende de los resultados presentados a continuación, los valores de concentración más bajos obtenidos por el analizador de ácidos nucleicos calibrado para procesar muestras de plasma tuvieron que multiplicarse por FC más altos para recuperar las concentraciones de partida correctas utilizadas para preparar las muestras MSS. Del mismo modo, los valores de salida más elevados tuvieron que multiplicarse por FC más bajos para recuperar las concentraciones de partida correctas utilizadas para preparar las muestras MSS.

Ejemplo 2

El factor de corrección no es constante en todo el rango dinámico del ensayo cuantitativo en tiempo realSe siguieron los procedimientos descritos esencialmente en el Ejemplo 1 para preparar muestras MSS utilizando sangre completa enriquecida con diferentes niveles del analito VIH-1. Las muestras MSS se procesaron como se ha descrito anteriormente, y los polinucleótidos eluidos se amplificaron y detectaron utilizando el ensayo de carga vital en tiempo real Aptima HIV-1 Quant Dx en el analizador de ácidos nucleicos Panther automatizado (Hologic, Inc.). La concentración diana de VIH-1 utilizada para la preparación de MSS se comparó con la concentración medida en el ensayo para calcular el FC adecuado para cada entrada de concentración de VIH-1 según la ecuación Ec 4.

FC = Concentración de analito en sangre utilizada para preparar la MSS______ (Ec. 4)

Resultado de concentración medida por el analizador de ácidos nucleicos

Tabla 2

Los resultados presentados en la Tabla 2 indicaron claramente que no se podía utilizar un valor de FC único, fijo o estático para cuantificar correctamente el analito polinucleotídico a lo largo del intervalo dinámico del ensayo. La columna final de la tabla revela en general una tendencia en la que se requerían valores de FC más altos para cuantificar correctamente muestras que tenían concentraciones más bajas del analito polinucleotídico.

El Ejemplo 3 describe el desarrollo de un enfoque cuantitativo utilizando un valor de FC que variaba en función del resultado medido calibrado para una muestra líquida (p. ej., plasma) diferente de la muestra líquida sometida a prueba (es decir, una muestra MSS extraída). Este tipo de FC variable se denomina a veces "no estático".

Ejemplo 3

Desarrollo de un factor de corrección no estático

Se preparó un total de 747 muestras MSS utilizando reservas de sangre completa con diferentes concentraciones de analito VIH-1 conocidas que abarcaban el rango de cuantificación del de ensayo cuantitativo en tiempo real modelo. En pro de la exhaustividad, las concentraciones conocidas del analito VIH-1 utilizadas para crear las muestras MSS fueron las mismas que las presentadas en la primera columna de la Tabla 2. Las muestras MSS se reconstituyeron con 1 ml de una solución detergente tamponada (es decir, tampón de extracción de MSS), y se utilizaron 500 pl de la solución resultante para el aislamiento del ácido nucleico y la amplificación y detección de la diana con el ensayo cuantitativo en tiempo real modelo. La concentración diana (es decir, real) de VlH-1 se comparó con la concentración medida en el ensayo para calcular el FC adecuado para cada concentración de VIH-1 utilizando la ecuación Ec 4. El multiplicador FC necesario para ajustar los valores de concentración de analito medidos del VIH-1 para igualar las concentraciones de analito de entrada conocidas se trazó después como una función de los valores de copia medidos. Los datos resultantes se utilizaron después para optimizar una ecuación no lineal según técnicas matemáticas convencionales de ajuste de curvas que resultarán familiares para aquellos que tienen un nivel normal de conocimiento práctico de la técnica. Aunque se pueden utilizar muchas ecuaciones no lineales diferentes para este fin, la técnica se ilustra en la Figura 1 utilizando una ecuación 4-PL ajustada. Se reconocerá que el ajuste de curvas mediante ecuaciones 4-PL se utiliza con frecuencia para procesar datos que presentan propiedades de curvas bifásicas o sigmoideas.

Los resultados presentados en la Figura 1 confirmaron gráficamente que los valores de FC no eran estáticos o constantes, sino que variaban como una función no lineal del valor de concentración medido emitido por el analizador de ácidos nucleicos calibrado para el procesamiento de muestras de plasma. Las agrupaciones de puntos de datos que aparecen como formas de media luna espaciadas demuestran la variabilidad entre los resultados de FC calculados para cantidades de entrada de un solo nivel. Dicho de otro modo, una colección de muestras MSS que contenían prácticamente la misma cantidad de analito polinucleotídico (es decir, las manchas de sangre seca se habían preparado utilizando una única reserva de analito diluido) arrojaron naturalmente un rango de valores de FC. Los coeficientes para la ecuación 4-PL optimizada (es decir, la Ec 1) mostrada como curva ajustada en la Figura 1 fueron los siguientes: b = 3,705178; c = 47,21279; d = 486,6657; y e = 0,506889. Notablemente, el hecho de que los datos en el presente caso no se ajustaran particularmente a una forma sigmoidea no impidió la utilidad de la ecuación 4-PL, como se demuestra en el siguiente Ejemplo.

El Ejemplo 4 demuestra el uso de valores de FC determinados por una curva no lineal ajustada. Más específicamente, el valor de FC determinado se multiplicó por el resultado cuantitativo medido emitido por un analizador de ácidos nucleicos en tiempo real (medido en copias/ml) para indicar la concentración de analito en la muestra líquida utilizada para preparar la mancha de sangre seca.

Ejemplo 4

Factor de corrección calculado a partir de la cuantificación mejorada del analito por ajuste de la curva no lineal

Se siguieron los procedimientos descritos esencialmente en el Ejemplo 1 para preparar muestras MSS utilizando sangre completa enriquecida con diferentes niveles del analito VIH-1. Las muestras MSS se procesaron como se ha descrito anteriormente, y los polinucleótidos eluidos se amplificaron y detectaron utilizando el ensayo de carga viral en tiempo real Aptima HlV-1 Quant Dx en el analizador de ácidos nucleicos automatizado Panther. Los resultados cuantitativos emitidos (es decir, medidos) se multiplicaron por los valores de FC tomados de la curva ajustada que se muestra en la Figura 1. Más específicamente, la ecuación de la curva ajustada que se muestra en la figura se resolvió para determinar un valor de FC utilizando el resultado cuantitativo emitido en el eje horizontal como variable independiente (es decir, valor x) en la ecuación. A continuación, el valor de FC determinado se multiplicó por el mismo resultado cuantitativo emitido (es decir, el valor x) para calcular una concentración "recuperada" (es decir, ajustada). Los resultados se presentan en la Tabla 3

Tabla 3

Ajuste cuantitativo utilizando un FC calculado

Diana Diana (lo eact ividad Recuperada Sesgo Desv. Típ. rror Total Error (copias/ml) copias/m (log Copias estgard) Total opias/m (RMS)

900 2,95 97% 2,79 0,47 1,10 0,50

1.000 3,00 97% 2,78 0,46 1,15 0,51

1.200 3,08 97% 2,91 0,37 0,91 0,41

Los resultados presentados en la Tabla 3 confirmaron que el uso del FC calculado a partir de la ecuación no lineal ajustada mejoró sustancialmente la capacidad cuantitativa del ensayo. Como se indica en las dos últimas columnas de la tabla, los valores de ET se redujeron sustancialmente en comparación con los resultados presentados en la Tabla 1. Dicho de otro modo, el uso del FC calculado a partir de una ecuación no lineal ajustada produjo mejoras significativas en comparación con un procedimiento similar que empleaba un valor fijo (es decir, FC = 29,1). El LLOQ del ensayo en este Ejemplo fue de 813 copias/ml (esdecir,2,91 log copias/ml). Entre todos los resultados obtenidos utilizando tres lotes de reactivos diferentes, el LLOQ más alto determinado utilizando valores de FC calculados tomados de la curva ajustada mostrada en la Figura 1 fue de 883 copias/ml (es decir, 2,95 log copias/ml).

Ejemplo 5

El uso de la ecuación del factor de corrección mejora la precisión y exactitud del ensayo

Los procedimientos divulgados en el presente documento se utilizaron para preparar muestras de MSS a partir de reservas de sangre completa enriquecidas con un analito VIH-1 a 900 copias/ml, 1.000 copias/ml o 1.200 copias/ml. Los polinucleótidos eluidos de las muestras se amplificaron utilizando el ensayo de carga viral en tiempo real Aptima HIV-1 Quant DX en el analizador de ácidos nucleicos automatizado Panther. Los resultados comunicados se obtuvieron utilizando procedimientos llevados a cabo en los laboratorios de los autores de la presente invención con la intención de analizar el rendimiento en torno al punto de decisión médicamente relevante de 1.000 copias/ml. Los resultados promediados obtenidos utilizando tres lotes de reactivos diferentes se presentan en la Tabla 4.

Tabla 4

Los resultados presentados en la Tabla 4 muestran que el FC calculado a partir de la ecuación no lineal, cuando se multiplica por el resultado medido en copias/ml para una muestra de plasma, arrojó ventajosamente una mayor exactitud en las asignaciones cuantitativas con una mayor precisión. Las columnas 1 y 2 de la tabla indican las concentraciones diana de VIH-1 de las muestras de la reserva utilizadas para crear las muestras MSS. Las columnas 3 y 4 muestran las concentraciones de VIH ajustadas determinadas multiplicando una FC (29,1 para la columna 3; valor calculado utilizando la ecuación de la curva ajustada de la Figura 1 para la columna 4) por un resultado emitido del ensayo de carga viral modelo que se había calibrado para cuantificar muestras de plasma, y no muestras MSS. La diferencia entre los valores presentados en la columna 2 y los valores presentados en las columnas 3 y 4 reflejan la exactitud de los ensayos que emplean los distintos enfoques del factor de corrección. En todos los casos, la magnitud de la diferencia fue menor cuando se utilizó la ecuación de FC en lugar del FC estático. Estas diferencias menores indican una cuantificación más exacta. Las columnas 5 y 6 muestran medidas de precisión (es decir, las desviaciones típicas entre las concentraciones medidas para las réplicas). De nuevo, en todos los casos la desviación típica fue menor cuando se utilizó la ecuación de FC en lugar del FC estático. Esto indica que el uso de la ecuación de FC se asoció con una mayor precisión en los resultados cuantitativos.

El Ejemplo 5 presenta datos clínicos que demuestran cómo se consiguió una cuantificación mejorada del ensayo que da como resultado una mayor sensibilidad clínica en el punto de decisión médica de 1.000 copias/ml para VIH-1 empleando un multiplicador de FC calculado utilizando una ecuación para la curva ajustada mostrada en la Figura 1. Notablemente, los datos utilizados para obtener la curva ajustada no fueron los mismos datos clínicos que se procesaron en el Ejemplo. Esto demostró adicionalmente cómo una curva ajustada (o la ecuación para la misma) puede prepararse utilizando un conjunto de datos, y después utilizarse para determinar los valores de FC y procesar un conjunto de datos diferente (p. ej., un conjunto de datos obtenido utilizando un aparato diferente para realizar el ensayo).

Ejemplo 5

Mejora del rendimiento clínico en el punto de decisión médica recomendado por la OMS de 1.000 copias/ml para el seguimiento de la carga viral del VIH-1

Se recogieron especímenes emparejados de plasma y MSS de pacientes positivos para VIH-1 en terapia antirretroviral. Se probaron dos réplicas para el espécimen de plasma, y a continuación, se promediaron los resultados de la carga viral obtenidos mediante los procedimientos descritos en el presente documento y se utilizaron como referencia. También se probaron aproximadamente 5 muestras reconstituidas de MSS de cada paciente, y los resultados cuantitativos medidos se multiplicaron por un FC estático (es decir, 29,1) o un FC calculado mediante la ecuación no lineal de la curva ajustada que se muestra en la Figura 1 para obtener valores de concentración recuperados. A continuación, los resultados se compararon con el patrón de referencia de plasma en el punto de decisión médicamente relevante de 1.000 copias/ml. Debe tenerse en cuenta que 90% de los resultados de este estudio tenían una carga viral plasmática <10.000 copias/ml, lo que hace que este conjunto de datos sea ideal para la evaluación del rendimiento clínico en torno a 1.000 copias/ml de VIH.

Como respaldan los resultados presentados en las Tablas 5 y 6, la sensibilidad del ensayo a 1.000 copias/ml mejoró de 79,83% a 90,56% cuando el FC se determinó a partir de la ecuación no lineal en comparación con el valor estático. El cambio de un valor de FC a otro no tuvo un impacto negativo significativo en la especificidad. Así se desprende de la especificidad de 94,30% obtenida utilizando el FC estático de 29,1 frente a la de 91,36% obtenida utilizando la ecuación de FC. La estrecha correspondencia entre estos últimos valores indica un impacto mínimo en la especificidad.

Tabla 5

Tabla 6

Aunque la presente divulgación ha sido descrita y mostrada con considerable detalle con referencia a ciertas realizaciones ilustrativas, incluyendo varias combinaciones y subcombinaciones de características, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que otras realizaciones y variaciones y modificaciones de las mismas están incluidas dentro del alcance de la presente divulgación. Por otra parte, no se pretenden que las descripciones de tales realizaciones, combinaciones y subcombinaciones transmitan que la divulgación requiere características o combinaciones de características distintas de las expresamente mencionadas en las reivindicaciones.

Aunque se han ilustrado y descrito con detalle varias realizaciones de la presente divulgación, resultará obvio para aquellos expertos en la técnica que se pueden realizar diversas modificaciones sin apartarse de la presente divulgación o del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Un método de cuantificación de un analito polinucleotídico presente en una muestra de sangre fluida que se secó para producir una mancha de sangre seca (MSS), comprendiendo el método las etapas de:

(a) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico utilizando la MSS como fuente de moldes para producir productos de amplificación y obtener un resultado medido, indicando el resultado medido una concentración o una cantidad del analito polinucleotídico; y

(b) multiplicar el resultado medido por un factor de corrección para obtener un resultado corregido,

en donde el factor de corrección es la solución de una ecuación que especifica el factor de corrección en función del resultado medido, y

en donde la ecuación comprende una ecuación no lineal,

cuantificando así el analito polinucleotídico presente en la muestra de sangre fluida.

2. Un método de cuantificación de un analito polinucleotídico presente en una muestra de sangre fluida que creó una MSS, comprendiendo el método las etapas de:

(a) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico utilizando la MSS como fuente de moldes para producir productos de amplificación y obtener un resultado medido, indicando el resultado medido una concentración o una cantidad del analito polinucleotídico;

(b) resolver una ecuación para determinar un factor de corrección,

en donde la ecuación especifica el factor de corrección en función del resultado medido; y

en donde la ecuación comprende una ecuación no lineal; y

(c) multiplicar el resultado medido por el factor de corrección para obtener un resultado corregido, cuantificando así el analito polinucleotídico presente en la muestra de sangre fluida.

3. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde la ecuación no lineal comprende coeficientes optimizados en un procedimiento matemático de ajuste de curvas para definir una curva ajustada; preferiblemente, en donde la ecuación no lineal comprende cuatro coeficientes.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la etapa (a) comprende trabajar con un analizador de ácidos nucleicos automatizado que amplifica el analito polinucleotídico y detecta los productos de amplificación a medida que se produce la reacción de amplificación de ácido nucleico; preferiblemente,

en donde la ecuación no lineal en la etapa (b) es una ecuación no lineal preparada utilizando resultados obtenidos de un analizador de ácidos nucleicos automatizado diferente del analizador de ácidos nucleicos automatizado utilizado para llevar a cabo la reacción de amplificación de ácido nucleico en la etapa (a).

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la etapa (a) comprende trabajar con un analizador de ácidos nucleicos automatizado que aísla el analito polinucleotídico, y a continuación amplifica el analito polinucleotídico aislado; preferiblemente,

en donde el analizador de ácidos nucleicos automatizado detecta adicionalmente la síntesis de productos de productos de amplificación a medida que se produce la reacción de amplificación de ácido nucleico.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el resultado medido indica una concentración del analito polinucleotídico en una muestra de plasma; y/o

en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico es una reacción de amplificación de ácido nucleico isotérmica; preferiblemente,

en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico isotérmica es una reacción de amplificación de ácido nucleico asociada a la transcripción; preferiblemente,

en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico asociada a la transcripción comprende una reacción de amplificación mediada por transcripción (AMT).

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el analito polinucleotídico comprende un segmento de un genoma viral; preferiblemente,

en donde el genoma viral comprende ARN.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el analito polinucleotídico comprende un segmento de un genoma de VIH-1; y/o

en donde la muestra de sangre fluida comprende sangre completa.

9. Un ordenador programado con instrucciones de soporte lógico para cuantificar un analito polinucleotídico presente en una muestra de sangre fluida que se secó para producir una MSS, las instrucciones de soporte lógico, cuando se ejecutan por el ordenador, hacen que el ordenador:

(a) reciba un resultado medido;

(b) resuelva una ecuación no lineal para determinar un factor de corrección,

en donde la ecuación no lineal especifica el factor de corrección en función del resultado medido;

(c) multiplique el resultado medido por el factor de corrección para calcular un resultado corregido; y

(d) registre el resultado corregido de forma no transitoria, cuantificando así el analito polinucleotídico.

10. El ordenador de la reivindicación 9,

en donde el resultado medido se determina a partir de los resultados de una reacción de amplificación de ácido nucleico en tiempo real,

en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico en tiempo real se lleva a cabo utilizando la MSS como fuente de moldes para producir productos de amplificación, y

en donde el resultado medido indica una concentración o una cantidad del analito polinucleotídico; y/o en donde el resultado medido y el resultado corregido se expresan ambos en unidades de concentración.

11. El ordenador de la reivindicación 9, en donde la ecuación no lineal comprende coeficientes optimizados en un procedimiento matemático de ajuste de curvas para definir una curva ajustada; preferiblemente,

en donde la ecuación no lineal comprende cuatro coeficientes.

12. El ordenador de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde la forma no transitoria comprende el almacenamiento en un dispositivo de memoria legible por ordenador; y/o

en donde la muestra de sangre fluida comprende sangre completa.

13. Un medio de almacenamiento legible por ordenador que comprende instrucciones que, cuando son ejecutadas por un ordenador, hacen que el ordenador lleve a cabo el método de la reivindicación 9.

14. Un sistema configurado para cuantificar un analito polinucleotídico que puede estar presente en una muestra de sangre fluida que se secó para producir una MSS, que comprende:

un analizador de ácidos nucleicos que comprende:

una incubadora de temperatura controlada;

un fluorómetro en comunicación óptica con la incubadora de temperatura controlada,

en donde el fluorómetro está configurado para medir la producción de productos de amplificación de ácido nucleico contenidos en la incubadora de temperatura controlada en función del tiempo o del número de ciclos; y un ordenador en comunicación con el fluorómetro,

en donde el ordenador está programado con instrucciones de soporte lógico que hacen que el ordenador:

(a) calcule un resultado medido utilizando las mediciones realizadas por el fluorómetro,

(b) resuelva una ecuación para determinar un factor de corrección,

en donde la ecuación comprende una ecuación no lineal, y

en donde la ecuación no lineal especifica el factor de corrección en función del resultado medido;

(c) multiplique el resultado medido por el factor de corrección para calcular un resultado corregido, y (d) registre el resultado corregido de forma no transitoria, cuantificando así el analito polinucleotídico diana presente en la muestra de sangre fluida que se secó para producir una MSS.

15. El sistema de la reivindicación 14, en donde la incubadora de temperatura controlada está configurada para mantener una temperatura constante; o

en donde la incubadora de temperatura controlada está configurada para ciclos de temperatura.

16. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en donde el fluorómetro está configurado para detectar una pluralidad de diferentes longitudes de onda de luz; y/o

en donde la incubadora de temperatura controlada, el fluorómetro y el ordenador son componentes integrales del analizador de ácidos nucleicos; y/o

en donde el resultado medido comprende un valor de concentración del analito polinucleotídico.

17. Un método de cuantificación de un analito polinucleotídico presente en una muestra de fluido corporal que se secó para producir una muestra seca, comprendiendo el método las etapas de:

(a) realizar una reacción utilizando la muestra seca como fuente del analito polinucleotídico para obtener un resultado medido, indicando el resultado medido una concentración o una cantidad del analito polinucleotídico, en donde la reacción se realiza con un analizador de ácidos nucleicos automatizado que amplifica el analito polinucleotídico y detecta productos de amplificación a medida que se produce la reacción de amplificación de ácido nucleico; y

(b) multiplicar el resultado medido por un factor de corrección para obtener un resultado corregido,

en donde el factor de corrección es la solución de una ecuación que especifica el factor de corrección en función del resultado medido, y

en donde la ecuación comprende una ecuación no lineal,

cuantificando así el analito polinucleotídico presente en la muestra de fluido corporal.

18. El método de la reivindicación 17, en donde la ecuación no lineal comprende coeficientes optimizados en un procedimiento matemático de ajuste de curvas para definir una curva ajustada; preferiblemente,

en donde la ecuación no lineal comprende cuatro coeficientes.

19. El método de la reivindicación 17, en donde la ecuación que comprende la ecuación no lineal en la etapa (b) comprende coeficientes optimizados en un procedimiento matemático de ajuste de curvas para definir una curva ajustada, y en donde la ecuación no lineal se prepara utilizando resultados obtenidos de un analizador de ácidos nucleicos automatizado diferente del analizador de ácidos nucleicos automatizado utilizado para llevar a cabo la reacción de amplificación de ácido nucleico en la etapa (a).

20. El método de la reivindicación 17, en donde la etapa (a) comprende trabajar con un analizador de ácidos nucleicos automatizado que aísla el analito polinucleotídico, y después amplifica el analito polinucleotídico aislado; preferiblemente,

en donde el analizador de ácidos nucleicos automatizado detecta adicionalmente la síntesis de productos de amplificación a medida que se produce la reacción de amplificación de ácido nucleico.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 o 20, en donde el resultado medido indica una concentración del analito polinucleotídico en una muestra de plasma.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico es una reacción de amplificación de ácido nucleico isotérmica; preferiblemente,

en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico isotérmica es una reacción de amplificación de ácido nucleico asociada a la transcripción; preferiblemente,

en donde la reacción de amplificación de ácido nucleico asociada a la transcripción comprende una reacción de amplificación mediada por la transcripción (AMT).

23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en donde el analito polinucleotídico comprende un segmento de un genoma viral; preferiblemente,

en donde el genoma viral comprende ARN.

24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en donde el analito polinucleotídico comprende un segmento de un genoma de VIH-1; y/o

en donde la muestra de fluido corporal se selecciona del grupo que consiste en una muestra de sangre completa, una muestra de plasma, una muestra de orina y una muestra de saliva.